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JP5048575B2 - オリゴヌクレオチドの脱シリル化の方法 - Google Patents

オリゴヌクレオチドの脱シリル化の方法 Download PDF

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Description

関連出願
本出願は、2004年4月5日に受理された米国特許仮出願第60/559,782号の優先権を享受し、その内容の全てを参照として本明細書に取り入れておく。
オリゴヌクレオチドの研究は、多くの大学および企業の研究室における研究の重要分野である。例えば、非特許文献１、非特許文献２および非特許文献３を参照。治療および診断に対してオリゴヌクレオチドが有する潜在能力により、研究活動の実質的な量が爆発的に増加している。オリゴヌクレオチドの重要な用途のひとつは、配列特異的に遺伝子およびタンパク質の機能を調節できることである。しかしながら、研究の多くは、実験に使用できるオリゴヌクレオチドの量が少ないことが足かせになっている。高純度のオリゴヌクレオチド化合物を大量に作成する方法が開発されれば、オリゴヌクレオチド研究が大きく伸展するはずである。さらに、ある種のオリゴヌクレオチドの誘導体を調製することが非常に有用であると考えられる。しかしながら、オリゴヌクレオチドおよびそれらのアナログの合成は手間と費用がかかることが多い。
一般的に、RNAは、次のような工程を経る方法によって合成および精製される：活性化剤としてテトラゾールを用いてホスホルアミダイトをカップリングさせ、リンのリンカーを酸化してジエステルにし、NH4OHを用いて環外のアミノ保護基を脱保護し、テトラ−n−ブチルアンモニウムフルオリド（TBFA）を用いて2'−OHのアルキルシリル保護基を除去し、さらに、脱保護したRNAをゲル精製して分析する。化学合成、脱保護、精製および分析の方法の例については、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６および非特許文献７に記載されている。オダイおよび共同研究者らは、リボザイムの形成に用いたRNAフラグメントの逆相クロマトグラフィー精製について記載している。非特許文献８を参照。残念なことに、上述の化学合成、脱保護、精製および分析法は時間がかかり（カップリング時間は10〜15分）、テトラゾールによるRNAアミダイトの活性化は非効率的であり、NH4OHによる環外アミノ保護基の脱保護は不完全であり、ゲル電気泳動を用いて行うRNA精製の量は少量であり、さらに、ゲル電気泳動によるRNAの分割分析能は低い。故に、オリゴヌクレオチドの合成に関する改良合成法が希求されている。
オリゴヌクレオチドアナログのひとつの重要な種類は、ホスホジエステル結合の代わりにホスホロチオエートを有する化合物である。ホスホロチオエートアナログは、核酸研究およびタンパク質研究において重要な化合物である。例えば、ホスホロチオエート含有アンチセンスオリゴヌクレオチドは、遺伝子発現の阻害剤として、イン・ビトロ（in vitro）およびイン・ビボ（in vivo）で用いられている。DNAもしくはRNA上へのレポーター部位の部位特異的結合は、ひとつのホスホロチオエート結合を導入することによって容易に行える。ホスホロチオエートは、DNA−タンパク質およびRNA−タンパク質の相互作用、ならびに触媒的RNAの機構研究を目的として、オリゴヌクレオチドに導入することもできる。
固相合成によって組み立てられたオリゴヌクレオチドへのホスホロチオエート結合の導入は、H−ホスホナート法またはホスホルアミダイト法を用いて実施できる。H−ホスホナート法は、所望する配列を組み立てた後に、硫黄転移工程を1回行い、ヌクレオチド間の全ての結合をホスホロチオエートに転換する。別の方法としては、ホスホルアミダイト法は、各合成サイクルで選択を行うことを特徴とする。標準的な酸化によってヌクレオチド内に正常なホスホジエステル結合が生じるが、硫化工程によって配列内の特定の位置にホスホロチオエートが導入される。ホスホルアミダイト法を利用することの利点は、部位特異的に各結合の状態、すなわち、P=O対P=Sの比を制御できることである。ホスホロチオエートを作出するための初期の実験においては、イオウ原子を用いていたが、ホスホルアミダイト法の成功は、自動合成に適した、より効率的、より可溶性の硫黄転移反応試薬が入手でき、かつ利用できることにかかっている。故に、自動オリゴヌクレオチド合成に適した新規な硫黄転移反応試薬が希求されている。
オリゴヌクレオチドのもうひとつの重要な種類は二本鎖RNAであり、これは、RNA干渉（RNAi）として知られている遺伝子サイレンシングのひとつの型の開始に使用することができる。RNA干渉は、進化の過程で保存されている遺伝子サイレンシング機構であり、線虫類の一種であるCaenorhabditis elegansの研究において最初に発見された（非特許文献９；非特許文献１０）。RNA干渉は、適切な分子機構を発現する細胞内にdsRNAを導入することが引き金になり、対応する内在性mRNAを分解する。反応機構には、dsRNAの短いRNAへの転換が含まれるが、これらの短いRNAは、リボヌクレアーゼを相同なmRNA標的に向かわせる（非特許文献１１に総括されている）。この過程は、ウイルスに対する正常な防御およびトランスポゾンの移動に関係がある。
二本鎖リボ核酸（dsRNA）は、天然にはほとんど存在せず、酵母またなウイルスなどのある種の微生物にのみ見出されている。最近の研究では、dsRNAは、発現の制御、および細胞によるインターフェロンの合成開始に利用される（非特許文献１２；非特許文献１３）。さらに、dsRNAは、抗増殖特性を有していることが報告されており、治療への応用も考えられている（非特許文献１４）。例えば、合成dsRNAは、マウスにおいて腫瘍増殖を阻害することが示されており（非特許文献１５）、白血病マウスの治療に有効であり（非特許文献１６）、さらに、マウスの皮膚において化学的に誘導した腫瘍発生を阻害する（非特許文献１７）。
dsRNAを用いた処理は、無脊椎生物の遺伝子機能の分析に重要な手段になっている。例えば、非特許文献１８においては、麻酔をかけたショウジョウバエの腹部にdsRNAを注入することにより、ショウジョウバエの成虫の体内でRNAiが誘導できたこと、および、この方法は、中枢神経系で発現される遺伝子を標的にすることもできることを始めて示した。ショウジョウバエの成虫においては、導入遺伝子および内在性遺伝子は、それぞれに対応するdsRNAを腹部に注入することにより、首尾よくサイレンス化された。さらに、非特許文献１９においては、dsRNAプロセシングの方向により、干渉を引き起こす短いRNA（siRNA）−タンパク質のコンプレックスによって解裂される対象が、センス標的RNAであるのかアンチセンス標的RNAであるのかが決定されるという事実を示している。
最近の２つの報告では、RNAiにより、線虫類の一種であるCaenorhabditis elegansの遺伝子機能を試験するための迅速な方法が提供されることが明らかにされており、C.elegansの染色体IおよびIII上のほとんどの遺伝子がRNAi表現型に関して調べられている（非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２）。RNAiを機能消失情報を得るための迅速法として使用した場合には、RNAiを用いて卵巣転写物のランダムセットを分析し、C.elegansの胚形成における基本的役割に関して、81個の遺伝子を確認した（非特許文献２３）。RNAiを用い、ニクバエの蛹の血液細胞タンパク質を分断することもできる（非特許文献２４）。
無脊椎生物のRNAiと同様に、植物における転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）はRNA分解機構である。植物においては、この現象が、転写中および転写後の両方の工程で生じるが、これまでのところ、無脊椎生物では転写後RNAiのみが報告されている（非特許文献２５）。勿論、いずれの場合においても二本鎖RNA（dsRNA）が関与しており、局所開始領域から生体内に広がって、干渉を引き起こす短いRNA（siRNA）の蓄積と相関しており、さらに、RNA依存性の推定RNAポリメラーゼ、RNAヘリカーゼならびに、PAZおよびPiwiドメインを含む機能不明のタンパク質を必要とする。
RNAiとPTGSとの間にいくつかの相異があることは明らかであり、それらについては、非特許文献２６に報告されている。第一に、植物のPTGSは、少なくとも２つの遺伝子、SGS３（コイルコイルド（coil-coiled）ドメインを含む機能不明のタンパク質をコードしている）およびMET1（DNAメチルトランスフェラーゼをコードしている）を必要とし、これらはC.elegansには存在せず、従って、RNAiには不要である。第二に、正常に機能しないPTGSを呈するシロイヌナズナ（Arabidopsis）の突然変異体のすべてにおいて、キュウリモザイクウイルス（CMV）による感染に対して感受性過度であることから、PTGSは、ウイルスに対する植物の抵抗性の機構に関与していることが示唆される。RNAiを介した腫瘍遺伝子のサイレンシングは、クラウンゴール腫瘍形成に対する抵抗性を付与することも報告されている（非特許文献２７）。
RNAiは、RNA誘導性サイレンシングコンプレックス（RISC）によって媒介されるが、ここで、RISCとは、サイレンシングトリガー（silencing trigger）と相同なメッセンジャーRNAを破壊する配列特異的な多構成ヌクレアーゼである。RISCは、二本鎖RNAトリガー由来の短いRNA（ヌクレオチド数は約22個）を含むことが知られているが、この活性に関与するタンパク質構成成分はまだ明らかになっていない。非特許文献２８には、培養ショウジョウバエ細胞由来のRNAiエフェクターヌクレアーゼの生化学的精製について報告されており、活性フラクションのリボヌクレオタンパク質コンプレックスのタンパク質マイクロシークエンスを行うことにより、このコンプレックスのうちのひとつの構成要素は、アルゴノーテ（Argonaute）ファミリータンパク質の一員であり、線虫類（Caenorhabditis elegans）、アカパンカビ属（Neurospora）およびシロイヌナズナ（Arabidopsis）の遺伝子サイレンシングに必須である。このことから、多様な生物由来のRNAiの遺伝子的分析とショウジョウバエのイン・ビトロ（in vitro）系に由来するRNAiの生化学的モデルとの間に関連があることが示唆される。
非特許文献２９には、RNAiにより、マウス卵母細胞中の休眠中の母系mRNAの機能を研究するための適切かつ有力な方法が提供されることが報告されている。Mos（始めはc-mosという名称で知られていた）および組織プラスミノーゲンアクチベーターmRNAは、休眠中の母系ｍRNAであり、卵母細胞の成熟期間中に補充され、Mos RNAの翻訳により、MAPキナーゼが活性化される。マウス卵母細胞中のMosまたはTPA mRNAを標的にするdsRNAは、時間および濃度依存的様式で標的mRNAを特に減少させ、MAPキナーゼ活性の出現を阻害した。非特許文献３０も参照のこと。
薬理学的特性が改良されたsiRNA（干渉を引き起こす短いRNA）−コンジュゲートが待ち望まれている。特に、オリゴヌクレオチド配列は、血清への溶解性が低く、細胞への分布および取込が低く、さらに、腎臓を通して迅速に排出される。特に、生来のホスホジエステル（P=O）骨格を有するオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼを介した分解を受けやすい。例えば、非特許文献３１を参照。オリゴヌクレオチドの安定性は、P=O結合を、イン・ビボ（in vivo）でヌクレアーゼによる分解を受けにくいP=S結合に転換することによって高められる。別の方法としては、ホスフェート基をホスホルアミダイトまたはアルキルホスホナートに転換することができるが、後2者は、生来のホスフフェートよりも酵素分解されにくい傾向がある。非特許文献３２を参照。オリゴヌクレオチドの糖部を修飾することにより、酵素分解に対する安定性を付与することができる。例えば、リボ核酸を有するオリゴヌクレオチドは、糖の2'−OH基をメトキシエトキシ基に転換すると、核溶解性分解を受けにくくなる。非特許文献３３およびその引用文献を参照。
故に、オリゴヌクレオチドの合成を効率的に行うための改良合成法が希求されている。所望されている改良の代表的な例としては、ヌクレオチドのホスホルアミダイトカップリングのためのより優れた活性化剤、ホスホロチオエート含有オリゴヌクレオチドを調製するためのより優れた硫黄転移反応試薬、およびオリゴヌクレオチド精製のための改良法などが挙げられる。
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本発明は、オリゴヌクレオチドの合成および精製のための方法および反応試薬に関する。ひとつの側面から見ると、本発明は、オリゴヌクレオチド合成において、ホスホルアミダイトの活性化に有用な化合物に関する。別の側面から見ると、本発明は、本発明に従うアクチベーターを用い、ホスホルアミダイト法によってオリゴヌクレオチドを調製する方法に関する。別の側面から見ると、本発明は、硫黄転移反応試薬に関する。好ましい実施態様においては、硫黄転移反応試薬は、3−アミノ−1,2,4−ジチアゾリジン−5−オンである。別の側面から見ると、本発明は、本発明に従う硫黄反応試薬を用いてホスファイトを処理することにより、ホスホルアミダイトを調製する方法に関する。好ましい実施態様においては、硫黄転移反応試薬は、3−アミノ−1,2,4−ジチアゾリジン−5−オンである。また別の側面から見ると、本発明は、エチルニトリル保護基を有するホスフェート基の脱保護中に生成するアクリロニトリルを捕捉する化合物に関する。好ましい実施態様においては、アクリロニトリル捕捉剤はポリマーに結合したチオールである。別の側面からみると、本発明は、ホスファイトを酸化してホスフェートにするような酸化剤に関する。好ましい実施態様においては、酸化剤は、亜塩素酸ナトリウム、クロロアミンまたはピリジン−N−オキシドである。別の側面から見ると、本発明は、第一の一本鎖オリゴヌクレオチドと第二の一本鎖オリゴヌクレオチドとをアニールして二本鎖オリゴヌクレオチドを生成し、該二本鎖オリゴヌクレオチドをクロマトグラフィー精製することによってオリゴヌクレオチドを精製する方法に関する。好ましい実施態様においては、クロマトグラフィー精製は、高速液体クロマトグラフィーである。
本発明は、オリゴヌクレオチドの合成および精製に用いる方法および反応試薬に関する。方法および反応試薬については、以下に記載している。
ホスホルアミダイトを介したオリゴヌクレオチドの合成に用いるアクチベーター
固相化学を用いたオリゴヌクレオチドの合成において最も一般的に用いられる方法は、ホスホルアミダイト法である。一般的な方法においては、アクチベーターの存在下において、ホスホルアミダイトに、支持体に結合したヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを反応させる。ホスホルアミダイトカップリング生成物を酸化し、保護ホスフェートを得る。本方法に使用できるホスホルアミダイト誘導体としては多様なものが知られており、最も汎用されているアクチベーターは1H−テトラゾールである。可溶性支持体を用いる同様な方法についても記載されている。ボロナ（Borona）ら、Nucleic Acids Res., 21: 1213-1217 (1993)などを参照。ホスホルアミダイト法は、オリゴヌクレオチド合成のための液相化学においても広く用いられている。さらに、デオキシリボヌクレオシドホスホルアミダイト誘導体がオリゴヌクレオチドの合成に使用されている。ビューケージ（Beaucage）ら、Tetrahedron Lett., 22: 1859-1862(1981)を参照。
多様なヌクレオシド由来のホスホルアミダイト誘導体は市販されている。3'−O−ホスホルアミダイトが最も広範に使用されているアミダイトであるが、オリゴヌクレオチドの合成においては、5'−O−および2'−O−ホスホルアミダイトを使用することができる。ワグナー（Wagner）ら、Nucleosides&Nucleotides,17:1657-1660(1997)およびバハン（Bhan）ら、Nucleosides&Nucleotides,1195-1199(1997)を参照。ヌクレオシドではないその他のホスホルアミダイトも市販されている（クルアケム（Cruachem）社、バージニア州デュレス；クロンテック（ Clontech ）社、カリフォルニア州パロアルト；グレン・リサーチ（Glen Research）社、バージニア州スターリング；ケムジーンズ（ChemGenes）社、マサチューセッツ州ウィルミントン）。
上述のホスホルアミダイトカップリング過程を行う前に、5'−O−保護ヌクレオシドの3'−OH基をホスフィチル化（phosphityled）しなければならない。さらに、通常は、ホスフィチル化に先立って、ヌクレオベース（nucleobase）部位上に存在する環外アミノ基およびその他の官能基を保護する。従来から、ヌクレオシドのホスフィチル化は、保護されたヌクレオシドをホスフィチル化反応試薬（非常に強力でアクチベーターを必要としてないクロロ−（2−シアノエトキシ）−N,N−ジイソプロピルアミノホスフィンまたはアクチベーターを必要とする2−シアノエチル−N,N,N',N'−テトライソ−プロピルホスホロジアミダイト（ビスアミダイト反応試薬）など）で処理することによって行われている。調製後、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドヌクレオシドの5'−OH基に3'−O−ホスホルアミダイトを結合させる。ホスフィチル化反応において最もよく用いられるアクチベーターは、1H−テトラゾールである。
ホスホルアミダイトカップリングおよびホスフィチル化反応において1H−テトラゾールを常用するにもかかわらず、1H−テトラゾールの使用には、特に大量合成を行う場合に根本的に問題がある。例えば、1H−テトラゾールは爆発性であることが知られている。材料安全性データシート（MSDS）に従えば、1H−テトラゾール（1H−テトラゾール、純度98％）は、吸入、摂取または皮膚を介して吸収した場合に有毒である。MSDSには、1H−テトラゾールは、融点（155℃）以上に加熱した場合には爆発の可能性があり、非常に反応性が高い爆発性金属化合物を形成することも記載されている。故に、1H−テトラゾールは、保存、使用および廃棄に際して特別な取り扱いを要する。
毒性および爆発性に加えて、1H−テトラゾールは酸性であり、5'−O−保護基を脱保護することができ、さらに、アミダイト合成のホスフィチル化工程において脱プリン化も起こし得る。クロッツ（Krotz）ら、Tetrahedron Lett.,38:3875-3878(1997)を参照。クロロ−(2−シアノエトキシ)−N,N−ジイソプロピルアミノホスフィンを使用した場合にも5'−O−保護基が偶発的に脱保護されることが問題である。近年、5'−O−DMTヌクレオシドのホスフィチル化において、ビスアミダイト反応試薬と共に、アクチベーターとしてトリメチルクロロシランが用いられているが、この反応試薬は、通常、HClが混入しており、それによって脱保護および所望しない生成物の生成が生じる。W.ダブコウスキ（Dabkowski）ら、Chem.Comm.,877(1997)を参照。本方法によるホスフィチル化の結果は、1H−テトラゾールを用いた場合のそれと同程度である。1HテトラゾールのpKa（4.9）よりも高いpKaを有する（すなわち、酸性度が低い）アクチベーター（例えば、pKaが5.2の4,5−ジシアノイミダゾールなど）が5'−O−DMTチミジンのホスフィチル化に用いられている。C.ヴァーギース（Vargeese）、Nucleic Acids Res.,26:1046-1050(1998)を参照。
1H−テトラゾールを使用することにおける別の難点は、反応試薬の価格である。2003年版のアルドリッヒ・ケミカル（ Aldrich Chemical ）社のカタログでは、1H−テトラゾールは1gあたり7ドル以上である。さらに、1H−テトラゾールが爆発性であることから、アセトニトリル中の希釈溶液としてしか掲載されていない。本反応試薬は、反応混合物中に存在するヌクレオシドの化学量論的量より過量に使用することから、特に大量合成の場合には、相当なコストがかかる。
ホスホルアミダイト、オリゴヌクレオチドおよびそれらのアナログの大量合成においては、1H−テトラゾールの溶解性も問題である。アセトニトリルへの1H−テトラゾールの溶解度は約0.5Mである。この溶解性の低さがホスフィチル化反応を行うのに必要な溶媒量を制限する因子である。反応に使用する溶媒量を最小限に抑えることを目的として、溶解性が高いアクチベーターを用いることが好ましく、それによってコストと廃棄物の生成が抑えられる。さらに、オリゴヌクレオチド合成用に通常使用される1H−テトラゾールは、室温が20℃以下に下がると1H−テトラゾールが沈殿する。1H−テトラゾールが偶発的に沈殿すると、自動合成装置上のラインが詰まり、合成が失敗する。
1H−テトラゾールの使用に伴う問題点に対処するために、ホスホルアミダイトカップリングに使用するいくつかのアクチベーターが報告されている。5−エチルチオ−1H−テトラゾール（ウィンコット（Wincott）,F.ら、Nucleic Acids Res.,23:2677(1995)）および5−（4−ニトロフェニル）−1H−テトラゾール（ポン（Pon）,R.T.、Tetrahedron Lett.,28:3643(1987)）が立体的に窮屈なリボヌクレオシドモノマーのカップリング（例えば、RNA合成など）に用いられている。これらのアクチベーターのpKaは、それぞれ、4.28および3.7である（エタノール：水＝1：1）。モノマーのカップリングのアクチベーターとしてピリジンヒドロクロリド／イミダゾール（pKa 5.23（水））を使用することが、ダイマーの合成において示されている（グリアズノフ（Gryaznov）,S.M.、レシンガー（Letsinger）,L.M.、Nucleic Acids Res.,20:1879(1992)）。ベンズイミダゾリウムトリフラート（pKa 4.5（エタノール：水＝1：1））は、かさ高いまたは立体的に窮屈なリン保護基（アリールオキシ基など）を有するオリゴヌクレオチドの合成用のアクチベーターとして使用されている（ハヤカワ（Hayakawa）ら、J.Org.Chem.,61:7996-7997(1996)）。イミダゾリウムトリフラート（pKa 6.9（水））の使用については、溶液中でのダイマーの合成において示されている（ハヤカワ（Hayakawa）Y.、カタオカ（Kataoka）,M.、「核酸および関連巨大分子：合成、構造、機能および用途（Nucleic Acids and Related Macromolecules:Synthesis,Structure,Function and Applications）」、1997年9月4〜9日、ドイツ国ウルム）。ヌクレオシドホスホルアミダイトおよびホスホロチオエートを含むいくつかの2'−修飾オリゴヌクレオチドの合成用のアクチベーターとして、4,5−ジシアノイミダゾールを使用することについても報告されている。
臨床面の要求から、オリゴヌクレオチドおよびそれらのアナログ類の合成は、以前よりも大きな規模で行われている。クルック（Crooke）ら、BioTechnology and Genetic Engineering Reviews,15:121-157(1998) を参照。現在使用されている1H−テトラゾールなどよりも危険性が少なく、酸性度が弱く、安価なホスホルアミダイドアクチベーターが希求されている。本発明は本点ならびにその他の重要な部分に焦点を当てている。
本発明に従うアクチベーター
本発明に従うアクチベーター化合物は、オリゴヌクレオチド合成において用いられるホスホルアミダイトの活性化に対して優れた特性を有する。一般的に、アクチベーター化合物は、1H−テトラゾールよりも爆発性が低く、アセトニトリルへの溶解性が高い。さらに、本発明に従うアクチベーター化合物は、デカマーRNA分子の合成に要する反応時間が1H−テトラゾールよりも短い。実施例１を参照。ある実施態様においては、本発明に従うアクチベーター化合物は電子吸引基を有しており、化合物のpKaを低下させている。より酸性のアクチベーター化合物は、特定の場合において、ホスホルアミダイトカップリング反応の速度を速めることができる。重要なことは、反応時間の短縮によって副作用発生の機会が抑えられ、それにより、所望する生成物がより高純度で得られる。さらに、本発明に従うアクチベーター化合物は、遊離複素環式化合物、または、アクチベーターとそれに対応するモノアルキル、ジアルキルもしくはトリアルキルアンモニウム塩との混合物（塩のアクチベーターに対するモル比は多様）である。本発明に従う好ましいアクチベーター化合物については、図１、２および３に示している。
本発明をひとつの側面から見ると、構造式Iで表される化合物に関し：
ここで、Xは、C(R6)またはNであり；
R1、R2、R3およびR6は、それぞれ別異に、H、−NO2、−CN、−CF3、−SO2R8、−SR8、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、アルコキシル、−OR7、−N(R7)2、−N(R7)C(O)R8、−C(O)R7または−CO2R8を表し；あるいは、R1およびR2、またはR2およびR3は、O、NおよびSより成る群から選択される0〜4個のヘテロ原子を有する4〜8員の環構造を形成し；
R4は、空位、または、ぞれぞれ別異に、−(C(R9)2)nCH3・Yを表し；
R5は、Hまたは−(C(R9)2)nCH3であり；
R7は、それぞれ別異に、H、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し；
R8は、それぞれ別異に、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し；
R9は、それぞれ別異に、Hまたはアルキルを表し；
nは、それぞれ別異に0〜15を表し；さらに、
Yは、それぞれ別異に、ハロゲンまたはR8CO2 -を表す。
ある実施態様においては、本発明は、上記化合物に関し、ここで、XはC(R6)である。
ある実施態様においては、本発明は、上記化合物に関し、ここで、XはNである。
ある実施態様においては、本発明は、上記化合物に関し、ここで、XはC(R6)であり；R1、R2、R3およびR6は、それぞれ別異に、H、−NO2または−CNを表し；R4は空位であり；さらに、R5はHである。
ある実施態様においては、本発明は、上記化合物に関し、ここで、XはC(R6)であり；R1、R2、R3およびR6はHであり；R4は空位であり；さらに、R5はHである。
ある実施態様においては、本発明は、上記化合物に関し、ここで、XはNであり；R1、R2、R3およびR6は、Hであり；R4は空位であり；さらに、R5はHである。
本発明を別の側面から見ると、下記の構造式IIで表される化合物に関し：
ここで、R1 およびR3は、それぞれ別異に、H、−NO2、−CN、−CF3、−SO2R6、−SR6、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、−N(R5)C(O)R6、−C(O)R5または−CO2R6を表し；
R2は、空位、または、それぞれ別異に−(C(R7)2)nCH3・Yを表し；
R4は、Hまたは−(C(R7)2)nCH3を表し；
R5は、それぞれ別異に、H、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し；
R6は、それぞれ別異に、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し；
R7は、それぞれ別異に、Hまたはアルキルを表し；
nは、それぞれ別異に0〜15を表し；さらに、
Yは、それぞれ別異に、ハロゲンまたはR6CO2 -を表す。
ある実施態様においては、本発明は、上記化合物に関し、ここで、R1およびR3は、それぞれ別異に、H、−NO2または−CNを表し；R2は空位であり；さらに、R4はHである。
ある実施態様においては、本発明は、上記化合物に関し、ここで、R1はHであり；R3は−NO2であり；R2は空位であり；さらに、R4はHである。
本発明を別の側面から見ると、下記の構造式IIIで表される化合物に関し：
ここで、R1 およびR2は、それぞれ別異に、H、−NO2、−CN、−CF3、−SO2R6、−SR6、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、−N(R5)C(O)R6、−C(O)R5または−CO2R6を表し；
R3は、空位、または、それぞれ別異に−(C(R7)2)nCH3・Yを表し；
R4は、Hまたは−(C(R7)2)nCH3を表し；
R5は、それぞれ別異に、H、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し；
R6は、それぞれ別異に、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し；
R7は、それぞれ別異に、Hまたはアルキルを表し；
nは、それぞれ別異に0〜15を表し；さらに、
Yは、それぞれ別異に、ハロゲンまたはR6CO2 -を表す。
ある実施態様においては、本発明は、上記化合物に関し、ここで、R1およびR2は、それぞれ別異に、H、−NO2または−CNであり；R3は空位であり；さらに、R4はHである。
ある実施態様においては、本発明は、上記化合物に関し、ここで、R1はHであり；R2は−NO2であり；R3は空位であり；さらに、R4はHである。
本発明を別の側面から見ると、下記の構造式IVで表される化合物に関し：
ここで、R1 は、H、−SR5、アルキル、アリール、−N(R4)2、−（C(R4)2)mCO2R5、−NO2、−CN、−CF3、−SO2R5、ハロゲン、アルケニル、アルキニル、アラルキル、−N(R4)C(O)R5、−C(O)R4または−CO2R5あり；
R2は、空位、または、それぞれ別異に−(C(R7)2)nCH3・Yを表し；
R3は、Hまたは−(C(R6)2)nCH3を表し；
R4は、それぞれ別異に、H、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し；
R5は、それぞれ別異に、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し；
R6は、それぞれ別異に、Hまたはアルキルを表し；
nは、それぞれ別異に0〜15を表し；
ｍは、1、2、3、4、5、6、7または8であり；さらに、
Yは、それぞれ別異に、ハロゲンまたはR5CO2 -を表す。
ある実施態様においては、本発明は、上記化合物に関し、ここで、R1は、−SR5、アルキル、アリール、−N(R4)2または−（C(R4)2)mCO2R5である。
ある実施態様においては、本発明は、上記化合物に関し、ここで、R2は空位であり；R3はHである。
ある実施態様においては、本発明は、上記化合物に関し、ここで、R1は、−SR5、アルキル、アリール、−N(R4)2または−（C(R4)2)mCO2R5であり；R2は空位であり；R3はHであり；R4はHであり；R5は、アルキルまたはアラルキルであり；さらに、ｍは１である。
本発明を別の側面から見ると、下記の構造式Vで表される化合物に関し：
ここで、R1 、R３およびR4は、それぞれ別異に、H、−NO2、−CN、−CF3、−SO2R7、−SR7、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、−N(R6)C(O)R5、−C(O)R6または−CO2R7を表し；
R2は、空位、または、それぞれ別異に−(C(R8)2)nCH3・Yを表し；
R5は、Hまたは−(C(R8)2)nCH3を表し；
R6は、それぞれ別異に、H、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し；
R7は、それぞれ別異に、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し；
R8は、それぞれ別異に、Hまたはアルキルを表し；
nは、それぞれ別異に0〜15を表し；さらに、
Yは、それぞれ別異に、ハロゲンまたはR7CO2 -を表す。
ある実施態様においては、本発明は、上記化合物に関し、ここで、R2は空位であり；；さらに、R5はHである。
ある実施態様においては、本発明は、上記化合物に関し、ここで、R1はHであり；R2は空位であり；R3およびR4は−CNであり；さらに、R5はHである。
本発明を別の側面から見ると、ホスファイト化合物を生成する方法に関し、該方法は次のような工程を含み：
ホスホルアミダイト、アルコールおよび活性化剤を混合してホスファイト化合物を生成させるが、ここで、該活性化剤は、以下のような化合物より成る群から選択され：
ここで、Xは、C(R6)またはNであり；
R1、R2、R3およびR6は、それぞれ別異に、H、−NO2、−CN、−CF3、−SO2R8、−SR8、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、アルコキシル、−OR7、−N(R7)2、−N(R7)C(O)R8、−C(O)R7または−CO2R8を表し；あるいは、R1およびR6、R1およびR2、または、R2およびR3は、O、NおよびSより成る群から選択される0〜4個のヘテロ原子を有する4〜8員の環構造を形成し；
R4は、空位、または、ぞれぞれ別異に、−(C(R9)2)nCH3・Yを表し；
R5は、Hまたは−(C(R9)2)nCH3であり；
R7は、それぞれ別異に、H、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し；
R8は、それぞれ別異に、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し；
R9は、それぞれ別異に、Hまたはアルキルを表し；
nは、それぞれ別異に0〜15を表し；さらに、
Yは、それぞれ別異に、ハロゲンまたはR8CO2 -を表し；
ここで、R1 およびR3は、それぞれ別異に、H、−NO2、−CN、−CF3、−SO2R6、−SR6、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、−N(R5)C(O)R6、−C(O)R5または−CO2R6を表し；
R2は、空位、または、それぞれ別異に−(C(R7)2)nCH3・Yを表し；
R4は、Hまたは−(C(R7)2)nCH3を表し；
R5は、それぞれ別異に、H、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し；
R6は、それぞれ別異に、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し；
R7は、それぞれ別異に、Hまたはアルキルを表し；
nは、それぞれ別異に0〜15を表し；さらに、
Yは、それぞれ別異に、ハロゲンまたはR6CO2 -を表し；
ここで、R1 およびR2は、それぞれ別異に、H、−NO2、−CN、−CF3、−SO2R6、−SR6、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、−N(R5)C(O)R6、−C(O)R5または−CO2R6を表し；
R3は、空位、または、それぞれ別異に−(C(R7)2)nCH3・Yを表し；
R4は、Hまたは−(C(R7)2)nCH3を表し；
R5は、それぞれ別異に、H、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し；
R6は、それぞれ別異に、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し；
R7は、それぞれ別異に、Hまたはアルキルを表し；
nは、それぞれ別異に0〜15を表し；さらに、
Yは、それぞれ別異に、ハロゲンまたはR6CO2 -を表し；
ここで、R1 は、H、−SR5、アルキル、アリール、−N(R4)2、−（C(R4)2)mCO2R5、−NO2、−CN、−CF3、−SO2R5、ハロゲン、アルケニル、アルキニル、アラルキル、−N(R4)C(O)R5、−C(O)R4または−CO2R5を表し；
R2は、空位、または、それぞれ別異に−(C(R6)2)nCH3・Yを表し；
R3は、Hまたは−(C(R6)2)nCH3を表し；
R4は、それぞれ別異に、H、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し；
R5は、それぞれ別異に、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し；
R6は、それぞれ別異に、Hまたはアルキルを表し；
nは、それぞれ別異に0〜15を表し；
ｍは、1、2、3、4、5、6、7または8であり；さらに、
Yは、それぞれ別異に、ハロゲンまたはR5CO2 -を表し；
ここで、R1 、R３およびR4は、それぞれ別異に、H、−NO2、−CN、−CF3、−SO2R7、−SR7、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、−N(R6)C(O)R5、−C(O)R6または−CO2R7を表し；
R2は、空位、または、それぞれ別異に−(C(R8)2)nCH3・Yを表し；
R5は、Hまたは−(C(R8)2)nCH3を表し；
R6は、それぞれ別異に、H、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し；
R7は、それぞれ別異に、アルキル、アリールまたはアラルキルを表し；
R8は、それぞれ別異に、Hまたはアルキルを表し；
nは、それぞれ別異に0〜15を表し；さらに、
Yは、それぞれ別異に、ハロゲンまたはR7CO2 -を表す。
ある実施態様においては、本発明は、上述の方法に関し、ここで、前記ホスホルアミダイトは、3'−ヌクレオシドホスホルアミダイト、3'−ヌクレオチドホスホルアミダイト、または3'−オリゴヌクレオチドホスホルアミダイトである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記ホスホルアミダイトは次のような構造式Aによって表され：
ここで、R1は、アルキル、アリール、アラルキルまたは−Si(R5)3であり；このとき、該アルキル、アリールおよびアラルキル基は、−CN、−NO2、−CF3、ハロゲン、−O2CR5または−OSO2R5で必要に応じて置換されており；
R2は、任意に置換されたアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アラルキルまたはアルケニルであり；
R3およびR4は、それぞれ別異に、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはアラルキルを表し；あるいは、R3およびR4は、共に3〜8員の環構造を形成し；さらに、
R5は、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはアラルキルである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R1は、−CH2CH2CNである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R2は、必要に応じて置換されたヘテロシクロアルキルである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R2は、必要に応じて置換されたリボースである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R2は、必要に応じて置換されたデオキシリボースである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R2は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R3およびR4は、アルキルである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記アルコールは、必要に応じて置換されたリボースである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記アルコールは、必要に応じて置換されたデオキシリボースである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記アルコールは、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記アルコールはR5−OHで表され、ここで、R5は、必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アラルキル、アルケニル、または−(C(R6)2)pヘテロシクロアルキルであり；R6は、Hまたはアルキルであり；さらに、ｐは1、2、3、4、5、6、7または8である。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R5は−(C(R6)2)pヘテロシクロアルキルである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、さらに、前記ホスホルアミダイト、前記アルコールおよび前記活性化剤を含む混合物に、プロトンシャトル（proton-shuttle）化合物を混合する過程を追有し、ここで、該プロトンシャトル化合物のpKaは、前記活性化剤のそれよりも大きく、かつ、該プロトンシャトル化合物のpKaは、前記ホスホルアミダイトのそれよりも小さい。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記プロトンシャトル化合物は、一級、二級または三級アミンである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記プロトンシャトル化合物は、N(R7)(R8)(R9)で表され、ここで、R7、R8およびR9は、それぞれ別異に、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アルケニルを表し；あるいは、R7およびR8は、共に3〜8員の環構造を形成し；さらに、R9は、H、アルキル、シクロアルキル、アリールまたはアラルキルである。
硫黄転移反応試薬
修飾オリゴヌクレオチドは、分子生物学的研究および抗ウイルス治療などのような用途において非常に重要である。RNAの翻訳を阻止し、ヌクレアーゼ耐性である修飾オリゴヌクレオチドは、アンチセンス反応試薬として有用である。ホスホロチオエート（P=S）結合を有する硫化オリゴヌクレオチドがこの領域の注目の的である。ホスホロチオエート含有オリゴヌクレオチドは、核酸を認識するある種の酵素の立体化学的経路の決定においても有用である。
含リン化合物の硫化に用いられる標準的な技術を適用して硫化デオキシリボヌクレオチドが合成されている。従来から使用されている硫化反応試薬の例としては、硫黄原子、ジベンゾイルテトラスルフィド、3−H−1,2−ベンジジチオール−3−オン、1,1−ジオキシド（ビューケージ反応試薬（Beaucage reagent）としても知られている）、テトラエチルチウラムジスルフィド（TETD）およびビス（O,O−ジイソプロポキシホスフィノチオイル）ジスルフィド（ステック反応試薬（Stec reagent）としても知られている）などが挙げられる。しかしながら、既知の硫化反応試薬の大多数は、ひとつもしくはそれ以上の重大な欠点がある。
イオウ原子は、ほとんどの有機溶媒に不溶であることから、問題を呈し、自動化には不適である。さらに、硫黄の好ましい供給源である二硫化炭素は、所望しない爆発性を有し、かつ、引火点が低い。ジベンゾイルテトラスルフィドを用いた場合には、所望しない副生成物の生成がよく観察される。ビューケージ反応試薬は、比較的効率的な硫化反応試薬であるが、合成が難しく、安定性に欠ける。さらに、ビューケージ反応試薬を使用することにより、二次反応生成物が生成し、これは強力な酸化剤である。R.P.イーヤー（Iyer）ら、J.Am.Chem.Soc.,112:1253-1254(1990)およびR.P.イーヤー（Iyer）ら、J.Org.Chem.,4693-4699(1990)を参照。このことにより、所望する反応生成物との分離が困難になるような副生成物が生成する。比較的安価で安定なテトラエチルチウラムジスルフィドは、問題にならないほど硫化反応速度が遅い。
ホスファイトエステルにアシルジスルフィドを反応させることによりホスホロチオエートエステルを生成する方法は、オランダ国特許出願第8902521号に開示されている。開示されている方法は、液相化学を用い、精製ホスホトリエステルダイマーに対して適用している。この方法は、時間および労力を要し、複雑な様式の作業が示されているのみである。そのような様式とは、アセトニトリル中で合成の第一段階（ホスファイトの生成）を行い、アセトニトリルを除去し、中間体であるホスホトリエステルを精製し、さらに、ジクロロエタン（DCE）および2,4,6−コリジンの溶媒混合物中で硫化を行う。さらに、この方法は、ジヌクレオチドの場合においてのみ示されている。オランダ国特許記載の方法は、より大きな核酸構造に応用できること、合成の全工程を通して、共通の溶媒を使用できること、収率が向上すること、または、自動化様式の大幅な変更を行うことなく、従来から使用されている自動合成に適用できることに関して何ら示唆されていない。アセトニトリルは、使用可能な数種の溶媒のうちのひとつとして挙げられているが、共通溶媒としてアセトニトリルを用いて合成の全工程を行うための方法については示されていない。その他の文献（カマー（Kamer）ら、Tetrahedron Lett.,30(48):6757-6760(1989)およびロエレン（Roelen）ら、Rech.Trav.Chim.,Pays-Bas,110:325-331(1991)）においては、ヌクレオチド数が6までのオリゴマーの硫化が示されているが、これらの参考文献中に開示されている方法では、上述の欠点は克服されていない。
チオアンヒドリド誘導体であるEDITH（3−エトキシ−1,2,4−ジチアゾリジン−5−オン）は、米国特許第5,852,168号に記載されている。該特許において、発明者らは、予測に反して、この反応試薬は、2'−置換RNAおよびキメラRNAの合成に使用できることを確認した。重要な点は、これらの反応条件が塩基性であっても、RNAの2'−置換基の排除またはその他のRNA分解を起こさないことである。
最後に、PADS（フェニルアセチルジスルフィド）は、米国特許第6,242,591号および第6,114,519号に開示されている。これらの特許は、デオキシ核酸にアセチルジスルフィドを十分な時間接触させ、ホスホロチオエート官能基を形成させることによる硫化法を開示している。しかしながら、これらの特許は、本明細書において示しているようなRNA（2'−置換RNAおよびキメラRNAを含む）合成反応などの例を示していない。さらに、これらの反応条件は塩基性であるにもかかわらず、RNAの2'−置換基の排除またはその他のRNA分解を起こさない。
故に、オリゴヌクレオチドおよびその他の有機化合物中において、ホスホロチオエート結合などの含硫ホスホラス基を調製するための改良法および反応試薬が希求されている。本発明は、硫黄転移反応試薬およびホスホロチオエートの形成法に関する。本方法は、複雑な溶媒混合物、繰り返し洗浄または溶媒交換の必要無しにオリゴヌクレオチドまたはその誘導体中にホスホロチオエート結合を形成することに使用できる。
本発明に従う好ましい硫黄転移反応試薬の例については、図４、５および５０に示している。
本発明をひとつの側面から見ると、次の構造式Dで表される化合物に関し：
ここで、Xは、それぞれ別異に、C(O)、C(S)、SO2、CO2、CS2またはSOを表し；
R1 およびR2は、それぞれ別異に、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキルまたは−N(R3)R4を表し、あるいは、R1 およびR2は共に、必要に応じて置換された芳香環を形成し；
R3は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルであり；
R4は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルであり；
nは、2、3または4であり；さらに、
XがC(O)のとき、R1はベンジルではない。
ある実施態様においては、本発明は上記化合物に関し、ここで、nは2である。
ある実施態様においては、本発明は上記化合物に関し、ここで、R1 およびR2は、フェニル、ベンジル、シクロヘキシル、ピロール、ピリジンまたは−CH2−ピリジンである。
ある実施態様においては、本発明は上記化合物に関し、ここで、XはC(O)であり、R1 はフェニルであり、さらに、R2はフェニルである。
ある実施態様においては、本発明は上記化合物に関し、ここで、XはSO2であり、R1 はフェニルであり、さらに、R2はフェニルである。
ある実施態様においては、本発明は上記化合物に関し、ここで、XはC(O)であり、R1 はピロールであり、さらに、R３はピロールである。
ある実施態様においては、本発明は上記化合物に関し、ここで、XはC(O)であり、さらに、R1 およびR2は共にフェニル環を形成する。
本発明を別の側面から見ると、下記の構造式D1で表される化合物に関し：
ここで、Xは、CN、P(OR2)2、P(O)(OR2)2、C(O)R1、C(S)R1、SO2R1、CO2R1、CS2R1、またはSOR1であり；
Yは、CN、P(OR2)2またはP(O)(OR2)2であり；
R1 は、それぞれ別異に、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキルまたは−N(R3)R4を表し；
R2は、それぞれ別異に、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、アルカリ金属または遷移金属を表し、あるいは、R2が2個ある場合には、全体の電荷が+2であるようなアルカリ土類金属または遷移金属を共に形成し；
R3は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルであり；
R4は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルであり；さらに、
nは、2、3または4である。
ある実施態様においては、本発明は上記化合物に関し、ここで、nは2である。
ある実施態様においては、本発明は上記化合物に関し、ここで、YはCNである。
ある実施態様においては、本発明は上記化合物に関し、ここで、YはP(OR2)2である。
本発明を別の側面から見ると、下記の構造式Eで表される化合物に関し：
ここで、Xは、OまたはSであり；
R1 は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルであり；
R2 は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、C(O)N(R3)R4、C(S)N(R3)R4、C(S)N(R3)2、C(S)OR4 、CO2R4、C(O)R4または−C(S)R4であり；
R3 は、Hまたはアルキルであり；さらに、
R4 は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルである。
ある実施態様においては、本発明は上記化合物に関し、ここで、XはOである。
ある実施態様においては、本発明は上記化合物に関し、ここで、R2 は、H、アルキルまたはシクロアルキルである。
ある実施態様においては、本発明は上記化合物に関し、ここで、R2 は、アリールまたはアラルキルである。
ある実施態様においては、本発明は上記化合物に関し、ここで、R2 は、−C(O)N(R3)R4、−C(S)N(R3)R4、−C(S)N(R3)2、−C(S)OR4 、−CO2R4、−C(O)R4または−C(S)R4である。
ある実施態様においては、本発明は上記化合物に関し、ここで、R3はHである。
ある実施態様においては、本発明は上記化合物に関し、ここで、R4は、アルキルまたはアリールである。
ある実施態様においては、本発明は上記化合物に関し、ここで、XはOであり、さらに、R2 はHである。
本発明を別の側面から見ると、以下の工程を含む過程によって形成される化合物に関し：
アルゴン雰囲気下、氷槽中で約0℃に冷却した容器内で、約1当量のクロロカルボニルスルフェニルクロリド、約1当量のチオ尿素、および約1当量のトリエチルアミンを混合し、得られた混合物を約6時間混合した後、該混合物をろ過し、濃縮して残渣を得、さらに、ジクロロメタン−ヘキサンから該残渣を再結晶させて化合物を得る。
本発明を別の側面から見ると、以下の工程を含むホスホロチオエート化合物の調製法に関し：
ホスファイトおよび硫黄転移反応試薬を混合してホスホロチオエートを生成させるが、ここで、該硫黄転移反応試薬は、MoS4・Et3NCH2Ph、
ここで、Xは、それぞれ別異に、C(O)、C(S)、SO2、CO2、CS2またはSOを表し；
R1 およびR2は、それぞれ別異に、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキルまたは−N(R3)R4を表し、あるいは、R1 およびR2は共に、必要に応じて置換された芳香環を形成し；
R3は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルを表し；
R4は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルを表し；
nは、2、3または4であり；さらに、
XがC(O)のとき、R1はベンジルではなく；
ここで、Xは、CN、P(OR2)2、P(O)(OR2)2、C(O)R1、C(S)R1、SO2R1、CO2R1、CS2R1またはSOR1であり；
Yは、CN、P(OR2)2またはP(O)(OR2)2であり；
R1 は、それぞれ別異に、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキルまたは−N(R3)R4を表し；
R2は、それぞれ別異に、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、アルカリ金属または遷移金属を表し、あるいは、R2が2個ある場合には、全体の電荷が+2であるようなアルカリ土類金属または遷移金属を共に形成し；
R3は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルであり；
R4は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルであり；さらに、
nは、2、3または4であり；さらに、
ここで、Xは、OまたはSであり；
R1 は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルであり；
R2 は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、−C(O)N(R3)R4、−C(S)N(R3)R4、−C(S)N(R3)2、−C(S)OR4 、−CO2R4、−C(O)R4または−C(S)R4であり；
R3 は、Hまたはアルキルであり；さらに、
R4 は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルである、
より成る群から選択される。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記ホスファイトは下記の構造式Fで表され：
ここで、R1は、アルキル、アリール、アラルキルまたは−Si(R4)3であり；ここで、該アルキル、アリールおよびアラルキル基は、−CN、−NO2、−CF3、ハロゲン、−O2CR5または−OSO2R4で必要に応じて置換されており；
R2は、必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アラルキルまたはアルケニルであり；
R3は、必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アラルキル、アルケニルまたは−(CR5 )2)p−ヘテロシクロアルキルであり；
R4は、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはアラルキルであり；
R5は、Hまたはアルキルであり；さらに、
pは、1、2、3、4、5、6、7または8である。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R1は−CH2CH2CNである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R2は、必要に応じて置換されたヘテロシクロアルキルである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R2は、必要に応じて置換されたリボースである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R2は、必要に応じて置換されたデオキシリボースである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R2は、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R2は、
であり、このとき、R'1は、それぞれ別異に、アルキル、アリール、アラルキルまたは−Si(R4)3であり；ここで、該アルキル、アリールおよびアラルキル基は、−CN、−NO2、−CF3、またはハロゲンで必要に応じて置換されており；さらに、n1は1〜50である。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、n1は1〜25である。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、n1は1〜15である。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、n1は1〜10である。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、n1は1〜5である。
アクリロニトリル停止剤
オリゴヌクレオチド合成における一般的なホスフェート保護基はエチルニトリルである。この保護基の利点のひとつは、塩基を用いて保護されたホスフェートを処理することにより、容易に除去できる点である。転換の全体を以下に図示する：
しかしながら、脱保護反応によって生成したアクリロニトリルは、良好な親電子基であり、所望するヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド生成物上の求核性官能基と反応することができる。この副反応によって所望する生成物の収量が低下し、除去が困難な不純物が生成する。故に、脱保護反応中に生成するアクリロニトリルと選択的に反応するような反応試薬が希求されている。脱保護反応中にアクリルニトリル捕捉剤として作用する化合物の代表例としては、ポリマー結合チオール類、炭素原子数が少なくとも10以上のアルカンチオール、ヘテロアリールチオール、アルカンチオールのナトリウム塩、および、においが感じられない程度に十分に揮発性が低いチオール類（例えば、分子量が大きいチオール類など）などが挙げられる。
無臭チオール類については、K.ニシデ（Nishide）およびM.ノデ（Node）、によって報告されている（Green Chem.,6:142(2004)）。無臭チオールの例としては、ドデカンチオール、4−n−ヘプチルフェニルメタンチオール、4−トリメチルシリルフェニルメタンチオールおよび4−トリメチルシリルベンゼンチオールなどが挙げられる。さらなる例については、「無臭チオール類およびスルフィド類の開発ならびに有機合成への応用（Development of Odorless Thiols and Sulfides and Their Applications to Organic Synthesis）」を参照（ニシデ，キヨハル（Nishide,Kiyoharu）、オオスギ，シンイチ（Ohsugi, Shin-ichi）、ミヤモト，テツオ（Miyamoto,Tetsuo）、クマー，カマル（Kumar,Kamal）、ノデ，マナブ（Node,Manabu）（京都大学薬学部（日本国京都市山科区御陵））、Monatshefte fuer Chemie,135(2):189-200(2004)）。ごくわずかににおいがあるベンゼンチオールおよびベンジルメルカプタン誘導体については、ニシデ（Nishide）および共同研究者らによって既に記載されている。代表例としては、次のようなものが挙げられる：4−RC6H4X、3−RC6H4Xおよび2−RC6H4X（R＝Me3Si、Et3SiまたはPr3Si；X=SHまたはCH2SH）。ニシデ，キヨハル（Nishide,Kiyoharu）、ミヤモト，テツオ（Miyamoto,Tetsuo）、クマー，カマル（Kumar,Kamal）、オオスギ，シンイチ（Ohsugi, Shin-ichi）、ノデ，マナブ（Node,Manabu）（京都大学薬学部（日本国京都市山科区御陵））、「微臭のベンゼンチオールおよびベンジルメルカプタンの合成等価物：トリアルキルシリル基の脱臭効果（Synthetic Equivalents of Benzenethiol and Benzyl Mercaptan Having Faint Smell:Odor Reducing Effect of Trialkylsilyl Group）」、Tetrahedron Lett.,43(47):8569-8573(2002)を参照。無臭1−ドデカンチオールおよびp−ヘプチルフェニルメタンチオールに関するノデ（Node）および共同研究者らの記述を参照（ノデ，マナブ（Node,Manabu）、クマー，カマル（Kumar,Kamal）、ニシデ，キヨハル（Nishide,Kiyoharu）、オオスギ，シンイチ（Ohsugi, Shin-ichi）、ミヤモト，テツオ（Miyamoto,Tetsuo）、（京都大学薬学部（日本国京都市山科区御陵））、「悪臭チオール類に対する無臭置換：合成および用途（Odorless substitutes for foul-smelling thiols:synthesis and applications）」、Tetrahedron Lett.,42(52):9207-9210(2001））。
アクリロニトリル停止剤の代表例は図８に示す。
本発明をひとつの側面から見ると、 以下の工程を含む、エチルシアニド保護基の除去法に関し：
アクリロニトリル捕捉剤の存在下、エチルシアニド基を有するホスフェート化合物を塩基と混合するが、このとき、該アクリロニトリル捕捉剤は、ポリマー結合チオール、4−n−ヘプチルフェニルメタンチオール、炭素原子数が少なくとも10以上であるアルカンチオール、ヘテロアリールチオール、アルキルチオールのナトリウム塩、
であり、
ここで、R1はアルキルであり；R2は、−SHまたは−CH2SHである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記アクリロニトリル捕捉剤は、
である。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記ホスフェート化合物はオリゴヌクレオチドである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記ホスフェート化合物は、少なくとも1個のホスホロチオエート基を有するオリゴヌクレオチドである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記ホスフェート化合物は、リボヌクレオチドのオリゴマーである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記ホスフェートは次の構造式Gで表され：
ここで、R1は、必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アラルキルまたはアルケニルであり；
R2は、必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アラルキル、アルケニルまたは−(C(R3 )2)p−ヘテロシクロアルキルであり；
R3は、Hまたはアルキルであり；さらに、
pは、1、2、3、4、5、6、7または8である。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R1は、必要に応じて置換されたヘテロシクロアルキルである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R1は、必要に応じて置換されたリボースである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R1は、必要に応じて置換されたデオキシリボースである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R1は、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R1は、
であり、このとき、R'1は、それぞれ別異に、アルキル、アリール、アラルキルまたは−Si(R4)3であり；ここで、該アルキル、アリールおよびアラルキル基は、−CN、−NO2、−CF3、またはハロゲンで必要に応じて置換されており；R4は、アルキル、アリールまたはアラルキルであり；さらに、n1は1〜50である。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、n1は1〜25である。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、n1は1〜15である。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、n1は1〜10である。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、n1は1〜5である。
P=S結合を保持するための方法
ホスホロチオエートヌクレオチドのP=S結合は酸化剤に弱く、P=S結合がP=O結合に転換してしまう。本発明をひとつの側面から見ると、P=S結合の所望しない酸化を防ぐ方法に関する。P=S結合を所望しない酸化から守るためのひとつの方法は、ホスホロチオエート基のP=S結合よりも酸化されやすい化合物をホスホロチオエート含有ヌクレオチドと混合することである。ホスホロチオエート基のP=S結合よりも酸化されやすい化合物の例としては、2−ヒドロキシエタンチオール、EDTA、ビタミンE、無臭チオール類を含むチオール類、およびビタミンCなどが挙げられる。その他の化合物についても、当業者であれば、抗酸化剤に対してホスホロチオエート基のP=S結合の酸化され易さを比較することによって容易に確認できる。抗酸化剤は、ホスホロチオエート基のP=S結合よりも酸化され易くなければならない。
P=O結合を形成するための酸化剤
上述したように、ホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドは、治療剤として有望である。ある例においては、ホスフェート結合およびホスホロチオエート結合を併せ持つオリゴヌクレオチドを調製することが有利である。ホスフェート結合およびホスホロチオエート結合を併せ持つオリゴヌクレオチドを調製するためのひとつの方法としては、第一のオリゴヌクレオチドを第二のオリゴヌクレオチドに結合させるが、このとき、第一のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート基を介して連結されたヌクレオシドを有し、第二のオリゴヌクレオチドは、ホスファイト基を介して連結されたヌクレオシドを有する。次に、ホスファイト基を酸化してホスフェート結合にする。別の方法としては、ホスホルアミド法を用い、第一のオリゴヌクレオチドに順にオリゴヌクレオチドを結合させていくことができる。次に、ホスファイト基を介して連結された新規に加えられたヌクレオシドを酸化することにより、ホスファイト結合をホスフェート結合に転換する。ホスファイトをホスフェートに転換する際に最もよく用いられる酸化剤のひとつは、I2／アミンである。I2／アミン反応試薬は非常に強力な酸化剤であり、その結果、ホスホロチオエート基も酸化されてホスフェート基になる。従って、ホスファイトをホスフェートに酸化するが、ホスホロチオエート基は酸化しないような緩和な酸化剤が必要である。ホスファイトをホスフェートに酸化するが、ホスホロチオエート基は酸化しないような酸化剤の例としては、NaClO2、クロロアミンおよびピリジン−N−オキシドの３つが挙げられる。本発明に使用することができるその他の酸化剤としては、CCl4、CCl4／水／アセトニトリル、CCl4／水／ピリジン、ジメチルカルボナート、または、CH2Cl2、NBSもしくはNCS中でのKNO3／TMSCl混合物、あるいは、酸化剤、非プロトン性有機溶媒、塩基および水の組み合わせなどが挙げられる。
本発明をひとつの側面から見ると、ホスファイトをホスフェートに酸化する方法に関し、次のような工程を含む：
ホスファイトを酸化剤と混合してホスフェートを生成させ、ここで、該酸化剤は、NaClO2、クロロアミン、ピリジン−N−オキシド、CCl4、CCl4／水／アセトニトリル、CCl4／水／ピリジン、ジメチルカルボナート、または、CH2Cl2、NBSもしくはNCS中でのKNO3／TMSCl混合物である。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記酸化剤は、NaClO2、クロロアミン、ピリジン−N−オキシドである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記ホスファイトは、ホスファイト基を介して結合しているヌクレオシドのオリゴマーである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記ヌクレオシドはリボヌクレオシドである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記ホスファイトは次の構造式Hで表され：
ここで、R'1は、アルキル、アリール、アラルキルまたは−Si(R4)3であり；このとき、該アルキル、アリール、およびアラルキル基は、−CN、−NO2、−CF3、ハロゲン、−O2CR5または−OSO2R4で必要に応じて置換されており；
R2は、必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アラルキルまたはアルケニルであり；
R3は、必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アラルキル、アルケニルまたは−(C(R5)2)pシクロアルキルであり；
R4は、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはアラルキルであり；
R5は、Hまたはアルキルであり；さらに、
pは、1、2、3、4、5、6、7または8である。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R1は−CH2CH2CNである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、R2は必要に応じて置換されたヘテロシクロアルキルである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R2は、必要に応じて置換されたリボースである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R2は、必要に応じて置換されたデオキシリボースである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R2は、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R2は、
であり、このとき、R'1は、それぞれ別異に、アルキル、アリール、アラルキルまたは−Si(R4)3であり；このとき、該アルキル、アリール、およびアラルキル基は、−CN、−NO2、−CF3またはハロゲンで必要に応じて置換されており；さらに、n1は、1〜50である。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、n1は1〜25である。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、n1は1〜15である。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、n1は1〜10である。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、n1は1〜5である。
保護基を脱保護／解裂させるための反応試薬
RNAは、次のような方法に基づいて合成および精製される場合が多い：テトラゾールを用いてRNAアミダイトを活性化し、NH4OHを用いて環外のアミノ保護基を除去し、n−テトラブチルアンモニウムフルオリド（TBAF）を用いて2'−OHアルキルシリル保護基を除去し、さらに、脱保護したRNAをゲル精製して分析する。RNA化合物は、化学的方法または酵素的方法を用いて合成することができる。
オリゴヌクレオチド合成におけるひとつの重要な要素は、保護基の導入と除去である。保護基の導入または除去が不完全であると、合成の全体収率が低下し、不純物が生成するが、そのような不純物は、最終生成物からの除去が非常に困難な場合が多い。大きなRNA分子（すなわち、ヌクレオチド塩基数が約20〜40）で納得のゆく収率を上げるためには、塩基のアミノ官能基の保護用にアミドまたは置換アミド保護基を要する。アミドまたは置換アミド保護基は、合成条件下に耐えうる安定なものでなければならず、かつ、合成の最後に除去できなければならない。これらの要求は、次のようなアミド保護基によって満たされる：アデノシンのためのベンゾイル基、シチジンのためのイソブチリル基もしくはベンゾイル基、ならびに、グアノシンのためのイソブチリル基。アミド保護基は、合成の最終工程において、NH3/EtOHまたは40％のMeNH2水溶液中でRNAをインキュベートすることによって除去する場合が多い。グアノシンおよびアデノシンに対するフェノキシアセチル型保護基、ならびにシチジンに対するアセチル保護基の場合には、エタノール性アンモニア溶液中、65℃で4時間インキュベートすることにより、これらの保護基を完全に除去する。しかしながら、NH3またはMeNH2の混合物を用いた脱保護法は、アンモニアおよびメチルアミンが腐食性の気体であることから、複雑である。故に、反応試薬の取り扱いは、特に工業スケールなどの大量スケールで反応を行う場合には危険である。NH3およびMeNH2は揮発性であることから、脱保護反応が完了した後に、過量のNH3およびMeNH2を捕捉し、中和するための特別な過程も必要である。故に、高収率でアミド脱保護反応を行うことができる低揮発性の反応試薬が希求されている。
本発明をひとつの側面から見ると、アミド脱保護反応を進行させることができる比較的低揮発性のアミノ化合物に関する。上述の所望される性質を有する化合物群を以下に列挙する。特別な場合においては、各化合物群の中で好ましい実施態様も列挙している。
１）ポリアミン類
本発明において使用するポリアミン化合物は、少なくとも2個のアミン官能基を有するポリマーであり、ここで、該アミン官能基は、少なくとも1個の水素原子を有する。ポリマーの分子量範囲は広い。ある実施態様においては、ポリマー化合物の分子量は約5000g／mol以上である。別の実施態様においては、ポリマーの分子量は、約10,000g／mol以上、約20,000g／mol以上または約30,000g／mol以上である。
２）PEHA
３）PEG-NH2
本発明において使用するPEG-NH2化合物は、アミン官能基を有するポリエチレングリコールポリマーであり、ここで、該アミン官能基は、少なくとも1個の水素原子を有する。ポリマーの分子量範囲は広い。ある実施態様においては、PEG-NH2化合物の分子量は約5000g／mol以上である。別の実施態様においては、PEG-NH2化合物の分子量は、約10,000g／mol以上、約20,000g／mol以上または約30,000g／mol以上である。
４）短鎖PEG-NH2（short PEG-NH2）
本発明において使用する短鎖PEG-NH2化合物は、アミン官能基を有するポリエチレングリコールポリマーであり、ここで、該アミン官能基は、少なくとも１個の水素原子を有する。ポリマーの分子量範囲は、比較的小さい。
５）シクロアルキルアミン類およびヒドロキシシクロアルキルアミン類
本発明において使用するシクロアルキルアミン類は、少なくとも1個のアミン官能基を有するシクロアルキル化合物であり、該アミン官能基は、少なくとも1個の水素原子を有する。本発明において使用するヒドロキシシクロアルキルアミン類は、少なくとも1個のアミン官能基および少なくとも1個の水酸基を有し、ここで、該アミン官能基は、少なくとも1個の水素原子を有する。代表的な例としては、以下の化合物などが挙げられる。
６）ヒドロキシアミン類
本発明において使用するヒドロキシアミン類は、少なくとも1個のアミン官能基および少なくとも1個の水酸基を有するアルキル、アリールおよびアラルキル化合物であり、ここで、該アミン官能基は、少なくとも1個の水素原子を有する。代表的な例としては、9−アミノノナノール、4−アミノフェノールおよび4−ヒドロキシベンジルアミンなどが挙げられる。
７）マイクロ波を伴う、または伴わないK2CO3/MeOH
８）システアミン（H2NCH2CH2SH）およびチオール化アミン類
９）β−アミノ−エチル−スルホン酸またはβ−アミノ−エチル−スルホン酸またはβの硫酸ナトリウム塩
本発明をひとつの側面から見ると、オリゴヌクレオチドからアミド保護基を除去する方法に関し、次のような工程を含む：
アミド保護基を有するオリゴヌクレオチドに、ポリアミン、PEHA、PEG-NH2 、短鎖PEG-NH2 、シクロアルキルアミン、ヒドロキシシクロアルキルアミン、ヒドロキシアミン、K2CO3/MeOHマイクロ波、チオアルキルアミン、チオール化アミン、β−アミノ−エチル−スルホン酸またはβ−アミノ−エチル−スルホン酸の硫酸ナトリウム塩を混合する。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、該オリゴヌクレオチドはリボヌクレオチドのオリゴマーである。
シリル基を脱保護するための反応試薬
既に記載しているように、保護基の使用は、オリゴヌクレオチド合成の重要な要素である。さらに、保護基の導入および除去は高収率で進行し、最終生成物中への不純物の混入を最小限に留めねばならない。発明者らは、オリゴヌクレオチドの合成中のシリル保護基の除去に対しては、次のような反応試薬が優れていることを見出した：ピリジン−HF、DMAP−HF、尿素−HF、アンモニア−HF、フッ化アンモニウム−HF、TAS−F、DASTおよびポリビニルピリジン−HFなど。例えば、図７および実施例５を参照。本発明において有用なその他のアリールアミン−HF反応試薬としては、下記の構造式AAで表される化合物などが挙げられ：
ここで、R1は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルであり：
R2は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルであり；
R3は、アリール、またはヘテロアリールである。
例えば、アリールアミン類のフッ化水素塩は、（ジアルキル）アリールアミン類、（アルキル）ジアリールアミン類、（アルキル）（アラルキル）アリールアミン類、（ジアラルキル）アリールアミン類、（ジアルキル）ヘテロアリールアミン類、（アルキル）ジヘテロアリールアミン類、（アルキル）（ヘテロアリール）アリールアミン類、（アルキル）（ヘテロアラルキル）アリールアミン類、（アルキル）（アラルキル）ヘテロアリールアミン類、（ジアラルキル）ヘテロアリールアミン類、（ジヘテロアラルキル）ヘテロアリールアミン類および（アラルキル）（ヘテロアラルキル）ヘテロアリールアミン類より成る群から選択される。
さらに、上述の方法は、以下の化合物より成る群から選択される化合物のフッ化水素塩を用いて実施することができ：
ここで、それぞれ別異に、Xは、O、S、NR1またはCR2であり；Yは、NまたはCRであり；Rは、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、−C(=O)−、−C(=O)X−、−OR1、−N(R1)2、−SR1または−（CH2)mR1であり；R1は、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルであり；さらに、ｍは0〜10である。
ある実施態様においては、脱保護反応の速度は、マイクロ波照射下において脱保護反応を行うことによって加速させることができる。実施例６に示すように、10−mer または12−mer上のtert−ブチルジメチルシリル基は、マイクロ波照射下（300ワット、2450MHz）、THF、Et3-HFもしくはピリジン−HF／DBU中、1MのTBAFを用いて処理することにより、それぞれ、2分または4分で除去することができた。
本発明をひとつの側面から見ると、オリゴヌクレオチドからシリル保護基を除去する方法に関し、そのような方法は次のような工程を含む：
シリル保護基を有するオリゴヌクレオチドに、ピリジン−HF、DMAP−HF、尿素−HF、TAS−F、DASTおよびポリビニルピリジン−HFまたは次の構造式AAで表されるアリールアミン−HF反応試薬を混合する：
ここで、R1は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルであり：
R2は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルまたはヘテロアラルキルであり；さらに、
R3は、アリール、またはヘテロアリールである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドのオリゴマーである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、反応は、マイクロ波照射下において行う。
オリゴヌクレオチド合成用の固体支持体
固相オリゴヌクレオチド合成は、制御多孔質ガラス上で行われる場合が多い、しかしながら、固相オリゴヌクレオチド合成は次のようなものの上で行うことができる：
１）フラクトシル（Fractosil）
２）CPGではないが、シリカを基本とする固体支持体（制御多孔質ガラス以外）
３）ポリスチレンビーズ上のユニバーサルリンカー
４）アルゴゲル（Argogel）
５）アルゴポア（Argopore）
６）AMポリスチレン
７）ノヴァゲル（Novagel）
８）PEGA；EM Merck poly(vinyl alcohol）（PVA）；および日東電工（Nitto Denko）ポリスチレン
など。
ArgoGelを用いて行った実験（支持体上にdTスクシナートを結合させた。結合量＝229.35μmol/g）から、ポリ−T合成が非常に良好に行われたことが明らかになった。しかしながら、材料が粘着性であることから、計量し、カラムにかける場合には困難である。
Argopore−1を用いて行った実験（支持体上にdTスクシナートを結合させた。結合量＝322.14μmol/g）では、材料の通過がスムーズであることが明らかになり、材料は粘着性ではなかった。しかしながら、合成カップリング効率は、4〜5回のカップリングの後に低下した。
Argopore−2を用いて行った実験（支持体上にdTスクシナートを結合させた。結合量＝194μmol/g）では、ポリ−T合成が非常に良好に行われたことが明らかになった。
固体支持体へのリンカー
一般的に、オリゴヌクレオチドは、連結基（linking group）を介して固体支持体に結合している。適切な連結基としては、オキザキルリンカー、スクシニルリンカー、ジカルボン酸リンカー、グリコリルリンカーまたはチオグリコリルリンカーなどが挙げられる。シリルリンカーも使用できる。例えば、ディブラシ（DiBlasi）,C.M.、マックス（Macks）,D.E.、タン（Tan）,D.S.「固相有機合成用の酸安定性tert−ブチルジアリールシリル（TBDAS）リンカー（An Acid-Stable tert−Butyldiarylsilyl(TBDAS) Linker for Solid-Phase Organic Synthesis）」、Org.Lett.,2005；ASAPウェブ掲載日2005年5月30日、(Letter) DOI:10.1021/o1050370yなどを参照。ディブラシ（DiBlasi）らは、固相有機合成用の頑強なtert−ブチルジアリールシリル基（TBDAS）リンカーについて記載している。重要な点は、TBDASリンカーが、CH3CN中の水性HFに対して安定なことであり、このことにより、固相合成法において、HFに不安定な矩形の保護基を使用することができる。ひとつの方法として、リンカーの解裂は、トリス（ジメチルアミノ）スルホニウムジフルオロトリメチルシリケート（TAS-F）を用いて達成できることが確立された。
溶媒
環境により優しい溶媒中で反応を行うことの重要性が高まっていることに呼応して、発明者らは、非ハロゲン性溶媒を用いてオリゴヌクレオチドを調製できることを見出した。例えば、オリゴヌクレオチドは、トルエン、テトラヒドロフラン、または1,4−ジオキサンを溶媒として調製できる。
H−ホスホナートカップリングを介したRNA合成
H−ホスホナートカップリングを用いたRNA合成法は、活性化剤の存在下、H−ホスホナート置換ヌクレオシドに、第二のヌクレオシドの水酸基を反応させる過程を含む。最も一般的に使用される活性化剤のひとつは、塩化ピバロイルである。しかしながら、塩化ピバロイルは、可燃性、腐食性、揮発性（沸点は105〜106℃）であり、引火点が比較的低い（引火点は8℃）ことから、大量合成には不向きである。故に、上述の欠点を排した新規な活性化剤が希求されている。
オリゴヌクレオチド合成のH−ホスホナート法に使用できることが当業者において知られている有用な縮合反応試薬は多数存在する。ワダ（Wada）ら、J.Am.Chem.Soc.,119:12710-12721(1997)を参照。有用な縮合反応試薬としては、酸塩化物、クロロホスフェート類、カルボナート類、カルボニウム型化合物およびホスホニウム型化合物などが挙げられる。好ましい実施態様においは、縮合反応試薬は、塩化ピバロイル、塩化アダマンチル、2,4,6−トリイソプロピル−ベンゼンスルホニルクロリド、2−クロロ−5,5−ジメチル−2−オクソ−1,3,2−ジオキサホスフィナン、ジフェニルホスホロクロリダート、ビス（2−オクソ−3−オキサゾリジニル）ホスフィニッククロリド、ビス（ペンタフルオロフェニル）カルボナート、2−（1−H−ベンゾトリアゾール−1−イル）−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、O−（アザベンゾトリアゾール−1−イル）−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、6−（トリフルオロメチル）ベンゾトリアゾール−1−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、ブロモ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、ベンゾトリアゾール−1−イル−オキシ−トリス−ピロリジン−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェートおよび2−（ベンゾトリアゾール−1−イルオキシ）−1,3−ジメチル−2−ピロリジン−1−イル−1,3,2−ジアザホスホリジニウムヘキサフルオロホスフェートより成る群から選択される。さらに、2−クロロ−5,5−ジメチル−2−オクソ−1,3,2−ジオキサホスフィナナン、NEP-Cl／ピリジン／MeCN系についても記載されている。米国特許第6,639,061号を参照。
H−ホスホナートカップリング法に使用できるその他の活性化剤についても本明細書に開示している。より優れた活性化剤の化合物分類としては、長鎖アルキル基の酸塩化物、芳香族基の酸塩化物、芳香族基で置換されたアルキル基の酸塩化物、およびポリマー結合アシル塩化物などが挙げられる。活性化剤の代表的な例としては、塩化デカノイル、塩化ドデカノイル、塩化ベンゾイル、1,2−ジベンジルエタノイルクロリド、塩化ナフトイル、塩化アントラセンカルボニルおよび塩化フルオレンカルボニルなどが挙げられる。
H−ホスホナートカップリング法に使用できるその他の酸化剤についても本明細書に開示している。最も一般的に使用される酸化剤のひとつは、ヨウ素である。しかしながら、ヨウ素は非常に強力な酸化剤であり、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド上の敏感な官能基に対して不要な酸化を引き起こす。H−ホスホナートカップリング法に使用できる代表的な酸化剤の例としては、MeCN／ ピリジン、CCl4／ピリジン／水／MeCN中で使用するカンフォリルスルホニルオキサザリジンおよびN,O−ビス（トリメチルシリル）−アセタミド、ならびに、ピリジン／CCl4／水中で使用するDMAPなどが挙げられる。
本発明を別の側面から見ると、ホスホジエステル化合物の調製法に関し、そのような方法は以下の工程を含む：
H−ホスホナート、アルコールおよび活性化剤を混合してホスホジエステル化合物を調製するが、このとき、該活性化剤は、C8-C20アルキルカルボニルクロリド、塩化アリールカルボニルおよび塩化アラルキルカルボニルより成る群から選択される。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記活性化剤は、塩化デカノイル、塩化ドデカノイル、塩化ベンゾイル、1,2−ジベンジルエタノイルクロリド、塩化ナフトイル、塩化アントラセンカルボニルまたは塩化フルオレンカルボニルである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、このとき、該H−ホスホナートは次の構造式Iで表され：
ここで、R1は、必要に応じて置換された、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アラルキルまたはアルケニルである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R1は、必要に応じて置換されたヘテロシクロアルキルである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R1は、必要に応じて置換されたリボースである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R1は、必要に応じて置換されたデオキシリボースである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R1は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記アルコールは、必要に応じて置換されたリボースである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記アルコールは、必要に応じて置換されたデオキシリボースである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記アルコールは、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記アルコールはR5−OHで表され、ここで、R5は、必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アラルキル、アルケニル、または−（C(R6)2)pヘテロシクロアルキルであり；R6は、Hまたはアルキルであり；さらに、pは、1、2、3、4、5、6、7または8である。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、このとき、前記ホスホジエステルは、次の構造式Jで表され：
ここで、R1は、必要に応じて置換された、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アラルキルまたはアルケニルであり；
R2は、必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アラルキル、アルケニル、または−（C(R6)2)pヘテロシクロアルキルであり；R6は、Hまたはアルキルであり；さらに、pは、1、2、3、4、5、6、7または8である。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R1は、必要に応じて置換されたヘテロシクロアルキルである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R1は、必要に応じて置換されたリボースである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R1は、必要に応じて置換されたデオキシリボースである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R1は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R2は−（C(R6)2)pヘテロシクロアルキルである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R2は、必要に応じて置換されたリボースである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R2は、必要に応じて置換されたデオキシリボースである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、R2は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドである。
二本鎖RNAの精製
RNA調製において遭遇するひとつの共通した問題点は、高純度で所望するオリゴヌクレオチドを得ることである。多くの場合、オリゴヌクレオチドの調製に使用される反応では、100％の転換が達成されないか、または副生成物が生成する。不幸なことに、未反応の出発材料および副生成物は同様な化学的特性を有している場合が多く、これらの不純物からの所望する生成物の分離を非常に困難にしている。
十分に脱保護されたRNA分子を回収するための最も定量的な方法は、スカリンジ（Scaringe）らによって記載されているように（Nucleic Acids Res.,18:5433-5341(1990)）、エタノール沈殿または陰イオン交換カートリッジ脱塩による方法である。長いRNA配列の精製は、二段階クロマトグラフィー法を用いて行うことが多く、この場合、はじめに、逆相カラム上で5'位のトリチル基を着脱させることによって分子を精製する。この精製は、水相としてトリエチルアンモニウムまたは重炭酸塩を用いたアセトニトリル濃度勾配を利用して行う。精製中にトリチル基がRNAに結合したままである場合には、さらに酸を添加してトリチル基を除去した後、部分精製したRNA分子を乾燥させる。最終精製は、アルカリ金属過塩化物塩濃度勾配を用いて陰イオン交換カラム上で行い、十分精製されたRNA分子を適切な金属塩（例えば、Na+、Li+など）として溶出させる。小さい逆相カートリッジ上で最終脱塩段階を行うことにより、精製過程が完了する。
ある実施態様においては、長いRNA分子の精製は、特に、アルカリ過塩化物塩と組み合わせて陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて行う。この系を用いることにより、非常に長いRNA分子を精製することができる。特に、陰イオン交換法によるRNAの精製には、ディオネックス（Dionex）社のNUCLEOPAK 100（登録商標）またはファルマシア（ Pharmacia ）社のMONO Q（登録商標）陰イオン交換カラムの使用が有効である。この陰イオン交換精製は、逆相精製の後、または、逆相精製の前に行うことができる。この方法により、クロマトグラフィー中にリボザイムのナトリウム塩が生成する。ナトリウムアルカリ土類塩をその他の金属塩（例えば、リチウム、マグネシウムまたはカルシウム過塩化物など）に置換することにより、精製中にRNAの対応する塩が得られる。
二段階精製法の場合には、第一段階は逆相精製であり、次に陰イオン交換段階を行うが、通常、逆相精製は、ポリスチレンなどのポリマー性逆相媒体を用い、5'−トリチル−着法もしくは5'−トリチル−脱法に従って行う。このような逆相法を用いることにより、いずれの分子も回収することができ、次に、一旦脱トリチル化し、2つのフラクションをプールし、上述の陰イオン交換精製過程を行う。
しかしながら、上述したような厄介な精製過程を経ているにもかかわらず、多くの合成RNA製品は、実質的に多量の不純物を含んでいる。故に、高純度のRNAを得るための新規な精製法が希求されている。
驚くべきことに、発明者らは、一本鎖RNA組成物中の不純物は、一本鎖RNAの混合物をアニールして二本鎖RNAを形成させたものについて、HPLC精製を行うことによって容易に除去できることを発見した。
手順全体の流れ図は図９に示している。AL-4112、AL-4180、AL-DP-4014、AL-2200、AL-2201、AL-DP-4127、AL-2299、AL-2300、AL-DP-4139、AL-2281、AL-2282およびAL-DP-4140の構造式は図１０に示している。構成要素としてAL-4112およびAL-4180を有するAL-DP-4014の特別な精製法については、図１１および12に示している。AL-DP-4127、AL-DP-4139およびAL-DP-4140も図９、１１および１２に示した方法を用いて精製した。分析結果は図１９〜３９に示す。
二本鎖法を用いた別のRNA精製法を図４０〜４３に示す。
本発明をひとつの側面から見ると、オリゴヌクレオチドの精製法に関し、次のような工程を含む：
第一のオリゴヌクレオチドを第二のオリゴヌクレオチドにアニールさせて二本鎖オリゴヌクレオチドを形成させ、該二本鎖オリゴヌクレオチドをクロマトグラフィー精製する。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、第一のオリゴヌクレオチドを第二のオリゴヌクレオチドにアニールさせる過程は、第一温度と第二温度の間の温度で行い、このとき、該第一温度は、第一のオリゴヌクレオチドと第三のオリゴヌクレオチドからなる二本鎖オリゴヌクレオチドのTm付近であって、このとき、第三のオリゴヌクレオチドは、第一のオリゴヌクレオチドに対応するアンチセンス配列であり、さらに、該第二温度は、 該第一温度より約5℃低い。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、クロマトグラフィー精製は液体クロマトグラフィーである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、前記クロマトグラフィー精製は高速液体クロマトグラフィーである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、前記第一のオリゴヌクレオチドはリボヌクレオチドのオリゴマーである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、前記第二のオリゴヌクレオチドはリボヌクレオチドのオリゴマーである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、前記第一のオリゴヌクレオチドはリボヌクレオチドのオリゴマーであり、さらに、前記第二のオリゴヌクレオチドはリボヌクレオチドのオリゴマーである。
RNA HPLC法
上述したように、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）は、RNA化合物の精製に使用される重要な方法である。オリゴヌクレオチドの精製に関しては、非常に多様なカラム、溶媒、添加剤および条件が報告されている。しかしながら、RNA化合物を精製するために現在行われている方法は、大量の不純物からRNA化合物を分離しきれていない。本明細書では、現行のHPLC法を改良し、不純物の混入が実質的に減少しているRNA化合物を提供する：
１）オリゴヌクレオチドの分析的HPLC分離において、イオン対化剤としてテトラブチルアンモニウムアセタートを使用する。分析的HPLC分離におけるテトラブチルアンモニウムアセタートの使用については、M.ギラー（Gilar）、Analytical Biochemistry,298:196-206(2001)）を参照。
２）RNA化合物の親油性コンジュゲート用には、C-18またはC-4カラムを用い、DMTが結合していない状態でHPLC精製を行う。 ◎
３）溶媒としてエタノールまたはアセトニトリルを使用してRNA化合物をHPLC精製する。
RNA合成用の2'−保護基
上述したように、RNA合成において保護基は有用な役割を果たす。本明細書においては、RNA合成において使用できる数種の新規な保護基を記載している。RNA合成に使用できる2'−保護基のひとつのグループはカルボナート類である。ひとつの好ましいカルボナートは、以下に示すプロパルギルカルボナートである：
Org.Lett.,4:4731(2002)に記載されているように、プロパルギルカルボナートは、ベンジルトリエチルアンモニウムテトラチオモリブダートを用いて除去することができる。
RNA合成に使用できるもうひとつの2'−保護基グループは、アセタール類である。アセタール基は、水性酸を用いて脱保護できる。いくつかの代表的なアセタール保護基を以下に示す。さらなる例については、図４４を参照。
RNA合成に使用できるその他の2'−保護基を以下に示す。
さらに、ビス−シリル法もRNA合成に使用できる。この方法は、リボースの2'−水酸基およびシリル基を有するリボースの3'位に結合しているホスフェートの両方を保護する。代表例は図４４に示す。
多様なヌクレオシドに対する上述した保護基の代表例は図４４に示す。
別の5'−保護基
ジメトキシトリチル（DMT）の代わりに、モノメトキシトリチル（MMT）、9−フェニルキサンテン−9−イル（Pixyl）および9−（p−メトキシフェニル）キサンテン−9−イル（Mox）およびそれらのアナログを使用することができる。
別の塩基保護基
１）NpsおよびDNPS基（フクヤマ（Fukutyama））
２）フェナセチル（ペニシリンGアシラーゼを用いて除去）
酵素を用いた保護基の除去法
本発明を別の側面から見ると、酵素を用いて除去できる保護基に関する。−O2CCH2Rで表されるアラルキルエステル類（ここで、Rは、フェニル、ピリジニル、アニリン、キノリンまたはイソキノリンである）は、ペニシリンGアシラーゼを用いて酵素解裂を行うことにより、ヌクレオシドの2'位から除去できる。リボースの2'位にアラルキルエステル保護基を有するヌクレオシドの代表例は、図４５に示している。さらに、図４５に示しているものを含むある種の内部アミダイトも酵素解裂によって除去できる。
ひとつの側面から見ると、本発明は、保護基の除去法に関し、次のような工程を含む：
C2位に保護基を有する必要に応じて置換されたリボースに酵素を混合し、C2位に水酸基を有する必要に応じて置換されたリボースを生成する。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記保護基はアラルキルエステルである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記保護基は、−O2CCH2Rで表され、このとき、Rは、フェニル、ピリジニル、アニリン、キノリンまたはイソキノリンである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記酵素は、ペニシリンGアシラーゼである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記リボースは、リボヌクレオチドのオリゴマーである。
TTユニットを含むオリゴヌクレオチドの合成
ある実施態様においては、隣接する2個のチミジンヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを合成することが好ましい。より好ましい実施態様においては、チミジンヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの3'末端に位置している。チミジン−チミジン（TT）ヌクレオチドユニットは、液相化学を用いて調製することができ、次に、TTユニットを固体支持体に結合させる。ある実施態様においては、TTユニットは、ホスホロチオエート基を介して連結されている。ある実施態様においては、ホスホロチオエートTTユニットの別異の立体異性体を分離した後に、TTユニットを固体支持体に結合させる。オリゴヌクレオチド鎖の残りの部分は、TT−支持体結合ユニットをプライマーとして用い、標準的な固相合成法によって合成することができる。ある実施態様においては、チミジン−チミジンヌクレオチドユニットは、デオキシチミジン残基から調製される。
ひとつの側面から見ると、本発明は、ジヌクレオシドユニットを含むオリゴヌクレオチドの調製法に関し、次のような工程を含む：
液相化学を経てジヌクレオシド基を合成し、該ヌクレオシド基を固体支持体に結合させてプライマーを形成し、固相合成法を用いて該プライマーにさらにヌクレオチドを付加する。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記ジヌクレオシド基の各ヌクレオシド残基は、それぞれ別異に、天然または非天然のヌクレオシドである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記ジヌクレオシド基は、それぞれ別異に、糖およびヌクレオベースを含む2個のヌクレオシド残基から成り、このとき、糖は、D−リボースまたはD−デオキシリボースであり、さらに、ヌクレオベースは、天然または非天然のものである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記ジヌクレオシド基は、それぞれ別異に、糖およびヌクレオベースを含む2個のヌクレオシド残基から成り、このとき、糖は、L−リボースまたはL−デオキシリボースであり、さらに、ヌクレオベースは、天然または非天然のものである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記ジヌクレオシド基は2個のチミジン残基を有する。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記ジヌクレオシド基は2個のデオキシチミジン残基を有する。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記ジヌクレオシド基は2個の2'−修飾5−メチルウリジンまたはウリジン残基を有し、このとき、2'−修飾体は、2'−O−TBDMS、2'−OMe、2'−F、2'−O−CH2CH2OMeまたは2'−アルキルアミノ誘導体である。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記ジヌクレオシド基は、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホナート結合またはボラノホスフェート結合を有する。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記ジヌクレオシド基は、ホスホロチオエート結合、アルキルホスホナート結合またはボラノホスフェート結合を有し、さらに、前記ジヌクレオシド基は、リン原子に関して単一の立体異性体である。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記ジヌクレオシド基のヌクレオシド残基間の結合は、3'−5'結合である。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記ジヌクレオシド基のヌクレオシド残基間の結合は、2'−5'結合である。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記ジヌクレオシド基は、それぞれ別異に、糖およびヌクレオベースを含む2個のヌクレオシド残基から成り、このとき、糖は、D−リボースまたはD−デオキシリボースであり、ヌクレオベースは、天然または非天然のものであり、さらに、前記ジヌクレオシド基のヌクレオシド残基間の結合は、非天然かつホスフェートを介さないものである。
ある実施態様においては、本発明は上述の方法に関し、ここで、前記ジヌクレオシド基は、それぞれ別異に、糖およびヌクレオベースを含む2個のヌクレオシド残基から成り、このとき、糖は、L−リボースまたはL−デオキシリボースであり、ヌクレオベースは、天然または非天然のものであり、さらに、前記ジヌクレオシド基のヌクレオシド残基間の結合は、MMI、アミド結合またはグアニジニウム結合である。
ヌクレオシド、ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド合成のための改良法
重要なことは、上述の改良点の任意のひとつは、単独で標準的なヌクレオシド、ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド合成法と組み合わせることができること、あるいは、上述の改良点は、そのひとつ以上を、標準的なヌクレオシド、ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド合成法と組み合わせることができることである。さらに、当業者であれば、上述の各改良点に最適な条件を即座に判断することができる。
オリゴヌクレオチドに関する一般的記述
上述したように、本発明は、オリゴヌクレオチドの合成および精製に用いる方法および反応試薬に関する。以下の記載は、オリゴヌクレオチドの主要な型および構造的特徴のうちのいくつかを簡潔に記すものである。重要なことは、以下の項は、代表例を述べただけであり、本発明の範ちゅうを制限することを意味するものではない。
オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、または、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの混合物から調製することができる。ヌクレオチドは天然または非天然のものを用いることができる。オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖である。オリゴヌクレオチドの糖、塩基およびホスフェート構成要素に対する多様な修飾体を以下に記載する。本明細書において定義しているように、修飾骨格またはヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドとしては、骨格内にリン原子を保持しているもの、および骨格内にリン原子を持たないものが含まれる。本発明の目的を達成するためには、糖骨格内にリン原子を持たないオリゴヌクレオチドもオリゴヌクレオシドであると考えることができる。
オリゴヌクレオチドの特殊な化学的修飾について以下に記載する。与えられた化合物中の全ての位置において均一に修飾されている必要はなく、実際、ひとつのsiRNA化合物、またはそれらのひとつのヌクレオチドにおいて、以下の修飾のうちのひとつ以上が生じている。
ヌクレオシド間結合または骨格における好ましい修飾としては、例えば、ホスホロチオエート類、キラルホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類、ホスホトリエステル類、アミノアルキルホスホトリエステル類、メチルおよびその他のアルキルホスホナート類（3'−アルキレンホスホナート類およびキラルホスホナート類を含む）、ホスフィナート類、ホスホロアミダート類（3'−アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホロアミダート類を含む）、チオノホスホロアミダート類、チオノアルキルホスホナート類、チオノアルキルホスホトリエステル類、およびボラノホスフェート類（正常な3'−5'結合を有するもの、2'−5'結合を有するアナログ、ならびに、極性が逆であるもの、このとき、隣接するヌクレオシドユニット対は、3'−5'結合が5'−3'結合に、2'−5'結合が5'−2'結合になっている）などが挙げられる。多様な塩類、混合塩類および遊離酸型も含まれる。
上述のリン原子含有結合の調製に関して開示している米国特許の代表例としては次のようなものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない：第3,687,808号、第4,469,863号、第4,476,301号、第5,023,243号、第5,177,196号、第5,188,897号、第5,264,423号、第5,276,019号、第5,278,302号、第5,286,717号、第5,321,131号、第5,399,676号、第5,405,939号、第5,453,496号、第5,455,233号、第5,466,677号、第5,476,925号、第5,519,126号、第5,536,821号、第5,541,306号、第5,550,111号、第5,563,253号、第5,571,799号、第5,587,361号、第5,625,050号および5,697,248号など。これらの各々を参照として本明細書中に取り入れておく。
好ましい修飾ヌクレオシド間結合またはリン原子を含まない骨格（すなわちオリゴヌクレオシド）は、短鎖アルキルまたはシクロアルキル糖間結合、ヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルが混じった糖間結合、あるいは、ひとつもしくはそれ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式糖間結合によって形成された骨格を有する。そのようなものとしては、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部からその一部が形成されている）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホナートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに、N、O、SおよびCH2が混じったその他の骨格などが挙げられる。
上述のオリゴヌクレオシドの調製について開示している米国特許の代表例としては杉のようなものが挙げられるが、これらに限定されるわけではな：第5,034,506号、第5,166,315号、第5,185,444号、第5,214,134号、第5,216,141号、第5,235,033号、第5,264,562号、第5,264,564号、第5,405,938号、第5,434,257号、第5,466,677号、第5,470,967号、第5,489,677号、第5,541,307号、第5,561,25号、第5,596,086号、第5,602,240号、第5,610,289号、第5,602,240号、第5,608,046号、第5,610,289号、第5,618,704号、第5,623,070号、第5,663,312号、第5,633,360号、第5,677,437号および5,677,439号など。これらの各々を参照として本明細書中に取り入れておく。
その他の好ましいオリゴヌクレオチドミメチックとしては、糖およびヌクレオシド間結合の両方、すなわち、ヌクレオシドユニットからなる骨格が新規な基に置換されているものがある。ヌクレオベースユニットは、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために保持されている。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているそのようなオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドミメチック）のひとつは、ペプチド核酸（PNA）と称されている。PNA化合物においては、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格に置換されている。ヌクレオベースは保持されており、骨格のアミド部位の原子に直接または間接的に結合している。PNA化合物の調製について開示した米国特許の代表例としては次のようなものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない：第5,539,082号、第5,714,331号および第5,719,262号など。これらの各々を参照として本明細書中に取り入れておく。PNA化合物に関しては、ニールセン（Nielsen）ら、Science,254:1497(1991)にも報告されている。
本発明に従ういくつかの好ましい実施態様においては、ホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシドを用い、特に、上掲の米国特許第5,489,677号に開示されている−CH2−NH−O−CH2−、−CH2−N（CH3)−O−CH2−（メチレン（メチルイミノ）骨格またはMMI骨格として知られている）、−CH2−O−N(CH3)−CH2−、−CH2−N（CH3)−N（CH3)−CH2−、および−O−N(CH3)−CH2−CH2−（ここで、天然のホスホジエステル骨格は−O−P−O−CH2−で表される）、ならびに上掲の米国特許第5,602,240号に開示されているアミド骨格を用いる。上掲の米国特許第5,034,506号に開示されているモルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドも好ましい。
オリゴヌクレオチドは、追加の、または別の、ヌクレオベース（当該分野においては単に「ベース（塩基）」と称されることが多い）の修飾または置換を含む場合がある。本明細書において使用しているように、「非修飾」または「天然」のヌクレオベースには、プリン塩基であるアデニン（A)およびグアニン（G)、ならびに、ピリミジン塩基であるチミン（T)、シトシン（C)およびウラシル（U)が含まれる。修飾ヌクレオベースには、その他の合成および天然ヌクレオベースが含まれ、例えば、5−メチルシトシン（5−me−C）；5−ヒドロキシメチルシトシン；キサンチン；ヒポキサンチン；2−アミノアデニン；アデニンならびにグアニンの6−メチルおよびその他のアルキル誘導体；アデニンならびにグアニンの2−プロピルおよびその他のアルキル誘導体；2−チオウラシル、2−チオチミンおよび2−チオシトシン；5−ハロウラシルおよびシトシン；5−プロピニルウラシルおよびシトシン；6−アゾウラシル、シトシンおよびチミン；5−ウラシル（プソイドウラシル）；4−チオウラシル；8−ハロ、8−アミノ、8−チオール、8−チオアルキル、8−ヒドロキシルおよびその他の8置換アデニンならびにグアニン；5−ハロ、特に5−ブロモ、5−トリフルオロメチルおよびその他の5−置換ウラシルならびにシトシン；7−メチルグアニンおよび7−メチルアデニン、8−アザグアニンおよび8−アザアデニン、7−デアザグアニンおよび7−デアザアデニンおよび3−デアザグアニンおよび3−デアザアデニンなどが挙げられる。
さらに、ヌクレオベースとしては、米国特許第3,687,808号に開示されているもの、「ポリマー化学および操作に関する明解百科事典（Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering）」、858〜859ページ（クロシュウィッツ（Kroschwitz）,J.I.編、ジョン・ウィレー＆サンズ（ John Wiley & Sons ）社、1990年）に記載されているもの、イングリッシュ（Englisch）ら、Angewandte Chemie,International Edition,30:613(1991)に記載されているもの、ならびにシャンヴィ（Sanghvi）,Y.S.ら、「アンチセンスの研究および応用（Antisense Research and Applications）」、第15章、289〜302ページ（クロッケ（Crooke）,S.T.およびレブリュー（Lebleu）,B.編、CRCプレス（CRC Press）社、1993年）に記載されているものなどが挙げられる。これらのヌクレオベースのうちのあるものは、本発明に従うオリゴヌクレオチドの結合アフィニティーの強化に特に有用である。そのようなものとしては、5−置換ピリミジン類、6−アザピリミジン類、ならびに、N−2、N−6およびO−6置換プリン類（2−アミノプロピルアデニン、5−プロピニルウラシルおよび5−プロピニルシトシンを含む）が挙げられる。5−メチルシトシン置換により、核酸二本鎖の安定性が0.6〜1.2℃向上することが示されており（同上、276〜278ページ）、現時点では好ましい塩基置換体であり、特に、2'−O−メトキシエチル糖修飾との組み合わせにおいてより好ましい。
上述のある種の修飾ヌクレオーベースならびにその他の修飾ヌクレオベースの調製について開示している米国特許の代表例としては、次のようなものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない：米国特許第4,845,205号、第5,130,302号、第5,134,066号、第5,175,273号、第5,367,066号、第5,432,272号、第5,457,187号、第5,459,255号、第5,484,908号、第5,502,177号、第5,525,711号、第5,552,540号、第5,587,469号、第5,594,121号、第5,596,091号、第5,614,617号、第5,681,941号および第5,808,027号など。これらの各々を参照として本明細書中に取り入れておく。
オリゴヌクレオチドは、追加として、または別に、ひとつもしくはそれ以上置換された糖部位を含む場合がある。好ましいオリゴヌクレオチドは、2'位に次のうちのひとつをふくむものである；OH；F；O−、S−もしくはN−アルキル、O−、S−もしくはN−アルケニル、または、O−、S−もしくはN−アルキニル、ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換もしくは未置換のC1〜C10アルキル、またはC2〜C10アルケニルおよびアルキニルである。特に好ましいものは、O［（CH2)n)］ｍCH3、O（CH2)nOCH3、O（CH2)nNH2、O（CH2)nCH3 、O（CH2)nONH2 およびO（CH2)nON［（CH2)nCH3］2 であり、ここで、nおよびmは、1〜約10である。その他の好ましいオリゴヌクレオチドは、2'位に次のうちのひとつを含むものである：C1〜C10 低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル(alkaryl)、アラルキル、O−アルカリル(O-alkaryl)もしくはO−アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2、CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル(heterocycloalkaryl)、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ならびに、RNAの解裂基、レポーター基、インターカレーター（intercalator）、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、あるいは、オリゴヌクレオチドの薬理学的特性を改善するための基、ならびに、同様な特性を有するその他の置換基など。好ましい修飾としては、2'−メトキシエトキシ（2'−OCH2CH2OCH3、また、2'−O−（2−メトキシエチル）または2'−MOEとしても知られている）（マーティン（Martin）ら、Helv.Chim.Acta.,78:486(1995)）、すなわち、アルコキシアルコキシ基が挙げられる。さらに好ましい修飾としては、1998年1月30日に受理された米国特許第6,127,533号に記載されている2'−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、O(CH2)2ON(CH3)2基（2'−DMAOEとしても知られている）が挙げられ、該特許の内容を参照として本明細書中に取り入れておく。
その他の好ましい修飾としては、2'−メトキシ（2'−O−CH3）、2'−O−メトキシエチル、2'−アミノプロポキシ（2'−O−CH2CH2CH2NH2）および2'−フルオロ（2'−F）などが挙げられる。同様な修飾は、オリゴヌクレオチドのその他の位置、特に、3'末端ヌクレオチド上または2'−5'結合オリゴヌクレオチド内の糖の3'位においても行うことができる。
本明細書において使用している「糖置換基」または「2'−置換基」とは、リボフラノシル部位の2'位に酸素原子を伴って、または伴わずに結合している基である。置換基としては次のようなものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない：フルオロ、O−アルキル、O−アルキルアミノ、O−アルキルアルコキシ、保護されたO−アルキルアミノ、O−アルキルアミノアルキル、O−アルキルイミダゾール、および化学式（O−アルキル）mで表されるポリエーテル類などであり、mは1〜約10である。これらのポリエーテル類の中で好ましいものは、直鎖および環状ポリエチレングリコール類（PEG）、ならびにクラウンエーテル類などの（PEG）−含有基、さらに、オウチ（Ouchi）ら、（Drug Design and Discovery,9:93(1992)）、ラヴァシオ（Ravasio）ら、（J.Org.Chem.,56:4329(1991)）およびデルガルド（Delgardo）ら、（Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,9:249(1992)）によって記載されたものなどである。それらの各文献の全体を参照として本明細書中に取り入れておく。さらなる糖の修飾については、クック（Cook）によって記載されている（Anti-Cancer Drug Design:6:585-607(1991)）。フルオロ、O−アルキル、O−アルキルアミノ、O−アルキルイミダゾール、O−アルキルアミノアルキルおよびアルキルアミノ置換については、米国特許第6,166,197号（発明の名称は「2'および5'位に置換基を有するピリミジンヌクレオチドを含むオリゴマー化合物（Oligomeric Compounds having Pyrimidine Nucleotide(s) with 2' and 5' Substitutions）」）に開示されており、その全体を参照として本明細書中に取り入れておく。
本発明に使用することができるさらなる糖置換基としては、2'−SRおよび2'−NR2が挙げられ、ここで、各Rは、それぞれ別異に、水素、保護基、または、置換もしくは未置換のアルキル、アルケニルまたはアルキニルである。2'−SRヌクレオシドは、1997年9月23日に交付された米国特許第5,670,633号に開示されており、その全体を参照として本明細書中に取り入れておく。2'−SRモノマーシントンの取込みについては、ハム（Hamm）らによって記載されている（J.Org.Chem.,62:3415-3420(1997)）。2'−NRヌクレオシドについては、ゲッティンゲン（Goettingen）、J.Org.Chem.,61:6273-6281(1996)およびポルシン（Polushin）ら、Tetrahedron Lett.,37:3227-3230(1996)によって記載されている。本発明に使用することができるさらなる2'−置換基の代表例としては、次の構造式IまたはIIで表されるものが挙げられ：
ここで、Eは、C1〜C10アルキル、N(Q3)(Q4)またはN=C(Q3)(Q4)であり、各Q3およびQ4は、それぞれ別異に、H、C1−C10アルキル、ジアルキルアミノアルキル、窒素保護基、拘束もしくは非拘束共役基、固体支持体に対するリンカーであり；あるいは、Q3およびQ4は、共に、窒素保護基または、NおよびOから選択される少なくとも1個の追加のヘテロ原子を有する環構造を形成し；
q1は、1〜10までの整数であり；
q2は、1〜10までの整数であり；
q3は、0または1であり；
q4は、0、1または2であり；
各Z1、Z2およびZ3は、それぞれ別に、C4〜C7シクロアルキル、C5〜C14アリールまたはC3〜C15複素環であり、このとき、該複素環基内のヘテロ原子は、酸素、窒素および硫黄から選択され；
Z4は、OM1、SM1またはN(M1)2であり；各M1は、それぞれ別異に、H、C1〜C8アルキル、C1〜C8ハロアルキル、C(=NH)N(H)M2、C(=O)N(H)M2またはOC(=O)N(H)M2であり；M2は、HまたはC1〜C8アルキルであり；さらに、
Z5は、C1〜C10アルキル、C1〜C10ハロアルキル、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル、C6〜C14アリール、N(Q3)(Q4)、OQ3、ハロ、SQ3またはCNである。
構造式Iで表される2'−O−糖置換基の代表例は、米国特許第6,172,209号（発明の名称は、「キャップされた2'−オキシエトキシオリゴヌクレオチド（Capped 2'-Oxyethoxy Oligonucleotides）」）に開示されており、その全体を参照として本明細書中に取り入れておく。構造式IIで表される環状2'−O−糖置換基の代表例は、1998年7月27日に受理された米国特許第6,271,358号（発明の名称は、「RNAを標的とし、立体的に予め組織された2'−修飾オリゴヌクレオチド（RNA Targeted 2'-Modified Oligonucleotides that are Conformationally Preorganized）」）に開示されており、その全体を参照として本明細書中に取り入れておく。
リボシル環上にO−置換基を有する糖類も本発明に用いることができる。環のOに対する代表的な置換基としては次のようなものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない：NH、NR、S、CH2、CHFおよびCF2など。例えば、セクリスト（Secrist）ら、第10回ヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの生物学的応用に関する国際円卓会議（Tenth International Roundtable, Nucleosides,Nucleotides and their Biological Applications）、プログラムおよび要旨集（Program&Abstructs）、要旨21（1992年9月16〜20日、ユタ州パークシティ）などを参照。
オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部位、ヘキソース、シクロヘキセニルなどの糖ミメチックも有する。そのような修飾糖構造の調製について開示している米国特許の代表例としては次のようなものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない：第4,981,957号、第5,118,800号、第5,319,080号、第5,359,044号、第5,393,878号、第5,446,137号、第5,466,786号、第5,514,785号、第5,519,134号、第5,567,811号、第5,576,427号、第5,591,722号、第5,597,909号、第5,610,300号、第5,627,0531号、第5,639,873号、第5,646,265号、第5,658,873号、第5,670,633号、第5,700,920号および第5,859,221号など。これらの全てを参照として本明細書中に取り入れておく。
オリゴヌクレオチド上のその他の部位、特に、3'−末端ヌクレオチド上の糖の3'位において、さらに修飾を施すこともできる。例えば、オリゴヌクレオチドのひとつの修飾は、オリゴヌクレオチドのひとつもしくはそれ以上の追加部位またはコンジュゲートへの化学的結合を含み、そのことによってオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取込が増強される。そのような部位としては次のようなものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない：コレステロール部位などの脂質部位（レトシンガー（Letsinger）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,86:6553(1989)）、コール酸（マノハラン（Manoharan）ら、Bioorg.Med.Chem.Lett.,4:1053(1994)）、ヘキシル−S−トリチルチオールなどのチオエーテル（マノハラン（Manoharan）ら、Ann.N.Y.Acad.Sci.,660:306(1992)；マノハラン（Manoharan）ら、Bioorg.Med.Chem.Lett.,3:2765(1993)）、チオコレステロール（オバーハウザー（Oberhauser）ら、Nucl.Acids Res.,20:533(1992)）、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基などの脂肪族鎖（セゾン−ヘーモアラス（Saison-Behmoaras）ら、EMBO J.,10:111(1991)；カバノフ（Kabanov）ら、FEBS Lett.,259:327(1990)；スヴィナーチュク（Svinarchuk）ら、Biochimie,75:49(1993)）、ジ−ヘキサデシル−rac−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム1,2−ジ−O−ヘキサデシル−rac−グリセロ−3−H−ホスホナートなどのリン脂質（マノハラン（Manoharan）ら、Tetrahedron Lett.,36:3651(1995)；シェア（Shea）ら、Nucl.Acids Res.,18:3777(1990)）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（マノハラン（Manoharan）ら、Nucleosides&Nucleotides,14:969(1995)）あるいは、アダマンタン酢酸（マノハラン（Manoharan）ら、Tetrahedron Lett.,36:3651(1995)）、パルミチル部位（ミシュラ（Mishra）ら、Biochem.Biophys.Acta.,1264:229(1995)）、あるいは、オクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部位（クルッケ（Crooke）ら、J.Pharmacol.Exp.Ther.,277:923(1996)）など。
そのようなオリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製について開示している米国特許の代表例としては次のようなものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない：第4,828,979号、第4,948,882号、第5,218,105号、第5,525,465号、第5,541,313号、第5,545,730号、第5,552,538号、第5,578,717号、第5,580,731号、第5,591,584号、第5,109,124号、5,118,802号、第5,138,045号、第5,414,077号、第5,486,603号、第5,512,439号、第5,578,718号、第5,608,046号、第4,587,044号、第4,605,735号、第4,667,025号、第4,762,779号、第4,789,737号、第4,824,941号、第4,835,263号、第4,876,335号、第4,904,582号、第958,013号、第5,082,830号、第5,112,963号、第5,214,136号、第5,242,022号、第5,254,469号、第5,258,506号、第5,262,536号、第5,272,250号、第5,292,873号、第5,317,098号、第5,371,241号、第5,391,723号、第5,416,203号、第5,451,463号、第5,510,475号、第5,512,667号、第5,514,785号、第5,565,552号、第5,567,810号、第5,574,142号、第585,481号、第5,585,371号、第5,595,726号、第5,597,696号、第5,599,923号、第5,599,928号、および第5,688,941号など。これらを参照として本明細書中に取り入れておく。
オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド内の特定の位置に関して、キラル的に実質的に純粋である場合がある。キラル的に実質的に純粋なオリゴヌクレオチドの例としては次のようなものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない：少なくとも75％がSpまたはRpであるようなホスホロチオエート結合を有するもの（クック（Cook）ら、米国特許第5,587,361号）、およびキラル的に実質的に純粋な（SpまたはRp）アルキルホスホナート、ホスホルアミダイトまたはホスホトリエステル結合（クック（Cook）ら、米国特許第5,212,295号および第5,521,302号）など。
エンドリボヌクレアーゼ活性を非常に特異的に触媒する合成RNAおよびそれらの誘導体は、リボザイムとして知られている（一般的には、1996年8月6日にハセロフ（Haseloff）らに付与された米国特許第5,543,508号および1996年8月13日にグッドチャイルド（Goodchild）らに付与された米国特許第5,545,729号を参照）。解裂反応は、RNA分子自身によって触媒される。天然に存在するRNA分子においては、自己触媒解裂部位は、RNAの二次構造の高度に保存された領域内に存在している（ブザヤン（Buzayan）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,83:8859(1986)；フォースター（Forster）ら、Cell,50:9(1987)）。天然に存在する自己触媒性RNA分子を修飾し、特定の細胞性RNA分子または病原性RNA分子を高い選択性を以て標的化することができるリボザイムを生成する。従って、リボザイムは、アンチセンスオリゴヌクレオチドと同様な一般的目的（すなわち、特定の遺伝子の発現制御）に役立ち、オリゴヌクレオチドと同様に、一本鎖の特徴的な部分を有する核酸である。すなわち、リボザイムは、オリゴヌクレオチドと実質的に同一の化学的および機能的性質を有しており、従って、本発明の目的に対しては等価物であると考えられる。
ある実施態様においては、オリゴヌクレオチドはある部位によって修飾することができる。オリゴヌクレオチドの活性、細胞性分布または細胞取込を増強させることを目的として、オリゴヌクレオチドに多数の部位がコンジュゲートされており、そのようなコンジュゲーションを行うための方法については、化学文献から入手できる。そのような部位としては次のようなものが挙げられる：コレステロール部位などの脂質部位（レトシンガー（Letsinger）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,86:6553(1989)）、コール酸（マノハラン（Manoharan）ら、Bioorg.Med.Chem.Lett.,4:1053(1994)）、ヘキシル−S−トリチルチオールなどのチオエーテル（マノハラン（Manoharan）ら、Amm.N.Y.Acad.Sci.,660:306(1992)；マノハラン（Manoharan）ら、Bioorg.Med.Chem.Lett.,3:2765(1993)）、チオコレステロール（オバーハウザー（Oberhauser）ら、Nucl.Acids Res.,20:533(1992)）、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基などの脂肪族鎖（セゾン−ヘーモアラス（Saison-Behmoaras）ら、EMBO J.,10:111(1991)；カバノフ（Kabanov）ら、FEBS Lett.,259:327(1990)；スヴィナーチュク（Svinarchuk）ら、Biochimie,75:49(1993)）、ジ−ヘキサデシル−rac−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム1,2−ジ−O−ヘキサデシル−rac−グリセロ−3−H−ホスホナートなどのリン脂質（マノハラン（Manoharan）ら、Tetrahedron Lett.,36:3651(1995)；シェア（Shea）ら、Nucl.Acids Res.,18:3777(1990)）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（マノハラン（Manoharan）ら、Nucleoshides&Nucleotides,14:969(1995)）あるいは、アダマンタン酢酸（マノハラン（Manoharan）ら、Tetrahedron Lett.,36:3651(1995)）、パルミチル部位（ミシュラ（Mishra）ら、Biochem.Biophys.Acta.,1264:229(1995)）、あるいは、オクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部位（クルッケ（Crooke）ら、J.Pharmacol.Exp.Ther.,277:923(1996)）など。そのようなオリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製について開示している米国特許の代表例は上に記載している。典型的なコンジュゲーションプロトコールは、配列のひとつもしくはそれ以上の位置においてアミノリンカーを有するオリゴヌクレオチドを合成することを含む。次に、適切なカップリングまたは活性化反応試薬を用い、コンジュゲートを有する分子をアミノ基に反応させる。コンジュゲーション反応は、オリゴヌクレオチドが固体支持体に結合したままの状態で、または、オリゴヌクレオチドが液相中に解離した後のいずれでも行うことができる。一般的に、HPLCでオリゴヌクレオチドコンジュゲートを精製することにより、純粋なコンジュゲートが得られる。
二本鎖RNAのひとつの型は、干渉を引き起こす短いRNA（siRNA）である。ある実施態様においては、オリゴヌクレオチドの骨格を修飾してsiRNA化合物の治療または診断特性を向上させることができる。siRNA化合物の二本の鎖は、相補的、部分的に相補的またはキメラオリゴヌクレオチドである。ある実施態様においては、オリゴヌクレオチドの少なくとも1個の塩基または少なくとも1個の糖を修飾し、siRNA化合物の治療または診断特性を向上させることができる。
siRNA剤またはそれらのフラグメントは、標的遺伝子の抑制制御を媒介できるように、標的遺伝子に対して十分に相同な領域を含み、ヌクレオチドとして十分な長さを有する。修飾RNAまたはヌクレオチド代用物の場合には、「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」とは、修飾ヌクレオチド、または、ひとつもしくはそれ以上の位置における代用置換部位もさす。従って、siRNA剤は、標的RNAに対して少なくとも部分的に相補的である、または部分的に相補的な領域を含む。ある実施態様においては、siRNA剤は、標的RNAに対して全体的に相補的である。siRNA剤と標的との間は完全に相補的である必要はないが、対応性は、siRNA剤またはそれらの解裂生成物が配列特異的サイレンシング（例えば、標的RNAのRNAi解裂によるものなど）を行うことができる程度でなければならない。標的鎖との相補性または相同性の度合いは、アンチセンス鎖において最も重要な点である。特にアンチセンス鎖においては、完全な相補性が求められる場合が多いが、いくつかの実施態様においては、標的RNAに対しては、ひとつもしくはそれ以上ではあるが、好ましくは6、5、5、3、2個もしくはそれ以下のミスマッチは許容される。ミスマッチについては、末端領域で最も寛容であり、もし存在するならば、末端領域において、5'および／または3'末端のヌクレオチドのうちの6、5、4または3個以内である。センス鎖に要求されるのは、分子の全体的な二本鎖の性質を維持するためにアンチセンス鎖に十分に相補的であることのみである。
さらに、siRNA剤は、修飾されているか、またはヌクレオシド代用物を含む場合が多い。siRNA剤の一本鎖領域は、修飾されているか、またはヌクレオシド代用物を含む場合が多く、例えば、非対領域またはヘアピン構造領域（例えば、２つの相補的領域が連結している領域など）は、修飾されているか、またはヌクレオシド代用物を有する場合がある。iRNA剤（例えば、エキソヌクレアーゼに対するものなど）の3'−もしくは5'−末端のひとつまたはそれ以上を安定化させることを目的とした、あるいは、アンチセンスsRNA剤をRISC内に侵入させることを目的とした修飾も好ましい。修飾としては、次のようなものが挙げられる：C3（またはC6、C7、C12）アミノリンカー、チオールリンカー、カルボキシルリンカー、非ヌクレオチド性スペーサー（C3、C6、C9、C12、アベイシック（abasic）、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール）、特別なビオチンまたはフルオレセイン反応試薬（これらは、ホスホルアミダイトのように作用し、RNA合成中に複数のカップリングが行えるように、DMT−保護水酸基を別に有する）など。
siRNA剤としては次のようなものが挙げられる：インターフェロン応答を引き起こすのに十分な長さの分子（これらは、Dicer（バーンステイン（Bernstein）ら、Nature,409:363-366(2001)）によって解裂され、RISC内に入ることができる）；およびインターフェロン応答を引き起こさないくらい十分に短い分子（これらの分子もDicerによって解裂され、および／またはRISC内に入ることができる）、例えば、Dicer解裂生成物に類似した分子などのような、RISC内に入ることができる大きさの分子など。本明細書においては、インターフェロン応答を引き起こさないくらい十分に短い分子は、sRNA剤または短いiRNA剤と称する。本明細書において使用している「sRNA剤または短いiRNA剤」とは、ヒト細胞内において、欠失性のインターフェロン応答を誘導しないくらい十分に短く、例えば、二本鎖領域のヌクレオチド対数は60以下であり、好ましくは、50、40もしくは30以下である。sRNA剤またはそれらの解裂生成物は、標的RNA、好ましくは内因性もしくは病原性標的RNAに対してRNAiを誘導するなどして標的遺伝子を抑制制御することができる。
sRNA剤の各鎖は、ヌクレオチド数が30、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16または15以下である。ヌクレオチド鎖の長さは、好ましくは少なくとも19である。例えば、各ヌクレオチド鎖のヌクレオチド数は21〜25である。好ましいsRNA剤は、ヌクレオチド対の数が17、18、19、20、21、22、23、24、または25であり、さらに、ひとつもしくはそれ以上のオーバーハング、好ましくはヌクレオチド数が2〜3である1つもしくは2つの3'オーバーハングを有する。
標的RNAへの相同性および標的遺伝子を抑制制御する能力に加え、siRNA剤は、以下の特徴のうちのひとつもしくはそれ以上を有することが好ましい：
(1)ヌクレオシドの大多数または全てが修飾されているにもかかわらず、適切な三次元外郭構造内で塩基（または修飾塩基）を呈することができるアンチセンス鎖を有するが、これは、正しい塩基対を形成し、さらに、相同な標的RNAと二本鎖構造を形成するためであり、標的RNAの解裂などによって標的を抑制制御するのに十分である；
(2)ヌクレオシドの大多数または全てが修飾されているにもかかわらず、「RNA様」特性を保持している、すなわち、リボヌクレオチドに基づく内容物からなるRNA分子の全体的な構造的、化学的および物理的特徴を、限定的ではないが、あるいは、部分的ではあるが有する。例えば、siRNA剤は、ヌクレオチド糖の全てが、2'−ヒドロキシルの代わりに2'−フルオロなどを有するセンスおよび／またはアンチセンス鎖などを含む場合がある。このデオキシリボヌクレオチド含有剤は、RNA様特性を呈することが期待される。理論的裏付けがあるわけではないが、電気的に陰性であるフッ素は、リボースの2'位に結合した場合には、アキシアル方向を好む。フッ素のこのような空間的傾向は、次に、糖をC3'−エンドパッカーに結合させる。これは、RNA分子内で観察されるものと同様のパッカー様式であり、RNA特徴的なAファミリー型へリックスが生じる。さらに、フッ素は、良好な水素結合アクセプターであることから、RNA構造を安定化させることが知られている水分子と同様な水素結合相互作用に関与することができる。一般的に、糖の2'位における修飾部位は、デオキシリボヌクレオチドのH部位の特徴よりもリボヌクレオチドのOH部位のそれに近いH結合に入っていくことができる。好ましいsiRNA剤は、糖の全て、または、少なくとも50、75、80、85、90または95％おいてC3'−エンドパッカーを呈する；RNA特徴的なAファミリー型へリックスを呈するのに十分量のC3'−エンドパッカーを糖内に呈する；C3'−エンドパッカー構造ではない糖は、20、10、5、4、3、2または1個以下である。
本明細書において使用している「一本鎖iRNA剤」とは、単一分子から形成されているiRNA剤である。鎖内対合によって形成した二本鎖領域、例えば、ヘアピン構造またはパンハンドル構造などは含まれる。好ましくは、一本鎖iRNA剤は、標的分子に対してアンチセンスである。一本鎖iRNA剤は、RISC内に入り、RISCを介した標的ｍRNAの解裂に関与することができるような十分な長さでなければならない。一本鎖iRNA剤は、ヌクレオチド数が少なくとも14、より好ましくは少なくとも15、25、29、35、40または50である。ヌクレオチド数は、200、100、または60以下であることが好ましい。
ヘアピンiRNA剤は、ヌクレオチド対の数が少なくとも17、18、19、20、21、22、23、24または25である二本鎖領域を有する。好ましくは、二本鎖領域のヌクレオチド対の数は、200、100または50以下である。二本鎖領域のヌクレオチド対の数の好ましい範囲は、15〜30、17〜23、19〜23、および19〜21である。ヘアピン構造は、好ましくは3'位、およびヘアピン構造のアンチセンス側に、一本鎖のオーバーハングまたは末端非対領域を有することが好ましい。好ましいオーバーハングのヌクレオチド数は2〜3である。
キメラオリゴヌクレオチドまたは「キメラ」は、2つもしくはそれ以上の化学的に特別な領域を有するオリゴヌクレオチドであり、そのような領域は、それぞれ、少なくとも1個のモノマーユニット（すなわち、オリゴヌクレオチド化合物の場合はヌクレオチド）からなっている。一般的には、これらのオリゴヌクレオチドは、少なくともひとつの領域を含み、ここで、該オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性を強化する、細胞取込を増強させる、および／または標的核酸に対する結合親和性を増強させるように修飾されている。その結果、キメラオリゴヌクレオチドを使用する場合には、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドと比較して、短いオリゴヌクレオチドを用いていられた結果と類似した結果が得られることが多かった。本発明に従うキメラオリゴヌクレオチドは、2もしくはそれ以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、ならびに／または上述したようなオリゴヌクレオチドミメチックからなる複合構造として生成することができる。当該分野においては、そのようなオリゴヌクレオチドは、ハイブリッドまたはギャップマーとも称される。そのようなハイブリッド構造の調製について開示している米国特許の代表例としては次のようなものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない：第5,013,830号、第5,149,797号、第5,220,007号、第5,256,775号、第5,366,878号、第5,403,711号、第5,491,133号、第5,565,350号、第5,623,065号、第5,652,355号、第5,652,356号、第5,700,922号および第5,955,589号など。それらの各々を参照として本明細書中に取り入れておく。ある実施態様においては、キメラオリゴヌクレオチドは、RNA−DNA、DNA−RNA、RNA−DNA−RNA、DNA−RNA−DNAまたはRNA−DNA−RNA−DNAであり、このとき、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド数は5〜60である。
定義
便宜を図るため、請求項、明細書および実施例において使用されている用語をこの項にまとめている。
本明細書において使用している「ヘテロ原子」とは、炭素または水素以外の任意の元素の原子を意味する。好ましいヘテロ原子は、ホウ素、窒素、酸素、リン、硫黄およびセレンである。
「アルキル」とは、飽和脂肪族基のラジカルをさし、直鎖アルキル基、分岐鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基、およびシクロアルキル置換アルキル基などが挙げられる。好ましい実施態様においては、直鎖または分岐鎖アルキルは、骨格内の炭素原子数が30以下であり（例えば、直鎖の場合はC1〜C30、分岐鎖の場合はC3〜C30）、より好ましくは20以下である。同様に、好ましいシクロアルキルは、環構造内の炭素原子数が3〜10であり、より好ましくは、環構造内の炭素原子数は5、6または7である。
炭素原子数を特に指定していない限りは、本明細書において使用している「低級アルキル」は、上に定義したようなアルキル基を意味するが、骨格構造内の炭素原子数は1〜10、より好ましくは1〜6である。同様に、「低級アルケニル」および「低級アルキニル」も同様な長さである。好ましいアルキル基は低級アルキルである。好ましい実施態様においは、明細書中にアルキルとして指定されている置換基は低級アルキルである。
本明細書において使用している「アラルキル」という語は、アリール基（例えば、芳香族または複素芳香族基など）で置換されたアルキル基をさす。例えば、ベンジル基（PhCH2−）はアラルキル基である。
「アルケニル」および「アルキニル」は、長さおよび置換の可能性について、上に定義したアルキルと類似している不飽和脂肪族基をさすが、それぞれ、少なくとも1つの二重結合または三重結合を含む。
本明細書において使用している「アリール」という語は、5、6または7員の単環芳香族基であり、0〜4個のヘテロ原子を含む場合がある。例えば、ベンゼン、アントラセン、ナフタレン、ピレン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジンおよびピリミジンなどが挙げられる。環構造内にヘテロ原子を有するこれらのアリール基は、「アリール複素環」または「複素芳香環」とも称される。芳香環は、環上のひとつもしくはそれ以上の位置において、上に定義したような置換基で置換することができ、そのような置換基としては、ハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、水酸基、アルコキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホナート、ホスフィナート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、複素環、芳香環式もしくは複素芳香環式部位、−CF3、−CNなどが挙げられる。「アリール」には、2もしくはそれ以上の環を有する多環構造も含まれ、2つの隣接する環に対して2個またはそれ以上の炭素が共有されており（そのような環は「融合環」である）、このとき、環のうちの少なくともひとつは芳香族であり、例えば、その他の環はシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリールおよび／もしくは複素環である。
オルト、メタ、およびパラは、それぞれ、1,2−、1,3−および1,4−置換ベンゼンをさす。例えば、1,2−ジメチルベンゼンとオルト−ジメチルベンゼンは同義である。
「複素環」または「複素環式基」は、3〜10員の環構造、より好ましくは3〜7員の環構造をさし、環構造内には1〜4個のヘテロ原子を含む。複素環は多環の場合もある。複素環式基としては、次のようなものが挙げられる：チオフェン、チアンスレン、フラン、ピラン、イソベンゾフラン、クロメン、キサンテン、フェノキサチイン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、イソチアゾール、イソキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナンスリジン、アクリジン、ピリミジン、フェナントロリン、フェナジン、フェナルサジン、フェノチアジン、フラザン、フェノキサジン、ピロリジン、オキソラン、チオラン、オキサゾール、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ラクトン、ラクタム（アゼチジノン類およびピロリジノン類など）、スルタム類およびスルトン類など。複素環は、ひとつもしくはそれ以上の位置において、上述したような置換基を用いて置換することができ、そのような置換基としては、ハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、水酸基、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホナート、ホスフィナート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、ケトン、アルデヒド、エステル、複素環、芳香環式もしくは複素芳香環式部位、−CF3、−CNなどが挙げられる。
「多環」または「多環式基」とは、2個もしくはそれ以上の環（例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、および／もしくは複素環など）をさし、このとき、2個もしくはそれ以上の炭素が2つの隣接する環に共有されている（そのような環は「融合環」である）。非隣接原子を介して結合している環は「架橋環」と称される。多環を構成する各環は、上述のような置換基を用いて置換することができ、そのような置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、水酸基、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホナート、ホスフィナート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、ケトン、アルデヒド、エステル、複素環、芳香環式もしくは複素芳香環式部位、−CF3、−CNなどが挙げられる。
本明細書において使用している「ニトロ」は−NO2を意味し；「ハロゲン」は、−F、−Cl、−Br、−Iをさし；「スルフヒドリル」は−SHを意味し；「水酸基」は−OHを意味し；さらに、「スルホニル」は−SO2−を意味する。
「アミン」および「アミノ」は、当該分野において既知であり、未置換または置換されたアミン類をさし、例えば、次のような一般式で表される部位であって：
ここで、R9、R10およびR'10は、それぞれ別異に、原子価則に許容される基を表す。
「アシルアミノ」は当該分野において既知であり、次のような一般式で表される部位をさし：
ここで、R9は上に定義したとおりであり、R'11は、水素、アルキル、アルケニルまたは−(CH2)m−R8を表し、このとき、R8は上に定義したとおりである。
「アミド」は、当該分野においては、アミノ置換カルボニルと認識されており、次のような一般式で表される部位を含む：
ここで、R9およびR10は上に定義したとおりである。アミドの好ましい実施態様においては、不安定なイミドを含まない。
「アルキルチオ」は、上に定義したようなアルキル基に硫黄ラジカルが結合したものをさす。好ましい実施態様においては、「アルキルチオ」部位は、−S−アルキル、−S−アルケニル、−S−アルキニル、および−S(CH2)m−R8で表わされ、このとき、R8は上に定義したとおりである。代表的なアルキルチオ基としては、メチルチオ、エチルチオなどが挙げられる。
「カルボニル」は当該分野において既知であり、次のような一般式で表される部位を含む：
ここで、Xは、結合または酸素もしくは硫黄を表し；R11は、水素、アルキル、アルケニル、(CH2)m−R8、または薬剤学的に許容される塩を表し；R'11は、水素、アルキル、アルケニルまたは(CH2)m−R8を表し、このとき、R8は上に定義したとおりである。Xが酸素であり、かつ、R11もしくはR'11が水素でない場合には、該構造式は「エステル」を表す。Xが酸素であり、かつ、R11は上に定義したとおりである場合には、そのような部位はカルボキシル基と称され、特に、R11が水素である場合には、該構造式は「カルボン酸」を表す。Xが酸素であり、かつ、R'11が水素である場合には、該構造式は「ホルメート」を表す。一般的に、上の構造式の酸素原子を硫黄に置換した場合には、該構造式は「チオカルボニル」基を表す。Xが硫黄であり、かつ、R11もしくはR'11が水素でない場合には、該構造式は「チオエステル」を表す。Xが硫黄であり、R11が水素である場合には、該構造式は「チオカルボン酸」を表す。Xが硫黄であり、かつ、R'11が水素である場合には、該構造式は「チオホルメート」を表す。一方、Xが結合であり、R11が水素でない場合には、該構造式は「ケトン」基を表す。Xが結合であり、R11が水素である場合には、該構造式は「アルデヒド」基を表す。
本明細書において使用している「アルコキシル」または「アルコキシ」とは、上に定義したアルキル基に酸素ラジカルが結合したものをさす。代表的なアルコキシル基としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、tert−ブトキシなどが挙げられる。「エーテル」は、2個の炭化水素が酸素によって共有結合しているものである。従って、アルキルをエーテルにするようなアルキルの置換基は、アルコキシルであり、次のうちのひとつで表すことができ、−O−アルキル、−O−アルケニル、−O−アルキニル、および−O(CH2)m−R8、このとき、mおよびR8は上に定義したとおりである。
「スルホナート」は当該分野において既知であり、次のような一般式で表される部位を含む：
ここで、R41は、電子対、水素、アルキル、シクロアルキルまたはアリールである。
トリフリル、トシル、メシルおよびノナフリルは当該分野において既知であり、それぞれ、トリフルオロメタンスルホニル基、p−トルエンスルホニル基、メタンスルホニル基およびノナフルオロブタンスルホニル基をさす。トリフラート、トシラート、メシラートおよびノナフラートは、当該分野において既知であり、それぞれ、トリフルオロメタンスルホナートエステル官能基、p−トルエンスルホナートエステル官能基、メタンスルホナートエステル官能基およびノナフルオロブタンスルホナートエステル官能基を含む分子をさす。
Me、Et、Ph、Tf、Nf、Ts、Msという略語は、それぞれ、メチル、エチル、フェニル、トリフルオロメタンスルホニル、ノナフルオロブタンスルホニル、p−トルエンスルホニル、およびメタンスルホニルを表す。当該分野の通常の知識を有する有機化学者によって用いられる略号の総合的な表は、Journal of Organic Chemistryの各巻の最初の号に記載されており、この表は、一般的には、「略号標準表（Standard List of Abbreviations）」と表題が付けられている表の中に含まれている。概表中に含まれている略号、および当該分野の標準的な知識を有する有機化学者によって使用される全ての略号を参照として本明細書中に取り入れておく。
「スルフェート」は当該分野において既知であり、次のような一般式で表される部位を含む：
ここで、R41は、上に定義したとおりである。
「スルホニルアミノ」は、当該分野において既知であり、次のような一般式で表される部位を含む：
「スルファモイル」は、当該分野において既知であり、次のような一般式で表される部位を含む：
本明細書において使用されている「スルホニル」は次のような一般式で表される部位をさし：
ここで、R44は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、複素環、アリールまたはヘテロアリールより成る群から選択される。
本明細書において使用されている「スルホキシド」は、次のような一般式で表される部位をさし：
ここで、R44は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、複素環、アラルキルまたはアリールより成る群から選択される。
「セレノアルキル」は、置換されたセレノ基が結合したアルキル基をさす。アルキルが置換された「セレノエーテル」の代表例としては、−Se−アルキル、−Se−アルケニル、−Se−アルキニル、および−Se(CH2)m−R7が挙げられ、このとき、mおよびR7は上に定義したとおりである。
アルケニルおよびアルキニル基に同様な置換を行い、例えば、アミノアルケニル、アミノアルキニル、アミドアルケニル、アミドアルキニル、イミノアルケニル、イミノアルキニル、チオアルケニル、チオアルキニル、カルボニル置換アルケニルもしくはアルキニルなどを調製することができる。
本明細書において使用しているように、各表現の定義（例えば、アルキル、ｍ、nなど）は、ある構造内で1回以上使用されている場合には、同一構造内の別の場所における定義とは無関係である。
「置換」または「〜で置換された」とは、置換された原子と置換基との間で許容される原子価に従っており、また、置換によって安定な化合物が得られる（例えば、再配列、環化、排除などのような偶発的に進行した転移ではない）という暗黙の了解を含む。
本明細書において使用されているように、「置換された」とは、有機化合物について、許容される全ての置換基を含むことを意図する。広義には、許容される置換基とは、有機化合物の非環式および環式、分岐および未分岐、炭素環式および複素環式、芳香環式および非芳香環式の置換基を含む。代表的な置換基は、例えば、上に記載したものなどが挙げられる。さらに置換基としては、ハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホナート、ホスフィナート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、複素環、芳香環式もしくは複素芳香環式部位、−CF3、−CNなどを用いることができる。許容される置換基は、適切な有機化合物に対して、ひとつもしくはそれ以上、ならびに、同一もしくは別異のものを用いることができる。本発明の目的を達成するためには、窒素などのヘテロ原子は、水素置換基、ならびに／または、本明細書に記載されている有機化合物に許容される任意の置換であって、基該ヘテロ原子の原子価を満たすものを有する。本発明は、如何なる意味においても、有機化合物の許容される置換基によって制限されるものではない。
本明細書において使用している「保護基」とは、所望しない化学的転換から反応性の高い官能基を保護する一時的な置換基を意味する。そのような保護基の例としては、カルボン酸に対するエステル、アルコールに対するシリルエーテル、アルデヒドおよびケトンに対するアセタールおよびケタールなどが挙げられる。保護基化学の分野については総説が書かれている（グリーン（Greene）,T.W.、ヴッツ（Wuts）,P.G.M.、「有機合成における保護基（Protective Groups in Organic Synthesis）」第2版、ウィレー（Wiley）社、ニューヨーク、1991年）。
本発明に従うある種の化合物には、特定の幾何学的または立体異性体型が存在する。本発明は、シス−およびトランス−異性体、R−およびS−鏡像異性体、ジアステレオ異性体、（D)−異性体、（L)−異性体、それらのラセミ混合物、さらに、本発明の範ちゅうに属するそれらのその他の混合物を含むそのような化合物の全てを包含する。アルキル基などの置換基内には、さらに不斉炭素原子が存在する場合がある。そのような異性体の全て、ならびにそれらの混合物も本発明の範ちゅうに包含される。
例えば、本発明に従うある化合物の特定の鏡像異性体が所望される場合には、不斉合成により、あるいは、キラル補助基を用いた誘導によって調製することができ、後者の場合には、得られたジアステレオ混合物を分離し、補助基を解裂させることによって所望する純粋な鏡像異性体を得る。別の方法としては、分子がアミノなどの塩基性官能基、またはカルボキシルなどの酸性官能基を有する場合には、適切な光学活性酸また塩基を用いてジアステレオ異性体塩を形成させ、次に、当該分野において既知の分別結晶化またはクロマトグラフィー法によって該ジアステレオ異性体を分割し、続いて純粋な鏡像異性体を回収する。
上述の化合物の等価物としては、その他の点ではそれらに対応している化合物、および、それらと同一の一般的特性を有する化合物（例えば、鎮痛剤として作用するものなど）などが挙げられ、このとき、置換基に対してひとつもしくはそれ以上の単純な修飾が施されており、それによって該化合物のシグマレセプターへの結合性に悪影響を及ぼさない。一般的に、本発明に従う化合物は、以下に記載しているような一般的な反応式に示されている方法、または、簡単に入手できる出発材料、反応試薬および従来から行われている合成手順を用いたそのような方法の変形法によって調製することができる。これらの反応においては、既知ではあるが本明細書においては言及されていない変異体を使用することも可能である。
本発明の目的を達成するためには、化学元素は、CAS版の周期律表（Periodic Table of Elements,CAS version）（「化学および物理学のハンドブック（Handbook of Chemistry and Physics）」、第67版、1986-87、表紙の内側）に従って確認する。
本発明を一般的に記載してきたが、以下の実施例を参照にすることにより、よりわかり易いはずである。以下の実施例は、本発明の特定の側面および実施態様を示すことのみを目的にしており、本発明を制限するためのものではない。
実施例１：ホスホルアミダイトアクチベーター35〜48を用いたオリゴヌクレオチドの合成（図1〜３を参照）
ある実施態様においては、活性化塩を形成させることにより、アクチベーターの強度が増し、RNA合成のカップリング時間が減少する。
デカマーRNA分子（49、5'−CAUCGCTGAdT−3'）は、メーカーが作成した標準的な98段階サイクルについて、いくつかの待ち段階に以下のように変形を加え、394ABI装置（ALN 0208）上で合成した。固体支持体は、制御多孔質ガラス（CPG、充填済み、1μM、500、プロリゴ・バイオケミー（Proligo Biochemie）社）であり、モノマーは、ファスト脱保護基が結合したRNAホスホルアミダイト（ピアス核酸テクノロジーズ（Pierce Nucleic Acid Technologies）社）を、特に指定していない限りは、アセトニトリル（CH3CN）中、0.15Mの濃度で用いた。特に、RNAホスホルアミダイトは、5'−O−ジメトキシトリチル−N6−フェノキシアセチル−2'−O−t−ブチルジメチルシリル−アデノシン−3'−O−（β−シアノエチル−N,N'−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト、5'−O−ジメトキシトリチル−N2−p−イソプロピルフェノキシアセチル−2'−O−t−ブチルジメチルシリル−グアノシン−3'−O−（β−シアノエチル−N,N'−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト、5'−O−ジメトキシトリチル−N4−アセチル−2'−O−t−ブチルジメチルシリル−シチジン−3'−O−（β−シアノエチル−N,N'−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト、および5'−O−ジメトキシトリチル−2'−O−t−ブチルジメチルシリル−ウリジン−3'−O−（β−シアノエチル−N,N'−ジイソプロピル）−ホスホルアミダイトである。
5−（エチルチオ）−1H−テトラゾール（ETT、0.25M、グレン・リサーチ（Glen Research）社）に対する塩濃度が10、20および40モル％の時のカップリング時間は、それぞれ1、3または5分とした。必要なモル％のETTのジイソプロピルアンモニウム塩は、0.25MのETT溶液に計算した量の無水ジイソプロピルアミンを加えることによって得られ、モレキュラーシーブを加えて4〜6時間保存した。その他の反応試薬の詳細については以下に記載する：CapA：5％の無水フェノキシ酢酸／THF／ピリジン（グレン・リサーチ（Glen Research）社）、およびCapB：10％のN−メチルイミダゾール／THF（グレン・リサーチ（Glen Research）社）；酸化剤は、THF／水／ピリジン中の0.02Mのヨウ素（グレン・リサーチ（Glen Research）社）、脱トリチル化は、3％のTCA／ジクロロメタン（プロリゴ（Proligo）社）を用いて行った。
合成完結後、CPGは、スクリューキャップ付きRNase不含微量遠心管に移した。40％のメチルアミン：アンモニア（1：1）の混合物1.0ml中、65℃で30分かけて塩基およびホスフェート基を同時に脱保護することにより、CPGからオリゴヌクレオチドを解裂させた。溶液を凍結乾燥して乾燥させた。
実施例２：化合物1の合成（R'=H、およびR''=C(S)OEt、あるいは、R',R''＝H）
チオ尿素（7.62ｇ、0.1mol）の乾燥エーテル（500ml）溶液およびトリエチルアミン（14ml、0.1mol）は、アルゴン雰囲気下、氷槽中で3時間冷却し、これに、クロロカルボニルスルフェニルクロリド（8.4ml、0.1mol）の乾燥エーテル（50ml）溶液を滴下した。反応混合物は同じ温度で計6時間撹拌した。固体をろ去し、ろ液を濃縮して粗残渣を得、これをジクロロメタン−ヘキサンから結晶化させることによって純粋な化合物（2.5ｇ）を得た。母液を濃縮して粗残渣を得、これをシリカゲルカラムにかけてジクロロメタン−メタノール（40：1）で溶出させることにより、純粋な化合物（180mg）を得た。総収率は約30％であった。1H-NMR（CDCl3、400MHz）：δ10.46(br,1H),4.38(q,2H,J=6.8,14.4Hz,CH2),1.39(t,H,J=7.2Hz,CH3)；13C-NMR（CDCl3、100MHz）: 181.01,177.00,153.75,64.68,14.32
実施例３：硫黄転移反応試薬1を用いたジ−およびポリ−オリゴチミジンのホスホロチオエート化（R'=H、およびR''=C(S)OEt、あるいは、R',R''＝H）
ジヌクレオチド2およびヘキサマー3は、メーカーが作成した標準的な93段階サイクルに、以下のように待ち段階に変形を加え、394ABI装置上で合成した。アクチベーターとしては5−（エチルチオ）−1H−テトラゾール（0.25M）を用い、PS−酸化には1の無水アセトニトリル溶液（0.05M）を用いた。硫化時間は約4分であった。合成完結後、55℃において水性アンモニアで1時間処理することにより、支持体から2および3を脱保護した。HPLC精製後、化合物をLC-MSで分析した。
硫黄転移反応試薬として1を用いたオリゴチミジンのホスホロチオエート化の結果を下に示す：
実施例４：P=O、P=SおよびP=O/P=S混合骨格を有するオリゴヌクレオチドの中量／大量合成
A.P=O骨格を有する配列23およびP=S骨格を有する配列24の固相合成
ÅKTA OligoPilot 100を使用し、500ÅのdT-CPGを用いた6.3mlのカラムで200μmolスケールの合成を行った（担体1gあたり97μmol）（プライム・シンセシス（Prime Synthesis）社、ペンシルバニア州アストン）。脱トリチル化は、ジクロロメタン（CH2Cl2）中、3％のジクロロ酢酸（DCA）を用いて行った。カップリングは、アセトニトリル（MeCN）中、それぞれ0.2Mに調整したDNA3'−β−シアノエチルホスホルアミダイト（CEP）（2当量）またはRNA3'−β−シアノエチルホスホルアミダイト（2.5当量）（ピアス核酸（Pierce Nucleic Acids）社、ウィスコンシン州ミルウォーキー）を用いて行った。アクチベーターは、MeCN中で0.6Mに調整した5−エチルチオテトラゾール（アメリカン・インターナショナル・ケミカル（American International Chemical）社、マサチューセッツ州ナティック）であり、RNA CEPに対しては3倍過量、DNA CEPに対しては4.5倍過量で使用した。酸化は、90％のピリジン＋10％の水中、50mMのI2を介して、または、MeCN中で0.05Mの3−エトキシ−1,2,4−ジチアゾリジン−5−オン（EDITH）を用いて行った（Q.ク（Xu）ら、Nucleic Acids Research,24(18):3643-3644）。キャッピングは、MeCN中、10％の無水酢酸（Ac2O）＋10％の1−メチルイミダゾール（1−MeIm）＋15％の2,6−ルチジンを用いて行った。
合成後、40％のメチルアミン（MeNH2）水溶液25ml中、200rpm、60℃で20分かけて支持体を脱保護し、次に、ドライアイス（CO2（固体））中で冷却してから支持体を焼結ガラスろうとでろ去し、さらに75mlのジメチルスルホキシド（DMSO）で洗浄し、洗浄液をろ液に加えた。この溶液に25mlのトリエチルアンモニウムトリヒドロフルオリド（TEA・3HF、TREAT）を入れ、次に、200rpm、60℃で20分間加熱した。この溶液をCO2（固体）中で冷却後、20mMの酢酸ナトリウム（NaOAc）（125ml）を用いて希釈し、pHが6であることを確認した。必要であれば、HClを用いてpHを調整した。
分析は、Dionex 4×250mm DNAPakカラムを用い、Agilent 1100シリーズのHPLCで行った。緩衝液Aは、1mMのEDTA、25mMのTris（pH8）、20mMのNaClO4であった。緩衝液Bは、1mMのEDTA、25mMのTris（pH8）、0.4MのNaClO4であった。分離は、緩衝液Bの割合を0から40％まで変化させ、カラムを65℃に加熱して行った。
材料は、Hi Load Qセファロースをカラム床から10cmの高さまで充填したXK26/10カラム（アマシャム・バイオサイエンシーズ（Amersham Biosciences）社、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を取り付けたÅKTA Explorerで精製した。緩衝液Aは、1mMのEDTA、25mMのTris（pH8）であった。緩衝液Bは、1mMのEDTA、25mMのTris（pH8）、0.4MのNaClO4であった。粗材料は水で4〜6倍に希釈してカラムかけた。プールされた精製材料＝8.1kAU（96％、イオン交換（IEX）による）。
粗材料を含む溶液を4〜6倍に希釈し、1〜3kAUの量をカラムに入れ、緩衝液Bの割合を0から60％まで変化させ、10ml／分で溶出させた。適切なフラクションをプールし、このプールした材料は、Sephadex G25を充填した、BioPlotカラム（直径6cm×長さ7.5cm）に30ml量を加え、水に対して脱塩を行った。溶出液を減圧蒸留して25ml以下にし、外部を冷凍し（shell-frozen）、凍結乾燥した。
23および24の合成から得られた結果を以下に示す。精製は、ÅKTA Explorerでおこない、「nd」は、値が測定できなかったことを意味することに注意：
B.フェニルアセチルジスルフィドまたは3−エトキシ−1,2,4−ジチアゾリジン−5−オンを用いた混合ホスホロチオエート−ホスホジエステルオリゴリボヌクレオチドの固相合成
ÅKTA OligoPilot 100を使用し、500ÅのdT-CPGを用いた6.3mlのカラムで200μmolスケールの合成を行った（担体1gあたり97μmol） （プライム・シンセシス（Prime Synthesis）社、ペンシルバニア州アストン）。脱トリチル化は、ジクロロメタン（CH2Cl2）中、3％のジクロロ酢酸（DCA）を用いて行った。カップリングは、アセトニトリル（MeCN）中でそれぞれ0.2Mに調整したDNA CEP（2当量）またはRNACEP（2.5当量）（ピアス核酸（Pierce Nucleic Acids）社、ウィスコンシン州ミルウォーキー）を用いて行った。アクチベーターは、MeCN中、0.6Mの5−エチルチオテトラゾール（アメリカン・インターナショナル・ケミカル（American International Chemical）社、マサチューセッツ州ナティック）であり、RNA CEPに対しては3倍過量、DNA CEPに対しては4.5倍過量で使用した。酸化は、90％のピリジン＋10％の水中、50mMのI2を介して行った。チオール化は、3−ピコリン：MeCN（1：1）中で0.2Mのフェニルアセチルジスルフィド（PADS）を用いて、または、MeCN中で0.05Mの3−エトキシ−1,2,4−ジチアゾリジン−5−オン（EDITH）を用いることにより行った（Q.ク（Xu）ら、Nucleic Acids Research,24(18):3643-3644）。キャッピングは、MeCN中、10％の無水酢酸（Ac2O）＋10％の1−メチルイミダゾール（1−MeIm）＋15％の2,6−ルチジンを用いて行った。EDITHを用いる場合には、キャッピングは、チオール化反応の前後のいずれでも行うことができた（M.マ（Ma）ら、Nucleic Acids Research,25(18):3590-3593(1997)）。
合成後、40％のメチルアミン（MeNH2）水溶液25ml中、200rpm、60℃で20分かけて支持体を脱保護し、次に、ドライアイス（CO2（固体））中で冷却してから支持体を焼結ガラスろうとでろ去し、さらに75mlのジメチルスルホキシド（DMSO）で洗浄し、洗浄液をろ液に加えた。この溶液に25mlのトリエチルアンモニウムトリヒドロフルオリド（TEA・3HF、TREAT）を入れ、次に、200rpm、60℃で20分間加熱した。この溶液をCO2（固体）中で冷却後、20mMの酢酸ナトリウム（NaOAc）（125ml）を用いて希釈し、pHが6であることを確認した。必要であれば、HClを用いてpHを調整した。
分析は、Dionex 4×250mm DNAPakカラムを用い、Agilent 1100シリーズのHPLCで行った。緩衝液Aは、1mMのEDTA、25mMのTris（pH9）、50mMのNaClO4、20％のMeCNであった。緩衝液Bは、1mMのEDTA、25mMのTris（pH9）、0.4MのNaClO4、20％のMeCNであった。分離は、緩衝液Bの割合を0から65％まで変化させ、カラムを65℃に加熱して行った。
材料は、TSKgel Q 5PW（トーソー・バイオサイエンシーズ（Tosoh Biosciences）社）をカラム床から28cmの高さ（＝1.08L）まで充填したFineLine 70カラムを取り付けたÅKTA Pilotで精製した。緩衝液Aは、1mMのEDTA、25mMのTris（pH9）であった。緩衝液Bは、1mMのEDTA、25mMのTris（pH9）、0.4MのNaClO4であった。緩衝液は、4kWの緩衝液ヒーターを65℃にセットして加熱し、カラムの出口温度が45℃になるようにした。粗材料は水で4〜6倍に希釈してカラムかけ、緩衝液Bの割合を0から60％まで変化させ、200ml／分で溶出させた。適切なフラクションをプールし、このプールした材料は、Sephadex G-25を充填したBioPilotカラム（直径6cm×長さ7.5cm）に30mlを加え、水に対して脱塩を行った。溶出液を減圧蒸留して25ml以下にし、外部を冷凍し（shell-frozen）、凍結乾燥した。
PADSまたはEDITHを用いて行った25および26の合成結果を図６に示す。EDITHへの接触時間は、Q.ク（Xu）らによって推奨された時間よりも短い（ク（Xu）らが2分であるのに対して、本実施例においては1分）ことに注意されたい。
実施例５：脱保護条件
概論
多様な脱保護法に対して、以下のオリゴヌクレオチド配列を使用した：
方法１
PyHFおよびDBU（容量比約1：4）をDMSO（PyHFの4〜5倍量）に溶解して混合し、65℃で15分加熱した。これが2段階反応の条件である。
対照：27の約1μmolのサンプルは、MeNH2を用い、65℃で20分間加熱して脱保護し、乾燥させた。次に、0.1mlのTEA・3HF、0.075mlのTEAおよび0.15mlのDMSOの混合物を用い、65℃で1.5時間かけて処理した。陰イオン交換HPLCを用いて測定した収率は47／54％（260nm／280nm）であった。MeNH2を用い、65℃で20分間加熱して脱保護した27のODサンプル（0.5μmol）は、10μlのPyHF、50μlのDBUおよび50μlのDMSOの混合液に溶解し、65℃に加熱した。10分後の収率は55／53％、20分後の収率は57／57％、30分後の収率は57／58％、1時間後の収率は57／57％であった。この1：5混合物のpHは、水を加えることにより、約10であることがわかった。故に、MeNH2で脱保護し、乾燥させた約0.5μmolの27は、6.5μlのPyHF、27.4μlのDBUおよび26μlのDMSO中、65℃で15分および70分加熱することによって脱保護された。15分後および70分後の収率は57／57％であった。27の約4μmolのサンプルは、濃アンモニアを用い、65℃で1時間加熱して脱保護し、乾燥させた。残渣は、0.06mlのPyHF、0.24mlのDBUおよび0.3mlのDMSOの混合物に溶解し、65℃で15分間加熱した。収率は58／60％であった。27の約4μmolのサンプルは、エタノール性アンモニアを用い、65℃で1時間加熱して脱保護し、乾燥させた。0.06mlのPyHF、0.24mlのDBUおよび0.3mlのDMSOの混合物を用い、65℃で15分間かけてRNAを処理した。収率は59／60％であった。
化合物29は、1μmolスケールで合成した。サンプルは、エタノール性アンモニアを用い、65℃で1時間加熱して脱保護し、半分に分け（71ODおよび77OD）、乾燥させた。27μlのPyHF、108μlのDBUおよび135μlのDMSOを混合した。この混合物の半量を用いて77ODサンプルを65℃で20分間処理し、残りの半量を用いて71ODサンプルを30分間処理した。20分後収率は64／63％、30分後の収率は62／63％であった。完全に硫化されている31は、エタノール性アンモニアを用い、65℃で45分間かけて脱保護した。粗混合物を半分に分けて乾燥させたが、各サンプルは76ODであった。20μlのPyHF、80μlのDBUおよび100μlのDMSOを混合し、その半量にひとつのサンプルを溶解し、残りの半量にもうひとつのサンプルを溶解した。65℃において、20分後の収率は64／81％、30分後の収率は63／81％であった。LC-MSにおいては、PS／PO転換は検出されなかった。
28の一部は、MeNH2を用い、65℃で20分間加熱して脱保護した。粗混合物は、約40ODのサンプルに分けて乾燥させた。28の残りは、エタノール性アンモニアを用い、65℃で40分間加熱して脱保護し、これも約40ODのサンプルに分けて乾燥させた。MeNH2を用いて脱保護したサンプルの一部について、標準的な方法（16μlのTEA・3HF、12μlのTEAおよび24μlのDMSO、65℃）で脱シリル化したところ、30分後の収率は37／36％、1時間後の収率は41／49％、1.5時間後の収率は38／43％、および2.5時間後の収率は42／42％であった。MeNH2を用いて脱保護したサンプルの二番目の部分について、9μlのTEA・3HF、36μlのDBUおよび36μlのDMSOの混合物を用い、65℃で脱シリル化したところ、15分後の収率は44／45％、30分後の収率は46／45％、1時間後の収率は45／44％、1.5時間後の収率は45／44％、および2.5時間後の収率は44／48％であった。MeNH2を用いて脱保護したサンプルの別の一部について、9μlのPyHF、31.5μlのDBUおよび31.5μlのDMSOの混合物を用い、65℃で脱シリル化したところ、15分後の収率は42／45％、30分後の収率は45／47％、1時間後の収率は45／44％、1.5時間後の収率は45／48％、および2.5時間後の収率は39／47％であった。エタノール性アンモニアで脱保護したサンプルの一部について、標準的な方法（16μlのTEA・3HF、12μlのTEAおよび24μlのDMSO、65℃）で脱シリル化したところ、30分後の収率は40／39％、1時間後の収率は49／51％、1.5時間後の収率は49／51％、および2.5時間後の収率は47／49％であった。エタノール性アンモニアで脱保護したサンプルの二番目の部分について、9μlのPyHF、36μlのDBUおよび36μlのDMSOの混合物を用い、65℃で脱シリル化したところ、15分後の収率は50／50％、30分後の収率は49／49％、1時間後の収率は53／54％、1.5時間後の収率は55／58％、および2.5時間後の収率は54／54％であった。エタノール性アンモニアで脱保護したサンプルの別の一部について、9μlのPyHF、31.5μlのDBUおよび3
1.5μlのDMSOの混合物を用い、65℃で脱シリル化したところ、15分後の収率は52／52％、30分後の収率は52／51％、1時間後の収率は52／52％、1.5時間後の収率は53／55％、および2.5時間後の収率は52／55％であった。
29の標準的な脱保護法による収率は47／48％であった。29について、エタノール性アンモニアを用いて65℃で1時間脱保護を行った後、105μlのPyHF、367.5μlのDBUおよび300μlのDMSOの混合物を用い、65℃で15分処理した後の収率は47／49％であった。支持体の一部は、エタノール性アンモニアを用い、65℃で1.5時間処理し、105μlのPyHF、367.5μlのDBUおよび300μlのDMSOの混合物に溶解し、65℃で15分間加熱後の収率は47／47％であった。
32／34について、エタノール性アンモニアを用い、65℃で1時間かけて脱保護し、続いて、1：3.5混合物脱シリル化を65℃で20分／30分間かけて行ったときの収率は、60／61％および61／61％であった。1μmolスケールで合成した33については、標準的脱保護法およびピリジン−HF／DBU脱保護法の両方を行ったところ、標準的方法による収率は41／40％であり、ピリジン−HF／DBU法による収率は45／43％であった。
方法２：一段階法
シリル脱保護反応試薬：エタノール性アンモニア1容量につき、脱シリル化混合物（1mlのPyHF、3.5mlのDBU、4mlのDMSO）4容量を用い、60℃で20分間加熱した。
この方法は、28をMeNH2で脱保護した後、約40ODのサンプルを用いて試験した。20μlのエタノール性アンモニアを用いてオリゴヌクレオチドを溶解し、次に、80μlのPyHF反応試薬（1mlのPyHF＋3.5mlのDBU＋4mlのDMSOの混合物）をサンプルに加えた。60℃で20分、1時間および2時間加熱した場合の収率は、49／45％であった。この条件下においては、脱保護は、RNAの分解を起こすことなく20分で完結した。
方法３：二段階法
シリル脱保護反応試薬：ポリ［4−ビニルピリジニウムポリ（ヒドロジェンフルオリド）］（PVPHF）1mgあたり、5μlのDMSO＋2.5μlのDBUを用い、65℃で20分間加熱した。
エタノール性アンモニアで脱保護し、乾燥させた27のうち、約40ODのサンプルを50μlのDMSOに溶解した。25μlのDBUおよび10mgのPVPHFを加えて65℃に加熱した。20分後の収率は52／51％、40分後の収率は54／57％、および90分後の収率は55／62％であった。50μlのDMSO＋30μlのDBU＋10mgのPVPHFを用いて65℃でサンプルを処理した場合には、20分後の収率は48／51％、40分後の収率は50／50％、および1.5時間後の収率は48／48％であった。
方法４：一段階脱保護法
PVPHFを用いた一段階脱保護：エタノール性アンモニア10μlに約30〜40μlのDMSOおよび約3mgのPVPHFを加えた。脱保護の所要時間は1.5時間以内である。
エタノール性アンモニアで脱保護し、乾燥させた28のうち、約40ODのサンプルを30μlのエタノール性アンモニアに再溶解し、90μlのDMSOおよび9mgのPVPHFを加えた。脱保護は20分では完結しなかった。40分後の収率は49／51％、1.5時間後の収率は51／51％であった。28の第二のサンプルは、25μlのエタノール性アンモニアおよび9mgのPVPHFを加えたDMSO（100μl）に溶解した。反応は20分では完結しなかった。40分後の収率は41／50％、1.5時間後の収率は50／57％であった。MeNH2で脱保護した28の一部は、20μlのエタノール性アンモニアおよび10mgのPVPHFを加えたDMSO（80μl）に再溶解したが、この場合、50分後の収率は42／42％であった。
方法５
PVPHFを用いた一段階脱保護：エタノール性アンモニア10μlに約30〜40μlのDMSO、5μlのDBUおよび約4.5mgのPVPHFを加えた。脱保護の所要時間は40分以内である。
MeNH2で脱保護し、乾燥させた28のうち、約40ODのサンプルを20μlのエタノール性アンモニアに再溶解し、80μlのDMSO、10μlのDBUおよび9mgのPVPHFを加えた。この方法により、40分後の収率は45／45％、1.5時間後の収率は46／49％であった。
方法６：RNA合成のためのシリル脱保護試薬としてトリス（ジメチルアミノ）スルホニウムジフルオロトリメチルシリケート（TAS-F）を使用する方法
約1μmolのメチルアミンで脱保護し、乾燥させた27は、0.2mlのDMF中に0.16gのTAS-Fを加えた溶液を用いて55℃で2時間処理した。反応は完結せず、溶液の一部がゲル状になり、反応混合物は均一ではなかった。この反応混合物に20μｌの水を加えた。55℃で一晩放置すると、反応混合物は透明になった。HPLC精製を行ったところ、この反応の収率は51／55％であった。本反応の再現性はよくなかった。80mgのTAS-Fおよび0.2mlのピリジンを用い、約0.6μmolの27を65℃で処理した。2時間後の収率はわずかに22／21％であった。80mgのTAS-Fおよび0.2mlのN−メチルピロリジノンを用い、約0.6μmolの27を65℃で処理した。反応過程において沈殿が生成し、2時間後の収率は34／37％であった。27mgのTAS-F、0.15mlのN−メチルピロリジノンおよび0.5mlのDMSOを用い、約0.4μmolの27を65℃で2時間処理した。収率は35／24％であった。27mgのTAS-F、0.15mlのN−メチルピロリジノンおよび0.05mlのDMSOを用い、約0.4μmolの27を65℃で2時間処理した。収率は25／25％であった。27mgのTAS-F、0.15mlのN−メチルピロリジノンおよび0.05mlのピリジンを用い、約0.4μmolの27を65℃で2時間処理した。収率は22／22％であった。エタノール性アンモニアで脱保護し、乾燥させた27の約1μmolのサンプルについて、75mgのTAS-Fおよび0.2mlのDMSOを用いて65℃で処理した。2時間後の収率は39／41％であった。同じサンプル約1μmolについて、75mgのTAS-Fおよび0.2mlのDMFを用い、65℃で処理した。反応の進行中に沈殿が生成し、2時間後の収率は21／21％であった。アンモニアで脱保護し、乾燥させた27の約1μmolについて、75mgのTAS-Fおよび0.2mlのDMSOを用い、65℃で処理した。2時間後の収率は31／30％であった。同じサンプル約1μmolについて、75mgのTAS-Fおよび0.2mlのDMFを用い、65℃で処理した。沈殿が生成し、2時間後の収率は21／24％であった。
MeNH2で脱保護し（65℃、20分）、乾燥させた28の約40ODのサンプルについて、41mgのTAS-Fおよび90μlのDMFを用い、65℃で処理した。注入は30分後、1時間後、2時間後に終了し、その後、室温で一晩放置した。めぼしい量の反応生成物は得られなかった。別の約40ODのサンプルについて、41mgのTAS-F、90μlのDMFおよび40μlの水を用い、65℃で処理した。注入は30分後、1時間後、2時間後に終了し、その後、室温で一晩放置した。HPLCにおいては、生成物に相当する主要ピークは検出されなかった。エタノール性アンモニアで脱保護した（65℃、40分）28の約40ODのサンプルについて、同様の脱保護条件を適用したが、結果は同様であった（主要ピークは検出されず）。
実施例６：RNAの2'−シリル基に対するマイクロ波を用いた脱保護
A.脱保護１（標準法）
オリゴヌクレオチドは、塩基およびホスフェート基の脱保護と同様に、2.0mlのアンモニア混合物および8Mのエタノール性メチルアミン（1：1）を用い、65℃、30分かけて支持体から解裂させた。反応管を氷上で短時間冷却し、エタノール性アンモニア混合物を新しい微量遠心管に移した。CPGは、脱イオン水（2×0.1ml）で洗浄し、ドライアイス上に10分間置いた後、真空乾燥機（speed vac.）内で乾燥させた。
B.RNAの2'−O−TBDMS基に対するマイクロ波を用いた脱保護
オリゴヌクレオチド50および51の約12ODのサンプルは、600μlの反応試薬A〜Cに懸濁させた。オリゴヌクレオチドを入れた反応管をマイクロ波装置内に入れた。CEM Discover Explorer内で溶液にマイクロ波を2分間および4分間照射した。
精査（Work up）
条件A：TBAFの場合、マイクロ波照射後、反応を水で停止し、次に脱塩した。
条件B：反応は、400μlのイソプロポキシトリメチルシラン（iPrOSiMe3、アルドリッヒ（Aldrich）社）で停止し、さらに、キャップを開け、ヒーティングブロック上で10分間インキュベートした（このことにより、揮発性のイソプロポキシトリメチルシリルフルオリド付加物が蒸発する）。残った反応停止試薬は、真空乾燥機内で乾燥することによって除去した。3％のトリエチルアミン（ジエチルエール中、1.5ml）を加え、遠心分離を行った。ペレットを乱さないようにして、上清をピペットで除去した。真空乾燥機内でペレットを乾燥させた。粗RNAは、微量遠心管内に白色綿状の物質として得られた：
実施例７
発明者らは、一本鎖RNA組成物中の不純物は、一本鎖RNAの混合物をアニールして二本鎖RNAを形成させたものについて、HPLC精製を行うことによって容易に除去できるという驚くべき事実を発見した。
一般的方法
図９に、精製法の全体的な流れを図示している。AL-DP-4014の精製に対して使用した特別な方法については、図１１および１２に示している。
逆相HPLC精製、イオン交換HPLC精製、キャピラリーゲル電気泳動およびLC-MSに用いた条件を以下に示す。
逆相HPLC:
Luna C-18カラム、150×2.0mm、温度＝25℃、流速＝0.2ml／分
緩衝液A：35mm TEAA (pH7)、100mmHFIP
緩衝液B：MeOH
濃度勾配：50分でBを25から35％に、さらに、55分時にBが85％になるように上昇させ、再平衡化
イオン交換HPLC
Dnapac PA-100イオン交換カラム、250×4mm、温度＝65℃、流速＝1ml／分
緩衝液A：50mMのNaClO4、25mMのTris（pH9.0）、1mMのEDTA、20％のCAN
緩衝液B：400mMのNaClO4、25mMのTris（pH9.0）、1mMのEDTA、20％のCAN
濃度勾配：2.00分間Bは0％、17分時にBが40％になるように上昇させ、○分時にBが65％になるように上昇させ、さらに、32.5分時にBが100％になるように上昇させた後、再平衡化
キャピラリーゲル電気泳動
DNA 100R Gel、温度＝40℃
12KVで分離し、極を逆にする
LC-MS分析
Chromolith speedrod 50×4mm、温度＝25℃、流速＝0.8ml／分
緩衝液A：20％のMeOH、10mMのTBAA、pH7.0
緩衝液B：80％のMeOH、10mMのTBAA、pH7.0
濃度勾配：19.5分間にBを40％から80％に、23分時にBを100％まで上昇させた後、再平衡化
負イオンモードで500〜3000まで質量をスキャンする。
結果
AL-DP-4014の精製に用いた特別な方法については、図１１および１２に示している。図１４〜１８に示しているクロマトグラフデータから、AL-DP-4014用精製法により、実質的に純粋型が得られたことが示されている。精製法は、AL-DP-4127、AL-DP-4139およびAL-DP-4140について上に記載されているものと同様に行った。分析機器から得られた結果は図19〜39に示している。
実施例８：アクリロニトリル停止法
固体支持体に結合しているオリゴヌクレオチドは、トリエチルアミン（またはpKa＝9〜12のアミン）、有機溶媒（例えば、アセトニトリル、THFなど）、ならびにチオールもしくは無臭チオールの混合物を過量に用いて処理した。アルキルアミンはアクリロニトリルを生成し、これはチオールによって捕獲される。この点は、キャパルディ（Capaldi）らによって記載された方法（Org. Process Res.Dev.7:832-838(2003)）よりも優れている。
実施例９：2'−O−メチル−修飾、2'−フルオロ−修飾、コンジュゲート、チオエート化オリゴヌクレオチド
段階１．オリゴヌクレオチド合成
ヌクレオチドは全て、AKTAoligopilot合成装置で合成した。合成には、市販の制御多孔質ガラス固体支持体（プライム・シンセシス（Prime Synthesis）社のdT-CPG、rC-CPG、rU-CPG）または自家製固体支持体（2004年8月10日に受理された米国特許仮出願60/600,703号、および2004年4月16日に受理されたPCT/US04/11829号に記載されているフタルイミド−ヒドロキシ−プロリノール−CPG、ヒドロキシプロリノール−コレステロール−CPG）を用いた。標準的な保護基が付いたRNAホスホルアミダイトおよび2'−O−修飾RNAホスホルアミダイト（5'−O−ジメトキシトリチル−N6−ベンゾイル−2'−t−ブチルジメチルシリル−アデノシン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイト、5'−O−ジメトキシトリチル−N4−アセチル−2'−t−ブチルジメチルシリル−シチジン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイト、5'−O−ジメトキシトリチル−N2−イソブチル−2'−t−ブチルジメチルシリル−グアノシン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイト、5'−O−ジメトキシトリチル−2'−t−ブチルジメチルシリル−ウリジン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイト、5'−O−ジメトキシトリチル−N6−ベンゾイル−O−メチル−アデノシン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイト、5'−O−ジメトキシトリチル−N4−アセチル−2'−O−メチル−シチジン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−２シアノエチル−ホスホルアミダイト、5'−O−ジメトキシトリチル−N2−イソブチル−2'−O−メチル−グアノシン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチル−ホスホルアミダイト、および5'−O−ジメトキシトリチル−2'−O−メチル−ウリジン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチル−ホスホルアミダイト）は、ピアス核酸テクノロジーズ（Pierce Nucleic Acids Technologies）社およびケムジーンズ・リサーチ（ChemGenes Reseach）社から購入した。2'−F−ホスホルアミダイト（5'−O−ジメトキシトリチル−N4−アセチル−2'−フルオロ−シチジン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイトおいよび5'−O−ジメトキシトリチル−2'−フルオロ−ウリジン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチル−ホスホルアミダイト）は、プロメガ（Promega）社から購入した。ホスホルアミダイトは、グアノシンおよび2'−O−メチル−ウリジンを除き、全て、CH3CN中、0.2Mで使用した（グアノシンおよび2'−O−メチル−ウリジンは、10％のTHF/CH3CN（v/v）中、0.2Mの濃度で使用した）。全てのホスホルアミダイトカップリングに対して、カップリング／リサイクル時間は16分に設定した。アクチベーターとしては5−エチル−チオ−テトラゾール（0.75M、アメリカン・インターナショナル・ケミカルズ（Amerian International Chemicals）社）を用いた。PO酸化用には、水／ピリジン（10：90、v/v）中、50mMのヨウ素を使用し、PS酸化用には、2,6−ルチジン／CH3CN（1：1、v/v）中、2％のPADS（GLシンセシス（GL Synthesis）社）を用いた。コレステロールおよびアミノリンカーホスホルアミダイトは自ら合成し、コレステロールについては、ジクロロメタン中0.1M、アミノリンカーについては、CH3CN中0.2Mの濃度で使用した。コレステロールおよびアミノリンカーホスホルアミダイトに対するカップリング／リサイクル時間はいずれも16分で行った。
段階２：オリゴヌクレオチドの脱保護
(a)2'−フルオロ修飾を伴わないRNAの脱保護：合成完了後、支持体を100mlのガラス瓶（VWR）に移した。オリゴヌクレオチドは、40％のメチルアミン（アルドリッヒ（Aldrich）社）水溶液（40ml）を用い、45℃、90分かけて、塩基およびホスフェート基を同時に脱保護することにより、支持体から解裂させた。瓶は氷上で短時間冷却し、メチルアミンは新しい500mlの瓶にろ過して入れた。CPGは、40mlのDMSOを用いて3回洗浄した。混合物をドライアイス上で冷却した。
2'位に存在するtert−ブチルジメチルシリル（TBDMS）基を除去することを目的として、上述の混合物に60mlのトリエチルアミントリヒドロフルオリド（Et3N-HF）を加えた。混合物を40℃で60分間加熱した。50mMの酢酸ナトリウム（pH5.5）220mlを用いて反応を停止し、精製を行うまで冷凍庫で保存した。
(b)2'−フルオロ修飾RNAの脱保護：合成完了後、支持体を100mlのガラス瓶（VWR）に移した。オリゴヌクレオチドは、エタノール性アンモニア混合物（アンモニア：エタノール＝3：1（v/v））（80ml）を用い、55℃、6.5時間かけて、塩基およびホスフェート基を同時に脱保護することにより、支持体から解裂させた。瓶は氷上で短時間冷却し、エタノール性アンモニア混合物は新しい250mlの瓶にろ過して入れた。CPGは、40mlのエタノール／水（1：1(v/v)）を用いて2回洗浄した。回転式エバポレーターを用い、混合物の容量を約30mlまで減らした。混合物をドライアイス上で冷凍し、減圧乾燥機内で乾燥させた。
乾燥させた残渣は、トリエチルアミン、トリエチルアミントリヒドロフルオリド（Et3N-HF）およびDMSOの混合液（3：4：6）（26ml）に再懸濁させ、60℃で90分間加熱することにより、2'位のtert−ブチルジメチルシリル（TBDMS）基を除去した。20mMの酢酸ナトリウム（50ml）を用いて反応を停止し、pHを6.5に調整してから、精製を行うまで冷凍庫に保存した。
段階３：粗オリゴヌクレオチドの定量
全てのサンプルについて、10μlのアリコートを990μlの脱イオン化ヌクレアーゼ不含水（1.0ml）で希釈し、260nmにおける吸光度を読み取った。
段階４：オリゴヌクレオチドの精製
(a)コンジュゲートしていないオリゴヌクレオチド：コンジュゲートしていない粗オリゴヌクレオチドは、まず、HPLC（Dionex PA 100）で分析した。緩衝液としては、20mMのホスフェート（pH11）（緩衝液A）および20mMのホスフェート＋1.8MのNaBr（pH11）（緩衝液B）を用いた。流速は1.0ml／分、モニター波長は260〜280nmとした。各サンプルの注入量は5〜15μlであった。
コンジュゲートしていないサンプルは、自ら充填したTSK-Gel SuperQ-5PW(20)カラム（17.3×5cm）を用い、HPLC精製した。緩衝液は、20mMのホスフェート（10％のCH3CN中）（pH8.5）（緩衝液A）および20mMのホスフェート＋1.0MのNaBr（10％のCH3CN中）（pH8.5）（緩衝液B）を用いた。流速は50.0ml／分、モニターは、波長260および294nmで行った。オリゴヌクレオチドの全長を含むフラクションをプールし、溶媒留去し、約100mlの脱イオン水で再構成した。
(b)コレステロールコンジュゲートオリゴヌクレオチド：コレステロールがコンジュゲートした粗オリゴヌクレオチドは、はじめにLC/MS分析を行って純度を確認した。5'−コレステロールコンジュゲート配列は、自ら充填したRPC-Source15逆相カラムを用いてHPLC精製した。緩衝液は、20mMのTEAA（10％のCH3CN中）（緩衝液A）および20mMのTEAA（70％のCH3CN中）（緩衝液B）を用いた。オリゴヌクレオチドの全長を含むフラクションをプールし、溶媒留去し、約100mlの脱イオン水で再構成した。3'−コレステロールコンジュゲート配列は、自ら充填したRPC-Source15逆相カラムを用いてHPLC精製した。緩衝液は、20mMのNaOAc（10％のCH3CN中）（緩衝液A）および20mMのNaOAc（70％のCH3CN中）（緩衝液B）を用いた。オリゴヌクレオチドの全長を含むフラクションをプールし、溶媒留去し、約100mlの脱イオン水で再構成した。
段階５：精製オリゴヌクレオチドの脱塩
精製したオリゴヌクレオチドは、Sephadex G-25カラムを用い、AKTA Explorer system（アマシャム・バイオサイエンシーズ（Amersham Biosciences）社）で脱塩した。はじめに、水を流速25ml／分で20〜30分流すことによってカラムを洗浄した。次に、サンプルを25mlずつに分けてカラムに入れた。溶出した塩不含フラクションを合わせて乾燥させ、50mlのRNA不含水で再構成した。
段階６：キャピラリーゲル電気泳動（CGE）およびLC-MS、イオン交換HPLCおよびエレクトロスプレーLC/MSによる純度分析
脱塩した各オリゴヌクレオチドの約0.3ODのサンプルは、300μlの水で希釈し、CGE、イオン交換HPLCおよびLC/MSを用いて分析した：
オリゴヌクレオチド鎖は、5'→3'方向に記している。小文字の「s」は、ホスホロチオエート結合を示している。小文字の「d」は、デオキシ残基を示している。「HP-NH2」または「NH2-HP」は、ヒドロキシプロリノールアミンコンジュゲートを示している。「Chol−」は、ヒドロキシプロリノールコレステロールコンジュゲートを示している。下付き文字の「OMe」は、2'−O−メチル糖を表し、下付き文字の「F」は2'−フルオロ修飾糖を表す。純度は、＊を付けたもの以外はCGEで判断した（＊をつけた2例については、イオン交換クロマトグラフィーによって純度を決定した）。
実施例１０：PyHFおよびポリビニルピリジンポリHF（PVPHF）を用いたRNA（2'−OMe、PSまたはコレステロール修飾を有するもの）の脱保護法
段階１：オリゴヌクレオチド合成
ヌクレオチドは全て、AKTAoligopilot 合成装置で合成した。合成には、市販の制御多孔質ガラス固体支持体（dT-CPG、U-CPG 500）またはヒドロキシ−プロリノール−コレステロール固体支持体（2004年8月10日に受理された米国特許仮出願60/600,703号、および2004年4月16日に受理されたPCT/US04/11829号に記載）を用いた。オリゴヌクレオチド合成用には、標準的な保護基が付いたRNAホスホルアミダイト（5'−O−ジメトキシトリチル−N6−ベンゾイル−2'−t−ブチルジメチルシリル−アデノシン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイト、5'−O−ジメトキシトリチル−N4−アセチル−2'−t−ブチルジメチルシリル−シチジン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイト、5'−O−ジメトキシトリチル−N2−イソブチル−2'−t−ブチルジメチルシリル−グアノシン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイト、5'−O−ジメトキシトリチル−2'−t−ブチルジメチルシリル−ウリジン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイトおよび5'−O−ジメトキシトリチル−チミジン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイト）を用いた。グアノシンおよび2'−OMeウリジンを除く全てのホスホルアミダイトは、アセトニトリル中、0.2Mの濃度で用い、グアノシンおよび2'−OMeウリジンについては、10％のTHF／アセトニトリル（v/v）中、0.2Mの濃度で用いた。カップリング／リサイクル時間は、12mlの合成カラム中、流速500cm／時間で14分に設定した。アクチベーターとしては5−エチル−チオ−テトラゾール（0.75M）を用いた。PO酸化用には、10％の水を加えたピリジン中、0.5Mのヨウ素を使用し、PS酸化用には、CH3CN／2,6−ルチジンの1：1混合物中、0.2MのPADSを用いた。キャッピング混合物Aは、20％のN−メチルイミダゾール＋80％のCH3CNであり、キャッピング混合物Bは、25％の無水酢酸＋30％の2,6−ルチジン＋45％のCH3CNあった。
合成したオリゴヌクレオチド、合成規模、支持体の型および量、ならびにカラム注入量を以下に示す：
段階２：4つの脱保護法を用いて次の解裂および脱保護の2つの段階を行った：段階1
）オリゴヌクレオチドから塩基およびホスフェート保護基を同時に除去することによって支持体からオリゴヌクレオチドを解裂させ、2）2'−O−TBDMS基を脱保護した。
(a)ピリジンHFを用いた脱保護：200μmolスケールの合成に用いた固体支持体は、30ml（1容量）のMeNH2（40％水溶液）を用い、45℃で1.5時間処理した。支持体をろ過し、60ml（2容量）のDMSOで洗浄した。ドライアイス中で約10分間冷却し、7.5mlのピリジンHF（70％）および30ml（1容量）のDMSOの混合液をろ液に加え、溶液を洗浄し、40℃で1時間加熱した。50mMのリン酸ナトリウム（pH5.5）を加えて反応を停止し、水を加えて適当な容量まで希釈した。
(b)ピリジンHFおよびDBUを用いた脱保護：200μmolスケールの合成に用いた固体支持体は、20mlのMeNH2（40％水溶液）を用い、45℃で1.5時間処理した。支持体をろ過し、60mlのDMSOで洗浄した。この溶液に10mlのDBUを加え、ドライアイス中で約10分間冷却した。次に、6mlのピリジンHF（70％）および20mlのDMSOの混合液を加え、ろ液を洗浄し、40℃で1時間加熱した。反応は50mMのリン酸ナトリウム（pH5.5）を加えて停止し、水で希釈した。
(c)ポリビニルピリジンポリHF（PVPHF）を用いた脱保護：200μmolスケールの合成に用いた固体支持体は、30mlのMeNH2（40％水溶液）を用い、45℃で1.5時間処理した。支持体をろ過し、90mlのDMSOで洗浄した。ドライアイス中で約10分間冷却し、PVPHF（12g）を加えて40℃で1時間加熱した。反応は50mMのリン酸ナトリウム（pH5.5）を用いて停止した。反応混合物をろ過し、固体を水で洗浄した。
(d)ポリビニルピリジンポリHF（PVPHF）およびDBUを用いた脱保護：200μmolスケールの合成に用いた固体支持体は、20mlのMeNH2（40％水溶液）を用い、45℃で1.5時間処理した。支持体をろ過し、80mlのDMSOで洗浄した。この溶液に8mlのDBUを加えた。ドライアイス中で約10分間冷却し、12gのPVPHFを加えて40℃で1時間加熱した。反応は50mMのリン酸ナトリウム（pH5.5）を用いて停止した。反応混合物をろ過し、固体を水で洗浄した。
段階３：オリゴヌクレオチドの精製
(a)イオン交換HPLC精製：イオン交換精製に使用した緩衝液は、20mMのリン酸ナトリウムおよび10％のCH3CN（pH8.5）（緩衝液A）、ならびに20mMのリン酸ナトリウム、1MのNaBrおよび10％のCH3CN（pH8.5）（緩衝液B）であった。粗オリゴヌクレオチドの量が10,000OD以下の場合には、TSK-Gel super Q-5PW樹脂を充填したウォーターズ（Waters）社の2cmのカラムを使用した。流速は10ml／分、濃度勾配は、30分以上かけて緩衝液Bを0から20％にし、次に、200分以上かけて緩衝液Bを20から50％にした。
粗オリゴヌクレオチドの量が10,000OD以上の場合には、短いオリゴヌクレオチドの混入の可能性があることから、分割が必要であり、TSK-Gel super Q-5PW樹脂を充填したウォーターズ（Waters）社の5cmのカラムを使用した。流速は50ml／分、濃度勾配は、30分以上かけて緩衝液Bを0から20％にし、次に、200分以上かけて緩衝液Bを20から50％にした。
(b)逆相HPLC精製：逆相精製用には、緩衝液は、20mMの酢酸ナトリウムおよび10％のCAN（pH8.5）（緩衝液A）、ならびに20mMの酢酸ナトリウムおよび70％のCH3CN（pH8.5）（緩衝液B）を使用した。source 15RPCを充填した5cmのウォーターズ（Waters）社のカラムを使用した。流速は50ml／分、濃度勾配は、30分以上かけて緩衝液Bを0から15％にし、次に、160分以上かけて緩衝液Bを15から50％にした。
段階４：精製オリゴマーの脱塩
精製したオリゴヌクレオチドは、分子ふるい樹脂であるSephadex G-25を充填したウォーターズ（Waters）社の5cmのカラムを用いて脱塩した。流速は25ml／分で行った。溶出した塩不含フラクションを合わせて乾燥させ、RNase不含水で再構成した。
段階５：キャピラリーゲル電気泳動（CGE）およびエレクトロスプレーLC-MS
約0.15ODのオリゴヌクレオチドを水で希釈して150μlにした。生成物の質量および純度（以下に示す）は、LC/MS分析および陰イオン交換HPLCまたはCGEで測定した：
オリゴヌクレオチド鎖は、5'→3'方向に記している。小文字の「s」は、ホスホロチオエート結合を示している。小文字の「d」は、デオキシ残基を示している。下付の「OMe」は、2'−O−メチル糖を表している。「Chol−」は、ヒドロキシプロリノールコレステロールコンジュゲートを示している。
実施例１１：ポリビニルピリジンポリHF（PVPHF）を用いた2'−フルオロ修飾キメラRNAの脱保護法
段階１：オリゴヌクレオチドの合成
合成、精製および脱塩は、実施例９の段階１の記載と同様に行った。
段階２：脱保護
合成完了後、0.5Mのピペリジン（CH3CN中）（約30ml）を流速5〜10ml／分でカラムに通し、ホスフェート結合からシアノエチル保護基を除去したが、このとき、RNAは支持体に結合したままであった。次に、以下の解裂および脱保護の２つの段階を行うために脱保護の2つの方法を評価した：段階1)支持体からのオリゴヌクレオチドの解裂は、オリゴヌクレオチドからの塩基保護基の除去と同時に行い；段階2）2'−O−TBDMS基の脱保護を行った。
(a)ポリビニルピリジンポリHF（PVPHF）を用いた脱保護：200μmolスケールの合成に用いた固体支持体は、50mlのNH3：エタノール（3：1）溶液を用い、55℃で6時間処理した。支持体をろ過して溶液と分け、90mlのDMSOで洗浄した。固体支持体をろ取した。ろ液と洗浄液を合わせてドライアイス中で約10分間冷却し、PVPHF（12g）を加えて40℃で2時間加熱した。脱保護の状態は、1時間、1.5時間および2時間後に確認した。反応は50mMのリン酸ナトリウム（pH5.5）を用いて停止した。反応混合物をろ過し、固体を水で洗浄した。
(b)ポリビニルピリジンポリHF（PVPHF）およびDBUを用いた脱保護：200μmolスケールの合成に用いた固体支持体は、35mlのMeNH2（40％水溶液）を用い、55℃で6時間処理した。支持体をろ過し、140mlのDMSOで洗浄した。ろ液と洗浄液を合わせた溶液に7mlのDBUを加えた。ドライアイス中で約10分間冷却し、12gのPVPHFを加えて40℃で2時間加熱した。脱保護の状態は、1時間、1.5時間および2時間後に確認した。反応は50mMのリン酸ナトリウム（pH5.5）を用いて停止した。反応混合物をろ過し、固体を水で洗浄した。
実施例１２：RNAオリゴヌクレオチドの脱保護法
段階１：オリゴヌクレオチドの合成
合成、精製および脱塩は、実施例１０の段階１の記載と同様に行った。オリゴヌクレオチドAL-SQ-5548（5'−AAAGUGCACAACAUUAUACdTdT−3'、ここで、3'末端の2個のヌクレオチド（これらはデオキシチミジン）を除く全ての残基はリボヌクレオチドであった）およびAL-SQ-5549（5'−GUAUAAUGUGCACUUUdTdT−3'）の合成は、400μmolスケールで行った。AL-SQ-5548の計算によって求めた質量は6645.03であり、測定された質量は6644.94であった。AL-SQ-5549の計算によって求めた質量は6609.88であり、測定された質量は6609.70であった。
段階２：脱保護条件
脱保護は94μmolスケールで行った。100mlのSchott瓶に乾燥CPG（1.5g）を入れた。瓶にメチルアミン（40％水溶液、25ml）を加え、混合物を45℃の振とうオーブンに1.5時間入れた。混合物を冷却、ろ過し、ろ液を250mlのSchott瓶に入れた。CPGは、ろうと上、25mlのDMSOを用いて3回洗浄した。合わせたろ液をドライアイス中で10分間冷却した。HFのピリジン溶液（アルドリッヒ（Aldrich）社、20ml）を瓶に加えた。混合物をよく振とうし、40℃の振とうオーブンに1時間入れた。混合物を室温まで冷却し、50mMの酢酸ナトリウム（150ml）を加えて反応を停止した。最終溶液は4℃で保存した。
段階３：粗オリゴヌクレオチドの定量
粗収率を計算することを目的として、以下の方法を用いた。粗オリゴヌクレオチド溶液中に存在するピリジンは254nmで吸収を起こすことから、吸収は280nmで測定した。少量の粗支持体は、HFのピリジン溶液の代わりにTEA3HFを用いて脱保護した。このサンプルの吸収は、254nmおよび280nmで測定した。このサンプルのA254のA280に対する比に基づき、ピリジンを含むサンプルの254nmにおける吸収を求めた。
全長生成物の量は、陰イオン交換HPLCによって測定した。AL-SQ-5548では、全長生成物は総濃度の73％であり、AL-SQ-5549では、全長生成物は67％であった。粗収率は143OD／μmolであった。
実施例１３：1.6mmolスケールにおけるRNAの合成および脱保護条件
段階１：オリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドは、AKTA oligopilot合成装置を用いて合成した。市販の制御多孔質ガラス固体支持体（プライム・シンセシス（Prime Synthesis）社）を使用した。標準的な保護基が付いたRNAホスホルアミダイトおよび2'−O−メチル修飾RNAホスホルアミダイト（5'−O−ジメトキシトリチル−N6−ベンゾイル−2'−t−ブチルジメチルシリル−アデノシン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイト、5'−O−ジメトキシトリチル−N4−アセチル−2'−t−ブチルジメチルシリル−シチジン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイト、5'−O−ジメトキシトリチル−N2−イソブチル−2'−t−ブチルジメチルシリル−グアノシン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイト、5'−O−ジメトキシトリチル−2'−t−ブチルジメチルシリル−ウリジン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイト、5'−O−ジメトキシトリチル−N6−ベンゾイル−O−メチル−アデノシン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイト、5'−O−ジメトキシトリチル−N4−アセチル−2'−O−メチル−シチジン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチル−ホスホルアミダイト、5'−O−ジメトキシトリチル−N2−イソブチル−2'−O−メチル−グアノシン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−シアノエチルホスホルアミダイトおよび5'−O−ジメトキシトリチル−2'−O−メチル−ウリジン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイト）は、ピアス核酸テクノロジーズ（Pierce Nucleic Acids Technologies）社およびケムジーンズ・リサーチ（ChemGenes Research）社から購入した。2'−F−ホスホルアミダイト（5'−O−ジメトキシトリチル−N4−アセチル−2'−フルオロ−シチジン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイト、5'−O−ジメトキシトリチル−2'−フルオロ−ウリジン−3'−O−N,N'−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホルアミダイト）は、プロメガ（Promega）社から購入した。
全てのホスホルアミダイトは、CH3CN中、0.15Mの濃度で使用した。RNAアミダイトのカップリング・リサイクル時間は23分とし、2当量のアミダイトを使用した。DNAカップリングサイクルは、60％のアクチベーター、リサイクル時間は7分、2.0当量のホスホルアミダイトを用いて行った。UV観察は、「リサイクル」段階の前の「プッシュ」段階で行い、各カップリング段階の一貫性を確認した。アクチベーターとしては0.6Mのエチルチオテトラゾールを用いた。PO酸化の場合には、50mMのヨウ素（水：ピリジン＝10：90（v/v）溶液）を使用し、2.5分で4.5当量を加えた。PS酸化の場合には、チオール化反応試薬として0.2MのPADS（アセトニトリル：2,6−ルチジン＝1：1溶液）を2〜5カラム容量使用した。CapA溶液は、20％の1−メチルイミダゾール（アセトニトリル溶液）であり、CapB溶液は、無水酢酸：2,6−ルチジン：アセトニトリル（25：30：45）であった。キャッピング用には、1.5分で1.5カラム容量を加えた。
段階２：脱保護条件
250mlのSchott瓶中で、CPGを180mlのメチルアミン水溶液（アルドリッヒ（Aldrich）社）と混合した。混合物を45℃の振とうオーブンに75分間入れた。混合物を冷却し、ろ液を1LのSchott瓶に入れ、CPGを160mlのDMSOで3回洗浄した。ろ液を合わせ、ドライアイス中で10分間冷却した。混合物にTEA3HF（アルファ・イーサー（Alfa Aesar）社、270ml）を加えた。瓶を40℃の振とうオーブンに65分間入れた。混合物を室温まで冷却し、50mMの酢酸ナトリウム（1L）を加えて反応を停止した。
段階３：オリゴヌクレオチドの精製
オリゴヌクレオチドは、TSK-Gel super Q-5PW（20）樹脂を充填した5cm×17〜18cmのカラムを用いた逆相HPLCによって精製した。温度は55〜65℃に維持した。緩衝液は、20mM のリン酸ナトリウムおよび10％のACN（v/v）（pH8.5）（緩衝液A）、ならびに20mMのリン酸ナトリウム、1MのNaBrおよび10％のACN（v/v）（pH8.5）（緩衝液B）を用いた。流速は60ml／分、濃度勾配は、160分で緩衝液Bを20％から40％にした。
粗オリゴヌクレオチドの溶液は、緩衝液Aで5倍希釈し、粗材料約20mg（A260の読み取り値に基づく量）／カラム容量mlでカラムに入るような流速で直接精製カラムに加えた。50mlのフラクションを集めた。
参考文献の取込
本明細書中に引用している全ての特許および印刷物を参照として本明細書中に取り入れておく。
等価性
当業者であれば、日常の実験から、本明細書に記載している発明の特定の実施態様と等価な多くの実施態様に気付くはずである。そのような等価の実施態様についても請求項に包含されるものとする。
ホスホルアミダイトを介するオリゴヌクレオチド合成において有用なアクチベーター化合物 ホスホルアミダイトを介するオリゴヌクレオチド合成において有用なアクチベーター化合物 ホスホルアミダイトを介するオリゴヌクレオチド合成において有用なアクチベーター化合物 オリゴヌクレオチド内にホスホロチオエート結合を形成させるのに有用な硫黄転移反応試薬 オリゴヌクレオチド内にホスホロチオエート結合を形成させるのに有用な硫黄転移反応試薬 PADSまたはEDITHを用いた25および26の合成結果。25＝5'−GsCsGGAUCAAACCUCACCAsAsdTsdT−3'、26＝5'−UsUsGGUGAGGUUUGAUCCGｓCsdTsdT−3'、PADS（新鮮）とは、溶解から24時間以内であることを示しており、PADS（時間経過）とは、溶解から48時間以上経過していることを示しており、「nd」とは、値が求められなかったことを示している。「PADS」は、（ベンジルC(O)S)2化合物をさす。「EDITH」は、3−エトキシ−1,2,4−ジチアゾリジン−5−オンをさす。 オリゴヌクレオチド合成に使用する脱シリル化反応試薬および関連する塩基 アクリロニトリル反応停止剤 siRNA精製およびQCのためのフローチャートを示す図。注：LC-MSとは、液体クロマトグラフィー質量分析をさし、CGEとは、キャピラリーゲル電気泳動分析をさす。 AL-4112、AL-4180、AL-DP-4014、AL-2200、AL-2201、AL-DP-4127、AL-2299、AL-2300、AL-DP-4139、AL-2281、AL-2282およびAL-DP-4140の構造 AL-DP-4014（構成要素はAL-4112およびAL-4180）を精製するための二本鎖法の最初の部分を示す図 AL-DP-4014（構成要素はAL-4112およびAL-4180）を精製するための二本鎖法の二番目の部分を示す図。注：RP HPLCとは、逆相高速液体クロマトグラフィー分析をさす。IEX HPLCとは、イオン交換高速液体クロマトグラフィー分析をさす。 AL-DP-4014の逆相HPLCのクロマトグラム AL-DP-4014のLC-MSクロマトグラム 図１４に示すAL-DP-4014のLCクロマトグラム中の9.913分におけるピークの質量分析 AL-DP-4014のキャピラリーゲル電気泳動クロマトグラム AL-DP-4014の逆相HPLCのクロマトグラム AL-DP-4014のイオン交換クロマトグラム AL-DP-4127のLC-MSクロマトグラム 図１９に示すAL-DP-4127のLCクロマトグラム中の10.616分におけるピークの質量分析 図１９に示すAL-DP-4127のLCクロマトグラム中の12.921分におけるピークの質量分析 図１９に示すAL-DP-4127のLCクロマトグラム中の16.556分におけるピークの質量分析 AL-DP-4127のLC-MSクロマトグラム 図２３に示すAL-DP-4127のLCクロマトグラム中の13.397分にピークを示す微量混入物の質量分析 図２３に示すAL-DP-4127のLCクロマトグラム中の13.201分にピークを示す微量混入物の質量分析 AL-DP-4127のキャピラリーゲル電気泳動クロマトグラム AL-DP-4127の逆相HPLCクロマトグラム AL-DP-4127のイオン交換クロマトグラム AL-DP-4139のLC-MSクロマトグラム 図２９に示すAL-DP-4139のLCクロマトグラム中の13.005分におけるピークの質量分析 AL-DP-4139のキャピラリーゲル電気泳動クロマトグラム AL-DP-4139の逆相HPLCクロマトグラム AL-DP-4127のイオン交換クロマトグラム AL-DP-4140のLC-MSクロマトグラム 図３４に示すAL-DP-4140のLCクロマトグラム中の13.965分におけるピークの質量分析 図３４に示すAL-DP-4140のLCクロマトグラム中の17.696分におけるピークの質量分析 AL-DP-4140のキャピラリーゲル電気泳動クロマトグラム AL-DP-4140の逆相HPLCクロマトグラム AL-DP-4140のイオン交換クロマトグラム 二本鎖RNAの精製法に関する別の方法 二本鎖RNAの精製法に関する別の方法 二本鎖RNAの精製法に関する別の方法 二本鎖RNAの精製法に関する別の方法 多様な2'−保護基を有するヌクレオシド。注：「B」は、保護されたC、G、A、Uまたは5−Me−Uをさす。「X」は、CN、NO2、CF3、SO2RまたはCO2Rをさす。「X'」は、CN、NO2、CF3、FまたはOMeをさす。「Z」は、Hまたはアルキルをさす。「R1」は、オキサゾール、チアゾールまたはアゾールをさす。 酵素解裂によって除去可能な多様な2'−保護基を有するヌクレオシド。注：「B」は、U、5−Me−U、5−Me−C、GまたはAをさす。「X」は、H、CN、NO2、CF3をさす。「X'」は、H、CN、NO2、CF3、SO2RまたはCO2Rをさす。 本発明に使用できる多様な塩基性保護基を有するヌクレオシド。注；Rは、H、OMe、F、MOEまたはTOMである。 本発明に使用できるRNAビルディングブロックであり、ヌクレオシドはTOM保護基を有する。 本明細書に記載しているシリル脱保護法に適した5'−シリル保護RNA。注：塩基は、N−ベンゾイルアデニン、N−アセチルシトシン、N−イソプチリルグアニンまたはウラシルである。Rは、グアノシンおよびウリジンに対してはシクロオクチルである。Rは、アデノシンおよびシチジンに対してはシクロドデシルである。スカリンジ（Scaringe）,S.A.、ウィンコット（Wincott）F.E.およびカルサース（Caruthers）,M.H.、J.Am.Chem.Soc.,120:11820-11821(1998)を参照。 固相RNA分析の一般的工程 オリゴヌクレオチド中のホスホロチオエート結合の調製に有用な硫黄転移反応試薬 オリゴヌクレオチドの5'および3'末端にコレステリル−およびアミノアルキル−ヒドロキシプロリノールをコンジュゲートさせるためのビルディングブロック。化合物IおよびIIIは、5'−コンジュゲーション用、化合物IIおよびIVは、3'−コンジュゲーション用。実施例８を参照。

Claims (27)

  1. （ａ）固相ホスホルアミダイト法、液相ホスホルアミダイト法、固相Ｈ−ホスホナート法、液相Ｈ−ホスホナート法、固相−液相ハイブリッドホスホリアミダイト法および固相−液相ハイブリッドＨ−ホスホナート法に基づく合成法よりなる群から選択される方法を用いて、１以上のヌクレオチドを含む核酸分子を合成し；
    （ｂ）前記工程（ａ）からの核酸分子を、該核酸分子から、アミノ基を保護するアミド基または置換アミド基およびホスフェート基を保護するシアノエチル基または置換シアノエチル基を除去するのに適した条件下で、水性メチルアミン、アンモニア、ピペリジン、またはそれらの組合せと接触させ；
    （ｃ）前記工程（ｂ）からの核酸分子を含む反応混合物を、ピリジン−HF、トリス(ジメチルアミノ)スルホニウムジフルオロトリメチルシリケート(TAS-F)またはポリビニルピリジン−HF、ならびにDMSO、DMF、エタノール、イソプロパノール、メタノール、アセトニトリルおよびそれらの組合せより成る群から選択される少なくとも１つの極性溶媒と、シリル保護基を除去するため水性条件下で接触させ；
    （ｄ）前記工程（ｃ）からの核酸分子を含む反応混合物を、適切な緩衝液中においてクロマトグラフィーに装填し；そして
    （ｅ）適切な溶出緩衝液を用いて精製勾配をかけ、フラクションを分析し、さらに精製フラクションをプールしさらに脱塩する；
    工程を含む方法。
  2. 前記核酸分子が、１以上のリボヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
  3. 前記核酸分子がsiRNA分子であることを特徴とする請求項２記載の方法。
  4. 前記核酸分子が、１以上の2'-デオキシ-2'-フルオロヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項２記載の方法。
  5. 前記核酸分子が、１以上のデオキシリボヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項２記載の方法。
  6. 前記核酸分子が、糖修飾、塩基修飾、骨格の修飾、および１以上の親油性部分へのコンジュゲーションから成る群より選択される１以上の化学修飾を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
  7. 前記糖修飾が、2'-糖修飾または3'-糖修飾であることを特徴とする請求項６記載の方法。
  8. 前記2'-糖修飾が、2'-O−メチル修飾であることを特徴とする請求項７記載の方法。
  9. 前記骨格の修飾が、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホナート、チオノアルキルホスホナート、ホスフィナート、ホスホロアミダート、チオノホスホロアミダート、ボラノホスフェート、およびそれらの組合せより成る群から選択されるホスフェート骨格の修飾であることを特徴とする請求項６記載の方法。
  10. 前記化学修飾が、１以上の親油性部分へのコンジュゲーションであり、該親油性部分がコレステロールまたはコレステロール誘導体を含むことを特徴とする請求項６記載の方法。
  11. 前記核酸分子が、該核酸分子の3'末端、5'末端、または3'末端および5'末端の両方において、１以上の末端修飾を含むことを特徴とする請求項６記載の方法。
  12. 前記工程（ａ）の合成法が、固相ホスホルアミダイト法、液相ホスホルアミダイト法、または固相−液相ハイブリッドホスホリアミダイト法であることを特徴とする請求項１記載の方法。
  13. 前記水性メチルアミン、アンモニア、ピペリジン、またはそれらの組合せを、エタノールと予め混合することを特徴とする請求項１記載の方法。
  14. 前記シリル保護基が、t-ブチルジメチルシリル（TBDMSi）基であることを特徴とする請求項１記載の方法。
  15. 前記工程（ｃ）においてピリジン-HFおよびDMSOを用い、それらを、DBU、Hunig塩基、ピリジン、ピペリジンおよびN-メチルイミダゾールよりなる群から選択される塩基と、予め混合することを特徴とする請求項１記載の方法。
  16. 前記工程（ｃ）において、ポリビニルピリジン-HFを用いることを特徴とする請求項１記載の方法。
  17. 前記核酸分子が、二本鎖核酸分子であることを特徴とする請求項１記載の方法。
  18. 前記核酸分子が、一本鎖核酸分子であることを特徴とする請求項１記載の方法。
  19. 前記クロマトグラフィーがイオン交換クロマトグラフィーであり、装填用の緩衝液が、水、エタノールまたはアセトニトリルを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
  20. 前記工程（ｅ）において脱塩工程を適用しあるいは脱塩工程を適用しないで、前記核酸分子を第２の核酸分子とアニーリングさせて二本鎖核酸分子を形成し；さらに
    前記二本鎖核酸分子をクロマトグラフィー精製にかける；工程をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
  21. （ａ）固相ホスホルアミダイト法、液相ホスホルアミダイト法、固相Ｈ−ホスホナート法、液相Ｈ−ホスホナート法、固相−液相ハイブリッドホスホリアミダイト法および固相−液相ハイブリッドＨ−ホスホナート法に基づく合成法よりなる群から選択される方法を用いて、１以上のヌクレオチドを含む核酸分子を合成し；
    （ｂ）前記工程（ａ）からの核酸分子を、該核酸分子から、アミノ基を保護するアミド基または置換アミド基およびホスフェートを保護するシアノエチル基または置換シアノエチル基を除去するのに適した条件下で、水性メチルアミン、アンモニア、ピペリジン、またはそれらの組合せと接触させ；
    （ｃ）前記工程（ｂ）からの核酸分子からを含む反応混合物を、ピリジン−HF、トリス(ジメチルアミノ)スルホニウムジフルオロトリメチルシリケート(TAS-F)またはポリビニルピリジン−HF、ならびにDMSO、DMF、エタノール、イソプロパノール、メタノール、アセトニトリルおよびそれらの組合せより成る群から選択される少なくとも１つの極性溶媒と、シリル保護基を除去するため水性条件下で接触させ；
    （ｄ）前記工程（ｃ）からの核酸分子を含む反応混合物を、水、約20mMリン酸ナトリウム中のエタノールまたは約20mMリン酸ナトリウム中のアセトニトリルを含む装填用緩衝液中においてイオン交換クロマトグラフィーに装填し；そして
    （ｅ）適切な溶出緩衝液を用いて精製勾配をかけ、フラクションを分析し、さらに精製フラクションをプールしさらに脱塩する；
    工程を含む方法。
  22. 前記核酸分子を含む反応混合物を、前記工程（ｄ）の前または後に、適切な緩衝液中において逆相クロマトグラフィーに装填する工程をさらに含む請求項２１記載の方法。
  23. 前記工程（ｅ）において脱塩工程を適用しあるいは脱塩工程を適用しないで、前記核酸分子を第２の核酸分子とアニーリングさせて二本鎖核酸分子を形成し；さらに
    前記二本鎖核酸分子をクロマトグラフィー精製にかける；工程をさらに含むことを特徴とする請求項２１記載の方法。
  24. 前記二本鎖核酸分子をクロマトグラフィー精製にかける工程が：
    前記二本鎖核酸分子を適切な緩衝液中においてクロマトグラフィーに装填し；そして
    適切な溶出緩衝液を用いて精製勾配をかけ、フラクションを分析し、さらに精製フラクションをプールしさらに脱塩する；工程を含むことを特徴とする請求項２３記載の方法。
  25. 前記クロマトグラフィー精製が、高速液体クロマトグラフィーであることを特徴とする請求項２３記載の方法。
  26. 前記核酸分子が、１以上のリボヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項２３記載の方法。
  27. 前記二本鎖核酸分子がsiRNAであることを特徴とする請求項２３記載の方法。
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