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KR20110004880A - 올리고뉴클레오타이드의 제조 방법 - Google Patents

올리고뉴클레오타이드의 제조 방법 Download PDF

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KR20110004880A
KR20110004880A KR1020107026079A KR20107026079A KR20110004880A KR 20110004880 A KR20110004880 A KR 20110004880A KR 1020107026079 A KR1020107026079 A KR 1020107026079A KR 20107026079 A KR20107026079 A KR 20107026079A KR 20110004880 A KR20110004880 A KR 20110004880A
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타데우스 크시슈토프 비시키에비츠
헤이젠 크레이머
휘헤 주
케빈 제임스 핀
Original Assignee
기린두스 아메리카 인코포레이티드
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Abstract

보호된 올리고뉴클레오타이드로부터 β-인 제거-보호기, 특히는 β-시아노에틸 보호기를 제거하는 단계를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 제조 방법으로, 상기 제거 단계는 보호된 올리고뉴클레오타이드를 바람직하게는 피리딘으로 구성되지 않은 용매 중의 아민 용액과 접촉시키는 것을 포함하고, 아민의 짝산의 pKa가 바람직하게는 11.5를 초과하며, 용매 중의 아민의 농도는 0.5 몰/리터 미만인 것인 올리고뉴클레오타이드의 제조 방법.

Description

올리고뉴클레오타이드의 제조 방법{PROCESS FOR THE MANUFACTURE OF OLIGONUCLEOTIDES}
본 출원은 2008년 4월 24일자로 출원된 미국 특허출원 제61/047524호의 이점을 주장하며, 그 전체 내용이 본원에 참조로써 통합된다.
본 발명은 올리고뉴클레오타이드의 제조 방법에 관한 것이다. 올리고뉴클레오타이드 및 그 유도체는 예를 들어 암 치료를 위한 후보약물이다.
β-시아노에틸 보호기는 특히 포스포아미다이트 기법을 통한 올리고뉴클레오타이드의 합성시 인보호기(phosphorus protective group)로서 흔히 사용된다. 시아노에틸기를 탈보호시키는 것은 최종 생성물에 이르기 위한 한 단계이다.
본 명세서에 그 내용이 참조로써 통합된 미국 특허 제6,858,715호 및 제7,199,236호에는 β-시아노에틸 보호기를 탈보호시키는 방법이 기재되어 있으며, 이 방법에서는 자신의 짝산(conjugate acid)의 pKa가 약 8 내지 약 11인 아민의 사용이 필수적이다.
Eritja et al. Helv. Chim. Acta, Vol 83(2000) p.1417-1423에는 아세토니트릴 중의 0.5M 농축 DBU 용액을 사용하여 β-시아노에틸 올리고뉴클레오타이드를 탈보호시키는 것을 개시하고 있다.
놀랍게도, 심지어 자신의 짝산의 pKa가 11.5를 초과하는(예를 들어, 약 12) 강염기도 특정 조건하에 사용되면 예컨대 β-시아노에틸 보호기를 실질적으로 완전히 탈보호시키는 한편 핵 염기(특히, 티미딘)에 대해 시아노에틸 부가물이 형성되는 것을 실질적으로 방지할 수 있다는 것이 현재 밝혀졌다.
결과적으로 본 발명은 올리고뉴틀레오타이드의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 보호된 올리고뉴클레오타이드로부터 β-인 제거-보호기, 특히는 β-시아노에틸 보호기를 제거하는 단계를 적어도 포함하며, 상기 제거 단계는 보호된 올리고뉴클레오타이드를 바람직하게는 피리딘으로 구성되지 않은 용매 중의 아민 용액과 접촉시키는 것을 포함하고, 이때 아민의 짝산의 pKa는 바람직하게 11.5를 초과하며, 용액 중의 아민의 농도는 0.5 몰/리터 미만이다.
본 발명에 따른 방법이, 놀랍게도, 높은 선택성과 수율을 가진 인-보호 올리고뉴클레오타이드, 특히는 β-시아노에틸 보호기를 탈보호시키는 것에 있어 특히 효율적이라는 것이 밝혀졌다. 탈보호 조작시 원치 않는 부반응들을 상당히 방지할 수 있다.
용액 중의 아민의 농도는 0 몰/리터보다 높다. 바람직하게는 0.03 몰/리터 이상이다. 용액 중의 아민의 농도는 종종 0.4 몰/리터 이하이며, 바람직하게는 0.3 몰/리터 이하, 더 바람직하게는 0.25 몰/리터 이하이다. 이러한 바람직한 농도는 예를 들어 0.15 몰/리터 이하이거나, 또는 0.1 몰/리터 이하이다. 아민 농도가 약 0.05 몰/리터인 경우에 양호한 결과가 주어진다.
보호된 올리고뉴클레오타이드와 접촉되는 아민의 총량은 다양할 수 있다. 일 구현예에서, 이러한 양은 아민과 보호기(특히 제거대상인 β-시아노에틸 보호기) 사이의 몰비가 1 이상이 되도록 정해진다.
다른 구현예에 의하면, 보호된 올리고뉴클레오타이드와 접촉되는 아민의 총량은 아민과 보호기(특히 제거대상인 β-시아노에틸 보호기) 사이의 몰비가 0.01 이상 0.9 이하, 바람직하게는 약 0.1이 되도록 정해진다.
본 발명의 구성 내에서 "올리고뉴클레오타이드"란 용어는 핵염기에 연결된 당(sugar) 단위들을 포함한 뉴클레오사이드 단량체 단위들의 올리고머를 특히 지칭하며, 상기 뉴클레오사이드 단량체 단위는 인터뉴클레오타이드 결합(internucleotide bond)에 의해 연결되어 있다. "인터뉴클레오타이드 결합"은 구체적으로 2개의 뉴클레오사이드 모이어티(moiety) 사이의 화학적 연결기(chemical linkage)를 가리키는 것으로, 예컨대, 자연에서 발견되는 핵산에 통상 존재하는 포스포디에스테르 연결기 또는 합성 핵산 및 핵산 유사물에 통상 존재하는 다른 연결기들을 가리킨다. 이러한 인터뉴클레오타이드 결합에는 예를 들어 포스포(phospho) 또는 포스파이트기(phosphite group)가 포함될 수 있으며, 포스포 또는 포스파이트기의 하나 이상의 산소 원자가 치환기로 변형되거나 (예컨대, 황 원자, 또는 모노- 또는 디-알킬 아미노기의 질소 원자와 같은) 다른 원자로 대체되는 연결기들이 포함될 수 있다. 통상 인터뉴클레오타이드 결합은 인산의 디에스테르 또는 그 유도체이며, 예를 들면, 포스페이트, 티오포스페이트(thiophosphates), 디티오포스페이트, 포스포아미데이트(phosphoramidates), 티오 포스포아미데이트가 있다.
"뉴클레오사이드"란 용어는 구체적으로 당에 연결된 핵염기로 구성된 화합물을 지칭한다. 이러한 당으로는, 오각형 고리(furanose ring)(예컨대, 리보스), 2'-디옥시리보스 및 비(non)-오각형 고리(예컨대, 사이클로헥센일, 안하이드로헥시톨, 모르폴리노)가 포함되되, 이에 한정되지는 않는다. 뉴클레오사이드에 포함된 당과 관련하여 이하 표시되는 변형, 치환 및 위치들이 오각형 고리를 참조하여 설명되되, 동일한 변형 및 위치가 다른 당 고리의 유사한 위치에도 적용된다. 당은 추가적으로 변형될 수 있다. 당 변형의 비제한적 예로는 예를 들어 수소; 하이드록시; 메톡시, 에톡시, 알릴옥시, 이소프로폭시, 부톡시, 이소부톡시, 메톡시에틸, 알콕시, 페녹시와 같은 알콕시; 아지도(azido); 아미노; 알킬아미노; 플루오로; 클로로; 및 브로모를 포함하는 오각형 당 고리의 예컨대 2'- 또는 3'-위치(구체적으로는 2'-위치)에서의 변형;2'-4'- 및 3'-4'-연결된 오각형 당 고리 변형을 특히 언급할 수 있으며, 여기서 오각형 당 고리에서의 변형은 예를 들면 고리 4'-O를 S, CH2, NR, CHF 또는 CF2로 치환하는 것을 포함한다.
"핵염기"란 용어는 특히 상보적인 핵염기 또는 핵염기 유사물과 쌍을 이룰 수 있는 질소-함유 헤테로사이클릭 모이어티를 구체적으로 지칭하는 것으로 이해하면 된다. 전형적인 핵염기는, 자연발생적 핵염기로서, 퓨린 염기인 아데닌(A) 및 구아닌(G)과, 피리미딘 염기인 티민(T), 사이토신(C) 및 우라실(U)을 포함하며; 다른 합성 및 천연 핵염기를 포함하는 변형된 핵염기로서, 예를 들어 5-메틸사이토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 사이토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸 및 아데닌과 구아닌의 다른 알킬 유도체, 2-프로필 및 아데닌과 구아닌의 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오사이토신, 5-할로우라실 및 사이토신, 5-프로피닐 우라실 및 사이토신, 그리고 피리미딘 염기의 다른 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 사이토신 및 티민, 5-우라실(pseudouracil), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-치환 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히는 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환 우라실 및 사이토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌, 8-아자아데닌, 7-디아자구아닌 및 7-디아자아데닌, 3-디아자구아닌 및 3-디아자아데닌, 및 불소화 염기를 포함한다. 추가의 변형된 핵염기로는, 트리사이클릭 피리미딘, 예를 들어 페녹사진 시티딘(1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조옥사진-2(3H)-온), 페노티아진 시티딘(1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조티아진-2(3H)-온), G-클램프, 예를 들어 치환된 페녹사진 시티딘(예컨대, 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조옥사진-2(3H)-온), 카바졸 시티딘(2H-피리미도[4,5-b]인돌-2-온), 피리도인돌 시티딘(H-피리도[3',2':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘-2-온)을 포함한다. 잠재적으로 적합한 다른 염기로는, 유니버셜(universal) 염기, 소수성 염기, 프로미스큐어스(promiscuous) 염기 및 크기-확대형 염기가 포함된다.
본 발명에 따른 방법에서, 종종 용매는 하나 또는 두 개의 탄소원자를 포함한 클로로알칸(예컨대, 염화메틸렌 또는 1,2-디클로로에탄)과 같은 할로겐화 화합물을 포함한다. 염화메틸렌이 염화용매(chlorosolvent)로 바람직하다.
시아노알킬 화합물을 함유하는 용매가 바람직하다. 아세토니트릴이 시아노알킬 화합물로 바람직하다.
본질적으로 상기 언급된 화합물로 구성된 용매가 바람직하다. 더 구체적으로, 용매는 바람직하게 아세토니트릴로 구성된다.
본 발명에 사용되는 특정의 β-인 제거-보호기(Rt)에 의해 보호되는 인터뉴클레오타이드 결합을 하기의 화학식 I:
Figure pct00001
(식 중, 각 X 및 Y는 독립적으로 O, S 또는 NR이고;
Rt는 -C(R1)2-C(R1)2-W 또는 C(R1)2-(CH-CH)p-C(R1)2-W이며, 여기서 각 R1은 독립적으로 H이거나 또는 저급 알킬이고, W는 전자흡인기이고, p는 0 내지 3임)로 나타낼 수 있다.
특히 바람직한 구현예에서는, β-인 제거-보호기(Rt)가 -CH2-CH2-C≡N 또는 -CH2-(CH=CH)p-CH2-C≡N이며, 식 중 p는 1 내지 3의 정수이고, -CH2-CH2-C≡N 또는 -CH2-CH=CH-CH2-C≡N가 바람직하며, -CH2-CH2-C≡N가 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 방법의 특정 구현예에 의하면, 보호된 올리고뉴클레오타이드가 적어도 200분의 반응시간 동안 아민과 접촉된다. 반응시간은 240분 내지 600분이 바람직하며, 300분 내지 400분이 더욱 바람직하다. 반응시간이 약 360분일 때 양호한 결과를 얻었다.
반응시간은, 보호된 올리고뉴클레오타이드가 아민 용액과 접촉되는 동안의 기간을 지칭하는 것으로 통상 이해하면 된다.
다른 바람직한 구현예에 의하면, 반응시간은 200분 미만으로, 통상 100분 이하이며, 더 바람직하게는 30분 이하이다. 20분 이하의 반응시간이 더 특히 바람직하며, 15분 이하의 반응시간이 가장 특히 바람직하다. 이러한 바람직한 구현예에서는, 반응시간이 통상 3분 이상이며, 더 바람직하게는 6분 이상이다.
놀랍게도, 짧은 반응시간으로도 매우 효율적인 탈보호 조작을 달성할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
본 발명에 따른 방법의 다른 구현예에 의하면, 제거 단계는 일반적으로 0 내지 80℃의 온도에서, 바람직하게는 10 내지 60℃의 온도에서 수행된다. 약 20 내지 30℃의 온도에서 수행될 때 양호한 결과를 얻었다.
본 발명에 따른 방법에서, 보호된 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어 보호된 뉴클레오타이드의 용액상 또는, 바람직하게, 고체상 커플링에 의해 수득가능하다. 전술된 바와 같이 보호된 올리고뉴클레오타이드를 제공하는 커플링 기법은 본질적으로 공지되어 있다.
본 발명에 따른 방법의 다른 구현예에 의하면, 보호된 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게 고상 지지체에 부착되어 있다. "고상 지지체"는 구체적으로 그 위에서 올리고뉴클레오타이드의 합성이 일어나는 임의의 입자, 비드 또는 표면을 지칭한다. 본 발명에 따른 방법의 다른 구현예에서 사용될 수 있는 고상 지지체는, 예를 들어 무기 지지체 및 유기 지지체 중에서 선택된다. 바람직하게 무기 지지체는 실리카겔 및 다공성 유리(controlled pore glass(CPG)) 중에서 선택된다. 바람직하게 유기 지지체는 고가교도 폴리스티렌, Tentagel(폴리에틸렌 글리콜(PEG 또는 POE)가 그래프트된 저가교도 폴리스티렌 매트릭스로 이루어진 그래프트 공중합체), 폴리비닐아세테이트(PVA), Poros-폴리스티렌/디비닐 벤젠의 공중합체, 아미노폴리에틸렌글리콜 및 셀룰로오스 중에서 선택된다. 고상 지지체가 더 바람직하게는 고가교도 폴리스티렌 중에서 선택된다. 보호된 올리고뉴클레오타이드는 고상 지지체에 연결기를 통해 부착될 수 있다. 연결기는 당해 기술분야에서 화학적 모이어티로 알려져 있으며, 이는 공유 결합을 포함하거나, 또는 고상 지지체를 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드에 공유적으로 부착시키는 원자 체인을 포함한다. 연결기(linker)를 통해 미리 부착된 뉴클레오사이드를 운반하는 소위 "표준 고상 지지체"가 상업적으로 입수가능하다. 이러한 뉴클레오사이드는 절단(cleavage) 및 탈보호 단계 이후에 최종 올리고뉴클레타이드의 3'- 또는 5'-말단 잔기가 된다. 본 발명의 이러한 구현예에서 사용될 수 있는 적합한 연결기로는, 예를 들어 숙시닐, 카보네이트, 카바메이트가 있다. 숙시닐 연결기가 가장 바람직하다. 표준 고상 지지체는 3'- 또는 5'-말단 뉴클레오사이드를 운반한다.
미리 부착된 3'- 또는 5'-말단 뉴클레오사이드가 없는 고상 지지체, 즉 "유니버셜" 고상 지지체가 또한 당해 기술분야에 공지되어 있으며 상업적으로 입수가능하다. 이들 지지체에는 의도적인 3'- 또는 5'-뉴클레오사이드가 부착되어 있지 않다. 오히려, 해당 말단 뉴클레오사이드 또는 잔기는 첫 번째 사이클에 첨가되어, 이러한 뉴클레오사이드와 유니버셜 지지체 사이에 원치 않는 포스페이트 또는 티오포스페이트 연결기를 생성한다. 이러한 기법에서는 절단 단계 및/또는 보호 단계시 원치 않는 포스페이트 또는 티오포스페이트 연결기를 제거시키도록 요구된다. "유니버셜" 고상 지지체의 전형적인 예들이 반응식 1에 도시되어 있다.
반응식 1
Figure pct00002
유니버셜 지지체 유형 1
Figure pct00003
유니버셜 지지체 유형 2
놀랍게도, 본 발명에 따른 방법이 올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 절단하지 않고도 인보호기를 선택적으로 탈보호시키도록 한다는 것이 밝혀졌다.
이러한 구현예의 특정 양상의 경우, 보호된 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 고상 지지체를 주입구 및 배출구가 구비된 칼럼과 같은 장치에 함유시킬 수 있다. 본 구현예에 따르면, 상기 장치에 아민 용액을 통과시킴으로써 보호된 올리고뉴클레오타이드에 아민을 접촉시킬 수 있다. 바람직하게는, 이러한 공정은 상업적으로 입수가능한 자동합성기를 이용하여 자동화되며, 이러한 자동합성기는 합성기에 마련된 전달 라인들 중 하나를 통해 용매 중의 아민을 전달하도록 프로그램되어 있다.
유리하게는, 적어도 칼럼 체적과 같은 양, 종종 칼럼 체적의 2배 이상의 양, 가장 바람직하게는 칼럼 체적의 5배 이상의 양에 해당되는 아민 용액이 칼럼을 통과할 수 있다. 유리하게는, 칼럼 체적의 100배 이하의 양, 바람직하게는 칼럼 체적의 60배 이하 양에 해당되는 아민 용액이 칼럼을 통과할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은,
(a) 고체상 커플링 기법에 의해 고상 지지체에 부착된 상태의 보호된 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 단계와;
(b) 보호된 올리고뉴클레오타이드로부터 본원에 기술된 바와 같이 인보호기를 탈보호시키는 단계와;
(c) 지지체에 부착된 상태의 보호된 올리고뉴클레오타이드를 선택적으로 처리하여 아민 함량을 감소시키는 단계와;
(d) 올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 절단하는 단계를 포함한다.
단계 (c)는 예를 들어 세척 조작일 수 있으며, 예를 들면 본원에 기술된 용매, 특히는 아세토니트릴을 사용한 세척 조작일 수 있다. 단계 (d)는 양성자성 염기 용액 또는 친핵성 염기 용액을 이용한 처리법 중에서 적합하게 선택된다. 적합한 염기의 예는 수성 암모니아, 메틸아민 및 암모니아/메틸아민 혼합물 중에서 선택된다.
본 발명에 따른 방법의 다른 구현예에 의하면, 자신의 짝산의 pKa가 11.5보다 크고 최대 12.5인 아민이 일반적으로 사용된다. 바람직하게는, 자신의 짝산의 pKa가 약 12인 아민이 사용된다. 보통 "pKa"란 용어는 특히 25℃에서 측정되었을 때 수용액 중의 짝산의 평형 해리상수에 대한 -log(상용로그) 값으로 정의된다. 적합한 아민의 비제한적 예로는 DBU(1,8-디아자바이사이클로[5.4.0]운덱-7-엔), DBN(1,5-디아자바이사이클로[4.3.0]논-5-엔), TMG(테트라메틸구아니딘), TBD(트리아자바이사이클로데센)이 있다. 바람직한 아민의 예는 DBU(디아자바이사이클로운데센)이다. DBU가 가장 바람직하다.
가장 바람직한 구현예에서, 본 발명은 올리고뉴클레오타이드의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 보호된 올리고뉴클레오타이드로부터 β-시아노에틸 보호기를 제거하는 단계를 적어도 포함하며, 상기 제거 단계는 보호된 올리고뉴클레오타이드를, 바람직하게는 전술된 바와 같은 농도에서, 아세토니트릴을 포함하는 용매 중에 DBU와 접촉시키는 것을 포함한다. 이 구현예의 경우, 바람직하게 반응시간은 전술된 바와 같다.
예를 들어, 본 발명에 따른 방법의 다른 구현예는 DNA, RNA, BNA, UNA 및 이들의 유도체 중에서 선택되는 올리고뉴클레오타이드의 합성에 적용될 수 있다. BNA의 전형적인 예로는 LNA, ENA가 있다. 어떤 올리고뉴클레오타이드의 예들은 미국 특허 제6,456,628호의 col.21.1 내지 col.31.15에 기재된 화학식으로 정의될 수 있다.
DNA는 구체적으로 디옥시리보핵산 단위의 중합체를 지칭하며, RNA는 구체적으로 리보핵산 단위의 중합체를 지칭하고, BNA는 구체적으로 바이사이클릭 핵산의 중합체를 지칭하고, LNA는 구체적으로 잠금 핵산 단위의 중합체를 지칭하고, ENA는 구체적으로 2'-O,4'C-에틸렌 연결(bridged) 핵산의 중합체를 지칭하고, UNA는 구체적으로 비잠금(unlocked) 핵산의 중합체를 지칭한다.
본 발명에 유용한 자연발생적 핵 염기의 비제한적 예들로는, 아데닌, 구아닌, 사이토신, 우라실 및 티민을 언급할 수 있다. 비자연발생적이며 드물게 자연발생적인 핵 염기의 비제한적 예들로는, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸 및 아데닌과 구아닌의 다른 알킬 유도체, 2-프로필 및 아데닌과 구아닌의 다른 알킬 유도체, 5-할로 우라실 및 사이토신, 6-아조 우라실, 사이토신 및 티민, 5-수도우라실(pseudouracil), 4-티오우라실, 8-할로, 옥사, 아미노, 티올, 티오알킬, 하이드록실 및 다른 8-치환 아데닌 및 구아닌, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환 우라실 및 사이토신, 7-메틸구아닌을 언급할 수 있다.
적합한 핵 염기 보호기가 당해 기술분야의 숙련자에 공지되어 있으며, 그 예로는 벤조일, 이소부티릴, 아세틸, 페녹시아세틸, 아릴옥시아세틸, 프탈로일(phthaloyl), 2-(4-니트로-페닐)에틸, 펜트-4-에노일(pent-4-enoyl), 디메틸포름아미딘(dmf), 이알킬포르아미딘 및 디알킬아세트아미딘이 있다.
적합한 5'-하이드록실 보호기로는 트리틸(trityl)기가 포함되나, 이에 한정되지는 않으며, 바람직하게는 디메톡시트리틸기(DMTr)이거나 또는 모노메톡시트리틸기(MMTr)이다. 다른 적합한 5'-보호기로는 터트-부틸 디메틸실릴(TBDMS), 레뷰리닐(levulinyl), 벤조일, 플루오렌메톡시카보닐(FMOC), 9-페닐티오잔텐-9-일(9-phenylthioxanthen-9-yl)(S-pixyl)이 포함되되, 이에 한정되지는 않는다.
RNA 합성에 사용되는 적합한 2'-보호기로는, 2'-O-보호기; 터트-부틸 디메틸실릴(TBDMS), 9-페닐잔텐-9-일(Px), 9-페닐티오잔텐-9-일(SPx), 1-[(2-클로로-4메틸)페닐]-4-메톡시피페리딘-4-일(Ctmp), 1-(2-플루오로페닐)-4-메톡시피페리딘-4-일(Fpmp), [2-(메틸티오)페닐]티오메틸(MTPM), 비스-(아세톡시에틸옥시)메틸에스테르(ACE), (1-메틸-1-메톡시에틸)(MME), 메톡시(에톡시메틸)(MEM), p-니트로페닐에틸실포닐(NPES), p-시아노페닐에틸실포닐(CPES), 카보메톡시에틸술포닐(CEMS), 트리이소프로필실릴옥시메틸(TOM) 및 2'실릴-함유 티로카보네이트 보호기가 포함되되, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 따른 방법의 다른 구현예에 의하면, 보호된 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 β-시아노에틸 보호 포스페이트 결합 및/또는 β-시아노에틸 보호 포스포티오에이트(phosphorthioate) 결합 및/또는 β-시아노에틸 보호 포스포디티오에이트 결합 및/또는 β-시아노에틸 보호 포스포아미데이트 결합 및/또는 β-시아노에틸 보호 티오포스포아미데이트 결합을 함유하고 있다.
본 발명에 따른 방법의 다른 구현예에 의하면, 보호된 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 β-시아노에틸 보호 포스페이트 결합 및/또는 β-시아노에틸 보호 포스포티오에이트 결합을 함유하고 있다.
하기에서는, 본 발명에 의한 방법 중 일부 특히 바람직한 특정 구현예들을 제공한다.
본 발명의 일 특정 구현예는 올리고뉴클레오타이드의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 보호된 올리고뉴클레오타이드로부터 β-시아노에틸 보호기를 제거하는 단계를 적어도 포함하며, 상기 제거 단계는 보호된 올리고뉴클레오타이드를 전술된 바와 같은 농도에서 DBU와 접촉시키는 것을 포함하며, 올리고뉴클레오타이드는 고상 지지체에 부착되며, 바람직하게 용매는 아세토니트릴이다.
다른 특정 구현예에서, 본 발명은 올리고뉴클레오타이드의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 보호된 올리고뉴클레오타이드로부터 β-시아노에틸 보호기를 제거하는 단계를 적어도 포함하며, 상기 제거 단계는 보호된 올리고뉴클레오타이드를, 전술된 바와 같은 농도에서, 짝산의 pKa가 11.5를 초과하는 아민과 접촉시키는 것을 포함하며, 올리고뉴클레오타이드는 DNA이고 고상 지지체에 부착된다. 바람직하게 아민은 DBU이다. 바람직하게 용매는 아세토니트릴이다.
다른 특정 구현예에서, 본 발명은 올리고뉴클레오타이드의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 보호된 올리고뉴클레오타이드로부터 β-시아노에틸 보호기를 제거하는 단계를 적어도 포함하며, 상기 제거 단계는 보호된 올리고뉴클레오타이드를, 전술된 바와 같은 농도에서, 짝산의 pKa가 11.5를 초과하는 아민과 접촉시키는 것을 포함하며, 올리고뉴클레오타이드는 RNA이고 고상 지지체에 부착된다. 바람직하게 아민은 DBU이다. 바람직하게 RNA는 2'-O-TBDMS이거나 또는 2'-O-알킬 RNA이다. 바람직하게 용매는 아세토니트릴이다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명은 올리고뉴클레오타이드의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 보호된 올리고뉴클레오타이드로부터 β-시아노에틸 보호기를 제거하는 단계를 적어도 포함하며, 상기 제거 단계는 보호된 올리고뉴클레오타이드를, 전술된 바와 같은 농도에서, 짝산의 pKa가 11.5를 초과하는 아민과 접촉시키는 것을 포함하며, 올리고뉴클레오타이드는 LNA이고 고상 지지체에 부착된다. 바람직하게 아민은 DBU이다. 바람직하게 LNA는 2'-O,4'-C-메틸렌-β-D-리보퓨라노실 뉴클레오타이드를 포함한다. 바람직하게 용매는 아세토니트릴이다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명은 올리고뉴클레오타이드의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 보호된 올리고뉴클레오타이드로부터 β-시아노에틸 보호기를 제거하는 단계를 적어도 포함하며, 상기 제거 단계는 보호된 올리고뉴클레오타이드를, 전술된 바와 같은 농도에서, 짝산의 pKa가 11.5를 초과하는 아민과 접촉시키는 것을 포함하며, 올리고뉴클레오타이드는 BNA이고 고상 지지체에 부착된다. 바람직하게 아민은 DBU이다. 바람직하게 BNA는 2'-O,4'-C-가교 뉴클레오타이드를 포함한다. 바람직하게 용매는 아세토니트릴이다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명은 올리고뉴클레오타이드의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 보호된 올리고뉴클레오타이드로부터 β-시아노에틸 보호기를 제거하는 단계를 적어도 포함하며, 상기 제거 단계는 보호된 올리고뉴클레오타이드를, 전술된 바와 같은 농도에서, 짝산의 pKa가 11.5를 초과하는 아민과 접촉시키는 것을 포함하며, 올리고뉴클레오타이드는 ENA이고 고상 지지체에 부착된다. 바람직하게 아민은 DBU이다. 바람직하게 ENA는 2'-O,4'-C-에틸렌-가교 뉴클레오타이드를 포함한다. 바람직하게 용매는 아세토니트릴이다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명은 올리고뉴클레오타이드의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 보호된 올리고뉴클레오타이드로부터 β-시아노에틸 보호기를 제거하는 단계를 적어도 포함하며, 상기 제거 단계는 보호된 올리고뉴클레오타이드를, 전술된 바와 같은 농도에서, 짝산의 pKa가 11.5를 초과하는 아민과 접촉시키는 것을 포함하며, 올리고뉴클레오타이드는 UNA이고 고상 지지체에 부착된다. 바람직하게 아민은 DBU이다. 바람직하게 UNA는 2',3'-seco RNA 뉴클레오타이드를 포함한다. 바람직하게 용매는 아세토니트릴이다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명은 올리고뉴클레오타이드의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 보호된 올리고뉴클레오타이드로부터 β-시아노에틸 보호기를 제거하는 단계를 적어도 포함하며, 상기 제거 단계는 보호된 올리고뉴클레오타이드를, 전술된 바와 같은 농도에서, 짝산의 pKa가 11.5를 초과하는 아민과 접촉시키는 것을 포함하며, 올리고뉴클레오타이드는 고상 지지체에 부착되고, 지지된 올리고뉴클레오타이드는 칼럼 내에 마련되며, 염기 용액은 칼럼을 통과한다. 바람직하게 아민은 DBU이다. 이 구현예에서, 바람직하게 용매는 아세토니트릴이다. 바람직하게, 상기 방법은 아민 용액이 연속적으로 칼럼을 순환하는 동안에 수행된다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명은 올리고뉴클레오타이드의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 보호된 올리고뉴클레오타이드로부터 β-시아노에틸 보호기를 제거하는 단계를 적어도 포함하며, 상기 제거 단계는 보호된 올리고뉴클레오타이드를, 전술된 바와 같은 농도에서, 짝산의 pKa가 11.5를 초과하는 아민과 접촉시키는 것을 포함하며, 올리고뉴클레오타이드는 전술된 바와 같이 고상 지지체에 부착되되, 특히는 폴리스티렌에 부착된다. 바람직한 아민은 DBU이고, 바람직한 용매는 아세토니트릴이다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명은 올리고뉴클레오타이드의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 보호된 올리고뉴클레오타이드로부터 β-시아노에틸 보호기를 제거하는 단계를 적어도 포함하며, 상기 제거 단계는 보호된 올리고뉴클레오타이드를, 전술된 바와 같은 농도에서, 짝산의 pKa가 11.5를 초과하는 아민과 접촉시키는 것을 포함하며, 올리고뉴클레오타이드는 고상 지지체에 부착되며, 올리고뉴클레오타이드는 β-시아노에틸 보호 포스페이트, β-시아노에틸 보호 포스포티오에이트, β-시아노에틸 보호 포스포디티오에이트, β-시아노에틸 보호 포스포아미데이트, β-시아노에틸 보호 티오포스포아미데이트 또는 이들의 2종 이상으로 이루어진 군에서 선택된 β-시아노에틸 보호기를 포함한다. 바람직하게 아민은 DBU이다. 바람직하게 용매는 아세토니트릴이다.
본 발명에 의한 방법의 이점은 보호기, 특히 β-시아노에틸 보호기의 효과적인 제거에 있다. 본 발명의 방법은 고상 지지체에 부착된 올리고뉴클레오타이드를 지지체로부터 절단하지 않고 처리할 수 있게 한다.
비록 이전의 설명과 하기의 실시예들이, 본질적으로는, 그 짝산의 pKa가 11.5를 초과하는 아민 염기의 사용에 대한 것이지만, 보호기, 특히 β-시아노에틸 보호기를 보호된 올리고뉴클레오타이드로부터 제거하는 일은, 본원에 전술된 바와 같은 농도 및 방법 조건에 따라서 유기 용매에 용해가능한 다른 유기 염기 용액을 사용함으로써 유리하게 수행될 수 있다. 이러한 다른 염기의 예로는, 그 짝산의 pKa가 8 내지 11.5인 아민, 예컨대 알킬아민, 특히는 디에틸아민, 트리에틸아민 또는 피페리딘이 포함된다.
도 1 내지 도 14는 HPLC 및/또는 LC/MS의 분석 결과들을 나타내는 도면.
후술하는 실시예는 예시적인 것일 뿐 본 발명을 제한하는 것이 아니다.
실시예
이들 실시예와 본 명세서 전체에 걸쳐 이용된 약어들을 다음과 같이 정의한다:
CNET 부가물은, 합성된 올리고뉴클레오타이드의 P-중심으로부터 2-시아노에틸 보호기를 제거하는 동안에 생성된 아크릴로니트릴과의 반응 결과로 얻은 N3-시아노에틸 변형 티미딘(N3-cyanoethyl modified thymidine)을 의미하고, FL35는 Fineline 35 칼럼을 의미하며, CT는 접촉 시간을 의미하고, CV는 칼럼 체적을 의미한다.
실시예 1:
완전 변형된 5'-d(TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT)-3' 포스포로티오에이트 24-머의 합성
상기 서열(SEQ ID NO:1)의 합성은, ChemGenes(및 ThermoFisher)로부터 수득된 시아노에틸 포스포아미다이트 및 그램 당 200 umoles로 충전된 GE Primer 지지체를 사용하여, 3 mmol 합성 스케일에서 FL35 칼럼을 이용하여 ÅKTA 100 합성기 상에서 수행되었다. 합성이 끝나면, 말단 5'-O-보호기 4,4-디메톡시트리틸(DMTr) 보호기는 제거되는 반면에 올리고뉴클레오타이드 생성물은, 아민 세척 단계 이전에는, 여전히 고상 지지체에 부착된 상태였다. 아민 세척 단계는, 탈시아노에틸화 시약의 10-60 칼럼 체적(CV)을 이용하여, 아세토니트릴 중의 0.05M DBU(1,8-디아자바이사이클로[5.4.0]운덱-7-엔) 용액을 이용하여 적어도 200분 동안 수행되었다. 후속으로, 탈시아노에틸화된 올리고뉴클레오타이드 생성물을 합성 칼럼으로부터 제거하고, 농축된 수성 암모니아(물 중, ~30 wt%)로 55℃에서 16 내지 24 시간 동안 처리하고, 분석적 이온교환 HPLC와 LC/MS에 의해 분석하였다(도 1 및 도 2).
실시예 2, 3, 4 및 5: 모든 인터뉴클레오타이드 결합이 포스포로티오에이트 연결기 5'-d(TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT)-3'(SEQ ID NO:1)인 변형 24-머의 합성
일반 과정
SEQ ID NO:1인 포스포로티오에이트의 합성은, 206 μmol/g로 충전된 GE Primer 지지체 및 상업적으로 입수가능한 포스포아미다이트를 사용하여, 3 mmol 합성 스케일로 FL35 칼럼을 이용하여 ÅKTA 100 합성기 상에서 수행되었다. 고상 지지체의 합성이 끝나면, 말단 5'-O-4,4-디메톡시트리틸(DMTr) 보호기는 디클로로아세트산을 이용한 처리에 의해 칼럼 상에서 제거되었다. 다양한 칼럼 체적(CV)의 디시아노에틸화 시약을 사용하여, 다양한 접촉 시간에서 다양한 농도의 DBU(1,8-디아자바이사이클로[5.4.0]운덱-7-엔) 용액을 이용한 탈시아노에틸화 반응들을 연구하기 위해, 고상 지지체를 건조시켜, 1.2 ml 고정식 칼럼(0.05 mmol 스케일) 또는 6.3 ml 고정식 칼럼(0.25 mmol 스케일)에 분배식으로 다시 채웠다. 비교예의 경우, DBU와의 접촉 단계를 수행하지 않았다. 표 1에 관련 데이터를 정리하였다. 모든 실시예에 대해, 탈시아노에틸화된 올리고뉴클레오타이드 생성물을 농축된 수성 암모니아(물 중, ~30 wt%)로 55℃에서 16 시간 동안 처리하고, 분석적 RP-HPLC와 LC/MS에 의해 분석하였다.
실시예 스케일
(mmol)		 ACN 중의 DBU [M] CT
[분] (a)		 CV 량
(b)		 HPLC 결과 LC-MS 결과
2 0.05 0.05 M 360 60 도 3 도 4
3 (비교예) 0.0 - - - 도 5 도 6
4 0.25 0.2 M 15 5 도 7 -
5 0.25 0.05 M 360 30 도 8 -
(a) CT = 접촉 시간; (b) CV = 칼럼 체적
HPLC와 LC-MS 데이터를 도 3과 도 4에 나타내었다. SEQ ID NO:1은 27.174분에 용출(elute)되었고, CNET 부가물은 28.464분에 용출되었다. SEQ ID NO:1의 이론적 MW는 7698 Da이었으며, CNET 부가물의 이론적 MW는 7751 Da이었다.
실시예 6 및 실시예 7: 모든 인터뉴클레오타이드 결합이 포스포로티오에이트 연결기 5'-CcA ttG Tca CaC tCC-3'(upper case LNA, lower case DNA)(SEQ ID NO:2)인 변형 15-머의 합성
SEQ ID NO:2인 포스포로티오에이트의 합성은, GE Primer 지지체 및 상업적으로 입수가능한 포스포아미다이트 단량체를 사용하여, 3.6 mmol 스케일로 FL35 칼럼을 이용하여 ÅKTA 100 합성기 상에서 수행되었다. 합성이 끝나면, 말단 5'-O-4,4-디메톡시트리틸(DMTr) 보호기는 제거된 반면에, 올리고뉴클레오타이드 생성물은 여전히 고상 지지체에 부착되어 있었다. 다양한 칼럼 체적(CV)의 디시아노에틸화 시약을 사용하여, 다양한 접촉 시간에서 다양한 농도의 DBU(1,8-디아자바이사이클로[5.4.0]운덱-7-엔) 용액을 이용한 탈시아노에틸화 반응들을 연구하기 위해, 고상 지지체를 건조시켜, 1.2 ml 고정식 칼럼(0.05 mmol 스케일) 또는 6.3 ml 고정식 칼럼(0.25 mmol 스케일)에 분배식으로 다시 채웠다. 비교예의 경우, DBU와의 접촉 단계를 수행하지 않았다. 표 2에 관련 데이터를 정리하였다. 모든 실시예에 대해, 탈시아노에틸화된 올리고뉴클레오타이드 생성물을 농축된 수성 암모니아(물 중, ~30 wt%)로 55℃에서 16 시간 동안 처리하고, 분석적 RP-HPLC와 LC/MS에 의해 분석하였다. LC-MS 데이터를 도 9에 나타내었다. SEQ ID NO:2와 CNET 부가물은 동시에 용출되었다. LC/MS로 양쪽 모두의 화합물을 확인하고 정량화하였다. SEQ ID NO:2의 이론적 MW는 4967 Da이었으며, CNET 부가물의 이론적 MW는 5020 Da이었다
탈시아노에틸화 처리를 또한 1 mmol 스케일까지 연장하였으며, 긍정적 결과를 얻었다(데이터 미제공).

실시예
스케일
(mmol)
ACN 중의 DBU [M]
CT
[분] (a)
CV 량
(b)		 LC-MS 결과
데이터 SEQ ID NO:2
(c)		 CNET
부가물 (c)
6
(비교예)		 0.05 - - - 도 9 86.53 4.39
7 0.05 0.03 6 2 도 10 88.94 0.16
(a) CT = 접촉 시간; (b) CV = 칼럼 체적
(c) 피크의 총 표면 %
실시예 8, 9, 10 및 11: 모든 인터뉴클레오타이드 결합이 포스포로티오에이트 연결기 5'-d(TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT)-3'(SEQ ID NO:1)인 변형 24-머의 합성
SEQ ID NO:1인 포스포로티오에이트의 합성은, 6.3 mL 고정식 칼럼과, ÅKTA 100 합성기와, 상업적으로 입수가능한 포스포아미다이트 단량체(각각 0.215 및 0.156 mmol의 스케일)를 이용하여 두 개의 상이한 유니버셜 지지체(유니버셜 지지체 유형 1 및 2(반응식 1)) 상에서 수행되었다. 유니버셜 지지체를 사용함에 따라, 첫 번째 뉴클레오사이드를 3' 말단에 통합하기 위한 커플링 단계가 추가로 요구된다. 합성이 끝나면, 말단 5'-O-4,4-디메톡시트리틸(DMTr) 보호기는 제거된 반면에, 올리고뉴클레오타이드 생성물은 여전히 고상 지지체에 부착되어 있었다. 다양한 칼럼 체적(CV)의 디시아노에틸화 시약을 사용하여, 다양한 접촉 시간에서 다양한 농도의 DBU(1,8-디아자바이사이클로[5.4.0]운덱-7-엔) 용액을 이용한 탈시아노에틸화 반응들을 연구하기 위해, 고상 지지체를 진공 하에 건조시키고, 지지체의 일부를 1.2 ml 고정식 칼럼들(각각 0.043 & 0.025 mmol 스케일)에 재충전하였다. 비교예의 경우, DBU와의 접촉 단계를 수행하지 않았다. 표 3에 관련 데이터를 정리하였다. 모든 실시예에 대해, 탈시아노에틸화된 올리고뉴클레오타이드 생성물을 농축된 수성 암모니아(물 중, ~30 wt%)로 지지체의 제조업자가 제안한 조건에 따라 처리하고, 분석적 RP-HPLC에 의해 분석하였다.
실시예 스케일
(mmol)		 유니버셜
지지체
유형 		ACN 중의 DBU [M] CT
[분] (a)		 CV 량
(b)
HPLC 결과
8 (비교예) 0.043 1 - - - 도 11
9 0.043 1 0.2M 30 10 도 12
10 (비교예) 0.025 2 - 0 - 도 13
11 0.025 2 0.2M 30 10 도 14
(a) CT = 접촉 시간; (b) CV = 칼럼 체적
도 11에 나타난 바와 같이, SEQ ID NO:1은 26.388분에 용출되었고, CNET 부가물은 27.661분에 용출되었다.
이들 실시예는 본 발명에 따른 방법이 염기의 농도가 매우 낮더라도 인-보호기를 효율적 및 선택적으로 탈보호시킬 수 있게 한다는 것을 보여준다. 특히, 원치 않는 CNET 부가물의 형성을 실질적으로 막을 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Girindus America Inc <120> Process for the manufacture of oligonucleotides <130> GIR 2008/01 <150> US 61/047524 <151> 2008-04-24 <160> 2 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> Feature: <223> Synthetic Sequence <400> 1 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> artificial sequence <220> Feature: <223> Synthetic sequence <220> Feature: <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> 2'-O,4'-C-methylene-beta-D-ribofuranosyl cytosine <220> Feature: <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, t or u <220> Feature: <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 2'-O,4'-C-methylene-beta-D-ribofuranosyl adenosine <220> Feature: <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is a, c, g, t or u <220> Feature: <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2'-O,4'-C-methylene-beta-D-ribofuranosyl guanosine <220> Feature: <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> n is a, c, g, t or u <220> Feature: <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> 2'-O,4'-C-methylene-beta-D-ribofuranosyl thymine <220> Feature: <221> modified_base <222> (10)..(10) <223> 2'-O,4'-C-methylene-beta-D-ribofuranosyl cytosine <220> Feature: <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is a, c, g, t or u <220> Feature: <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> 2'-O,4'-C-methylene-beta-D-ribofuranosyl cytosine <220> Feature: <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a, c, g, t or u <220> Feature: <221> modified_base <222> (14)..(14) <223> 2'-O,4'-C-methylene-beta-D-ribofuranosyl cytosine <220> Feature: <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, t or u <220> Feature: <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> 2'-O,4'-C-methylene-beta-D-ribofuranosyl cytosine <400> 2 ncnttnncan antnn 15

Claims (15)

  1. 보호된 올리고뉴클레오타이드로부터 β-인 제거-보호기, 특히는 β-시아노에틸 보호기를 제거하는 단계를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 제조 방법으로, 상기 제거 단계는 보호된 올리고뉴클레오타이드를 바람직하게는 피리딘으로 구성되지 않은 용매 중의 아민 용액과 접촉시키는 것을 포함하고, 아민의 짝산의 pKa가 바람직하게는 11.5를 초과하며, 용매 중의 아민의 농도는 0.5 몰/리터 미만인 것인 올리고뉴클레오타이드의 제조 방법.
  2. BNA, LNA, ENA, UNA 및 이들의 유도체 중에서 선택된 올리고뉴클레오타이드의 제조 방법으로, 상기 방법은 보호된 BNA, LNA, ENA 또는 UNA-올리고뉴클레오타이드로부터 β-인 제거-보호기, 특히는 β-시아노에틸 보호기를 제거하는 단계를 적어도 포함하며, 상기 제거 단계는 보호된 올리고뉴클레오타이드를 바람직하게는 피리딘으로 구성되지 않은 용매 중에 함유되어 있고, 짝산의 pKa가 11.5를 초과하는 아민과 접촉시키는 것을 포함하는 것인 올리고뉴클레오타이드의 제조 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 용매 중의 아민의 농도가 0.03 내지 0.25 몰/리터인 것인 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 용매가 할로겐화 화합물 또는 시아노알킬 화합물을 포함하거나, 또는 할로겐화 화합물 또는 시아노알킬 화합물로 본질적으로 구성되는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 용매가 아세토니트릴을 포함하거나, 또는 아세토니트릴로 본질적으로 구성되는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드가 아민 용액과 3분 내지 360분의 반응 시간 동안 접촉되는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 반응 시간이 30분 미만이며, 바람직하게는 20분 이하인 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제거 단계가 10℃ 내지 60℃의 온도에서 수행되는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 보호된 올리고뉴클레오타이드가 고상 지지체에 부착되는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 짝산의 pKa가 11.5보다 크고 최대 12.5, 바람직하게는 약 12인 아민이 사용되는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 아민이 DBU(1,8-디아자바이사이클로[5.4.0]운덱-7-엔)인 것인 방법.
  12. 제1항 또는 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 짝산의 pKa가 8 내지 11.5인 아민이 사용되는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 보호된 올리고뉴클레오타이드와 접촉되는 아민의 총량은, 아민과 보호기, 특히 제거대상인 β-시아노에틸 보호기 사이의 몰비가 1 이상이 되도록 정해지는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 보호된 올리고뉴클레오타이드와 접촉되는 아민의 총량은, 아민과 보호기, 특히 탈보호 조작시 제거대상인 β-시아노에틸 보호기 사이의 몰비가 0.01 이상 0.9 이하, 바람직하게는 약 0.1이 되도록 정해지는 것인 방법.
  15. 제1항 또는 제3항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드가 DNA, RNA, BNA, LNA, ENA, UNA 및 이들의 유도체 중에서 선택되는 것인 방법.
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