[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

HU220294B - Kukoricában növelt inszekticid aktivitással rendelkező szintetikus DNS-szekvencia - Google Patents

Kukoricában növelt inszekticid aktivitással rendelkező szintetikus DNS-szekvencia Download PDF

Info

Publication number
HU220294B
HU220294B HU9400960A HU9400960A HU220294B HU 220294 B HU220294 B HU 220294B HU 9400960 A HU9400960 A HU 9400960A HU 9400960 A HU9400960 A HU 9400960A HU 220294 B HU220294 B HU 220294B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
gene
protein
sequence
plant
maize
Prior art date
Application number
HU9400960A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9400960D0 (en
HUT68261A (en
Inventor
Lyle D. Crossland
Nalini M. Desai
Stephen V. Evola
Michael G. Koziel
Vance C. Kramer
Karen L. Launis
Kelly S. Lewis
Ellis J. Merlin
Steven J. Rothstein
Gregory W. Warren
Martha S. Wright
Original Assignee
Novartis Ag.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27118547&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU220294(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Novartis Ag. filed Critical Novartis Ag.
Publication of HU9400960D0 publication Critical patent/HU9400960D0/hu
Publication of HUT68261A publication Critical patent/HUT68261A/hu
Publication of HU220294B publication Critical patent/HU220294B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

A találmány tárgyát inszekticid fehérjéket kódoló DNSszekvenciák, illetve ezeknek a szekvenciáknak az expresszálása képezi.
A Bacillus thuringiensisből (Bt) származó inszekticid fehérje (IP) gének növényekben való expresszálása rendkívül nehéznek bizonyult. Kísérleteket tettek a kiméra promoter/Bt IP gén expressziójára növényekben. Az volt a jellemző, hogy a fehérjének csak alacsony szintű expresszióját lehetett elérni a transzgenikus növényekben [Vaeck et. al., Natúré, 328, 33-37 (1987); Barton et. al., Plánt Physiol., 85, 1103-1109 (1987); Fischoff et. al., Bio/Technology, 5, 807-813 (1987)].
Az alacsony szintű expresszió okára adott egyik válasz az, hogy véletlenszerű transzkripciós processzálási helyek a Bt IP mRNS transzkriptum aberrált formáit hozzák létre. Ezek az aberrált módon feldolgozott transzktiptumok nem működnek a növényekben, az inszekticid fehérje termelődése szempontjából. A lehetséges processzálási pontok közé tartozik a poliadenilezési hely, az intronillesztési hely, a transzkripciós terminációs szignálok és a transzport szignálok. A legtöbb gén nem tartalmaz olyan helyeket, amelyek a gén expresszióját károsan érintik a gén normális gazdaszervezetében. Azonban az ilyen szekvenciák véletlenszerű előfordulása a kódolórégióban bonyolíthatja az adott gén expresszióját a transzgenikus gazdaszervezetben. Például a Bt inszekticid kristályfehérje génje, amely a Bacillus thuringiensis kurstaki [GENBANK BTHKURHD, M15271 letéti szám, B. thuringiensis var. kurstaki, HD-1, Geiser et. al., Gene, 48, 109-118 (1986)] törzsből származik, olyan helyeket tartalmazhat, amelyek megakadályozhatják, hogy ez a gén helyesen processzálódjon növényekben.
A további nehézségek akkor jelentkeznek, ha megpróbáljuk a Bacillus thuringiensis-fehéijét egy szervezetben, például egy növényben expresszálni. Felfedezték, hogy a természetes Bt IP gén kodonhasznosítása lényegesen eltér attól, ami a növényi sejtekben érvényes. Pontosabban, a természetes Bt IP gén kodonhasznosítása nagyon eltér a kukoricagénektől. Ennek eredményeképpen az erről a génről keletkező mRNS nem használódik hatékonyan. A kodonhasznosítás befolyásolhatja a gén expresszióját a transzláció, a transzkripció vagy mRNS-processzálás szintjén. Ahhoz, hogy egy inszekticid gén expresszióját optimalizálják növényekben, kísérleteket tettek, hogy megváltoztassák a gént, hogy ezáltal amennyire lehetséges, hasonlítson a transzformálandó növényben található génekre.
Adang és munkatársai bejelentése [EP 0359472 (1990)] egy szintetikus Bacillus thuringiensis tenebrionis (Btt) génre vonatkozik, amely 85%-ban homológ a természetes Btt génnel, és amelyet úgy terveztek meg, hogy A+T tartalma körülbelül annyi legyen, mint amennyit általában a növényekben találnak. Adang és munkatársai 1. táblázata a szintetikus Btt gén szekvenciáját mutatja, amit úgy készítettek el, hogy jobban feleljen meg a kétszikű növények normális kodonhasznosításának. Adang és munkatársai azt állítják, hogy egy IP-t kódoló szintetikus gén hasonló módon optimalizálható arra, hogy egyszikű növényekben expresszáljon, az erősen expresszálódó egyszikűfehérjék 1. táblázatban látható kodonhasznosítását mutatva. A 9. oldalon Adang és munkatársai azt állítják, hogy a Btt gént úgy tervezték, hogy A+T tartalma 55% legyen (ebből természetesen következik, hogy a G+C tartalma 45%). A 20. oldalon Adang és munkatársai leírják, hogy a szintetikus gént úgy tervezték, hogy a természetes Bt génben levő egyes aminosavkodonok megváltoztatása a gén kódolórégióján belül tükrözze a kétszikű gének által előnyben részesített kodonok általános eloszlását. Adang és munkatársai azt is állítják, hogy a természetes Btt kodonok közül csak néhányat kell helyettesíteni az egyes aminosavaknak a növények által leggyakrabban használt kodonjaival, és ezáltal a kétszikű növényekben használt kodonok általános eloszlását meg lehet őrizni.
Fischoff és munkatársai [EP O 385 962 (1990)] a Bacillus thuringiensis kristályfehérje-toxint kódoló növényi génekkel foglalkoznak. Az V. táblázatban Fischhoff és munkatársai az egyes aminosavak kodonjainak százalékos hasznosítását írják le. A 8. oldalon Fischhoff és munkatársai azt javasolják, hogy a természetes Bt gént módosítani kell, a feltételezett poliadenilezési jel és az ATTTA szekvenciák eltávolításával. Fischhoff és munkatársai emellett azt is javasolják, hogy a természetes Bt szekvenciát végig kell pásztázni olyan régiókat keresve, amelyek több mint négy adenin- vagy timinszekvenciát tartalmaznak egymás után, hogy ezzel feltételezhető növényi poliadenilezési szignálokra találjunk. Fischhoff és munkatársai azt állítják, hogy a nukleotidszekvenciát meg kell változtatni, ha egymástól tíz nukleotidtávolságon belül egy feltételezett poliadenilezési szignált találunk. A 9. oldalon Fischhoff és munkatársai azt állítják, hogy erőfeszítéseket kell tenni a kodonok megválasztásában, hogy ezzel a G+C tartalmat előnyösen körülbelül 50%-ra állítsuk be.
Perlak és munkatársai [PNAS USA, 88, 3324-3328 (1991)] a Bacillus thuringiensis crylA(b) gén módosított kódolószekvenciájával foglalkoznak, hasonló módon, mint Fischhoff és munkatársai. Amint az a 3325. oldalon levő 1. táblázatban látható, Perlak és munkatársai részlegesen módosított cryIA(b) génje körülbelül 96%-ban homológ a természetes crylA(b) génnel (1743 nukleotid közül 1681 nukleotid), 41%-os G+C tartalommal, a növényi poliadenilezési szignálok (PPSS) száma 18-ról 7-re csökkent, és az ATTTA szekvenciák számát is 13-ról 7-re csökkentették. A Perlak és munkatársai által közölt teljesen módosított cryIA(b) génről leírják, hogy teljesen szintetikus (3325. oldal, 1. oszlop). Ez a gén körülbelül 79%-ban homológ a természetes cryIA(b) génnel (1845 nukleotidból 1455) G+C tartalma 49%, a növényi adenilezési szignálok számát (PPSS) 1-re csökkentették, és az összes ATTTA szekvenciát eltávolították.
Barton és munkatársai [EP O 431 829 (1991)] az inszekticid toxinok növényekben való expressziójával foglalkoznak. A 10. oszlopban Barton és munkatársai leírják egy szintetikus AalT inszekticid toxin génjének a készítését, amely gén a skorpiótoxint kódolja, a pub2
HU 220 294 B likáció 1. ábráján látható séma szerinti leggyakoribb kodont használva minden egyes aminosavhoz.
A jelen találmány tárgya eljárás heterológ gének növényekben való expressziójának fokozására. Általában egy gént vagy kódolórégiót úgy szerkesztenek meg, hogy növényspecifikus kodonszekvenciát kapjanak. Ily módon egy adott fehérje kodonhasznosítását megváltoztatják, hogy fokozzák az expresszióját egy adott növényben. Az ilyen, növényre optimalizált kódolószekvenciákat működés szempontjából olyan promoterekhez kötjük, amelyek képesek vezérelni a kódolószekvencia expresszióját egy növényi sejtben.
Pontosabban, a jelen találmány egyik tárgya olyan szintetikus inszekticid fehérje gének előállítása, amelyeket a növényekben való expresszióra optimalizáltunk.
A jelen találmány tárgya továbbá szintetikus Bt inszekticid fehérje gének előállítása, azzal a céllal, hogy maximalizáljuk a Bt fehérjék expresszióját egy növényben, előnyösen egy kukoricanövényben. A jelen találmány tárgya tehát egy szintetikus Bt IP gén előállítása a leggyakrabban használt kukoricakodonok alkalmazásával, azoknak az eltéréseknek a kivételével, amelyek ahhoz szükségesek, hogy a teljesen szintetikus gén konstruálásához szükséges ligálási helyeket létrehozzuk.
A fenti megfontolások alapján olyan Bt inszekticid kristályfehérje géneket szintetizáltunk, amelyekben a kodonhasznosítást úgy változtattuk meg, hogy fokozzuk az expressziót növényekben, főleg kukoricában. Azonban ahelyett, hogy megváltoztatnánk a kodonhasznosítást azzal a céllal, hogy hasonlítson egy kukoricagénre az általános kodoneloszlás szempontjából, optimalizáltuk a kodonhasznosítást, azokat a kodonokat használva, amelyek a leggyakrabban használtak a kukoricában (a kukorica által előnyben részesített kodon) a szintetikus gén szintézise során. Az optimalizált, kukorica által előnyben részesített kodonhasznosítás hatásos a Bt inszekticid fehérje magas szintű expressziója során. Ennek lehet eredménye az, hogy egy adott hírvivő-RNSpopulációról transzlálódó Bt inszekticid fehérje mennyisége maximalizálódik. Egy Bt IP génnek a kukorica által előnyben részesített kodonok figyelembevételével való szintézise arra is jó, hogy ezzel elimináljuk azokat a véletlenszerűen előforduló processzálási pontokat, amelyek a természetes kódolószekvenciában előfordulhatnak. Ennek a szintetikus génnek az expressziója lényegesen magasabb a kukoricasejtekben mint a természetes IP Bt géné.
A jelen találmány szerinti előnyös szintetikus, kukoricára optimalizált DNS-szekvenciák a Bacillus thuringiensis var. kurstaki, HD-1 [Geiser et. al., Gene, 48, 109-118 (1986] crylA(b) gén, vagy a Brizzard és Whiteley által leírt crylB gén (AKA Crya4 gén) [Nuc. Acids Rés., 16, 2723 (1988)] által kódolt fehérjéből származnak. A természetes kurstaki HD-1 cryIA(b) gént 1-es szekvenciaként mutatjuk be. Ezek a fehérjék számos különböző pikkelyes szárnyú rovarral szemben aktívak, beleértve az Ostrinia nubilalist, az európai magfúrót.
Jóllehet a jelen találmány leírására a kukoricára optimalizált Bt fehérje gének szintézisét hozzuk fel példaként, az nyilvánvaló, hogy a módszer bármely más fehérje növényben való expressziójának optimalizálására alkalmas.
Az optimalizált géneket számos különböző promoterrel lehet fuzionáltatni, beleértve a konstitutív, indukálható, időlegesen szabályozott, a fejlődési folyamat által szabályozott, szövetspecifikus, illetve szövetek által előnyben részesített promoterekkel, hogy rekombináns DNS-molekulákat készítsünk, például kiméra géneket. A kukoricára optimalizált gén (kódolószekvencia) lényegesen magasabb expressziós szintet biztosít egy transzformált növényben, ha egy kukoricára nem optimalizált génnel hasonlítjuk össze. Ennek megfelelően fedeles szárnyú vagy pikkelyes szárnyú rovarok, például az európai magfuró vagy a cukomádfuró ellen rezisztens növények készíthetők.
A jelen találmány tárgya továbbá szövetek által előnyben részesített és szövetspecifikus promoterek készítése, amelyek vezérlik egy működés szempontjából hozzájuk kapcsolt struktúrgén expresszióját a növény egy specifikus részében vagy részeiben, lényegében a többi rész kizárásával.
A találmány tárgya továbbá olyan promoterek készítése, amelyek főleg a bélben működnek. A „főleg bélben működnek” szakkifejezés alatt azt értjük, hogy a promoter úgy képes vezérelni egy működés szempontjából hozzákötött struktúrgén expresszióját, hogy sokkal több keletkezik a fehérjéből a növény bélrészében, mint a gyökerekben, a külső burokban és a merevítőgyökerekben, és lényegében semmi nem keletkezik a magvakban.
A találmány tárgya továbbá virágpor-specifikus promoterek készítése. A „virágpor-specifikus” szakkifejezés alatt azt értjük, hogy a promoter egy működés szempontjából hozzákapcsolt, számunkra fontos struktúrgén expresszióját lényegében a növény virágporában képes vezérelni, míg a többi növényi részben elhanyagolható az expresszió. Az „elhanyagolható” alatt működés szempontjából jelentéktelen mennyiséget értünk.
A találmány tárgya továbbá olyan rekombináns DNS-molekulák előállítása, amelyek szövetek által előnyben részesített, illetve szövetspecifikus promotert tartalmaznak, működés szempontjából egy számunkra fontos struktúrgénhez illesztve vagy kapcsolva, főleg egy inszekticid hatású fehérjét kódoló struktúrgénhez, és ezt a rekombináns molekulát egy növényben expresszáljuk.
A jelen találmány tárgyát képezi továbbá olyan transzgenikus növények előállítása, amelyek legalább egy, számunkra fontos struktúrgént expresszálnak, működés szempontjából egy szövet által előnyben részesített, illetve szövetspecifikus expresszió szerint.
A találmány egy alábbiakban ismertetett és igényelt előnyös megvalósítási módja szerint az egy szövet által előnyben részesített, illetve szövetspecifikus promotert működés szempontjából egy inszekticid fehérjét kódoló struktúrgénhez kapcsoljuk, majd egy növényt stabilan transzformálunk legalább egy ilyen rekombináns molekulával. A kapott növény rezisztens lesz bizonyos rovarokra, amelyek a növény azon részeiből táplálkoz3
HU 220 294 B nak, amelyekben a gén(ek) expresszálód(nak)ik. Előnyösebbek a kukoricára optimalizált Bt IP gének.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat.
Az 1. ábrán láthatjuk összehasonlítva a teljes hosszúságú természetes cryIA(b) gént (BTHKURHD), egy teljes hosszúságú, kukoricára optimalizált szintetikus Bt crylA(b) gént (flsynbt.fin), és egy csonkított, kukoricára optimalizált szintetikus Bt crylA(b) gént (bssyn). Ezen az ábrán az látható, hogy a teljes hosszúságú kukoricára optimalizált szintetikus crylA(b) génszekvencia illeszkedik a természetes crylA(b) génhez, a 3468 nukleotid közül körülbelül 2354 nukleotid (körülbelül 68%-os homológia).
A 2. ábrán láthatjuk összehasonlítva a csonkított természetes Bt crylA(b) gént (BTHKURHD) és egy csonkított szintetikus, kukoricára optimalizált Bt gént (bssyn). Erről az ábráról látható, hogy a csonkított, kukoricára optimalizált szintetikus crylA(b) génszekvencia illeszkedik a természetes crylA(b) génhez, az 1947 nukleotid közül 1278 nukleotid (körülbelül 66%-os homológia).
A 3. ábrán láthatjuk összehasonlítva a tiszta kukoricára optimalizált Bt génszekvenciát (synlT.mze) egy csonkított, kukoricára optimalizált szintetikus Bt gént (bssyn), és egy teljes hosszúságú, kukoricára optimalizált szintetikus Bt gént, amelyet úgy módosítottunk, hogy olyan restrikciós hasítási helyeket tartalmazzon, amelyek megkönnyítik a gén készítését (synfúl.mod). Erről az ábráról látható, hogy a csonkított, kukoricára optimalizált szintetikus crylA(b) gén illeszkedik a tiszta, kukoricára optimalizált cryIA9b) génhez, 1947 nukleotid közül 1913 (körülbelül 98%-os homológia).
A 4. ábrán láthatunk összehasonlítva egy természetes, csonkított Bt crylA(b) gént (BTHKURHD) egy csonkított, szintetikus génnel [Perlak et. al., PNAS USA, 88, 3324-3328 (1991)] (PMONBT), valamint egy csonkított, kukoricára optimalizált szintetikus Bt gént (bssyn). Erről az ábráról látható, hogy a PMONBT génszekvencia illeszkedik a természetes crylA(b) génhez, 1845 nukleotid közül 1453 nukleotid (körülbelül 79%-os homológia), míg a csonkított, kukoricára optimalizált szintetikus Bt crylA(b) gén illeszkedik a természetes crylA(b) génhez, az 1845 nukleotid közül 1209 nukleotid (körülbelül 66%-os homológia).
Az 5. ábrán láthatunk összehasonlítva egy szintetikus cryIA(b) gént [Perlak et. al., PNAS USA, 88., 3324-3328 (1991)] (PMONBT), valamint egy csonkított, kukoricára optimalizált szintetikus Bt gént (bssyn). Erről az ábráról látható, hogy a PMONBT génszekvencia illeszkedik a csonkított, kukoricára optimalizált szintetikus Bt cryIA(b) génhez, az 1845 nukleotid közül 1410 nukleotid (körülbelül 77%-os homológia).
A 6. ábrán egy teljes hosszúságú, kukoricára optimalizált crylB gén látható.
A 7. ábrán egy teljes hosszúságú, hibrid, kukoricára részlegesen optimalizált crylA(b) DNS-szekvencia látható, amely a pCIB4434 plazmidban található. A szintetikus régió az 1-1938-as nukleotidokra terjed ki (1-646os aminosavak), a természetes régió az 1939-3468-as nukleotidokra terjed ki (647-1155-ös aminosavak). A szintetikus és a természetes kódolószekvencia közötti fúziós pontot egy per (/) jel jelzi a szekvenciában.
A 8. ábrán a pCIB4434 plazmid térképe látható.
A 9. ábrán egy teljes hosszúságú, hibrid, kukoricára optimalizált DNS-szekvencia látható, amely egy hőre stabil cryIA(b) fehérjét kódol, a pCIB5511 plazmidban.
A 10. ábrán a pCIB5511 plazmid térképe látható.
All. ábrán egy teljes hosszúságú, hibrid, kukoricára optimalizált DNS-szekvencia látható, amely egy hőre stabil crylA(b) fehérjét kódol, a pCIB5512 plazmidban.
A 12. ábrán a pCIB5512 plazmid térképe látható.
A 13. ábrán egy teljes hosszúságú, hibrid, kukoricára optimalizált DNS-szekvencia látható, amely egy hőre stabil crylA(b) fehérjét kódol, a pCIB5513 plazmidban.
A 14. ábrán a pCIB5513 plazmid térképe látható.
A 15. ábrán egy teljes hosszúságú, hibrid, kukoricára optimalizált DNS-szekvencia látható, amely egy hőre stabil crylA(b) fehérjét kódol, a pCIB5514 plazmidban.
A 16. ábrán a pCIB5514 plazmid térképe látható.
A 17. ábrán a pCIB4418 plazmid térképe látható.
A 18. ábrán a pCIB4420 plazmid térképe látható.
A 19. ábrán a pCIB4429 plazmid térképe látható.
A 20. ábrán a pCIB4431 plazmid térképe látható.
A 21. ábrán a pCIB4428 plazmid térképe látható.
A 22. ábrán a pCIB4430 plazmid térképe látható.
A 23A. ábrán egy táblázat látható, amely a crylA(b) fehérjeszintekre vonatkozó adatokat tartalmazza transzgenikus kukoricában.
A 23B. ábrán egy táblázat látható, amely összefoglalja az Ostrinia és Diatraea biológiai vizsgálatok eredményeit, egy kukoricára optimalizált CryIA(b) gént tartalmazó kukoricából származó leveleken végezve.
A 23C. ábrán egy táblázat látható, amely a crylA(b) fehérjeszintekre vonatkozó adatokat tartalmazza transzgenikus kukoricában.
A 23D. ábrán egy táblázat látható, amely összefoglalja az Ostrinia és Diatraea biológiai vizsgálatok eredményeit, egy működés szempontjából egy bélspecifikus promoterhez kapcsolt szintetikus Bt kukoricagént tartalmazó kukoricaleveleken végezve.
A 23E. ábrán egy táblázat látható, amelyben a bélben való expressziót előnyben részesítő promotert használó crylA(b) gén transzgenikus kukoricában való expressziójára vonatkozó adatok találhatók.
Cry(Alb) fehérjeszintek transzgenikus kukoricában Szántóföldi növények ELISA Bt-értékei
Beltenyésztett szülő ABRU növényszám ng Bt/mg fehérje
2ND01X171-4A 1646 29
5N984X171-4A 857 1705
5N984X171-4A 870 1760
5N984X171-13 969 22
5N984X171-15 1468 17
5N984X171-15 1470 28
HU 220 294 B
Táblázat (folytatás)
Beltenyésztett szülő ABRU növényszám ng Bt/mg fehérje
5N984X171-14A 1502 180
5N984X171-14A 1529 1500
5N984X176-11 1667 408
5Ν984Χ176-11 1671 1270
5N984X176-11 1673 1522
5N984X176-11 1675 943
5N984X176-11 1679 967
5N984X171-4B 1942 15
5N984X171-4B 1946 16
5NA56X171-16ABX 1101 30
Beltenyésztett szülő ABRU növényszám ng Bt/mg fehérje
5NA89X176-11 1622 959
5ΝΑ89Χ176-11 1630 1172
5NA89X176-11 1635 1100
6F010X171-4 825 103
6F010X171-4 832 1298
A Bt-szintek ng cryIA(b)/mg összfehérje értékben vannak megadva.
A cryIA(b) fehéqét expresszáló, ismertetett kukoricatranszformánsok utódaiból származó adatok.
A transzgenetikus levélanyag ELISA elemzését a máshol ismertetett standard körülmények között végezzük.
Az európai magfúró (Ostrinia nubilalis) és a cukorrépafúró (Diatrea saccharalis) biológiai vizsgálata
Plazmid Promoter Keresztezés A növény száma Bt Gcnc Százalékos mortalitás
Ostrinia Diatraea
pCIB4431 PEPC 5N984x 176-88 21 + 100 100
22 0 0
40 + 100 100
pCIB4431 PEPC 5N984x 176-11 95 + 100 100
96 0 0
98 + 100 100
pCIB4418 35S 5N984xl71-MA 45 0 10
64 + 100 90
68 + 100 100
pCIB4431 PEPC 2N217AFx 176-88 1 0 0
3 100 100
4 + 100 100
pCI34418 35S 2N217AFx 171-15 70 10 0
83 + 90 80
88 + 90 100
CrylA(b) fehérjeszintek transzgenikus kukoricában
Üvegházi növények
35S vonal Levél Bél Gyökér Virágpor
6F010xl71-4A 409+288 NT NT NT
5Ν984χ171-14A 256+159 191 198 30
6F010x171-16AB 240+174 221 271 NT
5N984x 171-13 201+94 NT NT NT
5NA89xl71-13 37+7 150 0 NT
5N984x171-18 7,7+3 NT NT NT
6N615xl71-16AB 7,5+3 0 0
HU 220 294 B
Táblázat (folytatás)
Üvegházi növények
PEPC vonal
6N615x 176-11 1125+419 41 19 NT
6F010x176-10 774+159 NT NT 130
5N984xl76- 11 719+128 16 20 186
A Bt-szinteket ng cryIA(b)/mg összfehérje értékben ELISA A transzgenikus növényi anyag ELISA adjuk meg. elemzését máshol ismertetett standard eljárásokkal vé- A rcyIA(b) fehérjét expresszáló, ismertetett kukori- gezzük. catranszformánsok utódaiból származó adatok. Az európai magfiiró (Ostrinia nubilis) biológiai vizsgálata Bél: SynBt kukoricán
Plazmid Promoter Esemény A növény száma %-os mortalitás
pCIB4433 Pith JS21A-Top 1 3 11 13 14 19 28 90 80 90 70 75 85 80
pCIB4433 Pith JS22D-Mid kontroll 3 4 7 17 1 2 3 70 65 85 95 5 0 0
A crylA(b) gén expressziója transzgenikus kukori- 40 cában, a bél által előnyben részesített promotert használva.
A növény száma ng cylA(b)/mg fehérje
JS21A-1 TOP 169
JS21A-2 TOP 0
JS21A-3 TOP 113
JS21A-11TOP 127
JS21A-12TOP 112
JS21A-13TOP 97
JS21A-14TOP 118
JS21A-19TOP 82
JS21A-24 TOP 0
JS21A-28 TOP 154
JS22D-3 MID 2946
JS22D-4 MID 5590
A növény száma ng cylA(b)/mg feltétje
JS22D-11 MID 215
JS22D-17MID 3004
Az egyéb helyen ismertetett eljárással pCIB4433 plazmiddal transzformált kis hajtások levélmintáinak elemzése a crylA(b) fehérje jelenlétére ELISA-val. Az összes olyan növényt, amely cryIA(b)-t expresszált, inszekticid hatásúnak találtuk a standard európai megfúró biológiai vizsgálatban. Meg kell jegyeznünk, hogy a bél által előnyben részesített promoter alacsony, de kimutatható szintű expressziót biztosít kukoricalevélszövetben. A crylA(b) fehérje kimutatása megegyezik ezzel az expressziós mintázattal.
A 24. ábrán a kukorica triptofán-szintetáz alfa-alegység génjének teljes genomiális DNS-szekvenciája látható. Láthatók az intronok, exonok, a transzkripciós és transzlációs startpontok, a cDNS kezdete és vége. $=a cDNS kezdete és vége; +1= transzkripciós startpont; 73********=primer extenziós indítómolekula;
HU 220 294 Β + l=a transzláció kezdete; + + + = stopkodon; bp 1495-99=CCAAT box; bp 1593-1598=TATAA box; bp 3720-3725 =poli A addíciós pont; az aláhúzott szekvenciák fölötti # jelek PCR indítómolekulák.
A 25A., 25B., 25C. és 25D. ábrákon Northem-blot elemzések láthatók, amelyek a kukorica TrpA alegységének differenciális expresszióját mutatják kukoricaszövetben 2, 4, 18 és 48 órás intervallumokban, -80 °Con, DuPont Cronex erősítőfólia alkalmazásával. P=bél; C=csutka; BR=támasztógyökerek; ES=fölkocsány; LP=alsó bél; MP=középső bél; UP=felső bél; S=mag; L=levél; R=gyökér; P(bal felső)=összes bél.
A 26. ábrán egy Northem-blot elemzés látható, a két bal oldali sávon a kukorica TrpA gén expressziója látható a levélben (L) és a bélben (P), Fűnk beltenyésztett 211D és 5N984 vonalakban. A jobb oldali öt vonal azt mutatja, hogy nincs expresszió a Fűnk 211D mag össz-RNS-ében. S(l, 2, 3, 4 és 5)=magvak 1, 2, 3, 4 és 5 héttel a beporzás után. L=levél, P=bél; S#=mag, # héttel a beporzás után.
A 27. ábrán a 211D Fűnk vonal genomiális DNSének Southem-blot elemzése látható, amelyhez próbaként a kukorica TrpA cDNS 8-2-t használtuk (pCIB5600), amelynél B jelentése BamHI, E jelentése EcoRI, EV jelentése EcoRV, H jelentése HindHI, S jelentése Sacl. Az IX, 5X és 10X jelentése rekonstruált génmásolatok ekvivalensei.
A 28A. ábrán egy primer extenziós elemzés eredményei intronok, exonok, a transzkripciós és transzlációs startpontok, a cDNS kezdete és vége. $=a cDNS kezdete és vége; +1 transzkripciós startpont; 73********=primer extenziós indítómolekula; +l=a transzláció kezdete; + + + =stopkodon; bp 1495-99=CCAAT box; bp 1593-1598=TATAA box; bp 3720-3725=poli A addíciós pont; az aláhúzott szekvenciák fölötti # jelek PCR indítómolekulák.
A 25A., 25B., 25C. és 25D. ábrákon Northem-blot elemzések láthatók, amelyek a kukorica TrpA alegységének differenciális expresszióját mutatják kukoricaszövetben 2, 4, 18 és 48 órás intervallumokban, -80 °C-on, DuPont Cronex erősítőfólia alkalmazásával. P=bél; C=csutka; BR=támasztógyökerek; ES fülkocsány; LP=alsó bél; MP=középső bél; UP=felső bél; S mag; L=levél; R=gyökér; P(bal felső)= =összes bél.
A 26. ábrán egy Northem-blot elemzés látható, a két bal oldali sávon a kukorica TrpA gén expressziója látható a levélben (L) és a bélben (P), Fűnk beltenyésztett 211D és 5N984 vonalakban. A jobb oldali öt vonal azt mutatja, hogy nincs expresszió a Fűnk 211D mag össz-RNS-ében. S(l, 2, 3, 4 és 5) magvak 1, 2, 3, 4 és 5 héttel a beporzás után. L=levél, P bél; S#=mag, # héttel a beporzás után.
A 27. ábrán a 211D Fűnk vonal genomiális DNSének Southem-blot elemzése látható, amelyhez próbaként a kukorica TrpA cDNS 8-2-t használtuk (pCIB5600), amelynél B jelentése BamHI, E jelentése EcoRI, EV jelentése EcoRV, H jelentése HindlII, S jelentése Sacl. Az IX, 5X és 10X jelentése rekonstruált génmásolatok ekvivalensei.
A 28A. ábrán egy primer extenziós elemzés eredményei láthatók, amelyek a kukorica TrpA alegység gén transzkripciós startpontját mutatják, valamint egy szekvenálólétrát. A +1 és +2 sávok jelentése IX + 0,5X minták a primer hosszabbító reakcióból.
A 28B. ábrán az Rnáz-protekció elemzése látható a +2 bp-től a +387 bp-ig, 42 °C, 48 °C és 54 °C illeszkedési hőmérsékleten, 16 órás expozíciót követően (-80 °Con), DuPont Cronex erősítőfólia alkalmazásával.
A 29. ábrán az eredeti ΙΙ-es típusú virágpor-specifikus cDNS-klón térképe látható. A három EcoRI fragment szubklónozása is látható a pBluescript vektorba, amelynek eredménye a pCIB3168, pCIB3169 és II—.6 létrehozása.
A 30. ábrán a kukoricavirágpor-specifikus kalciumdependens protein-kináz gén cDNS DNS-szekvenciája látható, amint az eredeti ΙΙ-es típusú cDNS-klón 1,0 kb és 0,5 kb méretű ffagmentjeiben előfordul. Az 1,0 kb és 0,5 kb méretű fragmenteket elválasztó EcoRI hasítási helyet is jelezzük. Ez a cDNS nem teljes hosszúságú, mivel az mRNS kezdőpontja 490 bp-vel a cDNS-klón vége előtt található.
A 31. ábrán a virágpor CDPL mRNS szövetspecifikus expressziója látható. Az ismertetett kukorica 211D-ből származó RNS-t denaturáljuk, agarózgélen elektroforetizáljuk, nitrocellulóz membránra átvisszük, majd a virágpor CDPK cDNS 0,5 kb méretű fragmentjét használjuk próbaként. A mRNS csak a virágporban mutatható ki, ahol egy erős jel látható.
A 32. ábrán látható a virágpor CDPK eredetű fehérjeszekvencia és a patkány protein-kináz-2 fehéijeszekvencia [Tobimatsu et. al., J. Bioi. Chem., 263, 16082-16086 (1988)] összehasonlítása. A DNAstar programcsomag Align programját használjuk a szekvenciák értékeléséhez. A proteinkinázokkal való homológia a gén 5’ kétharmadában jelentkezik, azaz az 1,0 kb méretű ffagmentben.
A 33. ábrán a virágpor CDPK eredetű fehéqeszekvencia és a humán kalmodulin fehérjeszekvencia aminosavszekvenciáinak összehasonlítása látható [Fischer et. al., J. Bioi. Chem., 263, 17055-17062 (1988)]. A kalmodulinnal való homológia a gén 3’ egyharmadában található, azaz a 0,5 kb méretű ffagmentben.
A 34. ábrán a virágpor CDPK eredetű fehéijeszekvencia és a szójabab CDPK fehérjeszekvencia összehasonlítása látható. A homológia a teljes génben megfigyelhető.
A 35. ábrán a kukoricavirágpor-specifikus CDPK gén szekvenciáját láthatjuk. Az mRNS kezdete előtt 1,4 kb méretű szekvenciát is bemutatjuk. A hét exon és a hat intron pozícióját a megfelelő DNS-szekvencia alatt jelezzük. A poliadenilezés helyét a cDNS-klónban jelezzük.
A 36. ábrán a pCIB4433 plazmid térképe látható.
A 37. ábrán egy teljes hosszúságú hibrid, kukoricára optimalizált DNS-szekvencia látható, amely egy hőre stabilis crylA(b) fehérjét kódol.
A 38. ábrán a pCIB5515 plazmid térképe látható.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt szekvenciákat:
HU 220 294 B
Az 1-es szekvencia a teljes hosszúságú természetes Bt cryIA(b) gén DNS-szekvenciája.
A 2-es szekvencia a teljes hosszúságú tiszta, kukoricára optimalizált szintetikus Bt cryIA(b) gén DNS-szekvenciája.
A 3-as szekvencia egy körülbelül 2 kb méretű csonkított, kukoricára optimalizált szintetikus Bt crylA(b) gén szekvenciája.
A 4-es szekvencia egy teljes hosszúságú, kukoricára optimalizált szintetikus Bt cryIA(b) gén szekvenciája.
Az 5-ös szekvencia egy körülbelül 2 kb méretű, szintetikus Bt gén szekvenciája [Perlak et. al., PNAS USA, 88. 3324-3328 (1991)].
Az alábbi meghatározásokat azért adjuk meg, hogy egyértelműen értelmezhetők legyenek ezek a szakkifejezések, a jelen találmány leírásánál használt specifikáció és igénypontok olvasása során.
A kukorica által előnyben részesített kodon
Az előnyben részesített kodonok egy specifikus gazdasejt által mutatott szelekcióra utalnak, egy adott aminosav nukleotidkodonjainak meghatározása során. Egy adott gazdaszervezetben egy adott aminosav előnyben részesített kodonja az az egy kodon, amely a leggyakrabban kódolja az adott aminosavat az adott gazdaszervezetben. A kukoricának egy adott aminosavat leggyakrabban kódoló kodonját a kukorica ismert génszekvencáiból származtathatjuk. Például, 28, kukoricából származó gén kodonhasznosítását listázzuk a 4. táblázatban [Murray et. al., Nucleic Acids Research, 17, 477-498 (1989)], amely publikációra a továbbiakban referenciaként hivatkozunk. Például az alanin kódolására leggyakrabban használt kukoricakodon a GCC, mivel az összegyűjtött szekvenciák (26 kukoricagénből) [Murray et. al., Nucleic Acids Research, 17, 477-498 (1989)] tanúbizonysága szerint ez a kodon 36 százalékban kódolja az alanint, míg a GCG 24%-ban, a GCA 13%-ban és a GCT 27%-ban.
Tisztakukorica-optimalizált szekvencia
Egy optimalizált gén vagy DNS-szekvencia szakkifejezés egy olyan génre vagy DNS-szekvenciára vonatkozik, amelyben a természetes gén nukleotidszekvenciáját módosítottuk, abból a célból, hogy a kukorica által előnyben részesített szekvenciát használjuk. Például, egy kukoricára optimalizált szintetikus Bt crylA(b) egy olyan gén, amelyben a természetes Bt cryIA(b) gén szekvenciáját úgy módosítottuk, hogy a használt kodonok a kukorica által előnyben részesített kodonok, az előzőkben leírt módon. Egy tiszta, kukoricára optimalizált gén olyan, amelyben a nukleotidszekvencia 100 százalékban a kukorica által leggyakrabban használt kodonszekvenciáit tartalmazza egy polipeptid kódolására. Például a kukoricára optimalizált Bt crylA(b) gén olyan, hogy benne 100 százalékban a kukorica által előnyben részesített kodonszekvenciák találhatók, és egy olyan polipeptidet kódol, amelynek aminosavszekvenciája ugyanaz, mint a természetes Bt crylA(b) géné. Az optimalizált gén tiszta nukleotidszekvenciája változhat, hogy ezzel lehetővé tegyük a gén manipulációját, például úgy, hogy egy nukleotid megváltoztatásával restrikciós hasítási helyeket hozunk létre. Az optimalizált gén tiszta nukleotidszekvenciája is változhat, hogy a potenciálisan káros hatású processzáló helyeket eltávolítsuk, amilyenek például a poliadenilezési helyek vagy az intronfelismerő helyek.
Nyilvánvaló, hogy „részlegesen kukoricára optimalizált” szekvenciák is használhatók. Azon, hogy részlegesen kukoricára optimalizált, azt értjük, hogy a gén kódolórégiója kiméra (hibrid), mivel egy természetes inszekticid génből származó szekvenciákat és a kukoricában való expresszióhoz optimalizált szekvenciákat tartalmaz. Egy részlegesen optimalizált gén az inszekticid fehérjét olyan szinten expresszálja, amely elegendő ahhoz, hogy gátolja a rovarkártevőket, és ez az expresszió magasabb szinten valósul meg, mint amit a csak natív szekvenciát tartalmazó génnel el lehet érni. A kukoricára részlegesen optimalizált szekvenciák közé tartoznak azok, amelyek legalább 50%-ban optimalizált szekvenciát tartalmaznak.
Teljes hosszúságú Bt gének
Olyan DNS-szekvenciákra vonatkozik, amelyek a természetes Bt gén által termelt polipeptid kódolásához szükséges teljes nukleotidszekvenciát tartalmazzák. Például, a természetes Bt crylA(b) gén körülbelül 3,5 kb méretű, és egy körülbelül 1150 aminosavból álló polipeptidet kódol. Egy teljes hosszúságú szintetikus crylA(b) gén legalább 3,5 kb méretű.
Csonkított Bt gének
Olyan DNS-szekvenciákra vonatkozik, amelyek egy természetes Bt gén által termelt polipeptid kódolásához szükséges teljes nukleotidszekvenciánál kevesebb nukleotidot tartalmaznak, de amelyek a polipeptid aktívtoxin-részét kódolják. Például, egy körülbelül 1,9 kb méretű csonkított szintetikus Bt gén a polipeptid aktívtoxin-részét kódolja, oly módon, hogy a fehéije inszekticid aktivitással rendelkezik.
Szövet által előnyben részesített promoter
A. „szövet által előnyben részesített promoter” szakkifejezést annak jelzésére használjuk, hogy egy adott szabályozó-DNS-szekvencia a hozzákapcsolt struktúrgén vagy DNS-kódolószekvencia magasabb szintű transzkripcióját teszi lehetővé, illetve a kapcsolt gén magasabb szintű expresszióját teszi lehetővé, amit bármely szokványos RNS- vagy fehérje vizsgálattal igazolni lehet, illetve egy adott DNS-szekvencia bizonyos differenciális hatást mutat; azaz, a hozzákapcsolt DNSszekvenciák transzkripciója, illetve egy géntermék expressziója nagyobb bizonyos szövetekben, mint a növény egyéb szöveteiben.
Szövetspecifikus promoter
A „szövetspecifikus promoter” szakkifejezést annak jelzésére használjuk, hogy egy adott szabályozóDNS-szekvencia egy hozzákapcsolt kódoló-DNS-szekvencia transzkripcióját majdnem kizárólag egy növénynek csak egy vagy több szövetében teszi lehetővé, például a zöld szövetben, míg a kapcsolt DNS-szekvencia transzkripciója lényegében nem játszódik le a növény egyéb szöveteiben vagy szövettípusaiban.
A jelen találmány tárgyát növényekben, főleg kukoricanövényekben való expresszióra optimalizált DNSszekvenciák képezik. A jelen találmány egy előnyös
HU 220 294 B megvalósítási módja szerint a DNS-szekvenciák egy inszekticid toxin termelését kódolják, előnyösen egy olyan polipeptidet, amely lényegében ugyanazzal az aminosavszekvenciával rendelkezik, mint egy inszekticid kristályfehérje, amelyet normális körülmények között a Bacillus thuringiensis termel. A szintetikus gén egy csonkított vagy egy teljes hosszúságú inszekticid fehérjét kódol. Különösen előnyösek azok a szintetikus DNS-szekvenciák, amelyek a Lepidoptera és Coleoptera rendbe tartozó rovarok ellen hatékony polipeptidet kódolnak, valamint az olyan DNS-szekvenciák, amelyek egy olyan polipeptidet kódolnak, amelynek az aminosavszekvenciája lényegében azonos a Bacillus thuringiensis variety kurstaki, HD-1 által termelt kristályfehérje-toxinok aminosavszekvenciáj ával.
A jelen találmány tárgyát olyan szintetikus DNSszekvenciák képezik, amelyekről nagy mennyiségben expresszálódnak aktív inszekticid fehérjék növényekben, előnyösen kukoricaprotoplasztokban, növényi sejtekben és növényekben. A jelen találmány szerinti szintetikus DNS-szekvenciákat úgy módosítottuk, hogy a kodonhasznosítás és a G+C tartalom szempontjából hasonlítsanak a kukoricagénekre. Ezeknek a módosításoknak az eredményeképpen a jelen találmány szerinti szintetikus DNS-szekvenciák nem tartalmaznak potenciális processzáló helyeket, amelyek a természetes génben megtalálhatók. A keletkező szintetikus DNS-szekvencia (szintetikus Bt IP-t kódoló szekvenciák) és az ezt a szintetikus DNS-szekvenciát (szintetikus Bt IP gének) tartalmazó növényi transzformációs vektorok a szintetikus Bt IP gén meglepően magas szintű expresszióját eredményezik, a természetes Bt IP génnel összehasonlítva, az inszekticid fehérjetermelés alapján, főleg kukoricában. A magas szintű expresszió olyan kukoricasejteket és növényeket eredményez, amelyek a fedeles szárnyú rovarokkal, előnyösen az euópai magfüróval és a Diatrea saccharalisszal, a cukomádfüróval szemben rezisztensek.
A jelen találmány szerinti szintetikus DNS-szekvenciákat úgy tervezzük, hogy a Bacillus thuringiensisből származó inszekticid fehérjéket kódolják, de a G+C tartalom és a kodonhasznosítás szempontjából a kukoricában való expresszióra legyenek optimalizálva. Például a Murray és munkatársai által közölt kodonhasznosítás! táblázatot [Murray et. al., Nucleic Acids Research, 17, 477-498 (1989)] használjuk a Bacillus thuringiensis subsp kurstaki HD-1 crylA(b) génről keletkező toxin aminosavszekvenciájának nukleotidokra való visszafordításánál, a leggyakrabban használt kukoricakodonokat alkalmazva. A visszafordított DNS-szekvenciára úgy hivatkozunk, mint tiszta, kukoricára optimalizált szekvenciára, amint az a 4. szekvenciában látható. Ezt a szekvenciát azután módosítjuk, hogy a nemkívánatos restrikciós endonukleáz hasítási helyeket elimináljuk, és létrehozzuk a számunkra fontos restrikciós hasítási helyeket. Ezeket a módosításokat úgy tervezzük meg, hogy megkönnyítsék a gén klónozását, anélkül, hogy jelentős mértékben megváltoztatnánk a kukoricára optimalizált szekvencia kodonhasznosítását. A klónozási eljárás során, abból a célból, hogy megkönnyítsük a gén klónozását, más módosításokat is teszünk egy olyan régióban, amely különösen érzékenynek tűnik azokra a hibákra, amelyek a polimeráz láncreakcióval (PCR) való klónozás során keletkeznek. A kukoricára optimalizált szintetikus Bt IP gén végső szekvenciáját a 2. szekvenciában mutatjuk be. A kukoricára optimalizált szintetikus Bt IP gén és a természetes kurstaki crylA(b) Bt gén összehasonlítását az 1. ábrán mutatjuk be.
A jelen találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a szintetikus DNS-szekvenciáról keletkező fehérje hatékony a Lepidoptera vagy Coleoptera nembe tartozó rovarokkal szemben. Egy még előnyösebb megvalósítási mód szerint a szintetikus DNS-szekvencia által kódolt polipeptid egy inszekticid fehérje, amelyet normális körülmények között a Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD-1 termel, teljes hosszúságú vagy csonkított aminosavszekvenciáj át tartalmazza. Egy bizonyos megvalósítási mód szerint a szintetikus DNSszekvencia egy olyan polipeptidet kódol, amely a Bt CrylA(b) fehéijének lényegében egy csonkított aminosavszekvenciáját tartalmazza.
A találmány szerinti inszekticid fehéijéket egy növényben elegendő mennyiségben expresszáljuk ahhoz, hogy a rovarkártevőket gátoljuk, azaz rovarkártevő-gátló mennyiségben. Az világos, hogy egy növényben a rovarok gátlásához szükséges inszekticid fehéije expressziójának mértéke függ a növénytől, a rovar típusától, környezeti tényezőktől és hasonlóktól. A rovarpopulációt általában a gazdaságossági küszöb alatt kell tartani, ami növényről növényre változik. Például ahhoz, hogy az európai magfüró kukoricában való kártevését gátoljuk, a gazdaságossági küszöb 0,5 tojástömeg/növény, másképpen kifejezve körülbelül 10 lárva/növény.
A találmány szerinti módszerek jól használhatók számos különböző rovarral szemben, beleértve, de nem korlátozva magunkat a szőlőfirkáló bogárra, a bagolypillehemyóra, az amerikai sereghemyóra, különösen az őszi és répasereghemyóra, a drótféregre, levéltetvekre, magfúrókra, főleg az európai magfurókra, a cukorrépafüróra, alsó kukoricaszár fúróra, délnyugati magfüróra, stb.
A jelen találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a kukoricában való expresszióra optimalizált szintetikus DNS-kódolószekvenciában magasabb a G+C százalék, mint a természetes cryIA(b) génben. Előnyös, ha a G+C százalék legalább 50 százalék, és még előnyösebb, ha legalább körülbelül 60 százalék. Különösen előnyös, ha körülbelül 64 százalék.
A jelen találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint a kukoricában való expresszióhoz optimalizált szintetikus DNS-kódolószekvencia olyan nukleotidszekvenciával rendelkezik, amely legalább körülbelül 90 százalékos homológiát mutat a természetes Bacillus thuringiensis crylA(b) fehérje „tiszta” kukoricára optimalizált nukleotidszekvenciájával, még előnyösebb, ha a homológia legalább körülbelül 95 százalékos, és legelőnyösebb, ha a homológia legalább körülbelül 98 százalékos.
A jelen találmány további előnyös megvalósítási módjai olyan szintetikus DNS-szekvenciákat tartalmaznak, amelyeknek szekvenciája lényegében megegyezik
HU 220 294 B a SEQ ID NO. 4 szekvenciával, valamint ennek mutánsaival vagy variánsaival; a SEQ ID NO. 4 DNS-szekvenciáját tartalmazó transzformációs vektorokat; és a pCIB4406, pCIB4407, pCIB4413, pCIB4414, pCIB4416, pCIB4417, pCIB4418, pCIB4419, pCIB4420, pCIB4421, pCIB4423, pCIB4434, pCIB4429, pCIB4431, pCIB4433 plazmidokból izolált DNS-szekvenciákat. A legelőnyösebbek a pCIB4418 és pCIB4420, pCIB4434, pCIB4429, pCIB4431 és pCIB4433-as plazmidokból izolált DNS-szekvenciák.
Abból a célból, hogy a jelen találmány szerinti, kukoricára optimalizált DNS-szekvenciákat előállítsuk, szintetikus DNS-oligonukleotidokat állítunk elő, amelyeknek átlagos hossza körülbelül 80 nukleotid. Ezeket az oligonukleotidokat úgy tervezzük, hogy hibridizálva olyan fragmenteket képezzenek, amelyek a csonkított toxingén különböző részeit alkotják. Egy adott résznek az oligonukleotidjait hibridizáltatjuk és PCR-rel amplifikáljuk. A részeket azután klónozzuk, és a klónozott részeket szekvenáljuk, hogy megtaláljuk azokat, amelyek a keresett szekvenciákat tartalmazzák. Az egyik esetben a negyedik részben, a hibridizált oligonukleotidokat közvetlenül klónozzuk, PCR amplifikálás nélkül. Ha a négy résznek az összes kiónja megvan, amelyek egy nyitott leolvasási keretet tartalmaznak, akkor az aktív inszekticid fehérjét kódoló intakt gént összeállítjuk. Az összeállított gént azután meg lehet vizsgálni, hogy kódol-e inszekticid aktivitást bármely, számunkra fontos rovarral szemben, beleértve az európai magfúrót (ECB) és a cukorrépafúrót (5A. és 5B. példák). Ha egy teljesen működőképes gént kapunk, akkor ismét szekvenáljuk, hogy igazoljuk a primer szerkezetét. A teljesen működőképes génről kiderült, hogy 100%-os mortalitást biztosít, ha az ECB ellen vizsgáljuk. A teljesen működőképes gént is módosítjuk a kukoricában való expresszálás céljából.
A kukoricára optimalizált gént tranziens expreszsziós vizsgálatban próbáltuk ki, azaz egy kukoricatranziens expressziós rendszerében. Az aktív inszekticid toxint kódoló natív Bt crylA(b) szekvencia nem expreszszálódik kimutatható szinten a kukoricatranziens expressziós rendszerben. Tehát a szintetizált gén expreszsziós szintjét meg lehet határozni. A jelen módszerrel egy fehétjének egy transzformált növényben való expresszióját legalább százszorosra lehet fokozni, de elérheti az 50 000-szeres értéket is, illetve pontosabban a fokozás mértéke 1000-20 000-szeres lehet.
Egy inszekticid génnek egy hatásos szintig való fokozott expressziójához nem szükséges a természetes gén teljes hosszúságban való manipulálása. A hatásos expressziót úgy érhetjük el, hogy a szekvenciának csak azt a részét manipuláljuk, amelynek megváltoztatása a fokozott expresszióhoz elengedhetetlen. Egy teljes hosszúságú, kukoricára optimalizált CrylA(b) gént állíthatunk elő, amely a természetes CrylA(b) szekvencia fehérjéjét tartalmazza. Azaz, a génnek körülbelül 2 kb méretű része (az 1-1938-as nukleotidok) lehet kukoricára optimalizált, azaz szintetikus. A megmaradó, C-terminális nukleotidok (647-1155-ös nukleotidok) azonosak a megfelelő természetes CrylA(b) génnel. Az illusztrált gén konstrukcióját az alábbi, 6. példában írjuk le.
Az elismert dolog, hogy az ismertetett módszerek alkalmazásával, számos különböző szintetikus/természetes hibrid állítható elő, és vizsgálható az expressziójuk. A hibrid készítésének fontos szempontja, hogy a fehérjét elegendő mennyiségben állítsuk elő ahhoz, hogy gátolja a rovarkártevőket. Ily módon a gén kritikus régiói azonosíthatók, és ezeket a régiókat az előnyben részesített kodonokkal meg lehet szintetizálni. A szintetikus szekvenciákat a természetes szekvenciákkal össze lehet kapcsolni, amit az alábbi példákban igazolunk. Általában az N-terminálisrészek vagy a processzálási pontok szintetizálhatok meg, és helyettesíthetők a természetes kódolószekvenciában, hogy a növényben fokozott expressziót kapjunk.
A jelen találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint a crylA(b) fehérjét kódoló, kukoricára optimalizált géneket úgy lehet manipulálni, hogy az így kapott fehérje hőre sokkal stabilabb, a természetes crylA(b) feltétjével összehasonlítva. Kimutattuk, hogy a Bacillus thuringiensis kurstaki HD-1-ben talált cryAI(b) gén egy 26 aminosavas deléciót tartalmaz, ha a crylA(a) és crylA(c) fehérjékkel hasonlítjuk össze, a fehérje C-terminális végében. A deléció egy hőmérséklet-érzékeny fehérjét eredményez [M. Geiser, EP O 440851, címe: „Temperaturstabiles Bacillus thuringiensis-Toxin”]. Ennek a deléciónak a crylA(a) vagy crylA(c) fehérjéből származó megfelelő régióval való helyreállításával a javított fehérje hőmérsékletstabilitása fokozható. A teljes hosszúságú módosított crylA(b) szintetikus gén konstrukcióit úgy tervezzük, hogy a hiányzó aminosavakat kódoló szekvenciákat beépítjük a szekvencia megfelelő részeibe, a leolvasási keret megváltoztatása nélkül, és anélkül, hogy megváltoztatnánk a fehérjeszekvencia további részét. A gén teljes hosszúságú szintetikus verzióját úgy állítjuk össze, hogy egy sorozat kétszálú DNS-kazettát szintetizálunk, mindegyik körülbelül 300 bp méretű, a DNS-szintézis és az enzimatikus reakciók standard technikáinak alkalmazásával. A helyreállított génről azt mondjuk, hogy egy „hőstabil” vagy „hőmérséklet-stabil” cryIA(b) fehérjét kódol, mivel a biológiai aktivitásának sokkal nagyobb részét tartja meg, mint a természetes pátja, ha magas hőmérséklet hatásának tesszük ki. A kukoricára optimalizált, hőstabil, hőmérsékletre stabil fehérjéket kódoló crylA(b) gének specifikus szekvenciáit a 9., 11., 13. és 15. ábrákon mutatjuk be, illetve az alábbi, 7. példában írjuk le.
A jelen találmány tárgyát kukoricára optimalizált, más polipeptideket kódoló szekvenciák képezik, beleértve más Bacillus thuringiensis inszekticid polipeptideket, illetve más forrásból származó inszekticid fehérjéket. Például a crylB géneket lehet kukoricára optimalizálni, majd stabilan be lehet juttatni növényekbe, főleg kukoricába. Egy kukoricára optimalizált crylB gén szekvenciáját, amely gént a jelen találmány szerint konstruáltunk, a 6. ábrán mutatunk be.
Ha a Bt IP gént kukoricában való expresszióra optimalizáljuk, a kukorica által előnyben részesített kodo10
HU 220 294 Β nokat alkalmazva a jelen találmány szerint, akkor ennek eredménye az inszekticid gén expressziójának jelentős fokozódása. Az várható, hogy más gének szintetizálhatok a növényi kodonpreferenciák használatával, hogy ezzel fokozzuk expressziójukat kukoricában, illetve egyéb növényekben. A kukoricakodon-preferencia használata egy valószínű módszere idegen gének kukoricában való expressziója optimalizálásának és maximalizálásának. Az ilyen gének közé tartoznak azok a gének, amelyeket szelektálható, illetve kimutatható markerekként használunk a kukorica transzformálása során, azaz a herbicidrezisztenciát kódoló gének, a betegségekkel szembeni ellenállást kódoló gének, és más gének, amelyek inszekticidrezisztenciát biztosítanak.
A szintetikus cryIA(b) géneket beépítjük Agrobacterium vektorokba is, amelyek jól használhatók nagyszámú kétszikű növényfaj transzformálására (44. példa). A szintetikus cryIA(b) Agrobacterium vektorokkal stabilan transzformált növények inszekticid aktivitással rendelkeznek.
A természetes Bt crylA(b) gén meglehetősen gazdag A+T-ben. A teljes hosszúságú természetes Bt cryIA(b) gén G+C tartalma körülbelül 39%. Egy csonkított, kb 2 kb. hosszúságú természetes Bt cryIA(b) génnek a G+C tartalma 37% körül van. Általában a kukoricakódoló régiók G+C tartalma magas. A Bt cryIA(b) génben tett változtatások eredménye egy szintetikus IP kódolórégió, amelynek G+C tartalma 50%-nál nagyobb, és DNS-szinten körülbelül 65%-os homológiával rendelkezik a természetes crylA(b) génnel. Az ezáltal a szintetikus CryIA(b) gén által kódolt fehérje 100%-osan homológ a természetes fehéijével, és az inszekticid aktivitás szempontjából a teljes aktivitását megtartja. A csonkított szintetikus CryIA(b) IP gén körülbelül 2 kb méretű, és a gén a természetes CryIA(b) inszekticid fehérje aktívtoxin-régióját kódolja. A csonkított szintetikus CryIA(b) gén által kódolt fehérje 648 aminosavból áll.
A jelen találmány szerinti szintetikus gének jól használhatók transzgenikus növényekben való fokozott expresszióra, különösen transzformált kukoricában. A jelen találmány szerinti transzgenikus növények használhatók az inszekticid CryIA(b) fehérje magas szintű expressziójára, aminek az eredménye a rovarkártevők elleni rezisztencia, főleg a fedeles szárnyú és pikkelyes szárnyú rovarok elleni, és leginkább az európai magfúró és a cukomádfúró elleni rezisztencia.
A jelen találmányban a kukoricára optimalizált szintetikus DNS-kódolószekvencia szabályozó elemek, például promoterek hatása alatt állhat, amelyek a kódolószekvencia expresszióját vezérlik. Az ilyen szabályozóelemek közé tartoznak például az egyszikűek, illetve a kukorica, valamint más egyszikűekben működő promoterek, amelyek biztosítják a gén expresszióját a kukoricanövény különböző részeiben. A szabályozóelem lehet konstitutív. Azaz, biztosíthatja a gén folytonos és stabil expresszióját. Az ilyen promoterek közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a CaMV 35S promoter; a CaMV 19S promoter; az Agrobacterium tumefaciens promoterek, azaz az oktopin szintetáz promoter, illetve egyéb opinszintetáz promoterek; az ubiquitin promoterek, az aktin promoterek, a hiszton promoterek és a tubulin promoterek. A szabályozóelem lehet egy bizonyos szövetet előnyben részesítő promoter, azaz a növény egyes szöveteiben magasabb szintű expressziót biztosíthat, mint más szöveteiben. Az egy bizonyos szövetet előnyben részesítő promoter a szintetikus gének magasabb szintű expresszióját biztosíthatja a levelekben, a szárban, a gyökerekben és/vagy a virágporban, mint például a magvakban. A szabályozóelem lehet indukálható is, azaz például hősokkal, vízsokkal, rovarokkal vagy kémiai indukcióval, illetve szabályozhatja a fejlődési folyamat. Számos promoter ismert, amelyeknek az expressziójáról tudott, hogy szövetspecifikusan változik. Az egyik ilyen példa a kukorica foszfoenol-piruvát-karboxiláz (PEPC), amely a zöld levelekben specifikus [Hudspeth, R. L. and J. W., Plánt Molecular Biology, 12, 579-589 (1989)]. Más, zöld szövetekben specifikus promoterek közé tartoznak a klorofill a/b kötő fehérjék, és a RubisCO kis alegység promoterei.
A jelen találmány tárgyát képezik továbbá izolált és tisztított, főleg bélben működő promoterek. Az előnyös, bélben működő promotereket pázsitfű jellegű egyszikűekből izoláljuk, azaz például cukornádból, rizsből, búzából, cirokból, árpából, rozsból és kukoricából; a legelőnyösebbek a kukoricából izolált promoterek.
Egy előnyös megvalósítási mód szerint a bélben működő promotert egy növényi TrpA génből izoláljuk; egy még előnyösebb megvalósítási mód szerint a kukorica TrpA génből izoláljuk. Azaz a promoter természetes állapotában működés szempontjából egy kukorica triptofán-szintetáz alfa-alegység génhez (a továbbiakban „TrpA”) van kapcsolva. A kódolt fehérje molekulasúlya körülbelül 38 kDa. Egy másik alfa-alegységgel és két béta-alegységgel együtt a TrpA egy multimer enzimet képez, a triptofán szintetázt. Mindegyik alegység külön működik, de hatékonyan működnek együtt. A TrpA katalizálja az indol-glicerol-foszfát indollá való konverzióját. Sem a kukorica TrpA gént, sem a kódolt fehérjét nem izolálták egyetlen növényből sem, a jelen bejelentés előtt. Az Arabidopsis thaliana triptofán szintetáz béta-alegység gént klónozták és jellemezték [Wright et. al., The Plánt Cell, 4, 711-719 (1992)]. A kukorica TrpA gén semmilyen homológiával nem rendelkezik a béta-alegységet kódoló génnel.
A jelen találmány tárgyát képezik növényi kalciumdependens foszfát-kináz (CPDK) génből származó tisztított virágpor-specifikus promoterek. Azaz természetes állapotában a promoter működés szempontjából egy növényi CPDK génhez van kapcsolva. Egy előnyös megvalósítási mód szerint a promotert egy kukorica CPDK génből izoláljuk. A „virágpor-specifikus” szakkifejezés alatt azt értjük, hogy egy működés szempontjából hozzákapcsolt, számunkra lényeges struktúrgén expressziója lényegében kizárólag egy növény virágporában játszódik le, és az összes többi növényi részben elhanyagolható. A „CPDK” szakkifejezés alatt egy olyan növényi protein-kinázt értünk, amelynek magas az affinitása a kalciumhoz, de nem a kalmodulinhoz, és kalciumot igényel, de kalmodulint nem a katalitikus aktivitásához.
HU 220 294 B
Egy bizonyos szövet által előnyben részesített, vagy szövetspecifikus promoterek izolálásához szövetspecifikus hírvivő-RNS-t (mRNS) kódoló géneket izolálhatunk egy cDNS-könyvtár differenciálszűrésével. Például egy bélre inkább jellemző cDNS-t úgy állíthatunk elő, hogy egy bél-cDNS-könyvtárat differenciálszűrésnek vetünk alá, bél- és mag-mRNS-ből kapott cDNSpróbákat használva [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press: New York (1989)].
Egy másik módszer szerint a szövetspecifikus promotereket úgy kaphatjuk meg, hogy szövetspecifikus fehérjéket izolálunk, az N-terminálisuk szekvenciáját meghatározzuk, oligonukleotidpróbákat szintetizálunk, és ezekkel a próbákkal vizsgálunk át egy cDNS-könyvtárat. Az ilyen eljárásokat a kísérleti részben adjuk meg, a virágpor-specifikus promoter izolálásánál.
A jelen találmány oltalmi köre a bélben inkább előforduló, illetve virágpor-specifikus promoterek szempontjából vonatkozik egy teljes hosszúságú promoter funkcionálisan aktív fragmentjeire is, amelyek szintén képesek a hozzájuk kapcsolt struktúrgének bél- vagy virágpor-specifikus transzkripciójának vezérlésére. Egy promoter DNS-szekvencia funkcionálisan aktív ffagmentjei származhatnak egy promoter DNS-szekvenciából, számos, a szakterületen jártas szakember által ismert eljárással, például a promoter DNS-szekvencia restrikciós enzimekkel való hasításából, a promoter DNS-szekvencia alapján végzett szintézisből, illetve PCR technológia alkalmazásából [Mullis et. al., Meth. Enzymol., 155, 335-350 (1087); Erlich (ed.), PCR Technology, Stockton Press (New York, 1989)].
A jelen találmány oltalmi körébe tartoznak még a teljes hosszúságú promoterekkel „ekvivalens”, bél- és virágpor-specifikus promoterek. Azaz különböző nukleotidok, illetve nukleotidcsoportok módosíthatók, beszúrhatok, illetve kivághatok, oly módon, hogy az ne tegye tönkre a promoter aktivitását, az ismert eljárások szerint.
A 24. ábrán egy kukorica TrpA génből nyert bélspecifikus promoter látható. A szakterületen jártas szakemberek, ezzel a szekvenciainformációval a birtokukban, hamar felismerik, hogy a jelen találmány oltalmi körébe tartozó bélspecifikus promotert ki lehet nyerni más növényekből, oly módon, hogy az ezekből a növényekből származó bélkönyvtárakat a kukorica TrpA struktúrgénjéből származó próbákkal vizsgáljuk át. A különböző fajok TrpA alegység génjei között erősen konzerválódott szekvenciákból tervezett próbák az előnyösek, amint azt a 17. példában tárgyaljuk. Más pollenspecifikus promoterek, amelyek a természetes állapotukban a kukoricától eltérő növények CPDK génjeihez kapcsolódnak, hasonló módon izolálhatok, a kukorica CPDK gén konzervált régióiból származó próbák alkalmazásával virágporkönyvtárak átvizsgálásában.
A jelen találmány egy másik megvalósítási módja szerint a bél- vagy pollenspecifikus promotert működés szempontjából egy DNS-szekvenciához kapcsoljuk, azaz például egy számunkra érdekes fehérjét kódoló struktúrgénhez, és így hozunk létre egy rekombináns
DNS-molekulát vagy kiméra gént. A „működés szempontjából hozzákapcsolva” szakkifejezés a szakterületen elfogadott jelentéssel rendelkezik; ugyanúgy használható, mint a „hozzákapcsolva”, vagy „fúzionáltatva” szakkifejezések.
A struktúrgén, figyelembe véve a promoter eredetét és/vagy a célnövényt, amelybe transzformáljuk, lehet homológ vagy heterológ. A viszonylagos eredettől eltekintve, a kapcsolódó DNS-szekvencia expresszálható egy transzformált növényben annak a promotemek az expressziós tulajdonságai alapján, amelyhez hozzá van kapcsolva. Tehát a kapcsolt DNS-szekvencia megválasztása abból a szándékból kell hogy származzon, hogy a szekvenciának ily módon expresszálódnia kell. A heterológ DNS-szekvenciák közé tartoznak azok, amelyek inszekticid fehérjéket kódolnak, azaz például olyan fehérjéket vagy polipeptideket, amelyeknek toxikus vagy gátló hatásuk van a rovarokra vagy egyéb növényi parazita ízeltlábúakra, illetve növényi patogénekre, úgymint gombákra, baktériumokra és fonalférgekre. Ezek a heterológ DNS-szekvenciák fehéijéket kódolnak, például maganineket [Zasloff, PNAS USA, 84, 5449-5453 (1983)], cekropinokat [Hultmark et. al., Eur. J. Biochem., 127, 207-217 (1982)], attacineket [Hultmark et. al., EMBO J., 2, 571-576 (1983)]; melittint, gramicidin S-t [Katsu et. al., Biochem. Biophys. Acta, 939, 57-63 (1988)]; nátrium-csatorna fehérjéket és szintetikus fragmenteket [Oiki et. al., PNAS USA, 85, 2395-2397 (1988)]; a Staphylococcus aureus alfatoxinját [Tobkes et. al., Biochem., 24, 1915-1920 (1985)], apolipoproteineket és azok fragmentjeit [Knott et. al., Science, 230, 37 (1985); Nakagawa et. al., J. Am. Chem. Soc., 107, 7087 (1985)]; alamethicint és számos különböző szintetikus amfipatikus peptidet [Kaiser et. al., Ann. Rév. Biophys. Biophys. Chem., 16, 561-581 (1987)]; lektineket [Lis et. al., Ann. Rév. Biochem., 55, 35-68 (1986)]; proteáz és amiláz inhibitorokat és Bacillus thuringiensisből származó inszekticid fehérjéket, főleg a Bacillus thuringiensis delta-endotoxinokat, valamint egyéb baktériumokból vagy gombákból származó inszekticid fehérjéket.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint egy kukorica TrpA alegység génből származó bélspecifikus promoter, illetve egy kukorica CPDK génből származó pollenspecifikus promoter működés szempontjából összekapcsolható egy heterológ DNS-szekvenciával, amely egy Bacillus thuringiensis („Bt”) inszekticid fehéqét kódol. Ezek a fehéijék és a megfelelő struktúrgének a szakterületen jártas szakemberek számára jól ismertek [Hofte and Whiteley, Microbiol. Reviews, 53, 242-255 (1989)].
Miközben az elfogadott tény, hogy bármely, az expresszió vezérlésére képes promoter használható, előnyös lehet a heterológ promoterek használata a számunkra fontos fehérje természetes promotere helyett. Ily módon kiméra nukleotidszekvenciák konstruálhatok, amelyeket a transzformálandó növény, valamint a rovarkártevő alapján határozunk meg. Például ahhoz, hogy a rovarkártevőket gátoljuk kukoricában, egy egyszikű- vagy kukoricapromotert kapcsolhatunk működés
HU 220 294 B szempontjából egy Bt fehérjéhez. A kukoricapromotert a szövetek által előnyben részesített, illetve szövetspecifikus promoterek közül választhatjuk ki, ilyenek például a bélben előnyben részesített és virágpor-specifikus promoterek, az alábbiakban ismertetettek szerint.
Néhány esetben előnyös lehet, ha a növényi sejtet egynél több kiméra génkonstrukcióval transzformáljuk. Tehát például egyetlen növény transzformálható egy bélspecifikus promoterrel, amely egy Bt fehérjéhez kapcsolódik, valamint egy virágpor-specifikus promoterrel, amely működés szempontjából egy Bt fehérjéhez kapcsolódik. A transzformált növények expresszálják a Bt fehérjéket a növényi bélben és virágporban, és sokkal kisebb mértékben a gyökerekben, a külső héjban és a merevítőgyökerekben.
Más egyéb okok miatt, főleg a növényben expreszszálódó inszekticid fehérjék elleni potenciális rovarrezisztencia kifejlődésének kezelése céljából, előnyös lehet, ha egynél több inszekticid fehérjét (IP) expresszálunk ugyanabban a növényben. Expresszálhatunk két különböző gént (azaz például két különböző Bacillus thuringiensis eredetű delta-endotoxint), amelyek a megcélzott rovar középbelének eltérő receptorához kötődnek, illetve szelektíven expresszálhatjuk a két toxint ugyanannak a növénynek különböző szöveteiben, szövetspecifikus promoterek alkalmazásával. Két Bt gént (illetve bármely más két inszekticid gént) expresszálva ugyanabban a növényben, három különböző szövetspecifikus promoter alkalmazásával, a számunkra fontos fenotípust expresszáló növény előállításának problémáját hozza elő. Ha három különböző promoterrel két különböző gént vezérlünk, akkor hat különböző inszekticid gént kapunk, amelyeket egy időben kell bejuttatni a növénybe. A transzformációhoz szükség van még szelekciós markerre is, hogy azonosítani lehessen a transzformáit növényeket. Ez azt jelenti, hogy egy időben hét különböző gént kell bejuttatnia növénybe. Az különösen kívánatos, hogy az összes gén, főleg az inszekticid gének, ugyanabban a lókuszban integrálódjanak a növényi genomba, és ezáltal úgy viselkedjenek, mint egyetlen tulajdonság, és ne úgy mint több genetikai tulajdonság, mert ebben az esetben nehezebb követni a kereskedelmi forgalomba kerülő hibridek nemesítése során. A gének összámát csökkenteni lehet, ha a különböző inszekticid fehérjék differenciális szövetspecifikus expresszióját alkalmazzuk.
Ha például a crylA(b) gént a virágpor és PEP-karboxiláz-specifikus promoterekkel fuzionáltatjuk, akkor ennek következtében ennek a génnek az expresszióját kapjuk a zöld szövetekben és a virágporban. Ha egy bélspecifikus promotert fuzionáltatunk a Bacillus thuringiensis crylB delta-endotoxinnal, akkor ennek következménye ennek az inszekticid promotemek a nagy mennyiségben, bőségben való expressziója a transzformált növény bélrészében, de a magszövetekben nincs expresszió. Ha egy növényt három génnel, azaz a PEPkarboxiláz/cryIA(b), virágpor/cryIA(b) és bél/crylAB génnel transzformáljuk, akkor egy olyan növényt kapunk, amely két különböző Bt inszekticid endotoxint expresszál ugyanannak a növénynek a különböző szöveteiben. A crylA(b) expresszálódni fog a növény „külső” szöveteiben (főleg a kukoricanövényben), azaz, azokban a szövetekben, amelyekből az európai magfuró a kikelés után először táplálkozik. Ha az ECB rezisztensnek bizonyul a cryIA(b)-re, és képes befészkelni magát a növény szárába, miután a levélszövetből és/vagy a virágporból táplálkozott, akkor találkozik a crylB delta-endotoxinnal, és érintkezésbe kerül egy második inszekticid komponenssel. Ily módon ugyanabban a növényben differenciáltan expresszálhatunk két különböző inszekticid komponenst, és csökkenthetjük azoknak a géneknek az összámát, amelyeket egyetlen genetikai egységként szükséges bejuttatni, és ugyanakkor védelmet nyújtanak az egyetlen inszekticid komponensre kialakuló rezisztencia ellen.
Hasonlóképpen, egy növényt olyan konstrukciókkal transzformálhatunk, amelyek egynél több inszekticid fehérjekonstrukciót kódolnak, hogy különböző rovarok szaporodását gátoljuk. így tehát a szakterületen jártas szakember számos variációt készíthet.
A találmány szerinti rekombináns DNS-molekulák úgy állíthatók elő, hogy a különböző elemeket megfelelően manipulálva megfelelő orientációban helyezzük el. Tehát adapterek és linkerek használhatók a DNSffagmentek összekapcsolására. Más manipulációk is végezhetők azzal a céllal, hogy alkalmas restrikciós hasítási helyeket hozzunk létre, és a fölösleges restrikciós hasítási helyeket eltávolítsuk [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)]. Például restrikciós emésztés, visszaemésztés vagy feltöltés a tompa végek kialakítására, linkerek ligálása, a DNS-fragmentek komplementer végeinek kialakítása használható a kapcsoláshoz és ligáláshoz [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)].
Más funkcionális DNS-szekvenciákat is bevihetünk a rekombináns DNS-molekulába, attól függően, hogy a molekulát milyen úton akarjuk bejuttatni a megcélzott növény genomjába. Például, az Agrobacterium úton végzett transzformáció esetében, ha Ti- vagy Ri-plazmidokat használunk a növényi sejtek transzformálására, akkor a Ti- és Ri-plazmidok T-DNS-ének jobb és bal oldali határoló szakaszait kell az expressziós kazetta jobb, illetve bal oldalához kapcsolni. Az Agrobacterium úton végzett növényi transzformációt többen leírták már a szakirodalomban [Horsch et. al., Science, 225, 1229 (1985); Marton, Cell Culture Somatic Cell Genetics of Plants, 1, 514-521 (1984); Hoekema. In: The Binary Plánt Vector System, V. fejezet, Offset-Drukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985); Fraley et. al., Crit. Rév. Plánt Sci., 4, 1-46; An et. al., EMBO J., 4, 277-284 (1985)].
A találmány szerinti rekombináns DNS-molekulák tartalmazhatnak egy marker gént is, hogy ezzel megkönnyítsük a rekombináns növényi sejtek szelekcióját. Marker lehet például egy biocidra, például antibiotikumra, azaz kanamicinre, higromicinre, kloramfenikolra, paromomicinre, metotrexátra és bleomicinre való rezisztencia, illetve egy herbicidre, azaz például imidazolonokra, szulfonil-karbamidokra, glifozátra, foszfi13
HU 220 294 B notricinre vagy bialafoszra való rezisztencia. A marker gének jól ismertek a szakirodalomban.
A jelen találmány egy másik megvalósítási módja szerint az előzőkben ismertetett rekombináns DNSmolekulával vagy kiméra génnel stabilan transzformált növényeket állítunk elő. A keletkező transzgenikus növény tartalmazza a genomba stabilan beépült transzformáló gént, és a működés szempontjából a promoterhez kötődő struktúrgént megfelelő módon expresszálja.
A jelen találmány mind egyszikű, mind kétszikű transzgenikus növényekkel foglalkozik. Jellemző példák a kukorica, a dohány, a paradicsom, a gyapot, a repce, a szójabab, a búza, a rizs, a lucerna, a burgonya és a napraforgó [mások?]. Az előnyben részesített növény a kukorica, főleg a beltenyésztett kukorica.
Az összes transzformált növényt, amellyel a jelen találmányban foglalkozunk, számos, a szakirodalomból jól ismert módszerrel elő lehet állítani. Az Agrobacterium tumefaciens által közvetített transzformációt az előzőkben ismertettük. Más módszer lehet a közvetlen géntranszfer a protoplasztokba [Paszkowski et. al., EMBO J., 12, 2717 (1984); Loerz et. al., Mól. Gén. Génét., 1199:178 (1985); Fromm et. al., Natúré, 319, 719 (1986)], a mikrorészecskebombázás [Klein et. al., Bio/Technology, 6, 559-563 (1988)], protoplasztokba, tenyésztett sejtekbe és szövetekbe való injekciózás [Reich et. al., Bio/Technology, 4, 1001-1004 (1986)], illetve merisztéma szövetekbe vagy palántákba és növényekbe való injekciózás [De La Pena et. al., Natúré, 325, 274-276 (1987); Graves et. al., Plánt Mól. Bioi., 7, 43-50 (1986); Hoykaas-Van Slogteren et. al., Natúré, 311, 763-764 (1984); Grimsley et. al., Bio/Technology, 6, 185 (1988); Grimsley et. al., Natúré, 325, 177 (1988)], valamint az elektroporáció [WO92/09696].
Egy szövet által előnyben részesített, vagy szövetspecifikus promterhez kapcsolt struktúrgén expressziós mintázata egy olyan transzformált növényben, amely ugyanazt tartalmazza, kritikus lehet abban az esetben, ha a struktúrgén egy inszekticid fehérjét kódol. Például, az előzőkben ismertetett bélben előszeretettel expresszálódó expressziós mintázat lehetővé teszi a transzgenikus növény számára, hogy eltűrje és ellenálljon azoknak a patogéneknek és növényevőknek, amelyek elsősorban a bélrészt támadják, de emellett még a rögzítőgyökereket, a külső héjat és leveleket is, mivel a fehérje kisebb mértékben ugyan, de még az rovarokat gátló mennyiségben expresszálódik ezekben a növényi részekben, de mindkét típusú promoter esetében a növény magjait érintetlenül hagyja.
Példák
Az alábbi példákban tovább ismertetjük a találmány kivitelezéséhez szükséges anyagokat és módszereket. Csak illusztrálás céljából adjuk meg őket, céljuk nem lehet a találmány oltalmi körének korlátozása.
1. példa
Általános módszerek
A DNS-manipulációs lépéseket a szakterületen ismert módszerekkel hajtjuk végre. Ezeket az eljárásokat gyakran módosíthatjuk és/vagy helyettesíthetjük, anélkül, hogy lényegesen változtatnánk az eredményen. Kivéve, amikor másra hivatkozunk, általában a legtöbb eljárást az ismert Maniatis laboratóriumi kézikönyv alapján végezzük el [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Sprong Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)].
A DNS-oligomerek szintézise
A DNS-oligomereket, amelyek körülbelül 20-90 nukleotidból, előnyösen körülbelül 60-80 nukleotidból állnak, egy Applied Biosystems 380B modell DNS-szintetizátor és standard eljárások segítségével szintetizáljuk. Az oligomereket a modernizált SSCAF3 ciklussal állítjuk elő egy 0,2 mikromólos, széles pórusú, kis méretű ABI oszlopon. A végső eljárásban a tritilt lehasítjuk, majd az oligomert lehasítjuk az oszlopról, a 380B automatikus hasítási ciklusát használva. Az oligomereket azután fölöslegben levő ammónium-hidroxiddal deblokkoljuk 55 °C-on 8-12 óra hosszat. Az oligomereket azután egy bepárlóban, nitrogéngáz felhasználásával szárítjuk. A reakció teljes lejátszódása után az oligomereket 0,25-05 ml ionmentesített vízben oldjuk.
A szintetikus oligomerek tisztítása
Az egyes oligomerek egy aliquot részét azonos térfogatú kék festék/formamid keverékkel elegyítjük, mikor is a végső oldat 0,05% brómfenolkéket, 0,05% xiléncianol FF-et és 25% formamidot tartalmaz. Ezt az elegyet 10 percre 95 °C-ra melegítjük, az oligomerek denaturálása céljából. A mintákat azután egy 12%-os poliakrilamid-karbamid-gélre visszük, amely 7 mol/1 karbamidot tartalmaz [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)]. Az elektroforézist 3-400 V-on végezzük 3-4 óra hosszat, Vertical Slab Gél Unit (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA) alkalmazásával, majd UV árnyékolással lokalizáljuk a gélben a megfelelő méretű fragmentet, amit azután egy borotvapengével kivágunk. A tisztított gélfragmentet felaprítjuk, majd 0,4 mol/1 LiCl, 1 mmol/l EDTA (pH=8) pufferben inkubáljuk éjszakán át 37 °C-on.
Az oligomereknek a poliakrilamid-gél maradékaitól való elválasztására az alábbi két módszer egyikét használjuk: Gene/X 15 μΜ pórusméretű polietilén szűrőegység, illetve Millipore ultrafree-MC 0,45 μΜ szűrőegység. A tisztított oligomereket etanollal kicsapjuk, centrifugálással kinyerjük egy mikrocentrifugát alkalmazva (20 perc, 4 °C), majd végül TE pufferben szuszpendáljuk (10 mmol/l TRIS, 1 mmol/l EDTA pH=8). A koncentrációkat úgy állítjuk be, hogy a 260 nm-en végzett leolvasás alapján 50 ng/ml legyen.
oligomerek kinázolása a méret meghatározásához
Ahhoz, hogy néhány oligomemek ellenőrizzük a méretét egy szekvenáló gélen, kináz jelzési reakciót végzünk, tisztított szintetikus oligomereket használunk, az egyes jellemző méretekből: 40, 60, 70, 80 és 90 tagú oligomerekből. Mindegyik 20 μΐ-es kinázreakcióban egy pmol tisztított oligomert használunk 7,0 mmol/l TRIS (pH=7,5), 10 mmol/l KC1, 1 mmol/l MgCl2, 0,5 mmol/l DTT, 50 pg/ml BSA, 3000 pCi (3 pmol) 32P-gammaATP összetételű pufferben, és 8 egység T4 polinukleo14
HU 220 294 B tid-kináz felhasználásával. A kinázreakciót egy óra hosszat inkubáljuk 37 °C-on, majd fenol-kloroform eleggyel extraháljuk, etanollal háromszor kicsapjuk, hordozóként glikogént használva [Tracy, Prep. Biochem., 11, 251-268 (1981)].
Az egyes reakciókból két gélmintát készítünk (az egyik 1000 cpm-et, a másik 2000 cpm-et tartalmaz) 25% formamid, 0,05% brómfenolkék és 0,05% xiléncianol összetételű oldatban. A kinázolt oligomereket a felvitel előtt 5 percig forraljuk 6% poliakrilamid, 7 mol/1 karbamid összetételű szekvenáló gélen (BRL Gél Mix TM6, BRL, Gaithersburg, MD). A pUC18 plazmid szekvenáló reakcióját ugyanazon a gélen futtatjuk, hogy molekulasúly-markereket kapjunk.
Az elektroforézis után a gélt megszárítjuk, és orvosi röntgenfilmre tesszük (Kodak, X-OMAT AR). A kapott autoradiogram azt mutatja, hogy az összes vizsgált tisztított oligomer megfelelő méretű. Azokat az oligomereket, amelyeknek a méretét nem határoztuk meg közvetlenül, egy 6% poliakrilamid, 7 mol/1 karbamid összetételű gélen futtatjuk (BRL Gél Mix TM6), a meghatározott méretű oligomereket használva méretmarkerként. Először mindegyik oligomert 25% formamidban 100 °C-on öt percig denaturáljuk, mielőtt felvisszük a gélre. A poliakrilamid-gél etídium-bromiddal való festése lehetővé teszi, hogy az összes oligomert láthatóvá tegyük a méret meghatározásához.
Hibridizáló oligomerek a közvetlen klónozáshoz
A hibridizálandó oligomereket egyesítjük (1-20 pg össz-DNS), és 37 °C-on 1 óra hosszat kinázoljuk IX Promega ligáló pufferben, amely 30 mmol/1 TRIS-HC1 (pH=7,8), 10 mmol/1 MgCl2, 10 mmol/1 DTT és 1 mmol/1 dATP összetételű. A reakcióban 1-20 egység T4 polinukleotid kinázt használunk, a jelen levő DNS összmennyiségétől függően. A kinázolási reakciót úgy állítjuk le, hogy a reakciót forrásban levő vízfürdőbe tesszük öt percre. A hibridizált molekulák 5’-végét alkotó oligomereket nem kinázoljuk, de hozzáadjuk a kinázolt oligomerekhez, további hibridizációs pufferrel együtt, forralás után. Az egyesített oligomerek össztérfogata 50-100 pl a hozzáadott hibridizációs pufferrel együtt, amelyet arra használunk, hogy a sók végkoncentrációját 100 mmol/1 NaCl, 120 mmol/1 TRIS (pH=7,5) és 10 mmol/1 MgC122 értékre állítsuk be. A kinázolt és nem kinázolt oligomereket egyesítjük és forrásban levő vízfürdőben öt percig melegítjük, majd lassan hagyjuk szobahőmérsékletre hűlni, körülbelül négy óra alatt. A hibridizált oligomereket azután fenolkloroform eleggyel extraháljuk, etanollal kicsapjuk, és oldjuk 17 pl TE pufferben (10 mmol/1 TRIS, 1 mmol/1 EDTA pH=8,0). Ennek a 17 μΐ-nek a felhasználásával egy 20 μΐ végtérfogatú ligáló reakcióelegyet teszünk össze [végső állapotok=30 mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,8, 10 mmol/1 MgCl2, 10 mmol/1 DTT, 1 mmol/1 ATP és 3 egység T4 DNS ligáz (Promega, Madison WI)]. A ligálási reakciót körülbelül két óra hosszat szobahőmérsékleten inkubáljuk. A hibridizált/ligált fragmenteket általában 2%-os Nusieve gélen tisztítjuk, restrikciós enzimekkel való hasítás előtt és/vagy után, mielőtt vektorokba klónoznánk őket. Egy 20 μΐ-es ligálási reakciót teszünk össze, 100-500 ng-ot használva az egyes ffagmentekből, hozzávetőlegesen ekvimoláris mennyiségű DNS-t, 30 mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,8, 10 mmol/1 MgCl2, 10 mol/1 DTT, 1 mmol/1 ATP és 3 egység T4 DNS ligáz (Promega, Madison WI) összetételű oldatban. A ligáló elegyeket szobahőmérsékleten inkubáljuk 2 óra hosszat. A ligálás után a DNS-t fagyasztott kompetens Escherichia coli-sejtekbe transzformáljuk, standard eljárások alkalmazásával [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)], majd a transzformánsokat LB-agaron szelektáljuk [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)], amely 100 pg/ml ampicillint tartalmaz (lásd alább).
PCR reakciók klánok kiszűrésére Escherichia coliban
A helyes DNS-inszertet tartalmazó Escherichia colitelepeket PCR-rel azonosítjuk [lásd általában Sandhu et. al., BioTechniques, 7, 689-690 (1989)]. Fogpiszkálóval levesszük a telepeket egy éjszakán át inkubált lemezről, majd 20-45 μΐ-es PCR reakcióelegyhez adjuk, amely az egyes hibridizáló indítómolekulákból körülbelül 50 pmol-t tartalmaz (lásd például az MK23A28 és MK25A28 indítómolekulák használatát a SacII fragment orientációjának kiválasztására a pHYB3#6-ban), valamint az egyes dNTP-kből 200 pmolt-400 mmolt, és IX reakciópuffert (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT). Miután az Escherichia coli/PCR keveréket forrásban levő vízfürdőben tartottuk 10 percig, 5 μΐ Taq polimeráz (0,5 egység) (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Conn) IX reakcióelegyben készült oldatát adjuk hozzá. A PCR reakcióparamétereket általában úgy határozzuk meg, hogy van egy denaturáló lépés 94 °C-on 30 másodpercig, illeszkedés 55 °C-on 45 másodpercig, és hosszabbodás 72 °C-on 45 másodpercig, 30-36 cikluson keresztül. A PCR reakciótermékeket agarózon vagy Nusieve agarózon (FMC) futtatjuk, hogy kimutassuk, a helyes méretű fragment amplifikálódott.
Ligálások
A restrikciós enzimekkel emésztett fragmenteket vagy 1%-os LGT-ben (alacsony gélesedési hőmérsékletű agaróz, FMC), vagy 2%-os Nusieve-ben (FMC), vagy 0,75%-os agarózban tisztítjuk, a szakterületen közismert standard technikákat alkalmazva. A DNS-csíkokat etídium-bromiddal tesszük láthatóvá, majd a csíkokat borotvapengével kivágjuk a gélből. Az LGT-ből izolált fragmenteket közvetlenül LGT-ben ligáljuk. Az egyes kinyert DNS-fragmentekből tíz mikrolitert használunk a ligálási reakcióelegyek összeállításához, így kapunk egy körülbelül 23 μΐ-es végső reakció-térfogatot. Egy borotvapengével való kivágás után a kinyert gélcsíkokat, amelyek a keresett DNS-ffagmenteket tartalmazzák, megolvasztjuk, és IX ligáz puffer koncentrációt állítunk be, majd 3 egység T4 DNS ligázt adunk hozzá (Promega), az előzőkben leírt módon. A normális agarózból vagy Nusieve agarózból izolált fragmenteket megtisztítjuk az agaróztól, ultrafree-MC 0,45 pm-es szűrőegységeket használva (Millipore), majd a fragmenteket az előzőkben leírt módon ligáljuk. A ligálási reak15
HU 220 294 B ciókat szobahőmérsékleten inkubáljuk két óra hosszat, mielőtt fagyasztott kompetens Escherichia coli-sejtekbe transzformáljuk, standard eljárások alkalmazásával [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)].
Transzformációk
A DH5alfa- vagy HB101 lefagyasztott kompetens Escherichia coli-sejteket standard eljárások alapján készítjük el [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
2. ed. (1989)]. Az Escherichia coli „SURE” kompetens sejteket a Stratagene-től szerezzük be (La Jolla, CA). Az LGT agarózban végzett ligálásokhoz azután, hogy a ligálási reakciók teljesen lejátszódtak, 50 mmol/1 CaCl2-t adunk körülbelül 150 μΐ végtérfogatra, majd az oldatot körülbelül 65 °C-ra melegítjük körülbelül 10 percre, hogy az agarózt teljesen megolvasszuk. Az oldatot azután összekeverjük, és körülbelül 10 percre jégbe hűtjük, mielőtt hozzáadnánk körülbelül 200 μΐ kompetens sejthez, amelyet jégen megolvasztottunk. Ezt a keveréket 30 percig jégen inkubáljuk. A keveréket azután hővel sokkoljuk 42 °C-on 60 másodpercig, mielőtt két percre jégbe hűtenénk. Ezután 800 μΐ SOC táptalajt adunk hozzá (20% tripton, 0,5% élesztőkivonat, 10 mmol/1 NaCl, 2,5 mmol/1 KC1, pH = 8-ra állítva 5 mol/l-es NaOH, 20 mmol/1 MgCl2:MgSO4 elegy, 20 mmol/1 glükóz) [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)], majd a sejteket 37 °C-on rázatjuk körülbelül 1 óra hosszat, mielőtt szelektív táptalajra szélesztjük. A lemezek általában LB-agarból készülnek [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)], és 100 pg/ml ampicillint tartalmaznak.
Ha a ligálásokat agarózt nem tartalmazó oldatban végezzük, akkor általában 200 μΐ fagyasztott kompetens Escherichia coli-sejteket (DH5alfa (BRL, Gaithersburg, MF, vagy SURE sejtek, Stratagene, La Jolla, CA) olvasztunk meg jégen, és 5 μΐ ligáló elegyet adunk hozzájuk. A reakcióelegyet körülbelül 45-60 percig jégen inkubáljuk, majd hővel sokkoljuk (42 °C, körülbelül 90 másodperc). Miután szobahőmérsékleten körülbelül 90 másodpercig hagyjuk, hogy magukhoz térjenek, 800 μΐ SOC táptalajt adunk hozzá, és a sejteket 1 óra hosszat 37 °C-on rázatjuk, majd a fentiek szerint szélesztjük.
Ha olyan inszerteket keresünk, amelyek a béta-galaktozidázba épültek be, néhány standard vektort használunk, és a jó állapotú transzformációs keverékből 200 μΐ-t LB-agar lemezekre szélesztünk, amelyek 0,008% X-gal-t, 80 pmol/l IPTG-t és 100 pg/ml ampicillint tartalmaznak [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)]. A lemezeket 37 °C-on éjszakán át inkubáljuk, hogy lehetővé tegyük a szelekciót és a transzformánsok növekedését.
DNS minipreparálás
A szelektív táptalaj lemezeken kinőtt transzformánsokat elszaporítjuk, majd a plazmidok szerkezetét megvizsgáljuk, és megerősítjük, standard miniplazmidizolálási eljárást alkalmazva [Maniatis et. al., Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)]. Egy másik módszer szerint egy ammónium-acetátos eljárást használunk néhány esetben. Ez az eljárás módosítása annak, amit Shing-yi Lee és munkatársai közöltek [Biotechniques, 9, 676-679 (1990)].
1. Az éjszakán át inkubált szelekciós lemezről egyetlen baktériumtelepet 5 ml (egészen 1 ml-ig csökkenthető) TB táptalajba [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)] oltjuk, majd a megfelelő antibiotikum jelenlétében szaporítjuk.
2. Forgó kémcsőrázón szaporítjuk éjszakán át 37 °C-on.
3. 5 ml baktériumsejtet nyerünk ki egy műanyag Oakridge csőben, majd 5 percig 5000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk egy Sorvall SS-34 rotorban 4 °C-on.
4. Eltávolítjuk a felülúszót.
5. Az üledéket 1 ml lízis pufferben szuszpendáljuk (50 mmol/1 glükóz, 25 mmol/1 TRIS-HC1 pH=8,0, 10 mmol/1 EDTA és 5 mg/ml lizozim), 5 percig vortexeljük, majd szobahőmérsékleten tartjuk 5 percig.
6. 2 ml frissen készített lúgos oldatot adunk hozzá (0,2 mol/1 NaOH, 1% nátrium-dodecil-szulfát), szorosan lezáijuk, ötször fejre fordítva keverjük, majd a csövet 5 percre jeges vízfürdőbe tesszük.
7. 1,5 ml jéghideg 7,5 mol/1 ammónium-acetátot (pH=7,6) adunk hozzá, majd a csövet ötször fejre fordítva óvatosan megkeverjük, és 5 percre jeges vízfürdőbe tesszük.
8. A keveréket szobahőmérsékleten 5000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk 20 percig.
9. A tiszta felülúszót egy 15 ml-es Corex csőbe visszük át, majd 0,6 térfogatnyi izopropanolt adunk hozzá (körülbelül 2,5 ml). 10 percig hagyjuk szobahőmérsékleten állni.
10. A keveréket 10 percig 9000/perc fordulatszámmal szobahőmérsékleten centrifugáljuk, majd a felülúszót elöntjük.
11. Az üledéket 300 μΐ TE pufferben szuszpendáljuk. 6 μΐ RNáz A és TI törzsoldatot adunk hozzá (a törzsoldatot úgy készítjük, hogy 189 μΐ RNáz A oldatot [3254 E/mg fehérje, 5,6 mg fehérje/ml] és 20 μΐ RNáz TI oldatot [481 E/pg fehérje, 1,2 mg fehérje/ml] összeöntünk 200 μΐ végtérfogatra). Ezeket a törzsoldatokat az USB-től (US Biochemical) lehet vásárolni. Mikrocentrifügacsövekbe visszük át, majd 15 percig 37 °Con inkubáljuk.
12. 75 μΐ desztillált vizet és 100 μΐ 7,5 mol/1 koncentrációjú ammónium-acetátot adunk hozzá, és jeges vízfürdőben inkubáljuk 10 percig.
13. A keveréket 10 percig 4 °C-on centrifügáljuk 14 000/perc fordulatszámmal Beckman mikrocentrifügában.
14. Az oldat tartalmát kicsapjuk, 2,5 térfogatnyi 100%-os etanol hozzáadásával (körülbelül 1 ml), majd jeges vízfürdőben tartjuk 10 percig.
15.10 percig 14 000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk egy mikrocentrifugában.
HU 220 294 B
16. az üledéket 70%-os etanollal mossuk (0,5-1 mlt használva erre a célra). Az üledéket megszárítjuk, és 100 μΐ lXNew England Biolabs 4-es restrikciós enzim pufferben szuszpendáljuk (20 mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,9, 10 mmol/1 magnézium-acetát, 50 mmol/1 kálium-acetát, 1 mmol/1 DTT). Mérjük a koncentrációját és ellenőrizzük a tisztaságot 260 és 280 nm-en végzett spektrofotometriás méréssel.
Annak gyors meghatározására, hogy egy baktériumtelep tartalmaz-e rekombináns plazmidot, egy PCR miniszűrővizsgálatot végzünk, a Sandhu és munkatársai által kidolgozott eljárást módosítva [Sandhu et. al., BioTechniques, 2, 689-690 (1989)]. Röviden, az alábbi elegyet készítjük el:
100 μΐ fenti indítómolekula-keverék, 20-20 μιηοΐ az egyes indítómolekulákból,
100 μΐ dNTP keverék (2,5-2,5 mmol az egyes dNTP-kből),
100 μΐ 10X AmpliTaq puffer (Perkin-Elmer Cetus, IX puffer=10 mmol/1 TRIS-HC1 pH = 8,3, 50 mmol/1 KC1, 1,5 mmol/1 MgCl2 és 0,01% zselatin),
700 μΐ ionmentesített víz.
A fenti elegyből 20 μΐ-t egy 0,5 ml-es polipropilén
PCR csőbe teszünk. Egy transzformált baktériumtelepet fogpiszkálóval felveszünk, majd az elegyben centrifugáljuk. A csövet forrásban levő vízbe tesszük 10 percre, majd szobahőmérsékletre hűtjük, mielőtt 5 μΐ-t hozzáadnánk az alábbi elegyből:
265 μΐ ionmentesített víz, μΐ 10X Amplitaq puffer (Perkin-Elmer Cetus, IX puffer=10 mmol/1 TRIS-HC1 pH = 8,3, 50 mmol/1 KC1, 1,5 mmol/1 MgCl2 és 0,01% zselatin),
7,5 μΐ Taq polimeráz.
A mintákat 50 μΐ ásványolajjal rétegezzük le, majd a PCR-t 30 ciklusban hajtjuk végre, az alábbi paraméterekkel :
denaturálás: 94 °C 1 percig, illesztés: 55 °C 1 percig, kiterjesztés: 72 °C 45 másodpercig.
A PCR-es amplifikálás után 1 μΐ felvivőfestéket (30% glicerin, 0,25% brómfenolkék, 0,25% xiléncianol) adunk a teljes reakcióelegyhez, és a keverék 20 μΐét egy 2%-os Nusieve, 1% agarózgélre visszük, hogy lássuk, van-e a várt méretű PCR termék.
Ezt az eljárást kezdeti szűrővizsgálatként alkalmazzuk. A minipreparátumokat ezután készítjük el, annak igazolására szekvenálás előtt, hogy a plazmid és az inszert a megfelelő szerkezettel rendelkezik.
2. példa
Az egyes negyedek amplifikálása és összeállítása
A szintetikus Bt cryIA(b) fragmentjeinek klónozása
A szintetikus gént úgy terveztük meg, hogy négy darabban lehessen klónozni, mindegyik durván a gén egynegyede legyen. Az egyes negyedek oligomerjeit egyesítjük, hogy PCR-rel vagy hibridizálással összeállíthassuk, illetve a hibridizálást az utána következő PCR amplifikálással kombinálva, amint az máshol le van írva.
A szintetikus negyedeket egymáshoz illesztjük, átfedő AatlI, Ncol és Apa restrikciós felismerési helyeket alkalmazva az 1. és 2., a 2. és 3., valamint a 3. és 4. negyed között.
A gén mindegyik negyedét (körülbelül 500 bp méretűek) úgy állítjuk össze, hogy a megfelelő oligomereket hibridizáltatjuk, és a keresett ffagmenteket amplifikáljuk, az adott negyed végeire specifikus PCR indítómolekulák alkalmazásával. Két különböző PCR reakciót alkalmazunk, amelyekben két különböző, egymástól kismértékben eltérő indítómolekulákat használunk. A két reakció PCR termékeit úgy terveztük meg, hogy azonosak legyenek, azzal az eltéréssel, hogy az első reakcióban egy további AAT szekvencia található a kódolórégió 5’-végén, és a második reakcióban egy AGCT szekvencia található egy adott negyed 3’-végén. Ha egy adott negyednek a két reakciótermékeit összekeverjük (a polimeráz, az indítómolekulák és a nem komplett termékek eltávolítása után), denaturáljuk, majd ezt követően újra illesztjük, az illesztett termékeknek egy bizonyos arányban (elméletileg 50%-ban) nem homológ túllógó végekkel kell rendelkezniük. Ezeket a végeket úgy terveztük meg, hogy feleljenek meg a molekula 5’végén az EcoRI, a molekula 3’-végén a HindlII restrikciós enzimekkel végzett hasítás után kapott ragadós végeknek feleljenek meg. A keletkező molekulákat foszforilezzük, ligáljuk egy EcoRI/HindlII restrikciós enzimekkel emésztett és foszfatázozott Bluescript vektorba, majd fagyasztott kompetens Escherichia coli DH5alfa-sejtekbe transzformáljuk. A szelekció után a keresett ffagmentet tartalmazó Escherichia coli-telepeket a DNS restrikciós enzimes emésztésével kapott mintázat alapján azonosítjuk. A szintetikus gén részeit képviselő inszerteket ezt követően tisztítjuk és szekvenáljuk, standard eljárások alkalmazásával. Mindegyik esetben többszörös PCR reakciókból származó kiónokat hozunk létre és szekvenálunk. A negyedeket azután egymáshoz kapcsoljuk, a kapcsolódási pontoknál kialakított egyedi restrikciós felismerési helyek alapján, a teljes gén összerakása céljából.
A klónozott negyedeket mini-szűrővizsgálati eljárással azonosítjuk, és a génfragmentet szekvenáljuk. Azt találtuk, hogy gyakran kerülnek hibák a szekvenciába, a legvalószínűbb, hogy a PCR amplifikációs lépésben. Ahhoz, hogy azokban a kiónokban, amelyek csak néhány ilyen hibát tartalmaznak, kijavítsuk ezeket a hibákat, hibridizálódó oligomereket használunk. A hibridizálódó fragmenteket a ffagmenten belüli restrikciósenzim-felismerési helyeknél emésztjük, majd klónozzuk, hogy a szintetikus génben helyettesítsük a mutált régiót. A hibridizálódó fragmentek hosszúsága 90 bptől (azaz az a régió, amely a 2. negyedben a SacII hasítási helyek közötti fragmentet helyettesíti körülbelül 350 bp-ig terjed, amely a 4. negyedben két PCR által indukált mutációt javít ki.
A PCR magas hibaszázaléka miatt egy olyan plazmidot tervezünk és hozunk létre, amely lehetővé teszi, hogy olyan klónozott génfragmentet szelektáljunk, amely egy nyitott leolvasási keretet tartalmaz. Ezt a plazmidot azon az alapon tervezzük meg, hogy ha a
HU 220 294 Β klónozási helyre egy nyitott leolvasási keretet építünk be, akkor a baktérium képes kanamicin jelenlétében növekedni. Ennek a vektornak a készítését az alábbiakban ismertetjük. Ez a szelekciós rendszer nagyon felgyorsítja a haladást, azáltal, hogy lehetővé teszi, 5 hogy olyan kiónokat azonosítsunk, amelyek nyitott leolvasási keretet tartalmaznak, anélkül, hogy nagyszámú független kiónt kellene szekvenálnunk. A szintetikus negyedeket különböző plazmidokban állítjuk össze, beleértve a BSSK-t (Stratagene; La Jolla, 10 CA), a pUC18-at [Maniatis et. al., Molecular Cloning,
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)], valamint a Km expressziós vektort. Más megfelelő plazmidok, beleértve a pUC-alapú plazmidokat, ismertek a szakterületen, és szintén hasz- 15 nálhatók. A klónozott ffagmentek teljes szekvenálása, a klónozott gén termékének Westem-blot elemzése, és a rovarbiológiai vizsgálatok, amelyekhez tesztrovarként európai magfurót használunk, igazolják, hogy teljesen működőképes szintetikus Bt crylA(b) géneket kaptunk.
A nyitott leolvasási keret szelektálására alkalmas Km expressziós vektor készítése
A Km expressziós vektort azon az alapon terveztük meg, hogy a szintetikus génnek olyan fragmentjeit szelektáljuk, amelyek nyitott leolvasási kereteket tartalmaznak. Olyan PCR oligomereket terveztünk, amelyek lehetővé teszik a Tn5-ből származó NPTII gén fúzióját a 13-as nukleotidtól kezdve [Reiss et. al., EMBO J., 3, 3317-3322 (1984)] a pUC18 plazmiddal, és ezáltal hasznos restrikciós hasítási helyeket juttassunk be a DNS-szegmentek közé. A polilinker régió olyan restrikciós hasítási helyeket tartalmaz, amelyek lehetővé teszik különböző szintetikus Bt IP ffagmentek klónozását a Km génnel leolvasási keretben. A polilinker régiót tartalmazó 88 bp méretű 5’-oligomert 6%-os poliakrilamid-gélen tisztítjuk az előzőkben a PAGE oligomerre ismertetett módon. PCR reakciót állítunk össze egy 1 kb méretű BglII/Smal templát fragmenttel, amely a Tn5-ből származó NPTII gént tartalmazza. A PCR reakciókeverék 100 ng templátot tartalmaz, valamint 100-100 pmolt a KE72A28 és KE74A28 oligomerek20 bői (a szekvenciákat lásd alább), 200 nmol dNTP-t és
2,5 egység Taq polimerázt, 50 μΐ végtérfogatban, azonos térfogatú ásványolajjal lerétegezve. Az indítómolekulák szekvenciája az alábbi :
KE74A28
5’-GCAGATCTGG ATCCATGCAC GCCGTGAAGG GCCCTTCTAG AAGGCCTATC GATAAAGAGC TCCCCGGGGA TGGATTGCAC GCAGGTTC-3’
KE72A28
5’-GCGTTAACAT GTCGACTCAG AAGAACTCGT CAAGAAGGCG-3’
Az alkalmazott PCR paraméterek.: 94 °C 45 másodpercig, 55 °C 45 másodpercig és 72 °C 55 másodpercig, a 3. lépésben 3 másodperces hosszabbítással 20 cikluson keresztül. Az összes PCR reakciót egy Perkin- 35 Elmer Cetus PCR berendezésben hajtjuk végre. Az amplifikált PCR termék 800 bp méretű, és tartalmazza a polilinker régiót egy transzlációs kezdőponttal, amelyet egyedi restrikciós hasítási helyek követnek, leolvasási keretben fuzionáltatva a Km génnel, a #13-as bázistól a 40 transzlációs terminációs részen átfutva. A pUC:KM74 az az expressziós kazetta, amelyet a pUC18 vektorba klónozott 800 bp méretű BglII/Sall polilinker/Km fragmentből állítunk össze. A lacZ promoter lehetővé teszi, hogy a Km gén Escherichia coliban expresszálód- 45 jón. A pUC:KM74 származékokat először LB-agar lemezekre kell széleszteni, amelyek 100 pg/ml ampicillint tartalmaznak, hogy azokat a transzformánsokat szelektáljuk, amelyeket a következőkben át lehet vizsgálni 25 pg/ml kanamicin/IPTG tartalmú LB-agar lemezeken. 50 A szintetikus Bt IP génlfagmenteket a Km kazettában állítjuk össze, hogy igazoljuk azt, hogy egy nyitott leolvasási keretet tartalmazó fragmentdarabokat klónoztunk. Az első ECB aktív szintetikus Bt IP fragment, a pBt:Km#6 egy Bt IP gén, amely Km-rezisztenciát mutat. Erről a fragmentről a későbbiekben kiderült, hogy a
3. és 4. negyedben mutációkat tartalmaz, amelyeket azután kijavítottunk.
2A. példa
A szintetikus gén első negyedének (1-550 bázispár) szintézise és klónozása
Az alábbi eljárást alkalmazzuk azzal a céllal, hogy a szintetikus Bt cryIA(b) gént kódoló szintetikus DNSszekvencia első negyedét klónozzuk. Lényegében ugyanazt az eljárást használjuk a szintézisre és a klónozásra, mint a többi negyedeknél, kivéve az indítómolekulákban és a restrikciós hasítási helyekben végrehajtott változtatásokat.
Templát az 1. negyedhez: Az azonos mennyiségű tisztított U1-U7 és L1-L7 oligomerek keveréke
PCR indítómolekulák:
Előre:
Pl (a): 5’-GTCGACAAGG ATCCAACAAT GG-3’
Pl (b): 5 ’-AATTGTCGAC AAGGATCCAA CAATGG-3’
Fordított:
P2 (a): 5’-ACACGCTGAC GTCGCGCAGC ACG-3’
P2 (b): 5’-AGCTACACGC TGACGTCGCG CAG-3’
HU 220 294 B
A1 indítómolekula-pár: Pl(b) + P2(a)
A2 indítómolekula-pár: P2(a) + P2(b)
A kukoricára optimalizált szintetikus Bt IP gén első negyedét tartalmazó oligomereket tartalmazó PCR reakciót az alábbiak szerint állítjuk össze: 5
200 ng oligokeverék (a negyed összes oligóját súlyra számítva azonos mennyiségben összekeverjük) pl indítómolekula-keverék (1:1 keverék, mindegyik 20 pmol; az indítómolekulákat az előzőekben ismertettük) 10 μΐ 10X PCRpuffer
A használt PCR puffer lehet az alábbi:
(a) IX koncentráció=10 mmol/1 KC1, 10 mmol/1 (NH4)22SO4, 20 mmol/1 TRIS-HC1 pH=8,0, 2 mmol/1 MgSO4, és 0,1% Triton X-100, illetve 15 (b) IX koncentráció=10 mmol/1 TRIS-HC1 pH=8,3, 50 mmol/1 K.C1, 1,5 mmol/1 MgCl2, 0,01 tömeg/térf. % zselatin.
A komponenseket összekeverjük, forrásban levő vízfürdőben tartjuk 5 percig, majd 10 percig 65 °C-on 20 inkubáljuk.
Ezután a következő reagenseket adjuk hozzá:
μΐ dNTP elegyet (a reakcióban a végkoncentráció 0,2-0,2 mmol/1), egység polimeráz.
A reakció végtérfogata 50 pl.
Az oligomereket azután 3 percig 72 °C-on inkubáljuk, majd egy PCR ciklust lefuttatunk. A PCR reakciót egy Perkis Elmer PCR berendezésben végezzük, az alábbi paraméterek szerint:
denaturálási ciklus: 94 °C 1 percig, illesztési ciklus: 60 °C 1 percig, hosszabbítási ciklus: 72 °C 45 másodpercig, (+3 másodperc ciklusonként) ciklusok száma: 15.
Miután a reakció teljesen lejátszódott, a PCR reakcióelegyből 10 pl-t egy 2% Nusieve-GTG (FMC), 1% agaróz analitikai gélre viszünk, a reakció ellenőrzése céljából. A megmaradt 40 pl-t használjuk a génffagmentek klónozására, az alábbiak szerint.
PCR termékek
A különböző indítómolekula-pároknak megfelelő kétszálú PCR termék végeit mutatjuk be (csak felső szál):
Al AATTGTCGAC. A2 GTCGAC.
GCGTGT (554 bp) első negyed
GCGTGTAGCT (554 bp) első negyed
Hibridizálás
A fentiekben ismertetett PCR reakciókból 40 pl-t tisztítunk, chromaspin 400 oszlop alkalmazásával (Clonetech, Palo Alto, CA), a gyártó előírásainak alapján. Mielőtt az oszlopra visszük, öt pg hordozó-DNS-t adunk a reakciókhoz. (A legtöbb klónozásnál ezt tesszük. Néhány reakciónál azonban a PCR reakcióelegyet fenol:kloroform reakcióeleggyel extraháljuk, standard eljárások alapján [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)], hogy eltávolítsuk a Taq polimerázt, és a PCR eljárásban keletkező DNS-t kinyerjük a vizes fázisból, standard etanolos kicsapással). A hordozó-DNS nem eluálódik a PCR-ben keletkező fragmentekkel. Az egyes negyedeknek megfelelő Al és A2 partnereket összekeverjük, forrásban levő vízfürdőben tartjuk 10 percig, majd éjszakán át 65 °C-on inkubáljuk. A reakcióelegyeket azután eltávolítjuk a 65 °Cos fürdőből, és etanollal kicsapjuk, 1 μΐ (20pg) nukleázmentes glikogént használva hordozóként [Tracy, Prep. Biochem., 11, 251-268 (1981)]. Az üledéket 40 μΐ ionmentes vízben oldjuk.
Foszforilezési reakció
A foszforilezési reakciót az alábbiak szerint végezzük:
pl DNS,
2,5 μΐ 20 mmol/1 ATP,
0,5 μΐ 10X BSA/DTT (1X = 5 mmol/1 DTT, 0,5 mg/ml BSA),
1,0 μΐ 10X polinukleotid-kináz puffer (1X=7O mmol/1, TRIS-HC1 pH = 7,6, 0,1 mol/1 KC1,10 mmol/1 MgCl2),
2,0 μΐ polinukleotid kináz (New England Biolabs, 20 egység).
Az inkubálást két óra hosszat 37 °C-on végezzük.
A reakcióelegyet azután egyszer extraháljuk 1:1 arányú fenol: kloroform eleggyel, majd egyszer kloroformmal, és a vizes fázist etanollal kicsapjuk, standard eljárásokat alkalmazva. Az üledéket 10 μΐ TE-ben szuszpendáljuk.
Restrikciós emésztés
20 pg Bluescript vektor (BSSK+, Stratagene, La Jolla, CA),
10 pl 10X restrikciós puffer (1X=2O mmol/1, TRIS-HC1 pH=8,0, 10 mmol/1 MgCl2, 100 mmol/1 NaCl),
5 pl EcoRI (New England Biolabs) 100 egység,
5 pl HindlII (New England Biolabs) 100 egység.
A reakció végtérfogata 100 pl.
Az inkubálást 3 óráig 37 °C-on végezzük.
Ha az emésztés teljesen lejátszódott, akkor azonos térfogatú, TE-vel (10 mmol/1 TRIS-HC1 pH = 8, 10 mmol/1 EDTA) telített fenollal extraháljuk. Centrifugálás után a vizes fázist azonos térfogatú, TE-vel (10 mmol/1 TRIS-HC1 pH=8, 10 mmol/1 EDTA) telített fenollal extraháljuk (a „kloroform” jelentése kloroform : izoamil-alkohol 24:1 arányú elegye), majd végezetül az ebből az extrakcióból származó vizes fázist azonos térfogatú kloroformmal extraháljuk. A végső vizes fázist etanollal kicsapjuk (10 μΐ 3 mol/1 koncentrációjú nátrium-acetát és 250 μΐ abszolút etanol hozzáadásával), majd 10 percig 4 °C-on hagyjuk állni, és mikrocentrifugában maximális sebességgel 10 percig centrifugáljuk. Az üledéket 70%-os etanollal öblítjük, majd szobahőmérsékleten szárítjuk 5-10 percig, és 100 μΐ TRIS-HCl-ben (pH=8,3) oldjuk.
HU 220 294 B
Foszfatázreakciö
A vektor DNS-t rutinszerűen kezeljük foszfatázzal, hogy csökkentsük azoknak a telepeknek a számát, amelyek nem tartalmaznak inszertet. Általában boíjúbél alkalikus foszfatázt használunk [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)], de más foszfatáz enzim is használható ebben a lépésben.
A tipikus foszfatázreakciót az alábbiak szerint állítjuk össze:
pl, az előzőkben ismertetett, emésztett DNS, pl 10X borjúbél alkalikus foszfatáz puffer (1X=5O mmol/1, TRIS-HC1 (pH=8,3), 10 mmol/1 MgCl2, 1 mmol/1 ZnCl2, 10 mmol/1 spermidin, pl (1 egység) borjúbél alkalikus foszfatáz (CIP, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN).
Az inkubálást 37 °C-on végezzük 1 óra hosszat.
A DNS-t azután gélen tisztítjuk (1%-os alacsony olvadáspontú (LGT) agarózgélen), majd az üledéket 50 pl TE-ben szuszpendáljuk. Az elektroforézis után a megfelelő csíkot borotvapengével kivágjuk a gélből, percig 65 °C-on megolvasztjuk, majd 1:1 arányban TE-vel hígítjuk. Ezt az oldatot kétszer extraháljuk fenol- ; lal, egyszer azonos térfogatú TE-vel (10 mmol/1 TRIS-HC1 pH=8,10 mmol/1 EDTA) telített fenollal (a „kloroform” jelentése kloroform :izoamil-alkohol 24:1 arányú elegye), majd végezetül az ebből az extrakcióból származó vizes fázist azonos térfogatú kloroform- I mai extraháljuk. A végső vizes fázist etanollal kicsapjuk és TE pufferben oldjuk.
Ligálás
Ahhoz, hogy a szintetikus gén ffagmentjeit vektorokba Egáljuk, általában az alábbi körülményeket állít- : juk be:
pl foszforilezett inszert DNS, pl foszfatázozott EcoRI/HindlII restrikciós enzimekkel emésztett Bluescript vektor, percre 65 °C-ra melegítve, majd vissza- hűtve, pl 10X ligáz puffer (IX puffer=30 mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,8, 10 mmol/1 MgCl2, mmol/1 DTT, 1 mmol/1 ATP), pl BSA (1 mg/ml), <
pl ligáz (3 egység, Promega, Madison,
Wisc.).
A ligázreakciókat általában 16 °C-on inkubáljuk éjszakán át, illetve szobahőmérsékleten két óra hoszszat. !
Transzformáció
A ligáit DNS-fragmentek Escherichia coliba való transzformációját standard eljárásokkal hajtjuk végre f
PGR indítómolekulák: előre
P3 (a): 5’-GCTGCGCGAC P3 (b): 5’-AATTGCTGCG [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)], az előzőkben ismertetettek szerint.
A rekombinánsok azonosítása
Az éjszakán át inkubált transzformációs lemezekről fehér vagy világoskék telepeket választunk ki. Az ezekben a transzformánsokban levő plazmidokat standard miniprep. eljárással vizsgáljuk át [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)], illetve az előzőkben leírtak szerint. Az alábbiakban felsorolt eljárások közül alkalmazzuk az egyiket:
1. forralásos DNS miniprep. módszer
2. PCR minivizsgálat
3. Ammónium-acetátos miniprep. módszer
Azoknak a plazmidoknak a restrikciós emésztését, amelyekről feltételezzük, hogy az első negyedet tartalmazzák, az alábbiak szerint hajtjuk végre:
(a) BamHI/AatlI emésztés : 10 pl DNS + 10 pl IX New England Biolabs 4-es restrikciós enzim puffer,
0,5 pl BamHI (1 egység),
0,5 pl AatlI (5 egység).
Az inkubálást körülbelül két óra hosszat végezzük 37 °C-on.
Azokat a kiónokat, amelyekről kiderült, hogy a számunkra megfelelő restrikciós mintázattal rendelkeznek, ezek után PvuII és BglI restrikciós enzimekkel emésztjük, két külön reakcióban. Csak azokat a kiónokat visszük tovább a szekvenálásra, amelyek mindhárom enzimes emésztéssel a számunkra megfelelő restrikciós mintázatot adták.
A klónozott génfragmentek szekvenálása
A szekvenálást a Sanger-féle didezoxi-láncterminációs módszer módosításával végezzük [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)], kétszálú DNS-t használva a Sequenase 2 kittel (United States Biochemical Corp., Cleveland, OH). Összesen hat első negyedbe tartozó kiónt szekvenáltunk. A szekvenált kiónok közül csak két kiónról derült ki, hogy csak egyegy deléciót tartalmaznak, ezek jele pQAl és pQA5. Ezeknek a delécióknak a mérete egy-egy bázis a pQAl-ben a 452-es pozícióban, és a pQA5-ben a 297es pozícióban.
A pQAl plazmidot használjuk a pPl -8-cal (az alábbiakban ismertetjük), hogy megkapjuk az első negyedet a várt szekvenciával.
2. példa
A második negyed szintézise és klónozása (531-1050-es bázispárok)
Templát: az U8-U14 és L8-L14 oligomerek
GTCAGCGTGT TCGG-3’ CGACGTCAGC GTG-3’
HU 220 294 B fordított
P4 (a): 5’-GGCGTTGCCC ATGGTGCGT ACAGG-3’ P4 (b): 5’-AGCTGGCGT TGCCCATGGT GCCG-3’
B1 indítómolekula-pár: P3(b) + P4(a)
B2 indítómolekula-pár: P3(a) + P4(b)
PCR termékek B1 AATTGCTGCG_ B2 GCTGCG
A hibridizációt, PCR amplifíkálást, forgatott oszloppal való méretfrakcionálást, és a gén EcoRI/HindlII enzimmel emésztett Bluescript plazmidba való klónozását az előzőekben az első negyedre leírt módon végezzük (2A. példa). Ennek a negyednek a PCR terméke körülbelül 529 bp méretű, és a gén második negyedét jelenti (531-1050-es nukleotidok). A transzformálást kompetens fagyasztott Escherichia coli-sejtekbe végezzük, az előzőkben ismertetett standard eljárások alkalmazásával [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)].
A pQB klánok miniméretű vizsgálata
Miniprep. DNS-t készítünk az előzőkben ismertetett módszerrel, majd emésztjük (a) AatlI/NcoI, (b) PvuII és (c) BglI restrikciós enzimekkel, hogy igazoljuk a vektorban levő inszertnek a szerkezetét, mielőtt szekvenáljuk.
A szekvenálást az előzőekben ismertetett módszenei végezzük, a Sanger-féle didezoxi eljárással [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)].
Ebből a negyedből összesen tizenhárom kiónt szekvenáltunk. A második negyedben következetesen előfordul egy vagy több deléció a 884-es és 887-es pozíciók között. A legtöbb esetben a 884-es pozícióban levő G hiányzik.
A pQB5 plazmidban egyetlen deléció van a 884-es pozícióban. Ez a régió két SacII hasítási hely között található (a 859-es és 849-es pozíciók között). Ennek a deléciónak a kijavítását a 3. példában újuk le.
Az első fél (1-1050 bp) klónozása
A szintetikus Bt kukoricagén első felének (az 1. és 2. negyed) klónozásához szükséges fragmentet egyetlen DNS-ffagment formájában úgy kapjuk meg, hogy egy olyan PCR reakció termékét, amely az első negyedet és a második negyedet tartalmazza, restrikciós enzimmel emésztjük. Az AatlI restrikciós endonukleázt használjuk a DNS hasítására (fenolos extrakciót és etanolos kicsapást követően) egy 20 μΐ-es reakcióelegyPCR indítómolekulák:
előre _AACGCC (524 bp) második negyed
AACGCCAGCT (524 bp) ben. Az AatlI-vel emésztett egyes negyedekből 15-15 μΐ-t elegyítünk, majd Egáljuk (50 μΐ-es végtérfogatban, 5 μΐ 10X ligáz puffer (1X=3O mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,8, 10 mmol/1 MgCl2, 10 mmol/1 DTT, 1 mmol/1 ATP), 14 μΐ ionmentes víz és 1 μΐ T4 DNS ligáz (3 egység, Promega, Madison, WI)) 2 óra hosszat szobahőmérsékleten. Ennek eredménye egy körülbelül 1 kb méretű ffagment, amelynek méretét gélelektroforézis alapján becsüljük meg, 1%-os gélen standard körülmények között futtatva [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)]. A ligálási termékből 10 μΐ-t PCR-rel amplifikálunk, az előzőkben ismertetett körülményeket alkalmazva, azzal a különbséggel, hogy csak 5 ciklust futtatunk le. Indítómolekula-pár: HA=Pl(a) + P4(b)
Indítómolekula-pár: HB=Pl(b) + P4(a)
Ezeknek a reakcióknak a termékeit Bluescriptbe klónozzuk (stratagene, La Jolla, CA), amint azt az egyes negyedekre leírtuk. Ezt az eljárást csak egyszer végezzük el, azaz egy adott régióhoz az összes inszert DNS-t egyetlen PCR reakcióból kapjuk meg.
Harminchat telepet vizsgálunk át minimódszerrel, Sáli és PvuII emésztéseket alkalmazva. Négy kivételével mindegyik tartalmazott egy körülbelül 1 kb méretű inszertet, amelyek közül legalább 20 a megfelelő restrikciós emésztési mintázattal rendelkezik. Ezek közül nyolc telepet választunk ki szekvenciaelemzés céljából. A kiónok közül az egyik, a Pl-8 a számunkra megfelelő szekvenciával rendelkezik az EcoNI hasítási hely (396 bp) és a Drall hasítási hely (640 bp) között. Ezt a kiónt használjuk egy, a második negyedben a DralII hasítási helyig (640 bp) a számunkra megfelelő szekvenciával rendelkező plazmid előállítására a pQAl-gyel (az első negyed, deléció a 452-es pozícióban, az előzőkben ismertettük).
2C. példa
A harmadik negyed klónozása és szintézise (az
1021-1500 bázispárok között)
Templát: az U15-U20 és L15-L21 oligók
P5 (a): 5’-TTCCCCCTGT ACGGCACCAT GGGCAACGCC GC-3’ P5 (b): 5’-AATTGTACGG CACCATGGGC AAC-3’ fordított
P6 (a): 5’-GAAGCCGGGG CCCTTCACCA CGCTGG-3’
P6 (b): 5’-AGCTGAAGCC GGGGCCCTTC ACC-3’
HU 220 294 B
Cl indítómolekula-pár: P5(b) + P6(a)
C2 indítómolekula-pár: P5(a) + P6(b)
PCR termék:
Cl AATTGTACGG_
C2 TTCCCCTGTACGG.
.GGCTTC (475 bp) 3. negyed
GGCTTCAGCT (484 bp) 3. negyed
A PCR reakciókat, a megfelelő méretű fragment forgatottoszlopon való kinyerését, valamint a vektorba való ligálást az előzőekben leírt módon hajtjuk végre (2A. példa), EcoRI és HindlII restrikciós enzimekkel hasított Bluescript vektort használva. A hozzávetőleg 479 bázispár méretű PCR termék a szintetikus gén harmadik negyedét képviseli (1021-1500 nukleotidok).
A fagyasztott kompetens Escherichia coli DH5alfasejtekbe való transzformációt, a transzformánsok sze- 15 lektálását és azonosítását, a transzformánsok minieljárásokkal való jellemzését, és a vektorban levő szintetikus génfragment szekvenálását az előzőekben már ismertettük.
A PQC klánok
A harmadik negyedet minieljárással vizsgáljuk át, standard módszereket alkalmazva [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)]. A miniprep. DNS-t (a) Ncol/Apal és (b) PvuII restrikciós enzimek- 25 kel hasítjuk. A megfelelő restrikciós emésztési mintázattal rendelkező kiónokat standard eljárással szekvenáljuk. A harmadik negyedből összesen 22 kiónt szekvenálunk. A harmadik negyedben három fő deléciós „forró pont„-ot azonosítottunk (a) az 1083-as pozíció- 30 bán (b) az 1290-1397-es pozíciók között és (c) az 1356-1362-es pozíciók között. Az összes kiónban, az egy pQC8 kivételével, következetesen megtalálható egy C inszerció is az 1365-ös pozícióban. Ezek mellett a mutációk mellett a harmadik negyed kiónjai nagyszá- 35 mű más, véletlenszerű deléciót is tartalmaznak. A harmadik negyedben található három mutációs „forró pont”, és a második negyedben található egy mutációs „forró pont” közös tulajdonsága az, hogy ezeket a régiókat mindkét oldalukon körülbelül 80%-os G+C tar- 40 talmú szekvenciák határolják. Más, 5-9 C-G-t tartalmazó régiók nincsenek érintve. Az U15, U16, U18, U19,
L15, L16, L18 és L19 oligomereket újra terveztük, hogy csökkentsük a G+C tartalmat ezekben a régiókban. A módosított oligomerekkel végrehajtott PCR reakciókból származó öt-öt kiónt szekvenáltunk.
A pQCN103 plazmid a megfelelő szekvenciával rendelkezik a harmadik negyedben, az 1326-os pozícióban található változás kivételével. Ez a változás, ami azt jelenti, hogy egy G C-re van kicserélve, azt eredmé- 50 nyezi, hogy egy leucin helyettesíti az eredeti aminosavat (fenilalanin).
2D. példa
A negyedik negyed szintézise és klónozása 55 (1480-1960-as bázispárok)
A gén negyedik negyedét egy olyan kiónból kapjuk, amelyet eredetileg azzal a céllal terveztünk, hogy a gén harmadik és negyedik negyedét tartalmazza. A szinteti10 kus gén „második felét” PCR reakciókból nyerjük, amelyeket azzal a céllal terveztünk, hogy fuzionálják a harmadik és negyedik negyedet. Ezeket a reakciókat az előzőkben a harmadik negyedhez leírt P5(a) és P6(a) PCR indítómolekulákkal, és az alábbiakban ismertetendő P7(a) és P8(a) indítómolekulákkal végezzük el. A fordított indítómolekulát módosítjuk, hogy tartalmazzon egy SacI hasítási helyet és egy terminációs kodont. Az egyes negyedeknél végzett külön reakciókat 30 ciklusban futtatjuk, az előzőkben ismertetett körülményeket alkalmazva. A két negyedet átfedő PCR-rel összekapcsoljuk, majd Ncol és SacI restrikciós enzimekkel emésztjük. A keletkező 953 bp méretű fragmentet irányítva klónozzuk a pCIB3054 vektorba, amelyet NcoI/SacI restrikciós enzimekkel emésztettünk és alkalikus foszfatázzal kezeltünk.
A pCIB3054 plazmidot úgy állítjuk elő, hogy a PEPkarboxiláz #9 intronját (PÉP ivs #9) beillesztjük a pCIB246 egyedi Hpal hasítási helyére (részletes ismertetés a 4. példában). A pCIB246-ot Hpal restrikciós enzimmel hasítjuk, majd CIP-pel foszfatázozzuk, a 2A. példában ismertetett standard eljárások alkalmazásával. A PEPC ivs #9-et PCR-rel kapjuk meg, templátként a ρΡΕΡ-10-et alkalmazva. A pPEP-10 egy genomiális szubklón, amely a teljes kukorica PEP-karboxiláz gént tartalmazza, amely viszont a C4 fotoszintetikus enzimet kódolja, plusz körülbelül 2,2 kb-t az 5’ határoló és 1,8 kb-t a 3’ határoló DNS-ből. A 10 kb méretű DNS-t a pUC18 HindlII hasítási helyére klónozzuk [Hudspeth et. al., Plánt Molecular Biology, 12, 576-589 (1989)]. A PEPCivs#9 előállításánál használt előre PCR indítómolekula a GTACAAAAACCAGCAACTC, a fordított indítómolekula pedig a CTGCACAAAGTGGAGTAGT. A PCR termék egy 108 bp méretű fragment, amely csak a PEP-karboxiláz #9 intronjának a szekvenciáját tartal45 mázzá. A PCR reakciót fenollal és kloroformmal extraháljuk, etanollal kicsapjuk, polinukleotid-kinázzal foszforilezzük, majd T4 polimerázzal kezeljük, hogy feltöltsük a PCR termékekben található nem templát alapon hozzáadott bázisokat [Clark, J. M., Nucleic Acids Research, 16, 9677-9686 (1988)], standard eljárások alkalmazásával. A kinázolt fragmentet tompa végűvé alakítjuk, majd a pCIB246 Hpal hasítási helyére klónozzuk, az előzőkben ismertetett standard eljárások alkalmazásával.
A negyedik negyed amplifikálása és összeállítása Templát: U21-U26 és L22-L28
PCR indítómolekulák
Előre
P7 (a): 5’-TGGTGAAGGG CCCCGGCTTC ACCGG-3’
HU 220 294 B
Fordított
P8 (a): 5’-ATCATCGATG AGCTCCTACA CCTGATCGAT GTGGTA-3’
4-es indítómolekula-pár: P7(a) + P8(a)
3-as indítómolekula-pár: P5(a) + P6(a)
Indítómolekula-pár az átlapoló PCR-hez: P7(a) + P8(a)
PCR termek negyedik negyed: GGTGAA_ATCAGGAGCTCATCGATGAT (484 bp) harmadik negyed: YYCCCCCTGTA_TTCACCGG (484 bp) második fél: GGTGAA_CATGATGAT (953 bp)
Négy pozitív kiónt lehet azonosítani plazmid minivizsgálattal, majd ezt követően szekvenáljuk őket, standard eljárások alkalmazásával. 15
A PtP2 #1 plazmid hozzávetőlegesen a helyes negyedik negyed szekvenciát tartalmazza, két mutáció kivételével. Ezek a mutációk az 1523-as pozícióban (egy A helyettesít egy G-t, ennek eredménye egy aminosavcsere, amelynél egy His helyettesít egy Arg-ot), illetve 20 az 1634-es pozícióban találhatók (egy T helyettesít egy C-t, aminek eredménye az, hogy egy Ser aminosav helyettesít egy Thr-t).
A BtP2 #1 plazmidot használjuk az alábbiakban ismertetendő pCIB4414 plazmid készítésében. (A hibá- 25 kát kijavítjuk, a negyedik negyed összes oligóját hibridizáltatva, Apal/BstI restrikciós enzimekkel emésztve, és ezt a régiót a pCIB4414-ben helyettesítve. Ennek következtében csak az 1842-1960-as pozíciók közötti szekvenciák maradnak BtP2 #1 eredetűek a végső konstruk- 30 cióban.)
3. példa
A végső szintetikus gén összeállítása és kijavítása
A szintetikus, kukoricára optimalizált Bt crylA(b) 35 gént úgy terveztük meg, hogy negyedekben klónozzuk.
A PCR technika alkalmazásával azonban mutációk jönnek létre, amelyek a legtöbb esetben deléciók, ezért kereteltolódási mutációkat okoznak. Ezért az egyes negyedeket tartalmazó plazmidokat szekvenáljuk, és a he- 40 lyes részeket Egáljuk egymáshoz standard eljárások alkalmazásával.
A majdnem pontos szekvenciával rendelkező első és második negyed kiónok előállítása után a pEBlQ#4 és a pEBlQ#5 plazmidokat készítjük el, hogy megkapjuk a 45 szintetikus Bt gén keresett szekvenciáját egészen a DralII hasítási helyig, a 634-es bázispár-pozícióban (ez a mutáció elrontja a DralII hasítási helyet). A pEBlQ konstrukciókat úgy állítjuk elő, hogy a pPl-8 plazmidból származó 3,9 kb méretű EcoNI/BamHI fragmentet a 50 pQAl-ből származó 400 bp méretű ffagmenttel Egálunk össze. A pEBlQ#5 a keresett szekvenciával rendelkezik egészen a DralII hasítási helyig, de a pEBlQ#4-ben van egy mutáció a 378-as bázispámál.
A plHlM4 és a plHlM5 plazmidokat úgy állítjuk 55 elő, hogy helyreállítsuk a DralII hasítási helyet a pEBlQ#4-ben és a pEBlQ#5-ben. A plHlM#4 és #5 plazmidokat úgy állítjuk elő, hogy a pEBlQ#4-ből, illetve #5-ből egy 3,5 kb méretű NcoI/AatlI fragmentet Egálunk össze a pQB5-ből származó 500 bp méretű 60
NcoI/AatlI ffagmenttel. A plHlM5 plazmid egy mutációt tartalmaz a szintetikus Bt gén második negyede 884es pozíciójában levő SacII hasítási helyben. A plHlM4 plazmid a további mutációkat a pEBlQ#4 jelű prekurzor konstrukcióban tartalmazza, a leírtak szerint.
A plHlM4 Bluescript vektor részében levő SacII hasítási helyet kivágjuk, oly módon hogy a plHlM4 plazmidot NotI és SacI restrikciós enzimekkel emésztjük, majd ezeket a végeket tompa végekké alakítjuk, T4 DNS polimeráz standard körülmények között való alkalmazásával, mielőtt ezt a 3,9 kb méretű fragmentet ligálnánk, a plHlM4AS előállítása céljából. A vektorrégióban levő SacII hasítási hely eltávolítása lehetővé teszi egy 90 bp méretű SacII fragment eltávolítását, amely a plHlM4AS második negyedében a 884-es pozícióban levő mutáció eltávolítását jelenti, mielőtt egy 90 bp méretű SacII ffagmenttel helyettesítenénk. Az /L 12 és 13 oligomereket kinázoljuk és hibridizáltatjuk (az előzőkben leírt módon), mielőtt SacII enzimmel hasítanánk, majd egy 90 bp méretű fragmentet izolálunk 2%os Nusieve gélen. A SacII fragmentet a körülbelül 3,8 kb méretű, SacII-vel hasított plHlM4AS vektorba Egáljuk, amelyet CIP-pel foszfatázoztunk. A helyreállított SacII konstrukció jelzése pHYB#6. A SacII fragment orientációját a pHYB#6-ban PCR módszerrel határozzuk meg, az előzőkben leírt módon, az alábbi indítómolekulák alkalmazásával:
MK23 A28=5 ’ -GGGGCTGCGGATGCTGCCCT-3 ’ MK.25 A28 = 5 ’ - GAGCTGACCCTGACCGTGCT- 3 ’ MK26A28 = 5’ -CACCTGATGGACATCCTGAA-3 ’
A PCR reakciót 50 pmol MK23A28 és MK25A28 indítómolekulával futtatva egy körülbelül 180 bp méretű fragmentet kapunk, ami azt mutatja, hogy a beépített fragmentet SacII hasítási helyek határolják a pHYB#6ban, a helyes orientációban. Ha az MK25A28 és MK26A28 indítómolekulákat használjuk a PCR vizsgálatban, akkor kapjuk a negatív kontrollt, ami azt mutatja, hogy csak azokban a konstrukciókban keletkezik egy körülbelül 180 bp méretű fragment, amelyekben a SacII hasítási helyekkel határolt fragment a rossz orientációban található. A pHYB#6 szekvenciáját standard eljárásokkal határozzuk meg.
A pHYB#6 egyetlen mutációt tartalmaz a 378-as pozícióban, amelyet ki kell javítani ahhoz, hogy megkapjuk az első negyedet, a kívánt szekvenciával.
A plHG#6 plazmid tartalmazza a szintetikus Bt gén teljes első felét a kívánt szekvenciával. A plHG#6-ot a plHlM5#2 plazmidnak egy 3,4 kb méretű AatlI/NcoI
HU 220 294 B fragmentjéből állítjuk elő, a pHYB#6 500 bp méretű AatlI/NcoI fragmentjéhez ligáivá.
Ahhoz hogy a szintetikus gén azon kiónjait vagy részleges kiónjait azonosítsuk, amelyek nyitott leolvasási kereteket tartalmaznak, az előzőkben ismertetett kanamicin szelekciós vektort használjuk. A szintetikus Bt gén negyedik negyedét először a kanamicin kazettába visszük be. A pKM74-4 tartalmazza a BtP2 plazmidból származó körülbelül 500 bp méretű Apal/Clal fragmentet (amely plazmidot előzőleg egy dam Escherichia coli törzsbe transzformáltunk (PO-100), hogy hasítható legyen Clal enzimmel), az Apal/Clal enzimekkel hasított pUC:KM74 vektorba ligáljuk. A pKM74-4 plazmid kanamicinrezisztenciát mutat, de később kiderült, hogy két szubsztitúciós mutációt tartalmaz az 1523-as és 1634-es pozíciókban (a mutációkat az előző részben ismertettük, amikor a negyedik negyed klónozását ismertettük; ezek szubsztitúciók, nem deléciók vagy inszerciók).
A szintetikus plHG#6-ból származó Bt gén helyes első felét a PKM74-4 plazmidba építjük be. A kapott plazmidot, jele pKml24, a PKM74-4 plazmidnak a körülbelül 3,9 kb méretű Apal/BamHI fragmentjéből készítjük, a plHG#6 1 kb méretű Apal/BamHI fragmentjéhez ligáivá. A pKml24 kanamicinrezisztenciát mutat. Ez a plazmid tartalmazza a szintetikus gén első, második és negyedik negyedét, egyetlen nyitott leolvasási keretet hozva létre.
A szintetikus gén harmadik negyedét ezután klónozzuk a pKM124-be. Az első funkcionális klón a pBt:Km#6-ban a csonkított szintetikus crylA(b) génnek egy funkcionális másolata a Km kazettában, amely kanamicinrezisztenciát mutat, de tartalmaz deléciós mutációkat a harmadik és negyedik negyedek között. A pBt:Km#6 plazmidot a körülbelül 5 kb méretű Apal/Ncol pKM124 vektorfragmentből készítjük, a pQCN103-ból (apQCN103 egy rossz illeszkedési mutációt tartalmaz az 1326-os pozícióban, amelyet később kijavítunk) származó körülbelül 500 bp méretű Apal/Ncol fragmenttel ligáivá. Valószínűleg a szennyező nukleázaktivitás felelős azért, hogy a pBt:Km#6ban az Apai hasítási hely hiányzik a harmadik és negyedik negyed között. A pBt:Km#6 plazmidban levő szintetikus gén által kódolt Bt gén a természetes fehérje ECB elleni aktivitásának körülbelül 50-60%-ával rendelkezik. A pBt:Km#6 2 kb méretű Smal/BamHI fragmentjét egy 35S: expressziós kazettába építjük be, így állítjuk elő a 35S:Bt6 plazmidot.
Először két funkcionális szintetikus Bt kiónt kapunk, mindegyiket mutációkkal: a pBT: KM#6 plazmidot és a pCIB4414 plazmidot. A pCIB4414, amely a természetes génnel összehasonlítva 100%-ban aktív a rovarbioesszékben az európai magfúróval szemben, szubsztitúciós mutációkat tartalmaz a harmadik és negyedik negyedben, az 1323,1523 és 1634-es pozíciókban.
A pCIB4414 plazmidot két plazmidból állítjuk elő: az MG3.G4#18 és 1HG plazmidokból, amelyeket az előzőkben ismertettünk. Az MG3.G4#18-at úgy állítjuk elő, hogy a BtP2#l plazmidban levő Apal/KpnI fragmentet a pQCN 103-ba klónozzuk a megfelelő restrikciós hasítási helyek felhasználásával). Ezáltal egy olyan plazmidot kapunk, amely a gén harmadik és negyedik negyedét tartalmazza. A szintetikus génnek a plHG-ből származó első felét BamHI és Ncol enzimekkel hasítjuk, majd az MG3.G4-be visszük (amely tartalmazza a gén harmadik és negyedik negyedét). A keletkező plazmid, a pCIB4414 a szintetikus génnek egy funkcionális verzióját tartalmazza. Miközben jóllehet működőképes, az ebben a plazmidban levő szintetikus gén három hibát tartalmaz: az 1326-os pozícióban (C-t G helyettesít), az 1523-as pozícióban (G-t A helyettesít), és az 1634-es pozícióban (C-t T helyettesít).
A pCIB4414-ben levő negyedik negyedet egy 354 bp méretű negyedik negyed Apal/BstEII fragmenttel helyettesítjük, amelyet negyedik negyed oligomerek hibridizálásával, ligálásával és restrikciós enzimes hasításával állítunk elő, az előzőkben leírt módon, majd a fragmentet egy 2%-os Nusieve agarózgélből izoláljuk. A pCIB4408 egy szintetikus Bt gén klón, amelyet úgy kapunk, hogy a pCIB4406-ban levő negyedik negyed fragmentet a hibridizálódó negyedik negyed fragmenttel helyettesítjük. Ahhoz, hogy a CaMV 35S promoterét a szintetikus Bt gén elé illesszük, a pCIB4406-ot a p35SBt6 plazmidnak egy 4 kb méretű EcoNI/KpNI fragmentjéből és a pCIB4408 plazmidnak egy 1,8 kb méretű EcoNI/KpNI fragmentjéből állítjuk elő.
A pCIB4406 100%-osan aktív (a természetes génből származó fehérjével összehasonlítva) ECB ellen, de a szintetikus gén harmadik negyedében szubsztitúciós mutációt hordoz, az 1323-as pozícióban, aminek az eredménye egy aminosavcsere (fenilalanin helyett leucin). A pBS123#13 plazmidot használjuk ennek a mutációnak a kijavítására.
A pBS123#13 plazmidban levő harmadik negyedet egy körülbelül 479 bp méretű, hibridizált oligomerből készült fragmenttel készítjük el. A harmadik negyed U15-U20 és L15-L21 oligomereit kinázoljuk, hibridizáljuk, majd ligáljuk, az előzőkben leírt módon. A PCR reakciókat az előzőkben leírt módon hajtjuk végre a P5(a) és P6(b) indítómolekulákat használva 15 cikluson keresztül. A PCR terméket proteináz K-val kezeljük körülbelül 50 pg/ml végkoncentrációban körülbelül 95 μΐ térfogatban, 30 percig 37 °C-on, majd 10 percig 65 °C-on [Crowe et. al., Nucleic Acids Research, 19, 184 (1991)]. Ezt követően a terméket fenol/kloroform eleggyel extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk, standard eljárásokat alkalmazva, mielőtt Apai és Ncol restrikciós enzimmel emésztenénk.
A körülbelül 450 bp méretű Apal/Ncol PCR fragmentet a plHG#6 plazmidból származó 3,8 kb méretű Apal/Ncol vektor fragmenthez ligáljuk, így állítjuk elő a pBS123#13 plazmidot. A pBS123#13 plazmid tartalmazza a számunkra megfelelő, kukoricára optimalizált crylA(b) gén harmadik negyedét az Nspl hasítási helynél levő 1319-es pozíciótól, az 1439-es pozícióban levő Apai hasítási helyig. Ezt a pBS123#13 plazmidból származó 170 bp méretű Nspl/Apal fragmentet használjuk a pCIB4418 plazmidban levő teljesen aktív szintetikus crylA(b) génhez.
HU 220 294 B
Westem-blot elemzés
A különböző transzformánsok Westem-blot elemzését szelektív lemezeken növesztett Escherichia coliból készített nyersextraktumokkal végezzük. Egy fogpiszkálóval levakarjuk a tenyészeteket a friss lemezekről, amelyek a számunkra érdekesek, éjszakán át 37 °C-on növesztett transzformánsokat tartalmazzák. A Bt gén Escherichia coliban való expressziójának pozitív kontrollja egy pCIB3069 konstrukció, amely a természetes Bt-k gént tartalmazza, a növényben expresszálható CaMV promoterrel fuzionáltatva. A pCIB3069 emellett tartalmazza a 35S promotert is, működés szempontjából a higromicinrezisztencia génhez kapcsolva, a 35S promoter az Adh #1 in trónnal működés szempontjából a GUS génhez kapcsolva, és a 35S gént működés szempontjából a természetes Bt crylA(b) IP fehérje termelését kódoló génhez kapcsolva. Az elemzésbe bevontunk egy negatív kontroll Escherichia colit is, amely nem tartalmazza a Bt gént. A tenyészeteket 100 μΐ felvivőpufferben szuszpendáljuk, amely 63 mmol/1 TRIS-HCl-t (pH=6,8), 1% SDS-t, 0,0025% brómfenolkéket, 10% glicerint és 7,5% merkapto-etanolt tartalmaz. Miután a keverékeket 10 percig 95 °C-on tartottuk, a készítményeket 1-2 másodpercig ultrahanggal besugározzuk. A törmeléket 5 percig mikrocentrifugában centrifugáljuk szobahőmérsékleten, majd az egyes mintákból 1015 μΐ-t akrilamidgélre viszünk, amely egy 10%-os futtatógélből és egy 6%-os felvivőgélből áll [Laemmli, Natúré, 227, 680-685 (1970)]. Miután éjszakán át 10 mA-rel elektroforetizáltuk, a fehérjéket a gélből egy Immobilon membránra visszük át (Millipore). A transzfert egy elektroforetikus Blotting Unit felhasználásával (American BioNuclear, Emeryville, CA) végezzük transzfer pufferben (20 mmol/1 TRIS, 150 mmol/1 glicin, 20% metanol) 1,5 óra hosszat, 450 mA áramerősséggel.
A Westem-blotoláshoz használt pufferek:
Blokkolópuffer: 2%Tween-20 mmol/1 TRIS-HC1 pH=10,2 150 mmol/1 NaCl
Mosópuffer: 0,05% Tween-20 mmol/1 Tris-HCl pH=10,2 150 mmol/1 NaCl
Előhívó puffer: 100 mmol/1 TRIS - HC1 pH=9,6 100 mmol/1 NaCl 10 mmol/1 MgCl2
Azután, hogy a transzfer teljesen lejátszódott, a membránt körülbelül tíz percig inkubáljuk a blokkolópufferben. Az első antitestkezelés előtt a mosópufferrel háromszor 15 perces mosást végzünk. Az első antitest egy immunaffinitással tisztított nyúl- vagy kecskeantitest, amelyet a CryLA(b) fehérjével mint antigénnel kaptunk, (Ciba-Geigy, RTP, N. C.; Rockland Inc., Gilbertsville, PA.; és Berkeley Antibody Co., Richmond, CA). A cryIA(b)-specifikus antitestet közvetlenül felhasználás előtt a Bio-Radtól vásárolt Escherichia coli-lizátummal kezeljük 1 ml térfogatban, 5pg antitest, 50 μΐ Escherichia coli-lizátum összetételű 1 ml végtérfogatú reakcióelegyben, a mosópufferben. Ezt az elegyet 1 óra hosszat szobahőmérsékleten inkubáljuk mielőtt 1-30-szorosra hígítanánk, a mosópufferrel végzett 1:6000-es végső hígítás előtt. A membránnak az első antitesttel való inkubálását szobahőmérsékleten végezzük 1,5 óra hosszat.
Három tízperces mosást végzünk az 1. és a 2. antitestkezelés között. A második antitest vagy nyúl antikecske vagy kecske anti-nyúl/alkalikus foszfatáz konjugátum (Sigma, St. Louis, MO). Az alkalikus foszfatáz konjugátummal való inkubálást szobahőmérsékleten végezzük egy óra hosszat, a mosópufferben készített 1-6000-es hígításban. Hat tízperces mosást végzünk a második antitestkezelés és a Westem-blot előhívása előtt. A Westem-blotot 100 ml előhívó pufferben hívjuk elő, amelynek összetétele 440 μΐ nitroblue-tetrazolium 70% dimetilformamidban (75 mg/ml), és 330 μΐ
5-bróm-4-klór-indolil-foszfát 100%-os dimetilformamidban (50 mg/ml). 15-30 percig való előhívás után a membránt vízzel mossuk, majd a levegőn szárítjuk.
4. példa
Transzformációs vektorok készítése
A pCIB710 és származékainak készítése
A pCIB709 és pCIB710 CaMV promoter kazetta plazmidokat Rothstein és munkatársai leírása szerint készítjük [Rothstein et. al., Gene, 53, 153-161 (1987)]. A pCIB710 tartalmazza a CaMV promotert és a transzkripciós terminációs szekvenciákat a 35S RNS-transzkriptumhoz [Covey et. al., Nucleic Acids Rés., 9, 6735-6747 (1981)]. A CaMV DNS-ből egy 1149 bp méretű BglII restrikciós fragmentet [6494-7643 bp; Hohn et. al., Current Topics in Microbiology and Immunology, 96, 194-220, A-G függelékek (1982)] izolálunk preparatív agaróz-gélelektroforézissel, az előzőkben leírt módon. A fragmentet BamHI enzimmel felnyitott pUC19 DNS-be juttatjuk be, T4 ligázzal kezeljük, majd Escherichia coliba transzformáljuk. (Meg kell jegyezni, hogy a keletkező plazmidban a BamHI restrikciós hasítási hely tönkremegy, amikor a BglII tapadós véget a BamHI tapadós véggel ligáljuk.)
A keletkező plazmidot (jele pUC19/35S) használjuk azután oligonukleotidvezérelt in vitro mutagenezisben, hogy a GGATCC BamHI felismerési szekvenciát közvetlenül a 7483-as CaMV nukleotid után építsük be (Hohn-féle számozás). A keletkező plazmid, a pCIB710 tartalmazza a BamHI restrikciós hasítási hellyel elválasztott CaMV 35S promoter régiót és a transzkripciós terminációs régiót. Az ebbe a BamHI hasítási helybe beillesztett DNS-szekvenciák expresszálódnak a növényekben, a CaMV transzkripciós szabályozószekvenciák révén. (Meg kell jegyezni még, hogy a pCIB nem tartalmaz egyetlen ATG transzlációs iniciációs kodont sem a transzkripció kezdete és a BamHI hasítási hely között.)
A pCIB710-et úgy módosítjuk, hogy a pCIB709 keletkezzen, oly módon hogy a BamHI hasítási helyre egy BamHI fragmentet építünk be, amely a pLG90-ből származó higromicin-foszfotranszferáz kódolószekvenciát hordozza [Rothstein et. al., Gene, 53, 153-161 (1987)].
A pCIB709-et úgy módosítjuk, hogy a pCIB996 keletkezzen, oly módon hogy eltávolítjuk a közvetlenül a
HU 220 294 B higromicin-foszfotranszferáz gén előtt ATG iniciációs kodont, standard mutagenezis technikák alkalmazásával, miközben erre a pontra egy BglII restrikciós hasítási helyet építünk be. A keletkező plazmidot, a pCIB996-t tovább módosítjuk, hogy eltávolítsuk a BamHI, Smal és BglII hasítási helyeket az iniciációs kodontól 5’-irányban található 5’ nem transzlálódó régióban levő BanHI, Smal és BglII hasítási helyeket. Ennek eredménye a DNS-szekvencia megváltozása -TATAAGGATC CCGGGGGCA AGATCTGAGA TATG-Hyg-ről TATAAGGATC TGAGATG-Hyg-re. A keletkező plazmid jele pCIB3073.
Egy másik eljárásban a pCIB710-et úgy módosítjuk, hogy a pCIB900 keletkezzen, oly módon, hogy a pCIB10/35SBt BamHI-BclI ffagmentjét, amely a 645 aminosavból álló Bt-kódoló szekvenciát tartalmazza (az alábbi, C pontban részletesen ismertetjük), a pCIB710 BamHI hasítási helyére építjük be, így hozzuk létre a pCIB710/35SBt plazmidot. Ahhoz, hogy egy antibiotikumrezisztencia-markert juttassunk be, a pCIB709-et Sáli restrikciós enzimmel hasítjuk, egy KpnI/Sall adaptert Egálunk hozzá, majd a kapott ligálási terméket KpnI restrikciós enzimmel hasítjuk. A pCIB709-nek a 35S/higromicinrezisztencia gént tartalmazó KpnI ffagmentjét a pCIB710/35SBt KpnI hasítási helyére illesztjük, így kapjuk a pCIB900 plazmidot.
A szelekciós markerként használható gének közé tartozik a higromicinrezisztencia gén [Rothstein et. al., Gene, 53, 153-161 (1987)]. Az ebben a publikációban leírt higromicin gént egy pUC plazmidba visszük be, azaz például a pCIB710-be vagy a pCIB709-be, és a higromicin-foszfotranszferáz kódolószekvencia „extra” ATG-jét eltávolítjuk, így kapjuk a pCIB996-ot. Ezt a módosított pCIB996 plazmidot tovább módosítjuk, hogy eltávolítsuk a gén 5’ régiójából a BglII, BamHI és Smal hasítási helyeket, a molekuláris biológia standard módszereinek alkalmazásával, így kapjuk a pCIB3073 plazmidot.
A pCIB932 egy pUC19-alapú plazmid,amely a Pep-C:promoter/Bt/ Pep-C:terminátor szerkezetű kiméra gént tartalmazza. Ez a pPEP-10-ből származó ffagmentből, a fotoszintézisben aktív PÉP karboxiláz enzimet kódoló kukoricagénnek egy Hl-lambda-14 genomiális klón HindlII szubklónjából [PNAS USA, 83, 2884-2888 (1986)], és a pCIB930-ból származó fragmentekből tevődik össze, amely utóbbi egy BamHI ffagment, a crylAb endotoxin gén 645 aminosavas csonkított formáját tartalmazó BamHI fragment, a pUC18 BamHI hasítási helyében.
A pPEP-10-nek a 2,6 kb méretű EcoRI-XhoI ffagmentjét, amely a PÉP karboxiláz gén poliA addíciós helyét tartalmazza, izoláljuk, majd PstI és HincII restrikciós enzimekkel emésztjük. A restrikciós emésztményt Pstl/HincII enzimekkel emésztett pUC18 plazmidba ligáljuk, Escherichia coliba transzformáljuk, majd a transzformánsokat átvizsgáljuk, olyanokat keresve, amelyek egy 412 bp méretű Pstl-HincII inszertet tartalmaznak a pUC 18-ban, és az inszert szerkezetét szekvenálással igazoljuk. A keletkező plazmid jele pCIB931.
A foszfoenol-piruvát-karboxiláz izozimet („PEP-C”) kódoló nukleáris gént Hudspeth és munkatársai írják le [Plánt Molecular Biology, 12, 579-589 (1989)]. A pCIB932-t három ffagment ligálásával készítjük el. Az első ffagmentet, amely a PEP-C transzkripciós terminátort tartalmazza, úgy állítjuk elő, hogy a pCIB931 plazmidot teljesen megemésztjük HindlII enzimmel, majd részlegesen emésztjük Sphl enzimmel, és a 3098 bp méretű ffagmentet izoláljuk. A második ffagmentet, amely a Bt endotoxint kódoló szekvenciát tartalmazza, úgy állítjuk elő, hogy a pCIB930 plazmidot Ncol és Sphl restrikciós enzimekkel emésztjük, majd izoláljuk az 1950 bp méretű ffagmentet. A harmadik ffagmentet, amely a PEP-C promotert tartalmazza, úgy állítjuk elő, hogy a pPEP-10 plazmidot teljesen megemésztjük HindlII restrikciós enzimmel, majd részlegesen emésztjük Ncol-gyel, és izoláljuk a 2,3 kb méretű ffagmentet. A ligáló elegyet Escherichia coliba transzformáljuk, majd a helyes inszertet tartalmazó transzformánsokat azonosítjuk, és az inszert szerkezetét szekvenálással igazoljuk.
A pCIB932 plazmidot PvuII restrikciós enzimmel hasítjuk, így kapunk egy 4,9 kb méretű ffagmentet, amely a kukorica Pep-C:promoter/Bt/Pep-C:terminátor konstrukciót tartalmazza, majd 1%-os LGT agarózgélen, IX TAE-ben tisztítjuk. A linearizált pCIB3079 vektort és a pCIB932-ből származó 4,9 kb méretű inszertet T4 DNS ligázzal ligáljuk LGT-ben, így kapjuk a pCIB4401-et. A pCIB4401 egy kukoricatranszformációs vektor, amely kiméra géneket tartalmaz: 35S:promoter/PAT/35S:terminátor, Pep-C:promoter/Bt/ /Pep-C:terminátor, és 35S:promoter/Adhl #1 intron/GUS/35S:terminátor.
A pCIB246plazmid készítése (35S-GUS-35S)
Egy CaMV 35 S promoter kazettát, a pCIB246-ot az alábbiak szerint állítunk elő.
A CaMV genom 7482-es pozíciójában levő Ddel restrikciós hasítási helyet [Franck et. al., Cell, 21, 285-294 (1980)] módosítjuk, oly módon, hogy egy 48 bp méretű oligonukleotidot építünk be, amely számos restrikciós enzim felismerési helyét tartalmazza, beleértve egy Ncol (CCATGG) hasítási helyet, egy Sáli (GTCGAC) hasítási helyet és egy SstI (GAGCTC) hasítási helyet. Ezt a megváltoztatott CaMV 35S promotert egy pUC19 vektorba építjük be, amelyet már előzőleg úgy módosítottunk, hogy a vektor SstI és Sáli hasítási helyét tönkretettük. Ily módon a pCIB1500 CaMV 35S promotere egyedi SstI és Sáli hasítási helyeket tartalmaz a klónozáshoz.
A pCIB1500-at Sstl/Ncol enzimekkel emésztjük, majd a pBI221 plazmidból származó GUS génnel ligáljuk (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA). Az Ncol hasítási helyet fuzionáltatjuk a GUS génnel, úgyhogy az Ncol hely ATG kodonja működik startkodonként a GUS gén transzlációja során. A CaMV 35S poliadenilezési és terminációs szignáljait használjuk a kiméra gén 3’-végéhez.
A pC!B3069 (35S-Adhl-GUS-35S) plazmid készítése
A pCIB246-ot úgy módosítjuk, hogy a kukoricaalkohol-dehidrogenáz Adhl intron 1 gént (Adhl) [Den26
HU 220 294 B nis et. al., Nucleic Acids Research, 12, 3983-4000 (1984)] a pCIB246 plazmid Sáli hasítási helyére építjük be, így kapjuk a pCIB3007 plazmidot. Az Adhl intront egy Ball/Pstl fragment formájában kivágjuk a kukorica Adhl génjéből, és egy Smal/Pstl enzimekkel emésztett pUC18 plazmidba szubklónozzuk, így állítjuk elő az Adh 1026 jelű plazmidot. Az Adh 1026 plazmidot PvuII/SacII restrikciós enzimekkel emésztjük, a végeket tompa végekké alakítjuk T4 DNS polimerázzal, majd Sáli linkereket adunk hozzá, standard eljárások alkalmazásával, majd egy körülbelül 560 bp méretű fragmentet kinyerünk egy 3%-os Nusieve gélből, és a Sáli enzimmel hasított, foszfatázzal kezelt pUC18 plazmidba ligáljuk. A keletkező plazmidban levő Sáli linkerekkel ellátott Adh #1 intront Sáli enzimmel kivágjuk, gélen tisztítjuk, majd Sáli enzimmel hasított, foszfatázzal kezelt pCIB246 plazmidba ligáljuk, így kapjuk a pCIB3007 plazmidot.
A pCIB3007 plazmidot PstI enzimmel emésztjük, majd a végeket tompa végekké alakítjuk T4 DNS polimeráz (New England Biolabs) alkalmazásával, a gyártó előírásai szerint. A kapott tompa végű molekulákat Sphl enzimmel hasítjuk, majd a körülbelül 5,8 kb méretű fragmentet, amelynek az egyik vége tompa, a másik Sphl, alacsony olvadáspontú agarózgélen tisztítjuk, standard eljárásokkal. A pCIB900 plazmidot Smal/Sphl enzimekkel emésztjük, majd a 35S/Bt gént tartalmazó fragmentet LGT agarózgélen tisztítjuk. A két, gélen tisztított fragmentet LGT agarózban ligáljuk, T4 ligáz felhasználásával, standard körülmények között. A kapott ligáit fragmenteket Escherichia coliba transzformáljuk, standard eljárások alkalmazásával, a kapott plazmid jele pCIB3062. A pCIB3062-nek két verziója létezik. A pCIB3062#l-ben van egy regenerált Smal hasítási hely, ahol a Smal véget és a T4 polimerázzal tompa végűvé alakított véget összeligáltuk. A legvalószínűbb, hogy ez abból származik, hogy a T4 polimeráz a PstI helyből egy-két bázist levág a tompavéget kialakító reakcióban. A pC!B3062#3-ban nincs meg ez a Smal hasítási hely.
A pCIB3062#3 plazmidot KpnI enzimmel hasítjuk, majd T4 DNS polimerázzal tompa végűvé alakítjuk, ezt követően pedig PvuII-vel hasítjuk, így kapunk egy körülbelül 6,4 kb méretű tompa végű fragmentet, amely tartalmazza a 35S/GUS és 35S/Bt géneket. Ezt a tompa végű fragmentet a Smal enzimmel emésztett pCIB3073-ba Egáljuk, így kapjuk a pCIB3063 vagy pCIB3069 plazmidokat. A pCIB3069 ugyanazt a fragmentet tartalmazza, mint amelyet a pCIB3063 előállításában használtunk, de a pCIB3069-ben levő kiméra gének kivétel nélkül ugyanabban a relatív orientációban találhatók, a pCIB3063-tól eltérően. Ezek aplazmidok tartalmaznak:
a) egy 35S promotert, működés szempontjából a higromicinrezisztencia génhez kapcsolva;
b) egy 35S promotert, egy Adh #1 intronnal, működés szempontjából a GUS génhez kapcsolva; és
c) egy 35S promotert működés szempontjából egy olyan génhez kapcsolva, amely a Bacillus thuringiensisből származó szintetikus crylA(b) inszekticid fehérjét kódolja, az előzőkben ismertetett módon.
GUS vizsgálatok
A GUS vizsgálatokat lényegében úgy végezzük el, ahogy azokat Jefferson leírta [Plánt Mól. Bio. Reporter, 5, 387-405 (1987)]. Amint az előzőkben bemutattuk, a pCIB246 plazmid egy CaMV promotert tartalmaz, a GUS génnel fuzionáltatva. Ennek a kiméra génnek az 5’ nem transzlálódó leader szekvenciája a kukorica Adh #1 intron egy másolatát tartalmazza. Ezt itt transzformációs kontrollként használjuk. Jóllehet ugyanazt a mennyiséget adjuk a pCIB246 plazmidból minden egyes transzformációhoz, a számított aktivitás változott a vizsgált Bt-konstrukciók között. Az alábbiakban közölt értékek 3 ismétlés átlagai. A pCIB plazmidot kétszer vizsgáltuk.
pCIB3069 28 nmol MU/pg/perc pCIB4407 0,7 nmol MU/pg/perc,
2,3 nmol MU/pg/perc
5Λ. példa
A szintetikus crylA(b) európai magfúróval szemben mutatott inszekticid aktivitásának vizsgálata Az Escherichia coliban levő pCIB4414 által hordozott szintetikus crylA(b) génnek vizsgáljuk az inszekticid aktivitását európai magfüróval szemben, az alábbi kísérleti leírás szerint.
Megolvasztott mesterséges rovartápot öntünk egy 60 mm-es Gellman patentsapkás Petri-csészébe. A megszilárdulás után 0,1% Triton Χ-100-ban szuszpendált Escherichia coli-sejteket terítünk el a felszínen, 3 χ 107 sejt/cm2 koncentrációban. A lemezeket levegőn szárítjuk. Ezután tíz első lárvaállapotú európai magfurót (Ostrinia nubilalis), amelyek 12 óránál fiatalabbak, a táp felszínére teszünk. A vizsgálati elrendezést 30 °C-on inkubáljuk teljes sötétségben 2-5 napig. A vizsgálat végén a mortalitás százalékát feljegyezzük. Azt tekintjük pozitív kiónnak, amely 50%-os vagy magasabb mortalitást ad, míg a kontroll-Escherichia coli-sejtek 0-10%-os háttér mortalitást adnak.
Összehasonlításként, a pCIB3069-ben levő természetes cryIA(b) gént is vizsgáltuk ugyanebben a koncentrációban. A kiónokat 3 χ 107 sejt/cm2 tápkoncentrációban vizsgáltuk; 20 rovar per klón.
Az alábbi eredményeket kaptuk:
Klón Százalékos mortalitás
Kontroll 0 pCIB3069 100 pCIB4414 100
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a szintetikus crylA(b) gén által termelt kristályfehéqe olyan aktivitást mutat az európai magfüróval szemben, amely összehasonlítható a természetes crylA(b) aktivitásával. Más, szintetikus cryIA(b) gént tartalmazó plazmidokat is vizsgáltunk hasonló módszerek alkalmazásával.
5B. példa
A crylA(b) fehérje cukornádfúró elleni inszekticid aktivitásának vizsgálata
A crylA(b) fehéqét Escherichia coliban expresszáljuk és vizsgáljuk a cukomádfüró (Diatrea saccharalis)
HU 220 294 Β elleni inszekticid aktivitását, ugyanannak a protokollnak a felhasználásával, amelyet az európai magfűró elleni aktivitás vizsgálatánál használtunk, és az előzőkben ismertettünk. Az eredményeket az alábbi táblázatban foglaljuk össze.
Táblázat
Cukomádfüró vizsgálata Escherichia coliból származó Bt fehérjével
Fehéijekoncentráció (ng/g) Százalékos mortalitás crylA(b)
10 0
25 0
50 7
100 13
200 40
500 53
1000 80
LC50 380
95% Cl 249-646
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy egy kukoricára optimalizált Bt gén által termelt inszekticid fehérje hatásos a cukomádfüróval szemben. A crylA(b) fehérje magasabb koncentrációi, 250 ng/g - 1000 ng/g, hozzáférhetők a jelen találmány szerint előállítva transzgenikus kukoricanövényekben.
6. példa
Kukoricaprotoplasztok izolálása és transzformálása a szintetikus Bt génnel
A szintetikus Bt gén expresszióját tranziensen transzformáit kukoricaprotoplasztokban vizsgáljuk.
A protoplasztizolálási eljárás
1. 10 kétnapos kukorica 2717 6-os vonal szuszpenziós tenyészetet 50 ml-es steril csövekbe pipettázunk, majd hagyjuk leülepedni. A táptalajt teljes mértékben eltávolítjuk és elöntjük.
2. A sejteket (3-5 ml nedves sejttérfogat) 30 ml protoplaszt enzimoldatban szuszpendáljuk. A recept az alábbi:
3% Celluláz RS
1% Macerozim RIO KMC pufferben KMC puffer (1 literre)
KC1 8,65 g
MgCl2x6H2O 16,47 g
CaCl2x6H2O 12,50 g
MES 5,0 g
PH =5,6, szűréssel sterilezve
3. A sejteket összekeverjük, majd 100x25 mm-es Petri-csészébe osztjuk szét körülbelül 15 ml/lemez aliquot részekben. Körkörös rázón rázatjuk 4 óra hoszszat, emésztés céljából.
4. 10 ml KMC-t pipettázunk át mindegyik használandó 100 mikronos szitán. A lemezek tartalmát a szitákon átszűrjük. A szitákat azonos térfogatú KMC-vel mossuk.
5. A szitán átbocsátott protoplasztokat óvatosan 50 ml-es csövekbe pipettázzuk, majd egy Beckman TJ-6 centrifugában centrifugáljuk 10 percig 1000/perc fordulatszámmal (500 c g).
6. Eltávolítjuk a felülúszót, majd az üledéket óvatosan 10 ml KMC-ben szuszpendáljuk. A 3 cső tartalmát egyesítjük, és térfogatát KMC-vel 50 ml-re állítjuk.
7. Az előző lépést megismételve centrifugálunk és mosunk.
8. Az összes mosott protoplasztot 50 ml KMC-ben szuszpendáljuk. Hemocitométerben megszámláljuk a protoplasztokat. A protoplasztokat centrifugáljuk, majd
8xl06/ml koncentrációban szuszpendáljuk szuszpen-
dálópufferben (RS puffer). Az RS puffer összetétele (500 ml-re): mannit 27,33 g
CaCl2 (0,1 mol/l-es törzsoldat) 75 ml
MES 0,5 g
pH=5,8, szűréssel sterilezve
Protoplaszttranszformációs eljárás
1. 50-50 pg plazmid-DNS-t (Bt IP konstrukciók, mind szintetikus (pCIB4407) mind természetes (pCIB3069)) 15 ml-es polisztirol tenyészcsövekbe osztunk szét. Emellett 25-25 pg GUS-t tartalmazó plazmid-DNS-t [amely nem tartalmaz Bt IP-t (pCIB246)] is szétosztunk csövekbe. Az egyes vizsgálandó konstrukciókból 3 párhuzamost készítünk, és egy ismétlés egyáltalán nem tartalmaz DNS-t, kontrollként.
Bt-konstrukciók: GUS-konstrukciók:
pCIB3069 pCIB246 pCIB4407
2. Alaposan, de óvatosan összekeverjük a protoplasztokat, majd csövenként 0,5-0,5 ml-t osztunk szét.
3. Az egyes csövekhez 0,5 ml PEG-40-et adunk. PEG-40:
0,4 mol/1 mannit,
0,1 mol/1 Ca(NO3)2 x 4 H2O, pH=8,0, szűréssel sterilezve.
4. A protoplasztokat óvatosan összekeverjük a PEGgel. 30 percig állni hagyjuk.
5. Ezután egymás után 1, 2 és 5 ml W5 oldatot adunk hozzá ötperces intervallumokban.
W5 oldat:
154 mmol/1 NaCl,
125 mmol/1 CaCl2xH2O, mmol/1 KC1, mmol/1 glükóz, pH =7,0, szűréssel sterilezve.
6. Tíz percig Beckman TJ-6 centrifugában centrifugáljuk, körülbelül 1000/perc fordulatszámmal (500 g). A felülúszót eltávolítjuk.
7. Az üledéket óvatosan felszuszpendáljuk 1,5 ml FW táptalajban, majd óvatosan 35x10 mm-es Petricsészékre szélesztjük.
FW táptalaj (1 literre):
MS sók 4,3 g
200 x B5 vitamin 5 ml
HU 220 294 Β szacharóz 30 g prolin 1,5 g mannit 54 g
2,4 D 3 mg
PH =5,7, szűréssel sterilezve
8. Éjszakán át szobahőmérsékleten tartjuk.
9. GUS vizsgálatot, inszekt bioesszét és ELISA-t végzünk az alábbiakban ismertetett protoplasztok kivonataival.
7. példa
Teljes hosszúságú, kukoricára optimalizált crylA(b) gén készítése
A 4-es szekvencia mutatja a szintetikus, kukoricára optimalizált szekvenciát, amely a teljes hosszúságú, Bacillus thuringiensisből származó crylA(b) inszekticid fehérjét kódolja. Az előzőkben ismertetett csonkított verzió az első, körülbelül 2 kb méretű részét jelenti ennek a génnek. A teljes hosszúságú génnek a megmaradt részét az előzőkben ismertetett eljárások alkalmazásával 20 klónozzuk. Röviden, ez az eljárás lehetővé teszi 40-90 nukleotidméretű DNS-oligomerek szintézisét, az átlagos méret 80 oligomer. Az oligomereket standard HPLC eljárásokkal vagy gélből való kinyeréssel tisztítjuk. A tisztított oligomereket kinázoljuk, majd hibridi- 25 záljuk, így kapunk körülbelül 500 bp méretű ffagmenteket. A hibridizált oligomereket PCR-rel lehet amplifikálni, standard körülmények között. Az 500 bp méretű fragmenteket, amelyek származhatnak közvetlenül hibridizációból, PCR amplifikációból, vagy kinyerhet- 30 jük agarózgélből hibridizálás vagy PCR amplifikálás után, ezután egy plazmidba klónozzuk, és Escherichia coliba transzformáljuk, standard eljárások alkalmazásával.
A keresett inszertet tartalmazó rekombináns plaz- 35 midokat az előzőkben ismertetett módon azonosítjuk,
A pCIB4434 előállításához az alábbi oligókat terveztük:
PCR és/vagy mini-szűrővizsgálati eljárások alkalmazásával. Azokat az inszerteket, amelyek a PCR reakciójuk alapján és/vagy a restrikciós enzimes profil alapján megfelelőnek bizonyulnak, ezután szekvenáljuk, és azonosítjuk azokat a kiónokat, amelyek a számunkra megfelelő nyitott leolvasási keretet tartalmazzák. A fragmenteket azután ligáljuk a 2. példában ismertetett körülbelül 2 kb méretű szintetikus szekvenciával, így kapunk egy teljes hosszúságú, kukoricára optimizált crylA(b) gént, amely jól használható a CrylA(b) gén magas szintű expressziójára kukoricában.
A természetes és szintetikus Bt gének G+C tartalma:
teljes hosszúságú természetes 38,8%, csonkított természetes 37,2%, teljes hosszúságú szintetikus 64,8%, csonkított szintetikus 64,6%.
A Bt gén végső, csonkított verziójának a „tiszta” kukorica kodonhasznosítású génjéhez viszonyított %-os homológiája: 98,25%.
8. példa
Egy növényben expresszálódó, teljes hosszúságú, hibrid, kukoricára részlegesen optimalizált cryIA(b) gén készítése
A pCIB4434 egy teljes hosszúságú crylA(b) gént tartalmaz, amelyből körülbelül 2 kb a kukoricára optimalizált szintetikus crylA(b) gén, míg a gén megmaradó része (a C-terminálist kódoló rész) az eredeti génből származik. Tehát a kódolórégió a szintetikus gén és a természetes gén közötti kiméra, de a keletkező fehérje azonos a természetes crylA(b) fehéijével. A szintetikus régió az 1-1938-as nukleotidokból áll (az 1-646os aminosavak), míg a természetes kódolórégió az 1939-3468-as nukleotidokból áll (647-1155-ös aminosavak). Ennek a génnek a szekvenciáját a 7. ábrán mutatjuk be. A pCIB4434 térképét a 8. ábrán mutatjuk be.
KE134A28=5’-CGTGACCGAC TACCACATCG ATCAAGTATC CAATTTAGTT GAGT-3’
KE135A28=5’-ACTCAACTAA ATTGGATACT TGATCGATGT GGTAGTCGGTC AGG-3’
KE136A28= 5 ’-GCAGATCTGA GCTCTTAGGT ACCCAATAGC GTAACGT-3’
KE137A28=5 ’-GCTGATTATG CATCAGCCTAT-3 ’
KE138A28 = 5 ’-GCAGATCTGA GCTCTTATTC CTCCATAAGA AGTAATTC-3’
MK05A28=5 ’ -CAAAGGTACC CAATAGCGTA ACG-3’
MK35A28=5 ’ -AACGAGGTGT ACATCGACCG-3 ’
A pCIB4434 plazmidot négy fragmentből ligáljuk össze, egy, a pCIB4418-ból származó 5,7 kb méretű 55 fragmentet, egy PCR-rel készített 346 bp méretű szintetikus : natív fúziós BstEII/KpnI fragmentet, egy 108 bp méretű, a pCIB1315-ből származó természetes CrylA(b) KpnI/Nsil fragmentet, és egy 224 bp méretű PCR-rel előállított Nsil/BglII fragmentet használva a reakcióban. 60
A ligálás és a transzformálás standard körülményeit az alábbiakban ismertettük.
Egy szintetikus: természetes génfuziós fragmentet két lépésben, PCR alkalmazásával állítunk elő. A PCR fragmentnek az első 253 bázispárját 100 pmol KE134A28 és MK04A28 felhasználásával készítjük, körülbelül 200 ng természetes CrylA(b) templáton 100 μΐ
HU 220 294 B térfogatban, 200-200 nmol dNTP-vel, IX PCR pufferben (Perkin Elmer Cetus), 20% glicerin és 5 egység Taq polimeráz jelenlétében (Perkin Elmer Cetus). A PCR reakciót az alábbi paraméterekkel futtatjuk :1 perc 94 °C-on, 1 perc 55 °C-on, 45 másodperc 72 °C-on, 3 három másodperces extenzióval 25 ciklusban. Ennek az első PCR reakciónak egy frakcióját (1%) használjuk templátként 200 ng szintetikus cryIA(b) DNS-sel, így állítva elő a teljes 351 bp méretű szintetikus: natív fúziós fragmentet. Az ebben a második PCR reakcióban indítómolekulaként használt oligonukleotidok: 50 pmol MK35A28, 50 pmol MK04A28 és 25 pmol KE135A28. A PCR reakcióelegy összetétele és a paraméterek azonosak az előzőkben ismertetettekkel. A kapott 351 bp méretű szintetikus: természetes fúziós fragmentet Proteináz K-val kezeljük 50 pg/ml összkoncentrációban, majd fenol/kloroform eleggyel extraháljuk, utána etanollal kicsapjuk, mielőtt BstEII/KpnI enzimekkel hasítanánk, standard körülmények között.
A pCIB4434 előllításában használt 224 bp méretű Nsil/BglII PCR fragmentet 100 pmol KE137A28 és ΚΈ138Α28 oligók és 200 ng természetes cryIA(b) gén mint templát alkalmazásával állítjuk elő 100 μΐ térfogatban, ugyanolyan összetételű PCR reakcióelegy és paraméterek alkalmazásával, mint amelyeket az előzőkben ismertettünk. A 230 bp méretű PCR természetes cryIA(b) fragmentet Proteináz K-val kezeljük, fenol/kloroform eleggyel extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk az előzőkben leírt módon, mielőtt Nsil/BglII enzimekkel emésztenénk.
A pCIB4434 plazmidot kukoricaprotoplasztokba transzformáljuk, az előzőkben ismertetett módon. A 2727 6-os vonal protoplasztokat használjuk a pCIB4434 plazmiddal, és a pCIB4419-cel mint kontrollal. Az eredményeket az alábbiakban mutatjuk be:
ng Bt/mg fehérje
4419 (35S) 14 000±2100
4434 (teljes hosszúságú) 2 200±900
Háttér=13 ng Bt/mg fehérje a nem transzformált protoplasztoknál.
Az eredmények azt mutatják, hogy a pCIB4434 a pCIB4419 expressziós szintjének körülbelül 15%-ában expresszál.
A Westem-blot elemzés azt mutatja, hogy az ebben a rendszerben a pCIB4434-ről keletkező crylA(b) fehérjének legalább egyharmada 130 kD méretű. Ennélfogva jelentős mennyiségű teljes hosszúságú crylA(b) fehérje keletkezik a kukoricasejtekben a pCIB4434 plazmidról való expresszió következtében.
7. példa
Teljes hosszúságú, hőmérsékletstabil cryIA(b) fehérjét kódoló crylA(b) gének készítése A pCIB5511-5515 konstrukciók készítését, amelyek mind teljes hosszúságú cryIA(b) gént tartalmaznak, az alábbiakban ismertetjük. Ezekben a szekvenciákban a 26 aminosavas deléciót a 793-as és 794-es aminosavak között (KCGEPNRCAPHLEWNPDLDCSCRDGE), amely a crylA(a) és crylA(c) génekben megvan, de a cryIA(b)-ben nincs meg, kijavítjuk. A pCIB5513-ban levő gén szintetikus; a másik négy gén hibrid, és így részlegesen kukoricára vannak optimalizálva.
A pCIB5511 plazmid készítése
Ez a plazmid a pCIB4434 plazmid származéka.
A pCIB5511 plazmid térképe a 10. ábrán látható. A DNS 2165-ös és 2590-es nukleotidjai közötti 435 bp méretű szegmentjét úgy állítjuk elő, hogy olyan szintetikus oligomereket tervezünk, amelyek az alsó és felső szálakat jelentik, a csonkított crylA(b) génhez. Ezt a szintetikus DNS-szegmentet a szakterületen jártas szakemberek számára jól ismert standard technikákkal szintetizáljuk, és tartalmazza azt a 26 aminosavas deléciót, amelyről kiderült, hogy a természetben előfordul a Bacillus thuringiensis kurstaki HD-1-ből származó cryIA(b) fehérjében. A teljes beépített DNS-szegment kukoricára optimalizált kodonpreferenciát használ az aminosavak kódolására. A természetben előforduló deléció javítására használt 26 aminosav ebben a fragmentben található. Ezeket a 2170-es nukleotidnál található KpnI hasítási hely és a 2508-as nukleotidnál található Xbal hasítási hely (a pCIB5511-ben 2586) között levő 2387-es pozíciónál építjük be a pCIB4434 plazmidba. A pCIBB5511-es plazmidot három fragment ligálásával állítjuk elő, amely során a pCIB4434-es plazmid Sphl és KpnI restrikciós enzimekkel való emésztése során kapott 3,2 kb méretű fragmentet, a pCIB4434 plazmid Sphl és Xbal restrikciós enzimes emésztésével kapott 3,8 kb méretű fragmentet, és az előzőkben ismertetett szintetikus DNS KpnI és Xbal restrikciós enzimes emésztésével kapott 416 bp méretű fragmentjét ligáljuk össze. Az enzimes reakciókat standard körülmények között végezzük. Ligálás után a DNS-elegyet kompetens Escherichia coliba transzformáljuk, standard eljárások alkalmazásával. A transzformánsokat 100 pg/ml ampicillint tartalmazó L-agaron szelektáljuk. A transzformánsokban levő plazmidokat standard minieljárásokkal izoláljuk és jellemezzük. A helyreállított crylA(b) hőstabil fehéijét kódoló helyreállított crylA(b) gén szekvenciáját a 9. ábrán mutatjuk be.
A pCIB4434 plazmid készítése
Ez a plazmidkonstrukció a pCIB4434 plazmid egy származéka. A pCIB5512 plazmid térképét a 12. ábrán láthatjuk. A 26 aminosavas deléció helyreállításához szükséges DNS-t a DNS-szintézis és enzimreakciók standard technikáinak alkalmazásával állítjuk elő. Három kétszálú DNS-kazettát állítunk elő (pGFcasl, pGFcas2 és pGFcas3), mindegyik körülbelül 300 bázispárt tartalmaz. Ezeket a kazettákat úgy terveztük meg, hogy tartalmazzák a kukoricára optimalizált kodonokat, miközben 100%-os aminosavazonosságot tartanak meg az inszekticid fehérjével. Ezeket a kazettákat arra használjuk, hogy helyettesítsük az 1824-es pozícióban levő BstEII restrikciós hasítási hely és a 2508-as pozícióban levő Xbal restrikciós hasítási hely közötti régiót, miközben tartalmazzák a további 78 bázispárt, amelyek a hiányzó 26 aminosavat kódolják (az előzőkben ismertettük a pCIB4434-ben levő pCIB5511-re). Mindegyik említett kazettát a Bluescript vektor (Stratagene) EcoRV hasítási helyére klónozzuk, standard tech30
HU 220 294 B nikák alkalmazásával. A három kazettát úgy terveztük meg, hogy átfedő restrikciós hasítási helyeket tartalmazzanak. Az 1-es kazetta BstEII restrikciós hasítási helyet tartalmaz az 5’-végen és EcoRV hasítási helyet a 3’-végen: a 2-es kazetta EcoRV hasítási helyet tartalmaz az 5’-végen és Clal hasítási helyet tartalmaz a 3’végen, a 3-as kazetta Clal hasítási helyet tartalmaz az 5’-végen és Xbal hasítási helyet tartalmaz a 3’-végen. Ezeket egyenként klónozzuk a Bluescript vektorba, majd a teljes 762 bp méretű fragmentet ezt követően ligálással állítjuk össze, standard technikák alkalmazásával. A pCIB5512 összeállításához felhasználjuk ezt a 762 bp méretű fragmentet, ezt összeligálva egy 6,65 kb méretű fragmenttel, amelyet úgy kapunk, hogy a pCIB4434 plazmidot teljesen megemésztjük BstEII 15 restrikciós enzimmel, majd részlegesen emésztjük Xbal restrikciós enzimmel. Egy másik módszer szerint négy fragmentet ligálunk össze, felhasználva ugyanezt a vektort, és a három kazettát a használható enzimekkel emésztve. Az enzimes reakciókat standard körülmények között hajtjuk végre. Ligálás után a DNS-elegyet kompetens Escherichia coli-sejtekbe transzformáljuk, standard eljárások alkalmazásával. A transzformánsokat 100 pg/ml ampicillint tartalmazó L-agaron szelektáljuk. A transzformánsokban levő plazmidokat standard minieljárásokkal izoláljuk és jellemezzük.
A helyreállított crylA(b) gén szekvenciáját all. ábrán mutatjuk be. Ez a helyreállított crylA(b) gén annyiban különbözik attól, amelyik a pCIB5511 plazmidban található, amennyiben a cryIA(b)-t kódoló régiónak egy 30 nagyobb részét optimizáltuk a kukoricában való expresszióhoz, a kukorica által előnyben részesített kodonokat alkalmazva.
A pCIB5513 plazmid készítése
Ez a plazmid egy helyreállított cryIA(b) gént tártál- 35 máz, amely a pCIB5512 plazmidból származik.
A pCIB5513 plazmid térképét a 14. ábrán mutatjuk be.
A 2586-os pozícióban levő Xbal hasítási hely 3’-végétől a gén végéig (BglII hasítási hely a 3572-es pozícióban) terjedő régiót teljesen kukoricára optimalizált 40 kodonokkal helyettesítjük. Ezt a régiót a DNS-szintézis és enzimatikus reakciók standard technikáinak alkalmazásával szintetizáljuk meg, négy darab kétszálú DNSkazetta formájában (4., 5., 6. és 7. kazetták). A szomszédos kazetták átlapoló restrikciós hasítási helyekkel ren- 45 delkeznek, hogy megkönnyítsük a kazetták egymáshoz illesztését. Ezek a hasítási helyek a következők: Xbal és Xhol hasítási helyek a 4-es kazetta 5’- és 3’-végén; Xhol és SacI hasítási helyek a kazetta 5’-, illetve 3’-vé5 gein; SacI és XI hasítási helyek a 6-os kazetta 5’- és 3’végein; BstXI és BglII hasítási helyek a 7-es kazetta 5’és 3’-végein. Amint azt a pCIB5512-re leírtuk, a kazettákat a Bluescript vektor (Stratagene) tompa EcoRV hasítási helyére klónozzuk, és a teljes hosszúságú „helyre10 állított” crylA(b) gént vagy úgy klónozzuk, hogy egymás után egymáshoz építjük a fenti kazettákat Bluescript vektorban, majd a teljes 967 bp méretű szintetikus régiót a pCIB5512 plazmid BglII enzimmel való teljes emésztése és Xbal restrikciós enzimmel való részleges emésztése révén kapott 6448 bp méretű fragmentjével ligáljuk össze. Egy másik módszer szerint a teljes hosszúságú géneket tartalmazó plazmidot 5 fragment egyszerre egymáshoz való ligálásával kapjuk, amely 5 fragment közül 4 a kazetták (a megfelelő enzimmel 20 való emésztés után), egy pedig az előzőkben ismertetett vektor. A teljes hosszúságú, „helyreállított” crylA(b) gén szekvenciáját a 13. ábrán mutatjuk be. A különböző szintetikus és szintetikus/natív kódolórégiókat tartalmazó kiméra kódolórégiók által kódolt fehérjék azono25 sak. Ez a fehérje a crylA(b) hőstabil verziója, amelyet úgy állítunk elő, hogy a Bacillus thuringiensis kurstaki HD-1 törzsből származó cryIA(b) génben természetesen előforduló 26 aminosavas deléciót kijavítjuk. A deléció akkor derül ki, amikor a Bacillus thuringiensis kurstaki HD-1 megfelelő régióját összehasonlítjuk a Bacillus thuringiensis crylA(a) vagy crylA(c) delta-endotoxinok homológ régióival.
A pCIB5514 plazmid készítése Ez a plazmid a pCIB4434 plazmid származéka. A pCIB5514 plazmid térképét a 16. ábrán mutatjuk be. Ezt úgy állítjuk elő, hogy a 3-as szintetikus kazettát használjuk (lásd az előzőkben), amely a pCIB4434ben a pozícióban, a termostabil régióban levő Clal hasítási hely és a 2508-as pozícióban levő Xbal hasítási hely (a pCIB5511-ben 2586-os pozíció) közötti régióban kukoricára optimalizált szekvenciát tartalmaz. A pCIB4434-es nukleotidja és a termostabil régió kapcsolódási pontja közötti régiót PCR-rel amplifikáljuk, a pCR4434-et használva templátként az alábbi indítómolekulákkal :
előre: 5 ’ -GCACCGATATCACCATCCAAGGAGGCGATGACGTATTCAAAG- 3 ’ vissza: 5 ’ -AGCGCATCGATTCGGCTCCCCGCATCTTGCCGATTGGACTTGGGGCTGAAAG- 3 ’
A PCR terméket azután KpnI és Clal restrikciós enzimekkel emésztjük, majd négy fragmentet tartalmazó ligálási reakcióban ligáljuk, amelyben szerepel a 3-as kazetta Clal és Xbal restrikciós enzimmel való emésztése után kapott 189 bp méretű fragment, a pCIB4434 plazmid Sphl és KpnI restrikciós enzimmel való emész- 55 tése után kapott 3,2 kb méretű fragment, valamint a pCIB4434 plazmid Sphl és Xbal restrikciós enzimekkel való emésztése után kapott 3,8 kb méretű fragment.
Az enzimreakciókat standard körülmények között hajtjuk végre. A ligálás termékét kompetens Escherichia 60 coli-sejtekbe transzformáljuk, ampicillinen szelektáljuk, majd az előzőkben ismertetett standard eljárásokkal vizsgáljuk meg őket. A pCIB5514 plazmidban levő helyreállított crylA(b) gén szekvenciáját a 15. ábrán mutatjuk be.
A pCIB5515 plazmid készítése A pCIB4434 plazmidot úgy módosítjuk, hogy a 78 bp méretű Geiser hőstabil elemet adjuk hozzá (Geiser TSE), amelyet az előzőkben ismertettünk, a natív Bt-k régióban, a 2170-es nukleotidnál levő KpnI hasítási hely és a 2508-as nukleotidnál levő Xbal hasítási
HU 220 294 B hely közé építünk be. A beépítés pontos helye a 2379- azaz a KpnI-Geiser fragmentet és a Geiser TSE-Xbal es nukleotidnál kezdődik. A Geiser TSE-t tartalmazó fragmentet külön sokszorozzuk, régiót két sorozat PCR reakcióval sokszorozzuk meg,
1- es PCR indítómolekula (KpnI hasítási hely)
5’ - ATTACGTTAC GCTATTGGGT ACCTTTGATC - 3’
2- es PCR indítómolekula (Geiser TSE alja)
5’ - TCCCCGTCCC TGCAGCTGCA GTCTAGGTCC GGGTTCCACT CCAGGTGCGG AGCGCATCGA TTCGGCTCCC CGCACTTGCC GATTGGACTT GGGGCTGA -3’
3- as PCR indítómolekula (Geiser TSE teteje)
5’ - CAAGTGCGGG GAGCCGAATC GATGCGCTCC GCACCTGGAG TGGAACCCGG ACCTAGACTG CAGCTGCAGG GACGGGGAAA AATGTGCCCA TCATTCC - 3’
4- es PCR indítómolekula (Xbal hasítási hely)
5’-TGGTTTCTCT TCGAGAAATT CTAGATTTCC - 3’
Az amplifikálás után a PCR fragmenteket (KpnI+Clal), illetve (Clal-Xbal) restrikciós enzimekkel emésztjük. Ezt a két fragmentet ligáljuk a KpnI és Xbal restrikciós enzimekkel emésztett pCIB4434 plazmidba. A kapott konstrukció a pCIB5515, amely egy pCIB4434 plazmid, amelyben megtalálható a Geiser TSE, valamint egy extra Clal hasítási hely, amelyet KpnI és Xbal hasítási helyek határolnak. A pCIB5515 plazmid térképét a 38. ábrán mutatjuk be. A benne levő cryIA(b) gént, amely hőstabil crylA(b) fehérjét kódol, a 37. ábrán mutatjuk be.
Az alábbiakban következő 9-20. példák a bél által előnyben részesített promoter izolálására irányulnak.
9. példa
RNS-izolálás és Northern-blotok
Minden RNS-t üvegházban nevelt növényekből izolálunk. Az össz-RNS-t Kramer és munkatársai leírása szerint izoláljuk [Kramer et. al., Plánt Physiol., 90, 1214-1220 (1990)], a Fűnk 5N984 kukoricavonal alábbi szöveteiből: 8,11,15,25, 35,40 és 60 napos zöld levelek; 8, 11, 15, 25, 35, 39, 46, 60 és 70 napos bél; 60 és 70 napos merevítőgyökér a Fűnk 5N984 kukoricavonalból; 60 és 70 napos burok és kalász. RNS-t izoláltunk 14 napos 211D gyökerekből, valamint fejlődő magvakból, hetenként, az első héttől kezdve a pollenizáció utánig. A poli A+ RNS-t oligo-dT-vel izoláltuk [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)], majd Northem-blotot végzünk [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)], vagy össz-RNS-t (30 pg) vagy poli A+ RNS-t (2-10 pg) használva. Elektroforézis után az RNS-t Nitroplus 2000 membránra blotoljuk (Micron Separations Inc.). Az RNS-t Stratalinkerrel (Stratagene) kapcsoljuk a szűrőhöz, 0,2 mJoule energiával. A Northem-blotokat az 1200 bp méretű EcoRI bél (TrpA) 8-2 cDNS-ffagmenttel, majd 0,8%-os alacsony olvadáspontú agarózgélből izoláltuk TBE pufferrendszerben. A Northemblotokat hibridizáljuk, majd mossuk, és a szűrőlapokat filmre exponáljuk, amint azt a cDNS-klónok izolálásánál leírtuk.
10. példa
A cDNS-klónok izolálása
A cDNS első szálának szintézisét BRL AMV reverz transzkriptáz rendszerrel végezzük, a szállító által megadott körülmények között (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD). Részletesen: 25 pl reakcióelegyet, amely 50 mmol/1 TRIS-HCl-t (pH=8,3), 20 mmol/1 KCl-t, 1 mmol/1 DTT-t, 6 mmol/1 MgCl2-t, 1-1 mmol/l-t az egyes dNTP-kből, 0,1 mmol/1 oligo (dT) 12-18-at, 2 pg bél poli(A+) RNS-t, 100 pg/ml BSA-t, 50 pg/ml aktinomicin D-t, 8 egység placentaRNáz inhibitort, 1 pl (10 mmol Ci/ml) 32p dCTP-t >3000 mCi/mmol, mint nyomkövetőt, és 30 egység AMV reverz transzkriptázt tartalmaz, 42 °C-on inkubálunk 30 percig. További KCl-t adunk hozzá 50 mmol/1 koncentrációban, majd a 42 °C-os inkubálást további 30 percig folytatjuk. Ismét adunk hozzá KCl-t, így ennek végkoncentrációja 100 mmol/1. Még további AMV reverz transzkriptáz puffért adunk hozzá, hogy megtartsuk a többi komponens kiindulási koncentrációját, majd a 42 °C-os inkubálást további 30 percig folytatjuk. A második szál szintézisét Riboclone cDNS-szintézis rendszer alkalmazásával végezzük, EcoRI linkerek (Promega, Madison, WI) felhasználásával. A kétszálú DNS méretét 1%-os agarózgélen határozzuk meg, TRIS-borát-EDTA puffért alkalmazva [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)], az így kapott átlagméret körülbelül 1,2 kb. A cDNS-t méret alapján választjuk el, NA45 DEAE membránt alkalmazva, hogy visszatartsuk azokat a molekulákat, amelyek körülbelül 1000 bp-nél nagyobbak, a szállító által előírt körülmények között (Schleicher and Schüll). A méret alapján frakcionált cDNS-t a lambda-ZapII vektorba (Stratagene, La Jolla, CA) ligáljuk, majd lambda-részecskékbe csomagoljuk, a Gigapack II Plus kit felhasználásával (Stratagene, La Jolla, CA). A nem amplifikált könyvtár titere 315 000 tarfoltképző egység, míg az amplifikált könyvtár titere 3,5 χ 109/ml, PLK-F’ sejteket alkalmazva.
A rekombináns fágokat 5000 tarfoltképző egység sűrűségben szélesztjük 150x15 mm-es L-agarlemezre. Összesen 50 000 fágot vizsgáltunk át, az egyes leme32
HU 220 294 B zekről két másolatot készítve membránra, és az első cDNS-szálról készített, bél eredetű vagy mag eredetű mRNS-t használunk. A másolatokat Maniatis leírása szerint készítjük [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)] nitrocellulóz membránokra. A DNS-t UV-besugárzással kialakított keresztkötésekkel rögzítjük a szűrőlapokhoz, egy Stratalinker felhasználásával (Stratagene, La Jolla, CA), 0,2 mJoule-t alkalmazva. A szűrőlap előhibridizálását és hibridizálását az alábbi összetételű oldatban végezzük: 10X Denhardt oldat, 150 pg/ml összetört heringsperma-DNS, 1% SDS, 50 mmol/1 nátrium-foszfát (pH=7), 5 mmol/1 EDTA, 6XSSC, 0,05% nátrium-pirofoszfát. A prehibridizálást °C-on végezzük 4 óra hosszat, a hibridizálást 62 °Con végezzük 18 óra hosszat (azaz éjszakán át), 1 millió cpm/ml aktivitást alkalmazva 40 ml térfogatban. A szűrőlapokat 500 ml 2X SSC, 0,5% SDS összetételű oldatban mossuk 15 percig szobahőmérsékleten, majd °C-on mossuk 0,lX SSC, 0,5% SDS összetételű oldatban 30 percig. A radioaktív DNS-próbákat BRL random primer jelzési rendszerrel készítjük el, majd a be nem épült aktivitást Nick oszlopokkal (Pharmacia) távolítjuk el. A szűrőlapokat éjszakán át Kodak XOmat AR röntgenfilmre exponáljuk DuPont Cronex Lightning Plus erősítőfóliákat alkalmazva -80 °C-on. Azokat a tarfoltokat, amelyek hibridizálási jeleket adtak a bél eredetű próbával, de nem adtak hibridizálási jeleket a mag eredetű próbával, tarfolt tisztításnak vetjük alá a további tisztítás céljából.
77. példa
Genomiális klánok izolálása A Fűnk beltenyésztett 211D kukoricavonalból származó genomiális DNS-t Shure és munkatársai leírása szerint izoláljuk [Shure et. al., Cell, 75, 225-233 (1988)]. A DNS-t részlegesen emésztjük Sau3A enzimmel, majd ezt követően méret alapján ffakcionáljuk 10-40%-os szacharózgradiensen centrifugálva Beckman SW40 rptprban 22 000/perc fordulatszámmal, 20 óra hosszat, 20 °C-on. A 9-23 kb méretű DNS-t tartalmazó frakciókat egyesítjük és etanollal kicsapjuk. A BamHI restrikciós enzimmel hasított lambda-Dash II vektort (Stratagene) használjuk, a szállító előírásai szerint. A könyvtárat amplifikálatlan állapotban vizsgáljuk át, és összesen 300 000 tarfoltot vizsgálunk át, az előzőkben ismertetett körülmények között. A könyvtárat bélspecifikus (TrpA) 8-2 cDNS-klónnal vizsgáljuk át, és a pCIB5600 kiónt azonosítottuk a cDNS-könyvtár átvizsgálása során. Az izolált kiónokat tartfolt tisztításnak vetjük alá, majd nagy térfogatból izolálunk fágot, Lambdasorb (Promega) felhasználásával, a szállító előírási szerint. Az izolált genomiális kiónokat EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, majd a 4,8 kb méretű EcoRI fragmentet szubklónozzuk Bluescript vektorba (Stratagene).
72. példa
DNS-szekvencia és számítógépes elemzés A nukleotidszekvencia meghatározását a Sanger és munkatársai által ismertetett didezoxi-láncterminációs módszerrel végezzük [Sanger et. al., PNAS, 74, 5463-5467 (1977)]. A szekvenáláshoz szükséges indítómolekulákat egy Applied Biosystems 380B modell DNS-szintetizátorral szintetizáljuk, standard körülmények alkalmazásával. A szekvenálási reakciókat a Sequenase rendszer (US Biochemical Corp.) alkalmazásával hajtjuk végre. A gélelemzést 40 cm hosszú, TRIS-borátEDTA pufferben készített, 7 mól karbamidot tartalmazó 6%-os poliakrilamid-gélen végezzük (BRL Gel-Mix 6). A szekvenciák elemzését és a FenBank-ban levő szekvenciákkal való összehasonlítást az University of Wisconsin Genetic Computer Group Sequence Analysis Software (UWGCG) alkalmazásával végezzük.
13. példa
A transzkripciós startpont térképezése
A primer kiterjesztést Metraux és munkatársai módszerével végezzük [Metraux et. al., PNAS, 86, 896-900 (1988)]. Röviden, 30 pg kukoricabélből származó össz-RNS-t illesztünk az indítómolekulával 50 mmol/1 TRIS (pH=7,5), 40 mmol/1 KC1, 3 mmol/1 MgCl2 összetételű oldatban (RT puffer), oly módon, hogy az elegyet 10 percig 80 °C-on tartjuk, majd lassan 42 °C-ra hűtjük le. Az RNS/indítómolekula elegyet éjszakán át hagyjuk hibridizálódni. További RT puffért adunk hozzá, majd 6 mmol/1 végkoncentrációjú DTT-t, 0,1 mg/ml BSA-t, 4 E/ml RNazint és 1-1 mmol dNTP-t adunk hozzá. Ezután 8 egység AMV reverz transzkriptázt adunk hozzá, és a reakcióelegyet egy órára 37 °Cra tesszük. A használt indítómolekula szekvenciája 5’-CCGTTCGTTC CTCCTTCGTC GAGG-3’, amely a transzkripciós kezdőponthoz viszonyítva +90 bp-nél kezdődik. Lásd a 29A. ábrát. Egy olyan szekvenálólétrát készítünk, amelyhez ugyanazt az indítómolekulát használjuk, mint amelyet a primer extenziós reakcióban használtunk, a 4,8 kb méretű genomiális klón felhasználásával, azzal a céllal, hogy meghatározzuk a transzkripciós kezdőpontot. A szekvenálási reakciót a 12. példában leírtak alapján hajtjuk végre.
Az RNáz-protekciót használjuk annak meghatározására, hogy a +2 bp-től a +373 bp-ig (a cDNS kezdete) terjedő 371 bp méretű szekvencia egybefüggő-e, illetve tartalmaz-e egy vagy több intront. A transzkripciós kezdőponthoz viszonyítva a +2 bp-től a +387 bpig terjedő 385 bp méretű SphI-NcoI fragmentet (lásd 29B. ábra) klónozzuk a pGEM-5Zf(+) vektorba (Promega), majd a Riboprobe Gemini rendszerbe (Promega) klónozzuk, az SP6 promoterről, hogy radioaktívan jelzett antiszensz RNS-próbákat készítsünk, a szállító előírásai szerint. Az RNáz-protekciót a Maniatis és munkatársai által ismertetett módszenei végezzük [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)]. Hpall-vel hasított és 32P-dCTP-vel és Klenow-fragmenttel végjelzett pBR322-t használunk molekulasúly-markerként. A használt gélek 6%os akrilamid/7 mol/1 karbamid gélek (BRL Gel-Mix 6), amelyeket állandó 60 wattos teljesítménnyel futtatunk.
HU 220 294 Β
14. példa
Genomiális Southem-blotok A genomiális DNS-t a 211D kukoricavonalból izoláljuk, Shure és munkatársai előzőkben idézett eljárása alapján. 8 pg genomiális DNS-t használunk az egyes restrikciós enzimes emésztéshez. Az alábbi enzimeket használjuk, a szállító által javasolt pufferben: BamHI, EcoRI, EcoRV, HindlII és Sacl. A 8-2-es számú bélcDNS-klónt használjuk a gén kópiaszámának megbecslésére. Az emésztett DNS-t 0,7%-os agarózgélen futtatjuk, TRIS-Borát-EDTA pufferrendszerben. A gélt 15 percig 250 mmol/1 sósavval előkezeljük, hogy megkönnyítsük a nagy molekulasúlyú DNS transzferét. A DNS-t Nitroplus 2000 membránra visszük át, majd ezt követően a 8-2-es bél-cDNS-sel vizsgáljuk át. A blotot a 10. példában leírtak alapján vizsgáljuk át.
15. példa
PCR anyagok és módszerek A PCR reakciókat GeneAmp DNA Amplification reagens kit felhasználásával hajtjuk végre, és AmpliTaq rekombináns Taq DNS polimerázt (Perkin Elmer Cetus) használunk. A reakciókörülmények az alábbiak: 0,1-0,5 pmol a két indítómolekulából reakciónként, 25 ng a Bluescriptben levő 4,8 kb méretű EcoRI bélfragmentből, plusz a szállító által előírt PCR reakcióelegy, 50 μΐ össztérfogatban 0,5 ml-es GeneAmp reakciócsőben (Perkin Elmer Cetus). A DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus) a Step-Cycle programot alkalmazza, amely során 60 másodpercig 94 °C-on végzi a denaturálást, 60 másodpercig 55 °C-on végzi az illesztést, a hosszabbítást 45 másodpercig végzi 72 °C-on, amelyet egy 3 másodperc per ciklus hosszabbítás követ, összesen 30 ciklusban. Az alábbi indítómolekulákat használjuk: I. 83 X 84, -429 bp-től -2 bp-ig; II. 49 X 73, -69 bp-től +91 bp-ig; III. 38 X 41, +136 bp-től +258 bp-ig; IV. 40 X 75, +239 bp-től +372 bp-ig. Ezeket a 24. ábrán bejelöltük.
16. példa
A bél által előnyben részesített gén izolálása Bél eredetű mRNS-ből származó cDNS-könyvtárat klónozunk lambda-Zapba, majd vagy bél- vagy magRNS-ből származó cDNS első szállal vizsgáljuk át. Azokat a kiónokat, amelyek csak a bélpróbához hibridizálódnak, tarfolttisztításnak vetjük alá, és ismét átvizsgáljuk. Azokat a kiónokat, amelyek a második vizsgálatban is megfeleltek, próbaként használjuk olyan Northem-blotokban, amelyek különböző kukoricaszövetekből származnak.
17. példa
Génszerkezet és szekvenciaelemzés A 8-2 cDNS-klónban levő 1,2 kb méretű inszertet
Sanger és munkatársai idézett didezoxi-láncterminációs módszerével szekvenáljuk. Hasonlóképpen, egy Bluescriptben levő 4,8 kb méretű EcoRI fragmentet, amely a genomiális megfelelő, megszekvenáljuk. Ebből az információból kiderül, hogy a kódolórégió a genomiális másolatban 1,7 kb méretű, és öt intront tartalmaz. Az mRNS-transzkriptum hat exont képvisel. Ezt a 24. ábrán mutatjuk be. Az exonok mérete 43 bp és 313 bp között változik, az intronok mérete 76 bp és 130 bp között változik. A gén teljes szekvenciáját és az abból következő aminosavszekvenciát a 14. ábrán mutatjuk be.
Ez a gén egy 346 aminosavból álló fehérjét kódol, amelynek molekulasúlya körülbelül 38 kD. Amint azt az 1. táblázatban bemutatjuk, a megjósolt fehérje 62%os hasonlóságot és 41%-os azonosságot mutat a Pseudomonas aeruginosa-alegység fehérjéjével, és magas homológiát mutat a más szervezetekből származó trpA fehérjékkel.
1. táblázat
A TrpA szekvenciák konzerválódása a kukorica TrpA gén és más szervezetek között
Összehasonlított szervezetek %-os aminosav hasonlóság %-OS aminosav azonosság
Haloferax volancii 56,4 36,1
Methanococcus voltáé 58,1 35,1
Pseudomonas aeruginosa 62,5 41,8
Neurospora crassa 61,4 39,3
Saccharomyces cerevisiae 56,7 36,1
Hasonlósági csoportosítások, I=L=M=V, D=E, F=Y, K=R,N=Q,S=T
A hasonlóságok és azonosságok meghatározását az UWGCG-től származó GAP programmal végezzük.
Crawforf és munkatársai [Ann. Rév. Microbiol., 43, 567-600 (1989)], amely publikációként a továbbiakban referenciaként kezelünk, konzervált aminosavrégiókat találtak bakteriális trpA génekben. Ezek a 49-58-as aminosavak, a 181-184-es aminosavak, valamint a 213-216-os aminosavak, míg a gén többi része nagyobb variabilitást mutat, mint ami a TrpB szekvenciában látható. Az ismert trpA fehérjéknek a kukorica TrpA fehérjével (nem mutatjuk be) való összehasonlítása azt mutatja, hogy a kukoricagén és más trpA fehérjék között jelentős homológia van. Emellett, ez összehasonlítható azzal a homológiaszinttel, ami akkor figyelhető meg, ha, más TrpA fehéqéket hasonlítunk össze egymással, amint azt Crawford és munkatársai az előzőkben idézett publikációjukban közlik.
Ahhoz, hogy meghatározzuk a transzkripciós kezdőpont helyét, és azt, hogy vajon vannak-e intronok ebben a régióban, négy polimeráz láncreakcióban (PCR) generált fragmentet, amelyek mérete körülbelül 122 bp-től 427 bp-ig terjed, a -429-es bp-től a +372-es bp-ig, használunk próbaként Northem-blot elemzésben. A Northem-blotok eredménye azt mutatja, hogy a ΙΙ-es, III-as és IV-es PCR próbák hibridizálnak a bélből származó össz-RNS-sel, míg az I-es PCR próba nem hibridizál. Ez azt mutatja, hogy a transzkripciós kezdőpont a -69- +90 bp régióban van. Ahhoz, hogy pontosabban meghatározzuk a transzkripciós kezdőpontot, primer extenziót alkalmaztunk. A 29A. ábrán az látható, hogy ha egy indítómolekula (#73) a transzkripciós
HU 220 294 B kezdőponthoz viszonyítva +90 bp-nél található, és ezt használjuk a primer extenzióban, akkor a transzkripciós kezdőpont +l-nél található, a genomiális szekvencián az 1726-os bázispámál.
A transzkripciós kezdőpont után az első ATG a + 114 bp-nél található. Ettől az első ATG-től várható, hogy a transzlációs iniciáció kezdőpontjaként szolgáljon. Ez az ATG egy olyan nyitott leolvasási keretet kezd meg, amely a cDNS-klónban található nyitott leolvasási keretbe fut bele. Ennek a megjósolt nyitott leolvasási keretnek az első 60 aminosava nagyon erősen hasonlít egy kloroplaszt tranzitpeptidre [Berlyn et. al., PNAS, 86, 4604- 4608 (1989); Neumann-Karlin et. al., EMBO J., 5, 9-13 (1986)]. Ez az eredmény azt mutatja, hogy ez a fehérje egy plasztidba irányul, és valószínűleg processzáláson esik át, ahhoz hogy aktív fehérje keletkezzen. Egy kukorica mezofil protoplaszt rendszerében végzett tranziens expressziós vizsgálatok, amelyek során kukoricára optimalizált Bt gént használtunk, a trpA promoter szabályozása alatt áll, azt mutatja, hogy ha a 114-es bp-nél levő ATG-t használjuk fúziós pontként, akkor kapjuk a legmagasabb szintű expressziót. Akármelyik ezután következő két ATG-t használva jelentősen csökken a riportergén expressziója. A +390 bp-nél levő ATG ad valamennyi aktivitást, de sokkal alacsonyabb szinten mint a +114-es ATG, és a +201-es bp-nél levő ATG nem ad aktivitást.
Jóllehet számos TATA szerű box található a +l-nél levő transzkripciós kezdőpont előtt, a -132 bp-nél levő TATAAT a legvalószínűbb növényi konszenzus TATAAA [Joshi, Nucl. Acids Rés., 15, 6643-6653 (1987)]. A feltételezhető CCAAT-szerű box -231 bp-nél található. Az ATG startpontot körülvevő nukleotidszekvencinak (GCGACATGGC) van homológiája más kukoricatranszlációs kezdőpontokkal, amint azt Messing és munkatársai ismertetik [Messing et. al., Genetic Engineering of Plants: An Agricultural Perspective, Plenum Press, 211-227 (1983)], de eltér attól, amit a növényekben konszenzus szekvenciának tekintenek (ANNATGGC) [Joshi, Nucl. Acids Rés., 75, 6643-6653 (1987)]. A feltételezhető poli(A) addíciós szignál a genomiális szekvenciában 3719 bp-nél található (AATAAA), 52 bázispárral a cDNS vége előtt. A szekvencia illeszkedik a kukorica más ismert szekvenciáival [Dean et. al., Nucl. Acids. Rés., 14, 2229-2240 (1986)]. A cDNS 3’ nem transzlálódó cDNS a genomiális szekvencia 3775-ös bázispátjánál végződik.
A 28. ábrán a kukorica 211D genomiális DNS Southem-blot-ja látható, a hozzávetőleges génkópiaszámmal, amit a bél 8-2 cDNS alapján rekonstruálni lehet. A restrikciós emésztésekből és a rekonstrukcióból kiderül, hogy haploid genomonként 1-2 génkópia található. Nem látszanak egyéb gének, amelyek ehhez a génhez kisebb homológiával rendelkeznek. Ennélfogva ez reprezentál egy egyedi vagy kis géncsaládot a kukoricában. 18 * * *
18. példa
RNáz-protekció
Az mRNS 5’-végének szerkezetét RNáz-protekció alapján határozzuk meg. Az RNáz-protekciót egy olyan próbával végezzük, amely a +2 nukleotidtól a +387-es nukleotidig terjedő 385 nukleotidból áll. A genomiális kiónnak ezt a régióját a pGEM- 5Zf(+) RNS-transzkripciós vektorba tesszük, és 32P-vel jelzett RNS-próbát készítünk, SP6 polimeráz alkalmazásával. A próba és a többszörös klónozási helyből származó extra bázisokból egy 461 nukleotidméretű transzkriptum keletkezett. Ez a próba hibridizál a bélből származó összRNS-sel, majd ezt követően RNáz A és TI keverékével emésztjük, majd a védett ffagmenteket denaturáló poliakrilamid-gélen elemezzük. A gélek elemzése azt mutatja, hogy van egy körülbelül 355 nukleotidméretű védett fragment, és egy másik, körülbelül 160 nt méretű fragment. Lásd a 29B. ábrát.
Az a tény, hogy ha a +80 bp-nél egy indítómolekulával (#73) végzünk primer extenziót, akkor egy 90 nukleotidméretű fragmentet kapunk, amellett szól, hogy a transzkriptum 5’-vége a +1 bp-nél található. Ebben a régióban egy indítómolekuláról végzett primer extenzió egy terméket eredményez, tehát azt várhatnánk, hogy ezt a terméket is ki lehet mutatni RNáz-protekciós vizsgálattal. Ez az indítómolekula az RNáz-protekciós próba 5’-régiójában található. A cDNS-klón olyan szekvenciákat tartalmaz, amelyek az RNáz-protekciós próba 3’-végénél találhatók, és ennélfogva várható, hogy ebben a vizsgálatban védettek. Mivel csak egyetlen csík van jelen a gélben, amely mindkét ilyen szekvencia lehet, ezért meg vagyunk győződve arról, hogy a védett fragment valóban a nagyobb csík, és a kisebb, egyedi csík egy műtermék. Ha intron lenne ebben a régióban, akkor mindkét végről származó ffagmentek jelen lennének a próbában, és ennélfogva kimutathatók lennének a gélen. A két látható csík közül az egyikről tűnik úgy, hogy a teljes 5’-régiót reprezentálja, ennélfogva nem hisszük, hogy van ebben a régióban intron.
19. példa
Az Escherichia coli TrpA mutáns komplementációja a bél 8-2 cDNS-sel
Az Escherichia coli CGSC 5531 törzs az Escherichia coli Genetic Stock Centerből származik [Yale University (Ο. H. Smith laboratóriumi törzsjelölése #M5004)], kromoszomális markerei glnA3, TrpA9825,l-, IN(rmDrmE), thi-1 [Mayer et. al., Mól. Gén. Génét., 137, 131-142 (1975)], ezt transzformáljuk vagy a bél (TrpA) 8-2 cDNS-sel, vagy a Bluescript plazmiddal (Stratagene) [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)]. A TrpA 8-2 cDNS-t tartalmazó transzformánsoknak megvan az a képességük, hogy triptofán jelenléte nélkül is képesek minimáltáptalajon növekedni, míg a Bluescript transzformánsok (Stratagene), illetve a nem transzformált kontroll nem képes triptofán nélkül szaporodni. A kukorica TrpA génnel transzformált sejtek nagyon lassan növekednek, olyan telepek jelennek meg, amelyek hét nap után lesznek láthatók, szobahőmérsékleten való növesztés után. Mindegyik törzset M9 minimáltáptalajon szaporítjuk, amelyet 200 pg/ml glutaminnal, 0,01 pg/ml tiaminnal egészítettünk ki, illetve vagy tartalmaz 20 pg/ml triptofánt, vagy nem. Az összes transzfor35
HU 220 294 B mánst megvizsgáljuk, hogy megtalálható-e bennük a megfelelő plazmid (restrikciós enzimes elemzés alapján). A triptofán távollétében is szaporodó telepek mind tartalmazzák a 8-2 kiónt, amely a kukorica feltételezett TrpA génjének cDNS-t hordozza, amit Southern hibridizálási adatokkal lehet megerősíteni (nem közölt adatok). Ezek az eredmények támogatják azt a következtetést, hogy ez egy kukorica triptofán szintetáz A alegység fehérje.
20. példa
Génexpresszió
A bél által előnyben részesített gén expressziós mintázatát vizsgáljuk az egész vizsgált növényben. A különböző kukorica-genotípusokban is vizsgáljuk ennek a génnek a mintázatát. Az alábbi szöveteket használtuk RNS-forrásként ebben a vizsgálatban: felső, középső és alsó bél, támasztógyökerek, a kalász kocsánya, kukoricacsutka az 5N984 genotípusban; felső, középső és alsó bél, 10 napos levelek, 14 napos gyökerek és bél a teljes növényből a 211-es genotípusnál, és magvak a 211-es genotípusból, amelyeket hetenként gyűjtünk be, egy-öt héttel a beporzás után. Az alsó bél a támasztógyökerek fölött két csomóval levő részről származik; a középbél a következő három csomó területéről származik; a felső bél az utolsó két csomó területéről származik, a kukorica címere előtt, 60, illetve 70 napos növényekből. Csak két közbenső csomó van jelen a 39 napos növényekben és három csomó található a 46 napos növényekben. A Northem-blot elemzés azt mutatja, hogy a bél-cDNS-ből készített próbával hibridizálódó transzkriptumok gyorsan felhalmozódnak a fiatal bélben és a fiatal levelekben. Ahogy a növény életkora nő, és ahogy a száron felfelé mozgunk, jelentős csökkenés figyelhető meg a kimutatott transzkriptum mennyiségében. Lásd 25A-D. ábrák. Erről a génről soha nem keletkezik hírvivő RNS magban, nem mutatható ki sem a magból izolált össz-RNS-ben sem a poliA+ RNS-ben. Lásd 26. ábra. A transzkriptum kimutatható a gyökerekben, a címerkocsányban, valamint a héjban, de nem azon a magas szinten, amilyenben a bélben és a fiatal levélszövetekben. Lásd 25B., 25C. ábrák. Valamennyi hírvivő RNS kimutatható a támasztógyökerekben, de csak nagyon alacsony szinten. Lásd a 25D. ábrát. Hat differenciálatlan kukoricakallusz-vonalat vizsgáltunk Northem-blot elemzéssel, és ennek a génnek az expresszióját nem tudtuk kimutatni (nem közölt adatok) egyetlen kalluszmintában sem. Ennek a génnek az expressziója kiugróan magas, mivel nagyon erős jelet ad a TrpA 8-2 génből származó próbával, a bélben és a levelekben, alig két órával a blotnak filmre való expozíciója után (25A. ábra). A keletkező mRNS mennyisége összehasonlítható azzal, amennyi a kukorica foszfoenol-piruvát-karboxiláz génről keletkezik [Hudspeth et. al., Plánt Mól. Biology, 12, 579-589 (1989)], amely egy másik, erősen expresszálódó kukoricagén. Ezt a publikációt a továbbiakban referenciaként kezeljük.
Ennek a génnek az expressziós mintázata időben nem állandó. Az expresszió nagyon magas a növények alsó és középső belében, ha a növények 60 napnál fiatalabbak, és gyorsan csökken a növény teteje irányában.
Ahogy a növény eléri az érettséget, azaz több mint 70 napos, az expresszió közel kimutathatatlan szintre esik vissza, az alsó bél és a címerkocsány kivételével. A transzkriptum felhalmozódása a fiatal levelekben majdnem olyan magas, mint amilyen látható az alsó bélben, de az expresszió gyorsan csökken, és kimutathatatlan a 40 napnál idősebb levelekben. A levelekben való expresszióról kiderült, hogy változó, attól a szezontól függően, amelyikben nő.
Az alábbiakban bemutatott 21-39-es példák egy, a találmány szerinti virágpor specifikus promoter izolálására, jellemzésére és expressziójának elemzésére irányulnak.
Virágpor-specifikus fehéijék azonosítása
21. példa
Kukoricanövények termesztése
Kukoricanövényeket (Zea mays Fűnk beltenyésztett 211D) magról szaporítunk vermikulit/homok keverékben, üvegházban, 16 órás fény/8 órás sötét fényciklusban.
22. példa
Osszfehérje-izolálás
Az érett virágport kukoricanövényekből izoláljuk, amikor maximális a virágpor mennyisége. Megszitáljuk, hogy a törmeléket eltávolítsuk, majd cseppfolyós nitrogénben lefagyasztjuk, és egy 3-4 ml térfogatú lefagyasztott virágport eldörzsölünk egy mozsárban, azonos térfogatú 75-120 pm méretű üveggyönggyel együtt. A feltáró pufferből (2 mmol/l EDTA, 5 mmol/l DTT, 0,1% SDS, 100 mmol/l HEPES pH=8) 40 ml-t adunk hozzá, majd a keveréket ismét eldörzsöljük. Az üveggyöngyöket és az érintetlen virágporszemcséket kis sebességű centrifugálással távolítjuk el, majd az elegyet megtisztítjuk, oly módon hogy 10 000 xg-vei centrifugáljuk 15 percig. A fehérjét a felülúszóból 90% aceton hozzáadásával csapjuk ki.
23. példa
Virágpor exin fehérjéjének izolálása
Az exin fehérjét kukorica 211D virágporból izoláljuk, Matousek és Tupy leírása szerint [Matousek and Tupy, Plánt Physiology, 119, 169-178 (1985)].
24. példa
Levélfehérje izolálása
Fiatal leveleket (körülbelül 60%-ban kiterült) vágunk le a kukoricanövényről, és a középső bordát kivágjuk. Az összfehérjét ugyanúgy izoláljuk, mint ahogy a virágporra leírtuk, azzal az eltéréssel, hogy az anyagot nem fagyasztjuk le, és a feltárást Waring blendorban végezzük, üveggyöngyök nélkül.
25. példa
Magfehérje izolálása
Teljesen kifejlett, de még nedves magvakat tartalmazó csöveket távolítunk el a növényről, majd a magvakat szikével kivágjuk. Az összfehérjét a levelekre leírt módon izoláljuk.
HU 220 294 B
26. példa
A kukoricafehérjék gélelektroforézise A virágpor, levél és magfehéijéket SDS poliakrilamid-gélen választjuk szét [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)]. A Coomassie blue-val való festés után a virágporból, levélből és magokból származó fehérjecsíkokat összehasonlítjuk, és a nagymennyiségben előforduló 10 kD, 13 kD, 20 kD, 45 kD, 55 kD és 57 kD méretű fehérjékről megállapíthatjuk, hogy virágpor-specifikusak.
A virágpor-specifikus cDNS-klónok azonosítása
27. példa
A virágpor-specifikus fehérjék szekvenciájának részleges meghatározása
Azokat a fehéijecsíkokat, amelyekről megállapítottuk, hogy virágpor-specifikusak, elektroblotolással a poliakrilamid-gélről PVDF membránra visszük át [Matsuidara, P., J. Bioi. Chem., 261, 10035-10038 (1987)], és így tisztítjuk, vagy pedig fordított fázisú HPLC-vel. A tisztított fehérjék N-terminális szekvenciáját automatizált Edman-degradációval határozzuk meg, Applied Biosystems 120A PTH analizátorral. Ahhoz, hogy belső szekvenciát is kapjunk, a fehérjéket endoproteináz Lys-C-vel (Boehringer Mannheim) emésztjük 0,1 mol/1 TRIS-HC1 pH=8,5 összetételű pufferben, 24 óra hoszszat, szobahőmérsékleten, az alkalmazott enzim: szubsztrát arány 1:10. A keletkező peptideket HPLC-vel izoláljuk, Aquapore C-8 oszlopon, TFA-ban készített lineáris acetonitril/izopropanql (1:1 arány) gradienst (0-60%) alkalmazva. Az izolált Lys-C peptidek szekvenciáját az előzőkben ismertetett módon határozzuk meg. A 13 kd méretű virágpor-specifikus fehérjére az alábbi szekvenciákat határoztuk meg:
TTPLTFQVGKGSKPGGHL1LTPNVATI KPGHLILTPNVATISEWIK SGGTRIADDVIPADFK EHGGDDFSFTLK EGPTGTWTLDTK
N-terminális:
LysC61:
LysC 54:
LysC 49:
LysC 43:
Oligonukleotidpróbák szintézise virágpor-specifikus cDNS-ekhez
A 13 kD méretű fehérjében olyan szekvenciákat választunk ki, amelyeknek kicsi a kodonredundanciája, majd az ezeket a régiókat kódoló génszakaszokhoz megfelelő oligonukleotidpróbákat szintetizálunk Applied Biosystems 380A szintetizátorral. Az alábbi oligonukleotidokat szintetizáltuk:
51-esoligo: 5 ’-AA ATC ATC ACC ACC ATG TTC-3 ’
G G G G C
T c
58-as oligo: 5 ’-CC TTT ACC CAC TTG AAA-3’
CG CG
T
C
Ahol a nukleotidok oszlopai olyan bázisokat jelente- 40 nek, amelyeket ranszdomszerűen építünk be, azonos arányban az oligo jelzett pozícióiba. Az 51-es oligo a LysC 49-ben talált EHGGDDF aminosavszekvenciát kódolja, az 58-as oligo pedig a peptid N-terminálisánál talált FQVGKG szekvenciát kódolja. Ezeknek a kevert oligonukleotidoknak az alkalmazását egy cDNS-könyvtár pollenspecifikus gén keresése céljából való átvizsgálásában az alábbiakban ismertetjük.
29. példa
Kukorica-virágpor cDNS-könyvtár készítése A kukorica 211D elhullott pollenből származó összkukorica-RNS-t izolálunk, Glisen és munkatársai leírása szerint [Glisen et. al., Biochemistry, 13. 2633-2637 (1974)]. Poli A+ mRNS-t tisztítunk az össz-RNS-ből [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)]. Ennek az mRNS-nek a felhasználásával cDNS-t készítünk, egy Promegától vásárolt cDNS-szintézis kit segítségével, a kit mellé adott leírást követve. EcoRI linkereket adunk a cDNS-hez, majd a Zap lambda klónozó vektor karjaiba ligáljuk, amelyet a Stratagene-től vásároltunk, a gyártó által megadott leírás alapján. A ligálás termékét lambda pakoló extraktba csomagoljuk, amit szintén a Stratagene-től vásárolunk, majd Esche45 richia coli BB4 sejteket fertőzünk vele
30. példa
Virágpor-specifikus cDNS-klónok izolálása A kukorica-cDNS-könyvtárat a 13 kD fehérjére spe50 cifikus szintetikus oligonukleotidokkal vizsgáljuk át [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)]. Röviden, a virágpor-cDNS-ből körülbelül 100 000 fág tarfoltot szélesztünk ki, majd viszünk át 55 nitrocellulóz membránokra. A membránokat az 51-es és 58-as oligonukleotidokkal vizsgáljuk át, amelyeket polinukleotid-kináz alkalmazásával a végükün 32P-vel jeleztünk. A próbákat alacsony szigorúságú körülmények között hibridizáljuk a membránokhoz (50 °C 60 1 mol/1 NaCl, 10% dextrán-szulfát, 0,5% SDS-összeté37
HU 220 294 B telű oldat), majd szobahőmérsékleten mossuk 30 percig, majd 45 °C-on mossuk 6X SSC, 0,1% SDS-összetételű oldatban, majd röntgenfilmre exponáljuk, a pozitív kiónok azonosítása céljából. A feltételezett kiónokat négyszeres tarfolt-hibridizálással tisztítjuk. Három különböző osztályba sorolhatók az izolált cDNS-klónok. Az I-es típus 0,2-1,8 kb méretű EcoRI ffagmenteket tartalmaz. A ΙΙ-es típus 0,6 kb, 0,5 kb és 1,0 kb méretű EcoRI fragmenteket tartalmaz, a III-as típus pedig egy
2,3 kb méretű EcoRI ífagmentet tartalmaz.
31. példa
A virágpor-specifikus cDNS-klónok jellemzése
A ΙΙ-es típusú cDNS-klón EcoRI fragmentjeit a pBluescript SK+ plazmid vektorba szubklónozzuk, amelyet a Stratagene-től vásároltunk. Lásd a 30. ábrát. A pBluescriptben levő 0,6 kb méretű fragment jele II—.6, a pBluescriptben levő 0,5 kb méretű fragment jele II—.5 (utóbb pCIB3169-nek neveztük át), a pBluescriptben levő 1,0 kb méretű fragment jele II-1.0 (később ámeveztük pCIB3168-cá). Amint azt az alábbiakban ismertetjük, a 0,5 kb és az 1,0 kb méretű fragmentek a kukorica virágpor-specifikus CDPK génjét kódolják. A hím portokokból, a virágporból, a levélből, a gyökerekből és a selyemből származó RNS-t glioxállal denaturáljuk, 1%-os agarózgélen elektroforetizáljuk, nitrocellulóz membránra visszük át, majd külön átvizsgáljuk a három EcoRI fragmenttel, amelyeket 32P-vei jeleztünk random prímé extenziós módszerrel [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)]. A biotokat röntgenfilmre exponáljuk, majd egy körülbelül 1,5 kb méretű mRNS-csíkot azonosítunk a 0,6 kb méretű fragmentpróbával, miközben a 0,5 és 1,0 kb méretű fragmentből készített próbák egy körülbelül 2,0 kb méretű mRNS-hez hibridizálódnak. Mindegyik esetben a hibridizáció csak a virágpor RNS-csíkjában látható, azzal az eltéréssel, hogy a 0,6 kb méretű fragment csak gyenge jelet adott a hím portok mRNS-ével. Az ezekből az adatokból levonható következtetés az, hogy az eredeti cDNS-klón egy fúzió terméke, két különböző mRNS-ből származó cDNS-molekulák között. A 0,6 kb méretű fragment egy részleges cDNS, amely egy 1,5 kb méretű virágpor-specifikus mRNS-ről származik, és ez az mRNS kódolja a LysC 49 és az Nterminális peptideket. Az 1,0 és 0,5 kb méretű fragmentek egy részleges cDNS-t tartalmaznak a 2,0 kb méretű virágpor-specifikus mRNS-ből, amelynek nincs köze a próbákként használt oligonukleotidpróbákhoz és peptidekhez. Ezt a következtetést akkor igazoltuk, amikor a fragmenteket a Sambrook és munkatársai által leírt didezoxi-láncterminációs módszerrel szekvenáltuk [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)]. A cDNS-szekvenciát a 31. ábrán mutatjuk be.
32. példa
Az mRNS-expresszió specifitásának meghatározása
Annak meghatározására, hogy a pCIB3169 és pCIB3168 cDNS-klónok által képviselt 2,0 kb méretű
RNS csak a virágporban van-e jelen, a 211D kukorica gyökereiből, leveleiből, virágporából, hím portokjából vagy selyméből össz-RNS-t izolálunk. Az RNS-eket glioxállal denaturáljuk, 1%-os agarózgélen elektroforetizáljuk, nitrocellulóz membránra visszük át, majd a pCIB3168 vagy pCIB3169 plazmidból származó EcoRI inszertből készített 32P-vel jelzett próbával vizsgáljuk át, standard módszerek alkalmazásával [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)]. Ezt a blotot fényképészeti filmre exponálva igazolni lehet, hogy a két klón által képviselt gén csak a virágporban aktív a transzkripcióban (32. ábra).
Egy virágpor-specifikus promoter azonosítása
33. példa
Kukorica genomiális DNS-könyvtár készítése
A 211D fiatal hajtásaiból készített genomiális DNS-t Shure és munkatársai módszerével izoláltuk [Shure et. al., Cell, 35, 225- 233 (1983)]. A DNS-t átadtuk a Stratagene-nek, ahol genomiális DNS-könyvtárat készítettek belőle, oly módon hogy a Sau3AI-gyel részlegesen emésztett DNS-t a Stratagene lambda-Dash klónozó vektorba klónozták.
34. példa
Genomiális biot hibridizálása, abból a célból, hogy meghatározzuk a génköpiaszámot A kukorica 211D vonalból származó genomiális
DNS-t számos különböző restrikciós enzimmel emésztjük, az egyes emésztményeket agarózgéleken elektroforetizáljuk, nitrocellulózra visszük át, majd a pCIB3168 plazmidból (1,0 kb méretű fragment) a pCIB3169 plazmidból (0,5 kb méretű fragment) vagy a II—.6 kiónból származó 32P-vel jelzett EcoRI inszerttel vizsgáljuk át, standard technikák alkalmazásával [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)]. Több mint 10 sávot lehetett a II—.6 próbával kimutatni a legtöbb emésztmény esetében, jelezve, hogy ez a cDNS egy nagy, multigén családból származik. Az 1,0 kb méretű fragmenttel mint próbával vizsgálva 3-6 csíkot lehetett kimutatni, a 0,5 kb méretű fragmenttel mint próbával vizsgálva csak 1-3 csíkot lehetett kimutatni, amelyek az 1,0 kb méretű fragment által kimutatott csíkok egy alcsoportját képezik. Az 1,0 kb és 0,5 kb méretű fragmentek által kimutatott kisebb géncsaládméret következtében elhatároztuk, hogy a nekik megfelelő genomiális kiónt izoláljuk.
35. példa
Egy virágpor-specifikus genomiális klón izolálása
A Stratagene kukorica 211D genomiális könyvtárat tarfolt kópiákat a CIB3168 (1,0 kb méretű fragment) és a pCIB3169 plazmid (0,5 kb méretű fragment) 32P-vel jelzett inszertjeivel vizsgáljuk át, a könyvtár mellé adott Stratagene kézikönyvben leírt standard eljárás alkalmazásával. Ennek a stratégiának az alkalmazásával izoláltuk az MG14 lambda-klónt, amely mindkét próbával hibridizálódik. Az MG14-nek a 9,0 kb méretű BamHI fragmentjét, amely szintén hibridizálódik mindkét próbával,
HU 220 294 B a pBluescript SK+ BamHI hasítási helyére klónozzuk, így hozzuk létre a pCIB379-es plazmidot. A pCIB379-es plazmidból 1800 bp-t, amely megfelel a cDNS-szekvenciának, az előzőkben ismertetett módon megszekvenálunk. A cDNS és genomiális szekvenciák összehasonlítá- 5 sa csak 91%-os azonosságot mutatott. A pCIB379 inszert egy rokon virágpor-specifikus gént képvisel.
Egy második kukorica 211D genomiális könyvtárat is készítünk a lambda-GEM-11 vektorban, amelyet a Promega cégtől lehet beszerezni, a Promeg kézikönyv- 10 ben megadott eljárásokat alkalmazva. Ennek a nem amplifikált könyvtárnak a fentiek szerinti átvizsgálása eredményezte a GEM11-1 kiónt, amely szintén hibridizálódik mindkét próbához; ezt szubklónozzuk a pBluescript SK+ plazmidba, így kapjuk a pCIB3166 plazmidot. 15 A pCIB3166 4,l kb méretű ffagmentjének DNS-szekvenciáját meghatározzuk (36. ábra), majd beleszámítva a genomiális kiónban levő hat intront, kiderül, hogy 100%-ig azonos a pCIB3168 és pCIB3169 kiónokban levő DNS-szekvenciával. A pCIB3166 szekvenciáját a GenBank/EMBL adatbázisban levő szekvenciákkal öszszehasonlítva kiderül, hogy az 5’-rész, a 3-as exonon keresztül aminosavszinten 34,6%-ban azonos a patkánykalmodulin-dependens ΙΙ-es fehéqe kinázzal (33. ábra), míg a negyedik-hetedik exonon keresztül 39,4%-ban azonos a patkánykalmodulinnal. Lásd a 34. ábrát. Nem írtak le más virágpor-specifikus kinázt, és ez idáig ismeretlen volt, hogy ebben a fehéqében a kináz- és kalmodulindomének kombinálódnak. Ezt követően Harper és munkatársai [Science, 252, 951-954 (1991)] meghatározták egy szójababból származó hasonló fehéqe cDNSszekvenciáját, jóllehet ennek a génnek az expressziója nem volt virágpor-specifikus. A szójabab kalcium-dependens fehéqe kináz (CPDK) és a kukorica-virágpor CPDK összehasonlításával aminosavszinten 38%-os azonosságot lehet kideríteni. Lásd 35. ábra.
36. példa
A promoter transzkripciós kezdőpontjának felderítése primer extenzióval 20 Az alábbi szekvenciával rendelkező, PE51 jelű oligonukleotidot szintetizáljuk, indítómolekulának:
5’-TGGCCCATGGCTGCGGCGGGGAACGAGTGCGGC-3’
A primer extenziós elemzést poliA+ virágpor RNS-sel végezzük, Metraux és munkatársai leírása szerint [PNAS USA, 86, 896-890 (1989)]. A transzkripciós kezdőpontot a 1415 és 1425 bázisok között találtuk meg, a pCIB3166 36. ábrán bemutatott részleges szekvenciáján.
A promoterfunkció tesztelése növényekben.
37. példa
Promoter vektorok készítése növény transzformálásához
Annak igazolására, hogy a virágpor CPDK promoter vezérelheti egy hozzákapcsolt gén expresszióját transzgenikus növényekben, a virágpor CPDK promoter és az Escherichia coli béta-glükuronidáz génje között fúziót hozunk létre, az alábbiak szerint. A lambda-GEM-11 vektor 10 kb méretű BamHI fragmentjét, amely a virágpor CPDK génjének az első exonját és az első intron egy részét tartalmazza, plusz 9 kb-t a gén előtti régióból, a pBluescript SK+ plazmid BamHI hasítási helyére klónozzuk, így kapjuk a pCIB3167 plazmidot. A pCIB3167 plazmid 2,3 kb méretű BamHI- HindlII fragmentjét a pBluescript plazmid BamHI-HindlII hasítási helyére klónozzuk, így kapjuk a pSK105 plazmidot. A pSK105 plazmidot Aval és HindlII enzimekkel emésztjük, majd az 1,75 kb méretű HindlII-Aval fragmentet agarózgélből izoláljuk. PCR reakciót futtatunk standard körülmények között [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)], templátként az érintetlen pSK105-öt, indítómolekulákként pedig az alábbi oligonukleotidokat alkalmazva:
#42: 5 ’-AGCGGTCGACCTGCAGGCATGCGATCTGCACCTCCCGCCG-3’ #43: 5’-ATGGGCAAGGAGCTCGGG-3’
A PCR reakciótermékeket Aval és Sáli enzimekkel emésztjük, majd a kapott fragmentet agarózgélen izoláljuk. A pBluescript SK+ plazmidot HindlII és Sáli enzimekkel emésztjük. Az 1,75 kb méretű HindlII-Aval fragmentet, a PCR eredetű Aval-Sáli fragmentet, és a HindlII-Sall végekkel rendelkező pBluescript vektort egyszerre összeligáljuk, így kapjuk a pSKllO plazmidot.
A pSKl 10 plazmidban a fúziót a béta-glükuronidáz (GUS) génnel úgy hozzuk létre, hogy a pSKllO plazmidot HindlII és Sáli restrikciós enzimekkel emészt- 55 jük, az 1,9 kb méretű fragmentet agarózgélen izoláljuk, majd a pCIB3054 HindlII-Sall hasítási helyére ligál45 juk, így kapjuk a pKL2 plazmidot, amely a GUS gént tartalmazó pUC19 plazmidból származik, ezt követi a kukorica PEPC génjéből származó intron és a karfiolmozaikvírus poliA jele. Ez a promoter fúzió növényekben inaktív, valószínűleg azért, mert a GUS gén ATG50 jét megelőző leaderszekvenciában leolvasási kereten kívül eső ATG kodonok találhatók.
A promotemek egy működőképes fúzióját úgy hozzuk létre, hogy a pKL2 plazmidot Xbal és Sáli restrikciós enzimekkel emésztjük, hogy az előző fúziós struktúrát eltávolítsuk. Egy új fúziós kapcsolatot hozunk létre egy PCR reakcióban, templátként pSK105 plazmidot, és az alábbi indítómolekulákat alkalmazva:
# SK5 0: 5’-CCCTTCAAAATCTAGAAACCT-3’ #SK49: 5’-TAATGTCGACGAACGGCGAGAGATGGA- 3’
HU 220 294 B
A PCR terméket Xbal és Sáli restrikciós enzimekkel emésztjük, majd agarózgélen tisztítjuk. A tisztított fragmentet a pKL2 plazmid Xbal és Sáli hasítási helyére ligáljuk, így hozzuk létre a pCIB3171 plazmidot. Ez a plazmid tartalmaz egy működőképes fúziót a virágpor 5 CPDK promotere és a GUS között, amely vezérli a GUS gén expresszióját, kizárólag virágporban.
Ahhoz, hogy olyan vektort készítsünk, amely Agrobacterium tumefaciens segítségével végzett növényi transzformációhoz alkalmazható virágpor CPDK pro- 10 moter-GUS fúziót tartalmaz, a fúziós gént izoláljuk pCIB3171 plazmidból, HindlII és Sáli restrikciós enzimes emésztések útján. A kapott fragmentet a pBlOl (beszerezhető a Clontech-től) plazmid HindlII-Sáli hasítási helyére ligáljuk, így hozzuk létre a pCIB3175 15 plazmidot.
38. példa
Transzgenikus növények készítése
ApCIB3175 plazmidot Agrobacterium tumefaciens- 20 be transzformáljuk, amely a pCIB542 segítőplazmidot tartalmazza, majd a kapott tenyészetet használjuk dohányhaj táscsúcs-tenyészetekből származó levélkorongok transzformálására [Horsch et. al., Science, 227, 1229-1231 (1985)], azzal az eltéréssel, hogy a tápláló 25 tenyészeteket kihagyjuk, és a szelekciót 100 mg/1 kanamicinen végezzük. A transzgenikus növényeket regeneráljuk, és PCR-rel igazoljuk, hogy bennük megtalálható a transzgén.
39. példa
A GUS expresszió elemzése A primer transzformánsokból származó virágport és utódaikat hisztokémiailag elemezzük, a GUS gén expressziójának kimutatása céljából [Guerrero et. al., Mól. Gén. Génét., 224, 161-168 (1990)]. A GUS gént expresszáló virágporszemcsék százalékát, amint azt X-gluc pufferben végzett kékre való színeződés alapján ki lehet mutatni, az alábbi táblázatban mutatjuk be:
Növény száma Kék virágpor százaléka
PP1-51
PP1-54
PP1-55
PP1-61
PP1-63
PP1-67
PP1-80
PP1-83 nincs nagyon, kevés 51 15 20 12
A primer transzformánsok, amelyekbe egyetlen virágpor CPDK promoter-GUS gén integrálódott, maximum 50% GUS-pozitív virágport eredményeznek, az egyetlen gén szegregációja következtében.
Fluorimetriás GUS vizsgálatokat végzünk virágporon, száron, gyökereken, leveleken és bibeszöveten, kiválasztott növényekből, hogy igazoljuk a virágpor CPDK promoter expressziójának specificitását. A vizsgálatokat Jeferson leírása szerint végezzük [Plánt Mól. Bioi., 14, 995-1006 (1990)], majd a GUS aktivitási értékeket nmol MU/pg fehétje/perc értékben fejezzük ki.
A növény száma Szövet GUS aktivitás Transzformálatlan növény GUS aktivitása Tiszta GUS aktivitás
PP1-51 szár 0,01 0,02 0
levél 0 0 0
gyökér 0,15 0,10 0,05
bibe 0,02 0,01 0,01
virágpor 0,24 0,02 0,22
PP1-54 szár 0,01 0,02 0
levél 0 0 0
gyökér 0,13 0,10 0,03
bibe 0,01 0,01 0
virágpor 0,60 0,02 0,58
PP1-63 szár 0,01 0,02 0
levél 0 0 0
gyökér 0,07 0,10 0
bibe 0,01 0,01 0
virágpor 0,57 0,02 0,55
A 40-50-es példák elsődlegesen kiméra konstrukciók, azaz rekombináns DNS-molekulák készítésére irá- 55 nyúlnak, amelyek konstitutív, szövetek által előnyben részesített, vagy szövetspecifikus promotereket tartalmaznak, működés szempontjából egy Bacillus thüringiensis-génhez kapcsolva, és ezt a konstrukciót vektorokba építve, majd a vektort tartalmazó transzgenikus 60 növényeket készítve, és a Bacillus thüringiensis-fehérjék expressziós szintjét vizsgálva a transzgenikus növényekben.
40. példa
Kukoricára optimalizált Bacillus thüringiensis transzformációs vektorok készítése
HU 220 294 B
Annak igazolására, hogy a szintetikus Bacillus thüringiensis crylA(b) gén hatékony kukoricában, a PepC és bélspecifikus promotereket fuzionáltatjuk a szintetikus crylA(b) génnel, PCR-t használva erre a célra. A PCR fúziókhoz tervezett oligomerek az alábbiak:
(PEPC)
KE99A28= 5 ’-TGCGGTTACC GCCGATCACATG- 3 ’
KE97A28= 5’-GCGGTACCGC GTCGACGCGG ATCCCGCGGC GGGAAGCTAAG-3’ (BÉL)
KE100A28= 5 ’-GTCGTCGACC GCAACA-3’
KE98A28= 5’-GGGTACCGC GTTAACGCGG ATCCTGTCCG ACACCGGAC-3’ KE104A28= 5 ’-GATGTCGTCG ACCGCAACAC-3 ’
KE103A28= 5’-GCGGTACCGC GGATCCTGTC CGACACCGGA CGGCT-3’
A PCR indítómolekulákat úgy terveztük meg, hogy az említett szövetspecifikus gének 5’ nem transzlálódó leaderrégiójában BamHI hasítási hellyel helyettesítsék az Ncol hasítási helyet (amely ATG transzlációs kezdőpontot tartalmaz), hogy ezzel megkönnyítsük a szintetikus crylA(b) gén klónozását ebbe a BamHI hasítási helybe. A szintetikus crylA(b) génhez fúzionáltatott szövetspecifikus promotereket és a 35S: PAT: 35S marker gént tartalmazó vektorok ezt követő készítéséhez számos intermedier konstrukciót használunk fel.
1. pCIB4406 (3 5 S: szintetikus - cry I A(b): pepC ivs#9:35S)
A pCIB4406 tartalmazza a 2 kb méretű BamHI/Clal szintetikus cryIA(b) gént a CaMV 35S*promoterhez fúzionáltatva [Rothstein et. al., Gene, 53, 153-161 (1987)]. A gén tartalmazza ezenkívül a #6 intront is, amely a kukorica PÉP karboxiláz génből származik (ivs#9), a gén 3’ nem transzlálódó részében, amely a CaMV3’-véget használja [PNAS USA, 83, 2884-2888 (1986); Hudspeth et. al., Plánt Molecular Biology, 12, 579-589 (1989)]. A pCIB4406-ot Egáljuk, majd az Escherichia coli „SURE” törzsbe transzformáljuk (Stratagene, La Jolla, CA), az előzőkben ismertetett módon. Egy mutációt találtunk a pCIB4406 cryIA(b) génben a #436-os aminosavnál, aminek eredménye az, hogy a szükséges Phe Leu-ra változott. A pCIB4406 teljesen aktív az európai magfúróval szemben, amikor rovarbioesszében vizsgáljuk, és a várt méretű CryIA(b) fehérjét termeli, Westem-blot elemzés alapján.
2. pCIB4407 (35S szintetikus-crylA(b):pepC ivs#9:35S+ 35S:PAT:35S)
A pCIB4407 plazmidot egy körülbelül 4 kb méretű HindlII/EcoRI ffagmentből állítjuk elő, amely tartalmazza a 35S: PAT: 35S gént, valamint a pCIB4406-ból származó 3,1 kb méretű HindlII/EcoRI ffagmentből, amely a 35S: szintetikus-crylA(b): 35S gént tartalmazza. A pCIB4407 plazmidot ligáljuk, majd Escherichia coli „SURA” DH5alfa-és HB101 törzsekben transzformáljuk, standard módszerek alkalmazásával [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)]. A szintetikus crylS(b) génnek ugyanazok a tulajdonságai mint a pCIB4406 prekurzorának.
3. pCIB4416 (35S:szintetikus-cryI(b)rpepC ivs#9:35S+35S:PAT:35S+35S:Adh intron:GUS:35S)
A pCIB4407 plazmidot EcoRI restrikciós enzimmel hasítjuk, majd borjúból alkalikus foszfatázzal (CIP) kezeljük standard körülmények között [Maniatis et. al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. ed. (1989)], így állítjuk elő egy körülbelül 7,2 kb méretű fragmentet, amelyet egy
3,4 kb méretű EcoRI 35S: Adh/GUS:35S fragmenthez Egálunk, így kapjuk a pCIB4416-ot. A ligálást és a „SURE” törzsbe való transzformálást az előzőkben ismertetett módon végezzük. A pCIB4416-ban levő szintetikus crylA(b) gén tulajdonságai azonosak a pCIB4406ban levő gén tulajdonságaival.
4. pCIB4418 (35S: szintetikus-crylA(b): pepC ivs#9:35S)
A pCIB4406 plazmidot Apai és BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük, majd CIP-pel kezeljük, a pCIB4406-ot BamHI és Nspl enzimekkel emésztjük. A pSB123#13 plazmidot Nspl és Apai enzimekkel emésztjük. A három fragmentet egy lépésben Egáljuk össze, a három ffagment a következő: egy 4,3 kb méretű Apal/BamHI ffagment a pCIB4406-ból, egy 1,3 kb méretű BamHI/NspI ffagment a pCIB4406-ból, és egy 170 bp méretű Nspl/Apal ffagment a pBS123#13 plazmidból, így kapjuk a pCIB4418 plazmidot. A pCIB4418 gazdatörzse az Escherichia coli HB101.
5. pCIB4419 (35S: szintetikus-crylA(b):pepC ivs#9 + 35S:PAT:35S+35S:Adh intron: GUS: 35S)
A pCIB4416 és pCIB4418 plazmidokat BstEII és EcoNI enzimekkel emésztjük, majd a pCIB4416 ffagmenteket CIP-pel kezeljük. A pCIB4416-ból származó 9,1 kb méretű fragmentet Egálunk a pCIB4418-ból származó 1,4 kb méretű ffagmenttel, így kapjuk a pCIB4419 plazmidot. A pCIB4419-et kompetens Escherichia coli HB101 sejtekbe transzformáljuk. A pCIB4419 terméke teljes aktivitással rendelkezik az európai magfúró ellen rovarbiológiai vizsgálatokban.
6. pCIB4420 (Bél :szintetikus-cryIA(b):PEPC ivs#9:35S + 35S:PAT:35S)
A pCIB4420 előállításában köztitermék a pBtinl, pBtin2, a p4420A és a pBtin3 plazmid. A pBtinl plazmidot (promoter:a szintetikus Bt gén második fele + 35S:PAT:35S) úgy állítjuk elő, hogy a pith(3—1) plazmidból származó 2,1 kb méretű Xbal/Ncol bélpromoter-ffagmentet a pCIB4407-ből származó 5,2 kb méretű Xbal/Ncol ffagmenttel Egáljuk. A pBtin2 egy köztes
HU 220 294 B konstrukció, amely a bélpromotert tartalmazza, módosítva egy 210 bp méretű PCR fragmenttel,amelyet az előzőkben említett KE100A28 és KE98A28 indítómolekulák alkalmazásával állítottunk elő. A PCR reakcióelegy tartalma körülbelül 100 ng BamHI/NcoI bélpromoterffagment, az egyes oligomerekből 100-100 pmol, az egyes dNTP-kből 200-200 nmol, IX puffer (Cetus), és
2,5 egység hőstabil polimeráz. Mivel a Tm viszonylag alacsony (40 °C és 50 °C között), ezért a PCR reakciókat az alábbi paraméterekkel futtatjuk:
denaturálási ciklus: 94 °C 1 percig, illesztési ciklus: 37 °C 1 percig, hosszabbítási ciklus: 72 °C 45 másodpercig (+3 másodperc ciklusonként), a ciklusok száma: 25.
A PCR reakcióelegyeket proteináz K-val kezeljük, az előzőkben ismertetett módon, mielőtt Sall/KpnI enzimekkel emésztjük, majd fenol-kloroform eleggyel extraháljuk, és etanollal kicsapjuk, az előzőkben ismertetett módon. A 210 bp méretű fragmentet 2%-os Nusieve gélen tisztítjuk, majd a gélből extraháljuk, Millipore szűrőegységek alkalmazásával. A 210 bp méretű Sall/KpnI fragmentet a pith(3 — 1 )-ből származó 4,9 kb méretű Sall/KpnI fragmenthez Egáljuk, így állítjuk elő a pBtin2 plazmidot. A p4420A plazmidot (bél: szintetikus-Bt:Pep intron:35S + 35S:PAT:35S) három fragment összeligálásával állítjuk elő. A három fragment: 700 bp méretű Nsil/BamHI fragment a pBtin2-ből, egy 1,8 kb méretű BamHI/BstEII fragment a pCIB4418 plazmidból, és egy 5,9 kb méretű BstEII/Nsil fragment a pBtinl plazmidból. A p4420A plazmid elkészülte után három mutációt fedeztünk fel a pBtin2 plazmidban. Egy második PCR fragmentet készítettünk, hogy a bél-leaderszekvenciában módosítsuk az Ncol hasítási helyet, a KE104A28 és KE103A28 indítómolekulák alkalmazásával, a Tm érték 65 °C körül van. A PCR reakcióelegy összetétele azonos az előzőkben felsoroltakéval, azzal az eltéréssel, hogy 20% glicerint adtunk hozzá azzal a céllal, hogy csökkentsük a mutációt a G+Cben gazdag régiókban [Henry et. al., Plánt Molecular Biology Reporter, 9, (9), 139-144 (1991)]. A PCR reakció paraméterei az alábbiak:
I. fiié: II. fiié: 94 °C: 3 perc, 1 ciklus 60 °C: 1 perc 94 °C: 1 perc 25 ciklus
III. fiié: 72 °C: 5 perc, 1 ciklus,
A PCR reakcióelegyeket az előzőkben említett módon kezeljük, majd Sáli és KpnI restrikciós endonukleázokkal emésztjük. A 210 bp méretű Sall/KpnI PCR (a reakcióelegyben glicerin van) fragmentet a pith(3—1) plazmidból származó 4,9 kb méretű Sall/KpnI fragmenttel Egáljuk, így kapjuk a pBtin3 plazmidot. A pBtin3-G#l szekvencia adatai azt mutatják, hogy ez a PCR-rel előállított fragment helyes.
A pBtin-G#l plazmidot használjuk a pCIB4420 plazmid előállítására (ezt említjük még p4420B”G#6” néven is). A pCIB4420 plazmidot három fragment egy reakcióban való ligálásával állítjuk elő: a pBtin3-G#l plazmidból származó 700 bp Nsi fragment, egy 1,8 kb méretű, a pCIB4418 plazmidból származó BamHI/BstEII fragment, és egy 5,9 kb méretű, a pBtin3 plazmidból származó BstEII/Nsil fragment. A pCIB4420 plazmidot mezofill protoplaszt kísérletekben használjuk, ekkor a benne levő szintetikus cryIA(b) gén teljes aktivitást mutat az európai magfüróval szemben.
7. pCIB4413 (PEPC: szintetikus-Bt (Phe mutáció) : PEPC intron: 35S)
Egy fúziós fragmentet készítünk PCR-rel a KE99A28 és a KE97A28 indítómolekulák felhasználásával, a pGUS4.5 plazmidból származó 2,3 kb méretű HindlII/Sall templát felhasználásával. A PCR reakcióelegy ugyanabban a koncentrációban tartalmazza az indítómolekulákat, a templátot, a dNTP-ket, a sókat és a hőstabil polimerázt, mint ahogy az előzőkben ismertettük. A PCR reakció paraméterei az alábbiak:
denaturációs ciklus: 94 °C1 perc, illesztési ciklus: 55 °C1 perc, hosszabbítási ciklus: 72 °C 45 másodperc (+3 másodperc ciklusonként), ciklusok száma: 30.
A teljes befejeződés után a PCR reakciókat proteináz K-val kezeljük, majd fenol-kloroform eleggyel extraháljuk és etanollal kicsapjuk az előzőkben ismertetett módon, mielőtt BamHI és BstEI restrikciós enzimekkel hasítjuk.
A pCIB4413 plazmidot három fragment egy reakcióelegyben való ligálásával állítjuk elő. A három fragment: egy 210 bp méretű BamHI/BstEII PCR fragment, egy 4,7 kb méretű BamHI/HindlII fragment a pCIB4406 plazmidból, és egy 2,2 kb méretű HindlII/BstEII fragment a pGUS4.5 plazmidból.
8. pCIB4421 (PEPC: szintetikus-crylA(b): PEPC intron: 35S)
A pCIB4421 plazmidot úgy állítjuk elő, hogy a szintetikus crylA(b) gént, amely a pCIB4413 plazmidban a Phe mutációt tartalmazza, a pCIB4419 plazmidból származó szintetikus crylA(b) génnel helyettesítjük. A pCIB4421 plazmidot úgy állítjuk elő, hogy a pCIB4413 plazmidból származó 5,2 kb méretű BamHI/SacI fragmentet a pCIB4419-ből származó 1,9 kb méretű BamHI/SacI fragmenttel Egáljuk.
9. pCIB4423 (PAPC: szintetikus-crylA(b): PepC intron:35S + 35S:PAT:35S)
A pCIB4421-ből származó 2,4 kb méretű BamHI/HindlII PEPC promoter fragmentet a pCIB4420-ban levő 6,2 kb méretű BamHI/HindlII fragmenttel Egáljuk, így kapjuk a pCIB4423 plazmidot. A HindlII hasítási helyet a pCIB4423 klónozása során exonukleázok kihasították. A pCIB4423 tartalmazza a szintetikus crylA(b) gént, a PEPC promoter vezérlésével, és a PAT gént a 35S promoter vezérlésével.
10. Szintetikus crylA(b) gén Agrobacterium törzsekben
A szintetikus crylA(b) génnel készített Agrobacterium törzsek lehetővé teszik ennek a génnek nagyszámú kétszikű növénybe való bejuttatását. Az Agrobacterium pCIB4417 vektor tartalmazza a pCIB4406-ból származó 3,3 kb méretű HindlII/EcoRI fragmentet (35S: szintetikus-CrylA(b): PepC: ivs#9:35S) (Phe
HU 220 294 Β mutáció), a pBl01-ból (Clontech) származó 14 kb méretű HindlII/EcoRI lfagmenthez ligáivá. Elektroporáció alkalmazásával a pCIB4417 plazmidor Agrobacterium tumefaciens LBA4404 sejtekbe juttatjuk be [Diethard et. al., Nucleic Acids Research, 777(16), 6747 (1980)].
200 ng pCIB4417 plazmidot és 40 pl jégen olvasztott LBA4404 kompetens sejtet elektroporálunk előre hűtött 0,2 cm-es elektroporációs küvettában (Bio-Rad Laboratories Ltd.). A Gene Pulser-TM-et a Pulse Controller egységgel (Bio-Rad) használva egy elektromos impulzust alkalmazunk közvetlenül, a feszültséget 2,5 kVra állítva, a kapacitást pedig 25 pF-ra állítva. Az impulzus után a sejteket azonnal 1 ml YEB táptalajra visszük, majd 3 óra hosszat 27 °C-on rázatjuk, mielőtt 10 pl-t ABmin:Km50 táptalajra szélesztünk. Körülbelül 60 óra hosszat 28 °C-on inkubáljuk, majd telepeket választunk ki plazmid minipreparátumok készítése céljából, amelyen restrikciós enzimes elemzést végzünk. A végső Agrobacterium törzs jele pCIB4417: LBA4404.
41. példa
A transzformált protoplasztok EL1SA elemzése
A crylA(b) toxin fehérje jelenlétét enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálattal (ELISA) mutatjuk ki. Az ELISA módszerek nagyon érzékeny, specifikus eszközei az antigén anyagok kimutatásának. Az ELISA vizsgálatok jól használhatók a polipeptid géntermékek expressziójának kimutatásában. Ezekhez a vizsgálatokhoz antiszérumot úgy állítunk elő, hogy nyulakat immunizálunk gradiensen tisztított Bt kristályokkal [Ang et. al., Applied Environ. Microbiol., 36, 625-626 (1978)], amelyeket nátrium-dodecil-szulfáttal viszünk oldatba. A tranziensen transzformált kukoricasejtekből származó kivonatok ELISA elemzését standard módszerekkel végezzék [Harlow, E., and Lane, D. in „Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)]. Az ELISA technikák leírását megtaláljuk még az alábbi publikációkban [Clark et. al., Methods in Enzymology, 118, 742-766 (1986); Bradford, Anal. Biochem., 72, 248 (1976)]. Tehát ezek az eljárások jól ismertek a szakterületen jártas szakemberek számára. Ezeket a publikációkat a továbbiakban referenciaként kezeljük.
Az ELISA vizsgálatokat azért végezzük, hogy kimutassuk a CrylA(b) fehérje keletkezését kukoricaprotoplasztokban. A keletkező fehérje mennyiségét az alábbiakban ng Bt fehérje per mg összfehéije (ng Bt/mg) dimenzióban adjuk meg.
Mindegyik konstrukciót kétszer vizsgáljuk meg. pCIB3069 Nincs kimutatható Bt (mindkét vizsgálatban) pCIB4407 21900 ng Bt/mg összfehérje
21000 ng Bt/mg összfehérje
A transzformált kukoricasejtek nagy mennyiségben, körülbelül 20 000 ng Bt CrylA(b) fehérje/mg ossz oldható fehérje szinten termelik az expressziós terméket, ha a kukoricára optimalizált Bt génnel transzformáljuk őket. Ezeknek az ELISA-alapú eljárásoknak a kimutatási határa körülbelül 1-5 ng CrylA(b) fehérje per mg fehérje. Ennélfogva a kukoricára optimalizált Bt gén legalább 20 000-szeresre fokozza ennek a fehérjének az expresszióját a kukoricasejtekben.
42. példa
A transzformált protoplasztokból származó kivonatok európai magfúró elleni inszekticid aktivitásának vizsgálata
Westem-blot elemzést is végzünk olyan kukoricasejtekből származó kivonatokkal, amelyeket tranziensen transzformáltunk a kukoricára optimalizált gént tartalmazó DNS-sel. Ha Westem-blotokkal vizsgáljuk, akkor ez a fehérje azonosnak látszik az Escherichia coli által termelt fehérjével. Ezzel szemben, amint azt az előző, 6. példában igazoltuk, nem keletkezik kimutatható mennyiségű Bt crylA(b) inszekticid aktivitású fehérje a hasonló szerkezetű vektorokkal transzformált kukoricasejtekben, ha a természetes Bt eredetű kódolórégiót próbáljuk meg expresszálni,
A mennyiségi rovartoxicitási vizsgálatokat úgy végezhetjük el, hogy kinyerjük a protoplasztokat. Szuszpenziókat készítünk minden ismétléshez, amelyeket minden biológiai vizsgálatban megmérünk. Egy ismétlést pozitívnak tekintünk, ha lényegesen magasabb a mortalitása mint a kontrolioké. Például az ismétléseknek vizsgáljuk az aktivitásukat a Lepidoptera rendbe tartozó rovarokkal szemben, az európai magfúrót (Ostrinia nubilalis) használva erre a célra. 100 pl protoplaszt szuszpenziót (0,1% Triton X-100 oldatban szuszpendálva) pipettázunk mesterséges fekete bagolypille hernyó tápra (Bioserv, Inc., Frenchtown, NJ; F9240) 50 mmx 10 mm-es lezárható fedelű Petri-csészékben. Miután levegőn megszárítottuk, 10 újszülött lárvát teszünk az egyes lemezekre. A mortalitást körülbelül 4 nap elteltével vizsgáljuk meg. Ha ezzel a fehérjével európai magfúrót táplálunk, akkor a mortalitás 100%-os.
43. példa
Szintetikus Bt expressziói a kukorica mezofil protoplasztokban
A kukorica mezofil protoplasztok izolálásának általános módszerét Sheen és munkatársaitól adaptáltuk [Sheen et. al., The Plánt Cell, 2, 1027-1038 (1990)]. A Sheen és munkatársai által használt protoplaszt transzformációs rendszert úgy módosítjuk, hogy PEG-es transzformációt alkalmazunk az elektroporáció helyett. Ezt az eljárást, valamint az izolálási eljárásban tett változtatásokat ismertetjük az alábbiakban.
Kukorica mezofil protoplasztok izolálása/transzformálása:
1. Kukoricamagvakat sterilezünk és csíráztatunk levél előállításához. A hajtásokat fényben neveljük 25 °C-on.
2.10-12 napos hajtásokról származó levéldarabokat a felszínükön sterilezünk 5%-os Clorox-oldattal 5 percig, majd néhányszor mossuk steril desztillált vízzel.
3. Az enzimoldatokból (a receptet lásd alább) aliquot részeket készítünk; 25 pl/lemez (100x24 mm-es Petri-csésze).
HU 220 294 B
4. A levelekről minden vízcseppet eltávolítunk, majd 6-8 db 5 cm-es darabot teszünk minden egyes, enzimet tartalmazó Petri-csészébe. Általában 14 lemezt lehet készíteni körülbelül 100 hajtásról származó levélanyaggal.
5. A leveleket hosszában csíkokra szabdaljuk, a lehető legvékonyabb csíkokat készítjük (2-5 mm).
6. 6,5-7 óra hosszat óvatosan rázatjuk 25 °C-on. A lemezeket letakarjuk, hogy az inkubálás sötétben folyjon.
7. A protoplasztok megszűrése előtt 100 pm-es szitákat mosunk 10 ml 0,6 mol/1 koncentrációjú mannittal. A protoplasztokat lassan átpipettázzuk a szitákon. A lemezeket 0,6 mol/1 koncentrációjú mannittal mossuk, hogy a lemezeken maradt protoplasztokat is kinyerjük.
8. A megszűrt folyadékot óvatosan 50 ml-es steril csövekbe visszük. Azonos térfogatú 0,6 mol/1 koncentrációjú mannitot adunk hozzá hígítás céljából.
9. 10 percig centrifugáljuk 1000/perc fordulatszámmal (500 g) asztali centrifugában (Beckman TJ-6 moell).
10. Eltávolítjuk az enzimoldatot és elöntjük. Az üledéket óvatosan szuszpendáljuk 5 ml mamutban. Számos üledéket egyesítünk. A térfogatukat 50 ml-re állítjuk be 0,6 mol/1 koncentrációjú mannit hozzáadásával, majd centrifugáljuk.
11. Adott térfogatra (50 ml) újra szuszpendáljuk, majd megszámláljuk.
12. A számlálás és ülepítés után a protoplasztokat 2 millió/ml koncentrációban szuszpendáljuk szuszpendáló pufferben (a receptet lásd az alábbiakban). A transzformálás előtt a protoplasztokat legalább 30 percig hagyjuk ülepedni a szuszpendáló pufferben.
Transzformálás:
1. A plazmidokból aliquot részeket viszünk csövekbe (Fisherbrand polisztirol 17x100 mm-es lezárható tetejű tenyésztőcsövek); legalább három párhuzamosban végezzük az egyes kezeléseket; ekvimoláris mennyiségű plazmidokat használunk, hogy azonos kópiaszámú géneket hasonlítsunk össze.
2. 0,5 ml protoplaszt szuszpenziót adunk hozzá, majd 0,6 mol/1 mannitolban készített 0,5 ml 40%-os PEG-et.
3. Rázatva óvatosan összekeverjük, majd 30 percig 25 °C-on inkubáljuk.
4. Protoplaszttenyésztő táptalajt adunk hozzá ötpercenként: 1, 2, 5 ml.
5. 10 percig centrifugáljuk 1000/perc fordulatszámmal (500 g).
6. A folyadékot eltávolítjuk az üledékről, majd 1 ml tenyésztő táptalajban szuszpendáljuk (BMV táptalaj).
7. Éjszakán át 25 °C-on, sötétben inkubáljuk. Receptek:
Enzimoldat:
0,6 mol/1 mannit mmol/1 MES,pH=5,7 mmol/1 CaCl2 mmol/1 MgCl2
0,1% BSA szűréssel sterilezve.
Ehhez az oldathoz az alábbi enzimeket adjuk hozzá: 1% Celluláz RS 0,1% Macerozim RIO
Mosópuffer: 0,6 mol/1 mannit, szűréssel sterilezve Szuszpendáló puffer: 0,6 mol/1 mannit, 20 mmol/1 KC1 szűréssel sterilezve Tenyésztő táptalaj: BMC recept [Okuno et. al., Phytopathology, 67. 610-615 (1977)]
0,6 mol/1 mannit 4 mmol/1 MES, pH=5,7 0,2 mmol/1 KH2PO4 1 mmol/1 KNO3 1 mmol/1 MgSO4 10 mmol/1 CaCl2 1 xK3 mikrotápanyagok szűréssel sterilezve.
A transzformált protoplasztok ELISA elemzését a transzformálás után egy nappal végezzük. Az ELISA-t az előzőkben leírt módon végezzük. Az alábbi három kísérletet kukorica beltenyésztett 211D vonallal végezzük. Természetesen más kukoricavonalak is használhatók. 50 pg pCIB4419 plazmidot, és ekvimoláris mennyiségű egyéb plazmidot használunk. Az össz-oldhatófehérjét a BioRad fehérje meghatározási módszerrel határozzuk meg [Bradford, Anal. Biochem., 72, 248 (19 876)].
Transzformációs kísérlet:
A vizsgált konstrukciók:
1. pCIB4419 (A konstrukció szintetikus Bt-t tartalmaz a CaMV 35S promoter vezérlése alatt, valamint a 35S/PAT és a 35S/GUS marker géneket.)
2. pCIB4420 (A konstrukció tartalmazza a szintetikus Bt-t a bél eredetű promoter vezérlése alatt és a PAT marker gént.)
3. pCIB4423 (A konstrukció szintetikus Bt-t tartalmaz a PEPC promoter és a PAT marker gén vezérlése alatt.) (PEPC:szintetikus-cryIA(b):PepC intron:35S + 35S:PAT:35S)
Az alábbi kísérletekben 10-11 napos 211D palántákat elemeztünk a Bt CrylA(b) fehérje előállítása szempontjából, a Biorad fehérjemérési módszert alkalmazva.
1. kísérlet (11 napos palánták):
pCIB4419 15 000±3000 ng Bt/mg fehérje pCIB4420 280± 65 ng Bt/mg fehérje pCIB4421 9 000± 800 ng Bt/mg fehérje
2. kísérlet (10 napos palánták):
pCIB4419 5 000± 270 ng Bt/mg fehérje pCIB4420 80± 14 ng Bt/mg fehérje pCIB4421 1 600± 220 ng Bt/mg fehérje
3. kísérlet (11 napos palánták):
PCIB4419 21 500±1800 ng Bt/mg fehérje pCIB4420 260± 50 ng Bt/mg fehérje pCIB4421 11 900±4000 ng Bt/mg fehérje pCIB4423 7 200±3400 ng Bt/mg fehérje
A fenti kísérletek megerősítik, hogy mind a CaMV
35S és PEPC promoterek nagyon magas szinten expresszálják a szintetikus Bt CrylA(b) fehérjét. A bél eredetű promoter, jóllehet kevésbé hatékony, szintén expresszálja a szintetikus CrylA(b) fehérjét.
HU 220 294 B
44. példa
A szintetikus Bt stabil expressziója salátában A pCIB4417-ben Agrobacterium vektorban levő szintetikus Bt gént Lactuca sativa cv. Redprize (saláta) növénybe transzformáljuk. A transzformációs eljárás 5 ugyanaz, mint amit Enomoto és munkatársai írtak le [Plánt Cell Reports, 9, 6-9 (1990)].
A transzformációs eljárás:
A salátamagvakat a felszínén 5% Clorox-oldattal percig sterilezzük, majd néhányszor desztillált vízzel 10 mossuk. A felületen sterilezett magvakat kétszeresre hígított MS táptalajra szélesztjük [Murashige and Skoog, Physiol. Plánt., 15, 473-497 (1962)]. Hatnapos Redprize palánták szikleveleit, amelyeket 16 óra hosszat 3000 luxszal világítva 25 °C-on nevelünk, használjuk 15 explantumokként az Agrobacterium-fertőzésben. Az egyes sziklevelek alapját és csúcsát eltávolítjuk. Az explantumokat 10 percre a baktériumoldatba áztatjuk be, amelyet előzőleg 48 óra hosszat AB minimáltáptalajon növesztettünk a megfelelő antibiotikumokon 20 28 °C-on. A fölöslegben levő baktériumoldatot szűrőpapírral felitatjuk, majd az explantumokat MS táptalajra tesszük (0,1 mg/1 BA és 0,1 mg/1 NAA) 2 napra. Az explantumokat azután szelektív táptalajra visszük, amely 500 mg/1 karbenicillint és 50 mg/1 kanamicint tar- 25 talmaz. Az explantumokat hetente friss táptalajra oltjuk át. A nevelőkamra paraméterei: 16 órás, 2000 lx-es megvilágítás 25 °C-on. Körülbelül 4 hét elteltével ELISA vizsgálatot végzünk egészségesnek látszó kalluszokon, amelyek az átoltott négy lemezről származnak. 30 Az ELISA eljárás ugyanaz, mint amit az előzőkben a protoplasztokra ismertettünk; az oldható fehérje menynyiségét megint az előzőkben ismertetett Biorad vizsgálattal határozzuk meg.
Eredmények: 35 pCIB3021 (kan kontroll) 0 pCIB4417 (1. lemez) 0 pCIB4417 (2. lemez) pCIB4417 (3. lemez) pCIB4417 (4. lemez)
505 ng Bt/mg fehéije ng Bt/mg fehérje
1200 ng Bt/mg fehérje
Ez a példa azt igazolja, hogy a kétszikű növényekben is fokozottabban expresszálódik az optimalizált inszekticid gén.
45. példa 45
A pCIB4429plazmid készítése
A pCIB4429 egy előnyös kukoricavirágpor-specifikus promotert tartalmaz, a kukoricára optimalizált cryIA(b) génnel fuzionáltatva. Az ebben a konstrukcióban használt virágpor-specifikus kukoricapromotert a 50 pKL2 plazmidból állítjuk elő, a 37. példában leírtak alapján. A kukoricára optimalizált cryIA(b) gént a pCIB4418 plazmidból állítjuk elő, amelyet szintén a 37. példában írtunk le.
A pKL2 egy olyan plazmid, amely egy előnyös, 55 virágpor-specifikus kukoricapromotert tartalmaz, az Escherichia coli béta-glükuronidáz génnel fuzionáltatva. A pSKllO és a pCIB3054 plazmidokból állítottuk elő. A pSKllO tartalmazza a virágpor-specifikus kukoricapromotert. A pCIB3054, egy pUC19 származék, tartalmazza az Escherichia coli béta-glükuronidáz (GUS) gént, a karfiol-mozaikvírus (CaMV) 35S promoterével fuzionáltatva. Ez egy olyan konstrukció, amelyet a bejelentés más részében ismertettünk. Ezt a promotert el lehet távolítani a plazmidból, ha Sall/HindlII enzimekkel emésztjük, így kapunk egy olyan fragmentet, amely a GUS gént tartalmazza, valamint a bakteriális ampicillinrezisztencia gént és egy ColEI eredetű replikációs origót. Egy második fragment tartalmazza a CaMV 35S promotert.
A pCIB3054 plazmidot Sáli és HindlII restrikciós enzimekkel emésztjük, standard körülmények között, 2 óra hosszat, szobahőmérsékleten. A reakcióelegyet azután fenol/kloroform eleggyel extraháljuk, standard körülmények között, majd a DNS-t etanolos kicsapással kinyerjük, standard körülmények között. A kinyert DNS-t olyan pufferben oldjuk, amelyben működik a borjúbél alkalikus foszfatáz enzim (CIP), majd 2,5 egység CIPpel reagáltatjuk 37 °C-on, éjszakán át. A CIP reakció után a DNS-t agarózgélen tisztítjuk, az ebben e bejelentésben máshol leírt standard körülmények között. A pSKllO plazmidot Sall/HindlII enzimekkel hasítjuk standard körülmények között 2 óra hosszat szobahőmérsékleten, majd a DNS-t ezt követően standard körülmények között agarózgélen tisztítjuk. A kinyert DNS-fragmenteket standard körülmények között ligáljuk 2 óra hosszat, szobahőmérsékleten, majd ezt követően kompetens Escherichia coli HB101 sejtekbe transzformáljuk, standard körülmények között. A transzformánsokat 100 pg/ml koncentrációban anpicillint tartalmazó L-agaron szelektáljuk. A transzformánsokat megvizsgáljuk, hogy tartalmazzák-e a keresett plazmidkonstrukciókat, standard plazmid minipreparátumok előállításával. A helyes konstrukció jelzése pKL2.
A pCIB4429 előállításához három fragmentet Egálunk össze egy reakcióelegyben, a szakterületen jártas szakember számára ismert, standard körülmények között. Az összeligált három fragment az alábbi:
1. egy, a pCIB4418-ból származó HindlII/BamHI fragment, mérete körülbelül 4,7 kb, ez tartalmazza a crylA(b) gént, a bakteriális ampicillinrezisztencia gént, és a ColEI eredetű replikációs origót;
2. egy, a pKL2-ből származó HindlII/Xbal fragment, mérete körülbelül 1,3 kb, és a kukorica eredetű virágporspecifikus promotert tartalmazza;
3. egy PCR módszerrel előállított fragment, amely a virágpor promoterről származik, és egy BamHI hasítási helyet tartalmaz a transzkripció kezdőpontja után beépítve. Ez a fragment körülbelül 120 bp méretű, és Xbal/BamHI restrikciós enzimekkel hasított vége van.
A PCR fragmentet 100 μΐ-es reakcióelegyben állítjuk elő, az előzőkben ismertetett standard körülmények között. A használt indítómolekulák az alábbiak:
SK50: 5’-CCC TCC AAA ATC TAG AAA CCT-3’
KE127: 5’-GCG GAT CCG GCT GCG GCG GGG AAC GA-3’
HU 220 294 B
A fenti indítómolekulákat egy PCR reakcióelegyben a pSK105 plazmiddal keverjük össze, egy olyan plazmiddal, amely a kukorica eredetű virágpor-specifikus promotert tartalmazza.
Miután a PCR reakció teljesen lejátszódott, a reakcióelegyből 10 μΐ-t agarózgélen megfuttatunk, standard körülmények között, hogy biztosak legyünk abban, hogy a reakcióban a várt méretű termék keletkezett. A maradék 90 μΐ-t proteináz K-val kezeljük 50 pg/ml végkoncentrációban, 30 percig 37 °C-on. A reakcióelegyet azután 10 percre 65 °C-ra melegítjük, majd fenol/kloroform eleggyel extraháljuk, a standard módszer alkalmazásával. A DNS-t kinyerjük a felülúszóból, majd két térfogat etanollal kicsapjuk, standard körülményeket alkalmazva. A kicsapás után a DNS-t mikrocentrifugában centrifugálva nyerjük ki. Az üledéket egyszer öblítjük 70%-os etanollal (ahogy azt a gyakorlatban szokták), röviden szárítjuk az etanol eltávolítása céljából, majd az üledéket 17 μΐ TE pufferben szuszpendáljuk. 2 μΐ 10X restrikciós enzim puffért adunk hozzá, majd 0,5 μΐ BamHl és 0,5 μΐ Xbal restrikciós enzimet. A DNS-t 1 óra hosszat emésztjük 37 °C-on, így kapjuk az Xbal/BamHI enzimekkel emésztett DNS-fragmentet. A restrikciós enzimekkel való emésztés után ezt a fragmentet agarózgélen tisztítjuk, amelynek összetétele 2% Nusieve (FMC)/1% agarózgél. Millipore szűrőegységeket használunk a DNS-nek az agárból való eluálására, a gyártó előírásainak betartásával. Elúció után a DNS az előzőkben ismertetett, egy reakcióelegyben három fragment összeligálására használjuk.
A ligálás után a DNS-t kompetens Escherichia coli HB101 sejtekbe transzformáljuk, standard technika alkalmazásával. A transzformánsokat 100 pg/ml ampicillint tartalmazó L-agar lemezeken szelektáljuk. A szelektív körülmények között szaporodó telepeket izoláljuk, majd a bennük levő plazmidot a szakterületen ismert standard technikával vizsgáljuk, hogy milyen inszertet tartalmaznak.
48. példa
A pCIB4431 vektor készítése, amely a szintetikus crylA(b) gén növényekben szövetspecifikus expreszszióját biztosítja
A pCIB4431 vektor egy kukorica transzformálására tervezett vektor. Két kiméra Bt endotoxin gént tartalmaz, amelyek képesek kukoricában expresszálódni. Ezek a gének a következők: PEP-karboxiláz promoter/szintetikus-cryIA(b) gén és egy virágporpromoter/szintetikus-cryIA(b) gén. Az ebben a vektorban levő PEP-karboxiláz/cryIA(b) gén az előzőkben ismertetett pCIB4421 vektorból származik. A virágporpromotert is ismertettük az előzőekben. A 20. ábrán a pCIB4431 plazmid térképe látható. A pCIB4431 plazmidot három fragment egy reakcióelegyben való ligálásával állítjuk elő, ehhez a körülbelül 3,5 kb méretű Kpnl/HindlII fragmentet (amely a pCIB4429 plazmidból származó virágpor/szintetikus-cryIA(b) konstrukciót tartalmazza), a körülbelül 4,5 kb méretű HindlII/EcoRI fragmentet (amely a PEPC/szintetikus-cryIA(b) konstrukciót tartalmazza), és a körülbelül 2,6 kb méretű KpnI/EcoRI fragmentet (amely a pBluescript vektorból származik) használjuk.
Más vektorok, amelyek a virágporpromoter/szintetikus CryIA(b) kiméra gént tartalmazzák, a pCIB4428 és a pCIB4430 vektorok. Lásd a 21. és 22. ábrát. A pCIB tartalmazza a PEPC/szintetikus Bt gént is, amelyet az előzőkben ismertettünk.
47. példa
A szintetikus, kukoricára optimalizált CryIA(b) gént tartalmazó transzgenikus kukoricanövények előállítása
Az alábbi példában Biolisticet alkalmazunk a DNSsel borított részecskéknek kukoricasejtekbe való juttatására, amelyből a transzformált növények kifejlődnek.
KC-65 kísérlet
A szintetikus crylA(b) gént szövetspecifikus promoter vezérlésével expresszáló transzgenikus kukoricanövények előállítása
Szövet
Éretlen kukoricaembriókat, körülbelül 1,5-2,5 mm hosszúságúakat, kivágunk a 6N615 genotípusú kukorica kalászából, a beporzás után 14-15 nappal. Az anyanövényt üvegházban neveltük fel. A kivágás előtt a kalászt 20%-os Clorox-oldattal a felületén sterilezzük 20 percig, majd háromszor öblítjük steril vízzel. Az egyes embriókat a pajzsocskával lefelé tesszük le egy 2 négyzetcentiméteres felületre, egy lemezre 36 embriót, egy kalluszt iniciálé táptalajt használva, 2DG+5 chloramben táptalajt (N6 majorsók, B5 minorsók, MS vas, 2% szacharóz, 5 mg/ml chloramben, 20 mg/1 glükóz, és 10 ml G4 hozzáadásával (1. táblázat) autoklávozás után.
1. táblázat - G4 kiegészítés
Adalékanyag per liter táptalaj
Kazeinhidrolizátum 0,5 g
Prolin 1,38 g
Nikotinsav 0,2 mg
Piridoxin-HCl 0,2 mg
Tiamin-HCl 0,5 mg
Kolin-HCl 0,1 mg
Riboflavin 0,05 mg
Biotin 0,1 mg
Fólsav 0,05 mg
Ca-pantotenát 0,1 mg
p-Amino-benzoesav 0,05 mg
Bt2 0,135 pg
Bombázás
A szövetet PDS-lOOOHe Biolistics berendezés segítségével bombázzuk. A szövetet egy polcra tesszük, 8 cm-rel a leállítószűrő polca alá. A szövetet egyszer bombázzuk a DNS/arany mikrohordozó oldattal, amelyből 10 μΐ-t szárítunk a mikrohordozó felszínére. A használt leállítószűrőt kézzel kilyukasztva használjuk,
HU 220 294 Β
ABRU 10x10, rozsdamentes acélszűrőt használva. 10 687 kilopascalnál hasadó korongokat alkalmazunk. A bombázás után az embriókat sötétben szaporítjuk 25 °C-on.
A DNS előkészítése a bejuttatáshoz
A mikrohordozót lényegében a Biolistc berendezéssel szállított utasítások szerint készítjük el. Miközben 50 μ] 1,0 μ-os arany mikrohordozóval vortexeljük, hozzáadunk 5 μΐ pCIB4431 plazmidot (1,23 pg^l) [#898] + 2 μΐ pCIB3064 plazmidot (0,895 pg/pl), [#456], majd 50 μΐ 2,5 mol/1 CaC2-t adunk hozzá, végül pedig 20 μΐ 0,1 mol/1 spermidint (szabad bázis, TC minőség). A kapott elegyet 3 percig vortexeljük, majd 10 percig mikrofugáljuk. A felülúszót eltávolítjuk, majd a mikrohordozókat kétszer mossuk 250 μΐ 100%-os etanollal (HPLC minőség), röviden vortexelve, majd centrifugáljuk és eltávolítjuk a felülúszót. A mikrohordozókat 65 μΐ 100%-os etanolban szuszpendáljuk.
Kalluszképzés
Az embriókat a bombázás után kallusziniciáló táptalajra visszük át, amely 3 mg/1 PPT-t tartalmaz. Az embriókat osztályozzuk a kallusziniciálás alapján, a bombázás után 2 és 3 héttel. Minden válaszreakciót kalluszfenntartó táptalajra viszünk át, 2DG4 +0,5 2,4-D táptalaj, 3 mg/1 PPT-vel. A kalluszfenntartó táptalaj összetétele: N6 majorsók, B5 minorsók, MS vas, 2% szacharóz, 0,5 mg/1 2,4-D-vel, 30 mg/1 glükózzal és 10 ml G4 kiegészítővel kiegészítve az autoklávozás után. Az embriogén kalluszt minden két hétben átoltjuk friss fenntartó táptalajra, amely 3 mg/1 PPT-t tartalmaz. Minden kalluszt sötétben, 25 °C-on inkubálunk.
Az I-es típusú kalluszképződési válasz 15%. Mindegyik embriót, amely kalluszt termelt, egyedi eseményként szaporítottunk, így egyedi vonalakat kaptunk.
Regenerálás
A szelekciós körülmények közötti tartózkodás 12 hete után a szövetet eltávolítjuk a PPT tartalmú kalluszfenntartó táptalajról, majd regeneráló táptalajra tesszük. A regeneráló táptalaj összetétele 0,25 MS3S5BA (0,25 mg/1 2,4 D, 5 mg/1 BAP, MS-sók, 3% szacharóz), erre két hétre tesszük ki a kalluszokat, majd átoltjuk Ms3S táptalajra, a növények regenerálása érdekében. 4-10 hét elteltével a növényeket eltávolítjuk, és GA7ekre tesszük. A mi vonalunk a KC65 0-6, amely a #176 Bt esemény lett, összesen 38 növényt hozott.
Vizsgálatok
Mindegyik növényt, mihelyt megállapodott a GA’eken, a klórfenolvörös (CR) vizsgálattal vizsgáljuk, a PPT-vel szembeni rezisztenciát nézzük [leírása: 07/759,243 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, benyújtva 1991. szeptember 13-án, amelynek a releváns részeit a továbbiakban referenciaként kezeljük]. Ez a vizsgálat a pH-érzékeny indikátorfestéket használja annak kimutatására, hogy mely sejtek szaporodnak PPT jelenlétében. Azok a sejtek, amelyek szaporodnak, pH-változást idéznek elő ebben a tesztben (#176=8 pozitív/30 negatív). A CR teszt alapján pozitívnak bizonyult növényeket PCR-rel vizsgáljuk, hogy megvan-e bennük a szintetikus Bt gén. (#176=5 pozitív/2 negatív/1 elpusztult).
A PCR alapján a syn-Bt-re pozitívnak bizonyult növényeket a fitotronba visszük. Amint megállapodtak a fítotronban, az inszekt bioesszék és az ELISA elemzés alapján jellemezzük őket. A növények inszekt bioesszéjében a standard európaimagfuró-esszét használjuk (leírása az 5A. példában), amelyben a növényből kis darabokat csípünk ki, majd kis Petri-csészékre tesszük, számos ECB újszülöttlárvával. A növényeket rendszerint körülbelül 15 cm-es méret elérése után vizsgáljuk. Azokat a növényeket jellemezzük tovább, amelyek 100%os mortalitást mutatnak az ECB-vel szemben. A pozitív növényeket üvegházba visszük.
Üvegház/Fertilitás
A #176-11 számú növényt vad típusú 6N615 virágporral porozzuk be. Egy kalászcímer és egy címerhajtás fejlődött ki. A kalászcímerből az összes embriót (11) és az 1-es címerből 56 magot fogtunk. 294 mag maradt a címeren, és száradt le természetes úton.
A #176-11-ből származó virágport különböző kukorica-genotípusokkal (5N984, 5NA89 és 3N961) keresztezzük. Mindhárom keresztezésből fogtunk embriókat (5N984=45; 5NA89=30, 3N961=8). A magok legnagyobb része a növények címerén maradt az üvegházban, és természetes úton száradt le.
A #176-os növényből DNS-t izolálunk, standard technikák alkalmazásával, majd Southem-blot módszerrel vizsgáljuk. Azt találtuk, hogy olyan szekvenciákat tartalmaz, amelyek a szintetikus cryIA(b) génből készített próbákkal hibridizál, valamint hibridizálás a PAT génből készített próbával is. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy ezek a gének integrálódtak a kukorica genomjába.
KC-64 kísérlet
A szintetikus crylA(b) gént konstitutív promoterről expresszáló transzgenikus kukoricanövények termelése
Szövet
Éretlen kukoricaembriókat, körülbelül 1,5-2,5 mm hosszúságúak, kivágunk a 6N615 genotípusú kukorica kalászából, a beporzás után 14-15 nappal. Az anyanövényt üvegházban neveltük fel. A kivágás előtt a kalászt 20%-os Clorox-oldattal a felületén sterilezzük 20 percig, majd háromszor öblítjük steril vízzel. Az egyes embriókat a pajzsocskával lefele tesszük le egy 2 négyzetcentiméteres felületre, egy lemezre 36 embriót, egy kalluszt iniciáló táptalajt használva, 2DG+5 chloramben táptalajt (N6 majorsók, B5 minorsók, MS vas, 2% szacharóz, 5 mg/ml chloramben, 20 mg/1 glükóz, és 10 ml G4 hozzáadásával (1. táblázat) autoklávozás után.
1. táblázat - G4 kiegészítés
Adalékanyag per liter táptalaj
Kazeinhidrolizátum 0,5 g
Prolin 1,38 g
Nikotinsav 0,2 mg
Piridoxin-HCl 0,2 mg
Tiamin-HCl 0,5 mg
Kolin-HCl 0,1 mg
HU 220 294 B
Táblázat (folytatás)
Adalékanyag per liter táptalaj
Riboflavin 0,05 mg
Biotin 0,1 mg
Fólsav 0,05 mg
1. táblázat -G4 kiegészítés (folytatás)
Adalékanyag per liter táptalaj
Ca-pantotenát 0,1 mg
p-Amino-benzoesav 0,05 mg
Bi2 0,135 pg
Bombázás
A szövetet PDS-lOOOHe Biolistics berendezés segítségével bombázzuk. A szövetet egy polcra tesszük, 8 cm-rel a leállítószűrő polca alá. A szövetet egyszer bombázzuk a DNS/arany mikrohordozó oldattal, amelyből 10 μΐ-t szárítunk a mikrohordozó felszínére. A használt leállítószűrőt kézzel kilyukasztva használjuk, ABRU 10x10, rozsdamentes acélszűrőt használva. 10 687 kilopascalnál hasadó korongokat alkalmazunk. A bombázás után az embriókat sötétben szaporítjuk 25 °C-on.
A DNS előkészítése a bejuttatáshoz
A mikrohordozót lényegében a Biolistc berendezéssel szállított utasítások szerint készítjük el. Miközben 50 pl 1,0 μ-os arany mikrohordozóval vortexeljük, hozzáadunk 3,2 μΐ pCIB4418 plazmidot (0,85 pg/MD [#905] +2 pl pCIB3064 plazmidot (0,895 pg/μΐ), [#456], +1,6 pl pCIB3007A plazmidot (1,7 pg/ml) [#152], majd 50 pl 2,5 mol/1 CaCl2-t adunk hozzá, végül pedig 20 pl 0,1 mol/1 spermidint (szabad bázis, TC minőség). A kapott elegyet 3 percig vortexeljük, majd 10 percig mikrofugáljuk. A felülúszót eltávolítjuk, majd a mikrohordozókat kétszer mossuk 250 pl 100%-os etanollal (HPLC minőség), röviden vortexelve, majd centrifugáljuk és eltávolítjuk a felülúszót. A mikrohordozókat 65 pl 100%-os etanolban szuszpendáljuk.
Kalluszképzés
Az embriókat a bombázás után kallusziniciáló táptalajra visszük át, amely 3 mg/1 PPT-t tartalmaz. Az embriókat osztályozzuk, a kallusziniciálás alapján, a bombázás után 2 és 3 héttel. Minden válaszreakciót kalluszfenntartó táptalajra viszünk át, 2DG4 + 0,5 2,4-D táptalaj, 3 mg/1 PPT-vel. A kalluszfenntartó táptalaj összetétele: N6 majorsók, B5 minorsók, MS vas, 2% szacharóz, 0,5 mg/1 2,4-D-vel, 30 mg/1 glükózzal és 10 ml G4 kiegészítővel kiegészítve az autoklávozás után. Az embriogénkalluszt minden két hétben átoltjuk friss fenntartó táptalajra, amely 3 mg/1 PPT-t tartalmaz. Minden kalluszt sötétben, 25 °C-on inkubálunk.
Az I-es típusú kalluszképződési válasz 18%. Mindegyik embriót, amely kalluszt termelt, egyedi eseményként szaporítottunk, így egyedi vonalakat kaptunk.
Regenerálás
A szelekciós körülmények között tartózkodás 12 hete után a szövetet eltávolítjuk a PPT tartalmú kalluszfenntartó táptalajról, majd regeneráló táptalajra tesszük és 25 °C-on inkubáljuk 16 órás megvilágítást alkalmazva (50 pE.m-2.s-l)/8 óra sötét megvilágítási periódust alkalmazva. A regeneráló táptalaj összetétele 0,25MS3S5BA (0,25 mg/12,4 D, 5 mg/1 BAP, MS-sók, 3% szacharóz), erre két hétre tesszük ki a kalluszokat, majd átoltjuk Ms3S táptalajra, a növények regenerálása érdekében. 4-10 hét elteltével a növényeket eltávolítjuk, és GA7-ekre tesszük. A mi vonalunk a K.C64 0-1, amely a #170 Bt esemény lett, összesen 55 növényt hozott. A KC64 0-7 vonalunk, amely a #170 Bt esemény lett, összesen 33 növényt hozott.
Vizsgálatok
Tizenegy növényt, mihelyt megállapodtak a GA’eken, a klórfenolvörös (CR) vizsgálattal vizsgáljuk, a PPT-vel szembeni rezisztenciát nézzük [leírása: 07/759,243 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, benyújtva 1991. szeptember 13án, amelynek a releváns részeit a továbbiakban referenciaként kezeljük]. Ez a vizsgálat a pH-érzékeny indikátorfestéket használja annak kimutatására, hogy mely sejtek szaporodnak PPT jelenlétében. Azok a sejtek, amelyek szaporodnak, pH-változást idéznek elő a táptalajban és az indikátor színe sárgára változik (vörösről). A PPT rezisztencia gént expresszáló növényeket könnyen észrevehetjük ebben a tesztben. A CR teszt alapján pozitívnak bizonyult növényeket PCR-rel vizsgáljuk, hogy megvan-e bennük a szintetikus Bt gén. (#170=37 pozitív/18 negatív; #171 =25 pozitív/8 negatív).
A PCR alapján a syn-Bt-re pozitívnak bizonyult növényeket a fitotronba visszük. Amint megállapodtak a fitotronban, az inszekt bioesszék és az ELISA elemzés alapján jellemezzük őket. A növények inszekt bioesszéjében a standard európaimagfüró-esszét használjuk (leírása az 5A. példában), amelyben a növényből kis darabokat csípünk ki, majd kis Petri-csészékre tesszük, számos ECB újszülöttlárvával. A növényeket rendszerint körülbelül 15 cm-es méret elérése után vizsgáljuk. Azokat a növényeket jellemezzük tovább, amelyek 100%os mortalitást mutatnak az ECB-vel szemben. A pozitív növényeket üvegházba visszük.
Basta szűrővizsgálat
A 170-es eseményből származó érett növényeket választjuk ki a Basta [Hoechst] rezisztencia vizsgálata céljából. Növényenként egy középső levelet, egy körülbelül 10-14 cmxlevélszélesség-méretű darabot, 0, 0,4, 1,0 vagy 2,0% (10 ml 200g/l törzsoldat 100 ml ionmentesített vízzel hígítva) vizes Bastával festünk, amely 2 csepp Tween 20-at tartalmaz 100 ml-enként. Szintenként két növényt vizsgálunk. Nyolc, körülbelül azonos korú vad típusú 6N615 növényt használunk kontrollként. Mindegyik növényt 4 és 7 napos korban figyeljük meg. Végül az összes kontrollnövény elpusztult. A vizsgálat során a #170 eseményből származó növények közül egyik sem mutatta semmi nyomát sem a herbicid által okozott kárnak.
Beporzás
A #170 és #171 növényekről származó összes címerkalászt, az első kalászt, és ha létezik, akkor a máso48
HU 220 294 B dik kalászt vad típusú 6N615 virágporral porozunk be. A növényeknek legalább 90%-a nőtermékeny.
A #171-es növényekből származó virágport 6N615, 5N984, 5NA89, 6F010, 5NA56, 2N217AF, 2NDO1 és 3N961 genotípusú növényekkel kersztezünk. A növényeknek legalább 90%-a hímtermékeny.
Embriómentés
A #171-es eseményből származó embriókat „megmentjük”. 14-16 nappal a beporzás után a 25-50 magot tartalmazó kalászhegyet egy fűrésszel levágunk a kukoricacsőről. A vágás előtt a héjakat óvatosan félretoljuk, hogy a cső felső részét hozzáférhetővé tegyük. A növényen a csővágott véget Captain fungiciddel kezeljük, majd a héjat a helyére tesszük. A növényen maradt magvakat hagyjuk természetesen leszáradni.
A kivágott csodarabot a felszínén sterilezzük, 20%os Clorox-ot alkalmazva 20 percig, majd háromszor öblítjük steril vízzel. Az egyes embriókat kivágjuk, majd a pajzsocskával fölfelé B5 táptalajra (Gamborg) tesszük, amely 2% szacharózt tartalmaz. Autoklávozás után B5vitamint adunk a táptalajhoz. Minden Ga7 tartóba négy embriót teszünk, majd a tartókat sötétben inkubáljuk. Amikor a csírázás megtörtént, akkor a tartókat fényes szaporítószobába visszük, és 25 °C-on inkubáljuk, 16 órás megvilágítás (50 pE.m-2.s-l)/8 óra sötét megvilágítási periódust alkalmazva. A csírázási frekvencia 94%.
A #171-es esemény 15 növénye utódait, a #176-os esemény 2 növénye utódait megmentjük, standard embriómentési technikákat alkalmazva, majd kiértékeljük. Mindegyik növényt rovarvizsgálattal értékeljük ki. A #171-es eseményből származó növényeket is megvizsgáljuk a hisztokémiai GUS vizsgálatban. Mind a rovartesztben, mind a GUS vizsgálatban a transzgének szegregációja 1:1, amint az várható akkor, ha egyetlen lókuszba történt a beépülés.
48. példa
A transzgenikus kukoricanövények elemzése
ELISA vizsgálat
A cryIA(b) expresszióját transzgenikus kukoricában európai magfuró rovar biológiai vizsgálatával és ELISA elemzéssel mutatjuk ki, illetve a kapott cryIA(b) fehérje kvantitatív meghatározására is ezeket használjuk.
A crylA(b) IP transzgenikus növények leveleiben való mennyiségi meghatározását enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálattal (ELISA) végezzük, [Clark M. F., Lister R. M., Bar- Joseph M.: ELISA Techniques. In: Weissbach A., Weissbach H. (Eds), Methods in Enzymology, 118, 742-766, Academic Press, Florida (1986)]. A Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki IP-re specifikus, immunaffinitástisztított poliklonális nyúl- és kecskeantitesteket használunk a ng IP per mg oldhatófehérje-érték meghatározására, levelek nyerskivonataiból. A kettős szendvics ELISA érzékenysége 1-5 ng IP per mg oldható fehérje, 50 pg összfehérjét alkalmazva az egyes ELISA mikrotiter lukakban.
A kukoricakivonatokat úgy készítjük el, hogy levélszövetet dörzsölünk el műanyag zacskókban, kézi golyós homogenizáló alkalmazásával (AGDIA, Elkart
IN.), extrakciós puffer jelenlétében (50 mmol/1 Na2CO3 pH=9,5, 100 mmol/1 NaCl, 0,05% Triton, 0,05% Tween, 1 mmol/1 PMSF és 1 pmol/l leupeptin). A fehérje meghatározását Bio-Rad esszével végezzük (Richmond, CA).
A fenti eljárás alkalmazásával az előzőkben ismertetett primerkukorica-transzformánsokat vizsgáljuk ELISA-val, hogy tartalmazzák-e a crylA(b) fehérjét. Ezeknek a növényeknek a magassága 15 cm és 1,5 méter között változott az elemzés időpontjában.
Növény Bt Ng/mg oldható fehérje 5/27/91
176-8 0 0
176-10 700 1585
176-11 760 2195
171-4A 59
171-6 50
171-8 60
171 9 280
171-13 77
171-14B 60
171-15 55
171-16A 13
171-16B 19
171-18 19
176-30 1160
171-32 980
171-31 166
171-30 370
71-14
#10 levél 26
#1 levél 17
171-16-os növény
#9 levél 40
#1 levél 120
Európai magfúró vizsgálata
1. Egy kukoricanövény megnyúlt leveléből egy-négy 4 cm-es darabot vágunk ki.
2. Mindegyik levéldarabot nedvesített szűrőpapír korongra tesszük, egy 50x9 mm-es Petri-csészében.
3. Öt újszülött európaimagfúró-lárvát teszünk minden egyes levéldarabra (összesen 5-20 lárva per növény).
4. A Petri-csészéket 29,5 °C-on inkubáljuk.
5. A levéltáplálási károsodást és a mortalitási adatokat 24,48 és 72 óra elteltével jegyezzük fel.
49. példa
A Bt endotoxin expressziója a transzformált kukoricanövények utódaiban
A transzformált kukoricanövények teljesen termékenyek voltak, és számos különböző genotípusú kukoricá49
HU 220 294 B val kereszteztük. Az ezekből az utódokból származó utódoknak vizsgáljuk azt a képességét, hogy mennyire tudják elpusztítani az európai magfurót (ECB) standard ECB biológiai vizsgálatban (közvetlenül az előző részben írtuk le), valamint azt, hogy ELISA alapján van-e 5 jelen cryIA(b) fehérje. Az ECB pusztító képesség és a cryIA(b) fehérje termelőképessége korrelált. Ezek a tulajdonságok 1:1 arányban szegregáltak, jelezve, hogy egyetlen helyre épült be a szintetikus gén aktív kópiája.
Ez az 1:1 arány igaz mind a konstitutív promoter/szin- 10 tetikus-crylA(b) növényekre, mind a szövetspecifikus promoter/szintetikus-cryIA(b) növényekre is (nem közölt adatok).
A 23A. ábrán egy táblázat látható, amely az összes vizsgált utód egy alcsoportjának adatait tartalmaz- 15 za. Ez a táblázat számos különböző keresztezésre jellemző.
A rovarvizsgálatokat Diatrea saccharalis-szal és Ostrinia nubilalis-szal végezzük, kukoricára optimalizált CryIA(b) gént tartalmazó trangenikus utód levélanyagá- 20 nak felhasználásával (az előzőkben leírt módon). Ezeknek a vizsgálatoknak az eredménye a 23B. ábrán látható. Ezek azt mutatják, hogy a kukoricára optimalizált CrylA(b) gén működik a transzformált kukoricában, így biztosít rezisztenciát a cukomádfuró és az Ostrinia 25 nubilalis-szal szemben.
50. példa
A cryIA(b) gén expressziója kukorica-virágporban
A pCIB4431 plazmidból származó, kiméra virág- 30 porpromoter/szintetikus cryIA(b) gént tartalmazó transzformáit kukoricanövényeket szántóföldön érettségig neKE150A28: 5’-ATT CGC ATG CAT GTT TC KE151A28: 5’-GCT GGT ACC ACG GAT C(
A PCR reakció után a DNS-t agarózgélen ellenőrizzük, hogy a reakció rendben lejátszódott-e. A DNS-t kinyerjük a PCR reakcióelegyből, az előzőkben ismertetett standard körülmények alkalmazásával, majd stan- 40 dard körülmények között Nsil és BamHI enzimekkel hasítjuk. A hasítás után a fragmentet 2%-os Nusieve gélen futtatjuk, majd a keresett csíkot az előzőkben ismertetett módon nyerjük ki. A DNS-t az előzőkben ismertetett ligálásban használjuk fel. 45
A standard körülmények között végzett ligálás után a DNS-t kompetens Escherichia coli-sejtekbe transzformáljuk.
A transzformálást mikrorészecske-bombázással végezzük, lényegében a jelen bejelentésben más helyen is- 50 mertetett módszer alkalmazásával. Az embriókat a mikrorészecske-bombázás után 24 órával 100 pg/ml PPT-t tartalmazó táptalajra tesszük. A keletkező kalluszt négy hét után olyan táptalajra tesszük, amely 40 pg/ml PPT-t tartalmaz. A növényeket szelekció nél- 55 kül regeneráljuk.
A növényekből egy kis mintát (3-5) minden esetben PCR-rel vizsgálunk. További kódokat adtunk hozzá, hogy vizsgáljuk az embriók különböző pozícióit és távolságait, a mikrorészecske-bombázó berendezés 60 véljük. Virágport gyűjtünk, majd a máshol ismertetett ELISA technikával a cryIA(b) fehérje jelenlétét elemezzük. A virágporban magas szintű cryIA(b) fehérjekoncentrációt lehet kimutatni. A 35S promoter/szintetikus cryIA(b) génnel transzformált növények utódait üvegházban neveljük. Az ezekből a növényekből származó virágport ELISA-val elemezzük, és crylA(b) fehérjét lehet kimutatni.
Az eredmények a 23C. ábrán mutathatók ki.
Az nyilvánvaló, hogy különböző faktorok, úgymint a növényi vonalak, a növényi genotípusok, a szintetikus szekvenciák és hasonlók is befolyásolhatják az expressziót.
51. példa
A bél által preferált promoterrel fuzionált cryIA(b) gén expressziója
A pCIB4433 (36. ábra) egy olyan plazmid, amely a kukoricára optimalizált cryIA(b) gént a kukoricából izolált, bél által előnyben részesített promoterhez fuzionáltatva tartalmazza. Ezt a plazmidot három fragment egy reakcióelegyben való ligálásával hozzuk létre. A három fragment:
1. BstEII és BamHI enzimekkel hasított pCIB4418; 1,8 kb méretű fragment;
2. Nsil és BstEII enzimekkel hasított pBtin; 5,9 kb méretű fragment; a pBtinl-et máshol írjuk le ebben a leírásban;
3. A VI-151 jelű PCR fragmentet PCR reakcióelegyben állítjuk elő, az előzőkben ismertetett standard körülmények alkalmazásával.
A használt PCR indítómolekulák az alábbiak:
\ TTA TC-3’
TCG CTT CTG TGC AAC AAC C-3’ szempontjából. A növényeket az alábbi kódokkal küldtük az üvegházba:
JS21A TOP Bt PCR pozitív növények
JS21A MID Bt PCR pozitív növények
JS21C BOT Bt PCR pozitív növények
JS22D MID Bt PCR pozitív növények
JS23B MID Bt PCR negatív növények (kontroll).
A regenerált növényekből származó levélmintáknak biológiai vizsgálattal nézzük az inszekticid aktivitását európai magfűróval szemben, a 48. példában leírtak alapján, az eredmények a 23D. ábrán láthatók.
A levélminták ELISA analízisét a levelekben expresszált crylA(b) fehérje mennyiségének meghatározása céljából a 48. példában leírtak alapján végezzük, az eredmények a 24E. ábrán láthatók.
Deponálások
Az alábbi plazmidokat helyeztük letétbe az Agricultural Research Culture Collectionnél (NRRL) (1818 N. University St. Peoria, IL 61604), a Budapest Treaty előírásai szerint: pCIB4418, pCIB4420, pCIB4429, pCIB4431, pCIB4433, pCIB5601, pCIB3166 és pCIB3171.
A jelen találmányt specifikus megvalósítási módok alapján írtuk le; az azonban nyilvánvaló, hogy számos
HU 220 294 Β variáció, módosítás és megvalósítási mód lehetséges. Ennek megfelelően az összes ilyen variációt, módosítást és megvalósítási módot a jelen találmány oltalmi körébe tartozónak tekintünk.
1. számú szekvencia: 4360 bp
Bacillus thuringiensis kurstaki HD-1 Cryla(b) inszekticid kristályos protein gén
GTTAACACCC TGGGTCAAAA ATTGATATTT TCATAAGATG AGTCATATGT TTTAAATTGT AATTGGTATC TTAATAAAAG AGATGGAGGT AATGCATTCC TTATAATTGT TTAAGTAACC TAGAAACTGG TTACACCCCA ATCGATATTT AATTTGTTCC CGGTGCTGGA TTTGTGTTAG GTCCCTCTCA ATGGGACGCA TTTCTTGTAC AAGAATTCGC TAGGAACCAA GCCATTTCTA TTTACGCAGA ATCTTTTAGA GAGTGGGAAG AGATGCGTAT TCAATTCAAT GACATGAACA CAGTTCAAAA TTATCAAGTT CCTCTTTTAT TATCAGTTTT GAGAGATGTT TCAGTGTTTG TCAATAGTCG TTATAATGAT TTAACTAGGC GCTGGTACAA TACGGGATTA GAGCGTGTAT ATAATCAATT TAGAAGAGAA TTAACACTAA ACTATGATAG TAGAACGTAT CCAATTCGAA CAAACCCAGT ATTAGAAAAT TTTGATGGTA GAAGTATTAG GAGTCCACAT TTGATGGATA CTCATAGAGG AGAATATTAT TGGTCAGGGC CGGGGCCAGA ATTCACTTTT CCGCTATATG GTATTGTTGC TCAACTAGGT CAGGGCGTGT GACCTTTTAA TATAGGGATA AATAATCAAC CTTATGGAAC CTCCTCAAAT TTGCCATCCG CGCTGGATGA AATACCGCCA CAGAATAACA GATTAAGCCA TGTTTCAATG TTTCGTTCAG GAGCTCCTAT GTTCTCTTGG ATACATCGTA CACAAATTAC ACAAATACCT TTAACAAAAT TTAAAGGACC AGGATTTACA GGAGGAGATA CAACCTTAAG AGTAAATATT ACTGCACCAT ACGCTTCTAC CACAAATTTA CAATTCCATA GGAATTTTTC AGCAACTATG AGTAGTGGGA TAGGTTTTAC TACTCCGTTT AACTTTTCAA ATGTCTTCAA TTCAGGCAAT GAAGTTTATA TAACCTTTGA GGCAGAATAT GATTTAGAAA CTTCTTCCAA TCAAATCGGG TTAAAAACAG CCAATTTAGT TGAGTGTTTA TCTGATGAAT AGAAAGTCAA ACATGCGAAG CGACTTAGTG TTAGAGGGAT CAATAGACAA CTAGACCGTG AAGGAGGCGA TGACGTATTC AAAGAGAATT GCTATCCAAC GTATTTATAT CAAAAAATAG ACCAATTAAG AGGGTATATC GAAGATAGTC ATGCCAAACA CGAAACAGTA AATGTGCCAG CAAGTCCAAT CGGAAAATGT GCCCATCATT GATGTACAGA CTTAAATGAG GACTTAGGTG ATGGCCATGC AAGACTAGGA AATCTAGAAT CACTAGCTCG TGTGAAAAGA GCGGAGAAAA GGGAAACAAA TATTGTTTAT AAAGAGGCAA CTCAATATGA TAGATTACAA GCGGATACCA GCGTTCATAG CATTCGAGAA GCTTATCTGC CGGCTATTTT TGAAGAATTA GAAGGGCGTA GAAATGTCAT TAAAAATGGT GATTTTAATA ATGTAGATGT AGAAGAACAA AACAACCACC CAGAAGTGTC ACAAGAAGTT CGTGTCTGTC
AGTAAAATTA GTTGCACTTT GTGCATTTTT 60 AGTAATGAAA AACAGTATTA TATCATAATG 120 AACTTATGGA TAACAATCCG AACATCAATG 180 CTGAAGTAGA AGTATTAGGT GGAGAAAGAA 240 CCTTGTCGCT AACGCAATTT CTTTTGAGTG 300 GACTAGTTGA TATAATATGG GGAATTTTTG 360 AAATTGAACA GTTAATTAAC CAAAGAATAG 420 GATTAGAAGG ACTAAGCAAT CTTTATCAAA 480 CAGATCCTAC TAATCCAGCA TTAAGAGAAG 540 GTGCCCTTAC AACCGCTATT CCTCTTTTTG 600 CAGTATATGT TCAAGCTGCA AATTTACATT 660 GACAAAGGTG GGGATTTGAT GCCGCGACTA 720 TTATTGGCAA CTATACAGAT CATGCTGTAC 780 GGGGACCGGA TTCTAGAGAT TGGATAAGAT 840 CTGTATTAGA TATCGTTTCT CTATTTCCGA 900 CAGTTTCCCA ATTAACAAGA GAAATTTATA 960 GTTTTCGAGG CTCGGCTCAG GGCATAGAAG 1020 TACTTAACAG TATAACCATC TATACGGATG 1080 ATCAAATAAT GGCTTCTCCT GTAGGGTTTT 1140 GAACTATGGG AAATGCAGCT CCACAACAAC 1200 ATAGAACATT ATCGTCCACT TTATATAGAA 1260 AACTATCTGT TCTTGACGGG ACAGAATTTG 1320 CTGTATACAG AAAAAGCGGA ACGGTAGATT 1380 ACGTGCCACC TAGGCAAGGA TTTAGTCATC 1440 GCTTTAGTAA TAGTAGTGTA AGTATAATAA 1500 GTGCTGAATT TAATAATATA ATTCCTTCAT 1560 CTACTAATCT TGGCTCTGGA ACTTCTGTCG 1620 TTCTTCGAAG AACTTCACCT GGCCAGATTT 1680 TATCACAAAG ATATCGGGTA AGAATTCGCT 1740 CATCAATTGA CGGAAGACCT ATTAATCAGG 1800 GTAATTTACA GTCCGGAAGC TTTAGGACTG 1860 ATGGATCAAG TGTATTTACG TTAAGTGCTC 1920 TAGATCGAAT TGAATTTGTT CCGGCAGAAG 1980 GAGCACAAAA GGCGGTGAAT GAGCTGTTTA 2040 ATGTGACGGA TTATCATATT GATCAAGTAT 2100 TTTGTCTGGA TGAAAAAAAA GAATTGTCCG 2160 ATGAGCGGAA TTTACTTCAA GATCCAAACT 2220 GCTGGAGAGG AAGTACGGAT ATTACCATCC 2280 ACGTTACGCT ATTGGGTACC TTTGATGAGT 2340 ATGAGTCGAA ATTAAAAGCC TATACCCGTT 2400 AAGACTTAGA AATCTATTTA ATTCGCTACA 2460 GTACGGGTTC CTTATGGCCG CTTTCAGCCC 2520 CCCATCATTT CTCCTTGGAC ATTGATGTTG 2580 TATGGGTGAT ATTCAAGATT AAGACGCAAG 2640 TTCTCGAAGA GAAACCATTA GTAGGAGAAG 2700 AATGGAGAGA CAAACGTGAA AAATTGGAAT 2760 AAGAATCTGT AGATGCTTTA TTTGTAAACT 2820 ACATCGCGAT GATTCATGCG GCAGATAAAC 2880 CTGAGCTGTC TGTGATTCCG GGTGTCAATG 2940 TTTTCACTGC ATTCTCCCTA TATGATGCGA 3000 ATGGCTTATC CTGCTGGAAC GTGAAAGGGC 3060 GTTCGGTCCT TGTTGTTCCG GAATGGGAAG 3120 CGGGTCGTGG CTATATCCTT CGTGTCACAG 3180
HU 220 294 B
CGTACAAGGA GGGATATGGA GAAGGTTGCG ACGAACTGAA GTTTAGCAAC TGTGTAGAAG GTAATGATTA TACTGCGACT CAAGAAGAAT GATATGACGG AGCCTATGAA AGCAATTCTT AAGAAAAAGC ATATACAGAT GGACGAAGAG GGGATTACAC ACCACTACCA GCTGGCTATG CCGATAAGGT ATGGATTGAG ATCGGAGAAA AATTACTTCT TATGGAGGAA TAATATATGC GATTACTGAC TTGTATTGAC AGATAAATAA TCACTCTTAA AAGAATGATG TCCGTTTTTT TTTTTTGCGA AGGCTTTACT TAACGGGGTA CACTACCCCC AAGTGTCAAA AAACGTTATT ÁTTTTTTATG TTCAAGATGA TCATTTAACC CCTTCTCTTT TGGAAGAACT ACGAAAGTTT TCAGGAAATG AATTAGCTAC GAGTGATTCT CTCGTTCGAC TATGCAGTCA CCAGAAGGAC TCAATAAACG CTTTGATAAA TCTGCATTAT GGAAAAGTAA ACTTTGTAAA TATTTTCAAC GAATCCGTAT TTTAGATGCG CATGTATATC CTGGGTCAGG TGGTTGTGCA
2. számú szekvencia: 3474 bp.
kukoricára optimalizált tiszta szintetikus CrylA(b) gén
ATGGACAACA ACCCCAACAT CAACGAGTGC GTGGAGGTGC TGGGCGGCGA GCGCATCGAG AGCCTGACCC AGTTCCTGCT GAGCGAGTTC GTGGACATCA TCTGGGGCAT CTTCGGCCCC GAGCAGCTGA TCAACCAGCG CATCGAGGAG GAGGGCCTGA GCAACCTGTA CCAGATCTAC CCCACCAACC CCGCCCTGCG CGAGGAGATG CTGACCACCG CCATCCCCCT GTTCGCCGTG TACGTGCAGG CCGCCAACCT GCACCTGAGC CGCTGGGGCT TCGACGCCGC CACCATCAAC GGCAACTACA CCGACCACGC CGTGCGCTGG CCCGACAGCC GCGACTGGAT CCGCTACAAC CTGGACATCG TGAGCCTGTT CCCCAACTAC AGCCAGCTGA CCCGCGAGAT CTACACCAAC CGCGGCAGCG CCCAGGGCAT CGAGGGCAGC AACAGCATCA CCATCTACAC CGACGCCCAC ATCATGGCCA GCCCCGTGGG CTTCAGCGGC ATGGGCAACG CCGCCCCCCA GCAGCGCATC ACCCTGAGCA GCACCCTGTA CCGCCGCCCC AGCGTGCTGG ACGGCACCGA GTTCGCCTAC TACCGCAAGA GCGGCACCGT GGACAGCCTG CCCCCCCGCC AGGGCTTCAG CCACCGCCTG AGCAACAGCA GCGTGAGCAT CATCCGCGCC GAGTTCAACA ACATCATCCC CAGCAGCCAG AACCTGGGCA GCGGCACCAG CGTGGTGAAG CGCCGCACCA GCCCCGGCCA GATCAGCACC CAGCGCTACC GCGTGCGCAT CCGCTACGCC ATCGACGGCC GCCCCATCAA CCAGGGCAAC CTGCAGAGCG GCAGCTTCCG CACCGTGGGC AGCAGCGTGT TCACCCTGAG CGCCCACGTG CGCATCGAGT TCGTGCCCGC CGAGGTGACC CAGAAGGCCG TGAACGAGCT GTTCACCAGC ACCGACTACC ACATCGACCA GGTGAGCAAC CTGGACGAGA AGAAGGAGCT GAGCGAGAAG CGCAACCTGC TGCAGGACCC CAACTTCCGC CGCGGCAGCA CCGACATCAC CATCCAGGGC
TAACCATTCA TGAGATCGAG AACAATACAG 3240 AGGAAGTATA TCCAAACAAC ACGGTAACGT 3300 ATGAGGGTAC GTACACTTCT CGTAATCGAG 3360 CTGTACCAGC TGATTATGCA TCAGCCTATG 3420 ACAATCCTTG TGAATCTAAC AGAGGATATG 3480 TGACAAAAGA ATTAGAGTAC TTCCCAGAAA 3540 CGGAAGGAAC ATTCATCGTG GACAGCGTGG 3600 TTTATAATGT AAGGTGTGCA AATAAAGAAT 3660 GGAAATTTTT ATATGAATAA AAAACGGGCA 3720 GTATGATTTA ACGAGTGATA TTTAAATGTT 3780 CCGCCACATG CCCATCAACT TAAGAATTTG 3840 CTTTCTAAAA AGCTAGCTAG AAAGGATGAC 3900 ATTACAACTA TTTTCTGAAG AGCTGTATCG 3960 CGCTAAAGAA TTAGGTTTTG TAAAAAGAAA 4020 CATATGTATC TGGGGCAGTC AACGTACAGC 4080 ATTACACGCC GCCACAGCAC TCTTATGAGT 4140 AAAGCGGTTG AATTTTTGAA ATATATTTTT 4200 ACATCAGCCA TTTCAAGTGC AGCACTCACG 4260 ACGATTTTCC AAGTACCGAA ACATTTAGCA 4320 CAAACTGCAG 4360
ATCCCCTACA ACTGCCTGAG CAACCCCGAG 60 ACCGGCTACA CCCCCATCGA CATCAGCCTG 120 GTGCCCGGCG CCGGCTTCGT GCTGGGCCTG 180 AGCCAGTGGG ACGCCTTCCT GGTGCAGATC 240 TTCGCCCGCA ACCAGGCCAT CAGCCGCCTG 300 GCCGAGAGCT TCCGCGAGTG GGAGGCCGAC 360 CGCATCCAGT TCAACGACAT GAACAGCGCC 420 CAGAACTACC AGGTGCCCCT GCTGAGCGTG 480 GTGCTGCGCG ACGTGAGCGT GTTCGGCCAG 540 AGCCGCTACA ACGACCTGAC CCGCCTGATC 600 TACAACACCG GCCTGGAGCG CGTGTGGGGC 660 CAGTTCCGCC GCGAGCTGAC CCTGACCGTG 720 GACAGCCGCA CCTACCCCAT CCGCACCGTG 780 CCCGTGCTGG AGAACTTCGA CGGCAGCTTC 840 ATCCGCAGCC CCCACCTGAT GGACATCCTG 900 CGCGGCGAGT ACTACTGGAG CGGCCACCAG 960 CCCGAGTTCA CCTTCCCCCT GTACGGCACC 1020 GTGGCCCAGC TGGGCCAGGG CGTGTACCGC 1080 TTCAACATCG GCATCAACAA CCAGCAGCTG 1140 GGCACCAGCA GCAACCTGCC CAGCGCCGTG 1200 GACGAGATCC CCCCCCAGAA CAACAACGTG 1260 AGCCACGTGA GCATGTTCCG CAGCGGCTTC 1320 CCCATGTTCA GCTGGATCCA CCGCAGCGCC 1380 ATCACCCAGA TCCCCCTGAC CAAGAGCACC 1440 GGCCCCGGCT TCACCGGCGG CGACATCCTG 1500 CTGCGCGTGA ACATCACCGC CCCCCTGAGC 1560 AGCACCACCA ACCTGCAGTT CCACACCAGC 1620 TTCAGCGCCA CCATGAGCAG CGGCAGCAAC 1680 TTCACCACCC CCTTCAACTT CAGCAACGGC 1740 TTCAACAGCG GCAACGAGGT GTACATCGAC 1800 TTCGAGGCCG AGTACGACCT GGAGCGCGCC 1860 AGCAACCAGA TCGGCCTGAA GACCGACGTG 1920 CTGGTGGAGT GCCTGAGCGA CGAGTTCTGC 1980 GTGAAGCACG CCAAGCGCCT GAGCGACGAG 2040 GGCATCAACC GCCAGCTGGA CCGCGGCTGG 2100 GGCGACGACG TGTTCAAGGA GAACTACGTG 2160
HU 220 294 B
ACCCTGCTGG GCACCTTCGA CGAGTGCTAC AGCAAGCTGA AGGCCTACAC CCGCTACCAG CTGGAGATCT ACCTGATCCG CTACAACGCC GGCAGCCTGT GGCCCCTGAG CGCCCCCAGC CACTTCAGCC TGGACATCGA CGTGGGCTGC GTGATCTTCA AGATCAAGAC CCAGGACGGC GAGGAGAAGC CCCTGGTGGG CGAGGCCCTG CGCGACAAGC GCGAGAAGCT GGAGTGGGAG AGCGTGGACG CCCTGTTCGT GAACAGCCAG GCCATGATCC ACGCCGCCGA CAAGCGCGTG CTGAGCGTGA TCCCCGGCGT GAACGCCGCC ACCGCCTTCA GCCTGTACGA CGCCCGCAAC CTGAGCTGCT GGAACGTGAA GGGCCACGTG GTGCTGGTGG TGCCCGAGTG GGAGGCCGAG CGCGGCTACA TCCTGCGCGT GACCGCCTAC ATCCACGAGA TCGAGAACAA CACCGACGAG GTGTACCCCA ACAACACCGT GACCTGCAAC GGCACCTACA CCAGCCGCAA CCGCGGCTAC CCCGCCGACT ACGCCAGCGC CTACGAGGAG CCCTGCGAGA GCAACCGCGG CTACGGCGAC AAGGAGCTGG AGTACTTCCC CGAGACCGAC GGCACCTTCA TCGTGGACAG CGTGGAGCTG
CCCACCTACC TGTACCAGAA GATCGACGAG 2220 CTGCGCGGCT ACATCGAGGA CAGCCAGGAC 2280 AAGCACGAGA CCGTGAACGT GCCCGGCACC 2340 CCCATCGGCA AGTGCGCCCA CCACAGCCAC 2400 ACCGACCTGA ACGAGGACCT GGGCGTGTGG 2460 CACGCCCGCC TGGGCAACCT GGAGTTCCTG 2520 GCCCGCGTGA AGCGCGCCGA GAAGAAGTGG 2580 ACCAACATCG TGTACAAGGA GGCCAAGGAG 2640 TACGACCGCC TGCAGGCCGA CACCAACATC 2700 CACAGCATCC GCGAGGCCTA CCTGCCCGAG 2760 ATCTTCGAGG AGCTGGAGGG CCGCATCTTC 2820 GTGATCAAGA ACGGCGACTT CAACAACGGC 2880 GACGTGGAGG AGCAGAACAA CCACCGCAGC 2940 GTGAGCCAGG AGGTGCGCGT GTGCCCCGGC 3000 AAGGAGGGCT ACGGCGAGGG CTGCGTGACC 3060 CTGAAGTTCA GCAACTGCGT GGAGGAGGAG 3120 GACTACACCG CCACCCAGGA GGAGTACGAG 3180 GACGGCGCCT ACGAGAGCAA CAGCAGCGTG 3240 AAGGCCTACA CCGACGGCCG CCGCGACAAC 3300 TACACCCCCC TGCCCGCCGG CTACGTGACC 3360 AAGGTGTGGA TCGAGATCGG CGAGACCGAG 3420 CTGCTGATGG AGGAGTAGTA CATG 3474
3. számú szekvencia: 1961 bp. csonkított szintetikus kukoricára optimalizált Bt CryIA(b) gén
AACCCCGAGG TGGAGGTGCT GGGCGGCGAG ATCAGCCTGA GCCTGACCCA GTTCCTGCTG CTGGGCCTGG TGGACATCAT CTGGGGCATC GTGCAGATCG AGCAGCTGAT CAACCAGCGC AGCCGCCTGG AGGGCCTGAG CAACCTGTAC GAGGCCGACC CCACCAACCC CGCCCTGCGC AACAGCGCCC TGACCACCGC CATCCCCCTG CTGAGCGTGT ACGTGCAGGC CGCCAACCTG TTCGGCCAGC GCTGGGGCTT CGACGCCGCC CGCCTGATCG GCAACTACAC CGACCACGCC GTGTGGGGTC CCGACAGCCG CGACTGGATC CTGACCGTGC TGGACATCGT GAGCCTGTTC CGCACCGTGA GCCAGCTGAC CCGCGAGATT GGCAGCTTCC GCGGCAGCGC CCAGGGCATC GACATCCTGA ACAGCATCAC CATCTACACC GGCCACCAGA TCATGGCCAG CCCCGTCGGC TACGGCACCA TGGGCAACGC TGCACCTCAG GTGTACCGCA CCCTGAGCAG CACCCTGTAC CAGCAGCTGA GCGTGCTGGA CGGCACCGAG AGCGCCGTGT ACCGCAAGAG CGGCACCGTG AACAACGTGC CACCTCGACA GGGCTTCAGC AGTGGCTTCA GCAACAGCAG CGTGAGCATC CGCAGTGCCG AGTTCAACAA CATCATCCCC AAGAGCACCA ACCTGGGCAG CGGCACCAGC GACATCCTGC GCCGCACCAG CCCCGGCCAG CCCCTGAGCC AGCGCTACCG CGTCCGCATC CACACCAGCA TCGACGGCCG CCCCATCAAC GGCAGCAACC TGCAGAGCGG CAGCTTCCGC AGCAACGGCA GCAGCGTGTT CACCCTGAGC TACATCGACC GCATCGAGTT CGTGCCCGCC GAGAGGGCTC AGAAGGCCGT GAACGAGCTG ACCGACGTGA CCGACTACCA CATCGATCAG
CGCATCGAGA CCGGCTACAC CCCCATCGAC 120 AGCGAGTTCG TGCCCGGCGC CGGCTTCGTG 180 TTCGGCCCCA GCCAGTGGGA CGCCTTCCTG 240 ATCGAGGAGT TCGCCCGCAA CCAGGCCATC 300 CAAATCTACG CCGAGAGCTT CCGCGAGTGG 360 GAGGAGATGC GCATCCAGTT CAACGACATG 420 TTCGCCGTGC AGAACTACCA GGTGCCCCTG 480 CACCTGAGCG TGCTGCGCGA CGTCAGCGTG 540 ACCATCAACA GCCGCTACAA CGACCTGACC 600 GTGCGCTGGT ACAACACCGG CCTGGAGCGC 660 AGGTACAACC AGTTCCGCCG CGAGCTGACC 720 CCCAACTACG ACAGCCGCAC CTACCCCATC 780 TACACCAACC CCGTGCTGGA GAACTTCGAC 840 GAGGGCAGCA TCCGCAGCCC CCACCTGATG 900 GACGCCCACC GCGGCGAGTA CTACTGGAGC 960 TTCAGCGGCC CCGAGTTCAC CTTCCCCCTG 1020 CAGCGCATCG TGGCACAGCT GGGCCAGGGA 1080 CGTCGACCTT TCAACATCGG CATCAACAAC 1140 TTCGCCTACG GCACCAGCAG CAACCTGCCC 1200 GACAGCCTGG ACGAGATCCC CCCTCAGAAC 1260 CACCGTCTGA GCCACGTGAG CATGTTCCGC 1320 ATCCGTGCAC CTATGTTCAG CTGGATTCAC 1380 AGCAGCCAGA TCACCCAGAT CCCCCTGACC 1440 GTGGTGAAGG GCCCCGGCTT CACCGGCGGC 1500 ATCAGCACCC TGCGCGTGAA CATCACCGCC 1560 CGCTACGCCA GCACCACCAA CCTGCAGTTC 1620 CAGGGCAACT TCAGCGCCAC CATGAGCAGC 1680 ACCGTGGGCT TCACCACCCC CTTCAACTTC 1740 GCCCACGTGT TCAACAGCGG CAACGAGGTG 1800 GAGGTGACCT TCGAGGCCGA GTACGACCTG 1860 TTCACCAGCA GCAACCAGAT CGGCCTGAAG 1920 GTGTAGGAGC T 1961
HU 220 294 B
4. számú szekvencia: 3508 bp. teljes szintetikus kukoricára optimalizált Bt CryIA(b) gén
GATCCAACAA TGGACAACAA CCCCAACATC AACCCCGAGG TGGAGGTGCT GGGCGGCGAG ATCAGCCTGA GCCTGACCCA GTTCCTGCTG CTGGGCCTGG TGGACATCAT CTGGGGCATC GTGCAGATCG AGCAGCTGAT CAACCAGCGC AGCCGCCTGG AGGGCCTGAG CAACCTGTAC GAGGCCGACC CCACCAACCC CGCCCTGCGC AACAGCGCCC TGACCACCGC CATCCCCCTG CTGAGCGTGT ACGTGCAGGC CGCCAACCTG TTCGGCCAGC GCTGGGGCTT CGACGCCGCC CGCCTGATCG GCAACTACAC CGACCACGCC GTGTGGGGTC CCGACAGCCG CGACTGGATC CTGACCGTGC TGGACATCGT GAGCCTGTTC CGCACCGTGA GCCAGCTGAC CCGCGAGATT GGCAGCTTCC GCGGCAGCGC CCAGGGCATC GACATCCTGA ACAGCATCAC CATCTACACC GGCCACCAGA TCATGGCCAG CCCCGTCGGC TACGGCACCA TGGGCAACGC TGCACCTCAG GTGTACCGCA CCCTGAGCAG CACCCTGTAC CAGCAGCTGA GCGTGCTGGA CGGCACCGAG AGCGCCGTGT ACCGCAAGAG CGGCACCGTG AACAACGTGC CACCTCGACA GGGCTTCAGC AGTGGCTTCA GCAACAGCAG CGTGAGCATC CGCAGTGCCG AGTTCAACAA CATCATCCCC AAGAGCACCA ACCTGGGCAG CGGCACCAGC GACATCCTGC GCCGCACCAG CCCCGGCCAG CCCCTGAGCC AGCGCTACCG CGTCCGCATC CACACCAGCA TCGACGGCCG CCCCATCAAC GGCAGCAACC TGCAGAGCGG CAGCTTCCGC AGCAACGGCA GCAGCGTGTT CACCCTGAGC TACATCGACC GCATCGAGTT CGTGCCCGCC GAGAGGGCTC AGAAGGCCGT GAACGAGCTG ACCGACGTGA CCGACTACCA CATCGATCAG GAGTTCTGCC TGGACGAGAA GAAGGAGCTG AGCGACGAGC GCAACCTGCT GCAGGACCCC CGCGGCTGGC GCGGCAGCAC CGACATCACC AACTACGTGA CCCTGCTGGG CACCTTCGAC ATCGACGAGA GCAAGCTGAA GGCCTACACC AGCCAGGACC TGGAGATCTA CCTGATCCGC CCCGGCACCG GCAGCCTGTG GCCCCTGAGC CACAGCCACC ACTTCAGCCT GGACATCGAC GGCGTGTGGG TGATCTTCAA GATCAAGACC GAGTTCCTGG AGGAGAAGCC CCTGGTGGGC AAGAAGTGGC GCGACAAGCG CGAGAAGCTG GCCAAGGAGA GCGTGGACGC CCTGTTCGTG ACCAACATCG CCATGATCCA CGCCGCCGAC CTGCCCGAGC TGAGCGTGAT CCCCGGCGTG CGCATCTTCA CCGCCTTCAG CCTGTACGAC AACAACGGCC TGAGCTGCTG GAACGTGAAG CACCGCAGCG TGCTGGTGGT GCCCGAGTGG TGCCCCGGCC GCGGCTACAT CCTGCGCGTG TGCGTGACCA TCCACGAGAT CGAGAACAAC GAGGAGGAGG TGTACCCCAA CAACACCGTG GAGTACGAGG GCACCTACAC CAGCCGCAAC AGCAGCGTGC CCGCCGACTA CGCCAGCGCC CGCGACAACC CCTGCGAGAG CAACCGCGGC
AACGAGTGCA TCCCCTACAA CTGCCTGAGC 60 CGCATCGAGA CCGGCTACAC CCCCATCGAC 120 AGCGAGTTCG TGCCCGGCGC CGGCTTCGTG 180 TTCGGCCCCA GCCAGTGGGA CGCCTTCCTG 240 ATCGAGGAGT TCGCCCGCAA CCAGGCCATC 300 CAAATCTACG CCGAGAGCTT CCGCGAGTGG 360 GAGGAGATGC GCATCCAGTT CAACGACATG 420 TTCGCCGTGC AGAACTACCA GGTGCCCCTG 480 CACCTGAGCG TGCTGCGCGA CGTCAGCGTG 540 ACCATCAACA GCCGCTACAA CGACCTGACC 600 GTGCGCTGGT ACAACACCGG CCTGGAGCGC 660 AGGTACAACC AGTTCCGCCG CGAGCTGACC 720 CCCAACTACG ACAGCCGCAC CTACCCCATC 780 TACACCAACC CCGTGCTGGA GAACTTCGAC 840 GAGGGCAGCA TCCGCAGCCC CCACCTGATG 900 GACGCCCACC GCGGCGAGTA CTACTGGAGC 960 TTCAGCGGCC CCGAGTTCAC CTTCCCCCTG 1020 CAGCGCATCG TGGCACAGCT GGGCCAGGGA 1080 CGTCGACCTT TCAACATCGG CATCAACAAC 1140 TTCGCCTACG GCACCAGCAG CAACCTGCCC 1200 GACAGCCTGG ACGAGATCCC CCCTCAGAAC 1260 CACCGTCTGA GCCACGTGAG CATGTTCCGC 1320 ATCCGTGCAC CTATGTTCAG CTGGATTCAC 1380 AGCAGCCAGA TCACCCAGAT CCCCCTGACC 1440 GTGGTGAAGG GCCCCGGCTT CACCGGCGGC 1500 ATCAGCACCC TGCGCGTGAA CATCACCGCC 1560 CGCTACGCCA GCACCACCAA CCTGCAGTTC 1620 CAGGGCAACT TCAGCGCCAC CATGAGCAGC 1680 ACCGTGGGCT TCACCACCCC CTTCAACTTC 1740 GCCCACGTGT TCAACAGCGG CAACGAGGTG 1800 GAGGTGACCT TCGAGGCCGA GTACGACCTG 1860 TTCACCAGCA GCAACCAGAT CGGCCTGAAG 1920 GTGAGCAACC TGGTGGAGTG CCTGAGCGAC 1980 AGCGAGAAGG TGAAGCACGC CAAGCGCCTG 2040 AACTTCCGCG GCATCAACCG CCAGCTGGAC 2100 ATCCAGGGCG GCGACGACGT GTTCAAGGAG 2160 GAGTGCTACC CCACCTACCT GTACCAGAAG 2220 CGCTACCAGC TGCGCGGCTA CATCGAGGAC 2280 TACAACGCCA AGCACGAGAC CGTGAACGTG 2340 GCCCCCAGCC CCATCGGCAA GTGCGCCCAC 2400 GTGGGCTGCA CCGACCTGAA CGAGGACCTG 2460 CAGGACGGCC ACGCCCGCCT GGGCAACCTG 2520 GAGGCCCTGG CCCGCGTGAA GCGCGCCGAG 2580 GAGTGGGAGA CCAACATCGT GTACAAGGAG 2640 AACAGCCAGT ACGACCGCCT GCAGGCCGAC 2700 AAGCGCGTGC ACAGCATTCG CGAGGCCTAC 2760 AACGCCGCCA TCTTCGAGGA GCTGGAGGGC 2320 GCCCGCAACG TGATCAAGAA CGGCGACTTC 2880 GGCCACGTGG ACGTGGAGGA GCAGAACAAC 2940 GAGGCCGAGG TGAGCCAGGA GGTGCGCGTG 3000 ACCGCCTACA AGGAGGGCTA CGGCGAGGGC 3060 ACCGACGAGC TCAAGTTCAG CAACTGCGTG 3120 ACCTGCAACG ACTACACCGC CACCCAGGAG 3180 CGCGGCTACG ACGGCGCCTA CGAGAGCAAC 3240 TACGAGGAGA AGGCCTACAC CGACGGCCGC 3300 TACGGCGACT ACACCCCCCT GCCCGCCGGC 3360
HU 220 294 B
TACGTGACCA AGGAGCTGGA GTACTTCCCC GAGACCGACA AGGTGTGGAT CGAGATCGGC 3420 GAGACCGAGG GCACCTTCAT CGTGGACAGC GTGGAGCTGC TGCTGATGGA GGAGTAGTAC 3480 ATGTGATAGT ACGTAAGCTC GAGGATCT 3508
5. számú szekvencia: 1845 bp. csonkított szintetikus Bt gén (Perlak és munkatársai) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQID NO: 5 ATGGACAACA ACCCAAACAT CAACGAATGC GTTGAAGTAC TTGGTGGAGA ACGCATTGAA TCCTTGACAC AGTTTCTGCT CAGCGAGTTC GTTGACATCA TCTGGGGTAT CTTTGGTCCA GAGCAGTTGA TCAACCAGAG GATCGAAGAG GAAGGATTGA GCAATCTCTA CCAAATCTAT CCTACTAACC CAGCTCTCCG CGAGGAAATG TTGACCACAG CTATCCCATT GTTCGCAGTC TACGTTCAAG CAGCTAATCT TCACCTCAGC AGGTGGGGAT TCGATGCTGC AACCATCAAT GGAAACTACA CCGACCACGC TGTTCGTTGG CCTGATTCTA GAGATTGGAT TAGATACAAC TTGGACATTG TGTCTCTCTT CCCGAACTAT TCCCAACTTA CCAGAGAAAT CTATACTAAC CGTGGTTCTG CCCAAGGTAT CGAAGGCTCC AACAGCATAA CTATCTACAG CGATGCTCAC ATCATGGCCT CTCCAGTTGG ATTCAGCGGG ATGGGAAACG CCGCTCCACA ACAACGTATC ACCTTGTCTT CCACCTTGTA CAGAAGACCC TCCGTTCTTG ACGGAACAGA GTTCGCCTAT TACAGAAAGA GCGGAACCGT TGATTCCTTG CCACCCAGGC AAGGATTCTC CCACAGGTTG AGCAACAGTT CCGTGAGCAT CATCAGAGCT GAGTTCAACA ATATCATTCC TTCCTCTCAA AACCTTGGAT CTGGAACTTC TGTCGTGAAA AGAAGAACTT CTCCTGGCCA GATTAGCACC CAAAGATATC GTGTCAGGAT TCGTTACGCA ATCGACGGAA GGCCTATCAA TCAGGGTAAC TTGCAATCCG GCAGCTTCAG AACCGTCGGT TCAAGCGTTT TCACCCTTAG CGCTCATGTG CGTATTGAGT TTGTGCCTGC CGAAGTTACC
ATTCCATACA ACTGCTTGAG TAACCCAGAA ACCGGTTACA CTCCCATCGA CATCTCCTTG GTGCCAGGTG CTGGGTTCGT TCTCGGACTA TCTCAATGGG ATGCATTCCT GGTGCAAATT TTCGCCAGGA ACCAGGCCAT CTCTAGGTTG GCAGAGAGCT TCAGAGAGTG GGAAGCCGAT CGTATTCAAT TCAACGACAT GAACAGCGCC CAGAACTACC AAGTTCCTCT CTTGTCCGTG GTGCTTCGAG ACGTTAGCGT GTTTGGGCAA AGCCGTTACA ACGACCTTAC TAGGCTGATT TACAACACTG GCTTGGAGCG TGTCTGGGGT CAGTTCAGGA GAGAATTGAC CCTCACAGTT GACTCCAGAA CCTACCCTAT CCGTACAGTG CCAGTTCTTG AGAACTTCGA CGGTAGCTTC ATCAGGAGCC CACACTTGAT GGACATCTTG AGAGGAGAGT ATTACTGGTC TGGACACCAG CCCGAGTTTA CCTTTCCTCT CTATGGAACT GTTGCTCAAC TAGGTCAGGG TGTCTACAGA TTCAATATCG GTATCAACAA CCAGCAACTT GGAACCTCTT CTAACTTGCC ATCCGCTGTT GACGAAATCC CACCACAGAA CAACAATGTG AGCCACGTGT CCATGTTCCG TTCCGGATTC CCTATGTTCT CATGGATTCA TCGTAGTGCT ATCACCCAAA TCCCATTGAC CAAGTCTACT GGACCAGGCT TCACAGGAGG TGATATTCTT CTCAGAGTTA ACATCACTGC ACCACTTTCT TCTACCACTA ACTTGCAATT CCACACCTCC TTCTCCGCAA CCATGTCAAG CGGCAGCAAC TTCACTACTC CTTTCAACTT CTCTAACGGA TTCAATTCTG GCAATGAAGT GTACATTGAC TTCGAGGCTG AGTAC
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1845

Claims (39)

1. Nukleotidszekvencia, mely rovar irtására alkal- 45 más Bacillus thuringiensis proteint kódoló szekvenciát tartalmaz, azzal jellemezve, hogy a kódolószekvencia legalább 90%-ban homológ a fehérje kukoricára optimalizált kódolószekvenciáját 100%-ban tartalmazó kodonszekvenciával.
2. Az 1. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, azzal jellemezve, hogy a kódolószekvencia Bt proteint kódol.
3. A 2. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, azzal jellemezve, hogy a kódolószekvencia crylA(b) proteint kódol.
4. A 3. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, azzal jellemezve, hogy a kódolószekvencia a 3. vagy a 4. számú kódolószekvenciákat, vagy a 7. ábra szerinti szekvenciát tartalmazza.
5. A 3. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, azzal jellemezve, hogy a kódolószekvencia egy cryIA(b) proteint kódol, mely a természetes cryIA(b) proteinhez képest hőstabil.
6. Az 5. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, azzal jellemezve, hogy a kódolószekvencia a 9., 11., 13. vagy 15. ábra szerinti szekvenciákat tartalmazza.
50
7. A 2. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, azzal jellemezve, hogy a kódolószekvencia crylB vagy crylA(c) proteint kódol.
8. A 7. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, azzal jellemezve, hogy a kódolószekvencia a 6. ábra sze55 rinti crylB proteint kódoló szekvenciát tartalmazza.
9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti nukleotidszekvencia, azzal jellemezve, hogy egy első, növényi sejtben expresszió irányítására alkalmas, a kódolószekvenciához működőképesen kapcsolt promotert
60 tartalmaz.
HU 220 294 B
10. A 9. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, azzal jellemezve, hogy kukoricasejtben a kapcsolódó kódolószekvencia expressziójának irányítására alkalmas promotert tartalmaz.
11. A 9. vagy 10. igénypont bármelyike szerinti nukleotidszekvencia, azzal jellemezve, hogy a promoter valamely indukálható promoter, konstitutív promoter, időben vagy a fejlődési folyamat által szabályozott promoter, szövet által előnyben részesített vagy szövetspecifikus promoter.
12. A 11. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, azzal jellemezve, hogy a promoter CaMV35S promoter, CaMV 19S promoter, PÉP karboxiláz promoter, bél által előnyben részesített promoter vagy pollen által előnyben részesített promoter.
13. A 12. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, azzal jellemezve, hogy a promoter egy növényi kalciumfiiggő foszfát-kináz (CDPK) génből izolált, egy növény kapcsolódó szerkezeti génjében a pollenspecifikus expressziót szabályozni képes promoter.
14. A 13. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, azzal jellemezve, hogy a promoter egy növényi triptofán-szintáz-alfa (TrpA) alegység génből izolált, egy növény kapcsolódó szerkezeti génjében a bél által előnyben részesített expressziót szabályozni képes promoter.
15. A 13. vagy 14. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, azzaljellemezve, hogy a promoter egyszikű génből izolált.
16. A 15. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, azzal jellemezve, hogy a promoter kukoricagénből izolált.
17. A 14. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, azzal jellemezve, hogy az a 24. ábra szerinti DNS-szekvenciát tartalmazó, bél által előnyben részesített promotert tartalmazza.
18. A 13. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, azzal jellemezve, hogy az a 35. ábra szerinti DNS-szekvenciát tartalmazó, pollenspecifikus promotert tartalmazza.
19. A 9. igénypont szerinti nukleotidszekvencia azzal jellemezve, hogy egy második, egy növényi sejtben egy kapcsolódó kódolószekvencia expressziójának irányítására képes, egy második kódolószekvenciához működőképesen kapcsolódó második promotert is tartalmaz.
20. A 19. igénypont szerinti kódolószekvencia, azzal jellemezve, hogy a második promoter valamely, a 10-18. igénypontokban felsorolt promoter.
21. A 19. igénypont szerinti kódolószekvencia, azzal jellemezve, hogy a második kódolószekvencia egy rovar elpusztítására képes proteint kódol, mely legalább 90%-ban homológ a fehérje kukoricára optimalizált kódolószekvenciáját 100%-ban tartalmazó kodonszekvenciával.
22. A 21. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, azzal jellemezve, hogy a második kódolószekvencia Bt proteint kódol.
23. A 22. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, azzal jellemezve, hogy a második kódolószekvencia crylA(b) proteint kódol.
24. A 19. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, azzal jellemezve, hogy a második kódolószekvencia egy marker gén.
25. Rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy az 1-18. igénypontok bármelyike szerinti nukleotidszekvenciát tartalmazza.
26. Rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy a 19-24. igénypontok bármelyike szerinti nukleotidszekvenciát tartalmazza.
27. Növény vagy utódai, azzal jellemezve, hogy az 1-18. igénypontok bármelyike szerinti nukleotidszekvenciával stabilan vannak transzformálva.
28. Növény vagy utódai, azzal jellemezve, hogy a 19-24. igénypontok bármelyike szerinti nukleotidszekvenciával stabilan van transzformálva.
29. A 27. igénypont szerinti növény vagy utódai, azzal jellemezve, hogy a kódolószekvencia Bt proteint kódol.
30. A 27. igénypont szerinti növény vagy utódai, azzal jellemezve, hogy a kódolószekvenciák legalább egyike Bt proteint kódol.
31. A 29. igénypont szerinti növény vagy utódai, azzal jellemezve, hogy az első és második kódolószekvencia egyaránt Bt proteint kódol.
32. A 29-31. igénypontok bármelyike szerinti növény vagy utódai azzal jellemezve, hogy a Bt protein cryIA(b) protein.
33. A 32. igénypont szerinti növény vagy utódai azzal jellemezve, hogy a Lepidoptera vagy Coleoptera rovarok gátlásához megfelelő mennyiségű proteint expresszál.
34. A 33. igénypont szerinti növény vagy utódai azzal jellemezve, hogy európai magfúró, cukorrépafüró, szárfúró, bagolypillehemyó, amerikai sereghemyó, szőlőfirkáló bogarak, drótféreg és levéltetű gátlásához megfelelő mennyiségű proteint expresszál.
35. A 27-34. igénypontok bármelyike szerinti transzgenikus növény vagy utódai, azzal jellemezve, hogy genomjába stabilan beépítve olyan, első promotert tartalmazó nukleotidszekvenciát tartalmaz, ahol a promoter egy növényi sejt nukleotidszekvenciája expressziójának szabályozására képesen egy rovar irtására alkalmas, a fehérje kukoricára optimalizált kódolószekvenciát 100%-ban tartalmazó kodonszekvenciával legalább 90%-ban homológ Bt proteint kódoló szekvenciához működőképesen van kapcsolva, és a kódolószekvenciát a megfelelő protein expresszióját a növénynek a káros rovarok elleni védelméhez szükséges menynyiségben tartalmazza.
36. Eljárás kukoricának inszekticid Bt proteint kódoló szekvenciája előállítására, ahol a kódolószekvencia legalább 90%-ban homológ a fehérje kukoricára optimalizált kódolószekvenciáját 100%-ban tartalmazó kodonszekvenciával, azzal jellemezve, hogy meghatározzuk a kiválasztott inszekticid Bt fehérje aminosavszekvenciáját, és a protein kódolószekvenciáját a kukorica által a megfelelő natív kodonokra legelőnyösebb kodonoknak helyettesítésével oly módon módosítjuk, hogy a kukoricakódoló szekvencia legalább 90%-ban homológ a fe56
HU 220 294 B héije kukoricára optimalizált kódolószekvenciát 100%ban tartalmazó kodonszekvenciával.
37. Eljárás kukoricának legalább egy rovarkártevő elleni védelmére, azzal jellemezve, hogy kukoricanövényt stabilan transzformálunk az 1-24. igénypontok bármelyike szerinti legalább egy nukleotidszekvenciával, melyben a kódolószekvencia inszekticid proteint kódol, a növénynek a rovarok elleni védelemre megfelelő mértékű expressziós szintjéig.
38. Nukleotidszekvenciával stabilan transzformált növény, azzal jellemezve, hogy a nukleotidszekvencia kukoricára optimalizált kódolószekvenciát tartalmaz, amelyben a kódolószekvencia legalább 90%-ban homológ a kukorica előnyös kodonszekvenciájának 100%-át tartalmazó Bt proteint kódoló szekvenciával, ahol a fehérje a transzformált növényben legalább 100-szor nagyobb mértékben van kifejezve, mint a természetes kódolószekvencia alkalmazásával kapott fehérje.
39. Eljárás inszekticid Bt proteint kódoló szekvenciát genomjukba stabilan integrált transzgén kukoricanövények előállítására, azzal jellemezve, hogy (i) egy első, növényi sejtben expresszió vezérlésére alkalmas, a kódolószekvenciához működőképesen kapcsolt promotert tartalmazó nukleotidszekvenciát állítunk elő, mely rovar irtására alkalmas proteint kódol, ahol a kódolószekvencia legalább 90%-ban homológ a fehérje kukoricára optimalizált kódolószekvenciáját 100%-ban tartalmazó kodonszekvenciával, (ii) az (i) lépés szerint előállított nukleotidszekvenciát növénybe transzformáljuk, a nukleotidszekvenciának vagy részének a növényi genomba történő funkcionális integrálásával, a növénynek a rovarkártevő elleni védelmére szükséges mennyiségű protein expresszálásához, és (iii) a (ii) lépésben nyert növényt különböző kukorica-genotípusokkal keresztezzük olyan utódnövény létrehozására, mely kukoricára optimalizált inszekticid proteinkódoló szekvenciát tartalmaz, mely az utód genomjába stabilan integrált, és a növénynek a rovarkártevő elleni védelmére szükséges mennyiségű protein expresszióját biztosítja.
HU9400960A 1991-10-04 1992-10-05 Kukoricában növelt inszekticid aktivitással rendelkező szintetikus DNS-szekvencia HU220294B (hu)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US77202791A 1991-10-04 1991-10-04
US07/951,715 US5625136A (en) 1991-10-04 1992-09-25 Synthetic DNA sequence having enhanced insecticidal activity in maize
PCT/US1992/008476 WO1993007278A1 (en) 1991-10-04 1992-10-05 Synthetic dna sequence having enhanced insecticidal activity in maize

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9400960D0 HU9400960D0 (en) 1994-06-28
HUT68261A HUT68261A (en) 1995-06-28
HU220294B true HU220294B (hu) 2001-11-28

Family

ID=27118547

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9400960A HU220294B (hu) 1991-10-04 1992-10-05 Kukoricában növelt inszekticid aktivitással rendelkező szintetikus DNS-szekvencia

Country Status (18)

Country Link
US (9) US5625136A (hu)
EP (3) EP0618976B1 (hu)
JP (2) JPH07500012A (hu)
AT (1) ATE221916T1 (hu)
AU (1) AU2795292A (hu)
BG (1) BG62782B1 (hu)
BR (1) BR9206578A (hu)
CA (1) CA2120514C (hu)
CZ (1) CZ292953B6 (hu)
DE (1) DE69232725T2 (hu)
DK (1) DK0618976T3 (hu)
ES (1) ES2181678T3 (hu)
HU (1) HU220294B (hu)
RO (1) RO110263B1 (hu)
RU (1) RU2202611C2 (hu)
SK (1) SK283357B6 (hu)
UA (1) UA48104C2 (hu)
WO (1) WO1993007278A1 (hu)

Families Citing this family (1689)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5350689A (en) * 1987-05-20 1994-09-27 Ciba-Geigy Corporation Zea mays plants and transgenic Zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells
BR9007159A (pt) 1989-02-24 1991-12-10 Monsanto Co Genes sinteticos de plantas e processo para a preparacao dos mesmos
US5550318A (en) * 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US6803499B1 (en) 1989-08-09 2004-10-12 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US6329574B1 (en) * 1990-01-22 2001-12-11 Dekalb Genetics Corporation High lysine fertile transgenic corn plants
HU220773B1 (hu) * 1990-01-22 2002-05-28 Dekalb Genetics Corporation Eljárás termő transzgenikus kukoricanövények előállítására
US6777589B1 (en) * 1990-01-22 2004-08-17 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US6025545A (en) * 1990-01-22 2000-02-15 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US6395966B1 (en) * 1990-08-09 2002-05-28 Dekalb Genetics Corp. Fertile transgenic maize plants containing a gene encoding the pat protein
US6403865B1 (en) 1990-08-24 2002-06-11 Syngenta Investment Corp. Method of producing transgenic maize using direct transformation of commercially important genotypes
US6750046B2 (en) 1991-02-22 2004-06-15 Sembiosys Genetics, Inc. Preparation of thioredoxin and thioredoxin reductase proteins on oil bodies
UA48104C2 (uk) 1991-10-04 2002-08-15 Новартіс Аг Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника
CA2104341A1 (en) * 1992-08-19 1994-02-20 Charles L. Armstrong Method for transforming monocotyledonous plants
HU221339B1 (en) * 1992-08-27 2002-09-28 Plant Genetic Systems Nv New bacillus thuringiensis strains and their insecticidal proteins
US5849870A (en) 1993-03-25 1998-12-15 Novartis Finance Corporation Pesticidal proteins and strains
US6118047A (en) 1993-08-25 2000-09-12 Dekalb Genetic Corporation Anthranilate synthase gene and method of use thereof for conferring tryptophan overproduction
US6281411B1 (en) 1993-08-25 2001-08-28 Dekalb Genetics Corporation Transgenic monocots plants with increased glycine-betaine content
US6326527B1 (en) * 1993-08-25 2001-12-04 Dekalb Genetics Corporation Method for altering the nutritional content of plant seed
AU712874B2 (en) * 1993-08-25 1999-11-18 Monsanto Technology, Llc Fertile, transgenic maize plants and methods for their production
WO1995016778A1 (en) * 1993-12-13 1995-06-22 Ecogen Inc. Control of aphids with bacillus thuringiensis toxin proteins
US5689052A (en) * 1993-12-22 1997-11-18 Monsanto Company Synthetic DNA sequences having enhanced expression in monocotyledonous plants and method for preparation thereof
US7262055B2 (en) 1998-08-25 2007-08-28 Gendaq Limited Regulated gene expression in plants
US7285416B2 (en) 2000-01-24 2007-10-23 Gendaq Limited Regulated gene expression in plants
EP0793717B1 (en) * 1994-10-24 2005-01-26 The Texas A &amp; M University System Oral immunization with transgenic plants
US5631152A (en) * 1994-10-26 1997-05-20 Monsanto Company Rapid and efficient regeneration of transgenic plants
JP3761628B2 (ja) * 1995-07-14 2006-03-29 住友化学株式会社 植物プロモーターおよびその利用
ATE278788T1 (de) * 1995-07-26 2004-10-15 Pioneer Hi Bred Int Expressionskontrollesequenz zur allgemeinen und effektiven genexpression in pflanzen
GB9516241D0 (en) * 1995-08-08 1995-10-11 Zeneca Ltd Dna constructs
ES2330168T3 (es) * 1995-10-13 2009-12-04 Dow Agrosciences Llc Gen mopdificado de bacillus thuringiensis para combatir los lepidopteros en plantas.
GB9600786D0 (en) * 1996-01-15 1996-03-20 Ciba Geigy Ag Method of controlling insect pests
US5986174A (en) * 1996-06-21 1999-11-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize promoter sequence for leaf- and stalk-preferred gene expression
US6713063B1 (en) 1996-11-20 2004-03-30 Monsanto Technology, Llc Broad-spectrum δ-endotoxins
US6017534A (en) 1996-11-20 2000-01-25 Ecogen, Inc. Hybrid Bacillus thuringiensis δ-endotoxins with novel broad-spectrum insecticidal activity
PT942985E (pt) 1996-11-20 2004-12-31 Monsanto Technology Llc Delta-endotoxinas de largo espectro
US7585645B2 (en) 1997-05-27 2009-09-08 Sembiosys Genetics Inc. Thioredoxin and thioredoxin reductase containing oil body based products
EP1676922B1 (en) * 1997-11-12 2008-09-17 Mycogen Corporation Plant-optimized genes encoding pesticidal toxins
AU774176B2 (en) * 1997-11-12 2004-06-17 Mycogen Corporation Plant-optimised genes encoding pesticidal toxins
US6218188B1 (en) * 1997-11-12 2001-04-17 Mycogen Corporation Plant-optimized genes encoding pesticidal toxins
AUPP058797A0 (en) * 1997-11-28 1997-12-18 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Novel gene
JP2002504336A (ja) * 1998-02-20 2002-02-12 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト フォトラブドゥスからの殺昆虫性毒素
US6121521A (en) * 1998-04-01 2000-09-19 Novartis Ag Chimeric insecticidal protein and DNA coding therefor
AR020078A1 (es) 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
DE69931511T2 (de) 1998-10-23 2006-09-28 Mycogen Corp., San Diego Für 15kda und 45kda pestizid-proteine kodierende pflanzen-optimierte polynukleotide
US20110014706A2 (en) * 1998-12-14 2011-01-20 Monsanto Technology Llc Arabidopsis thaliana Genome Sequence and Uses Thereof
US6420630B1 (en) * 1998-12-01 2002-07-16 Stine Biotechnology Methods for tissue culturing and transforming elite inbreds of Zea mays L.
US20080047032A1 (en) * 1999-01-29 2008-02-21 Evolutionary Genomics Llc Eg307 nucleic acids and uses thereof
US7252966B2 (en) * 1999-01-29 2007-08-07 Evolutionary Genomics Llc EG307 polynucleotides and uses thereof
US7439018B2 (en) * 1999-01-29 2008-10-21 Evolutionary Genomics, Inc. EG1117 Polynucleotides and uses thereof
US6278041B1 (en) 1999-07-30 2001-08-21 Syngenta Participations Ag Peroxidase gene sequences
ES2319959T3 (es) * 1999-08-04 2009-05-18 Tosk, Inc. Procedimiento de cribado in vivo de toxicologia de alto rendimiento.
US6365129B1 (en) 1999-08-04 2002-04-02 Tosk, Inc. Invivo high throughput toxicology screening method
AU782918B2 (en) 1999-11-10 2005-09-08 University Of Washington Compositions and methods for modulation of plant cell division
CA2331674A1 (en) 2000-01-28 2001-07-28 Southern Illinois University Isolated polynucleotides and polypeptides relating to loci underlying resistance to soybean cyst nematode and soybean sudden death syndrome and methods employing same
MXPA02009254A (es) * 2000-03-24 2003-05-23 Pioneer Hi Bred Int Metodos de seleccion y desarrollo de plantas que tienen una calidad de raiz mejorada y una raiz resistente al vuelco.
AU8980001A (en) 2000-08-11 2002-02-25 Syngenta Participations Ag Methods for stable transformation of plants
IL154596A0 (en) 2000-08-25 2003-09-17 Basf Plant Science Gmbh Plant polynucleotides encoding novel prenyl proteases
US7053265B2 (en) 2000-10-02 2006-05-30 The Board Of Trustees Operating Michigan State University Application of bi-directional promoters for modification of gene expression
US8080496B2 (en) 2000-10-06 2011-12-20 Syngenta Crop Protection, Inc. Method for reducing pest damage to corn by treating transgenic corn seeds with thiamethoxam pesticide
US6593273B2 (en) 2000-10-06 2003-07-15 Monsanto Technology Llc Method for reducing pest damage to corn by treating transgenic corn seeds with pesticide
US6586365B2 (en) 2000-10-06 2003-07-01 Monsanto Technology, Llc Method for reducing pest damage to corn by treating transgenic corn seeds with clothianidin pesticide
AR035799A1 (es) 2001-03-30 2004-07-14 Syngenta Participations Ag Toxinas insecticidas aisladas de bacillus thuringiensis y sus usos.
CA2448096A1 (en) 2001-05-30 2002-12-05 Chromos Molecular Systems, Inc. Plant artificial chromosomes, uses thereof and methods of preparing plant artificial chromosomes
JP2005525081A (ja) 2001-06-05 2005-08-25 カレン ケイ． オオイシ 植物からの生物活性ミュラー管抑制物質を含むＴＧＦ−βタンパク質の遺伝子発現および産生法
EP1925672A1 (en) 2001-06-22 2008-05-28 Syngeta Participations AG Abiotic stress responsive polynucleotides and polypeptides
WO2003018766A2 (en) * 2001-08-27 2003-03-06 Syngenta Participations Ag Self-processing plants and plant parts
ATE539084T1 (de) 2001-11-07 2012-01-15 Syngenta Participations Ag Promotoren zur regulierung der genexpression in pflanzenwurzeln
US7230168B2 (en) * 2001-12-20 2007-06-12 The Curators Of The University Of Missouri Reversible male sterility in transgenic plants by expression of cytokinin oxidase
EP1947201A3 (en) 2002-01-16 2009-05-06 Evolutionary Genomics, LLC Methods to identify evolutionarily significant changes in polynucleotide and polypeptide sequences in domesticated plants and animals
ATE465628T1 (de) 2002-03-06 2010-05-15 Syngenta Participations Ag Neue vip3-toxine und ihre verwendung
AU2003220642C1 (en) * 2002-03-29 2009-01-29 Syngenta Participations Ag Lambda integrase mediated recombination in plants
US7049491B2 (en) * 2002-05-03 2006-05-23 Bayer Bioscience N.V. Plants made insect resistant by transformation with a nucleic acid encoding a modified Cry1Ab protein and methods for making same
EP1970442B1 (en) 2002-05-03 2017-01-18 Monsanto Technology LLC Transgenic high tryptophan plants
US20030208789A1 (en) * 2002-05-03 2003-11-06 Stefan Jansens Wound-inducible expression in plants
US20030208790A1 (en) * 2002-05-03 2003-11-06 Stefan Jansens Insect resistant plants and methods for making same
WO2004001003A2 (en) 2002-06-20 2003-12-31 Board Of Trustees Operating Michigan State University Plastid division and related genes and proteins, and methods of use
AU2003298545A1 (en) * 2002-08-08 2004-04-23 Evolutionary Genomics, Llc Detection of evolutionary bottlenecking by dna sequencing as a method to discover genes of value
US6920521B2 (en) * 2002-10-10 2005-07-19 International Business Machines Corporation Method and system of managing virtualized physical memory in a data processing system
CA2511824A1 (en) 2002-12-26 2004-07-22 Syngenta Participations Ag Cell proliferation-related polypeptides and uses therefor
US7460252B2 (en) * 2003-01-13 2008-12-02 Axiohm Transaction Solutions, Inc. Graphical printing system and method using text triggers
ATE412054T1 (de) 2003-02-20 2008-11-15 Athenix Corp Delta-endotoxin gene und verfahren zu ihrer verwendung
US20040210964A1 (en) * 2003-02-20 2004-10-21 Athenix Corporation AXMI-009, a delta-endotoxin gene and methods for its use
US7189694B2 (en) * 2003-04-18 2007-03-13 University Of Florida Research Foundation, Inc. Inhibitors of autophosphorylation protein kinases
US7554007B2 (en) 2003-05-22 2009-06-30 Evogene Ltd. Methods of increasing abiotic stress tolerance and/or biomass in plants
AU2005234725B2 (en) 2003-05-22 2012-02-23 Evogene Ltd. Methods of Increasing Abiotic Stress Tolerance and/or Biomass in Plants and Plants Generated Thereby
EP1959017A1 (en) 2003-06-17 2008-08-20 SemBioSys Genetics Inc. Methods for the production of insulin in plants
WO2005019425A2 (en) * 2003-08-18 2005-03-03 University Of Florida Research Foundation, Inc. Heat stable variants of adenosine diphosphate glucose pyrophosphorylase
JP2007507237A (ja) 2003-10-03 2007-03-29 ユニバーシティー オブ フロリダ リサーチ ファウンデイション インコーポレイテッド 植物における香味および芳香性の揮発性物質の合成のための材料および方法
US7935862B2 (en) * 2003-12-02 2011-05-03 Syngenta Participations Ag Targeted integration and stacking of DNA through homologous recombination
US7368629B2 (en) * 2004-02-04 2008-05-06 Divergence, Inc. Nucleic acids encoding anthelmintic agents and plants made therefrom
AR048669A1 (es) 2004-03-03 2006-05-17 Syngenta Ltd Derivados biciclicos de bisamida
WO2005086813A2 (en) 2004-03-08 2005-09-22 Syngenta Participations Ag Glutamine-rich maize seed protein and promoter
WO2005102034A2 (en) 2004-04-20 2005-11-03 Syngenta Participations Ag Regulatory sequences for expressing gene products in plant reproductive tissue
EP2336330B1 (en) 2004-06-14 2018-01-10 Evogene Ltd. Polynucleotides and polypeptides involved in plant fiber development and methods of using same
US7825233B2 (en) * 2004-06-30 2010-11-02 Allergan, Inc. Optimizing expression of active Botulinum Toxin type E
CA2575994A1 (en) * 2004-08-04 2006-02-16 Allergan, Inc. Optimizing expression of active botulinum toxin type a
GB0418047D0 (en) 2004-08-12 2004-09-15 Syngenta Participations Ag Fungicidal compositions
GB0422401D0 (en) 2004-10-08 2004-11-10 Syngenta Participations Ag Fungicidal compositions
UA89210C2 (ru) 2004-12-17 2010-01-11 Сингента Партисипэйшнс Аг Гербицидная композиция и способы борьбы с травянистыми и широколистыми сорняками в культурах риса, злаков и кукурузы
AU2006230352A1 (en) * 2005-03-29 2006-10-05 Evolutionary Genomics Llc EG1117 and EG307 polynucleotides and uses thereof
CA2605939A1 (en) * 2005-04-05 2006-10-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for designing nucleic acid molecules for polypeptide expression in plants using plant virus codon-bias
AR053049A1 (es) 2005-04-08 2007-04-18 Athenix Corp Identificacaion de una nueva clase de epsp sintetasas
EP1874936B1 (en) 2005-04-19 2013-10-30 BASF Plant Science GmbH Improved methods controlling gene expression
ES2570758T3 (es) 2005-04-21 2016-05-20 Univ Florida Materiales y métodos para el control de enfermedades respiratorias en cánidos
WO2006116202A1 (en) * 2005-04-22 2006-11-02 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for engineering resistance to tomato yellow leaf curl virus (tylcv) in plants
GB0508993D0 (en) 2005-05-03 2005-06-08 Syngenta Participations Ag Pesticidal compositions
WO2006125065A2 (en) 2005-05-18 2006-11-23 The Board Of Trustees Operating Michigan State University Resistance to soybean aphid in early maturing soybean germplasm
CN101184847B (zh) * 2005-06-02 2015-02-25 先正达参股股份有限公司 表达cry1ab的杀昆虫转基因棉ce43-67b
WO2006128569A2 (en) * 2005-06-02 2006-12-07 Syngenta Participations Ag 1143-14a, insecticidal transgenic cotton expressing cry1ab
WO2006128568A2 (en) * 2005-06-02 2006-12-07 Syngenta Participations Ag T342-142, insecticidal transgenic cotton expressing cry1ab
MX2007014832A (es) * 2005-06-02 2008-02-15 Syngenta Participations Ag Algodon transgenico insecticida ce44-69d que expresa cry1ab.
UA96128C2 (ru) 2005-06-30 2011-10-10 Сингента Партисипейшнс Аг Способы обработки семян, композиция для обработки семян, водное пестицидное средство в виде суспензии, способ защиты семян и органов растений и семян
EP2484768A3 (en) 2005-07-18 2012-11-21 Protalix Ltd. Mucosal or enteral administration of biologically active macromolecules
CN102057917B (zh) 2005-07-21 2013-03-20 先正达参股股份有限公司 杀真菌组合物
CN101296613B (zh) 2005-07-29 2016-02-10 目标栽培公司 显性失活突变体krp蛋白保护活性细胞周期蛋白-cdk复合物不受野生型krp抑制
KR20080063296A (ko) * 2005-09-02 2008-07-03 에보류셔너리 제노믹스 인크 Ｅｇ8798과 ｅｇ9703 폴리뉴클레오티드 및 그것의 용도
EP1929019A2 (en) 2005-09-08 2008-06-11 Chromatin, Inc. Plants modified with mini-chromosomes
EP1763998B1 (en) 2005-09-16 2007-05-23 Syngenta Participations AG Fungicidal compositions
EP1931789B1 (en) 2005-09-20 2016-05-04 BASF Plant Science GmbH Methods for controlling gene expression using ta-siran
RU2403714C2 (ru) 2005-09-29 2010-11-20 Зингента Партисипейшнс Аг Фунгицидная композиция, содержащая ципродинил
NZ717751A (en) 2005-10-19 2019-09-27 Cornell Res Foundation Inc Materials and methods for respiratory disease control in canines
EP1776864A1 (en) 2005-10-20 2007-04-25 Syngenta Participations AG Fungicidal compositions
BRPI0618965B1 (pt) 2005-10-24 2021-01-12 Evogene Ltd método para aumentar a tolerância de uma planta a uma condição de estresse abiótico, método para aumentar a biomassa, vigor e/ou rendimento de uma planta, método para aumentar a eficiência do uso de fertilizante e/ou absorção de uma planta
AR057205A1 (es) 2005-12-01 2007-11-21 Athenix Corp Genes grg23 y grg51 que confieren resistencia a herbicidas
RU2444896C2 (ru) 2005-12-22 2012-03-20 Зингента Партисипейшнс Аг Способы и композиция для воздействия на рост и для борьбы с болезнями
US20090012029A1 (en) * 2006-01-06 2009-01-08 Hussey Richard S Cyst Nematode Resistant Transgenic Plants
US20080313769A9 (en) 2006-01-12 2008-12-18 Athenix Corporation EPSP synthase domains conferring glyphosate resistance
UY30090A1 (es) 2006-01-16 2007-08-31 Syngenta Participations Ag Insecticidas novedosos
WO2007100897A2 (en) * 2006-02-27 2007-09-07 Edenspace System Corporation Energy crops for improved biofuel feedstocks
AR059724A1 (es) 2006-03-02 2008-04-23 Athenix Corp Metodos y composiciones para mejorar la actividad enzimatica en plantas transgenicas
US7977535B2 (en) 2006-07-12 2011-07-12 Board Of Trustees Of Michigan State University DNA encoding ring zinc-finger protein and the use of the DNA in vectors and bacteria and in plants
US8629259B2 (en) 2006-07-20 2014-01-14 Yeda Research And Development Co. Ltd. Photosynthetic organisms and compositions and methods of generating same
AU2007356171B8 (en) 2006-08-04 2014-01-16 Bp Corporation North America Inc. Glucanases, nucleic acids encoding them, and methods for making and using them
EP2489268A3 (en) 2006-09-18 2012-10-24 Basf Se Pesticidal mixtures comprising an anthranilamide insecticide and a fungicide
US8877478B2 (en) 2006-09-21 2014-11-04 Verenium Corporation Phytases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US20100162433A1 (en) 2006-10-27 2010-06-24 Mclaren James Plants with improved nitrogen utilization and stress tolerance
US8080647B2 (en) * 2006-11-22 2011-12-20 Pioneer Hi Bred International Inc Tetracycline repressor and uses thereof
EP1925205A1 (en) 2006-11-23 2008-05-28 Sygenta Participations AG. Plant propagation material treatment nematicides
SI2102349T1 (sl) 2006-12-07 2017-12-29 Kansas State University Research Foundation Acetolaktat sintaza proti herbicidu odporen sirek
WO2008075364A2 (en) 2006-12-20 2008-06-26 Evogene Ltd. Polynucleotides and polypeptides involved in plant fiber development and methods of using same
CN101646767B (zh) 2006-12-21 2013-05-29 先正达参股股份有限公司 淀粉酶和葡糖淀粉酶、编码其的核酸以及关于制备和使用其的方法
WO2008089061A2 (en) 2007-01-12 2008-07-24 Kansas State University Research Foundation Acetyl-coa carboxylase herbicide resistant sorghum
WO2008094512A2 (en) * 2007-01-29 2008-08-07 The Ohio Sate University Research Foundation System for expression of genes in plants from a virus-based expression vector
CA2675460A1 (en) 2007-01-29 2008-08-07 Syngenta Limited A post-emergent herbicidal composition for controlling the weed avena in wheat crops, said composition comprising pinoxaden, cyprosulfamide, and an additive
EP2074136A4 (en) 2007-01-30 2012-11-07 Verenium Corp ENZYMES FOR TREATING LIGNOCELLULOSE, FOR SUCH CODING NUCLEIC ACIDS, AND METHOD FOR THE PRODUCTION AND USE THEREOF
GB0704906D0 (en) 2007-03-14 2007-04-25 Syngenta Participations Ag Fungicides
ES2325523B1 (es) 2007-03-22 2010-06-24 Sumitomo Chemical Company, Limited Composicion agricola para controlar o prevenir enfermedades de las plantas provocadas por microbios patogeos de las plantas.
DE102008059357A1 (de) 2007-03-22 2009-04-23 Sumitomo Chemical Co. Ltd. Agrochemische Zusammensetzung zur Bekämpfung oder Prophylaxe von durch pflanzenpathogene Mikroben verursachten Pflanzenkrankheiten
US9522937B2 (en) * 2007-03-28 2016-12-20 Syngenta Participations Ag Insecticidal proteins
EP2137211B1 (en) * 2007-03-28 2016-08-24 Syngenta Participations AG Insecticidal proteins
JP5256753B2 (ja) 2007-03-29 2013-08-07 住友化学株式会社 イソオキサゾリン化合物とその有害生物防除用途
MX2009010858A (es) 2007-04-09 2009-11-02 Evogene Ltd Polinucleotidos, polipeptidos y metodos para aumentar el contenido de aceite, la velocidad de crecimiento y biomasa de las plantas.
ES2636907T3 (es) 2007-04-12 2017-10-10 Basf Se Mezclas pesticidas que comprenden un compuesto de cianosulfoximina
CA2584934A1 (en) 2007-04-17 2008-10-17 University Of Guelph Nitrogen-regulated sugar sensing gene and protein and modulation thereof
US20110079544A1 (en) 2009-10-01 2011-04-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for sorting resistant seed from a mixture with susceptible seed
EP2143709A4 (en) 2007-04-27 2010-04-28 Sumitomo Chemical Co AMIDE COMPOUND AND USE THEREOF
WO2008136387A1 (ja) 2007-04-27 2008-11-13 Sumitomo Chemical Company, Limited アミド化合物とその用途
JP2008291012A (ja) 2007-04-27 2008-12-04 Sumitomo Chemical Co Ltd アミド化合物ならびにその植物病害防除用途
JP2008291013A (ja) 2007-04-27 2008-12-04 Sumitomo Chemical Co Ltd アミド化合物およびその植物病害防除用途
GB0710223D0 (en) 2007-05-29 2007-07-11 Syngenta Ltd Novel Herbicides
EP2005812A1 (en) 2007-06-22 2008-12-24 Syngeta Participations AG A method for growing sugarcane
GB0712653D0 (en) 2007-06-28 2007-08-08 Syngenta Ltd Novel herbicides
EP2179651A4 (en) 2007-06-29 2012-07-11 Sumitomo Chemical Co MEANS FOR THE CONTROL OF PLANT DISEASES AND METHOD FOR THE CONTROL OF PLANT DISEASES
AU2009202819B2 (en) 2007-07-13 2014-08-28 Aramis Biotechnologies Inc. Recombinant influenza virus-like particles (VLPs) produced in transgenic plants expressing hemagglutinin
BRPI0814604A2 (pt) 2007-07-16 2015-01-27 Syngenta Participations Ag Inseticidas
BRPI0812742B1 (pt) 2007-07-24 2021-04-20 Evogene Ltd método de aumento da biomassa, da taxa de crescimento, da produtividade de semente, da eficiência do uso de nitrogênio, do estresse abiótico de uma planta, do comprimento de raiz, da cobertura de raiz, da taxa de crescimento da área de roseta, e da taxa de crescimento do diâmetro da roseta de uma planta
GB0716414D0 (en) 2007-08-22 2007-10-03 Syngenta Participations Ag Novel insecticides
GB0717082D0 (en) 2007-09-03 2007-10-10 Syngenta Ltd Novel herbicides
PL2292098T3 (pl) 2007-09-20 2020-05-18 Bayer Cropscience Lp Kombinacje zawierające szczep grzybobójczy i co najmniej jeden dodatkowy środek grzybobójczy
ES2381320T3 (es) 2007-09-26 2012-05-25 Basf Se Composiciones fungicidas ternarias que comprenden boscalida y clorotalonil
ATE504045T1 (de) * 2007-10-09 2011-04-15 Athenix Corp Berechnungsverfahren für das design synthetischer gene
US20090126044A1 (en) * 2007-10-10 2009-05-14 Athenix Corporation Synthetic genes encoding cry1ac
CA2956841A1 (en) * 2007-10-16 2009-04-23 Athenix Corporation Axmi-066 and axmi-076: delta-endotoxin proteins and methods for their use
US8318776B2 (en) 2007-11-20 2012-11-27 Sumitomo Chemical Company, Limited Pyridine compound, pesticidal composition and method of controlling pests
WO2009069123A2 (en) 2007-11-26 2009-06-04 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Compositions comprising fibrous polypeptides and polysaccharides
ES2647767T3 (es) 2007-12-03 2017-12-26 Syngenta Participations Ag Generación por ingeniería genética de proteínas enzimáticamente susceptibles
JP5347463B2 (ja) 2007-12-26 2013-11-20 住友化学株式会社 除草用組成物
CN101977928B (zh) 2007-12-27 2014-12-10 伊沃基因有限公司 用于改进植物的水分利用效率、肥料利用效率、生物/非生物胁迫耐受性、产量和生物量的分离多肽、多核苷酸
SG187500A1 (en) 2008-01-21 2013-02-28 Medicago Inc Recombinant influenza virus-like particles (vlps) produced in transgenic plants expressing hemagglutinin
FR2928070A1 (fr) 2008-02-27 2009-09-04 Sumitomo Chemical Co Composition agricole, utilisation d'un compose pour sa production et procede pour matriser ou prevenir les maladies des plantes.
WO2009116658A1 (ja) 2008-03-21 2009-09-24 住友化学株式会社 植物病害防除組成物
JP5365047B2 (ja) 2008-03-28 2013-12-11 住友化学株式会社 植物病害防除組成物および植物病害防除方法
US9074193B2 (en) * 2008-04-09 2015-07-07 University Of Florida Research Foundation, Inc. Heat resistant plants and plant tissues and methods and materials for making and using same
JP5369854B2 (ja) 2008-04-21 2013-12-18 住友化学株式会社 有害節足動物防除組成物および縮合複素環化合物
CA3148194A1 (en) 2008-05-22 2009-11-26 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and peptides and methods of using same for increasing plant yield, biomass, growth rate, vigor, oil content, abiotic stress tolerance of plants and nitrogen use efficiency
EP2727933B1 (en) * 2008-06-25 2019-01-09 Athenix Corporation Toxin genes and methods for their use
US8344209B2 (en) * 2008-07-14 2013-01-01 Syngenta Participations Ag Plant regulatory sequences
JP2011529464A (ja) 2008-07-29 2011-12-08 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 除草活性を有するピペラジン化合物
CA2733126A1 (en) 2008-08-05 2010-02-11 University Of South Florida Methods of treating cognitive impairment
US9132168B2 (en) 2008-08-05 2015-09-15 University Of South Florida Methods of treating cognitive impairment
WO2010020941A2 (en) 2008-08-18 2010-02-25 Evogene Ltd. Isolated polypeptides and polynucleotides useful for increasing nitrogen use efficiency, abiotic stress tolerance, yield and biomass in plants
AU2009289505B2 (en) 2008-09-08 2014-01-09 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Compositions and methods for expression of a heterologous nucleotide sequence in plants
EP2183969A3 (en) 2008-10-29 2011-01-05 Basf Se Method for increasing the number of seedlings per number of sowed grains of seed
TWI526535B (zh) 2008-09-12 2016-03-21 住友化學股份有限公司 噻唑菌胺對於基因轉殖植物在植物病害之防治方法的用途
JP5355053B2 (ja) 2008-09-19 2013-11-27 住友化学株式会社 有害生物防除用組成物及び有害生物の防除方法
TWI489941B (zh) 2008-09-19 2015-07-01 Sumitomo Chemical Co 種子處理劑及保護植物的方法
US20110201649A1 (en) 2008-09-19 2011-08-18 Sumitomo Chemical Company, Limited agricultural composition
JP2010100611A (ja) 2008-09-26 2010-05-06 Sumitomo Chemical Co Ltd ピリジン化合物及びその有害生物の防除用途
BRPI0919576A2 (pt) 2008-10-02 2015-08-18 Basf Se Composto de piperazina, e, método para controlar vegetação indesejada
JP2010090089A (ja) 2008-10-10 2010-04-22 Sumitomo Chemical Co Ltd 有害生物防除組成物及び有害生物の防除方法
JP2010090090A (ja) 2008-10-10 2010-04-22 Sumitomo Chemical Co Ltd 有害生物防除組成物及び有害生物の防除方法
WO2010046423A2 (en) 2008-10-22 2010-04-29 Basf Se Use of sulfonylurea herbicides on cultivated plants
AR075466A1 (es) 2008-10-22 2011-04-06 Basf Se Uso de herbicidas tipo auxina en plantas cultivadas
EP2347014B1 (en) 2008-10-30 2016-09-21 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides and methods of using same for increasing plant yield, biomass, growth rate, vigor, oil content, abiotic stress tolerance of plants and nitrogen use efficieny
GB0820344D0 (en) 2008-11-06 2008-12-17 Syngenta Ltd Herbicidal compositions
JP5417814B2 (ja) 2008-11-25 2014-02-19 住友化学株式会社 植物病害防除用組成物及び植物病害の防除方法
JP5365161B2 (ja) 2008-11-25 2013-12-11 住友化学株式会社 植物病害防除用組成物及び植物病害の防除方法
JP5365160B2 (ja) 2008-11-25 2013-12-11 住友化学株式会社 有害生物防除用組成物及び有害生物の防除方法
JP5365158B2 (ja) 2008-11-25 2013-12-11 住友化学株式会社 植物病害防除用組成物及び植物病害の防除方法
JP5365159B2 (ja) 2008-11-25 2013-12-11 住友化学株式会社 有害生物防除用組成物及び有害生物の防除方法
JP5359223B2 (ja) 2008-11-25 2013-12-04 住友化学株式会社 植物病害防除用組成物及び植物病害の防除方法
US9133475B2 (en) 2008-11-26 2015-09-15 Board Of Trustees Of Michigan State University Aphid resistant soybean plants
GB0822834D0 (en) 2008-12-15 2009-01-21 Syngenta Ltd Novel herbicides
US8362318B2 (en) 2008-12-18 2013-01-29 Board Of Trustees Of Michigan State University Enzyme directed oil biosynthesis in microalgae
JP2010168362A (ja) 2008-12-24 2010-08-05 Sumitomo Chemical Co Ltd 含硫黄化合物およびその用途
JP5212350B2 (ja) 2008-12-24 2013-06-19 住友化学株式会社 含ハロゲン有機硫黄化合物およびその用途
US8952218B2 (en) 2008-12-29 2015-02-10 Evogene Ltd. Polynucleotides, polypeptides encoded thereby, and methods of using same for increasing abiotic stress tolerance, biomass and/or yield in plants expressing same
CN101768213B (zh) 2008-12-30 2012-05-30 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种与植物分蘖数目相关的蛋白及其编码基因与应用
GB0900864D0 (en) 2009-01-19 2009-03-04 Syngenta Ltd Novel Herbicides
BRPI1007175A2 (pt) 2009-01-22 2015-08-18 Syngenta Participations Ag Polipeptídeos hidroxifenilpriruvato dioxigenase mutantes e métodos de uso
GB0901086D0 (en) 2009-01-22 2009-03-11 Syngenta Ltd Novel herbicides
TW201038196A (en) 2009-01-26 2010-11-01 Syngenta Participations Ag Pesticidal combinations
CN102300456B (zh) 2009-01-27 2014-11-12 巴斯夫欧洲公司 拌种方法
ES2649554T3 (es) 2009-01-30 2018-01-12 Sumitomo Chemical Company, Limited Semilla recubierta
US8362321B2 (en) * 2009-02-02 2013-01-29 University Of Florida Research Foundation, Inc. Methods and materials for increasing starch biosynthesis in plants
WO2010089244A1 (en) 2009-02-03 2010-08-12 Basf Se Method for dressing seeds
GB0901834D0 (en) 2009-02-04 2009-03-11 Syngenta Ltd Novel herbicides
GB0901835D0 (en) 2009-02-04 2009-03-11 Syngenta Ltd Novel herbicides
CN102307994A (zh) 2009-02-06 2012-01-04 先正达参股股份有限公司 用于在植物中表达的多结构域酶的修饰
AR075573A1 (es) 2009-02-11 2011-04-20 Basf Se Dimethomorph como protector de plaguicidas con efectos fitotoxicos
BRPI1006004A8 (pt) 2009-02-11 2017-04-11 Basf Se Misturas, composição pesticida, método para controlar pragas e/ou melhorar a saúde das plantas, método para proteção do material de propagação de plantas de pragas e material de propagação de plantas
WO2010092031A2 (en) 2009-02-11 2010-08-19 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2010092028A2 (en) 2009-02-11 2010-08-19 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2010092014A2 (en) 2009-02-11 2010-08-19 Basf Se Pesticidal mixtures
GB0902474D0 (en) 2009-02-13 2009-04-01 Syngenta Ltd Chemical compounds
WO2010096510A2 (en) 2009-02-17 2010-08-26 Edenspace Systems Corporation Tempering of cellulosic biomass
CA2751724A1 (en) 2009-02-19 2010-08-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Blended refuge deployment via manipulation during hybrid seed production
CA2753546A1 (en) * 2009-02-25 2010-09-02 Syngenta Participations Ag Methods for increasing starch content in plant cobs
CN101817879A (zh) 2009-02-26 2010-09-01 中国科学院遗传与发育生物学研究所 金属硫蛋白及其编码基因与应用
JP2010222342A (ja) 2009-02-26 2010-10-07 Sumitomo Chemical Co Ltd 有害生物防除組成物
JP2010222343A (ja) 2009-02-26 2010-10-07 Sumitomo Chemical Co Ltd 有害生物防除組成物
AU2010220157C1 (en) 2009-03-02 2015-08-06 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing plant yield and/or agricultural characteristics
UY32471A (es) 2009-03-04 2010-08-31 Basf Se Compuestos de 3-arilquinazolin-4-ona para combatir plagas de invertebrados
WO2010102220A1 (en) 2009-03-05 2010-09-10 Metabolix, Inc. Propagation of transgenic plants
WO2010102293A1 (en) 2009-03-06 2010-09-10 Metabolix, Inc. Method of positive plant selection using sorbitol dehydrogenase
CA2754092A1 (en) 2009-03-06 2010-09-10 Syngenta Limited Herbicidal formulations
WO2010103065A1 (en) 2009-03-11 2010-09-16 Basf Se Fungicidal compositions and their use
JP2010235603A (ja) 2009-03-13 2010-10-21 Sumitomo Chemical Co Ltd ピリダジノン化合物及びその用途
BRPI1006194A2 (pt) 2009-03-16 2015-09-15 Basf Se "composição, fungicida para o controle de fungos nocivos fitopatogênicos, agente fungicida, método para o controle de fungos nocivos fitopatogênicos, semente e uso de fluopiram e metrafenona"
HUE030498T2 (hu) 2009-03-20 2017-05-29 Basf Se Eljárás vetés kezelésére kapszulázott peszticiddel
EA019044B1 (ru) 2009-03-26 2013-12-30 Басф Се Применение синтетических и биологических фунгицидов в комбинации для борьбы с вредными грибами
WO2010112545A1 (en) 2009-04-01 2010-10-07 Basf Se Isoxazoline compounds for combating invertebrate pests
CN102448291B (zh) 2009-04-02 2015-05-27 巴斯夫欧洲公司 降低植物日晒伤害的方法
BRPI1016044B1 (pt) 2009-04-06 2021-03-09 Syngenta Limited compostos herbicidas, sal agronomicamente aceitável do composto, composição herbicida, método de controlar seletivamente pragas em um local compreendendo plantas de colheitas e pragas, método de produzir o referido composto e uso do mesmo
CN102459303B (zh) 2009-05-21 2016-06-29 巴斯夫酶有限责任公司 肌醇六磷酸酶、编码它们的核酸及制备和使用它们的方法
WO2010138971A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 Edenspace Systems Corporation Plant gene regulatory elements
EP2437592A4 (en) 2009-06-05 2013-02-27 Univ Florida ISOLATION AND TARGETED SUPPRESSION OF GENES OF LIGNIN BIOSYNTHESIS IN SUGAR CANE
AU2010258264B2 (en) 2009-06-10 2016-01-28 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing nitrogen use efficiency, yield, growth rate, vigor, biomass, oil content, and/or abiotic stress tolerance
WO2010142779A1 (en) 2009-06-12 2010-12-16 Basf Se Antifungal 1,2,4-triazolyl derivatives having a 5- sulfur substituent
US8685398B2 (en) 2009-06-15 2014-04-01 Biokine Therapeutics Ltd. Chemokine binding polypeptides capable of inhibiting the course of autoimmunity, inflammation and cancer
WO2010146032A2 (de) 2009-06-16 2010-12-23 Basf Se Fungizide mischungen
CN102459201A (zh) 2009-06-18 2012-05-16 巴斯夫欧洲公司 杀真菌的1，2，4-三唑衍生物
AU2010261888A1 (en) 2009-06-18 2012-01-19 Basf Se Fungicidal mixtures
JP2012530110A (ja) 2009-06-18 2012-11-29 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 抗菌性１，２，４−トリアゾリル誘導体
US20120088664A1 (en) 2009-06-18 2012-04-12 Basf Se Antifungal 1,2,4-triazolyl derivatives having a 5-sulfur subtituent
KR20120062679A (ko) 2009-06-18 2012-06-14 바스프 에스이 황 치환기를 보유하는 트리아졸 화합물
WO2010146116A1 (en) 2009-06-18 2010-12-23 Basf Se Triazole compounds carrying a sulfur substituent
WO2010146115A1 (en) 2009-06-18 2010-12-23 Basf Se Triazole compounds carrying a sulfur substituent
BRPI1010081B8 (pt) 2009-06-19 2017-06-27 Basf Se benzoxazinonas, processo para preparar benzoxazinonas de fórmula i, compostos, acetamidas, composições herbicidas, composição para a dessecação/desfolhação de plantas, processos para preparar composições, método para controlar vegetação indesejada, método para a dessecação/desfolhação de plantas e uso das benzoxazinonas de fórmula i
GB0910766D0 (en) 2009-06-22 2009-08-05 Syngenta Ltd Chemical compounds
PL2445928T3 (pl) 2009-06-24 2018-07-31 Medicago Inc Chimeryczne, podobne do wirusa grypy cząsteczki zawierające hemaglutyninę
WO2010149758A1 (en) 2009-06-25 2010-12-29 Basf Se Antifungal 1, 2, 4-triazolyl derivatives
US20120149572A1 (en) 2009-06-25 2012-06-14 Basf Se Use of agrochemical mixtures for increasing the health of a plant
EP2451804B1 (en) 2009-07-06 2014-04-30 Basf Se Pyridazine compounds for controlling invertebrate pests
WO2011003775A2 (de) 2009-07-09 2011-01-13 Basf Se Substituierte cyanobutyrate mit herbizider wirkung
WO2011003776A2 (de) 2009-07-09 2011-01-13 Basf Se Substituierte cyanobutyrate mit herbizider wirkung
CA2749383A1 (en) 2009-07-10 2011-06-09 Syngenta Participations Ag Novel hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use
WO2011006886A2 (en) 2009-07-14 2011-01-20 Basf Se Azole compounds carrying a sulfur substituent xiv
GB0912385D0 (en) 2009-07-16 2009-08-26 Syngenta Ltd Novel herbicides
CN102469785A (zh) 2009-07-24 2012-05-23 巴斯夫欧洲公司 防治无脊椎动物害虫的吡啶衍生物
MX2012000421A (es) 2009-07-28 2012-02-08 Basf Se Composiciones plaguicidas de suspo - emulsiones.
PE20121128A1 (es) 2009-07-28 2012-08-16 Basf Se Un metodo para aumentar el nivel de aminoacidos libres en tejidos de almacenamiento de plantas perennes
ES2545738T3 (es) 2009-07-30 2015-09-15 Merial, Inc. Compuestos insecticidas a base de 4-amino-tieno[2,3-d]-pirimidina y procedimientos para su uso
ES2579928T3 (es) 2009-07-31 2016-08-17 Syngenta Limited Dionas cíclicas sustituidas con heterarilo herbicidamente activas o derivados de las mismas
FR2948530B1 (fr) * 2009-07-31 2011-08-26 Stallergenes Sa Machine a recolter du pollen
FR2948531B1 (fr) * 2009-07-31 2011-08-26 Stallergenes Sa Machine a recolter le pollen
FR2948535B1 (fr) * 2009-07-31 2013-07-05 Stallergenes Sa Procede de preparation de pollen brut
WO2011018486A2 (en) 2009-08-14 2011-02-17 Basf Se Herbicidally active composition comprising benzoxazinones
US11096345B2 (en) 2009-09-01 2021-08-24 Basf Se Method for treating post-emergent rice
TW201113377A (en) 2009-09-01 2011-04-16 Basf Agrochemical Products Bv Herbicide-tolerant plants
US20120297507A1 (en) 2009-09-11 2012-11-22 Imperial Innovations Limited Method
GB0916267D0 (en) 2009-09-16 2009-10-28 Syngenta Ltd Herbicidal compounds
WO2011033041A2 (en) 2009-09-21 2011-03-24 Syngenta Participations Ag Control of elasmopalpus
RU2579903C2 (ru) 2009-09-22 2016-04-10 Медикаго Инк. Способ получения вирусоподобных частиц растений
BR112012006615A2 (pt) 2009-09-24 2019-09-24 Basf Se compostos de amnoquinazolina da fórmula i, composição agrícola, composição veterinária, método material de propagação da planta, sementes e uso
WO2011036111A2 (en) 2009-09-25 2011-03-31 Basf Se Method for reducing pistillate flower abortion in plants
PE20121667A1 (es) 2009-09-29 2012-11-25 Basf Se Mezclas de plaguicidas
JP2013505915A (ja) 2009-09-29 2013-02-21 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 殺有害生物性混合物
PE20121435A1 (es) 2009-09-30 2012-10-23 Basf Se Sales de amina poco volatiles de pesticidas anionicos
GB201117019D0 (en) 2011-10-04 2011-11-16 Syngenta Ltd Herbicidal compounds
EP2482639B1 (en) * 2009-10-02 2017-08-02 Syngenta Participations AG Insecticidal proteins
EP2308297A1 (en) 2009-10-07 2011-04-13 Syngenta Participations AG Pesticidal composition for coating seed with a herbicide
WO2011042378A1 (de) 2009-10-09 2011-04-14 Basf Se Substituierte cyanobutyrate mit herbizider wirkung
GB0917934D0 (en) 2009-10-13 2009-11-25 Syngenta Ltd Herbicidal compounds
WO2011048120A1 (en) 2009-10-22 2011-04-28 Syngenta Participations Ag Synergistic fungicidal composition containing a n-2-(pyrazolyl) ethylphenylcarboxamide
DE102010042867A1 (de) 2009-10-28 2011-06-01 Basf Se Verwendung heterozyklischer Verbindungen als Herbizide
WO2011051212A1 (de) 2009-10-28 2011-05-05 Basf Se Verwendung heteroaromatischer verbindungen als herbizide
DE102010042866A1 (de) 2009-10-30 2011-05-05 Basf Se Substituierte Thioamide mit herbizider Wirkung
WO2011051393A1 (en) 2009-11-02 2011-05-05 Basf Se Herbicidal tetrahydrophthalimides
US8329619B2 (en) 2009-11-03 2012-12-11 Basf Se Substituted quinolinones having herbicidal action
CN102595879B (zh) 2009-11-06 2014-08-06 巴斯夫欧洲公司 4-羟基苯甲酸和选定农药的结晶配合物
WO2011057989A1 (en) 2009-11-11 2011-05-19 Basf Se Heterocyclic compounds having herbicidal action
WO2011057942A1 (en) 2009-11-12 2011-05-19 Basf Se Insecticidal methods using pyridine compounds
DK2499136T3 (en) 2009-11-13 2014-03-03 Basf Se 3- (3,4-dihydro-2H-benzo [1,4] oxazin-6-yl) -1H-pyrimidine-2,4-dione COMPOUNDS AS HERBICIDES
WO2011058036A1 (en) 2009-11-13 2011-05-19 Basf Se Tricyclic compounds having herbicidal action
MX2012005612A (es) 2009-11-17 2012-11-30 Merial Ltd Derivados de oxa o tia heteroarilalquilsulfuro fluorados para combatir plagas de invertebrados.
WO2011064188A1 (en) 2009-11-27 2011-06-03 Basf Se Insecticidal methods using nitrogen-containing heteroaromatic compounds
WO2011067184A1 (de) 2009-12-01 2011-06-09 Basf Se 3- (4, 5 -dihydroisoxazol- 5 -yl) benzoylpyrazolverbindungen und ihre mischungen mit safenern
BR112012012754A2 (pt) 2009-12-02 2015-09-08 Basf Se "misturas, composição pesticida, método de controle de pragas, método de proteção de material de propagação vegetal contra pragas e material de propagação vegetal"
AU2010326791A1 (en) 2009-12-02 2012-07-05 Basf Se Pesticidal mixtures of triazamate with strobilurines
GB0921344D0 (en) 2009-12-04 2010-01-20 Syngenta Participations Ag Chemical compounds
MX2012006366A (es) 2009-12-04 2012-06-27 Basf Se Compuesto de bis-organoazufre plaguicidas.
GB0921343D0 (en) 2009-12-04 2010-01-20 Syngenta Participations Ag Chemical compounds
GB0921346D0 (en) 2009-12-04 2010-01-20 Syngenta Participations Ag Chemical compounds
US9562235B2 (en) 2009-12-06 2017-02-07 A.B. Seeds Ltd. MicroRNA compositions and methods for enhancing plant resistance to abiotic stress
WO2011069955A1 (en) 2009-12-07 2011-06-16 Basf Se Sulfonimidamide compounds for combating animal pests
WO2011069912A1 (de) 2009-12-07 2011-06-16 Basf Se Triazolverbindungen, ihre verwendung sowie sie enthaltende mittel
AU2010330080B2 (en) 2009-12-08 2014-07-31 Basf Se Pesticidal mixtures
EA025427B1 (ru) 2009-12-08 2016-12-30 Басф Се Пестицидные смеси
WO2011069894A1 (de) 2009-12-08 2011-06-16 Basf Se Triazolverbindungen, ihre verwendung sowie sie enthaltende mittel
WO2011069916A1 (de) 2009-12-08 2011-06-16 Basf Se Triazolverbindungen, ihre verwendung als fungizide sowie sie enthaltende mittel
CN102651968A (zh) 2009-12-10 2012-08-29 巴斯夫欧洲公司 农药混合物
WO2011069930A2 (en) 2009-12-10 2011-06-16 Basf Se Pesticidal mixtures
JP2013514342A (ja) 2009-12-17 2013-04-25 シンジェンタ リミテッド ピランジオン除草剤および共除草剤を含む除草組成物
US20130137573A1 (en) 2009-12-17 2013-05-30 Syngenta Limited Herbicidal compositions comprising, and methods of use of, herbicidally active pyrandiones
WO2011073143A1 (en) 2009-12-18 2011-06-23 Basf Se Substituted cyanobutyrates having herbicidal action
WO2011073060A2 (en) 2009-12-18 2011-06-23 Syngenta Participations Ag Method of combating and controlling pests
BR112012014944A2 (pt) 2009-12-18 2015-09-15 Basf Se compostos de azolina substituída , composição , uso de um composto , e, métodos para controlar pragas invertebradas e para tratar , controlar , prevenir ou proteger animais contra infestação ou infecção por parasitas.
US9493785B2 (en) 2009-12-28 2016-11-15 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides and methods of using same for increasing plant yield, biomass, growth rate, vigor, oil content, abiotic stress tolerance of plants and nitrogen use efficiency
EP2519104B1 (en) 2009-12-29 2021-03-31 Syngenta Participations AG Pesticidal composition
WO2011082253A2 (en) 2009-12-30 2011-07-07 Board Of Trustees Of Michigan State University A method to produce acetyldiacylglycerols (ac-tags) by expression ofan acetyltransferase gene isolated from euonymus alatus (burning bush)
AU2011206563B2 (en) 2010-01-18 2015-01-22 Basf Se Compound comprising a pesticide and an alkoxylate of 2-propylheptyl amine
EP2353388A1 (en) 2010-01-28 2011-08-10 Syngenta Participations AG Insecticidal composition
EP2531493B1 (en) 2010-02-01 2015-07-22 Basf Se Substituted ketonic isoxazoline compounds and derivatives for combating animal pests
WO2011098417A1 (en) 2010-02-10 2011-08-18 Basf Se Substituted cyanobutyrates having herbicidal action
WO2011101303A2 (de) 2010-02-16 2011-08-25 Basf Se Zusammensetzung umfassend ein pestizid und ein alkoxylat von iso-heptadecylamin
US20120324604A1 (en) 2010-02-25 2012-12-20 Syngenta Crop Protection Llc Pesticidal mixtures containing isoxazoline derivatives and a fungicide
US20130085064A1 (en) 2010-02-25 2013-04-04 Syngenta Crop Protection Llc Pesticidal mixtures containing isoxazoline derivatives and insecticide or nematoicidal biological agent
GB201003551D0 (en) 2010-03-03 2010-04-21 Syngenta Participations Ag Weed control method
EP2363023A1 (en) 2010-03-04 2011-09-07 Basf Se Synergistic fungicidal and insecticidal mixtures
AR081735A1 (es) 2010-03-05 2012-10-17 Syngenta Ltd Composicion herbicida que comprende, como ingrediente activo, una mezcla de pinoxaden y un herbicida adicional
WO2011110583A2 (en) 2010-03-10 2011-09-15 Basf Se Fungicidal mixtures comprising triazole derivatives
CN102947443A (zh) 2010-03-17 2013-02-27 巴斯夫农业化学产品公司 耐受除草剂的植物
EP2547200B1 (de) 2010-03-17 2015-02-25 Basf Se Zusammensetzung umfassend ein pestizid und ein alkoxylat von verzweigtem nonylamin
JP2013522339A (ja) 2010-03-23 2013-06-13 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 除草作用を有する置換されたピリジン
JP2013522347A (ja) 2010-03-23 2013-06-13 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 無脊椎有害生物を防除するためのピリダジン化合物
EP2550261B1 (en) 2010-03-23 2016-03-16 Basf Se Pyridazine compounds for controlling invertebrate pests
AR081526A1 (es) 2010-03-23 2012-10-03 Basf Se Piridazinas sustituidas que tienen accion herbicida
US8575068B2 (en) 2010-03-23 2013-11-05 Basf Se Pyrazinothiazines having herbicidal action
WO2011117211A1 (en) 2010-03-23 2011-09-29 Basf Se Substituted pyridazines having herbicidal action
WO2011117804A1 (en) 2010-03-23 2011-09-29 Basf Se Pyridazine compounds for controlling invertebrate pests
EA201201322A1 (ru) 2010-03-23 2013-05-30 Басф Се Пиридотиазины, обладающие гербицидным действием
AR081527A1 (es) 2010-03-23 2012-10-03 Basf Se Piridinas sustituidas que tienen accion herbicida
UY33289A (es) 2010-03-24 2011-10-31 Syngenta Participations Ag Mezclas pesticidas que comprenden cis-jasmona y un ingrediente activo, y métodos para controlar pes tes.
MX2012009416A (es) 2010-03-26 2012-10-02 Basf Se Mezclas fungicidas basadas en azolopirimidinilaminas.
EP2371219A1 (en) 2010-04-01 2011-10-05 Basf Se Herbicidal acylhydrazides
CN102946734A (zh) 2010-04-20 2013-02-27 巴斯夫欧洲公司 包含唑嘧菌胺和四唑肟衍生物的杀真菌混合物
CN101812527B (zh) * 2010-04-20 2014-09-17 北京农业职业学院 一种快速检测6种转基因玉米的方法
WO2011135491A1 (en) 2010-04-26 2011-11-03 Basf Se Herbicidal azolopyrimidines
BR122021002366B1 (pt) 2010-04-28 2022-05-24 Evogene Ltd Método de aumento de produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor e/ou eficiência de uso de nitrogênio de uma planta
JP2011246436A (ja) 2010-04-28 2011-12-08 Sumitomo Chemical Co Ltd 有害生物防除組成物
WO2011134539A1 (en) 2010-04-30 2011-11-03 Basf Se Use of oxylipins as safeners and safening herbicidal compositions comprising oxylipins
WO2011138345A2 (en) 2010-05-06 2011-11-10 Basf Se Fungicidal mixtures based on gallic acid esters
GB201008290D0 (en) 2010-05-18 2010-06-30 Syngenta Ltd Chemical compounds
WO2011144593A1 (en) 2010-05-18 2011-11-24 Basf Se Pesticidal mixtures comprising insecticides and pyraclostrobin
CN103025161A (zh) 2010-05-24 2013-04-03 明治制果药业株式会社 有害生物防治剂
ES2567266T3 (es) 2010-05-28 2016-04-21 Basf Se Mezclas de pesticidas
JP5948320B2 (ja) 2010-05-28 2016-07-06 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ 殺有害生物混合物
WO2011151199A1 (en) 2010-05-31 2011-12-08 Syngenta Participations Ag Spiroheterocyclic pyrrolidine derivatives based pesticides
EP2576555A1 (en) 2010-05-31 2013-04-10 Syngenta Participations AG 1, 8 -diazaspiro [4.5]decane- 2, 4 -dione derivatives useful as pesticides
WO2011151197A1 (en) 2010-05-31 2011-12-08 Syngenta Participations Ag 1, 8 -diazaspiro [4.5] decane- 2, 4 -dione derivatives useful as pesticides
US20140018242A1 (en) 2010-05-31 2014-01-16 Syngenta Participations Ag Method of crop enhancement
ES2582458T3 (es) 2010-05-31 2016-09-13 Syngenta Participations Ag Composiciones plaguicidas
KR20130080441A (ko) 2010-05-31 2013-07-12 신젠타 파티서페이션즈 아게 살충 조성물
MX2012013370A (es) 2010-05-31 2013-01-24 Basf Se Metodo para aumentar la salud de una planta.
JP6193758B2 (ja) 2010-06-07 2017-09-06 シンジェンタ パーティシペーションズ アクチェンゲゼルシャフト 安定化された化学組成物
BR112012031088A8 (pt) 2010-06-09 2017-10-10 Syngenta Participations Ag Misturas pesticidas incluindo os derivados da isoxazolina
US20130203591A1 (en) 2010-06-09 2013-08-08 Syngenta Crop Protection Llc Pesticidal mixtures including isoxazoline derivatives
WO2011154494A2 (en) 2010-06-09 2011-12-15 Syngenta Participations Ag Pesticidal mixtures comprising isoxazoline derivatives
CN103154022A (zh) 2010-06-16 2013-06-12 富途锐基尼以色列有限公司 抗害虫植物
FR2961375B1 (fr) 2010-06-16 2016-05-13 Inst De Rech Pour Le Dev (Ird) Surproduction d'acide jasmonique dans des plantes transgeniques
BR112012032902B1 (pt) 2010-06-24 2018-03-20 Basf Se Método para controlar vegetação indesejada, composições herbicidas e processo para preparar composições ativas herbicidas
WO2011161131A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Basf Se Herbicidal mixtures
WO2011161132A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Basf Se Pesticidal mixtures
EP2402335A1 (en) 2010-06-29 2012-01-04 Basf Se Pyrazolopyridine compounds
EP2402338A1 (en) 2010-06-29 2012-01-04 Basf Se Pyrazolopyridine compounds
EP2402340A1 (en) 2010-06-29 2012-01-04 Basf Se Pyrazolopyridine compounds
EP2401915A1 (en) 2010-06-29 2012-01-04 Basf Se Pyrazolopyridine compounds
EP2402336A1 (en) 2010-06-29 2012-01-04 Basf Se Pyrazolopyridine compounds
NZ602800A (en) 2010-06-29 2014-12-24 Kumiai Chemical Industry Co 6-acyl-1,2,4-triazine-3,5-dione derivative and herbicides
EP2402343A1 (en) 2010-06-29 2012-01-04 Basf Se Pyrazole-fused bicyclic compounds
EP2402339A1 (en) 2010-06-29 2012-01-04 Basf Se Pyrazolopyridine compounds
EP2402344A1 (en) 2010-06-29 2012-01-04 Basf Se Pyrazole fused bicyclic compounds
EP2402345A1 (en) 2010-06-29 2012-01-04 Basf Se Pyrazole fused bicyclic compounds
EP2409570A3 (en) 2010-06-29 2013-11-13 Basf Se Fungicidal mixtures based on pyrazolopyridine compounds
WO2012007426A1 (en) 2010-07-13 2012-01-19 Basf Se Azoline substituted isoxazoline benzamide compounds for combating animal pests
US10106812B2 (en) 2010-07-15 2018-10-23 Technion Research & Development Foundation Limited Nucleic acid construct for increasing abiotic stress tolerance in plants
DK2595995T3 (en) 2010-07-22 2016-02-29 Basf Se Herbicidal isoxazolo [5,4-b] pyridines
EP2600717A2 (en) 2010-08-03 2013-06-12 Basf Se Fungicidal compositions
TW201210488A (en) 2010-08-09 2012-03-16 Basf Se Fungicidal mixtures
DE102011080568A1 (de) 2010-08-16 2012-02-16 Basf Se Substituierte Cyanobutyrate mit herbizider Wirkung
WO2012022729A2 (en) 2010-08-20 2012-02-23 Basf Se Method for improving the health of a plant
CN103068233A (zh) 2010-08-24 2013-04-24 巴斯夫欧洲公司 用于提高植物健康的农业化学混合物
AU2011298034B2 (en) 2010-08-30 2016-05-26 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides, and methods of using same for increasing nitrogen use efficiency, yield, growth rate, vigor, biomass, oil content, and/or abiotic stress tolerance
US20130180014A1 (en) 2010-09-13 2013-07-11 Basf Se Pyridine Compounds for Controlling Invertebrate Pests III
EP2616459B1 (en) 2010-09-13 2016-05-04 Basf Se Pyridine compounds for controlling invertebrate pests i
CN103097376A (zh) 2010-09-13 2013-05-08 巴斯夫欧洲公司 用于防治无脊椎动物害虫的吡啶化合物ii
MX355432B (es) 2010-09-14 2018-04-18 Basf Se Composiciones que contienen un insecticida de piripiropeno y una base.
AU2011303970B2 (en) 2010-09-14 2015-08-13 Basf Se Composition containing a pyripyropene insecticide and an adjuvant
WO2012043372A1 (ja) 2010-09-29 2012-04-05 東海ゴム工業株式会社 水系ホース用ゴム組成物およびそれを用いて得られる水系ホース
AR083112A1 (es) 2010-10-01 2013-01-30 Syngenta Participations Ag Metodo para controlar enfermedades fitopatogenas y composiciones fungicidas utiles para dicho control
US8653000B2 (en) 2010-10-01 2014-02-18 Basf Se Imine substituted 2,4-diaryl-pyrroline derivatives as pesticides
EP2621897A1 (en) 2010-10-01 2013-08-07 Basf Se Imine compounds
EP2621924B1 (en) 2010-10-01 2015-03-04 Basf Se Herbicidal benzoxazinones
GB201016761D0 (en) 2010-10-05 2010-11-17 Syngenta Ltd Herbicidal compounds
US9234216B2 (en) 2010-10-06 2016-01-12 Bp Corporation North America Inc. Variant CBH I polypeptides
BR112013008319A2 (pt) 2010-10-07 2016-06-14 Basf Se uso de uma estrobilurina (composto a) e método para aumentar a resistência do glúten em cereais de inverno
EP2443923A1 (de) 2010-10-25 2012-04-25 Basf Se Zusammensetzung umfassend ein Pestizid und ein Polycarboxylatether
JP2013540765A (ja) 2010-10-11 2013-11-07 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 殺有害生物剤及びポリカルボキシレートエーテルを含む組成物
WO2012056003A1 (en) 2010-10-28 2012-05-03 Syngenta Participations Ag Novel microbicides
EP2447261A1 (en) 2010-10-29 2012-05-02 Basf Se Pyrrole, furane and thiophene derivatives and their use as fungicides
EP2447262A1 (en) 2010-10-29 2012-05-02 Basf Se Pyrrole, furane and thiophene derivatives and their use as fungicides
BR112013010782A2 (pt) 2010-11-02 2016-07-12 Syngenta Participations Ag combinações pesticidas
AR083708A1 (es) 2010-11-03 2013-03-13 Yissum Res Dev Co Plantas transgenicas con rendimientos de sacarificacion altos y metodos para generarlas
EP2460404A1 (en) 2010-12-01 2012-06-06 Basf Se Compositions containing identical polyamine salts of mixed anionic pesticides
WO2012062531A1 (en) 2010-11-12 2012-05-18 Syngenta Limited Herbicidal compounds
WO2012066122A1 (en) 2010-11-18 2012-05-24 Syngenta Participations Ag 2 - (pyridin- 2 -yl) -quinazoline derivatives and their use as microbicides
US20130269064A1 (en) 2010-11-23 2013-10-10 Syngenta Participations Ag Insecticidal compounds
WO2012069601A1 (en) 2010-11-25 2012-05-31 Syngenta Participations Ag Substituted quinazolines as fungicides
CN103237451A (zh) 2010-12-08 2013-08-07 巴斯夫欧洲公司 杀真菌混合物
EP2462807A1 (en) 2010-12-08 2012-06-13 Basf Se Pesticidal mixtures comprising pyraclostrobin
WO2012077061A1 (en) 2010-12-08 2012-06-14 Basf Se Pesticidal mixtures
AR083029A1 (es) 2010-12-09 2013-01-23 Syngenta Participations Ag Metodos y composiciones que utilizan arn interferente pequeño (arnip) para el control de nematodos en plantas
US20130253012A1 (en) 2010-12-10 2013-09-26 Basf Se Pyrazole Compounds for Controlling Invertebrate Pests
JP5918256B2 (ja) 2010-12-14 2016-05-18 シンジェンタ パーティシペーションズ アクチェンゲゼルシャフト ストリゴラクタム誘導体および植物成長調節剤としてのこれらの使用
BR112013014782A2 (pt) 2010-12-15 2016-07-19 Basf Se composição, método para o controle de vegetação indesejada, uso de composições, método para proteger a atividade fitotóxica de uma benzoxazinona de fórmula i e método de proteção
EP2465350A1 (en) 2010-12-15 2012-06-20 Basf Se Pesticidal mixtures
EP2651220A1 (en) 2010-12-15 2013-10-23 Syngenta Participations AG Pesticidal mixtures
WO2012080419A1 (en) 2010-12-15 2012-06-21 Syngenta Participations Ag Pesticidal mixtures
CN103261188A (zh) 2010-12-17 2013-08-21 先正达参股股份有限公司 杀虫化合物
BR112013014913A2 (pt) 2010-12-20 2016-07-19 Basf Se misturas pesticidas, composição pesticida ou parasiticida, método para proteger os vegetais do ataque ou da infestação por insetos, para o controle dos insetos, para o controle dos fungos fitopatogênicos prejudiciais, para a proteção dos vegetais dos fungos fitopatogênicos prejudiciais, para a proteção do material de propagação dos vegetais, para a proteção dos animais contra a infestação ou infecção por parasitas, para o tratamento dos aminais infectados ou infectados por parasitas e utilização
BR112013015830B8 (pt) 2010-12-22 2022-07-19 Evogene Ltd Método de aumento de produção, biomassa, taxa de crescimento, vigor, tolerância ao estresse abiótico, e/ou eficiência no uso de nitrogênio de uma planta, e, construção de ácido nucleico
WO2012085081A1 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Basf Se Sulfoximinamide compounds for combating invertebrate pests ii
CN103298346A (zh) 2010-12-22 2013-09-11 巴斯夫欧洲公司 用于增加植物健康的农用化学品混合物
AU2011347687A1 (en) 2010-12-23 2013-07-11 Basf Se Substituted pyridines having herbicidal activity
BR112013016460A2 (pt) 2010-12-27 2020-11-10 Sumitomo Chemical Company, Limited compostos amidínicos e seu uso para o controle de doenças de plantas
JP5842594B2 (ja) 2010-12-27 2016-01-13 住友化学株式会社 ピリダジノン化合物、それを含有する除草剤及び有害節足動物防除剤
EP2474226A1 (en) 2011-01-07 2012-07-11 Basf Se Herbicidally active composition comprising cyanobutyrates
EP2476313A1 (en) 2011-01-14 2012-07-18 Basf Se Synergistic pesticidal compositions comprising a dithiocarbamate and an insecticide
PT3272861T (pt) 2011-01-20 2020-03-26 Protalix Ltd Construção de ácido nucleico para expressão de alfα-galactosidase em plantas e células de plantas
EP2481284A3 (en) 2011-01-27 2012-10-17 Basf Se Pesticidal mixtures
EP2484210A1 (en) 2011-02-08 2012-08-08 Basf Se Pesticidal compositions
UY33895A (es) 2011-02-09 2012-09-28 Syngenta Participations Ag Compuestos insecticidas, método para combatir y controlar insectos, ácaros, nematodos o moluscos, y composición insecticida, acaricida o nematicida
PL2672826T3 (pl) 2011-02-11 2015-10-30 Basf Se Kompozycje chwastobójcze zawierające topramezon, pinoksaden i klokwintocet
EP2675273A1 (en) 2011-02-16 2013-12-25 Basf Se Method for controlling phytopathogenic fungi
EA022869B1 (ru) 2011-02-28 2016-03-31 Басф Се Композиция, содержащая пестицид, сурфактант и алкоксилат 2-пропилгептиламина
JP2011137030A (ja) 2011-03-01 2011-07-14 Sumitomo Chemical Co Ltd 有害生物防除組成物及び有害生物の防除方法。
BR112013022331B1 (pt) 2011-03-02 2021-01-26 Futuragene Israel Ltd. vetor de expressão de ácido nucleico, e, método para gerar uma planta que compreende resistência intensificada a um patógeno bacteriano
KR20140021581A (ko) 2011-03-07 2014-02-20 스미또모 가가꾸 가부시끼가이샤 논벼 경작에서의 잡초들의 제어 방법
GB201104199D0 (en) 2011-03-11 2011-04-27 Syngenta Participations Ag Plant growth regulator compounds
US20140005235A1 (en) 2011-03-22 2014-01-02 Syngenta Participations Ag Insecticidal compounds
PL2688405T3 (pl) 2011-03-23 2018-05-30 Basf Se Kompozycje zawierające polimerowe, jonowe związki zawierające grupy imidazoliowe
TWI620816B (zh) 2011-03-23 2018-04-11 苜蓿股份有限公司 植物衍生蛋白回收方法
WO2012130823A1 (en) 2011-03-30 2012-10-04 Basf Se Suspension concentrates
EP2694502A1 (en) 2011-04-06 2014-02-12 Basf Se Substituted pyrimidinium compounds for combating animal pests
AR085872A1 (es) 2011-04-08 2013-10-30 Basf Se Derivados heterobiciclicos n-sustituidos utiles para combatir parasitos en plantas y/o animales, composiciones que los contienen y metodos para combatir dichas plagas
GB201106062D0 (en) 2011-04-08 2011-05-25 Syngenta Ltd Herbicidal compounds
UY34014A (es) 2011-04-15 2012-11-30 Dow Agrosciences Llc Genes sintéticos para expresar proteínas en células de maíz, construcciones, plantas transgénicas, métodos para controlar pestes y composiciones
BR112013026394B1 (pt) 2011-04-15 2019-12-24 Syngenta Participations Ag método de proteção de um material de propagação de plantas, uma planta, uma parte de uma planta e/ou um órgão da planta contra danos causados por pragas
WO2012143395A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 Syngenta Participations Ag 4,5-dihydro-isoxazole derivatives as fungicides
CN103491775A (zh) 2011-04-21 2014-01-01 巴斯夫欧洲公司 3,4-二取代的吡咯-2,5-二酮及其作为杀真菌剂的用途
AU2012249818B2 (en) 2011-04-26 2014-11-20 Syngenta Participations Ag Enhanced transformation of recalcitrant monocots
US9198412B2 (en) 2011-05-02 2015-12-01 Basf Se Method for enhancing the performance of a pesticide with guanidines
US10760088B2 (en) 2011-05-03 2020-09-01 Evogene Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides and methods of using same for increasing plant yield, biomass, growth rate, vigor, oil content, abiotic stress tolerance of plants and nitrogen use efficiency
WO2012152527A2 (en) 2011-05-06 2012-11-15 Syngenta Participations Ag Herbicidal composition comprising pinoxaden and fluroxypyr, and methods of use thereof
EP2524596A1 (en) 2011-05-18 2012-11-21 Basf Se Seed treatment uses
MX2013013211A (es) 2011-05-18 2014-02-20 Syngenta Participations Ag Compuestos insecticidas a base de derivados de ariltioacetamida.
WO2012159891A1 (en) 2011-05-20 2012-11-29 Syngenta Participations Ag Endosperm-specific plant promoters and uses therefor
JP2014159374A (ja) 2011-05-20 2014-09-04 Nippon Nohyaku Co Ltd 作物の枯凋落葉剤組成物
UA114402C2 (uk) 2011-05-26 2017-06-12 Сінгента Партісіпейшнс Аг Композиція для біоконтролю у вигляді гранул, що диспергуються у воді
UY34104A (es) 2011-05-31 2013-01-03 Syngenta Participations Ag ?compuestos derivados benzamídicos heterocíclicos, procesos e intermedios para su preparación, composiciones y métodos para su uso?.
WO2012163824A1 (en) 2011-06-01 2012-12-06 Basf Se Method of preparing an aqueous tank mix comprising a base
GB201109309D0 (en) 2011-06-02 2011-07-20 Syngenta Ltd Herbicidal compositions
WO2012168210A1 (en) 2011-06-06 2012-12-13 Basf Se Seed treatment formulation aid containing polymeric sticker and silicon oil
WO2012168241A1 (en) 2011-06-09 2012-12-13 Basf Se Substituted pyrazines having herbicidal activity
BR112013030822A2 (pt) 2011-06-09 2016-08-16 Basf Se composto de piridina substituída da fórmula i, composição e método para controlar a vegetação indesejada
EP2532661A1 (en) 2011-06-10 2012-12-12 Syngenta Participations AG Novel insecticides
KR20140040224A (ko) 2011-06-17 2014-04-02 바스프 에스이 살진균제로서의 테트라시아노디티인의 용도
EP2720541A1 (en) 2011-06-17 2014-04-23 Basf Se Compositions comprising fungicidal substituted dithiines and further actives
WO2012175474A1 (en) 2011-06-20 2012-12-27 Syngenta Participations Ag 1,2,3 triazole pesticides
AR087008A1 (es) 2011-06-22 2014-02-05 Syngenta Participations Ag Derivados de n-oxi-pirazolo-triazepina-diona
WO2012175899A1 (en) 2011-06-23 2012-12-27 Syngenta Limited Herbicidal composition comprising a pyrandione herbicide and a sulfonyl urea herbicide
EP2727466A4 (en) 2011-06-29 2015-01-21 Nihon Nohyaku Co Ltd INSECTICIDAL COMPOSITION FOR AGRICULTURE AND HORTICULTURE AND METHOD OF USE
EP2540718A1 (en) 2011-06-29 2013-01-02 Syngenta Participations AG. Novel insecticides
WO2013005211A2 (en) 2011-07-05 2013-01-10 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Boron complexing plant materials and uses thereof cross-reference to related applications
WO2013006861A1 (en) 2011-07-07 2013-01-10 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Sorghum grain shattering gene and uses thereof in altering seed dispersal
WO2013007550A1 (en) 2011-07-08 2013-01-17 Syngenta Participations Ag Fungicide mixtures
DK2731935T3 (en) 2011-07-13 2016-06-06 Basf Agro Bv FUNGICIDE SUBSTITUTED 2- [2-HALOGENALKYL-4- (PHENOXY) -PHENYL] -1- [1,2,4] TRIAZOL-1-YLETHANOL COMPOUNDS
WO2013010894A1 (en) 2011-07-15 2013-01-24 Basf Se Fungicidal phenylalkyl-substituted 2-[2-chloro-4-(4-chloro-phenoxy)-phenyl]-1-[1,2,4]triazol-1-yl-ethanol compounds
CA2840284A1 (en) 2011-07-15 2013-01-24 Basf Se Fungicidal alkyl-substituted 2-[2-chloro-4-(4-chloro-phenoxy)-phenyl]-1-[1,2,4]triazol-1-yl-ethanol compounds
MX2014000514A (es) 2011-07-15 2014-02-19 Basf Se Metodos plaguicidas que utilizan compuestos de 3 - piridil tiazol sustituido y derivados para combatir las plagas de animales i.
JP2014520831A (ja) 2011-07-15 2014-08-25 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 殺菌性アルキル−およびアリール−置換２−［２−クロロ−４−（ジハロ−フェノキシ）−フェニル］−１−［１，２，４］トリアゾール−１−イル−エタノール化合物
WO2013011010A1 (en) 2011-07-19 2013-01-24 Syngenta Participations Ag Fungizide mixtures
BR122020017359B1 (pt) 2011-07-28 2021-10-13 Syngenta Participations Ag Método para controle de uma praga de nemátodos
KR20140053264A (ko) 2011-08-02 2014-05-07 바스프 에스이 방제물질 및 하이드로젠카르보네이트의 알칼리 염으로부터 선택되는 염기를 포함하는 수성 조성물
WO2013022743A1 (en) * 2011-08-05 2013-02-14 Dow Agrosciences Llc Use of dig3 insecticidal crystal protein in combination with cry1ab
US10119149B2 (en) 2011-08-05 2018-11-06 Dow Agrosciences Llc Use of DIG3 insecticidal crystal protein in combination with cry1Ab for management of resistance in european cornborer
AR088786A1 (es) 2011-08-12 2014-07-10 Basf Se Compuestos de antranilamida y sus usos como plaguicidas
EA201400213A1 (ru) 2011-08-12 2014-08-29 Басф Се Соединения анилинового типа
JP2014522872A (ja) 2011-08-12 2014-09-08 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア Ｎ−チオ−アントラニルアミド化合物、及び殺有害生物剤としてのそれらの使用
CA2843083A1 (en) 2011-08-12 2013-02-21 Basf Se Anthranilamide compounds and their use as pesticides
AR087516A1 (es) 2011-08-12 2014-03-26 Basf Se Compuestos de n-tio-antranilamida y sus usos como plaguicidas
EP2742027A1 (en) 2011-08-12 2014-06-18 Basf Se N-thio-anthranilamide compounds and their use as pesticides
BR112014003186A2 (pt) 2011-08-12 2017-04-04 Basf Se composto da fórmula geral (i), combinação pesticida, composição agrícola ou veterinária, método para combater ou controlar pragas invertebradas, método para a proteção de plantas e sementes, semente, uso de um composto e método para tratar um animal
US20140187423A1 (en) 2011-08-15 2014-07-03 Basf Se Fungicidal substituted 1--1H-[1,2,4]triazole compounds
BR112014003413A2 (pt) 2011-08-15 2017-03-14 Basf Se compostos de fórmula i, processo para a preparação dos compostos de fórmula i, compostos de fórmula xii, compostos de fórmula viii e xi, composições agroquímicas, utilizações dos compostos de fórmula i ou viii e semente revestida
AR087949A1 (es) 2011-08-15 2014-04-30 Basf Se Compuestos fungicidas de 1-{2-[halo-4-(4-halogeno-fenoxi)-fenil]-2-alcoxi-3-metil-butil}-1h-[1,2,4]triazol sustituidos, un metodo para su preparacion y su empleo en composiciones agroquimicas para combatir hongos fitopatogenicos
EP2559688A1 (en) 2011-08-15 2013-02-20 Basf Se Fungicidal substituted 1-{2-[2-halo-4-(4-halogen-phenoxy)-phenyl]-2-butoxy-ethyl}-1h [1,2,4]triazole compounds
CN103717578B (zh) 2011-08-15 2016-12-21 巴斯夫欧洲公司 杀真菌的取代的1‑{2‑[2‑卤代‑4‑(4‑卤代苯氧基)苯基]‑2‑乙氧基乙基}‑1h‑[1,2,4]三唑化合物
BR112014003412A2 (pt) 2011-08-15 2017-03-14 Basf Se compostos de fórmula i, processo, compostos de fórmula xii, viii e xi, composições agroquímicas, utilização e semente revestida
KR20140054235A (ko) 2011-08-15 2014-05-08 바스프 에스이 살진균 치환된 1-｛2-［2-할로-4-(4-할로겐-페녹시)-페닐］-2-알콕시-2-시클릴-에틸｝-1h-［1,2,4］트리아졸 화합물
EP2744790B1 (en) 2011-08-15 2016-04-27 Basf Se Fungicidal substituted 1-{2-[2-halo-4-(4-halogen-phenoxy)-phenyl]-2-alkoxy-2-alkynyl/alkenyl-ethyl}-1h-[1,2,4]triazole compounds
JP2014524432A (ja) 2011-08-18 2014-09-22 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 有害無脊椎動物を駆除するためのカルバモイルメトキシベンズアミドおよびカルバモイルメチルチオベンズアミドおよびカルバモイルメチルアミノベンズアミド
EP2744785A1 (en) 2011-08-18 2014-06-25 Basf Se Carbamoylmethoxy- and carbamoylmethylthio- and carbamoylmethylamino benzamides for combating invertebrate pests
EP2744784A1 (en) 2011-08-18 2014-06-25 Basf Se Carbamoylmethoxy- and carbamoylmethylthio- and carbamoylmethylamino benzamides for combating invertebrate pests
CN103732567A (zh) 2011-08-22 2014-04-16 先正达参股股份有限公司 作为杀虫化合物的二氢呋喃衍生物
US20140343049A1 (en) 2011-08-22 2014-11-20 Syngenta Participations Ag Dihydrofuran derivatives as insecticidal compounds
WO2013026900A1 (en) 2011-08-23 2013-02-28 Syngenta Participations Ag Pyridine derivatives as microbiocides
WO2013026695A1 (en) 2011-08-25 2013-02-28 Syngenta Participations Ag Isoxazoline derivatives as insecticidal compounds
WO2013026929A1 (en) 2011-08-25 2013-02-28 Syngenta Participations Ag Dihydropyrrole derivatives as insecticidal compounds
JP6061934B2 (ja) 2011-08-25 2017-01-18 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー 殺虫化合物としてのイソオキサゾリン誘導体
CN103781356A (zh) 2011-08-25 2014-05-07 先正达参股股份有限公司 作为杀虫化合物的异噁唑啉衍生物
HUE025377T2 (hu) 2011-08-25 2016-02-29 Basf Se Klór-acetamidokat tartalmazó herbicid kompozíciók
EP2750503A1 (en) 2011-09-02 2014-07-09 Basf Se Insecticidal active mixtures comprising arylquinazolinone compounds
US20140213445A1 (en) 2011-09-02 2014-07-31 Basf Se Use of Pesticidal Active 3-Arylquinazolin-4-One Derivatives in Soil Application Methods
US20140200136A1 (en) 2011-09-02 2014-07-17 Basf Se Agricultural mixtures comprising arylquinazolinone compounds
GB201115564D0 (en) 2011-09-08 2011-10-26 Syngenta Ltd Herbicidal composition
CA2845513A1 (en) 2011-09-13 2013-03-21 Basf Agrochemical Products B.V. Method of controlling parasitic weeds with mixtures comprising herbicidal acetolactate synthase inhibitors and plant growth regulators
EP3190110B1 (en) 2011-09-13 2020-01-08 Syngenta Participations AG Isothiazoline derivatives as insecticidal compounds
EP2570404A1 (en) 2011-09-16 2013-03-20 Syngenta Participations AG. Plant growth regulating compounds
EP2570406A1 (en) 2011-09-16 2013-03-20 Syngenta Participations AG. Plant growth regulating compounds
WO2013050317A1 (en) 2011-10-03 2013-04-11 Syngenta Limited Polymorphs of an isoxazoline derivative
JP2014534182A (ja) 2011-10-03 2014-12-18 シンジェンタ パーティシペーションズ アクチェンゲゼルシャフト 殺虫化合物としてのイソオキサゾリン誘導体
WO2013050261A1 (en) 2011-10-03 2013-04-11 Syngenta Participations Ag Insecticidal 2-methoxybenzamide derivatives
RU2604496C2 (ru) 2011-10-07 2016-12-10 Зингента Партисипейшнс Аг Способ защиты полезных растений или растительного материала для размножения
AR090394A1 (es) 2011-10-27 2014-11-12 Syngenta Participations Ag Formulacion
US20140182011A1 (en) 2011-11-03 2014-06-26 The University Of Hong Kong Methods Using Acyl-Coenzyme A-Binding Proteins to Enchance Drought Tolerance in Genetically Modified Plants
JP2014532683A (ja) 2011-11-04 2014-12-08 シンジェンタ パーティシペーションズ アクチェンゲゼルシャフト 殺虫化合物
EP2773622A1 (en) 2011-11-04 2014-09-10 Syngenta Participations AG Pesticidal compounds
MX2014005197A (es) 2011-11-04 2014-05-28 Syngenta Participations Ag Compuestos plaguicidas.
ES2553030T3 (es) 2011-11-04 2015-12-03 Syngenta Participations Ag Compuestos plaguicidas
EP3628320B1 (en) 2011-11-11 2022-03-16 Gilead Apollo, LLC Acc inhibitors and uses thereof
MX2014005175A (es) 2011-11-14 2014-05-28 Basf Se Compuestos de 1,2,5-oxadiazol sustituido y su uso como herbicidas.
BR112014011622A2 (pt) 2011-11-16 2017-05-09 Basf Se composto, composição, uso de um composto e método para o controle de vegetação indesejada
WO2013072450A1 (en) 2011-11-18 2013-05-23 Basf Se Substituted 1,2,5-oxadiazole compounds and their use as herbicides iii
EP2785708B1 (en) 2011-11-29 2016-03-23 Syngenta Participations AG Insecticidal triazinone derivatives
TWI572282B (zh) 2011-11-30 2017-03-01 先正達合夥公司 含有螺雜環吡咯啶二酮的殺有害生物混合物
SI2787814T1 (en) 2011-12-05 2018-03-30 Basf Agrochemical Products B.V. METHODS OF CONTROL OF UNAUTHORIZED VEGETATION WITH IMAGE AND ADDITIVES IN HERBICIDIC RESISTANT INDUSTRIAL PLANTS
GB201121314D0 (en) 2011-12-09 2012-01-25 Syngenta Ltd Herbicidal compositions
GB201121317D0 (en) 2011-12-09 2012-01-25 Syngenta Ltd Herbicidal compounds
UA116097C2 (uk) 2011-12-11 2018-02-12 Зе Стейт Оф Ізраел, Міністрі Оф Агрікалче Енд Руерал Девелопмент, Агрікалчерал Рісьоч Організейшн, (А.Р.О.), Волкані Сентре Спосіб модуляції провідності устячка рослини
WO2013087710A2 (en) 2011-12-14 2013-06-20 Syngenta Participations Ag Pesticidal mixtures
WO2013087712A1 (en) 2011-12-14 2013-06-20 Syngenta Participations Ag Pesticidal mixtures
GB201121539D0 (en) 2011-12-14 2012-01-25 Syngenta Participations Ag Plant growth regulating compounds
FR2984076A1 (fr) 2011-12-15 2013-06-21 Inst Rech Developpement Ird Surproduction de jasmonates dans des plantes transgeniques
GB201121803D0 (en) 2011-12-16 2012-02-01 Syngenta Participations Ag Plant growth regulating compounds
US9131688B2 (en) 2011-12-19 2015-09-15 Syngenta Participations Ag Strigolactam derivatives as plant growth regulating compounds
WO2013092244A1 (en) 2011-12-20 2013-06-27 Basf Se Herbicidal triazines
JP2015502966A (ja) 2011-12-21 2015-01-29 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ Ｎ−チオ−アントラニルアミド化合物、及び殺有害生物剤としてのそれらの使用
WO2013092834A1 (en) 2011-12-21 2013-06-27 Syngenta Limited Herbicidal compounds
ES2727479T3 (es) 2011-12-23 2019-10-16 Basf Se Compuestos de isotiazolina para combatir plagas de invertebrados
EP2802212B1 (en) 2012-01-12 2015-12-30 Basf Se Herbicidal isoxazolo[5,4-b]pyridines
EA201692369A1 (ru) 2012-01-17 2017-04-28 Зингента Партисипейшнс Аг Пестицидные смеси, содержащие спирогетероциклические пирролидиндионы
US9686992B2 (en) 2012-01-17 2017-06-27 Syngenta Participations Ag Pesticidal mixtures including spiroheterocyclic pyrrolidine diones
WO2013107794A2 (en) 2012-01-17 2013-07-25 Syngenta Participations Ag Pesticidal mixtures including spiroheterocyclic pyrrolidine diones
BR112014017562B1 (pt) 2012-01-17 2020-11-03 Syngenta Participations Ag. mistura pesticida, método de controle de insetos, ácaros, nematódeos ou moluscos e método de proteção de uma semente contra o ataque de pragas
WO2013114371A1 (en) 2012-02-01 2013-08-08 Protalix Ltd. Dry powder formulations of dnase i
TWI566701B (zh) 2012-02-01 2017-01-21 日本農藥股份有限公司 芳烷氧基嘧啶衍生物及包含該衍生物作為有效成分的農園藝用殺蟲劑及其使用方法
EP2809787B8 (en) 2012-02-02 2018-11-28 Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Técnicas (CONICET) HaHB11 PROVIDES IMPROVED PLANT YIELD AND TOLERANCE TO ABIOTIC STRESS
WO2013113789A1 (en) 2012-02-02 2013-08-08 Basf Se N-thio-anthranilamide compounds and their use as pesticides
WO2013113788A1 (en) 2012-02-03 2013-08-08 Basf Se Fungicidal pyrimidine compounds
US10184131B2 (en) 2012-02-06 2019-01-22 A.B. Seeds Ltd. Isolated polynucleotides expressing or modulating microRNAs or targets of same, transgenic plants comprising same and uses thereof
WO2013120940A2 (en) 2012-02-14 2013-08-22 Syngenta Participations Ag Novel compounds
CA2860626C (en) 2012-02-16 2021-05-18 Syngenta Participations Ag Engineered vip3 pesticidal proteins
CN104245725A (zh) 2012-02-19 2014-12-24 波塔力克斯有限公司 用于治疗高雪氏症的口服单位剂型及其用途
WO2013124250A2 (en) 2012-02-20 2013-08-29 Basf Se Fungicidal substituted thiophenes
BR112014021520A2 (pt) 2012-03-01 2017-07-11 Basf Se uso de uma composição agroquímica e método para controlar vegetação indesejada
WO2013127820A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with fungicidal, herbicidal and plant health improving action in rapeseed
WO2013127768A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Syngenta Participations Ag Pyridine carboxamide pesticides
IN2014DN07226A (hu) 2012-03-01 2015-04-24 Basf Se
WO2013127857A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with fungicidal and plant health improving action in cereals
WO2013127855A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with fungicidal, herbicidal and plant health improving action in cereals
WO2013127859A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with fungicidal, herbicidal and plant health improving action in soybeans
WO2013127861A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with herbicidal action in soybeans
WO2013127862A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with herbicidal action in rapeseed
CA2864263A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with herbicidal action in cereals
WO2013127846A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with fungicidal, herbicidal and plant health improving action in corn
BR112014021199A2 (pt) 2012-03-01 2018-05-08 Basf Se composição, método para preparação da composição, polímero, método para preparação do polímero, método para controlar fungos e semente
WO2013127845A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with fungicidal, herbicidal and plant health improving action in sunflowers
WO2013127821A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with fungicidal and plant health improving action in rapeseed
WO2013127780A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Syngenta Participations Ag Chemical compounds
WO2013127843A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with fungicidal, herbicidal and plant health improving action in sunflowers
WO2013127818A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with fungicidal and plant health improving action in soybeans
WO2013127848A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with fungicidal and plant health improving action in corn
US11692016B2 (en) 2012-03-09 2023-07-04 Vestaron Corporation High gene expression yeast strain
KR102384047B1 (ko) 2012-03-09 2022-04-08 베스타론 코포레이션 독성 펩타이드 제조, 식물에서의 펩타이드 발현 및 시스테인 농후 펩타이드의 조합
US9596843B2 (en) 2012-03-12 2017-03-21 Basf Se Liquid concentrate formulation containing a pyripyropene insecticide I
WO2013135674A1 (en) 2012-03-12 2013-09-19 Syngenta Participations Ag Insecticidal 2-aryl-acetamide compounds
CN104185421B (zh) 2012-03-12 2016-06-01 巴斯夫欧洲公司 含有啶南平杀虫剂的液体浓缩物配制剂ii
EP2825043B1 (en) 2012-03-12 2018-09-05 Basf Se Method for producing an aqueous suspension concentrate formulation of a pyripyropene insecticide
CA2865043A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 Basf Se Fungicidal pyrimidine compounds
JP6088552B2 (ja) 2012-03-13 2017-03-01 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ ピリピロペン殺虫剤ｉｉｉ含有液体濃厚製剤
HUP1400495A2 (en) 2012-03-13 2015-03-02 Univ Guelph Guelph Ontario Methods of increasing tolerance to heat stress and amino acid content of plants
WO2013135672A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 Basf Se Fungicidal pyrimidine compounds
WO2013139760A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Syngenta Limited Herbicidal compounds
UY34687A (es) 2012-03-21 2013-09-30 Basf Se Adyuvantes de mezcla en tanque de glifosato que comprenden una base seleccionada de un carbonato y/o un fosfato
AR090385A1 (es) 2012-03-21 2014-11-05 Basf Se Adyuvante de mezcla en tanque liquido o particulado que comprende una base seleccionada de una mezcla de carbonato e hidrogenocarbonato
JP2015510912A (ja) 2012-03-21 2015-04-13 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ 炭酸塩及び／又はリン酸塩から選択される塩基を含む固体粒子状タンクミックス用アジュバント
EP2827708A1 (en) 2012-03-21 2015-01-28 Basf Se Tank mix adjuvant comprising an alkyl polyglucoside and a base
EP2644595A1 (en) 2012-03-26 2013-10-02 Syngenta Participations AG. N-Cyclylamides as nematicides
WO2013144224A1 (en) 2012-03-27 2013-10-03 Syngenta Participations Ag Acetylenic microbiocides
EP2830420A1 (en) 2012-03-29 2015-02-04 Basf Se Co-crystals of dicamba and a co-crystal former b
GB201205654D0 (en) 2012-03-29 2012-05-16 Syngenta Ltd Herbicidal compounds
GB201205657D0 (en) 2012-03-29 2012-05-16 Syngenta Ltd Herbicidal compounds
WO2013144228A1 (en) 2012-03-29 2013-10-03 Basf Se Pesticidal methods using heterocyclic compounds and derivatives for combating animal pests
WO2013144223A1 (en) 2012-03-30 2013-10-03 Basf Se N-substituted pyrimidinylidene compounds and derivatives for combating animal pests
CN104202981B (zh) 2012-03-30 2018-01-30 巴斯夫欧洲公司 防治动物害虫的n‑取代的吡啶亚基化合物和衍生物
WO2013149940A1 (en) 2012-04-02 2013-10-10 Basf Se Acrylamide compounds for combating invertebrate pests
EP2647626A1 (en) 2012-04-03 2013-10-09 Syngenta Participations AG. 1-Aza-spiro[4.5]dec-3-ene and 1,8-diaza-spiro[4.5]dec-3-ene derivatives as pesticides
WO2013149903A1 (en) 2012-04-03 2013-10-10 Basf Se N- substituted hetero - bicyclic furanone derivatives for combating animal
WO2013149999A1 (en) 2012-04-05 2013-10-10 Basf Se Soluble liquid formulations of quinclorac ammonium salts
WO2013150115A1 (en) 2012-04-05 2013-10-10 Basf Se N- substituted hetero - bicyclic compounds and derivatives for combating animal pests
EP2649879A1 (en) 2012-04-10 2013-10-16 Basf Se Pesticidal mixtures containing fluxapyroxad
WO2013156331A1 (en) 2012-04-16 2013-10-24 Basf Se Synergistic compositions comprising pyraclostrobin and an insecticidal compound
WO2013156431A1 (en) 2012-04-17 2013-10-24 Syngenta Participations Ag Pesticidally active pyridyl- and pyrimidyl- substituted thiazole and thiadiazole derivatives
WO2013156433A1 (en) 2012-04-17 2013-10-24 Syngenta Participations Ag Insecticidally active thiazole derivatives
BR112014026823A2 (pt) 2012-04-27 2017-06-27 Basf Se compostos de n-(tetrazol-5-il) e n-(triazol-5-il)arilcarboxamida substituída e seu uso como herbicidas.
IN2014MN02211A (hu) 2012-04-27 2015-07-10 Basf Se
ES2694200T3 (es) 2012-04-27 2018-12-19 Basf Se Compuestos de N-(tetrazol-5-il) y N-(triazol-5-il)arilcarboxamida sustituidos y su uso como herbicidas
CN104411698A (zh) 2012-04-27 2015-03-11 巴斯夫欧洲公司 取代的n-(四唑-5-基)-和n-(三唑-5-基)杂芳基羧酰胺化合物及其作为除草剂的用途
EP2659777A1 (en) 2012-05-04 2013-11-06 Syngenta Participations AG. New use of a pesticide
MX2014013430A (es) 2012-05-04 2015-04-14 Basf Se Compuestos que contienen pirazol sustituido y su uso como plaguicidas.
BR112014027133A2 (pt) 2012-05-09 2017-06-27 Basf Se compostos, composição agrícola ou veterinária, método para o controle das pragas de invertebrados, material de propagação dos vegetais e método para o tratamento ou proteção de um animal.
MX2014014341A (es) 2012-05-24 2015-07-06 Basf Se Compuestos de n-tio-antranilamida y sus usos como plaguicidas.
EP2854834A4 (en) 2012-05-30 2016-05-18 Biostrategies LC PLANT LECTINES AS AN EXCIPIENT OF RELATED MEDICINAL SUBSTANCES IN ANIMAL AND HUMAN CELLS
CN104379588A (zh) 2012-06-01 2015-02-25 巴斯夫欧洲公司 具有除草活性的取代吡啶化合物
WO2013184768A1 (en) 2012-06-05 2013-12-12 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods of gene silencing in plants
EP2858981A1 (en) 2012-06-06 2015-04-15 Basf Se Pyrazolopyrans having herbicidal and pharmaceutical properties
EP2671881A1 (en) 2012-06-07 2013-12-11 Syngenta Participations AG. Pesticidally active pyridyl- and pyrimidyl- substituted thiazole derivatives
GB201210395D0 (en) 2012-06-11 2012-07-25 Syngenta Participations Ag Crop enhancement compositions
GB201210397D0 (en) 2012-06-11 2012-07-25 Syngenta Participations Ag Crop enhancement compositions
MX2014015265A (es) 2012-06-14 2015-08-12 Basf Se Metodos plaguicidas que utilizan compuestos de 3-piridiltiazol sustituido y derivados para combatir plagas de animales.
CN104703982B (zh) 2012-06-20 2018-01-05 巴斯夫欧洲公司 吡唑化合物和包含吡唑化合物的农药混合物
CA2873835C (en) 2012-06-21 2020-12-15 Basf Se Adjuvant comprising a 2-propylheptylamine alkoxylate, sugar-based surfactant, and drift-control agent and/or humectant
WO2013189773A1 (en) 2012-06-21 2013-12-27 Basf Se An aqueous composition comprising dicamba and a drift control agent
MX349486B (es) 2012-06-22 2017-08-01 Syngenta Participations Ag Control biologico de plagas de coleopteros.
WO2014001121A1 (en) 2012-06-25 2014-01-03 Syngenta Participations Ag Isothiazole derivatives as insecticidal compounds
WO2014001120A1 (en) 2012-06-25 2014-01-03 Syngenta Participations Ag Isothiazole derivatives as insecticidal compounds
US20150157012A1 (en) 2012-07-03 2015-06-11 Basf Se Highly Concentrated Aqueous Formulation Comprising an Anionic Pesticide and a Base
EP2684879A1 (en) 2012-07-09 2014-01-15 Basf Se Substituted mesoionic compounds for combating animal pests
CA2875755A1 (en) 2012-07-09 2014-01-16 Basf Se Drift control agent comprising polypropylene glycol and a triblock polymer
WO2014009293A1 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Basf Se New substituted thiadiazoles and their use as fungicides
BR112015000648A2 (pt) 2012-07-13 2017-10-03 Basf Se Uso de um composto, composições agrícolas para o controle de fungos fitopatogênicos, semente e método para controle de fungos fitopatogênicos
DK2880155T3 (da) 2012-07-29 2019-07-15 Yeda Res & Dev Anvendelse af den reduktive glycinvej til generering af formatotrofiske og autotrofiske mikroorganismer
CN104520287A (zh) 2012-08-03 2015-04-15 先正达参股股份有限公司 控制昆虫的方法
WO2014023531A1 (en) 2012-08-07 2014-02-13 Syngenta Participations Ag Trifluoromethylpyridine carboxamides as pesticides
WO2014028426A1 (en) 2012-08-13 2014-02-20 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for increasing pest resistance in plants
EP2700634A1 (en) 2012-08-20 2014-02-26 Basf Se 5-difluoromethylpyrazole amides having herbicidal activity
EP2700635A1 (en) 2012-08-20 2014-02-26 Basf Se 5-Trifluoromethylpyrazole amides having herbicidal activity
ES2736314T3 (es) 2012-08-24 2019-12-27 Syngenta Participations Ag Métodos para controlar gusanos elatéridos
EP2887809B1 (en) 2012-08-24 2018-11-21 Syngenta Participations AG Methods of controlling insects
WO2014029709A1 (en) 2012-08-24 2014-02-27 Syngenta Participations Ag Methods of controlling insects
WO2014033242A1 (en) 2012-08-31 2014-03-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with herbicidal action in rice
WO2014033241A1 (en) 2012-08-31 2014-03-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with fungicidal and plant health improving action in rice
AR092868A1 (es) 2012-09-03 2015-05-06 A B Seeds Ltd Metodo para mejorar la tolerancia al estres abiotico de plantas y plantas generadas mediante dicho metodo
US9816102B2 (en) 2012-09-13 2017-11-14 Indiana University Research And Technology Corporation Compositions and systems for conferring disease resistance in plants and methods of use thereof
MX369284B (es) 2012-09-14 2019-11-04 Bayer Cropscience Lp Variantes de hppd y metodos de uso.
US20150230470A1 (en) 2012-09-21 2015-08-20 Basf Se Pyrethroid Insecticide For Protecting Plants And Seed
CA2885115A1 (en) 2012-10-01 2014-04-10 Basf Se Pesticidal mixtures comprising jasmonic acid or a derivative thereof
WO2014053403A1 (en) 2012-10-01 2014-04-10 Basf Se Method of controlling insecticide resistant insects
US20150237858A1 (en) 2012-10-01 2015-08-27 Basf Se Method of controlling ryanodine-modulator insecticide resistant insects
WO2014053395A1 (en) 2012-10-01 2014-04-10 Basf Se Use of n-thio-anthranilamide compounds on cultivated plants
WO2014053407A1 (en) 2012-10-01 2014-04-10 Basf Se N-thio-anthranilamide compounds and their use as pesticides
WO2014053401A2 (en) 2012-10-01 2014-04-10 Basf Se Method of improving plant health
CN104968201A (zh) 2012-10-01 2015-10-07 巴斯夫欧洲公司 包含邻氨基苯甲酰胺类化合物的农药活性混合物
EP2903442A1 (en) 2012-10-01 2015-08-12 Basf Se Pesticidally active mixtures comprising anthranilamide compounds
EP2906043A1 (en) 2012-10-10 2015-08-19 Syngenta Participations AG Pesticidal mixtures
US20150257383A1 (en) 2012-10-12 2015-09-17 Basf Se Method for combating phytopathogenic harmful microbes on cultivated plants or plant propagation material
WO2014067838A1 (en) 2012-10-31 2014-05-08 Syngenta Participations Ag Insecticidal compounds
WO2014079935A1 (en) 2012-11-21 2014-05-30 Syngenta Participations Ag Insecticidal compounds based on arylthioacetamide derivatives
AU2013349839B2 (en) 2012-11-22 2017-03-30 Basf Corporation Pesticidal mixtures
WO2014079820A1 (en) 2012-11-22 2014-05-30 Basf Se Use of anthranilamide compounds for reducing insect-vectored viral infections
BR112015011775A2 (pt) 2012-11-22 2017-07-11 Basf Corp misturas sinérgicas, kit para a preparação de uma composição pesticida útil, composição pesticida, método para a proteção de material e material de propagação de plantas.
WO2014079841A1 (en) 2012-11-22 2014-05-30 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2014079766A1 (en) 2012-11-22 2014-05-30 Basf Se Pesticidal mixtures
CA2890162C (en) 2012-11-22 2023-03-21 Basf Corporation A pesticidal composition comprising bacillus pumilus
WO2014079774A1 (en) 2012-11-22 2014-05-30 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2014079804A1 (en) 2012-11-22 2014-05-30 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2014079772A1 (en) 2012-11-22 2014-05-30 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2014079770A1 (en) 2012-11-22 2014-05-30 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2014079728A1 (en) 2012-11-22 2014-05-30 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2014079752A1 (en) 2012-11-23 2014-05-30 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2014079813A1 (en) 2012-11-23 2014-05-30 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2014082871A1 (en) 2012-11-27 2014-06-05 Basf Se Substituted 2-[phenoxy-phenyl]-1-[1,2,4]triazol-1-yl-ethanol compounds and their use as fungicides
WO2014082879A1 (en) 2012-11-27 2014-06-05 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole compounds
US20160029630A1 (en) 2012-11-27 2016-02-04 Basf Se Substituted 2-[phenoxy-phenyl]-1-[1,2,4]triazol-1-yl-ethanol compounds and their use as fungicides
CN104955813A (zh) 2012-11-27 2015-09-30 巴斯夫欧洲公司 取代的[1,2,4]三唑化合物
EP2738171A1 (en) 2012-11-30 2014-06-04 Syngenta Participations AG. Pesticidally active tricyclic pyridyl derivatives
MX2015007116A (es) 2012-12-04 2015-11-30 Basf Se Nuevos derivados de 1,4-ditiina sustituida y su uso como fungicidas.
CA2894023A1 (en) 2012-12-14 2014-06-19 Basf Se Malononitrile compounds for controlling animal pests
EP2746278A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
EP2746279A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se Fungicidal imidazolyl and triazolyl compounds
WO2014095534A1 (en) 2012-12-19 2014-06-26 Basf Se New substituted triazoles and imidazoles and their use as fungicides
EP2746276A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se New substituted triazoles and imidazoles and their use as fungicides
EP2746262A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds for combating phytopathogenic fungi
EP2746264A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
EP2746266A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se New substituted triazoles and imidazoles and their use as fungicides
EP2746256A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se Fungicidal imidazolyl and triazolyl compounds
CN105164111B (zh) 2012-12-19 2018-11-20 巴斯夫欧洲公司 取代[1,2,4]三唑及其作为杀真菌剂的用途
EP2745691A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se Substituted imidazole compounds and their use as fungicides
BR112015014303A2 (pt) 2012-12-19 2017-07-11 Basf Se compostos de fórmula i, processo para a preparação dos compostos de fórmula i, composições agroquímicas, utilização de um composto de fórmula i, método para o combate dos fungos, semente e compostos intermediários xx3
EP2746275A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se New substituted triazoles and imidazoles and their use as fungicides
EP2746255A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
WO2014095381A1 (en) 2012-12-19 2014-06-26 Basf Se Fungicidal imidazolyl and triazolyl compounds
EP2746277A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se Fungicidal imidazolyl and triazolyl compounds
US20150329501A1 (en) 2012-12-19 2015-11-19 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole compounds and their use as fungicides
WO2014095555A1 (en) 2012-12-19 2014-06-26 Basf Se New substituted triazoles and imidazoles and their use as fungicides
EP2746263A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se Alpha-substituted triazoles and imidazoles
EP2746274A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole compounds
EP3498098A1 (en) 2012-12-20 2019-06-19 BASF Agro B.V. Compositions comprising a triazole compound
EP2746260A1 (en) 2012-12-21 2014-06-25 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
KR20150100808A (ko) 2012-12-21 2015-09-02 바스프 에스이 무척추동물 해충의 방제를 위한 시클로클라빈 및 이의 유도체
EP2746259A1 (en) 2012-12-21 2014-06-25 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
EP2746257A1 (en) 2012-12-21 2014-06-25 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
EP2746258A1 (en) 2012-12-21 2014-06-25 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
CN105189489A (zh) 2012-12-27 2015-12-23 巴斯夫欧洲公司 用于防除无脊椎动物害虫的带有亚胺或亚胺衍生取代基的2-(吡啶-3-基)-5-杂芳基噻唑化合物
WO2014102065A1 (en) 2012-12-31 2014-07-03 Basf Se Herbicidal composition comprising a cornexistin
US10253329B2 (en) 2013-01-04 2019-04-09 Board Of Trustees Of Michigan State University Sources of aphid resistance in soybean plants
US9650646B2 (en) 2013-01-11 2017-05-16 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods to increase plant growth and yield
WO2014118099A1 (en) 2013-01-30 2014-08-07 Basf Se Fungicidal naphthoquinones and derivatives
AR095109A1 (es) 2013-01-31 2015-09-30 Univ Guelph Plantas tolerantes a herbicidas auxínicos
ES2621386T3 (es) 2013-02-04 2017-07-03 Syngenta Participations Ag Microbicidas novedosos
TWI628170B (zh) 2013-02-05 2018-07-01 先正達合夥公司 植物生長調節化合物
EP2762468A1 (en) 2013-02-05 2014-08-06 Syngenta Participations AG. 2-aminopyridine derivatives as plant growth regulating compounds
WO2014124850A1 (en) 2013-02-14 2014-08-21 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
WO2014124988A1 (en) 2013-02-15 2014-08-21 Syngenta Limited Pyridine derivatives and their use as herbicides
WO2014128136A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Basf Se Anthranilamide compounds and their use as pesticides
BR112015020611B1 (pt) 2013-02-27 2020-06-30 Syngenta Participations Ag. compostos de carboxamida
WO2014131837A1 (en) 2013-02-28 2014-09-04 Syngenta Participations Ag Isoxaline derivatives for use in cotton plants
WO2014131735A1 (en) 2013-02-28 2014-09-04 Syngenta Participations Ag Use of chemical compounds as herbicides
WO2014131732A2 (en) 2013-02-28 2014-09-04 Syngenta Participations Ag Plant growth regulating compounds
AU2014224174B2 (en) 2013-03-06 2018-08-30 Hadasit Medical Research Services And Development Ltd. Use of plant cells expressing a TNFalpha polypeptide inhibitor in therapy
WO2014136114A1 (en) 2013-03-06 2014-09-12 Protalix Ltd. TNF alpha INHIBITOR POLYPEPTIDES, POLYNUCLEOTIDES ENCODING SAME, CELLS EXPRESSING SAME AND METHODS OF PRODUCING SAME
US20160015034A1 (en) 2013-03-07 2016-01-21 Basf Se Co-Crystals of Pyrimethanil and Selected Dithiine Tetracarboximide
DK2964767T3 (da) * 2013-03-07 2020-03-23 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Toksingener og fremgangsmåder til anvendelse deraf
RU2714724C2 (ru) 2013-03-15 2020-02-19 БАЙЕР КРОПСАЙЕНС ЭлПи Конститутивные промоторы сои
UY35421A (es) 2013-03-15 2014-10-31 Nihon Nohyaku Co Ltd Compuesto heterocíclico condensado o su sal, insecticida agrícola u hortícola que comprende el comp uesto y método de uso del insecticida
EP2783569A1 (en) 2013-03-28 2014-10-01 Basf Se Compositions comprising a triazole compound
CA2907750A1 (en) 2013-03-28 2014-10-02 Syngenta Participations Ag Methods of controlling neonicotinoid resistant pests
US9635853B2 (en) 2013-04-02 2017-05-02 Syngenta Participations Ag Insecticidal compounds
BR112015025028B1 (pt) 2013-04-02 2020-10-13 Syngenta Participations Ag compostos, processo para a produção de compostos, métodos para controle de insetos, ácaros, nematódeos ou moluscos e para proteção de plantas úteis e composição
WO2014167133A1 (en) 2013-04-12 2014-10-16 Syngenta Participations Ag Fungicides comprising boron
BR112015026357A2 (pt) 2013-04-19 2017-07-25 Basf Se compostos, composição agrícola ou veterinária, métodos para o combate ou controle das pragas, para a proteção de vegetais, para a proteção do material de propagação e para o tratamento de animais e utilização de um composto
WO2014173880A1 (en) 2013-04-22 2014-10-30 Syngenta Participations Ag Novel microbiocides
WO2014182945A1 (en) 2013-05-10 2014-11-13 Nimbus Apollo, Inc. Acc inhibitors and uses thereof
MX2015015421A (es) 2013-05-10 2016-06-21 Nimbus Apollo Inc Inhibidores de acetil-coa carboxilasa (acc) y usos de los mismos.
GB201308607D0 (en) 2013-05-14 2013-06-19 Syngenta Ltd Mixtures of haloalkylsulfonanilide derivatives and herbicides
WO2014184019A1 (en) 2013-05-15 2014-11-20 Basf Se N-(1,2,5-oxadiazol-3-yl)carboxamide compounds and their use as herbicides
WO2014184058A1 (en) 2013-05-15 2014-11-20 Basf Se Substituted 1,2,5-oxadiazole compounds and their use as herbicides
WO2014184014A1 (en) 2013-05-15 2014-11-20 Basf Se N-(1,2,5-oxadiazol-3-yl)carboxamide compounds and their use as herbicides
EA032323B1 (ru) 2013-05-15 2019-05-31 Басф Се Замещенные n-(тетразол-5-ил)- и n-(триазол-5-ил)арилкарбоксамидные соединения и их применение в качестве гербицидов
CN105228448B (zh) 2013-05-23 2019-03-01 先正达参股股份有限公司 桶混配制品
US20160102103A1 (en) 2013-05-24 2016-04-14 Basf Se Substituted pyridine compounds having herbicidal activity
GB201310047D0 (en) 2013-06-05 2013-07-17 Syngenta Ltd Compounds
WO2014201156A1 (en) 2013-06-11 2014-12-18 Florida State University Research Foundation, Inc. Materials and methods for controlling bundle sheath cell fate and function in plants
EP2813499A1 (en) 2013-06-12 2014-12-17 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
EP2815647A1 (en) 2013-06-18 2014-12-24 Basf Se Novel strobilurin-type compounds for combating phytopathogenic fungi
EP2815649A1 (en) 2013-06-18 2014-12-24 Basf Se Fungicidal mixtures II comprising strobilurin-type fungicides
WO2014206835A1 (en) 2013-06-26 2014-12-31 Basf Se Methods for improving the efficacy of anionic herbicides under hard water conditions and suitable compositions
ES2807599T3 (es) 2013-07-02 2021-02-23 Syngenta Participations Ag Heterociclos bi- o tricíclicos activos como plaguicidas con sustituyentes que contienen azufre
DK3019476T3 (en) 2013-07-08 2018-04-16 Syngenta Participations Ag 4-membered ring carboxamides used as nematicides
WO2015004091A1 (en) 2013-07-12 2015-01-15 Syngenta Participations Ag Nicotinamide derivatives and their use against nematodes
WO2015003991A1 (en) 2013-07-12 2015-01-15 Syngenta Participations Ag Novel microbiocides
CN105531265B (zh) 2013-07-15 2018-07-20 巴斯夫欧洲公司 杀害虫化合物
WO2015007564A1 (en) 2013-07-18 2015-01-22 Basf Se Substituted n-(1,2,4-triazol-3-yl)arylcarboxamide compounds and their use as herbicides
CN105451558B (zh) 2013-08-05 2018-10-23 先正达参股股份有限公司 吡唑基吡咯啉酮及其作为除草剂的用途
US9605004B2 (en) 2013-08-05 2017-03-28 Syngenta Limited Chemical compounds
EP2835052A1 (en) 2013-08-07 2015-02-11 Basf Se Fungicidal mixtures comprising pyrimidine fungicides
AR100017A1 (es) 2013-08-12 2016-09-07 Basf Se Hidroxifenilpiruvato dioxigenasas resistentes a herbicidas
WO2015021991A1 (en) 2013-08-16 2015-02-19 Cheminova A/S Combination of 2-methylbiphenyl-3-ylmethyl (z)-(1r)-cis-3-(2-chloro-3,3,3-trifluoroprop-1-enyl)-2,2-dimethylcyclopropanecarboxylate with at least one insecticide, acaricide, nematicide and/or fungicide.
ES2903085T3 (es) 2013-08-21 2022-03-31 Commw Scient Ind Res Org Gen de resistencia a la roya
EP2839745A1 (en) 2013-08-21 2015-02-25 Basf Se Agrochemical formulations comprising a 2-ethyl-hexanol alkoxylate
CN105874070A (zh) 2013-09-13 2016-08-17 不来梅大学 用于固氮的转基因植物
WO2015036059A1 (en) 2013-09-16 2015-03-19 Basf Se Fungicidal pyrimidine compounds
EP3046915A1 (en) 2013-09-16 2016-07-27 Basf Se Fungicidal pyrimidine compounds
JP6404357B2 (ja) 2013-09-19 2018-10-10 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ Ｎ−アシルイミノ複素環式化合物
WO2015040141A1 (en) 2013-09-23 2015-03-26 Syngenta Participations Ag Cyclobutylcarboxamides as nematicides
EP4154714A3 (en) 2013-10-03 2023-07-26 Syngenta Participations Ag Fungicidal compositions
WO2015052178A1 (en) 2013-10-10 2015-04-16 Basf Se 1,2,5-oxadiazole compounds and their use as herbicides
WO2015052173A1 (en) 2013-10-10 2015-04-16 Basf Se Tetrazole and triazole compounds and their use as herbicides
US9902704B2 (en) 2013-10-10 2018-02-27 Basf Se Substituted N-(tetrazol-5-yl)- and N-(triazol-5-yl)arylcarboxamide compounds and their use as herbicides
AR097995A1 (es) 2013-10-14 2016-04-27 Syngenta Participations Ag Método para sembrar filas de cultivos
JP6644681B2 (ja) 2013-10-18 2020-02-12 ビーエーエスエフ アグロケミカル プロダクツ ビー．ブイ． 土壌及び種子施用における殺有害生物活性カルボキサミド誘導体の使用、並びに処理方法
EP2868196A1 (en) 2013-11-05 2015-05-06 Basf Se Herbicidal compositions
EP2868197A1 (en) 2013-11-05 2015-05-06 Basf Se Herbicidal compositions
ES2651470T3 (es) 2013-11-11 2018-01-26 Syngenta Participations Ag Derivados de 1-(piridazin-3-il)-imidazolidin-2-ona como herbicidas
ES2909888T3 (es) 2013-11-12 2022-05-10 Nihon Nohyaku Co Ltd Compuestos de amida o sales de los mismos, y su uso como microbicidas agrícolas y hortícolas
EP2873668A1 (en) 2013-11-13 2015-05-20 Syngenta Participations AG. Pesticidally active bicyclic heterocycles with sulphur containing substituents
EP2878199A1 (en) 2013-11-27 2015-06-03 Syngenta Participations AG. Method of protecting a plant propagation material
EP2881387A1 (en) 2013-12-09 2015-06-10 Basf Se Pyrazolone compounds having herbicidal activity
EP2881388A1 (en) 2013-12-09 2015-06-10 Basf Se Pyrazolone compounds having herbicidal activity
DK3080243T3 (en) 2013-12-10 2019-01-07 Yeda Res & Dev USE OF ENZYMES THAT CATALYZE PYRUVATH SYNTHESIS FROM FORMIATE AND ACETYL COA, AND BACTERIES THAT EXPRESS THIS
US10053432B2 (en) 2013-12-12 2018-08-21 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
EP3083596A1 (en) 2013-12-18 2016-10-26 Basf Se Azole compounds carrying an imine-derived substituent
CN106029645A (zh) 2013-12-18 2016-10-12 巴斯夫欧洲公司 N-取代的亚氨基杂环化合物
WO2015091945A1 (en) 2013-12-20 2015-06-25 Syngenta Participations Ag Pesticidally active substituted 5,5-bicyclic heterocycles with sulphur containing substituents
WO2015097237A1 (en) 2013-12-23 2015-07-02 Syngenta Participations Ag Benzoxaborole fungicides
US9750246B2 (en) 2013-12-23 2017-09-05 Syngenta Participations Ag Insecticidal compounds
JP2015172030A (ja) 2013-12-25 2015-10-01 日産化学工業株式会社 ハロアルキルスルホンアミド誘導体
WO2015104422A1 (en) 2014-01-13 2015-07-16 Basf Se Dihydrothiophene compounds for controlling invertebrate pests
BR102015000943A2 (pt) 2014-01-17 2016-06-07 Dow Agrosciences Llc expressão aumentada de proteína em planta
US10392629B2 (en) 2014-01-17 2019-08-27 Board Of Trustees Of Michigan State University Increased caloric and nutritional content of plant biomass
DK3096775T5 (da) 2014-01-24 2024-10-14 Univ Florida SOCS-mimetika til behandling af sygdomme
AR100304A1 (es) 2014-02-05 2016-09-28 Basf Corp Formulación de recubrimiento de semillas
US20170101633A1 (en) 2014-02-10 2017-04-13 Protalix Ltd. Method of maintaining disease stability in a subject having gaucher's disease
EP2907807A1 (en) 2014-02-18 2015-08-19 Basf Se Benzamide compounds and their use as herbicides
EP3114483A1 (en) 2014-03-03 2017-01-11 Yissum Research and Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. Method and device for detection of pseudomonas aeruginosa
WO2015138394A2 (en) 2014-03-11 2015-09-17 Bayer Cropscience Lp Hppd variants and methods of use
PL3122732T3 (pl) 2014-03-26 2018-08-31 Basf Se Podstawione związki [1,2,4]triazolowe i imidazolowe jako fungicydy
CN106460005B (zh) 2014-03-27 2020-01-03 莫迪卡戈公司 修饰的cpmv增强子元件
EP2924027A1 (en) 2014-03-28 2015-09-30 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole fungicidal compounds
WO2015150465A2 (en) 2014-04-03 2015-10-08 Basf Se Plants having increased tolerance to herbicides
EP3126348B1 (en) 2014-04-03 2017-11-29 Basf Se Diaminotriazine compound useful as herbicide
EP2930174A1 (en) 2014-04-07 2015-10-14 Basf Se Diaminotriazine derivatives as herbicides
US20170223964A1 (en) 2014-04-17 2017-08-10 Basf Se Combination of Novel Nitrification Inhibitors and Herbicides as Well as Combination of (Thio)Phosphoric Acid Triamides and Herbicides
US9968092B2 (en) 2014-04-17 2018-05-15 Basf Se Combination of novel nitrification inhibitors and biopesticides as well as combination of (thio)phosphoric acid triamides and biopesticides
BR112016022782B1 (pt) 2014-04-23 2020-01-28 Basf Se composto de diaminotriazina, composição agroquímica e uso de um composto
EP3145927B1 (en) 2014-05-19 2017-06-14 Syngenta Participations AG Insecticidally active amide derivatives with sulfur-substituted phenyl or pyridine groups
US10294482B2 (en) 2014-05-22 2019-05-21 Yeda Research And Development Co. Ltd. Recombinant microorganisms capable of carbon fixation
EP2949649A1 (en) 2014-05-30 2015-12-02 Basf Se Fungicide substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
EP2949216A1 (en) 2014-05-30 2015-12-02 Basf Se Fungicidal substituted alkynyl [1,2,4]triazole and imidazole compounds
EP2952507A1 (en) 2014-06-06 2015-12-09 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole compounds
EP2952506A1 (en) 2014-06-06 2015-12-09 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
AR100743A1 (es) 2014-06-06 2016-10-26 Basf Se Compuestos de [1,2,4]triazol sustituido
EP3756464A1 (en) 2014-06-06 2020-12-30 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
EP2952512A1 (en) 2014-06-06 2015-12-09 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole compounds
WO2015193653A1 (en) 2014-06-16 2015-12-23 Consejo Nacional De Investigaciones Cientificas Y Tecnicas Oxidative resistance chimeric genes and proteins, and transgenic plants including the same
AU2015281187B2 (en) 2014-06-25 2018-10-04 BASF Agro B.V. Pesticidal compositions
RS60016B1 (sr) 2014-06-26 2020-04-30 Basf Agrochemical Products Bv Tretiranje semena inhibitorima acetolaktat sintaze (als)
EP2962567A1 (en) 2014-07-01 2016-01-06 Basf Se Ternary mixtures comprising biopesticides and at least two chemical insecticides
EP3912635A1 (en) 2014-07-11 2021-11-24 Biostrategies LC Materials and methods for treating disorders associated with sulfatase enzymes
WO2016004536A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 Medicago Inc. Modifying protein production in plants
HUE057012T2 (hu) 2014-07-14 2022-04-28 Basf Se Peszticid készítmények
WO2016016131A1 (en) 2014-07-31 2016-02-04 Syngenta Participations Ag Pesticidally active cyclic enaminones
EP2979549A1 (en) 2014-07-31 2016-02-03 Basf Se Method for improving the health of a plant
WO2016023954A2 (en) 2014-08-12 2016-02-18 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents
JP6568862B2 (ja) 2014-08-19 2019-08-28 日本農薬株式会社 オキサゼピン化合物及び該化合物を有効成分として含有する農園芸用殺虫剤並びにその使用方法
WO2016034615A1 (en) 2014-09-02 2016-03-10 BASF Agro B.V. Aqueous insecticide formulation containing hyperbranched polymer
PE20220960A1 (es) 2014-10-16 2022-06-10 Monsanto Technology Llc Proteinas de variantes de secuencias de aminoacidos de cry1da1 activas para lepidopteros
CN107074917B (zh) * 2014-10-16 2022-05-24 先锋国际良种公司 具有改进的活性谱的杀昆虫多肽及其用途
WO2016071168A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Basf Se Pesticidal mixtures
GB201419826D0 (en) 2014-11-07 2014-12-24 Syngenta Participations Ag Herbicidal compounds
JP2017535296A (ja) 2014-11-27 2017-11-30 ダンツィガー イノベイションズ リミテッドＤａｎｚｉｇｅｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ Ｌｔｄ． ゲノム編集のための核酸構築物
EP3028573A1 (en) 2014-12-05 2016-06-08 Basf Se Use of a triazole fungicide on transgenic plants
WO2016091731A1 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Syngenta Participations Ag Pesticidally active tetracyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2016091675A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Basf Se Method for improving the health of a plant
EP3229596A4 (en) 2014-12-12 2018-06-13 Syngenta Participations AG Compositions and methods for controlling plant pests
WO2016091674A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Basf Se Use of cyclaniliprole on cultivated plants
PT3237617T (pt) 2014-12-23 2019-05-30 Syngenta Participations Ag Controlo biológico de pragas de coleópteros
EP3247200A4 (en) 2015-01-21 2018-06-13 Basf Se Plants having increased tolerance to herbicides
WO2016120116A1 (en) 2015-01-29 2016-08-04 Basf Se Herbicidal phenylpyridines
WO2016120182A1 (en) 2015-01-30 2016-08-04 Syngenta Participations Ag Pesticidally active amide heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents
MX2017009843A (es) 2015-01-30 2017-11-02 Basf Se Fenilpirimidinas herbicidas.
EP3253209A1 (en) 2015-02-06 2017-12-13 Basf Se Pyrazole compounds as nitrification inhibitors
BR112017016789A2 (pt) 2015-02-11 2018-05-08 Basf Se métodos para produzir uma planta transgênica, para controlar a vegetação indesejada e para o cultivo da planta, molécula de ácido nucleico, construção de ácido nucleico, vetor, polipeptídeo hppd mutado, núcleo de célula vegetal, núcleo de célula vegetal transgênica, planta transgênica, uso do ácido nucleico, combinação útil, processo para a preparação de uma combinação útil e uso de uma combinação útil
EP3070080A1 (en) 2015-03-19 2016-09-21 Basf Se Herbicidal fluoromethanesulfonamides
EP3070079A1 (en) 2015-03-19 2016-09-21 Basf Se Herbicidal fluoromethanesulfonamides
CR20170418A (es) 2015-03-27 2017-11-09 Syngenta Participations Ag Derivados heterobicíclicos microbicidas
JP2018513137A (ja) 2015-03-31 2018-05-24 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ 殺有害生物剤及びイソノナン酸ｎ，ｎ−ジメチルアミドを含む組成物
CA2980505A1 (en) 2015-04-07 2016-10-13 Basf Agrochemical Products B.V. Use of an insecticidal carboxamide compound against pests on cultivated plants
UA125114C2 (uk) 2015-04-10 2022-01-12 Сінгента Партісіпейшнс Аг Кормова композиція для тварин і способи її застосування
EP3286187B1 (en) 2015-04-24 2019-09-18 Syngenta Participations AG Pesticidally active polycyclic derivatives with sulfur substituted five-membered ring heterocyles
WO2016169882A1 (en) 2015-04-24 2016-10-27 Syngenta Participations Ag Pesticidally active polycyclic derivatives with sulfur substituted five membered ring heterocyles
WO2016174042A1 (en) 2015-04-27 2016-11-03 BASF Agro B.V. Pesticidal compositions
MX2017014459A (es) 2015-05-12 2018-03-16 Basf Se Compuestos de tioeter como inhibidores de la nitrificacion.
EP3103798A1 (en) 2015-06-09 2016-12-14 Basf Se Herbicidal fluoromethanesulfonamides
AU2016279764B2 (en) 2015-06-16 2020-09-10 Basf Agrochemical Products B.V. Method for managing flea beetles of the family Chrysomelidae in Brassica crops
WO2017001311A1 (en) 2015-07-01 2017-01-05 Syngenta Participations Ag Pesticidally active tetracyclic derivatives with sulfur containing substituents
JP2018524336A (ja) 2015-07-01 2018-08-30 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー 硫黄含有置換基を有する有害生物防除に活性な多環式誘導体
EP3316692B1 (en) 2015-07-02 2021-03-17 BASF Agro B.V. Pesticidal compositions comprising a triazole compound
EP3111763A1 (en) 2015-07-02 2017-01-04 BASF Agro B.V. Pesticidal compositions comprising a triazole compound
WO2017009145A1 (en) 2015-07-10 2017-01-19 BASF Agro B.V. Herbicidal composition comprising cinmethylin and specific inhibitors of protoporphyrinogen oxidase
AU2016292569B2 (en) 2015-07-10 2021-01-21 BASF Agro B.V. Herbicidal composition comprising cinmethylin and specific pigment synthesis inhibitors
EP3319433B1 (en) 2015-07-10 2019-09-11 BASF Agro B.V. Herbicidal composition comprising cinmethylin and specific non-accase lipid synthesis inhibitors
WO2017009144A1 (en) 2015-07-10 2017-01-19 BASF Agro B.V. Herbicidal composition comprising cinmethylin and specific quinolinecarboxylic acids
EA201890265A1 (ru) 2015-07-10 2018-07-31 Басф Агро Б.В. Гербицидная композиция, содержащая цинметилин и метазахлор
EP3162209A1 (en) 2015-10-27 2017-05-03 BASF Agro B.V. Herbicidal composition comprising cinmethylin and imazamox
JP6875368B2 (ja) 2015-07-10 2021-05-26 ビーエーエスエフ アグロ ベー．ブイ． シンメチリン及びアセトクロール又はプレチラクロールを含む除草剤組成物
EP3319429A1 (en) 2015-07-10 2018-05-16 BASF Agro B.V. Herbicidal composition comprising cinmethylin, metazachlor and quinolinecarboxylic acids
EP3319432B1 (en) 2015-07-10 2020-01-01 BASF Agro B.V. Herbicidal composition comprising cinmethylin and pendimethalin
HUE044213T2 (hu) 2015-07-10 2019-10-28 Basf Agro Bv Cinmetilint és petoxamidot tartalmazó herbicid készítmény
EP3319427B1 (en) 2015-07-10 2019-04-17 BASF Agro B.V. Herbicidal composition comprising cinmethylin and dimethenamid
EA035584B1 (ru) 2015-08-12 2020-07-10 Зингента Партисипейшнс Аг Микробиоцидные гетеробициклические производные
EP3135113A1 (en) 2015-08-31 2017-03-01 Basf Se Use of herbicidal compositions for controlling unwanted vegetation
US20180213779A1 (en) 2015-09-25 2018-08-02 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents
WO2017050685A1 (en) 2015-09-25 2017-03-30 Syngenta Participations Ag Pesticidally active polycyclic derivatives with 5-membered sulfur containing heterocyclic ring systems
JP2018536627A (ja) 2015-09-28 2018-12-13 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー 硫黄含有置換基を有する殺有害生物的に活性な複素環式誘導体
BR112018006623B1 (pt) 2015-10-02 2022-04-26 Syngenta Participations Ag Composto derivado de oxadiazol, seu uso, composição agroquímica e método de controle ou prevenção da infestação de plantas úteis por microrganismos fitopatogênicos
US20180279615A1 (en) 2015-10-05 2018-10-04 Basf Se Pyridine derivatives for combating phytopathogenic fungi
CA3001979A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Basf Se Plants having increased tolerance to herbicides
WO2017067839A1 (en) 2015-10-23 2017-04-27 Syngenta Participations Ag Microbiocidal phenylamidine derivatives
WO2017067837A1 (en) 2015-10-23 2017-04-27 Syngenta Participations Ag Microbiocidal phenylamidine derivatives
JP2018537426A (ja) 2015-10-28 2018-12-20 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー 殺微生物オキサジアゾール誘導体
EP3371177A1 (en) 2015-11-02 2018-09-12 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
EP3165094A1 (en) 2015-11-03 2017-05-10 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
WO2017076982A1 (en) 2015-11-04 2017-05-11 Syngenta Participations Ag Microbiocidal anilide derivatives
US20180317490A1 (en) 2015-11-04 2018-11-08 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
EP3165093A1 (en) 2015-11-05 2017-05-10 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
WO2017080870A1 (en) 2015-11-09 2017-05-18 Syngenta Participations Ag Fungicidal compositions
EP3167716A1 (en) 2015-11-10 2017-05-17 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
CA3003794A1 (en) 2015-11-12 2017-05-18 Basf Se Herbicidal compositions comprising isoxazolo[5,4-b]pyridines
BR112018009579A2 (pt) 2015-11-13 2018-11-06 Basf Se composto da fórmula i, mistura, composição agroquímica, uso de composto e método de combate a fungos
US20180354920A1 (en) 2015-11-13 2018-12-13 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
BR112018008413A2 (pt) 2015-11-19 2018-10-23 Basf Se compostos, mistura, composição agroquímica e método para combater fungos nocivos fitopatogênicos
EP3376868A1 (en) 2015-11-19 2018-09-26 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
JP2018537460A (ja) 2015-11-23 2018-12-20 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー 硫黄およびシクロプロピル含有置換基を有する有害生物防除的に活性な複素環式誘導体
CN108290902B (zh) 2015-11-25 2021-08-31 吉利德阿波罗公司 酯类acc抑制剂及其用途
SI3380480T1 (sl) 2015-11-25 2023-04-28 Gilead Apollo, Llc Pirazolni inhibitorji ACC in uporabe le-teh
PT3380479T (pt) 2015-11-25 2023-03-13 Gilead Apollo Llc Inhibidores de triazol acc e seus usos
CN108290858B (zh) 2015-12-01 2021-07-06 日本农药株式会社 3h-吡咯并吡啶化合物或其n-氧化物、或它们的盐类及含有该化合物的农业园艺用杀虫剂及其使用方法
WO2017093120A1 (en) 2015-12-01 2017-06-08 Basf Se Pyridine compounds as fungicides
US20180368403A1 (en) 2015-12-01 2018-12-27 Basf Se Pyridine compounds as fungicides
BR112018011053A2 (pt) 2015-12-02 2018-11-21 Syngenta Participations Ag derivados de oxadiazol microbiocidas
BR112018012204B1 (pt) 2015-12-15 2022-03-22 Syngenta Participations Ag Compostos derivados de fenilamidina microbicidas, composição e método de combate, prevenção e controle de doenças fitopatogênicas
WO2017102006A1 (en) 2015-12-17 2017-06-22 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
AU2016369900B2 (en) 2015-12-17 2020-06-11 Basf Se Benzamide compounds and their use as herbicides
MX2018007527A (es) 2015-12-22 2018-09-07 Syngenta Participations Ag Derivados de pirazol activos como pesticidas.
EP3405030B1 (en) 2016-01-22 2020-11-04 Basf Se Biodegradable polyester capsules comprising an aqueous core and a pesticide
EP3202267A1 (en) 2016-02-05 2017-08-09 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2017134066A1 (en) 2016-02-05 2017-08-10 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents
EP3205208A1 (en) 2016-02-09 2017-08-16 Basf Se Mixtures and compositions comprising paenibacillus strains or fusaricidins and chemical pesticides
EP3205209A1 (en) 2016-02-09 2017-08-16 Basf Se Mixtures and compositions comprising paenibacillus strains or metabolites thereof and other biopesticides
WO2017140771A1 (en) 2016-02-18 2017-08-24 Syngenta Participations Ag Pesticidally active pyrazole derivatives
UY37137A (es) 2016-02-24 2017-09-29 Merial Inc Compuestos antiparasitarios de isoxazolina, formulaciones inyectables de acción prolongada que los comprenden, métodos y usos de los mismos
PL3421475T3 (pl) 2016-02-26 2022-04-04 Nihon Nohyaku Co., Ltd. Skondensowany związek heterocykliczny mający przyłączone heterocykle i jego sole, rolniczy/ogrodniczy środek owadobójczy zawierający wspomniany związek, oraz sposób zastosowania wspomnianego środka owadobójczego
CA3013564C (en) 2016-02-26 2020-08-25 Nihon Nohyaku Co., Ltd. Benzoxazole compound or salt thereof, agricultural and horticultural insecticide comprising the compound, and method for using the insecticide
CR20180434A (es) 2016-03-10 2018-11-21 Syngenta Participations Ag Derivados microbiocidas de tipo (tio) carboxamida de la quinolina
BR112018017034A2 (pt) 2016-03-10 2018-12-26 Basf Se misturas e seu uso, composição agroquímica, método de controle de fungos daninhos fitopatogênicos e material de propagação vegetal
US20190292174A1 (en) 2016-03-15 2019-09-26 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
GB201604970D0 (en) 2016-03-23 2016-05-04 Syngenta Participations Ag Improvements in or relating to organic compounds
WO2017162868A1 (en) 2016-03-24 2017-09-28 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
CN109071493A (zh) 2016-04-07 2018-12-21 先正达参股股份有限公司 具有含硫取代基的杀有害生物活性杂环衍生物
CN109068652A (zh) 2016-04-08 2018-12-21 先正达参股股份有限公司 杀微生物的噁二唑衍生物
EP3442969A1 (en) 2016-04-12 2019-02-20 Syngenta Participations AG Microbiocidal oxadiazole derivatives
WO2017178408A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Syngenta Participations Ag Microbiocidal silicon containing aryl derivatives
EP3245872A1 (en) 2016-05-20 2017-11-22 BASF Agro B.V. Pesticidal compositions
BR112018072479B1 (pt) 2016-05-24 2023-01-31 Basf Se Método para controlar o crescimento de ervas daninhas, uso do composto de fórmula (i) e uso da composição
CN109311842B (zh) 2016-05-24 2022-03-25 巴斯夫欧洲公司 除草的尿嘧啶吡啶类
LT3464284T (lt) 2016-05-30 2021-01-25 Syngenta Participations Ag Mikrobiocidiniai tiazolo dariniai
WO2017207368A1 (en) 2016-06-02 2017-12-07 BASF Agro B.V. Fungicidal compositions
JP2019523224A (ja) 2016-06-03 2019-08-22 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー 殺微生物オキサジアゾール誘導体
WO2017207358A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Basf Se Benzoxaborole compounds
AR108745A1 (es) 2016-06-21 2018-09-19 Syngenta Participations Ag Derivados de oxadiazol microbiocidas
EP3269246A1 (en) 2016-07-13 2018-01-17 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2018011750A1 (en) 2016-07-15 2018-01-18 Basf Se Plants having increased tolerance to herbicides
WO2018011112A1 (en) 2016-07-15 2018-01-18 Basf Se Fungicidal mixtures comprising a carboxamide
CA3029873A1 (en) 2016-07-20 2018-01-25 Basf Se Herbicidal compositions comprising phenylpyrimidines
CN109476613A (zh) 2016-07-22 2019-03-15 先正达参股股份有限公司 杀微生物的噁二唑衍生物
US10757941B2 (en) 2016-07-22 2020-09-01 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
US20200138028A1 (en) 2016-07-22 2020-05-07 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
CA3030084A1 (en) 2016-07-25 2018-02-01 Basf Se Herbicidal pyrimidine compounds
WO2018019552A1 (en) 2016-07-25 2018-02-01 Basf Se Herbicidal pyrimidine compounds
WO2018019721A1 (en) 2016-07-26 2018-02-01 Basf Se Herbicidal pyridine compounds
WO2018019555A1 (en) 2016-07-26 2018-02-01 Basf Se Herbicidal pyrimidine compounds
WO2018019755A1 (en) 2016-07-26 2018-02-01 Basf Se Herbicidal pyridine compounds
WO2018019758A1 (en) 2016-07-26 2018-02-01 Basf Se Herbicidal pyridine compounds
BR112019001483A2 (pt) 2016-07-27 2019-09-10 Basf Agro Bv método para controlar a vegetação indesejada em um local de cultivo de plantas
US20190269133A1 (en) 2016-07-27 2019-09-05 Basf Se Herbicidal Pyrimidine Compounds
WO2018019767A1 (en) 2016-07-27 2018-02-01 Basf Se Herbicidal pyridine compounds
EP3275877A1 (en) 2016-07-28 2018-01-31 Basf Se Herbicidal pyridine compounds
WO2018019770A1 (en) 2016-07-28 2018-02-01 Basf Se Herbicidal pyridine compounds
WO2018019574A1 (en) 2016-07-28 2018-02-01 Basf Se Herbicidal pyrimidine compounds
WO2018019845A1 (en) 2016-07-29 2018-02-01 Basf Se Method for controlling ppo resistant weeds
CA3030354A1 (en) 2016-07-29 2018-02-01 Basf Se Method for controlling ppo resistant weeds
WO2018024696A1 (en) 2016-08-05 2018-02-08 Basf Se Method for controlling ppo resistant weeds
US20210352900A1 (en) 2016-08-05 2021-11-18 Basf Se Method for Controlling PPO Resistant Weeds
EP3278667A1 (en) 2016-08-05 2018-02-07 Basf Se Method for controlling ppo-inhibitor resistant weeds
EP3281523A1 (en) 2016-08-09 2018-02-14 Basf Se Method for controlling ppo resistant weeds
WO2018029031A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 Basf Se Method for controlling ppo resistant weeds
EP3281525A1 (en) 2016-08-09 2018-02-14 Basf Se Method for controlling ppo resistant weeds
EP3281524A1 (en) 2016-08-09 2018-02-14 Basf Se Method for controlling ppo resistant weeds
CA3032238A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 Basf Se Method for controlling ppo resistant weeds
US10905121B2 (en) 2016-08-09 2021-02-02 Basf Se Method for controlling PPO resistant weeds
WO2018029242A1 (en) 2016-08-11 2018-02-15 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
CN109415357B (zh) 2016-09-01 2021-10-29 日本农药株式会社 具有腙基的缩合杂环化合物或其盐类及含有该化合物的农业园艺用杀虫剂及其使用方法
WO2018041729A2 (en) 2016-09-01 2018-03-08 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents
BR112019003301A2 (pt) 2016-09-01 2019-05-28 Basf Se mistura fungicida, composição fungicida, método para controlar fungos fitopatogênicos, método para melhorar a saúde de plantas, método para proteção de material de propagação de plantas contra fungos fitopatogênicos e material de propagação de plantas
WO2018050508A1 (en) 2016-09-13 2018-03-22 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2018055135A1 (en) 2016-09-23 2018-03-29 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
WO2018055133A1 (en) 2016-09-23 2018-03-29 Syngenta Participations Ag Microbiocidal tetrazolone derivatives
WO2018054723A1 (en) 2016-09-26 2018-03-29 Basf Se Pyridine compounds for controlling phytopathogenic harmful fungi
WO2018054721A1 (en) 2016-09-26 2018-03-29 Basf Se Pyridine compounds for controlling phytopathogenic harmful fungi
WO2018054711A1 (en) 2016-09-26 2018-03-29 Basf Se Pyridine compounds for controlling phytopathogenic harmful fungi
EP3518676A1 (en) 2016-09-27 2019-08-07 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2018065182A1 (en) 2016-10-04 2018-04-12 Basf Se Reduced quinoline compounds as antifuni agents
PL3522715T3 (pl) 2016-10-06 2021-06-28 Syngenta Participations Ag Mikrobiocydowe pochodne oksadiazolowe
WO2018069110A1 (en) 2016-10-10 2018-04-19 Basf Se Pesticidal mixtures
ES2964942T3 (es) 2016-10-10 2024-04-10 Basf Se Mezclas pesticidas
US20190307127A1 (en) 2016-10-10 2019-10-10 Basf Se Pesticidal Mixtures
US20200045970A1 (en) 2016-10-10 2020-02-13 Basf Se Pesticidal mixture
BR112019006354B1 (pt) 2016-10-13 2023-12-26 Nihon Nohyaku Co., Ltd Composto heterocíclico condensado 1h-pirrolo e seu uso, método para uso de um inseticida agrícola e hortícola, método para controle de pragas agrícolas e hortícolas, composição para controle de ectoparasita e seu uso
EP3527560A4 (en) 2016-10-13 2020-04-08 Nihon Nohyaku Co., Ltd. 1H-PYRROLOPYRIDINE COMPOUND, N-OXIDE THEREOF, SALT THEREOF, PESTICIDE FOR AGRICULTURAL USE AND HORTICULTURE CONTAINING SAID COMPOUND, AND METHOD OF USE THEREOF
WO2018073110A1 (en) 2016-10-20 2018-04-26 Basf Se Quinoline compounds as fungicides
CN110267527A (zh) 2016-10-21 2019-09-20 韦斯塔隆公司 可切割肽及包含可切割肽的杀昆虫和杀线虫蛋白
EP3532471B1 (en) 2016-10-27 2021-09-15 Syngenta Participations AG Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulphur and hydroxylamine substituents
GB201618266D0 (en) 2016-10-28 2016-12-14 Syngenta Participations Ag Improvements in or relating to organic compounds
WO2018076335A1 (en) 2016-10-31 2018-05-03 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Compositions and methods for enhancing abiotic stress tolerance
CA3039885C (en) 2016-11-01 2021-03-09 Nihon Nohyaku Co., Ltd. Oxime group-containing quinoline compound, n-oxide thereof or salt thereof, agricultural and horticultural insecticide comprising the compound, and method for using the insecticide
EP3539958A4 (en) 2016-11-01 2020-06-10 Nihon Nohyaku Co., Ltd. N-ALKYLSULFONYLINDOLINE COMPOUND, AGRICULTURAL INSECTICIDE AND HORTICULTURAL COMPRISING THE SAME AND METHOD OF USE
JP2020500850A (ja) 2016-11-15 2020-01-16 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー 殺微生物フェニルアミジン誘導体
WO2018091389A1 (en) 2016-11-17 2018-05-24 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents
WO2018095795A1 (en) 2016-11-23 2018-05-31 Syngenta Participations Ag Pesticidally active polycyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2018095811A1 (en) 2016-11-28 2018-05-31 Basf Se Diaminotriazine compounds
EP3329777A1 (en) 2016-11-30 2018-06-06 Basf Se Pesticidal mixtures
JP7282031B2 (ja) 2016-12-01 2023-05-26 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー 硫黄含有置換基を有する殺有害生物的に活性な複素環式誘導体
WO2018108612A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Basf Se Herbicidal compositions comprising isoxazolo[5,4-b]pyridines
CN110022682B (zh) 2016-12-15 2022-03-01 先正达参股股份有限公司 具有含硫取代基的杀有害生物活性杂环衍生物
MX2019007120A (es) 2016-12-16 2019-09-16 Basf Se Compuestos plaguicidas.
CN110072853B (zh) 2016-12-16 2023-07-25 巴斯夫欧洲公司 除草的苯基三唑啉酮类
EP3339297A1 (en) 2016-12-20 2018-06-27 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
BR112019012322A2 (pt) 2016-12-20 2019-11-19 Syngenta Participations Ag n-ciclobutil-tiazol-5-carboxamidas com atividade nematicida
EP3559243A1 (en) 2016-12-20 2019-10-30 BASF Agro B.V. Plants having increased tolerance to herbicides
WO2018116072A1 (en) 2016-12-20 2018-06-28 Pi Industries Ltd. Heterocyclic compounds
EP3338552A1 (en) 2016-12-21 2018-06-27 Basf Se Use of a tetrazolinone fungicide on transgenic plants
US11083198B2 (en) 2016-12-27 2021-08-10 Nihon Nohyaku Co., Ltd. 4H-pyrrolopyridine compound or salt thereof, agricultural and horticultural insecticide comprising the compound or the salt, and method for using the insecticide
JP6728399B2 (ja) 2016-12-27 2020-07-22 日本農薬株式会社 オキシム基を有する縮合複素環化合物又はその塩類、及びそれらの化合物を含有する農園芸用殺虫剤並びにその使用方法
US20190359589A1 (en) 2017-01-23 2019-11-28 Basf Se Fungicidal pyridine compounds
CN110248544A (zh) 2017-02-01 2019-09-17 巴斯夫欧洲公司 可乳化浓缩物
CN110248545A (zh) 2017-02-02 2019-09-17 巴斯夫欧洲公司 用阴离子烷氧基化酚类提高土壤除草剂活性
WO2018149754A1 (en) 2017-02-16 2018-08-23 Basf Se Pyridine compounds
TWI793104B (zh) 2017-02-21 2023-02-21 瑞士商先正達合夥公司 具有含硫取代基的殺有害生物活性雜環衍生物
UY37623A (es) 2017-03-03 2018-09-28 Syngenta Participations Ag Derivados de oxadiazol tiofeno fungicidas
WO2018165091A1 (en) 2017-03-07 2018-09-13 Bayer Cropscience Lp Hppd variants and methods of use
BR112019018175A2 (pt) 2017-03-07 2020-04-07 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC molécula, célula, planta, sementes, polipeptídeos recombinantes, método para produzir um polipeptídeo, planta, método para controlar ervas, uso do ácido nucleico e produto de utilidade
CA3055396A1 (en) 2017-03-07 2018-09-13 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Hppd variants and methods of use
WO2018162643A1 (en) 2017-03-10 2018-09-13 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
CA3050359A1 (en) 2017-03-14 2018-09-20 Basf Se Herbicidal azines
CN110446698B (zh) 2017-03-20 2023-03-28 先正达参股股份有限公司 杀微生物的喹啉(硫代)甲酰胺衍生物
US11160280B2 (en) 2017-03-28 2021-11-02 Basf Se Pesticial compounds
US20200205406A1 (en) 2017-03-31 2020-07-02 Syngenta Participations Ag Microbiocidal phenylamidine derivatives with improved plant safety properties
EP3606913B1 (en) 2017-04-03 2022-04-27 Syngenta Participations AG Microbiocidal oxadiazole derivatives
WO2018184986A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
WO2018184987A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
WO2018185187A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Syngenta Participations Ag Pesticidally active pyrazole derivatives
WO2018185185A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Syngenta Participations Ag Pesticidally active pyrazole derivatives
BR112019020819B1 (pt) 2017-04-05 2023-12-05 Syngenta Participations Ag Composto de fórmula (i), composição agroquímica, método para controlar ou prevenir a infestação de plantas úteis por micro-organismos fitopatogênicos e uso de um composto de fórmula (i)
BR112019020735B1 (pt) 2017-04-05 2023-12-05 Syngenta Participations Ag Compostos derivados de oxadiazol microbiocidas e seu uso, composição agroquímica e método para controlar ou prevenir a infestação de plantas úteis por microrganismos fitopatogênicos
WO2018184985A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
WO2018184984A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
US11142519B2 (en) 2017-04-05 2021-10-12 Syngenta Participations Ag Pesticidally active pyrazole derivatives
BR112019020879A2 (pt) 2017-04-06 2020-04-28 Basf Se compostos, composição, uso de um composto de formula i, método para combater fungos fitopatogênicos, semente e intermediários
WO2018185211A1 (en) 2017-04-06 2018-10-11 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
WO2018189001A1 (en) 2017-04-13 2018-10-18 Basf Se Fungicide mixtures for use in rice
US11109591B2 (en) 2017-04-24 2021-09-07 Taminco Bvba Single phase liquids of alkanolamine salts of dicamba
US20200216441A1 (en) 2017-04-25 2020-07-09 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
ES2951425T3 (es) 2017-04-27 2023-10-20 Nihon Nohyaku Co Ltd Compuesto heterocíclico condensado o sal del mismo, insecticida agrícola y hortícola que comprende el compuesto o la sal, y método para usar el insecticida
CN110730779B (zh) 2017-05-02 2023-05-02 先正达参股股份有限公司 具有含硫取代基的杀有害生物活性杂环衍生物
EP3621965B1 (en) 2017-05-08 2022-02-23 Syngenta Participations AG Imidazopyrimidine derivatives with sulfur containing phenyl and pyridyl substituents
WO2018206419A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 Syngenta Participations Ag Microbiocidal heterobicyclic derivatives
WO2018210659A1 (en) 2017-05-15 2018-11-22 Basf Se Heteroaryl compounds as agrochemical fungicides
WO2018210661A1 (en) 2017-05-15 2018-11-22 Basf Se Heteroaryl compounds as agrochemical fungicides
WO2018210660A1 (en) 2017-05-15 2018-11-22 Basf Se Heteroaryl compounds as agrochemical fungicides
WO2018210658A1 (en) 2017-05-15 2018-11-22 Basf Se Heteroaryl compounds as agrochemical fungicides
WO2018215304A1 (en) 2017-05-22 2018-11-29 Syngenta Participations Ag Tetracyclic pyridazine sulphur containing compounds and their use as pesticides
WO2018219935A1 (en) 2017-05-30 2018-12-06 Basf Se Benzamide compounds and their use as herbicides
US20210179569A1 (en) 2017-05-30 2021-06-17 Basf Se Benzamide compounds and their use as herbicides ii
US11737463B2 (en) 2017-05-30 2023-08-29 Basf Se Pyridine and pyrazine compounds
EP3630753A1 (en) 2017-06-02 2020-04-08 Syngenta Participations AG Microbiocidal oxadiazole derivatives
EP3412150A1 (en) 2017-06-06 2018-12-12 Basf Se Mixtures of meptyldinocap with sdhi fungicides
WO2018224861A1 (en) 2017-06-07 2018-12-13 International Rice Research Institute Increasing hybrid seed production through higher outcrossing rate in cytoplasmic male sterile gramineae plants and related materials and methods
WO2018229041A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 Basf Se Herbicidal pyrimidine compounds
CN110770223B (zh) 2017-06-19 2023-08-22 先正达参股股份有限公司 杀有害生物活性吡唑衍生物
AR112112A1 (es) 2017-06-20 2019-09-18 Basf Se Compuestos de benzamida y su uso como herbicidas
MX2019015881A (es) 2017-06-23 2020-02-07 Basf Se Mezclas plaguicidas que comprenden un compuesto de pirazol.
US11477984B2 (en) 2017-07-05 2022-10-25 BASF Agro B.V. Fungicidal mixtures of mefentrifluconazole
TW201920146A (zh) 2017-07-05 2019-06-01 瑞士商先正達合夥公司 具有含硫取代基之殺有害生物活性的雜環衍生物
WO2019007717A1 (en) 2017-07-06 2019-01-10 Basf Se PESTICIDE MIXTURES
WO2019008115A1 (en) 2017-07-07 2019-01-10 Syngenta Participations Ag HETEROCYCLIC DERIVATIVES HAVING PESTICIDE ACTIVITY HAVING SUBSTITUENTS CONTAINING SULFUR
WO2019007719A1 (en) 2017-07-07 2019-01-10 Basf Se PESTICIDE MIXTURES
CN110891923A (zh) 2017-07-10 2020-03-17 巴斯夫欧洲公司 包含脲酶抑制剂(ui)和硝化抑制剂如2-(3,4-二甲基-1h-吡唑-1-基)琥珀酸(dmpsa)或3,4-二甲基吡唑鎓乙醇酸盐(dmpg)的混合物
EP3427587A1 (en) 2017-07-10 2019-01-16 Basf Se Pesticidal mixtures
BR112020000465B1 (pt) 2017-07-11 2024-02-20 Syngenta Participations Ag Derivados oxadiazol microbiocidas
WO2019011929A1 (en) 2017-07-11 2019-01-17 Syngenta Participations Ag MICROBIOCIDE OXADIAZOLE DERIVATIVES
WO2019011928A1 (en) 2017-07-11 2019-01-17 Syngenta Participations Ag MICROBIOCIDE OXADIAZOLE DERIVATIVES
WO2019011926A1 (en) 2017-07-11 2019-01-17 Syngenta Participations Ag MICROBIOCIDE OXADIAZOLE DERIVATIVES
BR112020000371A2 (pt) 2017-07-12 2020-07-14 Syngenta Participations Ag derivados de oxadiazol microbiocidas
WO2019012001A1 (en) 2017-07-12 2019-01-17 Syngenta Participations Ag MICROBIOCIDE OXADIAZOLE DERIVATIVES
BR112020000463A2 (pt) 2017-07-13 2020-07-21 Syngenta Participations Ag derivados oxadiazol microbiocidas
WO2019016385A1 (en) 2017-07-21 2019-01-24 Basf Se BENZAMIDE COMPOUNDS AND THEIR USE AS HERBICIDES
WO2019020540A1 (en) 2017-07-26 2019-01-31 Basf Se PESTICIDE MIXTURES
WO2019030355A1 (en) 2017-08-11 2019-02-14 Syngenta Participations Ag ACTIVE PYRAZOLE DERIVATIVES ON THE PESTICIDE PLAN
US11252963B2 (en) 2017-08-11 2022-02-22 Syngenta Participations Ag Pesticidally active pyrazole derivatives
AR112672A1 (es) 2017-08-11 2019-11-27 Syngenta Participations Ag Derivados de tiofeno activos como plaguicidas
AR112673A1 (es) 2017-08-11 2019-11-27 Syngenta Participations Ag Derivados de pirazol activos como plaguicidas
AR112682A1 (es) 2017-08-17 2019-11-27 Syngenta Participations Ag Compuestos herbicidas
EP3447048A1 (en) 2017-08-23 2019-02-27 Syngenta Participations Ag Microbiocidal quinoline (thio)carboxamide derivatives
WO2019042800A1 (en) 2017-08-29 2019-03-07 Basf Se PESTICIDE MIXTURES
US20200267978A1 (en) 2017-09-13 2020-08-27 Syngenta Participations Ag Microbiocidal quinoline (thio)carboxamide derivatives
EP3681870B1 (en) 2017-09-13 2021-08-04 Syngenta Participations AG Microbiocidal quinoline (thio)carboxamide derivatives
US11185074B2 (en) 2017-09-13 2021-11-30 Syngenta Participations Ag Microbiocidal quinoline (thio)carboxamide derivatives
WO2019053024A1 (en) 2017-09-13 2019-03-21 Syngenta Participations Ag MICROBIOCIDE DERIVATIVES OF QUINOLINE (THIO) CARBOXAMIDE
CN111050558B (zh) 2017-09-13 2022-05-27 先正达参股股份有限公司 杀微生物的喹啉(硫代)羧酰胺衍生物
WO2019053027A1 (en) 2017-09-13 2019-03-21 Syngenta Participations Ag MICROBIOCIDE DERIVATIVES OF QUINOLINE (THIO) CARBOXAMIDE
US11584740B2 (en) 2017-09-13 2023-02-21 Syngenta Participations Ag Microbiocidal quinoline (thio)carboxamide derivatives
ES2975315T3 (es) 2017-09-18 2024-07-04 Syngenta Participations Ag Derivados heterocíclicos plaguicidamente activos con sustituyentes que contienen azufre
JPWO2019059244A1 (ja) 2017-09-21 2020-11-05 日本農薬株式会社 シクロプロピルピリジル基を有するベンゾイミダゾール化合物又はその塩類、及びそれらの化合物を含有する農園芸用殺虫剤並びにその使用方法
WO2019057660A1 (en) 2017-09-25 2019-03-28 Basf Se INDOLE AND AZAINDOLE COMPOUNDS HAVING 6-CHANNEL SUBSTITUTED ARYL AND HETEROARYL CYCLES AS AGROCHEMICAL FUNGICIDES
CN111148432B (zh) 2017-10-02 2021-11-23 先正达参股股份有限公司 工程化的杀有害生物蛋白和控制植物有害生物的方法
UY37913A (es) 2017-10-05 2019-05-31 Syngenta Participations Ag Derivados de picolinamida fungicidas que portan un grupo terminal cuaternario
UY37912A (es) 2017-10-05 2019-05-31 Syngenta Participations Ag Derivados de picolinamida fungicidas que portan grupos terminales heteroarilo o heteroariloxi
WO2019068820A1 (en) 2017-10-06 2019-04-11 Syngenta Participations Ag PYRROLE DERIVATIVES ACTIVE ON THE PESTICIDE PLAN
EP3692031B1 (en) 2017-10-06 2021-09-01 Syngenta Participations AG Pesticidally active pyrrole derivatives
WO2019076778A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Syngenta Participations Ag HETEROCYCLIC DERIVATIVES HAVING PESTICIDAL ACTIVITY HAVING SUBSTITUENTS CONTAINING SULFUR AND SULFONIMIDAMIDES
AR113761A1 (es) 2017-10-18 2020-06-10 Syngenta Participations Ag Control de plagas de hemípteros utilizando moléculas de arn
BR112020008096A2 (pt) 2017-10-24 2020-11-03 Basf Se método para conferir tolerância a um herbicida e planta de soja transgênica
BR112020008092A2 (pt) 2017-10-24 2020-09-15 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC método para conferir tolerância a um herbicida e planta de soja transgênica
WO2019086474A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Syngenta Participations Ag Pesticidally active mesoionics heterocyclic compounds
EP3710429B1 (en) 2017-11-15 2023-04-05 Syngenta Participations AG Microbiocidal picolinamide derivatives
CN111246738A (zh) 2017-11-15 2020-06-05 巴斯夫欧洲公司 桶混物
WO2019097054A1 (en) 2017-11-20 2019-05-23 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
EA202091234A1 (ru) 2017-11-21 2020-10-05 Зингента Партисипейшнс Аг Фунгицидные композиции
CA3079780A1 (en) 2017-11-22 2019-05-31 Basf Se Benzoxaborole compounds
CN111356693A (zh) 2017-11-23 2020-06-30 巴斯夫欧洲公司 除草的苯基醚类
CN111356684A (zh) 2017-11-23 2020-06-30 巴斯夫欧洲公司 除草的吡啶基醚类
WO2019105933A1 (en) 2017-11-29 2019-06-06 Syngenta Participations Ag Microbiocidal thiazole derivatives
CN111801012A (zh) 2017-11-29 2020-10-20 巴斯夫欧洲公司 具有增加的除草剂耐受性的植物
US20200369629A1 (en) 2017-11-29 2020-11-26 Basf Se Benzamide compounds and their use as herbicides
US11541428B2 (en) 2017-12-03 2023-01-03 Seedx Technologies Inc. Systems and methods for sorting of seeds
US11503757B2 (en) 2017-12-03 2022-11-22 Seedx Technologies Inc. Systems and methods for sorting of seeds
CN111656355B (zh) 2017-12-03 2023-08-29 种子X科技公司 种子分类的系统及方法
MX2020005759A (es) 2017-12-04 2020-08-20 Syngenta Participations Ag Derivados de fenilamidina microbicidas.
US20200392138A1 (en) 2017-12-13 2020-12-17 Syngenta Participations Ag Pesticidally active mesoionic heterocyclic compounds
CN111566087A (zh) 2017-12-19 2020-08-21 先正达参股股份有限公司 杀微生物的吡啶甲酰胺衍生物
WO2019121374A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Basf Se Herbicidal pyrimidine compounds
BR112020012211A2 (pt) 2017-12-20 2020-11-24 Sumitomo Chemical Company, Limited método para controlar organismos nocivos em safras
CA3085651A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Pi Industries Ltd. Fluoralkenyl compounds, process for preparation and use thereof
WO2019121373A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Basf Se Herbicidal pyrimidine compounds
WO2019121408A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Basf Se Herbicidal pyrimidine compounds
WO2019121352A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Basf Se Herbicidal pyrimidine compounds
KR102660151B1 (ko) 2017-12-21 2024-04-24 바스프 에스이 살충 화합물
WO2019122345A1 (en) 2017-12-22 2019-06-27 Basf Se Benzamide compounds and their use as herbicides
WO2019122347A1 (en) 2017-12-22 2019-06-27 Basf Se N-(1,2,5-oxadiazol-3-yl)-benzamide compounds and their use as herbicides
CN111566097B (zh) 2017-12-28 2024-01-26 日本农药株式会社 噁二唑化合物或其盐类及含有该化合物的农园艺用杀菌剂、以及其使用方法
EP3508480A1 (en) 2018-01-08 2019-07-10 Basf Se Benzamide compounds and their use as herbicides
GB201800305D0 (en) 2018-01-09 2018-02-21 Syngenta Participations Ag Herbicidal compounds
CA3087313A1 (en) 2018-01-09 2019-08-01 Basf Se Silylethynyl hetaryl compounds as nitrification inhibitors
WO2019138018A1 (en) 2018-01-15 2019-07-18 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
US11939587B2 (en) 2018-01-17 2024-03-26 Basf Se Plants having increased tolerance to herbicides
WO2019141552A1 (en) 2018-01-18 2019-07-25 Basf Se Herbicidal triazine compounds
EP3746439A2 (en) 2018-01-30 2020-12-09 PI Industries Ltd. Oxadiazoles for use in controlling phytopathogenic fungi
WO2019150311A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Pi Industries Ltd. 1-3 dithiol compounds and their use for the protection of crops from phytopathogenic microorganisms
US11905518B2 (en) 2018-02-12 2024-02-20 Curators Of The University Of Missouri Small auxin upregulated (SAUR) gene for the improvement of root system architecture, waterlogging tolerance, drought resistance and yield in plants and methods of uses
WO2019162309A1 (en) 2018-02-21 2019-08-29 Basf Se Benzamide compounds and their use as herbicides
WO2019162308A1 (en) 2018-02-21 2019-08-29 Basf Se Benzamide compounds and their use as herbicides
EP3530118A1 (en) 2018-02-26 2019-08-28 Basf Se Fungicidal mixtures
EP3530116A1 (en) 2018-02-27 2019-08-28 Basf Se Fungicidal mixtures comprising xemium
US12075780B2 (en) 2018-02-28 2024-09-03 Basf Se Use of alkoxypyrazoles as nitrification inhibitors
WO2019166252A1 (en) 2018-02-28 2019-09-06 Basf Se Fungicidal mixtures comprising fenpropidin
IL302719A (en) 2018-02-28 2023-07-01 Basf Se Use of N-functional alkoxy pyrazole compounds as nitrification inhibitors
CN111683528B (zh) 2018-02-28 2022-12-13 巴斯夫欧洲公司 吡唑炔丙基醚作为硝化抑制剂的用途
EP3533333A1 (en) 2018-03-02 2019-09-04 Basf Se Fungicidal mixtures comprising pydiflumetofen
EP3760621A4 (en) 2018-03-02 2021-08-25 Nihon Nohyaku Co., Ltd. AMIDE COMPOUND OR SALT THEREOF, AND AGRICULTURAL AND HORTICULTURAL MICROBICIDE CONTAINING IT, AND METHOD OF USE
EP3533331A1 (en) 2018-03-02 2019-09-04 Basf Se Fungicidal mixtures comprising pydiflumetofen
EP3536150A1 (en) 2018-03-06 2019-09-11 Basf Se Fungicidal mixtures comprising fluxapyroxad
US10470428B2 (en) 2018-03-07 2019-11-12 Basf Agricultural Solutions Seed, Us Llc Cotton variety ST 5471GLTP
US20210002232A1 (en) 2018-03-09 2021-01-07 Pi Industries Ltd. Heterocyclic compounds as fungicides
EP3539384A1 (en) 2018-03-15 2019-09-18 Basf Se 3-components mixtures comprising fluxapyroxad
AR114422A1 (es) 2018-03-30 2020-09-02 Syngenta Participations Ag Compuestos herbicidas
CN112020503A (zh) 2018-04-26 2020-12-01 先正达参股股份有限公司 杀微生物的噁二唑衍生物
US20210068395A1 (en) 2018-05-08 2021-03-11 Syngenta Crop Protection Ag Methods of applying one or more certain heteroaryl-1,2,4-triazole and heteroaryl-tetrazole compounds to control damage on plants, propagation material thereof, and plant derived products
WO2019219689A1 (en) 2018-05-18 2019-11-21 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfoximine containing substituents
CN112119069B (zh) 2018-05-22 2023-10-03 日本农药株式会社 苯并咪唑化合物或其盐类和含有该化合物的用于农业园艺的杀虫杀螨剂以及其使用方法
BR112020023915A2 (pt) 2018-05-25 2021-02-09 Syngenta Participations Ag derivados de picolinamida microbiocidas
WO2019229088A1 (en) 2018-05-30 2019-12-05 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2019229089A1 (en) 2018-05-31 2019-12-05 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
AR115495A1 (es) 2018-06-06 2021-01-27 Syngenta Crop Protection Ag Derivados heterocíclicos con sustituyentes que contienen azufre activos como plaguicidas
JP7536656B2 (ja) 2018-06-06 2024-08-20 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト スルホキシイミン含有置換基を有する殺有害生物的に活性な複素環式誘導体
GB201810047D0 (en) 2018-06-19 2018-08-01 Syngenta Participations Ag Improvements in or relating to organic compounds
WO2020002472A1 (en) 2018-06-28 2020-01-02 Basf Se Use of alkynylthiophenes as nitrification inhibitors
UY38281A (es) 2018-06-29 2020-01-31 Syngenta Participations Ag Compuestos de azol-amida pesticidamente activos
EP3814339A1 (en) 2018-06-29 2021-05-05 Syngenta Crop Protection AG Microbiocidal oxadiazole derivatives
WO2020007646A1 (en) 2018-07-02 2020-01-09 Basf Se Pesticidal mixtures
BR112020024823A2 (pt) 2018-07-02 2021-03-02 Basf Se misturas fungicidas, composição pesticida, uso da mistura e método de controle de pragas fitopatogênicas
WO2020007658A1 (en) 2018-07-02 2020-01-09 Syngenta Crop Protection Ag 3-(2-thienyl)-5-(trifluoromethyl)-1,2,4-oxadiazole derivatives as agrochemical fungicides
CN112384516A (zh) 2018-07-10 2021-02-19 日本农药株式会社 具有任选被卤代的亚烷基二氧基的苯并咪唑化合物或其盐类、以及含有这些化合物的农业园艺用杀虫剂及其使用方法
WO2020011808A1 (en) 2018-07-13 2020-01-16 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active bicyclic heteroaromatic compounds
BR112021000615A2 (pt) 2018-07-16 2021-04-13 Syngenta Crop Protection Ag Derivados oxadiazol microbiocidas
EP3826983B1 (en) 2018-07-23 2024-05-15 Basf Se Use of substituted 2-thiazolines as nitrification inhibitors
EP3826982B1 (en) 2018-07-23 2023-11-01 Basf Se Use of a substituted thiazolidine compound as nitrification inhibitor
GB201812692D0 (en) 2018-08-03 2018-09-19 Syngenta Participations Ag Microbiocidal compounds
WO2020025658A1 (en) 2018-08-03 2020-02-06 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active bicyclic heteroaromatic compounds
WO2020030503A1 (en) 2018-08-07 2020-02-13 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active bicyclic heteroaromatic compounds
EP3833187A1 (en) 2018-08-08 2021-06-16 Basf Se Use of fungicidal active compound i derivative and mixtures thereof in seed application and treatment methods
EP3835290B1 (en) 2018-08-08 2023-09-06 Nihon Nohyaku Co., Ltd. Oxadiazoline compound or salt thereof, agricultural or horticultural bactericide containing said compound, and use method therefor
WO2020030754A1 (en) 2018-08-10 2020-02-13 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active mesoionic bicyclic heteroaromatic compounds
WO2020035826A1 (en) 2018-08-17 2020-02-20 Pi Industries Ltd. 1,2-dithiolone compounds and use thereof
WO2020035565A1 (en) 2018-08-17 2020-02-20 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active mesoionic bicyclic heteroaromatic compounds
WO2020043470A1 (en) 2018-08-27 2020-03-05 Basf Se Aqueous compositions of topramezone
UY38367A (es) 2018-09-13 2020-04-30 Syngenta Participations Ag Compuestos de azol-amida pesticidamente activos
TW202019901A (zh) 2018-09-13 2020-06-01 瑞士商先正達合夥公司 殺有害生物活性唑-醯胺化合物
WO2020058009A1 (en) 2018-09-18 2020-03-26 Basf Se Diaminotriazine compounds
US11440888B2 (en) 2018-09-19 2022-09-13 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal quinoline carboxamide derivatives
BR112021003324A2 (pt) 2018-09-19 2021-05-11 Basf Se misturas de pesticidas, composições, métodos de combate ou controle de pragas invertebradas, de proteção de plantas em crescimento e de proteção de material de propagação vegetal, uso de mistura de pesticidas e semente
WO2020064492A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Basf Se Method of controlling pests by seed treatment application of a mesoionic compound or mixture thereof
MX2021003427A (es) 2018-10-01 2021-06-15 Pi Industries Ltd Nuevos oxadiazoles.
AR116557A1 (es) 2018-10-01 2021-05-19 Pi Industries Ltd Oxadiazoles
WO2020070049A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Syngenta Participations Ag Pesticidally active benzene- and azine-amide compounds
WO2020069876A1 (en) 2018-10-03 2020-04-09 Basf Se Microemulsion compositions of topramezone
JP2022504304A (ja) 2018-10-06 2022-01-13 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー 殺微生物性キノリンジヒドロ－（チアジン）オキサジン誘導体
WO2020070132A1 (en) 2018-10-06 2020-04-09 Syngenta Participations Ag Microbiocidal quinoline dihydro-(thiazine)oxazine derivatives
GB201816459D0 (en) 2018-10-09 2018-11-28 Syngenta Participations Ag Improvements in or relating to organic compounds
GB201816931D0 (en) 2018-10-17 2018-11-28 Syngenta Participations Ag Improvements in or relating to organic compounds
CN113195462A (zh) 2018-10-17 2021-07-30 先正达农作物保护股份公司 杀微生物的噁二唑衍生物
AR116628A1 (es) 2018-10-18 2021-05-26 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos microbiocidas
WO2020078794A1 (en) 2018-10-19 2020-04-23 Basf Se Ternary mixtures containing fenpropimorph, azoles and a multiside fungicide
JP2022505376A (ja) 2018-10-19 2022-01-14 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー 殺有害生物活性アゾール－アミド化合物
BR112021006011A2 (pt) 2018-10-19 2021-06-29 Basf Se misturas fungicidas, composição pesticida, uso da mistura e método para controlar pragas fitopatogênicas
BR112021006019A2 (pt) 2018-10-19 2021-06-29 Basf Se misturas fungicidas, composição pesticida, uso da mistura e método para controlar pragas fitopatogênicas
EP3643175A1 (en) 2018-10-24 2020-04-29 Basf Se Ternary pesticidal mixtures containing metyltetraprole and fenpropimorph
EP3643705A1 (en) 2018-10-24 2020-04-29 Basf Se Pesticidal compounds
TW202035404A (zh) 2018-10-24 2020-10-01 瑞士商先正達農作物保護公司 具有含亞碸亞胺的取代基之殺有害生物活性雜環衍生物
BR112021007905A2 (pt) 2018-11-02 2021-08-03 Nihon Nohyaku Co., Ltd. composição de controle de organismo prejudicial e método para uso da mesma
GB201818013D0 (en) 2018-11-05 2018-12-19 Syngenta Participations Ag Improvements in or relating to organic compunds
BR112021008675A2 (pt) 2018-11-05 2021-08-10 Syngenta Participations Ag compostos de azole-amida pesticidamente ativos
WO2020095161A1 (en) 2018-11-05 2020-05-14 Pi Industries Ltd. Nitrone compounds and use thereof
GB201818348D0 (en) 2018-11-12 2018-12-26 Syngenta Participations Ag Herbicidal compounds
GB201818349D0 (en) 2018-11-12 2018-12-26 Syngenta Participations Ag Herbicidal compounds
GB201818350D0 (en) 2018-11-12 2018-12-26 Syngenta Participations Ag Herbicidal compounds
JP2022507262A (ja) 2018-11-12 2022-01-18 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 除草化合物
US20220002284A1 (en) 2018-11-28 2022-01-06 Basf Se Pesticidal compounds
AR117183A1 (es) 2018-11-30 2021-07-14 Syngenta Crop Protection Ag Derivados de tiazol microbiocidas
AR117200A1 (es) 2018-11-30 2021-07-21 Syngenta Participations Ag Derivados de tiazol microbiocidas
WO2020120694A1 (en) 2018-12-14 2020-06-18 Syngenta Participations Ag Pesticidally-active bicyclic heteroaromatic compounds
AR117291A1 (es) 2018-12-14 2021-07-28 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos heterocíclicos de cianamida con actividad pesticida
WO2020126584A1 (en) 2018-12-18 2020-06-25 Basf Agrochemical Products B.V. Herbicidal combinations
EP3897151A1 (en) 2018-12-18 2021-10-27 BASF Agrochemical Products B.V. Herbicidal composition
EA202191606A1 (ru) 2018-12-18 2021-10-26 Басф Агрокемикэл Продактс Б.В. Гербицидные комбинации
WO2020126579A1 (en) 2018-12-18 2020-06-25 Basf Agrochemical Products B.V. Herbicidal combinations
EA202191655A1 (ru) 2018-12-18 2021-11-01 Басф Агрокемикэл Продактс Б.В. Гербицидные комбинации
WO2020126582A1 (en) 2018-12-18 2020-06-25 Basf Agrochemical Products B.V. Herbicidal combinations
GB201820671D0 (en) 2018-12-19 2019-01-30 Syngenta Participations Ag Herbicidal compositions
GB201821036D0 (en) 2018-12-21 2019-02-06 Syngenta Participations Ag Nematicidal compositions
WO2020127345A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Syngenta Participations Ag Pesticidally active pyrazole derivatives
WO2020141135A1 (en) 2018-12-31 2020-07-09 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2020141136A1 (en) 2018-12-31 2020-07-09 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
EP3680223A1 (en) 2019-01-10 2020-07-15 Basf Se Mixture comprising an urease inhibitor (ui) and a nitrification inhibitor (ni) such as an ni mixture comprising 2-(3,4-dimethyl-1h-pyrazol-1-yl)succinic acid (dmpsa) and dicyandiamide (dcd)
AR117990A1 (es) 2019-02-06 2021-09-08 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos herbicidas
WO2020161209A1 (en) 2019-02-06 2020-08-13 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal fused pyridazine compounds
GB201901617D0 (en) 2019-02-06 2019-03-27 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
WO2020161208A1 (en) 2019-02-06 2020-08-13 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal fused pyridazine compounds
WO2020161138A1 (en) 2019-02-07 2020-08-13 Syngenta Crop Protection Ag Pyridazinium compounds for use in controlling unwanted plant growth
GB201901760D0 (en) 2019-02-08 2019-03-27 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
GB201901757D0 (en) 2019-02-08 2019-03-27 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
GB201901866D0 (en) 2019-02-11 2019-04-03 Syngenta Crop Protection Ag Pre-harvest desiccation method
GB201901808D0 (en) 2019-02-11 2019-03-27 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
GB201901878D0 (en) 2019-02-11 2019-04-03 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
GB201901961D0 (en) 2019-02-13 2019-04-03 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
WO2020164993A1 (en) 2019-02-13 2020-08-20 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active pyrazole derivatives
WO2020164994A1 (en) 2019-02-13 2020-08-20 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active pyrazole derivatives
GB201902013D0 (en) 2019-02-14 2019-04-03 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
GB201902064D0 (en) 2019-02-14 2019-04-03 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
GB201902107D0 (en) 2019-02-15 2019-04-03 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
BR112021016007A2 (pt) 2019-02-15 2021-10-05 Syngenta Crop Protection Ag Composições herbicidas
EP3923723A1 (en) 2019-02-15 2021-12-22 Syngenta Crop Protection AG Herbicidal compositions
WO2020164920A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
WO2020165403A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Syngenta Crop Protection Ag Phenyl substituted thiazole derivatives as microbiocidal compounds
KR20210132670A (ko) 2019-02-15 2021-11-04 신젠타 크롭 프로텍션 아게 제초성 조성물
EP3923724B1 (en) 2019-02-15 2023-07-26 Syngenta Crop Protection AG Herbicidal compositions
WO2020169526A1 (en) 2019-02-18 2020-08-27 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active cyanamide heterocyclic compounds
EP3696175A1 (en) 2019-02-18 2020-08-19 Syngenta Crop Protection AG Pesticidally active azole-amide compounds
CA3129325A1 (en) 2019-02-20 2020-08-27 Syngenta Crop Protection Ag Engineered cry1 pesticidal proteins and method of controlling plant pests
EP3698632A1 (en) 2019-02-21 2020-08-26 Basf Se Pesticidal mixtures
GB201902383D0 (en) 2019-02-21 2019-04-10 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
GB201902438D0 (en) 2019-02-22 2019-04-10 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
EP3698633A1 (en) 2019-02-25 2020-08-26 Basf Se Pesticidal mixtures
EP3698634A1 (en) 2019-02-25 2020-08-26 Basf Se Pesticidal mixtures
TW202100015A (zh) 2019-02-28 2021-01-01 瑞士商先正達農作物保護公司 具有含硫取代基之殺有害生物活性雜環衍生物
TW202045011A (zh) 2019-02-28 2020-12-16 瑞士商先正達農作物保護公司 具有含硫取代基之殺有害生物活性雜環衍生物
GB201903000D0 (en) 2019-03-06 2019-04-17 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
BR112021017698A2 (pt) 2019-03-08 2021-11-16 Syngenta Crop Protection Ag Derivados heterocíclicos ativos em termos pesticidas com substituintes contendo enxofre
WO2020182649A1 (en) 2019-03-08 2020-09-17 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active azole-amide compounds
WO2020181354A1 (en) 2019-03-14 2020-09-17 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Endogenous plant expression enhancer
BR112021018495A2 (pt) 2019-03-20 2021-11-30 Syngenta Crop Protection Ag Compostos de azolamida ativos em termos pesticidas
BR112021018501A2 (pt) 2019-03-20 2021-11-30 Syngenta Crop Protection Ag Compostos de azolamida ativos em termos pesticidas
WO2020193341A1 (en) 2019-03-22 2020-10-01 Syngenta Crop Protection Ag N-[1-(5-bromo-2-pyrimidin-2-yl-1,2,4-triazol-3-yl)ethyl]-2-cyclopropyl-6-(trifluoromethyl)pyridine-4-carboxamide derivatives and related compounds as insecticides
GB201903993D0 (en) 2019-03-22 2019-05-08 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
GB201903942D0 (en) 2019-03-22 2019-05-08 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal compounds
WO2020193618A1 (en) 2019-03-27 2020-10-01 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal thiazole derivatives
AR118478A1 (es) * 2019-03-28 2021-10-06 Syngenta Crop Protection Ag Modulación de expresión transgénica
UY38623A (es) 2019-03-29 2020-10-30 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos de diazina-amida activos como pesticidas
BR112021019603A2 (pt) 2019-04-01 2021-11-30 Nissan Chemical Corp Composto de piridazinona e herbicida
CN113661165A (zh) 2019-04-05 2021-11-16 先正达农作物保护股份公司 杀有害生物活性的二嗪-酰胺化合物
AU2020270549A1 (en) 2019-04-08 2021-09-30 Pi Industries Limited Novel oxadiazole compounds for controlling or preventing phytopathogenic fungi
AU2020272217A1 (en) 2019-04-08 2021-10-07 Pi Industries Limited Novel oxadiazole compounds for controlling or preventing phytopathogenic fungi
WO2020208509A1 (en) 2019-04-08 2020-10-15 Pi Industries Limited Novel oxadiazole compounds for controlling or preventing phytopathogenic fungi
WO2020208095A1 (en) 2019-04-10 2020-10-15 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal picolinamide derivatives
CA3131861A1 (en) 2019-04-11 2020-10-15 Jurgen Harry Schaetzer Pesticidally active diazine-amide compounds
EP3730489A1 (en) 2019-04-25 2020-10-28 Basf Se Heteroaryl compounds as agrochemical fungicides
GB201907231D0 (en) 2019-05-22 2019-07-03 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal composition
US12116370B2 (en) 2019-05-27 2024-10-15 Nihon Nohyaku Co., Ltd. Condensed heterocyclic compound having a bridgehead nitrogen atom or salt thereof, agricultural or horticultural insecticide comprising the compound, and method for using the insecticide
EP3744174A1 (en) 2019-05-27 2020-12-02 Basf Se Use of metyltetraprol and mixtures of metyltetraprol for combating phytopathogenic fungi on cotton
US20230192628A1 (en) 2019-05-29 2023-06-22 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal derivatives
AU2020281612A1 (en) 2019-05-29 2021-12-23 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
WO2020239855A1 (en) 2019-05-29 2020-12-03 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal derivatives
AR119009A1 (es) 2019-05-29 2021-11-17 Syngenta Crop Protection Ag Derivados de alcoxipiridina y alcoxipirimidina microbicidas
AR119011A1 (es) 2019-05-29 2021-11-17 Syngenta Crop Protection Ag DERIVADOS DE [1,3]DIOXOLO[4,5-c]PIRIDIN-4-CARBOXAMIDA, COMPOSICIONES AGROQUÍMICAS QUE LOS COMPRENDEN Y SU EMPLEO COMO FUNGICIDA PARA CONTROLAR O PREVENIR LA INFESTACIÓN DE PLANTAS ÚTILES
WO2020254530A1 (en) 2019-06-18 2020-12-24 Syngenta Crop Protection Ag 7-sulfonyl-n-(1,3,4-thiadiazol-2-yl)-quinoxaline-6-carboxamide derivatives and the respective -benzimidazole-5-, -imidazo[4,5-b]pyridine-5-, -3h-furo[3,2b]pyridine-5-, -quinoline-2-, and -naphthalene-2-carboxamide derivatives as pesticides
JP7485667B2 (ja) 2019-06-21 2024-05-16 日本農薬株式会社 オキサジアゾール化合物又はその塩類及び該化合物を含有する農園芸用殺菌剤並びにその使用方法
CN114072384A (zh) 2019-07-05 2022-02-18 先正达农作物保护股份公司 杀微生物的吡啶酰胺衍生物
GB201910040D0 (en) 2019-07-12 2019-08-28 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
GB201910037D0 (en) 2019-07-12 2019-08-28 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal compounds
GB201910168D0 (en) 2019-07-16 2019-08-28 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
GB201910166D0 (en) 2019-07-16 2019-08-28 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
WO2021009311A1 (en) 2019-07-17 2021-01-21 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
GB201910290D0 (en) 2019-07-18 2019-09-04 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
GB201910291D0 (en) 2019-07-18 2019-09-04 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
EP3766879A1 (en) 2019-07-19 2021-01-20 Basf Se Pesticidal pyrazole derivatives
GB201910641D0 (en) 2019-07-25 2019-09-11 Syngenta Crop Protection Ag Improvments in or relating to organic compounds
CA3148950A1 (en) 2019-07-30 2021-02-04 The State Of Israel, Ministry Of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization (A.R.O.), Volcani Center Methods of controlling cannabinoid synthesis in plants or cells and plants and cells produced thereby
GB201910930D0 (en) 2019-07-31 2019-09-11 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
GB201910940D0 (en) 2019-07-31 2019-09-11 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to oranic compounds
GB201910926D0 (en) 2019-07-31 2019-09-11 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
CN114144419B (zh) 2019-08-09 2023-11-21 日本农药株式会社 氧氮杂环庚三烯酮衍生物及含有该衍生物的农园艺用杀虫剂以及其使用方法
AR119774A1 (es) 2019-08-19 2022-01-12 Pi Industries Ltd Compuestos de oxadiazol que contienen un anillo heteroaromático de 5 miembros para controlar o prevenir hongos fitopatogénicos
BR112022003375A2 (pt) 2019-08-23 2022-05-17 Syngenta Crop Protection Ag Compostos de pirazina-amida pesticidamente ativos
US20220287301A1 (en) 2019-09-03 2022-09-15 Basf Se Polymers for spray drift control of pesticide spray
AU2020346578B2 (en) 2019-09-12 2023-07-13 Nihon Nohyaku Co., Ltd. Agricultural or horticultural insecticide or animal ectoparasite or endoparasite control agent each comprising an imidazopyridazine compound having a substituted cyclopropane-oxadiazole group or a salt thereof as active ingredient, and method for using the insecticide or the control agent
EP4029571A4 (en) 2019-09-12 2023-09-20 Nihon Nohyaku Co., Ltd. AGRICULTURAL AND HORTICULTURAL INSECTICIDE PRODUCT USING AS ACTIVE INGREDIENT A CONDENSED HETEROCYCLE COMPOUND HAVING A SUBSTITUTED OXADIAZOLE CYCLOPROPANE GROUP OR SALTS THEREOF, PEST CONTROL AGENT AGAINST ECTOPARASITES AND ENDOPARASITES IN ANIMALS, AS WELL AS PROCEDURES USAGE DESCRIPTIONS THESE
BR112022003014A2 (pt) 2019-09-12 2022-05-10 Nihon Nohyaku Co Ltd Composto de imidazopiridazina, inseticida agrícola ou hortícola, método para uso do mesmo, agente de controle de ectoparasita ou endoparasita animal e método para uso do mesmo
WO2021053110A1 (en) 2019-09-20 2021-03-25 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur and sulfoximine containing substituents
UY38885A (es) 2019-09-20 2021-04-30 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos de azetidinil-, pirrolidinil-,piperdinil- o piperazinil-piridinil carbonilo pesticidamente activos
GB201913752D0 (en) 2019-09-24 2019-11-06 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
GB201914277D0 (en) 2019-10-03 2019-11-20 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
WO2021084526A1 (en) 2019-10-31 2021-05-06 Yeda Research And Development Co. Ltd. Engineered autotrophic bacteria for co2 conversion to organic materials
MX2022005219A (es) 2019-11-01 2022-06-08 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos heteroaromaticos biciclicos condensados activos como pesticidas.
WO2021092130A1 (en) 2019-11-05 2021-05-14 Pairwise Plants Services, Inc. Compositions and methods for rna-encoded dna-replacement of alleles
CN114616231A (zh) 2019-11-07 2022-06-10 日本农药株式会社 噁二唑啉化合物或其盐类及含有该化合物的农园艺用杀菌剂、以及其使用方法
AR120374A1 (es) 2019-11-08 2022-02-09 Pi Industries Ltd Compuestos de oxadiazol que contienen anillos de heterociclilo fusionados para controlar o prevenir hongos fitopatogénicos
EP4058477A2 (en) 2019-11-11 2022-09-21 IBI-AG Innovative Bio Insecticides Ltd. Insect control nanobodies and uses thereof
GB201916601D0 (en) 2019-11-14 2020-01-01 Syngenta Crop Protection Ag 81989-gb-reg-org-nat-1
GB201916600D0 (en) 2019-11-14 2020-01-01 Syngenta Crop Protection Ag 81991-gb-reg-org-nat-1
GB201916676D0 (en) 2019-11-15 2020-01-01 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
CA3152433A1 (en) 2019-11-15 2021-05-20 Claude Taranta Methods of using a composition comprising an anionic pesticide and a buffer
AR120445A1 (es) 2019-11-15 2022-02-16 Syngenta Crop Protection Ag N-tetrazolil o n-1,3,4-oxadiazolil benzamidas como herbicidas
BR112022010388A2 (pt) 2019-11-28 2022-10-25 Nihon Nohyaku Co Ltd Composto de benzimidazol ou sal deste, agente inseticida e acaricida agrícola e hortícola que contém o referido composto e método para sua utilização
CN115003666A (zh) 2019-12-04 2022-09-02 先正达农作物保护股份公司 杀有害生物活性的稠合二环杂芳香族氨基化合物
GB201917898D0 (en) 2019-12-06 2020-01-22 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
US11976278B2 (en) 2019-12-06 2024-05-07 Pairwise Plants Services, Inc. Recruitment methods and compounds, compositions and systems for recruitment
WO2021122645A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active azole-amide compounds
AU2020406507A1 (en) 2019-12-20 2022-06-30 Basf Corporation Low volatile polyamine salts of anionic pesticides
US20230039941A1 (en) 2019-12-23 2023-02-09 Basf Se Enzyme enhanced root uptake of agrochemical active compound
WO2021136722A1 (en) 2019-12-31 2021-07-08 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
GB202000011D0 (en) 2020-01-02 2020-02-19 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
TW202132300A (zh) 2020-01-06 2021-09-01 瑞士商先正達農作物保護公司 具有含硫取代基的殺有害生物活性雜環衍生物
WO2021144354A1 (en) 2020-01-15 2021-07-22 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active bicyclic heteroaromatic compounds
US20230063109A1 (en) 2020-01-16 2023-03-02 Basf Se Mixtures comprising nitrification inhibitors and carriers
EP4406929A3 (en) 2020-01-16 2024-10-02 Basf Se Mixtures comprising a solid carrier comprising an urease inhibitor and a further solid carrier comprising a nitrification inhibitor
US20230131903A1 (en) 2020-01-24 2023-04-27 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active fused bicyclic heteroaromatic compounds
WO2021155109A1 (en) 2020-01-30 2021-08-05 Pairwise Plants Services, Inc. Compositions, systems, and methods for base diversification
US20230142606A1 (en) 2020-01-30 2023-05-11 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active fused bicyclic heteroaromatic amino compounds
CA3165291A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Pairwise Plants Services, Inc. Suppression of shade avoidance response in plants
US20230063560A1 (en) 2020-02-04 2023-03-02 Pairwise Plans Services, Inc. Thornless and/or prickleless rubus plants
WO2021160680A1 (en) 2020-02-11 2021-08-19 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active cyclic amine compounds
BR112022015753A2 (pt) 2020-02-11 2022-10-11 Syngenta Crop Protection Ag Método de controle de fungos
EP4107274A1 (en) 2020-02-21 2022-12-28 Pairwise Plants Services, Inc. Improved resistance to soybean cyst nematode through gene editing
WO2021170881A1 (en) 2020-02-27 2021-09-02 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active diazine-bisamide compounds
WO2021175822A1 (en) 2020-03-02 2021-09-10 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally amidine-substituted benzoic acid amide compounds
US20230096145A1 (en) 2020-03-13 2023-03-30 Syngenta Crop Protection Ag Methods of controlling or preventing infestation of plants by the phytopathogenic microorganism corynespora cassiicola
BR112022018269A2 (pt) 2020-03-13 2022-12-27 Syngenta Crop Protection Ag Métodos de controle ou prevenção de infestação de plantas pelo microrganismo fitopatogênico corynespora cassiicola
EP4117436A1 (en) 2020-03-13 2023-01-18 Syngenta Crop Protection AG Methods of controlling or preventing infestation of plants by the phytopathogenic microorganism corynespora cassiicola
WO2021180976A1 (en) 2020-03-13 2021-09-16 Syngenta Crop Protection Ag Methods of controlling or preventing infestation of plants by the phytopathogenic microorganism corynespora cassiicola, cercospora sojina and/or cercospora kikuchii
EP4117433A1 (en) 2020-03-13 2023-01-18 Syngenta Crop Protection AG Methods of controlling or preventing infestation of plants by the phytopathogenic microorganism corynespora cassiicola
EP4117435A1 (en) 2020-03-13 2023-01-18 Syngenta Crop Protection AG Methods of controlling or preventing infestation of plants by the phytopathogenic microorganism corynespora cassiicola
US20210292754A1 (en) 2020-03-16 2021-09-23 Pairwise Plants Services, Inc. Natural guide architectures and methods of making and using the same
US11999946B2 (en) 2020-03-26 2024-06-04 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for controlling meristem size for crop improvement
US11882808B2 (en) 2020-03-27 2024-01-30 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for improving resistance to soybean rust
WO2021197885A1 (en) 2020-04-01 2021-10-07 Basf Se Ternary mixtures containing fenpropimorph, azoles and strobilurins
BR112022019796A2 (pt) 2020-04-01 2022-11-16 Basf Se Misturas fungicidas, composição pesticida, uso da mistura e método para controlar pragas fitopatogênicas
CN115426880A (zh) 2020-04-02 2022-12-02 巴斯夫公司 麦草畏的水性制剂
BR112022020134A2 (pt) 2020-04-06 2022-11-22 Basf Corp Composição agroquímica aquosa, métodos para produzir a composição agroquímica, para controlar vegetação indesejada e para reduzir a deriva de pulverização e composição adjuvante
US20230175006A1 (en) 2020-04-06 2023-06-08 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for increasing resistance to ear rot and stem rot disease in maize
CN115443273A (zh) 2020-04-08 2022-12-06 先正达农作物保护股份公司 杀微生物喹啉二氢-(噻嗪)噁嗪衍生物
GB202005175D0 (en) 2020-04-08 2020-05-20 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
AR121734A1 (es) 2020-04-08 2022-07-06 Syngenta Crop Protection Ag Derivados microbicidas de tipo dihidropirrolopirazina de quinolina
AR121733A1 (es) 2020-04-08 2022-07-06 Syngenta Crop Protection Ag Derivados microbiocidas de tipo dihidro-(tiazina)oxazina de quinolina
EP4135512A1 (en) 2020-04-16 2023-02-22 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for controlling meristem size for crop improvement
PL4136080T3 (pl) 2020-04-17 2024-08-12 Syngenta Crop Protection Ag Związki herbicydowe
WO2021213929A1 (en) 2020-04-20 2021-10-28 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active substituted 1,3-dihydro-2h-imidazo[4,5-c]pyridin-2-one derivatives with sulfur containing substituents
WO2021219513A1 (en) 2020-04-28 2021-11-04 Basf Se Pesticidal compounds
JP2023523456A (ja) 2020-04-30 2023-06-05 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 硫黄含有置換基を有する殺有害生物的に活性な複素環式誘導体
GB202006386D0 (en) 2020-04-30 2020-06-17 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal Compounds
GB202006399D0 (en) 2020-04-30 2020-06-17 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal compounds
GB202006480D0 (en) 2020-05-01 2020-06-17 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal compounds
GB202006606D0 (en) 2020-05-05 2020-06-17 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal compounds
WO2021224409A1 (en) 2020-05-06 2021-11-11 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
CN116096230A (zh) 2020-06-02 2023-05-09 成对植物服务股份有限公司 控制分生组织大小以改良作物的方法
EP4161924A1 (en) 2020-06-03 2023-04-12 Syngenta Crop Protection AG Microbiocidal derivatives
JP2023527894A (ja) 2020-06-03 2023-06-30 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 殺菌性組成物
IL297927A (en) 2020-06-03 2023-01-01 Syngenta Crop Protection Ag Fungicides
AR122485A1 (es) 2020-06-04 2022-09-14 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas
AR122199A1 (es) 2020-06-04 2022-08-24 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas
AR122187A1 (es) 2020-06-04 2022-08-24 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas
BR112022023774A2 (pt) 2020-06-04 2022-12-20 Syngenta Crop Protection Ag Composição fungicida compreendendo um depsipeptídeo cíclico
AR122484A1 (es) 2020-06-04 2022-09-14 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas
AR122189A1 (es) 2020-06-04 2022-08-24 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas
IL298987A (en) 2020-06-15 2023-02-01 Basf Se A stable concentrate without solvents that turns into an emulsion
BR112022025598A2 (pt) 2020-06-17 2023-01-03 Pairwise Plants Services Inc Métodos para controlar o tamanho do meristema para melhoria da safra
BR112022025816A2 (pt) 2020-06-26 2023-01-10 Nihon Nohyaku Co Ltd Derivado de ariltetra-hidropiridina ou sal do mesmo, agente inseticida contendo o composto e método de uso do mesmo
WO2021261563A1 (ja) 2020-06-26 2021-12-30 日本農薬株式会社 アリールテトラヒドロピリダジン誘導体又はその塩類及び該化合物を含有する殺虫剤並びにその使用方法
CA3187135A1 (en) 2020-06-30 2022-01-06 Pairwise Plants Services, Inc. Compositions, systems, and methods for base diversification
CN116234444A (zh) 2020-07-06 2023-06-06 皮埃企业有限公司 包含硫杂环丁烷氧基化合物、其氧化物或其盐的具有杀虫活性的混合物
GB202011068D0 (en) 2020-07-17 2020-09-02 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
WO2022013417A1 (en) 2020-07-17 2022-01-20 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2022017975A1 (en) 2020-07-18 2022-01-27 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
TW202220557A (zh) 2020-07-27 2022-06-01 印度商皮埃企業有限公司 包含吡唑並吡啶鄰氨基苯甲酰胺化合物、其氧化物或鹽的農藥活性混合物
AR123264A1 (es) 2020-08-18 2022-11-16 Pi Industries Ltd Nuevos compuestos heterocíclicos para combatir los hongos fitopatógenos
US20220112473A1 (en) 2020-08-28 2022-04-14 Pairwise Plants Services, Inc. Engineered proteins and methods of use thereof
JP2023540480A (ja) 2020-08-31 2023-09-25 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 硫黄含有置換基を有する殺有害生物的に活性な複素環式誘導体
AR123414A1 (es) 2020-09-01 2022-11-30 Syngenta Crop Protection Ag Derivados de isoindolin-1-ona o 7h-pirrolo[3,4-b]piridin-5-ona activos como plaguicidas con sustituyentes que contienen azufre
US20230303565A1 (en) 2020-09-02 2023-09-28 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
US20230265102A1 (en) 2020-09-02 2023-08-24 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
UY39411A (es) 2020-09-09 2022-04-29 Syngenta Crop Protection Ag Derivados de indazolil pirazolo[3,4-c] piridina pesticídicamente activos con sustituyentes que contienen azufre
GB202014303D0 (en) 2020-09-11 2020-10-28 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
UY39423A (es) 2020-09-15 2022-03-31 Pi Industries Ltd Nuevos compuestos de picolinamida para combatir hongos fitopatógenos
WO2022058878A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 Pi Industries Limited Novel picolinamide compounds for combating phytopathogenic fungi
GB202014840D0 (en) 2020-09-21 2020-11-04 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal compounds
AR123594A1 (es) 2020-09-26 2022-12-21 Pi Industries Ltd Compuestos nematicidas y uso de los mismos
KR20230113283A (ko) 2020-10-05 2023-07-28 프로탈릭스 리미티드 다이서-유사 넉아웃 식물 세포
WO2022073797A1 (en) 2020-10-08 2022-04-14 Basf Se Mixtures containing cyclobutrifluram
GB202016569D0 (en) 2020-10-19 2020-12-02 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
GB202016568D0 (en) 2020-10-19 2020-12-02 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
KR20230106633A (ko) 2020-11-06 2023-07-13 페어와이즈 플랜츠 서비시즈, 인크. 대립유전자의 rna-코딩된 dna-대체를 위한 조성물 및 방법
WO2022101265A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active fused bicyclic heteroaromatic compounds
GB202017990D0 (en) 2020-11-16 2020-12-30 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
US20240124432A1 (en) 2020-11-24 2024-04-18 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
EP4255189B1 (en) 2020-12-01 2024-10-30 Basf Se Mixtures containing metarylpicoxamid
WO2022128554A1 (en) 2020-12-15 2022-06-23 Basf Se Mixtures containing n-methoxy-n-[[4-[5-(trifluoromethyl)-1,2,4-oxadiazol-3-yl]phenyl]methyl]cyclopropanecarboxamide
AR124335A1 (es) 2020-12-18 2023-03-15 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos herbicidas
EP4018830A1 (en) 2020-12-23 2022-06-29 Basf Se Pesticidal mixtures
UY39612A (es) 2021-01-21 2022-08-31 Syngenta Crop Protection Ag Derivados heterocíclicos activos como plaguicidas con sustituyentes que contienen azufre
JP2024506253A (ja) 2021-01-23 2024-02-13 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 殺有害生物的に有効な芳香族複素環式化合物
KR20230137954A (ko) 2021-01-27 2023-10-05 바스프 에스이 디아미노트리아진 화합물
US20240101521A1 (en) 2021-01-27 2024-03-28 Basf Se Diaminotriazine compounds
CA3206495A1 (en) 2021-02-02 2022-08-11 Alexander Wissemeier Synergistic action of dcd and alkoxypyrazoles as nitrification inhibitors
CA3210785A1 (en) 2021-02-11 2022-08-18 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying cytokinin oxidase levels in plants
GB202102147D0 (en) 2021-02-16 2021-03-31 Syngenta Crop Protection Ag New use
US20240315245A1 (en) 2021-02-19 2024-09-26 Syngenta Crop Protection Ag Insect and acarina pest control
EP4294187A1 (en) 2021-02-19 2023-12-27 Syngenta Crop Protection AG Insect and acarina pest control
CN117203227A (zh) 2021-02-25 2023-12-08 成对植物服务股份有限公司 用于修饰植物中根结构的方法和组合物
WO2022180096A1 (en) 2021-02-26 2022-09-01 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidal compositions
AR124935A1 (es) 2021-03-01 2023-05-24 Syngenta Crop Protection Ag Formulaciones plaguicidas
CN116917276A (zh) 2021-03-01 2023-10-20 日本农药株式会社 具有磺酰胺基的缩合杂环化合物或其盐类及含有该化合物或其盐类的农业园艺用杀虫剂或者动物用的外部或内部寄生虫防除剂以及其使用方法
WO2022200364A1 (en) 2021-03-25 2022-09-29 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
AU2022251771A1 (en) 2021-03-27 2023-09-21 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal isonicotinic amide derivatives
EP4313966A1 (en) 2021-03-30 2024-02-07 Syngenta Crop Protection AG Pesticidally active cyclic amine compounds
EP4066643A1 (en) 2021-03-30 2022-10-05 Basf Se Pesticidal mixtures
UY39696A (es) 2021-03-31 2022-10-31 Syngenta Crop Protection Ag Derivados microbiocidas de quinolin/quinoxalin-benzotiazina como agentes fungicidas, en particular c
GB202104745D0 (en) 2021-04-01 2021-05-19 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
EP4320122A1 (en) 2021-04-07 2024-02-14 Syngenta Crop Protection AG Herbicidal compounds
AR125342A1 (es) 2021-04-16 2023-07-05 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos de amina cíclica activos como plaguicidas
KR20230173134A (ko) 2021-04-20 2023-12-26 신젠타 크롭 프로텍션 아게 살미생물 퀴놀린/퀴녹살린 이소퀴놀린 유도체
UY39755A (es) 2021-05-05 2022-11-30 Pi Industries Ltd Nuevos compuestos heterocíclicos condensados para combatir hongos fitopatógenos.
EP4334296A1 (en) 2021-05-07 2024-03-13 Syngenta Crop Protection AG Herbicidal compounds
EP4337651A1 (en) 2021-05-10 2024-03-20 Syngenta Crop Protection AG Substituted benzamides as herbicides
AU2022274138A1 (en) 2021-05-10 2023-11-09 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
EP4337016A1 (en) 2021-05-14 2024-03-20 Syngenta Crop Protection AG Seed treatment compositions
GB202106945D0 (en) 2021-05-14 2021-06-30 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
US20240260577A1 (en) 2021-05-14 2024-08-08 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
EP4091449A1 (en) 2021-05-19 2022-11-23 Syngenta Crop Protection AG Weed control method
WO2022243158A1 (en) 2021-05-19 2022-11-24 Syngenta Crop Protection Ag Thiophene derivatives and weed control method
US20240251792A1 (en) 2021-05-19 2024-08-01 Syngenta Crop Protection Ag Weed control method
EP4091450A1 (en) 2021-05-19 2022-11-23 Syngenta Crop Protection AG 3,3-difluoro-2-oxoindoline derivatives useful in weed control
CA3219022A1 (en) 2021-05-21 2022-11-24 Barbara Nave Use of ethynylpyridine compounds as nitrification inhibitors
CA3219128A1 (en) 2021-05-21 2022-11-24 Barbara Nave Use of an n-functionalized alkoxy pyrazole compound as nitrification inhibitor
EP4094579A1 (en) 2021-05-28 2022-11-30 Basf Se Pesticidal mixtures comprising metyltetraprole
MX2023014375A (es) 2021-06-01 2023-12-15 Syngenta Crop Protection Ag Derivados de tetrahidroisoquinolina microbiocida.
JP2024520657A (ja) 2021-06-02 2024-05-24 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト スルホキシイミン含有置換基を有する殺有害生物的に活性な複素環式誘導体
WO2022260849A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Nant Holdings Ip, Llc Methods and systems for producing a protein of interest in a plant
EP4352050A1 (en) 2021-06-09 2024-04-17 Syngenta Crop Protection AG Pesticidally active diazine-amide compounds
US20220403475A1 (en) 2021-06-14 2022-12-22 Pairwise Plants Services, Inc. Reporter constructs, compositions comprising the same, and methods of use thereof
CA3223995A1 (en) 2021-06-17 2022-12-22 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of growth regulating factor family transcription factors in soybean
EP4358725A1 (en) 2021-06-21 2024-05-01 Basf Se Metal-organic frameworks with pyrazole-based building blocks
JP2024527287A (ja) 2021-06-24 2024-07-24 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 殺有害生物剤としての２－［３－［１［（キナゾリン－４－イル）アミノ］エチル］ピラジン－２－イル］チアゾール－５－カルボニトリル誘導体及び類似化合物
WO2022268815A1 (en) 2021-06-24 2022-12-29 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
UY39827A (es) 2021-06-24 2023-01-31 Pairwise Plants Services Inc Modificación de genes de ubiquitina ligasa e3 hect para mejorar los rasgos de rendimiento
WO2022268813A1 (en) 2021-06-24 2022-12-29 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
CA3224982A1 (en) 2021-07-01 2023-01-05 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for enhancing root system development
KR102712874B1 (ko) * 2021-07-02 2024-10-04 주식회사 바이오에프디엔씨 고주파 특이적 발현 프로모터
WO2023280999A1 (en) 2021-07-07 2023-01-12 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
EP4376616A1 (en) 2021-07-27 2024-06-05 Syngenta Crop Protection AG Method for controlling diamide resistant pests & compounds therefor
US20240327397A1 (en) 2021-07-29 2024-10-03 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally Active Fused Bicyclic Heteroaromatic Compounds
EP4380933A1 (en) 2021-08-02 2024-06-12 Syngenta Crop Protection AG Microbiocidal pyrazole derivatives
WO2023012081A1 (en) 2021-08-05 2023-02-09 Syngenta Crop Protection Ag Method for controlling diamide resistant pests & compounds therefor
WO2023017094A1 (en) 2021-08-10 2023-02-16 Syngenta Crop Protection Ag 2,2-difluoro-5h-[1,3]dioxolo[4,5-f]isoindol-7-one derivatives as pesticides
AR126729A1 (es) 2021-08-10 2023-11-08 Syngenta Crop Protection Ag Mezcla fungicida
MX2024001883A (es) 2021-08-12 2024-02-29 Pairwise Plants Services Inc Modificacion de los genes receptores de brasinoesteroides para mejorar los rasgos de rendimiento.
CN118355126A (zh) 2021-08-17 2024-07-16 成对植物服务股份有限公司 用于修饰植物中的细胞分裂素受体组氨酸激酶基因的组合物和方法
IL309501A (en) 2021-08-19 2024-02-01 Syngenta Crop Protection Ag Method for controlling pests resistant to diamide and compounds therefor
US20230074699A1 (en) 2021-08-30 2023-03-09 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of ubiquitin binding peptidase genes in plants for yield trait improvement
AR126938A1 (es) 2021-09-02 2023-11-29 Pairwise Plants Services Inc Métodos y composiciones para mejorar la arquitectura de las plantas y los rasgos de rendimiento
CA3230261A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Manuel Dubald Plants having increased tolerance to herbicides
JP2024535811A (ja) 2021-09-13 2024-10-02 プランティバディーズ 組換えタンパク質作製のための遺伝子改変された生物
US20230266293A1 (en) 2021-09-21 2023-08-24 Pairwise Plants Services, Inc. Color-based and/or visual methods for identifying the presence of a transgene and compositions and constructs relating to the same
US20230087522A1 (en) 2021-09-21 2023-03-23 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for reducing pod shatter in canola
CN117998986A (zh) 2021-09-23 2024-05-07 先正达农作物保护股份公司 昆虫、蜱螨目和线虫类有害生物控制
CN118434850A (zh) 2021-10-04 2024-08-02 成对植物服务股份有限公司 用于改善小花能育性和种子产量的方法
CN118302434A (zh) 2021-10-07 2024-07-05 成对植物服务股份有限公司 用于改善小花育性和种子产量的方法
EP4414364A1 (en) 2021-10-08 2024-08-14 Nihon Nohyaku Co., Ltd. Pyrimidinyl triazole compound or salt thereof, pest control agent containing said compound as active ingredient, and pest control method
AR127279A1 (es) 2021-10-14 2024-01-03 Syngenta Crop Protection Ag Composición química estabilizada con nanocristales de celulosa
WO2023061838A1 (en) 2021-10-14 2023-04-20 Syngenta Crop Protection Ag Imidazo[1,2-a]pyridine derivatives
GB202114863D0 (en) 2021-10-18 2021-12-01 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
GB202115018D0 (en) 2021-10-20 2021-12-01 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
CN118556051A (zh) 2021-10-25 2024-08-27 先正达农作物保护股份公司 具有含硫取代基的杀有害生物活性的杂环衍生物
JP2024540115A (ja) 2021-10-27 2024-10-31 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 殺有害生物的に活性なピリダジノン化合物
EP4422400A1 (en) 2021-10-29 2024-09-04 Syngenta Crop Protection AG Agrochemical formulations for mitigating crystallization
EP4426112A1 (en) 2021-11-02 2024-09-11 Syngenta Crop Protection AG Micronized wax and silicone agrochemical formulation
CN118265702A (zh) 2021-11-19 2024-06-28 先正达农作物保护股份公司 杀微生物的异烟酰胺衍生物
AR127682A1 (es) 2021-11-19 2024-02-21 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas de aureobasidina
WO2023094304A1 (en) 2021-11-25 2023-06-01 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal heterobiaryl amide derivatives
WO2023094303A1 (en) 2021-11-25 2023-06-01 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal heterobiaryl amide derivatives
CN118354672A (zh) 2021-12-02 2024-07-16 先正达农作物保护股份公司 杀真菌组合物
TW202332376A (zh) 2021-12-02 2023-08-16 瑞士商先正達農作物保護公司 在熱緊迫下保留玉蜀黍花粉活力之方法
GB202117474D0 (en) 2021-12-03 2022-01-19 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
GB202117597D0 (en) 2021-12-06 2022-01-19 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
GB202117598D0 (en) 2021-12-06 2022-01-19 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
GB202117595D0 (en) 2021-12-06 2022-01-19 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
AR127904A1 (es) 2021-12-09 2024-03-06 Pairwise Plants Services Inc Métodos para mejorar la fertilidad de floretes y el rendimiento de semillas
WO2023105064A1 (en) 2021-12-10 2023-06-15 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
EP4444712A1 (en) 2021-12-10 2024-10-16 Syngenta Crop Protection AG Pesticidally active pyridazinone compounds
WO2023105065A1 (en) 2021-12-10 2023-06-15 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
US20230295646A1 (en) 2021-12-13 2023-09-21 Pairwise Plants Services, Inc. Model editing systems and methods relating to the same
WO2023110710A1 (en) 2021-12-13 2023-06-22 Syngenta Crop Protection Ag Method for controlling diamide resistant pests & compounds therefor
EP4197333A1 (en) 2021-12-15 2023-06-21 Syngenta Crop Protection AG Method for controlling diamide resistant pests & compounds therefor
AR127922A1 (es) 2021-12-15 2024-03-13 Syngenta Crop Protection Ag Derivados heterocíclicos bicíclicos microbiocidas
EP4198023A1 (en) 2021-12-16 2023-06-21 Basf Se Pesticidally active thiosemicarbazone compounds
WO2023111215A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal pyridine-substituted benzothiazine derivatives
EP4447682A1 (en) 2021-12-17 2024-10-23 Syngenta Crop Protection AG Microbiocidal pyrazole derivatives
AR127972A1 (es) 2021-12-17 2024-03-13 Pi Industries Ltd Novedosos compuestos de piridina carboxamida bicíclica sustituida fusionada para combatir hongos fitopatogénicos
AR127992A1 (es) 2021-12-21 2024-03-13 Syngenta Crop Protection Ag Composición agroquímica
WO2023118011A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal aza-heterobiaryl derivatives
WO2023117670A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Syngenta Crop Protection Ag Triazine herbicidal compounds
CN118613467A (zh) 2021-12-28 2024-09-06 株式会社艾迪科 芳基环己二酮衍生物或其盐类以及含有该化合物的有害生物防除剂及其使用方法
EP4458808A1 (en) 2021-12-28 2024-11-06 Adeka Corporation Arylcyclohexanedione derivative or salt thereof, pest control agent containing said compound, and method for using same
JPWO2023127806A1 (hu) 2021-12-28 2023-07-06
CN118632837A (zh) 2021-12-28 2024-09-10 株式会社艾迪科 芳基二氢吡喃衍生物或其盐类及含有该化合物的有害生物防除剂及其使用方法
GB2629276A (en) 2022-01-06 2024-10-23 Pairwise Plants Services Inc Methods and compositions for trichome removal
WO2023139166A1 (en) 2022-01-19 2023-07-27 Syngenta Crop Protection Ag Methods for controlling plant pathogens
TW202346271A (zh) 2022-01-26 2023-12-01 瑞士商先正達農作物保護公司 除草化合物
IL314310A (en) 2022-01-27 2024-09-01 Pi Industries Ltd Carbonyl sulfonamide compounds and their use
AR128372A1 (es) 2022-01-31 2024-04-24 Pairwise Plants Services Inc Supresión de la respuesta de evitación de la sombra en las plantas
WO2023148206A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal n-amide derivatives
CN118647605A (zh) 2022-02-03 2024-09-13 日本农药株式会社 介离子性芳基哒嗪鎓衍生物或其盐类和含有该化合物的杀虫剂及其使用方法
WO2023148368A1 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2023148369A1 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
CN118922081A (zh) 2022-02-10 2024-11-08 先正达农作物保护股份公司 昆虫、蜱螨目和线虫类有害生物控制
CN118715211A (zh) 2022-02-17 2024-09-27 巴斯夫欧洲公司 杀有害生物活性氨硫脲化合物
GB202202314D0 (en) 2022-02-21 2022-04-06 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
GB202202315D0 (en) 2022-02-21 2022-04-06 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
WO2023164722A1 (en) 2022-02-28 2023-08-31 Pairwise Plants Services, Inc. Engineered crispr-cas effector proteins and methods of use thereof
CN118829636A (zh) 2022-03-01 2024-10-22 先正达农作物保护股份公司 基于嘧啶基-氧基-喹啉的除草化合物
CN118786122A (zh) 2022-03-01 2024-10-15 先正达农作物保护股份公司 基于嘧啶基-氧基-喹啉的除草化合物
WO2023166067A1 (en) 2022-03-02 2023-09-07 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal pyridazinone amide derivatives
US20240327858A1 (en) 2022-03-02 2024-10-03 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of brassinosteroid receptor genes to improve yield traits
AU2023232657A1 (en) 2022-03-09 2024-10-03 Adeka Corporation Piperidinone derivative or salt thereof, harmful organism control agent containing said compound, and method for using same
WO2023169984A1 (en) 2022-03-11 2023-09-14 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
AU2023242003A1 (en) 2022-03-28 2024-10-10 Nihon Nohyaku Co., Ltd. 1-aryl tetrahydropyridazine-3,5-dione derivative or salt thereof, pesticide containing said compound, and method for using same
AU2023243430A1 (en) 2022-03-31 2024-10-24 Pairwise Plants Services, Inc. Early flowering rosaceae plants with improved characteristics.
WO2023187191A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
AU2023251095A1 (en) 2022-04-07 2024-10-17 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for improving resistance to fusarium head blight
WO2023203038A1 (en) 2022-04-19 2023-10-26 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
WO2023203066A1 (en) 2022-04-21 2023-10-26 Basf Se Synergistic action as nitrification inhibitors of dcd oligomers with alkoxypyrazole and its oligomers
US20230383305A1 (en) 2022-04-21 2023-11-30 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving yield traits
WO2023208866A1 (en) 2022-04-25 2023-11-02 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
WO2023215704A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for enhancing yield and disease resistance
US20230416767A1 (en) 2022-05-05 2023-12-28 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying root architecture and/or improving plant yield traits
AR129265A1 (es) 2022-05-12 2024-08-07 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos de alcoxi-heteroaril-carboxamida o tioamida
WO2023222834A1 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
WO2023222836A1 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
WO2023222831A1 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
WO2023222589A1 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
GB202207819D0 (en) 2022-05-27 2022-07-13 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
GB202209005D0 (en) 2022-06-20 2022-08-10 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
WO2023247360A1 (en) 2022-06-21 2023-12-28 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active fused bicyclic heteroaromatic compounds
AR129535A1 (es) 2022-06-21 2024-09-04 Syngenta Crop Protection Ag Derivados de carboxamida heterocíclicos bicíclicos microbiocidas
GB202209172D0 (en) 2022-06-22 2022-08-10 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
GB202209286D0 (en) 2022-06-24 2022-08-10 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
AR129709A1 (es) 2022-06-27 2024-09-18 Pairwise Plants Services Inc Métodos y composiciones para modificar el escape a la sombra en plantas
US20240000031A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement
WO2024006792A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement
WO2024012968A1 (en) 2022-07-13 2024-01-18 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal pyrimidinone derivatives
GB202210443D0 (en) 2022-07-15 2022-08-31 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
WO2024020360A1 (en) 2022-07-18 2024-01-25 Pairwise Plants Services, Inc. Mustard green plants named 'pwrg-1', 'pwrg-2,' and 'pwsgc'
WO2024017762A1 (en) 2022-07-19 2024-01-25 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
WO2024018016A1 (en) 2022-07-21 2024-01-25 Syngenta Crop Protection Ag Crystalline forms of 1,2,4-oxadiazole fungicides
WO2024023035A1 (en) 2022-07-25 2024-02-01 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
WO2024022910A1 (en) 2022-07-26 2024-02-01 Syngenta Crop Protection Ag 1-[1-[2-(pyrimidin-4-yl)-1,2,4-triazol-3-yl]ethyl]-3-[2,4-dichloro-5-phenyl]urea derivatives and similar compounds as pesticides
WO2024028243A1 (en) 2022-08-02 2024-02-08 Basf Se Pyrazolo pesticidal compounds
WO2024030984A1 (en) 2022-08-04 2024-02-08 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving yield traits
WO2024033374A1 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Syngenta Crop Protection Ag Novel arylcarboxamide or arylthioamide compounds
US20240060081A1 (en) 2022-08-11 2024-02-22 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement
WO2024038054A1 (en) 2022-08-16 2024-02-22 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
WO2024046890A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal pyrazole compounds
US20240090466A1 (en) 2022-09-08 2024-03-21 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving yield characteristics in plants
WO2024056732A1 (en) 2022-09-16 2024-03-21 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active cyclic amine compounds
TW202430514A (zh) 2022-09-30 2024-08-01 瑞士商先正達農作物保護股份公司 殺微生物之吡唑衍生物
TW202430031A (zh) 2022-09-30 2024-08-01 瑞士商先正達農作物保護股份公司 殺微生物之吡唑衍生物
WO2024074414A1 (en) 2022-10-06 2024-04-11 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal imidazole compounds
WO2024083558A1 (en) 2022-10-17 2024-04-25 Syngenta Crop Protection Ag Emulsifiable concentrate (ec)
WO2024089023A1 (en) 2022-10-25 2024-05-02 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2024089216A1 (en) 2022-10-27 2024-05-02 Syngenta Crop Protection Ag Novel sulfur-containing heteroaryl carboxamide compounds
WO2024089191A1 (en) 2022-10-27 2024-05-02 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal heterobicyclic dihydrooxadiazine derivatives
WO2024094575A1 (en) 2022-10-31 2024-05-10 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2024100069A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal pyridine derivatives
WO2024100115A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal pyrazole derivatives
WO2024099890A1 (en) 2022-11-10 2024-05-16 Syngenta Crop Protection Ag Weed control method
WO2024099889A1 (en) 2022-11-10 2024-05-16 Syngenta Crop Protection Ag Weed control method
WO2024105104A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal tetrahydroisoquinoline derivatives
WO2024110554A1 (en) 2022-11-23 2024-05-30 Syngenta Crop Protection Ag N-[(1 -[2-[6-(pyridazin-3-yl]-1,2,4-triazol-3-yl]ethyl]-quinazolin-4-amine and n-[1-[3-(6-(pyridazin-3-yl)pyrazin-2-yl]ethyl]-8-quinazolin-4-amine derivatives as pesticides
WO2024110215A1 (en) 2022-11-24 2024-05-30 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active cyclic amine compounds
WO2024115509A1 (en) 2022-11-29 2024-06-06 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal tetrahydroisoquinoline derivatives
WO2024115546A1 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
WO2024115512A1 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal tetrahydroisoquinoline derivatives
WO2024121264A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Syngenta Crop Protection Ag Insecticidal compound based on pyrazole derivatives
WO2024121263A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Syngenta Crop Protection Ag Insecticidal compound based on pyrazole derivatives
WO2024121262A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Syngenta Crop Protection Ag Insecticidal compound based on pyrazole derivatives
WO2024121261A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Syngenta Crop Protection Ag Insecticidal compound based on pyrazole derivatives
WO2024126388A1 (en) 2022-12-12 2024-06-20 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2024126113A1 (en) 2022-12-12 2024-06-20 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Plants having increased tolerance to herbicides
WO2024126404A1 (en) 2022-12-14 2024-06-20 Syngenta Crop Protection Ag Imidazo[1,2-a]pyridine derivatives
WO2024126650A1 (en) 2022-12-15 2024-06-20 Syngenta Crop Protection Ag Novel bicyclic-carboxamide compounds useful as pesticides
US20240200102A1 (en) 2022-12-16 2024-06-20 Pairwise Plants Services, Inc. Fusion proteins comprising an intein polypeptide and methods of use thereof
WO2024126407A1 (en) 2022-12-16 2024-06-20 Syngenta Crop Protection Ag Benzimidazole derivatives
WO2024126624A1 (en) 2022-12-16 2024-06-20 Syngenta Crop Protection Ag Stabilized agrochemical composition
WO2024132895A1 (en) 2022-12-19 2024-06-27 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal dihydrooxadiazinyl pyridazinone compounds
WO2024132901A1 (en) 2022-12-19 2024-06-27 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal pyridazine dihydrooxadiazine derivatives
WO2024132649A1 (en) 2022-12-20 2024-06-27 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
WO2024133426A1 (en) 2022-12-21 2024-06-27 Syngenta Crop Protection Ag Method for controlling diamide resistant pests and compounds therefor
WO2024133551A1 (en) 2022-12-21 2024-06-27 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active pyridazine compounds
US20240271109A1 (en) 2022-12-21 2024-08-15 Pairwise Plants Services, Inc. Engineered proteins and methods of use thereof
WO2024146945A1 (en) 2023-01-07 2024-07-11 Syngenta Crop Protection Ag Novel carboxamide and sulfonamide pesticidal compounds
WO2024149676A1 (en) 2023-01-12 2024-07-18 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal pyrazole compounds
WO2024149675A1 (en) 2023-01-12 2024-07-18 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal imidazole compounds
WO2024156664A1 (en) 2023-01-23 2024-08-02 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2024156886A1 (en) 2023-01-27 2024-08-02 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal pyrazole derivatives
WO2024160849A1 (en) 2023-01-31 2024-08-08 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
WO2024160801A1 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
WO2024170339A1 (en) 2023-02-13 2024-08-22 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active bicyclic compounds
US20240279673A1 (en) 2023-02-16 2024-08-22 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying shade avoidance in plants
WO2024175475A1 (en) 2023-02-24 2024-08-29 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
WO2024175476A1 (en) 2023-02-24 2024-08-29 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
US20240327811A1 (en) 2023-03-01 2024-10-03 Pairwise Plants Services, Inc. Engineered proteins and methods of use thereof
US20240294933A1 (en) 2023-03-02 2024-09-05 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying shade avoidance in plants
WO2024186950A1 (en) 2023-03-09 2024-09-12 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of brassinosteroid signaling pathway genes for improving yield traits in plants
WO2024188742A1 (en) 2023-03-13 2024-09-19 Syngenta Crop Protection Ag Stabilized agrochemical composition
WO2024189139A1 (en) 2023-03-14 2024-09-19 Syngenta Crop Protection Ag Control of pests resistant to insecticides
WO2024194063A1 (en) 2023-03-17 2024-09-26 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal triazine derivatives
WO2024206375A1 (en) 2023-03-30 2024-10-03 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for reducing thorns or prickles in plants
GB202305125D0 (en) 2023-04-06 2023-05-24 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
WO2024213659A1 (en) 2023-04-13 2024-10-17 Syngenta Crop Protection Ag Imidazo[1,2-a]pyrazine derivatives
WO2024213650A1 (en) 2023-04-13 2024-10-17 Syngenta Crop Protection Ag Imidazo[1,2-a]pyridine derivatives
WO2024213662A1 (en) 2023-04-13 2024-10-17 Syngenta Crop Protection Ag Pyrazolo[1,5-a]pyridine derivatives
WO2024213656A1 (en) 2023-04-13 2024-10-17 Syngenta Crop Protection Ag Imidazo[1,2-a]pyrazine derivatives
WO2024213664A1 (en) 2023-04-13 2024-10-17 Syngenta Crop Protection Ag Imidazo bicyclic derivatives
WO2024213653A1 (en) 2023-04-13 2024-10-17 Syngenta Crop Protection Ag Imidazo[1,2-a]pyridine derivatives
WO2024213651A1 (en) 2023-04-13 2024-10-17 Syngenta Crop Protection Ag Imidazo[1,2-a]pyridine derivatives
WO2024213663A1 (en) 2023-04-13 2024-10-17 Syngenta Crop Protection Ag Pyrazolo[1,5-a]pyridine derivatives
WO2024213720A1 (en) 2023-04-13 2024-10-17 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
WO2024217995A1 (en) 2023-04-20 2024-10-24 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active dihydropyridinone derivatives
WO2024223858A1 (en) 2023-04-28 2024-10-31 Syngenta Crop Protection Ag Methods of controlling or preventing infestation of plants by the phytopathogenic microorganism corynespora cassiicola

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4448885A (en) 1981-04-27 1984-05-15 Board Of The Regents Of The University Of Washington Bacillus thuringiensis crystal protein in Escherichia coli
US4467036A (en) 1981-11-12 1984-08-21 The Board Of Regents Of The University Of Washington Bacillus thuringiensis crystal protein in Escherichia coli
JPH0714349B2 (ja) 1983-01-17 1995-02-22 モンサント カンパニ− 植物細胞での発現に適したキメラ遺伝子
DE3416978A1 (de) 1983-05-12 1984-12-06 Stauffer Chemical Co., Westport, Conn. Durch liposom vermittelte transformation eukaryotischer zellen
US5380831A (en) * 1986-04-04 1995-01-10 Mycogen Plant Science, Inc. Synthetic insecticidal crystal protein gene
US4761373A (en) 1984-03-06 1988-08-02 Molecular Genetics, Inc. Herbicide resistance in plants
EP0160390A3 (en) 1984-04-16 1987-04-08 Sandoz Ltd. Embryogenic callus and cell suspension of inbred corn
CA1301094C (en) 1984-08-31 1992-05-19 Helen Riaboff Whiteley Bacillus thuringiensis crystal protein gene toxin segment
US4830966A (en) 1984-09-07 1989-05-16 Sungene Technologies Corporation Process for regenerating corn
US5100792A (en) 1984-11-13 1992-03-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
EP0290395B1 (en) * 1987-05-05 1994-01-26 Sandoz Ag Plant tissue transformation
US5371003A (en) 1987-05-05 1994-12-06 Sandoz Ltd. Electrotransformation process
US5350689A (en) * 1987-05-20 1994-09-27 Ciba-Geigy Corporation Zea mays plants and transgenic Zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells
ES2121803T3 (es) 1987-05-20 1998-12-16 Novartis Ag Plantas de zea mays y plantas transgenicas de zea mays generadas a partir de protoplastos o celulas derivadas de protoplastos.
US5990387A (en) 1988-06-10 1999-11-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Stable transformation of plant cells
ES2150410T3 (es) * 1988-06-20 2000-12-01 Novartis Ag Procedimiento para el combate de parasitos de plantas.
GB8818706D0 (en) * 1988-08-05 1988-09-07 Ici Plc Dna constructs & plants incorporating them
NZ230375A (en) * 1988-09-09 1991-07-26 Lubrizol Genetics Inc Synthetic gene encoding b. thuringiensis insecticidal protein
US5023179A (en) 1988-11-14 1991-06-11 Eric Lam Promoter enhancer element for gene expression in plant roots
CA2005658A1 (en) 1988-12-19 1990-06-19 Eliahu Zlotkin Insecticidal toxins, genes encoding these toxins, antibodies binding to them and transgenic plant cells and plants expressing these toxins
GB8901697D0 (en) * 1989-01-26 1989-03-15 Ici Plc Male flower specific gene sequences
BR9007159A (pt) * 1989-02-24 1991-12-10 Monsanto Co Genes sinteticos de plantas e processo para a preparacao dos mesmos
EP0400246A1 (en) * 1989-05-31 1990-12-05 Plant Genetic Systems, N.V. Prevention of Bt resistance development
WO1991002059A1 (en) 1989-08-01 1991-02-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Transcriptional activators of anthocyanin biosynthesis as visual markers for plant transformation
US20010003849A1 (en) * 1989-08-07 2001-06-14 Kenneth A. Barton Expression of genes in plants
US5550318A (en) 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5177308A (en) * 1989-11-29 1993-01-05 Agracetus Insecticidal toxins in plants
US6946587B1 (en) 1990-01-22 2005-09-20 Dekalb Genetics Corporation Method for preparing fertile transgenic corn plants
HU220773B1 (hu) 1990-01-22 2002-05-28 Dekalb Genetics Corporation Eljárás termő transzgenikus kukoricanövények előállítására
US6777589B1 (en) 1990-01-22 2004-08-17 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5484956A (en) 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
DE69133128T2 (de) * 1990-04-12 2003-06-18 Syngenta Participations Ag, Basel Gewebe-spezifische Promotoren
CA2080584C (en) * 1990-04-18 2000-09-05 Marc Cornelissen Modified bacillus thuringiensis insecticidal-crystal protein genes and their expression in plant cells
US6403865B1 (en) 1990-08-24 2002-06-11 Syngenta Investment Corp. Method of producing transgenic maize using direct transformation of commercially important genotypes
ES2147551T3 (es) 1990-11-23 2000-09-16 Aventis Cropscience Nv Procedimiento para transformar plantas monocotiledoneas.
AU664034B2 (en) 1991-05-15 1995-11-02 Monsanto Company Method of creating a transformed rice plant
UA48104C2 (uk) 1991-10-04 2002-08-15 Новартіс Аг Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника
TW261517B (hu) * 1991-11-29 1995-11-01 Mitsubishi Shozi Kk
US5530197A (en) * 1992-08-19 1996-06-25 Plant Genetic Systems, N.V. Control of ostrinia
US5689052A (en) 1993-12-22 1997-11-18 Monsanto Company Synthetic DNA sequences having enhanced expression in monocotyledonous plants and method for preparation thereof
US6350689B1 (en) * 2001-04-23 2002-02-26 Chartered Semiconductor Manufacturing Ltd. Method to remove copper contamination by using downstream oxygen and chelating agent plasma

Also Published As

Publication number Publication date
ATE221916T1 (de) 2002-08-15
WO1993007278A1 (en) 1993-04-15
US20030046726A1 (en) 2003-03-06
JP2003189888A (ja) 2003-07-08
EP0618976A1 (en) 1994-10-12
CZ292953B6 (cs) 2004-01-14
ES2181678T3 (es) 2003-03-01
SK37894A3 (en) 1994-10-05
BG62782B1 (bg) 2000-07-31
CZ76994A3 (en) 1995-03-15
US6720488B2 (en) 2004-04-13
UA48104C2 (uk) 2002-08-15
US6018104A (en) 2000-01-25
HU9400960D0 (en) 1994-06-28
EP1209237A2 (en) 2002-05-29
CA2120514C (en) 2008-08-05
US5625136A (en) 1997-04-29
JPH07500012A (ja) 1995-01-05
SK283357B6 (sk) 2003-06-03
RU2202611C2 (ru) 2003-04-20
RO110263B1 (ro) 1995-11-30
BR9206578A (pt) 1995-04-11
US6075185A (en) 2000-06-13
HUT68261A (en) 1995-06-28
US6320100B1 (en) 2001-11-20
US5859336A (en) 1999-01-12
DK0618976T3 (da) 2002-12-02
BG98747A (bg) 1995-02-28
EP1209237A3 (en) 2002-07-31
DE69232725T2 (de) 2003-04-03
EP0618976B1 (en) 2002-08-07
US6051760A (en) 2000-04-18
AU2795292A (en) 1993-05-03
CA2120514A1 (en) 1993-04-15
US20060021095A1 (en) 2006-01-26
US6121014A (en) 2000-09-19
EP1213356A2 (en) 2002-06-12
EP1213356A3 (en) 2002-06-19
DE69232725D1 (de) 2002-09-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6720488B2 (en) Transgenic maize seed and method for controlling insect pests
JP4030582B2 (ja) 植物における鱗翅目制御のための修飾バチルス・サーリンジェンシス遺伝子
Iannacone et al. Specific sequence modifications of a cry3B endotoxin gene result in high levels of expression and insect resistance
Wang et al. Poplar (Populus nigra L.) plants transformed with a Bacillus thuringiensis toxin gene: insecticidal activity and genomic analysis
KR0168038B1 (ko) 증진된 식물내 발현을 위한 합성 B.t. 유전자의 제조방법 및 그 유전자
JPS6094041A (ja) 昆虫耐性植物
JP2003518930A (ja) バチルス・チューリンゲンシス由来殺虫性タンパク質
BRPI9913089B1 (pt) sequencia de polinucleotídeos recombinante para expressão aumentada da proteína inseticida cry3b em plantas, bem como processo para controle da infestação de insetos coleópteros
AU2003259011B2 (en) Nucleic acids from rice conferring resistance to bacterial blight disease caused by xanthomonas SPP.
ES2270431T3 (es) Elemento regulador especifico de microesporas.
CN110818784B (zh) 水稻基因OsATL15在调节农药的吸收转运中的应用
CA2272788A1 (en) Means and methods for transformation of plant mitochondria
JP5054267B2 (ja) 新規トキシン
CA2218554A1 (en) Plant pathogen resistance genes and uses thereof
CN114096669A (zh) 编码杀虫晶体蛋白的合成核苷酸序列及其用途
EP1107984A1 (en) Modified synthetic dna sequences for improved insecticidal control
WO2001037643A9 (fr) Procede de reduction de la fertilite du pollen au moyen des genes du facteur de transcription a doigt de zinc specifiques du pollen
CN114008208A (zh) 编码CRY2Ai蛋白的经密码子优化的合成核苷酸序列及其用途
MXPA98002778A (en) Gene of bacillus thuringiensis modified for control of lepidopteros in plan

Legal Events

Date Code Title Description
DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: NOVARTIS AG., CH

HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: SYNGENTA PARTICIPATIONS AG, CH