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JPS6094041A - 昆虫耐性植物 - Google Patents

昆虫耐性植物

Info

Publication number
JPS6094041A
JPS6094041A JP59200337A JP20033784A JPS6094041A JP S6094041 A JPS6094041 A JP S6094041A JP 59200337 A JP59200337 A JP 59200337A JP 20033784 A JP20033784 A JP 20033784A JP S6094041 A JPS6094041 A JP S6094041A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
gene
plant
dna
insecticidal
promoter
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
JP59200337A
Other languages
English (en)
Inventor
マイケル　ジエイ．アダング
ジヨン　デイ．ケンプ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Agrigenetics Research Associates Ltd
Original Assignee
Agrigenetics Research Associates Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=24133813&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JPS6094041(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Agrigenetics Research Associates Ltd filed Critical Agrigenetics Research Associates Ltd
Publication of JPS6094041A publication Critical patent/JPS6094041A/ja
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
（技術分野） 本発明は遺伝子操作、農業植物および細菌性生物有効物
質、特にバチルス属に由来する物質の分野のものである
。 （発明の背景） バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ
）近縁の細菌種、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａ
ｃｉ　ｆｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）は胞子形
成の間に蛋白性の結晶含有物を形成する。本結晶は形成
胞子と反対の端の細胞内に形成される副胞子である。　
しばしば。 δ−エンドトキシンと称されるこの結晶タンパクは２つ
の型を有する：分子ｉｆ　（ＭＷ）約１３０キロダルト
ンの無毒性プロトキシンと分子量約６７キロダルトンを
有するトキシン。この結晶は多数の昆虫種（ｉｎｓｅｃ
ｔ　５ｐｅｃｉｅｓ）の幼虫の腸内で活性化されるプロ
レ１−シンタンパクを含む。Ｍ、Ｊ、ＫＩｏｗｄｅｎｅ
ｔ　ａｌ、　（１９８３）　八ｐｐ１．　Ｅｎｖｉｒ、
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、４６　：３１２−３１５．　ハハ
チルス・チューリンゲンシスｖａｒ。 イスラエレンシスの可溶化プロトキシンはアエデス・エ
シブティの成虫に毒性があることを示した。 活性化の間、プロトキシンば２木のポリペプチドに分解
され、その一方または両者が毒性を有する。 インヒポでは結晶は可溶化されることにより活性化され
、腸内のアルカリ度およびプロテアーゼにより毒性型に
変換される。インビトロでは極端は高ｐＨ（例えば、　
ｐＨ１２）　、温和な塩基性条件（例えば、　ｐＨｌｏ
）での還元剤、あるいは中性条件（ｐＨ７）での強力な
変性剤（グアニジン、尿素）により可溶化され、−変可
溶化するとプロテアーゼであるトリプシンの作用により
活性化されるらしい。結晶タンパクは胞子殻および栄養
細胞壁のタンパクと抗原的に関連があることが報告され
ている。炭水化物はこのタンパクの毒性には関与しない
。 結晶クンバクは特に鱗翅目、双翅目のものに共通してい
る１００以上の昆虫種の幼虫に毒性があることが知られ
ている殺虫タンパクであるので、バチルス・チューリン
ゲンシスおよびその結晶エンドトキシンは有用である。 ノζチルス・チューリンゲンシス結晶タンパクの作用を
受ける昆虫は第１表に挙げたものを含むが、これに限ら
ない。これら昆虫種の多くは経済的に重要な害虫である
。結晶タンパクの応用により保護され得る植物は第２表
に挙げたものを含むが、これに限らない。第３表に挙げ
たものに含まれるが、これに限定されないバチルス・チ
ューリンゲンシスの種々の変種は異なった宿主域を有す
る（Ｒ，Ｍ、Ｆａｕｓｔ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）　
ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｊｎｅｅｒｉｎｇ　ｉｎ
　ｔｈｅ　ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅｓ、　ｅｄ、　Ｎ
、Ｊ、ＰａｎａｐｏＩｏｕｓ＋　ｐｐ、　２２５−２５
４）　；これは多分ある結晶タンパクが特定の宿主に毒
性があることを反映し２ている。結晶タンパクは極めて
昆虫に特異的である；２０年以上にわたり胞子形成し７
たバチルス・ナユーリンゲンシス細胞が市販され作物や
９’ｌｉ　３’ｉ　ｆｉｇ物Ｑこ応用されてきたが、植
物あるいはノ日Ｎ虫動物へ影響した例は知られていない
。 エントド−１−ソンの効率および安全性は１１．　Ｍ、
　Ｆａｕｓ　＋ｅｔ　ａｌ、、ｉｉ！０１．　に、■、
りまとめられている。他の有用な（，８説乙こＰ、Ｇ、
Ｆａｓｔ　（１９８１）　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌエ
リｐ−（Ｊン２Ｊ−蓼λＬ」焚Ｓ）１≦□□ｉとす」Ｕ
２」−嗅−リしＤｉ　苧９ご鼾巨ｌも≦、１９７０−１
９８０、　ｃｄ、：　１１．Ｄ、ＢｕｒＨｅｓ、　ｐｐ
、２２３−２４８と１１　、　Ｅ　。 Ｈｕｂｅｒ　＆　Ｐ、ＬｕＬＩ＋ｙ　（１９８］）　ｉ
ｎ　ＰａｔｈｏＢｅｎｅｓｉｓ　ｏｆＩｎｖｅｒｔｅｂ
ｒａｔｅＭｉｃｒｏｂｉａｌＤｉｓｅａｓｅｓ、ｅｄ、
：ｌＥ、Ｗ。 Ｄａｖｉｄｓｏｎ、　１１１１．２０９２：Ｅかある。 結晶タンパク遺伝子はバチルス・チューリンゲンシスの
ある株では染色体−トに存在するらしいが（Ｊ、Ｗ、Ｋ
ｒｏｎｓｔａｄ　ｐ↓　ａｉ　（１９８３）　Ｊ、Ｂａ
ｃＬｅｒｉｏｌ。 １５４ユニ　４１．９−４２８）、通常ごの株にある数
個の大型プラスミドの１つに見出すことができる。いく
つかの遺伝子は大腸菌で増殖できるブラスミ１−にりｌ
コーン化された。Ｗｌ＋１ｔｅｌｅｙのグループ（１１
，１ン、Ｎ１ｔｅｌｅｙｅｔ　ａｌ、（１９８２）　ｉ
ｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ、Ｂ−ａｎｄ　
Ｇｅｎｅ−７ｏｎ　ｉｎ　Ｂａｃｉ−↓ｌｉ、ｅｄ。　
：　八、Ｔ、Ｇａｎｅｓａｎ射旦、、　ｐｐ、１３１−
１４４．　Ｉｌ、Ｅ、５ｃｈｎｅｐｆ　＆　Ｉｌ、Ｒ，
Ｗｈｉｔｅｌｅｙ（１，９８１）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、、八ｐａｄ、Ｓｃｉ。　１１．ｓ、Ａ、７８　：　２
８９３−２８９７およびＥｕｒｏｐｃａｎ　ｐａｔ、　
ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　６３＋９４９）は酵素釦肛３
Ａｌ　（部分分解条件下）およびＰ３１　、　Ｔｌを用
いて、夫々バチルス・チューリンゲンシスｖａｒ、タル
スタキイ　ＨＤ−１−ＤｉｐｅｌおよびＨＤ−７３株の
トキンン遺伝子を、エセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａｃｏｌｉ）のプラスミＩ・ベクターｐＢＲ３
２２の勧旦−１１■部位へ約１２　Ｋｂｐおよび１６　
ｉｐの大きさの大きな遺伝子を含む断片として挿入した
。クローニングを報告した。　ｌＩＤ−１の結晶タンパ
ク遺伝子は６．６　ＫｂｐＨ１ｎｄｌＩｌ断片上に存在
することが示された。幼虫に有毒で、免疫的に同定し得
る既知ブ０トキシンと同一大きさの１１０−１−　Ｄｉ
ｐｅｌ遺伝子の結晶タンパクがｐＢＲ３２２クローン化
またはザブクローンを含む形質転換エセリシア・コリー
細胞により生産されることが観察された。これはバチル
スの遺伝子がエセリシア・コリー内で多分それ自重のプ
ロモーターから転写され、翻訳されることを示す。さら
に、これはタンパク産物の毒性活性は合成の場とは無関
係であることを示唆する。この遺伝子を断片がいずれの
方向でベクターに挿入されても遺伝子が発現するごとδ
Ｊ転ｆｆｊ゛がそれ自重のブーコモ−ターに支配されて
いることを示唆する。１１０−Ｉ　Ｄｉｐｅｌプロトキ
シンのアミン末端から３３３アミノ酸から導かれた配列
と共に転写および翻訳開始部位が核酸配列により決定さ
れた（ｆｔ、（：、ＩＱｏｎ＋シ　倶　旦、　（１９８
３）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、ＣＩ＋ｅｍ、２５Ｂ−、：　１９
６０−１９６７）。殺虫遺伝子はバチルス・ザチルスの
ようなバクテリア−この転写開始に関与する−１０と−
３５＜ｍＲＮＡの５′末端に対する）で通常見られる配
列に沿って９期待されるリボゾーム結合および６■訳開
６（ｉ　（Ａ　Ｔ（、’；　）部位をイ１することが見
出された。八、旧ｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ。 （１９８２）　ＩＥＭＢＯＪ　上−：　７９１−７９９
はバチルス・チューリンケンシス　へルリーナ（ｂｅｒ
ｌ　１ｎｃｒ）　１７１５株の結晶タンパク遺伝子の１
）ＢＲ３２２へのクローニングを報告した。酵素ｊｌａ
ｍ　ＩＩＩを用いて結晶タンパク遺伝ｔを含む大きな１
４キロヘース対の断片をエセリシア・コリーとバチルス
両者で複製できるベクターｐ　ＨＶ　３３に移した。エ
セリシア・コリーと胞子形成しているバチルス・ザチル
ス両者でこのｐＨＶ３３に基づくクローンは、細胞質封
入体を形成し、既知プロ１−キシンに対する抗体と反応
する完全な大きさく１３０ギロダルトン）のプロトギシ
ンの合成をもたらした。　ｐＲＲ３２２またはｐＨＶ３
３に基づくプラスミドを保持するエセリシア・コリー細
胞の抽出物は幼虫に有毒であった。続く研究でＡ、ＫＩ
ｉｅｒ旦旦、（１９８３）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ、ｊ
ｄｓ　Ｒｅｓ、　１１　：　３９７３−３９８７、ばヘ
ルリーナ結晶タンパク遺伝子を４７１１〜口で転写させ
、結晶タンパクの最初の１１コドンと共にプロモーター
領域の配列を報告した。細菌のりボゾーム結合および翻
訳開始部位が同定された。ｊｌｌ持された“−１０パ配
列が同定されたが、他のプロモーターとの類似性は一３
５旬近にはまた見つかっていない。Ｈｅ１ｄ　ｅｔ　ａ
ｌ、（１９８２）　Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　Ｉ〒７　：
　６０６５−６０６９．はクルスタキ（ｋｕｒｓｔａｋ
ｉ）変株の結晶タンパク遺伝子のファージλ由来のクロ
ーニングベクター、シャロン４Ａへのクローニングを報
告した。シャロンクローンの１つで感染したエセリシア
・コリー細胞はプロトキシンと同一大きさく１３０キロ
ダルトン）で幼虫に有毒な抗原を生成した。このシャロ
ンクローンの４．６　ｋｂｐ　［ｉｃｏ　Ｒ１断片がｐ
ＨＶ３３およびエセリシア・コリーのプラスミドヘクタ
ーｐＢＲ３２８に移された。再び１３０キロダルトンの
抗原的に同一な結晶クンバクが適当なプラスミドを保持
するエセリシア・コリーおよびバチルス・サチルス両株
で生産された。クローン化された結晶タンパク遺伝子と
クロス−ハイブリダイズするバチルス・チューリンゲン
シスの染色体配列が胞子形成の間に結晶タンパクを生成
しないバチルス・チューリンゲンシス株中に同定された
。 結晶タンパクに加えて、バチルス・チューリンゲンシス
は少なくとも３つの他のトキシンを生産する。そのうち
の２つ、α−エキソトキシンとγエキソトキシンは脂質
を分解する酵素フォスファタ−ゼである。バチルス・セ
レウスもまた昆虫の幼虫に有毒なフォスファタ−ゼ（ま
たはレシチナーゼ）を生産することが知られている。昆
虫病原性に関与する他の細菌酵素はヒアルウロニダーゼ
・フォスファターゼおよびプロテアーゼを含むが、これ
に限られない。シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）により生
産されるプロテアーゼはガレリア・メロネラ（Ｇａｌｌ
ｅｒｉａ　ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）幼虫のタンパクに特
異的な親和性があることが示された（０．Ｌｙｓｅｎｋ
ｏ　＆　Ｍ、Ｋｕｃｅｒａ　（１９７１）　ｉｎ　Ｍｉ
ｃｒｏｂｉａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｉｎ５ｅｃｔ
ｓａｎｄ　Ｍｉｔｅｓ、　ｅｄｓ、　：　Ｈ，Ｄ、Ｂｕ
ｒｇｅｓ　＆　Ｎ、Ｗ、）Ｉｕｓｓｅｙ＋ｐｐ、　２０
５−２２７）。 （以下余白） り」−ト火企ノ」Ｌ二 Ｇ、Ｂ、ｌ？ｕｖｋｕｎ　＆　Ｆ、Ｍ、Ａｕ５ｕｂｅｌ
　（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ２９８　：８５−８８．
　により開発されたシャトルベクターは大型プラスミド
、ウィルスまたはゲノムの選ばれた位置に外来遺伝子物
質を挿入する道を開いた。大型プラスミドまたはゲノム
を扱う際に起きる主な問題が二つある。第１に、大型プ
ラスミドは各制限酵素に対する多くの部位があるだろう
。 特有の部位特異的切断反応は再現性がなく、多部位切断
反応とそれに続く結合は、変えたくない多くの断片の順
序と方向の混乱による大きな難点を生じる。第２に大型
ＤＮＡプラスミドの形質転換効率は非常に低い。シャト
ルベクターは、外来遺伝子物質を小型プラスミドにしば
しばインビトロで挿入し１次いで通常インビボ技術によ
り大型プラスミドに移すことにより、これらの難点を解
除させる。 シャトルベクターは究極の受容細菌へ導入可能なりＮＡ
分分子１常常プラスミドあるが、より成る。それはまた
外来遺伝物質が導入されるべき受容菌ゲノムの断片のコ
ピーと、これまた受容菌ゲノム断片に挿入される選択形
質をコードするＤＮＡ断片を含む。選択形質（“マーカ
ー″）はトランスボソン変異誘発または制限酵素とりガ
ーゼにより容易に挿入される。 シャトルベクターは究極の受容細胞、典型的にはリゾビ
アッシー（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）科（アグロバク
テリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属を含む）の
細菌に。 三組交雑（Ｒｕｖｋｉｎ　＆　Ａｕ５ｕｂｅｌ、前出）
、二組交雑で自己移動性ベクターの直接移送、アグロバ
クテリウム細胞による外部ＤＮＡの直接取り込み（Ｍ、
　Ｈｏ１ｓｔｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９７８）　Ｍｏ
１ｅｃ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ。 １６３　：　１８１４８７．　の条件を用いる“形質転
換”）。 アグロバクテリウムと他の細菌細胞のスフェロプラスト
融合、リポソーム包括ＤＮＡの取り込み。 或いはインビトロパソケイジング可能なウィルスに基づ
くシャトルベクターでの感染、により導入される。三組
交雑は、プラスミド移動と接合伝達に関する遺伝子を有
する移動性プラスミドを含む株と、シャトルベクターを
含む株との交雑を含む。 もしシャトルベクターがプラスミド遺伝子により移動が
可能であれば、このシャトルベクターは大型ゲノム、例
えばアグロバクテリウム株のＴｉまたはＲｉブラスミ１
包を有する受容細胞へ移される。 シャトルベクターが受容細胞に導入された後。 マーカーのどちらかの側での１回組み換え事象を伴う２
重交叉が起こり得る。この事象は挿入を欠く類似区分を
置換し、マーカーを含むＤＮＡ区分の受容菌り゛ツムへ
の移動をもたらすだろう。元のシャトルヘクターを失っ
た細胞を選択する為に。 本シャトルヘクターは究極の宿主細胞で複製出来ないか
、受容細胞に既存の独立に選択し得るプラスミドと不和
合性でなければならない。これを準備する１一つの共通
の手段は第３の親にシャトルヘクターと不和合性で異な
った薬剤耐性マーカーを有する別のプラスミドを用意す
る事である。したがって１両薬剤の耐性を選別すると、
生存細胞のみがシャトルベクターのマーカーガ受容菌ゲ
ノムと結合したものである。もしシャトルベクターが余
分のマーカーを持っていれば、完全なシャトルベクター
が受容菌プラスミドとともに組み込まれる協同組み込み
をもたらすシャトルベクターと受容菌プラスミド間の１
回交叉現象によるプラスミドを有する細胞を１選別し拾
うことができる。もし外来遺伝物質が選択マーカー内あ
るいは近くに挿入されると、それはまた同じ２重組み換
えにより受容菌プラスミドに組み込まれるだろう。また
マーカー内あるいは近くではなく、外来遺伝物質とマー
カーを遠く離す点での類似断片へ挿入されると、外来遺
伝物質とマーカー間で組み換えは起こるだろうが、外来
遺伝物質の移送は阻止されるだろう。 もしシャトルベクターが表現型として優性な形質（例え
ば失活した発癌性Ｔ−ＤＮＡ遺伝子でなく新規な発現性
殺虫構造遺伝子）の導入に用いられるならば、２重相同
組み換えに頼る必要はない。 プラスミドの協同取り込みをもたらす１回交叉の結果得
られた細胞は所望の形質を植物細胞へ移すことが出来る
。単一の分断されていないＴ−ＤＮＡ配列を有するシャ
トルベクター変種をも使用できるだろう。しかし、得ら
れたＴ−ＤＮＡは繰り返し重複を存しているので、アグ
ロバクテリウムあるし・は植物細胞のいずれかにある二
つの相同配列間で起こる１回の相同組み換え現象にょる
シャトルヘクターのまれではあるが起こり得る欠失に関
して用心せねばならない。 シャトルベクターはアグロバクテリウムのプラスミドの
操作に有用であることが示された：　Ｄ、Ｊ。 Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ　ａｔ　ａｌ、（１９８１）　Ｃｅ
１ｌ　２７：１４３−１５３゜八、Ｊ、Ｍ、ＭａＬｚｋ
ｅ　＆　Ｍ、−Ｄ、Ｃｈｉｌｔｏｎ　（１９８１）　Ｊ
、Ｍｏ１ｅｃ。 彼らはシャトルベクターを“中間ベクター”　（ｉｎｔ
ｅｒｍｅ＋Ｊｉａｔｅ　ｖｅｃＬｏｒｓ）という語で呼
んでいる。 を参照。 大型ＤＮ八へ子への挿入変換の為のシャトルベクター系
の最近現れた変種は“自殺ベクター”　（ｓｕｉｃｉｄ
ｅ　ｖｅｃむｏｒ）である。この系では＾、　Ｐｕｈｌ
ｅｒ旦旦、、　ＵＳ　ａｐｐｌｉ−ｃａｔｉｏｎ　ｓｅ
ｒ　ｎｏ、５１０．３７０およびＲ，Ｓｉｍｏｎ　ｅＬ
　ａｊ、（１９８３）印刷中、に示されたように１　シ
ャトルベクターは受容細胞内で維持され得ない。この性
質は、三組交雑で通常行われるように、シャトルベクタ
ーを排除する為に受容細胞へ不和合性プラスミドを導入
する必要性をなくす。ある既存のＤＮＡへ有効に取り込
まれない全てのベクターは、複製されない事により“自
殺する”。シャトルベクターの伝統的な型で行われ得る
ように、相同性の２つの領域間にない抗生物質耐性遺伝
子を選別する事により、２重と単一との相同性を区別で
きる。ＤＮＡ配列をＴｉプラスミドへ転移させるｐＢＲ
３２２に基づく自殺ベクターの利用がＥ、　Ｖａｎ　１
ｌａｕｔｅ　ｅｔ　ａｌ、（１９８３）　ＥＭＢＯＪ、
２　：４１１−４１７およびり、　Ｃｏｍａｉ　ｅＬ　
旦、（１９Ｂ２）　Ｐｌａｎｔ。 Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、土：　２９１−３００により
報告された。 相同組み換えによりＴ−ＤＮＡへの新規ＤＮＡ配列の導
入の為のシャトルベクターの使用に代わる他の方法とし
て、細菌のトランスボソンがある。 ＴＩＰプラスミド上のアグロバクテリウム−遺伝子の項
で述べるように、トランスボソンはＴＩＰプラスミドの
Ｔ−ＤＮＡへ“跳ぶ”ことができる。（例えばり、Ｊ、
　Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ　ｅｔ　ａｌ、（１９８１）　Ｃ
ｅ１１２７゜１４３−１５３参照）。トランスボソンは
インビトロで新規配列の挿入により修飾されるべきで３
　この新規ＤＮＡをトランスボソンによりＴＩＰプラス
ミドのＴ　−１）　Ｎ　Ａへ転移させ得る。このＴＩＰ
は次いで。 安定に組み込まれた場合、新規ＤＮＡ／トランスボソン
／　”Ｔ’　−Ｄ　Ｎ　Ａの組を植物細胞へ移すことが
できる。 アグロバクテリウム−（説 アグロバクテリウム・チューメファンエンス（Ａ、　ｔ
ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）とアグロバクテリウム・リゾゲ
ネス（＾、　ｒｌ＋ｉｚｏｇｅｎｅｓ）種はグラム陰性
細菌すゾビアシー科、アグロハタテリウム属に含まれる
。これら種は夫々植物のクラウンゴール病と毛状根病の
原固体である。クラウンゴールは脱分化組織の瘤生育に
より特徴づげられる。毛状根は感染組織で根の異常な誘
導により特徴づけられる奇形種である。両病において異
常生育植物組織は感染細菌により異化される。正常には
植物により生成されない、オピンとして知られる１つま
たはそれ以上のアミノ酸誘導体を生産する。既知のオビ
ンは３つの主な種類、その代表的物質はオクトロン、ツ
バリンおよびアグロピンであるが、に分類される。 異常に増殖している組織の細胞は培養で生育でき。 また適当な条件下で、ある形質転換表現型を維持した完
全植物体に再生できる。 アグロバクテリウムの野性株はアグロバクテリウム・チ
ューメファシエンスのＴｉ　（腫瘍誘導）プラスミド、
アグロバクテリウム・リゾゲネスのＲ４（根誘導）プラ
スミドとして知られる大型プラスミドを保持する。これ
らプラスミドを菌株から除去すると病原性を失う。Ｔｉ
プラスミドはＴ−ＤＮＡ（転移ＤＮＡ）と呼ばれる。腫
瘍では宿主植物のゲノムに組み込まれる領域を含む。こ
のＴ−ＤＮＡはいくつかの転写物をコードしている。変
異実験からこれらのうちのいくつかは腫瘍増殖の誘導に
関与することがわかった。ｔｍｌ　＋　ｔｍｒおよび展
遺伝子の変異は夫々巨大腫瘍（タバコで）。 種発生傾向、およびシュート誘導傾向になる。Ｔ−ＤＮ
Ａはまた少なくとも１つのオビンシンクーゼの遺伝子を
コードし、Ｔｉプラスミドはしばしばそれが合成を司る
オピンにより分類される。各Ｔ−ＤＮＡ遺伝子はＴ−Ｄ
ＮＡプロモーターの支配下にある。Ｔ　−Ｄ　Ｎ　Ａプ
ロモーターは構造では真核プロモーターに似ており、そ
れらは形質転換植物細胞でのみ機能するらしい。Ｔｉプ
ラスミドはまたＴ　−Ｄ　Ｎ　Ａ　？ｉｊ域の外側に遺
伝子を有する。これらの遺伝子はオビン異化１発癌性、
アゲロジン感受性、複製および細菌細胞への自己転移の
機能に関与する。旧プラスミドはＴｉプラスミドと類似
の様式で組織されている。植物細胞の形質転換に関与す
る遺伝子およびＤＮＡ配列の組は、以後、集合的に腫瘍
誘４説（ＴＩＰ　）のとおりに引用する。 したがってｒｌ））はＴｉとＲｉプラスミド両者を含む
。 ＴＩＰの組み込まれた区分をＴｉプラスミドあるいはＲ
１プラスミドいずれに由来しようと、ここではＴ−ＤＮ
Ａ”（転移ＤＮＡ）と呼ぶ。 Ｍ、−Ｄ、　ＣｂｉｌＬｏｎ　Ｄｕｎｅ　１９８３　）
　Ｓｃｉ、Δｍｅｒ、　２４Ｂ＋６１　：　５０−５９
．　は最近ベクターとしてのＴｉプラスミドの利用に関
する入門書を著した。アグロバクテリウム起因病の最近
の一般的総説には以下のものがある。Ｄ、Ｊ、　Ｍａｒ
ｌｏ　（１９８２）、　Ａｄｖ、　Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔ
ｈｏｌ。 １　：　１３９−１７８．　Ｌ、Ｗ、　Ｒｅａｍ　＆　
Ｍ、Ｐ、　Ｇｏｒｄｏｎ　（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ
　２１８　：　８５４−８５９．　およびＭ、Ｗ、　Ｂ
ｅｖａｎ　＆Ｍ、−Ｄ、　Ｃｈｊｌｔｏｎ　（１９８２
）、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、　１６：３５
７−３８４；Ｇ、Ｋａｈｌ　＆　Ｊ、５ｃｈｅｌｌ　（
１９８２）、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＢｉｏヨ１ｓトβＬ
ｙ−３≧１−一−Ｐ！↓ａｎｔ　Ｔｕｍｏｒｓ−とに、
八、Ｂａｒｔｏｎ　＆　Ｍ、＝Ｄ。 Ｃｈｉｌｔｏｎ　（１９８３）　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ、匪：　５２７−５３９゜アグロバクテリウム−
植物　織の感染 植物細胞は当業者に既知の以下の多くの方法によりアグ
ロバクテリウムで形質転換されるが、またこれらの方法
に限定されない：培養植物細胞とアグロバクテリウムの
共存培養、植物の直接感染。 植物プロトプラストとアグロバクテリウムのスフェロプ
ラストの融合、植物細胞プロトプラストによる遊離ＤＮ
Ａの取り込みによる直接形質転換。 部分的に細胞壁を再生しているプロトプラストの生細菌
での形質転換、プロトプラストのＴ−ＤＮＡ含有リポソ
ームによる形質転換、Ｔ−ＤＮＡを有するウィルスの利
用、顕微注射（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）など。 どの方法もｊ４伝子が確実に発現し、また有糸分裂、残
数分裂を通じて安定に伝達される限り−１−分である。 アゲｉコハクデリウＪ、による植物組織の感染は当業考
によく知られている単純な技術である（例えば、　Ｄ、
Ｎ、　ＢｕｔｃｌＩｅｒ　ｃ３　計、（１９８０）　ｉ
ｎ　Ｔｉ５ｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆ
ｏｒ　Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔｂｏ！ｏｇｉｓｔ、ｓ、　ｅ
ｄｓ。 １１、Ｓ、　ＩｎＢｒａｍ　＆　、夏、ｌ’、　１Ｉｅ
ｌ　ｇｅｓｏｎ、　ｐｐ、２０３−　２０８　参照）。 典型的には植物を多くの方法のいずれか。 例えば刃物でりノる。針で穴をあける。あるいは研磨剤
でごする。などで傷をつける。次いでこの傷に腫瘍１ｊ
Ｊ’ｊ＞ｆ！細菌を含む液をつける。仕植物体感染に対
する別の方法は、ポテトの塊茎ディスク（Ｉ）。 Ｋ、　八ｎａｄ　＆　Ｇ、１’、ｔｌｐｂｃｒｌｅｉｎ
　（１９７７）　八ｍｅｒ、Ｊ、Ｂｏｔ。 餅：　１５３−１５１ｉ　）あるいはタバコ茎の断片（
Ｋ、八。 ＢａｒＬｏｎ、　９１　ａｌ−、（１９８３）　Ｃｅ１
１３２　：　］０３３−１０４３）などの３Ｊ■織片の
感染である。感染後、腫瘍を植物ホルモン不含培地での
組織培養へ移すことができる。 ホルモン非依存性増グＩへは形質転換植物組織に典型的
なものであり、そのような組織の培養での通常の増殖条
件とは極めて対照的である（Ａ、Ｃ，Ｂｒａｕｎ（１９
５６）　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　１６　：　５３−５
６　）。 アグロバクテリウムはまた単離細胞、培養で生育した細
胞（Ｌ、　Ｍｒｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９７９）　
Ｎａｔｕｒｅ２７７　：　１２９−１３１）および単離
タバコプロトプラストに感染できる。後者の技術では１
新しい細胞壁の部分的再生の時間経過後、アグロバクテ
リウム細胞をしばらく培養に加え９次いで抗生物質によ
り殺す。Ｔ１プラスミドを保持するアグロバクテリウム
・チューメファシエンス細胞にさらされた細胞のみがホ
ルモン不含培地に置かれたとき、カルスを形成し得る。 大部分のカルスはオピン同化に関与する酵素活性を有す
ることがわかった。　他の研究者（Ｒ，Ｂ、ｌ１ｏｒｓ
ｃｌ＋　＆　Ｒ，Ｔ、Ｐｒａｌｅｙ　（１８Ｊａｎｕａ
ｒｙ１９８３）　１５ｔｈ　Ｍｉａｍｉ　Ｗｉｎｔｅｒ
　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）は共存培養による形質転換を報
告し、高い率（１０％以」−）でホルモン非依存増殖を
するカルスが得られ、これらカルスの９５％がオビンを
つくった。Ｍ、Ｒ，ＤａｖｅｙｅＬ　ａｌ、（１９８０
）　ｉｎ　Ｔｎｇｒａｍ　＆　Ｈｅｌにｅｓｏｎ、前出
。 ｐｐ、２０９−２１９．　はプロトプラストから再生し
た古い細胞の感染？Ｃ叩告した。 ４ｉ＆物プｕドブラストはＴ　Ｉ　ｌ）プラスミドの直
接取込めにより形質転換され得る。門、Ｉｌ、Ｄａｖｅ
ｙ　ｅｔ虹、　（１！１８０）　Ｉ月ａｎｔ　Ｓｃｉ、
ＬｅｔＬ、ｉｌｌ　：　３０７−３１３　およびＭ、Ｒ
，１）ａｖｅｙ倶　旦↓、（１９８０）　ｉｎ　Ｉｎｇ
ｒａｍ　１！１１ｅ１ｇｅｓｏｎ、前出、はポリ−１−
−−ａ−オルニチン存在下でＴｉプラスミドを用いてペ
チュニアのプロトプラスト 依存性増殖する表現型に，形質転換することができた。 ポリエチングリコール促進Ｔｉプラスミド取込みと，あ
るＴ　−　Ｄ　Ｎ　Ａ配列がゲノムに取込れることが後
に示された（Ｊ．Ｄｒａｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ−、（１９
８２）１’ｌａｎＬ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌ　ｌ’ｂｙｓｉ
ｏ１．　２３　：　４５１−４５８．　Ｍ．Ｒ。 Ｄａｖｅｙ　見（ａｌ．　（１９８２）　ｉｎ　Ｐｌａ
ｎｔ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ−Ｌ町Ｂ２．　ｅ
ｄ　：　Ａ．Ｆｕｊ商ａｒａ，　ｐｐ．５１５−５１６
）。Ｆ．八．Ｋｒｅｎｓｅｔ　ａｊ−、（１．９８２）
　Ｎａｔｕｒｅ　２９６　：　７２−７４．　はポリエ
チレングリコールと次いでカルシウムショックにより類
似の結果を報告したが．彼らの結果は．組み込まれたＴ
　−Ｄ　Ｎ　Ａは隣接するＴｉプラスミド配列を含むこ
とを示唆する。 ＤＮＡを取り込ませる別の方法にリポソームの利用があ
る。ＤＮＡ含有リポソームの調製はＰａｐａｈａｄｊｏ
ｐｏｕｌｏｓにより米国特許４，０７８，０５２と４、
２３５，８７１に述べられている。リポソームを介した
Ｔｉ−ＤＮＡの取込みに関する調製法が報告された（Ｔ
．Ｎａｇａｔａ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８２）　ｉｎ　
Ｆｕｊｉｗａｒａ，前出．　ｐｐ．５０９−５１０，お
よびＴ．Ｎａｇａｔａ　（１９８１）　Ｍｏｌ。 Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　１８４　：　１６１−］６５
）。類似の系に植物と細菌細胞の細胞壁除去後の融合が
ある。この方法の例はＳ．Ｉｌａｓｅｚａｗａ　ｅｔ　
旦．　（１９８１−）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ。 Ｇｅｎｅｔ．　１８２　：　２０６−２１０により報告
された。アグロバクテリウム・スフェロプラストによる
ビンカ（Ｖｉｎｃａ）・プロトプラストの形質転換であ
る。植物プロトプラストは細胞壁に欠陥のあるアグロバ
クテリウム細胞を取り入れることができる（Ｓ．ＩＩａ
ｓｅｚａｙａ　！鴇−］−．　（１９８２）　ｉｎ　Ｆ
ｕｊｉｗａｒａ，前出−　ｐｐ．５１７−５１８）。 Ｔ−ＤＮＡを，２つのプロトプラスト　の融合物から再
生したＭｉ織へ伝達することができ．そのうちの１つの
みが形質転換される（Ｇ，Ｊｊ＋ｌｕｌｌｅｍｓｅｔ　
ａｌ、（１９８０）　Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅ
ｎｅＬ、　５６　：　２０３−２０８）。植物の再生の
項で詳述するように、Ｔ−ＤＮＡは減数分裂を通して伝
わり、単純なメンデルの法則で子孫に伝達される。 アグロバクテリウム−植物の■生 正常な形態を有した分化植物組織がクラウンゴール腫瘍
から得られた。Ａ、Ｃ，Ｂｒａｕｎ　＆　１１．Ｎ、Ｗ
ｏｏｄ（１９７６）　Ｐｒｏｃ、ＮｎＬｌ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７３　：　４９６−５００゜はタバ
コ奇形種を正常植物につぎ木し、開花し１尋る正常に見
えるシュートを得ることができた。 このシュートはオピンを作り、培地に置くと植物ホルモ
ン非依存性増殖する能力を保持した。選ｙＪ１１された
植物では、これら腫瘍表現型の子孫への伝達は観察され
ず、見掛は上、減数分裂の間Ｇこ失われた（Ｒ，Ｔｕｒ
ｇｅｏｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９７６）　Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ。 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７３　：　３５６２−
３５６４）　、腫瘍の性質を自然に失った。あるいは奇
形種の種子から生じた植物は、最初すべてのＴ−ＤＮＡ
を失ったことが示された（Ｐ、−Ｍ、Ｙａｎｇ　ｅｔ　
ａｌ、（１９８０）　Ｉｎ　Ｖｉｔｒ。 １６　：　８７−９２．　Ｆ、Ｙａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、
（１９８０）Ｍｏｌｅｃ、　Ｇｅｎ。 Ｇｅｎｅｔ、　１７７　：　７０７−７１４．　Ｍルｅ
ｒｎｍｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８０）Ｊ、Ｍｏ１
．Ｂｉｏｌ、進：　３５３−３７６）。しかし、ホルモ
ン処理（１■／ｌカイネチン）後復帰した植物での後の
研究は、減数分裂を経過した植物は形質転換表現型に関
するＴ−ＤＮＡ遺伝子を失っているが。 Ｔ−ＤＮＡの両端に相同な配列を保持し得ることを示し
た（Ｆ、Ｙａｎｇ　＆　Ｒ，Ｂ、Ｓｉｍｐｓｏｎ（１９
８１）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｌｌ、Ｓ、Ａ、７８　：　４１５１
−４１５５）。Ｇ、ＪＪｕｌｌｅｍｓｅｔ　ａｌ、（１
９ｑｌ）　Ｃｅ１ｌ　２４　：　７１９−７２４はさら
に。 その植物は雄性不稔であるが、オピン同化に関与する遺
伝子は減数分裂を通して伝わり得ること。 および変化いていないＴ−ＤＮＡがメンデル法則で遺伝
できること示した（Ｇ、Ｗｕｌｌｅｍｓ　ｅｔ　ａｌ、
（１９８２）　ｉｎ　Ｆｕｊｉｗａｒａ、前出）。　Ｌ
、０ｔｔｅｎ　ｅｔ　ａｌ。 （１９８１）　Ｍｏ１ｅｃ　Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　１
８３　：　２０９−２１３．はシュートを生じる腫瘍生
成の展（シュート誘導）部位にＴｎ７　）ランスボソン
由来Ｔｉプラスミド変異を用いた。これらのシュートが
植物体へ再生するとき、彼らは自己稔性花を生ずること
を見出した。 生じた種子は発芽しＴ−ＤＮＡを含みオピンをつくる植
物になった。後の研究において、　１１．ＤｅＧｒｅｖ
ｅｅｔ　ａｔ、（１９８２）　Ｎａｔｕｒｅ　３００　
：　７５２−７５５．　はオクトピンシンターゼが単一
優性メンデル遺伝子として遺伝することができることを
見出した。しかし。 カルスから再生を行う間にＴ−ＤＮＡはｏｃｓより他の
機能の大きな欠失を受けた。ｔｍｒ　（根誘導）変異で
の同様の実験は、完全な長さのＴ−ＤＮＡが減数分裂を
通して子孫に伝わり得たこと、これらの子孫でツバリン
遺伝子がレヘルには変動があるが発現し得たこと、およ
び同時に転送された酵母のアルコールデヒドロゲナーゼ
■遺伝子は発現しなかつたごと（Ｋ、八、Ｂａｒｔｏｎ
　ｅｔ　ａｌ、（１９８３）Ｃｅｌｌ　３２　：　１０
３３−１０４３）を示した。今のところＴ−ＤＮＡ配列
を欠く再生組織は恐らく腫瘍に“混在している”非形質
転換細胞に由来するらしい（Ｇ。 Ｏｏｍｓ　旦　ａｌ、（１９８２）　Ｃｅ１ｌ　３０　
：　５８９−５９７）。Ａ。 Ｎ、Ｂ１ｎｎ５　（１９８３）　Ｐｌａｎｔａ　１５８
　：　２７２−２７９．による最近の研究は腫瘍の遺伝
子、この場合ｔｍｒ　、は再生の間は阻止されることが
でき、再生組織を培地に置くことにより“戻ってくる”
ことを示す。 アグロバクテリウム・リゾゲネスによる形質転換の結果
の根は比較的容易に苗に直接再生することが示された（
ｌｊ、−Ｄ、Ｃｈｉｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２
）Ｎａｔｕｒｅ　２９５　：　４３２−４３４）。 アグロバクテリウム−ＴＩＰプラスミド上の゛　云ヱ ＴＩＰプラスミドのＴ−ＤＮＡの中に多くの遺伝子が同
定された。約手ダースのオクトピンプラスミドＴ−ＤＮ
Ａの転写物がマツプされ（Ｓ、Ｂ。 Ｇｅ１ｖｉｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）　Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。 ＵＳＡ　７９　：　７６−８０．　Ｌ、Ｗｉｌｌｍｉｔ
ｚｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）ＥＭＢＯＪ、　１　
：　１３９−１４６）またいくつかの機能が明らかにな
った（Ｊ、Ｌｅｅｍａｎｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）
　ＥＭＢＯＪ。 １　：　１４７−１５２）。これら転写物のいくつか、
特にｔｍｒと虱をコードする領域のものはまた原核細胞
で転写され得る（Ｇ、５ｃｈｒｏｄｅｒ　ｅｔ　旦、（
１９８３）ＥＭＢＯＪ、　２　：　４０３−４０９）。 トランスボソン変異によりよくわかっているオクトピン
型プラスミドの４つの遺伝子にｔｍｓ　、　ｔｍｒおよ
びｔｍｌが含まれる（１５３）。これらの遺伝子に変異
のあるＴｉプラスミドは夫々ニコヂアナ・ツバカムの腫
瘍カルスを刺激し、シュートを発生させ、根を繁殖させ
１そして正常より大きくする。他の宿主では、これらの
遺伝子の変異は別の表現型となる（Ｍ、Ｗ、Ｂｅｖａｎ
　＆　Ｍ。 −Ｄ、　Ｃｈｉｌｔｏｎ　（１９８２）Δｎｎ、　Ｒｅ
ｖ、　Ｇｅｎｅｔ、　１６　：　３５７−３８４参照）
。旦と１五−の表現型は腫瘍に存在する植物ホルモンの
レベルの差と相関する。ザイトカイニン：オーキシン比
の差は、培養で非形質転換カルス組織にシュートを培養
するあるいは根を形成する差と似ている（Ｄ、Ｅ、Ａｋ
ｉｙｏｓｈｉ　ｅＬ　ａｌ。 （１，９８３）　Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ、八ｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、ＵＳＡ　８０　：　４０７−４１１）。展か展の一
方のみ、但し機能のある田辷単独ではないが、の機能す
る遺伝子を含むＴ−ＤＮＡは顕著な腫瘍増殖を助長でき
る。シュートとルートの助長は機能のあるＬｍｌ　によ
り夫々促進され、阻害される（Ｌ、Ｗ、Ｒｅａｍ　ｅｔ
　ａｌ、（１９８３）Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、Δｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０　：　１
６６０−１６６４）　、　Ｔ　ＤＮＡ遺伝子での変異は
”Ｉ”　−Ｄ　Ｎ　Ａの植物ゲノムへの挿入には影響が
ないらしい（Ｌｅｅｍａｎｓ　ｅｔ　ａｌ。 （１９８２）前出、　Ｒｅａｍ　旦　ａｌ、（１９８３
）前出）。 庄」−遺伝子はオクトピンシンターゼをコードし。 Ｈ，Ｄｅ　Ｇｒｅｖｅ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）　Ｊ
、Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ。 １　：　４９９−５１１．により配列が決定された。そ
れはイントロン（真核遺伝子に共通して見られる介在配
列で、転写後ｍＲＮＡの成熟の間にメソセンジャー前駆
体から切り出される）を含まない。それは真核の転写信
号（“ＴＡＴ＾ボックス″）とポリアデニル化部位を有
する。二遺伝子の発現に必要なすべての信号はｏｃｓ転
写開始部位の２９５ベースベアー内に見つかる（Ｃ，Ｋ
ｏｎｃｚ　ｅｔ　ａｌ、（１９８３）ＥＭＢＯＪ、２　
：　１５９７−１６０３）　。 ツバリンＴｉプラスミドはツバリンシンターゼ遺伝子（
ｎｏｓ　）をコードし、それは＾、Ｄｅｐｉｃｋｅｒ　
ｅｔａｌ、　（１９８２）　Ｊ、Ｍｏ１．八ｐｐ１．Ｇ
ｅｎｅｔ、Ｌ　：　５６１−５７３　により配列が決定
された。匹し遺伝子で見られたように二はイントロンで
分断されていない。それは２つの推定されるポリアデニ
ル化部位と可能性のある“ＴＡＴ＾ボックス”を有する
。ｏｃｓと対照的に虱は“ＣＡＴボックス”として知ら
れる転写信号らしい配列が前にある。虱遺伝子の発現に
必要なすべての信号が二転写開始部位の２６１ベースベ
アー内に見っがった（Ｃ，Ｋｏｎｃｚ劇、ａｌ、、前出
）。 アグロシノビンシンクーゼの遺伝子およびｂａ５と」Ｌ
に相当する遺伝子がツバリン型プラスミドで同定され（
ｉｌ、Ｊｏｏｓ　旦　旦、（１９８３）　Ｃｅ１ｌ　３
２　：１０５７−１００７）　、また多くの転写物がマ
ツプされた（Ｌ、Ｗｉｌｌｍｉｔｚｃｒ　ｅｔ　ａｌ、
（１９８３）　Ｃｅ１ｌ　３２　：　１０４５−１０５
６）　６．１．Ｃ，ＭｃＰｈｅｒｓｓｏｎ　ｅｔ　旦、
（１９８０）　Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７ニ乙：　２
６６６−２６７０．　はクラウンゴール組織のＴ　−１
）　Ｎ　ＡのコードするｍＲＮＡのインｅ’　ｌ−Ｉ：
ｒ翻訳を報告した。 毛状［ｉ　′Ｉ’　−Ｄ　Ｎ　Ａからの転写もまた検出
された（Ｌ、ＷｉｌｌｍｉＬ；＜ａｒ　ｅｔ　旦、（１
９８２）　Ｍｏ１Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ。 １８６　：　１Ｇ−２２）。機能的には、この毛状根の
症状は匠で変異したＴ１プラスミドにより刺激されたク
ラウンゴール腫瘍と同様に見える（Ｆ、Ｆ、Ｗｈｉｔｅ
　＆Ｅ、Ｗ、Ｎｅ５ｔｃｒ　（１９８０）　Ｊ、８ａｃ
ｔｅｒｉｏ１．　１４４　：　７１０−７２０）　。 真核生物ではＤＮＡのメチル化（特にシトシン残基の）
は転写の不活性化と相関している；比較的メチル化の少
ない遺伝子はｍＲＮＡへ転写される。Ｓ、Ｂ、Ｇｅ１ｖ
ｉｎ　ｅｔ　旦、（１９８３）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
１ｄｓＲｅｓ、　１１　：　１５９４７４．はクラウン
ゴール腫瘍のＴ−ＤＮＡには常に少なくとも１つメチル
化されていないコピーが存在することを見出した。同じ
ゲノムがメチル化されているＴ−ＤＮＡの多コピーを含
むであろうことは、１つ以上の過剰のＴ−ＤＮＡのコピ
ーは生物学的には不活性であるらしいことを示唆する（
またＧ、Ｏｏｍｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）Ｃｅｌｌ
並：　５８９−５９７参照）。 ＴｉプラスミドはＴ　−Ｄ　Ｎ　Ａ　９Ｍ域の外側にあ
り。 感染過程に必要な他の遺伝子をコードしている。 （ツバリンプラスミドについてはＭ、Ｈｏ１ｓｔｅｒｓ
　ｅｔａｌ、（１９８０）　ＰＩａｓｎ＋ｉｄ　３　：
　２１２−２３０．およびオクトピンプラスミドについ
てはＨ，Ｄｅ　Ｇｒｅｖｅ　ｅｔ　ａｌ。 （１９８１）　Ｐｌａｓｍｉｄ　６　：　２３５−２４
８．　ＤＪ、Ｇａｒｆｉｎｋｅｌａｎｄ　Ｅ、Ｗ、Ｎｅ
５ｔｅｒ　（１９８０）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　
１４４　：　７３２−？４３）およびＧ、Ｏｏｍｓ　（
１９８０）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１４４　：（
２−９１参照）。最も重要なのは匹遺伝子であり。 それが変異するとＴｉプラスミドの発癌性が失われる。 （これらの位置は毒性に対するｖｉｒ　としてまた知ら
れている）。い（つかの虱遺伝子は正確にマツプされて
おり３種々のＴｉプラスミド間で保存されている領域に
位置することがわかっている（Ｈｊ、ＫＩｅｅ　ｅＬ　
ａｌ、（１９８３）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５３
　：８７Ｂ−８８３，ν、Ｎ、Ｉｙｅｒ　ｅ％　ａｌ、
（１９８２）　Ｍｏ１．Ｇｅｎ。 Ｇｅｎｅｔ、　１８８　：　４１８−４２４）　、この
弘遺伝子はトランスで作用し、異なったプラスミド型の
Ｔ−ＤＮＡでの植物細胞の形質転換を起こすことができ
。 そして物理的に他のプラスミド上に存在する（Ｊ。 ３２７−３３１．　八、Ｊ、ｄｅ　Ｆｒａｍｏｎｄ　ｅ
ｔ　ａｌ、　（１９８３）Ｂｉｏｔｅｃｂｎｏｌ、　１
　：　２６２−２６９）。ツバリンＴｉＤＮＡは。 Ｔｉプラスミドからの切出しまたは宿主ゲノムへの取込
みに関与するらしいＴ−ＤＮＡの左および右境界にすく
に隣接した２５塩素対の順方向反復配列を有しくＮ、Ｓ
、Ｙａｄａｖ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）　Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ。 八ｃａｄ、Ｓｃｉ、υＳＡ　７９　：　６３２２−６３
２６）、そして類イ以の配列がオクトピンＴ−ＤＮＡ境
界に接していることが観察された（Ｒ，Ｂ、Ｓｉｍｐｓ
ｏｎ　ｅｔ　旦、（１９８２）Ｃｅｌｌ　２９　：　１
００５−１０１４）、オピン異化はオクトピンおよびツ
バリン型プラスミドの夫々匹（遺伝子おヨヒｎｏｃ遺伝
子により特異的に起こる。このＴｉプラスミドもまた複
製開始点を含むそれ自身の生成に必要な機能をコードす
る。Ｔｉプラスミドの転写物はＳ、Ｂ、Ｇｅ１ｖｉｎ　
ｅｔ　旦、（１９８１）　Ｐｌａｓｍｉｄ　６　：１７
−２９によりアグロバクテリウム・チューメファシエン
ス細胞に検出され、彼らはＴ−ＤＮＡ領域は非Ｔ−ＤＮ
Ａ配列に沿って弱く転写されることを見出した。Ｔｉプ
ラスミドが決定する性質についてはＭａｒｌｏ＋前出（
特に第２表参照）およびＲｅａｍ＆　Ｇｏｒｄｏｎ、前
出、による総説がある。 （以下余白） アグロハタテリウムーＴｉプラスミドＤＮＡ種々のオク
トピン型Ｔｉプラスミドは、ＤＮＡノｈイブリダイゼー
ション（Ｔ、Ｃ，Ｃｕｒｒｉｅｒ　＆　Ｅ、Ｗ、Ｎｅ５
ｔｅｒ（１９７６）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１２
６　：　１５７−１６５）あるいは制限酵素解析（Ｄ、
５ｃｉａｋｙ　ｅｔ　ａｌ、（１９７８）　Ｐｌａｓｍ
ｉｄｌ　：　２３８−２５３）で調べたところお互いに
ほぼ１００％類似している。ツバリン型Ｔｉプラスミド
はお互い６７％程度の類似性がある（Ｃｕｒｒｉｅｒ　
＆　Ｎｅ５ｔｅｒ、前出）。ある研究は異なったＴｉプ
ラスミドがお互いに極めて類似していることを示した（
Ｐ、Ｃｏ５ｔａｎｔｉ。 ｅｔ　ａｌ、（１９８１）　Ｐｌａｓｍｉｄ　５　：　
１７０−１８２）。Ｎ、１１゜Ｄｒｕｍｍｏｎｄ　＆　
Ｍ、−Ｉｌ、　Ｃｈｉｌｔｏｎ　（１９７Ｂ）　Ｊ、Ｂ
ａｃＬｅｒｉｏｌ。 １３６　：　１１７８−１１８３．はオクトピンおよび
ツバリン型Ｔｉプラスミドの比較的小さな区分はお互い
に類似していることを示した。これらの類似域ばＧ、Ｅ
ｎｇｌｅｒ旦虹、（１９８１）　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ＋
、且２　：　１８３−２０８．により詳しくマツプされ
た。彼らは４つの類似領域のうち３つが３　（Ｔ−ＤＮ
Ａに重なる）、４　（ある飢（遺伝子を含む）および９
　（鴎り遺伝子を有する）類似配列に細分類されること
を見出した。 連続した類イ以領域は少なくとも１つのｔｒａ遺伝子（
Ｔｉプラスミドの他の細菌細胞への接合伝達に関する）
と複製と不和合性に関する遺伝子を含む。 この連続した領域はりゾピアシー科の別の属であるリゾ
ビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の一種にある展プラスミ
ド（共生窒素固定に関与する）と類似性がある（Ｒ，に
、Ｐｒａｋａｓｈ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）　Ｐｌ
ａｓｍｉｄ　７　：２７１−２８０）。４つの領域はす
べて同一方向に配置しているが順序は保存されていない
。Ｔ−ＤＮＡ配列の一部はツバリンおよびオクトビンプ
ラスミド間で極めて高度に保存されている（Ｍ、−Ｄ、
Ｃｈｊｌｔｏｎｅｔ　ａｌ、　（１９７８）　Ｎａｔｕ
ｒｅ’２７！Σ　：　１４７−１４９．　八、Ｄｅｐｉ
ｃｋｅｒｅｔ　ａｌ、（１９７８）　Ｎａｔｕｒｅ　２
７５　：　１５０−１５３）　、　Ｒｉプラスミドはそ
れら自身の間で、およびオクトピン（Ｆ、Ｐ、Ｗｈｉｔ
ｅ　＆　Ｅ、Ｗ、Ｎｅ５ｔｅｒ　（１９８０）　Ｊ、Ｂ
ａｃｔｅｒｉｂｌ。 １４４　：　７１０−７２０）およびツバリン（Ｇ、Ｒ
１５ｕｌｅｏ　ｅｔａｌ、（１９８２）　Ｐｌａｓｍｉ
ｄ　７　：　４５−５１）両プラスミドに対し主に二遺
伝子をコードする領域に対し５極めて類似性があること
が示された。Ｒ４Ｔ−ＤＮＡは両型のＴｉプラスミドの
Ｔ−ＤＮＡに対し弱いながらも、かなり類似部分を含む
（Ｌ、Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒｅｔ　ａｔ、（１９８２）
　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　１８６　：　１６−
２２）。 感染していないニコチアナ・グラウカの植物Ｄ　ＮＡは
ｃＴ−１）ＮＡ（細胞１’　−Ｄ　Ｎ　Ａ　）と呼ばれ
る配列を含んでおり、１ｌｉＴ−１）Ｎへの一部に類似
性を示す（Ｆ、Ｉ’、Ｗｔ＋ｉ　Ｌａ　ｙ−（ａｔ、（
１９８３）　ＮａＬｕｒｅ　３０↓；３４８−３５０．
　Ｌ、５ｐａｎＱ　ｅｔ、　、］↓、　（１９８２）　
Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃ。 Ｂｉｏｌ、　］−：　２９１−３００）。Ｇ、Ａ、ｌｌ
ｕ［ｍａｎ　ｅｔ　ａｔ、　（１，９８３）Ｊ、１ｉａ
ｃｔｅｒｉｏ１．、ば交叉ハイブリダイゼーションの領
域をマツプし、またＲｉプラスミド、つまり。 ｐＲｉ八４へ）、はｐ１’１Ｔ３７よりｐＴｉ八６へオ
クトビン型）に近く、この旧プラスミドはｔｍｒ−では
なく釦とに類似の配列をイ１するらしいことを示した。 彼らの結果はまた１ぜｉ　Ｔ　−Ｌ）　Ｎ　Ａはオクト
ピンＴ−ＤＮＡの場合に似ζ不連続であるらしいことを
示唆した。 Ｔｉ　（Ｍ、Ｉｌ、Ｃｈｉｌｔｏｎ　ｅ５　ａｌ−、（
１９７７）　Ｃｅ１ｌ　誹２６３−２７１）　Ｊ−、た
はＩｌｉ　（Ｍ、　ｌ）、ＣＩ＋１ｌＬｏｎ　（１９８
２）　Ｎａｔｕｒｅ刈Ｌ：　４３２４３４．　Ｆ、Ｉ’
、ＷＩ＋ｉＬｅ　ｅｔ・ａｌ、（１９８２）Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ＜：ｉ、ＵＳＡ　７９　：　３
１９３−３１９７．　Ｌ、Ｗｉｌｌ−ｍｉｔｚｅｒ　（
１９１Ｊ２）　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　１８６
　：　１６−２２）プラスミドの一部が腫瘍植物細胞の
ＤＮＡにみられることが示された。転移したＤＮＡはＴ
−ＤＮＡとして知られる。Ｔ−ＤＮＡは核内の（Ｍ、Ｐ
、Ｎｕｔｉ斜旦、（１９８０）　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、
Ｌｅｔｔ、　１８　：　１−６．　Ｌ。 Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ　ｅｔ　、ｉｌ、（１９８０）　
Ｎａｔｕｒｅ　２８７　：　３５９−３６１、　Ｍ、−
Ｄ、Ｃｈｉｌｔｏｎ　ｐｉ　ａｌ、（１９８０）　Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７７　：　４０６０−４
０６４）宿主ＤＮＡ（Ｍ。 Ｆ、Ｔｂｏｍａｓｈｏｗ　ｅｔ　旦、（１９８０）　Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７７　：　６４４８−６４５２．　Ｎ
、Ｓ、Ｙａｄａｖ　ｅｔ　ａｌ。 （１９８０）　ｔＪａｔｕｒｅ　２８７　：　４５Ｂ−
４６１）に組み込まれる。 Ｍ、Ｆ、Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ　ｅｔ　旦、（１９８０）
　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７７　：　６４４８−６４５２およ
びＭ、　Ｆ、Ｔｈｏｍａｓｈｏｗｅｔ　ａｌ、（］９８
０）　Ｃｅ１ｌ　１９　：　７２９−７３９．はオクト
ピン型Ｔ１プラスミドのＴ−ＤＮＡが２つの別の区分。 Ｔ−ＤＮＡの夫々の左、右のＴ　Ｌ　−Ｄ　Ｎ　ＡとＴ
Ｒ−ＤＮＡに組み込まれたことを見つげた。ＴＲとＴＬ
のコピー数は変動する（ＤＪ、Ｍｅｒｌｏ　ｅｔ　ａｌ
。 （１９８０）　Ｍｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　１
７７　：　６３７−６４３）　、　Ｔ−ＤＮＡの中芯は
ツバリンＴ−ＤＮＡが類似性が高＜　（Ｃｈｉｌｔｏｎ
　ｅｔ　ａｌ、（１９７８）前出、およびＤｅｐｉｃｋ
ｅｒ　ａｔ　ａｌ、（１９７８）前出）、腫瘍維持に必
要で、”ｌ’Ｌにあり、一般に細胞当り１コピー存在し
、ｔｍ４−、−、釦りおよび田し遺伝子をコードする。 一方、ＴＲは多いコピー数存在するが（Ｍｅｒｌｏ旦旦
、（１９Ｂ（１）前出）全（なくても良い（Ｍ、ＤｅＢ
ｅｕｃｋｅｌｅｅｒ　ｅＬ　ａｌ、（１９８１）　Ｍｏ
１ｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ。 ７　：　１５−２９．はＴ　ＲがＴｉプラスミドから欠
失しても。 アグロハタテリウＪ、・チューノファシエンスはいくら
か毒性を保持していることを見出したが、ＴＲがＴ−Ｄ
ＮΔｈ■み込みに関与すると仮想した。 Ｇ、Ｏｏｍｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）　Ｃｅ１ｌ
　３０　：　５８９−５９７は１”　−Ｄ　Ｎ　Ａは時
に植物ゲノムへ組み込まれた後欠失するが、−・＋’ｌ
Ａに安定であり、またＴ−Ｄ　Ｎ　Ａの組織化が異なる
細胞の混合物を含む腫瘍は多重感染の結果であることを
示した。竺遺伝子はＴＬに見つかるが、腫瘍生育に関連
する表現型を失うことなく植物ゲノムから欠失し得る。 組み込まれたＴｌ−の左側境界は順方向あるいは逆方向
配列いずれかのＴ　−Ｄ　Ｎ　Ａ配列の反復か、
【るこ
とが観察された（Ｒ，Ｂ、Ｓｉｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ
、（１９８２）　Ｃｅ１１社：　１００５−１０１４）
。 オクトビン型腫瘍の立場と対照的に、ツバリンＴ−ＤＮ
Ａは１つの連続した断片として宿主ゲノムに組み込まれ
る（Ｍ、１．ｅｍｍｅｒｓ　ｅｔ　旦、（１９８０）Ｊ
、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１４４　：　３５３−３７６、　
Ｐ、Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ　ｅｔａｌ、（１９８０）　５
ｃｉｅｎｃｅ　２０９　：　１３８５−１３９１）。順
方向に連続した反復配列が見受けられた。奇形種から再
生した植物のＴ−ＤＮＡは挿入１）　Ｎ　Ａの境界断片
でのわずかな修飾を有する（Ｌｅｍｍｅｒｓ　ｅＬ　ａ
ｌ、。 前出）。右および左境界間の結合部の配列の解析から多
くの順方向反復と１つの逆方向反復が明らかになった。 　後者は結合部にまたがっていた（Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ
旦　旦、（１９８０）前出）。左側結合部は少なくとも
７０塩基対が変動していたが、他方。 右側結合部は１塩基より多くは変わらなかった（Ｐ、Ｚ
ａｍｂｒｙｓｋｉ　ｅｔ　旦、　（１９８２）　Ｊ、Ｍ
ｏ１ｅｃ、八ｐｐ１．Ｇｅｎｅｔ。 １　：　３６１−３７０）。一連の反復の結合部の左お
よび右境界は１３０塩基対以上の間隔で分析されて存在
する。この間隔は起源が不明でまたあるＴ−ＤＮＡ配列
を含む。Ｔ−ＤＮＡは両方の繰り返しおよび低コピー数
の宿主配列に組み込まれることが見出された。１１．Ｊ
ｏｏｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９８３）　Ｃｅ１ｌ　３２　
：　１０５７−１０６７、は毒性は通常のツバリンＴ−
ＤＮＡ境界のどちらかの欠失後もなくならないことを示
した。 Ｓｉｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）前出、およ
びＺａｍｂｒｙｓｋｉ史　計、（１９８０）前出、は境
界領域の順方向反復はＴ−ＤＮＡの植物ＤＮＡへの組み
込みに関与することを示唆した。２つの異なったＴｉプ
ラスミド由来の境界を有するＴ−ＤＮＡは、類イ以の境
界を有するものより特異的に組み込まれにくいことはこ
の示唆を支持する（Ｇ、Ｏｏｍｓ　ｅｔ　旦、（１９８
２）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃ、　１ｌｉｏ１．１　：　
２６５−２７６）。 Ｎ、Ｓ、Ｙａｄａｖ　ｅＬ　ａｌ、　（１９８２）　Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ。 Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９　：　６３２２−６３２６．は
バクテリオファージλでｌ０ｋｌ＋離れた周囲のＤＮＡ
に一般組み換えを増大させるｃｌ＋ｉ　部位をツバリン
Ｔｉプラスミド中のＴ−ＤＮＡの左端のすぐ外側に見出
した。　Ｒ，Ｂ。 Ｓｉｍｐｓｏｎ　ｅＬ　ａｌ、（１９８２）　Ｃｅ１ｌ
　２９　：　１００５−１０１４はオクトピンＴｉプラ
スミドにはｃｈｉ配列を見出さなかったが５作用の範囲
を考えると必ずしも可能性を排除するものでなく、配列
された領域の外側にあるかも知れない。Ｔｉプラスミド
でのｃｈｉの意義は不明である。もし紅が機能を有して
いるとすれば＋　ｃｂ＋がＴ−ＤＮＡ内に見つからない
ので。 それは、多分植物内ではなくアグロバクテリウム細胞内
で使われるだろう。 アグロバクテリウム−ＴＩＰプラスミドの１シヤトルベ
クターの項で詳述したように、変化したＤＮＡ配列をＴ
ＩＰプラスミドの所望位置に導入する技術が発達した。 トランスポランはこの技術を用いて容易に挿入され得る
（Ｄ、Ｊ、Ｇａｒｆｉｎｋｅ１６５６、はＴｉプラスミ
ド中のＴ−ＤＮＡに挿入されたＤＮＡ配列（ここでは細
菌のトランスポラン）が受容植物のゲノムに転移し組み
込まれることを示した。外来ＤＮＡの挿入が異なった起
源の多数の遺伝子を用いて行われたが、今迄のところ外
来遺伝子は通常それら自身のプロモーターの支配下では
発現されなかった。これら遺伝子の起源とした酵母のア
ルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ）　（Ｋ、Ａ。 Ｂａｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８３）　Ｃｅ１ｌ　
３２　：　１０３３−１０４３）。 トウモロコシの閃ｈ　Ｉ　（Ｊ、Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ、
未発表）およびゼイン、咄乳類のインターフェロンとグ
ロビン、および咄乳類ウィルスＳＶ　４０　（Ｊ、５ｃ
ｈｅｌｌ、未発表）がある。しかしノバリンシンクーゼ
遺伝子をオクトピンｉ’　−Ｄ　Ｎ　Ａに挿入し植物組
織に導入した場合、完全に機能を発揮した（Ｃ，Ｌ、Ｆ
ｉｎｋ（１９８２）Ｍ、Ｓ、ｔｌ＋ａｓｉｓ、　１ｌｎ
ｊｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｊｓｃｏｎｓｉｎ−Ｍａｄ
ｉｓｏｎ）。 豆のファセオラス・ブルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓν
ｕ１ｇａｒｉｓ）　Ｌ、の種子に存在する貯蔵タンパク
であるファセオリンをコードする遺伝子がヒマワリの腫
瘍に導入され２発現した。この後者の研究は転移した植
物遺伝子が異なる植物組織内で、それ自身のプロモータ
ーの支配下で発現した最初の例である。転写は正しい位
置で始まりそして終り。 そしてイントロンは転写後に適切に処理された（Ｔ、Ｃ
，Ｈａｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、　ＵＳ　ａｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎ　ｓｅｒ、　ｎｏ、４８５＋ｆｉ１３゜これをこ
こで引用文献として採用する）。Ｍ、Ｈｏ１ｓｔｅｒｓ
　ｅｔ　ａｌ、（１９Ｂ２）　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎ
ｅｔ、　１８５　：２８３−２８９．　はＴ−ＤＮＡに
挿入されたａｔ菌トランスホソ７　（Ｔｎ７　）が植物
ゲノムに取り込まれた後完全に機能を果たし、かつ形が
変化していないらしいことを示した。 欠失はいくつかの方法でＴＩＰプラスミドに起こさせ得
る。シャトルベクターを、標準組み換えＤＮＡ技術（Ｃ
ｏｈｅｎ　＆　Ｂｏｙｅｒ、ＵＳ　Ｐａｔ、　４，２３
７，２２４）により作られた欠失の導入に用いることが
できる。 一方のあらかじめ決定された末端を有する欠失はトラン
スポランの不適当な切出しにより作り出される　（Ｂ、
Ｐ、Ｋｏｅｋｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９７９）　Ｐｌ
ａｓｍｉｄ　訂３４７−３５７．およびＧ、Ｏｏｔｇｓ
　ｅｔ　旦、（１９８２）　Ｐｌａｓｍｉｄ？　：　１
５−２９）。Ｊ、Ｈ３ｌｌｅ　＆　Ｒ，５ｃｈｉｌｐｅ
ｒｏｏｔ　（１９８１）Ｐｌａｓｍｉｄ　６　：　１５
１−１５４．は両末端があらかじめ決定された位置を有
する欠失を２つのトランスポランを用いて作り得ること
を示した。この技術はまたインビボ“組み換えＤＮＡ”
分子作成に用いることもできる。 ツバリンシンターゼ遺伝子は、形質転換植物細胞の選別
ムご用いることができる薬剤耐性をコードするＤＮＡ区
分の挿入に用いられた。植物細胞では、　Ｔｎ５からの
カナマイシン耐性遺伝子はそれ自身のプロモーターの支
配下で転写されない（Ｊ、Ｄ。 Ｋｅｍｐ　ｅｔ　旦、（１Ｂ　Ｍａｙ　１９８２）　Ｂ
ｅ１ｔｓｖｉｌｌｅ　Ｓｙｍｐ。 ■、　Ｂｅ１ｔｓｖｉｌｌｅ、　ＭＤ；　（１９８３）
　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉ、ｎｅｅｒｉｎｇ：
　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｔｏ＾Ｂｒ１ｃｕｌＬｕ
ｒｅ、　ｅｄ、　Ｌ、Ｄ。 Ｏｗｅｎｓに掲載される；およびＣ，Ｌ、Ｆｉｎｋ　（
１９８２）。 ｎ’＋ｊ出）　、　１１．Ｗ、Ｂｅｖａｎｅ↓　ａｌ、
（１９８３）　Ｎａｔｕｒｅ　３０４：１８４−１８７
とＲ，Ｔ、Ｆｒａｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）
　Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０　：　４８
０３−４８０７．　はＴｎ５　のカナマイシン白（性遺
伝子（ネオマイシンフォスフオドランスフェラーゼＨ）
をツバリンプロモーターの後（すなわち、その支配下）
に挿入した。この作成物は培養でカナマイシンおよびＧ
４１８のようなそのアナログに耐性を示す植物細胞への
形質転換に用いられた。　Ｊ、５ｃ１１ｅｌｌ　ｅＬ　
旦、（１８Ｊａｎｕａｒｙ　１９８３）　１５Ｌｈ　Ｍ
ｔａｍｉ　Ｗｉｎｔｅｒ　Ｓｙｍｐ、　（Ｊ、Ｌ。 Ｍａｒｘ　（１９８３）　５ｃｉｅｎｃｅ　２１９　：
　８３０も参照）８．は同様の作成物を報告し、これに
はＴｎ７からのメトトレルキサメート耐性遺伝子（ジハ
イドロフォレート　リダクターゼ）がツバリンシンター
ゼのプロモーターの後に位置した。形質転換細胞はメト
トレキサメートに耐性であった。同様にり、ｔｌｅｒｒ
ｅｒａ−Ｆ、５ｔｒｅｌｌａ　ｅｔ　ａｌ、（１９８３
）　Ｎａｔｕｒｅ　３０３　：　２０９−２１３は植物
細胞でオクトビンシンターゼおよび細菌でクロラムフェ
ニコール耐性を与える酵素、クロラムフェニコールトラ
ンスアセチラーゼの酵素活性。 をこれら２つの酵素の構造遺伝子を！プロモーター支配
下におくことにより発現させた。 ここで引用文献として採用するＴ、Ｃ，Ｉｆａｌｌ　ａ
ｔ旦、、　ＵＳ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｓｅｒ、　
ｎｏ、４８５，６１４．はニプロモーターとオクトビン
シンターゼ構造遺伝子の５゛末端を豆種子クンバク、フ
１セオリンの構造遺伝子に融合させた。オクトビンシン
ターゼのアミノ末端を有しファセオリンのアミノ末端を
欠く融合タンパクがＴ−ＤＮＡプロモーターの支配下で
生産された。ファセオリン配列に介在するイントロンは
転写後に正しくプロセッシングされた。 八ｊ、ｄｅ　Ｆｒａｍｏｎｄ　ｅＬ　ａｌ、　（１９８
３）　旧ｏｔｅｃｈｎｏｌ。 １　：　２６２−２６９．は“小−Ｔｉプラスミド（ｍ
ｉｎｉ　−Ｔｉプラスミド）の作成を報告した。ツバリ
ンＴ−ＤＮＡには制限酵素ＲＬＩの切断部位は正常には
１ケ所しか存在しない。この部位を欠く変異が作成され
、完全なツバリンＴ−ＤＮＡを含むＫｐｎ　Ｉ断片が単
離された。この断片はカナマイシン耐性遺伝子と共にｐ
ＲＫ２９０に挿入され、これによりアグロハクテリうム
・チューメファシェンスで維持され、殆どずべ”この非
１’　−１）　ＮΔ１’ｉ配列を欠くプラスミドかでき
た。それ自身では、このプラスミドは植物細胞を形質転
換できなかった。しかしオクトビンＴｉプラスミドを含
むアグロバクテリウム・チューメファシエンス株に入れ
ると両オクトビン。 ツバリンを合成する腫瘍が誘導された。この小−Ｔｉプ
ラスミドはまた。それ１月のＴ−ＤＮＡを欠失したＴｉ
プラスミドで相補した場合、植物細胞に移された。これ
らの結果は、非Ｔ　−Ｄ　Ｎ　ＡはＴ−ＤＮＡと１−ラ
ンスで作用し、失われたツバリンＴｉプラスミドの機能
はオクトピンＴｉプラスミドで相補され、そして非ツバ
リン“小−Ｔビは植物細胞の形質転換にａ能的であるこ
とを示した。オクトビンＴ−ＤＮＡあるいはｏｎｃ−遺
伝子のいずれかを含む類似の各相補プラスミドの対がＡ
、Ｈｏｅｋｅｍａｅｔ　ａｌ、（１９８３）　Ｎａｔｕ
ｒｅ　３０３　：　１７９−１８０．により作成された
。 Ｃｈｉｌｔｏｎ　ａｔ　ａｌ、（１８Ｊａｎｕａｒｙ　
１９８３）　１５ＬｈＭｉａｍｉ　Ｗｉｎｔｅｒ　Ｓｙ
ｍｐ、＋　もまた、小−ＴｉをＳｍａ　ｒで処理し１本
質的にはＴ−ＤＮＡのすべてを欠失させ、ツバリンシン
ターゼ遺伝子と左右境界のみを残した”微−Ｔｉ”　（
ｍｉｃｒｏ−Ｔｉ）プラスミドの構築を報告した。この
倣−ＴｉをＳｍａ　１部位をなくした修飾ｐＲＫ２９０
プラスミドに挿入し、小−Ｔｉと同様にして用い、同し
ような結果を得た。 （発明の要旨） 本発明の目的は植物に害虫耐性、特に昆虫耐性を与える
ことにある。この最終目標に到達するのに、他の目的と
して、殺虫性タンパクをコードずる遺伝子を植物細胞の
ゲノムに安定に挿入すること、この遺伝子を植物細胞で
発現させること、調節あるいは構成的に発現させること
、およびこの植物組織が正常植物となることである。他
の目的は、植物について新規の特殊な殺虫性組織をつく
ること、特に正常な双子葉植物に、その組織内に殺虫性
タンパクを含む瘤を作らせる方法を確立することである
。他の目的および利点は以下の記述からｊ３）’］らか
になるであろう。 ここに開示する発明は、導入され、植物の発現プロモー
ターの支配下で発現する殺虫構造遺伝子を有する。遺伝
的に修飾された植物細胞を含む植物を提供する。さらに
本発明は、植物発現プロモーターの支配下で植物細胞内
で発現するような。 そのプロモーターに関し、方向と位置に挿入された殺虫
構造遺伝子を有するＴ−ＤＮＡを、そのゲノムに含む植
物細胞を有する植物組織を提供する。 またＴ−ＤＮＡを含有し、複製する新規細菌株をも提供
する。ここで、Ｔ−ＤＮＡとは、植物細胞内で植物発現
プロモーターの支配下で発現するような方向と間隔とを
該プロモーターに関し有する挿入殺虫構造遺伝子を含む
よう修飾されている。 さらに１本発明はエセリシア・コリー内で複製能を有し
、かつＴ−ＤＮＡを含み、そしてさらに植物発現プロモ
ーターの支配下で植物細胞内で発現するように、該プラ
スミド内に含まれるＴ−ＤＮＡ内に挿入された殺虫構造
遺伝子を含む新規プラスミドを提供する。さらに本発明
は殺虫構造遺伝子がエセリシア・コリーまたはバチルス
・サチルス内で発現可能な新規プラスミドを開示し、さ
らにまた前記細菌発現プラスミドを保持する細菌株を開
示する。 本発明は、植物細胞内で発現するプロモーターの支配下
にある殺虫構造遺伝子を含む。該プロモーター／遺伝子
の組合せは、さらに詳細には、好ましい実施態様におい
て、ここに開示する本発明はさらに、Ｔ−ＤＮＡを介し
て導入後、すなわち殺虫構造遺伝子をＴ−ＤＮＡへ植物
発現プロモーターの支配下に挿入しそして本挿入物を含
む該Ｔ−ＤＮＡを既知の方法を用いて植物細胞に導入後
。 殺菌構造遺伝子を植物細胞内で植物発現プロモーター支
配下にて発現させることをも包含する。 本発明は種々の細菌種または株の有用な殺虫構造遺伝子
を挿入することにより遺伝的に植物組織および全植物体
を修飾するのに有用である。そのようなを用殺虫構造遺
伝子は以下に定義される殺虫タンパク、特にバチルス・
チューリンゲンシスの結晶タンパク、関連タンパク等、
をコードする遺伝子を含むが、これに限らない。本発明
はバチルス・チューリンゲンシスｖａｒ、クルスタキ（
Ｂ。 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｖａｒ、　ｋｕｒｓｔａ
ｋｉ）　１１０−７３の結晶タンパクの構造遺伝子の綿
またはタバコ植物細胞への導入と発現により例Ｂ止され
る。一度植物発現プロモーター支配下で殺虫構造遺伝子
の発現する植物細胞が得られれば、植物組織および全植
物体をそれから、当業−Ｈに周知の方法と技術を用いて
、再生させることができる。再生し、た植物を次いで通
常の方法で生育させ５そして導入された遺伝子を通常の
植物育種技術により他の株や栽培物に移すことができる
。 殺虫タンパクの構造遺伝子の導入と発現はツノムシ（マ
ンドカ種（Ｍａｎｄｕｃａ　ｓｐ、））またはヨーロッ
パトウモロコシ喰い虫（オストリニア・ヌビラリス（Ｏ
ｓｔｒｉｎｉａ　ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）　）などのよう
な昆虫幼虫の蔓延から作物を守るのに用いることができ
る。本発明の他の利用、すなわち他の植物種へ導入され
た他の殺虫構造遺伝子の性質の探究は当業者には容易に
わかるだろう。本発明は原理的には。 外来ＤＮＡ　（より具体的にはＴ−ＤＮＡ）が導入され
、該ＤＮＡが安定に複製を維持できるいかなる植物種へ
の、殺虫構造遺伝子のいかなる導入にも応用される。　
一般にこれらの分類群は現在。 以下のものを含むが、これに限られない；ヒマワリ　（
キク　（Ｃｏｍｐｏｓ　ｉ　ｔｅａｅ）科）、タバコ　
（ナス　（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）科）、アルファルフ
ァ、大豆および他の豆類（マメ　（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓ
ｅａｅ）科）、綿（アオイ　（Ｍａ　１　ｖａｃｅａｅ
）科）および大部分の野菜などの裸子植物および双子葉
植物。本発明の手段により制御されるであろう害虫およ
び保護されるであろう作物は夫々第１，２表に列挙した
ものを含むが。 これに限らない。多くの幼虫に対する感受性の故に綿は
殺虫タンパク遺伝子の挿入に最も理想的な候補である。 以下の各々は主な綿の害虫であり。 またバチルス・チューリンゲンシス殺虫タンパクに感受
＋’ｌである：ヘリオシス・ゼア（ｌｌｅｌｉｏｔｈｉ
ｓｚｅａ　）　（：ｌノトン示−ルウオーム）、ペクチ
オノフォラ・ゴジビコニラ（Ｐｅｃｔｉｏｎｏｐｂｏｒ
ａ　ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ　）（ピンクボールウメー
ム）、ヘリオンス・ビレセンス（ｌｌｅｌｉｏｌ、ｈｉ
ｓ　ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ　）　（タハコハノドウメーム
）、Ｌリコブルシア・二（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　
ｎｌ）（キヤへ、シル−バー）。胞子形成しているバチ
ルス　チューリンゲンシスから調製した殺虫タンパクは
野のりタアカミムシのような昆虫には、その特殊なη−
活環と食飼；シ１性のために効かない。組織中に殺虫タ
ンパクを含む植物はこの１割性型の昆虫をも制御するだ
ろうし、バチルス・チューリンゲンシスの先の殺虫性利
用以上の利点を櫂供する。 殺虫タンパクを植物組織へ取り込ま−Ｕることにより１
本発明は不揃いな応用例を排除し、また殺虫性標品の１
％人と田畑への応用の価４８面でも先の利用法を凌ぐ利
点を提供する。また本発明は、小さな幼虫は殺虫タンパ
クに最も感受性が強く、またこのタンパクは常に存在し
また幼虫のエサとして早期に使われる結果２作物の害を
最小にするので。 このような標品の応用に注意深く時期を選ぶ必要性もな
い。 く以下余白） 以下に本発明を詳述する。 発明の詳細な説明および特許請求の範囲における用語の
不明瞭さを除くために以下の定義を採用する。 Ｔ　−Ｄ　Ｎ−Ａ　：植物ゲノムに組み込まれる形質転
換誘導説に基づ＜　ＤＮＡ区分。ここで用いる場合。 本用語は本来アグロバクテリウム・ヂューメファシエン
スおよびアグロバクテリウム・リゾゲネスを含むアゲ１
１Ｊハタチリウムの腫１ｇ　ＦＡ導株に由来するｌ）　
ＮＡを含み、後者の細菌の挿入区分は従来の文南ノ、で
はＩｌｉ′ＩｋＲ−１）　Ｎ　Ａと称された。さらにこ
こで用いる場合、用言￥Ｈ−ｒ　−Ｄ　ＮＡは自然発生
的あるいは実験室内操作により加えられたいかなる変化
修飾、変質、置換、挿入および欠失を含み、そのような
修飾に要求されまた限定される木質的な構造は、Ｔ−Ｄ
ＮＡの特性である形質転換細胞ゲノム内で期待される安
定な組み込みを保証するために自然に存在するＴ−ＤＮ
Ａの左右両端が充分に存在するというものである。この
Ｔ　−Ｄ　Ｎ　Ａはそれ自身、自然のあるいは合成の多
数の起源に由来する区分の混成物であろう。さらにこの
Ｔ−ＤＮＡは挿入された殺虫構造遺伝子の転写の開始お
よび翻訳の開始を制御するために充分完全な形で。 少なくとも１つの植物発現プロモーターを殺虫構造遺伝
子の挿入位置の５゛側あるいは゛上流”に含まなければ
ならない。このプロモーターはＴ−ＤＮＡ遺伝子、植物
遺伝子、あるいは少なくとも１つの組織および少なくと
も１つの発達段階の植物細胞内で機能するプロモーター
を有する他の遺伝子に由来するだろう。できれば挿入部
位は、プロモーターにより開始される転写および翻訳の
方向の“下流”　（プロモーターに対して３′）にあり
、したがってプロモーターに関して、そこに挿入された
殺虫構造遺伝子がそのプロモーターの支配下で直接ある
いは融合タンパクとして発現することができる位置にあ
るのが良い。木Ｔ−ＤＮＡはまた殺虫構造遺伝子の挿入
位置の下流に３゛非翻訳領域を含むかも知れない。この
領域は転写の終止、ポリアデニル化、および転写後のＲ
ＮＡプロセソシングを制御する機能を有するだろう。さ
らには融合タンパクもまた殺虫構造遺伝子と３”翻訳領
域を提供する構造遺伝子の３′末端との間で形成される
かも知れない。このプロモーターと３″非翻訳領域要素
は同一のあるいは異なった既存の遺伝子に由来するかも
知れないし、また同一のあるいは異なった植物、Ｔ−Ｄ
ＮＡあるいは他の起源に由来するかも知れない。例えば
ここで例証されるように、殺虫構造遺伝子は植物遺伝子
プロモーターと同じ遺伝子の３°配列の間に存在し得る
し、また同一のあるいは異なった植物種またはＴ　−１
）　Ｎ　Ａに由来する１つの遺伝子の３”非翻訳領域と
他のプロモーターからなる物でもあり得る。ここで定義
されるように植物遺伝子のコード領域は植物遺伝子の構
造部分のｃＤＮＡコピーを含むだろう、プロモーターと
３°非翻訳領域または自然あるいは人工的に誘導された
修飾を含むだろうし、また化学的に合成された区分も含
むだろう。 墓ＪＥｌ三ｊ！二久ニー：ここで用いる場合、Ｔ−ＤＮ
Ａ自身の遺伝子に対して外部にある前記植物遺伝子の調
節要素を含み、またさらに構造要素を含むだろう。これ
らはファセオリンおよびリプロースート５−ニリン酸カ
ルボキシラーゼの小サブユニットの遺伝子のプロモータ
ーを含むが、これに限らない。さらに植物遺伝子プロモ
ーターは転写の開始と翻訳の開始を提供しまた調節する
であろう遺伝子の領域である。さらにこの植物構造遺伝
子配列（部分的にあるいは完全にタンパクをコードし、
またイントロンを含まないかも知れないしあるいは１つ
またはそれ以上のイントロンを含むかも知れない領域）
はＴ−ＤＮＡに導入されるかも知れない。（イントロン
はｍＲＮＡが翻訳される以前に転写後に除去される遺伝
子転写物のＳＮ域である。）植物プロモーター支配下の
発現は直接発現の形をとるだろう；ここではプロモータ
ーにより正常に制御されている構造遺伝子の一部または
全体を除去挿入殺虫構造遺伝子で置換し、開始コドンは
植物構造遺伝子の残りあるいは挿入殺虫構造遺伝子の一
部としてのいずれかで提供されるか、または殺虫構造遺
伝子の一部またはすべてが既存の植物構造遺伝子内に正
しいリーディングフレームで挿入された融合タンパクと
して発現する。 後者の場合２発現産物は融合タンパクと呼ばれる。 プロモーター区分はそれ自身、自然に存在するあるいは
合成の多くの起源に由来する区分の混成物かも知れない
。植物プロモーターの起源は第２表に挙げた植物を含む
が、これに限らない。 Ｔ−ＤＮＡプロモーター二通常挿入Ｔ−ＤＮＡに関連し
ている自然に存在するプロモーターのいずれも対象とす
る。これらは“１．６”転写物、オクトビンシンターゼ
遺伝子（ＯＣＳ　）　、ツバリンシンターゼ遺伝Ｔ−（
胆ト）、田し、田りおよび田り遺伝子を含むが、これに
限らず、そしてＴ−ＤＮＡのＴＩＰ源に一部依存しうる
。Ｔ−ＤＮＡプロモーターの支配下の発現は直接発現の
形をとりうる。 そこではプロモーターにより正常に制御されている構造
遺伝子の一部または全体を除き挿入殺虫構造遺伝子で置
換し、開始コドンはＴ−ＤＮＡ構造遺伝子の残りあるい
は挿入殺虫構造遺伝子の一部としてのいずれかで提供さ
れるか、または植物構造遺伝子の一部またはすべてが既
存のＴ−ＤＮＡ構造遺伝子内に正しいリーディングフレ
ームで挿入された融合タンパクとして発現する。後者の
場合１発現産物は融合タンパクと呼ばれる。プロモータ
ー区分はそれ自身、自然に存在するあるいは合成の多く
の起源に由来する区分の混成物かも知れない。 プロモーター：ここで用いる場合、前述のＴ−ＤＮＡプ
ロモーターと植物プロモーターの定義を含む。しかし１
本発明のプロモーター成分の本質的な面は殺虫構造遺伝
子が植物細胞で発現するプロモーターの支配下にある点
である。したがって植物発現プロモーターはさらに、少
なくとも１つの発達段階においてその間少なくとも１つ
の組織で発現する植物細胞内で発現しうるいかなるプロ
モーターをも対象とする。起源は以下のものを含むであ
る・うが、それに限らない：植物ウルス（例えばカリフ
ラワーモザイクウィルス、　ＣａＭＶの３５Ｓおよび１
９ｓ転写物のプロモーター）、動物ウィルス、非植物真
核生物（例えば動物、酵母）。 あるいは色素体（例えば、クロロプラストあるいは殺虫
遺伝子がクロロプラスＩ−１）　Ｎ　Ａに挿入されてい
る場合の原核生物プロモーター）。植物ＤＮＡあるいは
Ｔ−ＤＮＡ以外の起源に由来するプロモーターの性質お
よび成分（例えば、”ＴＡＴＡボックス”、ＡＴＧ翻訳
開始部位、イントロンスプライシング部位１等）は”Ｔ
”　−Ｄ　Ｎ　Ａプロモーターに対して先に述べたのと
同じであり、そして植物プロモーターはまたこの定義内
に含まれる。本プロモーター区分はそれ自身１　自然の
、あるいは合成の多くの起源に由来する区分の混成物で
あろう。 双班糎泣１猛ヱ：ごこで用いる場合、殺虫タンパク、ポ
リペプチドあるいはその一部をコードするＤＮＡ区分を
殺虫遺伝子の部分を含み１翻訳開始コドンを含む場合も
あるが、ａ常プロモーター領域と見なされる転写開始お
よび翻訳開始を制御する細菌遺伝子の他の機能要素を欠
く。（本発明ではそのような細菌機能要素は殺虫構造遺
伝子のＴ−ＤＮＡへの転移後に存在するだろうことに注
意。 しかし、それらは植物細胞内では作用しないので。 そのような要素は用語“殺虫構造遺伝子”の対象としな
い）。殺虫構造遺伝子はプラスミドＤＮＡ全体または一
部、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび化学合成りＮＡに由
来するだろう。殺虫構造遺伝子は１発現産物の生物活性
または化学構造１発現速度、あるいは発現制御様式に影
響し得る。コード区分または非翻訳領域いずれかに１つ
またはそれ以上の修飾を含むかも知れないことがさらに
考えられる。そのような修飾は以下のものを含むが。 それに限らない：変異、挿入、欠失、置換および発現産
物の化学構造を変えないが９発現産物の細胞内局在性、
輸送１分泌あるいは安定性に影響する“沈黙”修飾。構
造遺伝子は連続してコードしている配列を構成しうるか
５あるいは１つまたはそれ以上のイントロンを含みうる
。このイントロンは合成または自然界の起源から得られ
うる適当な植物機能スプライス連結部に接している。構
造遺伝子は、殺虫性のまたは殺虫クンバクの一部に由来
する混成タンパクをコードする自然界にあるまたは合成
の複数の起源に由来する区分の混成物であってもよい。 殺虫夕／−パーり：ここで用いる場合、とにかく昆虫に
毒性のある細菌タンパクを含む。これは何らかの昆虫に
何らかの環境下で直接あるいは間接的に毒性がある。ま
たは生育を阻害するタンパクまたはペプチドを含む。こ
れはまた単独であるいは他の物質を＆Ｊｌみ合わ・Ｕて
、卵、幼虫、さなぎ５若虫および成虫段階を含む、昆虫
の生活環のあらゆる時期に、接触、摂取または呼吸によ
り毒性を示すタンパクを含む。これらは特に鱗翅および
双翅類材のもの、そしてオストリニア、ベリオティス。 ペクチノフォラ５およびトリコブルシア属のもの。 例えばマント力・セクスタ２オストリニア・ヌビラリス
、へりオティス・ゼア、へりオティス・ビレセンス、ベ
クチノフォラ・ゴジピエラおよびトリコブルシア・二、
の昆虫に毒性のあるタンパクを含む。標的として選ばれ
るであろう他の分類群は第１表に挙げたものを含むが、
これに限らない。 殺虫タンパクの例は第３表に挙げたものを含むが、バチ
ルス・チューリンゲンシスまたはバチルスの他の種５例
えばバチルス・セレウス、バチルス・ボピリエおよびバ
チルス・スフエリカス、の種々の変種に限らない。作成
に用いられる遺伝子あるいはまた昆虫に有毒なタンパク
をコードする配列は、フォスフォリバーゼ、ヒアルロニ
ダーゼ、フオスファクーゼ、プロテアーゼおよびバチル
ス・チューリンゲンシスの種々の結晶タンパクを含み。 またこれらに限らない。この用語結晶タンパクはバチル
ス・チューリンゲンシスの結晶封入体に見られるタンパ
クに関連する毒性タンパク、および自然界に存在する結
晶タンパクの人工的修飾物に対するプロトキシン型およ
びトキシン型両者を対象にすると解釈されるべきである
。関連するタンパクは核酸またはタンパクの構造のある
いは配列の類似性、免疫交叉反応性、または核酸のクロ
スハイブリダイゼーションにより同定されるだろう。 鼠惣■檄’根、芽、花粉２種子、クラウンゴールのよう
な腫瘍組織および胚、カルスのような培養での植物細胞
の集合体の種々の型を含む植物の分化または未分化組織
を含むが、これに限らない。 植物組織は栽培物または器官１組織あるいは細胞培養に
存在し、そして第２表に挙げた。あるいはこれに限らな
い、植物に由来するだろう。 穢豊狙胆：ここで用いる場合、栽培物の植物細胞および
培養物の植物細胞とプロトプラストを含み。 また第２表に挙げたものを含む、あるいはこれに限らな
い、植物に由来するだろう。 Ｔ−ＤＮＡを介して挿入された殺虫構造遺伝子を発現す
る遺伝的に修飾された植物の生産は２本明細書の知見と
当業者に既知の種々の技術と手段を結合させる。多くの
場合、別の手段が全体のプロセスの各段階で存在する。 手段の選択は１発現殺虫構造遺伝子の挿入と安定維持に
対する基本的ＴＩＰまたは他のベクター系の選択、修飾
されるべき植物種と所望の再生方針、および用いられる
特殊な殺虫構造遺伝子などの変動因子に依存し。 それらのすべてが当業者が選択でき、かつ所望の結果を
達成するのに使用できる別のプロセス段階を提供する。 例えば、殺虫構造遺伝子を得るための出発点はバチルス
・チューリンゲンシスｖａｒ。 クルスタキＨＤ−７３からのＤＮＡ単離により本願で示
されているが、適切な修飾が遺伝子単離と操作手順にな
される限り、他の殺虫タンパク遺伝子を有する細菌株の
ＤＮＡまたは組み換えＤＮＡ分子が代用されるだろう。 植物細胞内での外来遺伝子の制御された発現および／ま
たは安定な挿入に対して、新規な手段が開発される場合
、当業者は所望の結果を達成するために、これらの中か
ら別のプロセス段階を選択できるだろう。本発明の基本
的考え方は殺虫構造遺伝子の性質と構造、および植物ゲ
ノムへの挿入と発現の手段にある。遺伝的に修飾された
植物を得るために残、ている望まれる具体的な段階は、
修飾Ｔ−ＤＮＡが植物細胞ゲノムの一部として安定に組
み込まれる植物細胞へ。 この修飾Ｔ−ＤＮＡが移るようなＴ−ＤＮＡへのプロモ
ーター／殺虫構造遺伝子の組合せの挿入であり、インビ
トロ培養と完全植物体への事実上の再生に対する技術は
、形質転換植物細胞の選択と検出の段階、および尋人遺
伝子の最初に形質転換された株から実用的に受け入れら
れる栽培物への転移、の段階を含むだろう。 その好ましい態様での本発明の基本的特徴は。 植物発現プロモーターあるいは最も好ましくばＴ−ＤＮ
Ａプロモーターの制御下に挿入殺虫構造遺伝子を存する
Ｔ−ＤＮＡの作成であり、これらの用語は＋ｉｉｉ述の
ように定義した。この殺虫構造遺伝子は所望のプロモー
ターに関し正しい位置と方向で挿入されねばならない。 位置については２つの問題がある。第１は構造遺伝子が
プロモーターのどちら側に挿入されるかに関するもので
ある。大部分のプし１モーターは転写翻訳の開始をＤＮ
Ａに沿って一方向のみで制御することが知られている。 プロモーター制御下にあるＤＮへの領域はプロモーター
の“下流に”、または別の言葉で“後に”あるいは３”
側に”あると言われる。したがってプロモーターによっ
て制御されるには、植物構造遺伝子挿入の正しい位置は
プロモーターから“下流に”なければならない。（少し
の既知プロモーターは２方向制御を行うことが知られて
おり。 その場合はプロモーターのどちらかの側がそれか、ら“
下流に゛あると考えることができる。）位置についての
第２の問題は、プロモーターの既知の機能要素１例えば
転写開始部位、と構造遺伝子の翻訳開始部位間の塩基対
での距離に関するものである。この距離に関してはプロ
モーターによりかなりの変動がある。したがってこれに
関して構造上の要求は機能性という用語で最も良く表現
される。第１近似として、無理のない作動性はプロモー
ターと挿入殺虫構造遺伝子間の距離が、正常に作動して
いるプロモーターとＴ−ＤＮＡ間の距離に近い場合に達
し得る。方向は構造遺伝子の方向性に帰する。最終的に
植物タンパクのアミン末端をコードする構造遺伝子の部
分を構造遺伝子の５″末端と呼び、一方タンパクのカル
ボキシル末端付近のアミノ酸をコードする端を構造遺伝
子の３゜末端と叶ふ。殺虫構造遺伝子の正しい方向はそ
の５“末端がブ１１モーターの近くにあるものである。 融合タンパク発現をもたらす作成物の場合にさらに要求
されることは、プロモーターを提供している構造遺伝子
配列への殺虫構造遺伝子の挿入は両遺伝了の二Ｉ−Ｆ’
　している配列が同一のリーディングフレーＪ、相にな
けれはならず、その構造の要求性は当業者によく知られ
ている。本発明に関連するこの要求性の例外は、インＩ
・ロンが殺虫タンパク遺伝子由来のコート配列を殺虫構
造遺伝子の最初のコート区分から分けている場合に存在
する。 その場合、殺虫４１４造遺伝子は非殺虫性コード配列に
よりもたらされる一Ｉ冑Ａｍのスプライ１．ス結合部と
適合するスプライス部位を持っていなければならず。 そしてイントロンのスプライス部位は、プロモーターが
１に供する構造遺伝子と殺虫構造遺伝子の正しいリーデ
ィングフレー１、がイントロンが転写後のプｌ：Ｊセノ
シングで除去された後に回復するような２位置になけれ
ばならない。発現速度あるいは発達の制御の差は、ある
殺虫構造遺伝子が異なった植物発現プロモーターの制御
下に挿入される場合に見られるだろう。発現されたタン
パク白痢の安定性、細胞内または細胞内局在性または分
泌。 熔解性、標的特異性、および他の機械的性質などの性質
を含む。しかしこれに限定されない。異なった性質は、
融合タンパクの場合に、融合タンパク内に含まれるＴ−
ＤＮＡタンパクの区分の挿入部位、長さおよび性質、お
よびその立体構造に影響する融合タンパクの成分間での
相互作用に依存して見られるであろうし、これらのすべ
てに、植物細胞、植物組織、および完全植物体内で期待
される生理学的性質に依存して、殺虫タンパク産物の機
能性を操作し、制御するための多数の機会が存在する。 プロモーター／殺虫構造遺伝子組合せの挿入の位置は、
、Ｔ−１）ＮＡ境界のすく近くにある配列の転移機能が
破壊されない限り、厳密ではない。何故なら、これらの
領域は、先行技術の研究によれは修飾’Ｉ”　−１）　
Ｎへの植物ゲノムへの挿入に不可欠であるらしいので。 望ましい挿入部位は最も活発に転写されている領域、特
にｔｍｌ遺伝子と第２圓に示すように転写物２４に相当
する１ｌｉｎｄ　ＩＩＩ　−ｆ断片中にある“”１．６
”と名（ｕ、ｌた領域にあるものである。 こごで用いる用語”１．Ｇ”はこの活発に転写される′
Ｆ−Ｉ）Ｎへの領域を指す。このプロモーター／殺虫遺
伝子の組合せか挿入される′ｒ”　−１）　Ｎ八は何ら
かの′［’　Ｉ　Ｉ）プラスミｌ−から得られる。この
殺虫遺伝子は当業者によく知られた標準技術により挿入
される。内在Ｔ−１）　Ｎ　Ａの転写翻訳の方向に対し
て挿入植物遺伝子の方向は厳密ではなく、２つの可能な
方向の一方か機能的である。発現速度の差はある遺伝子
かＴ　−Ｄ　Ｎ　Ａ内の異なった位置に挿入された場合
に見られ、恐らくこれはＤＮＡメチル化やクロマチン構
造などの要因によるためである。ファセオリン遺伝子の
植物プロモーターの容易に検知できるレベルの発現は、
その遺伝子をアグロバクテリウム・チューメファシエン
スのオクトピン型ブラスミｔ”　、　ｐＴ　ｉ　１５９
５５の１ｍｌ遺伝子内のＳｍａ　１部位あるいはｔｍｒ
内の掩Ｌ１部位に挿入したときに得られた。 プロモーター／殺虫構造遺伝子の組合せをＴ−ＤＮＡに
挿入するための簡便な方法にエセリシア・コリー内で複
製できるプラスミドに取り込まれたＴ−ＤＮＡの区分（
その間に挿入が望まれる区分）を有する。先に述べた１
　シャトルヘクターの使用がある。このＴ−ＤＮＡは、
できればシャトルベクター内で特殊な、制限部位を含む
。殺虫構造遺伝子をＴ　−Ｄ　Ｎ　Ａ配列内のこの特殊
な部位に挿入するごとができ、このシャトルヘククーは
適当なアグロバクテリウム株の細胞内、できればその１
゛−ＤＮＡがシャＩ・ルヘククーのＴ−ＬＤＮＡと類似
している。に移される。形質転換されたアグロバクテリ
ウム株を、Ｔｉプラスミドの既存の区分をシャトルヘク
ターのＴ　−Ｄ　Ｎ　Ａ区分で置換さゼる２重相同組み
換え現象の選択を可能にする条件下で。 できれば生育させる。しかし１本発明はプロモーター／
殺虫構造遺伝子の組合せをＴ−ＤＮＡへ２重相同組み換
え機構によって博入することに限定されないことに注意
すべきである；シャトルベクター（多分１゛−Ｄ　Ｎ　
Ａと相同な唯一つの連続した領域を持つ）の単一部位で
の相同組み換え事象またはプＬ１モーター／遺伝子含有
細菌トランスポソンの挿入もまた。その組合せのＴ−Ｄ
ＮＡへノ挿入に有効な手段となるであろう。 今述べた方針により修飾Ｔ　−Ｄ　Ｎ　Ａを当業者に既
知の何れかの技術により植物細胞へ移すことができる。 例えば、この移送は、Ｔ−ＤＮＡ内に取り込まれた殺虫
遺伝子を含む新規のアグロバクテリウム株による植物の
直接感染、あるいはアグロハクテリウ１、株と植物細胞
の共存培養のいずれかにより最も容易に達成される。前
者の技術、直接感染は感染部位に腫瘍物体あるいはクラ
ウンゴールの出現の経過をたどらず。クラウンゴール細
胞を次いで培養で生育させることができ、そして当業者
に既知の適当な環境下で、挿入Ｔ−ＤＮＡ区分を含む完
全植物体へ再生させる。共存培養の方法を用いて植物細
胞群の一部は、それはそこに移されたＴ　−Ｄ　Ｎ　Ａ
を有しているが、植物細胞ゲノムに挿入されたものに形
質転換される。いずれの場合にも形質転換細胞を非形質
転換細胞と区別するために選別または分別しなければな
らない。選別は殺虫構造遺伝子に加えＴ−ＤＮＡに取り
込まれた選択マーカーを用いて容易に達成される。例と
して、ツバリンシンターゼのプロモーター支配下に発現
するジハイドロフオレートリダクターゼあるいはネオマ
イシンフォスフオドランスフェラーゼがある。これらの
マーカーは夫々メトトレキザートまたはカナマイシン、
あるいはそのアナログを含む培地での生育により選別さ
れる。さらにこのＴ−ｐＮＡは培養でＴｉ誘導腫瘍のホ
ルモン非依存性生育を制御する遺伝子または遺伝子群、
　Ｒｉ誘導腫瘍根の異常な形態を制御する遺伝子または
遺伝子群、およびオビンシンターゼによりもたらされる
アミノ酸アナログのような有毒物質に対する耐性制御す
る遺伝子、のような内在マーカーをも提供する。当業者
によく知られている選別方法にオビン生産の測定、特徴
的ＲＮＡまたはＴ−ＤＮＡ配列との特異的ハイブリダイ
ゼーション、あるいはＥＬＩＳ静　（“酵素連関免疫吸
着分析”の略）。 放射免疫分析、“ウェスタン”プロットを含む特異タン
パクに対する免疫分析、がある。さらに発現した殺虫タ
ンパクのを毒性を形質転換組織の同定につかうことがで
きる。 （以下余白） シャトルベクタ一方策の代わりに殺虫構造遺伝子が挿入
されるＴ−ＤＮＡまたは修飾Ｔ−ＤＮＡ。 を含むプラスミドの利用があり、このプラスミドはアグ
ロバクテリウム株内で独立に複製できるものである。本
発明の背景の項で述べた最近の証拠によれば、アグロバ
クテリウム株がＴ−ＤＮＡの植物細胞への転移を促進す
る機能のある。あるトランスに働く遺伝子を含んでいれ
ば３そのようなプラスミドのＴ−ＤＮＡをアグロバクテ
リウム株から植物細胞へ移すことができる。Ｔ−ＤＮＡ
を含み、アグロバクテリウム株内で複製できるプラスミ
ドを、ここで“副−ＴＩＰ″プラスミドと呼ぶ。この副
−ＴＩＰプラスミドはその含有するＴ−ＤＮＡの量に違
いがあると５作用の変動が可能である。変動の一方の極
端はＴＩＰプラスミドのＴ−ＤＮＡすべてが残っている
もので２時々これを“小−ＴＩＰ”プラスミドと呼ぶ。 他方の極端はＴ−ＤＮＡ境界付近の最少のＤＮＡを除い
たすべてが欠失している場合で、残っている部分は転移
能と宿主細胞への取込み能に最少必要物である。 このようなプラスミドを”微−Ｔ　Ｉ　Ｐ”と呼ぶ。 副−ＴＩＰプラスミドは相同組み換えによりシャトルベ
クターからゴー　１）　Ｎ　Ａへ遺伝子を移す必要がな
く、小さくて直接操作するのに比較的容易であるという
利点がある。希望する構造遺伝子を挿入した後、それら
をＴ−ＤＮＡ転移を促進するトランスに作用する遺伝子
を含む植物細胞へ容易に直接導入することができる。ア
グロバクテリウム株への導入は、アグロバクテリウム株
の、形質転換あるいは供与細菌細胞から接合伝達、のい
ずれかにより容易に達成され、この技術は通常の熟練技
術者によく知られている。新規ＤＮＡ配列を植物ゲノム
に導入する目的に対して、ＴＩＰプラスミドと副−’１
”　Ｉ　Ｐプラスミドは機能的に同等に考えられるべき
である。 本発明が提供する好ましい態様は、昆虫耐性（ｉｎｓｅ
ｃｔ　ｒｅｓｉｓｔａｎＬ）にさせる（１α物のゲノム
に殺虫遺伝子を取り込ませるｒ−ＤＮＡに基づくアグロ
ハクテリウＪ、仲介系を含むが、遺伝子の転移および導
入のための他の手段もまた本発明の領域に含まれる。殺
虫遺伝子の植物ゲノムへの安定な取込みに対する他の手
段はさらに、ウィルスゲノム。 小染色体、トランスボソン、および植物染色体への相同
性または非相同性組み換え、に基づくベクターの利用を
含むが、これらに限らない。これらベクターの植物細胞
への伝達の別の方法に、核酸の直接取込み、ベクター含
有リポソームとの融合。 顕微注入、およびウィルス・コート・タンパクへの包入
後の感染様過程、があるが、これに限らない。アグロバ
クテリウム細胞とＴＩＰに基づく系は細菌のＤＮＡを植
物細胞へ移すことによる双子葉類および裸子植物の形質
転換に利用できる；別のベクターあるいはベクター伝達
の別の方法に基づく系は単子葉１双子葉類両者を含むす
べての裸子植物とすべての被子植物の形質転換に用いら
れるだろう。 形質転換細胞と組織の再生は既知技術を用いて達成され
る。再生段階の目的は挿入Ｔ−ＤＮＡを保持しつつ正常
に生育と生殖する全植物体を得ることである。再生の技
術ばＴ−ＤＮＡの起源、それに与えられた（ぎ飾の性質
、および形質転換細胞の種により、技術的に既知の原理
に従っである程度変動する。Ｒｉ型Ｔ−ＤＮＡにより形
質転換された植物細胞は２　当業者によく知られた技術
で、余分の実験なしに容易に再生される。Ｔｉ型’ｌ”
　−Ｄ　ＮＡで形質転換された植物細胞は、ある例では
、培養のポルモンレヘルを適当に操作することにより再
生が１−ｉＪ能である。しかし、できればＴｉ−形質転
換組織は、Ｔ−ＤＮＡがハＬと旦遺伝子の一方または両
方で変異していると７最も容易に再生する。これら遺伝
子の失活は形質転換組織のボルモンハランスを正常に向
かわせ、培養の組織ポルモンレ・＼ル操作を楽にし、よ
り正常なホルモン生理のために４ｉｂ“物を容易に再生
さセる。もし展およびＬｍｓでの変異がシャトルベクタ
ーを用いた２重相同組め換えにより導入されるならば、
この変異の導入はプロモーター／殺虫構造遺伝子の導入
とは異なった方法で選択されねばならないことは重要な
点である。例えば、前者の場合、クロラムフェニコール
耐性を選択し、−力後者の選択はカナマイシン耐性で行
われるだろう。五およびｔｍｒ部位の不活化は、これら
遺伝子のコード領域またはプロモーター内での挿入、欠
失、あるいは１つまたはそれ以上の塩基の置換により達
成され、この変異はプロモーター失活、あるいはタンパ
クの構造破壊と呼ばれる。（適当な変異の作成はＴ、（
：。 Ｈａｌｌ　ｅＬ　ａｌ、、　ｓｅｔ、　ｎｏｓ、　４８
５＋６１３および４８５，６１４に例証されている。）
ある例では腫瘍細胞は、挿入Ｔ−ＤＮＡを有し、ノバリ
ンシンクーゼのようなＴ−ＤＮＡ遺伝子を発現し、また
挿入殺虫構造遺伝子をも発現する。シュー１−を再生し
得る。このシュートは根を有する植物に縦木することに
より生長能を維持することができ、また稔性のある花を
つけることができる。このようにして、このシュートは
親植物の物質を、Ｔ−ＤＮＡを存し。 かつそこへ挿入された殺虫構造遺伝子を発現する正常な
子孫植物へ提供する。 形質転換された植物組織の遺伝子型は、その細胞がイン
ビトロ培養で生育、再生しやすいという条件で選ばれる
。農耕に利用される栽培物はこれらめ操作には不適当で
あり、もっと扱い易い植物種をまず形質転換する。再生
後、新しく導入された外来殺虫タンパク遺伝子は、植物
育種、植物遺伝学の分野の当業者によく知られている方
法で。 希望する農耕栽培物へ容易に移される。形質転換植物と
農耕栽培物の有性交雑は最初の雑種を生ずる。これらの
雑種を次いで望みの遺伝的背景を持った植物と戻し交雑
させることができる。子孫を常に選別し、挿入Ｔ−ＤＮ
Ａを持ち続けていること、あるいは挿入殺虫タンパク遺
伝子の発現の結果新しい表現型を持つものを選択する。 このようにして多くの回数の戻し交雑と選択後、挿入殺
虫タンパク遺伝子に加えて、農耕的に望まれる植物と本
質的に同一の遺伝子型を有する植物を作ることができる
。 農作物に昆虫耐性を賦与することとは別の方法に、保護
したい田畑にある植物を発現殺虫タンパク遺伝子を持つ
有用なＴ　−Ｄ　Ｎ　Ａを含むＴＩＰプラスミドを保持
するアグロバクテリウム細胞で感染させてもよい。我々
は幼虫がクラウンゴール組織を喰うことを見つけた。田
畑に群がる昆虫の幼虫が殺虫遺伝子を含む形質転換組織
を喰うと、それらは組織内にある殺虫タンパクの影響を
受けるだろう。アグロバクテリウムとＴＩＰに昆虫誘引
物質の遺伝子をさらにコードさせる。形質転換組織中の
そのような誘引物質の存在は、田畑の他の農作物に比べ
５食飼源としてのその組織に対する昆虫の嗜好性を増大
させるだろう。 去施災 以後の実施例は、よく知られており２分子生物学および
、Ｔ、ＩＰｓとアグロバクテリウムとの操作に熟練した
者には容易な、多くの技術を利用している。そのような
方法は、ここで記述されていなくても、１つあるいはそ
れ以上の参照文献中に完全に記述されている。酵素は市
販品および業者の推薦品、あるいは当該分野に既知の種
々の方法により入手したものを用いる。試薬、緩衝液お
よび培養条件も当業者に知られている。そのような標準
技術を含む参照できる研究には次のようなものがある：
　Ｒ，Ｗｕ、　ｅｄ、　（１９７９）　Ｍｅｔｈ、Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ、　６Ｂ＋Ｒ，Ｗｕ　ｅｔ　旦１．　ｅｄｓ
、（１９８３）　ＭｅＬｔ＋、　Ｅｎｚｙｍｏｌ。 測艶および」財、Ｌ、Ｇｒｏｓｓｍａｎ　＆　Ｋ、Ｍｏ
１ｄａｖｅ＋　ｅｄｓ。 （１９８０）　Ｍｅｔｈ、［ｉｎｚｙｍｏｌ、　６５．
　Ｊ、Ｉｌ、旧１１ｅｒ　（１９７２）Ｅｘ　ｅｒｉｍ
ｅｎＬ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
、　Ｒ，Ｄａｖｉｓ　ｅｔ旦↓、（１９８０）　八ｄｖ
ａｎｃｅｄ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、
Ｒ，Ｆ。 ５ｃｈｌｅｉｆ　＆　Ｐ、Ｃ，Ｗｅｎｓｉｎｋ　（１９
８２）　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、およびＴ、Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ　ｅｔ旦、　（１９８２）　Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、加えてＲ，Ｆ、Ｌａｔｈｅ旦　
旦、　（１９Ｂ３）　Ｇｅｎｅｉ　Ｅｎｇｉｎ、　４　
：　１−５６．にはＤＮＡ操作に関する有用な論評がな
されている。 単独で制限エンドヌクレアーゼの名前の文字どおりの使
用１例えば゛取計１”、とは、酵素分解における酵素の
使用のことである。ただし、制限酵素の名前がその酵素
が作用し得る配列部位、たとえば制限部位５を表すこと
が可能な場合にはその旨を表示する。本文中では５制限
部位は“部位”。 たとえば゛′朋１部位”、という言葉をイ１けて表して
いる。“冒析ハ”、たとえば“Ｂｃｌ　Ｉ断片”。 という６葉をイ」けて用いる場合、それは該酵素の作用
により生じる末端を有する線状２本鎖ＤＮＡ分子（たと
えば制限断片）を表している。“ＢｃｌＩ／Ｓｍａｌ断
片”のような言い回しは、２つの異なる酵素、ここでは
Ｂｃｌ　ＩとＳｍａＩ、により生じた制限断片を表す。 異なる酵素の作用の結果として２つの末端が生ずる。該
末端は“平滑”あるいは“粘着”　（すなわち相補的一
本鎖オリゴヌクレオチドにより塩基対形成が可能な一本
鎖の突起をもつ）の性格をもち、そして、粘着末端の配
列はそれを作り出す酵素の特異性により決まる。という
ことに注意しなければならない。 これらの実施例においては、配列をより容易に理解でき
るように特別の記号を用いている。タンパクをコードし
ている配列には下線を引き、コドンは斜線（１）で区切
っである。制限エンドヌクレアーゼなどにより生じた各
類の切断箇所や、隙間は星印（＊）をつけて示している
。 プラスミド、およびプラスミドのみに、先頭には“ｐ”
、たとえばｐＴｉ１５９５５あるいはｐＭＳ−４゜をつ
け、菌株がプラスミドを有している場合プラスミドを挿
入句的に示ず；たとえばアグロバクテリウム・チューメ
ファシェンス（ρＴｉ１５９５５　）あるいはに８０２
　（ｐＫＳ−４）。プラスミドとそれらの相互関係を同
定するのに便利な索引を第４表に示す。 第５表は、寄託菌株のリストである。 犬羞艶ロー 昆虫ｆｌＴＪＪ　ｆグイ１物の開発に゛お＆ノる第１段
階は、バチルス・チューリンゲンシスνａｒ、クルスタ
キ１１０−７３、の殺虫タンパクをクローン化すること
である。 このバチルス・チューリンゲンシスｖａｒ、　クルスタ
キｌＩＤ−７：１４ｉ　ＡＢｒ：ｃｕＩｔｕｒａＩ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃＬｉｏｎ
、　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｉンｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｂ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＩ’ｅｏｒｉａ、　Ｉ
Ｌに、寄託し−Ｃあり、　ＮＲＲＬ番号Ｂ−４４８８を
もっている。 ５０メガダルトン（ＭＤ＞のプラスミドをｆｌｌｊ勾配
遠心分＃を用い°ζｌｌｌ１−７３から濃縮した。ＨＤ
−７３ライブラリイをｌ１ｉｎｄｌによる該プラスミド
の一次分解により作成した。　結果として生じた断片を
）ｌｉｎｄＩＩＩで線状化したｐＢＲ３２２（Ｆ、Ｂｏ
ｌｉｖａｒ　ｅｔ　ａｌ。 （１９７８）　Ｇｅｎｅ　２　：　９５−１１３）と混
合し連結後エセリシア・コリーＨＢＩＯＩを形質転換し
た。アンピシリン耐性テトラサイクリン感受性の形質転
換株について、各々が有するプラスミドＤＮＡを却離し
。 それをｌ１ｉｎｄｌｌｌで分解することで６．６キロヘ
ースベアー（ｋｂｐ）の挿入があるクローンを選別した
。ｌＩＤ−７３ライブラリーから昆虫バイオアッセイ　
（実施例８を参照）を用いるさらに進んだ解析のために
。 プラスミドｐ１２３１５８−３およびｐ１２３１５８−
１０を選別、した。　これらのコロニーをＬ培地中で生
育させ２５０倍に濃縮した細胞懸濁液を超音波処理した
。 そして抽出液を昆虫のエサの表面にかげた。新生のマン
ヂューカ・セクスタ（タバコ角虫）の幼虫をそのエサの
上に１週間置いた。ｐ１２３１５８−３あるいはｐ１２
３１５Ｂ−１０を有する株の抽出液を食べた幼虫は成長
せず、２〜５日の間にすべてが死滅した。 これらの抽出液はエサにあたえた幼虫と、バチルス・チ
ューリンゲンシスの細胞から精製した殺虫タンパクを１
す゛に与えた幼虫上の間に明らかな差異はなかった。 ｐ１２３１５８−３とｐ１２３１５８−１ｏの制限酵素
解析から。 ２つのプラスミドはｐＢＲ３２２ヘクターに６．６ｋｂ
ｐのバチルス・チューリンゲンシスＤＮＡ断片が逆方向
に挿入され−Ｃいる以外は同一であった。これらのプラ
スミドのどちらも１ｌｉｎｄｌｌｌで分解し、再連結し
、１１旧旧に形質転換し、適当な選択１選別段階によっ
て、　４１Ｊｌこ変わることができるということに７主
意されたい。 ＋１Ｄ　７３プラスミドイブラリ−からの形質転換株を
さらに厳密に調べるためにｐ１２３１５８−１０を用い
た。　５７２個のコロニーのうちで１６（１１１Ｉがク
ローンｐ　１２３　／　５８−１０の挿入物とハイブリ
ダイズした。そして、ずへてか６．６ｋｂｐの性格の１
ｌｉｎｄｌｌｌ！ｊ片を有していた。さらに制限酵素解
析を行った結果、すべてのクローンではｐ、ＢＴ２３２
２中で同一［）ＤＮＡ断片が２つの可能な配置のうちの
１つをとっていた。 これはｌＩＤ−７３株の中に単一の結晶クンバク遺伝子
が存在し得ることを示唆した。これらのクローンがＨＤ
−１３中に唯一の殺虫タンパク遺伝子の存在を表してい
ることを３標識したｐ１２３１５Ｂ−１０をプローブと
して、　ｔｌｉｎｄ　ＩＩＩ、　虱ＩＩあるいはＳａｌ
　Ｉで分解したＨＤ−７３プラスミドＤＮＡのサザンブ
ロ・ノドを行って確認した。これらの酵素の制限部位は
。 我々のクローン化した結晶タンパク遺伝子中には存在し
なかった。ハイブリダイゼーションの結果により、バチ
ルス・チューリンゲンシス細胞のＤＮＡの単一ハンドが
ｐ１２３１５８−１０にハイブリダイズすることがわか
った。さらに、ｌＩＤ−７３は単一の殺虫タンパク遺伝
子を有していることが示された。 我々は多くの他のクローンをｐｌ、２３１５８−１０か
ら作ったプローブによるハイブリダイゼーションにより
同定した。制限地図により、これらのクローンはずべて
ｐ１２３１５８−３あるいはｐ１２３１５８−１０と同
一であること、さらに、ｌＩＤ−７３が単一結晶タンノ
々り遺伝子を有しているとの結論を支持すること、が示
された。 １、　２　逸１０℃え梶 エセリシア・コリー　クローンで産生されるタンパクの
分析により、　ｐ１２３１５８−３およびｐ１２３１５
８−１０のコードしているタンパクはオフテロニー拡散
スライド中で、バチルス・チューリンゲンシスの殺虫タ
ンパクに対する抗血清と沈降線を形成することが示され
た。細胞抽出液をｌＯ％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
で分析し、ニトロセルロースニ移し、抗体と１２５１−
プロティンＡによる免疫反応（ウェスタン　プロット、
実施例７）を行った。 変性したプロトキシンが見られる１３０ｋＤ　（キロダ
ルトン）にはハンドは見られなかった。しかしながら約
６７　ｋ　Ｄのペプチドが見られ、それは結晶タンパク
抗体と結合していた（実施例７で行われたウェスタンプ
ｌニドノド）、そして、それは活性型トキシンと同じ大
きさであった。このペプチド断片はエセリシア・コリー
の全タンパクの約０．１％であった。 １．３　配列分析 我々は、ＤＮＡ配列（例えば＾、Ｍ、Ｍａｘａｍ　＆　
Ｗ。 Ｇ１１ｂｅｒｔ　（１９８０）　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ、　６５　：　４９９−５６０）の分野の当業者
によく知られた方法により得た我々のＤＮＡ配列結果を
（第１図）既報の配列（本発明の背景の項を参照）と比
較した。既報の配列と我々の配列とは部分的にしか相同
部分がなかった。約２．８ｋｂｐのオープンリーディン
グフレームがあり、それは翻訳開始信号（ＡＴＧ）によ
り５゜末端でつながり、バチルス・チューリンゲンシス
ＤＮＡとｐＢＲ３２２ベクターの間の接続点のＢｉｎｄ
ｌｌ［部位にあたるまでの間には終止しなかった。この
ＡＴＧからＢｉｎｄｌｌ［部位までオープンリーディン
グフレームにコードされるタンパクの大きさは、我々が
エセリシア・コリー細胞中で翻訳されているのを認めた
６７ｋＤのタンパクより大きいが、　１３０ｋＤ本来の
結晶タンパクをコードするには小さい。ｐＢＲ３２２に
コードされているリードスルー（ｒｅａｄ−ｔｈｒｕ）
のペプチドにおいての翻訳終止の正確な方法が重要でな
いということは、殺虫活性がｐＢＲ３２２ベクター中で
バチルス・チューリンゲンシスＤＮＡの挿入物がどちら
の方向を向いていてもコードされているという知見によ
り示唆された。多分、最初に翻訳されたペプチドのカル
ボキシル末端から最終物のカルボキシル末端までの部分
が５　自然の結晶タンパクを活性化するのと同様にエセ
リシア・コリー中でタンパク分解過程により除かれたの
であろう。 ス」１江λ この実施例は次のことを示している；バチルス・チュー
リンゲンシス殺虫遺伝子をＴ−ＤＮＡ遺伝子プロモータ
ーとポリアデニル化（ｐｏｌｙ（Ａ）　ａｄｄｉｔｉｏ
ｎ）信号の間に挿入し、Ｔｉプラスミドを通して殺虫遺
伝子を様々な植物に導入し、Ｔ−ＤＮＡプｔｌモーター
の支配下でこの遺伝子を発現する植物を再生する。この
構成に用いる大部分の方針は第３図に図式化しである。 第３図は図式化してプラスミドを表してあり、必ずしも
、正確な縮尺で描かれてはいない。 ２．１８′　タンパク゛　云　へのＢａＩＩＩ旧　立の
入 Ｂａｍ旧部位をｐ１２３１５８−１０の殺虫タンパク遺
伝子に、コードしている配列の開始点の丁度５゛の位置
へ導入する。野性型の塩基配列（ｂｌとオリゴヌクレオ
チドプライマー中の変化した塩基＋ａ）は次に示すとお
りである： ハｍＨＩ ａ）　５°　Ａ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ｇ　”　＆
Ａ工ＣＣＴＴ　ＡＴＧ　ＧＡＴ　ＡＡＣ＾ＡＴ　３’ｂ
）　、、、八ＧＡＴＧＧＡＧ　ＧＴＡＡＣＴＴ／、、／
ｌｉθυｙＬｌ八Ａ（）０．。 へｅｔ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ａｓｎ この変化した塩基はｆａ）で下線を引いたＡＴＣ配列で
ある。２７塩基対中わずか３塩基が変わっただけなので
、良好なハイブリダイゼーション特性は保証されること
に注意されたい。 ｐ１２３１５８−１０を匡■で分解し、肛皿■で線状化
したｍＷＢ２３４４　ＲＦ　（複製型）ＤＮＡと混ぜ連
結する。混合物をＪＭ１０３に形質転換し、そして形質
転換したコロニーをプラスミド単′ｆ４＋１　、次いで
制限分析によりｉｐ、−コピーの殺虫タンパク遺伝子を
もつ断片の挿入の有無を調べることにより７選別する。 ２つの１Ｊ能な配置を有するヘクターをそれぞれ旧３−
Ｂｌ−ＡおよびＭ２Ｓ−Ｂｔ−５と命名した。それらは
、ウィルスの形態のときにはそれぞれ殺虫タンパク構造
遺伝子の意味のない鎖と意味のある鎖を有する。 旧３−１１１−Ａは、実施例１０．１に述べたように既
に合成された。オリゴヌクレオチドプライマー５’　Ａ
ＧＡＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＧ（ｉＡＴＡＡｃΔ
八Ｔ３’　へとハイ　）リ　ダイズする。該オリコ゛ヌ
クレオチドとＭ２Ｓ−１１ｔ−／１とのハイブリッドを
コーセリシア・コリーのＤＮＡポリメラーゼ■のクレノ
ーＩす１片と一緒に保温し、そして共有結合的閉環状Ｄ
ＮＡ（ＣＣｃＤＮＡ）を増やし。 そして混合物をＪＭ１０３へ形質転換する。形質転換株
により作られたウィルス粒子を単離して低域染比で細胞
を感染させるのに用いる。ＲＦ　ＤＮＡを多数の感染し
たコロニーから単離し、制限地図作成により性格づけを
行う。変異オリゴヌクレオチドにより開始された鎖に由
来したクローンは殺虫構造遺伝子の５′末端に新しいハ
ｍｆｌＩ部位が存在することにより同定される。そして
そのようなヘクターをＭ２Ｓ−Ｂｔ−Ａ　（ハＬ）とし
た。 Ｍ２Ｓ−Ｂｔ、−Ａ　（ハｍ　）ＲＦ　ＤＮＡをハｍＨ
Ｉと朋■で分解し、実施例１０．１で記述したように合
成した１次に示す構造を有する。リンカ−と混合しそし
て連結する。 Ｕ皿■　則Ｖ−■ ５’　ＡＧＣＴＡＧＣＴＧＡＣＴＡＧ３’３’　ＴＣＧ
ＡＣＴＧＡＴＣＣＴＡＧ５″このリンカ−は、すべての
３種の可能な読みとり相における翻訳終止信号（下線部
）を有していることに注意されたい。該リンカ−をＢａ
ｎ旧による分解により末端をそろえ、そして殺虫構造遺
伝子を含むＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により
精製する。 て工２　プロモータービークル 該”Ｉ”　−　１）　Ｎ　Ａ“°１．６”遺伝子は下記
のように要約される： （以下余白） １ｍ　ム ：＝＋１ ：口 ・ｋ Ｃ１ａ　Ｉ断片を除くことにより“１．６”遺伝子のプ
ロモーター領域は、遺伝子の３°下流領域の隣にくるこ
とができる。この３゛領域はポリアデニル化信号を有し
ている。結果として生じる。構造は次のように要約され
る： （以下余白） ：　１ト ＝　モ ：　ト Ｔ−ＤＮＡクローンｐ４０３　（詳細な記述の項に述べ
た“１，６”遺伝子、第２図の転写物２４をコードする
。また、　Ｃ，Ｆ、Ｆｉｎｋ　（１９８２）　Ｍ、Ｓ、
ＴＩ＋ｅｓｉｓ。 Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＪＩ
ａｄｉｓｏｎを参照）に相当するｐＨＫ２９０クローン
である。　ｐＫｓｌｌｌを肝虹■で分解し９次いで再連
結する。（代わりに、ここに記述したごれらの操作を、
ｐＢＲ３２２に基づくクローンである。　ｐ４０３にお
いて選択の間にテトラサイクリンの代わりにアンピシリ
ンを用いることにより直接行うことかできる。連結混合
物をエセリシア・コリーに８０２　（Ｗ、Ｂ　Ｗｏｏｄ
　（１９６６）　Ｊ。 Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、几：　１１８）に形質転換するそし
てテトラサイクリン耐性で選択する。プラスミドを“ミ
ニプレツブ”　（小容量の細胞培養からのプラスミド調
製）を行いｉＰ−ｉｆ、ＩＩして、厳密に構造を決定す
るために制限地図を作製する。新しいヒークルであるｐ
ｕｓ−胆り（Ｔ、Ｃ，ｔｌａｌｌ　ｅＬ旦、、　ＬＩＳ
　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＳｅｒ、　ｎｏ、４８５．６
１４参１１０は旦虹Ｉによって線状化することができる
。 Ｋ２Ｏ２中で成育したｐＭＳ−ｐｒｏ　ＩをＣ１ａ　Ｉ
で切り。 ５°　−リン酸をもたないハｍ　Ｈ１／且虹Ｉリンカ−
５″ＣＧＧＡＴＣ３’と混合し連結した。結果として生
じた混合物を再連結したρＫＳ−ｐｒｏｌを省くために
且ＬＩで分解し、Ｋ２Ｏ２へ形質転換した。テトラサイ
クリン耐性形質転換株から得たプラスミドを制限分析に
より選別し、そしてＡＴＧ翻訳開始点のＣｌａｌ部位が
Ｂａｍ旧部位に代わったプラスミドをｐＫＳ−匹■　（
ハＬ）とする。 （以下余白） １−−ジ−−−−−千都−、、ｐＨすし」■ｉつ工さｑ
辺す７不之Ｚ亘は剌遣ル、ゴーの一傅入 該プじ１モ一ター／殺虫遺伝子結合物の隣にカナマイシ
ン１１１１性（和則−）遺伝子を配置することは。 三親交ｉ“（１移の二車半旧ｉｉＪ　Ａ；ＩＩみ換え体
を選択するために有利−Ｃある。都１の源はｐＫＳ−４
（実施例２．５）−ζあった。ｐＭＳ−４において、　
ｋａｎ−ｉＪｉ伝子の片端はり一、１Ｉ−１部位に隣接
している。−１」−遺伝子を有する断片をｐｌ（Ｓ−４
から９：　Ｉ　ａ−１（ずなわち“′叶虹Ｉ／と〆断片
ト）て取り出ずために、シラスミドに新たなり上−１部
荀を、既に存在するｑレー１部位の反対側の位置に一＼
？（人する必要がある。これはｂようと良い場所にある
１罰胛Ｉ１１部位（５’、、、Ｇ”ＧＡＴＣＣ，、，３
’　）をり−；２−１　（５”　へドＣＧへＴ、、、３
”）に変えることで達成される。 ｐ［ｓＪを拘り−Ｉｌ＋分解で綿状化すると次に示す構
造を有する粘着末端を生ずる： Ｓ’、、、Ｇ　ＧＡＴＣＣ，、，３” ３’　、、、ＣＣＴＡＧ　Ｃ，、，５’この構造の引っ
込んでいる末端をエセリシア・コリーＤＮＡポリメラー
ゼのクレノーフラグメントと保温することにより埋めて
１次に示す平滑末端を形成する： 、、、ＧＧＡＴＣＧＡＴＣＣ，、。 、、、ＣＣＴＡＧ　ＣＴＡＧＧ、、。 これらの平滑末端を互いに連結すると結果として生じる
構造は次の配列をもつ； ｌａ　１ 、、、ＧＧＡＴゞＣＧ　ＡＴＣＣ，、。 、、、ＣＣＴＡ　ＧＣゞＴＡＧＧ、、。 結果として生しる構造に、　Ｃ１ａ　ｌは作用するがル
」−旧は作用しない、ということに注意されたい。 上記の構築の代わりに、　Ｂａｍ、、Ｉ１１部位あるい
は２もう１つの都合の良い部位にある制限部位を適当な
リンカ−を用いてＣ１ａ　１部位に変えてもよい。 ｐ　Ｋ　Ｓ　−４をβ町Ｈ−，−１で分解し、　５’Ｃ
ＡＴＣＧＡＴＧ３’の配列を有するり；ｉ−１／平滑末
端リンカ−と混合し、連結した。そし“（、ＣＩ（Ｊ、
−１で分解し再び連結し、　Ｋ２Ｏ２へ形なｌｉ転換し
た。カナマイシン而１性の形質転換株からｊｉ’ｊβ；
１（シたプラスミドを通常は、　ｐｍａ　１部位の所に
新しい（Ｉｊ４＋−１部位が存在するかど・うかで選別
した。９１表−リ／　Ｋ−ａ　ｎ−断片はそのようなプ
ラスミドから単＋ｉｌｌするごとかてきる。 エセリシ゛Ｊ′・ｍｌリーに８０２中で成育させたとき
。 ｐ　Ｋ　Ｓ−、ｐｌ（Ｈ，−１（、ｊｌリ−）は２個の
残っている只９−１部荀において、メチル化される：貼
札１部位のうりの１　（ＩＩ、Ｉはプロモーター−−ポ
リアデニル化接続部（ごれは２靜に１のポリアデニル化
部位を過きて約３０へ−スのところである）から約１．
１５ヘースにある。そしてもう１つは、ｐ４０３の右側
のｌ１ｃｏ　Ｒ１部位から約２００ヘースのところであ
る（第２図参照）。 メチル化によりりＡ−１で切断されるべき部位がＣ１ａ
−Ｉ制限エントヌクレアーゼにより切断されなくなる。 このように、これらのメチル化によりこれらの部位は保
護される。また、他の部位へのＣ１ａ　ｌ酵素の直接作
用も効果的に抑えられる。ｐ　Ｋ　Ｓ−匹１（堕し）を
エセリシア・コリーＧＭ３３へ導入し増やす。エセリシ
ア・コリーＧＭ３３はＤＮＡのアデニン残基をメチル化
しない株であり、それゆえに。 他の場合はメチル化されるＣ１．＞　−Ｉ部位も切断さ
れ得る。ＧＭ３３から該プラスミド（ｐＫＳ−ｐｔｈ！
−三■　（展））を精製し、り且−■で部分分解する。 結果として生じた混合物を、前述のＣ１ａｌ／−沖す□
断片と連結する。エセリシア・コリーに８０２へ形質転
換後、形質転換株をテトラ→ノイクリンおよびカナマイ
シンを含む培地上で選択する。プラスミドの単離、およ
び制限地図作製後、希望の構成を有するクローンを同定
し、そのクローンに存在するプラスミドをｐＨ−３３ａ
　（第３回）とする。 ｐＨ−３３ａは、２番目のポリアデニル化部位を約３ｏ
ｂｐ過ぎた“中央の”Ｃ１ａ　１部位へ連結されたＫａ
ｎ遺伝子を有する。断片を有している。実施例２．１で
構成された修飾型ヘクターから単離した。殺虫遺伝子の
Ｂａｍ　ＩＩＩ断片を、Ｋ２Ｏ２に導入して成育させた
結果メチル化されているｐＨ−３３ａのＢａｍ旧部位ヘ
、　Ｂａｍ　ＩＩＩで線状化後、連結する。Ｋ２Ｏ２へ
形質転換し、テトラザイクリンとカナマイシンで選択し
、プラスミドを単離し、そして制限地図作製を行った後
で、ｐＴｉ１５９５５の“１．６”プロモーターとポリ
アデニル化部位との間に挿入された殺虫構造遺伝子を有
する構成を同定し、そして、それを有するプラスミドを
ｐＨ−３３ｂ　（第３図）と称する。 ２．４Ｔｉプラスミド−■」（１）Ｌ問■（社）１とｐ
Ｈ−３３ｂをｐＴｉ１５９５５　、　ｐＴｉＡ６Ｇ　（
ｉ能しナイｔｍｓ遺伝子を有する以外はｐＴｉ１５９５
５と同様）、および相同部位組み換えにより再生に影響
を及ぼす遺伝子中に欠失を有する変異物（実施例ＩＯ）
、に導入する。タバコ植物を実施例６で記述した方式に
より形質φＬ換し、形質転換株を、適当なプローブによ
るザザンおよびノーザンゾロソト（当業者にはよく知ら
れた技術）そしてオクトピンおよび結晶タンパクの存在
により同定する。形質転換したタバコ組織はタバコボー
ンウオームに対して致死的である。実施例６に記述した
ように形質転換細胞からタバコ植物を再生させ、そのタ
バコ植物を育種過程へ移す。再生植物およびそれらの殺
虫タンパクを有する子孫の田畑は、タバコホーンウオー
ムのような昆虫の幼虫の侵略に対して耐性である。それ
は、そのような幼虫がそのような植物から生じた組織を
食べたとき毒性効果があるからである。 ｐＲＺ１０２　（Ｒ，Ａ、Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ旦　ａｌ
、（１９７９）　Ｍｏｌ。 Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　１７７　：　６５−７２）は１
コピーのトランスボソンＴｎ５を有するＧｏｌＥ１プラ
スミドである。そのｐＲＺ１０２をＢａｍ旧およびＨｉ
ｎｄＩ［Ｉで分解し、前もって同じ２つの酵素で線状化
しておいたｐＢＲ３２２と混合し連結し、　Ｋ２Ｏ２へ
形質転換した。アンピシリンおよびカナマイシン両耐性
の形質転換株を選択し、それから単離したプラスミドの
制限地図作製を行い、第３図に示した構成を有するもの
をｐＫＳ−４とした。 ス１１１１ この実施例はバチルス・チューリンゲンシスの殺虫タン
パクの発現可能な遺伝子を植物ゲノムに挿入するもう一
つの方法を示す。該シャトルベクターはＣ，Ｌ、Ｆｉｎ
ｋ　（１９８２）　Ｍ、Ｓ、ｔｌ＋ａｓｉｓ、　Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙｏｆ　ｋｉｓｃｏｎｓｉｎ−Ｍａｄｉｓ
ｏｎ、により用いられたものと似ており、オクトピンＴ
ｉプラスミドに虱遺伝子を導入するのに用いる。ここに
示す発明においてＴｉプラスミドへ挿入する前に、タン
パクをコードしている虱遺伝子を取り除き殺虫遺伝子と
交換している。その結果、ツバリンシンターゼプロモー
ターの支配下で植物細胞中で発現する殺虫遺伝子を有し
たオクトピン型のプラスミドができる。 ３．１　」子のＭ１３ｍｐ７　ヘの１動ｐＣＦ４４　（
１’ｉｎｋ、　ｉ？ｉｊ出）を」Ｉで分解し、それ自身
で再連結させ再びに８０２へ形質転換した。アンピシリ
ン耐性形質転換株から単離したプラスミドを制限酵素に
より分析した。Ｔｉプラスミド由来のＤＮＡ配列中に唯
一のＸｈｏ　１部位を有するプラスミドをｐｃＰ４４Ａ
とした。唯一のＸｈｏ　１部位はｐｃＦ４４の２つのＸ
ｈｏ　Ｉ部位の間のＤＮＡ＠片欠失の結果である。この
Ｘｈｏ　Ｉ断片の除去により不都合な２つのＣ１ａ　Ｉ
部位を完全に除くことができた。 ｐＣＦ４４をＨｉｎｄｌ［［およびＢａｍ旧で分解し、
あらかじめ同じ２つの酵素で分解しておいたｐＢＲ３２
２と？１！　合シ連結シ、　Ｋ２Ｏ２へ形質転換した。 アンピシリン性の形質転換株を選択し、プラスミドＤＮ
Ａの制限酵素分析により選択し、　ｐＮＳ５と命名され
た。 ｎｏｓ遺伝子を有するプラスミドを存するコロニーを同
定した。 ｐＮｓ５をＢｃｌ　ＩおよびＢａｍ　Ｈｌで分解し、す
でにＢａｍ旧で線状化した一本鎖ＤＮＡベクターＭ１３
ｍｐ７の二本鎖環状複製型（ＲＦ）と混合し連結した。 混合物をＪＭ１０３に形質転換し、白いプラークを選択
した。２つのコロニーを、ＲＦｌｌｊｉｉｌ後の制限地
図作製により同定した。それらをＭ１３−１およびｌ’
１１３−３と命名した。それらは−末鎖型のときそれぞ
れ意味のある鎖と意味のない鎖を有していた。 λ−−λ　那竪−刀旦四二−久二１はＬΣｑ匙ｌ」」Ｌ
佼■■ ５°ＡＧ’ｌ’ＣＴＣＡ’ｒＡＣＴＣＡＣＴＣＴＣ：Ａ
ＡＴＣＣＡＡＡＴＡＡＴＣＴＧＣＣＡＴＧＧＡＴ：の配
列を有するオリゴヌクレオチドブライマーを実施例１０
．１に記述したように合成した。このオリゴヌクレオチ
ドは下線部が匹し構造遺伝子の５゛末端の本来の配列と
変化していた。この変化により、胛−遺伝子のＡＴＧ翻
訳開始点に態ｏ１部位５゛・・・Ｃ”ＣＡＴＧＧ・・・
３°が導入された。該オリゴヌクレオチドを、培養培地
から沈降さ−υたウィルス粒子から卯＾１１した環状一
本積旧３−３ＤＮＡとハイブリダイズさせた。言亥オリ
コ゛ヌクレオチード：旧３−３ハイブリツトをＤＮＡリ
ザーゼおよびエセリシア・コリ−ＤＮＡポリメラーゼ１
クレノー断片と共に保温し、共有結合的開環状Ｄ　Ｎ　
Ａ　（ｃｃｃＤＮＡ）を増やし、その混合物をＪＭ１０
３へ形質転換した。形質転換株から産生されたウィルス
粒子を＊離し、低感染比で細胞の感染に用いた。ＲＦＤ
ＮＡを多くのこれらの感染コ１：Ｊニーから単離し。 制限地図作製により性格づけを行った。変異オリゴヌク
レオチドブライマーにより複製された鎖から派生したク
ローンは、唯一のＮｃｏ　、　１部位の存在（もし存在
すればこの酵素で線状化できる）により同定した。変異
クローンをさらに、旦ａ１．Ｂａｍ旧（線状化分子の同
定のため）、およびＣＩａ　ＩをＮｃｏ　Ｉと共に作用
させて分解することにより、肛勉１部位の位置を調べる
性格づけを行った。該変異８１３−３　ヘクターをＭ１
３−３八／Ｂ１８ａとした。 ３．３　殺虫遺伝子のＭ１３ｍρ８への移ｐ１２３１５
８〜ｌ０ＤＮＡ（実施例１．１）を鳳ｏＲＩで分解し、
　Ｅｃｏ　Ｒ１で線状化したＭｊ３ｍｐ８　ＲＦ　ＤＮ
Ａと混合し連結した。混合物をＪＭ１０３へ形質転換し
、白いプラークを選＃Ｒ後、殺虫遺伝子を含む断片をそ
れぞれ反対の方向で有する２つのコロニーを、制限地図
作製により同定した。それらをそれぞれＭＢＴ１４およ
びＭＢＴ３と命名した。それらはそれぞれ一本積型のと
き、意味のある鎖および。 意味のない鎖を有していた。 ３．４　双班近亘ヱ■駈駅皿殉点二少熟虹上並位５°Ｇ
ＡＧＧ’ｒＡＡＣＣＣＡＴＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴ３’　
（７）配列を有するオリゴヌクレオチドブライマーを実
施例１０．１に記述しているとおりに合成する。このオ
リゴヌクレオチドでは、下線部の２つの塩基が殺虫構造
遺伝子の５°末端に本来ある配列と変化している。 その変化の結果、殺虫遺伝子のＡＴＧ翻訳開始点にと（
１部位、５゛・・・Ｃ”ＣＡＴＧＧ・・・３′、を導入
することになる。このオリゴヌクレオチドを、培養培地
から沈降さゼたウィルス粒子がら単離した環状一本鎖ｉ
＋ｎ゛ｒ３Ｄ　Ｎ　Ａとハイブリダイズさせる。 このオリ：」ヌクレオチド：　ＭＢＴ３ハイブリットを
ＤＮＡリガーセとエセリシア・コリーＤＮＡポリメラー
ゼ１のクレノー断片と共に保温しｃｃｃＤＮＡを増やし
、混合物をＪＭ１０３へ形質転換する。形質転換株が産
生じたウィルス粒子を単離し細胞を低感染比で感染をさ
せるのに用いる。多くのこれらの感染コロニーからＲＦ
　ＤＮＡを単離し、制限地図作製により性格づけする。 変異オリゴヌクレオチドにより複製が開始された鎖から
派生したクローンを唯一のＮｃｏ　Ｉ部位（もし存在す
ればこの酵素でそれらは線状化できる）の存在により同
定する。変異クローンを制限酵素分析によりさらに性格
づけし、変異配列の存在を配列決定により確認する。希
望の配列を有するプラスミドをＭＢＴ３（取札）とする
。 ＤＮＡを実施例１１．１に記述したように合成し。 次に示す構造を有するリンカ−と混合し連結する：肛皿
ｍ末端　匣１１１ ５°ＡＧＣＴＧＡＣＴＡＡＣＴＡＧ３’３’ＣＴＧＡＴ
ＴＧＡＴＣＣＴＡＧ５’このリンカ−はすべての３つの
読み取りフレームにおいて終止コドン（下線）をコード
しており。 そして、このリンカ−は機能するＲａｍ　Ｉ１１部位の
末端と、肛皿（］１の粘着末端と和合するが、再び財皿
■部位を再構成することができない粘着末端で有する。 殺虫遺伝子を有するＤＮＡ断片をＮｃｏ　ＩとＢａｍ　
Ｉｌｌによる分解により端をそろえ、アガロースゲル電
気泳動により単離する。 ｐＫＳＩＩＩ−Ｎ　（Ｆｉｎｋ、前出）は１機能的展遺
伝子を有する１’ｎ５　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｐＭＳ−４から
）中に挿入されたｎｏｓ　遺伝ｒを有しているプラスミ
ドで、それ自身がｐＫｓｌｌＩのＴ　−Ｄ　Ｎ　Ａ中に
挿入されている。ｐＫＳｌｌｌ−Ｎを５ｓＬＩＩで線状
化し、　Ｂａｍ　ＩＩＩで完全分解する。旧３−３八／
ｌ１１８ａを匙ｌ」と虱■で分解し頌ＦＨ／Ｎｃｏ−Ｉ
プロモーター断片をアガロースゲル電気泳動によって単
離する。このＳｓＬ　ＩＩ／）ｊｃｏ　Ｉプロモーター
とＮｃｏ　Ｉ　／Ｂａｍ旧遺伝子の断片をｐＫｓｌｌｌ
−Ｎ　Ｓｓ見ＩＩ　／４１ａｍ　ＩＩＩ反応産物と混合
し連結する。 連結混合物をエセリシア・コリーに８０２へ形質転換す
る。カナマイシンとテトラザイクリン耐性の形質転換株
から単離したプラスミドを制限酵素分析し、１咀−遺伝
子の５′部分が殺虫構造遺伝子に置換された以外はｐＫ
ｓｌｌｌ−Ｎと同一のプラスミドを有するコロニーを同
定する。そのようなプラスミドをｐＫｓｌｌｌ−ＮｐＢ
ｔとする。 ３．６ＴＩＰプラスミドへのｔ　；−植′の感′九本鷹
≦口Ｗ生 エセリシア・コリー［８０２（ｐ＋Ｋｓ１１１−ＮｐＢ
ｔ　）をアグロバクテリウム・チューメファシェンスと
実施例９に記述したように交雑させる。アグロバクテリ
ウム株は発明の背景の項で記述したような。 再生を容易にする変異を有するｐＴｉ１５９５５に基づ
＜ＴＩＰプラスミドを持つ。相同部位組み換え体を、実
施例９に記述したように選択し、制限地図作製により性
格づけを行う。作製物の効能をヒマワリの茎に感染させ
ることにより迅速に試験する。 結果として生ずる瘤について、実施例７で記述したよう
に、　ＥＬＩＳ八およびウェスタッフ゛ロットにより、
また、実施例８に記述したように、ハイオアソセイによ
り試験を行う。実施例６に記述しであるように、アグロ
バクテリウム株をタバコ細胞に感染させて、それから再
生させる。結果として生じた植物を、昆虫耐性の特性が
望まれる種々の商業作物と交叉させるための、栽培材料
として用いる。再生した植物およびこれらの殺虫タンパ
クを有する子孫の範囲は、タバコ鉤虫のような昆虫の幼
虫の侵略に対して耐性である。それはそのような幼虫が
そのような植物の組織を食べたとき、毒性効果があるか
らである。 去り桝↓ この実施例は、バチルス・チューリンゲンシスの殺虫タ
ンパクの発現し得る遺伝子を植物ゲノムへ挿入するもう
一つの方法を示す。方針はＴ−ＤＮＡプロモーターの代
わりに植物プロモーターを用いること以外は、実施例３
に記述したものと同様である。プロモーターを提供する
植物遺伝子はファセオリンであり、こればその起源であ
る豆科植物ファセオラス・ブルガリス　し、以外の種に
おいζも活性を有することが既に示されている。 ↓ユ」、７ｙ　−Ｍ　オリン遺伝子の旧３ｍｐ７への（
動５″ＧＧＡＴＣＣ３″の配列を有するＢａｍ旧リンカ
−をアニールさせ２本鎖の構造を形成させる。そして平
滑末端連絡を行い連鎖物を形成する。これらの連鎖物を
Ｂａｍ　ＩＩで部分分解して５″ＧＡＴＣ・・・３″の
粘着末端を露出させる。この粘着末端は匠旧、　Ｂｃｌ
Ｉ、旺■、池ｏＩ、田Ｌ３＾１．および西■などの酵素
により生じた粘着末端（５”ＧＡＴＣｏ、・３′）と和
合する。ファゼオリンのシャロン２４Ａファージクロー
ンである１７７．４　（Ｓ、Ｍ、Ｓｕｎ　ｅｔ　旦、　
（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ　２８９　：　３７−４１
．　Ｊ、Ｌ、ＳＩｉｇｈｔｏｍ　ｅｔａｔ、（１９８３
）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ
ＳＡ　８０　：１８９７−１９０１．　ＡＧ−ＰＶＰｈ
１７７．４　とも記される）を、匠■およびＢａｍ旧で
分解し、連鎖状リンカ−と連結する。そしてＢａｍ　Ｉ
ＩＩで完全分解し、リンカ−の端をそろえ、　Ｄａｍ　
ＩＩ粘着末端を露出させる。ファゼオリン遺伝子とその
５°−および３″−近辺の配列を有する３、　８ｋｂｐ
の断片をアガロースゲル電気泳動およびその後の抽出と
により単離する。この断片は、　Ｂａｍ　ＨＩ／Ｂｇｌ
　ＩＩの連鎖部位で両酵素のどちらかの作用に対して非
感受性であり、どちらかの末端にＢｚＨ−ｍ　、１１１
部位を有している。　この３．８ｋｂｐの旺ｊ−，−Ｉ
Ｉ　／ｊｌｉ甲−Ｉｌｌ断片は、ｐＢＲ３２２に基づ＜
　１７７．４のり゛ゾク１．Ｊ−ンであるｐ８．８から
も、得ることができる。 該３．８ｋｂｐ　１！１７片をＨａｍ　ＩＩ＋で線状化
した旧３ｍｐ７ＲＦと混合し、連結する。？ｊＲ合物を
ＪＭ１０３へ形質転換し、白いプラークを選択し、制限
酵素による性格づＧｊ２およびＲＦｓおよびファージＤ
ＮＡのハイブリダイゼーション分１ノｔにより２つのコ
ロニーを選ｔＭする。門１３−３．８八および門１３−
３．８３のウィルス型はそれぞれファセオリン遺伝子の
意味のない鎖と意味のある鎖を自していることが判明す
る。 −，１，２−ノボど（イソ）−７ズ」ｊ−天−−り−二
−〇後全！地鵠−土皿佼ｐ−汐−砺 Ｍ１３−３．８ＡのファセオラスＤＮＡはファゼオリン
の転写開始点から約４５０ｂｐ上流部分にＮｃｏ□１部
位を有している。この部位の存在は、ファゼオリンの翻
訳開始点に導入するために、Ｎｃ、ｏ−１部位でプラス
ミドを切断しようとするときに不都合になるであろう。 単離したＭ１３−３．８へのＲＦＩ）ＮＡを旺Ｉで線状
化し、５”−突出末端をエセリシア・コリーＤＮＡポリ
メラーゼ■のクレノー断片の作用で埋める。平滑末端連
結後、　ＪＭ１０３へ形質転換する。 ＲＦ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｓを単離し制限地図作製により性格
づげする。　ファセオラスＤＮＡのＮｇｏ　１部位は欠
失しているか他はＭ１３−３．８八と変わっていない。 Ｍ１３−３．８Ａｃと命名したヘクターを有するコし２
ニーを選別する。 ５’ＡＴＡＣＴＡＣＴＣＴＡ覗八ＴＧ…Ｇ／ｌＧ八ＧＧ
八八ＧＧＧ３”　の配列を有するオリゴヌクレオチドブ
ライマーを実施例１０゜１に記述したように合成する。 このオリゴヌクレオチドは下線部分がファゼオリン遺伝
子の５゛末端６ご本来存在する配列と異なっている。該
オリゴヌクレオチドを、培養培地から沈降させたウィル
ス粒子から単離した環状１木鎖旧３−３．８Ａｃ　ＤＮ
Ａとハイブリダイズさせる。このオリゴヌクレオチ］・
：旧３−３．８ＡｃハイブリッドをＤＮＡリガーゼとエ
セリソア・コリーＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片
と共に保温し、ｃｃｃＤＮＡを増やし。 その混合物を、１旧０３へ形質転換する。形質転換株が
産／−１するウィルス粒子を単離し、低域染比で細胞を
感染さ一已るのに用いる。ＲＦ　Ｄ　Ｎ　Ａを多（の感
染：Ｉ　ｌ：ｌニーから浄離し、制限地図作製により性
格づＧｊを行う。変異オリゴヌクレオチドで複製が開始
されたｉｊ’ｉから派生したクローンは、コードしてい
る配列の５”末端に新しいＮｃｏ　＋部位が存在し゛（
いるごとにより同定する６変異クローンをさらに、すＡ
−１，および致９□Ｉと共にり旦−■で。 分解するごとにより、　ＮＣ０１部位の位置に関する性
格づりをする。変異した旧３−３．８八〇ヘクターを旧
３−３．１１八〇とする。 Ａ＝−劣　〕−Ｌ古’　ｎ：　−，１）−イー■云イー
９Ｌ−七端子ΣＱ四ｙ呻訓１旧仏の一没−畝 殺虫遺伝子をファゼオリン遺伝子に節単に導入するには
、２つの変化をファセオリン遺伝子に与えねばならない
。第１は、ファゼオリン遺伝子のポリアデニル化部位お
よび３゛末端（＝１近に旦ｎｄｌ１１部位（５’、、、
八″ＡＧＣＴＴ・・、３゛）を伺加することある。他の
重要な変化はすべての３種の読み取りフレームに対する
翻訳終止コドン（例えば下記に下線で示しであるＴＡＡ
、ＴＡＧあるいはＴＧＡ）を配置することである。　オ
リゴヌクレオチド５′八ＧＧＧＴＧＣＡＴＴＴＧＡＡＧ
ＣＴＴＧＡＡＴＡＡＧＴＡＡＧＡＡＣＴＡＡ八八ＴＧＣ
３’ｔａ＋と、ファセオリン遺伝子をコードしている配
列の３゛末端［ｂｌと比べるとき次に示すように所望の
特性を有するごとがわかる： ｕ皿ｍ ａ）　５’ＡＧＧＧＴＧＣＡＴＴＴＧＡ″ＡＧＣＴＴＧ
ＡＡＴＡＡＧＴＡＡＧＡＡＣＴＡＡＡＡＴＧＣ３’ｈ）
　・−−ＡＧＧＧＴＧＣＡＴＴ’ｒＧＴ　ＧＴＡＣＴＧ
ＡＡＴＡＡＧＴＡＴＧＡＡＣＴＡＩＩＡＡＴＧＣ，、。 この３８−個にはわずか６個の適合しないものがあるだ
けなので７ブライミングに際し良好なハイブリダイゼー
ション特性が保証されることに注意されたい。 ８亥オリコ゛ヌクレオチｌご５゛八ＧＧＧＴＧＣＡＴＴ
ＴにＡＡＧＣＴＴＧ八ΔＴ＾ΔＧＴへＡＧＡＡＣＴＡＡ
ＡＡＴＧＣ３’を実施例１０．１に記述したように合成
し、培養培地から遠心分離によって単離したウィルス粒
子より精製した１本鎖環状Ｍ１３−３．８Ａａ　Ｄ　Ｎ
　Ａとハイブリダイズさせる。 このオリゴヌクレオチド：　Ｍ２Ｓ−３，８Ａａハイプ
リントをＤＮＡリガーゼおよびエセリシア・コリーＤＮ
ＡポリメラーゼＩのクレノー断片と保温し、　ｃｃｃＤ
ＮＡを増やし、混合物をＪＭ１０３へ形質転換する。 該形質転換株が産生ずるウィルス粒子を単離し。 低感染比で細胞を感染させるために用いる。ＲＦＤＮＡ
を多くの感染コロニーから単離し、制限酵素分析により
性格づけを行う。変異オリゴヌクレオチドで複製が開始
された鎖から派生したクローンを、ファセオリンの３゛
末端に１ＩｉｎｄｌＩ［部位が存在するかどうかで同定
した。そして、構造遺伝子の両末端に変異配列が存在す
ることを、塩基配列決定により確認する。希望する配列
を有するヘクターをＭ２Ｓ−３，８八すとする。 （以下余白） ４．４　意瀘１山ｉシ鉦１人 ３．８Ａｂ　ＤＮＡと混合し、連結する。混合物をに８
０２へ形質転換し、カナマイシンおよび／あるいはテト
ラザイクリン耐性形質転換株からのプラスミドＤＮＡを
単離し、制限酵素分析により性格づけを行った。ファゼ
オリンプロモーターとポリアデニル化部位との間に挿入
された殺虫構造遺伝子を有するプラスミドをＭ２Ｓ−Ｐ
ｐＢｔとし、それを有するコロニーを選別する。 ｐＫｓｌｌｌ−Ｋ　（Ｆｉｎｋ、前出）は、　ｐＫＳｌ
ｌｌ　Ｔ　−Ｄ　ＮＡのｌｌ１ｎｄｌ［部位の間に挿入
されたｐＫＳ−４由来のＴｎ５ハと遺伝子を有している
。Ｍ２Ｓ−ＰｐＢｔ／　ＲＦ　Ｄ　ＮＡｔｌ−Ｂａｍ旧
で分解し、ハＬ旧で線状化したｐＫｓｌｌｌ−Ｋ　（Ｆ
ｉｎｋ、前出）と混合し、連結する。　カナマイシンお
よび／あるいはテトラサイタリン耐性のに８０２形質転
換株からのプラスミドを単離し、制限地図作成により性
格づけを行った。ｐＫｓｌｌｌ−ＰｐＢｔと命名された
プラスミドを有するコロニーを選別し、それはファゼオ
リンプロモーター／殺虫構造遺伝子／ポリアデニル化部
位の組合せ（それは幻す−遺伝子と共にオクトピンＴ−
ＤＮＡに囲まれている。）を有している。 エセリシア・コリーに８０２　（ｐＫｓｌｌｌ−ＰｐＢ
ｔ　）をアゲ１コハクチリウム・チューメファシエンス
、実施例！〕に述べたように、交雑する。ｐＴｊ１５９
５５に基ツ＜１発明の背景の順に記述しているような再
生させる場合都合がよい変異を有する。１”ＩＰプラス
ミド′を有するアグロバクテリウム・チューメファシエ
ンス株を選別する。相同部位組み換え体を。 実施例９に記述しているように１選別し制限地図作成に
より性格づけを行う。その作成物の効力をヒマワリの茎
に感染させて迅速に試験する。結果として生じる瘤を、
実施例７に記述しているように、　ＥＬＩＳＡおよびウ
エスタッフ゛ロットでそして。 実施例８に記述しているように、パイオアツセイによっ
て試験する。実施例６に記述しているように、アグロバ
クテリウム株を、タバコ細胞の感染に用い２次いでその
タバコ細胞は再生する。得られた植物を、昆虫耐性の特
性が要求されるさまざまな商業品種と交叉するために、
育種用の貯蔵株として用いる。再生した植物および殺虫
タンパクを有する子孫の田畑は、タバコホーンウオーム
のような昆虫の幼虫の侵略に対して耐性である。これは
、幼虫が植物組織を食べた際に幼虫に対して毒性がある
からである。 実施例ｌ この実施例における再生は、Ｒｉプラスミドに基づ＜Ｔ
ＩＰプラスミドによりおこされたニンジンの腫瘍につい
でであり、基本的にはＭ、−Ｄ、Ｃｈｉｌｔｏｎｅｔ　
ａｌ、（１９８２）　Ｎａｔｕｒｅ　２９５　：　４３
２−４３４に記述されたとおりに行われている。 五−」−毛根全９−盛碌。 ニンジンのディスクに０．１ｎｌの水中に１０９のバク
テリアを植菌する。得られた毛の末端の１．５ｃｍの小
片を切取り、ホルモンを欠いた固体（１−１，５％寒天
）−ニエル培地（Ｄ、八、Ｔｅｐｆｅｒ　＆　Ｊ、Ｃ。 Ｔｅｍｐｔ　（１９８］、）　Ｃｒ、ｔ＋ｅｂｄ、５ｅ
ａｎｃ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、＋　Ｐａｒｉｓ幻５−：　
１５３−１５６）に置き、そしてｌｌｌ’１所で２５℃
〜２７℃で成育させる。バクテリアが混在していない培
養物を２〜３週間毎に移し代え、ホルモンおよび寒天を
欠くモニエル培地に縫代培養する。形質転換された根は
異系な形態で識別および選別することができる。 】−１租Ａ１月町Σ９近↓ 実施例５．１で記述している培養根組織を０．３６μＭ
　２．４−Ｄおよび０．７２μ門カイネチンを含む固体
（０，８％寒天）モニエル培地上に置く。４週間後。 結果として化したカルス組織をホルモンを欠く液体モニ
エル培地に移す。２２〜２５℃で振盪機（］Ｂ５ｒ、ｐ
、ｍ、）　ｊ−で１ケ月間培養している間にカルスが懸
濁培養中へ分離してくる。それをホルモンを欠くモニエ
ル培地の入ったベトリ皿に置くと、そこから胚が分化し
、それは小植物へ成長する。これらの植物は培養中で成
育し、徐々に湿気を減らしていくことによる“強化”の
後で、温室あるいは野外の土壌へ移す。 ５．３　非毛状根ベクターの１用 機能的ｔｍｒ遺伝子を有しないＴｉに基づくベクターを
、　Ｔ、Ｃ，Ｈａｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、　ＵＳ　ａｐｐ
ｌｉｃａｔｉｏｎｓ＋ｓｅｒ。 ｎｏｓ、４８５．６１３　ａｎｃ！　４８５，６１４　
らに記述されたように。 Ｒ４に基づくベクターの代わりに用いる。適当な変異の
作成は専門家によって可能であり、そしてそれについて
は発明の背景の項で述べである。 大施斑立 この実施例における再生はＴｉに基づ＜ＴＩ　Ｐプラス
ミドいよりおこされた。基本的にはに、Ａ、Ｂａｒｔｏ
ｎｅｔ　ａｌ、（１９８３）　Ｃｅ１ｌ　３２　：　１
０３３４０４３によって記述されたように行われたタバ
コ腫瘍を含む。 ６．１　裂う泣しご叶ソリ咥（句撰束 ツバコ組１＠を、八、Ｃ，８ｒａｕｎ　（１９５６）　
Ｃａｎｃ、Ｒｅｓ。 １６　：　５３−５６によって初めに述べられた。逆転
した茎の小片を利用する方法を用いて形質転換する。 茎は表面を７％市販クりロソクス（（：ｂｌｏｒｏｘ）
および８０％エタノールで殺菌し、殺菌水で洗い、寒天
で固形化したホルモンを欠＜ＭＳ培地（Ｔ、Ｍｕｒａｓ
ｈｉｇｅ＆　Ｆ、５ｋｏｏＨ（Ｎ］４ｉ２）　Ｐｆ＋ｙ
ｓｉｏ１．ＰＩａｎむ５　↓ｆｉ　：　４７３−４９７
）の入ったべ１−９皿に根本の端を上にして置く。植菌
は、注ｆｆ＝Ｊ器の針で茎の基本面の切片に穴をあけ。 バクテリアを注入することにより行う。茎を２５℃で１
日当り１６１１．胃ＩＪ１．光を照射して培養するう成
育したカルスを茎の小片の表面から採り、０，２■Ｚｍ
ｌｌカルビニシリンを含み、ホルモンを欠く固体ＭＳ培
地上に置く。そして約１ケ月の期間をおいて、３１ｍ新
鮮なＭＳ−カルベニシリン培地に移し変える。そして培
養中にバクテリアが存在していなかったかどうか試験す
る。無菌組織を前述の培養条件（２５℃；１６時間＝８
時間、明：暗）で添加物を欠く固体ＭＳ培地上で保存す
る。 ６．２　長ｉ！ｉ！旧１Δ堆ｌ− 形質転換した無菌組織からＡ、Ｂ１ｎｎ５　＆　Ｆ、Ｍ
ｅｉｎｓ（ｉ９７９）　Ｐｌａｎｔａ　１４５　：　３
６５−３６９．により記述されたようにしてクローンを
得る。カルスを０．０２■／ｌナフタレン酢酸（ＮＡＡ
）中で２５℃２２あるいは３日間、　１３５ｒ、ｐ、ｍ
、で振盪しながら培養し、５４３および２１３μｍのス
テンレススチールメソシュを順番に通して濾過すること
により懸濁細胞へ転換させる。濾過物を濃縮し、０．５
％の溶解した寒天。 ２．０　ｍｇ／ｌ　ＮＡＡ、０．３ｒｒｇ／Ｉｌカイネ
チンおよび０．４ｇ／ｊ２ディフコ酵母エキスを含む５
　ｍｊ’のＭＳ培地に約８Ｘ１０３細胞／ｍβの密度で
移植する。約１鶴の直径に達したコロニーをメスの先で
つまみ取り、２．Ｏｒｒｇ／　ｊ２ＮＡＡ、０．３ｗ／
　Ｒカイネチンおよび約１０ｐｇ　７ｍ７！Ｓ　−（２
−アミンエチル）−Ｌ−システィン（Ａ　Ｂ　Ｃ）を含
む固体ＭＳ培地に置く。　（ＡＢＣの濃度の範囲は、２
ｐｇ／ｍｌｌと３０μｇ７ｍｌｌの間について試される
。なぜなら２選別における正確な濃度の効果は、用いる
タバコの種類２および元の植物およびそれから派生した
組織に適用される成育条件、に依存しているため。）Ａ
ＢＣばオクトビンシンターゼを有する組織を選別するこ
とが可能な試薬ということは知られている（Ｇ、Ａ、Ｄ
ａｈｌ　＆　Ｊ、Ｔｅｍｐｅ　（１９８３）　Ｔｈｅｏ
ｒ、Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、。 印刷中）。代わりに、低密度ｃ数１００細胞／ｍｌ１）
で固体ＭＳ／ＮＡＡ／カイネチン／酵母エキス培酵母エ
キスレ地上バコ細胞のフィーダ一層の上に濾紙をおおい
その上に濾液を置いてもよい。１朋のコロニーが生した
ら、全濾紙を固体ＭＳ／Ｎ八八／へへネチン／ＡＢＣ培
地の入ったベトリ皿に移す。結果として生じたカルスか
らＡＢＣ毒性効果を示さないものを選別し、小片に分割
し、オクトピン産生能およびホルモンに独立的な成育な
どのような、他の形質転換表現型について試験を行う。 ６．３　ｉ１矩（往生 形質転換したクローンを０．３１■／βカイネチンを含
む固体ＭＳ培地上に移植し、そして実施例６゜１に記述
したように培養する。形成したシュートを、Ｉ／１０強
度のＭＳ培地塩および０．４■／１１チアミンを含み、
蔗糖およびホルモンを欠＜、ｐＨ７，０の固形（１，０
％寒天）培地上に移植して根を出させる。祖の出た植物
を培養して成育させ、実施例５．２で記述したように１
強化し、そして温室あるいは野外の土壌に移す。植物は
、専門家にはよく知られている方法１例えば適当なプロ
ーブを用いるサザン、ノーザンおよびドツトプロット、
オクトビン試験、結晶タンパクの存在に関する免疫的（
実施例７を参照）あるいは生物学的（実施例８を参照）
試験などにより、形質転換された表現型の保持について
選別する。 ６．４　侠月１ン１Σ久夕：− Ｔ、Ｃ，Ｈａｌｌ　ｅｔ　旦、、　ＬＩＳ　ａｐｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎ　ｓｅｒ、ｎｏｓ。 ４８５．６１３　ａｎｄ　４８５，６１４によって示さ
れた作成物は。 機能的ハＬ遺伝子を欠く、適したＴｉに基づくベクター
である。実施例６．１に示した逆転した茎の小片の感染
についての方法は、ＴＩＰ−形質転換植物細胞系列を確
立するのに、しばしば有用であ天１ｕ引り 抗殺虫タンパク抗体を、免疫学の当業者゛にはよく知ら
れている方法で２作成した。ＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気電気移動後原を発見するための゛°ウェスタン
”プロットを、基本的にはＲ，Ｐ。 Ｌｅｇｏｃｋｉ　＆　Ｄ、Ｐ、Ｓ、Ｖｅｒｍａ　（１９
８１）　八ｎａｌｙｔ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｌｌｌ　：　
３８５−３９２に記述しであるのと同様にして行った。 マイクロＥＬＩＳＡ　（酵素連関免疫吸着分析）試験を
、９６個のウェルを有したイムロン−２型プレートを用
いて、以下に示す手順で行ったニア、１　上υ（ｑブー
レートへの結分 １目目、コーテイング用緩衝液中で１　：　１０００に
希釈した抗体（ウサギ抗殺虫タンパク　［ｇＧ）でウェ
ルをコーティングする。２００μβ／ウエルを３７°Ｃ
で２〜４日間保温する。保温中、プレートはサランラン
プで覆う。それから、プレートをリン酸緩衝液で緩衝化
したサリンーツイーン（１’ＢＳ−Ｔｉｙｅｅｎ）で、
各々の洗いの段階の間を５分間保ち、３回洗う。次いで
１％の存生血清アルブミン（ＢＳＡ）を洗いのために加
え、そしてウェルに加えて捨てる前に、　２０分間静置
する。ＰＢＳ−Ｔｌｖｅｅｎで５回以上洗う。 ７．２　則１υ良壊 組織を小片に切り、ポリトロンを用いて、１＋ｗの組織
あたり１　ｍβのリン酸で緩衝化したザリン−ツイーン
−２％ポリビニルピロリドン−４０（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅ
ｎ−２％ＰＶＰ−４０）を加えてすりつぶす。すりつぶ
しの前後、すべての標品を水中に保ち、標準曲線を得る
。組織のホモジェネート中で行われる標準曲線もあれば
、すりつぶされた、ｍｍや細胞からの殺虫タンパクの回
収率を知るために緩衝液中で行われる標準曲線もある。 続いてすりつぶした標品を遠心分離し、１００μβずつ
の各々の標品をウェルに入れ、４℃で一晩放置する。失
敗を避けるために各々の標品について２通りずつ行う。 保温中、プレートはシールしておく。 ７、　３　隆♂ｉでＣず一凸憧 一晩保温した後、抗原を捨て、そしてＰＩＩＳ−Ｔｗｅ
ｅｎで各洗浄の間５分間置きながら５凹ウエルを洗う。 接合物（アルカリ性ボスファタージが結合したウザギ抗
殺虫タンパクｌ８Ｇ）を、０．２％ＢＳ八を含むＰＢＳ
−Ｔｗｅｅｎ−２％ｐｖｐでＩ　：　３０００に希釈し
。 １５０　μｐを各ウェルＧこ加える：続いて３７℃で３
〜６時間保温する。保温後、接合物を捨”乙　ウェルを
各々の洗いの間は５分間あり、　ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで
５回洗う。 二本　や月ＨＣ− 分析を１う・）直前、５■の錠剤状の１）−二トロフェ
ニルフメスフェ−１−（ソグマから購入し、暗所で凍結
保存）を１０ｍｆｆの基質に対して加え１錠剤が溶ける
まで１１ｖ拌して溶かす。室温に保った２００μｌの溶
７１１を素早く各ウェルに入れる。反応は様々な時間（
Ｌ）に１例えばｔ　＝０．１０．２０．４０゜６０、９
０そして１２０分、　Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｍｉｃｒｏ−
ＥＬＩＳＡｒｅａｄｅｒを用いて測定する。無色のｐ−
ニトロフェニルフォスフェートがアルカリ性フォスファ
ターゼにより加水分解されて、無機リン酸とｐ−二ｌ−
ロフェノールになり、後者は溶液を黄色にし、これは分
光光度計の４ＬＯｎｍで測ることができる。 尖籏附−斐 昆虫は市販のものを購入し、基本的には、　Ｒ，Ａ。 Ｂｅ１ｌ　＆　Ｆ、Ｇ、Ｊｏａｃｈｉｍ　（１９７６）
　Ａｎｎ、Ｅｎｔｏｍｏｌ、Ｓｏｃ。 八ｍｅｒ、　６９　：　３６５−３７３あるいは１１．
Ｔ、Ｙａｍａｍｏｔｏ　（１，９６９）Ｊ、Ｅｃｏｎ、
Ｅｎｔｏｍｏｌ、　６２　：　１４２７−１４３１に記
述されているようにして、保存した。殺虫クンバクに関
する生物試験は、基本的には、　Ｊ、ｔｌ、５ｃｈｅｓ
ｓｅｒ　ｅｔ　旦。 （１９７７）　Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ、　３３　：　８７８−８８０に記述しである
のと同様にして、殺虫タンパクの抽出物をマンドウ力・
セクスタ（Ｍａｍｄｕｃａ、５ｅｘｔａ）の幼虫に与え
ることにより行った。 咀は 三組交雑は通常下記のようにして行った；当業者にはよ
く知られている他の変法もまた用いることは可能である
。エセリシア・コリーに８０２　（ｐＲＫ２９０に基づ
くシャトルベクター含有）をエセリシア・コリー（ｐｉ
ンに２０１３）、およびＩ″ＩＰを有しストレプトマイ
シン耐性のアグロバクテリウム・チューメファシエンス
株と交雑させる。ｐＲＫ２０１３をシャトルベクターを
有する株へ導入し、転移さずためにシ、１・１〜ルベク
ターをアグロバクテリウムへ移動さ−Ｕる。ス）・レプ
トマイシンと、シャトルベクターが而（性を示すＡｊ剤
、大体カナマイシンかクロラムフェニニｌ−ル３両有を
含む培地上で成育させ。 結果として、シャトルヘクターの配列を有するアグロバ
クテリウＪ、細胞を選別する。これらの細（Ｉｐｂと、
エセリシア・コリー（ｐ門出１１）を交雑させてｐ　Ｐ
　ＩＩ　１．　Ｊ　１をアゲじノハタテリウム細胞へ導
入する。ｐｒ’ＨＩＪＩ　とｐＲＫ２９０に基づくシャ
トルベクターは、同一細胞内に長時間共存することはで
きない。ｐｐＨＩＪ１が耐性遺伝子を有しているゲンタ
マイシン上で成育さゼた結果、　ｐｌ？に２９０の配列
を失った細胞を選別する。ストレブＩ・マイシン、ゲン
タマイシン、およびカナマイシンに耐性な細胞のみがシ
ャトルベクターと二重相同部位組み換えを経験したＴｉ
プラスミドを有し、また希望する配列を有している。 ｐＲＫ２９０およびｐＲＫ２０１３はＧ、Ｄｊｔｔａ　
ｅｔ　ａｌ、（１９８０）Ｐｒｏｃ、Ｎａむ１．八ｃａ
ｄ、ｓｃｉ、１ＩｓＡ　７７　：　７３４７−７３５７
により発表され、　ｐＰＨＬＪｌはＰ、Ｒ，Ｉｔｉｒｓ
ｈ　（１９７８）　Ｔｈｅｓｉｓ。 Ｕ旧ν、Ｅ、Ａｎｇｌｉａにより発表されている。 ｎ例１０ この実施例は、オリゴヌクレオチドの合成および使用に
ついて記述しているものである。他の有用な参照研究は
、これらの実施例の冒頭部分に引用しである研究のリス
トを見ればさがし出すことができる。 １０．１　オリゴヌクレオチドの合成 これらの実施例中で用いているＤＮＡ１４Ｊｉ片の化学
合成の技術は多くのＤＮＡ合成の当業者によく知られた
技術を利用している。ヌクレオシドの修飾は、　ｔｌ、
５ｃｈａｌｌｏｒ　ｅｔ　ａｌ、（１９６３）　Ｊ、八
ｍｅｒ。 Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　８５　：　３８２０とＨ，Ｂｕ
ｃｈｉ　＆　Ｈ，Ｇ、Ｋｈｏｒａｎａ（１９６５）　Ｊ
、八ｍｅｒ、ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　８７　：　２９９
０．によって述べられている。デオキシヌクレオシドホ
スフォアミダイトの調製は、　Ｓ、Ｌ、Ｂｅａｕｃａｇ
ｅ　＆　Ｍ、１１．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）　
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　２２　：　１８
５９により述べられた。固相樹脂の調製はＳ、Ｐ、Ａｄ
ａｍｓ　旦　社。 （１９８３）　Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、によ
り述べられている。 ２本鎖合成リンカーの形成の期間中、有用な／”ｔイブ
リダイゼーション過程は、　Ｊｊ、Ｒｏｓｓｉ　ｅｔ　
ａｌ。 （１９８２）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５７　：
　１１０７０．により述べられている。 １０．２　オリゴヌクレオチドの使用 遺伝子の欠失した部分を再構成するだめの合成オリゴヌ
クレオチドの使用は、　１ｌａｌｌ　ｅｔ　ａｌ、＋Ｕ
Ｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｓｅｒ、ｎｏ、４８５＋
６１４により例示されている。また不和合性の制限部位
の粘着末端を連結するための合成オリゴヌクレオチドの
使用は。 ｆｌａｉｌ　ｅｔ　ａｌ、、ＵＳ　ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎ　ｓｅｒ、ｎｏ、４８５＋６１４に例示されており
、また、それらは組み換えＤＮＡ操作の当業者にはよく
知られている。 １０．３　オリゴヌクレオチドによる　・直接の一般的
方法は、最近、　Ｄ、５ｈｏｒｔｌｅ旦　リエ。 （１９８１）　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ、　１５　
：　２６５−２９４によって総説が出されている。遺伝
子の操作において特に有用なのは、オリゴヌクレオチド
による直接的特定部位の変更である。これは最近、　Ｍ
、Ｊ、Ｚｏｌｌｅｒ＆　Ｍ、Ｓｍ１ｔｈ　（１９８３）
　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１００　：　４６８−
５００とＭ、Ｓｍ１ｔｈ　＆　Ｓ、Ｇｉｌｌａｍ　（１
９８１）　、ｉｎ　ＧｅｎｅｔｒｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎ、　；　Ｐｒ１ｎｃｉ　ａｌｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ＋　ｖｏｌ、　３＋ｅｄｓ、：　Ｊ、に、Ｓｅｔｌ
ｏｗ　＆　Ａ、Ｈｏ１ｌａｅｎｄｅｒ、　ａｎｄ　Ｍ、
Ｓｍ１ｔｈ（１９８２）　Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、　７　：　４４０−４４２．によって総説が
出されている。この技術を用いると、ＤＮＡ配列中の１
ないしそれ以上のベースペアーの変換、あるいは小さい
挿入あるいは欠失を、導入することができる。最近のオ
リゴヌクレオチドを用いた直接変異には次のようなもの
がる：　Ｍ、Ｊ。 Ｚｏｌｌｅｒ　＆　Ｍ、Ｓｍ１ｔｈ　（１９８３）　旦
肛虹Ｍ、Ｊ、Ｚｏｌｌｅｒ　＆Ｍ、Ｓｍ１ｔｈ　（１９
８２）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１０　
：　６４８７−６５００、　Ｇ、Ｄａｌｂａｄｉｅ−Ｍ
ｃＦａｒｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）Ｐｒｏｃ
、ＮａＬｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　ヱ９　：　６
４０９−６４１３．　Ｇ。 Ｆ、Ｍ、Ｓｉｍｏｎｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）　Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。 １０　：　８２１−８３２およびＣ，Ａ、Ｈｕｔｃｈｉ
ｓｏｎｌ［Ｉ　ｅｔ　ａｌ。 （１９７８）　Ｊ、旧ｏ１．ｃｈｅｍ、　２５３　：６
５５１−６５６０　、有用なＭ１３に基づくベクター（
例えばｍＷＢ２３４４）がＷ、Ｍ。 Ｂａｒｎｅｓ　ｅＬ　ａｌ、（１９８３）　Ｍｅｔｈ、
　Ｅｎｒｙｍｏｌ、　１０１　：９８−１２２．とＷ、
Ｍ、Ｂａｒｎｅｓ　＆　Ｍ、Ｂｅｖａｎ　（１９８３）
　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、旦：　３４９−
３６８．によって報告されている。 修飾されるべき配列は２通常当業者にはよく知られた標
準技術により、１重鎖バタテリオファージベクター、こ
こではＭ１３から派生したもの、に移される。該ＤＮＡ
ベクターは一般的に２本鎖複製型（ＲＦ）の状態である
。なぜなら、１本鎖ウィルス型では、１ｆｆｌ常、制限
酵素およびリガーゼで“切断および結合”ができないか
らである。インビトロでのＲＦへの断片の連結後、適当
な宿主へ形質転換し、それからベクターの生活環の一部
としての１本鎖ＤＮＡ　（ｓｓＤＮＡ）を産生させる。 ５ｓＤＮＡをファージ粒子から単離し、充分な長さを有
し、適当な場所でベクターとハイブリダイズするべく配
列の相同性を有したオリゴヌクレオチドとハイブリダイ
ズさせる。オリゴヌクレオチドは、変化させるべき配列
以外は変化のない最終産物が希望できる。配列を有する
べきである。一旦。 変異配列を有するオリゴヌクレオチドと塩基対をなした
５ｓＤＮＡ環を含むハイブリッドが形＾されると、５”
から３°へのエキソヌクレアーゼ活性がないエセリシア
・コリーＤＮＡポリメラーゼ■のクレノー断片により、
オリゴヌクレオチドからＤＮＡの相補鎖が合成される。 該ベクターを随意に、ＤＮＡリガーゼと共に保温すると
、リガーゼとポリメラーゼの反応が同時に行なえる。優
先的に共有結合的閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）分子を
。 形質転換する前に、アルカリ性蔗糖勾配遠心分離。 アルカリ性条件でのフェノール抽出およびＳｌヌクレア
ーゼとの保温などの技術を用いて、該ベクターは現在、
適当な細菌宿主細胞へ形質転換することができる。この
初期の感染からのウィルス粒子を単離して、バクテリア
のローンに感染させてプラークを形成させるために用い
る。制限部位を変化させた場合には、制限酵素分析によ
り容易にＲＦｓをスクリーニングできる。また１合成変
異オリゴヌクレオチドプライマーをプローブとして用い
て注意深く選んだ条件下でのハイブリダイゼーション、
またはＤＮＡ配列を決定することによっても選別できる
。希望する変異を有するクローンを単離したとき、当業
者によ（知られた技術を用いて、必要に応して変異ＤＮ
Ａを操作することができる。 プ」１例」−１−通彩れこ用司−侵（ｆ−の」Ｌ戚Ｊ」
収σ−牡」作ましにゲ魅 完全なプロ］・キシン遺伝子を再構成するために。 隣接１）　Ｎへの制限部位を既知技術である制限酵素分
解物のサリ゛ンブロノトにより同定し、そして重複クロ
ーンを５０ＭＤ　（メガダルトン）プラスミド濃縮ＤＮ
Ａから作成したハ見■ライブラリーから選別した。プロ
トキシン遺伝子の５゛および３゛末端を次いで特殊なＨ
ｉｎｄｌ１１部位を用いて融合させ。 当業者に既知であるｐＢｔ７３−１６と呼ばれるプラス
ミドに含まれる完全なプロトキシン遺伝子を作成した。 　エセリシア・コリーＨＢＩＯＩ　（ｐＢｔ７３−１６
）はＮＲＲＬ　Ｂ−１５７５９として寄託されている。 ｐＫｓ−■ｌ」を本質的には実施例２．２に示したよう
に作成した。ｐＫＳ−肛虹Ｉ　Ｄ　Ｎ　ＡをＣｊ±」で
分解し、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼで埋め、そして５“
ＣＧＧＡＴＣＣＧ３’　リンカ−と連結しｐＫＳ−匹■
　（ハし）を作成した。　エセリシア・コリーＧＭ４Ｂ
　（Ｍ、Ｇ。 Ｍａｒｉｎｕｓ（１９７３）Ｍｏｌｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇｅ
ｎｅｔ、１２７　：　４７−５５）中で増殖させたｐＢ
Ｒ３２５（Ｆ、Ｂｏｌｉｖａｒ　（１９７８）　Ｇｅｎ
ｅ４　：　１２Ｌ　１３６）ＤＮＡをＢｃｌ　ＩとＢａ
ｍ　ＩＩＩで分解し。 そしてそれ自身を再結合することにより、ｐＢＲ３２５
のＢｃｌ　Ｉ　／Ｂａｍ　ＨＩ断片を欠失したｐＢＲ３
２５ａＢＢと名付けたプラスミドを作成した。ｐＫＳ−
ｐｒｏ　Ｉ　（Ｂａｍ　）の４．２ｋｂｐ　（キロヘー
スペアー）旺Ｉ１１断片をｐＢＲ３２５ａＢＢノＥｃｏ
　Ｒ１部位にクローン化することにより。 ｐ４０３Ｂと称するプラスミドを作成した。このプラス
ミドは、ｐＨＫ２９０に基づくベクターからｐＢＲ３２
５に基づくベクターへ移されたｐＭＳ−ｐｒｏ　Ｉ　（
Ｂａｍ　）のＴ　−１）　Ｎ　Ａを持つ。 ｐＢｔ７３−１６　１）　Ｎ　Ａを皿ｅｌで分解し、　
Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端にした後、この平
滑末端バチルス１．）　Ｎ　Ａを二本鎖のＳｎ＋ａ　Ｉ
で線状にしたＭ］３ｍｐ１９　ＲＦ　Ｄ　Ｎ　Ａ　’（
Ｊ、Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ　ｅＬ　ａｌ、（１９８３）　
Ｇｅｎｅ　２−６　：　１０１−１０６）と混ぜ、連結
し、　１．６゜４、と称するベクターを作成した。この
ベクターは。 一本積型が結晶タンパクｍ　ＲＮ　Ａと相補的であるく
ずなわら、ファージが意味のない鎖を有する）ように配
置分れた３、６ｋｂｐバチルスＤＮＡを有する。Ｉｌｐ
ｍ　Ｉ１１部位を含むオリコヌクレオチ］ニプライマー
を　５’ＧＡＧＡＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＧＧＡ
ｉ’ＡＡＣ３’（７）ｔ３ｅＪりの殺虫構造遺伝子の５
°末端に対して用いる本質的には実施例１０に述べたよ
うに、　ＢＩＩＩＴＩ　Ｉ１１部位をバチルスＩ）ＮΔ
に、結晶タンパクの翻訳開始部位のすく５“側に勇人し
、　１．６．４Ｂ−３，８，３と名付けたベクターを得
た。　殺虫タンパク構造遺伝子は３．７５ｋｂｐ　勧ｍ
ｌｌ＋断片上の二本鎖１．６．４Ｂ−３，８，３ＲＦ　
ＤＮＡから除かれうる。 Ｂａｍ　ＩＩＩで分解したｐ４０３Ｂおよび１．、６．
４Ｂ−３，８，３ＤＮＡを混ぜそして連結してｐ４０３
Ｂ／ＢＴＢｌ１３と称するプラスミドを作成した（第４
図）１゜このプラスミドは、“１．６”プロモーターと
ポリ−アデニル化部位の間にある完全な長さの殺虫タン
パク構造遺伝子を有する。この作成物の方向は“１．６
″プロモーターから転写されたとき、結晶タンパクをコ
ードするｍＲＮＡの合成をもたらす。 エセリシア・コリーＣ６００（ｐＲＫ−２０３−Ｋａｎ
−１０３−Ｌｅｃ）はＮＲＲＬ　Ｂ−１５８２１として
寄託されており、これは。 Ｔ−ＤＮＡの５，５１２肚皿■部位と９．０６２展旧部
位の間がＴｎ５由来のｋａｎ遺伝子Ｆレクチン遺伝子で
置換されている以外は、　Ｒ，Ｆ、Ｂａｒｋｅｒ　ｅｔ
　旦。 （１９８３）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏ）、　２　
：　３３５−３５０により決定されたように、　ｐＴｉ
１５９５５のＴ−ＤＮＡ配列を４．４９４と１２．８２
３の匡乞１ぜ１部位の間で有するｐＲＫ２９０誘導体で
ある。レクチン遺伝子はＨｉｎｄＩ［Ｉで分解し次いで
再連結することによりｐＲＫ−２０３−Ｋａｎ−１０３
−Ｌｅｃから除かれ、　ｐＲＫ−２０３−Ｋａｎ−１０
３と称されるベクターになる。ｐＲＫ−２０３−Ｋａｎ
−１０３は２本質的には実施例９に述べたように、アグ
ロバクテリウム・チュ−メファシエンスＡＴＣＣ１５９
５５へ導入された。Ｒ５２０１４と呼ぶ二重相同組み換
え体は同定され、それば変異ｐＴｉ１５９５５　Ｔ　−
Ｄ　Ｎ　Ａを有していた。この置換は詳細な記述の項で
述べたように、ある展および摩−配列を欠失する。Ｒ５
２０１４Ｔ　−Ｄ　Ｎ　Ａは植えつけられた植物組織を
ホルモン非依存増殖の表現型をＩｊえることなく形質転
換する。Ｒ３２０１４誘導体により形質転換されたタバ
コ組織は、当業者によく知られている手法により５正常
植物へ再生されうる。 アグロバクテリウムにおいては、ｐＢＲ３２５誘導体は
１発明の背景のシャトルベクターの項で述べたように、
“自殺ベクター”である。エセリシア・コリートＩＣ１
０６１（ｐ４０３／ＢＴＢ＃３）、　エセリシア・コリ
ー（ｐＲＫ２０１３）およびアグロバクテリウム・チュ
ーメファシエンスＲ５２０１４を交雑させた。単−相同
組み換え事象によりポリアデニル化部位の例。 すなわち“′１．６”構造遺伝子の左側、に□−差−ｐ
Ｔｉ１５９５５へ同時に取り込まれたｐ４０３／ＢＴＢ
Ｉ３を有するアグロバクテリウム・チューメファシエン
ス細胞を含む　Ｒ’３−１１と名付けた株が分離された
。 （この’　１．６”遺伝子はＢａｒｋｅｒ　ｅｔ　旦、
ｌ前出、のＯＲＦ　２４に相当する）。 ニコチアナ・ツバカムｖａｒ、キサンチの茎部分にＲ３
−１１細胞を３本質的には実施例６に述べたように、植
菌した。刺激細菌を除き、形質転換植物組織を培養し、
単細胞をクローン化し、植物組織培養の当業者によく知
られている方法を用いて正常細胞に再生させる。 植物発現性の全長の殺虫タンパク遺伝子を含む形質転換
タバコカルス組織を喰ったタバコホーンウオームは、バ
チルス・チューリンゲンシス結晶タンパク毒性による症
状を示すことが観察された。 ウェスタンプロット（実施例７）に類似の免疫学的ドン
トブロソトは、バチルス・チューリンゲンシス結晶タン
パク抗原が植物発現性の全長殺虫タンパク遺伝子を有す
る形質転換組織の抽出物中に存在すること、を示した。 （発明の要約） 発現殺虫タンパクの構造遺伝子を植物ゲノムへ導入する
方法を提供した。提供された具体例では。 本発明は、バチルス・チューリンゲンシスの結晶タンパ
クの構造遺伝子を植物あるいはＴ−ＤＮＡのプロモータ
ーの支配下、さらにポリアデニル化部位の前に置き１次
いで前記プロモーター／構造遺伝子の組をアグロバクテ
リウム・チューメファシエンスＴｉプラスミドに基づく
形質転換系を用いて植物ゲノムに挿入すること、を含む
。次いで修飾Ｔｉプラスミドは受容植物細胞を形質転換
するのに用いられる。さらに提供されたものはこの方法
で生産された植物および組織、そして本発明遂行に有用
な細菌株、プラスミドおよびベクターである。 （以下余白） Ｃｕ１ｅｘ肚、　フレック Ｃ，ｔｒｉｔａｅｎｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ　フレックＣ
，ｔａｒｓａｌｉｓ　（ｗｅｓｔｅｒｎ　ｅｎｃｅｐｈ
ａｌｉｔｉｓ　ｍｏｓｑｕｉｔｏ）　フレックＣ，ｔｅ
ｒｒｉｔａｎｓ　フレック Ｃ，ｕｎｉｖｉｔｔａｔｕｓ　’）　Ｌ／　ｙ　’）Ｃ
ｕｌｉｓｅｔａ　１ｎｃｉｄｅｎｓ　（Ｃｕｌｉｓｅｔ
ａ：　ｍｏｓｑｕｉｔｏｓ）　クリセタＣ，１ｎｏｒｎ
ａｔａ　クリセタ Ｄｉａｍｅｓｓａ　ｇ４．　ディアメ Ｄｉｘａ　ｇＨ，（Ｄｉｘａ：　ｍｉｄｇｅｓ）　ディ
キサＥｕｓｉｍｕｌｉｕｍ　（Ｓｉｍｕｌｉｕｍ）　１
ａｔｉｐｅｓ　（Ｅｕｓｉｍｕｌｉｕｍ：　ｇｎａｔｓ
）　ニーシムＧｏｅｌｄｉｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ　ｈｏ
ｌｏｐｒａｓｉｎｕｓ　プリデイｉｌａｅｍａｔｏｂｉ
ａ　１ｒｒｉｔａｎｓ　（ｈｏｒｎ　ｆｌｙ）　へマー
トビＨｉｐｐｅｌａｔｅｓ　ｃｏｌｌｕｓｏｒ　ヒノペ
レＯｄａｇｍｉａ　ｏｒｎａｔａ　オダグミＰａ１ｅｓ
　ｐａｖｉｄａ　ヘ−ガス Ｐｏｌｐｏｍｙｉａ　肚、　（Ｐｏｌｐｏｍｙｉａ：　
ｍｉｄｇｅｓ、　ｂｉｔｉｎｓ）　ボルボミＰｏｌｙｐ
ｅｄｉｌｕｍ　５２．　（Ｐｏｌｙｐｅｄｉｌｕｍ：　
ｍｉｄｇｅｓ）　ボリペデＰｓｏｒｏｐｈｏｒａ　ｃｉ
ｌｉａｔａ　ソロフオＰ、　ｃｏｌｕｍｉａｅ　（ｃｏ
ｎｆｉｎｎｉｓ）　（Ｆｌｏｒｉｄａ　Ｇｌａｄｅｓ　
ｍｏｓｑｕｉｔｏ、　ソロフオｄａｒｋ　ｒｉｃｅ　ｆ
ｉｅｌｄ　ｍｏｓｑｕｉｔｏ）　キード。 Ｐ、　ｆｅｒｏｘ　ソｔｌ　７　オ Ｓｉｍｕｌｉｕｍ　ａｌｃｏｃｋｉ　（Ｓｉｍｕｌｉｕ
ｍ：　ｂｌａｃｋ　ｆｌｉｅｓ）　シムリウＳ、ａｒｇ
ｕｓ　シムリウ ス種 ス・トリタニオリンカス ス・クーサリス（ウェスタン　エンセフプリテイス　モ
スキー１・）ス・テリタンス ス・ユニビタクス ・インシデンス（クリセフ：蚊） ・イノーナタ ソナ種 種（ディキサ：蚊） リウム（ンムリウム）・ラティペス（ユーシムリウム：
ブヨ）キロノムス・ホロブラシナス ア・イリタンス（ホーンフライ） 一テス・コルソー ア・オルナータ ・ペビダ ア種（ボルボミア：蚊５刺す） イラム種（ポリペディラム：蚊） 一う・シリアク ーラ・コルミニ（コンフィニス）　（フロリダ　グレー
デス　モスダークライス　フィールド　モスキード）−
ラ・フェロソクス ム・アルコツキ−（シムリウム：黒バエ）ム・アルガス Ｓ、　ｃｅｒνｉｃｏｒｎｕｔｕｍ　’ｉ　Ｌ　ＩＪＳ
、　ｄａｍｎｏｓｕｍ　シムリ Ｓ、　ｊｅｎｎｉｎｇｓ。　″”す Ｓ、　ｐｉｐｅｒｉ　シムリ ３、　ｔｅｓｃｏｒｕｍ　シムリ Ｓ、　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ　シＬ　’ＪＳ、　ｕｎｉｃ
ｏｒｎｕｔｕｍ　シムリ１Ｓ、　ｖｅｎｕｓｔｕｍ　シ
ム１月 Ｓ、　ｖｅｒｅｃｕｎｄｕｍ　シムリ・Ｓ、　ｖｉｔｔ
ａｔｕｍ　シＬ　’Ｊ　・Ｕｒａｎｏｔａｅｎｉａ　ｉ
ｎｇｕｉｃｕｌａｔａ　カランＩＪ、　ｌｏ讐ｉｉ　’
　カラン Ｗｙｅｏｍｙｉａ　ｍ１ｔｃｈｅｌｌｉｉ　（Ｗｙｅｏ
ｍｙｉａ：　ｍｏｓｑｕｉｔｏｓ）　ウエオＷ、　ｖａ
ｎｄｕｚｅｅｉ　ウニ：Ｉ−１１ＹＭＥＮｌ−１１Ｙ＾
　膜翅「Ｉ Ａｔｈａｌｉａ　ｒｏｓａｅ　（ａｓ　ｃｏｌｉｂｒｉ
）　アタリ”Ｎｅｍａｔｕｓ　（Ｐｔｅｒｏｎｉｄｅａ
）　ｒ’１ｂｅｓｉｉ　ネマタ・（ｉｍｐｏｒｔｅｄ　
ｃｕｒｒａｎｔｗｏｒｍ）Ｎｅｏｄｉｐｒｉｏｎ　ｂａ
ｎｋｓｉａｎａｅ　（ｊａｃｋ−ｐｉｎｅ　５ａｔ１ｆ
ｌｙ）　ネオデＰｒ１ｏｐｈｏｒｕｓ　ｔｒｉｓｔｉｓ
　プリオＰｒ１ｓｔｉｐｈｏｒａ　ｅｒｉｃｈｓｏｎｉ
ｉ　（ｌａｒｃｈ　ｓａｗｆｌｙ）　ブリスシム・セル
ビコルヌタム シム・ダムノーサム シム・ジェニングシ シム・ピペリ シム・テスコーラム シム・チューバローサム シム・ユニコーヌタム シム　ベヌスタム ラム・ヘレカンダム シム・ビソティクム トニ゛？・インギキュラータ 升ニア・ロビ ミア・ミチェリー（ウエオミア：蚊） ミア・バンドウゼイ ？・１：＋−ザ（またはコリブリ） ｌ（プテロニデ）・リヘシ（インボーテッド　カラン１
ウオーム）Ｃプリオン・パンクシヤニ（ジャック　パイ
ン　ソーフライ）７オ・−ラス・トリステイス トフォーラ・エリクソニ（ラーチ　ソーフライ）１、Ｅ
ＰＩＩ］０ＰＴＥＲＡ　！！Ｊ翅目八ｃへａｅａ　ｊａ
ｎａｔａ　アカエフＡｃｈｒｏｉａ　ｇｒｉｓｅｌｌａ
　（ｌｅｓｓｅｒ　ｗａｘ　ｍｏｔｈ）　アクコノＡｃ
ｈｙｒａ　ｒａｎｔａｌｉｓ　アキラ・八ｃｌｅｒｉｓ
　ｖａｒｉａｎａ　（ｂｌａｃｋ−ｈｅａｄｅｄ　ｂｕ
ｄｗｏｒｍ）　アクレｌ。 ＡｃｒｏｂａＳｉｓ　ｓＨ，アクロ− Ａｃｒｏｌｅｐｉａ　ａｌｌｉｅｌｌａ　アクロＬ＾ｃ
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（・・・マーロカンパ）・ンユードツガータ（ダグラス
ファーツク　］−ス） ギア・ズエリナ ソシアーゴシ力 トリニア（ピロラスタ）・ヌビラリス（ヨーロッパ　コ
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モレウス リオ・フイルター １／ブサ（アフェミア）・グラリス ロヘノア・ビテアナ ミエＬ１イス・　トランノテラ ナラ・グタタ 千ノー゛スラ　ゴシビエラ（ピンク　ボールウオーム）
カリア・リノニ トローマ・リウノア（ハリエゲイテノＦ　カッＩウォー
Ｊ、）レラ・ブセファラ ゴフォーラ・メティキュローサ ガニティア　カリフォルニ力（カリフ戸ルニア　オーク
ウオーム）リマユ（−ノリ干シェフ）・オーバキュレラ
（ボテｔ　チューバーウオーム）コノリフター（リソコ
レティス）・プランヵーデラノス・ブラシカ（ラージ　
ホヮイ［・　ハターフラ伺ｊス・キャンディダ　ソーデ
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２．　ブラ Ｐ、　５ｔｕｌｔａｎａ　ファ Ｐｌａｔｙｐｔｉｌｉａ　ｃａｒｄｕｌｄａｃｔｙｌａ
　（ａｒｔｉｃｈｏｋｅ　ｐｌｕｍｅ　ｍｏｔｈ）　プ
ラＰｌｏｄｉａ　１ｎｔｅｒｐｕｎｃｔｅｌｌａ　（Ｉ
ｎｄｉａｎ−ｍｅａｌ　ｍｏｔｈ）　プロ”Ｐｌｕｔｅ
ｌｌａ　ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ　ａｓ　ｍａｃｕｌｉｐ
ｅｎｎｉｓ　（ｄｉａｍｏｎｄｂａｃｋ　プルｍｏｔｈ
） Ｐｒａｙｓ　ｃｉｔｒｉ　（ｃｉｔｒｕｓ　ｆｌｏｗｅ
ｒ　ｍｏｔｈ）　プレ・Ｐ、　ｏｌｅａｅ　（ｏｌｉｖ
ｅ　ｍｏｔｈ）　ブレ・Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ　１
ｎｃｌｕｄｅｎｓ　（ｓｏｙｂｅａｎ　１ｏｏｐｅｒ）
　ソニーＰｙｇａｅｒａ　ａｎａｓｔｏｍｏｓｉｓ　ピ
ガーＲａｃｈｉｐｌｕｓｉａ　ｏｕ　’ｙ　キー。 Ｒｈｙａｃｉｏｎｉａ　ｂｕｏｌｉａｎａ　（Ｅｕｒｏ
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ｒａ　ｃｙｎｔｈ：ａ　サミ− ３ａｔｕｒｎｉａ　ｐａｖｏｎｉａ　サタ−５ｃｈｉｚ
ｕｒａ　ｃｏｎｃｉｎｎａ　（ｒｅｄ−ｈｕｍｐｅｄ　
ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ）　ンズミ５ｃｈｏｅｎｏｂｉ
ｕｓ　ｂｉｐｕｎｃｔｉｆｅｒ　ショー５ｅｌｅｎｅｐ
ｈｅｒａ　ｌｕｎｉｇｅｒａ　セレ調Ｓｅｓａｍｉａ　
１ｎｆｅｒｅｎｓ　セサミ５ｉｂｉｎｅ　ａｐｉｃａｌ
ｉｓ　シビーリス・レイバ（インポーテッド　キャベツ
ソウオーム。スモール　ホワイト−フライ） ンペナ・スカブラ（グリーン　クローバ−ウオーム）升
ツタ種 Ｌツタ　スタルタナ ｒ−ブチリア・カードゥイダクタイラ（アーティチョー
ク　プラム　モス）〆イア　インターバンクテラ（イン
ディアンミール　モス）トラ・−トラロステラまたはマ
カリペニス（ダイアモンドバック　モス）Ｃズ・ノトリ
　（シトラス　フラワー　モス）（ズ・オレア（オリー
ブ　モス） 一ドプルシア・インクルーデンス（ソイビーン　ルーバ
ー）ニラ・アナストモーシス げルンー？・オウ ／オニア・ポリアナ（ヨーロッパ　パイン　シュー１・
　モス）１デス・カベラータ ２・シンチア 一ニア・パポニア ・・コンンナ（レソドハンフ”ド　キャタピラーンエノ
ビラス・パイパンクティファー 、フェラ・ルニゲラ ア・・インフエレンス ン・アビカーリス ７、　ｗｉｌｋｉｎｓｏｎｉ　リーフ Ｔｌ＋ｙｍｅｌｉｃｕｓ　ｌ１ｎｅｏｌａ　（Ｒｕｒｏ
ｐｅａｎ　５ｋｉｐｐｅｒ）　チメリＴｈｙｒｉｄｏｐ
Ｌｅｒｙｘ　ｅｐｈｅｍｅｒａｅｆｏｒｍｉｓ　（ｂａ
ｇ＋ｓｏｒｍ）　チリドＴｉ’ｎｅｏｌａ　ｂｉｓｓｅ
ｌｌｉｅｌｌａ　（Ｈｅｂｂｉｎｇ　ｃｌｏｔｈｅｓ　
ｍｏｔｈ）　チネオＴｏｒｔｒｉｘ　ｖｉｒｉｄａｎａ
　（ｏａｋ　ｔｏｒｔｒｉｃｉｄ）　）−トＴｒｉｃｈ
ｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ　（ｃａｂｂａｇｅ　１ｏｏｐｅ
ｒ）　）リコＩｄｅａ　ｐｒｏｆｕｎｄａｌｉｓ　（ｃ
ｅｌｅｒｙ　１ｅａｆ　ｔｉｅｒ）　ウデアＩｆ、　ｒ
ｕｂｉｇａｌｉｓ　ウデア νａｎｅｓｓａ　ｃａｒｄｕｉ　（ｐａｉｎｔｅｄ−ｌ
ａｄｙ）　ツマネサｖ、１０　ツマネサ ＸａｎｔｈｏｐａｓＬｉｓ　ｔｉｍａｉｓ　キサンＸｅ
５ｔｉａ　（Ａｍａｔｈｅｓ、　Ａｇｒｏｔｉｓ）　ｃ
ｎｉｇｒｕｍ　（ｓｐｏｔｔｅｄ　ゼステｃｕ　ｔｗｏ
ｒｍ）　力、ト Ｙｐｏｎｏｍｅｕｔａ　ｃｏｇｎａｔｅｌｌａ　（＝　
Ｙ、　ｅｖｏｎｙｍｉ）　（Ｙｐｏｎｏｍｅｕｔａ　イ
ボノ冨１１ｙｐｏｎｏｍａｕ　ｔａ）　＝ヒポＹ、　ｅ
ｖｏｎｙｍｅｌｌａ　イ；＋ｊ　／Ｙ、　ｍａｈａｌｅ
ｂｅｌｌａ　イボノＹ、　ｍａｌｉｎｅｌｌａ　（ｓｍ
ａｌｌ　ｅｒｍｉｎｅ　ｍｏｔｈ）　イポノＹ、　ｐａ
ｄｅｌｌａ　（ｓｍａｌｌ　ｅｒｍｉｎｅ　ｍｏｔｈ）
　イボノＹ、　ｒｏｒｒｅｌｌａ　イホ／ Ｚｅｉｒａｐｈｅｒａ　ｄｉｎｉａｎａ　ゼイラトボエ
・ウィルキンソニ カス・ライネオラ（ヨーロッパ　スキ・ツバ−）プテリ
フクス・エフエメラエフオリス（バ・ノブウオーム）う
・ピノセリエラ（ウェビング　クロス　モス）リソクス
・ビリダナ（オーク　トートリジッド）プルシア・二（
キヤへソジ　ルーツイー）・プロファングリス（セロリ
−リーフ　ティア−）・ルビガリス ・カートイ　（ペインテッドレディ） ・イメ トパスティス・テイマイス イア（アマテス、アゲロチイス）・カニダラム（スボツ
テ・７ドウオーム） ミュータ・コグナテーラ（−イボノミュータ・エボニミ
）（イボノミュータノミューク） ミュータ・バプラ（スモール　エルミン　モス）ミュー
タ・ロレラ フェラ・ディニアナ ＭＡＬＬＯＰ）ＩＡＧ八 Ｂｏｖｉｃｏｌａ　ｂｏｖｉｓ　（ｃａｔｔｌｅ　ｂｉ
ｔｉｎｇ　１ｏｕｓｅ）Ｂ、ｃｒａｓｓｉｐｅｓ Ｂ、　Ｉｉｍｂａｔａ Ｂ、　ｏｖｉｓ Ｌｉｐｅｕｒｕｓ　ｃａｐｏｎｉｓ　（ｗｉｎｇ　ｌｏ
ｕｓｅ）Ｍｅｎａｃｎａｔｈｕｓ　ｓｔｒａｍｉｎｅｕ
ｓＭｅｎｏｐｏｎ　ｇａｌｌｉｎａｅ　（ｓｈａｆｔ　
１ｏｕｓｅ）ＴＩ？ＩＣＨＯＰＴＥＲＡ １１ｙｄｒｏｐｓｙｃｈｅ　ｐｅｌｌｕｃｉｄａＰｏｔ
ａｍｏｐｂｙｌａｘ　ｒｏｔｕｎｄｉｐｅｎｎｉｓハジ
ラミ目 ボビコーラ・ボビス（カトル　ハイティング　ルーズ）
ホヒコーラ・タラソソプス ポビコーラ・リンバータ ホビコーラ　オヒス リボイルス・カポニス（ウィング　ルーズ）メナクナー
クス・ストラミノイス メノボン　ガリーナ（シャフト　ルーズ）Ｉ・ビろ一う
目 ハイ１０プシケ・ペルシダ ボタモフィー・ノクス・ロータンディベニス第４表 プラノＪ−トζ抹■指」１ 株またはプラスミド　実施例での作成 または使用 アグロバクテリウム・チューメファシエンス　６アグロ
ハタテリウム・リゾゲネス　５ バチルス・チューリンゲンシスνａｒ。 クルスタキ　ＨＤ−７３１，１ ＣｏｌＢ１　２．５ エセリシア・コリー　ＧＭ３３　２．３エセリシア・コ
リー　ＨＢＩＯｌ、　１．１エセリシア・コリー　ＪＭ
１０３　２．１エセリシア・コリー　Ｋ２Ｏ２２，２ ＭＢ７３　３．３ ＭＢＴ３　（Ｎｃｏ　）　３．４ ＭＢＴ１４　３．３ ｍＷ８２３４４　２．１ 旧３−Ｂｔ−＾　２．１ Ｍ１３−Ｂｔ−Ａ　（ハｍ　）　２．１旧３−Ｂｔ−３
２，Ｉ Ｍ１３ｍｐ７　３．１ 参照図　作製の起源（および二］メント）（随所に存在
） （背景も参照） 旧３ｍｐ８．　ｐ１２３７５８−１０ ｎＴ３ 旧３ｍｐ８．　ｐ１２３１５８−１０ ｍＷＢ２３４４．ｐ１２３１５Ｂ−１０旧３−［１１−
Ａ ｍＷＢ２３４４．ｐ１２３１５８−１０旧３ｍｐ８　３
．３ 旧３−ＰｐＢｔ　４．４ Ｍ１３−１　３．１ Ｍ１３−３　３．１ 旧３−３Ａ／Ｂ１８ａ　３．２ 旧３−３．８Ａ　４．１ 旧３−３．８４ａ　４．２ 旧３−３．８Ａｂ　４゜３ 旧３−３．８Ａｃ　４．２ 旧３−３．８３　４．１ ρ８１１３２２　１　、１ ｐＣＦ４４　３．１ ｐｃＦ４４Ａ　３．１ ｐＫＳ−肛ｏ　Ｉ　２．２ ｐｕｓ−肛虹１　（Ｂａ恵−）２２ ｐＭＳ−４２，５ ｐＫｓｌ１１　２．２ ｐＫｓｌ１１−Ｋ　’　４．５ ｐＫｓ１１１−Ｎ　３．５ ｐＫｓ］１ｌ−ＮｐＲｔ　３．５ ｐＫｓ１１＋−ＰｐＢｔ　４．５ ｐＮＳ５　３．１ ｐＰｈｌＪｌ　９ ＭＩＩＴ３　（凡９虹）、旧３−３．８八り旧３ｍｐ７
．　ｐド３５ 旧３ｍｐ７．　ｐＮＳ５ 旧３−３ 旧３ｍｐ７．１７７．４ Ｍ］３−３．８八〇 旧３−３．８八〇 旧３−３．８＾ 旧３ｍｐ７．１７７．４ ｐＲＲ３２２，ｐＴｉＣ５８ ｃＦ４４ ３　ｐＫＳ］１１ ２．２　ｐｔｔｓ−稈１−１ ２　ｐＲＲ３２２，ｐＲ７，１０２ ２、３ｐＲＫ２９０．　ｐＴｉ１５９５５ｐＫＳ４（ｐ
ＲＺ１０２）、ｐＫｓｌｌｌｐｃＦ４４．ｐＫｓＩＩＩ
−Ｋ ＭＢＴ３　（凡ｐｏ１１．　旧３−３八／Ｂ１８ａ、ｐ
Ｋｓｌｌｌ−Ｎ旧３−Ｐｐｎｌ、ｐＫｓｌｌｌ−Ｋ ｐＲｒ３２２．　ｐＣＦ４４八 ｐＨＲ２９０２，２，９ ｐＲＫ２０１３　９ ＰＲＺ１０２　２．５ ｐＴｉＡ６６　２．４ ｐＴｉ１５９５５　２．４ ｐ８．８　４．１ ｐＨ−３３ａ　２．３ ｐＨ−３３ｂ　２．３ ｐ１２３１５８−３　１．１ ｐ１２３１５Ｂ−１０１・１ ｐ４０３　２．２ ″１．６”　２．２ １７７．４　４．１ ｐＢｔ７３−１６　１１．２ ｐＢＲ３２５１２，１ ｐＢＲ３２５ａＢ８　１２．１ ｐ４０３Ｂ　１２．１ Ｍ１３ｍｐ１９　１２．２ １．６．４　１２．２ ］、６．４Ｂ−３，８，３１２，２ ｐ４０３Ｂ／ＢＴＢ＃３　１２．３ ＣｏｌＥ１．　Ｔｎ５ ｐＨＲ３２２，１７７，４ ３９Ｋｓ−匹■（シル−）、ｐＭＳ−４３ｐＨ−３３ａ
、旧３−Ｂｔ−Ａ（ｆｉａｍ　）■　バチルス・チュー
リンゲンシスｖａｒ。 タルスタキ　＋１０−７３．　ｐＨＲ３２２１バチルス
・チューリンゲンシスｖａｒ。 クルスタキ　！ｌ１ｌ−７３．　ｐＨｌ＋３２２２　ｐ
［１Ｒ３２２，ｐＴｉ＋５９５５２　（−転写物２４．
また詳細な記述を参照）シャロン　２４Ａ１　ファゼオ
ラス ４　ｐＨｔ７３−１０　（ハｍ　）、　ｐＨＬ７３−１
６１４　ｐＨＲ３２５ ４ｐＨＲ３２５ａＢＲ，ｐＴＲ−ｐ−ｒｏ　ｌ（ｆｉａ
ｍ　）４　Ｍ１３ｍｐ１９．　ｐＨＬ７３−１６４　１
．６．．１ ４　１．６．４［１−３゜８．３．　ｐ４０３ＢｐＲＫ
−２０３−Ｋａｎ−１０３−Ｌｅｃ　１２．４ｐＲＫ−
２０３−Ｋａｎ−１０３１２，４４ｐＲＫ−２０３−Ｋ
ａｎ−１０３−１，ｅｃ５表 Ｕ且 ！？Ｌ　Ｂ−４４８８バチルス・チューリンゲンシスシ
ａｒ、クルスタキ　１１０−７３Ｒ］、Ｂ−１５３９４
エセリシア・コリー　Ｃ６００（ｐＭＳ−４）ＲＬ　Ｂ
−１１３７１エセリシア・コリー　１１ＢＩＯ］Ｒ１，
Ｂ−１２０１４エセリシア・コリー　ＲＲ］　（ｐＢＲ
３２２）ＣＣ３７０１７ｐＲＲ３２２ ＣＣ１５９５５アグロバクテリウム・チューメファシエ
ンス（ｐＴｉ１５９５５）ＲＬ　Ｂ−１５３９３エセリ
シア・コリー　１１８ＩＯＩ　（ρ８．８）ＲＬ　Ｂ−
１５６１２エセリシア・コリー　）ＩＢＩＯＩ　（ｐ１
２３１５８−１０）Ｒ１、Ｂ−１５７５９エセリシア・
コリー　１１８ＩＯＩ　（ρＢｔ７３−１６）ＲＬ　Ｂ
−１５８２１エセリシア・コリー　Ｃ６００（ｐＲＫ−
２０３−Ｋａｎ−１０３−Ｌｅｃ）
【図面の簡単な説明】
第１図は実施例１に示したｐ１２３１５８−１０の結晶
タンパク遺伝子の配列を示す部分配列図、第２図はｐＴ
ｉ＋５９５５の′Ｆ−Ｌ’）　Ｎ　Ａの制限位置地図と
転写物を示す図、第３図は実施例２に示した植物発現プ
ロモーターの支配下にある殺虫構造遺伝子を有する組み
換え６　ＮΔヘクター作成を示す模式図である。第４図
は殺虫構造遺伝子を有するｐ４０３Ｂ／ＢＴＢ１１３プ
ラスミドの作成およびこれのアグロバクテリウム・チュ
ーメファソエンスへの導入を説明する模式図である。 以上 代理人　弁理士　山木秀策 糸♂　晶　夕、ハ゛り遺イ云ぎり音子セト凸乙列ＦＩＧ
、　１　−　１ −・−・、・・・・φ・・−・・３１１６Ｉｕｌｌ＋Ａ
＋ｄ１ｗＡＩ＋Ｔ ＦＩＧ、　１−２

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 ■、植物で発現可能なプロモーター支配下の殺虫構造遺
    伝ｒ−を自する遺伝的に修飾された植物細胞を有する植
    物。 ２　、　’＋ｉｉｊ記細胞が’Ｉ’−１）　Ｎ八をイＪ
    シ、　１ｔｉｊ記殺虫構造遺伝子かその中に挿入さ４１
    ．ている４ろ許請求の範囲第１項に記載の植物。 ３、前記殺虫遺伝子か、−呻其遺伝子、　ｏｃｓ−遺伝
    子、あるいは前記１’　−Ｌ）　Ｎ　Ａの“１．６”領
    域のいず４ｑ、かの中の転写活性のある部位Ｇこ挿入さ
    れた特許請求の範囲第２項に記載の植物。 ４−１ｆ’ｌｎ己′ｌ’　−１）　Ｎ入力・切↓−１−
    （隻あるいは−（１−を不４Ｌ化４−る。１、’＋　（
    ＩＷ　降された特許請求の範囲第２項に記載の植物。 ５、＋ｉｉｊ記１’　−Ｄ　Ｎ　Ａがさらに機能的四千
    −遺伝子を有する特ｊ’ｌ請求の範囲第２項に記載の植
    物。 ６　前記殺虫（１〜造遺伝子がバチルス・チヱーリンゲ
    ンシスから得られた特許請求の範囲第１項に記載の植物
    。 ７、植物で発現可能なプロモーターの支配下にある殺虫
    構造遺伝子を含有する遺伝的に修飾された植物細胞を有
    する植物組織。 ８、前記細胞がＴ−ＤＮＡを有し、そのｉ゛−ＤＮＡ中
    に前記殺虫遺伝子が挿入されている特許請求の範囲第７
    項に記載の組織。 ９、前記殺虫遺伝子が前記９四−遺伝子、前記匹」−遺
    伝子、あるいは、前記Ｔ−ＤＮＡの前記”１．６’”領
    域のいずれかの中の転写活性のある部位に挿入された特
    許請求の範囲第８項に記載のＭｉ織。 １０、前記Ｔ−ＤＮＡが修飾された特許請求の範囲第８
    項に記載の組織。 １１、前記修飾により一堕ｊ−，ｔｍｒ　、、あるいは
    （−懸一。 が不活化された特許請求の範囲第１０項に記載の組織。 １２、前記Ｔ−ＤＮＡがさらに機能的９Ｃ５−遺伝子を
    有する特許請求の範囲第８項に記載の組織。 １３、前記植物が裸子植物である特許請求の範囲第８項
    に記載の組織。 １４．前記植物が被子植物である特許請求の範囲第８項
    に記載の組織。 １５、前記植物が単子葉植物である特許請求の範囲第Ｉ
    ４項に記載の組織。 １６、前記植物が双子葉植物である特許請求の範囲第１
    ４項に記載の組織。 １７、前記植物がナス科の一員である特許請求の範囲第
    １６項に記載の組織。 １８゜前記植物がマメ科の一員である特許請求の範囲第
    １６項に記載の組織。 １９、前記植物がキク科の一員である特許請求の範囲第
    １６項に記載の組織。 ２０、前記植物がアオイ科の一員である特許請求の範囲
    第１６項に記載の組織。 ２１、前記植物が野菜である特許請求の範囲第１４項に
    記載の組織。 ２２、前記構造遺伝子がＴ−ＤＮＡプロモーター支配下
    にある特許請求の範囲第７項に記載の組織。 ２３、前記構造遺伝子が、　ｔｎ＋ｒ　、　ｔｍｌ　、
    　ｔｍｓ　＊ｎｏｓ　、　ｏｃｓおよび前記“１．６”
    転写物から成るＴ−ＤＮＡ遺伝子の群から選択されたプ
    ロモーターの支配下にある特許請求の範囲第２２項に記
    載の組織。 ２４、前記殺虫構造遺伝子が植物プロモーターの支配下
    にある特許請求の範囲第７項に記載の組織。 ２５、前記構造遺伝子が、ファゼオリン、およびリプロ
    ースート５−ニリン酸カルボキシラーゼの小サブユニッ
    トから成る植物遺伝子の群から選択された植物遺伝子の
    プロモーターの支配下にある特許請求の範囲第２４項に
    記載の組織。 ２６６前記殺虫構造遺伝子が、３５Ｓおよび１９３の転
    写物を支配しているプロモーターの群から選択されたＣ
    ａＭＶプロモーターの支配下にある特許請求の範囲第７
    項に記載の組織。 ２７、前記殺虫構造遺伝子が修飾されている特許請求の
    範囲第７項に記載の組織。 ２８、前記殺虫構造遺伝子が前記殺虫タンパクのどちら
    かの末端に付加アミノ酸をコードするよう修飾されてい
    る特許請求の範囲第２７項に記載の組織。 ２９、前記修飾が挿入、欠失、あるいは構造遺伝子塩基
    配列中の１個あるいはそれ以上の塩基置換を含んでいる
    特許請求の範囲第２７項に記載の組織。 ３０、前記殺虫構造遺伝子がバチルス・チューリンゲン
    シスから得られた特許請求の範囲第７項に記載の組織。 ３１、前記構造遺伝子が１１２３１５８−１０の構造遺
    伝子とハイブリダイズ可能な特許請求の範囲第３０項に
    記載の組織。 ３２、殺虫構造遺伝子および植物で発現可能なプロモー
    ターを有するＤＮＡベクターであって。 該遺伝子および酸ブロモークーは、該遺伝子が植物細胞
    内で該プロモーター支配下で発現するような位置および
    方向に互いにある。ＤＮＡベクター。 ３３、前記殺虫遺伝子がＴ−ＤＮＡ中に挿入されている
    特許請求の範囲第３２項に記載のベクター。 ３４６前記Ｔ−ＤＮＡが修飾されている特許請求の範囲
    第３３項に記載のベクター。 ３５、前記遺伝子が前記ｔｓ＋］遺伝子２匹し遺伝子、
    あるいは前記Ｔ−ＤＮＡの前記“１．６”領域のいずれ
    かの中の転写活性のある部位へ挿入されている特許請求
    の範囲第３３項に記載のベクター。 ３６、前記Ｔ−ＤＮＡがさらに機能的匹し遺伝子を有す
    る特許請求の範囲第３３項に記載のベクタ０ ３７、前記プロモーターがＴ−ＤＮＡプロモーターであ
    る特許請求の範囲第３２項に記載のベクタ０ ３８、前記プロモーターが植物プロモーターである特許
    請求の範囲第３２項に記載のベクター。 ３９、前記植物プロモーターがファゼオリン。 およびリブロース−１・５−ニリン酸カルボキシラーゼ
    の小サブユニットから成る植物遺伝子の群から選択され
    た特許請求の範囲第３８項に記載のベクター。 ４０、前記プロモーターが３５３および１９３転写物を
    支配しているプロモーターの群から選択されたＣａＭＶ
    プロモーターである特許請求の範囲第３２項に記載のベ
    クター。 ４１、前記殺虫構造遺伝子が修飾されており。 その修飾が挿入、欠失、あるいは構造遺伝子塩基配列中
    の１個あるいはそれ以上の塩基置換を含む特許請求の範
    囲第３２項に記載のベクター。 ４２、前記殺虫構造遺伝子がバチルス・チューリンゲン
    シスからのものである特許請求の範囲第３２項に記載の
    ベクター。 ４３、前記構Ｘａ遺伝子カｐ１２３１５８−１０　（７
    ）構造遺伝子とハイブリダイズ可能な特許請求の範囲第
    ４２項に記載のベクター。 ４４、前記プロモーターが修飾されており、その修飾が
    挿入、欠失、あるいは構造遺伝子塩基配列中の１個ある
    いはそれ以上の塩基置換を含む特許請求の範囲第３２項
    に記載のベクター。 ４５、殺虫構造遺伝子および植物で発現可能なプロモー
    ターを有する細菌株であって２該遺伝子と該プロモータ
    ーは、該遺伝子が植物細胞内で該プロモーターの支配下
    で発現可能であるような。 位置と方向に互いにある。細菌株。 ４６、前記発現可能な遺伝子がＴ−ＤＮＡ中にある特許
    請求の範囲第４５項に記載の株。 ４７、前記Ｔ−ＤＮ八がアグロバクテリウム属から選択
    した細胞内にある特許請求の範囲第４６項に記載の株。 ４８、前記殺虫構造遺伝子がバチルス・チューリンゲン
    シスからのものである特許請求の範囲第４５項に記載の
    株。 ４９、前記構造遺伝子がｐ１２３１５Ｂ−１０の構造遺
    伝子にハイブリダイズ可能な特許請求の範囲第４８項に
    記載の株。 ５０　、ｐ１２３１５８−１０およびｐ１２３１５８−
    ３の群から選択されたプラスミド。 ５１　、ｐ１２３１５８−１０およびｐ１２３１５８−
    ３の群から選択されたプラスミドを有する細菌株。 ５２、前記細菌がエセリシア・コリーＩｔ　Ｂ　１０１
    である特許請求の範囲第５１項に記載の株。 ５３、植物細胞を遺伝的に修飾する方法であって、殺虫
    構造遺伝子と植物発現プロモーターとを含有するように
    該植物細胞を形質転換し１それにより該遺伝子が該植物
    細胞内で植物発現プロモーターの支配のもとに発現しう
    る方法。 ５４、前記殺虫遺伝子が植物プロモーター支配下にある
    特許請求の範囲第５３項に記載の方法。 ５　ｓ　、　ｉｉＵ記殺虫遺伝子が、ファゼオリン、お
    よびリプロースート５−ニリン酸カルボキシラーゼの小
    ザブユニットを含む植物遺伝子のグループから選択され
    たプロモーターの支配下にある特許請求の範囲第５４項
    に記載の方法。 ５６、ｎｉＪ記殺虫構造遺伝子がＴ−ＤＮＡプロモータ
    ーの支配下にある特許請求の範囲第５３項に記載の方法
    。 ５７、前記構造遺伝子がハＬ、ハ］　、　ｔｍｓ　、！
    。 旦および前記”１．６”転写物からなるＴ−ＤＮＡ遺伝
    子の群から選択されたプロモーターの支配下にある特許
    請求の範囲第５６項に記載の方法。 ５８、前記殺虫遺伝子が３５３および１９３の転写物を
    支配しているＣａＭＶプロモーターの群から選択された
    プロモーターの支配下にある特許請求の範囲第５３項に
    記載の方法。 ５９、前記殺虫遺伝子が修飾され、その修飾が挿入、欠
    失、あるいは前記構造遺伝子塩基配列中の１個あるいは
    それ以上の塩基置換を含む特許請求の範囲第５３項に記
    載の方法。 ６０、前記遺伝子がＴ−ＤＮＡへ挿入される特許請求の
    範囲第５３項に記載の方法。 ６１、前記Ｔ−ＤＮＡが修飾され、その修飾が挿入、欠
    失、あるいは前記Ｔ−ＤＮＡ塩基配列中の１個あるいは
    それ以上の塩基置換を含む特許請求の範囲第６０項に記
    載の方法。 ６２、前記形質転換細胞が裸子植物からのものである特
    許請求の範囲第６０項に記載の方法。 ６３、前記形質転換細胞が被子植物からのものである特
    許請求の範囲第６０項に記載の方法。 ６４、前記被子植物が単子葉である特許請求の範囲第６
    ３項に記載の方法。 ６５、前記被子植物が双子葉である特許請求の範囲第６
    ３項に記載の方法。 ６６、前記双子葉植物がナス科の一員である特許請求の
    範囲第６５項に記載の方法。 ６７、前記双子葉植物がマメ科の一員である特許請求の
    範囲第６５項に記載の方法。 ６８、前記双子葉植物がキク科の一員である特許請求の
    範囲第６５項に記載の方法。 ６９、前記双子葉植物がアオ・イ科の一員である特許請
    求の範囲第６５項に記載の方法。 ７０、前記双子葉植物が野菜である特許請求の範囲第６
    ３項に記載の方法。 ７１、前記殺虫遺伝子が前記ｔｍｌ遺伝子、前記ｏｃｓ
    遺伝子、あるいは前記Ｔ　−Ｄ　Ｎ　Ａの前記“１，６
    ”領域のいずれかの中の転写活性のある部位に挿入され
    る特許請求の範囲第６０項に記載の方法。 ７２、前記植物細胞が細菌から該植物細胞へのＤＮＡの
    導入により形質転換される特許請求の範囲第６０項に記
    載の方法。 ７３、前記植物細胞か、ＤＮＡの直接取込み。 あるいは該植物細胞へのＤＮＡの顕微注入により形質転
    換される特許請求の範囲第５３項に記載の方法。 ７４、前記形質転換細胞を再生して前記殺虫構造遺伝子
    の発現が可能な形質転換再生植物組織を得る工程をさら
    に包含する特許請求の範囲第５３項に記載の方法。 ７５、前記殺虫構造遺伝子がバチルス・チューリンゲン
    シスから得られる特許請求の範囲第５３項に記載の方法
    。 ７６、前記殺虫構造遺伝子が、ｐ１２３１５８−１０の
    中で発見される構造遺伝子とハイブリダイズ可能な特許
    請求の範囲第７５項に記載の方法。
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