JP2003189888A - メイズ（ｍａｉｚｅ）における強化殺虫活性をもつ合成ＤＮＡ配列の発現用プロモーター - Google Patents
メイズ（ｍａｉｚｅ）における強化殺虫活性をもつ合成ＤＮＡ配列の発現用プロモーターInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 植物内での発現のために最適化されたDNA 配
列の発現用プロモーターの提供。 【解決手段】 上記DNA 配列は、好ましくは、殺虫性ポ
リペプチド、特にバチルス・スリンギエンシス(Bacillu
s thuringiensis)からの殺虫性蛋白をコードしている。
植物のプロモーター、特に組織特異的及び組織好適プロ
モーターを提供する。さらに、上記DNA 配列を含んで成
る形質転換ベクターをも開示する。上記形質転換ベクタ
ーは、メイズ中に形質転換されるとき高レベルの殺虫活
性を示す。
列の発現用プロモーターの提供。 【解決手段】 上記DNA 配列は、好ましくは、殺虫性ポ
リペプチド、特にバチルス・スリンギエンシス(Bacillu
s thuringiensis)からの殺虫性蛋白をコードしている。
植物のプロモーター、特に組織特異的及び組織好適プロ
モーターを提供する。さらに、上記DNA 配列を含んで成
る形質転換ベクターをも開示する。上記形質転換ベクタ
ーは、メイズ中に形質転換されるとき高レベルの殺虫活
性を示す。
Description
【０００１】本出願は、1991年10月4 日に出願された米
国の第772,027 号の一部係属出願であり、その開示を全
体として本明細書中に取り込む。
国の第772,027 号の一部係属出願であり、その開示を全
体として本明細書中に取り込む。
【０００２】発明の分野
本発明は、殺虫性蛋白をコードしているDNA 配列、及び
植物内でのこれらの配列の発現に関する。
植物内でのこれらの配列の発現に関する。
【０００３】発明の背景
植物内でのバチルス・スリンギエンシス(Bacillus thur
ingiensis)(Bt)から得られる殺虫性蛋白(IP)遺伝子の発
現は、非常に困難であることが証明されている。植物内
でキメラ・プロモーター/Bt IP遺伝子組み合わせ物を発
現させるための試みが行われてきた。典型的には、低い
レベルの蛋白のみがトランスジェニック植物内で得られ
ている。例えば、Vaeck et al., Nature 328:33-37, 19
87; Barton et al., Plant Physiol. 85:1103-1109, 19
87; Fischoff et al., Bio/Technology 5:807-813, 198
7 を参照のこと。
ingiensis)(Bt)から得られる殺虫性蛋白(IP)遺伝子の発
現は、非常に困難であることが証明されている。植物内
でキメラ・プロモーター/Bt IP遺伝子組み合わせ物を発
現させるための試みが行われてきた。典型的には、低い
レベルの蛋白のみがトランスジェニック植物内で得られ
ている。例えば、Vaeck et al., Nature 328:33-37, 19
87; Barton et al., Plant Physiol. 85:1103-1109, 19
87; Fischoff et al., Bio/Technology 5:807-813, 198
7 を参照のこと。
【０００４】低い発現の原因についての1 つの仮定され
た説明は、偶然の転写プロセシング部位(fortuitious t
ranscription processing sites)がBt IP mRNA転写の異
常型の(aberrant)形態を作り出すというものである。こ
れらの異常にプロセシングされた転写は、殺虫性蛋白を
生産するという意味において、植物内で非機能的であ
る。可能なプロセシング部位は、ポリアデニレーション
部位、イントロン・スプライシング部位、転写終止シグ
ナル及びトランスポート・シグナルを含む。大部分の遺
伝子は、その遺伝子が正常な宿主生物における遺伝子発
現に有害に作用するであろう部位を含んでいない。しか
しながら、コード領域におけるこのようなプロセシング
部位の偶然の発生は、トランスジェニック宿主内のその
遺伝子の発現を複雑にしているかもしれない。例えば、
バチルス・スリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)
から直接得られるような、バチルス・スリンギエンシス
(Bacillus thuringiensis)株カースタキ(kurstaki)(GEN
EBANK BTHKURHD, 寄託番号M15271, B. thuringiensis v
ar. kurstaki, HD-1; Geiser et al. Gene 48:109-118
(1986)) から得られるBt殺虫性結晶蛋白をコードしてい
る領域は、この遺伝子が植物内で適当にプロセシングさ
れることを防ぐ部位を含むかもしれない。
た説明は、偶然の転写プロセシング部位(fortuitious t
ranscription processing sites)がBt IP mRNA転写の異
常型の(aberrant)形態を作り出すというものである。こ
れらの異常にプロセシングされた転写は、殺虫性蛋白を
生産するという意味において、植物内で非機能的であ
る。可能なプロセシング部位は、ポリアデニレーション
部位、イントロン・スプライシング部位、転写終止シグ
ナル及びトランスポート・シグナルを含む。大部分の遺
伝子は、その遺伝子が正常な宿主生物における遺伝子発
現に有害に作用するであろう部位を含んでいない。しか
しながら、コード領域におけるこのようなプロセシング
部位の偶然の発生は、トランスジェニック宿主内のその
遺伝子の発現を複雑にしているかもしれない。例えば、
バチルス・スリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)
から直接得られるような、バチルス・スリンギエンシス
(Bacillus thuringiensis)株カースタキ(kurstaki)(GEN
EBANK BTHKURHD, 寄託番号M15271, B. thuringiensis v
ar. kurstaki, HD-1; Geiser et al. Gene 48:109-118
(1986)) から得られるBt殺虫性結晶蛋白をコードしてい
る領域は、この遺伝子が植物内で適当にプロセシングさ
れることを防ぐ部位を含むかもしれない。
【０００５】植物のような生物内でバチルス・スリンギ
エンシス(Bacillus thuringiensis)蛋白を発現させるこ
とを企てるとき、さらなる困難が存在する。生来のBt I
P 遺伝子のコドンの用い方が植物遺伝子の典型であるも
のから有意に異なっていることが発見されている。特
に、生来のBt IP 遺伝子のコドンの用い方は、メイズ遺
伝子のものと非常に異なっている。その結果として、こ
の遺伝子からのmRNAを、有効に使用することはできな
い。コドンの用い方は、翻訳又は転写又はmRNAプロセシ
ングのレベルにおいて遺伝子の発現に影響を与えること
ができる。植物内での発現のための殺虫性遺伝子を最適
化するために、その遺伝子を、可能な限り、形質転換さ
れるべき宿主植物内に天然に含まれる遺伝子に似せるよ
うに変更するための試みが行われてきた。
エンシス(Bacillus thuringiensis)蛋白を発現させるこ
とを企てるとき、さらなる困難が存在する。生来のBt I
P 遺伝子のコドンの用い方が植物遺伝子の典型であるも
のから有意に異なっていることが発見されている。特
に、生来のBt IP 遺伝子のコドンの用い方は、メイズ遺
伝子のものと非常に異なっている。その結果として、こ
の遺伝子からのmRNAを、有効に使用することはできな
い。コドンの用い方は、翻訳又は転写又はmRNAプロセシ
ングのレベルにおいて遺伝子の発現に影響を与えること
ができる。植物内での発現のための殺虫性遺伝子を最適
化するために、その遺伝子を、可能な限り、形質転換さ
れるべき宿主植物内に天然に含まれる遺伝子に似せるよ
うに変更するための試みが行われてきた。
【０００６】Adang et al., EP 0359472 (1990) は、合
成バチルス・スリンギエンシス・テネブリオニス(Bacil
lus thuringiensis tenebrionis)(Btt) 遺伝子であって
生来のBtt 遺伝子に85% の相同性をもち、そして一般的
にその植物内に見いだされるものとほとんど同じA+T 含
量をもつように設計されているものに関する。Adanget
al.の表1は、双子葉(dicot) 遺伝子の正常コドン分散に
より近く似るように作られた合成Btt 遺伝子のコドン配
列について示している。Adang et al.は、類似の方法を
通して単子葉植物内での強化発現にために、IPのための
合成遺伝子を最適化することができることを述べてお
り、表1 中に、より高く発現された単子葉蛋白のコドン
の用い方の頻度を表している。9 ページにおいて、Adan
g et al.は、その合成Btt 遺伝子を55% のA+T 含量( そ
して、暗に、45% のG+C 含量) をもつように設計するこ
とを述べている。20ページにおいて、Adang et al.は、
その合成遺伝子を、その遺伝子のコード領域内でそれぞ
れのアミノ酸のための双子葉遺伝子により好まれるコド
ンの全体分散を反映させるように、生来のBt遺伝子内で
個々のアミノ酸のコドンを変更させることにより、設計
することを述べている。Adang et al.は、さらに、生来
のBtt 遺伝子コドンのほんのいくつかが、双子葉蛋白に
おいて使用されるコドンの全体分散が保存されるよう
に、それぞれのアミノ酸のための最も好ましい植物コド
ンにより、置き換えられるであろうということを述べて
いる。
成バチルス・スリンギエンシス・テネブリオニス(Bacil
lus thuringiensis tenebrionis)(Btt) 遺伝子であって
生来のBtt 遺伝子に85% の相同性をもち、そして一般的
にその植物内に見いだされるものとほとんど同じA+T 含
量をもつように設計されているものに関する。Adanget
al.の表1は、双子葉(dicot) 遺伝子の正常コドン分散に
より近く似るように作られた合成Btt 遺伝子のコドン配
列について示している。Adang et al.は、類似の方法を
通して単子葉植物内での強化発現にために、IPのための
合成遺伝子を最適化することができることを述べてお
り、表1 中に、より高く発現された単子葉蛋白のコドン
の用い方の頻度を表している。9 ページにおいて、Adan
g et al.は、その合成Btt 遺伝子を55% のA+T 含量( そ
して、暗に、45% のG+C 含量) をもつように設計するこ
とを述べている。20ページにおいて、Adang et al.は、
その合成遺伝子を、その遺伝子のコード領域内でそれぞ
れのアミノ酸のための双子葉遺伝子により好まれるコド
ンの全体分散を反映させるように、生来のBt遺伝子内で
個々のアミノ酸のコドンを変更させることにより、設計
することを述べている。Adang et al.は、さらに、生来
のBtt 遺伝子コドンのほんのいくつかが、双子葉蛋白に
おいて使用されるコドンの全体分散が保存されるよう
に、それぞれのアミノ酸のための最も好ましい植物コド
ンにより、置き換えられるであろうということを述べて
いる。
【０００７】Fischoff et al., EP 0 385 962 (1990)
は、バチルス・スリンギエンシス(Bacillus thuringien
sis)の結晶蛋白毒素をコードしている植物遺伝子に関す
る。表V において、Fischoff et al. は、それぞれのア
ミノ酸のためのコドンについてのパーセント用い方につ
いて開示している。8 ページにおいて、Fischoff et a
l. は、推定ポリアデニレーション・シグナル及びATTTA
配列の除去による生来のBt遺伝子の修飾について示唆
している。Fischoff et al. は、さらに、推定の植物ポ
リアデニレーション・シグナルを同定するために、4 以
上の連続したアデニン又はチミン分子をもつ領域につい
て生来のBt遺伝子配列を走査すること示唆している。
は、バチルス・スリンギエンシス(Bacillus thuringien
sis)の結晶蛋白毒素をコードしている植物遺伝子に関す
る。表V において、Fischoff et al. は、それぞれのア
ミノ酸のためのコドンについてのパーセント用い方につ
いて開示している。8 ページにおいて、Fischoff et a
l. は、推定ポリアデニレーション・シグナル及びATTTA
配列の除去による生来のBt遺伝子の修飾について示唆
している。Fischoff et al. は、さらに、推定の植物ポ
リアデニレーション・シグナルを同定するために、4 以
上の連続したアデニン又はチミン分子をもつ領域につい
て生来のBt遺伝子配列を走査すること示唆している。
【０００８】Fischoff et al. は、このヌクレオチド配
列が、1 以上の推定ポリアデニレーション・シグナルが
互いの10ヌクレオチド内で同定される場合に、変更され
るべきであることを述べている。9 ページにおいては、
Fischoff et al. は、そのG+C 含量を約50% に好ましく
は調整するようにコドンを選択する努力が行われるべき
であることを述べている。Perlak et al., PNAS USA, 8
8:3324-3328 (1991)は、Fischoff et al. 中に示される
ものと類似の、バチルス・スリンギエンシス(Bacillus
thuringiensis) cryIA(b) 遺伝子の修飾コード配列に関
する。表1 中の3325ページにおいて示されるように、Pe
rlak et al.の部分的に修飾されたcryIA(b)遺伝子は、
生来のcryIA(b)遺伝子(1743 ヌクレオチドの中の1681)
に約96% の相同性をもち、41% のG+C含量、18から7 ま
で減少された植物ポリアデニレーション・シグナル配列
(PPSS)数、及び13から7 まで減少されたATTTA 配列数を
もっている。Perlak et al.の全体として修飾されたcry
IA(b)遺伝子は、全体が合成的なものとして開示されて
いる( 3325ページ、カラム1)。この遺伝子は、生来のcr
yIA(b)遺伝子(1845 ヌクレオチドの中の1455) に約79%
の相同性をもち、49% のG+C 含量、1 まで減少された植
物ポリアデニレーション・シグナル配列(PPSS)数、及び
全ATTTA 配列が除去されているものをもつ。Barton et
al., EP 0431 829 (1991) は、植物内の殺虫性毒素の発
現に関する。カラム10において、Barton et al. は、そ
の書類のFig.1 中に示されたチャートに従うそれぞれの
アミノ酸のための最も好ましいコドンを使用したサソリ
毒素をコードしている合成AaIT昆虫毒素遺伝子の構築に
ついて記載している。
列が、1 以上の推定ポリアデニレーション・シグナルが
互いの10ヌクレオチド内で同定される場合に、変更され
るべきであることを述べている。9 ページにおいては、
Fischoff et al. は、そのG+C 含量を約50% に好ましく
は調整するようにコドンを選択する努力が行われるべき
であることを述べている。Perlak et al., PNAS USA, 8
8:3324-3328 (1991)は、Fischoff et al. 中に示される
ものと類似の、バチルス・スリンギエンシス(Bacillus
thuringiensis) cryIA(b) 遺伝子の修飾コード配列に関
する。表1 中の3325ページにおいて示されるように、Pe
rlak et al.の部分的に修飾されたcryIA(b)遺伝子は、
生来のcryIA(b)遺伝子(1743 ヌクレオチドの中の1681)
に約96% の相同性をもち、41% のG+C含量、18から7 ま
で減少された植物ポリアデニレーション・シグナル配列
(PPSS)数、及び13から7 まで減少されたATTTA 配列数を
もっている。Perlak et al.の全体として修飾されたcry
IA(b)遺伝子は、全体が合成的なものとして開示されて
いる( 3325ページ、カラム1)。この遺伝子は、生来のcr
yIA(b)遺伝子(1845 ヌクレオチドの中の1455) に約79%
の相同性をもち、49% のG+C 含量、1 まで減少された植
物ポリアデニレーション・シグナル配列(PPSS)数、及び
全ATTTA 配列が除去されているものをもつ。Barton et
al., EP 0431 829 (1991) は、植物内の殺虫性毒素の発
現に関する。カラム10において、Barton et al. は、そ
の書類のFig.1 中に示されたチャートに従うそれぞれの
アミノ酸のための最も好ましいコドンを使用したサソリ
毒素をコードしている合成AaIT昆虫毒素遺伝子の構築に
ついて記載している。
【０００９】発明の要約
本発明を、植物細胞内での異種遺伝子の発現を強化する
ための方法に対して得た。一般的には、問題の遺伝子又
はコード領域を植物に特異的な好ましいコドン配列を提
供するために構築する。このやり方において、特定の蛋
白のためのコドンの用い方を、特定の植物内で発現を増
加させるために変更する。このような植物最適化コード
配列は、植物細胞内でそのコード配列の発現に向けるこ
とができるプロモーターに作用可能な状態で結合される
ことができる。特に、本発明の1 つの目的は、植物内で
の発現について最適化されている合成殺虫性蛋白遺伝子
を提供することである。本発明の他の目的は、植物、好
ましくはメイズ植物内でのBt蛋白の発現を最適化するた
めの、合成Bt殺虫性蛋白遺伝子を提供することである。
本発明の1 つの特徴は、合成Bt IP 遺伝子を、その全合
成遺伝子の構築のための結合部位を提供するのに必要な
変更を除き、最も好ましいメイズ・コドンを使用して構
築することである。
ための方法に対して得た。一般的には、問題の遺伝子又
はコード領域を植物に特異的な好ましいコドン配列を提
供するために構築する。このやり方において、特定の蛋
白のためのコドンの用い方を、特定の植物内で発現を増
加させるために変更する。このような植物最適化コード
配列は、植物細胞内でそのコード配列の発現に向けるこ
とができるプロモーターに作用可能な状態で結合される
ことができる。特に、本発明の1 つの目的は、植物内で
の発現について最適化されている合成殺虫性蛋白遺伝子
を提供することである。本発明の他の目的は、植物、好
ましくはメイズ植物内でのBt蛋白の発現を最適化するた
めの、合成Bt殺虫性蛋白遺伝子を提供することである。
本発明の1 つの特徴は、合成Bt IP 遺伝子を、その全合
成遺伝子の構築のための結合部位を提供するのに必要な
変更を除き、最も好ましいメイズ・コドンを使用して構
築することである。
【００１０】上記の目的に従って、我々は、合成Bt殺虫
性結晶蛋白遺伝子であってその中でそのコドンの用い方
が植物、特にメイズ内での発現を増加させるように変更
されているものを、合成した。しかしながら、全体的な
コドン分散の意味において、メイズ遺伝子に似るように
そのコドンの用い方を変更するよりはむしろ、我々は、
その合成遺伝子の合成においてメイズ内で最も好ましい
コドン( メイズ好適コドン(maize preferres codons))
を使用することにより、そのコドンの用い方(usage) を
最適化した。その最適化されたメイズ好適コドンの用い
方は、高いレベルのBt殺虫性蛋白の発現に有効である。
これは、メッセンジャーRNAsの与えられた集団から翻訳
されるBt殺虫性蛋白の量を最大化する結果となることが
できた。また、メイズ好適コドンを使用したBt IP 遺伝
子の合成は、生来のコード配列内で生じることができる
偶然のプロセシング部位を取り除く傾向がある。この合
成遺伝子の発現は、生来のIP Bt 遺伝子のものよりもメ
イズ細胞内で有意に高い。
性結晶蛋白遺伝子であってその中でそのコドンの用い方
が植物、特にメイズ内での発現を増加させるように変更
されているものを、合成した。しかしながら、全体的な
コドン分散の意味において、メイズ遺伝子に似るように
そのコドンの用い方を変更するよりはむしろ、我々は、
その合成遺伝子の合成においてメイズ内で最も好ましい
コドン( メイズ好適コドン(maize preferres codons))
を使用することにより、そのコドンの用い方(usage) を
最適化した。その最適化されたメイズ好適コドンの用い
方は、高いレベルのBt殺虫性蛋白の発現に有効である。
これは、メッセンジャーRNAsの与えられた集団から翻訳
されるBt殺虫性蛋白の量を最大化する結果となることが
できた。また、メイズ好適コドンを使用したBt IP 遺伝
子の合成は、生来のコード配列内で生じることができる
偶然のプロセシング部位を取り除く傾向がある。この合
成遺伝子の発現は、生来のIP Bt 遺伝子のものよりもメ
イズ細胞内で有意に高い。
【００１１】好ましい合成の、本発明のメイズ最適化DN
A 配列は、バチルス・スリンギエンシス(Bacillus thur
ingiensis)var. kurstaki, HD-1内のcryIA(b)遺伝子に
よりコードされている蛋白から得られ;Geiser et al.,
Gene, 48:109-118(1986)又はそのcryIB 遺伝子(AKA Cry
a4遺伝子) は、Brizzard and Whiteley, Nuc. Acids.Re
s., 16:2723 (1988) により記載されている。生来のkur
staki HD-1 cryIA(b)遺伝子のDNA 配列を、配列1 とし
て示す。これらの蛋白は、Ostrinia nubilalis, すなわ
ち、the European Corn Borer(欧州トウモロコシ穿孔性
動物) を含む様々な鱗翅目(Lepidopteran)昆虫に対して
活性がある。本発明は、メイズ最適化Bt蛋白遺伝子の合
成により例示されるけれども、その方法を植物内でいか
なる蛋白の発現をも最適化するために使用することがで
きることが認識される。
A 配列は、バチルス・スリンギエンシス(Bacillus thur
ingiensis)var. kurstaki, HD-1内のcryIA(b)遺伝子に
よりコードされている蛋白から得られ;Geiser et al.,
Gene, 48:109-118(1986)又はそのcryIB 遺伝子(AKA Cry
a4遺伝子) は、Brizzard and Whiteley, Nuc. Acids.Re
s., 16:2723 (1988) により記載されている。生来のkur
staki HD-1 cryIA(b)遺伝子のDNA 配列を、配列1 とし
て示す。これらの蛋白は、Ostrinia nubilalis, すなわ
ち、the European Corn Borer(欧州トウモロコシ穿孔性
動物) を含む様々な鱗翅目(Lepidopteran)昆虫に対して
活性がある。本発明は、メイズ最適化Bt蛋白遺伝子の合
成により例示されるけれども、その方法を植物内でいか
なる蛋白の発現をも最適化するために使用することがで
きることが認識される。
【００１２】本最適化遺伝子を、様々なプロモーターで
あって構成的な、誘導性の、一時的に調節された、発展
的に調節された、組織好適(tissue-preferred)の、そし
て組織特異的な(tissue-specific) プロモーターと融合
させ、組換えDNA 分子、すなわち、キメラ遺伝子を作る
ことができる。このメイズ最適化遺伝子( コード配列)
は、非- メイズ最適化遺伝子と比べて、形質転換植物内
で、実質的に高いレベルの発現を提供する。したがっ
て、鞘翅目の(Coleopteran) 害虫又は鱗翅目の害虫、例
えば、欧州トウモロコシ穿孔性動物及びサトウキビ穿孔
性動物(sugarcaneboarer)に対して抵抗性の植物を、作
ることができる。
あって構成的な、誘導性の、一時的に調節された、発展
的に調節された、組織好適(tissue-preferred)の、そし
て組織特異的な(tissue-specific) プロモーターと融合
させ、組換えDNA 分子、すなわち、キメラ遺伝子を作る
ことができる。このメイズ最適化遺伝子( コード配列)
は、非- メイズ最適化遺伝子と比べて、形質転換植物内
で、実質的に高いレベルの発現を提供する。したがっ
て、鞘翅目の(Coleopteran) 害虫又は鱗翅目の害虫、例
えば、欧州トウモロコシ穿孔性動物及びサトウキビ穿孔
性動物(sugarcaneboarer)に対して抵抗性の植物を、作
ることができる。
【００１３】本発明の他の目的は、組織好適の及び組織
特異的なプロモーターであって、他の部分の実質的な排
除に対する植物の１つの特異的な部分又は複数の部分内
での、問題の作用関連構造遺伝子の発現を促進するもの
を提供する。本発明の他の目的は、髄(pith)- 好適プロ
モーターを提供することである。"髄- 好適(pith-prefe
rred)" は、そのプロモーターが、その根(roots) 、外
鞘(outer sheath)、及び支持根(brace roots)内よりも
植物の鞘内での多量の作用関連構造遺伝子の発現に向け
られることができ、そして実質的に種(seed)内で全く発
現されないということを意図している。本発明のさらに
他の目的は、花粉(pollen)- 特異的プロモーターを提供
することである。" 花粉- 特異的(pollen-specific)"
は、そのプロモーターが、植物の花粉内で実質的に限定
的に問題の作用関連構造遺伝子の発現に向けられること
ができ、他の植物の部分のいずれかにおいてはごくわず
かに発現するということを意図している。" ごくわずか
に(negligible)" は、機能的に有意差がないことを意味
する。
特異的なプロモーターであって、他の部分の実質的な排
除に対する植物の１つの特異的な部分又は複数の部分内
での、問題の作用関連構造遺伝子の発現を促進するもの
を提供する。本発明の他の目的は、髄(pith)- 好適プロ
モーターを提供することである。"髄- 好適(pith-prefe
rred)" は、そのプロモーターが、その根(roots) 、外
鞘(outer sheath)、及び支持根(brace roots)内よりも
植物の鞘内での多量の作用関連構造遺伝子の発現に向け
られることができ、そして実質的に種(seed)内で全く発
現されないということを意図している。本発明のさらに
他の目的は、花粉(pollen)- 特異的プロモーターを提供
することである。" 花粉- 特異的(pollen-specific)"
は、そのプロモーターが、植物の花粉内で実質的に限定
的に問題の作用関連構造遺伝子の発現に向けられること
ができ、他の植物の部分のいずれかにおいてはごくわず
かに発現するということを意図している。" ごくわずか
に(negligible)" は、機能的に有意差がないことを意味
する。
【００１４】本発明のさらに他の目的は、問題の構造遺
伝子、特に殺虫性蛋白をコードしている構造遺伝子、に
作用可能な状態で会合した又は結合した組織好適プロモ
ーター又は組織特異的プロモーターを含んで成る組換え
DNA 分子、並びに植物内でのその組換え分子の発現を提
供する。本発明のさらなる目的は、組織好適又は組織特
異的発現パターンにおいて作用可能な状態で少なくとも
１つの問題の構造遺伝子を発現するトランスジェニック
植物を提供することである。
伝子、特に殺虫性蛋白をコードしている構造遺伝子、に
作用可能な状態で会合した又は結合した組織好適プロモ
ーター又は組織特異的プロモーターを含んで成る組換え
DNA 分子、並びに植物内でのその組換え分子の発現を提
供する。本発明のさらなる目的は、組織好適又は組織特
異的発現パターンにおいて作用可能な状態で少なくとも
１つの問題の構造遺伝子を発現するトランスジェニック
植物を提供することである。
【００１５】本明細書中で開示されそして請求された本
発明の1 つの特定の態様においては、この組織好適又は
組織特異的なプロモーターを、殺虫性蛋白をコードして
いる構造遺伝子に作用可能な状態で結合さあせ、そして
植物を、少なくとも1 つの上記のような組換え分子によ
り安定的に形質転換させる。得られた植物は、その中で
その遺伝子が発現されるところの植物の部分を食べる特
定の昆虫に対して抵抗性となるであろう。好ましい構造
遺伝子は、B.t.殺虫性蛋白をコードしている。より好ま
しくは、メイズの最適化されたB.t.IP遺伝子である。
発明の1 つの特定の態様においては、この組織好適又は
組織特異的なプロモーターを、殺虫性蛋白をコードして
いる構造遺伝子に作用可能な状態で結合さあせ、そして
植物を、少なくとも1 つの上記のような組換え分子によ
り安定的に形質転換させる。得られた植物は、その中で
その遺伝子が発現されるところの植物の部分を食べる特
定の昆虫に対して抵抗性となるであろう。好ましい構造
遺伝子は、B.t.殺虫性蛋白をコードしている。より好ま
しくは、メイズの最適化されたB.t.IP遺伝子である。
【００１６】配列の説明:配列番号1 は、完全長の生来
のBt cryIA(b) 遺伝子のDNA 配列である。配列番号2
は、完全長の純粋メイズ最適化合成Bt cryIA(b) 遺伝子
のDNA 配列である。配列番号3 は、約2Kb の切り詰めら
れた合成メイズ最適化Bt cryIA(b) 遺伝子のDNA 配列で
ある。配列番号4 は、完全長の合成メイズ最適化Bt cry
IA(b) 遺伝子のDNA 配列である。配列番号5 は、Perlak
et al. に記載の約2Kb の合成Bt遺伝子のDNA 配列であ
る。
のBt cryIA(b) 遺伝子のDNA 配列である。配列番号2
は、完全長の純粋メイズ最適化合成Bt cryIA(b) 遺伝子
のDNA 配列である。配列番号3 は、約2Kb の切り詰めら
れた合成メイズ最適化Bt cryIA(b) 遺伝子のDNA 配列で
ある。配列番号4 は、完全長の合成メイズ最適化Bt cry
IA(b) 遺伝子のDNA 配列である。配列番号5 は、Perlak
et al. に記載の約2Kb の合成Bt遺伝子のDNA 配列であ
る。
【００１７】発明の詳細な説明
本発明を記載するために明細書及び請求の範囲の中でそ
れらを使用するとき、その用語に関して明瞭性を提供す
るために以下の定義を与える。
れらを使用するとき、その用語に関して明瞭性を提供す
るために以下の定義を与える。
【００１８】メイズ好適コドン(Maize preffered codo
n): 好ましいコドンとは、与えられたアミノ酸を特定
するためのヌクレオチド・コドンの用い方において特定
の宿主細胞により示される好ましさをいう。特定の宿主
についてのアミノ酸のための好ましいコドンは、その宿
主内でそのアミノ酸を最も頻繁にコードしている単一の
コドンである。特定のアミノ酸のためのメイズ好適コド
ンは、メイズ由来の知られた遺伝子配列から得られる。
例えば、メイズ植物からの28遺伝子のためのメイズ・コ
ドンの用い方は、Murray et al., Nucleic Acids Resea
rch,17:477-498(1989)の表4 中に列記されており、この
開示を引用により本明細書中に取り込む。例えば、アラ
ニンのためのメイズ好適コドンは、GCC である。なぜな
ら、Murray et al.,前記中の、26のメイズ遺伝子のプー
ルされた配列に従って、そのコドンが、GCG(24%)、GCA
(13%)、及びGCT(27%)に比べてアラニンを同時期に36%コ
ードしているからである。
n): 好ましいコドンとは、与えられたアミノ酸を特定
するためのヌクレオチド・コドンの用い方において特定
の宿主細胞により示される好ましさをいう。特定の宿主
についてのアミノ酸のための好ましいコドンは、その宿
主内でそのアミノ酸を最も頻繁にコードしている単一の
コドンである。特定のアミノ酸のためのメイズ好適コド
ンは、メイズ由来の知られた遺伝子配列から得られる。
例えば、メイズ植物からの28遺伝子のためのメイズ・コ
ドンの用い方は、Murray et al., Nucleic Acids Resea
rch,17:477-498(1989)の表4 中に列記されており、この
開示を引用により本明細書中に取り込む。例えば、アラ
ニンのためのメイズ好適コドンは、GCC である。なぜな
ら、Murray et al.,前記中の、26のメイズ遺伝子のプー
ルされた配列に従って、そのコドンが、GCG(24%)、GCA
(13%)、及びGCT(27%)に比べてアラニンを同時期に36%コ
ードしているからである。
【００１９】純粋なメイズ最適化配列(pure maize opti
mized sequence):最適化遺伝子又はDNA 配列とは、その
中で生来の遺伝子のヌクレオチド配列がメイズのための
好ましいコドンを使用するために修飾されているところ
の遺伝子をいう。例えば、合成メイズ最適化Bt cryIA
(b)遺伝子は、その中で、その生来のBt cryIA(b) 遺伝
子のヌクレオチド配列が、使用されるコドンが先に記載
したようなメイズ好適コドンであるように修飾されてい
る遺伝子である。純粋なメイズ最適化遺伝子は、その中
で、そのヌクレオチド配列が特定のポリペプチドのため
のメイズ好適コドン配列の100 パーセントを含んで成る
遺伝子である。例えば、純粋なメイズ最適化Bt cryIA
(b) 遺伝子は、その中で、そのヌクレオチド配列が100
パーセントのメイズ好適コドン配列のを含んで成り、そ
してその生来のBt cryIA(b) 遺伝子により作られるもの
と同一のアミノ酸配列をもつポリペプチドをコードして
いる遺伝子である。最適化遺伝子の純粋なヌクレオチド
配列は、例えば、ヌクレオチドを変更し制限部位を創出
又は削除することにより、その遺伝子の操作を許容する
ように変動されてもよい。また、最適化遺伝子の純粋な
ヌクレオチド配列は、潜在的に有害なプロセシング部
位、例えば、潜在的なポリアデニレーション部位又はイ
ントロン認識部位を削除するように変動されてもよい。
mized sequence):最適化遺伝子又はDNA 配列とは、その
中で生来の遺伝子のヌクレオチド配列がメイズのための
好ましいコドンを使用するために修飾されているところ
の遺伝子をいう。例えば、合成メイズ最適化Bt cryIA
(b)遺伝子は、その中で、その生来のBt cryIA(b) 遺伝
子のヌクレオチド配列が、使用されるコドンが先に記載
したようなメイズ好適コドンであるように修飾されてい
る遺伝子である。純粋なメイズ最適化遺伝子は、その中
で、そのヌクレオチド配列が特定のポリペプチドのため
のメイズ好適コドン配列の100 パーセントを含んで成る
遺伝子である。例えば、純粋なメイズ最適化Bt cryIA
(b) 遺伝子は、その中で、そのヌクレオチド配列が100
パーセントのメイズ好適コドン配列のを含んで成り、そ
してその生来のBt cryIA(b) 遺伝子により作られるもの
と同一のアミノ酸配列をもつポリペプチドをコードして
いる遺伝子である。最適化遺伝子の純粋なヌクレオチド
配列は、例えば、ヌクレオチドを変更し制限部位を創出
又は削除することにより、その遺伝子の操作を許容する
ように変動されてもよい。また、最適化遺伝子の純粋な
ヌクレオチド配列は、潜在的に有害なプロセシング部
位、例えば、潜在的なポリアデニレーション部位又はイ
ントロン認識部位を削除するように変動されてもよい。
【００２０】" 部分的なメイズ最適化(partially maize
optimized)"配列を使用することができることも認識さ
れる。部分的なメイズ最適化とは、その遺伝子のコード
領域が、生来の殺虫性遺伝子から得られる配列及びメイ
ズ内での発現のための最適化されている配列を含んで成
る、キメラ( ハイブリッド) であることを意味してい
る。部分的な最適化遺伝子は、昆虫の害虫を制御するの
に十分なレベルにおいて殺虫性蛋白を発現し、そしてこ
のような発現が、生来の配列のみを使用して達成される
よりも高いレベルにある。部分的なメイズ最適化配列
は、少なくとも約5%の最適化配列を含むものである。
optimized)"配列を使用することができることも認識さ
れる。部分的なメイズ最適化とは、その遺伝子のコード
領域が、生来の殺虫性遺伝子から得られる配列及びメイ
ズ内での発現のための最適化されている配列を含んで成
る、キメラ( ハイブリッド) であることを意味してい
る。部分的な最適化遺伝子は、昆虫の害虫を制御するの
に十分なレベルにおいて殺虫性蛋白を発現し、そしてこ
のような発現が、生来の配列のみを使用して達成される
よりも高いレベルにある。部分的なメイズ最適化配列
は、少なくとも約5%の最適化配列を含むものである。
【００２１】完全長Bt遺伝子: とは、生来のBt遺伝子に
より作られるポリペプチドをコードするのに必要なヌク
レオチド配列の全体を含んで成るDNA 配列をいう。例え
ば、この生来のBt cryIA(b) 遺伝子は、長さ約3.5kb で
あり、そして長さ約1150アミノ酸であるポリペプチドを
コードしている。完全長の合成cryIA(b) Bt 遺伝子は、
少なくとも約3.5kb の長さをであろう。
より作られるポリペプチドをコードするのに必要なヌク
レオチド配列の全体を含んで成るDNA 配列をいう。例え
ば、この生来のBt cryIA(b) 遺伝子は、長さ約3.5kb で
あり、そして長さ約1150アミノ酸であるポリペプチドを
コードしている。完全長の合成cryIA(b) Bt 遺伝子は、
少なくとも約3.5kb の長さをであろう。
【００２２】切り詰められたBt遺伝子(Truncated Bt Ge
ne):とは、生来のBt遺伝子により作られるポリペプチド
をコードするのに必要なヌクレオチド配列の全てよりも
少ないものを含んで成るDNA 配列であるが、そのポリペ
プチドの活性な毒素部分をコードしているものをいう。
例えば、約1.9Kb の切り詰められた合成Bt遺伝子は、そ
の蛋白が殺虫活性を示すようにポリペプチドの活性毒素
部分をコードしている。
ne):とは、生来のBt遺伝子により作られるポリペプチド
をコードするのに必要なヌクレオチド配列の全てよりも
少ないものを含んで成るDNA 配列であるが、そのポリペ
プチドの活性な毒素部分をコードしているものをいう。
例えば、約1.9Kb の切り詰められた合成Bt遺伝子は、そ
の蛋白が殺虫活性を示すようにポリペプチドの活性毒素
部分をコードしている。
【００２３】組織好適プロモーター(Tissue-preferred
promoter):用語" 組織好適プロモーター" は、与えられ
た調節DNA 配列が、慣用のRNA 又は蛋白検定のいずれか
により示されるように、より高いレベルの関連構造遺伝
子又はDNA コード配列の転写を、又は関連遺伝子の生成
物の発現を、促進するであろうし、又は与えられたDNA
配列がいくつかの特異な効果(differential effect) を
現すであろうということを示すために使用され; すなわ
ち、その関連DNA 配列の転写又は遺伝子生成物の発現が
その植物の他の組織のすべての内においてよりも幾つか
の組織内でより大きなものであるということを示すため
に使用される。
promoter):用語" 組織好適プロモーター" は、与えられ
た調節DNA 配列が、慣用のRNA 又は蛋白検定のいずれか
により示されるように、より高いレベルの関連構造遺伝
子又はDNA コード配列の転写を、又は関連遺伝子の生成
物の発現を、促進するであろうし、又は与えられたDNA
配列がいくつかの特異な効果(differential effect) を
現すであろうということを示すために使用され; すなわ
ち、その関連DNA 配列の転写又は遺伝子生成物の発現が
その植物の他の組織のすべての内においてよりも幾つか
の組織内でより大きなものであるということを示すため
に使用される。
【００２４】" 組織特異的プロモーター(Tissue-specif
ic promoter)" は、与えられた調節DNA 配列が、植物の
1 以上の組織内、又は1 つのタイプの組織、例えば、緑
組織(green tissue)内で、関連コードDNA 配列を本質的
に完全に転写することを促進するであろうし、一方、そ
の関連コードDNA 配列の転写がその植物の組織の他のす
べての組織又はタイプにおいて本質的に全く生じないと
いうことを示すために使用される。
ic promoter)" は、与えられた調節DNA 配列が、植物の
1 以上の組織内、又は1 つのタイプの組織、例えば、緑
組織(green tissue)内で、関連コードDNA 配列を本質的
に完全に転写することを促進するであろうし、一方、そ
の関連コードDNA 配列の転写がその植物の組織の他のす
べての組織又はタイプにおいて本質的に全く生じないと
いうことを示すために使用される。
【００２５】本発明は、植物内、特にメイズ植物内での
発現のために最適化されたDNA 配列を提供する。本発明
の好ましい態様においては、そのDNA 配列は、殺虫性毒
素、好ましくは、バチルス・スリンギエンシス(Bacillu
s thuringiensis)により正常に生産される殺虫性結晶蛋
白毒素のアミノ酸配列と実質的に分かち合うポリペプチ
ドの生産をコードしている。この合成遺伝子は、切り詰
められた又は完全長の殺虫性蛋白をコードすることがで
きる。特に好ましいものは、合成DNA 配列であって鱗翅
目及び鞘翅目の昆虫に対して有効なポリペプチドをコー
ドしているもの、並びに合成DNA 配列であってバチルス
・スリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)変種kurs
taki, HD-1の結晶蛋白毒素の中の1 つと本質的に同じア
ミノ酸配列をもつポリペプチドをコードしているもので
ある。
発現のために最適化されたDNA 配列を提供する。本発明
の好ましい態様においては、そのDNA 配列は、殺虫性毒
素、好ましくは、バチルス・スリンギエンシス(Bacillu
s thuringiensis)により正常に生産される殺虫性結晶蛋
白毒素のアミノ酸配列と実質的に分かち合うポリペプチ
ドの生産をコードしている。この合成遺伝子は、切り詰
められた又は完全長の殺虫性蛋白をコードすることがで
きる。特に好ましいものは、合成DNA 配列であって鱗翅
目及び鞘翅目の昆虫に対して有効なポリペプチドをコー
ドしているもの、並びに合成DNA 配列であってバチルス
・スリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)変種kurs
taki, HD-1の結晶蛋白毒素の中の1 つと本質的に同じア
ミノ酸配列をもつポリペプチドをコードしているもので
ある。
【００２６】本発明は、植物、好ましくはメイズのプロ
トプラスト、植物細胞及び植物内の活性な殺虫性蛋白の
高い発現を作り出すのに有効な合成DNA 配列を提供す
る。本発明の合成DNA 配列を修飾し、コドンの用い方及
びG+C 含量の意味においてメイズ遺伝子に似せた。これ
らの修飾の結果として、本発明の合成DNA 配列は、その
生来の遺伝子内に存在する潜在的なプロセシング部位を
含まない。得られた合成DNA 配列( 合成Bt IP コード配
列) 及びこの合成DNA 配列( 合成Bt IP 遺伝子)を含む
植物の形質転換ベクターは、驚くべきことに、植物、特
にメイズ内の殺虫性蛋白に生産の意味において、その生
来のBt IP 遺伝子に比較して、その合成BtIP 遺伝子の
増加された発現をもたらす。高いレベルの発現は、鱗翅
目昆虫、好ましくは欧州トウモロコシ穿孔性動物及びDi
atrea saccharalis 、サトウキビ穿孔性動物に対する抵
抗性を示すメイズ細胞及び植物をもたらす。
トプラスト、植物細胞及び植物内の活性な殺虫性蛋白の
高い発現を作り出すのに有効な合成DNA 配列を提供す
る。本発明の合成DNA 配列を修飾し、コドンの用い方及
びG+C 含量の意味においてメイズ遺伝子に似せた。これ
らの修飾の結果として、本発明の合成DNA 配列は、その
生来の遺伝子内に存在する潜在的なプロセシング部位を
含まない。得られた合成DNA 配列( 合成Bt IP コード配
列) 及びこの合成DNA 配列( 合成Bt IP 遺伝子)を含む
植物の形質転換ベクターは、驚くべきことに、植物、特
にメイズ内の殺虫性蛋白に生産の意味において、その生
来のBt IP 遺伝子に比較して、その合成BtIP 遺伝子の
増加された発現をもたらす。高いレベルの発現は、鱗翅
目昆虫、好ましくは欧州トウモロコシ穿孔性動物及びDi
atrea saccharalis 、サトウキビ穿孔性動物に対する抵
抗性を示すメイズ細胞及び植物をもたらす。
【００２７】本発明の合成DNA 配列は、バチルス・スリ
ンギエンシス(Bacillus thuringiensis)からの殺虫性蛋
白をコードするように設計されているが、G+C 含量及び
コドンの用い方の意味において、メイズ内の発現のため
に最適化されている。例えば、Murray et al.,前記中に
記載されているメイズのコドンの用い方を、最も好まし
いメイズのコドンのみを使用して、バチルス・スリンギ
エンシス(Bacillus thuringiensis)サブ種、kurstaki H
D-1 cryIA(b)遺伝子により生産される毒素のアミノ酸配
列を逆翻訳するために使用する。この逆翻訳されたDNA
配列を、純粋なメイズ最適化配列として表し、そして配
列番号4 として示す。この配列は、不所望の制限エンド
ヌクレアーゼ部位を取り除くように、そして所望の制限
エンドヌクレアーゼ部位を作り出すように修飾されてい
る。これらの修飾は、そのコドンの用い方又はそのメイ
ズ最適化配列を相当に変更することなくその遺伝子のク
ローニングを容易にするように設計されている。このク
ローニング手順の間に、この遺伝子のクローニングを容
易にするために、他の修飾を、そのポリメラーゼ連鎖反
応(PCR) によるクローニングの間に誘導されるエラー対
して特に感受性であるような領域内で行う。このメイズ
最適化合成Bt IP 遺伝子の最後の配列を、配列番号2 中
に示す。このメイズ最適化合成Bt IP 遺伝子とその生来
のkurstaki cryIA(b) Bt遺伝子との比較を、Fig.1 中に
示す。
ンギエンシス(Bacillus thuringiensis)からの殺虫性蛋
白をコードするように設計されているが、G+C 含量及び
コドンの用い方の意味において、メイズ内の発現のため
に最適化されている。例えば、Murray et al.,前記中に
記載されているメイズのコドンの用い方を、最も好まし
いメイズのコドンのみを使用して、バチルス・スリンギ
エンシス(Bacillus thuringiensis)サブ種、kurstaki H
D-1 cryIA(b)遺伝子により生産される毒素のアミノ酸配
列を逆翻訳するために使用する。この逆翻訳されたDNA
配列を、純粋なメイズ最適化配列として表し、そして配
列番号4 として示す。この配列は、不所望の制限エンド
ヌクレアーゼ部位を取り除くように、そして所望の制限
エンドヌクレアーゼ部位を作り出すように修飾されてい
る。これらの修飾は、そのコドンの用い方又はそのメイ
ズ最適化配列を相当に変更することなくその遺伝子のク
ローニングを容易にするように設計されている。このク
ローニング手順の間に、この遺伝子のクローニングを容
易にするために、他の修飾を、そのポリメラーゼ連鎖反
応(PCR) によるクローニングの間に誘導されるエラー対
して特に感受性であるような領域内で行う。このメイズ
最適化合成Bt IP 遺伝子の最後の配列を、配列番号2 中
に示す。このメイズ最適化合成Bt IP 遺伝子とその生来
のkurstaki cryIA(b) Bt遺伝子との比較を、Fig.1 中に
示す。
【００２８】本発明の好ましい態様においては、この合
成DNA 配列により生産される蛋白は、その他の鱗翅目又
は鞘翅目の昆虫に対して有効である。より好ましい態様
においては、この合成DNA 配列によりコードされている
ポリペプチドは、バチルス・スリンギエンシス(Bacillu
s thuringiensis)変種kurstaki HD-1 により正常に生産
される殺虫性蛋白の完全長の又は切り詰められたアミノ
酸配列から本質的に成る。特定の態様においては、この
合成DNA 配列は、上記のBt CryIA(b) 蛋白の切り詰めら
れたアミノ酸配列から本質的に成るポリペプチドをコー
ドしている。
成DNA 配列により生産される蛋白は、その他の鱗翅目又
は鞘翅目の昆虫に対して有効である。より好ましい態様
においては、この合成DNA 配列によりコードされている
ポリペプチドは、バチルス・スリンギエンシス(Bacillu
s thuringiensis)変種kurstaki HD-1 により正常に生産
される殺虫性蛋白の完全長の又は切り詰められたアミノ
酸配列から本質的に成る。特定の態様においては、この
合成DNA 配列は、上記のBt CryIA(b) 蛋白の切り詰めら
れたアミノ酸配列から本質的に成るポリペプチドをコー
ドしている。
【００２９】本発明の殺虫性蛋白は、昆虫害虫を制御す
るのに十分な量において、すなわち、昆虫制御量におい
て植物内で発現される。昆虫を制御するのに必要な殺虫
性蛋白の発現の量は、植物の種、昆虫のタイプ、環境因
子等に依存して変動することができる。一般的に、その
昆虫集団は、植物から植物へ変動する経済的な閾値より
低く保たれるであろう。 例えば、メイズにおいて欧州
トウモロコシ穿孔性動物を制御するためには、その経済
的な閾値は、約10幼虫(larvae)/植物(plant)に翻訳され
る0.5eggmass( 卵の塊)/植物である。
るのに十分な量において、すなわち、昆虫制御量におい
て植物内で発現される。昆虫を制御するのに必要な殺虫
性蛋白の発現の量は、植物の種、昆虫のタイプ、環境因
子等に依存して変動することができる。一般的に、その
昆虫集団は、植物から植物へ変動する経済的な閾値より
低く保たれるであろう。 例えば、メイズにおいて欧州
トウモロコシ穿孔性動物を制御するためには、その経済
的な閾値は、約10幼虫(larvae)/植物(plant)に翻訳され
る0.5eggmass( 卵の塊)/植物である。
【００３０】本発明の方法は、植物の根を食う昆虫の幼
虫(rootworms) 、ネキリムシ(cutworms)、アワヨトウの
幼虫(armyworms) 、特に秋のビート(beet)のアワヨトウ
の幼虫、コメツキムシの幼虫(wireworms) 、アブラムシ
(aphids)、トウモロコシ穿孔性動物(corn borers) 、特
に欧州トウモロコシ穿孔性動物(European corn borer
s)、サトウキビ穿孔性動物(sugarcane borers)、マダラ
メイガ(lesser corn stalk borer) 、南西部トウモロコ
シ穿孔性動物(Southwestern corn borers)等を含むがこ
れに限定されない多種多様な昆虫を制御(controlling)
するために有用である。
虫(rootworms) 、ネキリムシ(cutworms)、アワヨトウの
幼虫(armyworms) 、特に秋のビート(beet)のアワヨトウ
の幼虫、コメツキムシの幼虫(wireworms) 、アブラムシ
(aphids)、トウモロコシ穿孔性動物(corn borers) 、特
に欧州トウモロコシ穿孔性動物(European corn borer
s)、サトウキビ穿孔性動物(sugarcane borers)、マダラ
メイガ(lesser corn stalk borer) 、南西部トウモロコ
シ穿孔性動物(Southwestern corn borers)等を含むがこ
れに限定されない多種多様な昆虫を制御(controlling)
するために有用である。
【００３１】本発明の好ましい態様においては、メイズ
内での発現のために最適化された合成コードDNA 配列
は、その生来のcryIA(b)遺伝子のものより大きなG+C パ
ーセンテージを含んで成る。このG+C パーセンテージが
少なくとも約50パーセント、そしてより好ましくは少な
くとも約60パーセントであることが好ましい。このG+C
含量が約64パーセントであることが特に好ましい。
内での発現のために最適化された合成コードDNA 配列
は、その生来のcryIA(b)遺伝子のものより大きなG+C パ
ーセンテージを含んで成る。このG+C パーセンテージが
少なくとも約50パーセント、そしてより好ましくは少な
くとも約60パーセントであることが好ましい。このG+C
含量が約64パーセントであることが特に好ましい。
【００３２】本発明の他の好ましい態様においては、メ
イズ内での発現のために最適化された合成コードDNA 配
列は、その生来のバチルス・スリンギエンシス(Bacillu
s thuringiensis) cryIA(b) 蛋白の" 純粋な(pure)" メ
イズ最適化ヌクレオチド配列と少なくとも約90パーセン
トの相同性を、より好ましくは少なくとも約95パーセン
トの相同性を、そしてより好ましくは少なくとも約98パ
ーセントの相同性をもつヌクレオチド配列を含んで成
る。
イズ内での発現のために最適化された合成コードDNA 配
列は、その生来のバチルス・スリンギエンシス(Bacillu
s thuringiensis) cryIA(b) 蛋白の" 純粋な(pure)" メ
イズ最適化ヌクレオチド配列と少なくとも約90パーセン
トの相同性を、より好ましくは少なくとも約95パーセン
トの相同性を、そしてより好ましくは少なくとも約98パ
ーセントの相同性をもつヌクレオチド配列を含んで成
る。
【００３３】本発明の他の好ましい態様は、本質的に配
列番号4 のDNA 配列をもつ合成DNA配列、並びにそれら
の突然変異体又は変異体; 本質的に配列番号4 のDNA 配
列を含んで成る形質転換ベクター; 及び、プラスミドpC
IB4406、pCIB4407、pCIB4413、pCIB4414、pCIB4416、pC
IB4417、pCIB4418、pCIB4419、pCIB4420、pCIB4421、pC
IB4423、pCIB4434、pCIB4429、pCIB4431、pCIB4433から
得られた単離されたDNA 配列を含む。最も好ましいもの
は、プラスミドpCIB4418並びにpCIB4420、pCIB4434、pC
IB4429、pCIB4431及びpCIB4433である。
列番号4 のDNA 配列をもつ合成DNA配列、並びにそれら
の突然変異体又は変異体; 本質的に配列番号4 のDNA 配
列を含んで成る形質転換ベクター; 及び、プラスミドpC
IB4406、pCIB4407、pCIB4413、pCIB4414、pCIB4416、pC
IB4417、pCIB4418、pCIB4419、pCIB4420、pCIB4421、pC
IB4423、pCIB4434、pCIB4429、pCIB4431、pCIB4433から
得られた単離されたDNA 配列を含む。最も好ましいもの
は、プラスミドpCIB4418並びにpCIB4420、pCIB4434、pC
IB4429、pCIB4431及びpCIB4433である。
【００３４】本発明のメイズ最適化DNA 配列の中の1 つ
を構築するために、約80ヌクレオチドの平均長さをもつ
合成DNA オリゴヌクレオチドを、作る。これらのオリゴ
ヌクレオチドは、ハイブリダイズされ、その切り詰めら
れた毒素遺伝子の様々な( クオーター(quarter))を含ん
で成る断片を作るように設計されている。与えられたク
オーターのためのオリゴヌクレオチドを、ハイブリダイ
ズし、そしてPCR を使用して増幅する。次にそのクオー
ターをクローン化し、そしてこのクローン化クオーター
を所望の配列を含むものを見つけるために配列決定す
る。1 つの場合、第四クオーターにおいては、ハイブリ
ダイズされたオリゴヌクレオチドをPCR 増幅なしに直接
クローン化する。4 つのクオーターのすべてのクローン
がオープン・リーディング・フレームを含んでいること
が一旦見つかれば、活性な殺虫性蛋白をコードしている
無傷の遺伝子を集合させる。この集められた遺伝子を次
に欧州トウモロコシ穿孔性動物(ECB) 及びサトウキビ穿
孔性動物を含む問題の昆虫のいくつかに対する殺虫活性
についてテストすることができる( それぞれ、例5A及び
5B) 。完全に作用する遺伝子を得たとき、その一次構造
を確認するために再びそれを配列決定する。完全に作用
する遺伝子は、ECB に対して生物検定したとき100%死亡
率を与えることが分かった。また、この完全に作用する
遺伝子をメイズ内の発現のために修飾する。
を構築するために、約80ヌクレオチドの平均長さをもつ
合成DNA オリゴヌクレオチドを、作る。これらのオリゴ
ヌクレオチドは、ハイブリダイズされ、その切り詰めら
れた毒素遺伝子の様々な( クオーター(quarter))を含ん
で成る断片を作るように設計されている。与えられたク
オーターのためのオリゴヌクレオチドを、ハイブリダイ
ズし、そしてPCR を使用して増幅する。次にそのクオー
ターをクローン化し、そしてこのクローン化クオーター
を所望の配列を含むものを見つけるために配列決定す
る。1 つの場合、第四クオーターにおいては、ハイブリ
ダイズされたオリゴヌクレオチドをPCR 増幅なしに直接
クローン化する。4 つのクオーターのすべてのクローン
がオープン・リーディング・フレームを含んでいること
が一旦見つかれば、活性な殺虫性蛋白をコードしている
無傷の遺伝子を集合させる。この集められた遺伝子を次
に欧州トウモロコシ穿孔性動物(ECB) 及びサトウキビ穿
孔性動物を含む問題の昆虫のいくつかに対する殺虫活性
についてテストすることができる( それぞれ、例5A及び
5B) 。完全に作用する遺伝子を得たとき、その一次構造
を確認するために再びそれを配列決定する。完全に作用
する遺伝子は、ECB に対して生物検定したとき100%死亡
率を与えることが分かった。また、この完全に作用する
遺伝子をメイズ内の発現のために修飾する。
【００３５】メイズ最適化遺伝子を過渡的発現検定にお
いて、例えば、メイズ発現検定においてテストする。活
性殺虫性毒素のための生来のBt cryIA(b) コード配列
は、メイズ過渡的発現系においては検出可能なレベルに
おいて発現されない。したがって、合成遺伝子の発現の
レベルを、測定することができる。本方法により、形質
転換植物内の蛋白の発現は、少なくとも約100 倍〜約5
0,000倍、より特に少なくとも約1,000 倍〜少なくとも
約20,000倍、増加されることができる。
いて、例えば、メイズ発現検定においてテストする。活
性殺虫性毒素のための生来のBt cryIA(b) コード配列
は、メイズ過渡的発現系においては検出可能なレベルに
おいて発現されない。したがって、合成遺伝子の発現の
レベルを、測定することができる。本方法により、形質
転換植物内の蛋白の発現は、少なくとも約100 倍〜約5
0,000倍、より特に少なくとも約1,000 倍〜少なくとも
約20,000倍、増加されることができる。
【００３６】有効レベルまでの殺虫性遺伝子の発現の増
加は、その完全配列に沿った生来の遺伝子の操作を必要
としない。有効な発現は、増加した発現を得るために必
要な配列の一部だけを操作することにより達成されるこ
とができる。その生来のCryIA(b)配列の蛋白を含む、完
全長のメイズ最適化cryIA(b)遺伝子を、調製することが
できる。例えば、Fig.7 は、合成- 生来のハイブリッド
である完全長のメイズ最適化cryIA(b)遺伝子について説
明している。すなわち、約2kb の遺伝子( ヌクレオチド
1-1938) は、メイズ最適化された、すなわち、合成のも
のである。その残りの、C-末端のヌクレオチド647-1155
は、そのCryIA(b)遺伝子の対応する生来の配列と同一で
ある。
加は、その完全配列に沿った生来の遺伝子の操作を必要
としない。有効な発現は、増加した発現を得るために必
要な配列の一部だけを操作することにより達成されるこ
とができる。その生来のCryIA(b)配列の蛋白を含む、完
全長のメイズ最適化cryIA(b)遺伝子を、調製することが
できる。例えば、Fig.7 は、合成- 生来のハイブリッド
である完全長のメイズ最適化cryIA(b)遺伝子について説
明している。すなわち、約2kb の遺伝子( ヌクレオチド
1-1938) は、メイズ最適化された、すなわち、合成のも
のである。その残りの、C-末端のヌクレオチド647-1155
は、そのCryIA(b)遺伝子の対応する生来の配列と同一で
ある。
【００３７】本明細書中に記載した方法の使用により、
様々な合成/ 生来ハイブリッドを構築し、そして発現に
ついてテストすることができることが認められている。
ハイブリッド構築物の重要な態様は、その蛋白が昆虫害
虫を制御するのに十分な量において生産されるというこ
とである。このやり方においては、その遺伝子の決定的
な領域を、同定し、そしてこのような領域を好ましいコ
ドンを使用して合成することができる。この合成配列
を、以下の例中に表すような生来の配列と結合させるこ
とができる。一般的に、N-末端の部分又はプロセシング
部位を、合成し、そして植物内の発現を増強するために
その生来のコード配列内で置換させることができる。
様々な合成/ 生来ハイブリッドを構築し、そして発現に
ついてテストすることができることが認められている。
ハイブリッド構築物の重要な態様は、その蛋白が昆虫害
虫を制御するのに十分な量において生産されるというこ
とである。このやり方においては、その遺伝子の決定的
な領域を、同定し、そしてこのような領域を好ましいコ
ドンを使用して合成することができる。この合成配列
を、以下の例中に表すような生来の配列と結合させるこ
とができる。一般的に、N-末端の部分又はプロセシング
部位を、合成し、そして植物内の発現を増強するために
その生来のコード配列内で置換させることができる。
【００３８】本発明の他の態様においては、cryIA(b)蛋
白をコードしているメイズ最適化遺伝子を、そのコード
蛋白をその生来のcryIA(b)蛋白に比べてより熱安定性又
は温度安定性にするために操作することができる。バチ
ルス・スリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)kurs
taki HD-1 内にあるcryIA(b)遺伝子が、そのcryIA(a)及
びcryIA(c)蛋白と比べたとき、その蛋白の-COOH 半分内
で、26アミノ酸の欠失を含むことが示されている。この
欠失は、温度感受性cryIA(b)蛋白を導く。M. Geiser, E
P 0 440 581,名称"Temperaturstabiles Bacillus thuri
ngiensis -Toxin"を参照のこと。そのcryIA(a)及びcryI
A(c)蛋白からのその対応領域の上記の欠失の修復は、そ
の修復された蛋白の温度安定性を改善する。完全長修飾
cryIA(b)合成遺伝子の構築物を、その読み取り枠を変更
することなく、そしてその蛋白配列の残りを変更するこ
となく、その配列内の適切な場所に失ったアミノ酸をコ
ードする配列を挿入するように設計する。その遺伝子の
完全長の合成変異体を、一連の2 本鎖DNA カセットであ
ってそれぞれサイズ約300 塩基対であるものを、DNA 合
成及び酵素反応の標準的な技術を使用して、合成するこ
とにより、組み立てる。この修復された遺伝子は、" 熱
安定性" 又は" 温度安定性"cryIA(b) 蛋白をコードして
いることを表している。なぜなら、それは、高い温度に
晒されたときその生来の片割れよりもより生物活性を保
持しているからである。温度安定蛋白をコードしている
メイズ最適化熱安定性cryIA(b)遺伝子の特異的な配列
を、Figs. 9 、11、13、及び15中に記載し、そしてま
た、以下の例7 中にも記載する。
白をコードしているメイズ最適化遺伝子を、そのコード
蛋白をその生来のcryIA(b)蛋白に比べてより熱安定性又
は温度安定性にするために操作することができる。バチ
ルス・スリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)kurs
taki HD-1 内にあるcryIA(b)遺伝子が、そのcryIA(a)及
びcryIA(c)蛋白と比べたとき、その蛋白の-COOH 半分内
で、26アミノ酸の欠失を含むことが示されている。この
欠失は、温度感受性cryIA(b)蛋白を導く。M. Geiser, E
P 0 440 581,名称"Temperaturstabiles Bacillus thuri
ngiensis -Toxin"を参照のこと。そのcryIA(a)及びcryI
A(c)蛋白からのその対応領域の上記の欠失の修復は、そ
の修復された蛋白の温度安定性を改善する。完全長修飾
cryIA(b)合成遺伝子の構築物を、その読み取り枠を変更
することなく、そしてその蛋白配列の残りを変更するこ
となく、その配列内の適切な場所に失ったアミノ酸をコ
ードする配列を挿入するように設計する。その遺伝子の
完全長の合成変異体を、一連の2 本鎖DNA カセットであ
ってそれぞれサイズ約300 塩基対であるものを、DNA 合
成及び酵素反応の標準的な技術を使用して、合成するこ
とにより、組み立てる。この修復された遺伝子は、" 熱
安定性" 又は" 温度安定性"cryIA(b) 蛋白をコードして
いることを表している。なぜなら、それは、高い温度に
晒されたときその生来の片割れよりもより生物活性を保
持しているからである。温度安定蛋白をコードしている
メイズ最適化熱安定性cryIA(b)遺伝子の特異的な配列
を、Figs. 9 、11、13、及び15中に記載し、そしてま
た、以下の例7 中にも記載する。
【００３９】本発明は、他のポリペプチドをコードして
いるメイズ最適化コード配列であって他のバチルス・ス
リンギエンシス(Bacillus thuringiensis)殺虫性ポリペ
プチド又は他の源からの殺虫性蛋白の配列を含むものを
包含する。例えば、cryIB 遺伝子は、メイズ最適化さ
れ、そして次に、植物、特にメイズ中に安定的に導入さ
れることができる。本発明に従って構築されたメイズ最
適化cryIB 遺伝子の配列を、Fig.6 中に記載する。
いるメイズ最適化コード配列であって他のバチルス・ス
リンギエンシス(Bacillus thuringiensis)殺虫性ポリペ
プチド又は他の源からの殺虫性蛋白の配列を含むものを
包含する。例えば、cryIB 遺伝子は、メイズ最適化さ
れ、そして次に、植物、特にメイズ中に安定的に導入さ
れることができる。本発明に従って構築されたメイズ最
適化cryIB 遺伝子の配列を、Fig.6 中に記載する。
【００４０】本発明に記載のメイズ好適コドンの用い方
を使用したメイズ内の発現のためのBt IP 遺伝子を最適
化することは、その殺虫性遺伝子の発現における有意な
増加をもたらす。他の遺伝子は、メイズ又は他の植物内
でのそれらの発現を改善するための植物コドン選択物(p
reference)を使用して合成されることができる。メイズ
・コドン選択物の使用は、メイズ内の外来遺伝子の発現
を最適化し、そして最大化する有望な方法である。この
ような遺伝子は、メイズ形質転換における選択性(selec
table)又は獲得性(scoreable) マーカーとして使用され
る遺伝子、除草剤耐性を与える遺伝子、疾患抵抗性を与
える遺伝子、そして昆虫抵抗性を与える他の遺伝子を含
む。
を使用したメイズ内の発現のためのBt IP 遺伝子を最適
化することは、その殺虫性遺伝子の発現における有意な
増加をもたらす。他の遺伝子は、メイズ又は他の植物内
でのそれらの発現を改善するための植物コドン選択物(p
reference)を使用して合成されることができる。メイズ
・コドン選択物の使用は、メイズ内の外来遺伝子の発現
を最適化し、そして最大化する有望な方法である。この
ような遺伝子は、メイズ形質転換における選択性(selec
table)又は獲得性(scoreable) マーカーとして使用され
る遺伝子、除草剤耐性を与える遺伝子、疾患抵抗性を与
える遺伝子、そして昆虫抵抗性を与える他の遺伝子を含
む。
【００４１】合成cryIA(b)遺伝子を、広い範囲の双子葉
植物の種の形質転換のために有用であるアグロバクテリ
ウム(Agrobacterium) ベクター中に挿入することもでき
る(例44) 。合成cryIA(b)アグロバクテリウム(Agrobact
erium) ベクターにより安定的に形質転換された植物
は、殺虫活性を示す。
植物の種の形質転換のために有用であるアグロバクテリ
ウム(Agrobacterium) ベクター中に挿入することもでき
る(例44) 。合成cryIA(b)アグロバクテリウム(Agrobact
erium) ベクターにより安定的に形質転換された植物
は、殺虫活性を示す。
【００４２】生来のBt cryIA(b) 遺伝子は、非常にA+T
が豊富である。完全長の生来のBt cryIA(b) 遺伝子のG+
C 含量は、約39% である。長さ約2kb の切り詰められた
Bt cryIA(b) 遺伝子のG+C 含量は、約37% である。一般
的には、メイズのコード領域は、優勢的にG+C 豊富であ
る。このBt cryIA(b) 遺伝子に対して行われた修飾は、
50% より大きなG+C 含量をもつ合成IPコード領域をもた
らし、そしてその生来のcryIA(b)遺伝子とそのDNA レベ
ルにおいて約65% の相同性をもつ。この合成CryIA(b)遺
伝子によりコードされている蛋白は、その生来の蛋白と
100%の相同性をもち、そしてそれ故、殺虫活性の意味に
おいて完全な機能を保持している。この切り詰められた
合成CryIA(b) IP 遺伝子は、長さ約2kb であり、そして
その遺伝子は、その生来のBt kurstaki CryIA(b)殺虫性
蛋白の活性毒素領域をコードしている。この切り詰めら
れた合成CryIA(b) IP 遺伝子によりコードされている蛋
白の長は、648 アミノ酸である。
が豊富である。完全長の生来のBt cryIA(b) 遺伝子のG+
C 含量は、約39% である。長さ約2kb の切り詰められた
Bt cryIA(b) 遺伝子のG+C 含量は、約37% である。一般
的には、メイズのコード領域は、優勢的にG+C 豊富であ
る。このBt cryIA(b) 遺伝子に対して行われた修飾は、
50% より大きなG+C 含量をもつ合成IPコード領域をもた
らし、そしてその生来のcryIA(b)遺伝子とそのDNA レベ
ルにおいて約65% の相同性をもつ。この合成CryIA(b)遺
伝子によりコードされている蛋白は、その生来の蛋白と
100%の相同性をもち、そしてそれ故、殺虫活性の意味に
おいて完全な機能を保持している。この切り詰められた
合成CryIA(b) IP 遺伝子は、長さ約2kb であり、そして
その遺伝子は、その生来のBt kurstaki CryIA(b)殺虫性
蛋白の活性毒素領域をコードしている。この切り詰めら
れた合成CryIA(b) IP 遺伝子によりコードされている蛋
白の長は、648 アミノ酸である。
【００４３】本発明の合成遺伝子は、トランスジェニッ
ク植物における最も好ましくは形質転換されたメイズに
おける発現強化に有用である。本発明のトランスジェニ
ック植物は、高レベルにおける殺虫性CryIA(b)蛋白であ
って、昆虫害虫、好ましくは鱗翅目又は鞘翅目昆虫、そ
して最も好ましくは欧州トウモロコシ穿孔性動物(ECB)
及びサトウキビ穿孔性動物に対する抵抗性をもたらすも
のを発現させるために使用されることができる。
ク植物における最も好ましくは形質転換されたメイズに
おける発現強化に有用である。本発明のトランスジェニ
ック植物は、高レベルにおける殺虫性CryIA(b)蛋白であ
って、昆虫害虫、好ましくは鱗翅目又は鞘翅目昆虫、そ
して最も好ましくは欧州トウモロコシ穿孔性動物(ECB)
及びサトウキビ穿孔性動物に対する抵抗性をもたらすも
のを発現させるために使用されることができる。
【００４４】本発明においては、合成メイズ最適化遺伝
子のDNA コード配列は調節要素、例えば、そのコード配
列の発現に向けられるプロモーターの制御下にあること
ができる。このような調節要素は、そのメイズ植物の様
々な部分内でその遺伝子の発現を提供するために、例え
ば、単子葉又はメイズ及び他の単子葉の機能的プロモー
ターを含む。この調節要素は、構成的であることができ
る。すなわち、それは、そおの遺伝子の連続的なそして
安定的な発現を促進させることができる。このようなプ
ロモーターは、CaMV 35Sプロモーター;CaMV 19S プロモ
ーター; A. tumefaciensプロモーター、例えば、オクト
ピン・シンターゼ(octopine synthase)プロモーター、
マンノピン・シンターゼ(mannopine synthase)プロモー
ター、ノパリン・シンターゼ(nopaline synthase) プロ
モーター、又は他のオパイン・シンターゼ(opine synth
ase)プロモーター; ユビキチン(ubiquitin) プロモータ
ー、アクチン・プロモーター、ヒストン・プロモーター
及びチュブリン・プロモーターを含むがこれに限定され
ない。この調節要素は、組織優先(tissue-preferentia
l) プロモーターであることができ、すなわち、それ
は、他の中においてよりも植物のいくつかの組織内にお
いて高い発現を促進する。好ましくは、組織優先プロモ
ーターは、種の中よりも葉、茎、根及び/ 又は花粉の中
においてその合成遺伝子の高い発現に向けられることが
できる。また、その調節要素は、例えば、熱ストレス、
水ストレス、昆虫摂食又は化学誘導により誘導されるこ
ともでき、又は 発展的に調節されることもできる。そ
の発現が組織特異的なやり方において変動することが知
られている多数のプロモーターが、当業者に知られてい
る。
子のDNA コード配列は調節要素、例えば、そのコード配
列の発現に向けられるプロモーターの制御下にあること
ができる。このような調節要素は、そのメイズ植物の様
々な部分内でその遺伝子の発現を提供するために、例え
ば、単子葉又はメイズ及び他の単子葉の機能的プロモー
ターを含む。この調節要素は、構成的であることができ
る。すなわち、それは、そおの遺伝子の連続的なそして
安定的な発現を促進させることができる。このようなプ
ロモーターは、CaMV 35Sプロモーター;CaMV 19S プロモ
ーター; A. tumefaciensプロモーター、例えば、オクト
ピン・シンターゼ(octopine synthase)プロモーター、
マンノピン・シンターゼ(mannopine synthase)プロモー
ター、ノパリン・シンターゼ(nopaline synthase) プロ
モーター、又は他のオパイン・シンターゼ(opine synth
ase)プロモーター; ユビキチン(ubiquitin) プロモータ
ー、アクチン・プロモーター、ヒストン・プロモーター
及びチュブリン・プロモーターを含むがこれに限定され
ない。この調節要素は、組織優先(tissue-preferentia
l) プロモーターであることができ、すなわち、それ
は、他の中においてよりも植物のいくつかの組織内にお
いて高い発現を促進する。好ましくは、組織優先プロモ
ーターは、種の中よりも葉、茎、根及び/ 又は花粉の中
においてその合成遺伝子の高い発現に向けられることが
できる。また、その調節要素は、例えば、熱ストレス、
水ストレス、昆虫摂食又は化学誘導により誘導されるこ
ともでき、又は 発展的に調節されることもできる。そ
の発現が組織特異的なやり方において変動することが知
られている多数のプロモーターが、当業者に知られてい
る。
【００４５】このような例の1 つは、メイズのホスホエ
ノール・ピルベート・カルボキシラーゼ(PEPC)であって
緑組織特異的(green tissue-specific) なものである。
例えば、Hudspeth, R.L. and Grula, J.W., Plant Mole
cular Biology 12:579-589,1989) を参照のこと。例の
緑組織特異的プロモーターは、クロロフィルa/b 結合性
蛋白プロモーター及びRubisCO 小サブユニット・プロモ
ーターを含む。
ノール・ピルベート・カルボキシラーゼ(PEPC)であって
緑組織特異的(green tissue-specific) なものである。
例えば、Hudspeth, R.L. and Grula, J.W., Plant Mole
cular Biology 12:579-589,1989) を参照のこと。例の
緑組織特異的プロモーターは、クロロフィルa/b 結合性
蛋白プロモーター及びRubisCO 小サブユニット・プロモ
ーターを含む。
【００４６】また、本発明は、単離されたそして精製さ
れた髄(pith)- 好適プロモーターを提供する。好ましい
髄好適プロモーターは、イネ科(graminaceous)の単子葉
植物、例えば、サトウキビ(sugarcane) 、米、小麦、サ
トウモロコシ(sorghum) 、大麦、ライ麦(rye) 及びメイ
ズ(maize) から単離され; より好ましいものは、メイズ
植物から単離されたものである。
れた髄(pith)- 好適プロモーターを提供する。好ましい
髄好適プロモーターは、イネ科(graminaceous)の単子葉
植物、例えば、サトウキビ(sugarcane) 、米、小麦、サ
トウモロコシ(sorghum) 、大麦、ライ麦(rye) 及びメイ
ズ(maize) から単離され; より好ましいものは、メイズ
植物から単離されたものである。
【００４７】好ましい態様においては、髄好適プロモー
ターは、植物TrpA遺伝子から単離され; 最も好ましい態
様においては、それは、メイズTrpA遺伝子から単離され
る。すなわち、その生来の状態におけるプロモーター
は、メイズのトリプトファン・シンターゼ- アルファ・
サブユニット遺伝子( 以下、"TrpA") と作用的に関連し
ている。コードされた蛋白は、約38kDの分子質量をもっ
ている。他のアルファ・サブユニット及び2 つのベータ
・サブユニットと一緒になって、TrpAは、多量体酵素、
トリプトファン・シンターゼを形成する。それぞれのサ
ブユニットは、別々に働くことができるが、それらは、
一緒になってより効果的に機能する。TrpAは、インドー
ル・グリセロール・ホスフェートのインドールへの変換
を触媒する。メイズTrpA遺伝子又はそのコードされた蛋
白のいずれも全く、出願人の発明の前にはいずれの植物
からも単離されていなかった。Arabisdopsis thalinaの
トリプトファン・シンターゼ・ベータ・サブユニット遺
伝子を、Wright et al., ThePlant Cell, 4:711-719(19
92)中に記載されているようにクローン化した。このメ
イズTrpA遺伝子は、そのベータ・サブユニット・コード
遺伝子に全く相同性をもっていない。
ターは、植物TrpA遺伝子から単離され; 最も好ましい態
様においては、それは、メイズTrpA遺伝子から単離され
る。すなわち、その生来の状態におけるプロモーター
は、メイズのトリプトファン・シンターゼ- アルファ・
サブユニット遺伝子( 以下、"TrpA") と作用的に関連し
ている。コードされた蛋白は、約38kDの分子質量をもっ
ている。他のアルファ・サブユニット及び2 つのベータ
・サブユニットと一緒になって、TrpAは、多量体酵素、
トリプトファン・シンターゼを形成する。それぞれのサ
ブユニットは、別々に働くことができるが、それらは、
一緒になってより効果的に機能する。TrpAは、インドー
ル・グリセロール・ホスフェートのインドールへの変換
を触媒する。メイズTrpA遺伝子又はそのコードされた蛋
白のいずれも全く、出願人の発明の前にはいずれの植物
からも単離されていなかった。Arabisdopsis thalinaの
トリプトファン・シンターゼ・ベータ・サブユニット遺
伝子を、Wright et al., ThePlant Cell, 4:711-719(19
92)中に記載されているようにクローン化した。このメ
イズTrpA遺伝子は、そのベータ・サブユニット・コード
遺伝子に全く相同性をもっていない。
【００４８】本発明は、植物カルシウム依存性ホスフェ
ート・キナーゼ(CDPK)遺伝子から得られる精製花粉特異
的プロモーターをも提供する。すなわち、その生来の状
態においては、そのプロモーターは、植物のCDPK遺伝子
に作用可能な状態で結合されている。好ましい態様にお
いては、そのプロモーターを、メイズCDPK遺伝子から単
離する。"花粉特異的(pollen-specific)"は、問題の作
用関連構造遺伝子の発現が植物の花粉内に実質的に限定
されており( すなわち、本質的に全部であり)、そして
他の植物部分のすべて内でほとんどないことを意味して
いる。"CDPK"は、カルモジュリンでなくカルシウムにつ
いて高いアフィニティーをもち、その触媒活性のため
に、カルモジュリンでなくカルシウムを必要とする植物
蛋白キナーゼを意味している。
ート・キナーゼ(CDPK)遺伝子から得られる精製花粉特異
的プロモーターをも提供する。すなわち、その生来の状
態においては、そのプロモーターは、植物のCDPK遺伝子
に作用可能な状態で結合されている。好ましい態様にお
いては、そのプロモーターを、メイズCDPK遺伝子から単
離する。"花粉特異的(pollen-specific)"は、問題の作
用関連構造遺伝子の発現が植物の花粉内に実質的に限定
されており( すなわち、本質的に全部であり)、そして
他の植物部分のすべて内でほとんどないことを意味して
いる。"CDPK"は、カルモジュリンでなくカルシウムにつ
いて高いアフィニティーをもち、その触媒活性のため
に、カルモジュリンでなくカルシウムを必要とする植物
蛋白キナーゼを意味している。
【００４９】組織好適又は組織特異的プロモーターを得
るために、組織特異的メッセンジャーRNA(mRNA) をコー
ドしている遺伝子を、cDNAライブラリーの差異スクリー
ニング(differential screening)により得ることができ
る。例えば、髄好適cDNAを、髄から得られたcDNAプロー
ブ及び種mRNAを使用する差異スクリーニングに髄cDNAラ
イブラリーを供することにより得ることができる。Mole
cular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook et a
l. eds. Cold Spring Harbor Press: New York(1989)を
参照のこと。
るために、組織特異的メッセンジャーRNA(mRNA) をコー
ドしている遺伝子を、cDNAライブラリーの差異スクリー
ニング(differential screening)により得ることができ
る。例えば、髄好適cDNAを、髄から得られたcDNAプロー
ブ及び種mRNAを使用する差異スクリーニングに髄cDNAラ
イブラリーを供することにより得ることができる。Mole
cular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook et a
l. eds. Cold Spring Harbor Press: New York(1989)を
参照のこと。
【００５０】あるいは、組織特異的プロモーターを、組
織特異的蛋白を得て、そのN-末端を配列決定し、オリゴ
ヌクレオチド・プローブを合成し、そしてcDNAライブラ
リーをスクリーニングするためにそのプローブを使用す
ることにより、得ることができる。このような手順を、
花粉特異的プロモーターの単離のための本実験セクショ
ン中に例示する。髄特異的及び花粉特異的プロモーター
に関しての本発明の範囲は、完全長プロモーターの機能
的に活性な断片であって、関連構造遺伝子のそれぞれ髄
好適又は花粉特異的転写に向けることもできるものを包
含する。プロモーターDNA 配列の機能的に活性な断片
は、幾つかの当分野において認められた手順により、例
えば、制限酵素を使用したプロモーターDNA 配列の解
裂、その配列に従ったそのプロモーターDNA 配列の合成
により、プロモーターDNA 配列から得ることができ、又
はPCR 技術の使用を通して得ることができる。例えば、
Mulliset al., Meth. Enzymol. 155:335-350 (1987); E
rlich (ed.), PCR Technology, Stockton Press (New Y
ork 1989)を参照のこと。
織特異的蛋白を得て、そのN-末端を配列決定し、オリゴ
ヌクレオチド・プローブを合成し、そしてcDNAライブラ
リーをスクリーニングするためにそのプローブを使用す
ることにより、得ることができる。このような手順を、
花粉特異的プロモーターの単離のための本実験セクショ
ン中に例示する。髄特異的及び花粉特異的プロモーター
に関しての本発明の範囲は、完全長プロモーターの機能
的に活性な断片であって、関連構造遺伝子のそれぞれ髄
好適又は花粉特異的転写に向けることもできるものを包
含する。プロモーターDNA 配列の機能的に活性な断片
は、幾つかの当分野において認められた手順により、例
えば、制限酵素を使用したプロモーターDNA 配列の解
裂、その配列に従ったそのプロモーターDNA 配列の合成
により、プロモーターDNA 配列から得ることができ、又
はPCR 技術の使用を通して得ることができる。例えば、
Mulliset al., Meth. Enzymol. 155:335-350 (1987); E
rlich (ed.), PCR Technology, Stockton Press (New Y
ork 1989)を参照のこと。
【００５１】本発明の範囲内にさらに含まれるものは、
完全長プロモーターに" 等価な(equivalent)" 髄好適及
び花粉特異的プロモーターである。すなわち、異なるヌ
クレオチド、又はヌクレオチドの群を、公知の手順に従
ってプロモーター活性を破壊しないやり方で、修飾、付
加又は欠失させることができる。
完全長プロモーターに" 等価な(equivalent)" 髄好適及
び花粉特異的プロモーターである。すなわち、異なるヌ
クレオチド、又はヌクレオチドの群を、公知の手順に従
ってプロモーター活性を破壊しないやり方で、修飾、付
加又は欠失させることができる。
【００５２】メイズTrpA遺伝子から得られる髄好適プロ
モーターを、Fig.24中に示す。当業者は、手に入れた本
配列情報により、メイズTrpA構造遺伝子から得られるプ
ローブによりこれらの植物からの髄ライブラリーをプロ
ービングすることにより、本発明の範囲内に含まれる髄
好適プロモーターを他の植物から得ることができること
を、認識するであろう。例17中に一般的に討議するよう
に、様々な種のTrpAサブユニット遺伝子の中に高く保存
される配列から設計されたプローブが、好ましい。他の
花粉特異的プロモーターであってそおれらの生来の状態
においてメイズ以外の植物CDPK遺伝子に結合するもの
を、花粉ライブラリーをプローブするために、メイズCD
PK遺伝子の保存領域から得られたプローブを使用して、
類似の方法で、単離することができる。
モーターを、Fig.24中に示す。当業者は、手に入れた本
配列情報により、メイズTrpA構造遺伝子から得られるプ
ローブによりこれらの植物からの髄ライブラリーをプロ
ービングすることにより、本発明の範囲内に含まれる髄
好適プロモーターを他の植物から得ることができること
を、認識するであろう。例17中に一般的に討議するよう
に、様々な種のTrpAサブユニット遺伝子の中に高く保存
される配列から設計されたプローブが、好ましい。他の
花粉特異的プロモーターであってそおれらの生来の状態
においてメイズ以外の植物CDPK遺伝子に結合するもの
を、花粉ライブラリーをプローブするために、メイズCD
PK遺伝子の保存領域から得られたプローブを使用して、
類似の方法で、単離することができる。
【００５３】本発明の他の態様においては、髄好適又は
花粉特異的なプロモーターを、DNA配列、すなわち、問
題の蛋白をコードしている構造遺伝子に作用可能な状態
で結合し、組換えDNA 分子又はキメラ遺伝子を形成させ
る。語句" に作用可能な状態で結合する(operably link
ed to)" は、本分野で認められる意味をもち; それ
は、" と作用関連の(operatively associated wit
h)"、" に結合した(linked to)"又は" に融合した(fuse
d to)" と互いに交換可能なものとして使用されてもよ
い。
花粉特異的なプロモーターを、DNA配列、すなわち、問
題の蛋白をコードしている構造遺伝子に作用可能な状態
で結合し、組換えDNA 分子又はキメラ遺伝子を形成させ
る。語句" に作用可能な状態で結合する(operably link
ed to)" は、本分野で認められる意味をもち; それ
は、" と作用関連の(operatively associated wit
h)"、" に結合した(linked to)"又は" に融合した(fuse
d to)" と互いに交換可能なものとして使用されてもよ
い。
【００５４】構造遺伝子は、プロモーターの起点(origi
n)及び/ 又はその中にそれが形質転換されるところの標
的植物に関して、同種のものであり又は異種性のもので
あってもよい。相対的な起点にかかわらず、その関連DN
A 配列は、それが結合するところのプロモーターの発現
の性質に従って形質転換植物内で発現されるであろう。
それ故、関連DNA 配列の選択は、上記の方法により発現
される配列をもつ必要性から開放されるべきである。異
種DNA 配列の例は、殺虫性蛋白、例えば、昆虫又は他の
植物寄生性の節足動物(arthropods)、あるいは植物病因
原、例えば、菌類、バクテリア及び線虫類(nematodes)
に対して毒性又は阻害的な蛋白又はポリペプチドをコー
ドしているものを含む。これらの異種DNA 配列は、蛋
白、例えば、マガイニン(magainins) 、Zasloff, PNAS
USA, 84:5449-5453 (1987); セクロピン(cecropins), H
ultmark et al., Eur. J. Biochem. 127:207-217 (198
2);アタシン(attacins), Hultmark et al., EMBO J. 2:
571-576 (1983);メリチン(melittin), グラミシジンS(g
ramicidin S),Katsu et al., Biochem. Biophy. Acta,9
39:57-63 (1988);ナトリウム・チャンネル蛋白及び合成
断片, Oiki et al. PNAS USA, 85:2395-2397 (1988);ス
タフィロコッカス・アウレウズム(Staphylococcus aure
usm)のアルファ毒素(alpha toxin), Tobkes et al., Bi
ochem., 24:1915-1920 (1985);アポリポ蛋白(apolipopr
oteins) 及びそれらの断片, Knott et al., Science 23
0:37 (1985); Nakagawa et al., J. Am. Chem. Soc., 1
07:7087(1985); アラメチシン(alamethicin) 及び各種
の合成両親媒性(amphipathic) ペプチド, Kaiser et a
l., Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 16:561-581
(1987); レクチン(lectins), Lis et al., Ann. Rev. B
iochem., 55:35-68 (1986);プロテアーゼ及びアミラー
ゼ阻害剤; 及びバチルス・スリンギエンシス(Bacillus
thuringiensis)からの殺虫性蛋白、特にバチルス・スリ
ンギエンシス(B. thuringiensis)からの及び他のバクテ
リア又は菌類(fungi) からのデルタ- エンドトキシン(d
elta-endotoxins)を、コードしている。
n)及び/ 又はその中にそれが形質転換されるところの標
的植物に関して、同種のものであり又は異種性のもので
あってもよい。相対的な起点にかかわらず、その関連DN
A 配列は、それが結合するところのプロモーターの発現
の性質に従って形質転換植物内で発現されるであろう。
それ故、関連DNA 配列の選択は、上記の方法により発現
される配列をもつ必要性から開放されるべきである。異
種DNA 配列の例は、殺虫性蛋白、例えば、昆虫又は他の
植物寄生性の節足動物(arthropods)、あるいは植物病因
原、例えば、菌類、バクテリア及び線虫類(nematodes)
に対して毒性又は阻害的な蛋白又はポリペプチドをコー
ドしているものを含む。これらの異種DNA 配列は、蛋
白、例えば、マガイニン(magainins) 、Zasloff, PNAS
USA, 84:5449-5453 (1987); セクロピン(cecropins), H
ultmark et al., Eur. J. Biochem. 127:207-217 (198
2);アタシン(attacins), Hultmark et al., EMBO J. 2:
571-576 (1983);メリチン(melittin), グラミシジンS(g
ramicidin S),Katsu et al., Biochem. Biophy. Acta,9
39:57-63 (1988);ナトリウム・チャンネル蛋白及び合成
断片, Oiki et al. PNAS USA, 85:2395-2397 (1988);ス
タフィロコッカス・アウレウズム(Staphylococcus aure
usm)のアルファ毒素(alpha toxin), Tobkes et al., Bi
ochem., 24:1915-1920 (1985);アポリポ蛋白(apolipopr
oteins) 及びそれらの断片, Knott et al., Science 23
0:37 (1985); Nakagawa et al., J. Am. Chem. Soc., 1
07:7087(1985); アラメチシン(alamethicin) 及び各種
の合成両親媒性(amphipathic) ペプチド, Kaiser et a
l., Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 16:561-581
(1987); レクチン(lectins), Lis et al., Ann. Rev. B
iochem., 55:35-68 (1986);プロテアーゼ及びアミラー
ゼ阻害剤; 及びバチルス・スリンギエンシス(Bacillus
thuringiensis)からの殺虫性蛋白、特にバチルス・スリ
ンギエンシス(B. thuringiensis)からの及び他のバクテ
リア又は菌類(fungi) からのデルタ- エンドトキシン(d
elta-endotoxins)を、コードしている。
【００５５】本発明の好ましい態様においては、メイズ
TrpAサブユニット遺伝子から得られた髄好適プロモータ
ー又はメイズCDPK遺伝子から得られた花粉特異的プロモ
ーターを、バチルス・スリンギエンシス(Bacillus thur
ingiensis)("B.t.")殺虫性蛋白をコードしている異種DN
A 配列に作用可能な状態で結合させる。これらの蛋白及
びその対応する構造遺伝子は、当技術分野においてよく
知られている。Hofteand Whiteley, Microbiol. Review
s, 53:242-255 (1989) を参照のこと。
TrpAサブユニット遺伝子から得られた髄好適プロモータ
ー又はメイズCDPK遺伝子から得られた花粉特異的プロモ
ーターを、バチルス・スリンギエンシス(Bacillus thur
ingiensis)("B.t.")殺虫性蛋白をコードしている異種DN
A 配列に作用可能な状態で結合させる。これらの蛋白及
びその対応する構造遺伝子は、当技術分野においてよく
知られている。Hofteand Whiteley, Microbiol. Review
s, 53:242-255 (1989) を参照のこと。
【００５６】発現に向けられることができるいずれかの
プロモーターを利用することができることは認められて
いるが、問題の蛋白の生来のプロモーターよりもむしろ
異種のプロモーターを使用することが好ましいであろ
う。このやり方において、形質転換されるべき植物並び
に昆虫害虫に基づき決定されるっこおとができる、キメ
ラのヌクレオチド配列を構築することができる。例え
ば、メイズにおける昆虫害虫を制御するために、単子葉
又はメイズのプロモーターを、作用可能な状態でBt蛋白
に結合することができる。このメイズのプロモーター
を、組織好適及び組織特異的プロモーター、例えば、そ
れぞれ本明細書中に開示するような、髄好適及び花粉特
異的プロモーターから選択することができる。
プロモーターを利用することができることは認められて
いるが、問題の蛋白の生来のプロモーターよりもむしろ
異種のプロモーターを使用することが好ましいであろ
う。このやり方において、形質転換されるべき植物並び
に昆虫害虫に基づき決定されるっこおとができる、キメ
ラのヌクレオチド配列を構築することができる。例え
ば、メイズにおける昆虫害虫を制御するために、単子葉
又はメイズのプロモーターを、作用可能な状態でBt蛋白
に結合することができる。このメイズのプロモーター
を、組織好適及び組織特異的プロモーター、例えば、そ
れぞれ本明細書中に開示するような、髄好適及び花粉特
異的プロモーターから選択することができる。
【００５７】いくつかの場合には、1 以上のキメラ遺伝
子構築物によりその植物細胞を形質転換することが好ま
しいかもしれない。それ故、例えば、単一植物を、Bt蛋
白に作用可能な状態で結合された髄好適プロモーター並
びにBt蛋白に作用可能な状態で結合された花粉特異的プ
ロモーターにより、形質転換することができるであろ
う。
子構築物によりその植物細胞を形質転換することが好ま
しいかもしれない。それ故、例えば、単一植物を、Bt蛋
白に作用可能な状態で結合された髄好適プロモーター並
びにBt蛋白に作用可能な状態で結合された花粉特異的プ
ロモーターにより、形質転換することができるであろ
う。
【００５８】形質転換された植物は、その植物の髄及び
花粉内で、そしてより少ない程度において根、外鞘及び
支持根内で、Bt蛋白を発現するであろう。様々な他の理
由のために、特に潜在的な昆虫抵抗性を殺虫性蛋白発現
植物に発達させるのために、同一の植物内で1 以上の殺
虫性蛋白(IP)を発現させることが有利である。ある者
は、同一の組織内に2 つの異なる遺伝子( 例えば、標的
昆虫の中腸(midgut)内の異なるレセプタに結合する、2
つの異なるバチルス・スリンギエンシス(Bacillus thur
ingiensis)誘導デルタ- エンドトキシン) を発現させる
ことができたし、又はある者は、組織特異的プロモータ
ーを使用して同一植物の異なる組織内で2 つの毒素を選
択的に発現させることができている。3 つの異なる組織
特異的プロモーターを使用して同一植物内で2 つのBt遺
伝子( 又はいずれかの2 つの殺虫性遺伝子) を発現させ
ることは、所望の発現型を発現する植物の生産について
の問題を現す。2 つの異なる遺伝子を動かす3 つの異な
るプロモーターは、同時にその植物内に導入されること
が必要な6 つの異なる殺虫性遺伝子を作り出す。また、
この形質転換に必要なものは、形質転換植物の同定にお
いて助けとなる選択マーカーである。このことは、同時
に、7 つの異なる遺伝子をその植物中に導入することを
意味する。全ての遺伝子、特に殺虫性遺伝子が、単一遺
伝子の習性(trait) として、そしてそれらが商業的なハ
イブリッドの栽培の間に追跡することがより難しくなる
であろう且つ多遺伝子の習性としてではなく振る舞うよ
うに、同一の座においてその植物ゲノム中に組み込まれ
ることが最も要求される。遺伝子の全数を、異なる殺虫
性蛋白の差異に基づく(differential)組織特異的な発現
を使用することにより、減少させることができる。
花粉内で、そしてより少ない程度において根、外鞘及び
支持根内で、Bt蛋白を発現するであろう。様々な他の理
由のために、特に潜在的な昆虫抵抗性を殺虫性蛋白発現
植物に発達させるのために、同一の植物内で1 以上の殺
虫性蛋白(IP)を発現させることが有利である。ある者
は、同一の組織内に2 つの異なる遺伝子( 例えば、標的
昆虫の中腸(midgut)内の異なるレセプタに結合する、2
つの異なるバチルス・スリンギエンシス(Bacillus thur
ingiensis)誘導デルタ- エンドトキシン) を発現させる
ことができたし、又はある者は、組織特異的プロモータ
ーを使用して同一植物の異なる組織内で2 つの毒素を選
択的に発現させることができている。3 つの異なる組織
特異的プロモーターを使用して同一植物内で2 つのBt遺
伝子( 又はいずれかの2 つの殺虫性遺伝子) を発現させ
ることは、所望の発現型を発現する植物の生産について
の問題を現す。2 つの異なる遺伝子を動かす3 つの異な
るプロモーターは、同時にその植物内に導入されること
が必要な6 つの異なる殺虫性遺伝子を作り出す。また、
この形質転換に必要なものは、形質転換植物の同定にお
いて助けとなる選択マーカーである。このことは、同時
に、7 つの異なる遺伝子をその植物中に導入することを
意味する。全ての遺伝子、特に殺虫性遺伝子が、単一遺
伝子の習性(trait) として、そしてそれらが商業的なハ
イブリッドの栽培の間に追跡することがより難しくなる
であろう且つ多遺伝子の習性としてではなく振る舞うよ
うに、同一の座においてその植物ゲノム中に組み込まれ
ることが最も要求される。遺伝子の全数を、異なる殺虫
性蛋白の差異に基づく(differential)組織特異的な発現
を使用することにより、減少させることができる。
【００５９】例えば、cryIA(b)を、その花粉及びPEP カ
ルボキシラーゼ・プロモーターと融合させることによ
り、ある者は、緑組織及び花粉内でこの遺伝子の発現を
得ることができるであろう。髄好適プロモーターをバチ
ルス・スリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)から
のcryIB デルタ・エンドトキシンと融合することは、形
質転換植物の種組織内ではなく髄内で最も豊富な上記の
殺虫性蛋白の発現を生じさせるであろう。3 つの遺伝
子、すなわち、PEP カルボキシラーゼ/cryIA(b) 、花粉
/cryIA(b) 、及び髄/cryIBによる植物の形質転換は、同
一の植物の異なる組織内で2 つの異なるBt殺虫性エンド
トキシンを発現する植物を作り出す。CryIA(b)は、植物
の" 外側(outside)"の組織内で、すなわち、欧州トウモ
ロコシ穿孔性動物が孵化(hatching)後最初に食べるよう
な組織内で、発現されるであろう。ECB がcryIA(b)に抵
抗性であり、そして葉組織及び/ 又は花粉を食べた後そ
の植物の葉柄(stalk) 中に穴を掘る(burrow)ことができ
る場合には、その時は、それは、cryIB デルタ- エンド
トキシンに遭遇し、そして第二の殺虫性成分に晒される
ことができる。このようなやり方で、ある者は、同一の
植物内に2 つの異なる殺虫性成分を差異に基づいて発現
させ、単一殺虫性成分への抵抗性の発展に対する保護を
同時に提供しながら単一の遺伝的単位として導入される
必要がある遺伝子の全体数を減少させることができる。
ルボキシラーゼ・プロモーターと融合させることによ
り、ある者は、緑組織及び花粉内でこの遺伝子の発現を
得ることができるであろう。髄好適プロモーターをバチ
ルス・スリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)から
のcryIB デルタ・エンドトキシンと融合することは、形
質転換植物の種組織内ではなく髄内で最も豊富な上記の
殺虫性蛋白の発現を生じさせるであろう。3 つの遺伝
子、すなわち、PEP カルボキシラーゼ/cryIA(b) 、花粉
/cryIA(b) 、及び髄/cryIBによる植物の形質転換は、同
一の植物の異なる組織内で2 つの異なるBt殺虫性エンド
トキシンを発現する植物を作り出す。CryIA(b)は、植物
の" 外側(outside)"の組織内で、すなわち、欧州トウモ
ロコシ穿孔性動物が孵化(hatching)後最初に食べるよう
な組織内で、発現されるであろう。ECB がcryIA(b)に抵
抗性であり、そして葉組織及び/ 又は花粉を食べた後そ
の植物の葉柄(stalk) 中に穴を掘る(burrow)ことができ
る場合には、その時は、それは、cryIB デルタ- エンド
トキシンに遭遇し、そして第二の殺虫性成分に晒される
ことができる。このようなやり方で、ある者は、同一の
植物内に2 つの異なる殺虫性成分を差異に基づいて発現
させ、単一殺虫性成分への抵抗性の発展に対する保護を
同時に提供しながら単一の遺伝的単位として導入される
必要がある遺伝子の全体数を減少させることができる。
【００６０】同様に、植物を、様々な昆虫を制御するた
めに、1 以上のタイプの殺虫性蛋白をコードしている構
築物により形質転換することができる。このように、多
数の変種が当業者によって構築されることができる。本
発明の組換えDNA 分子は、適当な方向でそれらを配置す
るための様々な要素を操作することにより調製すること
ができる。したがって、アダプター(adapters)及びリン
カー(linkers) をDNA 断片を結合するために使用するこ
とができる。その他の操作を、慣用の制限部位の提供、
制限部位又は余分のDNA の除去、のために行うことがで
きる。これらの操作を、当分野で認められる方法により
行うことができる。Sambrook et al., Molecular Cloni
ng: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labora
tory Press, second edition, 1989 を参照のこと。例
えば、方法、例えば、制限酵素処理、平滑末端(blunt e
nds)を提供するための突出(overhangs) のチューイング
・バック(chewing back)又はフィル・イン(filling i
n)、リンカーの結合(liigation) 、DNA 断片の相補的末
端を、連結(joining)及び結合のために提供することが
できる。Sambrook et al.,前記を参照のこと。
めに、1 以上のタイプの殺虫性蛋白をコードしている構
築物により形質転換することができる。このように、多
数の変種が当業者によって構築されることができる。本
発明の組換えDNA 分子は、適当な方向でそれらを配置す
るための様々な要素を操作することにより調製すること
ができる。したがって、アダプター(adapters)及びリン
カー(linkers) をDNA 断片を結合するために使用するこ
とができる。その他の操作を、慣用の制限部位の提供、
制限部位又は余分のDNA の除去、のために行うことがで
きる。これらの操作を、当分野で認められる方法により
行うことができる。Sambrook et al., Molecular Cloni
ng: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labora
tory Press, second edition, 1989 を参照のこと。例
えば、方法、例えば、制限酵素処理、平滑末端(blunt e
nds)を提供するための突出(overhangs) のチューイング
・バック(chewing back)又はフィル・イン(filling i
n)、リンカーの結合(liigation) 、DNA 断片の相補的末
端を、連結(joining)及び結合のために提供することが
できる。Sambrook et al.,前記を参照のこと。
【００６１】他の機能的なDNA 配列は、その分子がその
標的植物ゲノム中に取り込まれるであろう方法に依存し
て、その組換えDNA 分子内に含まれることができる。例
えば、アグロバクテリウム(Agrobacterium)-仲介形質転
換の場合においては、Ti- 又はRi- プラスミドを植物細
胞を形質転換するために使用場合には、そのTi- 又はRi
- プラスミドのT-DNA の右及び左の縁(border)をその発
現カセットのフランキング領域として連結することがで
きる。植物のアグロバクテリウム・チュメファシエンス
(Agrobacterium tumefaciens)-仲介形質転換は、Horsch
et al., Science, 225:1229 (1985); Marton, Cell Cu
lture Somatic Cell Genetics of Plants, 1:514-521
(1984); Hoekema, In: The Binary Plant Vector Syste
m Offset-Drukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, 198
5, Chapter V Fraley, et al., Crit. Rev. Plant Sc
i., 4:1-46;及びAn et al., EMBO J., 4:277-284 (198
5)中に記載されている。
標的植物ゲノム中に取り込まれるであろう方法に依存し
て、その組換えDNA 分子内に含まれることができる。例
えば、アグロバクテリウム(Agrobacterium)-仲介形質転
換の場合においては、Ti- 又はRi- プラスミドを植物細
胞を形質転換するために使用場合には、そのTi- 又はRi
- プラスミドのT-DNA の右及び左の縁(border)をその発
現カセットのフランキング領域として連結することがで
きる。植物のアグロバクテリウム・チュメファシエンス
(Agrobacterium tumefaciens)-仲介形質転換は、Horsch
et al., Science, 225:1229 (1985); Marton, Cell Cu
lture Somatic Cell Genetics of Plants, 1:514-521
(1984); Hoekema, In: The Binary Plant Vector Syste
m Offset-Drukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, 198
5, Chapter V Fraley, et al., Crit. Rev. Plant Sc
i., 4:1-46;及びAn et al., EMBO J., 4:277-284 (198
5)中に記載されている。
【００６２】本発明の組換えDNA 分子は、組換え植物細
胞における選択を容易にするためにマーカー遺伝子を含
む。マーカーの例は、殺生剤、例えば、抗生物質、例え
ば、カナマイシン(kanamycin) 、ハイグロマイシン(hyg
romycin)、クロラムフェニコール(chloramphenicol) 、
パラモマイシン(paramomycin) 、メトトレキサート(met
hotrexate)及びブレオマイシン(bleomycin) 、又は除草
剤、例えば、イミダゾロン(imidazolones)、スルホニル
ウレア(sulfonulureas) 、グリフォセート(glyphosat
e)、ホスフィノトリシン(phosphinothricin)、又はバイ
アラフォス(bialaphs)に対する抵抗性を含む。マーカー
遺伝子は、当業者によく知られている。本発明の他の態
様においては、本明細書中で先に記載したような組換え
DNA 分子又はキメラ遺伝子により安定的に形質転換され
た植物を提供する。得られたトランスジェニック植物
は、そのゲノム中に安定的に取り込まれた形質転換され
た遺伝子を含み、そしてそれぞれの流儀でそのプロモー
ターに作用可能な状態で結合した構造遺伝子を発現する
であろう。
胞における選択を容易にするためにマーカー遺伝子を含
む。マーカーの例は、殺生剤、例えば、抗生物質、例え
ば、カナマイシン(kanamycin) 、ハイグロマイシン(hyg
romycin)、クロラムフェニコール(chloramphenicol) 、
パラモマイシン(paramomycin) 、メトトレキサート(met
hotrexate)及びブレオマイシン(bleomycin) 、又は除草
剤、例えば、イミダゾロン(imidazolones)、スルホニル
ウレア(sulfonulureas) 、グリフォセート(glyphosat
e)、ホスフィノトリシン(phosphinothricin)、又はバイ
アラフォス(bialaphs)に対する抵抗性を含む。マーカー
遺伝子は、当業者によく知られている。本発明の他の態
様においては、本明細書中で先に記載したような組換え
DNA 分子又はキメラ遺伝子により安定的に形質転換され
た植物を提供する。得られたトランスジェニック植物
は、そのゲノム中に安定的に取り込まれた形質転換され
た遺伝子を含み、そしてそれぞれの流儀でそのプロモー
ターに作用可能な状態で結合した構造遺伝子を発現する
であろう。
【００６３】本発明により包含されるトランスジェニッ
ク植物は、単子葉及び双子葉植物の両方を含む。代表的
な例は、メイズ、タバコ、トマト、綿、ナタネ(rape se
ed)、大豆、小麦、米、アルファルファ、ポテト及びヒ
マワリを含む。[ 他は?]。好ましい植物は、メイズ、特
に同系のメイズ植物(inbred maize plants) を含む。本
発明により包含される形質転換植物のすべては、当業者
に知られた幾つかの方法により生産される。A. tumefac
iens- 仲介形質転換は、先に開示されている。他の方法
は、プロトプラスト中への直接遺伝子伝達(direct gene
transfer),Paszkowski et al., EMBO J., 12:2717 (19
84); Loerz et al., Mol. Gen. & Genet., 1199:178 (1
985); Fromm et al., Nature 319:719 (1986); マイク
ロプロジェクタイル・ボンバードメント(microprojecti
le bombardment), Klein et al., Bio/Technology, 6:5
59-563 (1988);プロトプラスト、培養細胞及び組織中へ
のインジェクション, Reich et al., Bio/Technology,
4:1001-1004 (1986);又はDe La Pena et al., Nature,
325:274-276 (1987); Graves et al., Plant Mol. Bio
l., 7:43-50 (1986); Hooykaas-Van Slogteren et al.,
Nature, 311:763-764 (1984); Grimsley et al., Bio/
Technology, 6:185 (1988);及び Grimsleyet al., Natu
re, 325:177 (1988)により記載されているような分裂組
織(meristematic tissue) 又は苗木(seedlings)及び植
物中へのインジェクション; 及びエレクトロポレーショ
ン,WO92/09696を含む。
ク植物は、単子葉及び双子葉植物の両方を含む。代表的
な例は、メイズ、タバコ、トマト、綿、ナタネ(rape se
ed)、大豆、小麦、米、アルファルファ、ポテト及びヒ
マワリを含む。[ 他は?]。好ましい植物は、メイズ、特
に同系のメイズ植物(inbred maize plants) を含む。本
発明により包含される形質転換植物のすべては、当業者
に知られた幾つかの方法により生産される。A. tumefac
iens- 仲介形質転換は、先に開示されている。他の方法
は、プロトプラスト中への直接遺伝子伝達(direct gene
transfer),Paszkowski et al., EMBO J., 12:2717 (19
84); Loerz et al., Mol. Gen. & Genet., 1199:178 (1
985); Fromm et al., Nature 319:719 (1986); マイク
ロプロジェクタイル・ボンバードメント(microprojecti
le bombardment), Klein et al., Bio/Technology, 6:5
59-563 (1988);プロトプラスト、培養細胞及び組織中へ
のインジェクション, Reich et al., Bio/Technology,
4:1001-1004 (1986);又はDe La Pena et al., Nature,
325:274-276 (1987); Graves et al., Plant Mol. Bio
l., 7:43-50 (1986); Hooykaas-Van Slogteren et al.,
Nature, 311:763-764 (1984); Grimsley et al., Bio/
Technology, 6:185 (1988);及び Grimsleyet al., Natu
re, 325:177 (1988)により記載されているような分裂組
織(meristematic tissue) 又は苗木(seedlings)及び植
物中へのインジェクション; 及びエレクトロポレーショ
ン,WO92/09696を含む。
【００６４】本組織好適又は組織特異的プロモーターと
作用可能な状態で結合した構造遺伝子のそれを含む形質
転換植物内での発現パターンは、その構造遺伝子が殺虫
性蛋白をコードしている場合においては決定的である。
例えば、今般開示する髄好適発現パターンは、そのトラ
ンスジェニック植物が、その植物の主として髄、そして
またその支持根、外鞘及び葉を攻撃する病原体(pathoge
ns) 及び草食動物(herbivores)に耐えそして阻止するこ
とを可能にするであろう。何故なら、その蛋白が、より
少ない程度であるが、これらの植物部分内で昆虫を制御
する量において発現されるであろうからであり、そして
さらに両方のタイプのプロモーターの場合においては、
その蛋白が影響を受けていない植物の種に残されるであ
ろうからである。
作用可能な状態で結合した構造遺伝子のそれを含む形質
転換植物内での発現パターンは、その構造遺伝子が殺虫
性蛋白をコードしている場合においては決定的である。
例えば、今般開示する髄好適発現パターンは、そのトラ
ンスジェニック植物が、その植物の主として髄、そして
またその支持根、外鞘及び葉を攻撃する病原体(pathoge
ns) 及び草食動物(herbivores)に耐えそして阻止するこ
とを可能にするであろう。何故なら、その蛋白が、より
少ない程度であるが、これらの植物部分内で昆虫を制御
する量において発現されるであろうからであり、そして
さらに両方のタイプのプロモーターの場合においては、
その蛋白が影響を受けていない植物の種に残されるであ
ろうからである。
【００６５】
【実施例】例
以下の例は、本発明の実施において使用される材料及び
方法についてさらに記載している。それらは、説明によ
り提供されているものであり、限定によるものではな
い。例1: 一般的方法 DNA 操作は、本分野において標準的な手順を使用して行
った。これらの手順は、その結果を実質的に変更するこ
となくしばしば修正及び/ 又は置き換えられることがで
きる。他の文献を示さない限り、これらの手順のほとん
どは、Sambrooket al., Molecular Cloning: A Laborat
ory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, s
econd edition, 1989 中に記載されている。
方法についてさらに記載している。それらは、説明によ
り提供されているものであり、限定によるものではな
い。例1: 一般的方法 DNA 操作は、本分野において標準的な手順を使用して行
った。これらの手順は、その結果を実質的に変更するこ
となくしばしば修正及び/ 又は置き換えられることがで
きる。他の文献を示さない限り、これらの手順のほとん
どは、Sambrooket al., Molecular Cloning: A Laborat
ory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, s
econd edition, 1989 中に記載されている。
【００６６】DNA オリゴマーの合成:約20から約90まで
の、好ましくは約60から約80までの長さのヌクレイチド
であるDNA オリゴマーを、Applied Biosystems model 3
80B DNA シンセサイザー及び標準的な手順を使用して合
成する。このオリゴマーは、0.2 μモル、広孔、小規模
ABI カラム上で最新SSCAF3サイクルを使用して作る。最
終手順を、トリチルを除き行い、そしてそのオリゴマー
を380Bの自動解裂サイクルを使用してそのカラムから解
裂させる。次にこのオリゴマーを、55℃で8-12時間にお
いて過剰の水酸化アンモニウム(NH 4 OH) 中で脱ブロ
ックする。次にこのオリゴマーを、窒素ガスを使用して
エバポレーター内で乾燥させる。終了後、このオリゴマ
ーを、0.25-0.5mlの脱イオン水中に再懸濁させる。
の、好ましくは約60から約80までの長さのヌクレイチド
であるDNA オリゴマーを、Applied Biosystems model 3
80B DNA シンセサイザー及び標準的な手順を使用して合
成する。このオリゴマーは、0.2 μモル、広孔、小規模
ABI カラム上で最新SSCAF3サイクルを使用して作る。最
終手順を、トリチルを除き行い、そしてそのオリゴマー
を380Bの自動解裂サイクルを使用してそのカラムから解
裂させる。次にこのオリゴマーを、55℃で8-12時間にお
いて過剰の水酸化アンモニウム(NH 4 OH) 中で脱ブロ
ックする。次にこのオリゴマーを、窒素ガスを使用して
エバポレーター内で乾燥させる。終了後、このオリゴマ
ーを、0.25-0.5mlの脱イオン水中に再懸濁させる。
【００６７】合成オリゴマーの精製:それぞれのオリゴ
マーの部分を、0.05% ブロモフェノール・ブルー、0.05
% キシレン・シアノールFF、及び25% ホルムアミドを含
む最終溶液との等容量のブルー染料/ ホルムアミドと混
合する。この混合物を、95℃で10分間加熱し、このオリ
ゴマーを変性させる。次にサンプルを、7Mウレアを含む
12% のポリアクリルアミド- ウレア・ゲル(Sambrook et
al.) に供給する。。Vertical Slab Gel Unit(Hoefer
Scientific Instruments, San Francisco, CA)を使用し
て300-400 ボルトで3-4 時間の電気泳動の後、UV影付け
を、そのゲル中の正確なサイズの断片を位置決めするた
めに使用し、次にゲルを、レーザー・ブレードを使用し
て切断した。精製された断片を、細かく刻みそして37℃
で一夜、0.4M LiCl 、1mM EDTA (pH 8) バッファー中で
インキュベートした。
マーの部分を、0.05% ブロモフェノール・ブルー、0.05
% キシレン・シアノールFF、及び25% ホルムアミドを含
む最終溶液との等容量のブルー染料/ ホルムアミドと混
合する。この混合物を、95℃で10分間加熱し、このオリ
ゴマーを変性させる。次にサンプルを、7Mウレアを含む
12% のポリアクリルアミド- ウレア・ゲル(Sambrook et
al.) に供給する。。Vertical Slab Gel Unit(Hoefer
Scientific Instruments, San Francisco, CA)を使用し
て300-400 ボルトで3-4 時間の電気泳動の後、UV影付け
を、そのゲル中の正確なサイズの断片を位置決めするた
めに使用し、次にゲルを、レーザー・ブレードを使用し
て切断した。精製された断片を、細かく刻みそして37℃
で一夜、0.4M LiCl 、1mM EDTA (pH 8) バッファー中で
インキュベートした。
【００６８】2 つの方法の中のいずれかを、そのポリア
クリルアミド・ゲル残存物からそのオリゴマーを分離す
るために使用する:Gene/X25 μM小孔性ポリエチレン・
フィルター装置又はMillipore's ulltrafree-MC 0.45μ
M フィルター装置。精製されたオリゴマーをエタノール
沈殿させ、4 ℃で20分間マイクロフュージ内で遠心分離
により回収し、そして最後にTE(10mM Tris、1mM EDTA、
pH 8.0) 中で再懸濁させる。濃度を、260nm における吸
収の読みに基づき50ng/ μl に調整する。
クリルアミド・ゲル残存物からそのオリゴマーを分離す
るために使用する:Gene/X25 μM小孔性ポリエチレン・
フィルター装置又はMillipore's ulltrafree-MC 0.45μ
M フィルター装置。精製されたオリゴマーをエタノール
沈殿させ、4 ℃で20分間マイクロフュージ内で遠心分離
により回収し、そして最後にTE(10mM Tris、1mM EDTA、
pH 8.0) 中で再懸濁させる。濃度を、260nm における吸
収の読みに基づき50ng/ μl に調整する。
【００６９】サイズ決定のためのオリゴマーのキナーゼ
分解:配列決定ゲル上でオリゴマーのいくつかのサイズ
をチェックするために、キナーゼ標識付け反応を、それ
ぞれの代表的なサイズ:40マー(40mers)、60マー、70マ
ー、80マー、及び90マーの精製合成オリゴマーを使用し
て行う。それぞれ20μl のキナーゼ分解反応において、
1 ピコモルの精製オリゴマーを、7.0mM Tris pH 7.5 、
10mM KCl、1mM MgCl2、0.5mM DTT 、50μg/ml BSA、300
0μCi(3ピコモル) の32P-ガンマATP 、及び8 ユニット
のT4ポリヌクレオチド・キナーゼのバッファー中で使用
する。このキナーゼ反応を、37℃で1時間インキュベー
トし、その後、フェノール/ クロロホルム抽出及び担体
としてのグリコーゲンによる3 回のエタノール沈殿(Tra
cy, Prep. Biochem. 11:251-268 (1981))を行う。
分解:配列決定ゲル上でオリゴマーのいくつかのサイズ
をチェックするために、キナーゼ標識付け反応を、それ
ぞれの代表的なサイズ:40マー(40mers)、60マー、70マ
ー、80マー、及び90マーの精製合成オリゴマーを使用し
て行う。それぞれ20μl のキナーゼ分解反応において、
1 ピコモルの精製オリゴマーを、7.0mM Tris pH 7.5 、
10mM KCl、1mM MgCl2、0.5mM DTT 、50μg/ml BSA、300
0μCi(3ピコモル) の32P-ガンマATP 、及び8 ユニット
のT4ポリヌクレオチド・キナーゼのバッファー中で使用
する。このキナーゼ反応を、37℃で1時間インキュベー
トし、その後、フェノール/ クロロホルム抽出及び担体
としてのグリコーゲンによる3 回のエタノール沈殿(Tra
cy, Prep. Biochem. 11:251-268 (1981))を行う。
【００７０】それぞれの反応の2 つのゲル充填材(loadi
ng)(1 つは1000cpm を含み、他方は2000cpm を含む)
を、25% ホルムアミド、0.05% ブロモフェノール・ブル
ー、及び0.05% キシレン・シアノールFFにより調製し
た。キナーゼ分解(kinased) オリゴマーを、6%ポリアク
リルアミド、7Mウレア配列決定ゲル(BRL Gel Mix TM6,
BRL, Gaithersburg, MD)上への供給の前、5 分間沸騰さ
せた。プラスミドpUC18 の配列決定反応を、同一ゲル上
で行いサイズマーカーを提供した。
ng)(1 つは1000cpm を含み、他方は2000cpm を含む)
を、25% ホルムアミド、0.05% ブロモフェノール・ブル
ー、及び0.05% キシレン・シアノールFFにより調製し
た。キナーゼ分解(kinased) オリゴマーを、6%ポリアク
リルアミド、7Mウレア配列決定ゲル(BRL Gel Mix TM6,
BRL, Gaithersburg, MD)上への供給の前、5 分間沸騰さ
せた。プラスミドpUC18 の配列決定反応を、同一ゲル上
で行いサイズマーカーを提供した。
【００７１】電気泳動の後、ゲルを乾燥させ、そして診
断X-線フィルム(Kodak, X-OMAT AR)に露出させた。得ら
れたオートラジオグラフは、正確なサイズを有すべくテ
ストされた精製オリゴマーのすべてを示す。配列決定ゲ
ル上で直接サイズ分画されたオリゴマーを、6%ポリアク
リルアミド、7Mウレア・ゲル(BRL Gel Mix TM6) 上で、
サイズ・マーカーとしてサイズ分画されたオリゴマーを
使用して、走らせた。オリゴマーのすべてを、ゲル上へ
の供給前に100 ℃で5 分間、25%ホルムアミドにより最
初に変性させる。このポリアクリルアミド・ゲルの臭化
エチジウム染色は、そのオリゴマーのすべてがサイズ決
定のために可視化されることを可能にする。
断X-線フィルム(Kodak, X-OMAT AR)に露出させた。得ら
れたオートラジオグラフは、正確なサイズを有すべくテ
ストされた精製オリゴマーのすべてを示す。配列決定ゲ
ル上で直接サイズ分画されたオリゴマーを、6%ポリアク
リルアミド、7Mウレア・ゲル(BRL Gel Mix TM6) 上で、
サイズ・マーカーとしてサイズ分画されたオリゴマーを
使用して、走らせた。オリゴマーのすべてを、ゲル上へ
の供給前に100 ℃で5 分間、25%ホルムアミドにより最
初に変性させる。このポリアクリルアミド・ゲルの臭化
エチジウム染色は、そのオリゴマーのすべてがサイズ決
定のために可視化されることを可能にする。
【００７２】直接クローニングのためのオリゴマーのハ
イブリダイジング:ハイブリダイズされるべきオリゴマ
ーを、一緒にプールし(1μgから20μg 全DNA まで) 、
そして30mM Tris-HCl pH 7.8、10mM MgCl 2 、10mMDT
T、及び1 mM dATP を含む1X Promega結合バッファー中
で37℃で1 時間、キナーゼ分解する。20ユニットの中の
1 のT4ポリヌクレオチド・キナーゼを、存在する全DNA
の量に依存して、その反応中で使用する。このキナーゼ
反応を、5 分間沸騰水浴内にその反応を置くことにより
終了させる。ハイブリダイズした分子の5'末端を形成す
るためのオリゴマーを、キナーゼ分解せず、加熱後の追
加のハイブリダイゼーション・バッファーと一緒のキナ
ーゼ分解オリゴマーに添加する。このプールされたオリ
ゴマーは、最終塩濃度を100mM NaCl、120mM Tris pH 7.
5、及び10mM MgCl2に調整するために使用される添加さ
れたハイブリダイゼーション・バッファーを含み50-100
μl の容量にある。このキナーゼ分解及び非- キナーゼ
分解オリゴマーを、一緒にプールし、そして5 分間沸騰
水浴内で加熱し、そして約4 時間にわたり室温までゆっ
くりと冷却する。次にハイブリダイズされたオリゴマー
を、フェノール/ クロロホルム抽出し、エタノール沈殿
させ、そして17μl のTE(10mM Tris、1mM EDTA、pH 8.
0) 中に再懸濁させる。この17μl を使用して、最終容
量20μl をもつ結合反応物を結合させる( 最終濃度=30m
M Tris-HCl pH 7.8 、10mM MgCl 2 、10mM DTT、1mM A
TP 、及び3 ユニットのT4 DNAリガーゼ(Promega, Madis
on WI))。この結合物を、室温において約2 時間インキ
ュベートする。ハイブリダイズ/ 結合断片を、ベクター
中へのクローニングに先立って制限酵素による切断の前
及び/ 又は後に2% Nusieveゲル上で一般的に精製する。
20μl 容量の結合反応物(legation reaction) を、30mM
Tris-HCl pH 7.8、10mM MgCl2、10mM DTT、1mM ATP 、
及び3 ユニットのT4 DNAリガーゼ(Promega,Madison WI)
中のおおよそ等モル量のDNA をもつ100ng〜500ng のそ
れぞれの断片を使用して結合させる。この結合物を、室
温において約2 時間インキュベートする。結合後、DNA
を、標準的な手順(Sambrook et al.) を使用して、凍結
コンピテント大腸菌(E.coli)細胞中に形質転換し、そし
て形質転換細胞を、100 μg/mlアンピシリンを含むLB-
寒天上で選択する( 以下参照) 。
イブリダイジング:ハイブリダイズされるべきオリゴマ
ーを、一緒にプールし(1μgから20μg 全DNA まで) 、
そして30mM Tris-HCl pH 7.8、10mM MgCl 2 、10mMDT
T、及び1 mM dATP を含む1X Promega結合バッファー中
で37℃で1 時間、キナーゼ分解する。20ユニットの中の
1 のT4ポリヌクレオチド・キナーゼを、存在する全DNA
の量に依存して、その反応中で使用する。このキナーゼ
反応を、5 分間沸騰水浴内にその反応を置くことにより
終了させる。ハイブリダイズした分子の5'末端を形成す
るためのオリゴマーを、キナーゼ分解せず、加熱後の追
加のハイブリダイゼーション・バッファーと一緒のキナ
ーゼ分解オリゴマーに添加する。このプールされたオリ
ゴマーは、最終塩濃度を100mM NaCl、120mM Tris pH 7.
5、及び10mM MgCl2に調整するために使用される添加さ
れたハイブリダイゼーション・バッファーを含み50-100
μl の容量にある。このキナーゼ分解及び非- キナーゼ
分解オリゴマーを、一緒にプールし、そして5 分間沸騰
水浴内で加熱し、そして約4 時間にわたり室温までゆっ
くりと冷却する。次にハイブリダイズされたオリゴマー
を、フェノール/ クロロホルム抽出し、エタノール沈殿
させ、そして17μl のTE(10mM Tris、1mM EDTA、pH 8.
0) 中に再懸濁させる。この17μl を使用して、最終容
量20μl をもつ結合反応物を結合させる( 最終濃度=30m
M Tris-HCl pH 7.8 、10mM MgCl 2 、10mM DTT、1mM A
TP 、及び3 ユニットのT4 DNAリガーゼ(Promega, Madis
on WI))。この結合物を、室温において約2 時間インキ
ュベートする。ハイブリダイズ/ 結合断片を、ベクター
中へのクローニングに先立って制限酵素による切断の前
及び/ 又は後に2% Nusieveゲル上で一般的に精製する。
20μl 容量の結合反応物(legation reaction) を、30mM
Tris-HCl pH 7.8、10mM MgCl2、10mM DTT、1mM ATP 、
及び3 ユニットのT4 DNAリガーゼ(Promega,Madison WI)
中のおおよそ等モル量のDNA をもつ100ng〜500ng のそ
れぞれの断片を使用して結合させる。この結合物を、室
温において約2 時間インキュベートする。結合後、DNA
を、標準的な手順(Sambrook et al.) を使用して、凍結
コンピテント大腸菌(E.coli)細胞中に形質転換し、そし
て形質転換細胞を、100 μg/mlアンピシリンを含むLB-
寒天上で選択する( 以下参照) 。
【００７３】大腸菌(E.coli)内のクローンのスクリーニ
ングのためのPCR 反応:正確なDNA 挿入物を含む大腸菌
コロニーを、PCR を使用して同定する( 一般的に、Sand
hu et al., BioTechniques 7:689-690 (1989) を参照の
こと。) 。つまようじを使用して、コロニーを、一夜プ
レートからこそげ取り、そして約50ピコモルのそれぞれ
のハイブリダイズジング・プライマー(pHYB2#6中のSacI
I 断片の方向を選択するためにプライマーMK23A28 及び
MK25A28 を使用する例を参照のこと) 、200 μm 〜400
μm のそれぞれのdNTP、及び1X反応バッファー(Perkin
Elmer Cetus, Norwalk, CT) を含む20μl 〜45μl のPC
R 反応混合物に添加する。10分間沸騰水浴内で大腸菌/P
CR混合物を沸騰させた後、1X反応バッファー中の5μl
の Taqポリメラーゼ(0.5ユニット)(Perkin Elmer Cetu
s, Norwalk, Conn.)を添加する。このPCR 反応のパラメ
ーターは、一般的に、30〜36サイクルにわたる、94℃30
秒間の変性段階、55℃45秒間のアニーリング、及び72℃
45秒間の伸長、により設定される。PCR 反応生成物を、
アガロース又はNusieve アガロース(FMC) ゲル上で走ら
せ、増幅された正確な断片サイズを検出する。
ングのためのPCR 反応:正確なDNA 挿入物を含む大腸菌
コロニーを、PCR を使用して同定する( 一般的に、Sand
hu et al., BioTechniques 7:689-690 (1989) を参照の
こと。) 。つまようじを使用して、コロニーを、一夜プ
レートからこそげ取り、そして約50ピコモルのそれぞれ
のハイブリダイズジング・プライマー(pHYB2#6中のSacI
I 断片の方向を選択するためにプライマーMK23A28 及び
MK25A28 を使用する例を参照のこと) 、200 μm 〜400
μm のそれぞれのdNTP、及び1X反応バッファー(Perkin
Elmer Cetus, Norwalk, CT) を含む20μl 〜45μl のPC
R 反応混合物に添加する。10分間沸騰水浴内で大腸菌/P
CR混合物を沸騰させた後、1X反応バッファー中の5μl
の Taqポリメラーゼ(0.5ユニット)(Perkin Elmer Cetu
s, Norwalk, Conn.)を添加する。このPCR 反応のパラメ
ーターは、一般的に、30〜36サイクルにわたる、94℃30
秒間の変性段階、55℃45秒間のアニーリング、及び72℃
45秒間の伸長、により設定される。PCR 反応生成物を、
アガロース又はNusieve アガロース(FMC) ゲル上で走ら
せ、増幅された正確な断片サイズを検出する。
【００７４】結合(Ligations):制限酵素消化断片を、本
分野において標準的な技術を使用して1%LGT(低ゲル化温
度アガロース、FMC)、2%Nusieve(FMC)、又は0.75%アガ
ロース中でいずれかの精製を行う。DNA バンドを臭化エ
チジウムにより可視化し、そしてバンドを、レーザー・
ブレードによる切除によりゲルから回収する。LGT から
単離された断片を、LGT 中で直接結合させる。それぞれ
の回収されたDNA 断片の10マイクロリッターを、その結
合反応物と結合させるために使用し、約23μl の最終結
合反応物容量を作り出す。レーザー・ブレードによる切
除の後、所望のDNA 断片を含む回収されたゲル・バンド
を溶融させ、そして1Xリガーゼ・バッファーにもってい
き、そして3 ユニットのT4 DNAリガーゼ(Promega) を先
に記載したように添加する。普通のアガロース又はNusi
eve アガロースのいずれかから単離した断片を、ultraf
ree-MC 0.45 μM フィルター装置(Millipore) を使用し
てそのアガロースから精製し、そしてその断片を、先に
記載したように結合させる。結合反応物を、標準的な手
順(Sambrook et al.) を使用して凍結コンピテント大腸
菌(E.coli)細胞中に形質転換する前、2 時間室温におい
てインキュベートする。
分野において標準的な技術を使用して1%LGT(低ゲル化温
度アガロース、FMC)、2%Nusieve(FMC)、又は0.75%アガ
ロース中でいずれかの精製を行う。DNA バンドを臭化エ
チジウムにより可視化し、そしてバンドを、レーザー・
ブレードによる切除によりゲルから回収する。LGT から
単離された断片を、LGT 中で直接結合させる。それぞれ
の回収されたDNA 断片の10マイクロリッターを、その結
合反応物と結合させるために使用し、約23μl の最終結
合反応物容量を作り出す。レーザー・ブレードによる切
除の後、所望のDNA 断片を含む回収されたゲル・バンド
を溶融させ、そして1Xリガーゼ・バッファーにもってい
き、そして3 ユニットのT4 DNAリガーゼ(Promega) を先
に記載したように添加する。普通のアガロース又はNusi
eve アガロースのいずれかから単離した断片を、ultraf
ree-MC 0.45 μM フィルター装置(Millipore) を使用し
てそのアガロースから精製し、そしてその断片を、先に
記載したように結合させる。結合反応物を、標準的な手
順(Sambrook et al.) を使用して凍結コンピテント大腸
菌(E.coli)細胞中に形質転換する前、2 時間室温におい
てインキュベートする。
【００７５】形質転換:株DH5 アルファ又はHB101 の凍
結コンピテント大腸菌(E.coli)細胞を、標準的な手順(S
ambrook et al.) を使用して調製し、そして形質転換さ
せる。大腸菌(E.coli)"SURE(確かな)"コンピテント細胞
を、Stratagene (La Jolla, CA) から得る。LGT アガロ
ース中で行われる結合のために、結合反応が終了した
後、50mM CaCl2 を、約150μl の最終容量に添加し、そ
してその溶液を、そのアガロースを完全に溶融するため
に約65℃で約10分間加熱する。次に、この溶液を、約20
0 μl のコンピテント細胞であって氷上で解凍されてい
るものの添加の前に、約10分間、氷上で混合し、そして
冷凍する。
結コンピテント大腸菌(E.coli)細胞を、標準的な手順(S
ambrook et al.) を使用して調製し、そして形質転換さ
せる。大腸菌(E.coli)"SURE(確かな)"コンピテント細胞
を、Stratagene (La Jolla, CA) から得る。LGT アガロ
ース中で行われる結合のために、結合反応が終了した
後、50mM CaCl2 を、約150μl の最終容量に添加し、そ
してその溶液を、そのアガロースを完全に溶融するため
に約65℃で約10分間加熱する。次に、この溶液を、約20
0 μl のコンピテント細胞であって氷上で解凍されてい
るものの添加の前に、約10分間、氷上で混合し、そして
冷凍する。
【００７６】この混合物を、氷上で30分間インキュベー
トする。次にこの混合物を、2 分間氷上で冷凍する前に
42℃で60秒間、熱ショックを与える。次に、800 μl の
SOC培地(20%トリプトン、0.5%酵母エキス、10mM NaCl
、2.5mM KCl であってによりpH 8に調整されているも
の、5 N NaOH、20mM MgCl2 :MgSO4 混合物、及び20mMグ
ルコース; Sambrook et al.)を、添加し、そしてその細
胞を振とうしながら37℃において、選択培地プレート上
へのプレーティング前約1 時間、インキュベートする。
プレートは、典型的には、100 μg/mlアンピシリンを含
むL-寒天(Sambrook et al.) である。
トする。次にこの混合物を、2 分間氷上で冷凍する前に
42℃で60秒間、熱ショックを与える。次に、800 μl の
SOC培地(20%トリプトン、0.5%酵母エキス、10mM NaCl
、2.5mM KCl であってによりpH 8に調整されているも
の、5 N NaOH、20mM MgCl2 :MgSO4 混合物、及び20mMグ
ルコース; Sambrook et al.)を、添加し、そしてその細
胞を振とうしながら37℃において、選択培地プレート上
へのプレーティング前約1 時間、インキュベートする。
プレートは、典型的には、100 μg/mlアンピシリンを含
むL-寒天(Sambrook et al.) である。
【００７７】結合がアガロースを含まない溶液中で行わ
れるとき、典型的には、200 μl の凍結コンピテント大
腸菌(E.coli)細胞( 株DH5 アルファ(BRL, Gaithersbur
g, MD) 又は確かな細胞, Stratagene, La Jolla, CA)
を、氷上で解凍し、そして5 μlの結合混合物を添加す
る。この反応物を、約40〜60分間氷上でインキュベート
し、次にこの細胞を、約90秒間42℃で熱ショックを与え
る。約10分間室温において回収した後、800 μl のSOC
培地を添加し、そしてその細胞を、次に、振とうしなが
ら37℃で1 時間インキュベートし、そして上記のように
プレーティングする。
れるとき、典型的には、200 μl の凍結コンピテント大
腸菌(E.coli)細胞( 株DH5 アルファ(BRL, Gaithersbur
g, MD) 又は確かな細胞, Stratagene, La Jolla, CA)
を、氷上で解凍し、そして5 μlの結合混合物を添加す
る。この反応物を、約40〜60分間氷上でインキュベート
し、次にこの細胞を、約90秒間42℃で熱ショックを与え
る。約10分間室温において回収した後、800 μl のSOC
培地を添加し、そしてその細胞を、次に、振とうしなが
ら37℃で1 時間インキュベートし、そして上記のように
プレーティングする。
【００７８】使用される標準的なベクターのいくつかの
においてベータ- ガラクトシダーゼ遺伝子中への挿入に
ついてスクリーニングするとき、200 μl の回収した形
質転換混合物を、0.008% X-gal、80μM IPTG、及び100
μg/mlアンピシリン(Sambrook et al.) を含むLB- 寒天
プレート上にプレーティングする。このプレートを、37
℃で一夜インキュベートし、形質転換細胞の選択及び培
養に供する。
においてベータ- ガラクトシダーゼ遺伝子中への挿入に
ついてスクリーニングするとき、200 μl の回収した形
質転換混合物を、0.008% X-gal、80μM IPTG、及び100
μg/mlアンピシリン(Sambrook et al.) を含むLB- 寒天
プレート上にプレーティングする。このプレートを、37
℃で一夜インキュベートし、形質転換細胞の選択及び培
養に供する。
【００７９】DNA のミニスクリーニング:選択培地プレ
ートからの形質転換細胞を、培養し、そしてそれらのプ
ラスミド構造を、標準的なプラスミド・ミニ- スクリー
ニング手順(Sambrook et al.) を使用して検査及び確認
する。典型的には、" 沸騰(boiling)"手順を、分析のた
めの少量のプラスミドDNA を作るために使用する(Sambr
ook et al.) 。あるいは、酢酸アンモニウム手順を、い
くつかの場合において使用する。この手順は、Shing-yi
Lee et al., Biotechniques 9:676-679 (1990) により
報告されたものを修正したものである。
ートからの形質転換細胞を、培養し、そしてそれらのプ
ラスミド構造を、標準的なプラスミド・ミニ- スクリー
ニング手順(Sambrook et al.) を使用して検査及び確認
する。典型的には、" 沸騰(boiling)"手順を、分析のた
めの少量のプラスミドDNA を作るために使用する(Sambr
ook et al.) 。あるいは、酢酸アンモニウム手順を、い
くつかの場合において使用する。この手順は、Shing-yi
Lee et al., Biotechniques 9:676-679 (1990) により
報告されたものを修正したものである。
【００８０】1)一夜選択プレートからの単一バクテリア
・コロニーを、5ml(1ml までのスケール・ダウンが可
能) のTB(Sambrook et al.) 培地中に接種し、そして適
当な抗生物質の存在中で増殖させる。 2)ローラー上で37℃において一夜インキュベートする。 3)プラスチックのOakridgeチューブ内に5ml のバクテリ
ア細胞を回収し、そしてSorvall SSローター内で5000rp
m において4 ℃において5 分間回転させる。
・コロニーを、5ml(1ml までのスケール・ダウンが可
能) のTB(Sambrook et al.) 培地中に接種し、そして適
当な抗生物質の存在中で増殖させる。 2)ローラー上で37℃において一夜インキュベートする。 3)プラスチックのOakridgeチューブ内に5ml のバクテリ
ア細胞を回収し、そしてSorvall SSローター内で5000rp
m において4 ℃において5 分間回転させる。
【００８１】4)その上澄液を除去する。
5)1ml の溶菌バッファー(50mM グルコース、25mM Tris-
HCl[pH 8.0] 、10mM EDTA 及び5mg/mlのリゾチーム) 中
に上記のペレットを再懸濁させ、5 秒間混合し、そして
室温において5 分間インキュベートする。 6)2ml の新たに調製したアルカリ溶液(0.2N NaCl、1%ド
デシル硫酸ナトリウム) を添加し、きつく蓋を締め、5
回引っ繰り返すことにより混合し、そして5 分間氷浴内
のチューブ内に入れる。
HCl[pH 8.0] 、10mM EDTA 及び5mg/mlのリゾチーム) 中
に上記のペレットを再懸濁させ、5 秒間混合し、そして
室温において5 分間インキュベートする。 6)2ml の新たに調製したアルカリ溶液(0.2N NaCl、1%ド
デシル硫酸ナトリウム) を添加し、きつく蓋を締め、5
回引っ繰り返すことにより混合し、そして5 分間氷浴内
のチューブ内に入れる。
【００８２】7)1.5ml の氷冷7.5M酢酸アンモニウム(pH
7.6)を上記溶液に添加し、穏やかに5 回そのチューブを
引っ繰り返すことにより混合し、そして5 分間氷水浴上
に置く。 8)室温において9000rpm で10分間遠心分離する。 9)透明の上澄液を15ml Corexチューブに移し、そして0.
6 容量のイソプロパノール( 約2.5ml)を添加する。室温
において10分間放置する。 10) 室温において9000rpm で10分間遠心分離し、その上
澄液を捨てる。
7.6)を上記溶液に添加し、穏やかに5 回そのチューブを
引っ繰り返すことにより混合し、そして5 分間氷水浴上
に置く。 8)室温において9000rpm で10分間遠心分離する。 9)透明の上澄液を15ml Corexチューブに移し、そして0.
6 容量のイソプロパノール( 約2.5ml)を添加する。室温
において10分間放置する。 10) 室温において9000rpm で10分間遠心分離し、その上
澄液を捨てる。
【００８３】11) そのペレットを300 μl のTEバッファ
ー中に再懸濁させる。6 μl のRNase A & T1のストック
(180μl のRNase A[3254ユニット/mg 蛋白、5.6mg 蛋白
/ml]及び20μl のRNase T1[481ユニット/mg 蛋白、1.2m
g 蛋白/ml]を添加することにより200 μl として作った
もの) を添加する。これらのストックを、USB(US Bioch
emical) から購入することができる。マイクロ遠心分離
チューブに移し、そして37℃で15分間インキュベートす
る。 12)75 μl の蒸留水及び100 μl の7.5M酢酸アンモニウ
ムを添加し、そして10分間氷水浴内でインキュベートす
る。
ー中に再懸濁させる。6 μl のRNase A & T1のストック
(180μl のRNase A[3254ユニット/mg 蛋白、5.6mg 蛋白
/ml]及び20μl のRNase T1[481ユニット/mg 蛋白、1.2m
g 蛋白/ml]を添加することにより200 μl として作った
もの) を添加する。これらのストックを、USB(US Bioch
emical) から購入することができる。マイクロ遠心分離
チューブに移し、そして37℃で15分間インキュベートす
る。 12)75 μl の蒸留水及び100 μl の7.5M酢酸アンモニウ
ムを添加し、そして10分間氷水浴内でインキュベートす
る。
【００８４】13) その混合物をBeckman メイクロフュー
ジ内で14,000rpm において10分間4℃で遠心分離する。 14)2.5容量の100%EtOH( 約1ml)を添加することにより沈
殿させ、そして10分間氷水浴内でインキュベートする。 15) マイクロフュージ内で14,000rpm において10分間回
転させる。 16)(0.5ml-1ml を使用して）70% エタノールによりペ
レットを洗浄する。そのペレットを乾燥させ、そして10
0 μl の1X New England Biolabs制限酵素バッファー4
[20mM Tris-HCl(pH 7.9)、10mM酢酸マグネシウム、50mM
酢酸カリウム、1mM DTT]中に再懸濁させる。濃度を測定
し、そして吸光度260 及び280nm における分光光度計に
より精製度をチェックする。
ジ内で14,000rpm において10分間4℃で遠心分離する。 14)2.5容量の100%EtOH( 約1ml)を添加することにより沈
殿させ、そして10分間氷水浴内でインキュベートする。 15) マイクロフュージ内で14,000rpm において10分間回
転させる。 16)(0.5ml-1ml を使用して）70% エタノールによりペ
レットを洗浄する。そのペレットを乾燥させ、そして10
0 μl の1X New England Biolabs制限酵素バッファー4
[20mM Tris-HCl(pH 7.9)、10mM酢酸マグネシウム、50mM
酢酸カリウム、1mM DTT]中に再懸濁させる。濃度を測定
し、そして吸光度260 及び280nm における分光光度計に
より精製度をチェックする。
【００８５】組換えプラスミドを宿す特定のバクテリア
のコロニーであるか否かについてのより迅速な決定のた
めに、PCR ミニスクリーン手順を、(Sandhu, G.S. et a
l.,1989, BioTechnique, 7:689-690)により記載された
方法を修正したものを使用して行う。簡単に言えば、以
下の混合物:100 μl の先のプライマー混合物、20μM
のそれぞれのプライマー、100 μl のdNTP混合物( それ
ぞれ2.5mM)、100 μl の10X AmpliTaqバッファー(Perki
n-Elmer Cetus, 1Xバッファー=10mM Tris-HCl pH 8.3,
50 mM KCl 、1.5mM MgCl2 、及び0.01% ゼラチン) 、70
0 μl の脱イオン水、を調製する。
のコロニーであるか否かについてのより迅速な決定のた
めに、PCR ミニスクリーン手順を、(Sandhu, G.S. et a
l.,1989, BioTechnique, 7:689-690)により記載された
方法を修正したものを使用して行う。簡単に言えば、以
下の混合物:100 μl の先のプライマー混合物、20μM
のそれぞれのプライマー、100 μl のdNTP混合物( それ
ぞれ2.5mM)、100 μl の10X AmpliTaqバッファー(Perki
n-Elmer Cetus, 1Xバッファー=10mM Tris-HCl pH 8.3,
50 mM KCl 、1.5mM MgCl2 、及び0.01% ゼラチン) 、70
0 μl の脱イオン水、を調製する。
【００８６】20μl の上記の混合物を、0.5ml のポリプ
ロピレンPCR チューブ内に入れる。形質転換されたバク
テリアのコロニーを、つまようじで拾い上げ、そしてそ
の混合物中に再懸濁させる。このチューブを、沸騰水浴
内に10分間置き、そして次に、以下に記載する5 μl の
混合物:265 μl の脱イオン水、30μl の10X AmpliTaq
バッファー(Perkin-Elmer Cetus, 1X バッファー=10mM
Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KCl 、1.5mM MgCl2 、及び0.0
1% ゼラチン) 、7.5 μl のTaq ポリメラーゼ、を添加
する前に室温まで冷却する。
ロピレンPCR チューブ内に入れる。形質転換されたバク
テリアのコロニーを、つまようじで拾い上げ、そしてそ
の混合物中に再懸濁させる。このチューブを、沸騰水浴
内に10分間置き、そして次に、以下に記載する5 μl の
混合物:265 μl の脱イオン水、30μl の10X AmpliTaq
バッファー(Perkin-Elmer Cetus, 1X バッファー=10mM
Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KCl 、1.5mM MgCl2 、及び0.0
1% ゼラチン) 、7.5 μl のTaq ポリメラーゼ、を添加
する前に室温まで冷却する。
【００８７】このサンプルを50μl の鉱油により重層
し、そしてPCR を、以下のパラメーター: 変性:94 ℃、1 分間 アニーリング:55 ℃、1 分間 伸長:72 ℃、45秒間、 を使用して、30サイクルにわたり行う。
し、そしてPCR を、以下のパラメーター: 変性:94 ℃、1 分間 アニーリング:55 ℃、1 分間 伸長:72 ℃、45秒間、 を使用して、30サイクルにわたり行う。
【００８８】PCR 増幅後、1 μl の充填染料(30%グリセ
ロール、0.25% ブロムフェノール・ブルー、0.25% キシ
レン・シアノール) を、その反応物全体に添加し、そし
て20μl の混合物を、所望のサイズのPCR 生成物が在る
かどうかを見るために、2%Nusieve 、1%アガロース・ゲ
ル上に装填する。この手順を、最初のスクリーンとして
使用する。ミニ調製(Minipreps) を、その後、スクリー
ニングに先立ってそのプラスミドの構造及びその挿入物
を確認するために行う。
ロール、0.25% ブロムフェノール・ブルー、0.25% キシ
レン・シアノール) を、その反応物全体に添加し、そし
て20μl の混合物を、所望のサイズのPCR 生成物が在る
かどうかを見るために、2%Nusieve 、1%アガロース・ゲ
ル上に装填する。この手順を、最初のスクリーンとして
使用する。ミニ調製(Minipreps) を、その後、スクリー
ニングに先立ってそのプラスミドの構造及びその挿入物
を確認するために行う。
【００８９】例2: それぞれのクオーターの増幅及び組
み立て 合成Bt cryIA(b) 遺伝子の断片のクローニング:合成遺
伝子を、4 つの片であってそれぞれがその遺伝子のだい
たい1 クオーターであるものの内において、クローン化
されるように設計した。それぞれのクオーターのための
オリゴマーを、PCR 、ハイブリダイゼーション、又はハ
イブリダイゼーションの組み合わせその後の他で記載さ
れるようなPCR 増幅のいずれかにより、組み立てられる
ようにプールした。合成クオーターを、第一及び第二、
第二及び第三、そして第三及び第四の間において、それ
ぞれ、制限部位AatII 、NcoI、及びApaIを重複させるこ
とにより一緒に片とした。
み立て 合成Bt cryIA(b) 遺伝子の断片のクローニング:合成遺
伝子を、4 つの片であってそれぞれがその遺伝子のだい
たい1 クオーターであるものの内において、クローン化
されるように設計した。それぞれのクオーターのための
オリゴマーを、PCR 、ハイブリダイゼーション、又はハ
イブリダイゼーションの組み合わせその後の他で記載さ
れるようなPCR 増幅のいずれかにより、組み立てられる
ようにプールした。合成クオーターを、第一及び第二、
第二及び第三、そして第三及び第四の間において、それ
ぞれ、制限部位AatII 、NcoI、及びApaIを重複させるこ
とにより一緒に片とした。
【００９０】遺伝子のそれぞれのクオーター( 約500 塩
基対を表す) を、その好適なオリゴマーとハイブリダイ
ズさせ、そして所望の断片を、そのクオーターの末端に
特異的なPCR プライマーを使用して増幅することによ
り、結合させた。わずかに異なるプライマーの2 セット
を使用するPCR 反応の2 つの異なるセットを使用した。
この2 つの反応のPCR 生成物は、第一反応においてその
コード領域の5'末端における追加のAATTが存在し、そし
て第二反応において与えられたクオーターの3'末端にお
いてAGCT配列が存在することを除き、同一のものとして
設計された。特定のクオーターのためのこの2 つの反応
の生成物が( そのポリメラーゼ、プライマー及び不完全
生成物を除去した後に) 混合、変性、そしてその後の再
アニーリングを行われたとき、特定の比( 理論的には50
%)のアニール生成物は非同種の突出(overhanging) 末端
をもつはずである。これらの末端は、その分子の5'末端
におけるEcoRI による、その3'末端におけるHindIII に
よる制限消化の間に形成される" 付着末端(sticky end
s)"に対応するように設計された。得られた分子を、リ
ン酸化し、EcoRI/HindIII 消化及びホスファターゼ処理
Bluscript ベクター中へ結合し、そして凍結コンピテン
ト大腸菌(E.coli)株DH5 アルファ中へ形質転換した。選
択後、所望の断片を含む大腸菌(E.coli)コロニーをその
DNA の制限消化パターンにより同定した。その合成遺伝
子の挿入を表す部分を、次に精製し、そして標準的な手
順を使用して配列決定する。すべての場合において、多
数のPCR 反応からのクローンを、作りそして配列決定す
る。次に、このクオーターを、その完全な遺伝子を得る
ためにその連結点(junctions) におけるユニーク制限部
位を使用して一緒に連結する。
基対を表す) を、その好適なオリゴマーとハイブリダイ
ズさせ、そして所望の断片を、そのクオーターの末端に
特異的なPCR プライマーを使用して増幅することによ
り、結合させた。わずかに異なるプライマーの2 セット
を使用するPCR 反応の2 つの異なるセットを使用した。
この2 つの反応のPCR 生成物は、第一反応においてその
コード領域の5'末端における追加のAATTが存在し、そし
て第二反応において与えられたクオーターの3'末端にお
いてAGCT配列が存在することを除き、同一のものとして
設計された。特定のクオーターのためのこの2 つの反応
の生成物が( そのポリメラーゼ、プライマー及び不完全
生成物を除去した後に) 混合、変性、そしてその後の再
アニーリングを行われたとき、特定の比( 理論的には50
%)のアニール生成物は非同種の突出(overhanging) 末端
をもつはずである。これらの末端は、その分子の5'末端
におけるEcoRI による、その3'末端におけるHindIII に
よる制限消化の間に形成される" 付着末端(sticky end
s)"に対応するように設計された。得られた分子を、リ
ン酸化し、EcoRI/HindIII 消化及びホスファターゼ処理
Bluscript ベクター中へ結合し、そして凍結コンピテン
ト大腸菌(E.coli)株DH5 アルファ中へ形質転換した。選
択後、所望の断片を含む大腸菌(E.coli)コロニーをその
DNA の制限消化パターンにより同定した。その合成遺伝
子の挿入を表す部分を、次に精製し、そして標準的な手
順を使用して配列決定する。すべての場合において、多
数のPCR 反応からのクローンを、作りそして配列決定す
る。次に、このクオーターを、その完全な遺伝子を得る
ためにその連結点(junctions) におけるユニーク制限部
位を使用して一緒に連結する。
【００９１】クローン化クオーターを、ミニ- スクリー
ン手順により同定し、そしてその遺伝子断片を配列決定
する。最も多くはそのPCR 増幅段階の間にその配列中に
誤りがしばしば導入されることが見つかっている。この
ような誤りのほんの少しを含むクローン内でこのような
誤りを正すために、ハイブリダイズされたオリゴマーを
使用する。ハイブリダイズされた断片は、その断片内の
制限酵素認識部位において消化され、そしてその合成遺
伝子内でその突然変異した領域を置き換られる。ハイブ
リダイズされた断片は、長さ90塩基対( 例えば、第二ク
オーター内のSacII 部位間の断片を置き換える領域) か
ら約350 塩基対の、第四クオーター断片であってその遺
伝子の第四クオーター内で2 つのPCR 誘導突然変異を置
き換えるもの、までの範囲にある。高い誤り率のPCR の
ために、オープン・リーディング・フレームを含むクロ
ーン化遺伝子断片の選択を可能にするプラスミドを、設
計し、そして構築する。このプラスミドを、オープン・
リーディング・フレームがそのクローニング部位中に導
入される場合に、その形質転換されたバクテリアがカナ
マイシンの存在中で増殖することができるようなやり方
で、設計する。このベクターの構築を、以下、詳細に記
載する。この選択系は、多数の独立したクローンの配列
決定を行う必要なくオープン・リーディング・フレーム
をもつクローンを迅速に同定することを可能にすること
により、非常にその進行を速めるものである。合成クオ
ーターを、様々なプラスミドであって、BSSK(Stratagen
e; La Jolla, Ca)、pUC18(Sambrook et al.)、及びKm-
発現ベクターを含むものの中で、組み立てた。pUC ベー
スのプラスミドを含む他の好適なプラスミドは、当業者
によく知られており、そしてこれも使用することができ
る。
ン手順により同定し、そしてその遺伝子断片を配列決定
する。最も多くはそのPCR 増幅段階の間にその配列中に
誤りがしばしば導入されることが見つかっている。この
ような誤りのほんの少しを含むクローン内でこのような
誤りを正すために、ハイブリダイズされたオリゴマーを
使用する。ハイブリダイズされた断片は、その断片内の
制限酵素認識部位において消化され、そしてその合成遺
伝子内でその突然変異した領域を置き換られる。ハイブ
リダイズされた断片は、長さ90塩基対( 例えば、第二ク
オーター内のSacII 部位間の断片を置き換える領域) か
ら約350 塩基対の、第四クオーター断片であってその遺
伝子の第四クオーター内で2 つのPCR 誘導突然変異を置
き換えるもの、までの範囲にある。高い誤り率のPCR の
ために、オープン・リーディング・フレームを含むクロ
ーン化遺伝子断片の選択を可能にするプラスミドを、設
計し、そして構築する。このプラスミドを、オープン・
リーディング・フレームがそのクローニング部位中に導
入される場合に、その形質転換されたバクテリアがカナ
マイシンの存在中で増殖することができるようなやり方
で、設計する。このベクターの構築を、以下、詳細に記
載する。この選択系は、多数の独立したクローンの配列
決定を行う必要なくオープン・リーディング・フレーム
をもつクローンを迅速に同定することを可能にすること
により、非常にその進行を速めるものである。合成クオ
ーターを、様々なプラスミドであって、BSSK(Stratagen
e; La Jolla, Ca)、pUC18(Sambrook et al.)、及びKm-
発現ベクターを含むものの中で、組み立てた。pUC ベー
スのプラスミドを含む他の好適なプラスミドは、当業者
によく知られており、そしてこれも使用することができ
る。
【００９２】クローン化断片の完全な配列決定、クロー
ン化遺伝子生成物のウェスタン・ブロット分析、及び完
全に作用する合成Bt cryIA(b) 遺伝子を確認するテスト
昆虫として欧州トウモロコシ穿孔性動物を使用した昆虫
検定を、得た。
ン化遺伝子生成物のウェスタン・ブロット分析、及び完
全に作用する合成Bt cryIA(b) 遺伝子を確認するテスト
昆虫として欧州トウモロコシ穿孔性動物を使用した昆虫
検定を、得た。
【００９３】オープン・リーディング・フレームを選択
するためのKm- 発現ベクターの構築:Km- 発現ベクター
を、オープン・リーディング・フレームを含む合成遺伝
子の断片について選択するために設計した。ヌクレオチ
ド13におけるTn5 開始からのNPTII 遺伝子(Reiss et a
l., EMBO J.3:3317-3322 (1984)をpUC18 と融合し、そ
してそのDNA セグメント間に有用な制限部位を導入する
ことができるPCR オリゴマーを設計した。このポリリン
カー領域は、フレーム内にKm- 遺伝子をもつ様々な合成
Bt IP 断片をクローニングすることができる制限部位を
含む。
するためのKm- 発現ベクターの構築:Km- 発現ベクター
を、オープン・リーディング・フレームを含む合成遺伝
子の断片について選択するために設計した。ヌクレオチ
ド13におけるTn5 開始からのNPTII 遺伝子(Reiss et a
l., EMBO J.3:3317-3322 (1984)をpUC18 と融合し、そ
してそのDNA セグメント間に有用な制限部位を導入する
ことができるPCR オリゴマーを設計した。このポリリン
カー領域は、フレーム内にKm- 遺伝子をもつ様々な合成
Bt IP 断片をクローニングすることができる制限部位を
含む。
【００９４】このポリリンカー領域を含む88塩基対の5'
オリゴマーを、オリゴマー PAGE 精製のために先に記載
したように6%ポリアクリルアミド・ゲル上で精製する。
PCR 反応物を、Tn5 から得られたNPT II遺伝子を含む1K
b のBglII/SmaIテンプレート断片と結合させる。このPC
R 反応混合物は、100 ピコモルのオリゴマーKE72A28 及
びKE74A28(以下の配列を参照のこと) をもつ100ng のテ
ンプレート、200nM dNTP、及び2.5 ユニットのTaq ポリ
メラーゼを、すべて50μl 容量中に含み、等容量の鉱油
で重層される。このプライマーの配列は: KE74A28 5'-GCAGATCTGG ATCCATGCAC GCCGTGAAGG GCCCTTCTAG AAG
GCCTATCGATAAAGAGC TCCCCGGGGA TGGATTGCAC GCAGGTTC-
3' KE72A28 5'-GCGTTAACAT GTCGACTCAG AAGAACTCGT CAAGAAGGCG-3'
オリゴマーを、オリゴマー PAGE 精製のために先に記載
したように6%ポリアクリルアミド・ゲル上で精製する。
PCR 反応物を、Tn5 から得られたNPT II遺伝子を含む1K
b のBglII/SmaIテンプレート断片と結合させる。このPC
R 反応混合物は、100 ピコモルのオリゴマーKE72A28 及
びKE74A28(以下の配列を参照のこと) をもつ100ng のテ
ンプレート、200nM dNTP、及び2.5 ユニットのTaq ポリ
メラーゼを、すべて50μl 容量中に含み、等容量の鉱油
で重層される。このプライマーの配列は: KE74A28 5'-GCAGATCTGG ATCCATGCAC GCCGTGAAGG GCCCTTCTAG AAG
GCCTATCGATAAAGAGC TCCCCGGGGA TGGATTGCAC GCAGGTTC-
3' KE72A28 5'-GCGTTAACAT GTCGACTCAG AAGAACTCGT CAAGAAGGCG-3'
【００９５】使用するPCR パラメーターは: 94℃、45秒
間、55℃、45秒間、及び72℃、55秒間、であって、段階
3 において3 秒間の伸長、20サイクルにわたるものであ
る。すべてのPCR 反応を、Perkin-Elmer Cetus thermoc
ycler 内で行う。増幅されたPCR 生成物は800 塩基対で
あり、そして翻訳開始部位その後の、その翻訳終止因子
を通して走る塩基#13 からのKm遺伝子とフレーム内融合
したユニーク制限部位をもつポリリンカー領域を含む。
pUC:KM74は、Km- 発現カセットであってPUC18ベクター
内でクローン化された800 塩基対のBglII/SalIポリリン
カー/Km 断片から組み立てられたものである。このlacZ
プロモーターは、このKm遺伝子が大腸菌(E.coli)内で発
現されることを可能にする。pUC:KM74誘導体は、25μg/
mlカナマイシン/IPTG を含むLB- 寒天プレート上でその
後スクリーニングされることができる突然変異細胞を選
択されるために、最初に100 μg/mlアンピシリンを含む
LB- 寒天プレート上にプレーティングされなければなら
い。合成Bt IP 遺伝子断片を、Km- カセット内のそれぞ
れのクオーターから組み立て、オープン・リーディング
・フレーム含有断片の片のクローニングについて確認す
る。この第一のECB活性合成Bt IP 遺伝子断片、pBt:Km#
16 は、Km抵抗性を示すBt IP 遺伝子である。この断片
は、その後、第三及び第四クオーター内に突然変異を含
むことが発見され、それはその後修復されるものであ
る。
間、55℃、45秒間、及び72℃、55秒間、であって、段階
3 において3 秒間の伸長、20サイクルにわたるものであ
る。すべてのPCR 反応を、Perkin-Elmer Cetus thermoc
ycler 内で行う。増幅されたPCR 生成物は800 塩基対で
あり、そして翻訳開始部位その後の、その翻訳終止因子
を通して走る塩基#13 からのKm遺伝子とフレーム内融合
したユニーク制限部位をもつポリリンカー領域を含む。
pUC:KM74は、Km- 発現カセットであってPUC18ベクター
内でクローン化された800 塩基対のBglII/SalIポリリン
カー/Km 断片から組み立てられたものである。このlacZ
プロモーターは、このKm遺伝子が大腸菌(E.coli)内で発
現されることを可能にする。pUC:KM74誘導体は、25μg/
mlカナマイシン/IPTG を含むLB- 寒天プレート上でその
後スクリーニングされることができる突然変異細胞を選
択されるために、最初に100 μg/mlアンピシリンを含む
LB- 寒天プレート上にプレーティングされなければなら
い。合成Bt IP 遺伝子断片を、Km- カセット内のそれぞ
れのクオーターから組み立て、オープン・リーディング
・フレーム含有断片の片のクローニングについて確認す
る。この第一のECB活性合成Bt IP 遺伝子断片、pBt:Km#
16 は、Km抵抗性を示すBt IP 遺伝子である。この断片
は、その後、第三及び第四クオーター内に突然変異を含
むことが発見され、それはその後修復されるものであ
る。
【００９６】例2A: 合成遺伝子の第一クオーター[ 塩基
対1 〜550]の合成及びクローニング 以下の手順を、合成Bt cryIA(b) 遺伝子をコードしてい
る合成DNA 配列の第一クオーターをクローン化するため
の、手本とする。同一の手順を、他のクオーターの合成
及びクローニングのための手本とする。但し、プライマ
ー及び制限部位について述べるときを除く。クオーター
1 のためのテンプレート: 等量の精製オリゴマーU1-U7
とL1〜L7との混合物
対1 〜550]の合成及びクローニング 以下の手順を、合成Bt cryIA(b) 遺伝子をコードしてい
る合成DNA 配列の第一クオーターをクローン化するため
の、手本とする。同一の手順を、他のクオーターの合成
及びクローニングのための手本とする。但し、プライマ
ー及び制限部位について述べるときを除く。クオーター
1 のためのテンプレート: 等量の精製オリゴマーU1-U7
とL1〜L7との混合物
【００９７】PCR プライマー:
前進(Forward):
P1(a):5'-GTCGACAAGG ATCCAACAAT GG-3'
P1(b):5'-AATTGTCGAC AAGGATCCAA CAATGG-3'
復帰(reverse):
P2(a):5'-ACACGCTGAC GTCGCGCAGC ACG-3'
P2(b):5'-AGCTACACGC TGACGTCGCG CAG-3'
プライマー対A1:P1(b) + P2(a)
プライマー対A2:P1(a) + P2(b)
【００９８】合成メイズ最適化Bt IP 遺伝子の第一クオ
ーターを含んで成るオリゴマーを含むPCR 反応物を、以
下のように述べる: 200ng のオリゴ混合物(oligo mix)(重量に基づく等量に
おいて混合されたクオーターのためのすべてのオリゴ) 10μl のプライマー混合物(primer mix)(20 μM におけ
るそれぞれの1:1 の混合物; プライマーは先に記載のも
のと同じである) 5 μl の10X PCR バッファー。
ーターを含んで成るオリゴマーを含むPCR 反応物を、以
下のように述べる: 200ng のオリゴ混合物(oligo mix)(重量に基づく等量に
おいて混合されたクオーターのためのすべてのオリゴ) 10μl のプライマー混合物(primer mix)(20 μM におけ
るそれぞれの1:1 の混合物; プライマーは先に記載のも
のと同じである) 5 μl の10X PCR バッファー。
【００９９】使用するPCR バッファーは、
(a)1X 濃度= 10mM KCl、10mM (NH4)2SO4、20mM Tris-HC
l 、pH 8.0、2mM MgSO 4、及び0.1% Triton X-100 、又
は、(b)1X 濃度= 10mM Tris-HCl 、pH 8.3、50mM KCl、
1.5mM MgCl2、0.01% wt/volゼラチン、のいずれかであ
ることができる。
l 、pH 8.0、2mM MgSO 4、及び0.1% Triton X-100 、又
は、(b)1X 濃度= 10mM Tris-HCl 、pH 8.3、50mM KCl、
1.5mM MgCl2、0.01% wt/volゼラチン、のいずれかであ
ることができる。
【０１００】成分を混合し、5 分間沸騰水浴内で加熱
し、そして65℃で10分間インキュベートする。次に、以
下の試薬:8 μl のdNTPs 混合物( 反応における最終濃
度= それぞれ0.2mM)、5 ユニットのポリメラーゼ、を添
加する。
し、そして65℃で10分間インキュベートする。次に、以
下の試薬:8 μl のdNTPs 混合物( 反応における最終濃
度= それぞれ0.2mM)、5 ユニットのポリメラーゼ、を添
加する。
【０１０１】最終反応容量は、50マイクロリッターであ
る。次に、オリゴマーを、72℃において3 分間インキュ
ベートし、そして次に、PCR サイクルを走らせる。この
PCR 反応を、以下のような段階サイクル手順に基づきPe
rkin Elmer thermocycler 内で走らせる: 変性(denaturation)サイクル:94 ℃、1 分間、 アニーリング・サイクル:60 ℃、1 分間、 伸長サイクル(extenssion cycle):72 ℃、45秒間(1サイ
クル当たり+3秒間)、 サイクル数:15 。
る。次に、オリゴマーを、72℃において3 分間インキュ
ベートし、そして次に、PCR サイクルを走らせる。この
PCR 反応を、以下のような段階サイクル手順に基づきPe
rkin Elmer thermocycler 内で走らせる: 変性(denaturation)サイクル:94 ℃、1 分間、 アニーリング・サイクル:60 ℃、1 分間、 伸長サイクル(extenssion cycle):72 ℃、45秒間(1サイ
クル当たり+3秒間)、 サイクル数:15 。
【０１０２】反応終了後、10μl のPCR 反応物を、2% N
usieve-GTG(FMC) 、1%アガロース分析ゲル上に供給し、
その反応物を監視した。残りの40μl を、以下に記載す
るように、遺伝子断片をクローン化するために使用す
る。
usieve-GTG(FMC) 、1%アガロース分析ゲル上に供給し、
その反応物を監視した。残りの40μl を、以下に記載す
るように、遺伝子断片をクローン化するために使用す
る。
【０１０３】PCR 生成物
様々なプライマー対に対応する2 本鎖PCR 生成物の末端
を示す(上側の鎖のみ): A1 AATTGTCGAC GCGTGT (554塩基対) 第一ク
オーター A2 GTCGAC GCGTGTAGCT(554塩基対) 第一ク
オーター。
を示す(上側の鎖のみ): A1 AATTGTCGAC GCGTGT (554塩基対) 第一ク
オーター A2 GTCGAC GCGTGTAGCT(554塩基対) 第一ク
オーター。
【０１０４】ハイブリダイゼーション
先に記載したようなPCR 反応物のそれぞれの40μl を、
製造者の指示に従ってクロマスピン(chromaspin)400 カ
ラム(Clonetech, Palo Alto, CA)を使用して精製する。
担体DNA の5 μg をそのカラムに供給する前に反応物に
添加した。( このことは、ほとんどのクローニングにつ
いて行われる。しかしながら、いくつかの反応物におい
ては、PCR 反応物は、標準的な手順(Sambrook et al.)
を使用して、フェノール: クロロホルム抽出され、Taq
ポリメラーゼを除去され、そしてPCR 生成DNA を、標準
的なエタノール沈降を使用してその水相から回収する。
この担体DNA は、PCR 生成断片と共には溶出しない。そ
れぞれのクオーターのためのA1及びA2反応の片割れ(cou
nterparts)を混合し、10分間、沸騰水浴内で加熱し、そ
して次に、65℃で一夜インキュベートする。次に、その
反応物を、65℃の浴から取り出し、そして担体としての
1 μl (20 μg)のヌクレアーゼ不含有グリコーゲン(Tra
cy, prep. Biochem. 11:251-268 (1981)によりエタノー
ル沈降させた。このペレットを、40μl の脱イオン水中
に再懸濁させる。
製造者の指示に従ってクロマスピン(chromaspin)400 カ
ラム(Clonetech, Palo Alto, CA)を使用して精製する。
担体DNA の5 μg をそのカラムに供給する前に反応物に
添加した。( このことは、ほとんどのクローニングにつ
いて行われる。しかしながら、いくつかの反応物におい
ては、PCR 反応物は、標準的な手順(Sambrook et al.)
を使用して、フェノール: クロロホルム抽出され、Taq
ポリメラーゼを除去され、そしてPCR 生成DNA を、標準
的なエタノール沈降を使用してその水相から回収する。
この担体DNA は、PCR 生成断片と共には溶出しない。そ
れぞれのクオーターのためのA1及びA2反応の片割れ(cou
nterparts)を混合し、10分間、沸騰水浴内で加熱し、そ
して次に、65℃で一夜インキュベートする。次に、その
反応物を、65℃の浴から取り出し、そして担体としての
1 μl (20 μg)のヌクレアーゼ不含有グリコーゲン(Tra
cy, prep. Biochem. 11:251-268 (1981)によりエタノー
ル沈降させた。このペレットを、40μl の脱イオン水中
に再懸濁させる。
【０１０５】リン酸化反応
リン酸化反応を、以下のように行う:
40μl DNA
2.5 μl 20mM ATP
0.5 μl 10X BSA/DTT (1X=5mM DTT 、0.5mg/ml BSA)
1.0 μl 10X ポリヌクレオチド・キナーゼ・バッファー
(1X=70Mm Tris-HCl、pH 7.6、0.1 M KCl 、10mM MgCl
2) 2.0 μl ポリヌクレオチド・キナーゼ(New England Bio
labs、20ユニット)。 インキュベーションは、37℃で2 時間である。次にこの
反応を、1:1 フェノール: クロロホルムで1 回、次にク
ロロホルムで1 回抽出し、そして標準的な手順を使用し
てその水相をエタノール沈降させる。このペレットを10
μl のTE中に再懸濁させる。
(1X=70Mm Tris-HCl、pH 7.6、0.1 M KCl 、10mM MgCl
2) 2.0 μl ポリヌクレオチド・キナーゼ(New England Bio
labs、20ユニット)。 インキュベーションは、37℃で2 時間である。次にこの
反応を、1:1 フェノール: クロロホルムで1 回、次にク
ロロホルムで1 回抽出し、そして標準的な手順を使用し
てその水相をエタノール沈降させる。このペレットを10
μl のTE中に再懸濁させる。
【０１０６】制限消化
20μg のBluescriptベクター(BSSK+, Stratagene, La J
olla, CA) 10μl 10X 制限バッファー(1X=20mMTris-HCl pH 8.0 、
10mM MgCl 2、100mMNaCl) 5 μl EcoRI(New England Biolabs) 100ユニット 5 μl HindIII(New England Biolabs) 100ユニット 最終反応物容量は、100 μl である。インキュベーショ
ンは、37℃で3 時間である。
olla, CA) 10μl 10X 制限バッファー(1X=20mMTris-HCl pH 8.0 、
10mM MgCl 2、100mMNaCl) 5 μl EcoRI(New England Biolabs) 100ユニット 5 μl HindIII(New England Biolabs) 100ユニット 最終反応物容量は、100 μl である。インキュベーショ
ンは、37℃で3 時間である。
【０１０７】終了時、こん反応物を、等容量のTE飽和フ
ェノール(10mM Tris-HCl pH 8.0 及びEDTA) により抽出
する。遠心分離後、この水相を、等容量の(TE 飽和) フ
ェノール: クロロホルムの1:1 混合物( この" クロロホ
ルム" は、24:1の比のクロロホルム: イソアミル・アル
コール中で混合されている。) により抽出し、最後に、
この抽出物からの水相を、等容量のクロロホルムにより
抽出する。最後の水相を、(10 μl の3M酢酸ナトリウム
及び250 μl の無水エタノールを添加することにより)
エタノール沈降し、4 ℃で10分間放置し、そして最大速
度で10分間マイクロフュージ内で遠心分離する。このペ
レットを、70% エタノール中で濯ぎ、そして室温で5-10
分間乾燥させ、そして100 μl の10mM Tris-HCl(pH 8.
3) 中に再懸濁させる。
ェノール(10mM Tris-HCl pH 8.0 及びEDTA) により抽出
する。遠心分離後、この水相を、等容量の(TE 飽和) フ
ェノール: クロロホルムの1:1 混合物( この" クロロホ
ルム" は、24:1の比のクロロホルム: イソアミル・アル
コール中で混合されている。) により抽出し、最後に、
この抽出物からの水相を、等容量のクロロホルムにより
抽出する。最後の水相を、(10 μl の3M酢酸ナトリウム
及び250 μl の無水エタノールを添加することにより)
エタノール沈降し、4 ℃で10分間放置し、そして最大速
度で10分間マイクロフュージ内で遠心分離する。このペ
レットを、70% エタノール中で濯ぎ、そして室温で5-10
分間乾燥させ、そして100 μl の10mM Tris-HCl(pH 8.
3) 中に再懸濁させる。
【０１０８】ホスファターゼ反応
ベクターDNA を、ホスファターゼにより定例的に処理
し、挿入物をもたずに得られたコロニーの数を減少させ
る。ウシ腸アルカリ性ホスファターゼを、典型的に使用
するが(Sambrook et al.) 、他のホスファターゼ酵素も
本段階のために使用することができる。
し、挿入物をもたずに得られたコロニーの数を減少させ
る。ウシ腸アルカリ性ホスファターゼを、典型的に使用
するが(Sambrook et al.) 、他のホスファターゼ酵素も
本段階のために使用することができる。
【０１０９】典型的なホスファターゼ反応を、以下のよ
うに設定する: 90μl の先に記載した消化DNA 10μl の10X ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ・バッフ
ァー(1X=50mM Tris-HCl (pH 8.3)、10mM MgCl 2、1mM Z
nCl2、10mMスペルミジン(spermidine)) 1 μl (1ユニット) のウシ腸アルカリ性ホスファターゼ
(CIP, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) インキュベーションは、37℃で1 時間である。
うに設定する: 90μl の先に記載した消化DNA 10μl の10X ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ・バッフ
ァー(1X=50mM Tris-HCl (pH 8.3)、10mM MgCl 2、1mM Z
nCl2、10mMスペルミジン(spermidine)) 1 μl (1ユニット) のウシ腸アルカリ性ホスファターゼ
(CIP, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) インキュベーションは、37℃で1 時間である。
【０１１０】次にこのDNA を、(1% 低ゲル化温度(LGT)
のアガロース・ゲル上で) ゲル精製し、そしてそのペレ
ットを、50μl TE中で再懸濁させた。電気泳動後、適当
なバンドを、レーザー・ブレードを使用してそのゲルか
ら切除し、65℃で5 分間融解し、そしてTEにより1:1 に
希釈した。この溶液を、フェノールにより2 回、上記の
フェノール: クロロホルム混合物により1 回、そしてク
ロロホルムにより1回抽出する。最終水相をエタノール
沈降させ、そしてTEバッファー中で再懸濁させる。
のアガロース・ゲル上で) ゲル精製し、そしてそのペレ
ットを、50μl TE中で再懸濁させた。電気泳動後、適当
なバンドを、レーザー・ブレードを使用してそのゲルか
ら切除し、65℃で5 分間融解し、そしてTEにより1:1 に
希釈した。この溶液を、フェノールにより2 回、上記の
フェノール: クロロホルム混合物により1 回、そしてク
ロロホルムにより1回抽出する。最終水相をエタノール
沈降させ、そしてTEバッファー中で再懸濁させる。
【０１１１】結合:合成遺伝子の断片をベクター中に結
合させるために、以下の条件を典型的に使用する。5 μ
l のリン酸化挿入DNA 、2 μl のホスファターゼ処理Ec
oRI/HindIII 消化Bluescriptベクターであって65℃で5
分間加熱し、そして次に冷却したもの、1 μl 10X リガ
ーゼ・バッファー(1X バッファー=30mM Tris-HCl (pH
7.8)、10mM MgCl 2、10mM DTT、1mM ATP)、1 μl BSA(1
mg/ml) 、1 μl リガーゼ(3ユニット、Promega, Madiso
n, Wisc.)、リガーゼ反応を、典型的に、16℃で一夜、
又は2 時間室温においてインキュベートする。
合させるために、以下の条件を典型的に使用する。5 μ
l のリン酸化挿入DNA 、2 μl のホスファターゼ処理Ec
oRI/HindIII 消化Bluescriptベクターであって65℃で5
分間加熱し、そして次に冷却したもの、1 μl 10X リガ
ーゼ・バッファー(1X バッファー=30mM Tris-HCl (pH
7.8)、10mM MgCl 2、10mM DTT、1mM ATP)、1 μl BSA(1
mg/ml) 、1 μl リガーゼ(3ユニット、Promega, Madiso
n, Wisc.)、リガーゼ反応を、典型的に、16℃で一夜、
又は2 時間室温においてインキュベートする。
【０１１２】形質転換:大腸菌(E.coli)中への結合DNA
断片の形質転換を、先に記載したような標準的な手順(S
ambrook et al.) を使用して行う。 組換細胞の同定 形質転換プレートの一夜のインキュベーションから生じ
た白色又は明るい青色のコロニーを選択した。この形質
転換細胞内のプラスミドを標準的なミニ- スクリーン手
順(Sambrook et al.) 又は先に記載したようなものを使
用して特徴ずけする。以下に列記する3 つの手順の中の
1 つは、典型的に、 (1) 沸騰DNA ミニ調製方法(boiling DNA miniprep meth
od) (2)PCRミニスクリーン (3) 酢酸アンモニウムミニ調製 を使用している。
断片の形質転換を、先に記載したような標準的な手順(S
ambrook et al.) を使用して行う。 組換細胞の同定 形質転換プレートの一夜のインキュベーションから生じ
た白色又は明るい青色のコロニーを選択した。この形質
転換細胞内のプラスミドを標準的なミニ- スクリーン手
順(Sambrook et al.) 又は先に記載したようなものを使
用して特徴ずけする。以下に列記する3 つの手順の中の
1 つは、典型的に、 (1) 沸騰DNA ミニ調製方法(boiling DNA miniprep meth
od) (2)PCRミニスクリーン (3) 酢酸アンモニウムミニ調製 を使用している。
【０１１３】第一クオーターを含むと信じられている組
換えプラスミドの制限消化は、以下のように設定され
る: (a)Bam HI/Aat II消化:10 μl DNA + 10μl 1X New Eng
land Biolabs制限酵素バッファー4 、 0.5 μl Bam HI (10ユニット) 、 0.5 μl Aat HI (10ユニット) 、 インキュベーションは、37℃で2 時間である。
換えプラスミドの制限消化は、以下のように設定され
る: (a)Bam HI/Aat II消化:10 μl DNA + 10μl 1X New Eng
land Biolabs制限酵素バッファー4 、 0.5 μl Bam HI (10ユニット) 、 0.5 μl Aat HI (10ユニット) 、 インキュベーションは、37℃で2 時間である。
【０１１４】所望の制限パターンをもつものとして同定
されたクローンを、別々の反応においてPvuII 及びBglI
I により消化する。3 つの酵素消化のすべてによる所望
の制限パターンをもつクローンのみを、さらに配列決定
について行う。 クローン化遺伝子断片の配列決定:配列決定を、Sequena
se 2 キット(United States Biochemical Corp., Cleve
land, OH)による2 本鎖DNA を使用するSanger'sのジデ
オキシ連鎖停止法(Sanger's dideoxy chain terminatio
n method)(Sambrook et al.) を使用して行う。すべて
の中で、6 つの第一クオーター・クローンを配列決定す
る。この配列決定されたクローンの中で、2 つのクロー
ンであってpQA1及びpQA5と命名されたもののみが、それ
ぞれたった1 つの欠失を含むことが見つかっている。こ
れらの欠失は、それぞれ、pQA1内の452 位及びpQA5内の
297 位において配置された1 つの塩基対のものである。
プラスミドpQA1を、( 以下に記載するような)pP1-8と共
に使用して。期待される配列をもつ第一クオーターを得
る。
されたクローンを、別々の反応においてPvuII 及びBglI
I により消化する。3 つの酵素消化のすべてによる所望
の制限パターンをもつクローンのみを、さらに配列決定
について行う。 クローン化遺伝子断片の配列決定:配列決定を、Sequena
se 2 キット(United States Biochemical Corp., Cleve
land, OH)による2 本鎖DNA を使用するSanger'sのジデ
オキシ連鎖停止法(Sanger's dideoxy chain terminatio
n method)(Sambrook et al.) を使用して行う。すべて
の中で、6 つの第一クオーター・クローンを配列決定す
る。この配列決定されたクローンの中で、2 つのクロー
ンであってpQA1及びpQA5と命名されたもののみが、それ
ぞれたった1 つの欠失を含むことが見つかっている。こ
れらの欠失は、それぞれ、pQA1内の452 位及びpQA5内の
297 位において配置された1 つの塩基対のものである。
プラスミドpQA1を、( 以下に記載するような)pP1-8と共
に使用して。期待される配列をもつ第一クオーターを得
る。
【０１１５】例2B: 第二クオーター[ 塩基対531 〜105
0] の合成及びクローニング テンプレート: オリゴマーU8-U14及びL8-L14 PCR プライマー: 前進: P3(a):5'-GCTGCGCGAC GTCAGCGTGT TCGG-3' P3(b):5'-AATTGCTGCG CGACGTCAGC GTG-3' 復帰: P4(a):5'-GGCGTTGCCC ATGGTGCCGT ACAGG-3' P4(b):5'-AGCTGGCGT TGCCCATGGT GCCG-3' プライマー対B1:P3(b)+P4(a) プライマー対B2:P3(a)+P4(b)
0] の合成及びクローニング テンプレート: オリゴマーU8-U14及びL8-L14 PCR プライマー: 前進: P3(a):5'-GCTGCGCGAC GTCAGCGTGT TCGG-3' P3(b):5'-AATTGCTGCG CGACGTCAGC GTG-3' 復帰: P4(a):5'-GGCGTTGCCC ATGGTGCCGT ACAGG-3' P4(b):5'-AGCTGGCGT TGCCCATGGT GCCG-3' プライマー対B1:P3(b)+P4(a) プライマー対B2:P3(a)+P4(b)
【０１１６】PCR 生成物
B1 AATTGCTGCG AACGCC (524塩基対) 第二ク
オーター B2 GCTGCG AACGCCAGCT(524塩基対) 第二ク
オーター。 EcoRI/HindIII により消化されたBluescript内の上記DN
A 断片の、ハイブリダイゼーション、PCR 増幅、スピン
・カラム・サイズ分画(spin columnsize fractionatio
n)、及びクローニングを、第一クオーターについて先に
記載( 例2A) したように行う。本クオーターのPCR 生成
物は、サイズ約529 塩基対であって本遺伝子の第二クオ
ーター( ヌクレオチド531 〜1050) を代表する。形質転
換は、先に記載した標準的な手順(Sambrook et al.) を
使用して凍結コンピテント大腸菌(E.coli)細胞(DH5アル
ファ) 中へのものである。
オーター B2 GCTGCG AACGCCAGCT(524塩基対) 第二ク
オーター。 EcoRI/HindIII により消化されたBluescript内の上記DN
A 断片の、ハイブリダイゼーション、PCR 増幅、スピン
・カラム・サイズ分画(spin columnsize fractionatio
n)、及びクローニングを、第一クオーターについて先に
記載( 例2A) したように行う。本クオーターのPCR 生成
物は、サイズ約529 塩基対であって本遺伝子の第二クオ
ーター( ヌクレオチド531 〜1050) を代表する。形質転
換は、先に記載した標準的な手順(Sambrook et al.) を
使用して凍結コンピテント大腸菌(E.coli)細胞(DH5アル
ファ) 中へのものである。
【０１１７】pQB クローンのミニスクリーン:ミニ調製D
NA を、先に記載したように調製し、そして(a)AatII/Nc
oI 、(b)PvuII及び(c)BglI により消化し、配列決定の
前にベクター内の構造挿入物について確認する。配列決
定を、Sanger(Sambrook et al.) のジデオキシ法を使用
して先に記載したように行う。本クオーターの13クロー
ンの全てを、配列決定する。第二クオーターは、884と8
87 位の間に1 以上の欠失を一貫して含む。ほとんどの
場合において、884 位のG が欠失している。
NA を、先に記載したように調製し、そして(a)AatII/Nc
oI 、(b)PvuII及び(c)BglI により消化し、配列決定の
前にベクター内の構造挿入物について確認する。配列決
定を、Sanger(Sambrook et al.) のジデオキシ法を使用
して先に記載したように行う。本クオーターの13クロー
ンの全てを、配列決定する。第二クオーターは、884と8
87 位の間に1 以上の欠失を一貫して含む。ほとんどの
場合において、884 位のG が欠失している。
【０１１８】プラスミドpQB5は、884 位においてたった
1 つの欠失をもっていた。この領域は、2 つのSacII 部
位(859と949 位) の間に横たわっている。この欠失を正
したものを例3 中に記載する。
1 つの欠失をもっていた。この領域は、2 つのSacII 部
位(859と949 位) の間に横たわっている。この欠失を正
したものを例3 中に記載する。
【０１１９】第一半分(1-1050 塩基対) のクローン
1 本鎖DNA 断片としての合成Btメイズ遺伝子の第一半分
( クオーター1 及び2)をクローニングするための断片
を、PCR 反応生成物であって第一クオーター及び第二ク
オーターを含んで成るものの制限消化により得る。制限
エンドヌクレアーゼAatII を、20μl 反応において( フ
ェノール抽出及びエタノール沈降後に)DNAを切断するた
めに使用する。それぞれのAatII 消化クオーターの15μ
l を混合し、そして室温において2 時間、(5μl の10X
リガーゼ・バッファー(1X=30mM Tris-HCl pH 7.8、10mM
MgCl 2 、10mM DTT、1mM ATP)、14μl の脱イオン水
及び1μl のT4 DNAリガーゼ、3 ユニット、Progema, Ma
dison, WIを添加することにより、50μl 容量中で) 結
合する。結果物は、標準的な条件(Sambrook et al.)を
使用して走らせた1%アガロース・ゲル上の電気泳動によ
り判断されるような約1kb の断片である。10μl の結合
生成物を、先に記載した条件を使用してPCR により増幅
する。但し、５サイクルのみを走らせた。 プライマー対:HA=P1(a)+P4(b) プライマー対:HB=P1(b)+P4(a) 。
( クオーター1 及び2)をクローニングするための断片
を、PCR 反応生成物であって第一クオーター及び第二ク
オーターを含んで成るものの制限消化により得る。制限
エンドヌクレアーゼAatII を、20μl 反応において( フ
ェノール抽出及びエタノール沈降後に)DNAを切断するた
めに使用する。それぞれのAatII 消化クオーターの15μ
l を混合し、そして室温において2 時間、(5μl の10X
リガーゼ・バッファー(1X=30mM Tris-HCl pH 7.8、10mM
MgCl 2 、10mM DTT、1mM ATP)、14μl の脱イオン水
及び1μl のT4 DNAリガーゼ、3 ユニット、Progema, Ma
dison, WIを添加することにより、50μl 容量中で) 結
合する。結果物は、標準的な条件(Sambrook et al.)を
使用して走らせた1%アガロース・ゲル上の電気泳動によ
り判断されるような約1kb の断片である。10μl の結合
生成物を、先に記載した条件を使用してPCR により増幅
する。但し、５サイクルのみを走らせた。 プライマー対:HA=P1(a)+P4(b) プライマー対:HB=P1(b)+P4(a) 。
【０１２０】これらの反応の生成物を、個々のクオータ
ーについて記載するようにBluescript(Stratagene, La
Jolla, CA)中にクローン化する。この手順を、1 回だけ
行い、すなわち、DNA 挿入物のすべてを、単一のPCR 反
応からの特定の領域内で得る。
ーについて記載するようにBluescript(Stratagene, La
Jolla, CA)中にクローン化する。この手順を、1 回だけ
行い、すなわち、DNA 挿入物のすべてを、単一のPCR 反
応からの特定の領域内で得る。
【０１２１】36のコロニーを、SalI消化及びPvuII 消化
によりミニスクリーンする。4 つを除くすべてのクロー
ンは、サイズ約1kb の挿入物を含み、その中の少なくと
も2020は、正しいPvuII 消化パターンを含む。このクロ
ーン、P1-8の中の1 つは、EcoNI 部位(396塩基対) とDr
aIII部位(640塩基対) との間の所望の配列をもってい
る。このクローンを、pQA1( 先に記載した452 塩基対位
における欠失をもつ第一クオーター) と共に第二クオー
ター内のDraIII部位(640塩基対) までの所望の配列をも
つプラスミドを得るために使用する。
によりミニスクリーンする。4 つを除くすべてのクロー
ンは、サイズ約1kb の挿入物を含み、その中の少なくと
も2020は、正しいPvuII 消化パターンを含む。このクロ
ーン、P1-8の中の1 つは、EcoNI 部位(396塩基対) とDr
aIII部位(640塩基対) との間の所望の配列をもってい
る。このクローンを、pQA1( 先に記載した452 塩基対位
における欠失をもつ第一クオーター) と共に第二クオー
ター内のDraIII部位(640塩基対) までの所望の配列をも
つプラスミドを得るために使用する。
【０１２２】例2C: 第三クオーター[ 塩基対1021〜150
0] のクローニング及び合成 テンプレート: オリゴU15-U20 及びL15-L21 PCR プライマー: 前進 P5(a):5'-TTCCCCCTGT ACGGCACCAT GGGCAACGCC GC-3' P5(b):5'-AATTGTACGG CACCATGGGC AAC-3' 復帰: P6(a):5'-GAAGCCGGGG CCCTTCACCA CGCTGG-3' P6(b):5'-AGCTGAAGCC GGGGCCCTTC ACC-3' プライマー対C1:P5(b)+P6(a) プライマー対C2:P5(a)+P6(b)
0] のクローニング及び合成 テンプレート: オリゴU15-U20 及びL15-L21 PCR プライマー: 前進 P5(a):5'-TTCCCCCTGT ACGGCACCAT GGGCAACGCC GC-3' P5(b):5'-AATTGTACGG CACCATGGGC AAC-3' 復帰: P6(a):5'-GAAGCCGGGG CCCTTCACCA CGCTGG-3' P6(b):5'-AGCTGAAGCC GGGGCCCTTC ACC-3' プライマー対C1:P5(b)+P6(a) プライマー対C2:P5(a)+P6(b)
【０１２３】PCR 生成物
C1 AATTGTACGG GGCTTC (475塩基対) 第三ク
オーター C2 TTCCCCTGTACGG GGCTTCAGCT(484塩基対) 第三ク
オーター。 PCR 反応、正確なサイズのDNA 断片のスピン・カラム回
収、及びベクター中への結合を、EcoRI/HindIII により
切断されたBluescriptベクターを使用して先に記載した
ように( 例2A) 行う。約479 塩基対のPCR 生成物は、合
成遺伝子の第三クオーターを現している(ヌクレオチド1
021〜1500) 。凍結コンピテント大腸菌(E.coli)株DH5
アルファ細胞中への形質転換、形質転換細胞の選択及び
同定、ミニ- スクリーン生成物による形質転換細胞の特
徴ずけ、及びそのベクター内の合成遺伝子断片の配列決
定は、先に記載したものとすべて同じである。
オーター C2 TTCCCCTGTACGG GGCTTCAGCT(484塩基対) 第三ク
オーター。 PCR 反応、正確なサイズのDNA 断片のスピン・カラム回
収、及びベクター中への結合を、EcoRI/HindIII により
切断されたBluescriptベクターを使用して先に記載した
ように( 例2A) 行う。約479 塩基対のPCR 生成物は、合
成遺伝子の第三クオーターを現している(ヌクレオチド1
021〜1500) 。凍結コンピテント大腸菌(E.coli)株DH5
アルファ細胞中への形質転換、形質転換細胞の選択及び
同定、ミニ- スクリーン生成物による形質転換細胞の特
徴ずけ、及びそのベクター内の合成遺伝子断片の配列決
定は、先に記載したものとすべて同じである。
【０１２４】pQC クローンのミニスクリーン:第三クオ
ーターを、標準的な手順(Sambrook et al.) を使用して
ミニスクリーンする。ミニ調製DNA を、(a)NcoI/ApaI及
び(b)PvuIIにより切断する。正しい制限消化パターンを
含むクローンを、標準的な手順を使用して配列決定す
る。第三クオーターの22クローンの全てを、配列決定す
る。第三クオーター内の3 つの主要な欠失" ホットスポ
ット" を、(a)1083 位、(b)1290-1397位の間、及び(c)1
356-1362位の間において同定する。1 つ、すなわちpQC8
を除いてすべてのクローンにおいて、1365位においてC
の挿入がこれもまた一貫してある。これらの突然変異の
付加において、この第三クオーターは、多数の他の明ら
かにランダムな欠失を含む。第三クオーター内の3 つの
突然変異性" ホットスポット" 及び第二クオーター内の
1 つのものに対する共通要素は、約80%C+Gである配列に
よるいずれかの側上にこれらの領域が全て隣接している
とういことである。列内に5 〜9 のC-G を含む他の領域
は、影響されていない。U15 、U16 、U18 、U19 、L15
、L16、L18 及びL19 内のオリゴマーは、これらの領域
内の C+G含量を減少させるように再設計されている。修
飾されたオリゴマーを使用したPCR 反応からのそれぞれ
の5 つのクローンを、配列決定する。
ーターを、標準的な手順(Sambrook et al.) を使用して
ミニスクリーンする。ミニ調製DNA を、(a)NcoI/ApaI及
び(b)PvuIIにより切断する。正しい制限消化パターンを
含むクローンを、標準的な手順を使用して配列決定す
る。第三クオーターの22クローンの全てを、配列決定す
る。第三クオーター内の3 つの主要な欠失" ホットスポ
ット" を、(a)1083 位、(b)1290-1397位の間、及び(c)1
356-1362位の間において同定する。1 つ、すなわちpQC8
を除いてすべてのクローンにおいて、1365位においてC
の挿入がこれもまた一貫してある。これらの突然変異の
付加において、この第三クオーターは、多数の他の明ら
かにランダムな欠失を含む。第三クオーター内の3 つの
突然変異性" ホットスポット" 及び第二クオーター内の
1 つのものに対する共通要素は、約80%C+Gである配列に
よるいずれかの側上にこれらの領域が全て隣接している
とういことである。列内に5 〜9 のC-G を含む他の領域
は、影響されていない。U15 、U16 、U18 、U19 、L15
、L16、L18 及びL19 内のオリゴマーは、これらの領域
内の C+G含量を減少させるように再設計されている。修
飾されたオリゴマーを使用したPCR 反応からのそれぞれ
の5 つのクローンを、配列決定する。
【０１２５】プラスミドpQCN103 は、1326位における変
更を除き第三クオーターについての正しい配列をもって
いる。G をC と置換するこの変更は、1 つのアミノ酸(
ロイシン) を元のもの( フェニルアラニン)と置き換え
ることをもたらす。
更を除き第三クオーターについての正しい配列をもって
いる。G をC と置換するこの変更は、1 つのアミノ酸(
ロイシン) を元のもの( フェニルアラニン)と置き換え
ることをもたらす。
【０１２６】例2D: 第四クオーター[ 塩基対1480〜196
0] の合成及びクローニング この遺伝子の第四クオーターを、その遺伝子の第三及び
第四クオーターを含んで成るように元々設計されている
クローンから得る。合成遺伝子の" 第二半分"を、PCR
反応から得て、第三及び第四クオーターを融合する。こ
れらの反応を、第三クオーターのために先に記載したPC
R プライマーP5(a) 及びP6(a) 並びにプライマーP7(a)
及びP8(a)(以下に記載する) と共に走らせる。復帰プラ
イマーを、SacI部位及び終止コドンを含むように修飾す
る。それぞれのクオーターのための別個の反応を、先に
記載した条件を使用して30サイクルにわたり走らせる。
この2 つのクオーターを、PCR を重複させることにより
一緒に結合し、そしてその後、制限酵素NcoI及びSacIに
より消化する。得られた953 塩基対断片を、pCIB3054で
あってNcoI/SacI により切断されそしてアルカリ性ホス
ファターゼにより処理されているものの中に直接的にク
ローン化する。
0] の合成及びクローニング この遺伝子の第四クオーターを、その遺伝子の第三及び
第四クオーターを含んで成るように元々設計されている
クローンから得る。合成遺伝子の" 第二半分"を、PCR
反応から得て、第三及び第四クオーターを融合する。こ
れらの反応を、第三クオーターのために先に記載したPC
R プライマーP5(a) 及びP6(a) 並びにプライマーP7(a)
及びP8(a)(以下に記載する) と共に走らせる。復帰プラ
イマーを、SacI部位及び終止コドンを含むように修飾す
る。それぞれのクオーターのための別個の反応を、先に
記載した条件を使用して30サイクルにわたり走らせる。
この2 つのクオーターを、PCR を重複させることにより
一緒に結合し、そしてその後、制限酵素NcoI及びSacIに
より消化する。得られた953 塩基対断片を、pCIB3054で
あってNcoI/SacI により切断されそしてアルカリ性ホス
ファターゼにより処理されているものの中に直接的にク
ローン化する。
【０１２７】pCIB3054を、pCIB246(例4 中に詳細に記載
する) のユニークHpaI部位内にPEPカルボキシラーゼの
イントロン#9(PEPC ivs #9) を挿入することにより構築
する。pCIB246 をHpaIにより切断し、そして例2A中に記
載する標準的な手順を使用してCIP によりホスファター
ゼ処理する。PEPC ivs #9 を、テンプレートとしてpPEP
-10 を使用したPCR により得る。pPEP-10 は、C 4 光合
成酵素をコードしているメイズPEP カルボキシラーゼ遺
伝子の全体に加え、約2.2Kb の5'- フランキング及び1.
8Kb の3'- フランキングDNA を含むゲノムのサブクロー
ンである。この10Kb DNAを、pUC18 のHindIII 部位内で
結合させる(Hudspeth et al., Plant Molecular Biolog
y, 12:576-589 (1989)) 。PEPC ivs #9 を得るために使
用される前進PCR プライマーは、GTACAAAAACCAGCAACTC
であり、そして復帰プライマーは、CTGCACAAAGTGGAGTAG
T である。PCR 生成物は、PEP カルボキシラーゼのイン
トロン#9配列のみを含む108 塩基対の断片である。PCR
反応物を、フェノール及びクロロホルムにより抽出し、
エタノール沈降させ、ポリヌクレオチド・キナーゼによ
りリン酸化し、そしてT4ポリメラーゼにより処理し、標
準的な手順を使用してPCR 生成物内に見つけられた3'非
テンプレート・ベースの付加(Clark, J.M.,Nucleic Aci
d Research, 16: 9677-9686 (1988))をフィル・インす
る。このキナーゼ断片は、pCIB246 のHpaI部位中に、先
に記載した標準的な手順を使用して、平滑末端クローン
化する。
する) のユニークHpaI部位内にPEPカルボキシラーゼの
イントロン#9(PEPC ivs #9) を挿入することにより構築
する。pCIB246 をHpaIにより切断し、そして例2A中に記
載する標準的な手順を使用してCIP によりホスファター
ゼ処理する。PEPC ivs #9 を、テンプレートとしてpPEP
-10 を使用したPCR により得る。pPEP-10 は、C 4 光合
成酵素をコードしているメイズPEP カルボキシラーゼ遺
伝子の全体に加え、約2.2Kb の5'- フランキング及び1.
8Kb の3'- フランキングDNA を含むゲノムのサブクロー
ンである。この10Kb DNAを、pUC18 のHindIII 部位内で
結合させる(Hudspeth et al., Plant Molecular Biolog
y, 12:576-589 (1989)) 。PEPC ivs #9 を得るために使
用される前進PCR プライマーは、GTACAAAAACCAGCAACTC
であり、そして復帰プライマーは、CTGCACAAAGTGGAGTAG
T である。PCR 生成物は、PEP カルボキシラーゼのイン
トロン#9配列のみを含む108 塩基対の断片である。PCR
反応物を、フェノール及びクロロホルムにより抽出し、
エタノール沈降させ、ポリヌクレオチド・キナーゼによ
りリン酸化し、そしてT4ポリメラーゼにより処理し、標
準的な手順を使用してPCR 生成物内に見つけられた3'非
テンプレート・ベースの付加(Clark, J.M.,Nucleic Aci
d Research, 16: 9677-9686 (1988))をフィル・インす
る。このキナーゼ断片は、pCIB246 のHpaI部位中に、先
に記載した標準的な手順を使用して、平滑末端クローン
化する。
【０１２８】第四クオーターの増幅及び組み立て
テンプレート: U21-U26 及びL22-L28
PCR プライマー:
前進
P7(a):5'-TGGTGAAGGG CCCCGGCTTC ACCGG-3'
復帰:
P8(a):5'-ATCATCGATG AGCTCCTACA CCTGATCGAT GTGGTA-
3' プライマー対4:P7(a)+P8(a) プライマー対3:P5(a)+P6(a) 重複PCR のためのプライマー対:P7(a)+P8(a)PCR 生成物 第四クオーター:GGTGAA ATCAGGAGCTCATCGATGAT(4
84塩基対) 第三クオーター:TTCCCCCTGTA---------TTCACCGG(484 塩
基対) 第二半分:GGTGAA---------CATGATGAT(953 塩基対) 4 つの陽性クローンを、プラスミド・ミニスクリーンに
より同定し、そして次に標準的な手順を使用して配列決
定する。
3' プライマー対4:P7(a)+P8(a) プライマー対3:P5(a)+P6(a) 重複PCR のためのプライマー対:P7(a)+P8(a)PCR 生成物 第四クオーター:GGTGAA ATCAGGAGCTCATCGATGAT(4
84塩基対) 第三クオーター:TTCCCCCTGTA---------TTCACCGG(484 塩
基対) 第二半分:GGTGAA---------CATGATGAT(953 塩基対) 4 つの陽性クローンを、プラスミド・ミニスクリーンに
より同定し、そして次に標準的な手順を使用して配列決
定する。
【０１２９】プラスミドBt.P2#1 は、2 つの突然変異を
除きおおよそ正しい第四クオーター配列を含んでいる。
これらの突然変異は、1523位におけるもの(AをG に置換
しており、His をArg に置換するアミノ酸の変更をもた
らすもの) 、そして1634位におけるもの(TをC に置換し
ており、Ser のThr へのアミノ酸の置換をもたらすも
の) である。
除きおおよそ正しい第四クオーター配列を含んでいる。
これらの突然変異は、1523位におけるもの(AをG に置換
しており、His をArg に置換するアミノ酸の変更をもた
らすもの) 、そして1634位におけるもの(TをC に置換し
ており、Ser のThr へのアミノ酸の置換をもたらすも
の) である。
【０１３０】プラスミドBt.P2#1 は、以下に記載するpC
IB4414の構築において使用される。( この間違えは、第
四クオーターのいすべてのオリゴのハイブリダイゼーシ
ョン、ApaI/Bst E II による消化及びpCIB4414内のその
領域の置き換えにより最終的に訂正される。それ故、18
42-1960 位からの配列のみがその最終構築物内のBt.P2#
1 を有して残る。)
IB4414の構築において使用される。( この間違えは、第
四クオーターのいすべてのオリゴのハイブリダイゼーシ
ョン、ApaI/Bst E II による消化及びpCIB4414内のその
領域の置き換えにより最終的に訂正される。それ故、18
42-1960 位からの配列のみがその最終構築物内のBt.P2#
1 を有して残る。)
【０１３１】例3:最後の合成遺伝子の組み立て及び修復
合成メイズ最適化Bt cryIA(b) 遺伝子を、クオーター内
でクローン化されるべく設計する。しかしながら、PCR
技術を使用して、突然変異であって殆どの場合にフレー
ム・シフトをもたらす欠失となるものをもたらす。個々
のクオーターを含むプラスミドを、それ故、配列決定
し、そして正しい部分を、標準的な手順を使用して一緒
に結合する。
でクローン化されるべく設計する。しかしながら、PCR
技術を使用して、突然変異であって殆どの場合にフレー
ム・シフトをもたらす欠失となるものをもたらす。個々
のクオーターを含むプラスミドを、それ故、配列決定
し、そして正しい部分を、標準的な手順を使用して一緒
に結合する。
【０１３２】殆どの所望の配列をもつ第一及び第二クオ
ーターを得た後、プラスミドpEB1Q#4 及びpEB1Q#5 を、
構築し、その塩基対634 においてDraIII部位までの合成
Bt遺伝子の所望の配列を得るために構築する( この突然
変異は、このDraIII部位を破壊する。) 。このpEB1Q 構
築物を、pP1-8 からの3.9kb Eco NI/Bam HI 断片とpQA1
からの400 塩基対の断片とを結合させることにより、作
る。pEB1Q#5 は、DraIII部位までの所望の配列をもつ
が、pEB1Q#4 は、塩基対位378 における突然変異をもっ
ている。
ーターを得た後、プラスミドpEB1Q#4 及びpEB1Q#5 を、
構築し、その塩基対634 においてDraIII部位までの合成
Bt遺伝子の所望の配列を得るために構築する( この突然
変異は、このDraIII部位を破壊する。) 。このpEB1Q 構
築物を、pP1-8 からの3.9kb Eco NI/Bam HI 断片とpQA1
からの400 塩基対の断片とを結合させることにより、作
る。pEB1Q#5 は、DraIII部位までの所望の配列をもつ
が、pEB1Q#4 は、塩基対位378 における突然変異をもっ
ている。
【０１３３】プラスミドp1H1M4及びp1H1M5を構築し、pE
B1Q#4 及びpEB1Q#5 内のDraIII部位を修復する。プラス
ミドpEB1Q#4 及びpEB1Q#5 を、pEB1Q#4 及びpEB1Q#5 の
それぞれからの3.5Kb Nco I/Aat II断片を結合すること
により作る。プラスミドp1H1M5は、合成Bt遺伝子の第二
クオーター内の884 位におけるSacII 部位間の突然変異
を含む。プラスミドp1H1M4は、その前駆体構築物pEB1Q#
4 内に記載したような追加の突然変異を含む。
B1Q#4 及びpEB1Q#5 内のDraIII部位を修復する。プラス
ミドpEB1Q#4 及びpEB1Q#5 を、pEB1Q#4 及びpEB1Q#5 の
それぞれからの3.5Kb Nco I/Aat II断片を結合すること
により作る。プラスミドp1H1M5は、合成Bt遺伝子の第二
クオーター内の884 位におけるSacII 部位間の突然変異
を含む。プラスミドp1H1M4は、その前駆体構築物pEB1Q#
4 内に記載したような追加の突然変異を含む。
【０１３４】p1H1M4のBluescriptベクター領域内のSacI
I 部位を、Not I 及びSac I によるp1H1M4の切断し、そ
してこれらの部位をT4 DNAポリメラーゼを使用して、p1
H1M4Sを作るためのの3.9Kb 断片を結合させる前に標準
的な条件下で変換させることにより欠失させる。このベ
クター領域内のSacII 部位の欠失は、p1H1M4 Sの第二ク
オーター内の884 位における突然変異をもつ90塩基対の
Sac II断片が90塩基対のSac II断片との置換に先立って
除去されることを可能にする。オリゴマーU/L12 及び13
を、SacII による切断及び2%Nusieve ゲル上の90塩基対
断片の単離の前に、( 先に記載したように) キナーゼ処
理し、そしてハイブリダイズする。このSacII 断片を、
約3.8Kb のSacII 切断p1H1M4 SベクターであっってCIP
によりホスファターゼ処理されているものの中に結合す
る。この修復されたSacII 断片を、pHYB2#6 という。pH
YB2#6 内のSacII 断片の方向を、以下のプライマーを使
用して先に記載したようなPCR スクリーニングにより検
出する: MK23A28=5'-GGGGCTGCGGATGCTGCCCT-3' MK25A28=5'-GAGCTGACCCTGACCGTGCT-3' MK26A28=5'-CACCTGATGGACATCCTGAA-3'
I 部位を、Not I 及びSac I によるp1H1M4の切断し、そ
してこれらの部位をT4 DNAポリメラーゼを使用して、p1
H1M4Sを作るためのの3.9Kb 断片を結合させる前に標準
的な条件下で変換させることにより欠失させる。このベ
クター領域内のSacII 部位の欠失は、p1H1M4 Sの第二ク
オーター内の884 位における突然変異をもつ90塩基対の
Sac II断片が90塩基対のSac II断片との置換に先立って
除去されることを可能にする。オリゴマーU/L12 及び13
を、SacII による切断及び2%Nusieve ゲル上の90塩基対
断片の単離の前に、( 先に記載したように) キナーゼ処
理し、そしてハイブリダイズする。このSacII 断片を、
約3.8Kb のSacII 切断p1H1M4 SベクターであっってCIP
によりホスファターゼ処理されているものの中に結合す
る。この修復されたSacII 断片を、pHYB2#6 という。pH
YB2#6 内のSacII 断片の方向を、以下のプライマーを使
用して先に記載したようなPCR スクリーニングにより検
出する: MK23A28=5'-GGGGCTGCGGATGCTGCCCT-3' MK25A28=5'-GAGCTGACCCTGACCGTGCT-3' MK26A28=5'-CACCTGATGGACATCCTGAA-3'
【０１３５】プライマーMK23A28 及びMK25A28 の50ピコ
モルによりPCR 反応を走らせることは、約180 塩基対の
断片を作り、pHYB2#6 内のSacII 部位により結合される
挿入断片が正しい方向にあることを示している。PCR ス
クリーニングにおけるプライマーMK25A28 及びMK26A28
は、陰性対照として作用し、間違った方向のSacII 結合
断片を含む構築物内にのみ約180 塩基対の断片を作る。
pHYB2#6 配列を、標準的な手順を使用して決定する。pH
YB2#6 は、378 位において1 つの突然変異であって所望
の配列を含む第一クオーターを得るために修復される必
要があるものをもっている。プラスミドp1HG#6は、合成
Bt遺伝子の完全な第一半分の所望の配列を含んでいる。
p1HG#6を、pHYB2#6 からの500 塩基対のAat II/NcoI 断
片に結合されたp1HM5#2 の3.4Kb AatII/NcoI断片から作
る。
モルによりPCR 反応を走らせることは、約180 塩基対の
断片を作り、pHYB2#6 内のSacII 部位により結合される
挿入断片が正しい方向にあることを示している。PCR ス
クリーニングにおけるプライマーMK25A28 及びMK26A28
は、陰性対照として作用し、間違った方向のSacII 結合
断片を含む構築物内にのみ約180 塩基対の断片を作る。
pHYB2#6 配列を、標準的な手順を使用して決定する。pH
YB2#6 は、378 位において1 つの突然変異であって所望
の配列を含む第一クオーターを得るために修復される必
要があるものをもっている。プラスミドp1HG#6は、合成
Bt遺伝子の完全な第一半分の所望の配列を含んでいる。
p1HG#6を、pHYB2#6 からの500 塩基対のAat II/NcoI 断
片に結合されたp1HM5#2 の3.4Kb AatII/NcoI断片から作
る。
【０１３６】オープン・リーディング・フレームを含む
合成遺伝子のクローン又は部分クローンを同定するため
に、( 先に記載したような) カナマイシン選択ベクター
を使用する。合成Bt遺伝子の第四クオーターを、カナマ
イシン・カセット中に最初に入れる。pKM74-4 は、ApaI
/ClaI により切断されたpUC:KM74に結合されている、プ
ラスミドBtP2からの約500 塩基対のAraI/ClaI 断片( こ
れは、ClaIにより切断されることができるように、先に
dam-大腸菌(E.coli)株(PO-100)中に形質転換されてい
る) を含む。プラスミドpKM74-4 は、カナマイシン抵抗
性を示すが、後に1523及び1634位において2 つの置換突
然変異を含むことが見つかっている( 突然変異は、第四
クオーターのクローニングについてのセクション内で先
に記載されており; それらは、置換であり、欠失又は挿
入ではない。) 。
合成遺伝子のクローン又は部分クローンを同定するため
に、( 先に記載したような) カナマイシン選択ベクター
を使用する。合成Bt遺伝子の第四クオーターを、カナマ
イシン・カセット中に最初に入れる。pKM74-4 は、ApaI
/ClaI により切断されたpUC:KM74に結合されている、プ
ラスミドBtP2からの約500 塩基対のAraI/ClaI 断片( こ
れは、ClaIにより切断されることができるように、先に
dam-大腸菌(E.coli)株(PO-100)中に形質転換されてい
る) を含む。プラスミドpKM74-4 は、カナマイシン抵抗
性を示すが、後に1523及び1634位において2 つの置換突
然変異を含むことが見つかっている( 突然変異は、第四
クオーターのクローニングについてのセクション内で先
に記載されており; それらは、置換であり、欠失又は挿
入ではない。) 。
【０１３７】プラスミドp1HG#6からの合成Bt遺伝子の正
しい第一半分を、プラスミドpKM74-4 中に挿入する。pK
m124という得られたプラスミドを、p1HG#6からの1Kb の
ApaI/BamHI断片に結合されているpKM74-4 から得られた
約3.9Kb のApaI/BamHI断片から作る。pKm124は、カナマ
イシン抵抗性を示す。このプラスミドは、合成遺伝子の
第一、第二、及び第四クオーターを含み単一のオープン
・リーディング・フレームを形成する。
しい第一半分を、プラスミドpKM74-4 中に挿入する。pK
m124という得られたプラスミドを、p1HG#6からの1Kb の
ApaI/BamHI断片に結合されているpKM74-4 から得られた
約3.9Kb のApaI/BamHI断片から作る。pKm124は、カナマ
イシン抵抗性を示す。このプラスミドは、合成遺伝子の
第一、第二、及び第四クオーターを含み単一のオープン
・リーディング・フレームを形成する。
【０１３８】合成遺伝子の第三クオーターを、次に、pK
M124中にクローン化する。プラスミドpBt:Km#6内の第一
の機能的クローンは、Km- カセットであってカナマイシ
ン抵抗性を示すが第三と第四クオーターとの間の欠失突
然変異を含むものの中の切り詰められた合成cryIA(b)遺
伝子の機能的コピーである。プラスミドpBt:Km#6を、pQ
CN103 からの約500 塩基対のApaI/NcoI 断片に結合され
ている約5Kb のApaI/NcoI 124 ベクター断片から得る(
pQCN103 は、その後に修復される1326位におけるミスマ
ッチ突然変異を含んでいる。) 。ヌクレアーゼ活性の汚
染がpBt:Km#6内の第三と第四クオーターとの間のApaI部
位を欠失させたようである。プラスミドpBT:Km#6内の合
成遺伝子によりコードされているBt遺伝子は、ECB に対
する生来の蛋白の活性の約50-60%をもっている。pBT:Km
#6からの2Kb SmaI/BamHI断片を、35S:Bt6 といわれるプ
ラスミドを作るために35S:発現カセット中に挿入する。
M124中にクローン化する。プラスミドpBt:Km#6内の第一
の機能的クローンは、Km- カセットであってカナマイシ
ン抵抗性を示すが第三と第四クオーターとの間の欠失突
然変異を含むものの中の切り詰められた合成cryIA(b)遺
伝子の機能的コピーである。プラスミドpBt:Km#6を、pQ
CN103 からの約500 塩基対のApaI/NcoI 断片に結合され
ている約5Kb のApaI/NcoI 124 ベクター断片から得る(
pQCN103 は、その後に修復される1326位におけるミスマ
ッチ突然変異を含んでいる。) 。ヌクレアーゼ活性の汚
染がpBt:Km#6内の第三と第四クオーターとの間のApaI部
位を欠失させたようである。プラスミドpBT:Km#6内の合
成遺伝子によりコードされているBt遺伝子は、ECB に対
する生来の蛋白の活性の約50-60%をもっている。pBT:Km
#6からの2Kb SmaI/BamHI断片を、35S:Bt6 といわれるプ
ラスミドを作るために35S:発現カセット中に挿入する。
【０１３９】それぞれ突然変異をもつ、2 つの機能的な
合成Btクローン:pBT:KM#6 及びpCIB4414を、最初に得
る。生来の遺伝子に比べて欧州トウモロコシ穿孔性動物
に対する昆虫生物検定内で100%の活性をもつpCIB4414
は、1323、1523、及び1634位において第三及び第四クオ
ーター内に置換突然変異を含む。
合成Btクローン:pBT:KM#6 及びpCIB4414を、最初に得
る。生来の遺伝子に比べて欧州トウモロコシ穿孔性動物
に対する昆虫生物検定内で100%の活性をもつpCIB4414
は、1323、1523、及び1634位において第三及び第四クオ
ーター内に置換突然変異を含む。
【０１４０】pCIB4414を、先に記載したような2 つのプ
ラスミドMG3.G4#18 及び1HG から構築する。MG3.G4#18
を、プラスミドBt.P2#1 内のApaI/KpnI 断片をpQCN103
中にクローニングすることにより( 上記と同じ制限部位
を使用して) 得る。この手順は、本遺伝子の第三及び第
四クオーターを含むプラスミドを作り出す。プラスミド
1HG からの合成遺伝子の第一半分を、BamHI 及びNcoIに
より切断し、そして(本遺伝子の第三及び第四クオータ
ーを含む)MG.G4#18 中に動かす。得られたプラスミドpC
IB4414は、合成遺伝子の機能的変異体を含む。機能的で
はあるけれども、このプラスミド中の合成遺伝子は、3
つの誤り;1326 位(Cに置換されたG)、1523位(Gに置換さ
れたA)、及び1634位(Cに置換されたT)におけるものを含
んでいる。
ラスミドMG3.G4#18 及び1HG から構築する。MG3.G4#18
を、プラスミドBt.P2#1 内のApaI/KpnI 断片をpQCN103
中にクローニングすることにより( 上記と同じ制限部位
を使用して) 得る。この手順は、本遺伝子の第三及び第
四クオーターを含むプラスミドを作り出す。プラスミド
1HG からの合成遺伝子の第一半分を、BamHI 及びNcoIに
より切断し、そして(本遺伝子の第三及び第四クオータ
ーを含む)MG.G4#18 中に動かす。得られたプラスミドpC
IB4414は、合成遺伝子の機能的変異体を含む。機能的で
はあるけれども、このプラスミド中の合成遺伝子は、3
つの誤り;1326 位(Cに置換されたG)、1523位(Gに置換さ
れたA)、及び1634位(Cに置換されたT)におけるものを含
んでいる。
【０１４１】pCIB4414内の第四クオーターを、先に記載
したように第四クオーターをハイブリダイズし、結合
し、そして制限解裂することから、そして2%アガロース
・ゲルからその断片を単離することから得られた354 塩
基対の第四クオーターのApaI/Bst E II 断片と置き換え
る。pCIB4408は、pCIB4414内の第四クオーター断片をハ
イブリダイズされた第四クオーター断片と置き換えるこ
とにより得られる合成Bt遺伝子クローンである。この合
成Bt遺伝子の前にCaMV 35Sプロモーターを挿入するため
に、pCIB4406を、プラスミドp35SBt6 からの4Kb EcoNI/
Kpn I 断片から、そしてpCIB4408からの1.8Kb EcoNI/Kp
n I 断片から作る。
したように第四クオーターをハイブリダイズし、結合
し、そして制限解裂することから、そして2%アガロース
・ゲルからその断片を単離することから得られた354 塩
基対の第四クオーターのApaI/Bst E II 断片と置き換え
る。pCIB4408は、pCIB4414内の第四クオーター断片をハ
イブリダイズされた第四クオーター断片と置き換えるこ
とにより得られる合成Bt遺伝子クローンである。この合
成Bt遺伝子の前にCaMV 35Sプロモーターを挿入するため
に、pCIB4406を、プラスミドp35SBt6 からの4Kb EcoNI/
Kpn I 断片から、そしてpCIB4408からの1.8Kb EcoNI/Kp
n I 断片から作る。
【０１４２】pCIB4406は、( その生来の遺伝子からの蛋
白と比較して)ECBに対して100%活性であるがロイシンの
フェニルアラニンへのアミノ酸置換をもたらす1323位に
おける合成遺伝子の第三クオーター内の置換突然変異を
含む。プラスミドpBS123#13を、この突然変異を修復す
るために使用する。
白と比較して)ECBに対して100%活性であるがロイシンの
フェニルアラニンへのアミノ酸置換をもたらす1323位に
おける合成遺伝子の第三クオーター内の置換突然変異を
含む。プラスミドpBS123#13を、この突然変異を修復す
るために使用する。
【０１４３】プラスミドpBS123#13 内の第三断片を、約
479 塩基対のハイブリダイズされたオリゴマー生成断片
から作る。第三オリゴマーU15-U20 及びL15-L21 を、先
に記載したようにキナーゼ処理し、ハイブリダイズし、
そして結合させる。PCR 反応を、プライマーP5(a) 及び
P6(b) により15サイクルのわたり先に記載したように行
う。このPCR 生成物を、約95μl の容量中で最終濃度約
50μg/mlにおいて37℃で30分間、その後65℃で10分間プ
ロテイナーゼK により処理する(Crowe et al.,Nucleic
Acid Research 19:184, 1991.) 。次に、この生成物
を、フェノール/クロロホルム抽出し、そして制限酵素A
paI及びNcoIによる切断の前に標準的な手順を使用して
エタノール沈降させる。約450 塩基対のApaI/NcoI PCR
断片を、p1HG#6からの3.8Kb のApaI/NcoI ベクター断片
に結合させ、pBS123#13 を作る。プラスミドpBS123#13
は、そのNspI部位における1319位から1493位におけるAp
aI部位までのメイズ最適化cryIA(b)遺伝子の第三クオー
ターのための所望の配列を含む。プラスミドpBS123#13
からのこの170 塩基対のNspI/ApaI 断片を、プラスミド
pCIB4418内の完全に活性な合成cryIA(b)遺伝子内で使用
する。
479 塩基対のハイブリダイズされたオリゴマー生成断片
から作る。第三オリゴマーU15-U20 及びL15-L21 を、先
に記載したようにキナーゼ処理し、ハイブリダイズし、
そして結合させる。PCR 反応を、プライマーP5(a) 及び
P6(b) により15サイクルのわたり先に記載したように行
う。このPCR 生成物を、約95μl の容量中で最終濃度約
50μg/mlにおいて37℃で30分間、その後65℃で10分間プ
ロテイナーゼK により処理する(Crowe et al.,Nucleic
Acid Research 19:184, 1991.) 。次に、この生成物
を、フェノール/クロロホルム抽出し、そして制限酵素A
paI及びNcoIによる切断の前に標準的な手順を使用して
エタノール沈降させる。約450 塩基対のApaI/NcoI PCR
断片を、p1HG#6からの3.8Kb のApaI/NcoI ベクター断片
に結合させ、pBS123#13 を作る。プラスミドpBS123#13
は、そのNspI部位における1319位から1493位におけるAp
aI部位までのメイズ最適化cryIA(b)遺伝子の第三クオー
ターのための所望の配列を含む。プラスミドpBS123#13
からのこの170 塩基対のNspI/ApaI 断片を、プラスミド
pCIB4418内の完全に活性な合成cryIA(b)遺伝子内で使用
する。
【０１４４】ウェスタン・ブロット分析:様々な形質転
換細胞のウェスタン・ブロット分析を、選択プレート上
で増殖させた大腸菌(E.coli)から得られた粗抽出物を使
用して行う。つまようじを使用して、集落を、37℃にお
いて一夜増殖させた問題の形質転換細胞を含む新たなプ
レートからこそげ取る。大腸菌(E.coli)内のBt遺伝子の
発現のための陽性対照は、pCIB3069という構築物であ
り、植物発現性CaMV 35Sプロモーターと融合された生来
のBt-k遺伝子を含む。また、pCIB3069は、ハイグロマイ
シン耐性遺伝子に作用可能な状態で結合されている35S
プロモーターを含み、この35S プロモーターは、GUS 遺
伝子に作用可能な状態で結合されているAdh イントロン
#1をもち、そして生来のBt cryIA(b) IPの生産をコード
している遺伝子に作用可能な状態で結合されている。Bt
遺伝子を含まない大腸菌(E.coli)の陰性対照も、この分
析において含まれる。集落を、62mM Tris-HCl pH 6.8、
1% SDS、0.0025% ブロモフェノール・ブルー、10% グリ
セロール及び7.5%メルカプトメタノールを含む100 μl
の供給バッファー(loading buffer)中に再懸濁させる。
この混合物を、95℃において10分間加熱した後、この調
製物を、1-3 秒間音波破砕する。この死骸を、室温にお
いて約5 分間マイクロフュージ内で遠心分離し、そして
10〜15μl のそれぞれのサンプルを、6%スタッキング・
ゲル(stacking gel)の下方の10% ランニング・ゲルをも
つアクリルアミド・ゲル上に供給する(Laemmliu, Natur
e 227;680-685(1970))。10mAmps において一夜、電気泳
動の後、蛋白を、そのゲルからImmobilon 膜(Millipor
e) に転移させる。この転移を、電気泳動Blotting Unit
(American BioNuclear, Emeryville, CA)を使用して転
移バッファー(20mM Tris, 150mMグリシン、及び20% メ
タノール) 中で1.5 時間450mAmpsにおいて行う。ウェス
タン・ブロッティングのためのバッファーは:
換細胞のウェスタン・ブロット分析を、選択プレート上
で増殖させた大腸菌(E.coli)から得られた粗抽出物を使
用して行う。つまようじを使用して、集落を、37℃にお
いて一夜増殖させた問題の形質転換細胞を含む新たなプ
レートからこそげ取る。大腸菌(E.coli)内のBt遺伝子の
発現のための陽性対照は、pCIB3069という構築物であ
り、植物発現性CaMV 35Sプロモーターと融合された生来
のBt-k遺伝子を含む。また、pCIB3069は、ハイグロマイ
シン耐性遺伝子に作用可能な状態で結合されている35S
プロモーターを含み、この35S プロモーターは、GUS 遺
伝子に作用可能な状態で結合されているAdh イントロン
#1をもち、そして生来のBt cryIA(b) IPの生産をコード
している遺伝子に作用可能な状態で結合されている。Bt
遺伝子を含まない大腸菌(E.coli)の陰性対照も、この分
析において含まれる。集落を、62mM Tris-HCl pH 6.8、
1% SDS、0.0025% ブロモフェノール・ブルー、10% グリ
セロール及び7.5%メルカプトメタノールを含む100 μl
の供給バッファー(loading buffer)中に再懸濁させる。
この混合物を、95℃において10分間加熱した後、この調
製物を、1-3 秒間音波破砕する。この死骸を、室温にお
いて約5 分間マイクロフュージ内で遠心分離し、そして
10〜15μl のそれぞれのサンプルを、6%スタッキング・
ゲル(stacking gel)の下方の10% ランニング・ゲルをも
つアクリルアミド・ゲル上に供給する(Laemmliu, Natur
e 227;680-685(1970))。10mAmps において一夜、電気泳
動の後、蛋白を、そのゲルからImmobilon 膜(Millipor
e) に転移させる。この転移を、電気泳動Blotting Unit
(American BioNuclear, Emeryville, CA)を使用して転
移バッファー(20mM Tris, 150mMグリシン、及び20% メ
タノール) 中で1.5 時間450mAmpsにおいて行う。ウェス
タン・ブロッティングのためのバッファーは:
【０１４５】
ブロッキング・バッファー: 2% Tween-20
30mM Tris-HCl pH 10.2
150mM NaCl
洗浄バッファー: 0.05% Tween-20
30mM Tris-HCl pH 10.2
150mM NaCl
展開バッファー: 100mM Tris-HCl pH 9.6
100mM NaCl
10mM MgCl 2
【０１４６】転移終了後、この膜を、上記のブロッキン
グ・バッファー中で約10分間インキュベートする。洗浄
バッファーによる3 回の15分間の洗浄を、第一抗体処理
の前に行う。第一抗体は、抗原としてCryIA(b)蛋白を使
用して調製した免疫アフィニティー精製されたウサギ又
はヤギ抗体(Ciba-Geigy, RTP, N.C.; Rockland Inc.,Gi
lbertsville, PA.; and Berkeley Antibody CO., Richm
ond, CA.)である。このcryIA(b)特異的抗体を、5 μg
の抗体を含む1ml 容量中のBio-Rad からの大腸菌(E.col
i)溶菌物、その洗浄バッファー溶液中の50μl の大腸菌
(E.coli)溶菌物により、使用直前に処理する。この混合
物を、洗浄バッファーによる1:6000の最終希釈のために
それを1 〜30に希釈する前に室温において1 時間インキ
ュベートする。第一抗体とのその膜のインキュベーショ
ンは、室温において1.5 時間である。
グ・バッファー中で約10分間インキュベートする。洗浄
バッファーによる3 回の15分間の洗浄を、第一抗体処理
の前に行う。第一抗体は、抗原としてCryIA(b)蛋白を使
用して調製した免疫アフィニティー精製されたウサギ又
はヤギ抗体(Ciba-Geigy, RTP, N.C.; Rockland Inc.,Gi
lbertsville, PA.; and Berkeley Antibody CO., Richm
ond, CA.)である。このcryIA(b)特異的抗体を、5 μg
の抗体を含む1ml 容量中のBio-Rad からの大腸菌(E.col
i)溶菌物、その洗浄バッファー溶液中の50μl の大腸菌
(E.coli)溶菌物により、使用直前に処理する。この混合
物を、洗浄バッファーによる1:6000の最終希釈のために
それを1 〜30に希釈する前に室温において1 時間インキ
ュベートする。第一抗体とのその膜のインキュベーショ
ンは、室温において1.5 時間である。
【０１４７】3 回の10分間洗浄を、第一と題意に抗体処
理の間に行う。第二抗体は、ウサギ抗- ヤギ又はヤギ抗
- ウサギ/ アルカリ性ホスファターゼ抱合体( conjugat
e)(Sigma, St. Louis, MO)のどちらかである。のアルカ
リ性ホスファターゼ抱合体とのインキュベーションを、
洗浄バッファー中の1 〜6000希釈を使用して室温におい
て1 時間行う。6 回の10分間の洗浄を、第二抗体処理と
ウェスタン・ブロット展開との間に行う。このウェスタ
ン・ブロットを、70% ジメチル・ホルムアミド中の440
μl のニトロブルー・テトラゾリウム(nitroblue tetra
zolium)(75mg/ml)及び100%ジメチル・ホルムアミド中の
330 μl の5-ブロモ-4- クロロ- インドールイル- ホス
フェート(50mg/ml) を含む100ml の展開(developing)バ
ッファー中で展開させる。15〜30分間の展開後、この膜
を水中で洗浄し、そして風乾させる。
理の間に行う。第二抗体は、ウサギ抗- ヤギ又はヤギ抗
- ウサギ/ アルカリ性ホスファターゼ抱合体( conjugat
e)(Sigma, St. Louis, MO)のどちらかである。のアルカ
リ性ホスファターゼ抱合体とのインキュベーションを、
洗浄バッファー中の1 〜6000希釈を使用して室温におい
て1 時間行う。6 回の10分間の洗浄を、第二抗体処理と
ウェスタン・ブロット展開との間に行う。このウェスタ
ン・ブロットを、70% ジメチル・ホルムアミド中の440
μl のニトロブルー・テトラゾリウム(nitroblue tetra
zolium)(75mg/ml)及び100%ジメチル・ホルムアミド中の
330 μl の5-ブロモ-4- クロロ- インドールイル- ホス
フェート(50mg/ml) を含む100ml の展開(developing)バ
ッファー中で展開させる。15〜30分間の展開後、この膜
を水中で洗浄し、そして風乾させる。
【０１４８】例4: 形質転換ベクターの構築
pCIB710 及び誘導体の構築。
CaMV 35Sプロモーター・カセット・プラスミドpCIB709
及びpCIB710 をRothstein et al., Gene 53:153-161(19
87) 中に示されるように構築する。pCIB710 は、35S RN
A 転写のためのCaMVプロモーター及び転写終止配列を含
む[Covey et al., Nucl. Acids. Res., 9:6735-6747 (1
981)] 。CaMV DNAの1149塩基対のBglII制限断片[Hohn e
t al., Current Topics in Microbiology and Immunol
ogy, 96:194-220 and Appendices A to G (1982)中の塩
基対6494-7643]を、先に記載したような分離用アガロー
ス・ゲル電気泳動によりCaMV DNAから単離する。この断
片を、BamHI-解裂プラスミドpUC19 DNA と混合し、T4 D
NAリガーゼにより処理し、そして大腸菌(E.coli)に形質
転換する( 得られたプラスミド内のBamHI 制限部位がBg
lII 付着末端をBamHI 付着末端に結合させることにより
破壊されていることに注意のこと。) 。
及びpCIB710 をRothstein et al., Gene 53:153-161(19
87) 中に示されるように構築する。pCIB710 は、35S RN
A 転写のためのCaMVプロモーター及び転写終止配列を含
む[Covey et al., Nucl. Acids. Res., 9:6735-6747 (1
981)] 。CaMV DNAの1149塩基対のBglII制限断片[Hohn e
t al., Current Topics in Microbiology and Immunol
ogy, 96:194-220 and Appendices A to G (1982)中の塩
基対6494-7643]を、先に記載したような分離用アガロー
ス・ゲル電気泳動によりCaMV DNAから単離する。この断
片を、BamHI-解裂プラスミドpUC19 DNA と混合し、T4 D
NAリガーゼにより処理し、そして大腸菌(E.coli)に形質
転換する( 得られたプラスミド内のBamHI 制限部位がBg
lII 付着末端をBamHI 付着末端に結合させることにより
破壊されていることに注意のこと。) 。
【０１４９】pUC19/35S という、得られたプラスミド
を、次にオリゴヌクレオチド- 特異的インビトロ突然変
異誘発において使用し、このBamHI 認識配列GGATCCを、
Hohnの文献中のCaMVヌクレオチド7483の直後に挿入す
る。得られたプラスミドpCIB710は、BamHI 制限部位に
より分けられたCaMV 35Sプロモーター領域及び転写終止
領域を含む。このBamHI 部位中に挿入されたDNA 配列
は、これらのCaMV転写調節配列により植物内で発現され
るであろう。(pCIB710が転写の開始とBamHI 部位との間
にいずれのATG 翻訳開始コドンを含んでいないことにも
注意のこと。)
を、次にオリゴヌクレオチド- 特異的インビトロ突然変
異誘発において使用し、このBamHI 認識配列GGATCCを、
Hohnの文献中のCaMVヌクレオチド7483の直後に挿入す
る。得られたプラスミドpCIB710は、BamHI 制限部位に
より分けられたCaMV 35Sプロモーター領域及び転写終止
領域を含む。このBamHI 部位中に挿入されたDNA 配列
は、これらのCaMV転写調節配列により植物内で発現され
るであろう。(pCIB710が転写の開始とBamHI 部位との間
にいずれのATG 翻訳開始コドンを含んでいないことにも
注意のこと。)
【０１５０】pCIB710 を、BamHI 部位内にpLG90 からの
ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼのための
コード配列を含むBamHI 断片[Rothstein et al., Gene.
53:153-161(1987)] を挿入することにより修飾し、pCIB
709 を作る。pCIB709 を、標準的な突然変異誘発技術を
使用してハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ
の開始コドンから丁度上流のATG を除去し、一方この位
置においてBglII 制限部位を挿入することにより、修飾
し、pCIB996 を作る。得られたプラスミドpCIB996 を、
さらに修飾し、その開始コドンのための、その開始コド
ンの5'に配置された5'未翻訳リーダー領域内のBamHI 、
SmaI及びBglII 部位を除去する。結果は、-TATAAGGATC
CCGGGGGCA AGATCTGAGA TATG-Hyg から-TATAAGGATC TGAG
ATATG-Hyg へのDNA 塩基配列の変更である。得られたプ
ラスミドは、pCIB3073として知られている。
ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼのための
コード配列を含むBamHI 断片[Rothstein et al., Gene.
53:153-161(1987)] を挿入することにより修飾し、pCIB
709 を作る。pCIB709 を、標準的な突然変異誘発技術を
使用してハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ
の開始コドンから丁度上流のATG を除去し、一方この位
置においてBglII 制限部位を挿入することにより、修飾
し、pCIB996 を作る。得られたプラスミドpCIB996 を、
さらに修飾し、その開始コドンのための、その開始コド
ンの5'に配置された5'未翻訳リーダー領域内のBamHI 、
SmaI及びBglII 部位を除去する。結果は、-TATAAGGATC
CCGGGGGCA AGATCTGAGA TATG-Hyg から-TATAAGGATC TGAG
ATATG-Hyg へのDNA 塩基配列の変更である。得られたプ
ラスミドは、pCIB3073として知られている。
【０１５１】あるいは、pCIB710 を、以下のパート4 中
に記載する645 アミノ酸Btコード配列を含む、pCIB10/3
5SBtのBamHI-BclI断片を、pCIB710 のBamHI 部位中に挿
入し、pCIB710/35SBt を作ることにより、修飾し、pCIB
900 を作る。抗生物質耐性マーカーを導入するために、
pCIB709 を、SalIにより切断し、KpnI/SalI アダプター
を結合させ、そして得られた結合生成物をKpnIにより切
断する。35S/ハイグロマイシン耐性遺伝子を含むpCIB70
9 のKpn 断片をpCIB710/35SBt のKpnI部位中に挿入し、
pCIB900 を作る。
に記載する645 アミノ酸Btコード配列を含む、pCIB10/3
5SBtのBamHI-BclI断片を、pCIB710 のBamHI 部位中に挿
入し、pCIB710/35SBt を作ることにより、修飾し、pCIB
900 を作る。抗生物質耐性マーカーを導入するために、
pCIB709 を、SalIにより切断し、KpnI/SalI アダプター
を結合させ、そして得られた結合生成物をKpnIにより切
断する。35S/ハイグロマイシン耐性遺伝子を含むpCIB70
9 のKpn 断片をpCIB710/35SBt のKpnI部位中に挿入し、
pCIB900 を作る。
【０１５２】選択マーカー遺伝子として有用な遺伝子
は、Rothstein et al., Gene, 53:153-161(1987)中に記
載されたハイグロマイシン耐性遺伝子を含む。この文献
中に記載されたハイグロマイシン遺伝子を。pUC プラス
ミド例えば、pCIB710 又はpCIB709 中に移し、そしてこ
のハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ・コー
ド配列から上流の" 余分な(extra)"ATG を除去し、pCIB
996 を作る。この修飾されたpCIB996 遺伝子を、さらに
修飾し、分子生物学の標準的な技術を使用してその遺伝
子の5'領域からBglII 、BamHI 及びSmaI部位を除去し、
pCIB3073を作る。
は、Rothstein et al., Gene, 53:153-161(1987)中に記
載されたハイグロマイシン耐性遺伝子を含む。この文献
中に記載されたハイグロマイシン遺伝子を。pUC プラス
ミド例えば、pCIB710 又はpCIB709 中に移し、そしてこ
のハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ・コー
ド配列から上流の" 余分な(extra)"ATG を除去し、pCIB
996 を作る。この修飾されたpCIB996 遺伝子を、さらに
修飾し、分子生物学の標準的な技術を使用してその遺伝
子の5'領域からBglII 、BamHI 及びSmaI部位を除去し、
pCIB3073を作る。
【０１５３】pCIB932 は、pUC19-ベースのプラスミドで
あってキメラ遺伝子Pep-C:プロモーター/Bt/Pep-C:ター
ミネーターを含むものである。それは、pPEP-10 、すな
わち、ゲノム・クローン、H1- ラムダ-14, PNAS USA, 8
3:2884-2888(1986) の、光合成におけるPEP カルボキシ
ラーゼ酵素活性をコードしているメイズ遺伝子の、Hind
III サブクローンから、そしてpUC18 のBamHI 部位内の
cryIAbエンドトキシン遺伝子の645 アミノ酸の切り詰め
られた形態を含むBamHI 断片であるpCIB930 から得られ
る断片から成る。
あってキメラ遺伝子Pep-C:プロモーター/Bt/Pep-C:ター
ミネーターを含むものである。それは、pPEP-10 、すな
わち、ゲノム・クローン、H1- ラムダ-14, PNAS USA, 8
3:2884-2888(1986) の、光合成におけるPEP カルボキシ
ラーゼ酵素活性をコードしているメイズ遺伝子の、Hind
III サブクローンから、そしてpUC18 のBamHI 部位内の
cryIAbエンドトキシン遺伝子の645 アミノ酸の切り詰め
られた形態を含むBamHI 断片であるpCIB930 から得られ
る断片から成る。
【０１５４】PEP カルボキシラーゼ遺伝子からのポリA
付加部位を含むpPEP-10 からの2.6kb EcoRI-XhoI断片
を、単離し、そしてPstI及びHincIIにより消化する。こ
の制限消化物を、PstI/HincII 消化pUC18 により結合さ
せ、大腸菌(E.coli)中に形質転換し、そして形質転換細
胞をpUC18 内に412 塩基対のPstI-HincII 挿入物を含む
ものについてスクリーンし、そしてその挿入物を配列決
定により確認する。得られたプラスミドを、pCIB931 と
いう。
付加部位を含むpPEP-10 からの2.6kb EcoRI-XhoI断片
を、単離し、そしてPstI及びHincIIにより消化する。こ
の制限消化物を、PstI/HincII 消化pUC18 により結合さ
せ、大腸菌(E.coli)中に形質転換し、そして形質転換細
胞をpUC18 内に412 塩基対のPstI-HincII 挿入物を含む
ものについてスクリーンし、そしてその挿入物を配列決
定により確認する。得られたプラスミドを、pCIB931 と
いう。
【０１５５】ホスホエノールピルベート・カルボキシラ
ーゼ・アイソザイム("Pep-C") をコードしている核遺伝
子は、Hudspeth et al., Plant Molecular Biology, 1
2:579-589 (1989) 中に記載されている。pCIB932 を3
つの断片の結合により構築する。このPEP-C 転写ターミ
ネーターを含む第一断片を、HindIII により、部分的に
SphIによりpCIB931 を完全に消化することにより作り、
そして3098塩基対の断片を単離する。Btエンドトキシン
・コード配列を含む第二断片を、pCIB930 をNcoI及びSp
hIにより消化することにより作り、そして1950塩基対の
断片を単離する。PEP-C プロモーターを含む第三断片
を、HindIII により、部分的にNcoIによりpPEP-10 を完
全に消化することにより作り、そして2.3kb の断片を単
離する。この結合混合物を、大腸菌(E.coli)中に形質転
換し、正しい挿入物をもつ形質転換細胞を同定し、そし
てこの挿入物を配列決定により確認する。
ーゼ・アイソザイム("Pep-C") をコードしている核遺伝
子は、Hudspeth et al., Plant Molecular Biology, 1
2:579-589 (1989) 中に記載されている。pCIB932 を3
つの断片の結合により構築する。このPEP-C 転写ターミ
ネーターを含む第一断片を、HindIII により、部分的に
SphIによりpCIB931 を完全に消化することにより作り、
そして3098塩基対の断片を単離する。Btエンドトキシン
・コード配列を含む第二断片を、pCIB930 をNcoI及びSp
hIにより消化することにより作り、そして1950塩基対の
断片を単離する。PEP-C プロモーターを含む第三断片
を、HindIII により、部分的にNcoIによりpPEP-10 を完
全に消化することにより作り、そして2.3kb の断片を単
離する。この結合混合物を、大腸菌(E.coli)中に形質転
換し、正しい挿入物をもつ形質転換細胞を同定し、そし
てこの挿入物を配列決定により確認する。
【０１５６】pCIB932 を、PvuII により切断し、メイズ
Pep-C:プロモーター/Bt/Pep-C:ターミネーターを含む4.
9Kb 断片を作り、そして1X TAE中の1% LGTアガロース・
ゲル上で精製する。この線状のpCIB3079ベクター及びpC
IB932 からの4.9Kb 挿入物をLGT 中のT4 DNAリガーゼを
使用して結合し、pCIB4401を作る。。pCIB4401は、キメ
ラ遺伝子:35S: プロモーター/PAT/35S: ターミネータ
ー、Pep-C:プロモーター/Bt/Pep-C:ターミネーター、及
び35S:プロモーター/AdhI #1イントロン/GUS/35S: ター
ミネーターを含むメイズの形質転換ベクターである。
Pep-C:プロモーター/Bt/Pep-C:ターミネーターを含む4.
9Kb 断片を作り、そして1X TAE中の1% LGTアガロース・
ゲル上で精製する。この線状のpCIB3079ベクター及びpC
IB932 からの4.9Kb 挿入物をLGT 中のT4 DNAリガーゼを
使用して結合し、pCIB4401を作る。。pCIB4401は、キメ
ラ遺伝子:35S: プロモーター/PAT/35S: ターミネータ
ー、Pep-C:プロモーター/Bt/Pep-C:ターミネーター、及
び35S:プロモーター/AdhI #1イントロン/GUS/35S: ター
ミネーターを含むメイズの形質転換ベクターである。
【０１５７】pCIB246(35S-GUS-35S)の構築
CaMV 35Sプロモーター・カセット、pCIB246 を以下のよ
うに構築する。CaMVゲノムのヌクレオチド位7482におけ
るDdeI制限部位[Franck et al., Cell, 21:285-294(198
0)] を、NcoI(CCATGG)部位、SalI(GTCGAC)部位、及びSs
tI(GAGCTC)部位を含む幾つかの制限酵素部位を含む48塩
基対のオリゴヌクレオチドを挿入することにより修飾す
る。この変更されたCaMV 35Sプロモーターを、そのベク
ターのSstI及びSalI部位を破壊するように修飾されてい
るpUC19 ベクター中に挿入する。したがって、pCIB1500
のCaMV 35Sプロモーターは、クローニングのためのユニ
ークSstI及びSalI部位を含む。
うに構築する。CaMVゲノムのヌクレオチド位7482におけ
るDdeI制限部位[Franck et al., Cell, 21:285-294(198
0)] を、NcoI(CCATGG)部位、SalI(GTCGAC)部位、及びSs
tI(GAGCTC)部位を含む幾つかの制限酵素部位を含む48塩
基対のオリゴヌクレオチドを挿入することにより修飾す
る。この変更されたCaMV 35Sプロモーターを、そのベク
ターのSstI及びSalI部位を破壊するように修飾されてい
るpUC19 ベクター中に挿入する。したがって、pCIB1500
のCaMV 35Sプロモーターは、クローニングのためのユニ
ークSstI及びSalI部位を含む。
【０１５８】pCIB1500を、SstI/NcoI により消化し、そ
してpBI221から得られるGUS 遺伝子(Clontech Laborato
ries, Inc., Palo Alto, CA)と結合する。このNcoI部位
を、そのNcoI部位のATG がGUS 遺伝子の翻訳のための開
始コドンとして機能するように、GUS 遺伝子に融合させ
る。CaMV 35Sポリアデニレーション及び終止シグナル
を、このキメラ遺伝子の3'末端のために使用する。
してpBI221から得られるGUS 遺伝子(Clontech Laborato
ries, Inc., Palo Alto, CA)と結合する。このNcoI部位
を、そのNcoI部位のATG がGUS 遺伝子の翻訳のための開
始コドンとして機能するように、GUS 遺伝子に融合させ
る。CaMV 35Sポリアデニレーション及び終止シグナル
を、このキメラ遺伝子の3'末端のために使用する。
【０１５９】pCIB3069(35S-Adh1-GUS-35S)の構築
pCIB246 を、メイズ・アルコール・デヒドロゲナーゼ遺
伝子Adh1イントロン番号1(Adh1)(Dennis et al., Nucle
ic Acids Research, 12:3983-4000(1984))をpCIB246 の
SalI部位中に付加することにより修飾し、プラスミドpC
IB3007を作る。Adh1イントロンを、BalI/PstI 断片とし
てメイズAdh1遺伝子から切除し、SmaI/PstI により切断
されたpUC18 中にサブクローンし、Adh 1026というプラ
スミドを作る。Adh 1026を、PvuII/SacII により切断
し、その断片を、T4 DNAポリメラーゼにより平滑末端と
し、SalIリンカーを、標準的な手順を使用して添加し、
そして約560 塩基対の断片を、3%Nusieve ゲルから回収
し、そしてSalI切断/ ホスファターゼ処理pUC18 中に結
合する。得られたプラスミド内のSalI線型化Adh イント
ロン#1を、salIにより切り出し、ゲル精製し、そしてSa
lI切断/ ホスファターゼ処理pCIB246 中に結合させ、プ
ラスミドpCIB3007を作る。
伝子Adh1イントロン番号1(Adh1)(Dennis et al., Nucle
ic Acids Research, 12:3983-4000(1984))をpCIB246 の
SalI部位中に付加することにより修飾し、プラスミドpC
IB3007を作る。Adh1イントロンを、BalI/PstI 断片とし
てメイズAdh1遺伝子から切除し、SmaI/PstI により切断
されたpUC18 中にサブクローンし、Adh 1026というプラ
スミドを作る。Adh 1026を、PvuII/SacII により切断
し、その断片を、T4 DNAポリメラーゼにより平滑末端と
し、SalIリンカーを、標準的な手順を使用して添加し、
そして約560 塩基対の断片を、3%Nusieve ゲルから回収
し、そしてSalI切断/ ホスファターゼ処理pUC18 中に結
合する。得られたプラスミド内のSalI線型化Adh イント
ロン#1を、salIにより切り出し、ゲル精製し、そしてSa
lI切断/ ホスファターゼ処理pCIB246 中に結合させ、プ
ラスミドpCIB3007を作る。
【０１６０】pCIB3007を、PstIにより切断し、そしてそ
の末端を供給者の仕様書に従ってT4DNAポリメラーゼ(Ne
w England Biolabs) を使用して平滑とする。得られた
平滑末端分子を、SphIにより切断し、そして1 つの平滑
末端及び1 つのSphI末端をもつ約5.8Kb 断片を、標準的
な手順を使用して低ゲル化温度(LGT) アガロース・ゲル
上で精製する。pCIB900 を、SmaI/SphI により切断し、
そして35S/Bt遺伝子を含む断片を、LGT アガロース・ゲ
ル上で精製する。この2 つのゲル精製断片を、標準的な
条件に従ってT4 DNAリガーゼを使用してLGT アガロース
中で結合する。得られた結合断片を、標準的な手順を使
用して大腸菌(E.coli)中に形質転換し、そして得られた
プラスミドをpCIB3062という。2 つの変異体のpCIB3062
が在る。pCIB3062#1は、再生されたSmaI部位をもち、こ
こでは、SmaI部位及びT4ポリメラーゼ平滑末端が結合さ
れている。この大部分は、たぶん、平滑化反応の間にPs
tI部位からの少ない塩基対を少しずつかみ取るT4ポリメ
ラーゼから生じる。pCIB3062#3は、このSmaI部位をもっ
ていない。
の末端を供給者の仕様書に従ってT4DNAポリメラーゼ(Ne
w England Biolabs) を使用して平滑とする。得られた
平滑末端分子を、SphIにより切断し、そして1 つの平滑
末端及び1 つのSphI末端をもつ約5.8Kb 断片を、標準的
な手順を使用して低ゲル化温度(LGT) アガロース・ゲル
上で精製する。pCIB900 を、SmaI/SphI により切断し、
そして35S/Bt遺伝子を含む断片を、LGT アガロース・ゲ
ル上で精製する。この2 つのゲル精製断片を、標準的な
条件に従ってT4 DNAリガーゼを使用してLGT アガロース
中で結合する。得られた結合断片を、標準的な手順を使
用して大腸菌(E.coli)中に形質転換し、そして得られた
プラスミドをpCIB3062という。2 つの変異体のpCIB3062
が在る。pCIB3062#1は、再生されたSmaI部位をもち、こ
こでは、SmaI部位及びT4ポリメラーゼ平滑末端が結合さ
れている。この大部分は、たぶん、平滑化反応の間にPs
tI部位からの少ない塩基対を少しずつかみ取るT4ポリメ
ラーゼから生じる。pCIB3062#3は、このSmaI部位をもっ
ていない。
【０１６１】pCIB3062#3を、KpnIにより切断し、そして
T4 DNAポリメラーゼを使用して平滑末端とし、そして次
に、PvuII により切断し、35S/GUS 及び35S/Bt遺伝子を
含む平滑末端をもつ6.4Kb の断片を作る。この平滑末端
断片を、SmaI切断pCIB3073中に結合させ、pCIB3063及び
pCIB3069を作る。pCIB3069は、pCIB3063を作るために使
用される同一断片を含むが、pCIB3069内のキメラ遺伝子
はすべて、pCIB3063内のものと異なり、同一の相対的方
向にある。これらの遺伝子は、先に記載したように、a)
35S プロモーターであってハイグロマイシン耐性遺伝子
に作用可能な状態で結合されているもの;b)35Sプロモー
ターであってGUS 遺伝子に作用可能な状態で結合されて
いるAdh イントロン#1をもつもの; 及びc)35S プロモー
ターであってバチルス・スリンギエンシス(Bacillus th
uringiensis)からの合成cryIA(b)殺虫性蛋白の生産をコ
ードしている遺伝子に作用可能な状態で結合されている
もの、を含む。
T4 DNAポリメラーゼを使用して平滑末端とし、そして次
に、PvuII により切断し、35S/GUS 及び35S/Bt遺伝子を
含む平滑末端をもつ6.4Kb の断片を作る。この平滑末端
断片を、SmaI切断pCIB3073中に結合させ、pCIB3063及び
pCIB3069を作る。pCIB3069は、pCIB3063を作るために使
用される同一断片を含むが、pCIB3069内のキメラ遺伝子
はすべて、pCIB3063内のものと異なり、同一の相対的方
向にある。これらの遺伝子は、先に記載したように、a)
35S プロモーターであってハイグロマイシン耐性遺伝子
に作用可能な状態で結合されているもの;b)35Sプロモー
ターであってGUS 遺伝子に作用可能な状態で結合されて
いるAdh イントロン#1をもつもの; 及びc)35S プロモー
ターであってバチルス・スリンギエンシス(Bacillus th
uringiensis)からの合成cryIA(b)殺虫性蛋白の生産をコ
ードしている遺伝子に作用可能な状態で結合されている
もの、を含む。
【０１６２】GUS 検定:GUS 検定を、Jefferson, Plant
Mol. Bio. Reporeter, 5:387-405 (1987)中に記載され
たよう本質的に行う。先に示したように、プラスミドpC
IB246 は、GUS遺伝子と融合したCaMV 35Sプロモーター
を含む。このキメラ遺伝子の5'未翻訳リーダーは、メイ
ズAdh1イントロン#1のコピーを含む。これを、ここで
は、形質転換対照として使用する。同一量のpCIB246
を、それぞれの形質転換に添加するけれども、計算され
た活性は、テストしたBt構築物の中で変動した。以下に
報告する値は、3 回繰り返しの平均である。pCIB4407
を、2 回テストした。
Mol. Bio. Reporeter, 5:387-405 (1987)中に記載され
たよう本質的に行う。先に示したように、プラスミドpC
IB246 は、GUS遺伝子と融合したCaMV 35Sプロモーター
を含む。このキメラ遺伝子の5'未翻訳リーダーは、メイ
ズAdh1イントロン#1のコピーを含む。これを、ここで
は、形質転換対照として使用する。同一量のpCIB246
を、それぞれの形質転換に添加するけれども、計算され
た活性は、テストしたBt構築物の中で変動した。以下に
報告する値は、3 回繰り返しの平均である。pCIB4407
を、2 回テストした。
【０１６３】
pCIB3069 28nM MU/ μg/分間
pCIB4407 0.7nM MU/ μg/分間、2.3nM MU/ μg/分間。
【０１６４】例5A: 欧州トウモロコシ穿孔性動物に対す
る殺虫活性についての合成cryIA(b)遺伝子の検定 大腸菌(E.coli)内のpCIB4414内の合成cryIA(b)遺伝子
を、以下の手順書に従って欧州トウモロコシ穿孔性動物
に対する殺虫活性について検定する。溶融人工昆虫食物
を、60mmのGellman のスナップ・キャップのペトリ皿中
に濯ぐ。凝固後、0.1% Triton X-100 中に懸濁された大
腸菌(E.coli)細胞を、3 X 10 7 細胞/cm 2 の濃度におい
てその表面上に拡げる。このプレートを風乾させる。10
の第一令の(first instar)の欧州トウモロコシ穿孔性動
物、Ostrinia nubilalisであって生後12時間未満のもの
を、次にその食事表面上に置く。テストを、30℃におい
て完全な暗闇内で2-5 日間インキュベートする。このテ
ストの最後において、死亡率のパーセントを記録する。
陽性クローンを、対照大腸菌(E. coli)細胞が0-10% の
背景死亡率を与えるとき、50% 以上の死亡率を与えるも
のとして定める。
る殺虫活性についての合成cryIA(b)遺伝子の検定 大腸菌(E.coli)内のpCIB4414内の合成cryIA(b)遺伝子
を、以下の手順書に従って欧州トウモロコシ穿孔性動物
に対する殺虫活性について検定する。溶融人工昆虫食物
を、60mmのGellman のスナップ・キャップのペトリ皿中
に濯ぐ。凝固後、0.1% Triton X-100 中に懸濁された大
腸菌(E.coli)細胞を、3 X 10 7 細胞/cm 2 の濃度におい
てその表面上に拡げる。このプレートを風乾させる。10
の第一令の(first instar)の欧州トウモロコシ穿孔性動
物、Ostrinia nubilalisであって生後12時間未満のもの
を、次にその食事表面上に置く。テストを、30℃におい
て完全な暗闇内で2-5 日間インキュベートする。このテ
ストの最後において、死亡率のパーセントを記録する。
陽性クローンを、対照大腸菌(E. coli)細胞が0-10% の
背景死亡率を与えるとき、50% 以上の死亡率を与えるも
のとして定める。
【０１６５】比較のために、pCIB3069内の生来のcryIA
(b)遺伝子を、上記と同じ濃度においてテストする。ク
ローンを、3 x 107 細胞/cm 2 食事(diet); クローン当
たり20昆虫においてテストする。
(b)遺伝子を、上記と同じ濃度においてテストする。ク
ローンを、3 x 107 細胞/cm 2 食事(diet); クローン当
たり20昆虫においてテストする。
【０１６６】以下の結果を観察する:クローン
パーセント死亡率
対照 0
pCIB3069 100
pCIB4414 100
【０１６７】これらの結果は、合成cryIA(b)遺伝子によ
り生産された殺虫性結晶蛋白がその生来のcryIA(b)によ
り生産されたIPのものに比較しての欧州トウモロコシ穿
孔性動物に対する活性を証明した。合成cryIA(b)遺伝子
を含む他のプラスミドを、同様のやり方で検定した。
り生産された殺虫性結晶蛋白がその生来のcryIA(b)によ
り生産されたIPのものに比較しての欧州トウモロコシ穿
孔性動物に対する活性を証明した。合成cryIA(b)遺伝子
を含む他のプラスミドを、同様のやり方で検定した。
【０１６８】例5AB: サトウキビ穿孔性動物(sugarcane
borer) に対する殺虫活性についてのcryIA(b)蛋白の検
定 CryIA(b)を、大腸菌(E.coli)内で発現させ、そして直前
に記載したように、欧州トウモロコシ穿孔性動物のため
に使用したものと同じ手順に従って、サトウキビ穿孔性
動物(Diatrea saccharalis) に対する殺虫活性について
検定する。結果を表中に要約する。
borer) に対する殺虫活性についてのcryIA(b)蛋白の検
定 CryIA(b)を、大腸菌(E.coli)内で発現させ、そして直前
に記載したように、欧州トウモロコシ穿孔性動物のため
に使用したものと同じ手順に従って、サトウキビ穿孔性
動物(Diatrea saccharalis) に対する殺虫活性について
検定する。結果を表中に要約する。
【０１６９】
表
大腸菌(E.coli)からのBt蛋白によるサトウキビ穿孔性動物検定
蛋白濃度(ng/g) パーセント死亡率cryIA(b)
10 0
25 0
50 7
100 13
250 40
500 53
1000 80
LC50 380
95%Cl 249-646
【０１７０】上記の結果は、メイズ最適化Bt遺伝子によ
り生産された殺虫性蛋白がサトウキビ穿孔性動物に対し
て有効であることを示している。CryIA(b)蛋白の最高濃
度、すなわち、250ng/g-1000ng/gが、本発明に従ってト
ランスジェニック・メイズ植物内で達成可能である。
り生産された殺虫性蛋白がサトウキビ穿孔性動物に対し
て有効であることを示している。CryIA(b)蛋白の最高濃
度、すなわち、250ng/g-1000ng/gが、本発明に従ってト
ランスジェニック・メイズ植物内で達成可能である。
【０１７１】例6: メイズ・プロプラストの単離及び合
成Bt遺伝子による形質転換 合成Bt遺伝子の発現を、過渡的に形質転換されたメイズ
・プロトプラスト内で検定する。
成Bt遺伝子による形質転換 合成Bt遺伝子の発現を、過渡的に形質転換されたメイズ
・プロトプラスト内で検定する。
【０１７２】プロトプラスト単離手順:
1. 10 の2 日目(two day old) のメイズ2717系6 懸濁培
養物の中身を、ピペットで50mlの無菌チューブ内に入
れ、そして沈殿させる。培養基を次に取り出し、そして
捨てる。 2. 細胞(3-5ml Packed Cell Volume)を、30mlのプロト
プラスト酵素溶液中に再懸濁させる。配合表(recipe)は
以下のようである。 3%セルラーゼRS KMC バッファー中の1% macerozyme R10 KMC バッファー(1リッターのための配合表) KCl 8.65g MgCl 2 -6H 2 O 16.47g CaCl 2 -2H 2 O 12.50g MES 5.0g pH 5.6 、滅菌濾過物
養物の中身を、ピペットで50mlの無菌チューブ内に入
れ、そして沈殿させる。培養基を次に取り出し、そして
捨てる。 2. 細胞(3-5ml Packed Cell Volume)を、30mlのプロト
プラスト酵素溶液中に再懸濁させる。配合表(recipe)は
以下のようである。 3%セルラーゼRS KMC バッファー中の1% macerozyme R10 KMC バッファー(1リッターのための配合表) KCl 8.65g MgCl 2 -6H 2 O 16.47g CaCl 2 -2H 2 O 12.50g MES 5.0g pH 5.6 、滅菌濾過物
【０１７３】3. 細胞をよく混合し、そして100 x 25mm
のペトリ皿中に、プレート当たり約15mlに部分分けす
る。旋回振とう機上で4 時間振とうし、消化させる。 4. 使用のためにそれぞれ100 ミクロン篩を通して10ml
KMCをピペットで取る。篩を通して皿の内容物を濾過す
る。等容量のKMC により篩を洗浄する。 5. 篩ったプロトプラストを注意して50mlのチューブ内
にピペットで入れ、そしてBeckman TJ-6遠心分離機内で
10分間1000rpm(500x g)により回転させる。 6. 上澄を取り除き、そしてペレットを10ml KMC中で注
意して再懸濁させる。3 つのチューブを合わせて1 つに
し、そしてKMC により50mlまでの容量にする。 7. 上記の段階を繰り返すことにより再び、回転及び洗
浄を行う。
のペトリ皿中に、プレート当たり約15mlに部分分けす
る。旋回振とう機上で4 時間振とうし、消化させる。 4. 使用のためにそれぞれ100 ミクロン篩を通して10ml
KMCをピペットで取る。篩を通して皿の内容物を濾過す
る。等容量のKMC により篩を洗浄する。 5. 篩ったプロトプラストを注意して50mlのチューブ内
にピペットで入れ、そしてBeckman TJ-6遠心分離機内で
10分間1000rpm(500x g)により回転させる。 6. 上澄を取り除き、そしてペレットを10ml KMC中で注
意して再懸濁させる。3 つのチューブを合わせて1 つに
し、そしてKMC により50mlまでの容量にする。 7. 上記の段階を繰り返すことにより再び、回転及び洗
浄を行う。
【０１７４】8. 洗浄したプロトプラストのすべてを50
ml KMC中に再懸濁させる。 血球計数器(hemocytometer) 内で計数を行う。プロトプ
ラストを回転させ、そして再懸濁バッファー(RS バッフ
ァー) 中で8 x 106 /ml において再懸濁させる。
ml KMC中に再懸濁させる。 血球計数器(hemocytometer) 内で計数を行う。プロトプ
ラストを回転させ、そして再懸濁バッファー(RS バッフ
ァー) 中で8 x 106 /ml において再懸濁させる。
【０１７５】
RSバッファー(500mlのための配合表)
マニトール 27.33g
CaCl2 (0.1M ストック) 75ml
MES 0.5g
pH 5.8、滅菌濾過物
【０１７６】プロトプラスト形質転換手順:
1. 50μg のプラスミドDNA(Bt IP 構築物、合成(pCIB4
407)及び生来(pCIB3069)の両方) を15mlのポリスチレン
培養チューブ内に部分分けする(Aliquot) 。また、25μ
g GUS-含有プラスミドDNA(Bt IP を含まないもの)(pCIB
246)をすべてのチューブに部分分けする。3 回の繰り返
しを、テストされるべき構築物毎に使用し、1 回は、対
照としてDNA を全く含んでいない。
407)及び生来(pCIB3069)の両方) を15mlのポリスチレン
培養チューブ内に部分分けする(Aliquot) 。また、25μ
g GUS-含有プラスミドDNA(Bt IP を含まないもの)(pCIB
246)をすべてのチューブに部分分けする。3 回の繰り返
しを、テストされるべき構築物毎に使用し、1 回は、対
照としてDNA を全く含んでいない。
【０１７７】Bt構築物
: GUS 構築物:
pCIB3069 pCIB246
pCIB4407
【０１７８】2. プロトプラストを穏やかによく混合
し、そしてチューブ毎に0.5ml を部分分けする。 3. それぞれのチューブに0.5ml PEG-40を添加する。 PEG-40: 0.4M マニトール 0.1M Ca(NO3 ) 2 -4H 2 O pH 8.0、無菌濾過物
し、そしてチューブ毎に0.5ml を部分分けする。 3. それぞれのチューブに0.5ml PEG-40を添加する。 PEG-40: 0.4M マニトール 0.1M Ca(NO3 ) 2 -4H 2 O pH 8.0、無菌濾過物
【０１７９】4. 穏やかに混合し、プロトプラストとPE
G とを一緒にする。30分間待つ。 5. 順次、1ml 、2ml 、及び5ml のW5溶液を、5 分間の
間隔をあけて添加する。
G とを一緒にする。30分間待つ。 5. 順次、1ml 、2ml 、及び5ml のW5溶液を、5 分間の
間隔をあけて添加する。
【０１８０】
W5溶液:
154mM NaCl
125mM CaCl2 - H 2 O
5mM KCl
5mM グルコース
pH 7.0、無菌濾過物
【０１８１】6. Beckman TJ-6遠心分離機内で10分間約
1000rpm(500g) において回転させる。上澄液を取り除
く。 7. 1.5ml のFW培地中で穏やかにペレットを再懸濁さ
せ、そして35 x 10mm ペトリ皿内に注意してプレーティ
ングする。
1000rpm(500g) において回転させる。上澄液を取り除
く。 7. 1.5ml のFW培地中で穏やかにペレットを再懸濁さ
せ、そして35 x 10mm ペトリ皿内に注意してプレーティ
ングする。
【０１８２】
FW培地(1リッターのための配合表):
MS塩 4.3g
200X B5 vits. 5ml
シュクロース 30g
プロリン 1.5g
マニトール 54g
2,4D 3mg
pH 5.7、無菌濾過物
【０１８３】8. 室温において暗室内で一夜インキュベ
ートする。 9. 以下に記載するように、プロトプラスト抽出物に対
して、GUS 検定、昆虫生物検定、及びELISA 検定を行
う。
ートする。 9. 以下に記載するように、プロトプラスト抽出物に対
して、GUS 検定、昆虫生物検定、及びELISA 検定を行
う。
【０１８４】例7: 完全長合成メイズ最適化cryIA(b)遺
伝子の構築 配列番号4 は、バチルス・スリンギエンシス(Bacillus
thuringiensis)からの完全長cryIA(b)殺虫性蛋白をコー
ドしている合成メイズ最適化配列を示している。先に記
載した切り詰められた変異体は、第一の、約2kb の上記
遺伝子を現している。完全長遺伝子の残りを、先に記載
したような手順を使用してクローン化する。簡単に言え
ば、この手順は、長さ40〜90NTのDNA オリゴマーの合成
を、典型的には平均サイズとして80mer の使用を必要と
する。このオリゴマーを、HPLCの標準的な手順又はポリ
アクリルアミド・ゲルからの回収を使用して精製する。
精製されたオリゴマーを、キナーゼ処理し、そしてハイ
ブリダイズさせ、約500 塩基対の断片を作る。このハイ
ブリダイズしたオリゴマーを、標準的な条件下でPCR を
使用して増幅することができる。ハイブリダイゼーショ
ンから直接、PCR 増幅から、あるいはハイブリダイゼー
ション又はPCR 増幅のいずれかの後のアガロース・ゲル
から、のいずれかから回収された500 塩基対の断片を、
次に、プラスミド中にクローン化し、そして標準的な手
順を使用して大腸菌(E.coli)中に形質転換させる。
伝子の構築 配列番号4 は、バチルス・スリンギエンシス(Bacillus
thuringiensis)からの完全長cryIA(b)殺虫性蛋白をコー
ドしている合成メイズ最適化配列を示している。先に記
載した切り詰められた変異体は、第一の、約2kb の上記
遺伝子を現している。完全長遺伝子の残りを、先に記載
したような手順を使用してクローン化する。簡単に言え
ば、この手順は、長さ40〜90NTのDNA オリゴマーの合成
を、典型的には平均サイズとして80mer の使用を必要と
する。このオリゴマーを、HPLCの標準的な手順又はポリ
アクリルアミド・ゲルからの回収を使用して精製する。
精製されたオリゴマーを、キナーゼ処理し、そしてハイ
ブリダイズさせ、約500 塩基対の断片を作る。このハイ
ブリダイズしたオリゴマーを、標準的な条件下でPCR を
使用して増幅することができる。ハイブリダイゼーショ
ンから直接、PCR 増幅から、あるいはハイブリダイゼー
ション又はPCR 増幅のいずれかの後のアガロース・ゲル
から、のいずれかから回収された500 塩基対の断片を、
次に、プラスミド中にクローン化し、そして標準的な手
順を使用して大腸菌(E.coli)中に形質転換させる。
【０１８５】所望の挿入物を含む組換えプラスミドを、
PCR 及び/ 又は標準的なミニスクリーン手順を使用して
先に記載したように同定する。それらのPCR 及び/ 又は
制限酵素のプロフィールに基づき正しいと思われる挿入
物を、次に配列決定し、所望のオープン・リーディング
・フレームを含んでいるクローンを同定する。この断片
を次に例2中に記載した約2Kb の合成配列と一緒に結合
し、完全長のメイズ最適化合成cryIA(b)遺伝子であって
メイズ内の高レベルのCryIA(b)蛋白の発現に有用なもの
を作り出す。
PCR 及び/ 又は標準的なミニスクリーン手順を使用して
先に記載したように同定する。それらのPCR 及び/ 又は
制限酵素のプロフィールに基づき正しいと思われる挿入
物を、次に配列決定し、所望のオープン・リーディング
・フレームを含んでいるクローンを同定する。この断片
を次に例2中に記載した約2Kb の合成配列と一緒に結合
し、完全長のメイズ最適化合成cryIA(b)遺伝子であって
メイズ内の高レベルのCryIA(b)蛋白の発現に有用なもの
を作り出す。
【０１８６】生来及び合成Bt遺伝子のG+C 含量:
完全長生来 38.8%
切り詰められた生来 37.2%
完全長合成 64.8%
切り詰められた合成 64.6% 。
" 純粋な" メイズのコドンの用い方の遺伝子に比較して
の、Bt遺伝子の最終的な切り詰められた変異体の% 相同
性: 98.25% 。
の、Bt遺伝子の最終的な切り詰められた変異体の% 相同
性: 98.25% 。
【０１８７】例8: 植物発現性完全長ハイブリッドの、
部分的メイズ最適化cryIA(b)遺伝子の構築 pCIB4434は、約2Kb の合成メイズ最適化cryIA(b)遺伝子
を含んで成り、この遺伝子の残り(COOH 末端コード領
域) は生来の遺伝子から得られる。したがって、このコ
ード領域は、合成遺伝子と生来の遺伝子との間のキメラ
であるが、得られた蛋白は、生来のcryIA(b)蛋白と同一
である。この合成領域は、ヌクレオチド1-1938( アミノ
酸1 〜646)からのものであり、そしてその生来のコード
配列は、ヌクレオチド1-3468( アミノ酸647 〜1155) か
らのものである。この遺伝子の配列を、Fig.7 中に記載
する。pCUB4434のマップを、Fig.8 中に示す。
部分的メイズ最適化cryIA(b)遺伝子の構築 pCIB4434は、約2Kb の合成メイズ最適化cryIA(b)遺伝子
を含んで成り、この遺伝子の残り(COOH 末端コード領
域) は生来の遺伝子から得られる。したがって、このコ
ード領域は、合成遺伝子と生来の遺伝子との間のキメラ
であるが、得られた蛋白は、生来のcryIA(b)蛋白と同一
である。この合成領域は、ヌクレオチド1-1938( アミノ
酸1 〜646)からのものであり、そしてその生来のコード
配列は、ヌクレオチド1-3468( アミノ酸647 〜1155) か
らのものである。この遺伝子の配列を、Fig.7 中に記載
する。pCUB4434のマップを、Fig.8 中に示す。
【０１８８】以下のオリゴを、pCIB4434を作るために設
計した： KE134A28=5'-CGTGACCGAC TACCACATCG ATCAAGTATC CAATT
TAGTT GAGT-3' KE135A28=5'-ACTCAACTAA ATTGGATACT TGATCGATGT GGTAG
TCGGTC ACG-3' KE136A28=5'-GCAGATCTGA GCTCTTAGGT ACCCAATAGC GTAAC
GT-3' KE137A28=5'-GCTGATTATG CATCAGCCTAT-3' KE138A28=5'-GCAGATCTGA GCTCTTATTC CTCCATAAGA AGTAA
TTC-3' MK05A28=5'-CAAAGGTACC CAATAGCGTA ACG-3' MK35A28=5'-AACGAGGTGT ACATCGACCG-3'
計した： KE134A28=5'-CGTGACCGAC TACCACATCG ATCAAGTATC CAATT
TAGTT GAGT-3' KE135A28=5'-ACTCAACTAA ATTGGATACT TGATCGATGT GGTAG
TCGGTC ACG-3' KE136A28=5'-GCAGATCTGA GCTCTTAGGT ACCCAATAGC GTAAC
GT-3' KE137A28=5'-GCTGATTATG CATCAGCCTAT-3' KE138A28=5'-GCAGATCTGA GCTCTTATTC CTCCATAAGA AGTAA
TTC-3' MK05A28=5'-CAAAGGTACC CAATAGCGTA ACG-3' MK35A28=5'-AACGAGGTGT ACATCGACCG-3'
【０１８９】pCIB4434を、pCIB4418からの5.7kb 断片、
346 塩基対のBst E II/Kpn I PCR生成合成: 生来融合断
片、pCIB1315からの108 塩基対のKpn I/Nsi I 生来CryI
A(b)断片、及び224 塩基対のNsi I/Bgl II PCR生成断片
の、4 方結合を使用して作る。結合及び形質転換のため
の標準的な条件は、先に記載したようなものと同じであ
る。
346 塩基対のBst E II/Kpn I PCR生成合成: 生来融合断
片、pCIB1315からの108 塩基対のKpn I/Nsi I 生来CryI
A(b)断片、及び224 塩基対のNsi I/Bgl II PCR生成断片
の、4 方結合を使用して作る。結合及び形質転換のため
の標準的な条件は、先に記載したようなものと同じであ
る。
【０１９０】合成: 生来遺伝子融合断片を、PCR を使用
して2 段階で作る。第一の253 塩基対のPCR 融合断片
を、200nm のそれぞれのdNTP、1 X PCR バッファー(Per
kin Elmer Cetus)、20% グリセロール、及び5 ユニット
のTaq ポリメラーゼ(Perkin Elmer Cetus)を含む100 μ
l 中に約200ng の生来のcryIA(b)テンプレートと共に10
0 ピコモルのオリゴKE134A28及びMK04A28 を使用して作
る。このPCR 反応を、以下のパラメーターにより走らせ
る:94 ℃で1 分間、55℃で1 分間、72℃で45秒間、伸長
3 、3 秒間、25サイクル。この第一PCR 反応の分画(1%)
を、200ng の合成cryIA(b) DNAと一緒にテンプレートと
して使用し、完全な351 塩基対の合成: 生来融合断片を
作る。この第二PCR 反応においてPCR プライマーとして
使用するオリゴは、50ピコモルのMK35A28 、50ピコモル
のMK04A28 、及び25ピコモルのKE135A28である。このPC
R 反応混合物及びパラメーターは、先に列記したものと
同じである。得られた351 塩基対の合成: 生来融合断片
を、50μg/mlの全濃度においてプロテイナーゼK により
処理し、そして標準的な手順を使用してBst E II/KpnI
による切断の前にフェノール/ クロロホルム抽出、その
後のエタノール沈降を行う。
して2 段階で作る。第一の253 塩基対のPCR 融合断片
を、200nm のそれぞれのdNTP、1 X PCR バッファー(Per
kin Elmer Cetus)、20% グリセロール、及び5 ユニット
のTaq ポリメラーゼ(Perkin Elmer Cetus)を含む100 μ
l 中に約200ng の生来のcryIA(b)テンプレートと共に10
0 ピコモルのオリゴKE134A28及びMK04A28 を使用して作
る。このPCR 反応を、以下のパラメーターにより走らせ
る:94 ℃で1 分間、55℃で1 分間、72℃で45秒間、伸長
3 、3 秒間、25サイクル。この第一PCR 反応の分画(1%)
を、200ng の合成cryIA(b) DNAと一緒にテンプレートと
して使用し、完全な351 塩基対の合成: 生来融合断片を
作る。この第二PCR 反応においてPCR プライマーとして
使用するオリゴは、50ピコモルのMK35A28 、50ピコモル
のMK04A28 、及び25ピコモルのKE135A28である。このPC
R 反応混合物及びパラメーターは、先に列記したものと
同じである。得られた351 塩基対の合成: 生来融合断片
を、50μg/mlの全濃度においてプロテイナーゼK により
処理し、そして標準的な手順を使用してBst E II/KpnI
による切断の前にフェノール/ クロロホルム抽出、その
後のエタノール沈降を行う。
【０１９１】pCIB4434の調製において使用された224 塩
基対のNpi I/Bal II PCR断片を、上記と同じPCR 反応混
合物及び先に列記したようなパラメーターを含む100 μ
l 容量中でテンプレートとして、100 ピコモルのオリゴ
KE137A28及びKE138A28及び200ng の生来のcryIA(b)遺伝
子を使用して作る。230 塩基対のPCR 生来cryIA(b)断片
を、プロテイナーゼK により処理し、フェノール/ クロ
ロホルム抽出し、そしてNsi I/Bal IIによる切断の前に
先に記載したようにエタノール沈殿させる。
基対のNpi I/Bal II PCR断片を、上記と同じPCR 反応混
合物及び先に列記したようなパラメーターを含む100 μ
l 容量中でテンプレートとして、100 ピコモルのオリゴ
KE137A28及びKE138A28及び200ng の生来のcryIA(b)遺伝
子を使用して作る。230 塩基対のPCR 生来cryIA(b)断片
を、プロテイナーゼK により処理し、フェノール/ クロ
ロホルム抽出し、そしてNsi I/Bal IIによる切断の前に
先に記載したようにエタノール沈殿させる。
【０１９２】pCIB4434を、先に記載したようにメイズ・
プロトプラスト中に形質転換した。系6 2717プロトプラ
ストを、比較のための対照としてpCIB4434及びpCIB4419
と共に使用した。結果を以下に示す:
プロトプラスト中に形質転換した。系6 2717プロトプラ
ストを、比較のための対照としてpCIB4434及びpCIB4419
と共に使用した。結果を以下に示す:
【０１９３】
ng Bt/mg蛋白
4419(35S) 14,400±2,100
4434( 完全長) 2,200± 900
背景= 未形質転換プロトプラストについて、13ng Bt/ mg 蛋白
【０１９４】上記の結果は、pCIB4434がpCIB4419の約15
% のレベルにおいて発現していることを示している。ウ
ェスタン・ブロット分析は、本系内のpCIB4434により生
産されたcryIA(b)蛋白の少なくとも3 分の1 がサイズ約
130kD であることを示す。それ故、有意な量の完全長cr
yIA(b)蛋白が、pCIB4434の発現からメイズ細胞内で生産
される。
% のレベルにおいて発現していることを示している。ウ
ェスタン・ブロット分析は、本系内のpCIB4434により生
産されたcryIA(b)蛋白の少なくとも3 分の1 がサイズ約
130kD であることを示す。それ故、有意な量の完全長cr
yIA(b)蛋白が、pCIB4434の発現からメイズ細胞内で生産
される。
【０１９５】例7: 温度耐性cryIA(b)蛋白をコードして
いる完全長、cryIA(b)遺伝子の構築 完全長のcryIA(b)遺伝子をそれぞれが含む構築物pCIB55
11-5515 を、以下に記載する。これらの配列内では、cr
yIA(a)及びcryIA(c)内には存在するがcryIA(b)内には存
在しないアミノ酸793 及び794 の間の26アミノ酸の欠
失、KCGEPNRCAPHLEWNPDLDCSCRDGEが修復されていた。pC
IB5513内の遺伝子は、合成のものであり;たの4 つの遺
伝子は、ハイブリッドであり、そしてそれ故、部分的に
メイズ最適化されている。
いる完全長、cryIA(b)遺伝子の構築 完全長のcryIA(b)遺伝子をそれぞれが含む構築物pCIB55
11-5515 を、以下に記載する。これらの配列内では、cr
yIA(a)及びcryIA(c)内には存在するがcryIA(b)内には存
在しないアミノ酸793 及び794 の間の26アミノ酸の欠
失、KCGEPNRCAPHLEWNPDLDCSCRDGEが修復されていた。pC
IB5513内の遺伝子は、合成のものであり;たの4 つの遺
伝子は、ハイブリッドであり、そしてそれ故、部分的に
メイズ最適化されている。
【０１９６】pCIB5511の構築
このプラスミドは、pCIB5511の誘導体である。pCIB5511
のマップをFig.10中に示す。2165と2590との間のDNA の
435 塩基対のセグメントを、切り詰められたcryIA(b)遺
伝子の構築について先に記載したように、上及び下スト
ランド(upper and lower strand)を現すように設計され
た合成オリゴマーのハイブリダイゼーションにより構築
した。合成DNA のこのセグメントは、当業者に知られた
標準的な技術を使用して合成され、そしてバチルス・ス
リンギエンシス(Bacillus thuringiensis) kurstaki HD
-1内においてはcryIA(b)蛋白内で天然に生じることが見
つかっている上記の26アミノ酸の欠失を含んでいる。DN
A の完全な挿入セグメントは、アミノ酸をコードするた
めのメイズ最適化コドン選択物を使用している。天然の
欠失を修復するために使用される26アミノ酸は、上記の
断片内に含まれる。それらは、pCIB4434のnt 2170 にお
けるKpnI部位とnt 2058 (pCIB5511 内の2586) における
XbaI部位との間の2387位において開始を挿入されてい
る。pCIB5511を、SphI及びKpnIによるpCIB4434の制限消
化により得られた3.2Kb 断片、SphI及びXbaIによるpCIB
4434の消化により得られた3.8Kb 断片、及びKpnI及びXb
aIにより、先に記載した合成DNA の消化により得られた
416 塩基対の断片を使用した3 方結合を介して構築す
る。酵素反応を、標準的な条件下で行う。結合後、DNA
混合物を、標準的な手順を使用してコンピテント大腸菌
(E.coli)細胞中に形質転換する。形質転換細胞を、100
μg/mlアンピシリンを含むL-寒天上で選択する。形質転
換細胞内のプラスミドを、標準的なミニ- スクリーン手
順を使用して特徴ずける。cryIA(b)温度( 熱) 安定性蛋
白をコードしている修復cryIA(b)遺伝子の配列を、Fig.
9 中に記載する。
のマップをFig.10中に示す。2165と2590との間のDNA の
435 塩基対のセグメントを、切り詰められたcryIA(b)遺
伝子の構築について先に記載したように、上及び下スト
ランド(upper and lower strand)を現すように設計され
た合成オリゴマーのハイブリダイゼーションにより構築
した。合成DNA のこのセグメントは、当業者に知られた
標準的な技術を使用して合成され、そしてバチルス・ス
リンギエンシス(Bacillus thuringiensis) kurstaki HD
-1内においてはcryIA(b)蛋白内で天然に生じることが見
つかっている上記の26アミノ酸の欠失を含んでいる。DN
A の完全な挿入セグメントは、アミノ酸をコードするた
めのメイズ最適化コドン選択物を使用している。天然の
欠失を修復するために使用される26アミノ酸は、上記の
断片内に含まれる。それらは、pCIB4434のnt 2170 にお
けるKpnI部位とnt 2058 (pCIB5511 内の2586) における
XbaI部位との間の2387位において開始を挿入されてい
る。pCIB5511を、SphI及びKpnIによるpCIB4434の制限消
化により得られた3.2Kb 断片、SphI及びXbaIによるpCIB
4434の消化により得られた3.8Kb 断片、及びKpnI及びXb
aIにより、先に記載した合成DNA の消化により得られた
416 塩基対の断片を使用した3 方結合を介して構築す
る。酵素反応を、標準的な条件下で行う。結合後、DNA
混合物を、標準的な手順を使用してコンピテント大腸菌
(E.coli)細胞中に形質転換する。形質転換細胞を、100
μg/mlアンピシリンを含むL-寒天上で選択する。形質転
換細胞内のプラスミドを、標準的なミニ- スクリーン手
順を使用して特徴ずける。cryIA(b)温度( 熱) 安定性蛋
白をコードしている修復cryIA(b)遺伝子の配列を、Fig.
9 中に記載する。
【０１９７】pCIB5512の構築
このプラスミド構築物は、pCIB4434の誘導体である。pC
IB5512のマップを、Fig.12中に示す。26アミノ酸欠失を
修復するためのDNA を、DNA 合成及び酵素反応の標準的
な技術を使用して調製する。3 つの2 本鎖DNA カセッ
ト、pGFcas1 、pGFcas2 及びpGFcas3 であってそれぞれ
約300 塩基対のサイズのものを、調製する。これらのカ
セットは、メイズ最適化コドンを含みながら殺虫性蛋白
と100%同じアミノ酸を維持するように設計されている。
これらのカセットは、1824位における制限部位BstEIIと
2058位におけるXbaIとの間の領域を置き換えるために使
用され、そして失われた26アミノ酸(pCIB4434 中でpCIB
5511について先に記載したもの) をコードしている追加
の78塩基対の挿入を含んでいる。これらのカセットのそ
れぞれを、標準的な技術によりベクターBluescript(Str
atagene)のEcoRV 部位中にクローン化する。3 つのカセ
ットは、重複した制限部位を含むように設計されてい
る。カセット1 は、5'末端における制限部位BstEII及び
3'末端におけるEcoRV をもち; カセット2 は、5'末端に
おけるEcoRV 及び3'末端におけるClaIをもち、そしてカ
セット3 は、5'末端におけるClaI及び3'末端におけるXb
aIをもつ。pCIB5512を、この762 塩基対断片を使用して
結合させ、そしてBstEIIによるpCIB4434の完全消化及び
XbaIによる部分消化により得られた6.65Kb断片とそれを
結合する。あるいは、上記と同じベクターを使用した4
方結合及び特異的酵素により消化した3 つのカセットを
使用することができる。酵素反応を、標準的な条件下で
行う。結合後、DNA 混合物を、標準的な手順を使用して
コンピテント大腸菌(E.coli)細胞中に形質転換させる。
形質転換細胞を、100 μg/mlアンピシリンを含むL-寒天
上で選択する。形質転換細胞内のプラスミドを、標準的
なミニ- スクリーン手順を使用して特徴ずける。得られ
たプラスミドは、pCIB5512である。修復cryIA(b)遺伝子
の配列を、Fig.11中に例示する。この修復されたcryIA
(b)は、pCIB5511内で行われたものとは異なっており、p
CIB5511内では、cryIA(b)コード領域のより大きな領域
がメイズ好適コドンの使用によりメイズの発現のために
最適化されている。
IB5512のマップを、Fig.12中に示す。26アミノ酸欠失を
修復するためのDNA を、DNA 合成及び酵素反応の標準的
な技術を使用して調製する。3 つの2 本鎖DNA カセッ
ト、pGFcas1 、pGFcas2 及びpGFcas3 であってそれぞれ
約300 塩基対のサイズのものを、調製する。これらのカ
セットは、メイズ最適化コドンを含みながら殺虫性蛋白
と100%同じアミノ酸を維持するように設計されている。
これらのカセットは、1824位における制限部位BstEIIと
2058位におけるXbaIとの間の領域を置き換えるために使
用され、そして失われた26アミノ酸(pCIB4434 中でpCIB
5511について先に記載したもの) をコードしている追加
の78塩基対の挿入を含んでいる。これらのカセットのそ
れぞれを、標準的な技術によりベクターBluescript(Str
atagene)のEcoRV 部位中にクローン化する。3 つのカセ
ットは、重複した制限部位を含むように設計されてい
る。カセット1 は、5'末端における制限部位BstEII及び
3'末端におけるEcoRV をもち; カセット2 は、5'末端に
おけるEcoRV 及び3'末端におけるClaIをもち、そしてカ
セット3 は、5'末端におけるClaI及び3'末端におけるXb
aIをもつ。pCIB5512を、この762 塩基対断片を使用して
結合させ、そしてBstEIIによるpCIB4434の完全消化及び
XbaIによる部分消化により得られた6.65Kb断片とそれを
結合する。あるいは、上記と同じベクターを使用した4
方結合及び特異的酵素により消化した3 つのカセットを
使用することができる。酵素反応を、標準的な条件下で
行う。結合後、DNA 混合物を、標準的な手順を使用して
コンピテント大腸菌(E.coli)細胞中に形質転換させる。
形質転換細胞を、100 μg/mlアンピシリンを含むL-寒天
上で選択する。形質転換細胞内のプラスミドを、標準的
なミニ- スクリーン手順を使用して特徴ずける。得られ
たプラスミドは、pCIB5512である。修復cryIA(b)遺伝子
の配列を、Fig.11中に例示する。この修復されたcryIA
(b)は、pCIB5511内で行われたものとは異なっており、p
CIB5511内では、cryIA(b)コード領域のより大きな領域
がメイズ好適コドンの使用によりメイズの発現のために
最適化されている。
【０１９８】pCIB5513の構築
このプラスミドは、pCIB5512から得られた修復されたcr
yIA(b)遺伝子を含んでいる。pCIB5513のマップを、Fig.
14中に示す。2586位におけるXbaI部位からこの遺伝子の
末端(3572 位におけるBglII 部位) までの3'領域を、メ
イズ最適化コドンにより完全に置き換える。この領域
を、4 つの2 本鎖DNA カセット( カセット#4、5 、6 、
7)として、当業者に知られたDNA 合成及び酵素反応の標
準的な技術を使用して、合成する。隣接するカセット
は、カセット間の結合を容易にするための重複した制限
部位をもっている。これらは、カセット4 の5'及び3'に
おけるXbaI及びXhoI; カセット5 の、5'及び3'末端にお
けるそれぞれXhoI及びSacI; カセット6 の、5'及び3'末
端におけるそれぞれSacI及びBstXI;及び、カセット7
の、5'及び3'末端におけるそれぞれBstXI 及びBglII で
ある。pCIB5512のために記載したように、このカセット
を、Bluescriptベクター(Stratagene)の平滑末端EcoRV
部位中にクローン化し、そして完全長の" 修復された"c
ryIA(b) 遺伝子を、Bluescript内の先のカセットの順次
結合、その後の完全967 塩基対合成領域と、BglII によ
るpCIB5512の完全消化及びXbaIによる部分消化により得
られた6448塩基対の断片との結合のいずれかにより、ク
ローン化する。あるいは、完全長遺伝子を含むプラスミ
ドを、上記の4 つのカセットのそれぞれ( 適当な酵素に
よる解裂の後に) と上記と同じベクターとの5-方結合に
より得る。この完全長の、" 修復された"cryIA(b) 遺伝
子を、Fig.13中に記載する。様々な合成及び合成/ 生来
コード領域キメラによりコードされている蛋白は、同一
の蛋白をコードしている。この蛋白は、この相同的な領
域をcryIA(a)又はcryIA(c)バチルス・スリンギエンシス
(Bacillus thuringiensis)デルタ- エンドトキシン(end
otoxin(内毒素))のいずれかと比較したとき、バチルス
・スリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)からのcr
yIA(b)遺伝子内に見つけられる天然の26アミノ酸欠失を
修復することにより作られるcryIA(b)の熱安定性の変異
体である。
yIA(b)遺伝子を含んでいる。pCIB5513のマップを、Fig.
14中に示す。2586位におけるXbaI部位からこの遺伝子の
末端(3572 位におけるBglII 部位) までの3'領域を、メ
イズ最適化コドンにより完全に置き換える。この領域
を、4 つの2 本鎖DNA カセット( カセット#4、5 、6 、
7)として、当業者に知られたDNA 合成及び酵素反応の標
準的な技術を使用して、合成する。隣接するカセット
は、カセット間の結合を容易にするための重複した制限
部位をもっている。これらは、カセット4 の5'及び3'に
おけるXbaI及びXhoI; カセット5 の、5'及び3'末端にお
けるそれぞれXhoI及びSacI; カセット6 の、5'及び3'末
端におけるそれぞれSacI及びBstXI;及び、カセット7
の、5'及び3'末端におけるそれぞれBstXI 及びBglII で
ある。pCIB5512のために記載したように、このカセット
を、Bluescriptベクター(Stratagene)の平滑末端EcoRV
部位中にクローン化し、そして完全長の" 修復された"c
ryIA(b) 遺伝子を、Bluescript内の先のカセットの順次
結合、その後の完全967 塩基対合成領域と、BglII によ
るpCIB5512の完全消化及びXbaIによる部分消化により得
られた6448塩基対の断片との結合のいずれかにより、ク
ローン化する。あるいは、完全長遺伝子を含むプラスミ
ドを、上記の4 つのカセットのそれぞれ( 適当な酵素に
よる解裂の後に) と上記と同じベクターとの5-方結合に
より得る。この完全長の、" 修復された"cryIA(b) 遺伝
子を、Fig.13中に記載する。様々な合成及び合成/ 生来
コード領域キメラによりコードされている蛋白は、同一
の蛋白をコードしている。この蛋白は、この相同的な領
域をcryIA(a)又はcryIA(c)バチルス・スリンギエンシス
(Bacillus thuringiensis)デルタ- エンドトキシン(end
otoxin(内毒素))のいずれかと比較したとき、バチルス
・スリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)からのcr
yIA(b)遺伝子内に見つけられる天然の26アミノ酸欠失を
修復することにより作られるcryIA(b)の熱安定性の変異
体である。
【０１９９】pCIB5514の構築
本プラスミドは、pCIB4434の誘導体である。pCIB5514の
マップをFig.16中に示す。これを、26アミノ酸の熱安定
性領域内にあるClaI部位(2396 位) とpCIB4434内の2508
位(pCIB5511 内の2586) におけるXbaI部位との間の領域
のメイズ最適化配列を含む合成DNA カセット#3( 上記参
照のこと) を使用して作る。pCIB4434のnt 2113 と上記
の熱安定性領域の連結部との間の領域を、以下のプライ
マーをもつテンプレートとしてpCIB4434を使用すること
によりPCR 増幅する:
マップをFig.16中に示す。これを、26アミノ酸の熱安定
性領域内にあるClaI部位(2396 位) とpCIB4434内の2508
位(pCIB5511 内の2586) におけるXbaI部位との間の領域
のメイズ最適化配列を含む合成DNA カセット#3( 上記参
照のこと) を使用して作る。pCIB4434のnt 2113 と上記
の熱安定性領域の連結部との間の領域を、以下のプライ
マーをもつテンプレートとしてpCIB4434を使用すること
によりPCR 増幅する:
【０２００】前進:5'-GCACCGATATCACCATCCAAGGAGGCGATG
ACGTATTCAAAG-3' 復帰:5'-AGCGCATCGATTCGGCTCCCCGCACTTGCCGATTGGACTTGG
GGCTGAAAG-3'。
ACGTATTCAAAG-3' 復帰:5'-AGCGCATCGATTCGGCTCCCCGCACTTGCCGATTGGACTTGG
GGCTGAAAG-3'。
【０２０１】PCR 生成物を次に制限酵素kpnI及びClaIに
より消化し、そしてClaI及びXbaIによるカセット3 の消
化により得られた189 塩基対の断片、SphI及びKpnIによ
り消化されたpCIB4434の3.2Kb 断片、及びSphI及びXba
による消化により得られたpCIB4434の3.8Kb 断片による
4 部反応において結合する。酵素反応を、標準的な条件
の下で行う。結合生成物を、アンピシリンにより選択さ
れたコンピテント大腸菌(E.coli)中に形質転換し、そし
て先に記載したような標準的な手順を使用してスクリー
ンする。pCIB5514内に含まれる修復されたcryIA(b)遺伝
子の配列を、Fig.15中に示す。
より消化し、そしてClaI及びXbaIによるカセット3 の消
化により得られた189 塩基対の断片、SphI及びKpnIによ
り消化されたpCIB4434の3.2Kb 断片、及びSphI及びXba
による消化により得られたpCIB4434の3.8Kb 断片による
4 部反応において結合する。酵素反応を、標準的な条件
の下で行う。結合生成物を、アンピシリンにより選択さ
れたコンピテント大腸菌(E.coli)中に形質転換し、そし
て先に記載したような標準的な手順を使用してスクリー
ンする。pCIB5514内に含まれる修復されたcryIA(b)遺伝
子の配列を、Fig.15中に示す。
【０２０２】pCIB5515の構築
pCIB4434を、先に記載した78塩基対のGeiser熱安定性因
子(Geiser TSE)を、生来のBtk 領域内のKpnI部位(2170
塩基対) とXbaI部位(2508 塩基対) との間に添加するこ
とにより修飾した。正確な挿入部位は、ヌクレオチド#2
379 において開始される。Geiser TSEを含む領域を、2
セットのPCR 反応物、すなわち、KpnI-Geiser TSE 断片
及びGeiser TSE-XbaI 断片により増幅した。
子(Geiser TSE)を、生来のBtk 領域内のKpnI部位(2170
塩基対) とXbaI部位(2508 塩基対) との間に添加するこ
とにより修飾した。正確な挿入部位は、ヌクレオチド#2
379 において開始される。Geiser TSEを含む領域を、2
セットのPCR 反応物、すなわち、KpnI-Geiser TSE 断片
及びGeiser TSE-XbaI 断片により増幅した。
【０２０３】PCR プライマー#1:(KpnI部位)
5'-ATTACGTTAC GCTATTGGGT ACCTTTGATG-3'
【０２０４】
【０２０５】
【０２０６】PCR プライマー#4:(XbaI部位)
5'-TGGTTTCTCT TCGAGAAATT CTAGATTTCC-3'
【０２０７】増幅後、PCR 断片を、それぞれ(KpnI + Cl
aI) 及び(ClaI + XbaI) により消化させた。これらの2
つの断片を、KpnI及びXbaI消化pCIB4434に結合させた。
得られた構築物pCIB5515は、Geiser TSEをもつpCIB4434
であり、そして余分なClaI部位がKpnI及びXbaIに隣接し
ている。pCIB5515のマップを、Fig.38中に例示する。本
明細書中に含まれるcryIA(b)遺伝子であって熱安定性の
cryIA(b)蛋白をコードしているものを、Fig.37中に示
す。
aI) 及び(ClaI + XbaI) により消化させた。これらの2
つの断片を、KpnI及びXbaI消化pCIB4434に結合させた。
得られた構築物pCIB5515は、Geiser TSEをもつpCIB4434
であり、そして余分なClaI部位がKpnI及びXbaIに隣接し
ている。pCIB5515のマップを、Fig.38中に例示する。本
明細書中に含まれるcryIA(b)遺伝子であって熱安定性の
cryIA(b)蛋白をコードしているものを、Fig.37中に示
す。
【０２０８】以下に述べる例9-20は、髄- 好適(pith-pr
eferred)プロモーターの単離及び特徴付けに向けられて
いる。
eferred)プロモーターの単離及び特徴付けに向けられて
いる。
【０２０９】例9: RNA 単離及びノーザン・ブロット
RNA のすべてを、グリーンハウス条件下で栽培した植物
から単離する。全RNAを、Kramer et al., Plant Physio
l., 90:1214-1220 中に記載されたように、Funkメイズ
系5N984 の以下の組織から単離した:8、11、15、25、3
5、40、及び60日目のグリーンハウスの葉;8、11、15、2
5、35、39、46、60及び70日目の髄;Funkメイズ系5N984
からの60及び70日目の支持根;60 及び70日目の5N984 鞘
及び穂のストック。また、RNA を、14日目の211D根か
ら、そして受粉後1 〜5 週間の間、1 週間毎の発育種か
ら単離した。ポリA + RNA を、Sambrook et al., Molec
ularCloning: A Laboratory Manual (2nd ed.),1989に
より記載されているようなオリゴ-dT を使用して単離
し、そしてまた、Sambrook et al. により、全RNA(30μ
g)又はポリA + RNA(2-10μg)のいずれかを使用してノー
ザン・ブロットを行った。
から単離する。全RNAを、Kramer et al., Plant Physio
l., 90:1214-1220 中に記載されたように、Funkメイズ
系5N984 の以下の組織から単離した:8、11、15、25、3
5、40、及び60日目のグリーンハウスの葉;8、11、15、2
5、35、39、46、60及び70日目の髄;Funkメイズ系5N984
からの60及び70日目の支持根;60 及び70日目の5N984 鞘
及び穂のストック。また、RNA を、14日目の211D根か
ら、そして受粉後1 〜5 週間の間、1 週間毎の発育種か
ら単離した。ポリA + RNA を、Sambrook et al., Molec
ularCloning: A Laboratory Manual (2nd ed.),1989に
より記載されているようなオリゴ-dT を使用して単離
し、そしてまた、Sambrook et al. により、全RNA(30μ
g)又はポリA + RNA(2-10μg)のいずれかを使用してノー
ザン・ブロットを行った。
【０２１０】電気泳動の後、RNA を、Nitroplus 2000膜
(Micron Separations Inc)上にブロットした。このRNA
を、Stratalinker(Stratagene)を使用して0.2mジュール
においてそのフィルターに結合させた。このノーザン
を、TBE バッファー系中の0.8%の低融点アガロースを使
用して単離した1200塩基対のEcoRI 髄(TrpA)8-2 cDNA断
片によりプローブした。ノーザンをハイブリダイズさ
せ、そして洗浄し、そしてこのフィルターをcDNAクロー
ンの単離において記載したようにフィルムに露出させ
た。
(Micron Separations Inc)上にブロットした。このRNA
を、Stratalinker(Stratagene)を使用して0.2mジュール
においてそのフィルターに結合させた。このノーザン
を、TBE バッファー系中の0.8%の低融点アガロースを使
用して単離した1200塩基対のEcoRI 髄(TrpA)8-2 cDNA断
片によりプローブした。ノーザンをハイブリダイズさ
せ、そして洗浄し、そしてこのフィルターをcDNAクロー
ンの単離において記載したようにフィルムに露出させ
た。
【０２１１】例10: cDNAクローンの単離
第一ストランドcDNA合成を、供給者(Life Technologie
s, Inc., Gaithersburg, MD) により特記された条件を
使用してBRL AMV 逆転写酵素を使用して行った。特に、
50mM Tris-HCl pH 8.3、20mM KCl、1mM DTT 、6mM MgCl
2 、1mM のそれぞれのdNTP、0.1mM オリゴ(dt)12-18 、
2 μg の髄ポリ(A+)RNA 、100 μg/mlのBSA 、50μg/ml
のアクチノマイシンD 、8 ユニットの胎盤性(placenta
l)RNaseインヒビター、トレーサーとしての1 μl (10mM
Ci/ml) 32 P dCTP>3000 mCi/mM、及び30ユニットのAMV
逆転写酵素を含む25μl の反応物を、42℃において30
分間インキュベートした。追加のKCl を、50mMの濃度ま
で添加し、そしてインキュベーションを42℃においてさ
らに30分間続けた。KCl を、再び添加し、100mM の最終
濃度にする。他の成分に追加の10ユニットを加えたもの
の出発濃度を維持するために追加のAMV 逆転写酵素反応
バッファーを添加し、そしてインキュベーションを、42
℃でさらに30分間続けた。第二ストランド合成を、EcoR
I リンカーを含むRiboclone cDNA合成系(Promega, Madi
son, WI)を使用して行う。2 本鎖cDNAは、Sambrook et
al.,中に開示されたようなTris- ボレート-EDTA バッフ
ァーを使用して1%アガロース・ゲル上でサイズ決定さ
れ、そして平均サイズ約1.2Kb を示していた。このcDNA
を、供給者(Schleicher and Schuell)により特定された
条件を使用して約1000以上の塩基対のそれらの分子を保
持するように NA45 DEAE膜を使用してサイズ分画した。
サイズ分画されたcDNAを、Lambda ZapIIベクター(Strat
agene, La Jolla, CA)中に結合し、そしてGigapack II
Plus(Stratagene, La Jolla, CA)を使用してラムダ粒子
中にパッケージングした。この未増幅ライブラリーは、
315,000pfuのタイターをもち、一方、増幅されたライブ
ラリーは、PLK-F'細胞を使用して3.5 ビリオン/ml のタ
イターをもっていた。
s, Inc., Gaithersburg, MD) により特記された条件を
使用してBRL AMV 逆転写酵素を使用して行った。特に、
50mM Tris-HCl pH 8.3、20mM KCl、1mM DTT 、6mM MgCl
2 、1mM のそれぞれのdNTP、0.1mM オリゴ(dt)12-18 、
2 μg の髄ポリ(A+)RNA 、100 μg/mlのBSA 、50μg/ml
のアクチノマイシンD 、8 ユニットの胎盤性(placenta
l)RNaseインヒビター、トレーサーとしての1 μl (10mM
Ci/ml) 32 P dCTP>3000 mCi/mM、及び30ユニットのAMV
逆転写酵素を含む25μl の反応物を、42℃において30
分間インキュベートした。追加のKCl を、50mMの濃度ま
で添加し、そしてインキュベーションを42℃においてさ
らに30分間続けた。KCl を、再び添加し、100mM の最終
濃度にする。他の成分に追加の10ユニットを加えたもの
の出発濃度を維持するために追加のAMV 逆転写酵素反応
バッファーを添加し、そしてインキュベーションを、42
℃でさらに30分間続けた。第二ストランド合成を、EcoR
I リンカーを含むRiboclone cDNA合成系(Promega, Madi
son, WI)を使用して行う。2 本鎖cDNAは、Sambrook et
al.,中に開示されたようなTris- ボレート-EDTA バッフ
ァーを使用して1%アガロース・ゲル上でサイズ決定さ
れ、そして平均サイズ約1.2Kb を示していた。このcDNA
を、供給者(Schleicher and Schuell)により特定された
条件を使用して約1000以上の塩基対のそれらの分子を保
持するように NA45 DEAE膜を使用してサイズ分画した。
サイズ分画されたcDNAを、Lambda ZapIIベクター(Strat
agene, La Jolla, CA)中に結合し、そしてGigapack II
Plus(Stratagene, La Jolla, CA)を使用してラムダ粒子
中にパッケージングした。この未増幅ライブラリーは、
315,000pfuのタイターをもち、一方、増幅されたライブ
ラリーは、PLK-F'細胞を使用して3.5 ビリオン/ml のタ
イターをもっていた。
【０２１２】組換えファージを、150 x 15mm L- 寒天プ
レート上に5000 pfuの密度においてプレーティングし
た。50,000ファージの全部を、それぞれのプレートから
2 連リフトを使用してスクリーンし、そして第一ストラ
ンドDNA のプローブを髄誘導mRNA又は種誘導mRNAのいず
れかから作った。このリフトを、ニトロセルロース・フ
ィルターを使用してSambrook et al. 中に記載したよう
に行った。DNA を、0.2mジュールにおいてStratalinker
(Stratagene, La Jolla, CA)を使用してUV架橋形成によ
りこのフィルターに固定した。このフィルターの前ハイ
ブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを、10
X Denhardts 溶液、150 μg/ml剪断サケ精子DNA 、1%SD
S 、50mMリン酸ナトリウムpH 7、5mM EDTA、6X SSC、0.
05% ピロリン酸ナトリウムの溶液中で行った。前ハイブ
リダイゼーションは、62℃において4 時間であり、そし
てハイブリダイゼーションは、40mlの容量における1 ミ
リオンcpm/mlにより、62℃において18時間( 一夜) であ
った。フィルターを、室温において15分間、2X SSC、0.
5%SDS の500ml 中で、次に30分間、0.1X SSC、0.5% SDS
中で63℃において洗浄した。
レート上に5000 pfuの密度においてプレーティングし
た。50,000ファージの全部を、それぞれのプレートから
2 連リフトを使用してスクリーンし、そして第一ストラ
ンドDNA のプローブを髄誘導mRNA又は種誘導mRNAのいず
れかから作った。このリフトを、ニトロセルロース・フ
ィルターを使用してSambrook et al. 中に記載したよう
に行った。DNA を、0.2mジュールにおいてStratalinker
(Stratagene, La Jolla, CA)を使用してUV架橋形成によ
りこのフィルターに固定した。このフィルターの前ハイ
ブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを、10
X Denhardts 溶液、150 μg/ml剪断サケ精子DNA 、1%SD
S 、50mMリン酸ナトリウムpH 7、5mM EDTA、6X SSC、0.
05% ピロリン酸ナトリウムの溶液中で行った。前ハイブ
リダイゼーションは、62℃において4 時間であり、そし
てハイブリダイゼーションは、40mlの容量における1 ミ
リオンcpm/mlにより、62℃において18時間( 一夜) であ
った。フィルターを、室温において15分間、2X SSC、0.
5%SDS の500ml 中で、次に30分間、0.1X SSC、0.5% SDS
中で63℃において洗浄した。
【０２１３】放射ラベルされたDNA プローブを、BRL ラ
ンダム・プライム標識付け装置を使用して行い、そして
非取り込みカウントを、Nickカラム(Pharmacia) を使用
して除去した。フィルターを、-80 ℃における(Dupont)
Cornex Lightning Plus 増感スクリーンにより、Kodak
X-Omat AR X-線フィルムに一夜露出させた。種誘導プロ
ーブとではなく髄誘導プローブとのハイブリダイゼーシ
ョンを示すプラークを、さらに特徴付けするためにプラ
ーク精製した。
ンダム・プライム標識付け装置を使用して行い、そして
非取り込みカウントを、Nickカラム(Pharmacia) を使用
して除去した。フィルターを、-80 ℃における(Dupont)
Cornex Lightning Plus 増感スクリーンにより、Kodak
X-Omat AR X-線フィルムに一夜露出させた。種誘導プロ
ーブとではなく髄誘導プローブとのハイブリダイゼーシ
ョンを示すプラークを、さらに特徴付けするためにプラ
ーク精製した。
【０２１４】例11: ゲノム・クローンの単離
Funk同系メイズ系211DからのゲノムDNA を、Shure et a
l., Cell,35:225-233(1988) により記載されているよう
に単離した。このDNA を、Sau 3Aにより部分的に消化
し、そして次にBeckman SW40ローター内で22,000rpm に
おいて20時間、20℃において遠心分離した、10-40%シュ
クロース・グラジエント上でサイズ分画した。9-23Kbの
レンジ内の画分をプールし、そしてエタノール沈降させ
た。BamHIにより切断されたLambda Dash II(Stratagen
e)を、供給者により記載されているように使用した。こ
のライブラリーを、未増幅スクリーンし、そして300,00
0pfuのすべてを、先に記載した条件を使用してスクリー
ンした。このライブラリーを、髄特異的(TrpA)cDNAクロ
ーン8-2 を使用してプローブし、pCIB5600を、cDNAライ
ブラリーの差異に基づくスクリーンにおいて同定した。
単離されたクローンを、プラーク精製し、そして大規模
ファージ調製を、供給者により記載されているようなLa
mbdasorb(Promega) を使用して作った。単離したゲノム
・クローンを、EcoRI により消化し、そして4.8kb のEc
oRI 断片を、Bluescriptベクター(Stratagene)中にサブ
クローニングした。
l., Cell,35:225-233(1988) により記載されているよう
に単離した。このDNA を、Sau 3Aにより部分的に消化
し、そして次にBeckman SW40ローター内で22,000rpm に
おいて20時間、20℃において遠心分離した、10-40%シュ
クロース・グラジエント上でサイズ分画した。9-23Kbの
レンジ内の画分をプールし、そしてエタノール沈降させ
た。BamHIにより切断されたLambda Dash II(Stratagen
e)を、供給者により記載されているように使用した。こ
のライブラリーを、未増幅スクリーンし、そして300,00
0pfuのすべてを、先に記載した条件を使用してスクリー
ンした。このライブラリーを、髄特異的(TrpA)cDNAクロ
ーン8-2 を使用してプローブし、pCIB5600を、cDNAライ
ブラリーの差異に基づくスクリーンにおいて同定した。
単離されたクローンを、プラーク精製し、そして大規模
ファージ調製を、供給者により記載されているようなLa
mbdasorb(Promega) を使用して作った。単離したゲノム
・クローンを、EcoRI により消化し、そして4.8kb のEc
oRI 断片を、Bluescriptベクター(Stratagene)中にサブ
クローニングした。
【０２１５】例12: DNA配列及びコンピューター分析
ヌクレオチド配列決定を、Sanger et al., PNAS,74:546
3-5467(1977)中に開示さあれているようなジデオキシ連
鎖停止法を使用して行った。配列決定プライマーを、標
準的な条件を使用してApplied Biosystems model 380B
DNA シンセサイザー上で合成した。配列決定反応を、Se
quence装置(US Biochemicaal Corp.) を使用して行っ
た。ゲル分析を、Tris- ボレート-EDTA バッファー中の
7M尿素を含む6%ポリアクリルアミドの40cmゲル(BRL Gel
-Mix 6) 上で行った。配列の分析及びGeneBank内の配列
との比較を、Wisconsin 大学のGenetic Computer Group
Sequence Analysis Software(UWGCG)を使用して行っ
た。
3-5467(1977)中に開示さあれているようなジデオキシ連
鎖停止法を使用して行った。配列決定プライマーを、標
準的な条件を使用してApplied Biosystems model 380B
DNA シンセサイザー上で合成した。配列決定反応を、Se
quence装置(US Biochemicaal Corp.) を使用して行っ
た。ゲル分析を、Tris- ボレート-EDTA バッファー中の
7M尿素を含む6%ポリアクリルアミドの40cmゲル(BRL Gel
-Mix 6) 上で行った。配列の分析及びGeneBank内の配列
との比較を、Wisconsin 大学のGenetic Computer Group
Sequence Analysis Software(UWGCG)を使用して行っ
た。
【０２１６】例13: 転写開始部位のマップ作成
プライマー伸長を、Metraux et al., PNAS,86:896-900
(1988) の手順に従って行った。簡単に言えば、30μg
のメイズ髄全RNA を、50mM Tris pH 7.5、40mM KCl、3m
M MgCl2 (RT バッファー) 中で80℃まで10分間加熱し、
そして42℃まで冷却することによりプライマーとアニー
リングさせた。このRNA/プライマー混合物を、一夜ハイ
ブリダイゼーションに供した。追加のRTバッファー、6m
M までのDTT 、0.1mg/mlまでのBSA 、4 U/mlにおけるRN
Asin及び1mM におけるdNTP'sをそれぞれ添加した。次
に、8 ユニットのAMV 逆転写酵素を、添加し、そして反
応物を、37℃において1 時間静置した。使用したプライ
マーは、5'-CCGTTCGTTC CTCCTTTCGTC GAGG-3' であり、
これは、上記の転写開始に比較して+90 塩基対において
開始させる。Fig.29A を参照のこと。プライマー伸長反
応におけるものと同じプライマーを使用した配列決定ラ
ダーっを、4.8Kb ゲノム・クローンを使用して作り、そ
の転写開始部位の決定を可能にした。この配列決定反応
を、例12中に記載したように行った。
(1988) の手順に従って行った。簡単に言えば、30μg
のメイズ髄全RNA を、50mM Tris pH 7.5、40mM KCl、3m
M MgCl2 (RT バッファー) 中で80℃まで10分間加熱し、
そして42℃まで冷却することによりプライマーとアニー
リングさせた。このRNA/プライマー混合物を、一夜ハイ
ブリダイゼーションに供した。追加のRTバッファー、6m
M までのDTT 、0.1mg/mlまでのBSA 、4 U/mlにおけるRN
Asin及び1mM におけるdNTP'sをそれぞれ添加した。次
に、8 ユニットのAMV 逆転写酵素を、添加し、そして反
応物を、37℃において1 時間静置した。使用したプライ
マーは、5'-CCGTTCGTTC CTCCTTTCGTC GAGG-3' であり、
これは、上記の転写開始に比較して+90 塩基対において
開始させる。Fig.29A を参照のこと。プライマー伸長反
応におけるものと同じプライマーを使用した配列決定ラ
ダーっを、4.8Kb ゲノム・クローンを使用して作り、そ
の転写開始部位の決定を可能にした。この配列決定反応
を、例12中に記載したように行った。
【０２１７】RNase 保護を、+2から+373塩基対(cDNA の
開始) までの371 塩基対の配列が連続しているか又はそ
れが1 以上のイントロンを含むかどうかを決定するため
に使用した。Fig.29B に見られる転写開始に比較して+2
塩基対〜+387塩基対にわたる385 塩基対のSphI-NcoI 断
片を、pGEM-5Zf(+)(Promega)中にクローン化し、そして
SP6 プロモーターからのRiboprobe Gemini system(Prom
ega)を使用して転写し、供給者により記載されているよ
うに放射性アンチセンスRNA プローブを作った。RNase
保護を、Sambrook et al. 中に記載されているように行
った。(HpaIIにより切断され、そして32P-dCTPにより標
識されている)pBR322 及びKlenow断片を、分子量マーカ
ーとして使用した。ゲルは、6%アクリルアミド/7M ウレ
ア(BRL Gel-Mix 6) であり、そして60ワット定電力にお
いて走らせた。
開始) までの371 塩基対の配列が連続しているか又はそ
れが1 以上のイントロンを含むかどうかを決定するため
に使用した。Fig.29B に見られる転写開始に比較して+2
塩基対〜+387塩基対にわたる385 塩基対のSphI-NcoI 断
片を、pGEM-5Zf(+)(Promega)中にクローン化し、そして
SP6 プロモーターからのRiboprobe Gemini system(Prom
ega)を使用して転写し、供給者により記載されているよ
うに放射性アンチセンスRNA プローブを作った。RNase
保護を、Sambrook et al. 中に記載されているように行
った。(HpaIIにより切断され、そして32P-dCTPにより標
識されている)pBR322 及びKlenow断片を、分子量マーカ
ーとして使用した。ゲルは、6%アクリルアミド/7M ウレ
ア(BRL Gel-Mix 6) であり、そして60ワット定電力にお
いて走らせた。
【０２１８】例14: ゲノムのサザン・ブロット
ゲノムDNA を、Shure et al.前記の手順を使用してメイ
ズ系211Dから単離した。8 μg のゲノムDNA を、それぞ
れの制限酵素消化のために使用した。以下の酵素を、供
給者により提案されたバッファー中で使用した:BamHI、
EcoRI 、EcoRV、HindIII 、及びSacI。髄cDNAクローン
数8-2 を、遺伝子コピー数を推定するために使用した。
消化したDNA を、Tris- ボレート-EDTA バッファー系を
使用して0.7%アガロース・ゲル上で走らせた。このゲル
を、250mM HCl により15分間、前処理し、高分子量DNA
の転写を容易にした。このDNA を、Nitroplus 2000膜に
転写し、そして次に髄cDNA 8-2によりプローブした。こ
のブロットを、例10中に記載したように洗浄した。
ズ系211Dから単離した。8 μg のゲノムDNA を、それぞ
れの制限酵素消化のために使用した。以下の酵素を、供
給者により提案されたバッファー中で使用した:BamHI、
EcoRI 、EcoRV、HindIII 、及びSacI。髄cDNAクローン
数8-2 を、遺伝子コピー数を推定するために使用した。
消化したDNA を、Tris- ボレート-EDTA バッファー系を
使用して0.7%アガロース・ゲル上で走らせた。このゲル
を、250mM HCl により15分間、前処理し、高分子量DNA
の転写を容易にした。このDNA を、Nitroplus 2000膜に
転写し、そして次に髄cDNA 8-2によりプローブした。こ
のブロットを、例10中に記載したように洗浄した。
【０２１９】例15: PCR の材料及び方法
PCR 反応を、GeneAmp DNA 増幅試薬キット及びAmpliTaq
組換えTaq DNA ポリメラーゼ(Perkin Elmer Cetus)を使
用して行った。反応条件は、以下のようなものであっ
た: 反応毎に使用する0.1 〜0.5 μM のそれぞれの上記
の2 つのプライマー、Bluescript内の25ngの髄4.8Kb Ec
oRI 断片、加えて0.5mL GeneAmp 反応チューブ(Perkin
Elmer Cetus)内の全容量50μl のための供給者により記
載されているようなPCR 混合物。DNA Thermal Cycler(P
erkin Elmer Cetus) は、94℃60秒間の解裂、55℃60秒
間のアニール、及び72℃45秒間、その後の全30サイクル
の間のサイクル当たり3 秒間の伸長のために、設定され
た Step-Cycle プログラムを使用していた。以下のプラ
イマーのセットを使用した：I. 83 x 84, -429塩基対〜
-2塩基対; II. 49 x 73, -69塩基対〜+91 塩基対; III.
38 x 41, +136塩基対〜+258塩基対; 及びIV. 40 x 75,
+239 塩基対〜+372塩基対。これらを、Fig.24上にマー
クした。
組換えTaq DNA ポリメラーゼ(Perkin Elmer Cetus)を使
用して行った。反応条件は、以下のようなものであっ
た: 反応毎に使用する0.1 〜0.5 μM のそれぞれの上記
の2 つのプライマー、Bluescript内の25ngの髄4.8Kb Ec
oRI 断片、加えて0.5mL GeneAmp 反応チューブ(Perkin
Elmer Cetus)内の全容量50μl のための供給者により記
載されているようなPCR 混合物。DNA Thermal Cycler(P
erkin Elmer Cetus) は、94℃60秒間の解裂、55℃60秒
間のアニール、及び72℃45秒間、その後の全30サイクル
の間のサイクル当たり3 秒間の伸長のために、設定され
た Step-Cycle プログラムを使用していた。以下のプラ
イマーのセットを使用した：I. 83 x 84, -429塩基対〜
-2塩基対; II. 49 x 73, -69塩基対〜+91 塩基対; III.
38 x 41, +136塩基対〜+258塩基対; 及びIV. 40 x 75,
+239 塩基対〜+372塩基対。これらを、Fig.24上にマー
クした。
【０２２０】例16: 髄好適遺伝子の単離
cDNAライブラリーを、Lambda Zap中にクローン化された
髄mRNAから得て、そして髄又は種mRNAから得られた第一
ストランドcDNAを使用っしてスクリーンした。髄プロー
ブのみとハイブリダイズしたクローンをプラーク精製
し、そして再びスクリーンした。第二スクリーンを通過
したクローンを、各種メイズ組織からのRNA を含む、ノ
ーザン・ブロットにおけるプローブとして使用した。
髄mRNAから得て、そして髄又は種mRNAから得られた第一
ストランドcDNAを使用っしてスクリーンした。髄プロー
ブのみとハイブリダイズしたクローンをプラーク精製
し、そして再びスクリーンした。第二スクリーンを通過
したクローンを、各種メイズ組織からのRNA を含む、ノ
ーザン・ブロットにおけるプローブとして使用した。
【０２２１】例17: 遺伝子構造及び配列分析
cDNAクローン8-2 の1.2 Kb挿入物を、Sanger et al.,前
記のジデオキシ法を使用して配列決定した。同様に、pC
IB5601として名付けたBluescript内の4.8 Kb EcoRI断片
上に含まれるゲノムの等価物を、配列決定した。この情
報は、このコード領域のゲノムのコピーが1.7 Kbにわた
り、そして5 つのイントロンを含んでいることっを明ら
かにした。このmRNA転写物は、6 つのエクソンを現し
た。これを、Fig.24中に示す。このエクソンは、43塩基
対から313 塩基対までのサイズ内に範囲にあり、そして
イントロンは、76塩基対から130 塩基対までのサイズ内
で変動している。この遺伝子の完全な配列及びその対応
する推理アミノ酸配列を、Fig.24中に示す。この遺伝子
は、約38 kD の分子質量をもつ346 アミノ酸の蛋白をコ
ードしている。表1 中に示すように、予想される蛋白
は。シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aerug
inosa)のサブユニット蛋白との62% 類似性(similarity)
及び41% 同一性(identity)を示しており、そして他の生
物からのtrpA蛋白と高い相同性をもっている。
記のジデオキシ法を使用して配列決定した。同様に、pC
IB5601として名付けたBluescript内の4.8 Kb EcoRI断片
上に含まれるゲノムの等価物を、配列決定した。この情
報は、このコード領域のゲノムのコピーが1.7 Kbにわた
り、そして5 つのイントロンを含んでいることっを明ら
かにした。このmRNA転写物は、6 つのエクソンを現し
た。これを、Fig.24中に示す。このエクソンは、43塩基
対から313 塩基対までのサイズ内に範囲にあり、そして
イントロンは、76塩基対から130 塩基対までのサイズ内
で変動している。この遺伝子の完全な配列及びその対応
する推理アミノ酸配列を、Fig.24中に示す。この遺伝子
は、約38 kD の分子質量をもつ346 アミノ酸の蛋白をコ
ードしている。表1 中に示すように、予想される蛋白
は。シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aerug
inosa)のサブユニット蛋白との62% 類似性(similarity)
及び41% 同一性(identity)を示しており、そして他の生
物からのtrpA蛋白と高い相同性をもっている。
【０２２２】
表1
メイズTrpA遺伝子と他の生物との間のTrpA配列の保存
────────────────────────────────────
比較生物 %アミノ酸 % アミノ酸
類似性 同一性
────────────────────────────────────
ハロフェラックス・ボランシ
(Haloferax volancii) 56.4 36.1
メタノコッカス ・ボルタエ
(Methanococcus voltae) 58.1 35.1
シュードモナス ・アウルギノサ
(Pseudomonas aeruginosa) 62.5 41.8
ニューロスポラ ・クラサ
(Neurospora crassa ) 61.4 39.3
サッカロミセス ・セレビシエ
(Saccharomyces cerevisiae) 56.7 36.1
────────────────────────────────────
類似性のグループ分け、I=L=M=V 、D=E 、F=Y 、K=R 、N=Q 、S=T
【０２２３】類似性及び同一性は、UWGCG からのGAP プ
ログラムを使用して行った。Crawford et al., Ann. Re
v. Microbiol., 43:567-600 (1989)であって本明細書中
に引用により取り込むものは、バクテリアtrpA遺伝子内
の変換されたアミノ酸の領域を発見した。TrpB配列内に
見られるよりも大きな変異性(variability)を示す、遺
伝子の休止をもつ、アミノ酸49〜58、アミノ酸181 〜18
4 、及びアミノ酸213 〜216 が存在する。メイズTrpA蛋
白( 示されていない) をもつ知られたtrpA蛋白の列は、
メイズ遺伝子と他のtrpA蛋白との間の相同性がかなりの
ものであることを説明している。また、それは、他のTr
pA蛋白が互いにCrawford et al.,前記中に記載されたよ
うに比較されたとき、観察される相同性のレベルに匹敵
する。
ログラムを使用して行った。Crawford et al., Ann. Re
v. Microbiol., 43:567-600 (1989)であって本明細書中
に引用により取り込むものは、バクテリアtrpA遺伝子内
の変換されたアミノ酸の領域を発見した。TrpB配列内に
見られるよりも大きな変異性(variability)を示す、遺
伝子の休止をもつ、アミノ酸49〜58、アミノ酸181 〜18
4 、及びアミノ酸213 〜216 が存在する。メイズTrpA蛋
白( 示されていない) をもつ知られたtrpA蛋白の列は、
メイズ遺伝子と他のtrpA蛋白との間の相同性がかなりの
ものであることを説明している。また、それは、他のTr
pA蛋白が互いにCrawford et al.,前記中に記載されたよ
うに比較されたとき、観察される相同性のレベルに匹敵
する。
【０２２４】転写開始部位の位置を、そしてこの領域に
イントロンが存在するかどうかを決定するために、領域
-429塩基対から+372塩基対までの約122 塩基対〜427 塩
基対の4 つのポリメラーゼ連鎖反応(PCR) 生成断片を、
ノーザン分析のために使用した。ノーザンの結果は、PC
R プローブII、III 、IVが髄の全RNA にハイブリダイズ
し、そしてPCR プローブI がハイブリダイズしないこと
を示した。これは、その転写開始が-69 塩基対〜+90 塩
基対の領域内にあることを示していた。その転写開始部
位をより正確に位置決めするために、プライマー伸長を
使用した。Fig.29A は、転写開始に比較して+90 塩基対
に位置するプライマー(#73) がプライマー伸長のために
使用されるとき、そのてんしゃあ開始部位が+1、すなわ
ち、そのゲノム配列上の726 塩基対に位置していること
を示している。転写開始部位からの第一のATG は、+114
塩基対にある。これは、翻訳開始のための部位として役
立つと予想されるであろうATG である。このATG は、cD
NAクローン内で見つかったオープン・リーディング・フ
レーム中に走り込むオープン・リーディングを開始させ
る。この予言オープン・リーディング・フレームの第一
の60アミノ酸は、クロロプラスト過渡的ペプチドに強く
類似している。Berlyn et al. PNAS, 86:4604-4608(19
89) 及びneumann-Karlin et al., EMBO J., 5:9-13 (19
86) を参照のこと。この結果は、この蛋白がプラスチド
に対して標的化されており、そしてたぶん活性蛋白を作
るように加工されるということを示唆している。trpAプ
ロモーターにより駆動されたメイズ最適化B.t.遺伝子を
使用したメイズ葉肉(mesophyll) プロトプラスト系にお
ける過渡的発現検定は、+114塩基対におけるATG がその
融合点として使用されるとき、最も高いレベルの発現が
得られるということを示していた。その配列内の次の2
つのATG のいずれかの使用は、そのリポーター遺伝子の
発現のレベルを実質的に減少させる。+390塩基対におけ
るATG は、いくつかの活性を与えるが、+114 ATGよりも
非常に低いレベルであり、そして+201塩基対におけるAT
G は、活性を全く与えない。
イントロンが存在するかどうかを決定するために、領域
-429塩基対から+372塩基対までの約122 塩基対〜427 塩
基対の4 つのポリメラーゼ連鎖反応(PCR) 生成断片を、
ノーザン分析のために使用した。ノーザンの結果は、PC
R プローブII、III 、IVが髄の全RNA にハイブリダイズ
し、そしてPCR プローブI がハイブリダイズしないこと
を示した。これは、その転写開始が-69 塩基対〜+90 塩
基対の領域内にあることを示していた。その転写開始部
位をより正確に位置決めするために、プライマー伸長を
使用した。Fig.29A は、転写開始に比較して+90 塩基対
に位置するプライマー(#73) がプライマー伸長のために
使用されるとき、そのてんしゃあ開始部位が+1、すなわ
ち、そのゲノム配列上の726 塩基対に位置していること
を示している。転写開始部位からの第一のATG は、+114
塩基対にある。これは、翻訳開始のための部位として役
立つと予想されるであろうATG である。このATG は、cD
NAクローン内で見つかったオープン・リーディング・フ
レーム中に走り込むオープン・リーディングを開始させ
る。この予言オープン・リーディング・フレームの第一
の60アミノ酸は、クロロプラスト過渡的ペプチドに強く
類似している。Berlyn et al. PNAS, 86:4604-4608(19
89) 及びneumann-Karlin et al., EMBO J., 5:9-13 (19
86) を参照のこと。この結果は、この蛋白がプラスチド
に対して標的化されており、そしてたぶん活性蛋白を作
るように加工されるということを示唆している。trpAプ
ロモーターにより駆動されたメイズ最適化B.t.遺伝子を
使用したメイズ葉肉(mesophyll) プロトプラスト系にお
ける過渡的発現検定は、+114塩基対におけるATG がその
融合点として使用されるとき、最も高いレベルの発現が
得られるということを示していた。その配列内の次の2
つのATG のいずれかの使用は、そのリポーター遺伝子の
発現のレベルを実質的に減少させる。+390塩基対におけ
るATG は、いくつかの活性を与えるが、+114 ATGよりも
非常に低いレベルであり、そして+201塩基対におけるAT
G は、活性を全く与えない。
【０２２５】多数のTATA様ボックスが+1塩基対における
転写開始部位の上流に配置されているけれども、-132塩
基対におけるTATAATは、TATAAAの植物コンセンサスに非
常に類似している。Joshi, Nuc. Acids Res., 15:6643
-6653 (1987)を参照のこと。仮定のCCAAT 様ボックス
は、-231塩基対において発見された。ATG 開始の周囲の
ヌクレオチド配列(GCGACATGGC)は、Messing et al., Ge
netic Engineering of Plants: An Agricultural Persp
ective, Plenum Press, pp. 211-227 (1983)中に記載さ
れているような他のメイズ翻訳開始に対する相同性をも
つが、植物内のコンセンサス配列と考えられるもの(ANN
ATGGC)とは異なっている。Joshi,上記を参照のこと。仮
定のポリ(A) 付加シグナルは、そのゲノム配列上の3719
塩基対、cDNAの末端から52塩基対に位置している。この
配列は、Dean et al., Nuc. AcidsRes.14:2229-2240 (1
986) 中に記載されているようなメイズのための知られ
た配列と適合している。Dean et al., Nuc. Acids Re
s.,14:2229-2240 (1986)を参照のこと。そのcDNAの3'未
翻訳配列は、そのゲノム配列上の3775塩基対において終
了する。
転写開始部位の上流に配置されているけれども、-132塩
基対におけるTATAATは、TATAAAの植物コンセンサスに非
常に類似している。Joshi, Nuc. Acids Res., 15:6643
-6653 (1987)を参照のこと。仮定のCCAAT 様ボックス
は、-231塩基対において発見された。ATG 開始の周囲の
ヌクレオチド配列(GCGACATGGC)は、Messing et al., Ge
netic Engineering of Plants: An Agricultural Persp
ective, Plenum Press, pp. 211-227 (1983)中に記載さ
れているような他のメイズ翻訳開始に対する相同性をも
つが、植物内のコンセンサス配列と考えられるもの(ANN
ATGGC)とは異なっている。Joshi,上記を参照のこと。仮
定のポリ(A) 付加シグナルは、そのゲノム配列上の3719
塩基対、cDNAの末端から52塩基対に位置している。この
配列は、Dean et al., Nuc. AcidsRes.14:2229-2240 (1
986) 中に記載されているようなメイズのための知られ
た配列と適合している。Dean et al., Nuc. Acids Re
s.,14:2229-2240 (1986)を参照のこと。そのcDNAの3'未
翻訳配列は、そのゲノム配列上の3775塩基対において終
了する。
【０２２６】Fig.28は、髄遺伝子8-2 cDNAを使用して再
構築されるときの、おおよその遺伝子コピー数をもつメ
イズ211DゲノムDNA のサザン・ブロットを示している。
制限消化及び再構築からは、ハプロイド・ゲノム毎に存
在する1-2 コピーの遺伝子が存在するようである。この
遺伝子と低いレベルの相同性をもつ他の遺伝子は存在し
ないようである。それ故、これは、メイズ内においてユ
ニーク又は少数の遺伝子ファミリーを現している。
構築されるときの、おおよその遺伝子コピー数をもつメ
イズ211DゲノムDNA のサザン・ブロットを示している。
制限消化及び再構築からは、ハプロイド・ゲノム毎に存
在する1-2 コピーの遺伝子が存在するようである。この
遺伝子と低いレベルの相同性をもつ他の遺伝子は存在し
ないようである。それ故、これは、メイズ内においてユ
ニーク又は少数の遺伝子ファミリーを現している。
【０２２７】例18: RNase保護
mRNAの5'末端の構造を、RNase 保護を使用して決定し
た。RNase 保護を、+2塩基対から+387塩基対までの385n
t を現しているプローブを使用して行った。このゲノム
・クローンからの上記領域を、RNA 転写ベクターpGEM-5
Zf(+) 内に配置し、そして32P 標識RNA プローブをSP6
ポリメラーゼを使用して作った。このプローブ及び多ク
ローニング部位からの余分の塩基は、461 ntの転写を作
り出す。このプローブを、全髄RNA とハイブリダイズ
し、そしてその後RNase A とT1との混合物により消化
し、そして保護断片を、変性ポリアクリルアミド・ゲル
上で分析した。このゲルの分析は、約355 ntの保護断片
及び約160 ntの他の断片を示している。Fig.29B を参照
のこと。
た。RNase 保護を、+2塩基対から+387塩基対までの385n
t を現しているプローブを使用して行った。このゲノム
・クローンからの上記領域を、RNA 転写ベクターpGEM-5
Zf(+) 内に配置し、そして32P 標識RNA プローブをSP6
ポリメラーゼを使用して作った。このプローブ及び多ク
ローニング部位からの余分の塩基は、461 ntの転写を作
り出す。このプローブを、全髄RNA とハイブリダイズ
し、そしてその後RNase A とT1との混合物により消化
し、そして保護断片を、変性ポリアクリルアミド・ゲル
上で分析した。このゲルの分析は、約355 ntの保護断片
及び約160 ntの他の断片を示している。Fig.29B を参照
のこと。
【０２２８】+80 塩基対におけるプライマー(#73) を使
用したプライマー伸長が長さ90 ntの生成物を作り出す
という事実は、その転写の5'末端が+1塩基対の位置にあ
るということを立証している。この領域内のプライマー
からのプライマー伸長は、生成物を作り出し、そのよう
に、ある者は、これがまたRNase 保護検定により検出さ
れることを予想するであろう。このプライマーは、RNas
e 保護プローブの5'領域内に位置している。このcDNAク
ローンは、RNase 保護プローブの3'末端内に存在する配
列を含み、そしてこの故にこの検定において保護される
ことが予想された。ただ1 つのバンドが、これらの配列
の両方を説明することができるであろうゲルの上に存在
するので、我々は、保護断片が実際、より大きなバンド
であり、そしてより小さな単一バンドが人工産物である
ことを確信している。この領域内にイントロンがある場
合には、それぞれの末端からの断片は、そのプローブ内
に存在するであろうし、そしてこれ故にそのゲル上で検
出可能であろう。観察された2 つのバンドの中で、それ
らの中の1 つは、完全な5'領域を現しているようであ
り、それ故、我々は、この領域内に位置するイントロン
があることを信じていない。
用したプライマー伸長が長さ90 ntの生成物を作り出す
という事実は、その転写の5'末端が+1塩基対の位置にあ
るということを立証している。この領域内のプライマー
からのプライマー伸長は、生成物を作り出し、そのよう
に、ある者は、これがまたRNase 保護検定により検出さ
れることを予想するであろう。このプライマーは、RNas
e 保護プローブの5'領域内に位置している。このcDNAク
ローンは、RNase 保護プローブの3'末端内に存在する配
列を含み、そしてこの故にこの検定において保護される
ことが予想された。ただ1 つのバンドが、これらの配列
の両方を説明することができるであろうゲルの上に存在
するので、我々は、保護断片が実際、より大きなバンド
であり、そしてより小さな単一バンドが人工産物である
ことを確信している。この領域内にイントロンがある場
合には、それぞれの末端からの断片は、そのプローブ内
に存在するであろうし、そしてこれ故にそのゲル上で検
出可能であろう。観察された2 つのバンドの中で、それ
らの中の1 つは、完全な5'領域を現しているようであ
り、それ故、我々は、この領域内に位置するイントロン
があることを信じていない。
【０２２９】例19: 髄cDNA 8-2による大腸菌(E.coli)Tr
pA突然変異体の相補性 大腸菌(E.coli)のGenetic Stock Center, Yale Univers
ity からの大腸菌(E.coli)株CGSC株5531(O.H. Smith 実
験室株名称#M5004) であってMayer et al., Mol. Gen.
Genet., 137:131-142(1975) 中に記載されているような
染色体マーカーglnA3 、TrpA9825、1-,IN(rrnD-rrnE)
、thi-1 をもつものを、髄(TrpA)cDNA 8-2又はSambroo
k et al.,前記中に記載されているようなBluescriptプ
ラスミド(Stratagene)のいずれかにより形質転換した。
TrpA cDNA 8-2 を含む形質転換細胞は、最小培地上のト
リプトファンの存在なしで増殖する能力をもち、一方、
Bluescriptプラスミド(Stratagene)による形質転換細胞
又は非形質転換対照は、トリプトファンなしでは増殖す
ることができなかった。メイズTrpA遺伝子により形質転
換された細胞は、非常にゆっくり増殖し、コロニーは、
室温において数日間の増殖の後見えるようになった。す
べての株を、20μg/mlのグルタミンの有無にかかわらず
200 μg/mlグルタミン、0.01μg/mlチアミンを補われた
M9最小培地上で増殖させた。形質転換細胞のすべてを、
制限酵素分析により適切なプラスミドの存在についてチ
ェックした。トリプトファンの存在中で増殖するコロニ
ーは、すべて、サザン・ハイブリダイゼーションにより
確認するように( データを示さず)、推定のメイズTrpA
遺伝子のためのcDNAを含むクローン8-2 を含んでいた。
これらの結果は、これがメイズ・トリプトファン・シン
ターゼ・サブユニットA 蛋白であるという結論を支持し
ている。
pA突然変異体の相補性 大腸菌(E.coli)のGenetic Stock Center, Yale Univers
ity からの大腸菌(E.coli)株CGSC株5531(O.H. Smith 実
験室株名称#M5004) であってMayer et al., Mol. Gen.
Genet., 137:131-142(1975) 中に記載されているような
染色体マーカーglnA3 、TrpA9825、1-,IN(rrnD-rrnE)
、thi-1 をもつものを、髄(TrpA)cDNA 8-2又はSambroo
k et al.,前記中に記載されているようなBluescriptプ
ラスミド(Stratagene)のいずれかにより形質転換した。
TrpA cDNA 8-2 を含む形質転換細胞は、最小培地上のト
リプトファンの存在なしで増殖する能力をもち、一方、
Bluescriptプラスミド(Stratagene)による形質転換細胞
又は非形質転換対照は、トリプトファンなしでは増殖す
ることができなかった。メイズTrpA遺伝子により形質転
換された細胞は、非常にゆっくり増殖し、コロニーは、
室温において数日間の増殖の後見えるようになった。す
べての株を、20μg/mlのグルタミンの有無にかかわらず
200 μg/mlグルタミン、0.01μg/mlチアミンを補われた
M9最小培地上で増殖させた。形質転換細胞のすべてを、
制限酵素分析により適切なプラスミドの存在についてチ
ェックした。トリプトファンの存在中で増殖するコロニ
ーは、すべて、サザン・ハイブリダイゼーションにより
確認するように( データを示さず)、推定のメイズTrpA
遺伝子のためのcDNAを含むクローン8-2 を含んでいた。
これらの結果は、これがメイズ・トリプトファン・シン
ターゼ・サブユニットA 蛋白であるという結論を支持し
ている。
【０２３０】例20: 遺伝子発現
植物の全体にわたる髄- 選択的(pith-preferential) 遺
伝子の発現パターンを、調査した。また、異なるメイズ
遺伝子型を、この遺伝子の発現のパターンについて調査
した。以下の組織を、これらの研究のためのRNA 源とし
て使用した: 遺伝子型 5N984内の、髄の上部、中央、及
び下部(upper, middle, and lower pith) 、支持根(bra
ce roots) 、穂(ear) 、葉柄(shank) 、穂軸(cob);遺伝
子型211D内の、植物全体からの、髄の上部、中部、及び
下部、10日目の葉(10 day old leaves) 、14日目の根及
び髄、そして受粉後1 〜5 週間の1 週間毎に収穫された
遺伝子型211Dからの種。髄下部は、支持根の上方の2 つ
の節間(internode) から生じており、すなわち、構成さ
れており; 髄中部は、次の3 つの節間から生じており;
髄上部は、60及び70日目の植物の雄穂(tassel)の前の最
後の2 つの節間を現している。2 つの節間のみが、39日
目の植物内に存在し、そして46日目の植物については3
つの節間が在る。ノーザン・ブロット分析は、髄cDNAか
ら得られたプローブとハイブリダイズする転写物が若い
髄及び若い葉内で急激に蓄積することを示している。植
物の齢が増し、そしてそれが茎(stalk) まで成長したと
き、検出される転写の量における有意な減少が在る。Fi
g.25A-D を参照のこと。種誘導体RNA 内で検出されたの
遺伝子からのメッセージ、すなわち、全RNA 又はポリA+
RNA のいずれかは、全くない。Fig.26を参照のこと。
また、転写は、根、穂葉柄、及び鞘内で検出されたが、
髄及び幼葉組織内で検出されたような高いレベルではな
かった。Fig.25B 、25C を参照のこと。いくつかのメッ
セージは、支持根内で検出されるが、非常に低いレベル
であった。Fig.25D を参照のこと。6 つのメイズ未分化
カルス系を、ノーザン・ブロットにより分析し、そして
いずれのカルス・サンプル内においてもこの遺伝子につ
いての発現は全くなかった( データを示さず) 。この遺
伝子の発現のレベルは、非常に高い。なぜなら、TrpA遺
伝子8-2 からのプローブに対する非常に強いシグナル
を、フィルムに対するこのブロットの露出の後の2 時間
程の少ない時間の間に髄及び葉内で検出することができ
る( Fig.21A)。作られたmRNAの量は、Hudspeth et al.,
Plant Mol. Biology, 12:579-589 (1989), 他の高発現
メイズ遺伝子(Hudspeth を引用により本明細書中に取り
込む) 中に開示されているようなメイズ・ホスホエノー
ルピルベート・カルボキシラーゼ遺伝子から生じたもの
に匹敵する。
伝子の発現パターンを、調査した。また、異なるメイズ
遺伝子型を、この遺伝子の発現のパターンについて調査
した。以下の組織を、これらの研究のためのRNA 源とし
て使用した: 遺伝子型 5N984内の、髄の上部、中央、及
び下部(upper, middle, and lower pith) 、支持根(bra
ce roots) 、穂(ear) 、葉柄(shank) 、穂軸(cob);遺伝
子型211D内の、植物全体からの、髄の上部、中部、及び
下部、10日目の葉(10 day old leaves) 、14日目の根及
び髄、そして受粉後1 〜5 週間の1 週間毎に収穫された
遺伝子型211Dからの種。髄下部は、支持根の上方の2 つ
の節間(internode) から生じており、すなわち、構成さ
れており; 髄中部は、次の3 つの節間から生じており;
髄上部は、60及び70日目の植物の雄穂(tassel)の前の最
後の2 つの節間を現している。2 つの節間のみが、39日
目の植物内に存在し、そして46日目の植物については3
つの節間が在る。ノーザン・ブロット分析は、髄cDNAか
ら得られたプローブとハイブリダイズする転写物が若い
髄及び若い葉内で急激に蓄積することを示している。植
物の齢が増し、そしてそれが茎(stalk) まで成長したと
き、検出される転写の量における有意な減少が在る。Fi
g.25A-D を参照のこと。種誘導体RNA 内で検出されたの
遺伝子からのメッセージ、すなわち、全RNA 又はポリA+
RNA のいずれかは、全くない。Fig.26を参照のこと。
また、転写は、根、穂葉柄、及び鞘内で検出されたが、
髄及び幼葉組織内で検出されたような高いレベルではな
かった。Fig.25B 、25C を参照のこと。いくつかのメッ
セージは、支持根内で検出されるが、非常に低いレベル
であった。Fig.25D を参照のこと。6 つのメイズ未分化
カルス系を、ノーザン・ブロットにより分析し、そして
いずれのカルス・サンプル内においてもこの遺伝子につ
いての発現は全くなかった( データを示さず) 。この遺
伝子の発現のレベルは、非常に高い。なぜなら、TrpA遺
伝子8-2 からのプローブに対する非常に強いシグナル
を、フィルムに対するこのブロットの露出の後の2 時間
程の少ない時間の間に髄及び葉内で検出することができ
る( Fig.21A)。作られたmRNAの量は、Hudspeth et al.,
Plant Mol. Biology, 12:579-589 (1989), 他の高発現
メイズ遺伝子(Hudspeth を引用により本明細書中に取り
込む) 中に開示されているようなメイズ・ホスホエノー
ルピルベート・カルボキシラーゼ遺伝子から生じたもの
に匹敵する。
【０２３１】この遺伝子の発現パターンは、一時的に一
定ではない。発現は、60日目未満の植物の髄下部及び中
部内で非常に高く、そしてその植物の頂上付近で急激に
減少している。植物が成熟に達したとき、例えば、70日
目を超えるとき、この発現は、髄下部及び穂葉柄を除
き、ほとんど検出できないレベルまで低下する。幼葉内
の転写物の蓄積は、髄下部内で見られるものとほとんど
同じ程高いが、発現は急激に減少し、そして40日齢を超
える葉内では検出できない。葉内の発現は、それが成長
するときの季節に依存して変動することが見つけられ
た。以下に述べる例21-39 は、本発明に記載の花粉特異
的プロモーターの単離、特徴付け及び発現に向けたもの
である。
定ではない。発現は、60日目未満の植物の髄下部及び中
部内で非常に高く、そしてその植物の頂上付近で急激に
減少している。植物が成熟に達したとき、例えば、70日
目を超えるとき、この発現は、髄下部及び穂葉柄を除
き、ほとんど検出できないレベルまで低下する。幼葉内
の転写物の蓄積は、髄下部内で見られるものとほとんど
同じ程高いが、発現は急激に減少し、そして40日齢を超
える葉内では検出できない。葉内の発現は、それが成長
するときの季節に依存して変動することが見つけられ
た。以下に述べる例21-39 は、本発明に記載の花粉特異
的プロモーターの単離、特徴付け及び発現に向けたもの
である。
【０２３２】花粉特異的蛋白の同定
【０２３３】例21: メイズ植物の成長
メイズ植物(Zea mays Funk inbred 211D) を、グリーン
ハウス内でバーミキュライト/ 砂混合物内で、明16時間
/ 暗8 時間の管理下で種から栽培した。
ハウス内でバーミキュライト/ 砂混合物内で、明16時間
/ 暗8 時間の管理下で種から栽培した。
【０２３４】例22: 全花粉蛋白の単離
成熟した花粉を、最大花粉はじけ(maximum pollen she
d) の時間においてメイズ植物から単離した。それを、
殻を除去するために篩、液体窒素内で凍結させ、そして
3-4ml 容量の凍結花粉を、すり鉢内で粉砕し、そして等
容量の75-150μmのガラス・ビーズで擦った。40mlの粉
砕バッファー(2mM EDTA 、5mM DDT 、0.1%SDS、100mM H
epes pH 8) を添加し、そしてこの混合物を再び粉砕し
た。ガラス・ビーズ及び無傷の花粉粒を、低速遠心分離
によりペレット化し、そして混合物を、10,000 gで15分
間、遠心分離により清澄化した。蛋白を、90% までアセ
トンを添加することによりその上澄液から沈殿させた。
d) の時間においてメイズ植物から単離した。それを、
殻を除去するために篩、液体窒素内で凍結させ、そして
3-4ml 容量の凍結花粉を、すり鉢内で粉砕し、そして等
容量の75-150μmのガラス・ビーズで擦った。40mlの粉
砕バッファー(2mM EDTA 、5mM DDT 、0.1%SDS、100mM H
epes pH 8) を添加し、そしてこの混合物を再び粉砕し
た。ガラス・ビーズ及び無傷の花粉粒を、低速遠心分離
によりペレット化し、そして混合物を、10,000 gで15分
間、遠心分離により清澄化した。蛋白を、90% までアセ
トンを添加することによりその上澄液から沈殿させた。
【０２３５】例23: 花粉外壁(Pollen Exine)蛋白の単離
外壁蛋白を、Matousek and Tupy, J., Plant Physiolog
y 119:169-178 (1985)中に記載されているようなメイズ
211Dはじけ花粉から単離した。
y 119:169-178 (1985)中に記載されているようなメイズ
211Dはじけ花粉から単離した。
【０２３６】例24: 葉蛋白の単離
幼葉( 約60% 成長) を、メイズ植物から切り、その中央
脈(midrib)を除去した。全蛋白を、花粉についてと同じ
ように単離した。但し、その材料を、凍結せず、そして
粉砕は、ガラス・ビーズを伴わないWaringブレンダー内
でのものであった。
脈(midrib)を除去した。全蛋白を、花粉についてと同じ
ように単離した。但し、その材料を、凍結せず、そして
粉砕は、ガラス・ビーズを伴わないWaringブレンダー内
でのものであった。
【０２３７】例25: 粒(kernel)蛋白の単離
穂が十分に成長しているが未だ湿っている粒を、その植
物から取り除き、そしてその粒を、メス(scalpel) で切
断した。全蛋白を、葉についてと同じように単離した。
物から取り除き、そしてその粒を、メス(scalpel) で切
断した。全蛋白を、葉についてと同じように単離した。
【０２３８】例26: メイズ蛋白のゲル電気泳動
花粉、葉及び粒の蛋白を、Sambrook et al., Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press: New York (1989)中に記載されてい
るようにSDS ポリアクリルアミド・ゲル上で分離した。
Coomasieブルーによる染色の後、花粉、葉及び粒からの
蛋白バンドを、比較し、そして約10 kD、13kD、20kD、4
5kD、55kD及び57kDの大量の蛋白が花粉特異的であるこ
とが測定された。
Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press: New York (1989)中に記載されてい
るようにSDS ポリアクリルアミド・ゲル上で分離した。
Coomasieブルーによる染色の後、花粉、葉及び粒からの
蛋白バンドを、比較し、そして約10 kD、13kD、20kD、4
5kD、55kD及び57kDの大量の蛋白が花粉特異的であるこ
とが測定された。
【０２３９】花粉特異的cDNAクローンの同定
【０２４０】例27: 花粉特異的蛋白の部分的配列の決定
花粉特異的であることが決定された蛋白バンドを、PVDF
膜上のポリアクリルアミド・ゲルからのエレクトロブロ
ッティング(Matsudaira, P., J. Biol. Chem.261:10035
-10038(1987))により又は逆相HPLCにより精製した。こ
の精製された蛋白のN-末端配列を、Applied Biosystems
470A 気相シーケンサーによる自動エドマン分解により
決定した。フェニルチオヒダントイン(PTH) アミノ酸
を、Applied Biosystems 120A PTH アナライザーを使用
して同定した。内部配列を得るために、蛋白を、酵素:
基質比1:10を使用して室温において、0.1M Tris-HCl 、
pH 8.5中で、24時間、エンドプロテイナーゼLys-C(Boeh
ringer Mannheim)により消化した。得られたペプチド
を、0.1% TFA中の、線型アセトニトリル/ イソプロパノ
ール(1:1比) グラジエント(0〜60%)による溶出させるAq
uapore C-8カラムを使用したHPLCにより単離した。単離
したLys-C ペプチドの配列を、上記のように決定した。
以下の配列を、13kDの花粉特異的蛋白について決定し
た:
膜上のポリアクリルアミド・ゲルからのエレクトロブロ
ッティング(Matsudaira, P., J. Biol. Chem.261:10035
-10038(1987))により又は逆相HPLCにより精製した。こ
の精製された蛋白のN-末端配列を、Applied Biosystems
470A 気相シーケンサーによる自動エドマン分解により
決定した。フェニルチオヒダントイン(PTH) アミノ酸
を、Applied Biosystems 120A PTH アナライザーを使用
して同定した。内部配列を得るために、蛋白を、酵素:
基質比1:10を使用して室温において、0.1M Tris-HCl 、
pH 8.5中で、24時間、エンドプロテイナーゼLys-C(Boeh
ringer Mannheim)により消化した。得られたペプチド
を、0.1% TFA中の、線型アセトニトリル/ イソプロパノ
ール(1:1比) グラジエント(0〜60%)による溶出させるAq
uapore C-8カラムを使用したHPLCにより単離した。単離
したLys-C ペプチドの配列を、上記のように決定した。
以下の配列を、13kDの花粉特異的蛋白について決定し
た:
【０２４１】N-末端: TTPLTFQVGKGSKPGHLILTPNVATI
LysC 61: KPGHLILTPNVATISDVVIK
LysC 54: SGGTRIADDVIPADFK
LysC 49: EHGGDDFSFTLK
LysC 43: EGPTGTWTLDTK。
【０２４２】例28: 花粉特異的cDNAs のためのオリゴヌ
クレオチド・プローブの合成 低コドン冗長性(codon redundancy)をもつ13kD蛋白内の
ペプチド配列の領域を、選択し、そしてこれらの領域を
コードしている遺伝子のための好適なオリゴヌクレオチ
ド・プローブを、Applied Biosystems 380A シンセサイ
ザー上で合成した。以下のオリゴヌクレオチドを、合成
した:
クレオチド・プローブの合成 低コドン冗長性(codon redundancy)をもつ13kD蛋白内の
ペプチド配列の領域を、選択し、そしてこれらの領域を
コードしている遺伝子のための好適なオリゴヌクレオチ
ド・プローブを、Applied Biosystems 380A シンセサイ
ザー上で合成した。以下のオリゴヌクレオチドを、合成
した:
【０２４３】
【０２４４】ここで、ヌクレオチドの列は、そのオリゴ
内の図示した位置において等しい割合でランダムに取り
込まれている塩基を表している。オリゴ#51 は、ペプチ
ドlysC49 内で見つかったアミノ酸配列EHGGDDF をコー
ドしており、そしてオリゴ#58は、ペプチドN-末端内で
見つかったアミノ酸配列FQVGKGをコードしている。花粉
特異的遺伝子のためのcDNAライブラリーをスクリーンす
るためのこれらの混合オリゴヌクレオチドの使用を以下
に記載する。
内の図示した位置において等しい割合でランダムに取り
込まれている塩基を表している。オリゴ#51 は、ペプチ
ドlysC49 内で見つかったアミノ酸配列EHGGDDF をコー
ドしており、そしてオリゴ#58は、ペプチドN-末端内で
見つかったアミノ酸配列FQVGKGをコードしている。花粉
特異的遺伝子のためのcDNAライブラリーをスクリーンす
るためのこれらの混合オリゴヌクレオチドの使用を以下
に記載する。
【０２４５】例29: メイズ花粉cDNAライブラリーの構築
メイズ211Dはじけ花粉からの全メイズRNA を、Gilisen
et al, Biochemistry13:2633-2637 (1974) 中に記載さ
れているように単離した。ポリA + mRNAを、Sambrook e
t al. 中に記載されているように全RNA から精製した。
このmRNAを使用して、cDNAを、そのキットと共に供給さ
れた手順書に従って、Promega から購入したcDNA合成キ
ットを使用して調製した。このEcoRI リンカーを、この
cDNAに添加し、そしてそれを、Stratageneから購入した
クローニング・ベクター・ラムダZap 中に、製造者によ
り供給された手順書に従って結合させた。この結合生成
物を、これもまたStratageneから購入したラムダ・パッ
キング抽出物内でパーケージングし、そして大腸菌(E.c
oli) BB4細胞に感染させるために使用した。
et al, Biochemistry13:2633-2637 (1974) 中に記載さ
れているように単離した。ポリA + mRNAを、Sambrook e
t al. 中に記載されているように全RNA から精製した。
このmRNAを使用して、cDNAを、そのキットと共に供給さ
れた手順書に従って、Promega から購入したcDNA合成キ
ットを使用して調製した。このEcoRI リンカーを、この
cDNAに添加し、そしてそれを、Stratageneから購入した
クローニング・ベクター・ラムダZap 中に、製造者によ
り供給された手順書に従って結合させた。この結合生成
物を、これもまたStratageneから購入したラムダ・パッ
キング抽出物内でパーケージングし、そして大腸菌(E.c
oli) BB4細胞に感染させるために使用した。
【０２４６】例30: 花粉cDNAクローンの単離
メイズ花粉cDNAライブラリーを、Sambrook et al. 中に
記載されているように、13kD蛋白遺伝子に特異的な合成
オリゴヌクレオチド・プローブを使用してプローブし
た。簡単に言えば、花粉cDNAライブラリーの約100,000
のファージ・プラークを、プレーティングし、そしてニ
トロセルロース・フィルターに移す。このフィルター
を、ポリヌクレオチド・キナーゼを使用して32P 末端標
識されているオリゴヌクレオチド#51 及び#58 を使用し
てプローブした。このプローブを、低いストリンジェン
シー(1M NaCl、10% 硫酸デキストラン、0.5% SDS中、50
℃) においてそのフィルターにハイブリダイズし、室温
において、そして次に、6X SSC、0.1% SDS中で45℃にお
いて30分間洗浄し、そして陽性クローンを同定するため
にX-線フィルムに露出させた。推定クローンを、4 ラウ
ンドのプラーク・ハイブリダイゼーションを通して精製
した。3 クラスのcDNAクローンを、単離した。タイプ1
は、0.2 kb及び1.8 kbのEcoRI 断片を含んでいた。タイ
プIIは、0.6 kb、0.5 kb及び1.0 kbのEcoRI 断片を含ん
でおり、そしてタイプIII は、2.3 KbのEcoRI 断片を含
んでいた。
記載されているように、13kD蛋白遺伝子に特異的な合成
オリゴヌクレオチド・プローブを使用してプローブし
た。簡単に言えば、花粉cDNAライブラリーの約100,000
のファージ・プラークを、プレーティングし、そしてニ
トロセルロース・フィルターに移す。このフィルター
を、ポリヌクレオチド・キナーゼを使用して32P 末端標
識されているオリゴヌクレオチド#51 及び#58 を使用し
てプローブした。このプローブを、低いストリンジェン
シー(1M NaCl、10% 硫酸デキストラン、0.5% SDS中、50
℃) においてそのフィルターにハイブリダイズし、室温
において、そして次に、6X SSC、0.1% SDS中で45℃にお
いて30分間洗浄し、そして陽性クローンを同定するため
にX-線フィルムに露出させた。推定クローンを、4 ラウ
ンドのプラーク・ハイブリダイゼーションを通して精製
した。3 クラスのcDNAクローンを、単離した。タイプ1
は、0.2 kb及び1.8 kbのEcoRI 断片を含んでいた。タイ
プIIは、0.6 kb、0.5 kb及び1.0 kbのEcoRI 断片を含ん
でおり、そしてタイプIII は、2.3 KbのEcoRI 断片を含
んでいた。
【０２４７】例31: 花粉特異的cDNAクローンの特徴付け
タイプII cDNA クローンのEcoRI 断片を、Stratageneか
ら購入したプラスミド・ベクターpBluescript SK+ 中に
サブクローン化した。Fig.30を参照のこと。pBluescrip
t 内の0.6 kb断片を、II-.6 と名付け、pBluescript 内
の0.5 kb断片を、II-.5 と名付け( その後、pCIB3169と
名付けた) 、そしてpBluescript 内の1.0 kb断片を、II
-1.0と名付けた( その後、pCIB3168と名付けた) 。以下
に記載するように、この0.5 kb及び0.6 kbの断片は、メ
イズ花粉特異的CDPK遺伝子をコードしている。葯(anthe
r)、花粉、葉、根、毛(silk)からのRNA を、グリオキサ
ル(glyoxal) により変性させ、1%アガロース・ゲル上で
電気泳動にかけ、ニトロセルロースに転写し、そしてSa
mbrook et al, Molecular Cloning, A LaboratoryManua
l, Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York
(1989)中に記載されておるように、ランダム・プライマ
ー伸長により32P により標識されている3 つのEcoRI 断
片により別々にプローブした。このブロットを、X-線フ
ィルムに露出させ、そして約1.5 kbのmRNAバンドを、0.
6 kb断片プローブにより同定し、一方、0.5 kb及び1.0
kb断片を、約2.0 kb mRNA とハイブリダイズした。すべ
ての場合において、ハイブリダイゼーションは、花粉RN
A レーン内でのみ見られた。但し、0.6 kb断片は、葯mR
NA内でわずかなシグナルを示した。これらのデータから
の結論は、元のcDNAクローンは、2 つの異なるmRNAs か
ら生じた融合cDNA分子であったということである。この
0.6 kb断片は、1.5 kb花粉特異的mRNAの部分的cDNAであ
り、そしてこのmRNAは、ペプチドLysC 49 及びN-末端を
コードしている。1.0 及び0.5 kb断片は、そのペプチド
及びプローブとして使用されたオリゴヌクレオチド・プ
ローブに無関係な2.0 kb花粉特異的mRNAの部分的cDNAを
含んで成る。この結論は、その断片をSambrook et al.
中に記載されているようなジデオキシ連鎖停止法を使用
して配列決定したときに確認された。このcDNAをFig.31
中に示す。
ら購入したプラスミド・ベクターpBluescript SK+ 中に
サブクローン化した。Fig.30を参照のこと。pBluescrip
t 内の0.6 kb断片を、II-.6 と名付け、pBluescript 内
の0.5 kb断片を、II-.5 と名付け( その後、pCIB3169と
名付けた) 、そしてpBluescript 内の1.0 kb断片を、II
-1.0と名付けた( その後、pCIB3168と名付けた) 。以下
に記載するように、この0.5 kb及び0.6 kbの断片は、メ
イズ花粉特異的CDPK遺伝子をコードしている。葯(anthe
r)、花粉、葉、根、毛(silk)からのRNA を、グリオキサ
ル(glyoxal) により変性させ、1%アガロース・ゲル上で
電気泳動にかけ、ニトロセルロースに転写し、そしてSa
mbrook et al, Molecular Cloning, A LaboratoryManua
l, Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York
(1989)中に記載されておるように、ランダム・プライマ
ー伸長により32P により標識されている3 つのEcoRI 断
片により別々にプローブした。このブロットを、X-線フ
ィルムに露出させ、そして約1.5 kbのmRNAバンドを、0.
6 kb断片プローブにより同定し、一方、0.5 kb及び1.0
kb断片を、約2.0 kb mRNA とハイブリダイズした。すべ
ての場合において、ハイブリダイゼーションは、花粉RN
A レーン内でのみ見られた。但し、0.6 kb断片は、葯mR
NA内でわずかなシグナルを示した。これらのデータから
の結論は、元のcDNAクローンは、2 つの異なるmRNAs か
ら生じた融合cDNA分子であったということである。この
0.6 kb断片は、1.5 kb花粉特異的mRNAの部分的cDNAであ
り、そしてこのmRNAは、ペプチドLysC 49 及びN-末端を
コードしている。1.0 及び0.5 kb断片は、そのペプチド
及びプローブとして使用されたオリゴヌクレオチド・プ
ローブに無関係な2.0 kb花粉特異的mRNAの部分的cDNAを
含んで成る。この結論は、その断片をSambrook et al.
中に記載されているようなジデオキシ連鎖停止法を使用
して配列決定したときに確認された。このcDNAをFig.31
中に示す。
【０２４８】例32: mRNA 発現の特異性の測定
cDNAクローンpCIB3169及びpCIB3168により表される2.0
kb RNAが花粉内にだけ存在するかどうかを決定するため
に。全RNA を、メイズ211Dの、根、葉、花粉、葯又は毛
から単離した。このRNAsを、グリオキサルにより変性さ
せ、1%アガロース・ゲル上で電気泳動にかけ、ニトロセ
ルロースに転写し、そしてすべて、Sambrook et al, Mo
lecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press: New York (1989)中に記載さ
れておるような標準的な技術を使用して、プラスミドpC
IB3168又はpCIB3169からの32P 標識EcoRI 挿入物により
プローブした。このブロットを写真フィルムに露出させ
ることは、これらの2 つのクローンにより表された遺伝
子が花粉内で転写についてのみ活性であるということを
証明している( Fig.32) 。
kb RNAが花粉内にだけ存在するかどうかを決定するため
に。全RNA を、メイズ211Dの、根、葉、花粉、葯又は毛
から単離した。このRNAsを、グリオキサルにより変性さ
せ、1%アガロース・ゲル上で電気泳動にかけ、ニトロセ
ルロースに転写し、そしてすべて、Sambrook et al, Mo
lecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press: New York (1989)中に記載さ
れておるような標準的な技術を使用して、プラスミドpC
IB3168又はpCIB3169からの32P 標識EcoRI 挿入物により
プローブした。このブロットを写真フィルムに露出させ
ることは、これらの2 つのクローンにより表された遺伝
子が花粉内で転写についてのみ活性であるということを
証明している( Fig.32) 。
【０２４９】花粉特異的プロモーターの同定
【０２５０】例33: メイズ・ゲノムDNA ライブラリーの
構築 メイズ系211D幼い苗条(shoot) からのゲノムDNA を、Sh
ure et al, Cell 35:225-233 (1983) 中に記載されてい
るように単離した。このDNA を、Stratageneに提供し、
そこで、ゲノムDNA ライブラリーを、Sau3AI部分消化DN
A をStratagene's Lambda Dashクローニング・ベクター
中にクローニングすることにより構築した。
構築 メイズ系211D幼い苗条(shoot) からのゲノムDNA を、Sh
ure et al, Cell 35:225-233 (1983) 中に記載されてい
るように単離した。このDNA を、Stratageneに提供し、
そこで、ゲノムDNA ライブラリーを、Sau3AI部分消化DN
A をStratagene's Lambda Dashクローニング・ベクター
中にクローニングすることにより構築した。
【０２５１】例34: 遺伝子コピー数を測定するためのゲ
ノムDNA ブロット・ハイブリダイゼーション メイズ系211DからのゲノムDNA を、多数の制限酵素によ
り消化し、個々の消化物をアガロース・ゲル上で電気泳
動にかけ、ニトロセルロースに転写し。そしてSambrook
et al. 中に記載されているような標準的な技術を使用
してプラスミドpCIB3168(1.0kb断片) 、pCIB3169(0.5kb
断片) 又はクローンII-.6 からの32P-標識EcoRI 挿入物
によりプローブした。10以上のバンドを、最も多い消化
物条のII-.6 プローブにより検出し、このcDNAが大きな
多遺伝子ファミリーから生じていることを示している。
1.0 kb断片によるプロービングは、3 から6 までのバン
ドを検出し、そして0.5 kb断片によるプロービングは、
1.0 kb断片により検出されたもののサブセットである1
から3 までのバンドのみを検出した。この1.0 kb及び0.
5 kb断片により検出された、より小さな遺伝子ファミリ
ーのサイズのため、それらに対応するゲノム・クローン
の単離を試みることを決定した。
ノムDNA ブロット・ハイブリダイゼーション メイズ系211DからのゲノムDNA を、多数の制限酵素によ
り消化し、個々の消化物をアガロース・ゲル上で電気泳
動にかけ、ニトロセルロースに転写し。そしてSambrook
et al. 中に記載されているような標準的な技術を使用
してプラスミドpCIB3168(1.0kb断片) 、pCIB3169(0.5kb
断片) 又はクローンII-.6 からの32P-標識EcoRI 挿入物
によりプローブした。10以上のバンドを、最も多い消化
物条のII-.6 プローブにより検出し、このcDNAが大きな
多遺伝子ファミリーから生じていることを示している。
1.0 kb断片によるプロービングは、3 から6 までのバン
ドを検出し、そして0.5 kb断片によるプロービングは、
1.0 kb断片により検出されたもののサブセットである1
から3 までのバンドのみを検出した。この1.0 kb及び0.
5 kb断片により検出された、より小さな遺伝子ファミリ
ーのサイズのため、それらに対応するゲノム・クローン
の単離を試みることを決定した。
【０２５２】例35: 花粉特異的ゲノム・クローンの単離
Stratageneメイズ211Dゲノムライブラリーを、そのライ
ブラリーと一緒に、Stratageneマニュアル中に記載され
ているような標準的な手順を使用してプラスミドpCIB31
68(1.0kb断片) 及びpCIB3169(0.5kb 断片) からの32P-
標識EcoRI 挿入物によりプラーク・リフト(plaque lift
s)をプロービングすることにより、スクリーニングし
た。
ブラリーと一緒に、Stratageneマニュアル中に記載され
ているような標準的な手順を使用してプラスミドpCIB31
68(1.0kb断片) 及びpCIB3169(0.5kb 断片) からの32P-
標識EcoRI 挿入物によりプラーク・リフト(plaque lift
s)をプロービングすることにより、スクリーニングし
た。
【０２５３】この戦略を使用して、ラムダ・クローンMG
14を、単離し、そしてそれを両方のプローブとハイブリ
ダイズさせた。これもまた両方のプローブにハイブリダ
イズするMG14の9.0 kb BamHI断片を、pBluescript SK+
のBamHI 部位中にサブクローン化し、プラスミドpCIB37
9 を作った。cDNA配列に対応する領域内の1800塩基対の
pCIB379 を、先に記載したように配列決定した。cDNAと
ゲノム配列との比較は、たった91% の同一性を示した。
pCIB379 挿入物は、関連花粉特異的遺伝子を表してい
る。
14を、単離し、そしてそれを両方のプローブとハイブリ
ダイズさせた。これもまた両方のプローブにハイブリダ
イズするMG14の9.0 kb BamHI断片を、pBluescript SK+
のBamHI 部位中にサブクローン化し、プラスミドpCIB37
9 を作った。cDNA配列に対応する領域内の1800塩基対の
pCIB379 を、先に記載したように配列決定した。cDNAと
ゲノム配列との比較は、たった91% の同一性を示した。
pCIB379 挿入物は、関連花粉特異的遺伝子を表してい
る。
【０２５４】第二メイズ211Dゲノム・ライブラリーを、
Promega マニュアル中に記載せれている手順を使用し
て、Promega から購入したベクター・ラムダGEM-11中に
構築した。上記のようにこの未増幅ライブラリーをスク
リーニングすることは、クローンGEM11-1 を作り出し、
これを、0.5 と1.0kb との間のプローブにハイブリダイ
ズさせた。両方のプローブにもハイブリダイズするGEM1
1-1 の20kb HindIII断片を、pBluescript SK+ のHindII
I 部位中にサブクローン化し、pCIB3166を作った。4.1k
b のpCIB3166のDNA 配列が、決定され( Fig.36) 、そし
てそのゲノム・クローン内の6 つのイントロンを数えた
後、pCIB3168及びpCIB3169のcDNA配列と100%同じであっ
た。Genbank/KMBLデータベースとpCIB3166との比較は、
その5'部分が3 つのエクソンを通して、そのアミノ酸レ
ベルにおいてラットのカルモジュリン依存性蛋白キナー
ゼIIに34.6% 同じであったということを( Fig.33) 、一
方、第7 エクソンを通しての第四がラットのカルモジュ
リンと39.4%同じであったということを明らかにした( F
ig.34を参照のこと) 。他の花粉特異的キナーゼは、全
く記載されておらず、そしてこの時、この、キナーゼと
カルモジュリン・ドメインとを結合する蛋白は、知られ
ていなかった。その後、Harper et al., Science 252:9
51-954 (1991) が、大豆からの類似の蛋白のcDNA配列を
開示したが、この遺伝子は、発現において花粉特異的で
はない。大豆カルシウム依存性蛋白キナーゼ(CDPK)とメ
イズ花粉CDPKとの比較は、そのアミノ酸レベルにおいて
38% 同じであった。Fig.35を参照のこと。
Promega マニュアル中に記載せれている手順を使用し
て、Promega から購入したベクター・ラムダGEM-11中に
構築した。上記のようにこの未増幅ライブラリーをスク
リーニングすることは、クローンGEM11-1 を作り出し、
これを、0.5 と1.0kb との間のプローブにハイブリダイ
ズさせた。両方のプローブにもハイブリダイズするGEM1
1-1 の20kb HindIII断片を、pBluescript SK+ のHindII
I 部位中にサブクローン化し、pCIB3166を作った。4.1k
b のpCIB3166のDNA 配列が、決定され( Fig.36) 、そし
てそのゲノム・クローン内の6 つのイントロンを数えた
後、pCIB3168及びpCIB3169のcDNA配列と100%同じであっ
た。Genbank/KMBLデータベースとpCIB3166との比較は、
その5'部分が3 つのエクソンを通して、そのアミノ酸レ
ベルにおいてラットのカルモジュリン依存性蛋白キナー
ゼIIに34.6% 同じであったということを( Fig.33) 、一
方、第7 エクソンを通しての第四がラットのカルモジュ
リンと39.4%同じであったということを明らかにした( F
ig.34を参照のこと) 。他の花粉特異的キナーゼは、全
く記載されておらず、そしてこの時、この、キナーゼと
カルモジュリン・ドメインとを結合する蛋白は、知られ
ていなかった。その後、Harper et al., Science 252:9
51-954 (1991) が、大豆からの類似の蛋白のcDNA配列を
開示したが、この遺伝子は、発現において花粉特異的で
はない。大豆カルシウム依存性蛋白キナーゼ(CDPK)とメ
イズ花粉CDPKとの比較は、そのアミノ酸レベルにおいて
38% 同じであった。Fig.35を参照のこと。
【０２５５】例36: プライマー伸長によるプロモーター
の転写開始部位の同定 以下の配列をもつオリゴヌクレオチドPE51を、プライマ
ーとして合成した: 5'-TGGCCCATGGCTGCGGCGGGGAACGAGTGCGGC-3' 。プライマー伸長分析を、Metraux et al., PNAS USA 8
6:896-890(1989)中に記載されているようにポリA+花粉m
RNA上で行った。この転写開始部位は、Fig.36中に示すp
CIB3166の部分配列上の塩基1415と1425との間にあるこ
とが決定された。
の転写開始部位の同定 以下の配列をもつオリゴヌクレオチドPE51を、プライマ
ーとして合成した: 5'-TGGCCCATGGCTGCGGCGGGGAACGAGTGCGGC-3' 。プライマー伸長分析を、Metraux et al., PNAS USA 8
6:896-890(1989)中に記載されているようにポリA+花粉m
RNA上で行った。この転写開始部位は、Fig.36中に示すp
CIB3166の部分配列上の塩基1415と1425との間にあるこ
とが決定された。
【０２５６】トランスジェニック植物内におけるプロモ
ーター機能のテスト
ーター機能のテスト
【０２５７】例37: 植物翻訳のためのプロモーター・ベ
クターの構築 花粉CDPKプロモーターがトランスジェニック植物内の結
合遺伝子の発現を駆動することができるとういことを証
明するために、大腸菌(E.coli)のベータ- グルクロニダ
ーゼ遺伝子への花粉CDPKプロモーターの遺伝子融合物
を、以下のように構築した。第一エクソンを含むラムダ
GEM11-1 からの10kb BamHI断片及び花粉CDPK遺伝子の第
一イントロンの部分これに加えてこの遺伝子の9kb 上流
を、pBluescript SK+ のBamHI 部位中にサブクローン化
し、プラスミドpCIB3167を作った。pCIB3167からの2.3
kbのBamHI-HindIII 部位を、pBluescript SK+ のBamHI
及びHindIII 部位中にサブクローン化し、プラスミドpS
K105を作った。このpSK105を、AvaI及びHindIII により
消化し、そしてこの1.75 kb のHindIII-AvaI断片を、ア
ガロース・ゲル上で単離した。PCR 反応を、Sambrook e
t al. 中に記載せれているような標準的な条件下でテン
プレートとして無傷のpSK105及び以下のプライマーを使
用して走らせた:
クターの構築 花粉CDPKプロモーターがトランスジェニック植物内の結
合遺伝子の発現を駆動することができるとういことを証
明するために、大腸菌(E.coli)のベータ- グルクロニダ
ーゼ遺伝子への花粉CDPKプロモーターの遺伝子融合物
を、以下のように構築した。第一エクソンを含むラムダ
GEM11-1 からの10kb BamHI断片及び花粉CDPK遺伝子の第
一イントロンの部分これに加えてこの遺伝子の9kb 上流
を、pBluescript SK+ のBamHI 部位中にサブクローン化
し、プラスミドpCIB3167を作った。pCIB3167からの2.3
kbのBamHI-HindIII 部位を、pBluescript SK+ のBamHI
及びHindIII 部位中にサブクローン化し、プラスミドpS
K105を作った。このpSK105を、AvaI及びHindIII により
消化し、そしてこの1.75 kb のHindIII-AvaI断片を、ア
ガロース・ゲル上で単離した。PCR 反応を、Sambrook e
t al. 中に記載せれているような標準的な条件下でテン
プレートとして無傷のpSK105及び以下のプライマーを使
用して走らせた:
【０２５８】#42: 5'-AGCGGTCGACCTGCAGGCATGCGATCTGCA
CCTCCCGCCG-3' #43: 5'-ATGGGCAAGGAGCTCGGG-3'
CCTCCCGCCG-3' #43: 5'-ATGGGCAAGGAGCTCGGG-3'
【０２５９】このPCR 反応生成物を、AvaI及びSalIによ
り消化し、そして得られた断片をアガロース・ゲル上で
単離した。pBluescript SK+ を、HindIII 及びSalIによ
り消化した。この1.75 kb HindIII-AvaI断片、PCR 誘導
体AvaI-SalI 断片、及びHindIII 及びSalI末端をもつpB
luescript ベクターを、3 方において結合し、プラスミ
ドpSK110を作った。
り消化し、そして得られた断片をアガロース・ゲル上で
単離した。pBluescript SK+ を、HindIII 及びSalIによ
り消化した。この1.75 kb HindIII-AvaI断片、PCR 誘導
体AvaI-SalI 断片、及びHindIII 及びSalI末端をもつpB
luescript ベクターを、3 方において結合し、プラスミ
ドpSK110を作った。
【０２６０】pSK110内のプロモーター断片とベータ- グ
ルクロニダーゼ(GUS) 遺伝子との融合を、pSK110をHind
III 及びsalIにより消化し、その1.9kb 断片をアガロー
ス・ゲル上で単離し、そしてそれをpCIB3054のHindIII
及びsalI部位中に結合することにより、作りだし、プラ
スミドpKL2を作った。このプラスミドは、GUS 遺伝子そ
の後のメイズPEPC遺伝子からの植物イントロン及びカリ
フラワー・モザイク・ウイルス(cauliflower mosaic vi
rus)からのポリA シグナルを含むpUC19 から得られる。
このプロモーター融合物は、おそらく、GUS 遺伝子ATG
に先行するリーダー配列内のフレームから外れたATG コ
ドンの存在を理由として、植物内では不活性であった。
ルクロニダーゼ(GUS) 遺伝子との融合を、pSK110をHind
III 及びsalIにより消化し、その1.9kb 断片をアガロー
ス・ゲル上で単離し、そしてそれをpCIB3054のHindIII
及びsalI部位中に結合することにより、作りだし、プラ
スミドpKL2を作った。このプラスミドは、GUS 遺伝子そ
の後のメイズPEPC遺伝子からの植物イントロン及びカリ
フラワー・モザイク・ウイルス(cauliflower mosaic vi
rus)からのポリA シグナルを含むpUC19 から得られる。
このプロモーター融合物は、おそらく、GUS 遺伝子ATG
に先行するリーダー配列内のフレームから外れたATG コ
ドンの存在を理由として、植物内では不活性であった。
【０２６１】このプロモーターの機能の融合は、先行の
融合連結を除去するために、pKL2をXbaI及びSalIにより
消化することにより作られた。新たな融合連結を、テン
プレートとしてのpSK105及び以下のプライマーを使用し
てPCR 反応において作った:
融合連結を除去するために、pKL2をXbaI及びSalIにより
消化することにより作られた。新たな融合連結を、テン
プレートとしてのpSK105及び以下のプライマーを使用し
てPCR 反応において作った:
【０２６２】#SK50: 5'-CCCTTCAAAATCTAGAAACCT-3'
#SK49: 5'-TAATGTCGACGAACGGCGAGAGATGGA-3'
【０２６３】このPCR 生成物を、XbaI及びSalIにより消
化し、そしてアガロース・ゲル上で精製した。この精製
断片を、pKL2のXbaI及びSalI部位中に結合し、プラスミ
ドpCIB3171を作った。このプラスミドは、花粉CDPKプロ
モーターと、花粉内で限定的にGUS 遺伝子を発現するこ
とに向けられているGUS との機能的融合物を含む。
化し、そしてアガロース・ゲル上で精製した。この精製
断片を、pKL2のXbaI及びSalI部位中に結合し、プラスミ
ドpCIB3171を作った。このプラスミドは、花粉CDPKプロ
モーターと、花粉内で限定的にGUS 遺伝子を発現するこ
とに向けられているGUS との機能的融合物を含む。
【０２６４】アグロバクテリウム・チュームファシエン
ス(Agrobacterium tumefaciens)-仲介植物形質転換にお
ける使用に好適な花粉CDPKプロモーター-GUS融合物を含
むベクターを作るために、その融合遺伝子を、HindIII
及びSalIによる消化によりpCIB3171から単離した。得ら
れた断片を、pBI101(Clontech から購入) のHindIII及
びsalI部位中に結合させ、プラスミドpCIB3175を作っ
た。
ス(Agrobacterium tumefaciens)-仲介植物形質転換にお
ける使用に好適な花粉CDPKプロモーター-GUS融合物を含
むベクターを作るために、その融合遺伝子を、HindIII
及びSalIによる消化によりpCIB3171から単離した。得ら
れた断片を、pBI101(Clontech から購入) のHindIII及
びsalI部位中に結合させ、プラスミドpCIB3175を作っ
た。
【０２６５】例38: トランスジェニック植物の生産
pCIB3175を、ヘルパー・プラスミドpCIB542 を含むアグ
ロバクテリウム・チュームファシエンス(Agrobacterium
tumefaciens) 中に形質転換させ、そして得られた集落
を、Horsch et al., Science 227:1229-1231 (1985) に
より記載されているようにタバコ苗条先端培養物からの
葉の皿(leaf disks)を形質転換するために使用した。但
し、培養集落(nurse culteres)を無視し、そして選択を
100mg/lカナマイシン上で行った。トランスジェニック
植物を、再生し、そしてPCR により転移遺伝子の存在に
ついて確認した。
ロバクテリウム・チュームファシエンス(Agrobacterium
tumefaciens) 中に形質転換させ、そして得られた集落
を、Horsch et al., Science 227:1229-1231 (1985) に
より記載されているようにタバコ苗条先端培養物からの
葉の皿(leaf disks)を形質転換するために使用した。但
し、培養集落(nurse culteres)を無視し、そして選択を
100mg/lカナマイシン上で行った。トランスジェニック
植物を、再生し、そしてPCR により転移遺伝子の存在に
ついて確認した。
【０２６６】例39: GUS 遺伝子発現分析
最初の形質転換細胞及びそれらの子孫からの花粉を、Gu
errero et al., Mol.Gen. Genet. 224:161-168 (1990)
により記載されているようなGUS 遺伝子の発現について
組織化学的に分析した。X-glucバッファー中での青色染
色により示されるような、GUS 遺伝子を発現している花
粉粒状物(grains)のパーセンテージを、以下の表中に示
す。
errero et al., Mol.Gen. Genet. 224:161-168 (1990)
により記載されているようなGUS 遺伝子の発現について
組織化学的に分析した。X-glucバッファー中での青色染
色により示されるような、GUS 遺伝子を発現している花
粉粒状物(grains)のパーセンテージを、以下の表中に示
す。
【０２６７】
植物番号 % 青色の花粉
PP1-51 28%
PP1-54 54%
PP1-55 無し
PP1-61 非常に少ない
PP1-63 51%
PP1-67 15%
PP1-80 10%
PP1-83 12%
【０２６８】単一の花粉CDPKプロモーター-GUS遺伝子が
組み込まれている最初の形質転換細胞は、その単一の遺
伝子の分泌により、最大50% のGUS 陽性花粉を生産する
であろう。
組み込まれている最初の形質転換細胞は、その単一の遺
伝子の分泌により、最大50% のGUS 陽性花粉を生産する
であろう。
【０２６９】蛍光定量法GUS 検定を、選択植物の花粉、
茎、根、葉及びめしべ(pistil)の組織状で行い、花粉CD
PKプロモーター発現の特異性について証明した。検定
を、Jefferson, Plant Mol. Biol. 14:995-1006 (1990)
中に記載されているように行い、そしてGUS 活性値を、
n モルMU/ μg 蛋白/ 分間として表した。
茎、根、葉及びめしべ(pistil)の組織状で行い、花粉CD
PKプロモーター発現の特異性について証明した。検定
を、Jefferson, Plant Mol. Biol. 14:995-1006 (1990)
中に記載されているように行い、そしてGUS 活性値を、
n モルMU/ μg 蛋白/ 分間として表した。
【０２７０】
植物番号 組織 GUS活性 非形質転換 正味GUS
植物GUS 活性 活性
PP1-51 茎 0.01 0.02 0
葉 0 0 0
根 0.15 0.10 0.05
めしべ 0.02 0.01 0.01
花粉 0.24 0.02 0.22
PP1-54 茎 0.01 0.02 0
葉 0 0 0
根 0.13 0.1 0.03
めしべ 0.01 0.01 0
花粉 0.60 0.02 0.58
PP1-63 茎 0.01 0.02 0
葉 0 0 0
根 0.07 0.1 0
めしべ 0.01 0.01 0
花粉 0.57 0.02 0.55
【０２７１】例40-50 は、キメラ構築物、すなわち、組
換えDNA 分子であって本B.t.遺伝子に作用可能な状態で
結合されている構成的な、組織好適又は組織特異的なプ
ロモーターを含むものの調製、ベクターへのそれの挿
入、ベクターを含むトランスジェニック植物の生産、並
びにそのトランスジェニック植物のB.t.蛋白の発現レベ
ルに、主に向けられている。
換えDNA 分子であって本B.t.遺伝子に作用可能な状態で
結合されている構成的な、組織好適又は組織特異的なプ
ロモーターを含むものの調製、ベクターへのそれの挿
入、ベクターを含むトランスジェニック植物の生産、並
びにそのトランスジェニック植物のB.t.蛋白の発現レベ
ルに、主に向けられている。
【０２７２】例40: メイズ最適化Bt形質転換ベクターの
構築 メイズ内の合成Bt cryIA(b) 遺伝子の効果を証明するた
めに、PepC及び髄特異的プロモーターを、PCR を使用し
て合成Bt cryIA(b) 遺伝子に融合させる。このPCR 融合
のために設計されたオリゴマーは:
構築 メイズ内の合成Bt cryIA(b) 遺伝子の効果を証明するた
めに、PepC及び髄特異的プロモーターを、PCR を使用し
て合成Bt cryIA(b) 遺伝子に融合させる。このPCR 融合
のために設計されたオリゴマーは:
【０２７３】(PEPC)
KE99A28 = 5'-TGCGGTTACC GCCGATCACATG-3'
KE97A28 = 5'-GCGGTACCGC GTCGACGCGG ATCCCGCGGC GGGA
AGCTAAG-3' ( 髄) KE100A28 = 5'-GTCGTCGACC GCAACA-3' KE98A28 = 5'-GCGGTACCGC GTTAACGCGG ATCCTGTCCG ACAC
CGGAC-3' KE104A28 = 5'-GATGTCGTCG ACCGCAACAC-3' KE103A28 = 5'-GCGGTACCGC GGATCCTGTC CGACACCGGA CGG
CT-3' である。
AGCTAAG-3' ( 髄) KE100A28 = 5'-GTCGTCGACC GCAACA-3' KE98A28 = 5'-GCGGTACCGC GTTAACGCGG ATCCTGTCCG ACAC
CGGAC-3' KE104A28 = 5'-GATGTCGTCG ACCGCAACAC-3' KE103A28 = 5'-GCGGTACCGC GGATCCTGTC CGACACCGGA CGG
CT-3' である。
【０２７４】PCR プライマーを、これらの組織特異的遺
伝子のそれぞれの5'未翻訳リーダー領域内のNcoI部位
を、BamHI 部位により置き換えるように設計し、その合
成cryIA(b)遺伝子のこのBamHI 部位中へのクローニング
を容易にする。この合成cryIA(b)遺伝子に融合された組
織特異的プロモーターを含み、そしてまた35S:PAT:35S
マーカー遺伝子を含むベクターのその後の構築は、幾つ
かの中間体の構築を含む。
伝子のそれぞれの5'未翻訳リーダー領域内のNcoI部位
を、BamHI 部位により置き換えるように設計し、その合
成cryIA(b)遺伝子のこのBamHI 部位中へのクローニング
を容易にする。この合成cryIA(b)遺伝子に融合された組
織特異的プロモーターを含み、そしてまた35S:PAT:35S
マーカー遺伝子を含むベクターのその後の構築は、幾つ
かの中間体の構築を含む。
【０２７５】1. pCIB4406(35S:合成-cryIA(b):pepC ivs
#9:35S) pCIB4406は、CaMV 35Sプロモーター(Rothstein et al.,
Gene 53:153-161 (1987))と融合した2 Kb BamHI/Cla I
合成cryIA(b)遺伝子を含む。また、この遺伝子は、その
遺伝子の3'未翻訳領域内のメイズPEP カルボキシラーゼ
遺伝子(ivs#9)から得られたイントロン#6を含み、これ
は、CaMV 3' 末端を使用している。(PNAS USA, 83:2882
-2888 (1986), Hudspeth et al., Plant Molecular Bio
logy, 12: 579-589 (1989)) 。pCIB4406を、結合させ、
先に記載したような大腸菌(E.coli)細胞の" 確かな(SUR
E)" 株(Stratagene, La Jolla, CA)中に形質転換させ
る。1 つの突然変異が、アミノ酸#436におけるpCIB4406
のcryIA(b)遺伝子内で見つかり、これは、所望のPhe が
Leu に変換されていることをもたらしていた。pCIB4406
は、昆虫生物検定においてテストしたとき、欧州トウモ
ロコシ穿孔性動物に対して十分に活性があり、そしてウ
ェスタン・ブロット分析により決定されるように予想さ
れたサイズのCryIA(b)蛋白を生産する。
#9:35S) pCIB4406は、CaMV 35Sプロモーター(Rothstein et al.,
Gene 53:153-161 (1987))と融合した2 Kb BamHI/Cla I
合成cryIA(b)遺伝子を含む。また、この遺伝子は、その
遺伝子の3'未翻訳領域内のメイズPEP カルボキシラーゼ
遺伝子(ivs#9)から得られたイントロン#6を含み、これ
は、CaMV 3' 末端を使用している。(PNAS USA, 83:2882
-2888 (1986), Hudspeth et al., Plant Molecular Bio
logy, 12: 579-589 (1989)) 。pCIB4406を、結合させ、
先に記載したような大腸菌(E.coli)細胞の" 確かな(SUR
E)" 株(Stratagene, La Jolla, CA)中に形質転換させ
る。1 つの突然変異が、アミノ酸#436におけるpCIB4406
のcryIA(b)遺伝子内で見つかり、これは、所望のPhe が
Leu に変換されていることをもたらしていた。pCIB4406
は、昆虫生物検定においてテストしたとき、欧州トウモ
ロコシ穿孔性動物に対して十分に活性があり、そしてウ
ェスタン・ブロット分析により決定されるように予想さ
れたサイズのCryIA(b)蛋白を生産する。
【０２７６】2. pCIB4407 (35S: 合成-cryIA(b):pepC i
vs#935S + 35S:pat:35S) pCIB4407を、35S:PAT:35S 遺伝子を含む約4 Kb HindIII
/EcoRI断片、並びにpCIB4406からの3.1 Kb/HindIII/Eco
RI 35S: 合成-cryIA(b):35S 遺伝子から作る。pCIB4407
を、結合させ、そして標準的な手順(Sambrook et al.)
を使用して大腸菌(E.coli)の" 確かな"DH5アルファ、及
びHB101 株の中に形質転換させる。この合成cryIA(b)遺
伝子は、その前駆体pCIB4406と同じ性質をもっている。
vs#935S + 35S:pat:35S) pCIB4407を、35S:PAT:35S 遺伝子を含む約4 Kb HindIII
/EcoRI断片、並びにpCIB4406からの3.1 Kb/HindIII/Eco
RI 35S: 合成-cryIA(b):35S 遺伝子から作る。pCIB4407
を、結合させ、そして標準的な手順(Sambrook et al.)
を使用して大腸菌(E.coli)の" 確かな"DH5アルファ、及
びHB101 株の中に形質転換させる。この合成cryIA(b)遺
伝子は、その前駆体pCIB4406と同じ性質をもっている。
【０２７７】3. pCIB4416 (35S:合成-cryIA(b):pepC i
vs#9:35S + 35S:PAT:35S + 35S:Adhイントロン:GUS:35
S.) pCIB4407を、EcoRI により切断し、そして標準的な条件
下(Sambrook et al.)でウシ腸アルカリ性ホスファター
ゼ(CIP) により処理し、約7.2 Kb断片を作り、これを、
3.4 Kb EcoRI 35S:Adh/GUS:35S断片と結合させ、pCIB44
16を作る。結合及び" 確かな" 細胞への形質転換は、先
に記載したものと同じである。pCIB4416内の合成cryIA
(b)遺伝子は、pCIB4406内の遺伝子と同じ性質をもって
いる。
vs#9:35S + 35S:PAT:35S + 35S:Adhイントロン:GUS:35
S.) pCIB4407を、EcoRI により切断し、そして標準的な条件
下(Sambrook et al.)でウシ腸アルカリ性ホスファター
ゼ(CIP) により処理し、約7.2 Kb断片を作り、これを、
3.4 Kb EcoRI 35S:Adh/GUS:35S断片と結合させ、pCIB44
16を作る。結合及び" 確かな" 細胞への形質転換は、先
に記載したものと同じである。pCIB4416内の合成cryIA
(b)遺伝子は、pCIB4406内の遺伝子と同じ性質をもって
いる。
【０２７８】4. pCIB4418 (35S: 合成-cryIA(b):pepC i
vs#9:35S) pCIB4406を、ApaI及びBamHI により消化し、そしてCIP
により処理する。pCIB4406を、BamHI 及びNspIにより消
化する。pBS123#13 を、NspI及びApaIにより消化する。
pCIB4406からの4.3Kb ApaI/BamHI断片、pCIB4406からの
1.3Kb BamHI/NspI断片、及びpBS123#13 からの170 塩基
対のNspI/ApaI 断片を含む3 方結合を、行い、pCIB4418
を作る。pCIB4418のための宿主大腸菌(E.coli)株は、HB
101 である。
vs#9:35S) pCIB4406を、ApaI及びBamHI により消化し、そしてCIP
により処理する。pCIB4406を、BamHI 及びNspIにより消
化する。pBS123#13 を、NspI及びApaIにより消化する。
pCIB4406からの4.3Kb ApaI/BamHI断片、pCIB4406からの
1.3Kb BamHI/NspI断片、及びpBS123#13 からの170 塩基
対のNspI/ApaI 断片を含む3 方結合を、行い、pCIB4418
を作る。pCIB4418のための宿主大腸菌(E.coli)株は、HB
101 である。
【０２７９】5. pCIB4419 (35S:合成-cryIA(b):pepC i
vs#9:35S + 35S:PAT:35S + 35S:Adhイントロン:GUS:35
S) pCIB4416及びpCIB4418を、Bst E II及びEco NIにより消
化し、そしてpCIB4416の断片を、CIP により処理する。
pCIB4416からの9.1 Kb断片を、pCIB4418からの1.4 Kb断
片に結合させ、pCIB4419を作る。HB101 コンピテント大
腸菌(E.coli)細胞内に形質転換されたpCIB4419は、欧州
トウモロコシ穿孔性動物に対する昆虫生物検定における
十分な活性を証明している。
vs#9:35S + 35S:PAT:35S + 35S:Adhイントロン:GUS:35
S) pCIB4416及びpCIB4418を、Bst E II及びEco NIにより消
化し、そしてpCIB4416の断片を、CIP により処理する。
pCIB4416からの9.1 Kb断片を、pCIB4418からの1.4 Kb断
片に結合させ、pCIB4419を作る。HB101 コンピテント大
腸菌(E.coli)細胞内に形質転換されたpCIB4419は、欧州
トウモロコシ穿孔性動物に対する昆虫生物検定における
十分な活性を証明している。
【０２８０】6. pCIB4420 ( 髄: 合成-cryIA(b):PEPC i
vs#9:35S + 35S:PAT:35S) pCIB4420の調製における中間体構築物は、pBTin1、pBti
n2、p4420A及びpBtin3である。pBtin1( 髄プロモータ
ー: 合成Bt遺伝子の第二半分+ 35S:PAT:35S)を、プラス
ミド髄(3-1) からの2.1Kb XbaI/NcoI 髄プロモーター断
片とpCIB4407からの5.2Kb XbaI/NcoI 断片とを結合させ
ることにより作る。pBtin2は、先に列記したプライマー
KE100A28及びKE98A28 を使用して作った210 塩基対のPC
R 断片により修飾された髄プロモーターを含む中間体構
築物である。PCR 反応混合物は、100 ピコモルのそれぞ
れのオリゴマー、200nM のそれぞれのdNTP、1Xバッファ
ー(Cetus) 及び2.5 ユニットの熱安定性ポリメラーゼと
共に約100ng の2.1Kb bamHI/NcoI髄プロモーター断片を
含む。このTmが比較的低い( 40℃と50℃との間) ので、
PCR 反応を以下のパラメーターにより走らせた:
vs#9:35S + 35S:PAT:35S) pCIB4420の調製における中間体構築物は、pBTin1、pBti
n2、p4420A及びpBtin3である。pBtin1( 髄プロモータ
ー: 合成Bt遺伝子の第二半分+ 35S:PAT:35S)を、プラス
ミド髄(3-1) からの2.1Kb XbaI/NcoI 髄プロモーター断
片とpCIB4407からの5.2Kb XbaI/NcoI 断片とを結合させ
ることにより作る。pBtin2は、先に列記したプライマー
KE100A28及びKE98A28 を使用して作った210 塩基対のPC
R 断片により修飾された髄プロモーターを含む中間体構
築物である。PCR 反応混合物は、100 ピコモルのそれぞ
れのオリゴマー、200nM のそれぞれのdNTP、1Xバッファ
ー(Cetus) 及び2.5 ユニットの熱安定性ポリメラーゼと
共に約100ng の2.1Kb bamHI/NcoI髄プロモーター断片を
含む。このTmが比較的低い( 40℃と50℃との間) ので、
PCR 反応を以下のパラメーターにより走らせた:
【０２８１】解裂サイクル:94 ℃、1 分間、
アニーリング・サイクル:37 ℃、1 分間、
伸長サイクル:72 ℃、45秒間(+サイクル毎3 秒間)
サイクル数:25
【０２８２】PCR 反応物を、SalI/KpnI による切断に先
立って先に記載したようなプロテイナーゼK により処理
し、その後、フェノール/ クロロホルム抽出し、そして
先に記載したようにエタノール沈降させた。この210 塩
基対の断片を、2% Nusieveゲル上で精製し、そしてその
ゲルからMillipore フィルター装置を使用して抽出し
た。この210Kb SalI/Kpn I断片を、髄(1-3) からの4.9
Kb salI/KpnI断片に結合させ、pBtin2を作る。p4420A(
髄: 合成-Bt:Pep イントロン:35S + 35S:PAT:35S) を、
pBtin2からの700 塩基対のNsiI/BamHI断片、pCIB4418か
らの1.8Kb のBamHI/Bst E II断片、及びpBtin1からの5.
9 KbのBst E II/Nsi I断片から成る3 方結合により作
る。p4420Aを作った後、pBtin2内で3 つの突然変異が発
見される。第二PCR 断片を、プライマーKE104A28及びKE
103A28を使用して約65℃のTm値で髄リーダー内のNcoI部
位を修飾するために作る。のPCR 反応混合物は、先に列
記したものと同じであり、20% までグリセロールを添加
し、G+C 豊富領域内の突然変異を減少させた(Henry et
al., Plant Molecular Biology Reporter 9(2):139-14
4, 1991) 。PCR パラメーターは、以下のものである:
立って先に記載したようなプロテイナーゼK により処理
し、その後、フェノール/ クロロホルム抽出し、そして
先に記載したようにエタノール沈降させた。この210 塩
基対の断片を、2% Nusieveゲル上で精製し、そしてその
ゲルからMillipore フィルター装置を使用して抽出し
た。この210Kb SalI/Kpn I断片を、髄(1-3) からの4.9
Kb salI/KpnI断片に結合させ、pBtin2を作る。p4420A(
髄: 合成-Bt:Pep イントロン:35S + 35S:PAT:35S) を、
pBtin2からの700 塩基対のNsiI/BamHI断片、pCIB4418か
らの1.8Kb のBamHI/Bst E II断片、及びpBtin1からの5.
9 KbのBst E II/Nsi I断片から成る3 方結合により作
る。p4420Aを作った後、pBtin2内で3 つの突然変異が発
見される。第二PCR 断片を、プライマーKE104A28及びKE
103A28を使用して約65℃のTm値で髄リーダー内のNcoI部
位を修飾するために作る。のPCR 反応混合物は、先に列
記したものと同じであり、20% までグリセロールを添加
し、G+C 豊富領域内の突然変異を減少させた(Henry et
al., Plant Molecular Biology Reporter 9(2):139-14
4, 1991) 。PCR パラメーターは、以下のものである:
【０２８３】
。
【０２８４】PCR 反応物を、上記にように処理し、そし
て制限エンドヌクレアーゼSalI及びKpnIにより切断す
る。この210Kb のSalI/KpnI PCR(反応中のグリセロー
ル) 断片を、プラスミド(3-1) からの4.9Kb SalI/KpnI
断片に結合させ、pBtin3を作る。pBtin3-G#1上のデータ
は、このPCR 生成断片が正しいものであることを示して
いる。
て制限エンドヌクレアーゼSalI及びKpnIにより切断す
る。この210Kb のSalI/KpnI PCR(反応中のグリセロー
ル) 断片を、プラスミド(3-1) からの4.9Kb SalI/KpnI
断片に結合させ、pBtin3を作る。pBtin3-G#1上のデータ
は、このPCR 生成断片が正しいものであることを示して
いる。
【０２８５】pBtin3-G#1を、pCIB4420(p4420B"G#6"とも
いう) を作るために使用する。pCIB4420を、pBtin3-G#1
からの700 塩基対のNsiI/BamHI断片、pCIB4418からの1.
8KbのBamHI/Bst E II断片、及びpBtin1からの5.9 Kb Bs
t E II/Nsi I 断片を使用した3 方結合により構築す
る。pCIB4420は、葉肉プロトプラスト実験において使用
され、そして欧州トウモロコシ穿孔性動物に対する合成
cryIA(b)遺伝子の十分な活性を証明している。
いう) を作るために使用する。pCIB4420を、pBtin3-G#1
からの700 塩基対のNsiI/BamHI断片、pCIB4418からの1.
8KbのBamHI/Bst E II断片、及びpBtin1からの5.9 Kb Bs
t E II/Nsi I 断片を使用した3 方結合により構築す
る。pCIB4420は、葉肉プロトプラスト実験において使用
され、そして欧州トウモロコシ穿孔性動物に対する合成
cryIA(b)遺伝子の十分な活性を証明している。
【０２８６】7. pCIB4413 (PEPC:合成-Bt(Phe 突然変
異):PEPCイントロン:35S.) 融合断片を、pGUS4.5 からの2.3 Kb HindIII/SalI テン
プレートと共にプライマーKE99A28 及びKE97A28 を使用
したPCR により作り出した。このPCR 混合物は、先に記
載したものと同じ濃度の、プライマー、テンプレート、
dNTPs 、塩、及び熱安定性ポリメラーゼを含む。PCR パ
ラメーターは:
異):PEPCイントロン:35S.) 融合断片を、pGUS4.5 からの2.3 Kb HindIII/SalI テン
プレートと共にプライマーKE99A28 及びKE97A28 を使用
したPCR により作り出した。このPCR 混合物は、先に記
載したものと同じ濃度の、プライマー、テンプレート、
dNTPs 、塩、及び熱安定性ポリメラーゼを含む。PCR パ
ラメーターは:
【０２８７】解裂サイクル:94 ℃、1 分間、
アニーリング・サイクル:55 ℃、1 分間、
伸長サイクル:72 ℃、45秒間 (サイクル毎に +3 秒間)
サイクル数:30
である。
【０２８８】終了後、PCR 反応物を、先に記載したよう
に、制限エンドヌクレアーゼBamHI及びBst E IIによる
切断に先立って、プロテイナーゼK により処理し、その
後フェノール/ クロロホルム抽出し、そしてエタノール
沈降させた。
に、制限エンドヌクレアーゼBamHI及びBst E IIによる
切断に先立って、プロテイナーゼK により処理し、その
後フェノール/ クロロホルム抽出し、そしてエタノール
沈降させた。
【０２８９】pCIB4413を、210 塩基対のBamHI/Bst E II
PCR断片、pCIB4406からの4.7Kb BamHI/HindIII 断片、
及びpGUS4.5 からの2.2Kb HindIII/Bst E II断片を使用
した3 方結合により作る。
PCR断片、pCIB4406からの4.7Kb BamHI/HindIII 断片、
及びpGUS4.5 からの2.2Kb HindIII/Bst E II断片を使用
した3 方結合により作る。
【０２９０】8. pCIB4421(PEPC:合成-cryIA(b):PEPCイ
ントロン:35S) pCIB4421を、pCIB4413内のPhe 突然変異を含む合成cryI
A(b)遺伝子を、pCIB4419からの合成cryIA(b)遺伝子と置
き換えるために作る。pCIB4421を、pCIB4413からの5.2K
b のBamHI/SacI断片とpCIB4419からの1.9Kb のBamHI/Sa
cI断片と結合させることにより作る。
ントロン:35S) pCIB4421を、pCIB4413内のPhe 突然変異を含む合成cryI
A(b)遺伝子を、pCIB4419からの合成cryIA(b)遺伝子と置
き換えるために作る。pCIB4421を、pCIB4413からの5.2K
b のBamHI/SacI断片とpCIB4419からの1.9Kb のBamHI/Sa
cI断片と結合させることにより作る。
【０２９１】9. pCIB4423(PEPC:合成-cryIA(b):pepCイ
ントロン:35S + 35S:PAT:35S) pCIB4421からの2.4Kb のBamHI/HindIII PEPCプロモータ
ー断片を、pCIB4420内の6.2Kb BamHI/HindIII 断片と結
合させ、pCIB4423を作る。このHindIII 部位は、pCIB44
23のクローニングにおいてエンドヌクレアーゼにより欠
失される。pCIB4423は、PEPCプロモーターの制御下の合
成cryIA(b)遺伝子を含み、このPAT 遺伝子は、35S プロ
モーターの制御下にある。
ントロン:35S + 35S:PAT:35S) pCIB4421からの2.4Kb のBamHI/HindIII PEPCプロモータ
ー断片を、pCIB4420内の6.2Kb BamHI/HindIII 断片と結
合させ、pCIB4423を作る。このHindIII 部位は、pCIB44
23のクローニングにおいてエンドヌクレアーゼにより欠
失される。pCIB4423は、PEPCプロモーターの制御下の合
成cryIA(b)遺伝子を含み、このPAT 遺伝子は、35S プロ
モーターの制御下にある。
【０２９２】10. アグロバクテリウム(Agrobacterium)
株内の合成cryIA(b)遺伝子 合成cryIA(b)遺伝子により作られたアグロバクテリウム
株は、双子葉植物の範囲内でこの遺伝子の伝達を可能に
する。アグロバクテリウム・ベクターpCIB4417は、pBI1
01(Clontech)からの14Kb HindIII/EcoRI断片に結合され
ているpCIB4406(Phe突然変異) からの3.3Kb HindIII/Ec
oRI 35S:合成-CryIA(b):pepC:ivs#9:35S断片を含む。エ
レクトロポレーションを使用して、pCIB4417を、A. tum
efaciens株LBA4404 中に伝達させる(Diethard et al.,
Nucleic Acids Research, Vol 17:#16:6647, 1989)。
株内の合成cryIA(b)遺伝子 合成cryIA(b)遺伝子により作られたアグロバクテリウム
株は、双子葉植物の範囲内でこの遺伝子の伝達を可能に
する。アグロバクテリウム・ベクターpCIB4417は、pBI1
01(Clontech)からの14Kb HindIII/EcoRI断片に結合され
ているpCIB4406(Phe突然変異) からの3.3Kb HindIII/Ec
oRI 35S:合成-CryIA(b):pepC:ivs#9:35S断片を含む。エ
レクトロポレーションを使用して、pCIB4417を、A. tum
efaciens株LBA4404 中に伝達させる(Diethard et al.,
Nucleic Acids Research, Vol 17:#16:6647, 1989)。
【０２９３】200ng のpCIB4417及び40μl の氷上解凍LB
A4404 コンピテント細胞を、前冷却0.2cm エレクトロポ
レーション・キュベット(Bio-Rad Laboratories Ltd.)
内でエレクトロポレーションにかける。Pulse Controll
er装置(Bio Rad) によるGenePulser-TMを使用して、電
気パルスを、直ちに、2.5 kVにおける電圧設定、及び25
μF における静電容量設定により、加える。パルス後、
細胞を、直ちに、1mlのYEB 培地に移し、そしてABmin:K
m50プレート上に10μl をプレーティングする前に、27
℃で3 時間、振とうする。約60時間28℃においてインキ
ュベートした後、コロニーを、ミニスクリーン調製のた
めに選択し、制限酵素分析を行う。最終的なアグロバク
テリウム株をpCIB4417:LBA4404という。
A4404 コンピテント細胞を、前冷却0.2cm エレクトロポ
レーション・キュベット(Bio-Rad Laboratories Ltd.)
内でエレクトロポレーションにかける。Pulse Controll
er装置(Bio Rad) によるGenePulser-TMを使用して、電
気パルスを、直ちに、2.5 kVにおける電圧設定、及び25
μF における静電容量設定により、加える。パルス後、
細胞を、直ちに、1mlのYEB 培地に移し、そしてABmin:K
m50プレート上に10μl をプレーティングする前に、27
℃で3 時間、振とうする。約60時間28℃においてインキ
ュベートした後、コロニーを、ミニスクリーン調製のた
めに選択し、制限酵素分析を行う。最終的なアグロバク
テリウム株をpCIB4417:LBA4404という。
【０２９４】例41: 形質転換メイズ・プロトプラストの
ELISA 検定 cryIA(b)毒素蛋白の存在を、酵素結合イムノソルベント
・アッセイ(ELISA) を利用して検出する。ELISA は、非
常に感度が良く、抗原物質に特異的な検定である。ELIS
A 検定は、ポリペプチド遺伝子生成物の発現を測定する
のに有用である。これらの検定のための抗血清を、ドデ
シル硫酸ナトリウムにより可溶化したグラジエント精製
Bt結晶[Ang et al., Applied Environ. Microbiol., 3
6:625-626(1978)]によるウサギの免疫化に対する応答に
おいて作り出す。過渡的形質転換メイズ細胞からの抽出
物のELISA 検定を、標準的な手順を使用して行う( 例え
ば、Harlow, E., and Lane, D. in "Antibodies: A Lab
oratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss, 1988) 。ELISA 技術は、さらに、Clark et al., Me
thods in Enzymology, 118:742-766 (1986);及びBradfo
rd, Anal. Biochem., 72:248 (1976)中に記載されてい
る。したがって、これらの手順は、当業者によく知られ
ている。これらの文献の開示を、ここで、引用により本
明細書中に取り込む。
ELISA 検定 cryIA(b)毒素蛋白の存在を、酵素結合イムノソルベント
・アッセイ(ELISA) を利用して検出する。ELISA は、非
常に感度が良く、抗原物質に特異的な検定である。ELIS
A 検定は、ポリペプチド遺伝子生成物の発現を測定する
のに有用である。これらの検定のための抗血清を、ドデ
シル硫酸ナトリウムにより可溶化したグラジエント精製
Bt結晶[Ang et al., Applied Environ. Microbiol., 3
6:625-626(1978)]によるウサギの免疫化に対する応答に
おいて作り出す。過渡的形質転換メイズ細胞からの抽出
物のELISA 検定を、標準的な手順を使用して行う( 例え
ば、Harlow, E., and Lane, D. in "Antibodies: A Lab
oratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss, 1988) 。ELISA 技術は、さらに、Clark et al., Me
thods in Enzymology, 118:742-766 (1986);及びBradfo
rd, Anal. Biochem., 72:248 (1976)中に記載されてい
る。したがって、これらの手順は、当業者によく知られ
ている。これらの文献の開示を、ここで、引用により本
明細書中に取り込む。
【０２９５】ELISA 検定を、メイズ・プロトプラスト内
のCryIA(b)蛋白を検出するために行う。作られた蛋白
を、全蛋白mg当たりのBtのng(ng Bt/mg)として以下に報
告する。それぞれの構築物を、2 回テストした。
のCryIA(b)蛋白を検出するために行う。作られた蛋白
を、全蛋白mg当たりのBtのng(ng Bt/mg)として以下に報
告する。それぞれの構築物を、2 回テストした。
【０２９６】上記の形質転換されたメイズ細胞は、メイ
ズ最適化Bt遺伝子により形質転換されたとき、全可溶化
蛋白mg当たり約20,000ngのBt CryIA(b) 蛋白のオーダー
に基づく、高いレベルのBt IP を作りだす。これらのEL
ISA ベースの検定の検出レベルは、mg蛋白当たり約1 〜
5ng CryIA(b)蛋白である。それ故、メイズ最適化Bt遺伝
子は、メイズ細胞内のこの蛋白の発現において約20,000
倍と大きな増加を作り出している。
ズ最適化Bt遺伝子により形質転換されたとき、全可溶化
蛋白mg当たり約20,000ngのBt CryIA(b) 蛋白のオーダー
に基づく、高いレベルのBt IP を作りだす。これらのEL
ISA ベースの検定の検出レベルは、mg蛋白当たり約1 〜
5ng CryIA(b)蛋白である。それ故、メイズ最適化Bt遺伝
子は、メイズ細胞内のこの蛋白の発現において約20,000
倍と大きな増加を作り出している。
【０２９７】例42: 欧州トウモロコシ穿孔性動物に対す
る殺虫活性についての形質転換されたプロトプラストか
らの抽出物の検定 ウェスタン・ブロット検定を、また、メイズ最適化遺伝
子を発現させるためのDNA により過渡的に形質転換され
ているメイズ細胞から得られた抽出物を使用して行う。
ウェスタン・ブロットにより検査するとき、この蛋白
は、大腸菌(E.coli)内で生産された蛋白と同一のものの
ようである。反対に、上記の例6 中に示したように、検
出可能なBt cryIA(b) 殺虫性蛋白は、生来のBt誘導コー
ド領域を発現することを試みられる競合ベクターにより
形質転換されたメイズ細胞によっては、全く作られてい
ない。
る殺虫活性についての形質転換されたプロトプラストか
らの抽出物の検定 ウェスタン・ブロット検定を、また、メイズ最適化遺伝
子を発現させるためのDNA により過渡的に形質転換され
ているメイズ細胞から得られた抽出物を使用して行う。
ウェスタン・ブロットにより検査するとき、この蛋白
は、大腸菌(E.coli)内で生産された蛋白と同一のものの
ようである。反対に、上記の例6 中に示したように、検
出可能なBt cryIA(b) 殺虫性蛋白は、生来のBt誘導コー
ド領域を発現することを試みられる競合ベクターにより
形質転換されたメイズ細胞によっては、全く作られてい
ない。
【０２９８】定性的な昆虫毒性テストを、収穫したプロ
トプラストを使用して行うことができる。懸濁液を、す
べての生物検定においてテストしたそれぞれの複製物に
ついて調製した。複製物は、その対照よりも有意に高い
死亡率を引き起こす場合には、陽性と考えられる。例え
ば、複製物を、欧州トウモロコシ穿孔性動物、Ostrinia
nubilalisを使用して鱗翅目内の昆虫に対するそれらの
活性についてテストする。0.1% Triton X-100 中の100
μl のプロトプラスト懸濁液を、50mm x 10mmスナップ-
キャップ・ペトリ皿内の人工Black ネキリムシ(cutwor
m) 餌(Bioserv, Inc., Frenchtown, NJ; F9240)の表面
上にピペットで移した。10の新生の幼虫を、それぞれの
プレートに添加する。約4 日後死亡率を記録する。この
蛋白が欧州トウモロコシ穿孔性動物に食べられたとき、
それは100%の死亡率をもたらす。
トプラストを使用して行うことができる。懸濁液を、す
べての生物検定においてテストしたそれぞれの複製物に
ついて調製した。複製物は、その対照よりも有意に高い
死亡率を引き起こす場合には、陽性と考えられる。例え
ば、複製物を、欧州トウモロコシ穿孔性動物、Ostrinia
nubilalisを使用して鱗翅目内の昆虫に対するそれらの
活性についてテストする。0.1% Triton X-100 中の100
μl のプロトプラスト懸濁液を、50mm x 10mmスナップ-
キャップ・ペトリ皿内の人工Black ネキリムシ(cutwor
m) 餌(Bioserv, Inc., Frenchtown, NJ; F9240)の表面
上にピペットで移した。10の新生の幼虫を、それぞれの
プレートに添加する。約4 日後死亡率を記録する。この
蛋白が欧州トウモロコシ穿孔性動物に食べられたとき、
それは100%の死亡率をもたらす。
【０２９９】例43: メイズ葉肉(mesophyll) プロトプラ
スト内での合成Bt遺伝子の発現 トウモロコシ葉肉プロトプラストの単離のための一般的
な手順をSheen et al., The Plant Cell, 2:1027-1038
(1990)から改良する。Shenn et al.中で使用されるプロ
トプラスト形質転換システムを、エレクトロポレーショ
ンよりもむしろPEG 仲介形質転換を使用して修飾する。
この手順並びにその単離手順において行われる変更を、
以下に記載する。
スト内での合成Bt遺伝子の発現 トウモロコシ葉肉プロトプラストの単離のための一般的
な手順をSheen et al., The Plant Cell, 2:1027-1038
(1990)から改良する。Shenn et al.中で使用されるプロ
トプラスト形質転換システムを、エレクトロポレーショ
ンよりもむしろPEG 仲介形質転換を使用して修飾する。
この手順並びにその単離手順において行われる変更を、
以下に記載する。
【０３００】メイズ葉肉プロトプラスト単離/ 形質転換
1. 葉材料のためのトウモロコシの種(corn seeds)を、
滅菌し、そして発芽させる。苗木(seedling)を、25℃に
おいて明かりの中で生育させる。 2. 5% Clorox により、5 分間、10-12 日目の苗木の葉
の片を表面滅菌し、その後、無菌蒸留水により洗浄す
る。
滅菌し、そして発芽させる。苗木(seedling)を、25℃に
おいて明かりの中で生育させる。 2. 5% Clorox により、5 分間、10-12 日目の苗木の葉
の片を表面滅菌し、その後、無菌蒸留水により洗浄す
る。
【０３０１】3. 酵素溶液( 以下の配合表を参照のこ
と) を部分分けする; 25ml/ 皿(100 x25 mmペトリ皿)
。 4. 葉から過剰の水を除去し、そして酵素のそれぞれの
皿の中に6-8 つの2 インチ片を入れる。14のプレート
は、約100 の苗木からの葉材料により普通には設定させ
る。 5. 可能な限り長いストリップにその葉を切断する(2-5
mm) 。
と) を部分分けする; 25ml/ 皿(100 x25 mmペトリ皿)
。 4. 葉から過剰の水を除去し、そして酵素のそれぞれの
皿の中に6-8 つの2 インチ片を入れる。14のプレート
は、約100 の苗木からの葉材料により普通には設定させ
る。 5. 可能な限り長いストリップにその葉を切断する(2-5
mm) 。
【０３０２】6. 25℃において6.5 〜7 時間ゆっくり振
とうする。インキュベーションが暗い中で起こるように
プレートを覆う。 7. プロトプラストを濾過する前に、100 μm 篩を10ml
0.6M マニトールにより洗浄する。プロトプラストをゆ
っくりと篩からピペットにとる。皿内に残ったプロトプ
ラストのいずれをも集めるために0.6Mマニトールにより
プレートを洗浄する。
とうする。インキュベーションが暗い中で起こるように
プレートを覆う。 7. プロトプラストを濾過する前に、100 μm 篩を10ml
0.6M マニトールにより洗浄する。プロトプラストをゆ
っくりと篩からピペットにとる。皿内に残ったプロトプ
ラストのいずれをも集めるために0.6Mマニトールにより
プレートを洗浄する。
【０３０３】8. 濾過した液体を注意して50mlの滅菌チ
ューブ内にピペットで入れる。 9. 卓上遠心分離機(Beckman Model TJ-6)内で1000 rpm
/500g において10分間回転させる。 10. 酵素溶液を除去し、そして捨てる。ペレットを注
意して5ml マニトール中に再懸濁させる。いくつかのペ
レットをプールする。0.6Mマニトールにより50mlまでの
容量とし、そして回転させる。
ューブ内にピペットで入れる。 9. 卓上遠心分離機(Beckman Model TJ-6)内で1000 rpm
/500g において10分間回転させる。 10. 酵素溶液を除去し、そして捨てる。ペレットを注
意して5ml マニトール中に再懸濁させる。いくつかのペ
レットをプールする。0.6Mマニトールにより50mlまでの
容量とし、そして回転させる。
【０３０４】11. 既知容量(50ml)に再懸濁させ、そし
て計数を行う。 12. 計数及びペレット化の後、再懸濁バッファー( 以
下の配合表) 中、2 ミリオン/ml においてプロトプラス
トを再懸濁させる。形質転換の前に少なくとも30分間、
再懸濁バッファー中で、プロトプラストをインキュベー
ションに供する。
て計数を行う。 12. 計数及びペレット化の後、再懸濁バッファー( 以
下の配合表) 中、2 ミリオン/ml においてプロトプラス
トを再懸濁させる。形質転換の前に少なくとも30分間、
再懸濁バッファー中で、プロトプラストをインキュベー
ションに供する。
【０３０５】形質転換:
1. プラスミドをチューブ(Fisherbrandポリスチレン17
x 100mmスナップ・キャップ培養チューブ) に部分分け
(Aliquot) し; 処理当たり少なくとも3 回繰り返し; 等
しい遺伝子コピー数が比較されるように等モル量のプラ
スミドを使用する。 2. 0.5mlのプロトプラストを添加し、そして0.5ml の40
% PEG を0.6 M マニトールにより調製する。 3. ゆるやかに混合するまで振とうし、そして30分間25
℃においてインキュベートする。
x 100mmスナップ・キャップ培養チューブ) に部分分け
(Aliquot) し; 処理当たり少なくとも3 回繰り返し; 等
しい遺伝子コピー数が比較されるように等モル量のプラ
スミドを使用する。 2. 0.5mlのプロトプラストを添加し、そして0.5ml の40
% PEG を0.6 M マニトールにより調製する。 3. ゆるやかに混合するまで振とうし、そして30分間25
℃においてインキュベートする。
【０３０６】4. 5 分間の間隔においてプロトプラスト
培養基を添加する1: 1、2 、5ml 。 5. 1000rpm/500gにおいて10分間回転させる。 6. ペレットから液体を除去し、そして1ml の培養基(B
MV培地)中に再懸濁させる。 7. 一夜、暗い中で25℃においてインキュベートする。
培養基を添加する1: 1、2 、5ml 。 5. 1000rpm/500gにおいて10分間回転させる。 6. ペレットから液体を除去し、そして1ml の培養基(B
MV培地)中に再懸濁させる。 7. 一夜、暗い中で25℃においてインキュベートする。
【０３０７】配合表:
酵素溶液
0.6Mマニトール
10mM MES、pH 5.7
1 mM CaCl 2
1 mM MgCl 2
0.1% BSA
滅菌濾過、
【０３０８】上記の溶液に、以下の酵素を添加する:
1% Cellulase RS 、及び0.1% Macerozyme R10
洗浄バッファー: 0.6Mマニトール、滅菌濾過、
再懸濁バッファー: 0.6Mマニトール、20mM KCl、滅菌濾
過、
過、
【０３０９】培養基: BMV 培地であってOkuno et al.,
Phytopathology 67:610-615(1977) からの配合表 0.6Mマニトール 4mM MES 、pH 5.7 0.2mM KH2 PO4 1mM KNO 3 1mM MgSO4 10mM CaCl 2 1x K3 マイクロニュートリエント(micronutrients) 滅菌濾過。
Phytopathology 67:610-615(1977) からの配合表 0.6Mマニトール 4mM MES 、pH 5.7 0.2mM KH2 PO4 1mM KNO 3 1mM MgSO4 10mM CaCl 2 1x K3 マイクロニュートリエント(micronutrients) 滅菌濾過。
【０３１０】形質転換されたプロトプラストのELISA 検
定を、形質転換後1 日目に行う。ELISA を先に記載した
ように行う。以下の3 つの実験を、メイズ同系211Dによ
り行う。もちろん、他の系のメイズを使用してもよい。
50μg のプラスミドpCIB4419及び等モル量の他のプラス
ミドを使用する。全可溶性蛋白を、BioRad蛋白検定を使
用して決定する(Bradford, Anal. Biochem, 72:248(197
6)) 。
定を、形質転換後1 日目に行う。ELISA を先に記載した
ように行う。以下の3 つの実験を、メイズ同系211Dによ
り行う。もちろん、他の系のメイズを使用してもよい。
50μg のプラスミドpCIB4419及び等モル量の他のプラス
ミドを使用する。全可溶性蛋白を、BioRad蛋白検定を使
用して決定する(Bradford, Anal. Biochem, 72:248(197
6)) 。
【０３１１】形質転換実験:
テスト構築物:
1. pCIB4419(CaMV 35Sプロモーターの制御下の合成Bt並
びに35S/PAT 及び35/GUSマーカー遺伝子を含む構築物) 2. pCIB4420(髄プロモーターの制御下の合成Bt及びPAT
マーカー遺伝子を含む構築物) 3. pCIB4421(PEPCプロモーターの制御下の合成Btを含む
構築物) 4. pCIB4423(PEPCプロモーターの制御下の合成Bt及びPA
T マーカー遺伝子を含む構築物) (PEPC:合成-cryIA(b):PepCイントロン:35S + 35S:PAT:3
5S)
びに35S/PAT 及び35/GUSマーカー遺伝子を含む構築物) 2. pCIB4420(髄プロモーターの制御下の合成Bt及びPAT
マーカー遺伝子を含む構築物) 3. pCIB4421(PEPCプロモーターの制御下の合成Btを含む
構築物) 4. pCIB4423(PEPCプロモーターの制御下の合成Bt及びPA
T マーカー遺伝子を含む構築物) (PEPC:合成-cryIA(b):PepCイントロン:35S + 35S:PAT:3
5S)
【０３１２】以下の実験において、10又は11日目の211D
苗木を、Biorad蛋白検定においてBtCryIA(b) の生産に
ついて分析する: 実験1(11日目の苗木): pCIB4419 15,000±3,000 ng Bt/mg蛋白 pCIB4420 280 ± 65 ng Bt/mg蛋白 pCIB4421 9,000 ±800 ng Bt/mg蛋白 実験2(10日目の苗木): pCIB4419 5,000 ±270 ng Bt/mg蛋白 pCIB4420 80± 14 ng Bt/mg蛋白 pCIB4421 1,600 ±220 ng Bt/mg蛋白
苗木を、Biorad蛋白検定においてBtCryIA(b) の生産に
ついて分析する: 実験1(11日目の苗木): pCIB4419 15,000±3,000 ng Bt/mg蛋白 pCIB4420 280 ± 65 ng Bt/mg蛋白 pCIB4421 9,000 ±800 ng Bt/mg蛋白 実験2(10日目の苗木): pCIB4419 5,000 ±270 ng Bt/mg蛋白 pCIB4420 80± 14 ng Bt/mg蛋白 pCIB4421 1,600 ±220 ng Bt/mg蛋白
【０３１３】実験3(11日目の苗木):
pCIB4419 21,500±1,800 ng Bt/mg蛋白
pCIB4420 260 ± 50 ng Bt/mg蛋白
pCIB4421 11,900±4,000 ng Bt/mg蛋白
pCIB4423 7,200 ±3,400 ng Bt/mg蛋白
【０３１４】上記の実験は、CaMV 35S及びPEPCプロモー
ターの両方が非常に高いレベルにおいて合成Bt CryIA
(b) 蛋白を発現することを確信させた。より少ない効率
であるが髄プロモーターも、合成CryIA(b)蛋白の発現に
ついて有効である。
ターの両方が非常に高いレベルにおいて合成Bt CryIA
(b) 蛋白を発現することを確信させた。より少ない効率
であるが髄プロモーターも、合成CryIA(b)蛋白の発現に
ついて有効である。
【０３１５】例44: レタス内における合成Btの安定的な
発現 アグロバクテリウム・ベクターpCIB4417内の合成Bt遺伝
子を、Lactuca sativacv. Redprize(レタス) 中に形質
転換させる。使用する形質転換の手順は、Enomoto et a
l., Plant Cell Reports, 9:6-9(1990) 中に記載されて
いるものである。
発現 アグロバクテリウム・ベクターpCIB4417内の合成Bt遺伝
子を、Lactuca sativacv. Redprize(レタス) 中に形質
転換させる。使用する形質転換の手順は、Enomoto et a
l., Plant Cell Reports, 9:6-9(1990) 中に記載されて
いるものである。
【０３１６】形質転換手順:レタスの種を、5% Clorox
中で5 分間滅菌し、その後無菌蒸留水中で数回洗浄す
る。表面滅菌された種を、半強度MS培地(Murashige and
Skoog, Physiol. Plant. 15:473-497 (1962))上にプレ
ーティングする。25℃において16時間、3,000lxの明か
りの下で成長させた6 日目のRedprize苗木の子葉を、ア
グロバクテリウム感染の外植体(explants)として使用す
る。それぞれの子葉の基及び先端を、メスで除去する。
この外植体を、28℃において適当な抗生物質を含むAB最
小培地中で48時間培養したバクテリア溶液中に10分間、
浸漬した。滅菌フィルター紙上で過剰のバクテリア溶液
を吸い取った後、その外植体を、MS培地(0.1mg/ml BA及
び0.1mg/l NAA)上に2 日間プレーティングした。次に外
植体を、500mg/l カルベニシリン(carbenicillin) 及び
50mg/lのカナマイシン(kanamycin) を含む選択培地に移
す。外植体を、新たな培地に一週間毎に継代培養する。
培養室条件は、25℃、16時間、2,000 lxである。約4 週
間後、ELISA を、継代培養されている4 つのプレートの
それぞれから健康に見えるカルスに対して行う。このEL
ISA 手順は、プロトプラストについて先に記載したもの
と同じである; 可溶性蛋白を、先に記載したようなBior
ad検定により再び測定する。
中で5 分間滅菌し、その後無菌蒸留水中で数回洗浄す
る。表面滅菌された種を、半強度MS培地(Murashige and
Skoog, Physiol. Plant. 15:473-497 (1962))上にプレ
ーティングする。25℃において16時間、3,000lxの明か
りの下で成長させた6 日目のRedprize苗木の子葉を、ア
グロバクテリウム感染の外植体(explants)として使用す
る。それぞれの子葉の基及び先端を、メスで除去する。
この外植体を、28℃において適当な抗生物質を含むAB最
小培地中で48時間培養したバクテリア溶液中に10分間、
浸漬した。滅菌フィルター紙上で過剰のバクテリア溶液
を吸い取った後、その外植体を、MS培地(0.1mg/ml BA及
び0.1mg/l NAA)上に2 日間プレーティングした。次に外
植体を、500mg/l カルベニシリン(carbenicillin) 及び
50mg/lのカナマイシン(kanamycin) を含む選択培地に移
す。外植体を、新たな培地に一週間毎に継代培養する。
培養室条件は、25℃、16時間、2,000 lxである。約4 週
間後、ELISA を、継代培養されている4 つのプレートの
それぞれから健康に見えるカルスに対して行う。このEL
ISA 手順は、プロトプラストについて先に記載したもの
と同じである; 可溶性蛋白を、先に記載したようなBior
ad検定により再び測定する。
【０３１７】
結果:
pCIB3021( カナマイシン対照) 0
pCIB4417( プレート1) 0
pCIB4417( プレート2) 505 ng Bt/mg 蛋白
pCIB4417( プレート3) 45 ng Bt/mg 蛋白
pCIB4417( プレート4) 1,200 ng Bt/mg 蛋白
【０３１８】本例は、双子葉植物も、最適化された殺虫
性遺伝子の増加された発現を示すことを示している。
性遺伝子の増加された発現を示すことを示している。
【０３１９】例45: pCIB4429 の構築
pCIB4429は、メイズ最適化cryIA(b)遺伝子と融合した好
ましいメイズ花粉特異的プロモーターを含む。この構築
において使用される花粉特異的メイズ・プロモーター
を、例37中に記載したプラスミドpKL2から得た。このメ
イズ最適化cryIA(b)遺伝子を、これもまた例37中に記載
したプラスミドpCIB4418から得た。
ましいメイズ花粉特異的プロモーターを含む。この構築
において使用される花粉特異的メイズ・プロモーター
を、例37中に記載したプラスミドpKL2から得た。このメ
イズ最適化cryIA(b)遺伝子を、これもまた例37中に記載
したプラスミドpCIB4418から得た。
【０３２０】pKL2は、大腸菌(E.coli)のベータ- グルク
ロニダーゼ(beta-glucuronidase)遺伝子と融合している
好ましいメイズ花粉特異的プロモーターを含むプラスミ
ドである。これを、プラスミドpSK110及びpCIB3054から
構築した。pSK110は、花粉特異的メイズ・プロモーター
を含む。pCIB3054、pUC19 誘導体は、カリフラワー・モ
ザイク・ウイルス(CaMV) 35Sプロモーターと融合した大
腸菌(E.coli)ベータ-グルクロニダーゼ(GUS) 遺伝子を
含む。その構築を、本明細書中の他の場所に記載する。
このプロモーターを、SalI/HindIIIにより切断すること
により上記のプラスミドから取り出し、GUS 遺伝子、バ
クテリアのアンピシリン耐性遺伝子及びColEI 複製起点
を含む断片を作ることができる。この第二断片は、CaMV
35Sプロモーターを含む。
ロニダーゼ(beta-glucuronidase)遺伝子と融合している
好ましいメイズ花粉特異的プロモーターを含むプラスミ
ドである。これを、プラスミドpSK110及びpCIB3054から
構築した。pSK110は、花粉特異的メイズ・プロモーター
を含む。pCIB3054、pUC19 誘導体は、カリフラワー・モ
ザイク・ウイルス(CaMV) 35Sプロモーターと融合した大
腸菌(E.coli)ベータ-グルクロニダーゼ(GUS) 遺伝子を
含む。その構築を、本明細書中の他の場所に記載する。
このプロモーターを、SalI/HindIIIにより切断すること
により上記のプラスミドから取り出し、GUS 遺伝子、バ
クテリアのアンピシリン耐性遺伝子及びColEI 複製起点
を含む断片を作ることができる。この第二断片は、CaMV
35Sプロモーターを含む。
【０３２１】pCIB3054を、標準的な条件を使用して、室
温において2 時間、制限酵素SalI及びHindIII により切
断した。次に、この反応物を、標準的な条件を使用して
フェニール/ クロロホルムにより抽出し、そしてそのDN
A を、標準的な条件を使用してエタノール沈降により回
収した。回収したDNA を、ウシ腸アルカリ性ホスファタ
ーゼ(CIP) を含む反応に適切なバッファー中に再懸濁さ
せ、そして37℃において一夜、2.5 ユニットのCIP と反
応させた。このCIP 反応の後、このDNA を、本明細書中
で他の場所に記載したような標準的な条件を使用してア
ガロース・ゲル上で精製した。pSK110を、室温において
2 時間標準的な条件下でSalI/HIndIIIにより切断し、そ
してその後、そのDNA を、標準的な条件下でアガロース
・ゲル上で精製した。回収したDNA 断片を、室温におい
て2 時間標準的な条件を使用して結合させ、そしてその
後、標準的な条件を使用してコンピテント大腸菌(E.col
i)株HB101 細胞中に形質転換させる。形質転換細胞を、
100 μg アンピシリン/mlを含むL-寒天上で選択した。
形質転換細胞を、標準的なプラスミドのミニ- スクリー
ン手順を使用して所望のプラスミド構築物として特徴付
けた。正しい構築物を、pKL2と名付けた。
温において2 時間、制限酵素SalI及びHindIII により切
断した。次に、この反応物を、標準的な条件を使用して
フェニール/ クロロホルムにより抽出し、そしてそのDN
A を、標準的な条件を使用してエタノール沈降により回
収した。回収したDNA を、ウシ腸アルカリ性ホスファタ
ーゼ(CIP) を含む反応に適切なバッファー中に再懸濁さ
せ、そして37℃において一夜、2.5 ユニットのCIP と反
応させた。このCIP 反応の後、このDNA を、本明細書中
で他の場所に記載したような標準的な条件を使用してア
ガロース・ゲル上で精製した。pSK110を、室温において
2 時間標準的な条件下でSalI/HIndIIIにより切断し、そ
してその後、そのDNA を、標準的な条件下でアガロース
・ゲル上で精製した。回収したDNA 断片を、室温におい
て2 時間標準的な条件を使用して結合させ、そしてその
後、標準的な条件を使用してコンピテント大腸菌(E.col
i)株HB101 細胞中に形質転換させる。形質転換細胞を、
100 μg アンピシリン/mlを含むL-寒天上で選択した。
形質転換細胞を、標準的なプラスミドのミニ- スクリー
ン手順を使用して所望のプラスミド構築物として特徴付
けた。正しい構築物を、pKL2と名付けた。
【０３２２】pCIB4429を作るために、3 方結合を、当業
者に知られた標準的な条件を使用し行った。これらの3
つの断片は、以下のものであった: 1) cryIA(b) 遺伝子、バクテリアのアンピシリン耐性遺
伝子、及びColE1 複製起点を含むサイズ約4.7Kb の、pC
IB4418からのHindIII/BamHI 断片、 2)サイズ約1.3Kb のpKL2からのHindIII/XbaI断片であっ
てメイズからの花粉特異的プロモーターを含むもの、 3)転写開始から下流に導入されたBamHI 部位をもつ花粉
プロモーターから得られたPCR 生成断片。
者に知られた標準的な条件を使用し行った。これらの3
つの断片は、以下のものであった: 1) cryIA(b) 遺伝子、バクテリアのアンピシリン耐性遺
伝子、及びColE1 複製起点を含むサイズ約4.7Kb の、pC
IB4418からのHindIII/BamHI 断片、 2)サイズ約1.3Kb のpKL2からのHindIII/XbaI断片であっ
てメイズからの花粉特異的プロモーターを含むもの、 3)転写開始から下流に導入されたBamHI 部位をもつ花粉
プロモーターから得られたPCR 生成断片。
【０３２３】この断片は、約120 塩基対であり、そして
制限酵素XbaI/BamHIにより切断された末端をもってい
る。このPCR 断片を、100 μl 反応容量及び先に記載し
たような標準的な条件を使用して作った。使用したプラ
イマーは:
制限酵素XbaI/BamHIにより切断された末端をもってい
る。このPCR 断片を、100 μl 反応容量及び先に記載し
たような標準的な条件を使用して作った。使用したプラ
イマーは:
【０３２４】
SK50: 5'-CCC TTC AAA ATC TAG AAA CCT-3'
KE127: 5'-GCG GAT CCG GCT GCG GCG GGG AAC GA-3'
であった。
【０３２５】上記のプライマーを、PCR 反応においてプ
ラスミドpSK105であってメイズからの花粉特異的プロモ
ーターを含むものと混合した。
ラスミドpSK105であってメイズからの花粉特異的プロモ
ーターを含むものと混合した。
【０３２６】このPCR 反応終了後、10、μl の反応物
を、標準的な条件を使用してアガロース・ゲル上で走ら
せ、その反応物が予想サイズの生成物を作ることを確認
した。残りの90μl を最終濃度50μg/mlにおいて30分間
37℃においてプロテイナーゼKにより処理した、次にこ
の反応物を、65℃において10分間加熱し、次に標準的な
手順を使用してフェノール/ クロロホルム抽出した。こ
のDNA を、標準的な条件を使用して2 容量のエタノール
により沈殿させることによりその上澄液から回収した。
沈殿後、このDNA を、マイクロフュージ内で遠心分離に
より回収した。このペレットを、70% エタノールで1 回
濯ぎ( 本技術分野において標準的である)、すべてのエ
タノールを除去するために簡単に乾燥させ、そしてその
ペレットを17μl TEバッファー中に再懸濁させた。2 μ
l の10X 制限酵素バッファーを、0.5 μl BamHI 及び0.
5 μl XbaIとなるように添加した。このDNA を、2 時間
37℃において消化し、XbaI/BamHIにより切断されたDNA
断片を作った。制限酵素による消化の後、この断片を、
2% Nusieve(FMC)/1%アガロース・ゲルから成るアガロー
ス・ゲル上で精製した。Millipore フィルター装置を、
製造者の指示を使用してそのアガロース・ゲルからその
DNA を溶出させるために使用した。溶出後、このDNA
を、先に記載したような3 方結合において使用した。
を、標準的な条件を使用してアガロース・ゲル上で走ら
せ、その反応物が予想サイズの生成物を作ることを確認
した。残りの90μl を最終濃度50μg/mlにおいて30分間
37℃においてプロテイナーゼKにより処理した、次にこ
の反応物を、65℃において10分間加熱し、次に標準的な
手順を使用してフェノール/ クロロホルム抽出した。こ
のDNA を、標準的な条件を使用して2 容量のエタノール
により沈殿させることによりその上澄液から回収した。
沈殿後、このDNA を、マイクロフュージ内で遠心分離に
より回収した。このペレットを、70% エタノールで1 回
濯ぎ( 本技術分野において標準的である)、すべてのエ
タノールを除去するために簡単に乾燥させ、そしてその
ペレットを17μl TEバッファー中に再懸濁させた。2 μ
l の10X 制限酵素バッファーを、0.5 μl BamHI 及び0.
5 μl XbaIとなるように添加した。このDNA を、2 時間
37℃において消化し、XbaI/BamHIにより切断されたDNA
断片を作った。制限酵素による消化の後、この断片を、
2% Nusieve(FMC)/1%アガロース・ゲルから成るアガロー
ス・ゲル上で精製した。Millipore フィルター装置を、
製造者の指示を使用してそのアガロース・ゲルからその
DNA を溶出させるために使用した。溶出後、このDNA
を、先に記載したような3 方結合において使用した。
【０３２７】結合後、DNA を、標準的な技術を使用して
コンピテント大腸菌(E.coli)株HB101 細胞中に形質転換
させた。形質転換細胞を、アンピシリンを100 μg/mlで
含むL-寒天上で選択した。選択条件下で増殖させたコロ
ーニーを、本技術分野において標準的な技術を使用して
プラスミド挿入物について特徴付けた。
コンピテント大腸菌(E.coli)株HB101 細胞中に形質転換
させた。形質転換細胞を、アンピシリンを100 μg/mlで
含むL-寒天上で選択した。選択条件下で増殖させたコロ
ーニーを、本技術分野において標準的な技術を使用して
プラスミド挿入物について特徴付けた。
【０３２８】例46: pCIB4431 、すなわち植物内の合成
cryIA(b)遺伝子の組織特異的発現のためのベクターの構
築 pCIB4431は、メイズを形質転換させるために設計された
ベクターである。それは、メイズ内で発現可能な2 つの
キメラのBtエンドトキシン遺伝子を含んでいる。これら
の遺伝子は、PEP/カルボキシラーゼ・プロモーター/ 合
成-cryIA(b) 及び花粉プロモーター/ 合成-cryIA(b) で
ある。このベクター内のPEP カルボキシラーゼ/cryIA
(b) 遺伝子は、先に記載したpCIB4421から得られる。花
粉プロモーターも先に記載されている。Fig.20は、プラ
スミドpCIB4431のマップである。pCIB4431を、pCIB4429
からの花粉/ 合成-cryIA(b) を含む約3.5Kb のKpnI/HIn
dIII断片、約4.5Kb のHindIII/EcoRI(PEPC/ 合成-cryIA
(b))及びベクターBluescriptからの約2.6Kb のKpnI/Eco
RI断片を使用した3 部結合を介して構築した。花粉プロ
モーター/ 合成CryIA(b)キメラ遺伝子を含む他のベクタ
ーは、pCIB4428及びpCIB4430を含む。Fig.21及び22を参
照のこと。pCIB4430も、先に記載したようなPEPC/ 合成
-Bt 遺伝子を含む。
cryIA(b)遺伝子の組織特異的発現のためのベクターの構
築 pCIB4431は、メイズを形質転換させるために設計された
ベクターである。それは、メイズ内で発現可能な2 つの
キメラのBtエンドトキシン遺伝子を含んでいる。これら
の遺伝子は、PEP/カルボキシラーゼ・プロモーター/ 合
成-cryIA(b) 及び花粉プロモーター/ 合成-cryIA(b) で
ある。このベクター内のPEP カルボキシラーゼ/cryIA
(b) 遺伝子は、先に記載したpCIB4421から得られる。花
粉プロモーターも先に記載されている。Fig.20は、プラ
スミドpCIB4431のマップである。pCIB4431を、pCIB4429
からの花粉/ 合成-cryIA(b) を含む約3.5Kb のKpnI/HIn
dIII断片、約4.5Kb のHindIII/EcoRI(PEPC/ 合成-cryIA
(b))及びベクターBluescriptからの約2.6Kb のKpnI/Eco
RI断片を使用した3 部結合を介して構築した。花粉プロ
モーター/ 合成CryIA(b)キメラ遺伝子を含む他のベクタ
ーは、pCIB4428及びpCIB4430を含む。Fig.21及び22を参
照のこと。pCIB4430も、先に記載したようなPEPC/ 合成
-Bt 遺伝子を含む。
【０３２９】例47: 合成メイズ最適化CryIA(b)遺伝子を
含むトランスジェニック・メイズ植物の生産 以下の例は、そこから形質転換細胞が作られるところ
の、メイズ細胞中にDNA被覆粒子を導入するためにBioli
sticsを使用する。 実験KC-65 組織特異的プロモーターを使用した合成cryIA(b)遺伝子
を発現するトランスジェニック・メイズ植物の生産
含むトランスジェニック・メイズ植物の生産 以下の例は、そこから形質転換細胞が作られるところ
の、メイズ細胞中にDNA被覆粒子を導入するためにBioli
sticsを使用する。 実験KC-65 組織特異的プロモーターを使用した合成cryIA(b)遺伝子
を発現するトランスジェニック・メイズ植物の生産
【０３３０】組織
長さ約1.5-2.5mm の、未成熟のメイズ胚(embryos) を、
受粉後14-15 日目の遺伝子型6N615 の穂から切除した。
母植物(mother plant)を、グリーンハウス内で生育させ
た。切除前、その穂を、20% Cloroxにより20分間表面滅
菌し、そして滅菌水により3 回濯いだ。個々の胚を、カ
ルス開始培地、すなわち、2DG4 + 5クロランベン(chlor
amben)培地(5mg/lクロランベン、20mg/lグルコース、及
びオートクレーブ後に添加した10ml G4 添加物( 表1)を
含む、N6主要塩、B5微量塩、MS鉄、2%シュクロース) 上
に、2 平方cmの面積内に胚盤(scutellum) 側を上に向け
て、すねわち1 つのプレートに対し36の胚において、置
いた。
受粉後14-15 日目の遺伝子型6N615 の穂から切除した。
母植物(mother plant)を、グリーンハウス内で生育させ
た。切除前、その穂を、20% Cloroxにより20分間表面滅
菌し、そして滅菌水により3 回濯いだ。個々の胚を、カ
ルス開始培地、すなわち、2DG4 + 5クロランベン(chlor
amben)培地(5mg/lクロランベン、20mg/lグルコース、及
びオートクレーブ後に添加した10ml G4 添加物( 表1)を
含む、N6主要塩、B5微量塩、MS鉄、2%シュクロース) 上
に、2 平方cmの面積内に胚盤(scutellum) 側を上に向け
て、すねわち1 つのプレートに対し36の胚において、置
いた。
【０３３１】
【０３３２】爆撃
組織を、PDS-1000He Biolistics 装置を使用して爆撃(b
ombarded) した。この組織を、その停止スクリーン棚の
下8cm の棚の上に置いた。この組織を、1 回、DNA/金マ
イクロキャリアー溶液により射ち、10μl をそのマイク
ロキャリアー上で乾燥させた。使用した終止スクリーン
を、10 x 10 ステンレス鋼メッシュ・スクリーンを使用
してABRUにおいて手で孔を開けた。1550psi 値の破裂板
を使用した。爆撃後、胚を、暗い中で25℃において培養
した。
ombarded) した。この組織を、その停止スクリーン棚の
下8cm の棚の上に置いた。この組織を、1 回、DNA/金マ
イクロキャリアー溶液により射ち、10μl をそのマイク
ロキャリアー上で乾燥させた。使用した終止スクリーン
を、10 x 10 ステンレス鋼メッシュ・スクリーンを使用
してABRUにおいて手で孔を開けた。1550psi 値の破裂板
を使用した。爆撃後、胚を、暗い中で25℃において培養
した。
【０３３３】デリバリーのためのDNA の調製
このマイクロキャリアーを、Biolistic 装置と共に提供
された指示に本質的に従って調製した。50μl を混合す
る間、1.0 μの金マイクロキャリアー(gold microcarri
er) を、5 μl のpCIB4431(1.23 μg/μl)[#898] + 2μ
l のpCIB3064(0.895μg/μl)[#456]、その後に、50μl
の2.5M CaCl 2 、次に、20μl の0.1Mスペルミジン(spe
rmidine)( 遊離塩基、TCグレード) を添加した。得られ
た混合物を3 分間攪拌し、そして10秒間マイクロフュー
ジした。この上澄液を、除去し、そのマイクロキャリア
ーを、手短に混合し、遠心分離し、そしてその上澄液を
除去することにより、250 μl の100%EtOH(HPLC グレー
ド) により2 回洗浄した。このマイクロキャリアーを65
μl の100%EtOH中に再懸濁させた。
された指示に本質的に従って調製した。50μl を混合す
る間、1.0 μの金マイクロキャリアー(gold microcarri
er) を、5 μl のpCIB4431(1.23 μg/μl)[#898] + 2μ
l のpCIB3064(0.895μg/μl)[#456]、その後に、50μl
の2.5M CaCl 2 、次に、20μl の0.1Mスペルミジン(spe
rmidine)( 遊離塩基、TCグレード) を添加した。得られ
た混合物を3 分間攪拌し、そして10秒間マイクロフュー
ジした。この上澄液を、除去し、そのマイクロキャリア
ーを、手短に混合し、遠心分離し、そしてその上澄液を
除去することにより、250 μl の100%EtOH(HPLC グレー
ド) により2 回洗浄した。このマイクロキャリアーを65
μl の100%EtOH中に再懸濁させた。
【０３３４】カルス形成
胚を、爆撃1 日後に3mg/l のPPT を含むカルス開始培地
に移した。胚を、爆撃後2 及び3 週間後にカルス開始を
獲得した。いくつかの反応物を、カルス維持培地、2DG4
+ 0.5 2,4-D培地であって3mg/L PPT を含むものに移し
た。カルス維持培地は、0.5mg/l の2,4-D 、20mg/lグル
コース、及びオートクレーブ後に添加した10ml G4 添加
物を含む、N6主要塩、B5微量塩、MS鉄、2%シュクロース
である。胚形成カルスを、2 週間毎に、3mg/l PPT を含
む新たな維持培地に継代培養した。全てのカルスを、暗
い中で25℃においてインキュベートした。
に移した。胚を、爆撃後2 及び3 週間後にカルス開始を
獲得した。いくつかの反応物を、カルス維持培地、2DG4
+ 0.5 2,4-D培地であって3mg/L PPT を含むものに移し
た。カルス維持培地は、0.5mg/l の2,4-D 、20mg/lグル
コース、及びオートクレーブ後に添加した10ml G4 添加
物を含む、N6主要塩、B5微量塩、MS鉄、2%シュクロース
である。胚形成カルスを、2 週間毎に、3mg/l PPT を含
む新たな維持培地に継代培養した。全てのカルスを、暗
い中で25℃においてインキュベートした。
【０３３５】タイプI のカルス形成反応は、15% であっ
た。個々の事件が個々の系を生じさせるように、カルス
を作るそれぞれの胚を培養した。
た。個々の事件が個々の系を生じさせるように、カルス
を作るそれぞれの胚を培養した。
【０３３６】再生
選択の間の12週間後、組織を、PPT を含むカルス維持培
地から取り出し、そして再生培地上に置いた。再生培地
は、2 週間の0.25MS3S5BA(0.25mg/lの2,4 D 、5mg/l BA
P 、MS塩、3%シュクロース) であり、その後の植物の再
生のためにMS3S培地に継代培養した。4 〜10週間後、植
物を、取り出し、そしてGA 7'S中に置いた。#176 BT 事
件となった我々の系KC65 0-6は、38の植物の全体を作り
出した。
地から取り出し、そして再生培地上に置いた。再生培地
は、2 週間の0.25MS3S5BA(0.25mg/lの2,4 D 、5mg/l BA
P 、MS塩、3%シュクロース) であり、その後の植物の再
生のためにMS3S培地に継代培養した。4 〜10週間後、植
物を、取り出し、そしてGA 7'S中に置いた。#176 BT 事
件となった我々の系KC65 0-6は、38の植物の全体を作り
出した。
【０３３７】検定
それらがGA7's において確立されるようになったとき、
全植物を、1991年9 月13日に出願された米国特許出願第
07/759,243号( この関連部分を、ここで、引用により本
明細書中に取り込む) 中に記載されているようにPPT に
対する抵抗性についてクロロフェノール・レッド(CR)に
よりテストした。この検定は、細胞がPPT の存在中で増
殖していることを示すためにpH感受性指示染料を使用す
る。増殖細胞は、その培地中のpHの変更を作り出し、そ
してこの指示薬を( 赤から) 黄色に変える。PPT に対す
る耐性遺伝子を発現する植物は、このテストにより容易
に観察される。(#176= 8陽性/30 陰性) 。CRテストによ
り陽性な植物を、合成Bt遺伝子の存在についてPCR によ
り検定した。(#176=5 陽性/2陰性/1致死) 。
全植物を、1991年9 月13日に出願された米国特許出願第
07/759,243号( この関連部分を、ここで、引用により本
明細書中に取り込む) 中に記載されているようにPPT に
対する抵抗性についてクロロフェノール・レッド(CR)に
よりテストした。この検定は、細胞がPPT の存在中で増
殖していることを示すためにpH感受性指示染料を使用す
る。増殖細胞は、その培地中のpHの変更を作り出し、そ
してこの指示薬を( 赤から) 黄色に変える。PPT に対す
る耐性遺伝子を発現する植物は、このテストにより容易
に観察される。(#176= 8陽性/30 陰性) 。CRテストによ
り陽性な植物を、合成Bt遺伝子の存在についてPCR によ
り検定した。(#176=5 陽性/2陰性/1致死) 。
【０３３８】合成-BT 遺伝子についてのPCR による陽性
の植物を、フィトトロン(phytotron) に送った。一旦、
フィトトロン内で確立されれば、それらを、昆虫生物検
定及びELISA 分析を使用して特徴付けした。植物を、標
準的な欧州トウモロコシ穿孔性検定を使用して昆虫生物
検定を行い( 例5A中に記載している) 、ここで、植物か
ら摘み取った葉の小片を、多数のECB 新生幼虫が入った
小さいペトリ皿内に置いた。植物を、典型的には、約6
インチの高さにおいて検定した。本検定においてECB に
対し100%の死亡率を示す植物を、以下に示す。陽性植物
を、グリーンハウス内に移した。
の植物を、フィトトロン(phytotron) に送った。一旦、
フィトトロン内で確立されれば、それらを、昆虫生物検
定及びELISA 分析を使用して特徴付けした。植物を、標
準的な欧州トウモロコシ穿孔性検定を使用して昆虫生物
検定を行い( 例5A中に記載している) 、ここで、植物か
ら摘み取った葉の小片を、多数のECB 新生幼虫が入った
小さいペトリ皿内に置いた。植物を、典型的には、約6
インチの高さにおいて検定した。本検定においてECB に
対し100%の死亡率を示す植物を、以下に示す。陽性植物
を、グリーンハウス内に移した。
【０３３９】グリーンハウス/ 結実
植物番号#176-11 を、野性型6N615 花粉により受粉させ
た。1 つの雄穂(tassel ear)及び1 つの穂苗(ear shoo
t) を作った。雄穂(11)からの胚の全て及び穂1からの56
粒(kernels) を、救出した(rescued) 。294 粒は、その
穂の上に残り、そして乾燥して自然に落下した。
た。1 つの雄穂(tassel ear)及び1 つの穂苗(ear shoo
t) を作った。雄穂(11)からの胚の全て及び穂1からの56
粒(kernels) を、救出した(rescued) 。294 粒は、その
穂の上に残り、そして乾燥して自然に落下した。
【０３４０】#176-11 からの花粉を、各種のメイズ遺伝
型5N984 、5NA89 、及び3N961 に対し外部交配させた(o
utcrossed)。胚を、3 つの外部交配の(5N984=45; 5NA89
=30;3N961=8) のすべてから救出した。その仁の大部分
が、グリーンハウス内の植物上の穂の上に残り、そして
乾燥して自然に落下した。DNA を、標準的な技術を使用
して植物#176-11 から単離し、そしてサザン・ブロット
検定を使用して分析した。これは、合成cryIA(b)遺伝子
から作られたプローブ及びPAT 遺伝子から作られたプロ
ーブとハイブリダイズする配列を含むことが発見され
た。これらの結果は、これらの遺伝子がメイズのゲノム
中に取り込まれていることを示した。
型5N984 、5NA89 、及び3N961 に対し外部交配させた(o
utcrossed)。胚を、3 つの外部交配の(5N984=45; 5NA89
=30;3N961=8) のすべてから救出した。その仁の大部分
が、グリーンハウス内の植物上の穂の上に残り、そして
乾燥して自然に落下した。DNA を、標準的な技術を使用
して植物#176-11 から単離し、そしてサザン・ブロット
検定を使用して分析した。これは、合成cryIA(b)遺伝子
から作られたプローブ及びPAT 遺伝子から作られたプロ
ーブとハイブリダイズする配列を含むことが発見され
た。これらの結果は、これらの遺伝子がメイズのゲノム
中に取り込まれていることを示した。
【０３４１】実験KC-64
構成的プロモーターを使用した、合成cryIA(b)遺伝子を
発現するトランスジェニック・メイズ植物の生産
発現するトランスジェニック・メイズ植物の生産
【０３４２】組織
長さ約1.5-2.5mm の、未成熟のメイズ胚を、受粉後14-1
5 日目の遺伝子型6N615 の穂から切除した。母植物を、
グリーンハウス内で生育させた。切除前、その穂を、20
% Cloroxにより20分間表面滅菌し、そして滅菌水により
3 回濯いだ。個々の胚を、カルス開始培地、すなわち、
2DG4 + 5クロランベン培地(5mg/lクロランベン、20mg/l
グルコース、及びオートクレーブ後に添加した10ml G4
添加物(表1)を含む、N6主要塩、B5微量塩、MS鉄、2%シ
ュクロース) 上に、2平方cmの面積内に胚盤(scutellum)
側を上に向けて、すねわち1 つのプレートに対し36の
胚において、置いた。
5 日目の遺伝子型6N615 の穂から切除した。母植物を、
グリーンハウス内で生育させた。切除前、その穂を、20
% Cloroxにより20分間表面滅菌し、そして滅菌水により
3 回濯いだ。個々の胚を、カルス開始培地、すなわち、
2DG4 + 5クロランベン培地(5mg/lクロランベン、20mg/l
グルコース、及びオートクレーブ後に添加した10ml G4
添加物(表1)を含む、N6主要塩、B5微量塩、MS鉄、2%シ
ュクロース) 上に、2平方cmの面積内に胚盤(scutellum)
側を上に向けて、すねわち1 つのプレートに対し36の
胚において、置いた。
【０３４３】
【０３４４】爆撃
組織を、PDS-1000He Biolistics 装置を使用して爆撃(b
ombarded) した。この組織を、その停止スクリーン棚の
下8cm の棚の上に置いた。この組織を、1 回、DNA/金マ
イクロキャリアー溶液により射ち、10μl をそのマイク
ロキャリアー上で乾燥させた。使用した終止スクリーン
を、10 x 10 ステンレス鋼メッシュ・スクリーンを使用
してABRUにおいて手で孔を開けた。1550psi 値の破裂板
を使用した。爆撃後、胚を、暗い中で25℃において培養
した。
ombarded) した。この組織を、その停止スクリーン棚の
下8cm の棚の上に置いた。この組織を、1 回、DNA/金マ
イクロキャリアー溶液により射ち、10μl をそのマイク
ロキャリアー上で乾燥させた。使用した終止スクリーン
を、10 x 10 ステンレス鋼メッシュ・スクリーンを使用
してABRUにおいて手で孔を開けた。1550psi 値の破裂板
を使用した。爆撃後、胚を、暗い中で25℃において培養
した。
【０３４５】デリバリーのためのDNA の調製
このマイクロキャリアーを、Biolistic 装置と共に提供
された指示に本質的に従って調製した。50μl を混合す
る間、1.0 μの金マイクロキャリアーを、3.2μl のpCI
B4418(0.85 μg/μl)[#905] + 2μl のpCIB3064(0.895
μg/μl)[#456]+ 1.6μl のpCIB3007A(1.7 μg/μl[#15
2] 、その後に、50μl の2.5M CaCl 2、次に、20μl の
0.1Mスペルミジン( 遊離塩基、TCグレード) を添加し
た。得られた混合物を3 分間攪拌し、そして10秒間マイ
クロフュージした。この上澄液を、除去し、そのマイク
ロキャリアーを、手短に混合し、遠心分離し、そしてそ
の上澄液を除去することにより、250 μl の100%EtOH(H
PLC グレード) により2 回洗浄した。このマイクロキャ
リアーを65μl の100%EtOH中に再懸濁させた。
された指示に本質的に従って調製した。50μl を混合す
る間、1.0 μの金マイクロキャリアーを、3.2μl のpCI
B4418(0.85 μg/μl)[#905] + 2μl のpCIB3064(0.895
μg/μl)[#456]+ 1.6μl のpCIB3007A(1.7 μg/μl[#15
2] 、その後に、50μl の2.5M CaCl 2、次に、20μl の
0.1Mスペルミジン( 遊離塩基、TCグレード) を添加し
た。得られた混合物を3 分間攪拌し、そして10秒間マイ
クロフュージした。この上澄液を、除去し、そのマイク
ロキャリアーを、手短に混合し、遠心分離し、そしてそ
の上澄液を除去することにより、250 μl の100%EtOH(H
PLC グレード) により2 回洗浄した。このマイクロキャ
リアーを65μl の100%EtOH中に再懸濁させた。
【０３４６】カルス形成
胚を、爆撃1 日後に3mg/l のPPT を含むカルス開始培地
に移した。胚を、爆撃後2 及び3 週間後にカルス開始を
獲得した。いくつかの反応物を、カルス維持培地、2DG4
+ 0.5 2,4-D培地であって3mg/L PPT を含むものに移し
た。カルス維持培地は、0.5mg/l の2,4-D 、20mg/lグル
コース、及びオートクレーブ後に添加した10ml G4 添加
物を含む、N6主要塩、B5微量塩、MS鉄、2%シュクロース
である。胚形成カルスを、2 週間毎に、3mg/l PPT を含
む新たな維持培地に継代培養した。全てのカルスを、暗
い中で25℃においてオンキュベートした。タイプI のカ
ルス形成反応は、18% であった。個々の事件が個々の系
を生じさせるように、カルスを作るそれぞれの胚を培養
した。
に移した。胚を、爆撃後2 及び3 週間後にカルス開始を
獲得した。いくつかの反応物を、カルス維持培地、2DG4
+ 0.5 2,4-D培地であって3mg/L PPT を含むものに移し
た。カルス維持培地は、0.5mg/l の2,4-D 、20mg/lグル
コース、及びオートクレーブ後に添加した10ml G4 添加
物を含む、N6主要塩、B5微量塩、MS鉄、2%シュクロース
である。胚形成カルスを、2 週間毎に、3mg/l PPT を含
む新たな維持培地に継代培養した。全てのカルスを、暗
い中で25℃においてオンキュベートした。タイプI のカ
ルス形成反応は、18% であった。個々の事件が個々の系
を生じさせるように、カルスを作るそれぞれの胚を培養
した。
【０３４７】再生
選択の間の12週間後、組織を、PPT を含むカルス維持培
地から取り出し、そして再生培地上に置き、16時間の明
かり(50 μE ・m -2・s -1)/8 時間の暗闇の光期間(pho
toperiod) を使用して25℃においてインキュベートし
た。再生培地は、2 週間の0.25MS3S5BA(0.25mg/lの2,4
D 、5mg/l BAP 、MS塩、3%シュクロース)であり、その
後の植物の再生のためにMS3S培地に継代培養した。4 〜
10週間後、植物を、取り出し、そしてGA 7'S中に置い
た。#170 BT 事件となった我々の系KC64 0-1は、55の植
物を作り出した。#171 BT 事件となった我々の系KC64 0
-7系は、全部で33植物を作り出した。
地から取り出し、そして再生培地上に置き、16時間の明
かり(50 μE ・m -2・s -1)/8 時間の暗闇の光期間(pho
toperiod) を使用して25℃においてインキュベートし
た。再生培地は、2 週間の0.25MS3S5BA(0.25mg/lの2,4
D 、5mg/l BAP 、MS塩、3%シュクロース)であり、その
後の植物の再生のためにMS3S培地に継代培養した。4 〜
10週間後、植物を、取り出し、そしてGA 7'S中に置い
た。#170 BT 事件となった我々の系KC64 0-1は、55の植
物を作り出した。#171 BT 事件となった我々の系KC64 0
-7系は、全部で33植物を作り出した。
【０３４８】検定
それらがGA7's において確立されるようになったとき、
11の植物を、上記のShillito et alによるPPT に対する
抵抗性についてクロロフェノール・レッド(CR)によりテ
ストした。この検定は、細胞がPPT の存在中で増殖して
いることを示すためにpH感受性指示染料を使用する。増
殖細胞は、その培地中のpHの変更を作り出し、そしてこ
の指示薬を( 赤から) 黄色に変える。PPT に対する耐性
遺伝子を発現する植物は、このテストにより容易に観察
される。CRテストにより陽性な植物を、合成BT遺伝子の
存在についてPCR により検定した。( 事件170 =37 陽性
/18 陰性;#171 =25 陽性/8陰性) 。
11の植物を、上記のShillito et alによるPPT に対する
抵抗性についてクロロフェノール・レッド(CR)によりテ
ストした。この検定は、細胞がPPT の存在中で増殖して
いることを示すためにpH感受性指示染料を使用する。増
殖細胞は、その培地中のpHの変更を作り出し、そしてこ
の指示薬を( 赤から) 黄色に変える。PPT に対する耐性
遺伝子を発現する植物は、このテストにより容易に観察
される。CRテストにより陽性な植物を、合成BT遺伝子の
存在についてPCR により検定した。( 事件170 =37 陽性
/18 陰性;#171 =25 陽性/8陰性) 。
【０３４９】合成-Bt 遺伝子についてのPCR による陽性
の植物を、フィトトロンに送った。一旦、フィトトロン
内で確立されれば、それらを、昆虫生物検定及びELISA
分析を使用して特徴付けした。植物を、標準的な欧州ト
ウモロコシ穿孔性動物検定(以下を参照のこと) を使用
して昆虫生物検定を行い、ここで、植物から摘み取った
葉の小片を、多数のECB 新生幼虫が入った小さいペトリ
皿内に置いた。植物を、典型的には、約6 インチの高さ
において検定した。本検定においてECB に対し100%の死
亡率を示す植物を、さらに特徴付けする。ELISA データ
を以下に示す。陽性植物を、グリーンハウス内に移す。
の植物を、フィトトロンに送った。一旦、フィトトロン
内で確立されれば、それらを、昆虫生物検定及びELISA
分析を使用して特徴付けした。植物を、標準的な欧州ト
ウモロコシ穿孔性動物検定(以下を参照のこと) を使用
して昆虫生物検定を行い、ここで、植物から摘み取った
葉の小片を、多数のECB 新生幼虫が入った小さいペトリ
皿内に置いた。植物を、典型的には、約6 インチの高さ
において検定した。本検定においてECB に対し100%の死
亡率を示す植物を、さらに特徴付けする。ELISA データ
を以下に示す。陽性植物を、グリーンハウス内に移す。
【０３５０】Basta スクリーニング
#170事件からの成熟植物の中の8 つを、Basta[Hoechst]
耐性の評価について選択した。植物毎に1 つの中央の葉
上で、約10-14 cm長さ x 葉幅の面積を、0 、0.4 、1.
0 又は2.0%( 脱イオン水により100ml に希釈された200g
/lの10ml) の水性Basta であって2 滴のTween 20/100ml
を含むものを塗布した。2 つの植物を、レベル毎にテス
トした。同一の概齢の8 つの野性型6N615 植物を、対照
として処理した。すべての植物を、4 及び7 日目に観察
した。対照植物のすべてが最終的に死に至った。本研究
を通して、#170植物は、その除草剤によるダメージのい
ずれについても全く示さなかった。
耐性の評価について選択した。植物毎に1 つの中央の葉
上で、約10-14 cm長さ x 葉幅の面積を、0 、0.4 、1.
0 又は2.0%( 脱イオン水により100ml に希釈された200g
/lの10ml) の水性Basta であって2 滴のTween 20/100ml
を含むものを塗布した。2 つの植物を、レベル毎にテス
トした。同一の概齢の8 つの野性型6N615 植物を、対照
として処理した。すべての植物を、4 及び7 日目に観察
した。対照植物のすべてが最終的に死に至った。本研究
を通して、#170植物は、その除草剤によるダメージのい
ずれについても全く示さなかった。
【０３５１】受粉
#170及び#171植物上の、すべての雄穂(tassel ear)、第
一穂(first ear) 、入手可能な場合には、第二穂(secon
d ear)を、野性型6N615 花粉により受粉させた。この植
物の少なくとも90% は、雌の結実能力があった。#171植
物からの花粉を、遺伝型6N615 、5N984 、5NA89 、6F01
0 、5NA56 、2N217AF 、2ND01 及び3N961 に対し外部交
配させた。この植物の少なくとも90% は、雄の結実能力
があることが示された。
一穂(first ear) 、入手可能な場合には、第二穂(secon
d ear)を、野性型6N615 花粉により受粉させた。この植
物の少なくとも90% は、雌の結実能力があった。#171植
物からの花粉を、遺伝型6N615 、5N984 、5NA89 、6F01
0 、5NA56 、2N217AF 、2ND01 及び3N961 に対し外部交
配させた。この植物の少なくとも90% は、雄の結実能力
があることが示された。
【０３５２】胚救出(Embryo Rescue)
#171事件からの胚を、" 救出" した。受粉後16日目まで
の14の、25-50 粒をもつ穂の先端(ear tip) を、糸のこ
(coping saw)によりその穂から切断した。切断に先立っ
て、皮(fusks) を、穏やかに剥きその穂の上の部分を露
出させた。その植物上の穂の切断端を、Captan殺菌剤で
塗布し、そして皮を被せた。その植物上に残った種を、
自然に乾燥させた。摘出した穂片を、20% Cloroxにより
20分間表面滅菌し、そして無菌水で3 回濯いだ。個々の
胚を、摘出し、そして胚盤側を上にして2%シュクロース
を含むB5培地[Gamborg] 上に置いた。B5ビタミンを、オ
ートクレーブ後にその培地に添加した。4 つの胚を、GA
7 容器毎に入れ、そしてその容器を、暗い中でインキュ
ベートした。発芽が生じるとき、この容器を、明るい培
養室に移し、そして16時間明かり(50 μE ・m -2・s
-1) /8時間暗い光期間を使用して25℃においてインキ
ュベートした。この発芽の頻度は、94% である。#171事
件の中の15植物及び#176事件の中の2 からの子孫を、標
準的な胚救出技術を使用して救出し、そして評価した。
すべての植物を、昆虫検定により評価した。#171事件か
らの植物を、組織化学的GUS 検定においてもテストし
た。昆虫検定及びGUS 検定の両方において、転移遺伝子
の分離比は、単一座挿入事件について予想されるよう
に、1:1 であった。
の14の、25-50 粒をもつ穂の先端(ear tip) を、糸のこ
(coping saw)によりその穂から切断した。切断に先立っ
て、皮(fusks) を、穏やかに剥きその穂の上の部分を露
出させた。その植物上の穂の切断端を、Captan殺菌剤で
塗布し、そして皮を被せた。その植物上に残った種を、
自然に乾燥させた。摘出した穂片を、20% Cloroxにより
20分間表面滅菌し、そして無菌水で3 回濯いだ。個々の
胚を、摘出し、そして胚盤側を上にして2%シュクロース
を含むB5培地[Gamborg] 上に置いた。B5ビタミンを、オ
ートクレーブ後にその培地に添加した。4 つの胚を、GA
7 容器毎に入れ、そしてその容器を、暗い中でインキュ
ベートした。発芽が生じるとき、この容器を、明るい培
養室に移し、そして16時間明かり(50 μE ・m -2・s
-1) /8時間暗い光期間を使用して25℃においてインキ
ュベートした。この発芽の頻度は、94% である。#171事
件の中の15植物及び#176事件の中の2 からの子孫を、標
準的な胚救出技術を使用して救出し、そして評価した。
すべての植物を、昆虫検定により評価した。#171事件か
らの植物を、組織化学的GUS 検定においてもテストし
た。昆虫検定及びGUS 検定の両方において、転移遺伝子
の分離比は、単一座挿入事件について予想されるよう
に、1:1 であった。
【０３５３】例48: トランスジェニック植物ELISA 検定
の分析 トランスジェニック・メイズ内でのcryIA(b)遺伝子発現
の検出を、欧州トウモロコシ穿孔性動物(ECB) 昆虫生物
検定並びに得られたcryIA(b)蛋白レベルの定量的測定に
ついてのELISA 分析を使用して監視した。トランスジェ
ニック植物の葉内のcryIA(b) IP の定量的測定を、Clar
k M F, Lister R M, Bar-Joseph M: ELISA Techniques.
In: Wessbach A, Weissbach H (eds) Methods in Enzy
mology 118:742-766, Academic Press, Florida (1986)
中に開示されているような酵素結合イムノソルベント検
定(ELISA) を使用して行った。免疫アフィニティー精製
ポリクロナール・ウサギ及びヤギ抗体であってバチルス
・スリンギエンシス(B. thuringiensis)サブ種. kursta
ki IP に特異的なものを、葉サンプルの粗抽出物からの
可溶性蛋白mg当たりのIPのngを測定するために使用し
た。この2 重サンドイッチELISA の感度は、ELISA マイ
クロタイター皿well当たりの50μg の全蛋白を使用して
可溶性蛋白mg当たり1-5ng IPである。
の分析 トランスジェニック・メイズ内でのcryIA(b)遺伝子発現
の検出を、欧州トウモロコシ穿孔性動物(ECB) 昆虫生物
検定並びに得られたcryIA(b)蛋白レベルの定量的測定に
ついてのELISA 分析を使用して監視した。トランスジェ
ニック植物の葉内のcryIA(b) IP の定量的測定を、Clar
k M F, Lister R M, Bar-Joseph M: ELISA Techniques.
In: Wessbach A, Weissbach H (eds) Methods in Enzy
mology 118:742-766, Academic Press, Florida (1986)
中に開示されているような酵素結合イムノソルベント検
定(ELISA) を使用して行った。免疫アフィニティー精製
ポリクロナール・ウサギ及びヤギ抗体であってバチルス
・スリンギエンシス(B. thuringiensis)サブ種. kursta
ki IP に特異的なものを、葉サンプルの粗抽出物からの
可溶性蛋白mg当たりのIPのngを測定するために使用し
た。この2 重サンドイッチELISA の感度は、ELISA マイ
クロタイター皿well当たりの50μg の全蛋白を使用して
可溶性蛋白mg当たり1-5ng IPである。
【０３５４】トウモロコシ抽出物を、抽出バッファー(5
0mM Na2 CO3 pH 9.5、100mM NaCl、0.05% Triton、0.05
% Tween 、1mM PMSF及び1 μM ロイペプチン) の存在中
で手でもったボール- ベアリング・ホモゲナイザー(AGD
IA, Elkart IN.) を使用して細線プラスチック容器内で
葉組織を破砕することにより調製した。蛋白測定を、Bi
o-Rad(Richmond, CA) 蛋白検定を使用して行った。
0mM Na2 CO3 pH 9.5、100mM NaCl、0.05% Triton、0.05
% Tween 、1mM PMSF及び1 μM ロイペプチン) の存在中
で手でもったボール- ベアリング・ホモゲナイザー(AGD
IA, Elkart IN.) を使用して細線プラスチック容器内で
葉組織を破砕することにより調製した。蛋白測定を、Bi
o-Rad(Richmond, CA) 蛋白検定を使用して行った。
【０３５５】上記の手順を使用して、先に記載したよう
な主要なメイズ形質転換体を、ELISA を使用してcryIA
(b)蛋白の存在について分析した。これらの植物を、分
析のときに、6 インチから約3 フィートまでの高さ内で
ばらついていた。
な主要なメイズ形質転換体を、ELISA を使用してcryIA
(b)蛋白の存在について分析した。これらの植物を、分
析のときに、6 インチから約3 フィートまでの高さ内で
ばらついていた。
【０３５６】
植物 Bt ng/mg 可溶性蛋白 5/27/91
176-8 0 0
176-10 700 1585
176-11 760 2195
171-4A 59
171-6 50
171-8 60
171-9 280
171-13 77
171-14A 43
171-14B 60
171-15 55
171-16A 13
171-16B 19
171-18 19
176-30 1160
171-32 980
171-31 166
171-30 370
71-14
#10 葉 26
1 葉 17
植物171-16
#9葉 40
#1葉 120
【０３５７】欧州トウモロコシ穿孔性動物検定
1. 1〜4 の4cm セクションを、トウモロコシ植物の広が
った葉から切断する。 2. それぞれの葉片を、50 x 9mmペトリ皿内の湿らせた
フィルター・ディスク上に置く。 3. 5 匹の新生欧州トウモロコシ穿孔性動物を、それぞ
れの葉片の上に置く。( 植物当たり全部で5-20幼虫とす
る) 4. ペトリ皿を、29.5℃においてインキュベートする。 5. 葉の食べられたダメージ及び死亡率データを、24、
48、及び72時間目において得る。
った葉から切断する。 2. それぞれの葉片を、50 x 9mmペトリ皿内の湿らせた
フィルター・ディスク上に置く。 3. 5 匹の新生欧州トウモロコシ穿孔性動物を、それぞ
れの葉片の上に置く。( 植物当たり全部で5-20幼虫とす
る) 4. ペトリ皿を、29.5℃においてインキュベートする。 5. 葉の食べられたダメージ及び死亡率データを、24、
48、及び72時間目において得る。
【０３５８】例49: 形質転換メイズ植物の子孫内でのBt
エンドトキシンの発現 形質転換メイズ植物を、十分に結実させ、そしていくつ
かの遺伝子型のメイズと交配させた。これらの交配から
の子孫を、標準的なECB 生物検定( 直前に記載したも
の) における欧州トウモロコシ穿孔性動物(ECB) のそれ
らの殺生能力について、並びに先に記載したようなELIS
A を使用したcryIA(b)蛋白の存在について分析した。EC
B 殺生能力とcryIA(b)蛋白生産とは相関があった。これ
らの特性(traits)は、その子孫に1:1 の比で分離され、
その合成遺伝子の活性コピーについて単一部位の挿入で
ることを示している。この1:1 の比は、構成的プロモー
ター/ 合成-cryIA(b) 植物及び組織特異的プロモーター
/ 合成-cryIA(b) 植物( データを示さず) の両方につい
て真実であった。
エンドトキシンの発現 形質転換メイズ植物を、十分に結実させ、そしていくつ
かの遺伝子型のメイズと交配させた。これらの交配から
の子孫を、標準的なECB 生物検定( 直前に記載したも
の) における欧州トウモロコシ穿孔性動物(ECB) のそれ
らの殺生能力について、並びに先に記載したようなELIS
A を使用したcryIA(b)蛋白の存在について分析した。EC
B 殺生能力とcryIA(b)蛋白生産とは相関があった。これ
らの特性(traits)は、その子孫に1:1 の比で分離され、
その合成遺伝子の活性コピーについて単一部位の挿入で
ることを示している。この1:1 の比は、構成的プロモー
ター/ 合成-cryIA(b) 植物及び組織特異的プロモーター
/ 合成-cryIA(b) 植物( データを示さず) の両方につい
て真実であった。
【０３５９】Fig.23A は、分析した子孫の全体数の小さ
なサブセットを含む表である。この表は、多数の交配の
代表である。昆虫検定を、メイズ最適化CryIA(b)遺伝子
を含むトランスジェニック子孫の葉材料( 先に記載した
ような) を使用してDiatrea saccharalis 及びOstrinia
nubilalisにより行った。これらの検定の結果を、Fig.
23B 中に示す。これらは、形質転換メイズ内のメイズ最
適CryIA(b)遺伝子の機能がサトウキビ穿孔性動物及びOs
trinia nubilalisに対する耐性を提供することを証明し
ている。
なサブセットを含む表である。この表は、多数の交配の
代表である。昆虫検定を、メイズ最適化CryIA(b)遺伝子
を含むトランスジェニック子孫の葉材料( 先に記載した
ような) を使用してDiatrea saccharalis 及びOstrinia
nubilalisにより行った。これらの検定の結果を、Fig.
23B 中に示す。これらは、形質転換メイズ内のメイズ最
適CryIA(b)遺伝子の機能がサトウキビ穿孔性動物及びOs
trinia nubilalisに対する耐性を提供することを証明し
ている。
【０３６０】例50: メイズ花粉内のCryIA(b)遺伝子の発
現pCIB4431から得られたキメラ花粉プロモーター/ 合成
cryIA(b)遺伝子を含む形質転換メイズ植物の子孫を、畑
において成熟まで成長させた。花粉を回収し、そして他
の場所で先に記載したような標準的なELISA 技術を使用
してcryIA(b)蛋白の存在について分析した。高いレベル
のcryIA(b)蛋白を、その花粉内で検出した。35S プロモ
ーター/ 合成cryIA(b)形質転換植物からの子孫を、グリ
ーンハウス内で成長させた。これらの植物からの花粉
を、ELISA を使用して分析し、そしてcryIA(b)蛋白を検
出した。
現pCIB4431から得られたキメラ花粉プロモーター/ 合成
cryIA(b)遺伝子を含む形質転換メイズ植物の子孫を、畑
において成熟まで成長させた。花粉を回収し、そして他
の場所で先に記載したような標準的なELISA 技術を使用
してcryIA(b)蛋白の存在について分析した。高いレベル
のcryIA(b)蛋白を、その花粉内で検出した。35S プロモ
ーター/ 合成cryIA(b)形質転換植物からの子孫を、グリ
ーンハウス内で成長させた。これらの植物からの花粉
を、ELISA を使用して分析し、そしてcryIA(b)蛋白を検
出した。
【０３６１】結果を、Fig.23C 中に示す。植物系、植物
遺伝型、合成配列、等の選択を含む要因も発現に影響す
ることができることを認識した。
遺伝型、合成配列、等の選択を含む要因も発現に影響す
ることができることを認識した。
【０３６２】例51: 髄好適プロモーターに融合されたcr
yIA(b)遺伝子の発現 pCIB4433( Fig.36) は、メイズから単離された髄好適プ
ロモーターに融合されたメイズ最適化CryIA(b)遺伝子を
含むプラスミドである。このプラスミドを、以下の:
yIA(b)遺伝子の発現 pCIB4433( Fig.36) は、メイズから単離された髄好適プ
ロモーターに融合されたメイズ最適化CryIA(b)遺伝子を
含むプラスミドである。このプラスミドを、以下の:
【０３６３】1)BstEII及びBamHI により切断されたpCIB
4418; 1.8Kb 断片、 2)NsiI及びBstEIIにより切断されたpBtin1; 5.9Kb 断
片、(pBtin1 は、本明細書中で他の場所に記載したもの
である。) 3)本明細書中で他の場所に記載したような標準的な条件
を使用したPCR 反応において作られたPCR 断片VI-151、
から成る3 方結合を使用して構築した。
4418; 1.8Kb 断片、 2)NsiI及びBstEIIにより切断されたpBtin1; 5.9Kb 断
片、(pBtin1 は、本明細書中で他の場所に記載したもの
である。) 3)本明細書中で他の場所に記載したような標準的な条件
を使用したPCR 反応において作られたPCR 断片VI-151、
から成る3 方結合を使用して構築した。
【０３６４】PCR プライマーは:
KE150A28: 5'-ATT CGC ATG CAT GTT TCA TTA TC-3'
KE151A28: 5'-GCT GGT ACC ACG GAT CCG TCG CTT CTG T
GC AAC AAC C-3' であった。
GC AAC AAC C-3' であった。
【０３６５】PCR 反応後、このDNA を、アガロース・ゲ
ル上でチェクし、その反応が適切に進行下かどうかを確
認した。DNA を、他の場所に記載したような標準的な条
件を使用したPCR 反応から最終し、そしてその後標準的
な条件を使用して制限酵素NsiI及びBamHI により切断し
た。切断後、断片を、2% NuSieveゲル上で走らせ、そし
て所望のバンドを、他の場所に記載したように回収し
た。DNA を、先に記載したような結合において使用し
た。
ル上でチェクし、その反応が適切に進行下かどうかを確
認した。DNA を、他の場所に記載したような標準的な条
件を使用したPCR 反応から最終し、そしてその後標準的
な条件を使用して制限酵素NsiI及びBamHI により切断し
た。切断後、断片を、2% NuSieveゲル上で走らせ、そし
て所望のバンドを、他の場所に記載したように回収し
た。DNA を、先に記載したような結合において使用し
た。
【０３６６】（標準的な条件下の) 結合後、DNA を、コ
ンピテント大腸菌(E.coli)細胞中に形質転換した。
ンピテント大腸菌(E.coli)細胞中に形質転換した。
【０３６７】形質転換を、本質的に本明細書中で他の場
所に記載したようなマイクロプロジェクタイル・ボンバ
ードメント(microprojectile bombardment) を使用して
行った。胚を、マイクロプロジェクタイル・ボンバード
メントの24時間後、100 μg/mlのPPT を含む培地に移し
た。得られたカルスを、4 週間後、40μg/mlのPPT を含
む培地に移した。植物は、選択なしに再生された。
所に記載したようなマイクロプロジェクタイル・ボンバ
ードメント(microprojectile bombardment) を使用して
行った。胚を、マイクロプロジェクタイル・ボンバード
メントの24時間後、100 μg/mlのPPT を含む培地に移し
た。得られたカルスを、4 週間後、40μg/mlのPPT を含
む培地に移した。植物は、選択なしに再生された。
【０３６８】植物小サンプル(3-5) を、それぞれの事件
についてPCR により検定した。さらなるコードを、上記
のマイクロプロジェクタイル・ボンバードメント装置に
関して、胚の異なる位置及び距離を示すために付加し
た。植物を、以下のコードをもつグリーンハウスに送っ
た:
についてPCR により検定した。さらなるコードを、上記
のマイクロプロジェクタイル・ボンバードメント装置に
関して、胚の異なる位置及び距離を示すために付加し
た。植物を、以下のコードをもつグリーンハウスに送っ
た:
【０３６９】
JS21A TOP 植物B.t. PCR陽性
JS21A MID 植物B.t. PCR陽性
JS21C BOT 植物B.t. PCR陽性
JS22D MID 植物B.t. PCR陽性
JS23B MID 植物B.t. PCR陰性( 対照のためのもの)
【０３７０】再生植物からの葉サンプルを、例48中に記
載したように欧州トウモロコシ穿孔性動物に対する殺虫
活性について生物検定した。結果を、Fig.23D 中に示
す。葉内で発現されたCryIA(b)蛋白のレベルを定量する
ための葉サンプルのELISA分析を、例48中に記載したよ
うに行った。結果を、Fig.24E 中に示す。
載したように欧州トウモロコシ穿孔性動物に対する殺虫
活性について生物検定した。結果を、Fig.23D 中に示
す。葉内で発現されたCryIA(b)蛋白のレベルを定量する
ための葉サンプルのELISA分析を、例48中に記載したよ
うに行った。結果を、Fig.24E 中に示す。
【０３７１】寄託
以下のプラスミドを、ブタペスト条約の規定の下、Agri
cultural Research Culture Collection (NRRL)(1818
N. University St.,Peoria, IL 61604) に寄託した:pCI
B4418 、pCIB4420、pCIB4429、pCIB4431、pCIB4433、pC
IB5601、pCIB3166及びpCIB3171。
cultural Research Culture Collection (NRRL)(1818
N. University St.,Peoria, IL 61604) に寄託した:pCI
B4418 、pCIB4420、pCIB4429、pCIB4431、pCIB4433、pC
IB5601、pCIB3166及びpCIB3171。
【０３７２】本発明は、それらの特異的な態様を参照し
ながら記載してきた; しかしながら、多くの変更、修
正、及び態様が可能であることは明らかであろう。した
がって、このような変更、修正、及び態様のすべてが、
本発明の核心及び範囲内にあるものとして認識されるべ
きである。
ながら記載してきた; しかしながら、多くの変更、修
正、及び態様が可能であることは明らかであろう。した
がって、このような変更、修正、及び態様のすべてが、
本発明の核心及び範囲内にあるものとして認識されるべ
きである。
【０３７３】
【配列表】
Sequence Listing
<110> Novartis AG
<120> Promotors for expressing DNA sequences having enhanced insecticida
l activity in maize
<130>
<140>
<141> 2002-11-14
<150> US 772,027
<151> 1991-10-04
<150> US 951,715
<151> 1992-09-25
<160> 5
<210> 1
<211> 4360
<212> DNA
<213> Bacillus thuringiensis, kurstaki HD-1
<220>
<223>
Inventor: Evola, Stephen V.
Inventor: Crossland, Lyle D.
Inventor: Wright, Martha S.
Inventor: Merlin, Ellis J.
Inventor: Launis, Karen L.
Inventor: Rothstein, Steven J.
<400> 1
gttaacaccc tgggtcaaaa attgatattt agtaaaatta gttgcacttt gtgcattttt 60
tcataagatg agtcatatgt tttaaattgt agtaatgaaa aacagtatta tatcataatg 120
aattggtatc ttaataaaag agatggaggt aacttatgga taacaatccg aacatcaatg 180
aatgcattcc ttataattgt ttaagtaacc ctgaagtaga agtattaggt ggagaaagaa 240
tagaaactgg ttacacccca atcgatattt ccttgtcgct aacgcaattt cttttgagtg 300
aatttgttcc cggtgctgga tttgtgttag gactagttga tataatatgg ggaatttttg 360
gtccctctca atgggacgca tttcttgtac aaattgaaca gttaattaac caaagaatag 420
aagaattcgc taggaaccaa gccatttcta gattagaagg actaagcaat ctttatcaaa 480
tttacgcaga atcttttaga gagtgggaag cagatcctac taatccagca ttaagagaag 540
agatgcgtat tcaattcaat gacatgaaca gtgcccttac aaccgctatt cctctttttg 600
cagttcaaaa ttatcaagtt cctcttttat cagtatatgt tcaagctgca aatttacatt 660
tatcagtttt gagagatgtt tcagtgtttg gacaaaggtg gggatttgat gccgcgacta 720
tcaatagtcg ttataatgat ttaactaggc ttattggcaa ctatacagat catgctgtac 780
gctggtacaa tacgggatta gagcgtgtat ggggaccgga ttctagagat tggataagat 840
ataatcaatt tagaagagaa ttaacactaa ctgtattaga tatcgtttct ctatttccga 900
actatgatag tagaacgtat ccaattcgaa cagtttccca attaacaaga gaaatttata 960
caaacccagt attagaaaat tttgatggta gttttcgagg ctcggctcag ggcatagaag 1020
gaagtattag gagtccacat ttgatggata tacttaacag tataaccatc tatacggatg 1080
ctcatagagg agaatattat tggtcagggc atcaaataat ggcttctcct gtagggtttt 1140
cggggccaga attcactttt ccgctatatg gaactatggg aaatgcagct ccacaacaac 1200
gtattgttgc tcaactaggt cagggcgtgt atagaacatt atcgtccact ttatatagaa 1260
gaccttttaa tatagggata aataatcaac aactatctgt tcttgacggg acagaatttg 1320
cttatggaac ctcctcaaat ttgccatccg ctgtatacag aaaaagcgga acggtagatt 1380
cgctggatga aataccgcca cagaataaca acgtgccacc taggcaagga tttagtcatc 1440
gattaagcca tgtttcaatg tttcgttcag gctttagtaa tagtagtgta agtataataa 1500
gagctcctat gttctcttgg atacatcgta gtgctgaatt taataatata attccttcat 1560
cacaaattac acaaatacct ttaacaaaat ctactaatct tggctctgga acttctgtcg 1620
ttaaaggacc aggatttaca ggaggagata ttcttcgaag aacttcacct ggccagattt 1680
caaccttaag agtaaatatt actgcaccat tatcacaaag atatcgggta agaattcgct 1740
acgcttctac cacaaattta caattccata catcaattga cggaagacct attaatcagg 1800
ggaatttttc agcaactatg agtagtggga gtaatttaca gtccggaagc tttaggactg 1860
taggttttac tactccgttt aacttttcaa atggatcaag tgtatttacg ttaagtgctc 1920
atgtcttcaa ttcaggcaat gaagtttata tagatcgaat tgaatttgtt ccggcagaag 1980
taacctttga ggcagaatat gatttagaaa gagcacaaaa ggcggtgaat gagctgttta 2040
cttcttccaa tcaaatcggg ttaaaaacag atgtgacgga ttatcatatt gatcaagtat 2100
ccaatttagt tgagtgttta tctgatgaat tttgtctgga tgaaaaaaaa gaattgtccg 2160
agaaagtcaa acatgcgaag cgacttagtg atgagcggaa tttacttcaa gatccaaact 2220
ttagagggat caatagacaa ctagaccgtg gctggagagg aagtacggat attaccatcc 2280
aaggaggcga tgacgtattc aaagagaatt acgttacgct attgggtacc tttgatgagt 2340
gctatccaac gtatttatat caaaaaatag atgagtcgaa attaaaagcc tatacccgtt 2400
accaattaag agggtatatc gaagatagtc aagacttaga aatctattta attcgctaca 2460
atgccaaaca cgaaacagta aatgtgccag gtacgggttc cttatggccg ctttcagccc 2520
caagtccaat cggaaaatgt gcccatcatt cccatcattt ctccttggac attgatgttg 2580
gatgtacaga cttaaatgag gacttaggtg tatgggtgat attcaagatt aagacgcaag 2640
atggccatgc aagactagga aatctagaat ttctcgaaga gaaaccatta gtaggagaag 2700
cactagctcg tgtgaaaaga gcggagaaaa aatggagaga caaacgtgaa aaattggaat 2760
gggaaacaaa tattgtttat aaagaggcaa aagaatctgt agatgcttta tttgtaaact 2820
ctcaatatga tagattacaa gcggatacca acatcgcgat gattcatgcg gcagataaac 2880
gcgttcatag cattcgagaa gcttatctgc ctgagctgtc tgtgattccg ggtgtcaatg 2940
cggctatttt tgaagaatta gaagggcgta ttttcactgc attctcccta tatgatgcga 3000
gaaatgtcat taaaaatggt gattttaata atggcttatc ctgctggaac gtgaaagggc 3060
atgtagatgt agaagaacaa aacaaccacc gttcggtcct tgttgttccg gaatgggaag 3120
cagaagtgtc acaagaagtt cgtgtctgtc cgggtcgtgg ctatatcctt cgtgtcacag 3180
cgtacaagga gggatatgga gaaggttgcg taaccattca tgagatcgag aacaatacag 3240
acgaactgaa gtttagcaac tgtgtagaag aggaagtata tccaaacaac acggtaacgt 3300
gtaatgatta tactgcgact caagaagaat atgagggtac gtacacttct cgtaatcgag 3360
gatatgacgg agcctatgaa agcaattctt ctgtaccagc tgattatgca tcagcctatg 3420
aagaaaaagc atatacagat ggacgaagag acaatccttg tgaatctaac agaggatatg 3480
gggattacac accactacca gctggctatg tgacaaaaga attagagtac ttcccagaaa 3540
ccgataaggt atggattgag atcggagaaa cggaaggaac attcatcgtg gacagcgtgg 3600
aattacttct tatggaggaa taatatatgc tttataatgt aaggtgtgca aataaagaat 3660
gattactgac ttgtattgac agataaataa ggaaattttt atatgaataa aaaacgggca 3720
tcactcttaa aagaatgatg tccgtttttt gtatgattta acgagtgata tttaaatgtt 3780
ttttttgcga aggctttact taacggggta ccgccacatg cccatcaact taagaatttg 3840
cactaccccc aagtgtcaaa aaacgttatt ctttctaaaa agctagctag aaaggatgac 3900
attttttatg aatctttcaa ttcaagatga attacaacta ttttctgaag agctgtatcg 3960
tcatttaacc ccttctcttt tggaagaact cgctaaagaa ttaggttttg taaaaagaaa 4020
acgaaagttt tcaggaaatg aattagctac catatgtatc tggggcagtc aacgtacagc 4080
gagtgattct ctcgttcgac tatgcagtca attacacgcc gccacagcac tcttatgagt 4140
ccagaaggac tcaataaacg ctttgataaa aaagcggttg aatttttgaa atatattttt 4200
tctgcattat ggaaaagtaa actttgtaaa acatcagcca tttcaagtgc agcactcacg 4260
tattttcaac gaatccgtat tttagatgcg acgattttcc aagtaccgaa acatttagca 4320
catgtatatc ctgggtcagg tggttgtgca caaactgcag 4360
<210> 2
<211> 3474
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atggacaaca accccaacat caacgagtgc atcccctaca actgcctgag caaccccgag 60
gtggaggtgc tgggcggcga gcgcatcgag accggctaca cccccatcga catcagcctg 120
agcctgaccc agttcctgct gagcgagttc gtgcccggcg ccggcttcgt gctgggcctg 180
gtggacatca tctggggcat cttcggcccc agccagtggg acgccttcct ggtgcagatc 240
gagcagctga tcaaccagcg catcgaggag ttcgcccgca accaggccat cagccgcctg 300
gagggcctga gcaacctgta ccagatctac gccgagagct tccgcgagtg ggaggccgac 360
cccaccaacc ccgccctgcg cgaggagatg cgcatccagt tcaacgacat gaacagcgcc 420
ctgaccaccg ccatccccct gttcgccgtg cagaactacc aggtgcccct gctgagcgtg 480
tacgtgcagg ccgccaacct gcacctgagc gtgctgcgcg acgtgagcgt gttcggccag 540
cgctggggct tcgacgccgc caccatcaac agccgctaca acgacctgac ccgcctgatc 600
ggcaactaca ccgaccacgc cgtgcgctgg tacaacaccg gcctggagcg cgtgtggggc 660
cccgacagcc gcgactggat ccgctacaac cagttccgcc gcgagctgac cctgaccgtg 720
ctggacatcg tgagcctgtt ccccaactac gacagccgca cctaccccat ccgcaccgtg 780
agccagctga cccgcgagat ctacaccaac cccgtgctgg agaacttcga cggcagcttc 840
cgcggcagcg cccagggcat cgagggcagc atccgcagcc cccacctgat ggacatcctg 900
aacagcatca ccatctacac cgacgcccac cgcggcgagt actactggag cggccaccag 960
atcatggcca gccccgtggg cttcagcggc cccgagttca ccttccccct gtacggcacc 1020
atgggcaacg ccgcccccca gcagcgcatc gtggcccagc tgggccaggg cgtgtaccgc 1080
accctgagca gcaccctgta ccgccgcccc ttcaacatcg gcatcaacaa ccagcagctg 1140
agcgtgctgg acggcaccga gttcgcctac ggcaccagca gcaacctgcc cagcgccgtg 1200
taccgcaaga gcggcaccgt ggacagcctg gacgagatcc ccccccagaa caacaacgtg 1260
cccccccgcc agggcttcag ccaccgcctg agccacgtga gcatgttccg cagcggcttc 1320
agcaacagca gcgtgagcat catccgcgcc cccatgttca gctggatcca ccgcagcgcc 1380
gagttcaaca acatcatccc cagcagccag atcacccaga tccccctgac caagagcacc 1440
aacctgggca gcggcaccag cgtggtgaag ggccccggct tcaccggcgg cgacatcctg 1500
cgccgcacca gccccggcca gatcagcacc ctgcgcgtga acatcaccgc ccccctgagc 1560
cagcgctacc gcgtgcgcat ccgctacgcc agcaccacca acctgcagtt ccacaccagc 1620
atcgacggcc gccccatcaa ccagggcaac ttcagcgcca ccatgagcag cggcagcaac 1680
ctgcagagcg gcagcttccg caccgtgggc ttcaccaccc ccttcaactt cagcaacggc 1740
agcagcgtgt tcaccctgag cgcccacgtg ttcaacagcg gcaacgaggt gtacatcgac 1800
cgcatcgagt tcgtgcccgc cgaggtgacc ttcgaggccg agtacgacct ggagcgcgcc 1860
cagaaggccg tgaacgagct gttcaccagc agcaaccaga tcggcctgaa gaccgacgtg 1920
accgactacc acatcgacca ggtgagcaac ctggtggagt gcctgagcga cgagttctgc 1980
ctggacgaga agaaggagct gagcgagaag gtgaagcacg ccaagcgcct gagcgacgag 2040
cgcaacctgc tgcaggaccc caacttccgc ggcatcaacc gccagctgga ccgcggctgg 2100
cgcggcagca ccgacatcac catccagggc ggcgacgacg tgttcaagga gaactacgtg 2160
accctgctgg gcaccttcga cgagtgctac cccacctacc tgtaccagaa gatcgacgag 2220
agcaagctga aggcctacac ccgctaccag ctgcgcggct acatcgagga cagccaggac 2280
ctggagatct acctgatccg ctacaacgcc aagcacgaga ccgtgaacgt gcccggcacc 2340
ggcagcctgt ggcccctgag cgcccccagc cccatcggca agtgcgccca ccacagccac 2400
cacttcagcc tggacatcga cgtgggctgc accgacctga acgaggacct gggcgtgtgg 2460
gtgatcttca agatcaagac ccaggacggc cacgcccgcc tgggcaacct ggagttcctg 2520
gaggagaagc ccctggtggg cgaggccctg gcccgcgtga agcgcgccga gaagaagtgg 2580
cgcgacaagc gcgagaagct ggagtgggag accaacatcg tgtacaagga ggccaaggag 2640
agcgtggacg ccctgttcgt gaacagccag tacgaccgcc tgcaggccga caccaacatc 2700
gccatgatcc acgccgccga caagcgcgtg cacagcatcc gcgaggccta cctgcccgag 2760
ctgagcgtga tccccggcgt gaacgccgcc atcttcgagg agctggaggg ccgcatcttc 2820
accgccttca gcctgtacga cgcccgcaac gtgatcaaga acggcgactt caacaacggc 2880
ctgagctgct ggaacgtgaa gggccacgtg gacgtggagg agcagaacaa ccaccgcagc 2940
gtgctggtgg tgcccgagtg ggaggccgag gtgagccagg aggtgcgcgt gtgccccggc 3000
cgcggctaca tcctgcgcgt gaccgcctac aaggagggct acggcgaggg ctgcgtgacc 3060
atccacgaga tcgagaacaa caccgacgag ctgaagttca gcaactgcgt ggaggaggag 3120
gtgtacccca acaacaccgt gacctgcaac gactacaccg ccacccagga ggagtacgag 3180
ggcacctaca ccagccgcaa ccgcggctac gacggcgcct acgagagcaa cagcagcgtg 3240
cccgccgact acgccagcgc ctacgaggag aaggcctaca ccgacggccg ccgcgacaac 3300
ccctgcgaga gcaaccgcgg ctacggcgac tacacccccc tgcccgccgg ctacgtgacc 3360
aaggagctgg agtacttccc cgagaccgac aaggtgtgga tcgagatcgg cgagaccgag 3420
ggcaccttca tcgtggacag cgtggagctg ctgctgatgg aggagtagta catg 3474
<210> 3
<211> 1961
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gatccaacaa tggacaacaa ccccaacatc aacgagtgca tcccctacaa ctgcctgagc 60
aaccccgagg tggaggtgct gggcggcgag cgcatcgaga ccggctacac ccccatcgac 120
atcagcctga gcctgaccca gttcctgctg agcgagttcg tgcccggcgc cggcttcgtg 180
ctgggcctgg tggacatcat ctggggcatc ttcggcccca gccagtggga cgccttcctg 240
gtgcagatcg agcagctgat caaccagcgc atcgaggagt tcgcccgcaa ccaggccatc 300
agccgcctgg agggcctgag caacctgtac caaatctacg ccgagagctt ccgcgagtgg 360
gaggccgacc ccaccaaccc cgccctgcgc gaggagatgc gcatccagtt caacgacatg 420
aacagcgccc tgaccaccgc catccccctg ttcgccgtgc agaactacca ggtgcccctg 480
ctgagcgtgt acgtgcaggc cgccaacctg cacctgagcg tgtcgcgcga cgtcagcgtg 540
ttcggccagc gctggggctt cgacgccgcc accatcaaca gccgctacaa cgacctgacc 600
cgcctgatcg gcaactacac cgaccacgcc gtgcgctggt acaacaccgg cctggagcgc 660
gtgtggggtc ccgacagccg cgactggatc aggtacaacc agttccgccg cgagctgacc 720
ctgaccgtgc tggacatcgt gagcctgttc cccaactacg acagccgcac ctaccccatc 780
cgcaccgtga gccagctgac ccgcgagatt tacaccaacc ccgtgctgga gaacttcgac 840
ggcagcttcc gcggcagcgc ccagggcatc gagggcagca tccgcagccc ccacctgatg 900
gacatcctga acagcatcac catctacacc gacgcccacc gcggcgagta ctactggagc 960
ggccaccaga tcatggccag ccccgtcggc ttcagcggcc ccgagttcac cttccccctg 1020
tacggcacca tgggcaacgc tgcacctcag cagcgcatcg tggcacagct gggccaggga 1080
gtgtaccgca ccctgagcag caccctgtac cgtcgacctt tcaacatcgg catcaacaac 1140
cagcagctga gcgtgctgga cggcaccgag ttcgcctacg gcaccagcag caacctgccc 1200
agcgccgtgt accgcaagag cggcaccgtg gacagcctgg acgagatccc ccctcagaac 1260
aacaacgtgc cacctcgaca gggcttcagc caccgtctga gccacgtgag catgttccgc 1320
agtggcttca gcaacagcag cgtgagcatc atccgtgcac ctatgttcag ctggattcac 1380
cgcagtgccg agttcaacaa catcatcccc agcagccaga tcacccagat ccccctgacc 1440
aagagcacca acctgggcag cggcaccagc gtggtgaagg gccccggctt caccggcggc 1500
gacatcctgc gccgcaccag ccccggccag atcagcaccc tgcgcgtgaa catcaccgcc 1560
cccctgagcc agcgctaccg cgtccgcatc cgctacgcca gcaccaccaa cctgcagttc 1620
cacaccagca tcgacggccg ccccatcaac cagggcaact tcagcgccac catgagcagc 1680
ggcagcaacc tgcagagcgg cagcttccgc accgtgggct tcaccacccc cttcaacttc 1740
agcaacggca gcagcgtgtt caccctgagc gcccacgtgt tcaacagcgg caacgaggtg 1800
tacatcgacc gcatcgagtt cgtgcccgcc gaggtgacct tcgaggccga gtacgacctg 1860
gagagggctc agaaggccgt gaacgagctg ttcaccagca gcaaccagat cggcctgaag 1920
accgacgtga ccgactacca catcgatcag gtgtaggagc t 1961
<210> 4
<211> 3508
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gatccaacaa tggacaacaa ccccaacatc aacgagtgca tcccctacaa ctgcctgagc 60
aaccccgagg tggaggtgct gggcggcgag cgcatcgaga ccggctacac ccccatcgac 120
atcagcctga gcctgaccca gttcctgctg agcgagttcg tgcccggcgc cggcttcgtg 180
ctgggcctgg tggacatcat ctggggcatc ttcggcccca gccagtggga cgccttcctg 240
gtgcagatcg agcagctgat caaccagcgc atcgaggagt tcgcccgcaa ccaggccatc 300
agccgcctgg agggcctgag caacctgtac caaatctacg ccgagagctt ccgcgagtgg 360
gaggccgacc ccaccaaccc cgccctgcgc gaggagatgc gcatccagtt caacgacatg 420
aacagcgccc tgaccaccgc catccccctg ttcgccgtgc agaactacca ggtgcccctg 480
ctgagcgtgt acgtgcaggc cgccaacctg cacctgagcg tgctgcgcga cgtcagcgtg 540
ttcggccagc gctggggctt cgacgccgcc accatcaaca gccgctacaa cgacctgacc 600
cgcctgatcg gcaactacac cgaccacgcc gtgcgctggt acaacaccgg cctggagcgc 660
gtgtggggtc ccgacagccg cgactggatc aggtacaacc agttccgccg cgagctgacc 720
ctgaccgtgc tggacatcgt gagcctgttc cccaactacg acagccgcac ctaccccatc 780
cgcaccgtga gccagctgac ccgcgagatt tacaccaacc ccgtgctgga gaacttcgac 840
ggcagcttcc gcggcagcgc ccagggcatc gagggcagca tccgcagccc ccacctgatg 900
gacatcctga acagcatcac catctacacc gacgcccacc gcggcgagta ctactggagc 960
ggccaccaga tcatggccag ccccgtcggc ttcagcggcc ccgagttcac cttccccctg 1020
tacggcacca tgggcaacgc tgcacctcag cagcgcatcg tggcacagct gggccaggga 1080
gtgtaccgca ccctgagcag caccctgtac cgtcgacctt tcaacatcgg catcaacaac 1140
cagcagctga gcgtgctgga cggcaccgag ttcgcctacg gcaccagcag caacctgccc 1200
agcgccgtgt accgcaagag cggcaccgtg gacagcctgg acgagatccc ccctcagaac 1260
aacaacgtgc cacctcgaca gggcttcagc caccgtctga gccacgtgag catgttccgc 1320
agtggcttca gcaacagcag cgtgagcatc atccgtgcac ctatgttcag ctggattcac 1380
cgcagtgccg agttcaacaa catcatcccc agcagccaga tcacccagat ccccctgacc 1440
aagagcacca acctgggcag cggcaccagc gtggtgaagg gccccggctt caccggcggc 1500
gacatcctgc gccgcaccag ccccggccag atcagcaccc tgcgcgtgaa catcaccgcc 1560
cccctgagcc agcgctaccg cgtccgcatc cgctacgcca gcaccaccaa cctgcagttc 1620
cacaccagca tcgacggccg ccccatcaac cagggcaact tcagcgccac catgagcagc 1680
ggcagcaacc tgcagagcgg cagcttccgc accgtgggct tcaccacccc cttcaacttc 1740
agcaacggca gcagcgtgtt caccctgagc gcccacgtgt tcaacagcgg caacgaggtg 1800
tacatcgacc gcatcgagtt cgtgcccgcc gaggtgacct tcgaggccga gtacgacctg 1860
gagagggctc agaaggccgt gaacgagctg ttcaccagca gcaaccagat cggcctgaag 1920
accgacgtga ccgactacca catcgatcag gtgagcaacc tggtggagtg cctgagcgac 1980
gagttctgcc tggacgagaa gaaggagctg agcgagaagg tgaagcacgc caagcgcctg 2040
agcgacgagc gcaacctgct gcaggacccc aacttccgcg gcatcaaccg ccagctggac 2100
cgcggctggc gcggcagcac cgacatcacc atccagggcg gcgacgacgt gttcaaggag 2160
aactacgtga ccctgctggg caccttcgac gagtgctacc ccacctacct gtaccagaag 2220
atcgacgaga gcaagctgaa ggcctacacc cgctaccagc tgcgcggcta catcgaggac 2280
agccaggacc tggagatcta cctgatccgc tacaacgcca agcacgagac cgtgaacgtg 2340
cccggcaccg gcagcctgtg gcccctgagc gcccccagcc ccatcggcaa gtgcgcccac 2400
cacagccacc acttcagcct ggacatcgac gtgggctgca ccgacctgaa cgaggacctg 2460
ggcgtgtggg tgatcttcaa gatcaagacc caggacggcc acgcccgcct gggcaacctg 2520
gagttcctgg aggagaagcc cctggtgggc gaggccctgg cccgcgtgaa gcgcgccgag 2580
aagaagtggc gcgacaagcg cgagaagctg gagtgggaga ccaacatcgt gtacaaggag 2640
gccaaggaga gcgtggacgc cctgttcgtg aacagccagt acgaccgcct gcaggccgac 2700
accaacatcg ccatgatcca cgccgccgac aagcgcgtgc acagcattcg cgaggcctac 2760
ctgcccgagc tgagcgtgat ccccggcgtg aacgccgcca tcttcgagga gctggagggc 2820
cgcatcttca ccgccttcag cctgtacgac gcccgcaacg tgatcaagaa cggcgacttc 2880
aacaacggcc tgagctgctg gaacgtgaag ggccacgtgg acgtggagga gcagaacaac 2940
caccgcagcg tgctggtggt gcccgagtgg gaggccgagg tgagccagga ggtgcgcgtg 3000
tgccccggcc gcggctacat cctgcgcgtg accgcctaca aggagggcta cggcgagggc 3060
tgcgtgacca tccacgagat cgagaacaac accgacgagc tcaagttcag caactgcgtg 3120
gaggaggagg tgtaccccaa caacaccgtg acctgcaacg actacaccgc cacccaggag 3180
gagtacgagg gcacctacac cagccgcaac cgcggctacg acggcgccta cgagagcaac 3240
agcagcgtgc ccgccgacta cgccagcgcc tacgaggaga aggcctacac cgacggccgc 3300
cgcgacaacc cctgcgagag caaccgcggc tacggcgact acacccccct gcccgccggc 3360
tacgtgacca aggagctgga gtacttcccc gagaccgaca aggtgtggat cgagatcggc 3420
gagaccgagg gcaccttcat cgtggacagc gtggagctgc tgctgatgga ggagtagtac 3480
atgtgatagt acgtaagctc gaggatct 3508
<210> 5
<211> 1845
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
atggacaaca acccaaacat caacgaatgc attccataca actgcttgag taacccagaa 60
gttgaagtac ttggtggaga acgcattgaa accggttaca ctcccatcga catctccttg 120
tccttgacac agtttctgct cagcgagttc gtgccaggtg ctgggttcgt tctcggacta 180
gttgacatca tctggggtat ctttggtcca tctcaatggg atgcattcct ggtgcaaatt 240
gagcagttga tcaaccagag gatcgaagag ttcgccagga accaggccat ctctaggttg 300
gaaggattga gcaatctcta ccaaatctat gcagagagct tcagagagtg ggaagccgat 360
cctactaacc cagctctccg cgaggaaatg cgtattcaat tcaacgacat gaacagcgcc 420
ttgaccacag ctatcccatt gttcgcagtc cagaactacc aagttcctct cttgtccgtg 480
tacgttcaag cagctaatct tcacctcagc gtgcttcgag acgttagcgt gtttgggcaa 540
aggtggggat tcgatgctgc aaccatcaat agccgttaca acgaccttac taggctgatt 600
ggaaactaca ccgaccacgc tgttcgttgg tacaacactg gcttggagcg tgtctggggt 660
cctgattcta gagattggat tagatacaac cagttcagga gagaattgac cctcacagtt 720
ttggacattg tgtctctctt cccgaactat gactccagaa cctaccctat ccgtacagtg 780
tcccaactta ccagagaaat ctatactaac ccagttcttg agaacttcga cggtagcttc 840
cgtggttctg cccaaggtat cgaaggctcc atcaggagcc cacacttgat ggacatcttg 900
aacagcataa ctatctacag cgatgctcac agaggagagt attactggtc tggacaccag 960
atcatggcct ctccagttgg attcagcggg cccgagttta cctttcctct ctatggaact 1020
atgggaaacg ccgctccaca acaacgtatc gttgctcaac taggtcaggg tgtctacaga 1080
accttgtctt ccaccttgta cagaagaccc ttcaatatcg gtatcaacaa ccagcaactt 1140
tccgttcttg acggaacaga gttcgcctat ggaacctctt ctaacttgcc atccgctgtt 1200
tacagaaaga gcggaaccgt tgattccttg gacgaaatcc caccacagaa caacaatgtg 1260
ccacccaggc aaggattctc ccacaggttg agccacgtgt ccatgttccg ttccggattc 1320
agcaacagtt ccgtgagcat catcagagct cctatgttct catggattca tcgtagtgct 1380
gagttcaaca atatcattcc ttcctctcaa atcacccaaa tcccattgac caagtctact 1440
aaccttggat ctggaacttc tgtcgtgaaa ggaccaggct tcacaggagg tgatattctt 1500
agaagaactt ctcctggcca gattagcacc ctcagagtta acatcactgc accactttct 1560
caaagatatc gtgtcaggat tcgttacgca tctaccacta acttgcaatt ccacacctcc 1620
atcgacggaa ggcctatcaa tcagggtaac ttctccgcaa ccatgtcaag cggcagcaac 1680
ttgcaatccg gcagcttcag aaccgtcggt ttcactactc ctttcaactt ctctaacgga 1740
tcaagcgttt tcacccttag cgctcatgtg ttcaattctg gcaatgaagt gtacattgac 1800
cgtattgagt ttgtgcctgc cgaagttacc ttcgaggctg agtac 1845
【０３７４】
【表１】
【０３７５】
【表２】
【０３７６】
【表３】
【０３７７】
【表４】
【０３７８】
【表５】
【０３７９】
【表６】
【０３８０】
【表７】
【０３８１】
【表８】
【図１】Fig.1 は、完全長の生来のBt cryIA(b) 遺伝子
[BTHKURHD]、完全長の合成メイズ最適化Bt cryIA(b) 遺
伝子[fllsynbt.fin]及び切り詰められた合成メイズ最適
化Bt cryIA(b) 遺伝子[bssyn] の比較である。このFig
は、完全長の合成メイズ最適化Bt cryIA(b) 遺伝子の配
列が、3468ヌクレオチドからの約2354において(約68%
の相同性)その生来のcryIA(b)遺伝子のものと適合して
いることを示している。
[BTHKURHD]、完全長の合成メイズ最適化Bt cryIA(b) 遺
伝子[fllsynbt.fin]及び切り詰められた合成メイズ最適
化Bt cryIA(b) 遺伝子[bssyn] の比較である。このFig
は、完全長の合成メイズ最適化Bt cryIA(b) 遺伝子の配
列が、3468ヌクレオチドからの約2354において(約68%
の相同性)その生来のcryIA(b)遺伝子のものと適合して
いることを示している。
【図２】Fig.1 のつづきである。
【図３】Fig.1 のつづきである。
【図４】Fig.1 のつづきである。
【図５】Fig.1 のつづきである。
【図６】Fig.2 は、切り詰められた生来のBt cryIA(b)
遺伝子[BTHKURHD]及び切り詰められた合成メイズ最適化
Bt遺伝子[bssyn] の比較である。このFig は、切り詰め
られた合成メイズ最適化cryIA(b)遺伝子の配列が、1947
ヌクレオチドからの約1278において( 約66% の相同性)
その生来のcryIA(b)遺伝子のものと適合していることを
示している。
遺伝子[BTHKURHD]及び切り詰められた合成メイズ最適化
Bt遺伝子[bssyn] の比較である。このFig は、切り詰め
られた合成メイズ最適化cryIA(b)遺伝子の配列が、1947
ヌクレオチドからの約1278において( 約66% の相同性)
その生来のcryIA(b)遺伝子のものと適合していることを
示している。
【図７】Fig.2 のつづきである。
【図８】Fig.2 のつづきである。
【図９】Fig.2 のつづきである。
【図１０】Fig.3 は、純粋なメイズ最適化Bt遺伝子配列
[syn1T.mze] と、切り詰められた合成メイズ最適化Bt遺
伝子[bssyn] 及びその遺伝子の構築を容易にするための
制限部位を含むように修飾されている完全長の合成メイ
ズ最適化Bt遺伝子[synful.mod]との比較である。このFi
g は、切り詰められた合成メイズ最適化cryIA(b)遺伝子
の配列が、1947ヌクレオチドからの約1913において( 約
98% の相同性) その純粋なメイズ最適化cryIA(b)遺伝子
のものとマッチしていることを示している。
[syn1T.mze] と、切り詰められた合成メイズ最適化Bt遺
伝子[bssyn] 及びその遺伝子の構築を容易にするための
制限部位を含むように修飾されている完全長の合成メイ
ズ最適化Bt遺伝子[synful.mod]との比較である。このFi
g は、切り詰められた合成メイズ最適化cryIA(b)遺伝子
の配列が、1947ヌクレオチドからの約1913において( 約
98% の相同性) その純粋なメイズ最適化cryIA(b)遺伝子
のものとマッチしていることを示している。
【図１１】Fig.3 のつづきである。
【図１２】Fig.3 のつづきである。
【図１３】Fig.3 のつづきである。
【図１４】Fig.3 のつづきである。
【図１５】Fig.3 のつづきである。
【図１６】Fig.4 は、生来の切り詰められたBt cryIA
(b) 遺伝子[BTHKURHD]と、Perlak et al., PNAS USA, 8
8:3324-3328 (1991)[PMONBT]中に記載されている切り詰
められた合成cryIA(b)遺伝子及び切り詰められた合成メ
イズ最適化Bt遺伝子[bssyn] との比較である。このFig
は、PMONBT遺伝子配列が、1845ヌクレオチドからの約14
53において( 約79% の相同性) その生来のcryIA(b)遺伝
子のものと適合しており、一方、切り詰められた合成メ
イズ最適化Bt cryIA(b) 遺伝子が、1845ヌクレオチドか
らの約1209において( 約66% の相同性) その生来のcryI
A(b)遺伝子と適合していることを示している。
(b) 遺伝子[BTHKURHD]と、Perlak et al., PNAS USA, 8
8:3324-3328 (1991)[PMONBT]中に記載されている切り詰
められた合成cryIA(b)遺伝子及び切り詰められた合成メ
イズ最適化Bt遺伝子[bssyn] との比較である。このFig
は、PMONBT遺伝子配列が、1845ヌクレオチドからの約14
53において( 約79% の相同性) その生来のcryIA(b)遺伝
子のものと適合しており、一方、切り詰められた合成メ
イズ最適化Bt cryIA(b) 遺伝子が、1845ヌクレオチドか
らの約1209において( 約66% の相同性) その生来のcryI
A(b)遺伝子と適合していることを示している。
【図１７】Fig.4 のつづきである。
【図１８】Fig.4 のつづきである。
【図１９】Fig.4 のつづきである。
【図２０】Fig.5 は、Perlak et al., PNAS USA, 88:33
24-3328 (1991)[PMONBT]中に記載されている切り詰めら
れた合成cryIA(b)遺伝子及び切り詰められた合成メイズ
最適化Bt cryIA(b) 遺伝子[bssyn] の比較である。この
Fig は、PMONBT遺伝子配列が、1845ヌクレオチドからの
約1410において( 約77% の相同性) その切り詰められた
合成メイズ最適化Bt cryIA(b) 遺伝子のものと適合して
いることを示している。
24-3328 (1991)[PMONBT]中に記載されている切り詰めら
れた合成cryIA(b)遺伝子及び切り詰められた合成メイズ
最適化Bt cryIA(b) 遺伝子[bssyn] の比較である。この
Fig は、PMONBT遺伝子配列が、1845ヌクレオチドからの
約1410において( 約77% の相同性) その切り詰められた
合成メイズ最適化Bt cryIA(b) 遺伝子のものと適合して
いることを示している。
【図２１】Fig.5 のつづきである。
【図２２】Fig.5 のつづきである。
【図２３】Fig.6 は、完全長のメイズ最適化Cry IB遺伝
子である。
子である。
【図２４】Fig.6 のつづきである。
【図２５】Fig.6 のつづきである。
【図２６】Fig.6 のつづきである。
【図２７】Fig.7 は、完全長のハイブリッドの、CryIA
(b)の部分的なメイズ最適化DNA 配列であってpCIB4434
中に含まれるものである。この合成領域は、ヌクレオチ
ド1-1938( アミノ酸1-646)からのものであり、そしてそ
の生来の領域は、ヌクレオチド1939-4368(アミノ酸647-
1155) からのものである。合成と生来コード配列との融
合点を、配列中スラッシュ(/) により示す。
(b)の部分的なメイズ最適化DNA 配列であってpCIB4434
中に含まれるものである。この合成領域は、ヌクレオチ
ド1-1938( アミノ酸1-646)からのものであり、そしてそ
の生来の領域は、ヌクレオチド1939-4368(アミノ酸647-
1155) からのものである。合成と生来コード配列との融
合点を、配列中スラッシュ(/) により示す。
【図２８】Fig.7 のつづきである。
【図２９】Fig.7 のつづきである。
【図３０】Fig.7 のつづきである。
【図３１】Fig.8 は、pCIB4434のマップである。
【図３２】Fig.9 は、完全長のハイブリッドの、熱安定
性のCryIA(b)の蛋白をコードしているメイズ最適化DNA
配列であってpCIB5511中に含まれるものである。
性のCryIA(b)の蛋白をコードしているメイズ最適化DNA
配列であってpCIB5511中に含まれるものである。
【図３３】Fig.9 のつづきである。
【図３４】Fig.9 のつづきである。
【図３５】Fig.9 のつづきである。
【図３６】Fig.10は、pCIB5511のマップである。
【図３７】Fig.11は、完全長のハイブリッドの、熱安定
性のCryIA(b)の蛋白をコードしているメイズ最適化DNA
配列であってpCIB5512中に含まれるものである。
性のCryIA(b)の蛋白をコードしているメイズ最適化DNA
配列であってpCIB5512中に含まれるものである。
【図３８】Fig.11のつづきである。
【図３９】Fig.11のつづきである。
【図４０】Fig.11のつづきである。
【図４１】Fig.12は、pCIB5512のマップである。
【図４２】Fig.13は、完全長の、熱安定性のCryIA(b)の
蛋白をコードしているメイズ最適化DNA 配列であってpC
IB5513中に含まれるものである。
蛋白をコードしているメイズ最適化DNA 配列であってpC
IB5513中に含まれるものである。
【図４３】Fig.13のつづきである。
【図４４】Fig.13のつづきである。
【図４５】Fig.13のつづきである。
【図４６】Fig.14は、pCIB5513のマップである。
【図４７】Fig.15は、完全長の、熱安定性のCryIA(b)の
蛋白をコードしているメイズ最適化DNA 配列であってpC
IB5514中に含まれるものである。
蛋白をコードしているメイズ最適化DNA 配列であってpC
IB5514中に含まれるものである。
【図４８】Fig.15のつづきである。
【図４９】Fig.15のつづきである。
【図５０】Fig.15のつづきである。
【図５１】Fig.16は、pCIB5514のマップである。
【図５２】Fig.17は、pCIB4418のマップである。
【図５３】Fig.18は、pCIB4420のマップである。
【図５４】Fig.19は、pCIB4429のマップである。
【図５５】Fig.20は、pCIB4431のマップである。
【図５６】Fig.21は、pCIB4428のマップである。
【図５７】Fig.22は、pCIB4430のマップである。
【図５８】Fig.23A(23-1) は、トランスジェニック・メ
イズ内のcryIA(b)蛋白レベルのデータを含む表である。
イズ内のcryIA(b)蛋白レベルのデータを含む表である。
【図５９】Fig.23B は、メイズ最適化CryIA(b)遺伝子を
含むメイズ子孫からの葉材料に対するOstrinia及びDiat
raeaの生物検定の結果を要約した表である。
含むメイズ子孫からの葉材料に対するOstrinia及びDiat
raeaの生物検定の結果を要約した表である。
【図６０】Fig.23C は、トランスジェニック・メイズ内
のcryIA(b)蛋白レベルのデータを含む表である。
のcryIA(b)蛋白レベルのデータを含む表である。
【図６１】Fig.23D は、髄プロモーターに作用可能な状
態で結合された合成Bt.メイズ遺伝子を含むメイズ子孫
からの葉材料に対するOstrinia及びDiatraeaの生物検定
の結果を要約した表である。
態で結合された合成Bt.メイズ遺伝子を含むメイズ子孫
からの葉材料に対するOstrinia及びDiatraeaの生物検定
の結果を要約した表である。
【図６２】Fig.23E は、髄好適プロモーターを使用した
トランスジェニック・メイズ内のcryIA(b)遺伝子の発現
の対するデータを含む表である。
トランスジェニック・メイズ内のcryIA(b)遺伝子の発現
の対するデータを含む表である。
【図６３】Fig.24は、メイズのトリプトファン・シンタ
ーゼ- アルファ・サブユニット遺伝子の完全なゲノムDN
A 配列である。イントロン、エクソン、転写開始及び翻
訳開始、cDNAの開始及び終止を、示す。$=cDNAの開始及
び終止;+1=転写開始;73*******= プライマー伸長プライ
マー;+1=翻訳の開始;+++= 終止コドン; 塩基対1495-99=
CCAAT ボックス; 塩基対1593-1598=TATAA ボックス; 塩
基対3720-3725=ポリA付加部位;#上記の下線配列は、PCR
プライマーである。
ーゼ- アルファ・サブユニット遺伝子の完全なゲノムDN
A 配列である。イントロン、エクソン、転写開始及び翻
訳開始、cDNAの開始及び終止を、示す。$=cDNAの開始及
び終止;+1=転写開始;73*******= プライマー伸長プライ
マー;+1=翻訳の開始;+++= 終止コドン; 塩基対1495-99=
CCAAT ボックス; 塩基対1593-1598=TATAA ボックス; 塩
基対3720-3725=ポリA付加部位;#上記の下線配列は、PCR
プライマーである。
【図６４】Fig.24のつづきである。
【図６５】Fig.24のつづきである。
【図６６】Fig.25A は、ノーザン・ブロット分析であっ
て、それぞれ、2 時間、4 時間、18時間、及び48時間の
間隔における、DuPont Cronex 増感スクリーンによる-8
0℃における、メイズ組織内のメイズTrpAサブユニット
遺伝子の分化発現を示すものである。P=髄;C= 穂軸(co
b);BR= 支持根;ES=穂の葉柄(ear shank);LP=髄下部(low
er pith);MP 髄中央部;UP=髄上部;S= 種;L= 葉;R= 根;
そしてP(左上)=全髄。
て、それぞれ、2 時間、4 時間、18時間、及び48時間の
間隔における、DuPont Cronex 増感スクリーンによる-8
0℃における、メイズ組織内のメイズTrpAサブユニット
遺伝子の分化発現を示すものである。P=髄;C= 穂軸(co
b);BR= 支持根;ES=穂の葉柄(ear shank);LP=髄下部(low
er pith);MP 髄中央部;UP=髄上部;S= 種;L= 葉;R= 根;
そしてP(左上)=全髄。
【図６７】Fig.25B は、ノーザン・ブロット分析であっ
て、それぞれ、2 時間、4 時間、18時間、及び48時間の
間隔における、DuPont Cronex 増感スクリーンによる-8
0℃における、メイズ組織内のメイズTrpAサブユニット
遺伝子の分化発現を示すものである。P=髄;C= 穂軸(co
b);BR= 支持根;ES=穂の葉柄(ear shank);LP=髄下部(low
er pith);MP 髄中央部;UP=髄上部;S= 種;L= 葉;R= 根;
そしてP(左上)=全髄。
て、それぞれ、2 時間、4 時間、18時間、及び48時間の
間隔における、DuPont Cronex 増感スクリーンによる-8
0℃における、メイズ組織内のメイズTrpAサブユニット
遺伝子の分化発現を示すものである。P=髄;C= 穂軸(co
b);BR= 支持根;ES=穂の葉柄(ear shank);LP=髄下部(low
er pith);MP 髄中央部;UP=髄上部;S= 種;L= 葉;R= 根;
そしてP(左上)=全髄。
【図６８】Fig.25C は、ノーザン・ブロット分析であっ
て、それぞれ、2 時間、4 時間、18時間、及び48時間の
間隔における、DuPont Cronex 増感スクリーンによる-8
0℃における、メイズ組織内のメイズTrpAサブユニット
遺伝子の分化発現を示すものである。P=髄;C= 穂軸(co
b);BR= 支持根;ES=穂の葉柄(ear shank);LP=髄下部(low
er pith);MP 髄中央部;UP=髄上部;S= 種;L= 葉;R= 根;
そしてP(左上)=全髄。
て、それぞれ、2 時間、4 時間、18時間、及び48時間の
間隔における、DuPont Cronex 増感スクリーンによる-8
0℃における、メイズ組織内のメイズTrpAサブユニット
遺伝子の分化発現を示すものである。P=髄;C= 穂軸(co
b);BR= 支持根;ES=穂の葉柄(ear shank);LP=髄下部(low
er pith);MP 髄中央部;UP=髄上部;S= 種;L= 葉;R= 根;
そしてP(左上)=全髄。
【図６９】Fig.25D は、ノーザン・ブロット分析であっ
て、それぞれ、2 時間、4 時間、18時間、及び48時間の
間隔における、DuPont Cronex 増感スクリーンによる-8
0℃における、メイズ組織内のメイズTrpAサブユニット
遺伝子の分化発現を示すものである。P=髄;C= 穂軸(co
b);BR= 支持根;ES=穂の葉柄(ear shank);LP=髄下部(low
er pith);MP 髄中央部;UP=髄上部;S= 種;L= 葉;R= 根;
そしてP(左上)=全髄。
て、それぞれ、2 時間、4 時間、18時間、及び48時間の
間隔における、DuPont Cronex 増感スクリーンによる-8
0℃における、メイズ組織内のメイズTrpAサブユニット
遺伝子の分化発現を示すものである。P=髄;C= 穂軸(co
b);BR= 支持根;ES=穂の葉柄(ear shank);LP=髄下部(low
er pith);MP 髄中央部;UP=髄上部;S= 種;L= 葉;R= 根;
そしてP(左上)=全髄。
【図７０】Fig.26は、ノーザン・ブロット検定であり、
その中の2 つの左のレーンが、Funk同系211D及び5N984
の葉(L) 及び髄(P) 内でメイズTrpA遺伝子発現を示す。
右の5 つのレーンは、Funk 211D 種の全RNAの不在を示
している。S(1 、2 、3 、4及び5)= 受粉後1 、2 、3、
4 及び5 週目における種。L=葉:P= 髄;S#=種# 受粉後の
週。
その中の2 つの左のレーンが、Funk同系211D及び5N984
の葉(L) 及び髄(P) 内でメイズTrpA遺伝子発現を示す。
右の5 つのレーンは、Funk 211D 種の全RNAの不在を示
している。S(1 、2 、3 、4及び5)= 受粉後1 、2 、3、
4 及び5 週目における種。L=葉:P= 髄;S#=種# 受粉後の
週。
【図７１】Fig.27は、メイズTrpA cDNA 8-2(pCIB5600)
によりプローブした、ゲノムDNAFunk系211Dのサザン・
ブロット検定であり、Fig 中、B はBamHI を表し、E は
EcoRI を表し、EVはEcoRV を表し、H はHINDIII を表
し、そしてS はSacIを表す。1X、5X及び10X は、再構築
遺伝子のコピー当量である。
によりプローブした、ゲノムDNAFunk系211Dのサザン・
ブロット検定であり、Fig 中、B はBamHI を表し、E は
EcoRI を表し、EVはEcoRV を表し、H はHINDIII を表
し、そしてS はSacIを表す。1X、5X及び10X は、再構築
遺伝子のコピー当量である。
【図７２】Fig.28A は、メイズTrpAサブユニット遺伝子
の転写開始及び配列決定ラダーを示すプライマー伸長分
析である。レーン+1及び+2は、プライマー伸長反応の1X
+0.5X サンプルである。
の転写開始及び配列決定ラダーを示すプライマー伸長分
析である。レーン+1及び+2は、プライマー伸長反応の1X
+0.5X サンプルである。
【図７３】Fig.28B は、Dupont Cronex 増感スクリーン
による-80 ℃におけるフィルムに対する16時間露出にお
ける42℃、48℃及び54℃のアニーリング温度における+2
塩基対から+387塩基対までのRNase 保護の分析である。
による-80 ℃におけるフィルムに対する16時間露出にお
ける42℃、48℃及び54℃のアニーリング温度における+2
塩基対から+387塩基対までのRNase 保護の分析である。
【図７４】Fig.29は、元のタイプII花粉特異的cDNAクロ
ーンのマップである。3 つのEcoRI 断片をpBluescript
ベクター中にサブクローニングし、pCIB3168、pCIB3169
及びII-.6 を作り出すことを説明している。
ーンのマップである。3 つのEcoRI 断片をpBluescript
ベクター中にサブクローニングし、pCIB3168、pCIB3169
及びII-.6 を作り出すことを説明している。
【図７５】Fig.30は、元のタイプII cDNA クローンの1.
0kb 及び0.5kb 断片内に含まれるような、メイズの花粉
特異的カルシウム依存性蛋白キナーゼ遺伝子cDNAのDNA
配列を示している。この1.0kb と0.5kb 断片を分けるEc
oRI 部位を、示す。このcDNAは、そのmRNA開始部位がそ
のcDNAクローンの末端の上流の490 塩基対にマッピング
しているので完全長でない。
0kb 及び0.5kb 断片内に含まれるような、メイズの花粉
特異的カルシウム依存性蛋白キナーゼ遺伝子cDNAのDNA
配列を示している。この1.0kb と0.5kb 断片を分けるEc
oRI 部位を、示す。このcDNAは、そのmRNA開始部位がそ
のcDNAクローンの末端の上流の490 塩基対にマッピング
しているので完全長でない。
【図７６】Fig.30のつづきである。
【図７７】Fig.31は、花粉CDPK mRNA の組織好適発現に
ついて説明している。示されたメイズ211D組織からのRN
A を、変性させ、アガロース・ゲル上で電気泳動し、ニ
トロセルロースに移し、そして花粉CDPK cDNA 0.5kb 断
片によりプローブした。このmRNAは、花粉内においての
み検出され、強いシグナルが見られる。
ついて説明している。示されたメイズ211D組織からのRN
A を、変性させ、アガロース・ゲル上で電気泳動し、ニ
トロセルロースに移し、そして花粉CDPK cDNA 0.5kb 断
片によりプローブした。このmRNAは、花粉内においての
み検出され、強いシグナルが見られる。
【図７８】Fig.32は、花粉CDPK誘導蛋白配列及びTobima
tsu et al., J. Biol. Chem. 263:16082-16086 (1988)
中に開示されたラット蛋白キナーゼ2 蛋白配列のアミノ
酸配列比較である。DNAstar ソフトウェアー・パッケー
ジの整列プログラム(Allign program)を、この配列を評
価するために使用した。蛋白キナーゼに対する相同性
は、この遺伝子の5'の2/3 内で、、すなわち、1.0kb 断
片内で、生じている。
tsu et al., J. Biol. Chem. 263:16082-16086 (1988)
中に開示されたラット蛋白キナーゼ2 蛋白配列のアミノ
酸配列比較である。DNAstar ソフトウェアー・パッケー
ジの整列プログラム(Allign program)を、この配列を評
価するために使用した。蛋白キナーゼに対する相同性
は、この遺伝子の5'の2/3 内で、、すなわち、1.0kb 断
片内で、生じている。
【図７９】Fig.33は、花粉CDPK誘導蛋白配列及びFische
r et al., J. Biol. Chem. 263:17055-17062(1988)中に
開示されたヒト・カルモジュリン蛋白配列のアミノ酸配
列比較である。カルモジュリンに対するそう相同性は、
その遺伝子の3'の1/3 内で、すなわち、0.5kb 断片内で
生じている。
r et al., J. Biol. Chem. 263:17055-17062(1988)中に
開示されたヒト・カルモジュリン蛋白配列のアミノ酸配
列比較である。カルモジュリンに対するそう相同性は、
その遺伝子の3'の1/3 内で、すなわち、0.5kb 断片内で
生じている。
【図８０】Fig.34は、花粉CDPK誘導蛋白配列及び大豆CD
PKのアミノ酸配列比較である。相同性は、遺伝子全体に
わたり生じている。
PKのアミノ酸配列比較である。相同性は、遺伝子全体に
わたり生じている。
【図８１】Fig.35は、メイズ花粉特異的CDPK遺伝子の配
列について説明している。そのmRNA開始部位に先立つ1.
4kb の配列を示す。7 つのエクソン(exons) 及び6 つの
イントロン(introns) の部分を、その対応するDNA 配列
の下に表す。このcDNA内のポリアデニレーションの部位
を示す。
列について説明している。そのmRNA開始部位に先立つ1.
4kb の配列を示す。7 つのエクソン(exons) 及び6 つの
イントロン(introns) の部分を、その対応するDNA 配列
の下に表す。このcDNA内のポリアデニレーションの部位
を示す。
【図８２】Fig.35のつづきである。
【図８３】Fig.35のつづきである。
【図８４】Fig.35のつづきである。
【図８５】Fig.35のつづきである。
【図８６】Fig.36は、pCIB4433のマップである。
【図８７】Fig.37は、完全長のハイブリッドの、熱安定
性cryIA(b)蛋白をコードしているメイズ最適化DNA 配列
である。
性cryIA(b)蛋白をコードしているメイズ最適化DNA 配列
である。
【図８８】Fig.37のつづきである。
【図８９】Fig.37のつづきである。
【図９０】Fig.38は、pCIB5515のマップである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 デサイ，ナリニ エム.
アメリカ合衆国，ノース カロライナ
27511，キャリー，シルバーウッド レー
ン 107
(72)発明者 ルイス，ケリー エス.
アメリカ合衆国，ノース カロライナ
27278，ヒルズボロー，ラトーニ ドライ
ブ 1508
(72)発明者 クラマー，バンス シー.
アメリカ合衆国，ノース カロライナ
27278，ヒルズボロー，ダナ コート 608
(72)発明者 ウォーレン，グレゴリー ダブリュ.
アメリカ合衆国，ノース カロライナ
27513，キャリー，ボンド レイク ドラ
イブ 324
(72)発明者 エボラ，スティーブン ブイ.
アメリカ合衆国，ノース カロライナ
27502，アペックス，イースト ビーチモ
ント サークル 1013
(72)発明者 クロスランド，ライル ディー.
アメリカ合衆国，ノース カロライナ
27514，チャペル ヒル，ピンチョット
レーン 108
(72)発明者 ライト，マーサ エス.
アメリカ合衆国，ノース カロライナ
27511，キャリー，プリンス ウィリアム
レーン 106
(72)発明者 マーリン，エリス ジェイ.
アメリカ合衆国，ノース カロライナ
27615，ラレイ，ストーンゲイト ドライ
ブ 8605
(72)発明者 ローニス，カレン エル.
アメリカ合衆国，ノース カロライナ
27525，フランクリントン，サドルビュー
レーン 104
(72)発明者 ロスステイン，スティーブン ジェイ.
カナダ国，オンタリオ エヌ１エー １エ
ー５，ギュールフ，フィールドストーン
ロード 15
Ｆターム(参考） 2B030 AA00 CA15 CA17 CA19
4B024 AA08 BA38 CA01 DA01 FA02
GA11 HA20
Claims (25)
- 【請求項１】 植物内の関連構造遺伝子の髄好適発現を
指令することがきる単離及び精製されたプロモーター。 - 【請求項２】 単子葉植物から単離された、請求項１に
記載のプロモーター。 - 【請求項３】 前記単子葉植物がメイズ(maize)であ
る、請求項２に記載のプロモーター。 - 【請求項４】 植物のトリプトファン・シンターゼ- ア
ルファ(TrpA)サブユニット遺伝子から単離された、請求
項１に記載のプロモーター。 - 【請求項５】 前記植物がメイズである、請求項４に記
載のプロモーター。 - 【請求項６】 Fig.24中に記載された配列を含む、請求
項４又は５に記載のプロモーター。 - 【請求項７】 植物内で関連構造遺伝子の花粉特異的発
現を指令することができる精製されたプロモーターであ
って、植物のカルシウム依存性ホスフェート・キナーゼ
(CDPK)遺伝子から単離されるプロモーター。 - 【請求項８】 単子葉植物CDPK遺伝子から単離される、
請求項７に記載のプロモーター。 - 【請求項９】 前記単子葉植物がメイズである、請求項
８に記載のプロモーター。 - 【請求項１０】 Fig.35中に記載される配列を含む、請
求項８に記載のプロモーター。 - 【請求項１１】 請求項１〜１０のいずれか１項に記載
のプロモーターであって着目の蛋白をコードする構造遺
伝子と作用可能な状態で結合しているものを含む組換え
DNA 分子。 - 【請求項１２】 前記構造遺伝子が殺虫性蛋白をコード
する、請求項１１に記載の組換えDNA 分子。 - 【請求項１３】 前記構造遺伝子がバチルス・スリンギ
エンシスの蛋白をコードしている、請求項１２に記載の
組換えDNA 分子。 - 【請求項１４】 少なくとも1 つの組換えDNA 分子によ
り安定的に形質転換されているメイズ植物であって;前
記DNA 分子が殺虫性蛋白をコードしているヌクレオチド
配列に作用可能な状態で結合されているプロモーターを
含み、 前記プロモーターがそのメイズ植物内でその遺伝子の組
織好適発現又は組織特異的発現を指令することができ
る、ことを特徴とするメイズ植物。 - 【請求項１５】 前記遺伝子がバチルス・スリンギエン
シスの蛋白をコードしている、請求項１４に記載のメイ
ズ植物。 - 【請求項１６】 前記プロモーターが、単子葉植物から
得られる、請求項１４に記載のメイズ植物。 - 【請求項１７】 前記単子葉植物がメイズ植物である、
請求項１６に記載のメイズ植物。 - 【請求項１８】 前記プロモーターがそのメイズ植物内
でその遺伝子の髄好適発現を指令することができる、請
求項１４に記載のメイズ植物。 - 【請求項１９】 前記プロモーターが、植物のトリプト
ファン・シンターゼ- アルファ・サブユニット遺伝子か
ら得られ、かつ、Fig.24中に記載した配列を含む、請求
項１４に記載の植物。 - 【請求項２０】 前記植物がメイズである、請求項１９
に記載のメイズ植物。 - 【請求項２１】 前記プロモーターが前記メイズ植物内
で前記遺伝子の緑組織特異的発現を指令することができ
る、請求項１４に記載のメイズ植物。 - 【請求項２２】 前記プロモーターがPEP カルボキシラ
ーゼ・プロモーターである、請求項１４に記載のメイズ
植物。 - 【請求項２３】 前記プロモーターが前記メイズ植物内
で前記遺伝子の花粉特異的発現を指令することができ
る、請求項１４に記載のメイズ植物。 - 【請求項２４】 前記プロモーターが、植物のカルシウ
ム依存性ホスフェート・キナーゼ遺伝子から得られ、か
つ、Fig.35中に記載した配列を含む、請求項１４に記載
のメイズ植物。 - 【請求項２５】 前記植物がメイズである、請求項２４
に記載のメイズ植物。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US77202791A | 1991-10-04 | 1991-10-04 | |
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| US07/951,715 US5625136A (en) | 1991-10-04 | 1992-09-25 | Synthetic DNA sequence having enhanced insecticidal activity in maize |
| US951,715 | 1992-09-25 |
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| JP5507123A Division JPH07500012A (ja) | 1991-10-04 | 1992-10-05 | メイズ（ｍａｉｚｅ）における強化殺虫活性をもつ合成ＤＮＡ配列 |
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|---|---|
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Family
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Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5507123A Withdrawn JPH07500012A (ja) | 1991-10-04 | 1992-10-05 | メイズ（ｍａｉｚｅ）における強化殺虫活性をもつ合成ＤＮＡ配列 |
| JP2002330314A Pending JP2003189888A (ja) | 1991-10-04 | 2002-11-14 | メイズ（ｍａｉｚｅ）における強化殺虫活性をもつ合成ＤＮＡ配列の発現用プロモーター |
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|---|---|---|---|
| JP5507123A Withdrawn JPH07500012A (ja) | 1991-10-04 | 1992-10-05 | メイズ（ｍａｉｚｅ）における強化殺虫活性をもつ合成ＤＮＡ配列 |
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