JP2020500009A - 切断可能ペプチドならびにそれを含む殺虫性タンパク質及び殺線虫性タンパク質 - Google Patents

Abstract

二元ペプチドまたは三元ペプチドのいずれかからなるペプチドであって、該ペプチドは、少なくとも４個のアミノ酸から最大１６個までのアミノ酸を含有し、２つまたは３つの異なる領域からなり、二元ペプチドは、２つの異なる領域を有し、三元ペプチドは、３つの異なる領域を有し、該ペプチドが、動物の腸内プロテアーゼ及び昆虫または線虫の腸内プロテアーゼの両方によって切断可能である、ペプチド。【選択図】図２

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１０月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／４１１，１１７号に基づく利益及び優先権を主張するＰＣＴ出願であり、この米国仮特許出願の開示内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。

配列表
本出願は、２０１７年９月２９日に作成され本明細書と共に電子提出された「ＦＡＭ＿Ｏ＿ＰＣＴ＿２２５３１２＿４１７６４１＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴ＿２０１７＿０９＿２９＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題する配列表（５．３７ＭＢ）の全体を参照により組み込む。

新たな殺虫性及び殺線虫性タンパク質、切断可能ペプチド、それらをコードするＤＮＡ構築物、トランスジェニックタンパク質、植物におけるそれらの発現、トランスジェニックタンパク質を産生する方法、新たなプロセス、産生技術、新たなペプチド、新たな製剤、ならびに昆虫及び線虫を制御するための関連する殺虫性及び殺線虫性タンパク質に期待されるものよりも高い有害生物抵抗性をもたらすトランスジェニックタンパク質に含有された新規及び公知の殺虫性及び殺線虫性タンパク質の組み合わせが記述され、特許請求される。

近代農業及び園芸によって生産される食物の世界的安全性には、昆虫有害生物という問題がある。農業従事者は虫害を抑制するために殺虫剤に依存しているが、危険な化学物質の市場からの排除、ならびにあらゆる主要なクラスの化学的殺虫剤及び生物学的殺虫剤に対して抵抗性がある昆虫系統の進化により、農業従事者にとって利用可能な安全かつ機能的な殺虫剤の商業的選択肢は減少している。農業従事者が作物保護を維持するためには新たな殺虫剤が必要である。

殺虫性及び殺線虫性のペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質は、それらの標的、通常は昆虫または線虫に対して毒性があるペプチド及びタンパク質ポリマーである。殺虫性ペプチドまたは毒素は、一般的にサソリまたはクモなどの節足動物起源に由来する。これらの毒素は、昆虫の腸または内臓に直接注入することによって送達してもよいし、または昆虫がその食物から毒素を摂取すること、例えば昆虫がトランスジェニック植物を採餌することを誘導することによって送達してもよい。これらの毒素は、昆虫の棲む生息地（ｌｏｃｕｓ）または昆虫の環境に散布または他の手段によって毒素を拡散することにより毒素が昆虫に送達されると、昆虫の成長を阻害したり、動きを損なったり、または更にはそれを殺傷したりする能力を有することが知られている。昆虫は、直接曝露または摂取により、毒性ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質と何らかのかたちで接触する。

しかしながら、殺虫性ペプチドが商業市場に達するには数多くの問題があり、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓすなわちＢｔに由来するペプチドという１つの注目すべき例外を除いては、これまでに認可され商業市場に出回っている殺虫性ペプチドは、あるとしてもごく少数である。現在、Ｂｔタンパク質に対する昆虫の抵抗性の上昇が大きく懸念されている。

Ｂｔタンパク質、またはＢｔペプチドは、植物組み込み保護剤及び葉面散布剤の両形態において作物保護のために使用される効果的な殺虫剤である。市販のＢｔタンパク質製剤は、幼虫段階で昆虫を制御するために広く使用されている。阻害性システインノットモチーフ（ＩＣＫ）タンパク質もまた、サソリまたはクモの毒液などの節足動物起源に由来する殺虫性ペプチドのクラスである。

トリプシン調節性卵形成阻害因子（ＴＭＯＦ）ペプチドなど、他のクラス及びタイプの潜在的なペプチドが特定されている。ＴＭＯＦペプチドは、殺虫活性を引き起こすためには、その生理学的作用部位に送達される必要がある。ＴＭＯＦペプチドは、大きな可能性をもつ潜在的な殺幼虫剤として特定されている（Ｄ．Ｂｏｒｏｖｓｋｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０６，３８６９−３８７５を参照のこと）。しかし、ほぼ全ての他の殺虫性ペプチドと同様に、ＴＭＯＦは商業化されておらず、また、農業従事者によって広く使用されていない。これには理由がある。

殺虫性ペプチドをペプチド構造及びフォールディングの再現性よく合理的かつ経済的な価格において商業規模で首尾よく産生できるようにすることは、商業化への大きな障害であり得る。殺虫性ペプチドの幅広い種類、独特の特性、及び特殊な性質を可能性のある多種多様な産生技術と組み合わせると、ペプチドの応用及び産生のための膨大な数の手法がもたらされ得るが、商業的に成功しているものは、あるとしてもごく少数である。

特定されている多数の殺虫性ペプチドのうち市場に出回っているものがほとんどない理由はいくつかある。第１に、ほとんどの殺虫性ペプチドは、商業的に使用するには脆弱すぎるか、または毒性が不十分であるかのいずれかである。第２に、殺虫性ペプチドは商業的に産生するのが困難であり、コストが高い。第３に、多くの殺虫性ペプチドは急速に分解され、短い半減期を有する。第４に、植物で発現させたときに適切にフォールディングする殺虫性ペプチドはごく少数であり、遺伝子修飾植物などの遺伝子修飾生物（ＧＭＯ）においてその毒性は失われる。第５に、特定されている殺虫性ペプチドのほとんどは、昆虫の全身に分布することができず、かつ／または昆虫に摂取されるとその毒性を失う。この最後の問題に関してＢｔタンパク質は例外であり、Ｂｔタンパク質は昆虫の採餌を妨害するため広く使用されている。
本発明は、殺虫性ペプチドの商業化及び広範な使用を妨げてきたこれらの主要な問題に対し、いくつかの解決策を提示する。本発明は、活性部位、すなわち昆虫または線虫の腸もしくは他の臓器における、比較的多数の殺虫性及び殺線虫性の毒性ペプチドの合成及び放出を可能にする、トランスジェニックタンパク質を提示する。宿主における合成は、トランスジェニックタンパク質の適切なフォールディングを可能にし、宿主細胞における合成を増強させる、宿主細胞の領域における指向性発現によって促進される。

Ｄ．Ｂｏｒｏｖｓｋｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０６，３８６９−３８７５

本発明は、宿主細胞、例えば昆虫または線虫有害生物によって摂取される植物細胞において発現及び合成され得る、毒性のある殺虫性及び／または殺線虫性の毒性ペプチド及びタンパク質に融合した切断可能ペプチドを提示する。切断可能ペプチドは、昆虫及び／または線虫の腸内環境及び／または血リンパ環境ならびにヒトの胃腸管系において切断されることにより、１つ以上の殺虫性及び／または殺線虫性の毒性ペプチド及びタンパク質を含むそのペイロードを放出し得る。

第１の態様において、本発明は、２つまたは３つの異なる領域からなる、少なくとも４個のアミノ酸から最大１６個までのアミノ酸を含有する、二元ペプチドまたは三元ペプチドを含む切断可能ペプチドを提示する。一例において、二元ペプチドは、２つの異なる領域（昆虫もしくは線虫の切断可能領域及び動物（例えばヒト）の腸内切断可能領域）を有し、三元ペプチドは、二元ペプチドと同じ２つの領域を有するが、二元ペプチドには見出されないもう１つの領域も含む。またこの二元ペプチド及び三元ペプチドは、動物の腸内プロテアーゼ及び昆虫または線虫の腸内プロテアーゼの両方によって切断可能である。一部の実施形態では、本発明の切断可能ペプチド（二元及び三元の切断可能ペプチド（Ｌ））は、植物細胞において、内因性植物プロテアーゼによっても、天然に存在する植物プロテアーゼによっても切断され得ない。

関連する実施形態において、例示的な二元ペプチドは、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ４−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ４、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ４、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４のアミノ酸配列［式中、各Ｘ_ｎ及び各Ｙ_ｎはアミノ酸であり、Ｘ_１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、及びＶからなる群から選択され、Ｘ_２は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ_４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｙ_１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ_２は、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ_４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される］を含む。

別の関連する態様において、本発明の三元ペプチドは、少なくとも５個のアミノ酸から最大１６個までのアミノ酸を含有し、三元ペプチドは、二元ペプチド及びアミノ酸数１〜４のスペーサーを含む。一部の実施形態では、スペーサーは、本明細書に開示されるように、アミノ酸配列ＧＳを含み、二元ペプチドのＮ末端に、または二元ペプチドのＣ末端に、または二元ペプチドのＮ末端及びＣ末端の両方にインフレームで融合している。

第２の態様において、本発明は、殺虫性または殺線虫性の毒性タンパク質に切断可能ペプチド（二元ペプチドまたは三元ペプチド）がインフレームで融合している殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を提示する。別の実施形態では、本発明は、２つ以上の切断可能ペプチドを有する殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質であって、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質が、二元ペプチドまたは三元ペプチドを含み、二元ペプチドまたは三元ペプチドが、（ＴＰ−Ｌ）_ｎ（式中、ｎは、１〜２００、または１〜１００、または１〜１０の範囲の整数である）を含む構築物にインフレームで融合している、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を提示する。別の実施形態では、本明細書に記述される殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、二元ペプチドまたは三元ペプチドにインフレームで融合した小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）を含み、二元ペプチドまたは三元ペプチドは、殺虫性もしくは殺線虫性の毒性タンパク質及び／またはリピート構築物（Ｌ−ＴＰ）_ｎもしくは（ＴＰ−Ｌ）_ｎ（式中、ｎは、１〜２００、または１〜１００、または１〜１０の範囲の整数である）にインフレームで融合している。種々の実施形態において、例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、（ＥＲＳＰ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）（式中、ｎは１〜２００の範囲の整数である）を含むタンパク質構築物を含み得る。上述した種々の関連する実施形態において、ＴＰは毒性タンパク質であり、Ｌは二元ペプチドまたは三元ペプチドであり、ｎは、１〜２００の範囲の整数、好ましくは１〜１００の範囲の整数、より好ましくは１〜１０の範囲の整数である。一部の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、同じであるかまたは異なっているＴＰと、同じであるかまたは異なっている二元ペプチド及び／または三元ペプチドとを含有し得る。一部の実施形態では、Ｃ末端側ＴＰは、そのＣ末端において、二元ペプチドまたは三元ペプチドに融合しているか、または融合していない。一部の実施形態では、Ｎ末端側ＴＰは、そのＮ末端において、二元ペプチドまたは三元ペプチドに融合しているか、または融合していない。

別の実施形態では、本発明は、２つ以上の切断可能ペプチドを有する殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質であって、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質が、二元ペプチドまたは三元ペプチドのＮ末端、あるいは（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−Ｌ、（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、またはＬ−（ＴＰ−Ｌ）_ｎを含む構築物のＮ末端のいずれかにインフレームで融合した安定化ドメイン（ＳＴＡ）を含む、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を提示する。一部の関連する実施形態において、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、毒性タンパク質のＮ末端に融合している二元ペプチドまたは三元ペプチドのＮ末端、あるいは（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−Ｌ、（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、またはＬ−（ＴＰ−Ｌ）_ｎを含む構築物のＮ末端のいずれかにインフレームで融合した、安定化ドメイン（ＳＴＡ）のＮ末端にインフレームで融合した、ＥＲＳＰを含む。種々の実施形態において、例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、または（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎを含む構築物を含み得る。一部の関連する実施形態において、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、毒性タンパク質のＮ末端に融合している二元ペプチドまたは三元ペプチドのＮ末端、あるいは（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−Ｌ、（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、またはＬ−（ＴＰ−Ｌ）_ｎを含む構築物のＮ末端のいずれかにインフレームで融合した、ＥＲＳＰを含む。種々の実施形態において、例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、または（ＥＲＳＰ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎを含む構築物を含み得る。本明細書及び上文に記述される種々の実施形態において、ＴＰは、昆虫及び／または線虫に対して毒性のある毒性タンパク質と定義され、Ｌは二元ペプチドまたは三元ペプチドであり、ｎは、１〜２００の範囲の整数、好ましくは１〜１００の範囲の整数、より好ましくは１〜１０の範囲の整数である。一部の実施形態では、本明細書及び上文に記述される構築物のＣ末端側ＴＰは、そのＣ末端において、二元ペプチドまたは三元ペプチドに融合しているか、または融合していない。一部の実施形態では、Ｎ末端側ＴＰは、そのＮ末端において、二元ペプチドまたは三元ペプチドに融合しているか、または融合していない。

別の関連する態様において、本発明は、本明細書に例示される殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を含む植物またはその一部を提示する。関連する実施形態において、本発明は、ＤＮＡ構築物、例えば発現ベクターにおいて、作動可能なプロモーター（例えば同種または異種プロモーター）に作動可能に連結したポリヌクレオチドを含む、植物またはその一部であって、ポリヌクレオチドが、二元ペプチドまたは三元ペプチドのいずれかを含むペプチドを含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードし、二元ペプチド及び／または三元ペプチドが、少なくとも４個のアミノ酸から最大１６個までのアミノ酸を含有し、かつ２つまたは３つの異なる領域からなり、二元ペプチドは、２つの異なる領域を有し、三元ペプチドは、３つの異なる領域を有し、二元ペプチド及び／または三元ペプチドが、動物の腸内プロテアーゼ（例えばヒトの腸内プロテアーゼ）及び昆虫または線虫の腸内プロテアーゼの両方によって切断可能であり、二元ペプチドまたは三元ペプチド（Ｌ）が、毒性タンパク質（ＴＰ）にインフレームで融合している、植物またはその一部を提示する。一部の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、リピート構築物（Ｌ−ＴＰ）_ｎまたは（ＴＰ−Ｌ）_ｎ（式中、ｎは、１〜２００、または１〜１００、または１〜１０の範囲の整数である）を含む。関連する実施形態において、二元ペプチド及び／または三元ペプチドは、そのＮ末端において、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）のＣ末端に作動可能に融合しており、そのＣ末端において、ＴＰのＮ末端に作動可能に融合している。図４、５、及び６Ｃを参照のこと。関連する実施形態において、植物またはその一部は、本明細書に例示される、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質、及び／または、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、この殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、二元ペプチドまたは三元ペプチドを含む（この二元ペプチドまたは三元ペプチドは、（ＴＰ−Ｌ）_ｎを含む構築物にインフレームで融合している）か、あるいは殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、リピート構築物（Ｌ−ＴＰ）_ｎまたは（ＴＰ−Ｌ）_ｎ（式中、ｎは、１〜２００、または１〜１００、または１〜１０の範囲の整数である）を含む。関連する実施形態において、植物またはその一部は、本明細書に例示される、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質、及び／または、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、この殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、二元ペプチドまたは三元ペプチドのＮ末端にインフレームで融合したＥＲＳＰを含む（この二元ペプチドまたは三元ペプチドは、（ＴＰ−Ｌ）_ｎを含む構築物にインフレームで融合している）か、あるいは殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、二元ペプチド及び／またはリピート構築物（Ｌ−ＴＰ）_ｎもしくは（ＴＰ−Ｌ）_ｎにインフレームで融合したＥＲＳＰを含む。図４、５、及び６Ｃを参照のこと。種々の実施形態において、例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、（ＥＲＳＰ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）の構築物を含み得る。別の実施形態では、植物またはその一部は、作動可能なプロモーター（例えば同種または異種プロモーター）に作動可能に連結したポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドは、安定化ドメイン（ＳＴＡ）のＮ末端にインフレームで融合したＥＲＳＰを含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードする。図３、図５、及び図６Ｃを参照のこと。ＳＴＡは、二元ペプチドまたは三元ペプチドのＮ末端、あるいは（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−Ｌ、（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、またはＬ−（ＴＰ−Ｌ）_ｎを含む構築物のＮ末端のいずれかにインフレームで融合している。種々の実施形態において、例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、または（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎを含み得る。種々の実施形態において、ＴＰは、本開示において記述及び例示される殺虫性タンパク質及び／または殺線虫性タンパク質であり得る毒性タンパク質であり、Ｌは二元ペプチドまたは三元ペプチドであり、ｎは、１〜２００、または１０〜１７５、または２０〜１５０、または３０〜１００、または４０〜１００、または２０〜７０、または２０〜６０、または２０〜５０、または２０〜４０、または３０〜４０の範囲の整数である。一部の実施形態では、ｎは、１〜２０、または５〜２０、または１０〜２０、または２０〜８０、または３０〜６０、または３０〜５０の範囲、好ましくは、およそもしくは約、または明確に２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０の整数である。一部の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、同じであるかまたは異なっているＴＰと、同じであるかまたは異なっている二元ペプチド及び／または三元ペプチドとを含有し得る。一部の実施形態では、Ｃ末端側ＴＰは、そのＣ末端において、二元ペプチドまたは三元ペプチドに融合しているか、または融合していない。

第３の態様において、本発明は、植物の有害生物感染または寄生を制御する方法を提示する。本方法は、植物もしくはその一部または植物細胞を該有害生物の食餌に供給することを含み、該植物、その一部、または植物細胞は、本明細書に例示される殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質、及び／または、作動可能なプロモーター（例えば同種もしくは異種プロモーター）に作動可能に連結した少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むＤＮＡ構築物を含み、このポリヌクレオチドは、１つ以上の切断可能な二元ペプチド及び／または三元ペプチドを有する殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードする。関連する実施形態において、植物またはその一部は、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするＤＮＡ構築物を含み、この殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、（ＴＰ−Ｌ）_ｎを含む構築物、またはリピート構築物（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−Ｌ、（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、もしくはＬ−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ（式中、ｎは、１〜２００、または１０〜１７５、または２０〜１５０、または３０〜１００、または４０〜１００、または２０〜７０、または２０〜６０、または２０〜５０、または２０〜４０、または３０〜４０の範囲の整数である）にインフレームで融合している二元ペプチドまたは三元ペプチドを含む。一部の実施形態では、ｎは、１〜２０、または５〜２０、または１０〜２０、または２０〜８０、または３０〜６０、または３０〜５０の範囲、好ましくは、およそもしくは約、または明確に２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０の整数である。関連する実施形態において、植物またはその一部は、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするＤＮＡ構築物を含み、この殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、二元ペプチドまたは三元ペプチドのＮ末端にインフレームで融合したＥＲＳＰを含む（この二元ペプチドまたは三元ペプチドは、（ＴＰ−Ｌ）ｎを含む構築物にインフレームで融合している）か、あるいは殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、二元ペプチド及び／またはリピート構築物（Ｌ−ＴＰ）_ｎもしくは（ＴＰ−Ｌ）_ｎにインフレームで融合したＥＲＳＰを含む。種々の実施形態において、例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、（ＥＲＳＰ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）（式中、ｎは、１〜２００、または１０〜１７５、または２０〜１５０、または３０〜１００、または４０〜１００、または２０〜７０、または２０〜６０、または２０〜５０、または２０〜４０、または３０〜４０の範囲の整数である）を含み得る。一部の実施形態では、ｎは、１〜２０、または５〜２０、または１０〜２０、または２０〜８０、または３０〜６０、または３０〜５０の範囲、好ましくは、およそもしくは約、または明確に２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０の整数である。

別の実施形態では、植物またはその一部は、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするＤＮＡ構築物を含み、この殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、安定化ドメイン（ＳＴＡ）のＮ末端にインフレームで融合したＥＲＳＰを含む。ＳＴＡは、二元ペプチドまたは三元ペプチドのＮ末端、あるいは（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−Ｌ、（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、またはＬ−（ＴＰ−Ｌ）_ｎを含む構築物のＮ末端のいずれかにインフレームで融合している。種々の実施形態において、例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）（式中、ｎは、１〜２００、または１０〜１７５、または２０〜１５０、または３０〜１００、または４０〜１００、または２０〜７０、または２０〜６０、または２０〜５０、または２０〜４０、または３０〜４０の範囲の整数である）の構築物を含み得る。一部の実施形態では、ｎは、１〜２０、または５〜２０、または１０〜２０、または２０〜８０、または３０〜６０、または３０〜５０の範囲、好ましくは、およそもしくは約、または明確に２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０の整数である。種々の実施形態において、例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、または（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎの構築物を含み得る。種々の実施形態において、ＴＰは毒性タンパク質であり、Ｌは二元ペプチドまたは三元ペプチドであり、ｎは、１〜２００の範囲の整数、好ましくは１〜１００の範囲の整数、より好ましくは１〜１０の範囲の整数である。一部の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、同じであるかまたは異なっているＴＰと、同じであるかまたは異なっている二元ペプチド及び／または三元ペプチドとを含有し得る。一部の実施形態では、Ｃ末端側ＴＰは、そのＣ末端において、二元ペプチドまたは三元ペプチドに融合しているか、または融合していない。上記に例示した実施形態の各々において、有害生物は、本開示に記述される昆虫または線虫であり得る。種々の実施形態において、ＤＮＡ構築物は、ベクター、例えば、本発明の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むコーディング配列と、宿主細胞、例えば細菌細胞、酵母細胞、もしくは植物細胞におけるコーディング配列の複製及び／または発現を可能にする１つ以上の制御配列とを含有する、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る。上記の実施形態の一部では、本発明の二元ペプチド及び／または三元ペプチドは、植物細胞において、内因性植物プロテアーゼによっても、天然に存在する植物プロテアーゼによっても切断され得ない。

第４の態様において、本発明は、毒性ペプチドの活性部分と不活性部分との間に挿入された（例えばインフレームで融合した）二元ペプチドまたは三元ペプチドを含む、修飾された毒性ペプチドまたはタンパク質（ＴＰ）を提示する。一例では、ペプチドの切断可能なプロ型の不活性部分と、ペプチドの成熟型の活性部分との間に、二元ペプチドまたは三元ペプチドが挿入される。別の例では、修飾された毒性タンパク質（ＴＰ）は、毒性タンパク質（ＴＰ）の活性部分にインフレームで融合した本発明の二元ペプチドまたは三元ペプチドにインフレームで融合している安定化ドメインを含む。別の例では、修飾された毒性タンパク質（ＴＰ）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓすなわちＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（「Ｂｔ」）由来タンパク質であり、本明細書では別称「Ｂｔタンパク質」及び「Ｂｔペプチド」といい、これらは交換可能に使用され、Ｂｔにより産生されるペプチドを含み、本明細書ではこれらを集合的にＢｔ毒性タンパク質または「Ｂｔ ＴＰ」と呼ぶ。このようなペプチド及びタンパク質は、ｃｒｙ、ｃｙｔ、及びｖｉｐ遺伝子によってコードされる「ｃｒｙ」、「ｃｙｔ」、または「ＶＩＰ」タンパク質と書かれることが多い。Ｂｔ ＴＰは、より一般的には、ｃｒｙ遺伝子によってコードされる殺虫性結晶タンパク質に起因する。Ｂｔ ＴＰは、ＰＦＩＰＳ（ポア形成殺虫性タンパク質）の例である。種々の実施形態において、修飾されたＴＰは、安定化ドメイン（ＳＴＡ）が、二元ペプチドまたは三元ペプチド、あるいは本発明の二元ペプチドまたは三元ペプチドを１つまたは２つ以上含有する構築物にインフレームで融合している、上文及び本明細書に記述されるＢｔタンパク質を含み得る。二元ペプチドまたは三元ペプチドは、昆虫及び／または線虫の腸内環境及び／または血リンパ環境に曝露されると、またヒトの胃腸管系において、二元ペプチドまたは三元ペプチドが切断され、それによりＴＰの活性型または成熟型からＴＰの安定化部分または不活性部分が分離し、切断された活性部分または成熟部分が殺虫性及び／または殺線虫性になるように、Ｂｔタンパク質の活性断片にインフレームで融合している。一部の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、Ｂｔ ＴＰ及び／または修飾されたＢｔタンパク質、１つ以上の二元ペプチド及び／または三元ペプチド、ならびに上述のＥＲＳＰ及びＳＴＡのうちの１つ以上を含む。図３Ｂに示される一部の例示的な実施形態では、修飾されたＴＰは、Ｂｔ ＴＰ、例えばｃｒｙ、ｃｙｔ、またはＶＩＰタンパク質を含んでよく、ここでＴＰ_{ｉｎａｃｔｉｖｅ}は、Ｂｔ_{（ｉｎａｃｔｉｖｅ）}（Ｂｔ ＴＰの不活性部分）であり、ＴＰ_{ａｃｔｉｖｅ}は、Ｂｔ_{（ａｃｔｉｖｅ）}（Ｂｔ ＴＰの活性部分）であり、これらは分離し、かつ、図３Ｂに示されるようにＬと表記される１つ以上の二元ペプチド及び／または三元ペプチドにインフレームで融合している。昆虫及び／または線虫の腸内環境及び／または血リンパ環境に曝露されると、また動物対象（例えばヒト対象）の胃腸管系において、二元ペプチドまたは三元ペプチドは切断され、それによりＴＰの活性部分または成熟部分からＴＰの不活性部分が分離し、切断された活性部分または成熟部分が昆虫及び／または線虫において殺虫性及び／または殺線虫性になる。一部の関連する実施形態において、上記の修飾されたＴＰ、例えば例示的なＢｔ ＴＰは、場合により、修飾されたＴＰのＮ末端側部分にインフレームで融合したＥＲＳＰを含んでもよい。

ヒトの擬似胃腸液（ＳＧＦ）及び昆虫の腸内消化酵素によるアミノ酸配列ベースの切断の特異性を検出する、ＦＲＥＴキット（カタログ番号ＰＳＲＥＰＬＩ００５、Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ）におけるＦＲＥＴ分子の例証。この図は、いかに切断によって検出可能な蛍光が発生するかを説明するためにＭｉｍｏｔｏｐｅｓ ＦＲＥＴキットから拝借したものである。 本発明の例示的な実施形態である第１及び第２の態様の例証。第１の態様は、（Ｌ）と表記される二元及び／または三元の切断可能リンカーペプチドの図形表現である。第２の態様は、毒性ペプチドまたはタンパク質（ＴＰ）に融合したＬの種々の組み合わせ（１〜２００のリピート）を例示している。 図３Ａ。ＴＰに融合したＬに融合した任意選択の安定性ドメインまたは安定性タンパク質（ＳＴＡ）の付加の例証。この図は、Ｎ末端位置に位置付けられ、Ｌ及びＴＰにインフレームで融合して例示的なＳＴＡ−Ｌ−ＴＰ構築物を形成している、ＳＴＡの例示的な使用を例証する。図３Ｂは、ＴＰのＴＰ_{ｉｎａｃｔｉｖｅ}部分を含む修飾されたＴＰが、ＴＰのＴＰ_{ａｃｔｉｖｅ}部分にインフレームで融合した切断可能（Ｌ）ペプチドにインフレームで融合している実施形態を示す。図３Ｂに例示されているように、動物ならびに昆虫及び／または線虫の腸内環境に曝露されると、切断可能なＬペプチドが切断され、それによりＴＰ_{ｉｎａｃｔｉｖｅ}部分及びＴＰ_{ａｃｔｉｖｅ}部分が分離し、よって昆虫及び／または線虫においてＴＰの活性部分が遊離する。種々の実施形態において、修飾されたＴＰは、本明細書に記述されるＢｔ ＴＰである。 ２つ以上のＴＰ及びＥＲＳＰを有する殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質における二元または三元の切断可能な連結ペプチドの例証。この図は、図２の種々の実施形態に、Ｎ末端側に融合したＥＲＳＰが付加されたものを例示する。 ２つ以上のＴＰと、ＳＴＡのＮ末端側に融合したＥＲＳＰとを含む、例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質の二元または三元の切断可能な連結ペプチドの例証。この図は、図２の種々の実施形態に、ＳＴＡ及びこのＳＴＡのＮ末端側に融合したＥＲＳＰが付加されたものを例示する。 図６Ａは、ＢＡＡＳ ＥＲＳＰを含む例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を示し、ＢＡＡＳ ＥＲＳＰは、ユビキチンにインフレームで融合しており、ユビキチンは、Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ ＴＰに融合しており、Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ ＴＰは、３つのＬ−ＴＰ融合構築物（各反復構築物は、切断可能な連結ペプチドＬを含み、ここでＬは、３つの領域（ＸＹＺ）を有する三元の切断可能な連結ペプチドであり、Ｚ領域は、ジペプチドグリシン−セリンＧＳであり、ＴＰは、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａである）に融合しており、最後のＴＰ Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは、融合した１０Ｈｉｓタグを有する。図６Ｂは、３反復構築物にインフレームで融合したＢＡＡＳ ＥＲＳＰを含む例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を示し、この構築物は、二元または三元の切断可能な連結ペプチドであり得るリンカー（Ｌ）に融合したＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ ＴＰを含む。最後のＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ ＴＰは、１０Ｈｉｓタグを有する。図６Ｃは、構築物の形態で示されている例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質の図形表現を示し、示されているＥＲＳＰ、ＳＴＡ、（ＴＰ−Ｌ）_Ｎ、及びＴＰの各々はインフレームで融合している。この構築物において、ＥＲＳＰはＳＴＡドメインのＮ末端に融合しており、ＳＴＡドメインは反復構築物に融合しており、反復構築物はリンカーペプチド（Ｌ）に融合したＴＰのユニットを含み、反復構築物中の各ＴＰは同じであっても異なっていてもよく、反復構築物中の各Ｌは同じであっても異なっていてもよい。最後に、ＴＰ−Ｌ構築物の最後の反復ユニットは、ＴＰのＮ末端に融合している。この例示的な実施形態において、Ｎは、昆虫及び／または線虫の腸内環境における切断時に各Ｌが切断されることにより、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を摂取した昆虫または線虫に対する殺虫性及び／または殺線虫性があるＴＰの複数のコピーが放出されるような、１〜１０個の反復ユニット、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のユニットであり得る。 全ての消化酵素条件における、ＣＥＷ腸抽出物中でのみ切断する対照ペプチドＩＧＥＲと比較した、三元の連結ペプチドＡＬＫＬＦＶＧＳ及びＩＦＶＲＬＲＧＳの切断の検出の例証。この図は、３つの消化酵素条件（横列）と、介在する三元の連結ペプチドまたは対照ペプチドＩＧＥＲを含む４つのＴＰユニット（Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ）を各々が含有する３つの異なるタンパク質（縦列）とを含む。切断反応は、各ゲル画像の下に列記されている時点で変性条件（化学物質及び熱）を付加することにより停止される。Ｈｉｓタグのウエスタンブロット検出は、全ての消化条件における三元ペプチドＡＬＫＬＦＶＧＳ及びＩＦＶＲＬＲＧＳの消化及びタンパク質バンドの消失、またはＳＣＲ腸抽出物及びＳＧＦの両方における複数時点での対照ペプチドＩＧＥＲのインタクトなタンパク質バンドの保持を例示している。 安定なトウモロコシ形質転換ベクターの一例。この図は、安定なトウモロコシ形質転換ベクターの一例を示す。白矢印は、ベクターの基本的な骨格成分を示す。黒矢印は、トウモロコシゲノムに形質転換され、切断可能な連結ペプチドを含有する殺虫性タンパク質を発現するトランスジェニックトウモロコシ植物の選択及び再生をもたらす、ベクターのＴ−ＤＮＡ部分を示す。 図８において説明されるベクターによる形質転換後に、図６Ａにおいて説明される例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を含むオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を発現する、トウモロコシ植物の圃場試験の効力データの一例。

定義

「ＡＣＴＸ」または「ＡＣＴＸペプチド」とは、Ａｔｒａｃｉｎａｅ亜科に属するオーストラリアジョウゴグモから単離された殺虫性ＩＣＫ ＴＰのファミリーを意味する。そのようなクモの１つは、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａという学名を有するオーストラリアブルーマウンテンジョウゴグモとして知られている。この種に由来するＡＣＴＸペプチドの３つの例は、オメガペプチド、カッパペプチド、及びＵペプチドである。

「アグロインフェクション」とは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属のＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓまたはＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを使用することによってＤＮＡを植物細胞に導入する植物形質転換法を意味する。

「ＢＡＡＳ」とは、オオムギアルファアミラーゼシグナルペプチドを意味する。これはＥＲＳＰの一例である。

「二元ベクター」または「二元発現ベクター」とは、Ｅ．ｃｏｌｉ株及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株の両方で自己複製することができる発現ベクターを意味する。またこのベクターは、病原性遺伝子によって認識されてコピーされ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによって植物細胞内に送達される、左及び右の境界配列に挟まれたＤＮＡの領域（ｔ−ＤＮＡと呼ばれることが多い）を含有する。

「Ｂｔ」、別称Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓまたはＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓは、農業、林業、及び公衆衛生における昆虫有害生物を制御するために６０年超にわたって世界中で使用されてきたグラム陽性土壌細菌を意味する。

「Ｂｔタンパク質」及び「Ｂｔペプチド」は交換可能に使用され、Ｂｔにより産生されるペプチドを含み、本明細書ではこれらを集合的に「Ｂｔ毒性タンパク質」または「Ｂｔ ＴＰ」と呼ぶ。このようなペプチドは、ｃｒｙ、ｃｙｔ、及びｖｉｐ遺伝子によってコードされる「ｃｒｙ」、「ｃｙｔ」、または「ＶＩＰ」タンパク質と書かれることが多い。Ｂｔ ＴＰは、より一般的には、ｃｒｙ遺伝子によってコードされる殺虫性結晶タンパク質に起因する。Ｂｔ ＴＰは、ＰＦＩＰＳ（ポア形成殺虫性タンパク質）の例である。下記の定義を参照のこと。ＰＦＩＰＳ及び他のＢｔタンパク質の例は配列表に提示する。

「キメラ遺伝子」とは、新たな遺伝子を生成するように１つ以上のコーディング配列の部分に由来する遺伝子をコードするＤＮＡ配列を意味する。

「切断可能リンカー」についてはリンカーを参照のこと。

「馴化培地」とは、細胞により使用された細胞培養培地で、細胞由来物質が濃縮されているが細胞は含有しないものを意味する。

「変換」または「変換される」とは、ＨＰペプチドを作製するプロセスを指す。

「ＣＲＩＰ」及び「ＣＲＩＰＳ」はそれぞれ、システインリッチ殺虫性タンパク質の単数形及び複数形の略語である。システインリッチ殺虫性ペプチド（ＣＲＩＰＳ）は、ジスルフィド結合を形成するシステインに富んだペプチドである。ＣＲＩＰＳは、少なくとも１０個のアミノ酸を有するタンパク質またはペプチドの中で、少なくとも４個、場合によっては６個、場合によっては８個のシステインアミノ酸を含有し、これらのシステインは、２つ、３つ、または４つのジスルフィド結合を形成する。ジスルフィド結合は、殺虫性ペプチドのフォールディング、三次元構造、及び活性に寄与する。システイン間ジスルフィド結合及びそれらが形成する三次元構造は、これらの殺虫性ペプチドの毒性において重要な役割を果たす。ＣＲＩＰの例には、阻害性システインノット毒性タンパク質すなわちＩＣＫ ＴＰ（通常は６〜８つのシステインを有するもの）があり、また例として、ジスルフィド結合を有するがＩＣＫ ＴＰとはみなされない毒性ペプチド（非ＩＣＫ ＣＲＩＰＳ）がある。ＩＣＫの例には、クモ由来で上記に定義したＡＣＴＸペプチドがある。ＩＣＫタンパク質の代表例としては、Ｕ−ＡＣＴＸ殺虫性ペプチド、オメガＡＣＴＸ殺虫性ペプチド、及びカッパＡＣＴＸ殺虫性ペプチドが挙げられる。非ＩＣＫ ＣＲＩＰの例には、イソギンチャクから最初に特定された毒性ペプチドであるＡｖ２及びＡｖ３のようなペプチドがある。これらのペプチドは、昆虫の末梢神経系（ＰＮＳ）におけるナトリウムチャネルを調整する化合物のクラスの例である。非ＩＣＫ ＣＲＩＰＳは、２〜４つのジスルフィド結合を形成する４〜８つのシステインを有し得る。これらのシステイン間ジスルフィド結合によって安定化された毒性ペプチド（ＣＲＩＰＳ）は、環境に曝露されたときに著しい安定性を有し得る。多くのＣＲＩＰＳは、クモ、サソリ、ヘビ、海産巻貝、及びイソギンチャクなどの有毒動物から単離され、これらは昆虫に対して毒性がある。更なる説明を以下に提示する。

「限定培地」とは、既知の化学成分からなるが、粗タンパク質抽出物または酵母抽出物もしくはペプトンなどの副産物を含有しない培地を意味する。

「ジスルフィド結合」とは、側鎖にある２つのチオール基のカップリングによって得られる２つのシステインアミノ酸間の共有結合を意味する。

「二重導入遺伝子ペプチド発現ベクター」または「二重導入遺伝子発現ベクター」とは、殺虫性ペプチド発現カセットの２つのコピーを含有する酵母発現ベクターを意味する。

「ＥＬＩＳＡ」または「ｉＥＬＩＳＡ」とは、次のように試料をプレートの表面に固定してから検出する分子生物学プロトコールを意味する：一次抗体の後に、酵素にコンジュゲートした二次抗体を適用する。この酵素は、無色の基質を、検出及び試料間の数量化が可能な発色基質に変換する。このプロトコールにおいて、エピトープに結合するものだけが残って検出されるように抗体を洗い流す。手元に残った試料が植物から単離されたタンパク質であり、ＥＬＩＳＡにより、発現したトランスジェニックタンパク質の回収量の数量化が可能になる。

「発現ＯＲＦ」とは、タンパク質複合体をコードするヌクレオチドを意味し、ＯＲＦ内のヌクレオチドと定義される。

「ＥＲ」または「小胞体」とは、全ての真核生物に共通する細胞内小器官であり、ここで一部の翻訳後修飾プロセスが起こる。

「ＥＲＳＰ」または「小胞体シグナルペプチド」とは、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子のタンパク質翻訳中に、宿主細胞シグナル認識粒子によって認識され結合されるアミノ酸のＮ末端配列であり、タンパク質翻訳リボソーム／ｍＲＮＡ複合体を細胞質内のＥＲに移動させる。その結果、ＥＲとドッキングするまでタンパク質翻訳が中断され、ＥＲにおいてタンパク質翻訳が継続し、結果として得られるタンパク質がＥＲに注入される。

「ｅｒｓｐ」とは、ペプチドのＥＲＳＰをコードするヌクレオチドを意味する。

「ＥＲ輸送」とは、翻訳後修飾、ソーティング、及び輸送のための、細胞で発現したタンパク質のＥＲへの輸送を意味する。

「ＦＥＣＴ」とは、コートタンパク質遺伝子及びトリプル遺伝子ブロックの除去を伴うＦｏｘｔａｉｌモザイクウイルスを使用した一過性の植物発現系を意味する。

「ＧＦＰ」は、クラゲのＡｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａに由来する緑色蛍光タンパク質を意味する。これは翻訳安定化タンパク質の一例である。

「高産生量ペプチド」または「ＨＰペプチド」とは、本明細書に記述される手順に従って作製可能な、または「変換される」ペプチドで、変換され次第、増加した収量で、または高い産生率で、または通常よりも多い量で、生物系において産生され得るものを意味する。高い産生率は、変換前のペプチドを産生するために使用されたものと同じまたは同様の産生方法を使用して、変換前のペプチドで達成され得るものよりも、２０〜４００％高い場合がある。

核酸との関連で使用される場合の「相同性」は、相補性の程度を指す。部分的な相同性がある場合もあれば、完全な相同性（すなわち同一性）がある場合もある。「配列同一性」とは、２つ以上の核酸またはタンパク質同士の間の関連性の尺度を指し、比較する長さ全体を基準にした百分率として示される。同一性の計算は、それぞれのより大きな配列において同一であり、同じ相対位置におけるヌクレオチドまたはアミノ酸残基を考慮する。同一性の計算は、「ＧＡＰ」（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）及び「ＡＬＩＧＮ」（ＤＮＡＳｔａｒ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）などのコンピュータプログラムに含まれるアルゴリズムによって行うことができる。部分的に相補的な配列とは、完全に相補的な配列が標的核酸とハイブリダイズすることを少なくとも部分的に阻害する（またはそれと競合する）ものであり、「実質的に相同な」という機能的用語を使用して参照される。完全に相補的な配列の標的配列とのハイブリダイゼーションの阻害は、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロットまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど）を使用して検査することができる。実質的に相同な配列またはプローブは、低ストリンジェンシー条件下で標的と完全に相同な配列の結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）について競合し、これを阻害する。低ストリンジェンシー条件は、非特異的な結合が許容されるようなものであるというわけではない。低ストリンジェンシー条件は、２つの配列の互いに対する結合が特異的（すなわち、選択的）相互作用であることを必要とする。非特異的結合の非存在は、部分的な程度の相補性（例えば、約３０％未満の同一性）さえも欠いている第２の標的の使用によって試験され得る。非特異的結合の非存在下では、プローブは、第２の非相補的標的とハイブリダイズしない。

好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づき、規定の「ストリンジェンシー」をもたらす。「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的な核酸の対合を指す。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性度、用いられる条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのＴｍ、及び核酸内のＧ：Ｃ比などの要因による影響を受ける。相補的な核酸の対をその構造に含む単一分子は、「自己ハイブリダイズしている」と言われる。

「Ｔｍ」という用語は、核酸の「融解温度」を指す。融解温度は、二本鎖核酸分子の集団が半分に解離して一本鎖になる温度である。核酸のＴｍを計算するための方程式は、当技術分野において周知である。標準的な参考文献に示されているように、核酸が１Ｍ ＮａＣｌ水溶液中にある場合、Ｔｍ値の簡易推定値は、次式：Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）によって計算され得る。「ストリンジェンシー」という用語は、核酸ハイブリダイゼーションが行われる温度、イオン強度、及び有機溶媒などの他の化合物の存在といった条件を指す。「高ストリンジェンシー」条件では、核酸塩基の対合は、高頻度の相補的塩基配列を有する核酸断片間でしか起こらない。よって、遺伝的に多様な生物に由来する核酸では、相補的配列の頻度が通常低いため、「低」ストリンジェンシー条件が必要とされることが多い。

核酸ハイブリダイゼーションに関して使用される「低ストリンジェンシー条件」は、長さ約５００ヌクレオチドのプローブを用いた場合、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏ、及び１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整したもの）、０．１％のＳＤＳ、５×デンハルト試薬［５０×デンハルト液は、５００ｍｌ当たり５ｇのＦｉｃｏｌｌ（Ｔｙｐｅ ４００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、５ｇのＢＳＡ（Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ；Ｓｉｇｍａ）を含有する］、及び１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡからなる４２℃の溶液中での結合またはハイブリダイゼーションに続いて、５×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを含む４２℃の溶液中での洗浄に相当する条件を含む。

核酸ハイブリダイゼーションに関して使用される「中ストリンジェンシー条件」は、長さ約５００ヌクレオチドのプローブを用いた場合、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏ、及び１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整したもの）、０．５％のＳＤＳ、５×デンハルト試薬、及び１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡからなる４２℃の溶液中での結合またはハイブリダイゼーションに続いて、１０×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む４２℃の溶液中での洗浄に相当する条件を含む。

核酸ハイブリダイゼーションに関して使用される「高ストリンジェンシー条件」は、長さ約５００ヌクレオチドのプローブを用いた場合、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏ、及び１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整したもの）、０．５％のＳＤＳ、５×デンハルト試薬、及び１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡからなる４２℃の溶液中での結合またはハイブリダイゼーションに続いて、０．１×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む４２℃の溶液中での洗浄に相当する条件を含む。

低ストリンジェンシー条件を構成するために多数の等価条件が用いられ得ることは周知である。プローブの長さ及び性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）、ならびに標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成、溶存しているか固定化されているかなど）、ならびに塩及び他の成分の濃度（例えば、ホルムアミド、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコールの存在または非存在）などの要因が考慮され、ハイブリダイゼーション溶液を変更することで、上文に列記した条件とは異なるが等価である低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件を作り出すことができる。加えて、当技術分野では、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションを促進する条件（例えば、ハイブリダイゼーション及び／または洗浄ステップの温度上昇、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの使用など）が知られている。

「ハイブリッドペプチド」、別称「ハイブリッド」、別称「ハイブリッド毒素」、別称「ハイブリッドＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」、別称「天然ハイブリッドＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」、ならびに「Ｕペプチド」、別称「Ｕ毒素」、別称「天然Ｕ」、別称「Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」、別称「天然Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」は全て、オーストラリアブルーマウンテンジョウゴグモＨａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａとして知られるクモから発見されたＡＣＴＸペプチドを指し、昆虫の電位開口型Ｃａ２＋チャネル及び電位開口型Ｋ＋チャネルに対する二重アンタゴニストである。

「ＩＧＥＲ」とは、一文字コードの実際の配列に基づく短いペプチドの名称を意味する。これは、昆虫においてしか切断されないペプチドの一例である。

「ＩＣＫモチーフ」、「ＩＣＫモチーフタンパク質」、「ＩＣＫポリペプチド」、「ＩＣＫタンパク質」、「インヒビターシスチンノットモチーフ」、「毒性昆虫ＩＣＫ ＴＰ」、「ＩＣＫモチーフＴＰ」、「ＣＫペプチド」、「シスチンノットモチーフ」、または「シスチンノットペプチド」（全て本明細書では交換可能に使用される）は、３つのジスルフィド架橋を有する少なくとも６個のハーフシスチンコアアミノ酸を含む１６〜６０アミノ酸ペプチドを意味し、この３つのジスルフィド架橋は共有結合であり、６個のハーフシスチン残基のうち共有結合性のジスルフィド結合は、Ｎ末端側アミノ酸から始めて６個のコアのハーフシスチンアミノ酸のうち、第１と第４、第２と第５、及び第３と第６のハーフシスチン同士の間にある。一般的に、このタイプのペプチドは、モチーフの第４と第６のコアハーフシスチン間に位置する残基から通常はなるベータヘアピン二次構造を含み、このヘアピンは、モチーフの３つのジスルフィド結合によってもたらされる構造の架橋によって安定化されている。更なるシステイン／シスチンまたはハーフシスチンアミノ酸がインヒビターシスチンノットモチーフ内に存在してもよいことに留意されたい。配列表に例を提示する。ＩＣＫタンパク質の代表例としては、Ｕ−ＡＣＴＸ殺虫性ペプチド、オメガＡＣＴＸ殺虫性ペプチド、及びカッパＡＣＴＸ殺虫性ペプチドが挙げられる。

「ｉｃｋ」とは、ＩＣＫモチーフタンパク質をコードするヌクレオチドを意味する。

「ＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦ」または「発現ＯＲＦ」とは、ＩＣＫモチーフタンパク質複合体をコードするヌクレオチドを意味し、ＯＲＦ内のヌクレオチドと定義される。

「ＩＣＫモチーフタンパク質発現ベクター」または「ＩＣＫ発現ベクター」、または「ＩＣＫモチーフ発現ベクター」とは、発現ＯＲＦを含有する二元ベクターを意味する。二元ベクターはまた、ＯＲＦ及びそれがコードするタンパク質の発現を促進するため、必要な転写プロモーター及びターミネーター配列を発現ＯＲＦの周囲に含有する。

「昆虫」には、「昆虫綱」のクラスにおける全ての生物が含まれる。「前成体期」の昆虫という用語は、例えば卵、幼虫、及び若虫を含む、成体期前の任意の形態の生物を指す。

「昆虫の腸内環境」または「腸内環境」とは、昆虫または昆虫の幼虫の前腸、中腸、もしくは後腸において見出される特定のｐＨ及びプロテアーゼ条件を意味する。

「昆虫の血リンパ環境」とは、昆虫または昆虫の幼虫において見出される特定のｐＨ及びプロテアーゼ条件を意味する。

本明細書で使用される「殺虫性」という用語は、概して、本明細書で使用されるポリペプチドまたはタンパク質がもつ、昆虫の死亡率を増加させる、または成長速度を抑制する能力を指すために使用される。本明細書で使用される「殺線虫性」という用語は、本明細書で使用されるポリペプチドまたはタンパク質がもつ、線虫の死亡率を増加させる、または成長速度を抑制する能力を指す。一般的に、「線虫」という用語は、該生物の卵、幼虫、幼若型及び成熟型を含む。

「殺虫活性」とは、昆虫が化合物またはペプチドに曝露された時点またはその後に、昆虫が死亡すること、その動きもしくはその採餌が停止もしくは減速すること、その成長が停止もしくは減速すること、蛹化できないこと、繁殖できないこと、または繁殖力のある子孫を産めないことのいずれかを意味する。

「殺虫性ペプチド」もしくは「殺虫性タンパク質」または「毒性ポリペプチド」もしくは「毒性タンパク質」（本明細書では交換可能に使用される）とは、昆虫に摂取されたとき、昆虫と接触したとき、または昆虫に注入されたときに殺虫活性を有するタンパク質またはポリペプチドを意味する。

「殺虫性ペプチド産生株スクリーニング」とは、収量の高い殺虫性ペプチド産生酵母株を収量の低い株から特定するスクリーニングプロセスを意味する。本明細書に記述される方法では、逆相ＨＰＬＣまたはイエバエ注入バイオアッセイを使用するスクリーニングを指す。

「組込み発現ベクター」または「組込みベクター」とは、酵母細胞ゲノムの特定の遺伝子座に自らを挿入することができ、安定に酵母ゲノムの一部になる酵母発現ベクターを意味する。

「公知のペプチド」とは、生物活性を有することが知られているペプチドを意味し、成熟ペプチド、またはプレペプチド及びプロペプチドを含むその任意のバージョンもしくは断片、ならびに活性ペプチドのコンジュゲートであり得る。好ましい公知のペプチドは、殺虫活性をもつものである。

適切な文脈における「Ｌ」とは、切断可能な介在する二元ペプチドまたは三元ペプチドを意味する。アミノ酸を参照しているとき、「Ｌ」はロイシンを意味する場合もある。

「リンカー、切断可能リンカー、またはペプチドリンカー」とは、少なくとも２タイプのプロテアーゼの標的部位である短いペプチド配列（二元ペプチドまたは三元ペプチド）（２タイプのプロテアーゼのうちの一方は昆虫及び／または線虫プロテアーゼであり、もう一方はヒトプロテアーゼであるため、タンパク質を切断して２つの部分に分離させることができる両タイプのプロテアーゼによってリンカーが分離され得る）か、または、ＯＲＦのリーディングフレーム内に配置され、タンパク質を切断して２つの部分に分離させることができる昆虫及び／または線虫プロテアーゼならびに動物（例えばヒト）プロテアーゼの標的部位であるタンパク質内の短いペプチド配列をコードする短いＤＮＡ配列を意味する。

「Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａの腸内環境」とは、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａの昆虫または幼虫の前腸、中腸、もしくは後腸において見出される特定のｐＨ及びプロテアーゼ条件を意味する。

「Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａの血リンパ環境」とは、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａの昆虫または幼虫において見出される特定のｐＨ及びプロテアーゼ条件を意味する。

「複合ＩＣＫモチーフタンパク質ドメイン」とは、複数の介在するリンカーペプチドによって連結されている複数のＩＣＫモチーフＴＰからなるタンパク質を意味する。複合ＩＣＫモチーフＴＰドメイン内のＩＣＫモチーフＴＰは同じであっても異なっていてもよく、このドメイン内の介在するリンカーペプチドもまた同じであっても異なっていてもよい。

「殺線虫性ペプチド」または「殺線虫性タンパク質」とは、線虫に摂取されたとき、線虫と接触したとき、または線虫に注入されたときに殺線虫活性を有するペプチドまたはタンパク質を意味し、毒性ペプチド及び毒性タンパク質の例として使用される。

「殺線虫剤」及び「殺線虫性」とは、殺線虫性ペプチドまたは殺線虫性タンパク質がもつ、線虫の死亡率を増加させる、または成長速度を抑制する能力を指す。一般的に、「線虫」という用語は、該生物の卵、幼虫、幼若型及び成熟型を含む。

「非ＩＣＫ ＣＲＩＰＳ」は、２〜４つのジスルフィド結合を形成する４〜８つのシステインを有し得る。非ＩＣＫ ＴＰは、ＩＣＫ ＴＰではないシスチンノットペプチドを含む。非ＩＣＫ ＴＰは、ＩＣＫとは異なるシスチン結合の結合順序を有し得る。非ＩＣＫ ＣＲＩＰの例は、イソギンチャクから最初に特定されたペプチドであるＡｖ２及びＡｖ３のようなペプチドである。これらのアネモネペプチドは、昆虫の末梢神経系（ＰＮＳ）におけるナトリウムチャネルを調整する化合物のクラスの例である。

「非極性アミノ酸」は、弱疎水性のアミノ酸であり、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、及びメチオニンを含む。グリシンまたはｇｌｙは、本発明のジペプチドに対して最も好ましい非極性アミノ酸である。

「正規化されたペプチド収量」とは、馴化培地中のペプチド収量をペプチド収量測定時の対応する細胞密度で除したものを意味する。このペプチド収量は、例えばｍｇ毎リットルすなわちｍｇ／Ｌの体積単位における産生されたペプチドの質量によって、または、ＨＰＬＣクロマトグラフにおける産生されたペプチドのＵＶ吸光度ピーク面積、例えばｍＡｕ．ｓｅｃによって表すことができる。細胞密度は、６００ｎｍの波長における培養物の可視光吸光度（ＯＤ６００）によって表すことができる。

「一文字コード」とは、タンパク質の一次構造における種々のアミノ酸を区別するために一文字コードで列記されるペプチド配列を意味する。アラニン＝Ａ、アルギニン＝Ｒ、アスパラギン＝Ｎ、アスパラギン酸＝Ｄ、アスパラギンまたはアスパラギン酸＝Ｂ、システイン＝Ｃ、グルタミン酸＝Ｅ、グルタミン＝Ｑ、グルタミンまたはグルタミン酸＝Ｚ、グリシン＝Ｇ、ヒスチジン＝Ｈ、イソロイシン＝Ｉ、ロイシン＝Ｌ、リジン＝Ｋ、メチオニン＝Ｍ、フェニルアラニン＝Ｆ、プロリン＝Ｐ、セリン＝Ｓ、スレオニン＝Ｔ、トリプトファン＝Ｗ、チロシン＝Ｙ、バリン＝Ｖ。

「オメガペプチド」は、本明細書では別称「オメガ毒素」ともいい、これには「オメガＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」、別称「天然オメガＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」の例が含まれ、これらは全て、オーストラリアブルーマウンテンジョウゴグモＨａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａとして知られるクモから最初に単離され、昆虫の電位開口型Ｃａ２＋チャネルに対するアンタゴニストであるＡＣＴＸペプチドのクラスを指す。

「ＯＲＦ」または「オープンリーディングフレーム」または「ペプチド発現ＯＲＦ」とは、ＡＴＧ開始コドンで始まり、ＴＧＡ、ＴＡＡ、またはＴＡＧ終止コドンで終わるタンパク質をコードするＤＮＡ配列を意味する。ＯＲＦは、ＤＮＡがコードする翻訳タンパク質を意味する場合もある。

「作動可能に連結した」とは、２つの隣接するＤＮＡ配列が、一方の転写活性化が他方に作用し得るように一緒に配置されていることを意味する。

「ＰＥＰ」とは、植物発現ペプチドを意味する。

「ペプチド発現カセット」、または「発現カセット」とは、生物発現系における殺虫性ペプチドの転写を完了するために必要な全てのＤＮＡエレメントからなるＤＮＡ配列を意味する。本明細書に記述される方法では、これには、転写プロモーター、α接合因子シグナル配列及びＫｅｘ２切断部位をコードするＤＮＡ配列、殺虫性ペプチド導入遺伝子、終止コドン、ならびに転写ターミネーターが含まれる。

「ペプチド発現ベクター」とは、異種の殺虫性ペプチド導入遺伝子を含有する宿主生物発現ベクターを意味する。

「ペプチド発現酵母株」、「ペプチド発現株」、または「ペプチド産生株」とは、異種殺虫性ペプチドを産生することができる酵母株を意味する。

「ペプチドを特別にする」とは、以前は生物発現系からのペプチド収量が低かったペプチドが、その収量を増加させるために本明細書に記述される方法を使用することによってＨＰペプチドになることを意味する。

「ペプチドリンカー」についてはリンカーを参照のこと。

「ペプチド導入遺伝子」または「殺虫性ペプチド導入遺伝子」とは、殺虫性ペプチドをコードし、生物発現系において翻訳され得るＤＮＡ配列を意味する。

「ペプチド収量」とは、ペプチド発現酵母株の細胞によって産生される馴化培地中の殺虫性ペプチドの濃度を意味する。これは、例えばｍｇ毎リットルすなわちｍｇ／Ｌの体積単位における産生されたペプチドの質量によって、または、ＨＰＬＣクロマトグラフにおける産生されたペプチドのＵＶ吸光度ピーク面積、例えばｍＡｕ．ｓｅｃによって表すことができる。

「囲食膜」とは、大きな食物粒子を捕捉し、腸を通過する食物粒子の動きを助け、消化しつつ腸壁を保護することもできる、昆虫の腸内の内膜を意味する。

「有害生物」としては、昆虫、真菌、細菌、線虫、ダニ、マダニなどが挙げられるが、これらに限定されない。

「ＰＦＩＰ」とは、昆虫の腸を覆う細胞、例えば腸上皮細胞において、ポアまたはチャネルを形成することができるタンパク質を意味する。ＰＦＩＰＳの例は、ｃｒｙ、ｃｒｔ、及びＶＩＰなどのＢｔ毒性ペプチド（Ｂｔ ＴＰ）であり、他のＰＦＩＰの例は、配列表で確認することができる。

「植物再生培地」とは、植物の生育に必要な要素及びビタミンや、発芽して組織培養から得られる小植物を発生させることができる胚への細胞の再生を促進するために必要な植物ホルモンを含有する、任意の培地を意味する。多くの場合、この培地は選択可能因子を含有し、これに対してトランスジェニック細胞は、この因子に対する抵抗性をもたらす選択遺伝子を発現する。

「植物トランスジェニックタンパク質」とは、それをコードするＤＮＡまたはＲＮＡが植物細胞のうちの１つ以上に送達された後に植物で発現する異種の種に由来するタンパク質を意味する。

「極性アミノ酸」とは極性のアミノ酸であり、セリン、スレオニン、シスチン、システイン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、トリプトファン、及びチロシンを含む。好ましい極性アミノ酸は、セリン、スレオニン、シスチン、システイン、アスパラギン、及びグルタミンであり、セリンが最も好ましい。

「転写後遺伝子サイレンシング」、または「ＰＴＧＳ」とは、遺伝子の発現を抑制する生細胞内の細胞プロセスを意味する。

「タンパク質」は、本文書では「ペプチド」と同じ意味を有する。

「組換えベクター」とは、外来ＤＮＡが挿入されているＤＮＡプラスミドベクターを意味する。

「選択遺伝子」とは、ゲノムが修飾された生物に選択圧下で成長する利点を与える遺伝子を意味する。

「スペーサー」（単数または複数）は、本明細書に開示されるように、二元ペプチドのＮ末端に、または二元ペプチドのＣ末端に、または二元ペプチドのＮ末端及びＣ末端の両方のいずれかにインフレームで融合している１〜４個のアミノ酸を含むペプチドで、したがって三元ペプチドを形成するものを意味する。三元ペプチドは、二元ペプチドと似ているが、任意の１〜４個のアミノ酸、より多くの場合では２〜４個のアミノ酸、時に１個、時に２個、時に３個、時に４個のアミノ酸を含む、スペーサーと呼ばれ、また時には「Ｚ」領域とも呼ばれる更なる領域を有するという点のみが二元ペプチドとは異なる。一部の特定の実施形態では、スペーサーは、「＋２」または「プラス２」と呼ばれる場合があり、これは、ペプチドのうち、本明細書に記述されるいずれかの２アミノ酸ペプチド、例えば「ＧＳ」などを含むジペプチドである部分を基準としている。一部の実施形態では、本発明のいわゆる三元ペプチドは３つの領域を有し、それらは、Ｘ領域及びＹ領域、ならびに「スペーサー」または「Ｚ」領域と呼ばれる第３の領域である。一部の実施形態では、Ｘ及びＹの各々は、２〜４アミノ酸長であってよく、Ｚは、各Ｚで更に１〜４アミノ酸長であってよく、１つのＺが二元ペプチドの前にあり、かつ１つのＺが二元ペプチドの後にある場合、１つまたは２つのＺ領域が可能であるため、１６アミノ酸長のリンカーが可能である。

「ＳＴＡ」または「翻訳安定化タンパク質」、または「安定化ドメイン」、または「安定化タンパク質」（本明細書では交換可能に使用される）とは、タンパク質分解の細胞プロセスによる標的となることなく細胞内で蓄積し得る十分な三次構造を有するタンパク質を意味する。このタンパク質は、５〜５０アミノ酸（ａａ）であり得る。本明細書の例示的な実施形態を通して使用される一部の実施形態では、ＳＴＡは、ＩＣＫモチーフタンパク質、５０〜２５０ａａ（ＧＮＡ）、２５０〜７５０ａａ（例えばキチナーゼ）、及び７５０〜１５００ａａ（例えばエンハンシン）を含み得る。翻訳安定化タンパク質は、ＯＲＦ内の殺虫性タンパク質をコードする配列にインフレームで融合しているタンパク質のＤＮＡ配列によってコードされる。この融合タンパク質は、毒性タンパク質の上流にあっても下流にあってもよく、介在配列がいずれかのＤＮＡ配列のフレームシフトをもたらさない限り、２つの配列間に任意の介在配列を有し得る。翻訳安定化タンパク質は、昆虫の腸壁を超えて血リンパ中に送達されるＩＣＫモチーフＴＰを増加させる活性を有する場合もある。そのような送達は、腸壁を超えるようにＯＲＦ全体を能動的に輸送すること、あるいは、腸内環境内の切断によりＩＣＫモチーフＴＰを分離させつつ、翻訳安定化タンパク質に囲食膜及び／または腸壁を損傷させ、ＩＣＫモチーフＴＰの血リンパ中への拡散を増加させることによって達成することができる。

「ｓｔａ」とは、翻訳安定化タンパク質をコードするヌクレオチドを意味する。

「ＴＭＯＦ」、「ＴＭＯＦモチーフ」、または「ＴＭＯＦ ＴＰ」とは、「トリプシン調節性卵形成阻害因子」タンパク質配列を意味する。配列表に例を提示する。本明細書では多数の例及び変異形を提示する。配列番号７０８は、野生型ＴＭＯＦ配列である。配列番号７０９〜７２１には他の非限定的な変異形が提示されている。他の例は当業者には公知であるか、または当業者によって作出され得る。

「毒性ペプチド」または「毒性タンパク質」または「ＴＰ」（全て交換可能に使用される）は、それぞれ昆虫もしくは線虫に摂取されたとき、それらと接触したとき、またはそれらに注入されたときに殺虫活性及び／または殺線虫活性を有するペプチドまたはタンパク質を意味する。本発明のＴＰには、修飾されたＴＰ、変異体ＴＰ、または誘導体ＴＰも含まれる。一部の実施形態では、変異体または変異形ＴＰには、保存的アミノ酸置換が組み合わさったとき、変異型ＴＰの殺虫活性及び／または殺線虫活性が、その非変異型ＴＰと比べて実質的に減少しない、すなわち、非変異型ＴＰの殺虫活性及び／または殺線虫活性の少なくとも９０％、または少なくとも８０％、または少なくとも７０％、または少なくとも６０％、または少なくとも５０％、または少なくとも４０％、または少なくとも３０％の殺虫活性及び／または殺線虫活性が保持される、１つ以上の保存的アミノ酸置換を有し得るＴＰが包含される。ＴＰには、変異型ＴＰをコードするポリヌクレオチドが転写及び／または翻訳されたとき、発現した変異型ＴＰペプチドまたはタンパク質が、対応する非変異型ＴＰポリヌクレオチドによってコードされるペプチドまたはタンパク質の殺虫活性及び／または殺線虫活性の少なくとも９０％、または少なくとも８０％、または少なくとも７０％、または少なくとも６０％、または少なくとも５０％、または少なくとも４０％、または少なくとも３０％である殺虫活性及び／または殺線虫活性を保持するような、１つ以上の点変異、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上の点変異を有するポリヌクレオチドによってコードされるペプチド及びタンパク質も含まれ得る。本発明のＴＰには、配列番号５〜１５９３及び１７６１〜１７７５及び１７６１〜１７７５に開示される任意のＴＰと少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、更に、配列番号５〜１５９３及び１７６１〜１７７５に示される対応するＴＰの殺虫活性及び／または殺線虫活性の少なくとも９０％、または少なくとも８０％、または少なくとも７０％、または少なくとも６０％、または少なくとも５０％、または少なくとも４０％、または少なくとも３０％を保持する、ＴＰペプチド及びタンパク質も含まれ得る。本発明のＴＰには、配列番号５〜１５９３及び１７６１〜１７７５に示されるアミノ酸配列を有する任意のＴＰのＮ末端またはＣ末端または両末端に１〜６個のアミノ酸伸長がインフレームで融合したＴＰペプチド及びタンパク質も含まれ得る。

「ＴＳＰ」または「全可溶性タンパク質」とは、植物組織試料から抽出され、抽出バッファー中に可溶化され得るタンパク質の総量を意味する。

「導入遺伝子」とは、植物に形質転換されるタンパク質をコードする異種ＤＮＡ配列を意味する。

「トランスジェニック宿主細胞」とは、遺伝子によって形質転換される細胞で、そのトランスジェニック状態について更なる選択遺伝子によって選択された細胞を意味する。

「トランスジェニック植物」とは、外来ＤＮＡにより、植物中の全ての細胞がその導入遺伝子を含有するように形質転換された、単一の細胞に由来する植物を意味する。

「一過性発現系」とは、武装解除した（ｄｉｓａｒｍｅｄ）植物ウイルスをコードするＤＮＡを植物細胞中に送達して発現させるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓベースの系を意味する。この植物ウイルスは、最高でＴＳＰの４０％という高濃度で目的のタンパク質を発現させるように工学操作されたものである。技術的試験において使用されている一過性発現系にはＴＲＢＯ系及びＦＥＣＴ系の２つがあり、植物細胞はタバコ植物「Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ」の葉組織である。

「ＴＲＢＯ」とは、ウイルスコートタンパク質遺伝子の除去を伴うタバコモザイクウイルスを使用した一過性の植物発現系を意味する。

「トリプシン切断」とは、プロテアーゼ酵素トリプシン（曝露されたリジン及びアルギニンのアミノ酸残基を認識する）を使用して切断可能リンカーをその切断部位で分離させるインビトロアッセイを意味する。また、トリプシン酵素がその部位を切断する作用も意味する。

「Ｕ−ＡＣＴＸペプチド」、または「Ｕタンパク質」、または「Ｕ毒素」は、「天然Ｕ」、または「Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」、または「天然Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」の例を含む場合があり、これには代表例の「ハイブリッドペプチド」、別称「ハイブリッド毒素」、別称「ハイブリッドＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」、別称「天然ハイブリッドＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」が含まれ、これらは全て、天然に見出され得るか、さもなければＵ−ＡＣＴＸペプチドの例として知られる天然タンパク質または天然毒素を指し、これは、「Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」、別称「天然Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」の場合は、オーストラリアのブルーマウンテンに起源をもつクモから最初に発見された天然のクモ毒であり、昆虫の電位開口型Ｃａ２＋チャネル及びＫ＋チャネルに対する二重アンタゴニストである。この毒素が発見されたクモは、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａという学名を有するオーストラリアブルーマウンテンジョウゴグモとして知られている。

「Ｕ＋２ペプチド」、「Ｕ＋２タンパク質」、「Ｕ＋２毒素」、または「Ｕ＋２」、または「Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」は全て、天然ペプチドに更なるジペプチドが動作可能に連結しているいずれかの毒素を指し、Ｕペプチド及び上述の他の名称で呼ばれることがあるクモ毒を指す場合がある。Ｕペプチドに動作可能に連結し、よって「＋２」または「プラス２」と示される更なるジペプチドは、いくつかのペプチドの中から選択することができ、これらのうちのいずれも、本明細書において詳解される独特の特性をもつ「Ｕ＋２ペプチド」をもたらし得る。これらは時に「高産生量ペプチド」と呼ばれることもある。「Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」という用語が使用されるときは、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａという学名を有するオーストラリアブルーマウンテンジョウゴグモに由来する天然に存在するペプチドを含む特定の高産生量毒性ペプチドを指す。

「ＶＩＰ」タンパク質は、植物性に増殖したＢｔ株の上清を殺虫活性の可能性についてスクリーニングすることから発見された。これらにはｃｒｙタンパク質との類似性がほとんどまたは全くなく、これらは植物性殺虫性タンパク質（Ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ）すなわちＶＩＰと名付けられた。特に有用であり、本文書での使用に好ましいのは、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａの活性を有するＶＩＰ３、Ｖｉｐ３タンパク質、またはＶｉｐ毒素と呼ばれているものである。これらは、Ｂｔ ｃｒｙペプチドと同様の作用形態を有すると考えられている。本文書においてＶＩＰタンパク質はＰＦＩＰタイプのタンパク質と分類される。

「酵母発現ベクター」、または「発現ベクター」、または「ベクター」とは、異種遺伝子及び／または発現カセットを酵母細胞に導入して転写及び翻訳させることができるプラスミドを意味する。

「収量」とはペプチドの産生量を指し、収量の増加は、産生量の増加、産生速度の増加、ならびに収量の平均または中央値の増加及び収量上昇の頻度増加を意味し得る。

（１）．殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質の切断可能な連結基

本発明は、昆虫もしくは線虫の腸または血リンパ環境、及び動物の胃腸管系、例えばヒトの胃腸管系において切断されるように作動可能である二元ペプチド及び三元ペプチドを提示する。したがって本発明は、より大きな殺虫性または殺線虫性タンパク質の他の成分に連結したとき、ヒト、昆虫、及び線虫の腸内環境に見出されるある特定のプロテアーゼ及びペプチダーゼによって切断され得る、切断可能な二元ペプチド及び三元ペプチドを提示する。有利なことに、殺虫性及び殺線虫性ペプチドの複数のコピーが結合または連結していてよい。各コピーは１つ以上の二元ペプチドまたは三元ペプチドによって分離されており、摂取されると、あるいは腸内環境内で昆虫及び／または線虫のペプチダーゼまたはプロテアーゼに接触すると、二元ペプチドまたは三元ペプチドが切断され、連結した殺虫性及び殺線虫性ペプチドの活性型が放出される（例えば、図２、第２の態様を参照のこと）。これらの例示的な実施形態において、図２の第２の態様に示されているＮは、１〜２００、または例えば１〜１００、または好ましくは１〜１０の範囲の任意の整数、及びこれらの間の任意の整数であり得る。本発明の種々の実施形態では、二元ペプチド及び／または三元ペプチドを、１つまたは２００個ほど、及びその間の任意の数、例えば１〜１００、またはより好ましくは１〜１０個の毒性ペプチド（すなわち殺虫性及び／または殺線虫性ペプチド）に連結させることで、殺虫性及び／または殺線虫性トランスジェニックタンパク質を形成することができ、これが昆虫、線虫、またはヒトの胃腸内環境に曝露されると、二元ペプチド及び／または三元ペプチド内の特定の基質配列において切断し、それによって殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質ポリマー構造から複数の毒性ペプチドが遊離する。種々の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性トランスジェニックタンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、植物細胞を形質転換させることができる。一部の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性トランスジェニックタンパク質は、植物またはその一部の表面に散布または当業者に公知の任意の様式で別様に適用することができる組成物中に配合され得る。したがって本明細書では、宿主細胞、例えば植物細胞において、適切な条件下で１つ以上の殺虫性及び／または殺線虫性トランスジェニックタンパク質をコードするように作動可能なＤＮＡ構築物が提示される。寄生性昆虫または寄生性線虫による植物細胞の有害生物感染を制御するための方法は、本明細書に記述される殺虫性及び／または殺線虫性トランスジェニックタンパク質をコードするポリヌクレオチドを組換え技術によって植物、植物組織、または植物細胞に投与または導入することと、有害生物に曝露された圃場において組換え的に改変された該植物、植物組織、または植物細胞を成長させることとを含む。代替的に、殺虫性及び／または殺線虫性トランスジェニックタンパク質は、感染性の昆虫及び／または線虫によって殺虫性及び／または殺線虫性トランスジェニックタンパク質が摂取されると、感染性の昆虫及び／または線虫によって摂取された殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質から殺虫性及び殺線虫性ペプチドの１つ以上のコピーまたはモノマーが切断され、昆虫及び／または線虫を殺すその効果がもたらされるように、散布可能な組成物に配合し、直接適用によって感受性植物に直接適用してもよい。

（１Ａ）．切断可能な二元及び三元の連結ペプチド

種々の実施形態において、本発明は、動物、例えばヒト、昆虫、及び／または線虫の胃腸管系において見出される動物、昆虫、及び線虫のプロテアーゼまたはペプチダーゼの存在下で切断される、切断可能な二元及び三元の連結ペプチドを提示する。本明細書で使用される場合、胃腸管環境及び腸内環境という用語は交換可能に使用され、その一般的な意味、すなわち摂取された食品がタンパク分解性に分解される場所を含むよう意図される。ヒトモデルにおいてペプチド及びタンパク質を分解することができる胃腸管環境としては、口、胃、及び小腸を挙げることができる。

昆虫及び線虫の腸内環境に見出される利用可能なプロテアーゼ及びペプチダーゼは、空間的かつ時間的に発現することが多いため、これらの酵素の一部は、昆虫のライフステージに依存する。昆虫の消化器系は、消化管及び付随する腺からなる。食物は口に入り、消化性プロテアーゼ及びペプチダーゼを含有する場合もしない場合もある分泌物と混合される。前腸及び後腸は外胚葉性由来である。前腸は、概して生の食物の貯蔵所として機能する。前腸から、小さく分かれた食物が中腸（中腸部（ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｎ）または胃（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌｕｓ））に入る。中腸は、食物の栄養素が消化及び吸収される部位である。概して、ある特定のプロテアーゼ及びペプチダーゼが中腸に存在するかは、腸のｐＨによる。ヒト胃腸管系内のある特定のプロテアーゼ及びペプチダーゼには、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、及びジペプチダーゼが含まれ得る。昆虫及び線虫の腸内環境は、草食種の消化器系のうち、ペプチド及びタンパク質が消化中に分解される領域を含む。昆虫及び線虫の腸内環境に見出される利用可能なプロテアーゼ及びペプチダーゼの一部には、（１）セリンプロテアーゼ、（２）システインプロテアーゼ、（３）アスパラギン酸プロテアーゼ、及び（４）メタロプロテアーゼが含まれ得る。

植食性昆虫の消化器系における２つの主なプロテアーゼクラスは、セリンプロテアーゼ及びシステインプロテアーゼである。Ｍｕｒｄｏｃｋら（１９８７）は、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａに属する種々の有害生物の中腸酵素に関する入念な研究を行い、Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎら（２００８）は、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａに属する種々の有害生物の中腸酵素について報告した。Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａではセリンプロテアーゼが幼虫の腸内環境において支配的であり、全消化活性の約９５％に寄与することが知られているが、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ種は、システインプロテアーゼを含め、より幅広い支配的な腸内プロテアーゼを有する。パパインファミリーには、広い特異性を有するエンドペプチダーゼ（例えばパパイン）、非常に狭い特異性を有するエンドペプチダーゼ（例えばグリシルエンドペプチダーゼ）、アミノペプチダーゼ、ジペプチジル−ペプチダーゼ、ならびにエンドペプチダーゼ活性及びエキソペプチダーゼ活性の両方を有するペプチダーゼ（例えばカテプシンＢ及びＨ）を含め、幅広い活性を有するペプチダーゼが含まれる。種々の昆虫の中腸に見出される他の例示的なプロテイナーゼとしては、トリプシン様酵素、例えばトリプシン及びキモトリプシン、ペプシン、カルボキシペプチダーゼ−Ｂ、及びアミノトリペプチダーゼが挙げられる。

セリンプロテアーゼは、ほぼ全ての動物及び微生物に広く分布している（Ｊｏａｎｉｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２００６）。高等生物では、遺伝子の約２％がこれらの酵素をコードする（Ｂａｒｒｅｔｔｅ−Ｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３）。宿主生物の維持及び生存のために本質的に不可欠であるセリンプロテアーゼは、多くの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。セリンプロテアーゼのクラスは、それらの基質特異性によって、特に、Ｐ１の残基がトリプシン様であるか（Ｌｙｓ／ＡｒｇがＰ１に好ましい）、キモトリプシン様であるか（Ｐ１にＰｈｅ／Ｔｙｒ／Ｌｅｕなどの大きな疎水性残基）、またはエラスターゼ様であるか（Ｐ１にＡｌａ／Ｖａｌなどの小さな疎水性残基）によって分類される（Ｔｙｎｄａｌｌらにより改訂、２００５）。セリンプロテアーゼは、中心的触媒機構がアスパラギン酸、ヒスチジン、及び独特の反応性を示すセリンという３つの不変残基からなるタンパク質分解酵素のクラスである。このため、これらの残基は「触媒トライアド」と命名されている。Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒのトライアドは、少なくとも４つの異なる構造的環境において見出され得る（Ｈｅｄｓｔｒｏｍ，２００２）。セリンプロテアーゼのこれら４つのクランは、キモトリプシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼＹ、及びＣｌｐプロテアーゼに代表される。キモトリプシン様クランの中で極めて詳細に研究されてきた３つのセリンプロテアーゼは、キモトリプシン、トリプシン、及びエラスターゼである。より最近では、Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ、Ｓｅｒ−Ｌｙｓ／Ｈｉｓ、Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ、及びＮ末端側Ｓｅｒを含む、新規の触媒トライアド及びダイアドを有するセリンプロテアーゼが、消化におけるそれらの役割に関して発見されている。

主要なタイプのペプチダーゼは全て、線虫において説明されている。アスパラギン酸ペプチダーゼは主に、栄養素の消化に関する機能について説明されている。無脊椎動物において、これらはシステインペプチダーゼと併せて、脊椎動物におけるアスパラギン酸ペプチダーゼ及びセリンペプチダーゼと同じ役割を有すると考えられている。寄生性線虫では、システインペプチダーゼが、寄生性線虫においてペプチダーゼが関与する実質的に全ての機能をカバーする。したがって、カテプシンＢ及びＬは、パパインファミリーに属するシステインペプチダーゼのタイプであり、線虫において包括的に研究されてきた。異なる線虫種に由来するカテプシンＢ間では、最適な温度及びｐＨ、ならびに基質親和性に関する高い可変性が見出されている。それらの主な役割は栄養素を消化することであり、観察された種間の高い可変性は、線虫が占める環境適所に線虫が適合したことに起因すると考えられている。カテプシンＬもまた栄養素の消化に関与していると思われる。

昆虫及び線虫の腸内環境に見出される消化酵素でよく研究されている１つのクラスは、システインプロテアーゼのクラスである。「システインプロテアーゼ」という用語は、システイン残基がもつ反応性の高いチオール基を酵素の触媒部位に保有するプロテアーゼを表すことを意図する。多くの植食性昆虫及び植物寄生性線虫が、中腸システインプロテアーゼに少なくとも部分的に依存してタンパク質消化を行うという証拠がある。これらは、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ、特にヘリカメムシ（Ａｎａｓａ ｔｒｉｓｔｉｓ）；アオカメムシ（Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ ｈｉｌａｒｅ）；Ｒｉｐｔｏｒｔｕｓ ｃｌａｖａｔｕｓ；及び今日までに検査されているほぼ全てのＣｏｌｅｏｐｔｅｒａ、特に、コロラドハムシ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅａｅｍｌｉｎｅａｔａ）；スリーラインドポテトビートル（Ｌｅｍａ ｔｒｉｌｉｎｅａｔａ）；アスパラガスクビナガハムシ（Ｃｒｉｏｃｅｒｉｓ ａｓｐａｒａｇｉ）；インゲンテントウ（Ｅｐｉｌａｃｈｎａ ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ）；コクヌストモドキ（Ｔｒｉｏｌｉｕｍ ｃａｓｔａｎｅｕｍ）；ヒラタコクヌストモドキ（Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃｏｎｆｕｓｕｍ）；ノミハムシ（Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ属、Ｈａｌｔｉｃａ属、及びＥｐｉｔｒｉｘ属）；コーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ属）；ヨツモンマメゾウムシ（Ｃａｌｌｏｓｏｂｒｕｃｈｕｓ ａｃｕｌａｔｕｅ）；ワタミハナゾウムシ（Ａｎｔｏｎｏｍｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ）；イネゾウムシ（Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｒｙｚａ）；コクゾウムシ（Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ ｚｅａｍａｉｓ）；グラナリアコクゾウムシ（Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ ｇｒａｎａｒｉｕｓ）；エジプトアルファルファタコゾウムシ（Ｈｙｐｅｒａ ｐｏｓｔｉｃａ）；マメゾウムシ（Ａｃａｎｔｈｏｓｅｅｌｉｄｅｓ ｏｂｔｅｃｔｕｓ）；コナナガシンクイムシ（Ｒｈｙｚｏｐｅｒｔｈａ ｄｏｍｉｎｉｃａ）；チャイロコメゴミムシダマシ（Ｔｅｎｅｂｒｉｏ ｍｏｌｉｔｏｒ）；Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ、特に、ミカンキイロアザミウマ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｉ ｅｌｌａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）；Ｄｉｐｔｅｒａ、特に、ハモグリバエ属（Ｌｉｒｉｏｍｙｚａ ｔｒｉｆｏｌｉｉ）；植物寄生性線虫、特にジャガイモシスト線虫（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ属）、テンサイシスト線虫（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｓｃｈａｃｈｔｉｉ）、及びネコブ線虫（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ属）を含むが、これらに限定されない。

別のクラスの消化酵素は、アスパラギン酸プロテアーゼである。「アスパラギン酸プロテアーゼ」という用語は、反応性の高い２つのアスパラギン酸残基を酵素の触媒部位に保有するプロテアーゼを表すことを意図し、これはほとんどの場合、ほぼ全ての既知のアスパラギン酸プロテアーゼの低分子量インヒビターであるペプスタチンによる、その特異的な阻害を特徴とする。多くの植食性昆虫は、ほとんどの場合でシステインプロテアーゼと併せて中腸アスパラギン酸プロテアーゼに部分的に依存してタンパク質消化を行うという証拠がある。これらは、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ、特に（Ｒｈｏｄｎｉｕｓ ｐｒｏｌｉｘｕｓ）及びトコジラミ（Ｃｉｍｅｘ属）ならびにＰｈｙｍａｔｉｄａｅ科、Ｐｅｎｔａｔｏｍｉｄａｅ科、Ｌｙｇａｅｉｄａｅ科、及びＢｅｌｏｓｔｏｍａｔｉｄａｅ科のメンバー；全てＣｕｃｕｊｉｆｏｒｍｉａ系に属するＭｅｌｏｉｄａｅ科、Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌｉｄａｅ科、Ｃｏｃｃｉｎｅｌｉｄａｅ科、及びＢｒｕｃｈｉｄａｅ科のＣｏｌｅｏｐｔｅｒａ、特に、コロラドハムシ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）スリーラインドポテトビートル（Ｌｅｍａｔｒｉ ｌｉｎｅａｔａ）；サザンコーンルートワーム及びウエスタンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ及びＤ．ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）、ワタミハナゾウムシ（Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ）、ヘリカメムシ（Ａｎａｓａｔｒｉｓｔｉｓ）；ノミハムシ（Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｃｒｕｃｉｆｅｒａ）、Ｂｒｕｃｈｉｄａｅ科昆虫（Ｃａｌｌｏｓｏｂｒｕｃｈｕｓ ｍａｃｕｌａｔｕｓ）、インゲンテントウ（Ｅｐｉｌａｃｈｎａ ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ）、ダイズハモグリバエ（Ｏｄｏｎｔｏｔａ ｈｏｒｎｉ）、有縁ツチハンミョウ（ｍａｒｇｉｎｅｄ ｂｌｉｓｔｅｒ ｂｅｅｔｌｅ）（Ｅｐｉｃａｕｔａ ｐｅｓｔｉｆｅｒａ）及びコクヌストモドキ（Ｔｒｉｏｌｉｕｍ ｃａｓｔａｎｅｕｍ）；Ｄｉｐｔｅｒａ、特にイエバエ（Ｍｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）を含むが、これらに限定されない（Ｔｅｒｒａ ａｎｄ Ｆｅｒｒｅｉｒａ（１９９４）Ｃｏｍｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０９Ｂ：１−６２、Ｗｏｌｆｓｏｎ ａｎｄ Ｍｕｒｄｏｃｋ（１９９０）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｃｏｌ．１６：１０８９−１１０２）。

種々の実施形態において、本発明は、上述のように、ヒト、昆虫、及び線虫のプロテイナーゼ、プロテアーゼ、及びペプチダーゼ（本明細書では集合的に「プロテアーゼ」と呼ぶ）の基質として作用する二元ペプチド及び三元ペプチドを提示する。種々の実施形態において、二元ペプチド及び三元ペプチドは、２つまたは３つの異なる領域からなる、少なくとも４個のアミノ酸から最大１６個までのアミノ酸を含有する。したがって、二元ペプチドは２つの異なる領域を有し、三元ペプチドは３つの異なる領域を有する。種々の実施形態において、本発明の二元ペプチド及び三元ペプチドは全て、１つの領域内ではヒトプロテアーゼによって、そして第２の領域内では昆虫及び／または線虫プロテアーゼによって切断可能である。三元ペプチドは、１〜４個のアミノ酸を含むスペーサーと呼ばれる更なる領域を有する点において二元ペプチドとは異なる。一部の実施形態では、スペーサーは、本明細書に記述される任意のアミノ酸を２つ含む「＋２」または「プラス２」ジペプチドであり得る。

本明細書で使用される場合、二元ペプチド及び三元ペプチドを形成し得るアミノ酸の様々な順列及び組み合わせについて記述する単なる例示目的に過ぎないが、二元ペプチド及び三元ペプチドの第１の領域は「Ｘ」と呼ばれ、「Ｘ」は昆虫及び／または線虫プロテアーゼの基質であり、二元ペプチド及び三元ペプチドの第２の領域は「Ｙ」と呼ばれ、これは、動物（例えばヒト）のプロテアーゼ、例えばヒトの胃腸管系に見出されるヒトプロテアーゼの基質である。一部の実施形態では、本発明の三元ペプチドはＸ領域及びＹ領域を有し、第３の領域はスペーサーまたは「Ｚ」領域と呼ばれる。一部の実施形態では、Ｘ及びＹの各々は２〜４アミノ酸長であってよく、Ｚは１〜４アミノ酸長であってよい。一部の実施形態では、特に殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を植物またはその一部において発現させる場合、二元及び／または三元の切断可能ペプチドは、植物プロテアーゼによって切断され得ない。これらの実施形態において、植物で発現させた殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、植物プロテアーゼによってインサイツで切断することはできないが、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を発現する植物またはその一部がヒトまたは昆虫もしくは線虫によって摂取されると、ヒトまたは昆虫もしくは線虫の腸内プロテアーゼによって切断することができる。

（１Ｂ）．二元ペプチドの説明及び例

したがって、二元ペプチドは、Ｘ（_２〜４）Ｙ（_２〜４）、もしくはＹ（_２〜４）Ｘ（_２〜４）を含むか、またはこれらからなる場合があり、例示的な三元ペプチドは、Ｘ（_２〜４）Ｙ（_２〜４）Ｚ（_１〜４）、またはＺ（_１〜４）Ｘ（_２〜４）Ｙ（_２〜４）、またはＹ（_２〜４）Ｘ（_２〜４）Ｚ（_１〜４）、またはＺ（_１〜４）Ｙ（_２〜４）Ｘ（_２〜４）、またはＺ（_１〜４）Ｘ（_２〜４）Ｙ（_２〜４）Ｚ（_１〜４）、またはＺ（_１〜４）Ｙ（_２〜４）Ｘ（_２〜４）Ｚ（_１〜４）を含む場合があり、ここで括弧内の各数字は、その領域のアミノ酸の数を表す。例えば、Ｘ_{（２〜４）}は、２〜４つのアミノ酸を含むＸ領域、例えばＸ_１Ｘ_２（２つのアミノ酸）、またはＸ_１Ｘ_２Ｘ_３（３つのアミノ酸）、またはＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４（４つのアミノ酸）を表す。例えば、二元ペプチドは、アミノ酸配列：Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４［式中、各Ｘ_ｎ及び各Ｙ_ｎはアミノ酸であり、Ｘ_１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、及びＶからなる群から選択され、Ｘ_２は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ_４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｙ_１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ_２は、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ_４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される］を含み得る。

種々の実施形態において、例示的なＸ領域のペプチド配列、すなわち、昆虫及び／または線虫の腸内／血リンパ環境に見出される１つ以上の昆虫及び／または線虫プロテアーゼによって切断され得るペプチド配列は、ＡＡＧ、ＡＡＫ、ＡＡＲ、ＡＦＧ、ＡＦＫ、ＡＦＲ、ＡＧＦ、ＡＧＩ、ＡＧＫ、ＡＧＬ、ＡＧＮ、ＡＧＱ、ＡＧＲ、ＡＧＳ、ＡＧＴ、ＡＧＹ、ＡＩＧ、ＡＩＫ、ＡＩＮ、ＡＩＱ、ＡＩＲ、ＡＫＦ、ＡＫＧ、ＡＫＩ、ＡＫＫ、ＡＫＬ、ＡＫＮ、ＡＫＱ、ＡＫＲ、ＡＫＳ、ＡＫＴ、ＡＫＹ、ＡＬＧ、ＡＬＫ、ＡＬＮ、ＡＬＱ、ＡＬＲ、ＡＰＦ、ＡＰＧ、ＡＰＫ、ＡＰＲ、ＡＲＦ、ＡＲＧ、ＡＲＩ、ＡＲＫ、ＡＲＬ、ＡＲＮ、ＡＲＱ、ＡＲＲ、ＡＲＳ、ＡＲＴ、ＡＲＹ、ＡＳＧ、ＡＳＫ、ＡＳＲ、ＡＴＧ、ＡＴＫ、ＡＴＲ、ＡＶＧ、ＡＶＫ、ＡＶＲ、ＡＹＧ、ＡＹＫ、ＡＹＲ、ＤＧＫ、ＤＧＲ、ＤＩＧ、ＤＩＫ、ＤＩＲ、ＤＬＧ、ＤＬＫ、ＤＬＲ、ＥＧＫ、ＥＧＲ、ＥＩＧ、ＥＩＫ、ＥＩＲ、ＥＬＧ、ＥＬＫ、ＥＬＲ、ＥＲ、ＦＶＲ、ＧＡＦ、ＧＡＩ、ＧＡＫ、ＧＡＬ、ＧＡＲ、ＧＡＹ、ＧＦＫ、ＧＦＲ、ＧＩＫ、ＧＩＮ、ＧＩＱ、ＧＩＲ、ＧＫＡ、ＧＫＤ、ＧＫＥ、ＧＫＦ、ＧＫＩ、ＧＫＫ、ＧＫＬ、ＧＫＮ、ＧＫＱ、ＧＫＲ、ＧＫＳ、ＧＫＴ、ＧＫＶ、ＧＫＹ、ＧＬＫ、ＧＬＮ、ＧＬＱ、ＧＬＲ、ＧＮＡ、ＧＮＫ、ＧＮＲ、ＧＮＶ、ＧＰＫ、ＧＰＲ、ＧＱＡ、ＧＱＫ、ＧＱＲ、ＧＱＶ、ＧＲＡ、ＧＲＤ、ＧＲＥ、ＧＲＦ、ＧＲＩ、ＧＲＫ、ＧＲＬ、ＧＲＮ、ＧＲＱ、ＧＲＲ、ＧＲＳ、ＧＲＴ、ＧＲＶ、ＧＲＹ、ＧＳＩ、ＧＳＫ、ＧＳＬ、ＧＳＲ、ＧＴＩ、ＧＴＫ、ＧＴＬ、ＧＴＲ、ＧＶＦ、ＧＶＩ、ＧＶＫ、ＧＶＬ、ＧＶＲ、ＧＶＹ、ＧＹＫ、ＧＹＲ、ＩＧＡ、ＩＧＦ、ＩＧＩ、ＩＧＫ、ＩＧＬ、ＩＧＮ、ＩＧＱ、ＩＧＲ、ＩＧＳ、ＩＧＴ、ＩＧＶ、ＩＧＹ、ＩＩＧ、ＩＩＫ、ＩＩＲ、ＩＫＡ、ＩＫＦ、ＩＫＧ、ＩＫＩ、ＩＫＫ、ＩＫＬ、ＩＫＮ、ＩＫＱ、ＩＫＲ、ＩＫＳ、ＩＫＴ、ＩＫＶ、ＩＫＹ、ＩＬＧ、ＩＬＫ、ＩＬＲ、ＩＮＡ、ＩＮＧ、ＩＮＫ、ＩＮＲ、ＩＮＶ、ＩＰＧ、ＩＰＫ、ＩＰＲ、ＩＱＡ、ＩＱＧ、ＩＱＫ、ＩＱＲ、ＩＱＶ、ＩＲＡ、ＩＲＦ、ＩＲＧ、ＩＲＩ、ＩＲＫ、ＩＲＬ、ＩＲＮ、ＩＲＱ、ＩＲＲ、ＩＲＳ、ＩＲＴ、ＩＲＶ、ＩＲＹ、ＩＳＧ、ＩＳＫ、ＩＳＲ、ＩＴＧ、ＩＴＫ、ＩＴＲ、ＫＡＦ、ＫＡＧ、ＫＡＩ、ＫＡＫ、ＫＡＬ、ＫＡＲ、ＫＡＹ、ＫＦＦ、ＫＦＧ、ＫＦＫ、ＫＦＲ、ＫＧＡ、ＫＧＤ、ＫＧＥ、ＫＧＦ、ＫＧＩ、ＫＧＫ、ＫＧＬ、ＫＧＮ、ＫＧＱ、ＫＧＲ、ＫＧＳ、ＫＧＴ、ＫＧＶ、ＫＧＹ、ＫＩＧ、ＫＩＫ、ＫＩＮ、ＫＩＱ、ＫＩＲ、ＫＫＡ、ＫＫＤ、ＫＫＥ、ＫＫＦ、ＫＫＧ、ＫＫＮ、ＫＫＱ、ＫＫＳ、ＫＫＴ、ＫＫＶ、ＫＫＹ、ＫＬＧ、ＫＬＫ、ＫＬＮ、ＫＬＱ、ＫＬＲ、ＫＮＧ、ＫＮＫ、ＫＮＲ、ＫＰＧ、ＫＰＫ、ＫＰＲ、ＫＱＧ、ＫＱＫ、ＫＱＲ、ＫＲＡ、ＫＲＤ、ＫＲＥ、ＫＲＦ、ＫＲＧ、ＫＲＮ、ＫＲＱ、ＫＲＳ、ＫＲＴ、ＫＲＶ、ＫＲＹ、ＫＳＧ、ＫＳＩ、ＫＳＫ、ＫＳＬ、ＫＳＲ、ＫＴＧ、ＫＴＩ、ＫＴＫ、ＫＴＬ、ＫＴＲ、ＫＶＦ、ＫＶＧ、ＫＶＩ、ＫＶＫ、ＫＶＬ、ＫＶＲ、ＫＶＹ、ＫＹＧ、ＫＹＫ、ＫＹＲ、ＬＦＲ、ＬＧＡ、ＬＧＦ、ＬＧＩ、ＬＧＫ、ＬＧＬ、ＬＧＮ、ＬＧＱ、ＬＧＲ、ＬＧＳ、ＬＧＴ、ＬＧＶ、ＬＧＹ、ＬＩＧ、ＬＩＫ、ＬＩＲ、ＬＫ、ＬＫＡ、ＬＫＦ、ＬＫＧ、ＬＫＩ、ＬＫＫ、ＬＫＬ、ＬＫＮ、ＬＫＱ、ＬＫＲ、ＬＫＳ、ＬＫＴ、ＬＫＶ、ＬＫＹ、ＬＬＧ、ＬＬＫ、ＬＬＲ、ＬＮＡ、ＬＮＧ、ＬＮＫ、ＬＮＲ、ＬＮＶ、ＬＰＧ、ＬＰＫ、ＬＰＲ、ＬＱＡ、ＬＱＧ、ＬＱＫ、ＬＱＲ、ＬＱＶ、ＬＲＡ、ＬＲＦ、ＬＲＧ、ＬＲＩ、ＬＲＫ、ＬＲＬ、ＬＲＮ、ＬＲＱ、ＬＲＲ、ＬＲＳ、ＬＲＴ、ＬＲＶ、ＬＲＹ、ＬＳＧ、ＬＳＫ、ＬＳＲ、ＬＴＧ、ＬＴＫ、ＬＴＲ、ＮＧＫ、ＮＧＲ、ＮＩＧ、ＮＩＫ、ＮＩＲ、ＮＬＧ、ＮＬＫ、ＮＬＲ、ＰＧＫ、ＰＧＲ、ＰＩＧ、ＰＩＫ、ＰＩＲ、ＰＫＧ、ＰＫＫ、ＰＫＲ、ＰＬＧ、ＰＬＫ、ＰＬＲ、ＰＲＧ、ＰＲＫ、ＰＲＲ、ＱＧＫ、ＱＧＲ、ＱＩＧ、ＱＩＫ、ＱＩＲ、ＱＬＧ、ＱＬＫ、ＱＬＲ、ＲＡＦ、ＲＡＧ、ＲＡＩ、ＲＡＫ、ＲＡＬ、ＲＡＲ、ＲＡＹ、ＲＦＦ、ＲＦＧ、ＲＦＫ、ＲＦＲ、ＲＧＡ、ＲＧＤ、ＲＧＥ、ＲＧＦ、ＲＧＩ、ＲＧＫ、ＲＧＬ、ＲＧＮ、ＲＧＱ、ＲＧＲ、ＲＧＳ、ＲＧＴ、ＲＧＶ、ＲＧＹ、ＲＩＧ、ＲＩＫ、ＲＩＮ、ＲＩＱ、ＲＩＲ、ＲＫＡ、ＲＫＤ、ＲＫＥ、ＲＫＦ、ＲＫＧ、ＲＫＫ、ＲＫＮ、ＲＫＱ、ＲＫＳ、ＲＫＴ、ＲＫＶ、ＲＫＹ、ＲＬＦ、ＲＬＦＬ、ＲＬＧ、ＲＬＫ、ＲＬＮ、ＲＬＱ、ＲＬＲ、ＲＮＧ、ＲＮＫ、ＲＮＲ、ＲＰＧ、ＲＰＫ、ＲＰＲ、ＲＱＧ、ＲＱＫ、ＲＱＲ、ＲＲＡ、ＲＲＤ、ＲＲＥ、ＲＲＦ、ＲＲＧ、ＲＲＫ、ＲＲＮ、ＲＲＱ、ＲＲＲ、ＲＲＳ、ＲＲＴ、ＲＲＶ、ＲＲＹ、ＲＳＧ、ＲＳＩ、ＲＳＫ、ＲＳＬ、ＲＳＲ、ＲＴＧ、ＲＴＩ、ＲＴＫ、ＲＴＬ、ＲＴＲ、ＲＶＦ、ＲＶＧ、ＲＶＩ、ＲＶＫ、ＲＶＬ、ＲＶＲ、ＲＶＹ、ＲＹＧ、ＲＹＫ、ＲＹＲ、ＶＡＧ、ＶＡＫ、ＶＡＲ、ＶＦＧ、ＶＦＫ、ＶＦＲ、ＶＧＦ、ＶＧＩ、ＶＧＫ、ＶＧＬ、ＶＧＮ、ＶＧＱ、ＶＧＲ、ＶＧＳ、ＶＧＴ、ＶＧＹ、ＶＩＧ、ＶＩＫ、ＶＩＮ、ＶＩＱ、ＶＩＲ、ＶＫＦ、ＶＫＧ、ＶＫＩ、ＶＫＫ、ＶＫＬ、ＶＫＮ、ＶＫＱ、ＶＫＲ、ＶＫＳ、ＶＫＴ、ＶＫＹ、ＶＬＧ、ＶＬＫ、ＶＬＮ、ＶＬＱ、ＶＬＲ、ＶＰＧ、ＶＰＫ、ＶＰＲ、ＶＲ、ＶＲＦ、ＶＲＧ、ＶＲＩ、ＶＲＫ、ＶＲＬ、ＶＲＮ、ＶＲＱ、ＶＲＲ、ＶＲＳ、ＶＲＴ、ＶＲＹ、ＶＳＧ、ＶＳＫ、ＶＳＲ、ＶＴＧ、ＶＴＫ、ＶＴＲ、ＶＶＧ、ＶＶＫ、ＶＶＲ、ＶＹＧ、ＶＹＫ、またはＶＹＲを含み得る。

種々の実施形態において、例示的なＸ領域のペプチド配列、すなわち、昆虫及び／または線虫の腸内／血リンパ環境に見出される１つ以上の昆虫及び／または線虫プロテアーゼによって切断され得るペプチド配列は、ＡＡＫ、ＡＡＲ、ＡＦＫ、ＡＦＲ、ＡＩＫ、ＡＩＮ、ＡＩＱ、ＡＩＲ、ＡＫＦ、ＡＫＩ、ＡＫＫ、ＡＫＬ、ＡＫＮ、ＡＫＱ、ＡＫＲ、ＡＫＳ、ＡＫＴ、ＡＫＹ、ＡＬＫ、ＡＬＮ、ＡＬＱ、ＡＬＲ、ＡＰＫ、ＡＰＲ、ＡＲＦ、ＡＲＩ、ＡＲＫ、ＡＲＬ、ＡＲＮ、ＡＲＱ、ＡＲＲ、ＡＲＳ、ＡＲＴ、ＡＲＹ、ＡＳＫ、ＡＳＲ、ＡＴＫ、ＡＴＲ、ＡＶＫ、ＡＶＲ、ＡＹＫ、ＡＹＲ、ＤＩＫ、ＤＩＲ、ＤＬＫ、ＤＬＲ、ＥＩＫ、ＥＩＲ、ＥＬＫ、ＥＬＲ、ＩＩＫ、ＩＩＲ、ＩＫＡ、ＩＫＦ、ＩＫＩ、ＩＫＫ、ＩＫＬ、ＩＫＮ、ＩＫＱ、ＩＫＲ、ＩＫＳ、ＩＫＴ、ＩＫＶ、ＩＫＹ、ＩＬＫ、ＩＬＲ、ＩＮＡ、ＩＮＫ、ＩＮＲ、ＩＮＶ、ＩＰＫ、ＩＰＲ、ＩＱＡ、ＩＱＫ、ＩＱＲ、ＩＱＶ、ＩＲＡ、ＩＲＦ、ＩＲＩ、ＩＲＫ、ＩＲＬ、ＩＲＮ、ＩＲＱ、ＩＲＲ、ＩＲＳ、ＩＲＴ、ＩＲＶ、ＩＲＹ、ＩＳＫ、ＩＳＲ、ＩＴＫ、ＩＴＲ、ＫＡＦ、ＫＡＩ、ＫＡＫ、ＫＡＬ、ＫＡＲ、ＫＡＹ、ＫＦＫ、ＫＦＲ、ＫＩＫ、ＫＩＮ、ＫＩＱ、ＫＩＲ、ＫＫＡ、ＫＫＤ、ＫＫＥ、ＫＫＦ、ＫＫＮ、ＫＫＱ、ＫＫＳ、ＫＫＴ、ＫＫＶ、ＫＫＹ、ＫＬＫ、ＫＬＮ、ＫＬＱ、ＫＬＲ、ＫＮＫ、ＫＮＲ、ＫＰＫ、ＫＰＲ、ＫＱＫ、ＫＱＲ、ＫＲＡ、ＫＲＤ、ＫＲＥ、ＫＲＦ、ＫＲＮ、ＫＲＱ、ＫＲＳ、ＫＲＴ、ＫＲＶ、ＫＲＹ、ＫＳＩ、ＫＳＫ、ＫＳＬ、ＫＳＲ、ＫＴＩ、ＫＴＫ、ＫＴＬ、ＫＴＲ、ＫＶＦ、ＫＶＩ、ＫＶＫ、ＫＶＬ、ＫＶＲ、ＫＶＹ、ＫＹＫ、ＫＹＲ、ＬＩＫ、ＬＩＲ、ＬＫＡ、ＬＫＦ、ＬＫＩ、ＬＫＫ、ＬＫＬ、ＬＫＮ、ＬＫＱ、ＬＫＲ、ＬＫＳ、ＬＫＴ、ＬＫＶ、ＬＫＹ、ＬＬＫ、ＬＬＲ、ＬＮＡ、ＬＮＫ、ＬＮＲ、ＬＮＶ、ＬＰＫ、ＬＰＲ、ＬＱＡ、ＬＱＫ、ＬＱＲ、ＬＱＶ、ＬＲＡ、ＬＲＦ、ＬＲＩ、ＬＲＫ、ＬＲＬ、ＬＲＮ、ＬＲＱ、ＬＲＲ、ＬＲＳ、ＬＲＴ、ＬＲＶ、ＬＲＹ、ＬＳＫ、ＬＳＲ、ＬＴＫ、ＬＴＲ、ＮＩＫ、ＮＩＲ、ＮＬＫ、ＮＬＲ、ＰＩＫ、ＰＩＲ、ＰＫＫ、ＰＫＲ、ＰＬＫ、ＰＬＲ、ＰＲＫ、ＰＲＲ、ＱＩＫ、ＱＩＲ、ＱＬＫ、ＱＬＲ、ＲＡＦ、ＲＡＩ、ＲＡＫ、ＲＡＬ、ＲＡＲ、ＲＡＹ、ＲＦＫ、ＲＦＲ、ＲＩＫ、ＲＩＮ、ＲＩＱ、ＲＩＲ、ＲＫＡ、ＲＫＤ、ＲＫＥ、ＲＫＦ、ＲＫＮ、ＲＫＱ、ＲＫＳ、ＲＫＴ、ＲＫＶ、ＲＫＹ、ＲＬＫ、ＲＬＮ、ＲＬＱ、ＲＬＲ、ＲＮＫ、ＲＮＲ、ＲＰＫ、ＲＰＲ、ＲＱＫ、ＲＱＲ、ＲＲＡ、ＲＲＤ、ＲＲＥ、ＲＲＦ、ＲＲＮ、ＲＲＱ、ＲＲＳ、ＲＲＴ、ＲＲＶ、ＲＲＹ、ＲＳＩ、ＲＳＫ、ＲＳＬ、ＲＳＲ、ＲＴＩ、ＲＴＫ、ＲＴＬ、ＲＴＲ、ＲＶＦ、ＲＶＩ、ＲＶＫ、ＲＶＬ、ＲＶＲ、ＲＶＹ、ＲＹＫ、ＲＹＲ、ＶＡＫ、ＶＡＲ、ＶＦＫ、ＶＦＲ、ＶＩＫ、ＶＩＮ、ＶＩＱ、ＶＩＲ、ＶＫＦ、ＶＫＩ、ＶＫＫ、ＶＫＬ、ＶＫＮ、ＶＫＱ、ＶＫＲ、ＶＫＳ、ＶＫＴ、ＶＫＹ、ＶＬＫ、ＶＬＮ、ＶＬＱ、ＶＬＲ、ＶＰＫ、ＶＰＲ、ＶＲＦ、ＶＲＩ、ＶＲＫ、ＶＲＬ、ＶＲＮ、ＶＲＱ、ＶＲＲ、ＶＲＳ、ＶＲＴ、ＶＲＹ、ＶＳＫ、ＶＳＲ、ＶＴＫ、ＶＴＲ、ＶＶＫ、ＶＶＲ、ＶＹＫ、またはＶＹＲを含み得る。

種々の実施形態において、例示的なＹ領域のペプチド配列、すなわち、動物（例えばヒト）の胃腸管環境に見出される１つ以上の動物（例えばヒト）のプロテアーゼによって切断され得るペプチド配列は、ＡＦＦ、ＡＦＧ、ＡＦＩ、ＡＦＬ、ＡＦＶ、ＡＦＹ、ＡＧＦ、ＡＧＬ、ＡＩＦ、ＡＩＬ、ＡＬＦ、ＡＬＧ、ＡＬＩ、ＡＬＬ、ＡＬＹ、ＡＹＦ、ＡＹＬ、ＤＦＦ、ＤＦＧ、ＤＦＩ、ＤＦＬ、ＤＦＹ、ＤＧＦ、ＤＧＬ、ＤＩＦ、ＤＬＦ、ＤＬＧ、ＤＬＹ、ＤＹＦ、ＤＹＬ、ＥＦＦ、ＥＦＧ、ＥＦＩ、ＥＦＬ、ＥＦＹ、ＥＧＦ、ＥＧＬ、ＥＩＦ、ＥＬＦ、ＥＬＧ、ＥＬＹ、ＥＹＦ、ＥＹＬ、ＦＦ、ＦＦＡ、ＦＦＤ、ＦＦＥ、ＦＦＦ、ＦＦＧ、ＦＦＩ、ＦＦＫ、ＦＦＬ、ＦＦＲ、ＦＦＳ、ＦＦＴ、ＦＦＶ、ＦＦＹ、ＦＧＡ、ＦＧＤ、ＦＧＥ、ＦＧＦ、ＦＧＩ、ＦＧＫ、ＦＧＬ、ＦＧＲ、ＦＧＳ、ＦＧＴ、ＦＧＶ、ＦＧＹ、ＦＬＶ、ＦＬＲ、ＦＹＡ、ＦＹＤ、ＦＹＥ、ＦＹＦ、ＦＹＧ、ＦＹＩ、ＦＹＫ、ＦＹＬ、ＦＹＲ、ＦＹＳ、ＦＹＴ、ＦＹＶ、ＦＹＹ、ＧＦＡ、ＧＦＤ、ＧＦＥ、ＧＦＦ、ＧＦＩ、ＧＦＫ、ＧＦＬ、ＧＦＲ、ＧＦＳ、ＧＦＴ、ＧＦＶ、ＧＦＹ、ＧＧＬ、ＧＩＦ、ＧＩＬ、ＧＬＦ、ＧＬＩ、ＧＬＬ、ＧＬＹ、ＧＹＦ、ＧＹＬ、ＩＦ、ＩＦＡ、ＩＦＦ、ＩＦＧ、ＩＦＩ、ＩＦＬ、ＩＦＶ、ＩＦＹ、ＩＧＦ、ＩＧＬ、ＩＩＦ、ＩＩＬ、ＩＬＦ、ＩＬＧ、ＩＬＩ、ＩＬＬ、ＩＬＹ、ＩＹＦ、ＩＹＬ、ＬＦＡ、ＬＦＦ、ＬＦＧ、ＬＦＩ、ＬＦＬ、ＬＦＶ、ＬＦＹ、ＬＧ、ＬＧＡ、ＬＧＥ、ＬＧＦ、ＬＧＩ、ＬＧＬ、ＬＧＶ、ＬＧＹ、ＬＩＦ、ＬＩＧ、ＬＩＩ、ＬＩＬ、ＬＩＹ、ＬＬＦ、ＬＬＧ、ＬＬＩ、ＬＬＬ、ＬＬＹ、ＬＹＡ、ＬＹＦ、ＬＹＧ、ＬＹＩ、ＬＹＬ、ＬＹＶ、ＬＹＹ、ＮＦＦ、ＮＦＧ、ＮＦＩ、ＮＦＬ、ＮＦＹ、ＮＧＦ、ＮＧＬ、ＮＩＬ、ＮＬＧ、ＮＬＩ、ＮＬＬ、ＮＹＦ、ＮＹＬ、ＱＦＦ、ＱＦＧ、ＱＦＩ、ＱＦＬ、ＱＦＹ、ＱＧＦ、ＱＧＬ、ＱＩＬ、ＱＬＧ、ＱＬＩ、ＱＬＬ、ＱＹＦ、ＱＹＬ、ＳＦＦ、ＳＦＧ、ＳＦＩ、ＳＦＬ、ＳＦＹ、ＳＧＦ、ＳＧＬ、ＳＩＦ、ＳＩＬ、ＳＬＦ、ＳＬＧ、ＳＬＩ、ＳＬＬ、ＳＬＹ、ＳＹＦ、ＳＹＬ、ＴＦＦ、ＴＦＧ、ＴＦＩ、ＴＦＬ、ＴＦＹ、ＴＧＦ、ＴＧＬ、ＴＩＦ、ＴＩＬ、ＴＬＦ、ＴＬＧ、ＴＬＩ、ＴＬＬ、ＴＬＹ、ＴＹＦ、ＴＹＬ、ＶＦＦ、ＶＦＧ、ＶＦＩ、ＶＦＬ、ＶＦＹ、ＶＧＦ、ＶＧＬ、ＶＩＦ、ＶＩＬ、ＶＬＦ、ＶＬＧ、ＶＬＩ、ＶＬＬ、ＶＬＹ、ＶＹＦ、ＶＹＬ、ＹＦＡ、ＹＦＤ、ＹＦＥ、ＹＦＦ、ＹＦＧ、ＹＦＩ、ＹＦＫ、ＹＦＬ、ＹＦＲ、ＹＦＳ、ＹＦＴ、ＹＦＶ、ＹＦＹ、ＹＧＦ、ＹＧＬ、ＹＹＦ、またはＹＹＬを含み得る。

種々の実施形態において、例示的なＹ領域のペプチド配列、すなわち、動物（例えばヒト）の胃腸管環境に見出される１つ以上の動物（例えばヒト）のプロテアーゼによって切断され得るペプチド配列は、ＡＦＦ、ＡＦＩ、ＡＦＬ、ＡＦＹ、ＡＩＦ、ＡＩＬ、ＡＬＦ、ＡＬＩ、ＡＬＬ、ＡＬＹ、ＡＹＦ、ＡＹＬ、ＤＦＦ、ＤＦＩ、ＤＦＬ、ＤＦＹ、ＤＩＦ、ＤＬＦ、ＤＬＹ、ＤＹＦ、ＤＹＬ、ＹＦＬ、ＥＦＦ、ＥＦＩ、ＥＦＬ、０、ＥＦＹ、ＥＩＦ、ＥＬＦ、ＥＬＹ、ＥＹＦ、ＥＹＬ、ＦＦＡ、ＦＦＤ、ＦＦＥ、ＦＦＦ、ＦＦＩ、ＦＦＫ、ＦＦＬ、ＦＦＲ、ＦＦＳ、ＦＦＴ、ＦＦＶ、ＦＦＹ、ＦＹＡ、ＦＹＤ、ＦＹＥ、ＦＹＦ、ＦＹＩ、ＦＹＫ、ＦＹＬ、ＦＹＲ、ＦＹＳ、ＦＹＴ、ＦＹＶ、ＦＹＹ、ＩＦＡ、ＩＦＦ、ＩＦＩ、ＩＦＬ、ＩＦＶ、ＩＦＹ、ＩＩＦ、ＩＩＬ、ＩＬＦ、ＩＬＩ、ＩＬＬ、ＩＬＹ、ＩＹＦ、ＩＹＬ、ＬＦＡ、ＬＦＦ、ＬＦＩ、ＬＦＬ、ＬＦＶ、ＬＦＹ、ＬＩＦ、ＬＩＩ、ＬＩＬ、ＬＩＹ、ＬＬＦ、ＬＬＩ、ＬＬＬ、ＬＬＹ、ＬＹＡ、ＬＹＦ、ＬＹＩ、ＬＹＬ、ＬＹＶ、ＬＹＹ、ＮＦＦ、ＮＦＩ、ＮＦＬ、ＮＦＹ、ＮＩＬ、ＮＬＩ、ＮＬＬ、ＮＹＦ、ＮＹＬ、ＱＦＦ、ＱＦＩ、ＱＦＬ、ＱＦＹ、ＱＩＬ、ＱＬＩ、ＱＬＬ、ＱＹＦ、ＱＹＬ、ＳＦＦ、ＳＦＩ、ＳＦＬ、ＳＦＹ、ＳＩＦ、ＳＩＬ、ＳＬＦ、ＳＬＩ、ＳＬＬ、ＳＬＹ、ＳＹＦ、ＳＹＬ、ＴＦＦ、ＴＦＩ、ＴＦＬ、ＴＦＹ、ＴＩＦ、ＴＩＬ、ＴＬＦ、ＴＬＩ、ＴＬＬ、ＴＬＹ、ＴＹＦ、ＴＹＬ、ＶＦＦ、ＶＦＩ、ＶＦＬ、ＶＦＹ、ＶＩＦ、ＶＩＬ、ＶＬＦ、ＶＬＩ、ＶＬＬ、ＶＬＹ、ＶＹＦ、ＶＹＬ、ＹＦＡ、ＹＦＤ、ＹＦＥ、ＹＦＦ、ＹＦＩ、ＹＦＫ、ＹＦＬ、ＹＦＲ、ＹＦＳ、ＹＦＴ、ＹＦＶ、ＹＦＹ、ＹＹＦ、またはＹＹＬを含み得る。

種々の実施形態において、例示的なＸまたはＹ領域のペプチド配列、すなわち、動物（例えばヒト）の胃腸管環境に見出される１つ以上の動物（例えばヒト）のプロテアーゼ、ならびに昆虫及び／または線虫の腸内／血リンパ環境に見出される１つ以上の昆虫及び／または線虫プロテアーゼによって切断され得るペプチド配列は、ＡＦＧ、ＡＧＦ、ＡＧＬ、ＡＬＧ、ＤＬＧ、ＥＬＧ、ＧＦＫ、ＧＦＲ、ＩＧＦ、ＩＧＬ、ＩＬＧ、ＬＧＡ、ＬＧＦ、ＬＧＩ、ＬＧＬ、ＬＧＶ、ＬＧＹ、ＬＩＧ、ＬＬＧ、ＮＬＧ、ＱＬＧ、ＶＦＧ、ＶＧＦ、ＶＧＬ、またはＶＬＧを含み得る。

一部の例示的な例において、本発明の二元ペプチドは、次式：Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４［式中、Ｘ_１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、及びＶからなる群から選択され、Ｘ_２は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ_４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｙ_１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ_２は、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ_４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される］を含み得る。

一部の実施形態では、例示的な二元ペプチド（ＸＹまたはＹＸ）は、次のアミノ酸配列：ＡＦＶＲＬＦ（配列番号１５９４）、ＡＫＬＦＶ（配列番号１５９５）、ＡＬＦＡＬＫ（配列番号１５９６）、ＡＬＦＬＫ（配列番号１５９７）、ＡＬＦＬＲ（配列番号１５９８）、ＡＬＦＲ（配列番号１５９９）、ＡＬＦＲＬＲ（配列番号１６００）、ＡＬＫＡＬＦ（配列番号１６０１）、ＡＬＫＦＦ（配列番号１６０２）、ＡＬＫＦＬＶ（配列番号１６０３）、ＡＬＫＩＦＶ（配列番号１６０４）、ＡＬＫＬＦＶ（配列番号１６０５）、ＦＦＡＤＩＫ（配列番号１６０６）、ＦＦＡＬＫ（配列番号１６０７）、ＦＦＬＫ（配列番号１６０８）、ＦＦＬＲ（配列番号１６０９）、ＦＦＲＬＲ（配列番号１６１０）、ＦＧＹＲＩＫ（配列番号１６１１）、ＦＬＲＬＦ（配列番号１６１２）、ＦＹＡＲＲ（配列番号１６１３）、ＧＧＬＲＫＫ（配列番号１６１４）、ＩＦＶＡＬＫ（配列番号１６１５）、ＩＦＶＬＫ（配列番号１６１６）、ＩＦＶＬＲ（配列番号１６１７）、ＩＦＶＲ（配列番号１６１８）、ＩＦＶＲＬＲ（配列番号１６１９）、ＩＬＦＮＩＫ（配列番号１６２０）、ＬＦＡＡＰＦ（配列番号１６２１）、ＦＶＡＬＫ（配列番号１６２２）、ＬＦＶＬＫ（配列番号１６２３）、ＬＦＶＬＲ（配列番号１６２４）、ＬＦＶＲ（配列番号１６２５）、ＬＦＶＲＬＲ（配列番号１６２６）、ＬＦＶＲＶＦＬ（配列番号１６２７）、ＬＧＥＲ（配列番号１６２８）、ＬＫＡＬＦ（配列番号１６２９）、ＬＫＦＦ（配列番号１６３０）、ＬＫＩＦＶ（配列番号１６３１）、ＬＫＬＦＶ（配列番号１６３２）、ＬＲＡＬＦ（配列番号１６３３）、ＬＲＦＦ（配列番号１６３４）、ＬＲＩＦＶ（配列番号１６３５）、ＬＲＬＦＶ（配列番号１６３６）、ＲＡＬＦ（配列番号１６３７）、ＲＩＦＶ（配列番号１６３８）、ＲＬＦＶ（配列番号１６３９）、ＲＬＲＡＬＦ（配列番号１６４０）、ＲＬＲＦＦ（配列番号１６４１）、ＲＬＲＩＦＶ（配列番号１６４２）、ＲＬＲＬＦＶ（配列番号１６４３）、ＲＲＫＡＦＶ（配列番号１６４４）、ＲＲＫＬＩＦ（配列番号１６４５）、ＲＲＲＦＦＡ（配列番号１６４６）、ＶＦＧＲＫＧ（配列番号１６４７）、及びＹＦＶＲＫ（配列番号１６４８）を含む。

種々の実施形態において、殺虫性及び／または殺線虫性ポリペプチド及びタンパク質、ＤＮＡ構築物に使用され、また、トランスジェニック植物またはその一部に組み込まれる、本発明の例示的な二元ペプチドは、ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、またはＬＦＡＡＰＦからなる群から選択される１つ以上の切断可能な二元ペプチドを含み得る。

（１Ｃ）．三元ペプチドの説明及び例

種々の実施形態において、三元ペプチドには、二元ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または両末端にインフレームで融合した１〜４個のアミノ酸が付加された、上記で説明した例示的な二元ペプチドが全て含まれ得る。一部の実施形態では、本発明の三元ペプチドには、例示的な二元ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または両末端に１個、２個、３個、または４個のアミノ酸がインフレームで融合した、上記に開示された例示的な二元ペプチドが全て含まれ得る。別の例において、例示的な三元ペプチドには、上記に定義した二元ペプチドのＮ末端、またはＣ末端、または両末端にインフレームで位置付けられたＺ（_１〜４）が付加された、Ｘ（_２〜４）Ｙ（_２〜４）、またはＹ（_２〜４）Ｘ（_２〜４）が含まれ得る。一部の例示的な例において、種々の三元ペプチドの例は、アミノ酸配列：Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、
Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、
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Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、
Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４［式中、Ｘ_１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、及びＶからなる群から選択され、Ｘ_２は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ_４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｙ_１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ_２は、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ_４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される］を含み得る。上記の三元ペプチドの群から選択される特定の例示的な三元ペプチドを以下に提示する。

一部の例示的な実施形態では、二元ペプチドは、少なくとも４個のアミノ酸から最大８個までのアミノ酸を含有してよく、一方で三元ペプチドは、少なくとも５個のアミノ酸から最大１６個までのアミノ酸を含有してよい。

関連する実施形態において、Ｘ領域及びＹ領域を含む切断可能な二元リンカーペプチド（Ｌ）は上述されており、上述のＸ領域及び／またはＹ領域に（Ｘ領域もしくはＹ領域のＮ末端側配列、またはＸ領域もしくはＹ領域のＣ末端側配列のいずれかに）インフレームで融合していてよい例示的なＺ領域（１〜４アミノ酸配列、例えば２アミノ酸配列）が、三元の切断可能な連結ペプチドを形成する。例示的なＺまたはスペーサーアミノ酸配列は、ＡＡ、ＡＦ、ＡＭ、ＡＮ、ＡＱ、ＡＶ、ＡＷ、ＡＹ、ＤＡ、ＤＤ、ＤＥ、ＤＦ、ＤＧ、ＤＩ、ＤＬ、ＤＰ、ＤＳ、ＤＴ、ＤＶ、ＤＷ、ＤＹ、ＥＡ、ＥＤ、ＥＥ、ＥＦ、ＥＧ、ＥＩ、ＥＬ、ＥＰ、ＥＳ、ＥＴ、ＥＶ、ＥＷ、ＥＹ、ＦＡ、ＦＤ、ＦＥ、ＦＦ、ＦＩ、ＦＫ、ＦＬ、ＦＭ、ＦＮ、ＦＱ、ＦＲ、ＦＳ、ＦＴ、ＦＶ、ＦＷ、ＦＹ、ＧＡ、ＧＤ、ＧＥ、ＧＦ、ＧＩ、ＧＬ、ＧＭ、ＧＮ、ＧＱ、ＧＳ、ＧＶ、ＧＷ、ＧＹ、ＨＡ、ＨＤ、ＨＥ、ＨＦ、ＨＨ、ＨＩ、ＨＫ、ＨＬ、ＨＮ、ＨＰ、ＨＱ、ＨＲ、ＨＳ、ＨＴ、ＨＶ、ＨＹ、ＩＡ、ＩＤ、ＩＥ、ＩＧ、ＩＨ、ＩＩ、ＩＫ、ＩＬ、ＩＭ、ＩＮ、ＩＰ、ＩＱ、ＩＲ、ＩＳ、ＩＴ、ＩＶ、ＩＷ、ＫＡ、ＫＤ、ＫＥ、ＫＦ、ＫＩ、ＫＬ、ＫＮ、ＫＱ、ＫＶ、ＫＹ、ＬＡ、ＬＤ、ＬＥ、ＬＧ、ＬＨ、ＬＩ、ＬＫ、ＬＬ、ＬＭ、ＬＮ、ＬＰ、ＬＱ、ＬＲ、ＬＳ、ＬＴ、ＬＶ、ＬＷ、ＭＡ、ＭＦ、ＭＧ、ＭＩ、ＭＫ、ＭＬ、ＭＭ、ＭＮ、ＭＱ、ＭＲ、ＭＳ、ＭＴ、ＭＶ、ＭＹ、ＮＡ、ＮＤ、ＮＥ、ＮＦ、ＮＩ、ＮＬ、ＮＭ、ＮＮ、ＮＱ、ＮＳ、ＮＴ、ＮＶ、ＮＹ、ＱＡ、ＱＤ、ＱＥ、ＱＦ、ＱＩ、ＱＬ、ＱＭ、ＱＮ、ＱＱ、ＱＳ、ＱＴ、ＱＶ、ＱＹ、ＲＡ、ＲＤ、ＲＥ、ＲＦ、ＲＩ、ＲＬ、ＲＮ、ＲＱ、ＲＶ、ＲＹ、ＳＡ、ＳＦ、ＳＧ、ＳＫ、ＳＮ、ＳＰ、ＳＱ、ＳＲ、ＳＳ、ＳＴ、ＳＶ、ＳＷ、ＳＹ、ＴＡ、ＴＦ、ＴＧ、ＴＫ、ＴＮ、ＴＰ、ＴＱ、ＴＲ、ＴＳ、ＴＴ、ＴＶ、ＴＷ、ＴＹ、ＶＡ、ＶＦ、ＶＭ、ＶＮ、ＶＱ、ＶＶ、ＶＷ、ＶＹ、ＷＡ、ＷＦ、ＷＩ、ＷＫ、ＷＬ、ＷＮ、ＷＰ、ＷＱ、ＷＲ、ＷＳ、ＷＴ、ＷＶ、ＷＷ、ＷＹ、ＹＡ、ＹＤ、ＹＥ、ＹＦ、ＹＩ、ＹＫ、ＹＬ、ＹＭ、ＹＮ、ＹＱ、ＹＲ、ＹＳ、ＹＴ、ＹＶ、ＹＷ、またはＹＹを含み得る。例示的な実施形態において、個々の本発明の三元ペプチドは、上記に開示された例示的な二元ペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端にインフレームで融合した２アミノ酸配列を含んでいてよく、この２アミノ酸配列は、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、またはＤＴである。

例示的な実施形態において、個々の本発明の三元ペプチドは、上記に開示された例示的な二元ペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端にインフレームで融合した２アミノ酸配列を含んでいてよく、この２アミノ酸配列は、ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、またはＭＶである。

一部の実施形態では、三元ペプチドのスペーサー部分（Ｚ領域）は、アミノ酸配列ＧＳを含み、これは二元ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端または両方にインフレームで融合していてよい。

種々の実施形態において、殺虫性及び／または殺線虫性ポリペプチド及びタンパク質、ＤＮＡ構築物に使用され、また、トランスジェニック植物またはその一部に組み込まれる、本発明の例示的な二元ペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、または両末端のいずれかにおいて、ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、ＭＶ、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、もしくはＤＴを含むか、またはこれらの群から選択されるか、またはこれらからなるＺ領域またはスペーサー配列にインフレームで融合した、ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、もしくはＬＦＡＡＰＦから選択される二元ペプチドを含むか、またはこれらの群から選択されるか、またはこれらからなる、１つ以上の切断可能な三元ペプチドを含み得る。

一部の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性ポリペプチド及びタンパク質、ＤＮＡ構築物に使用され、また、トランスジェニック植物またはその一部に組み込まれる、本発明の例示的な三元の連結ペプチド（Ｌ）は、次のアミノ酸配列：ＡＦＶＲＬＦＧＳ（配列番号１６４９）、ＡＫＬＦＶＧＳ（配列番号１６５０）、ＡＬＦＡＬＫＧＳ（配列番号１６５１）、ＡＬＦＬＫＧＳ（配列番号１６５２）、ＡＬＦＬＲＧＳ（配列番号１６５３）、ＡＬＦＲＧＳ（配列番号１６５４）、ＡＬＦＲＬＲＧＳ（配列番号１６５５）、ＡＬＫＡＬＦＧＳ（配列番号１６５６）、ＡＬＫＦＦＧＳ（配列番号１６５７）、ＡＬＫＦＬＶＧＳ（配列番号１６５８）、ＡＬＫＩＦＶＧＳ（配列番号１６５９）、ＡＬＫＬＦＶＧＳ（配列番号１６６０）、ＦＦＡＤＩＫＧＳ（配列番号１６６１）、ＦＦＡＬＫＧＳ（配列番号１６６２）、ＦＦＬＫＧＳ（配列番号１６６３）、ＦＦＬＲＧＳ（配列番号１６６４）、ＦＦＲＬＲＧＳ（配列番号１６６５）、ＦＧＹＲＩＫＧＳ（配列番号１６６６）、ＦＬＲＬＦＧＳ（配列番号１６６７）、ＦＹＡＲＲＧＳ（配列番号１６６８）、ＧＧＬＲＫＫＧＳ（配列番号１６６９）、ＩＦＶＡＬＫＧＳ（配列番号１６７０）、ＩＦＶＬＫＧＳ（配列番号１６７１）、ＩＦＶＬＲＧＳ（配列番号１６７２）、ＩＦＶＲＧＳ（配列番号１６７３）、ＩＦＶＲＬＲＧＳ（配列番号１６７４）、ＩＬＦＮＩＫＧＳ（配列番号１６７５）、ＬＦＡＡＰＦＧＳ（配列番号１６７６）、ＬＦＶＡＬＫＧＳ（配列番号１６７７）、ＬＦＶＬＫＧＳ（配列番号１６７８）、ＬＦＶＬＲＧＳ（配列番号１６７９）、ＬＦＶＲＧＳ（配列番号１６８０）、ＬＦＶＲＬＲＧＳ（配列番号１６８１）、ＬＦＶＲＶＦＬＧＳ（配列番号１６８２）、ＬＧＥＲＧＳ（配列番号１６８３）、ＬＫＡＬＦＧＳ（配列番号１６８４）、ＬＫＦＦＧＳ（配列番号１６８５）、ＬＫＩＦＶＧＳ（配列番号１６８６）、ＬＫＬＦＶＧＳ（配列番号１６８７）、ＬＲＡＬＦＧＳ（配列番号１６８８）、ＬＲＦＦＧＳ（配列番号１６８９）、ＬＲＩＦＶＧＳ（配列番号１６９０）、ＬＲＬＦＶＧＳ（配列番号１６９１）、ＲＡＬＦＧＳ（配列番号１６９２）、ＲＩＦＶＧＳ（配列番号１６９３）、ＲＬＦＶＧＳ（配列番号１６９４）、ＲＬＲＡＬＦＧＳ（配列番号１６９５）、ＲＬＲＦＦＧＳ（配列番号１６９６）、ＲＬＲＩＦＶＧＳ（配列番号１６９７）、ＲＬＲＬＦＶＧＳ（配列番号１６９８）、ＲＲＫＡＦＶＧＳ（配列番号１６９９）、ＲＲＫＬＩＦＧＳ（配列番号１７００）、ＲＲＲＦＦＡＧＳ（配列番号１７０１）、ＶＦＧＲＫＧＧＳ（配列番号１７０２）、ＹＦＶＲＫＧＳ（配列番号１７０３）、ＧＳＡＦＶＲＬＦ（配列番号１７０４）、ＧＳＡＫＬＦＶ（配列番号１７０５）、ＧＳＡＬＦＡＬＫ（配列番号１７０６）、ＧＳＡＬＦＬＫ（配列番号１７０７）、ＧＳＡＬＦＬＲ（配列番号１７０８）、ＧＳＡＬＦＲ（配列番号１７０９）、ＧＳＡＬＦＲＬＲ（配列番号１７１０）、ＧＳＡＬＫＡＬＦ（配列番号１７１１）、
ＧＳＡＬＫＦＦ（配列番号１７１２）、ＧＳＡＬＫＦＬＶ（配列番号１７１３）、ＧＳＡＬＫＩＦＶ（配列番号１７１４）、ＧＳＡＬＫＬＦＶ（配列番号１７１５）、ＧＳＦＦＡＤＩＫ（配列番号１７１６）、ＧＳＦＦＡＬＫ（配列番号１７１７）、ＧＳＦＦＬＫ（配列番号１７１８）、ＧＳＦＦＬＲ（配列番号１７１９）、ＧＳＦＦＲＬＲ（配列番号１７２０）、ＧＳＦＧＹＲＩＫ（配列番号１７２１）、ＧＳＦＬＲＬＦ（配列番号１７２２）、ＧＳＦＹＡＲＲ（配列番号１７２３）、ＧＳＧＧＬＲＫＫ（配列番号１７２４）、ＧＳＩＦＶＡＬＫ（配列番号１７２５）、ＧＳＩＦＶＬＫ（配列番号１７２６）、ＧＳＩＦＶＬＲ（配列番号１７２７）、ＧＳＩＦＶＲ（配列番号１７２８）、ＧＳＩＦＶＲＬＲ（配列番号１７２９）、ＧＳＩＬＦＮＩＫ（配列番号１７３０）、ＧＳＬＦＡＡＰＦ（配列番号１７３１）、ＧＳＬＦＶＡＬＫ（配列番号１７３２）、ＧＳＬＦＶＬＫ（配列番号１７３３）、ＧＳＬＦＶＬＲ（配列番号１７３４）、ＧＳＬＦＶＲ（配列番号１７３５）、ＧＳＬＦＶＲＬＲ（配列番号１７３６）、ＧＳＬＦＶＲＶＦＬ（配列番号１７３７）、ＧＳＬＧＥＲ（配列番号１７３８）、ＧＳＬＫＡＬＦ（配列番号１７３９）、ＧＳＬＫＦＦ（配列番号１７４０）、ＧＳＬＫＩＦＶ（配列番号１７４１）、ＧＳＬＫＬＦＶ（配列番号１７４２）、ＧＳＬＲＡＬＦ（配列番号１７４３）、ＧＳＬＲＦＦ（配列番号１７４４）、ＧＳＬＲＩＦＶ（配列番号１７４５）、ＧＳＬＲＬＦＶ（配列番号１７４６）、ＧＳＲＡＬＦ（配列番号１７４７）、ＧＳＲＩＦＶ（配列番号１７４８）、ＧＳＲＬＦＶ（配列番号１７４９）、ＧＳＲＬＲＡＬＦ（配列番号１７５０）、ＧＳＲＬＲＦＦ（配列番号１７５１）、ＧＳＲＬＲＩＦＶ（配列番号１７５２）、ＧＳＲＬＲＬＦＶ（配列番号１７５３）、ＧＳＲＲＫＡＦＶ（配列番号１７５４）、ＧＳＲＲＫＬＩＦ（配列番号１７５５）、ＧＳＲＲＲＦＦＡ（配列番号１７５６）、ＧＳＶＦＧＲＫＧ（配列番号１７５７）、及びＧＳＹＦＶＲＫ（配列番号１７５８）を含む、（ＺＸＹまたはＸＹＺ）を含み得る。

種々の実施形態において、代表的な本発明の二元ペプチドは、ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、またはＬＦＡＡＰＦを含み得る。

（１Ｄ）．殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質

本発明の種々の実施形態において、本開示は、殺虫性または殺線虫性毒性タンパク質（ＴＰ）に上述の切断可能ペプチド（Ｌ）（二元ペプチドまたは三元ペプチド）がインフレームで融合している殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を提示する。別の実施形態では、本発明は、２つ以上の切断可能ペプチドを有する殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質であって、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質が、二元ペプチドまたは三元ペプチドを含み、二元ペプチドまたは三元ペプチドが、（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、もしくは（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−Ｌ、もしくは（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、もしくはＬ−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ（式中、ＴＰは毒性ペプチドまたはタンパク質であり、Ｌは二元または三元の切断可能ペプチドであり、ｎは、１〜２００、または１〜１００、または１〜１０の範囲の整数である）を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる構築物にインフレームで融合している、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を提示する。別の実施形態では、本明細書に記述される殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、二元ペプチドまたは三元ペプチドにインフレームで融合した小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）を含み、二元ペプチドまたは三元ペプチドは、殺虫性及び／または殺線虫性の毒性タンパク質及び／またはリピート構築物（Ｌ−ＴＰ）_ｎもしくは（ＴＰ−Ｌ）_ｎ（式中、ｎは、１〜２００、または１〜１００、または１〜１０の範囲の整数である）にインフレームで融合している。種々の実施形態において、例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、（ＥＲＳＰ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）（式中、ｎは１〜２００の範囲の整数である）を含むタンパク質構築物を含み得る。上述した種々の関連する実施形態において、ＴＰは毒性タンパク質であり、Ｌは二元ペプチドまたは三元ペプチドであり、ｎは、１〜２００の範囲の整数、好ましくは１〜１００の範囲の整数、より好ましくは１〜１０の範囲の整数である。一部の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、同じであるかまたは異なっているＴＰと、同じであるかまたは異なっている二元ペプチド及び／または三元ペプチドとを含有し得る。一部の実施形態では、Ｃ末端側ＴＰは、そのＣ末端において、二元ペプチドまたは三元ペプチドに融合しているか、または融合していない。一部の実施形態では、Ｎ末端側ＴＰは、そのＮ末端において、二元ペプチドまたは三元ペプチドに融合しているか、または融合していない。

別の実施形態では、本発明は、２つ以上の切断可能ペプチドを有する殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質であって、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質が、二元ペプチドまたは三元ペプチドのＮ末端、あるいは（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−Ｌ、（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、またはＬ−（ＴＰ−Ｌ）_ｎを含む構築物のＮ末端のいずれかにインフレームで融合した安定化ドメイン（ＳＴＡ）を含む、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を提示する。一部の関連する実施形態において、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、毒性タンパク質のＮ末端に融合している二元ペプチドまたは三元ペプチドのＮ末端、あるいは（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−Ｌ、（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、またはＬ−（ＴＰ−Ｌ）_ｎを含む構築物のＮ末端のいずれかにインフレームで融合した、安定化ドメイン（ＳＴＡ）のＮ末端にインフレームで融合した、ＥＲＳＰを含む。種々の実施形態において、例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、または（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎを含む構築物を含み得る。一部の関連する実施形態において、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、毒性タンパク質のＮ末端に融合している二元ペプチドまたは三元ペプチドのＮ末端、あるいは（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−Ｌ、（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、またはＬ−（ＴＰ−Ｌ）_ｎを含む構築物のＮ末端のいずれかにインフレームで融合した、ＥＲＳＰを含む。種々の実施形態において、例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、または（ＥＲＳＰ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎを含む構築物を含み得る。本明細書及び上文に記述される種々の実施形態において、ＴＰは、昆虫及び／または線虫に対して毒性のある毒性タンパク質と定義され、Ｌは二元ペプチドまたは三元ペプチドであり、ｎは、１〜２００の範囲の整数、好ましくは１〜１００の範囲の整数、より好ましくは１〜１０の範囲の整数である。一部の実施形態では、本明細書及び上文に記述される構築物のＣ末端側ＴＰは、そのＣ末端において、二元ペプチドまたは三元ペプチドに融合しているか、または融合していない。一部の実施形態では、Ｎ末端側ＴＰは、そのＮ末端において、二元ペプチドまたは三元ペプチドに融合しているか、または融合していない。上記の実施形態の一部では、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質に使用されるＴＰは、配列番号５〜１５９３及び１７６１〜１７７５に示されるアミノ酸配列を有するペプチドもしくはタンパク質、またはそれらの変異形であり得る。種々の実施形態において、ＴＰは、同じであっても異なっていてもよく、リンカー（Ｌ）は、同じであっても異なっていてもよい。一部の関連する実施形態において、種々の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質、これらの殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチド及びＤＮＡ構築物、ならびにこれらの殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を含有するトランスジェニック植物または植物細胞において有用であるＴＰは、配列番号５、６及び１７６１、１７６２、１７６７、１７７１〜１７７３に示されるアミノ酸配列を有するペプチド、及びそれらの変異形と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％の配列同一性または配列相同性を有するペプチドを含む。

（２）．小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）

種々の実施形態において、二元及び／または三元の切断可能な連結ペプチドは、１つ以上の更なる成分に連結、または融合、またはカップリングしていてもよい（すなわち、インフレームで結合していてもよい。これらは本明細書では交換可能に使用される）。一部の実施形態では、二元及び／または三元の切断可能な連結ペプチドは、本明細書において更に記述されるように、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）に連結している。種々の実施形態において、例示的な二元及び／または三元の切断可能な連結ペプチドのＮ末端は、ＥＲＳＰのＣ末端に連結している。

本明細書で使用される場合、ＥＲＳＰとは、分泌型及び膜結合型のタンパク質のアミノ末端における短い連続したアミノ酸残基の区間を指す。このシグナルペプチドは、タンパク質の標的を分泌経路に定め、小胞体膜に移行すると新生鎖から切断される。このシグナルペプチドは、高頻度で正に荷電したアミノ酸残基が観察されるアミノ末端側の極性領域（Ｎ領域）、７〜８つのアミノ酸残基をもつ中心的な疎水性領域（Ｈ領域）、及び切断部位を含むカルボキシ末端側領域（Ｃ領域）の３つの領域からなる。成熟型タンパク質またはポリペプチドからのシグナルペプチドの切断は、この切断部位で起こる。例示的なＥＲＳＰは、３〜１００アミノ酸長、または５〜５０アミノ酸長、または２０〜３０アミノ酸長である。ＥＲＳＰは、タンパク質の輸送を指示することから、いわゆるシグナルペプチドである。シグナルペプチドは、ターゲティングシグナル、シグナル配列、輸送ペプチド、または局在化シグナルと呼ばれる場合もある。ＥＲ輸送のためのシグナルペプチドは、多くの場合、アミノ酸残基１５〜３０個の長さであり、正に荷電したアミノ末端側領域と、極性があるが無電荷のカルボキシ末端側領域とにフランキングされている疎水性残基のコアからなる三要素構成を有する。（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ＥＲ ｍｅｍｂｒａｎｅ”，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，２０１１，１８０８：９１２−９２４）。

多くのＥＲＳＰが知られている。多くの植物ＥＲＳＰが知られている。種々の実施形態において、例示的なＥＲＳＰとしては、植物ＥＲＳＰに由来するＥＲＳＰが挙げられる。一部の実施形態では、例示的なＥＲＳＰとしては、本明細書に記述される手順を用いて作動可能である非植物ＥＲＳＰも挙げられる。しかしながら、多くの植物ＥＲＳＰが周知であり、ある特定の例示される植物由来ＥＲＳＰが本発明において有用である。本明細書で使用される場合、「植物ＥＲＳＰ」には、植物起源の天然に存在するＥＲＳＰが含まれる。これには、植物または植物細胞にトランスフェクトし植物で発現させた非植物起源のＥＲＳＰは含まれない。例示的な一実施形態では、植物ＥＲＳＰは、例えばオオムギアルファアミラーゼシグナルペプチド（ＢＡＡＳ）を含み、これは植物のＨｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅに由来し、次のアミノ酸配列：ＭＡＮＫＨＬＳＬＳＬＦＬＶＬＬＧＬＳＡＳＬＡＳＧ（配列番号４）を有する。

他の実施形態では、例示的なＥＲＳＰとしては、１９アミノ酸シグナル（プレ）配列に続いて、３つのコンセンサスＮ結合型グリコシル化部位及び二塩基性Ｋｅｘ２エンドペプチダーゼプロセシング部位を含有する６７残基（プロ）配列からなる、酵母α接合因子プレプロペプチドシグナルリーダーを挙げることができる。一部の実施形態では、例示的なＥＲＳＰには、成熟型酵母α接合因子が含まれ得る。これらの実施形態において、例示的な酵母α接合因子プレプロペプチドシグナルリーダー及び成熟型酵母α接合因子は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの酵母株に見出され得る。

植物ＥＲＳＰは、発現して植物のアポプラスト空間に放出されることが知られるタンパク質のゲノム配列から選択され、いくつかの例としては、オオムギアルファアミラーゼシグナルペプチド、ニンジンエクステンシン、タバコＰＲ１が挙げられる。次の参考文献は更なる説明を提示するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。Ｄｅ Ｌｏｏｓｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ ｅｘｔｅｎｓｉｎ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｌｌｏｗｓ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ”Ｇｅｎｅ，９９（１９９１）９５−１００。Ｄｅ Ｌｏｏｓｅ，Ｍ．らは、タンパク質を小胞体に移行させるための典型的なシグナルペプチドが配列に含まれているＮｉｃｏｔｉａｎａ ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ由来のエクステンシンコード遺伝子の構造解析について記述した。Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．“Ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｒｉｃｅ ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ ａｎｄ ｃａｒｇｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ｐｌａｓｔｉｄｓ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓ”Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００４ Ｊｕｌ；１３５（３）：１３６７−７７．Ｅｐｕｂ ２００４ Ｊｕｌ ２。Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｈ．らは、トランスジェニックタバコにおけるα−アミラーゼの発現を、そのシグナルペプチドあり及びなしで解析することにより、植物細胞におけるα−アミラーゼの細胞内局在化を研究した。これらの参考文献及びその他の文献は、本明細書に記述される方法、手順、ならびにペプチド、タンパク質、及びヌクレオチド複合体において使用され得るシグナルペプチドを教示し、開示している。

一部の実施形態では、ＥＲＳＰは、オオムギアルファアミラーゼシグナルペプチド、またはタバコエクステンシンシグナルペプチド、または修飾されたタバコエクステンシンシグナルペプチド、またはＪｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉすなわちＪ．ａｓｈｅｉのＪｕｎ ａ ３シグナルペプチド、またはジャガイモプロテイナーゼインヒビター（ＩＩ）（ｐｉｎＩＩ）のシグナルペプチドであり得る。植物及び他の真核細胞からＥＲＳＰ配列を単離するように作動可能なＰＣＲプライマーは、当技術分野で公知であり、市販されている。

関連する実施形態において、ＥＲＳＰにカップリングされた二元及び／または三元の切断可能な連結ペプチドは、毒性ペプチド（ＴＰ）のＮ末端に連結している（ＥＲＳＰ−ＴＰ）。

（３）．毒性ペプチド（ＴＰ）

本発明のＴＰは、それぞれ昆虫もしくは線虫に摂取されたとき、それらと接触したとき、またはそれらに注入されたときに殺虫活性及び／または殺線虫活性を有する任意のポリペプチドまたはタンパク質を含む。種々の実施形態において、アミノ酸のポリマーすなわちタンパク性物質であるいくつかのクラスのＴＰを用い、１つのトランスジェニックに発現したタンパク質に含まれた同じＴＰ種の単一ユニットもしくは多量体または複数のＴＰ種の混合物として合成することができ、ここで複数のＴＰのうちの各々は、上述のように、１つまたは２つの切断可能な二元ペプチドまたは三元ペプチドにフランキングされている。種々の実施形態において、本明細書に記述される殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質において有用である例示的なクラスのＴＰとしては、ＣＲＩＰ ＴＰ、ＩＣＫ ＴＰ、非ＩＣＫ ＴＰ、イソギンチャクペプチド、ＴＭＯＦペプチド、及びＢｔタンパク質を挙げることができる。種々の実施形態において、本開示の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、少なくとも１つの二元または三元の切断可能リンカーペプチドと、少なくとも１つのＴＰとを含む、非天然の人工構築物である。本開示の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、化学的に合成し、組換え的に作製することができ、一部の実施形態では、酵母細胞、植物、植物組織に挿入された、または植物、植物組織、もしくは植物種子において適切な条件下で発現させたポリヌクレオチドから、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質として合成される。一部の実施形態では、本開示の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質はＥＲＳＰを含む。関連する実施形態において、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、ＥＲＳＰと、２つ以上の二元または三元の切断可能リンカーペプチドと、二元または三元の切断可能リンカーペプチドに隣接して位置付けられた１つ以上のＴＰとを含む。二元及び／または三元の切断可能リンカーペプチドとＴＰサブユニットとを含む他の多量体及びポリマーを合成してもよく、これらは本明細書に更に記述される。関連する実施形態において、二元または三元の切断可能リンカーペプチドとＴＰサブユニットとを含む多量体及びポリマーは、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質のＮ末端にＥＲＳＰを含んでもよく、安定化ドメイン（ＳＴＡ）を含んでもよい。一部の実施形態では、ＳＴＡは、ＴＰ、例えばＩＣＫ ＴＰも含み得る。（例えば、図３Ａ及び５、６Ａ及び６Ｃを参照のこと）。

本明細書で使用される「構築物」には、種々のポリペプチドユニット、例えばＥＲＳＰ、二元または三元の切断可能リンカーペプチド、ＴＰ、及びＳＴＡから構成されているポリペプチドまたはタンパク質が含まれ、これらのサブユニットの各々はインフレームで融合しており、単一のタンパク質として合成されるように作動可能である。これらの構築物は、二元または三元の切断可能リンカーペプチドまたは「リンカー」はＬ、毒性タンパク質はＴＰ、小胞体シグナルペプチドはＥＲＳＰ、そして安定化ドメインはＳＴＡと表記される短縮形で書かれる場合がある。種々の実施形態において、本発明の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、同じであっても異なっていてもよいＴＰを含み得る。加えて、一部の実施形態では、本発明の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、同じであっても異なっていてもよい二元または三元の切断可能リンカーペプチドを含み得る。種々の実施形態において、本発明の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、本明細書に開示及び例示されている殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質の種々の例に記述されているように、また、本発明の種々の構築物、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質、ならびに前出の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質の全てをコードするポリヌクレオチドによって表されるように、同じタイプのリンカーによって融合している同じタイプのＴＰを有し得る。一部の実施形態では、ＤＮＡ構築物またはポリヌクレオチドが、単一のＴＰを有するオープンリーディングフレームを含有する場合、ＴＰは、記述される他のＴＰの全てに加えてＢｔ ＴＰを含むことができる。ただし、ＤＮＡ構築物またはポリヌクレオチドが、２つ以上のＴＰを含有するオープンリーディングフレームを含有する場合、この２つ以上のＴＰがＢｔ ＴＰであることはできない。

例示的なクラスのＴＰは、システインリッチ殺虫性タンパク質（ＣＲＩＰＳ）を含む。ＣＲＩＰＳは、４つ、６つ、または８つのシステイン、及び２つ、３つ、または４つのジスルフィド結合を有する。このクラスのＴＰの一例は、インヒビターシステインノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質と呼ばれる。ＩＣＫモチーフＴＰは、特異的なＩＣＫ三次構造を形成する少なくとも６つのシステイン残基を有するタンパク質のクラスである。ＩＣＫモチーフＴＰ内のシステイン残基の共有結合による架橋はジスルフィド架橋を形成し、これにより、プロテアーゼに対して、また時には極端な物理的条件（ｐＨ、温度、ＵＶ光など）に対してタンパク質を比較的抵抗性にし、かつ昆虫に特異的であり得るイオンチャネルに対する活性を与える三次構造がもたらされる。多くのＩＣＫモチーフＴＰが、捕食動物もしくは餌食を静止させるまたは殺傷するための毒素としてＩＣＫモチーフＴＰを使用する無脊椎動物及び脊椎動物の毒液において進化してきた。そのような殺虫性ペプチドは、多くの場合サソリ、クモ、そして時にヘビの起源を有する。本質的に、毒性ペプチドは、注入によって昆虫の腸または内臓に指向され得る。本発明のＴＰの場合、ＴＰの送達は通常、植物組織で発現した殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を昆虫が摂取することによる。このように食物から毒素が摂取されると、例えば昆虫がトランスジェニック植物を採餌すると、ＩＣＫモチーフＴＰは、昆虫の成長を阻害したり、動きを損なったり、または更にはそれを殺傷したりする能力を有し得る。

ＩＣＫモチーフＴＰは、植物で発現するとその毒性を失うことが他者によって示されている。ＩＣＫモチーフＴＰは、適切にフォールディングされたタンパク質として発現しない限り、植物または作物を虫害から首尾よく保護することができない。場合によっては、植物発現ペプチドが活性となるためには、昆虫における切断によって、または発現プロセス中に活性化される必要がある。植物で発現したクモ及びサソリ由来の阻害性システインノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質については記述されている（Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．，２００６，１５：３４９−３５７、Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｃａｍｐｕｚａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｎ．２００９ Ｊａｎ；５３（１）：１２２−８）。「ＩＣＫモチーフＴＰ」、または「インヒビターシスチンノットモチーフタンパク質」は、３つのジスルフィド架橋を有する少なくとも６個のハーフシステインコアアミノ酸を含む１６〜６０アミノ酸ペプチドであり、この３つのジスルフィド架橋は共有結合であり、６個のハーフシスチン残基のうち共有結合性のジスルフィド結合は、Ｎ末端側アミノ酸から始めて６個のコアのハーフシスチンアミノ酸のうち、第１と第４、第２と第５、及び第３と第６のハーフシスチン同士の間にある。ＩＣＫモチーフＴＰは、モチーフの第４と第６のコアハーフシステイン間に位置する残基から通常はなるベータヘアピン二次構造を含み、このヘアピンは、モチーフの３つのジスルフィド結合によってもたらされる構造の架橋によって安定化されている。更なるシステイン／システインまたはハーフシスチンアミノ酸がインヒビターシステインノットモチーフ内に存在してもよいことに留意されたい。

ＩＣＫモチーフは、多数の種の毒液から単離されたペプチドによく見られる。無脊椎動物種としては、クモ、サソリ、イモガイ、イソギンチャクなどが挙げられ、他の例は多数あり、ヘビ毒でさえＩＣＫモチーフを有するペプチドを有することが知られている。ＩＣＫ ＴＰの例としては、オーストラリアブルーマウンテンジョウゴグモ由来のＡＣＴＸペプチド（例えば、Ｕ−ＡＣＴＸペプチド、オメガＡＣＴＸペプチド、またはカッパＡＣＴＸペプチド）が挙げられる。本明細書に記述される他のＩＣＫタンパク質を使用して、本明細書に記述される殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を合成してもよい。

ＩＣＫモチーフを有するＴＰの例は、次の参考文献で確認することができる。Ｎ型カルシウムチャネル遮断薬ω−コノトキシンは、Ｌｅｗ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ω−Ｃｏｎｏｔｏｘｉｎ ＧＶＩＡ”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７２，Ｎｏ．１８，Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｍａｙ ２，ｐｐ．１２０１４−１２０２３，１９９７によって概説された。様々なクモ及びサソリ種に由来する多数の節足動物毒性ペプチドの要旨は、Ｑｕｉｎｔｅｒｏ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．“Ｓｃｏｒｐｉｏｎ ａｎｄ Ｓｐｉｄｅｒ Ｖｅｎｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”Ｔｏｘｉｃｏｎ，５８，ｐｐ．６４４−６６３，２０１１において概説された。ＮＭＲ分光法を使用したハナトキシン１の三次元構造は、Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．“Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈａｎａｔｏｘｉｎ１，ａ ｇａｔｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｅｒ ｏｆ ｖｏｌｔａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｋ＋ｃｈａｎｎｅｌｓ：ｃｏｍｍｏｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｇａｔｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｅｒ ｔｏｘｉｎｓ”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２９７，Ｉｓｓｕｅ ３，３１ Ｍａｒｃｈ ２０００，ｐｐ．７７１−７８０において、インヒビターシステインノットモチーフとして特定された。サソリ毒ＩＣＫ毒素ペプチドのオピカルシン１をコードするｃＤＮＡの単離及び特定は、Ｚｈｕ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｙｓｔｉｎｅ ｋｎｏｔ ｐｅｐｔｉｄｅｓ”ＦＡＳＥＢ Ｊ．，２００３ Ｓｅｐ １７，（１２）：１７６５−７，Ｅｐｕｂ ２００３ Ｊｕｌ ３によって発表された。イソギンチャクＢｕｎｏｄｏｓｏｍａ ｇｒａｎｕｌｉｆｅｒａ由来のＫ＋チャネル遮断毒素であるＢｇＫの配列特異的割り当て及び二次構造の特定は、Ｄａｕｐｌａｉｓ，Ｍ．ｅｔ．ａｌ．“Ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｔｏｘｉｎｓ”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９７ Ｆｅｂ １４；２７２（７）：４３０２−９によって開示された。ポリペプチド毒素構造、作用形態、ならびにシステイン架橋、システインノット形成、及び「ノッティング型」フォールディングを示す分子進化に重点をおいた、クモ毒の組成及び薬理の概説は、Ｅｓｃｏｕｂａｓ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｓｐｉｄｅｒ ｖｅｎｏｍ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ”Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，Ｖｏｌ．８２，Ｉｓｓｕｅｓ ９−１０，１０ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０００，ｐｐ．８９３−９０７によって発表された。サソリ（Ｂｕｔｈｕｓ ｔａｍｕｌｕｓ）の毒液に由来するＣａ２＋活性化Ｋ＋チャネルのインヒビターである精製ペプチドのイベリオトキシンは、Ｇａｌｖｅｚ，Ａ．ｅｔ ａｌ．“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｕｎｉｑｕｅ，ｐｏｔｅｎｔ，ｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｒｏｂｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｃａｌｃｉｕｍ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ｆｒｏｍ ｖｅｎｏｍ ｏｆ ｔｈｅ ｓｃｏｒｐｉｏｎ Ｂｕｔｈｕｓ ｔａｍｕｌｕｓ”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９０ Ｊｕｌ ５；２６５（１９）：１１０８３−９０において開示された。サソリＬｅｉｕｒｕｓ ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓの毒液に由来するＣａ２＋活性化Ｋ＋チャネルのインヒビターである精製ペプチドのカリブドトキシンは、Ｇｉｍｅｎｅｚ−Ｇａｌｌｅｇｏ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ａｎｄ ｍｏｄｅｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃｈａｒｙｂｄｏｔｏｘｉｎ，ａ ｐｏｔｅｎｔ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌｓ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８８ Ｍａｙ；８５（１０）：３３２９−３３３３において開示された。当業者であれば、これら及び他の公開文献から、我々がＩＣＫモチーフＴＰ（「ＩＣＫモチーフ」、「ＩＣＫモチーフタンパク質」、及び「インヒビターシスチンノットモチーフ」と交換可能に使用される）として記述するものを有するタンパク質及びペプチドを容易に特定することができるはずである。

一部の例において、ＩＣＫモチーフＴＰは、２６〜６０のアミノ酸長を有する。一部のＩＣＫモチーフＴＰは、１６〜４８のアミノ酸長である。一部のＩＣＫモチーフＴＰは、２６〜４８のアミノ酸長である。一部のＩＣＫモチーフＴＰは、３０〜４４のアミノ酸長である。天然の殺虫活性を有するＩＣＫモチーフＴＰが好ましいが、耐塩性及び耐霜性などの他のタイプの活性を有するＩＣＫモチーフＴＰが当業者に公知であり、ここで特許請求される。ＩＣＫモチーフＴＰの例としては、ＡＣＴＸペプチド及び遺伝子が挙げられ、これらのペプチド及びＭａｇｉ６として知られるそれらのコード遺伝子の全てが含まれる。

例を提示する目的で開示され、決して限定を意図するものではない、ＩＣＫモチーフＴＰ及びペプチドの特定例は、上述のＴＰならびにそれらのホモログ及びそれらのペプチド変異形である。一部の実施形態では、いくつかの好ましいＴＰは、オーストラリアジョウゴグモの毒液を起源とする特定のペプチド及びヌクレオチドである。種々の実施形態において、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質、組成物、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質、またはそれをコードするポリヌクレオチドの調製に使用される、例示的なＴＰとしては、Ｕ−ＡＣＴＸ ＴＰ、カッパＡＣＴＸ ＴＰ、及びオメガＡＣＴＸ ＴＰ、ならびにそれをコードするポリヌクレオチドの群から選択される１つ以上のＴＰを挙げることができる。次の文書は、米国において参照によりその全体が組み込まれており、当業者に公知であり、全て公開されている。これらの文書には、多数のＩＣＫモチーフＴＰが開示されており、これらの全ペプチド配列、全ヌクレオチド配列は、明確に開示されており、かつ参照により組み込まれており、加えて、その配列表の全てを含め、全開示内容が参照により組み込まれている。次の参考文献：（全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれている）：２００８年４月８日に交付されたＵＳ７，３５４，９９３Ｂ２、特に、７，３５４，９９３Ｂ２に配列番号１〜３９として列記されているペプチド及びヌクレオチド配列、ならびにＵ−ＡＣＴＸポリペプチドと呼ばれるもの、ならびに２〜４つの鎖内ジスルフィド架橋を形成し得るこれら及び他の毒素、及びそれらの変異形、ならびに７，３５４，９９３Ｂ２の第４段〜第９段及び図２に記載のペプチドを参照のこと。他の特定の配列は、２００８年８月１０日に公開及び交付された欧州特許第１８１２４６４号Ｂ１において確認することができる。公報２００８／４１、特に、配列表に列記されているペプチド及びヌクレオチド配列、ならびに２〜４つの鎖内ジスルフィド架橋を形成し得る他の毒素、ならびに１〜３９として列記されている配列、ならびにＵ−ＡＣＴＸポリペプチドと呼ばれる配列、及びそれらの変異形、ならびに欧州特許第１８１２４６４号Ｂ１の段落００２３〜００５５及び図１に記載のペプチドを参照のこと。明確に列挙された全ての特許文献の開示内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。

殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質及びペプチドの例として本明細書に記述され、参照により組み込まれているＴＰは、次の、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ、すなわちブルーマウンテンジョウゴグモ、Ａｔｒａｘ ｒｏｂｕｓｔｕｓ、Ａｔｒａｘ ｆｏｒｍｉｄａｂｉｌｉｓ、Ａｔｒａｘ ｉｎｆｅｎｓｕｓの属種を含む、Ａｔｒａｘ属またはＨａｄｒｏｎｙｃｈｅ属のクモに見出されるか、それらから単離されるか、またはそれらに由来するペプチド及びそれらの変異形を含み、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドとして知られるＴＰを含み、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドは、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｂ、または変異体もしくは変異形、特にこれらのタイプのうちのいずれかのペプチド、そして特に、アミノ酸数約２００未満だがアミノ酸数約１０超のもの、特にアミノ酸数約１５０未満だがアミノ酸数約２０超のペプチド、特にアミノ酸数約１００未満だがアミノ酸数約２５超のペプチド、特にアミノ酸数約６５未満だがアミノ酸数約２５超のペプチド、特にアミノ酸数約５５未満だがアミノ酸数約２５超のペプチド、特にアミノ酸数約３７もしくは３９または約３６〜４２のペプチド、特にアミノ酸数約５５未満だがアミノ酸数約２５超のペプチド、特にアミノ酸数約４５未満だがアミノ酸数約３５超のペプチド、特にアミノ酸数約１１５未満だがアミノ酸数約７５超のペプチド、特にアミノ酸数約１０５未満だがアミノ酸数約８５超のペプチド、特にアミノ酸数約１００未満だがアミノ酸数約９０超のペプチドを含み、ここで述べた長さのうち任意の長さで、２つ、３つ、及びまたは４つ以上の鎖内ジスルフィド架橋を形成し得るペプチド毒素を含み、カルシウムチャネル電流を妨害する毒素を含み、カリウムチャネル電流を妨害する毒素を含み、特に昆虫のカルシウムチャネルを妨害する毒素またはそれらのＵ型（Ｕｓ）、特にこれらのタイプのいずれかの毒素またはそれらの変異形を含み、経口もしくは局所的な殺虫活性及び／または殺線虫活性を有する本明細書に記述される任意のタイプの毒素の任意の組み合わせを含み、これらは、本明細書に記述されるプロセスによって特別にすることができる。

オーストラリアジョウゴグモ、Ａｔｒａｘ属及びＨａｄｒｏｎｙｃｈｅ属に由来するＵペプチドが特に好適であり、本発明により記述される方法、手順、またはプロセスによって処置した場合に良好に機能する。そのような好適なペプチドで、試験済みでデータのあるものの例を本明細書に提示する。本発明において開示される方法による殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質としての植物発現に好適な毒性ペプチドを有するものとしては、次の種も明確に知られている。特に、次の種：Ａｔｒａｘ ｆｏｒｍｉｄａｂｉｌｌｉｓ、Ａｔｒａｘ ｉｎｆｅｎｓｕｓ、Ａｔｒａｘ ｒｏｂｕｓｔｕｓ、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｉｎｆｅｎｓａ、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａが挙げられる。上文に列記した属及び種及び／または属種のいずれかに由来し、Ｕペプチドと相同であり得るいずれのＴＰも、本発明による殺虫性及び殺線虫性タンパク質としての植物発現に好適である。本明細書に記述される種々の殺虫性及び／または殺線虫性ポリペプチド及びタンパク質に使用するのに好適な他のＴＰとしては、カッパＡＣＴＸ ＴＰ、オメガＡＣＴＸ ＴＰ、及びＵ−ＡＣＴＸ ＴＰが挙げられる。

一部の実施形態では、特定のＴＰを適切な発現ベクターにクローニングしてよく、本明細書に開示されるＥＲＳＰ及び切断可能な連結基と併せて、植物またはその一部を形質転換させるのに好適な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質にしてよい。あるいは、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を適切な賦形剤と配合して、植物または植物の一部の表面に適用してもよい。一部の実施形態では、好適なＴＰは、「Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」と呼ばれるＩＣＫモチーフＴＰ：ＱＹＣＶＰ ＶＤＱＰＣ ＳＬＮＴＱ ＰＣＣＤＤ ＡＴＣＴＱ ＥＲＮＥＮ ＧＨＴＶＹＹＣＲＡ（配列番号６）を含む場合があり、これは３〜１８位、１０〜２３位、１７〜３７位にジスルフィド架橋を有する。分子量は４４２６．８４ダルトンである。別の実施形態では、特定のＴＰを適切な発現ベクターにクローニングしてよく、本明細書に開示されるＥＲＳＰ及び切断可能な連結基と併せて、植物またはその一部を形質転換させるのに好適な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質にしてよい。あるいは、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を適切な賦形剤と配合して、植物または植物の一部の表面に適用してもよい。一部の実施形態では、好適なＴＰは、「Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」と呼ばれるＩＣＫモチーフＴＰ：ＧＳＱＹＣ ＶＰＶＤＱ ＰＣＳＬＮ ＴＱＰＣＣ ＤＤＡＴＣ ＴＱＥＲＮ ＥＮＧＨＴ ＶＹＹＣＲ Ａ（配列番号５）を含む場合があり、これは５〜２０位、１２〜２５位、１９〜３９位にジスルフィド架橋を有する。分子量は４５６４．８５ダルトンである。種々の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質、これらの殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチド及びＤＮＡ構築物、ならびにこれらの殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を含有するトランスジェニック植物または植物細胞において有用である他のＩＣＫ ＴＰは、配列番号５〜１５９３及び１７６１〜１７７５に示されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはタンパク質と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％の配列同一性または配列相同性を有するペプチドまたはタンパク質を含む。関連する実施形態において、種々の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質、これらの殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチド及びＤＮＡ構築物、ならびにこれらの殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を含有するトランスジェニック植物または植物細胞において有用であるＩＣＫ ＴＰは、配列番号５、６及び１７６１、１７６２、１７６７、１７７１〜１７７３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはタンパク質、及びそれらの変異形と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％の配列同一性または配列相同性を有するペプチドまたはタンパク質を含む。

（３Ａ）．Ｂｔ ＴＰ

一部の実施形態では、例示的なＴＰには、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）から発現した、またはそれから単離されたＴＰも含まれ得る。この普遍的なグラム陽性胞子形成菌は、胞子形成中に結晶パラ胞子封入体を合成するその能力のため、価値ある資源となる。δ内毒素と呼ばれる殺虫性タンパク質を含むこれらの結晶は、商業的利益のある昆虫有害生物に対する生物学的殺虫剤として広く使用されてきた。Ｂｔ結晶毒素としては、Ｃｒｙタンパク質（結晶毒素）及びＣｙｔタンパク質（細胞溶解性毒素）が挙げられる。Ｃｒｙ毒素は、死亡または弱体化した昆虫の幼虫における細菌の成長を可能にする重要な病原性因子である。Ｃｒｙ毒素の最大の群は、３つの明確な構造ドメインを有する。このいわゆる３ドメイン（３Ｄ）Ｃｒｙ毒素が、この概説の主眼である。Ｃｙｔ毒素は、蚊をはじめとする種々の昆虫に対するインビボ活性に加えて、インビトロの細胞溶解活性を有する［５］。ある特定のＤｉｐｔｅｒａに対する活性があり、蚊に対するＣｒｙタンパク質の毒性に相乗作用を与え、後者のＢｔタンパク質またはＢｔペプチド（本明細書では集合的にＢｔ ＴＰと呼ぶ）に対する抵抗性の発現を遅延させるＣｙｔ毒素は、植物組み込み保護剤及び葉面散布剤の両形態において作物保護のために使用される効果的な殺虫剤である。市販のＢｔタンパク質製剤は、幼虫段階で昆虫を制御するために広く使用されている。Ｂｔ Ｃｒｙ及びＣｙｔタンパク質は、Ｃｙｔに対して典型的には約１３０ｋＤａ、７０ｋＤａ、または２７ｋＤａであるプロ毒素を産生するために、昆虫の中腸における可溶化を必要とする。これらが次に中腸内プロテアーゼによりＣ末端及び／またはＮ末端においてタンパク分解性に切断され、活性化されたコア毒素が生成される。Ｃｒｙプロ毒素がタンパク分解性に活性化されると成熟型の活性毒素が産生される。Ｃｒｙプロ毒素のその活性型へのプロセシングは毒素活性に必須である。プロセシングは、プロ毒素ポリペプチドを特定の配列で切断する昆虫プロテアーゼによって媒介される。この毒素は次に囲食基質を横断し、中腸細胞の頂端膜中の受容体に結合する。受容体結合は毒素の特異性の重要な決定因子である。毒素が上皮膜に挿入されるとイオンチャネルまたはポアが形成され、細胞の溶解、中腸上皮組織の損傷、及び幼虫の死がもたらされる。Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目及びＤｉｐｔｅｒａ目における感受性種の中で主要な腸内プロテアーゼはセリン型のものであり、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａにおいて主要なプロテアーゼはシステインプロテアーゼ及びアスパラギン酸プロテアーゼであるが、一部はカテプシンＧセリンプロテアーゼを使用する。活性化は毒性を達成するために極めて重要なステップであるため、昆虫プロテアーゼのタイプ及び／または存在量が毒素特異性への寄与に重要であると示唆されている。場合によっては、ある特定の昆虫は、Ｂｔ ＴＰの活性化型または「活性」部分から不活性部分を切断する能力が欠如している。本発明は、Ｂｔ ＴＰの不活性部分と活性化型または「活性」部分との間に位置付けられた二元または三元の切断可能リンカーを有する（図３Ｂ参照）ある特定の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質、ならびに殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質の形態の複数のコピー（例えば、Ｂｔ ＴＰの不活性部分と活性部分との間に介在する切断可能リンカーが位置付けられたＢｔ ＴＰの２〜１０個のコピー）を含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質、ならびに、上記に言及されたＢｔ ＴＰならびに殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提示する。一部の実施形態では、ＤＮＡ構築物またはポリヌクレオチドが、単一のＴＰを有するオープンリーディングフレームを含有する場合、ＴＰは、記述される他のＴＰの全てに加えてＢｔ ＴＰを含むことができる。ただし、ＤＮＡ構築物またはポリヌクレオチドが、２つ以上のＴＰを含有するオープンリーディングフレームを含有する場合、この２つ以上のＴＰが２つ以上のＢｔ ＴＰであることはできない。

Ｂｔ ＴＰの特定例としては、Ｂｔタンパク質がＣｒｙまたはＣｙｔタンパク質であり、かつ／またはＢｔタンパク質が、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ３、ＴＩＣ８５１、ＣｒｙＥＴ７０、Ｃｒｙ２２、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ２０１、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、二元殺虫性タンパク質ＣｒｙＥＴ８０、及びＣｒｙＥＴ７６、二元殺虫性タンパク質ＴＩＣ１００及びＴＩＣ１０１、殺虫性タンパク質ＥＴ２９またはＥＴ３７と殺虫性タンパク質ＴＩＣ８１０またはＴＩＣ８１２との組み合わせ、ならびに二元殺虫性タンパク質ＰＳ１４９Ｂ１からなる群から選択されるペプチドを挙げることができる。Ｂｔ ＴＰは、Ｃｒｙタンパク質、Ｃｒｙ１Ａタンパク質、もしくはＣｒｙ１Ｆタンパク質、またはＣｒｙ１Ｆ−Ｃｒｙ１Ａ複合タンパク質から選択することができる。または、米国特許第７，３０４，２０６号の配列番号１０、１２、１４、２６、２８、もしくは３４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。我々は、Ｂｔ ＴＰがＤｉｐｅｌであるトランスジェニック植物について記述し、Ｂｔ ＴＰがＴｈｕｒｉｃｉｄｅであるトランスジェニック植物についても記述する。本明細書に記述される殺虫性及び／または殺線虫性ポリペプチド及びタンパク質の別の例では、Ｃｒｙ５１と呼ばれるＣｒｙ Ｂｔ ＴＰである。このＢｔ ＴＰは、米国特許第８，６０９，９３６号Ｂ２（２０１３年１２月１７日交付。その開示内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれている）に開示されている。このＣｒｙ Ｂｔ ＴＰは、ｌｙｇｕｓ属の植食性昆虫に対する殺虫性をもつ。例示されるＣｒｙ Ｂｔ ＴＰは、例えば、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質、あるいは該殺虫性及び／または殺線虫性ポリペプチド及びタンパク質を含む植物またはその植物の一部、例えば植物細胞、植物組織、または植物種子におけるＴＰとして、本発明において有用である。

種々の実施形態において、Ｂｔ ＴＰコーディング核酸配列に対応する単離された核酸分子が提示される。更に、これらのポリヌクレオチドに対応するアミノ酸配列が包含される。特に、本発明は、２００９年４月１８日に公開されたＵＳ２００９／００９９０８１（これは全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれており、番号により特定される配列は全て、参照により明確に組み込まれている）に示されているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提示する。ＵＳ２００９／００９９０８１、例えば配列番号９、１１、１３、１５、もしくは１８に開示されている種々の殺虫性ポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチド、または配列番号１、２、４、６、７、８、１０、１２、１４、１６、もしくは１７に示されているヌクレオチド配列、ならびにそれらの変異形及び断片は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。本発明のヌクレオチド配列と相補的であるか、または本発明の配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列も包含される。

本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１、２、４、６、７、８、１０、１２、１４、１６、または１７を含め、２００９年４月１８日に公開されたＵＳ２００９／００９９０８１に示されている配列を含み、ＵＳ２００９／００９９０８１に記載のそれらの変異形、断片、及び相補的ヌクレオチド配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。「相補的配列」という用語は、所与のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることにより安定な二重鎖を形成することができるように、所与のヌクレオチド配列に対して十分に相補的であるヌクレオチド配列を意図する。組成物のＴＰとして使用され得る例示的なＢｔタンパク質アミノ酸配列、トランスジェニック分子（ポリヌクレオチド及びタンパク質）は、本開示に示され、配列番号３３〜５３３として示されている。

これらのＢｔタンパク質コーディングヌクレオチド配列の断片である核酸分子も、本発明により包含される（例えば、２００９年４月１８日に公開されたＵＳ２００９／００９９０８１。これは全て参照により全体が本明細書に組み込まれており、番号により特定される配列は全て、参照によりＵＳ２００９／００９９０８１から明確に組み込まれている。ＵＳ２００９／００９９０８１に開示されているように、配列番号８は、配列番号４及び１２の断片であり、配列番号４は、配列番号２の断片である）。「断片」とは、Ｂｔタンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部分を意図する。ヌクレオチド配列の断片は、Ｂｔタンパク質の生物活性部分をコードしてもよいし、または下記に開示される方法を使用し、ハイブリダイゼーションプローブもしくはＰＣＲプライマーとして使用することができる断片であってもよい。Ｂｔタンパク質ヌクレオチド配列の断片である核酸分子は、少なくとも約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１８６０、１８７０、１８８０、１８８５個の連続したヌクレオチド、または本明細書に開示される完全長のＢｔタンパク質コーディングヌクレオチド配列に存在する数までのヌクレオチド（例えば、２００９年４月１８日に公開されたＵＳ２００９／００９９０８１では、ＵＳ２００９／００９９０８１の配列表において、ここでは配列番号１及び２として提示されるものでは１８９０個のヌクレオチド、配列番号４では１８０６個のヌクレオチド、配列番号６、７、８、及び１６では１７４３個のヌクレオチド、配列番号１０では１８０９個のヌクレオチド、そして配列番号１２及び１４では１７５２個のヌクレオチド）を含む。「連続した」ヌクレオチドとは、互いに直接隣接しているヌクレオチド残基を意図する。本発明のヌクレオチド配列の断片は、Ｂｔタンパク質の生物活性を保持し、ひいては殺有害生物活性を保持するタンパク質断片をコードする。「活性を保持する」とは、断片がＢｔタンパク質の殺有害生物活性の少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上を有することを意図する。殺有害生物活性を測定するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、Ｃｚａｐｌａ ａｎｄ Ｌａｎｇ（１９９０）Ｊ．Ｅｃｏｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．８３：２４８０−２４８５、Ａｎｄｒｅｗｓ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５２：１９９−２０６、Ｍａｒｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．ｏｆ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ ７８：２９０−２９３、及び米国特許第５，７４３，４７７号を参照のこと。これらは全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれており、番号により特定される配列は全て、参照により明確に組み込まれている。

本発明のタンパク質の生物活性部分をコードするＢｔタンパク質コーディングヌクレオチド配列の断片は、少なくとも約１５、２５、３０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、５６０、５７０、５７５、５８０、５８５、５９０、５９５、６００個の連続したアミノ酸、または本発明の完全長Ｂｔタンパク質に存在する総数までのアミノ酸（例えば、配列番号４１では５８０個のアミノ酸、配列番号４３では６０２個のアミノ酸、そして配列番号４５及び４７では５８３個のアミノ酸）をコードする。

好ましい本発明のＢｔタンパク質は、２００９年４月１８日に公開されたＵＳ２００９／００９９０８１のヌクレオチド配列（これは全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれており、番号により特定される配列は全て、参照により明確に組み込まれている）、配列１、２、４、６、７、８、１０、１２、１４、１６、または１７と十分な同一性があるヌクレオチド配列によってコードされる。「十分な同一性がある」とは、本明細書に記述されるアライメントプログラムのうちの１つを使用し、標準的なパラメータを使用して参照配列と比較した場合に、少なくとも約６０％または６５％の配列同一性、約７０％または７５％の配列同一性、約８０％または８５％の配列同一性、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸またはヌクレオチド配列を意図する。当業者には、コドンの縮退、アミノ酸の類似性、リーディングフレームの位置付けなどを考慮することによってこれらの値を適切に調節して、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定できることが認識されよう。

本発明は、変異形核酸分子も包含する（例えば、２００９年４月１８日に公開されたＵＳ２００９／００９９０８１。これは全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれており、番号により特定される配列は全て、参照により明確に組み込まれている。配列２は配列１の変異形であり、配列７及び８は配列６の変異形であり、配列１０は配列４及び１２の変異形であり、配列１４は配列１２の変異形である）。Ｂｔタンパク質コーディングヌクレオチド配列の「変異形」には、本明細書に開示されるＢｔタンパク質をコードするが、遺伝コードの縮退のため保存的に異なる配列のほか、上文で詳解したような十分な同一性があるものも含まれる。

天然に存在する対立遺伝子変異形は、下記に概説するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びハイブリダイゼーション技術といった周知の分子生物学技術の使用により特定することができる。変異形ヌクレオチド配列には、下記に詳解するように、例えば部位指向性変異誘発を使用して生成されたものだが、依然として本発明に開示されるＢｔタンパク質をコードする、合成的に誘導されたヌクレオチド配列も含まれる。本発明に包含される変異形タンパク質は、生物活性をもつ、すなわち所望される天然タンパク質の生物活性を保有し続ける、すなわち殺虫活性及び／または殺線虫活性（別称、殺有害生物活性）を保持する。「活性を保持する」とは、変異形が天然タンパク質の殺有害生物活性の少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％を有することを意図する。殺有害生物活性を測定するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、Ｃｚａｐｌａ ａｎｄ Ｌａｎｇ（１９９０）Ｊ．Ｅｃｏｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．８３：２４８０−２４８５、Ａｎｄｒｅｗｓ ｅｔ ａｌ．．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５２：１９９−２０６、Ｍａｒｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．ｏｆ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ ７８：２９０−２９３、及び米国特許第５，７４３，４７７号を参照のこと。これらは全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれており、番号により特定される配列は全て、参照により明確に組み込まれている。

本発明の一態様において、切断可能な連結分子（すなわち二元ペプチド及び三元ペプチド）を含有する殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質のデザイン及び合成に用いることができる一部のＴＰは、２００９年４月１８日に公開されたＵＳ２００９／００９９０８１（これは全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれており、番号により特定される配列は全て、参照により明確に組み込まれている）に開示されているものなどの１つ以上の合成ａｘｍｉ−００４ Ｂｔタンパク質配列（配列１）及びｓｙｎａｘｍｉ−００４Ｂ（配列２）を含み得る。これらの合成配列は、Ｕ．Ｓ．７，３５５，０９９（これは全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれており、番号により特定される配列は全て、参照により明確に組み込まれている）に挙げられたａｘｍｉ−００４配列（配列３）に対して改変されたＤＮＡ配列を有し、元のＡＸＭＩ−００４タンパク質をコードする。同様に、ｓｙｎａｘｍｉ−００４Ｂ−２Ｍ（配列４）が明示され、これは米国特許出願第１０／７８２，０２０号において最初に特定されたａｘｍｉ−００４の代替的な開始部位（本明細書ではａｘｍｉ−００４Ｂ−２Ｍと呼ばれ、配列５に示されている）をコードするものである。

可能性のあるものとして含まれる更なるＴＰは、ａｘｍｉ−００４Ｂ−３Ｍ（２００９年４月１８日に公開されたＵＳ２００９／００９９０８１。これは全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれており、番号により特定される配列は全て、参照により明確に組み込まれている。配列１６）を明示し、配列９に示されるＡＸＭＩ−００４Ｂ−３Ｍアミノ酸配列をコードする。ＡＸＭＩ−００４Ｂ−３Ｍタンパク質をコードする合成配列も明示された。これらの合成ヌクレオチド配列は、ｓｙｎａｘｍｉ−００４Ｂ−３Ｍ、ｓｙｎａｘｍｉ−００４Ｃ−３Ｍ、及びｓｙｎａｘｍｉ−００４Ｄ−３Ｍと表記され、それぞれ配列６、７、及び８に示されている。本発明の別の態様では、コード化タンパク質に更なるＮ末端側残基が付加されるような、ＡＸＭＩ−００４Ｂ−３Ｍタンパク質をコードするヌクレオチド配列の修飾バージョンがデザインされた。これらの配列は、ｓｙｎａｘｍｉ−００４Ｂ−３Ｍ−ａｌｔ１（２００９年４月１８日に公開されたＵＳ２００９／００９９０８１、配列１０）、ｓｙｎａｘｍｉ−００４Ｂ−３Ｍ−ａｌｔ２（配列１２）、ｓｙｎａｘｍｉ−００４Ｂ−３Ｍ−ａｌｔ３（配列１４）、及びｓｙｎａｘｍｉ−００４Ｂ−３Ｍ−ａｌｔ４（配列１７）と表記される。コード化タンパク質は、ＡＸＭＩ−００４Ｂ−３Ｍ−ＡＬＴ１（配列１１）、ＡＸＭＩ−００４Ｂ−３Ｍ−ＡＬＴ２（配列１３）、ＡＸＭＩ−００４Ｂ−３Ｍ−ＡＬＴ３（配列１５）、及びＡＸＭＩ−００４Ｂ−３Ｍ−ＡＬＴ４（配列１８）と表記される。

他のＢｔタンパク質及び遺伝子の説明は、以下で確認することができる。公報が参照するＢｔ毒素に関する注記と共に下記に参照される特許公報はいずれも、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。これらの文書は公開済みであり、これら及びこれらの配列はパブリックドメインである。

本発明のＢｔ遺伝子、ＴＰをコードするポリヌクレオチドとして好適なタンパク質、及びＴＰの更なる例、ならびにそれらについて記述する特許文書は、以下の表１、２、及び３に見出される。表１、２、３の特許文書、特に米国特許及び米国特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。

（ｅ）表１。Ｂｔ毒素

（ｆ）表２。ハイブリッド殺虫性結晶タンパク質及び特許

（ｇ）表３。他のハイブリッド殺虫性結晶タンパク質に関する特許

本開示の配列表は、例示的なＢｔ ＴＰアミノ酸配列である配列番号３３〜５３３を含む。これらのアミノ酸配列は、Ｂｔタンパク質の例であるＣｒｙ及びＣｙｔのタンパク質配列を含む。例は多数あり、当業者であれば、本開示におけるものの好適な代用物である種々のＢｔ配列の他の多くの例を知っているだろう。

（３Ｂ）．ＴＭＯＦ ＴＰ

一部の実施形態では、別のＴＰ源は、トリプシン調節性卵形成阻害因子（ＴＭＯＦ）ペプチドを含み得る。ＴＭＯＦペプチドは、その生理学的作用部位に種々の方法で送達される必要があり、ＴＭＯＦペプチドは、大きな可能性をもつ潜在的な殺幼虫剤として特定されている（Ｄ．Ｂｏｒｏｖｓｋｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０６，３８６９−３８７５を参照のこと。その開示内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれている）。

種々の実施形態において、例示的なＴＰとしては、ＩＣＫモチーフの長さが１６〜６０アミノ酸に及び、適切な順序における共有結合による架橋ジスルフィド結合を作り出す少なくとも６つのシステイン残基を有する、任意のポリペプチドまたはタンパク質であり得るＩＣＫモチーフＴＰが挙げられる。

種々の実施形態において、例示的なＴＰとしては、ＣＲＩＰ ＴＰ、例えばＩＣＫ ＴＰ、例えば、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチド、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｂとして知られるＴＰ、または変異体もしくは変異形、オメガＡＣＴＸポリペプチド及び変異形、ならびにカッパＡＣＴＸポリペプチド及び変異形を含む、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ、すなわちブルーマウンテンジョウゴグモ、Ａｔｒａｘ ｒｏｂｕｓｔｕｓ、Ａｔｒａｘ ｆｏｒｍｉｄａｂｉｌｉｓ、Ａｔｒａｘ ｉｎｆｅｎｓｕｓに由来する、すなわちそれらを起源とするＩＣＫ ＴＰが挙げられる。一部の実施形態では、例示的なＣＲＩＰ ＴＰとしては、非ＩＣＫ ＣＲＩＰ ＴＰ、例えば、イソギンチャク、ウニ、及びウミウシなどの非ＩＣＫ ＣＲＩＰＳを有する動物に由来する、すなわちそれらを起源とする非ＩＣＫ ＣＲＩＰ ＴＰ、及びそれらの変異形が挙げられる。例示的な一実施形態において、非ＩＣＫ ＣＲＩＰ ＴＰは、Ａｎｅｍｏｎｉａ ｖｉｒｉｄｉと呼ばれるイソギンチャクに由来するＴＰであってよく、場合により、Ａｖ２及びＡｖ３と呼ばれるＴＰ、特に、本出願の配列表に列記されているようなペプチドまたはそれらの変異体もしくは変異形を含め、Ａｖ２及びＡｖ３と同様のＴＰを含む。

他の実施形態では、本明細書に記述される組換え構築物ならびに殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質ならびに植物において使用され得る他のＴＰには、ＡＣＴＸタンパク質及び／またはＴＭＯＦタンパク質のうちの１つ以上が含まれ得る。「ＴＭＯＦモチーフ」または「ＴＭＯＦタンパク質」は、トリプシン調節性卵形成阻害因子ペプチドを含む。ＴＭＯＦ ＴＰの多数の例及び変異形が提示されている。本出願の配列番号７０８は、例示的な野生型ＴＭＯＦ配列である。配列番号７０９〜７２１には他の非限定的な変異形が提示されている。他の例は公知であるか、または当業者により当分野で知られている知識を指針として作出され得る。

（３Ｃ）．切断可能なＢｔ ＴＰ

一部の実施形態では、代表的なＢｔ毒性タンパク質（ＴＰ）としては、Ｂｔ ＴＰの活性部分と不活性部分との間に挿入された二元ペプチドまたは三元ペプチドを含む、本明細書に提示される切断可能なＢｔ ＴＰを挙げることができる。一例では、ペプチドの切断可能なプロ型の不活性部分と、ペプチドの成熟型の活性部分との間に、二元ペプチドまたは三元ペプチドが挿入される。別の例では、Ｂｔ ＴＰは、Ｂｔ ＴＰの活性部分にインフレームで融合した本発明の二元ペプチドまたは三元ペプチドにインフレームで融合している安定化ドメインを含む。別の例では、Ｂｔ ＴＰは、ｃｒｙ、ｃｙｔ、及びｖｉｐ遺伝子によってコードされる「ｃｒｙ」、「ｃｙｔ」、または「ＶＩＰ」タンパク質と書かれることが多い。Ｂｔ ＴＰは、より一般的には、ｃｒｙ遺伝子によってコードされる殺虫性結晶タンパク質に起因する。Ｂｔ ＴＰは、ＰＦＩＰＳ（ポア形成殺虫性タンパク質）の例である。種々の実施形態において、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、２つ以上の二元ペプチドまたは三元ペプチドと、１つ以上の二元ペプチド及び／または三元ペプチドにインフレームで融合した少なくとも１つのＢｔ ＴＰとを含むタンパク質を含み得る。一部の実施形態では、摂取され腸または血リンパ環境に曝露されると殺虫性及び／または殺線虫性の組成物をもたらす有用な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、上述のようにＢｔ ＴＰ及び／または切断可能なＢｔ ＴＰを含有し、また本明細書に更に例示されるように、ＴＰの切断可能なプロ型（不活性）部分とＴＰの成熟型（活性）部分との間に挿入された二元ペプチドまたは三元ペプチドを含有する場合がある。

例えば、Ｂｔ ＴＰの切断可能なプロ型の不活性部分と、Ｂｔ ＴＰの成熟型の活性部分との間に挿入された二元ペプチドまたは三元ペプチドは、摂取され昆虫または線虫の腸内プロテアーゼに接触すると切断可能なＢｔ ＴＰが切断される、切断可能なＢｔ ＴＰをもたらす（図３Ｂ参照）。一部の実施形態では、切断可能及び／または切断不可能なＢｔ ＴＰを含有する殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、植物またはその一部に形質転換された場合、あるいは植物の表面に直接適用された場合、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質が摂取され標的の昆虫及び／または線虫の腸及び／または血リンパ環境に曝露されたときに殺虫活性及び／または殺線虫活性をもたらす、ＤＮＡ構築物によってコードされ得る。

本明細書において記述され、特定されたＴＰを参照することにより組み込まれるものには、上文に述べたＴＰアミノ酸配列の変異形または変異体ペプチド及びタンパク質、特に、配列番号５〜１５９３及び１７６１〜１７７５に示されるアミノ酸配列を有し、かかる配列または本明細書で参照されるものと相同性または配列同一性を有するペプチド及びタンパク質（これらはまた、本明細書に記述されるプロセスに従って特別にするために好適なものとして特定及び特許請求される）があり、これには、ここに開示される配列のいずれかまたは参照により組み込まれる任意の配列に対して、少なくとも次の同一性パーセントのうちのいずれか、すなわち、上記の特許において特定されるあらゆる配列、及び本出願の配列表におけるあらゆる配列を含め、本明細書において特定される任意の他の配列に対して、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％以上のアミノ酸配列同一性または１００％のアミノ酸配列同一性を有する、全ての相同配列が含まれる。相同または相同性という用語が本明細書において５０％以上などの数と共に使用される場合、これが意味するのは、２つのペプチド間の同一性パーセントまたは類似性パーセントである。相同または相同性が数字のパーセントなしで使用されている場合は、局所毒性及び同様のサイズのような共通の物理的及び機能的側面をもつという点で進化的または発生的側面において密接に関連している２つのペプチド配列を指す（すなわち、ホモログは、本明細書において明確に述べられる、または上記のように本明細書において参照することにより特定されるペプチドよりも１００％長い長さまたは５０％短い長さに含まれる）。本発明のＴＰは、本明細書において明確に開示または記述されているＴＰの変異形も含む。「変異形」という用語は、改変、すなわち置換、挿入、及び／または欠失を１つ以上の（例えばいくつかの）位置に含む、殺虫活性及び／または殺線虫活性を有するポリペプチドまたはタンパク質を意味する。置換とは、ある位置を占めるアミノ酸を異なるアミノ酸で置き換えることを意味し、欠失とは、ある位置を占めるアミノ酸を除去することを意味し、挿入とは、ある位置を占めるアミノ酸に隣接してその直後にアミノ酸を付加することを意味する。本発明のＴＰ変異形は、配列番号５〜１５９３及び１７６１〜１７７５のポリペプチド及びタンパク質、ならびに本明細書において開示される他の明確に特定されたＴＰの殺虫活性及び／または殺線虫活性の少なくとも２０％、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％を有する。本発明の変異形は、配列番号５〜１５９３及び１７６１〜１７７５のいずれか１つのポリペプチドまたはタンパク質の殺虫活性及び／または殺線虫活性の少なくとも２０％、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％を有する。

ＴＰには、変異型ＴＰをコードするポリヌクレオチドが転写及び／または翻訳されたとき、発現した変異型ＴＰペプチドまたはタンパク質が、対応する非変異型ＴＰポリヌクレオチドによってコードされるペプチドまたはタンパク質の殺虫活性及び／または殺線虫活性の少なくとも９０％、または８０％、または７０％、または６０％、または５０％である殺虫活性及び／または殺線虫活性を保持するような、１つ以上の点変異、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上の点変異を有するポリヌクレオチドによってコードされる変異形ＴＰペプチド及びタンパク質も含まれ得る。本発明のＴＰには、配列番号５〜１５９３及び１７６１〜１７７５に開示されている任意のＴＰと少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、更に、配列番号５〜１５９３及び１７６１〜１７７５に示される対応するＴＰの殺虫活性及び／または殺線虫活性の少なくとも９５％、または９０％、または８０％、または７０％、または６０％、または５０％を保持する、ＴＰペプチド及びタンパク質も含まれ得る。

変異形ＴＰは更に、１つ以上の更なる置換を１つ以上の（例えばいくつかの）他の位置に含んでもよい。アミノ酸変化は、軽度の性質のもの、すなわちペプチドまたはタンパク質のフォールディング及び／または活性に著しく影響しない保存的アミノ酸置換または挿入；典型的には１〜３０アミノ酸の小さな欠失；わずかなアミノ末端側またはカルボキシル末端側の伸長、例えばアミノ末端側メチオニン残基；あるいは、正味電荷を変化させること、またはポリヒスチジントラクト、抗原性エピトープ、もしくは結合ドメインなどの別の機能によって精製を容易にするわずかな伸長であり得る。保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、及び小型アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン及びメチオニン）の群におけるものである。概して比活性を改変しないアミノ酸置換は当技術分野において公知であり、例えば、Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ ａｎｄ Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，１９７９，Ｉｎ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋによって記述されている。一般的な置換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、及びＡｓｐ／Ｇｌｙである。代替的に、アミノ酸変化は、ポリペプチドの物理化学的特性が改変されるような性質のものである。例えば、アミノ酸変化は、ポリペプチドの熱安定性を改善したり、基質特異性を改変したり、最適ｐＨを変化させたりする場合がある。

ペプチドまたはタンパク質における必須アミノ酸は、部位指向性変異誘発またはアラニン走査変異誘発などの当技術分野で公知の手順に従って特定することができる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５）。後者の技術では、分子内のすべての残基において単一のアラニン変異を導入し、結果として生じる変異体分子の殺虫活性または殺線虫活性を試験して、分子の活性に重要であるアミノ酸残基を特定する。Ｈｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９−４７０８も参照のこと。殺虫性及び／または殺線虫性ペプチドまたはタンパク質の活性部位、または他の生物学的相互作用は、推定上の接触部位のアミノ酸の変異と併せて、核磁気共鳴、結晶学、電子回折、または光親和性標識などの技術によって判定される、構造の物理的解析によって判定することもできる。例えば、ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４、Ｗｌｏｄａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３０９：５９−６４を参照のこと。必須アミノ酸の同一性は、本明細書において開示され、かつ／または配列番号５〜１５９３及び１７６１〜１７７５に示される、関連するＴＰペプチドまたはタンパク質とのアライメントから推測することもできる。

本発明のＴＰには、本明細書に記述される任意のＴＰ、例えば配列番号５〜１５９３及び１７６１〜１７７５に示されるアミノ酸配列を有するＴＰのＮ末端またはＣ末端または両末端に１〜６個のアミノ酸伸長がインフレームで融合したＴＰペプチド及びタンパク質も含まれ得る。変異形は、部位指向性変異誘発、合成遺伝子構築、半合成遺伝子構築、ランダム変異誘発、シャッフリングなど、当技術分野で公知の任意の変異誘発手順を使用して調製され得る。

部位指向性変異誘発とは、親をコードするポリヌクレオチドにおける１つ以上の規定の部位において、１つ以上の（例えばいくつかの）変異が導入される技術である。部位指向性変異誘発は、所望の変異を含有するオリゴヌクレオチドプライマーの使用を伴うＰＣＲによってインビトロで達成され得る。部位指向性変異誘発は、親をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド内の部位を制限酵素によって切断し、その後、ポリヌクレオチドにおいて変異を含有するオリゴヌクレオチドのライゲーションを行うことを含むカセット変異誘発によって、インビトロで行うこともできる。通常、プラスミド及びオリゴヌクレオチドを消化する制限酵素は同じであり、プラスミドの粘着末端及びインサートが互いにライゲートすることが可能である。例えば、Ｓｃｈｅｒｅｒ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：４９４９−４９５５、及びＢａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：７３４９−４９６６を参照のこと。部位指向性変異誘発は、当技術分野で公知の方法によってインビボで達成することもできる。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１１５４号、Ｓｔｏｒｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：７７３−７７６、Ｋｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：２８５−２９０、及びＣａｌｉｓｓａｎｏ ａｎｄ Ｍａｃｉｎｏ，１９９６，Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ．Ｎｅｗｓｌｅｔｔ．４３：１５−１６を参照のこと。本発明では、任意の部位指向性変異誘発の手順を使用してよい。本発明の変異形ＴＰを調製するために使用され得る多くのキットが市販されている。

合成遺伝子構築は、目的のポリペプチドをコードするようにデザインされたポリヌクレオチド分子のインビトロ合成を必要とする。遺伝子合成は、Ｔｉａｎら（２００４，Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１０５０−１０５４）によって記述されたマルチプレックスマイクロチップベースの技術、及びオリゴヌクレオチドを合成し光プログラム可能なマイクロ流体チップ上でアセンブルする同様の技術など、いくつかの技術を利用して行うことができる。

公知の変異誘発法、組換え法、及び／またはシャッフリング法に続いて、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５３−５７、Ｂｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２１５２−２１５６、ＷＯ９５／１７４１３、またはＷＯ９５／２２６２５に開示されているものなどの関連するスクリーニング手順を使用することで、単一もしくは複数のアミノ酸置換、欠失、及び／または挿入を作製し、試験することができる。使用され得る他の方法としては、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０８３２−１０８３７、米国特許第５，２２３，４０９号、ＷＯ９２／０６２０４）、及び領域指向性変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ ４６：１４５、Ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ ７：１２７）が挙げられる。

変異誘発／シャッフリング法をハイスループットの自動化スクリーニング法と組み合わせると、宿主細胞により発現させたクローン化変異誘発ポリペプチドの活性を検出することができる（Ｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：８９３−８９６）。活性ポリペプチドをコードする変異誘発ＤＮＡ分子を宿主細胞から回収し、当技術分野で標準的な方法を使用して高速シーケンシングを行ってもよい。これらの方法により、ペプチドまたはタンパク質内の個々のアミノ酸残基の重要性を迅速に判定することができる。

半合成遺伝子構築は、合成遺伝子構築、及び／または部位指向性変異誘発、及び／またはランダム変異誘発、及び／またはシャッフリングの態様を組み合わせることによって達成される。半合成構築は、合成されたポリヌクレオチド断片をＰＣＲ技術と組み合わせて利用するプロセスに代表される。したがって、遺伝子のうち規定の領域は、デノボ合成することができ、他の領域は、部位特異的変異原性プライマーを使用して増幅させることができ、更に他の領域は、エラープローンＰＣＲまたは非エラープローンＰＣＲ増幅に供することができる。その後、ポリヌクレオチドのサブ配列がシャッフルされ得る。

殺虫性及び／または殺線虫性ペプチド、タンパク質、かかる殺虫性及び／または殺線虫性ペプチド及びタンパク質をコードするポリヌクレオチド、かかる殺虫性及び／または殺線虫性ペプチド及びタンパク質をコードするＤＮＡ構築物、かかる殺虫性及び／または殺線虫性ペプチド及びタンパク質を含有するトランスジェニック植物またはその一部、ならびに有害生物の感染または寄生を制御するための方法、及びかかる殺虫性及び／または殺線虫性ペプチド及びタンパク質を組み込んだ作物の収量を増加させるための方法について記述する目的において、本発明のＴＰは、ＴＰまたは毒性ペプチドの定義において上述したように、変異形及び変異体及び変異型ＴＰも包含する（その定義に含む）。種々の実施形態において、本明細書に明確に記述されるＴＰには、配列番号５〜１５９３及び１７６１〜１７７５に示されるアミノ酸配列を有する任意のＴＰ、本明細書に明確に記述されるいずれかの特許または非特許参考文献に挙げられている任意のＴＰ、及びそれらの任意の変異形もしくは変異体もしくは変異型ペプチドまたはタンパク質が含まれる。種々の実施形態において、本明細書に記述される殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、配列番号５、６及び１７６１、１７６２、１７６７、１７７１〜１７７３に示されるアミノ酸配列を有するペプチド、及びそれらの変異形と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％の配列同一性または配列相同性を有するＴＰを含む。

（４）．組換え殺虫性及び殺線虫性ペプチドＤＮＡ組成物

種々の実施形態において、本発明は、殺虫性及び殺線虫性ポリペプチド、タンパク質、ならびにかかるポリペプチド及びタンパク質をコードするＤＮＡ構築物及びポリヌクレオチドを提示する。かかる殺虫性及び殺線虫性ポリペプチド及びタンパク質をコードするＤＮＡ構築物は、１つの長い融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する単一のポリヌクレオチドを包含する場合もあれば、本明細書に記述されるように、ベクターにおいて供給されると、かかる殺虫性及び殺線虫性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの転写を可能にする、いくつかのポリヌクレオチドを包含する場合もある。ＤＮＡ構築物は、ＤＮＡ構築物またはその一部分が宿主細胞内で効率的に転写及び翻訳されることを可能にする、プロモーター、終結配列、エンハンサー、及び抗生物質抵抗性遺伝子などの必要な調節エレメントを含有していてもよい。一部の実施形態では、本発明のＤＮＡ構築物は、作動可能なプロモーター（例えば同種または異種プロモーター）に作動可能に連結したポリヌクレオチドを含んでもよく、このポリヌクレオチドは、二元ペプチドまたは三元ペプチドのいずれかを含む殺虫性及び／または殺線虫性ペプチドをコードし、二元ペプチドまたは三元ペプチドは、少なくとも４個のアミノ酸から最大１６個までのアミノ酸を含有し、かつ２つまたは３つの異なる領域からなり、二元ペプチドは、２つの異なる領域を有し、三元ペプチドは、３つの異なる領域を有する。二元ペプチドまたは三元ペプチドは、動物の腸内プロテアーゼならびに昆虫及び／または線虫の腸内プロテアーゼの両方によって切断可能である。種々の実施形態において、二元ペプチドまたは三元ペプチドは、本明細書に記述される小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）のＣ末端に作動可能に融合（すなわち、インフレームで融合）しており、かつ、ＴＰ（例えばＣＲＩＰ ＴＰ）のＮ末端に作動可能に融合している。（例えば、図４〜６Ｃを参照のこと）。上記に関連する実施形態において、組換え殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質の製造において有用なＴＰは、１つ以上のＩＣＫ ＴＰ、例えば、Ａｔｒａｃｉｎａｅ亜科に属するオーストラリアジョウゴグモから単離された殺虫性ＩＣＫペプチドの「ＡＣＴＸ」または「ＡＣＴＸペプチド」ファミリーから選択されるＴＰ、例えば、オメガＡＣＴＸ ＴＰ、カッパＡＣＴＸ ＴＰ、及びＵ−ＡＣＴＸ ＴＰ、例えば、Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｂから選択される１つ以上のＴＰ、または配列番号５、６及び１７６１、１７６２、１７６７、１７７１〜１７７３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドもしくはタンパク質、及びそれらの変異形と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％の配列同一性または配列相同性を有するＴＰを含んでよく（このＴＰは、１つより多い場合、同じであっても異なっていてもよい）、各殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、二元ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または両末端のいずれかにおいて、ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、ＭＶ、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、もしくはＤＴの群から選択されるか、またはこれらからなるＺ領域またはスペーサー配列にインフレームで融合した、ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、またはＬＦＡＡＰＦから選択される二元ペプチドのアミノ酸配列を含み得る、１つ以上の三元ペプチド（上文でＬと表記したもの）を更に含む。

（４Ａ）．殺虫性及び殺線虫性トランスジェニックタンパク質をコードするＤＮＡ構築物

種々の実施形態において、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードする例示的なＤＮＡ構築物は、ＤＮＡ構築物を導入しようとする種のためにコドン最適化してよい。例えば、ＤＮＡ構築物を植物に形質転換させる場合、ＤＮＡ構築物は、植物細胞における発現及び複製のためにコドン最適化してよい。

一部の実施形態では、ＤＮＡ構築物は、アミノ酸配列：Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４［式中、各Ｘ_ｎ及び各Ｙ_ｎはアミノ酸であり、各Ｘｎ及び各Ｙｎはアミノ酸であり、Ｘ_１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、及びＶからなる群から選択され、Ｘ_２は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ_４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｙ_１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ_２は、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ_４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される］を含む二元ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

一部の実施形態では、例示的なＤＮＡ構築物は、１つ以上の例示的な二元ペプチド（ＸＹまたはＹＸ）を含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードし得る。一部の実施形態では、例示的なＤＮＡ構築物は、次のアミノ酸配列：ＡＦＶＲＬＦ（配列番号１５９４）、ＡＫＬＦＶ（配列番号１５９５）、ＡＬＦＡＬＫ（配列番号１５９６）、ＡＬＦＬＫ（配列番号１５９７）、ＡＬＦＬＲ（配列番号１５９８）、ＡＬＦＲ（配列番号１５９９）、ＡＬＦＲＬＲ（配列番号１６００）、ＡＬＫＡＬＦ（配列番号１６０１）、ＡＬＫＦＦ（配列番号１６０２）、ＡＬＫＦＬＶ（配列番号１６０３）、ＡＬＫＩＦＶ（配列番号１６０４）、ＡＬＫＬＦＶ（配列番号１６０５）、ＦＦＡＤＩＫ（配列番号１６０６）、ＦＦＡＬＫ（配列番号１６０７）、ＦＦＬＫ（配列番号１６０８）、ＦＦＬＲ（配列番号１６０９）、ＦＦＲＬＲ（配列番号１６１０）、ＦＧＹＲＩＫ（配列番号１６１１）、ＦＬＲＬＦ（配列番号１６１２）、ＦＹＡＲＲ（配列番号１６１３）、ＧＧＬＲＫＫ（配列番号１６１４）、ＩＦＶＡＬＫ（配列番号１６１５）、ＩＦＶＬＫ（配列番号１６１６）、ＩＦＶＬＲ（配列番号１６１７）、ＩＦＶＲ（配列番号１６１８）、ＩＦＶＲＬＲ（配列番号１６１９）、ＩＬＦＮＩＫ（配列番号１６２０）、ＬＦＡＡＰＦ（配列番号１６２１）、ＦＶＡＬＫ（配列番号１６２２）、ＬＦＶＬＫ（配列番号１６２３）、ＬＦＶＬＲ（配列番号１６２４）、ＬＦＶＲ（配列番号１６２５）、ＬＦＶＲＬＲ（配列番号１６２６）、ＬＦＶＲＶＦＬ（配列番号１６２７）、ＬＧＥＲ（配列番号１６２８）、ＬＫＡＬＦ（配列番号１６２９）、ＬＫＦＦ（配列番号１６３０）、ＬＫＩＦＶ（配列番号１６３１）、ＬＫＬＦＶ（配列番号１６３２）、ＬＲＡＬＦ（配列番号１６３３）、ＬＲＦＦ（配列番号１６３４）、ＬＲＩＦＶ（配列番号１６３５）、ＬＲＬＦＶ（配列番号１６３６）、ＲＡＬＦ（配列番号１６３７）、ＲＩＦＶ（配列番号１６３８）、ＲＬＦＶ（配列番号１６３９）、ＲＬＲＡＬＦ（配列番号１６４０）、ＲＬＲＦＦ（配列番号１６４１）、ＲＬＲＩＦＶ（配列番号１６４２）、ＲＬＲＬＦＶ（配列番号１６４３）、ＲＲＫＡＦＶ（配列番号１６４４）、ＲＲＫＬＩＦ（配列番号１６４５）、ＲＲＲＦＦＡ（配列番号１６４６）、ＶＦＧＲＫＧ（配列番号１６４７）、及びＹＦＶＲＫ（配列番号１６４８）を有する切断可能な二元ペプチドを含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードし得る。

種々の実施形態において、例示的なＤＮＡ構築物は、次のアミノ酸配列構築物：Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、
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Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、
Ｚ_１−Ｚ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４［式中、Ｘ_１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、及びＶからなる群から選択され、Ｘ_２は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ_４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｙ_１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ_２は、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ_４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される］を有する切断可能な三元ペプチドを含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードし得る。

関連する実施形態において、Ｘ領域及びＹ領域を含む切断可能な二元リンカーペプチド（Ｌ）は上述されており、上述のＸ領域及び／またはＹ領域に（Ｘ領域もしくはＹ領域のＮ末端側配列、またはＸ領域もしくはＹ領域のＣ末端側配列のいずれかに）インフレームで融合していてよい例示的なＺ領域（１〜４アミノ酸配列、例えば２アミノ酸配列）が、三元の切断可能な連結ペプチドを形成する。例示的なＺまたはスペーサーアミノ酸配列は、ＡＡ、ＡＦ、ＡＭ、ＡＮ、ＡＱ、ＡＶ、ＡＷ、ＡＹ、ＤＡ、ＤＤ、ＤＥ、ＤＦ、ＤＧ、ＤＩ、ＤＬ、ＤＰ、ＤＳ、ＤＴ、ＤＶ、ＤＷ、ＤＹ、ＥＡ、ＥＤ、ＥＥ、ＥＦ、ＥＧ、ＥＩ、ＥＬ、ＥＰ、ＥＳ、ＥＴ、ＥＶ、ＥＷ、ＥＹ、ＦＡ、ＦＤ、ＦＥ、ＦＦ、ＦＩ、ＦＫ、ＦＬ、ＦＭ、ＦＮ、ＦＱ、ＦＲ、ＦＳ、ＦＴ、ＦＶ、ＦＷ、ＦＹ、ＧＡ、ＧＤ、ＧＥ、ＧＦ、ＧＩ、ＧＬ、ＧＭ、ＧＮ、ＧＱ、ＧＳ、ＧＶ、ＧＷ、ＧＹ、ＨＡ、ＨＤ、ＨＥ、ＨＦ、ＨＨ、ＨＩ、ＨＫ、ＨＬ、ＨＮ、ＨＰ、ＨＱ、ＨＲ、ＨＳ、ＨＴ、ＨＶ、ＨＹ、ＩＡ、ＩＤ、ＩＥ、ＩＧ、ＩＨ、ＩＩ、ＩＫ、ＩＬ、ＩＭ、ＩＮ、ＩＰ、ＩＱ、ＩＲ、ＩＳ、ＩＴ、ＩＶ、ＩＷ、ＫＡ、ＫＤ、ＫＥ、ＫＦ、ＫＩ、ＫＬ、ＫＮ、ＫＱ、ＫＶ、ＫＹ、ＬＡ、ＬＤ、ＬＥ、ＬＧ、ＬＨ、ＬＩ、ＬＫ、ＬＬ、ＬＭ、ＬＮ、ＬＰ、ＬＱ、ＬＲ、ＬＳ、ＬＴ、ＬＶ、ＬＷ、ＭＡ、ＭＦ、ＭＧ、ＭＩ、ＭＫ、ＭＬ、ＭＭ、ＭＮ、ＭＱ、ＭＲ、ＭＳ、ＭＴ、ＭＶ、ＭＹ、ＮＡ、ＮＤ、ＮＥ、ＮＦ、ＮＩ、ＮＬ、ＮＭ、ＮＮ、ＮＱ、ＮＳ、ＮＴ、ＮＶ、ＮＹ、ＱＡ、ＱＤ、ＱＥ、ＱＦ、ＱＩ、ＱＬ、ＱＭ、ＱＮ、ＱＱ、ＱＳ、ＱＴ、ＱＶ、ＱＹ、ＲＡ、ＲＤ、ＲＥ、ＲＦ、ＲＩ、ＲＬ、ＲＮ、ＲＱ、ＲＶ、ＲＹ、ＳＡ、ＳＦ、ＳＧ、ＳＫ、ＳＮ、ＳＰ、ＳＱ、ＳＲ、ＳＳ、ＳＴ、ＳＶ、ＳＷ、ＳＹ、ＴＡ、ＴＦ、ＴＧ、ＴＫ、ＴＮ、ＴＰ、ＴＱ、ＴＲ、ＴＳ、ＴＴ、ＴＶ、ＴＷ、ＴＹ、ＶＡ、ＶＦ、ＶＭ、ＶＮ、ＶＱ、ＶＶ、ＶＷ、ＶＹ、ＷＡ、ＷＦ、ＷＩ、ＷＫ、ＷＬ、ＷＮ、ＷＰ、ＷＱ、ＷＲ、ＷＳ、ＷＴ、ＷＶ、ＷＷ、ＷＹ、ＹＡ、ＹＤ、ＹＥ、ＹＦ、ＹＩ、ＹＫ、ＹＬ、ＹＭ、ＹＮ、ＹＱ、ＹＲ、ＹＳ、ＹＴ、ＹＶ、ＹＷ、またはＹＹを含み得る。例示的な実施形態において、個々の本発明の三元ペプチドは、上記に開示された例示的な二元ペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端にインフレームで融合した２アミノ酸配列を含んでいてよく、この２アミノ酸配列は、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、またはＤＴである。

例示的な実施形態において、個々の本発明の三元ペプチドは、上記に開示された例示的な二元ペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端にインフレームで融合した２アミノ酸配列を含んでいてよく、この２アミノ酸配列は、ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、またはＭＶである。

一部の実施形態では、三元ペプチドのスペーサー部分（Ｚ領域）は、アミノ酸配列ＧＳを含み、これは二元ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端または両方にインフレームで融合していてよい。

種々の実施形態において、殺虫性及び／または殺線虫性ポリペプチド及びタンパク質、殺虫性及び／または殺線虫性ポリペプチド及びタンパク質をコードするＤＮＡ構築物及びポリヌクレオチドに使用され、また、トランスジェニック植物またはその一部に組み込まれる、本発明の例示的な二元ペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、または両末端のいずれかにおいて、ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、ＭＶ、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、もしくはＤＴの群から選択されるか、またはこれらからなるＺ領域またはスペーサー配列にインフレームで融合した、ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、もしくはＬＦＡＡＰＦから選択される二元ペプチドの群から選択されるか、またはこれらからなる、１つ以上の切断可能な三元ペプチドを含み得る。

一部の実施形態では、例示的なＤＮＡ構築物は、次の例示的なアミノ酸配列（ＺＸＹまたはＸＹＺ）：ＡＦＶＲＬＦＧＳ（配列番号１６４９）、ＡＫＬＦＶＧＳ（配列番号１６５０）、ＡＬＦＡＬＫＧＳ（配列番号１６５１）、ＡＬＦＬＫＧＳ（配列番号１６５２）、ＡＬＦＬＲＧＳ（配列番号１６５３）、ＡＬＦＲＧＳ（配列番号１６５４）、ＡＬＦＲＬＲＧＳ（配列番号１６５５）、ＡＬＫＡＬＦＧＳ（配列番号１６５６）、ＡＬＫＦＦＧＳ（配列番号１６５７）、ＡＬＫＦＬＶＧＳ（配列番号１６５８）、ＡＬＫＩＦＶＧＳ（配列番号１６５９）、ＡＬＫＬＦＶＧＳ（配列番号１６６０）、ＦＦＡＤＩＫＧＳ（配列番号１６６１）、ＦＦＡＬＫＧＳ（配列番号１６６２）、ＦＦＬＫＧＳ（配列番号１６６３）、ＦＦＬＲＧＳ（配列番号１６６４）、ＦＦＲＬＲＧＳ（配列番号１６６５）、ＦＧＹＲＩＫＧＳ（配列番号１６６６）、ＦＬＲＬＦＧＳ（配列番号１６６７）、ＦＹＡＲＲＧＳ（配列番号１６６８）、ＧＧＬＲＫＫＧＳ（配列番号１６６９）、ＩＦＶＡＬＫＧＳ（配列番号１６７０）、ＩＦＶＬＫＧＳ（配列番号１６７１）、ＩＦＶＬＲＧＳ（配列番号１６７２）、ＩＦＶＲＧＳ（配列番号１６７３）、ＩＦＶＲＬＲＧＳ（配列番号１６７４）、ＩＬＦＮＩＫＧＳ（配列番号１６７５）、ＬＦＡＡＰＦＧＳ（配列番号１６７６）、ＬＦＶＡＬＫＧＳ（配列番号１６７７）、ＬＦＶＬＫＧＳ（配列番号１６７８）、ＬＦＶＬＲＧＳ（配列番号１６７９）、ＬＦＶＲＧＳ（配列番号１６８０）、ＬＦＶＲＬＲＧＳ（配列番号１６８１）、ＬＦＶＲＶＦＬＧＳ（配列番号１６８２）、ＬＧＥＲＧＳ（配列番号１６８３）、ＬＫＡＬＦＧＳ（配列番号１６８４）、ＬＫＦＦＧＳ（配列番号１６８５）、ＬＫＩＦＶＧＳ（配列番号１６８６）、ＬＫＬＦＶＧＳ（配列番号１６８７）、ＬＲＡＬＦＧＳ（配列番号１６８８）、
ＬＲＦＦＧＳ（配列番号１６８９）、ＬＲＩＦＶＧＳ（配列番号１６９０）、ＬＲＬＦＶＧＳ（配列番号１６９１）、ＲＡＬＦＧＳ（配列番号１６９２）、ＲＩＦＶＧＳ（配列番号１６９３）、ＲＬＦＶＧＳ（配列番号１６９４）、ＲＬＲＡＬＦＧＳ（配列番号１６９５）、ＲＬＲＦＦＧＳ（配列番号１６９６）、ＲＬＲＩＦＶＧＳ（配列番号１６９７）、ＲＬＲＬＦＶＧＳ（配列番号１６９８）、ＲＲＫＡＦＶＧＳ（配列番号１６９９）、ＲＲＫＬＩＦＧＳ（配列番号１７００）、ＲＲＲＦＦＡＧＳ（配列番号１７０１）、ＶＦＧＲＫＧＧＳ（配列番号１７０２）、ＹＦＶＲＫＧＳ（配列番号１７０３）、ＧＳＡＦＶＲＬＦ（配列番号１７０４）、ＧＳＡＫＬＦＶ（配列番号１７０５）、ＧＳＡＬＦＡＬＫ（配列番号１７０６）、ＧＳＡＬＦＬＫ（配列番号１７０７）、ＧＳＡＬＦＬＲ（配列番号１７０８）、ＧＳＡＬＦＲ（配列番号１７０９）、ＧＳＡＬＦＲＬＲ（配列番号１７１０）、ＧＳＡＬＫＡＬＦ（配列番号１７１１）、ＧＳＡＬＫＦＦ（配列番号１７１２）、ＧＳＡＬＫＦＬＶ（配列番号１７１３）、ＧＳＡＬＫＩＦＶ（配列番号１７１４）、ＧＳＡＬＫＬＦＶ（配列番号１７１５）、ＧＳＦＦＡＤＩＫ（配列番号１７１６）、ＧＳＦＦＡＬＫ（配列番号１７１７）、ＧＳＦＦＬＫ（配列番号１７１８）、ＧＳＦＦＬＲ（配列番号１７１９）、ＧＳＦＦＲＬＲ（配列番号１７２０）、ＧＳＦＧＹＲＩＫ（配列番号１７２１）、ＧＳＦＬＲＬＦ（配列番号１７２２）、ＧＳＦＹＡＲＲ（配列番号１７２３）、ＧＳＧＧＬＲＫＫ（配列番号１７２４）、ＧＳＩＦＶＡＬＫ（配列番号１７２５）、ＧＳＩＦＶＬＫ（配列番号１７２６）、ＧＳＩＦＶＬＲ（配列番号１７２７）、ＧＳＩＦＶＲ（配列番号１７２８）、ＧＳＩＦＶＲＬＲ（配列番号１７２９）、ＧＳＩＬＦＮＩＫ（配列番号１７３０）、ＧＳＬＦＡＡＰＦ（配列番号１７３１）、ＧＳＬＦＶＡＬＫ（配列番号１７３２）、ＧＳＬＦＶＬＫ（配列番号１７３３）、ＧＳＬＦＶＬＲ（配列番号１７３４）、ＧＳＬＦＶＲ（配列番号１７３５）、ＧＳＬＦＶＲＬＲ（配列番号１７３６）、ＧＳＬＦＶＲＶＦＬ（配列番号１７３７）、ＧＳＬＧＥＲ（配列番号１７３８）、ＧＳＬＫＡＬＦ（配列番号１７３９）、ＧＳＬＫＦＦ（配列番号１７４０）、ＧＳＬＫＩＦＶ（配列番号１７４１）、ＧＳＬＫＬＦＶ（配列番号１７４２）、ＧＳＬＲＡＬＦ（配列番号１７４３）、ＧＳＬＲＦＦ（配列番号１７４４）、ＧＳＬＲＩＦＶ（配列番号１７４５）、ＧＳＬＲＬＦＶ（配列番号１７４６）、ＧＳＲＡＬＦ（配列番号１７４７）、ＧＳＲＩＦＶ（配列番号１７４８）、ＧＳＲＬＦＶ（配列番号１７４９）、ＧＳＲＬＲＡＬＦ（配列番号１７５０）、ＧＳＲＬＲＦＦ（配列番号１７５１）、ＧＳＲＬＲＩＦＶ（配列番号１７５２）、ＧＳＲＬＲＬＦＶ（配列番号１７５３）、ＧＳＲＲＫＡＦＶ（配列番号１７５４）、ＧＳＲＲＫＬＩＦ（配列番号１７５５）、ＧＳＲＲＲＦＦＡ（配列番号１７５６）、ＧＳＶＦＧＲＫＧ（配列番号１７５７）、及びＧＳＹＦＶＲＫ（配列番号１７５８）のうちの１つ以上を有する切断可能な三元ペプチドを含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードし得る。

種々の実施形態において、ＤＮＡ構築物は、二元ペプチドのＮ末端及び／または二元ペプチドのＣ末端にスペーサーが付加された、二元ペプチドのアミノ酸配列を有する三元ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、ここでスペーサーは、１〜４個のアミノ酸、好ましくは２個のアミノ酸、例えばＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、もしくはＭＶを含むアミノ酸またはペプチドである。他の特定のスペーサーの例及びスペーサーとして使用するのに最適なアミノ酸を以下に提示する。

一部の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードする例示的なＤＮＡ構築物は、Ｎ末端側及び／またはＣ末端側において、アミノ酸配列：ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、ＭＶ、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、及びＤＴから選択される１つ以上のスペーサー配列にインフレームで融合した、アミノ酸配列：ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、またはＬＦＡＡＰＦを含む１つ以上の二元ペプチドを、組み合わせて、または個々にコードする、１つ以上のポリヌクレオチドを含む。種々の実施形態において、真核細胞、例えば酵母細胞または植物細胞の形質転換またはトランスフェクションに使用される例示的なＤＮＡ構築物は、Ｎ末端、Ｃ末端、または両末端のいずれかにおいて、ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、ＭＶ、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、もしくはＤＴの群から選択されるか、またはこれらからなるＺ領域またはスペーサー配列にインフレームで融合した、ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、またはＬＦＡＡＰＦから選択される二元ペプチドの群から選択されるか、またはこれらからなる１つ以上の切断可能な三元ペプチドと、本明細書に記述される１つ以上のＴＰ、例えばＣＲＩＰ ＴＰ、例えばＩＣＫ ＴＰもしくは非ＩＣＫ ＣＲＩＰ ＴＰ、ＴＭＯＦ ＴＰ、または本開示を通じて例示されるＢｔ ＴＰとを含む、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。関連する実施形態において、上述の１つ以上の二元ペプチドまたは三元ペプチド（リンカーＬと表記される）は、ＴＰと、場合によりＥＲＳＰと、かつ／または場合によりＳＴＡとにインフレームで融合しており、例えば（Ｎ末端からＣ末端へ）：（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−Ｌ、または（Ｌ−ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、または（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎである（式中、ｎは、１〜２００、例えば１〜１００、または１〜２０、または１〜１０である）。上記に関連する実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドによってコードされる殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、同じであるかまたは異なっているＴＰと、同じであるかまたは異なっている二元ペプチド及び／または三元ペプチドとを含有し得る。上記に関連する実施形態において、三元ペプチド（上文でＬと表記したもの）は、二元ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または両末端のいずれかにおいて、ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、ＭＶ、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、もしくはＤＴの群から選択されるか、またはこれらからなるＺ領域またはスペーサー配列にインフレームで融合した、ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、またはＬＦＡＡＰＦから選択される二元ペプチドのアミノ酸配列を含み得る。

上記に関連する実施形態において、（１）殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするＤＮＡ構築物またはポリヌクレオチドの製造において有用なＴＰは、１つ以上のＩＣＫ ＴＰ、例えば、Ａｔｒａｃｉｎａｅ亜科に属するオーストラリアジョウゴグモから単離された殺虫性ＩＣＫペプチドの「ＡＣＴＸ」または「ＡＣＴＸペプチド」ファミリーから選択されるＴＰ、例えば、オメガＡＣＴＸ ＴＰ、カッパＡＣＴＸ ＴＰ、及びＵ−ＡＣＴＸ ＴＰ、例えば、Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｂから選択される１つ以上のＴＰ、または配列番号５、６及び１７６１、１７６２、１７６７、１７７１〜１７７３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドもしくはタンパク質、及びそれらの変異形と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％の配列同一性または配列相同性を有するＴＰを含んでよく（このＴＰは、１つより多い場合、同じであっても異なっていてもよい）、各殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、二元ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または両末端のいずれかにおいて、ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、ＭＶ、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、もしくはＤＴの群から選択されるか、またはこれらからなるＺ領域またはスペーサー配列にインフレームで融合した、ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、またはＬＦＡＡＰＦから選択される二元ペプチドのアミノ酸配列を含み得る、１つ以上の三元ペプチド（上文でＬと表記したもの）を更に含み、このＴＰは、１つより多い場合、同じであっても異なっていてもよく、各殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、二元ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または両末端のいずれかにおいて、ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、ＭＶ、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、もしくはＤＴの群から選択されるか、またはこれらからなるＺ領域またはスペーサー配列にインフレームで融合した、ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、またはＬＦＡＡＰＦから選択される二元ペプチドのアミノ酸配列を含み得る、１つ以上の三元ペプチド（上文でＬと表記したもの）を更に含む。

種々の実施形態において、本発明のＤＮＡ構築物は、本明細書に記述される１つ以上の二元ペプチド及び／または三元ペプチドを含有する殺虫性及び／または殺線虫性ＴＰをコードする。１つ以上の二元ペプチド及び／または三元ペプチドは、動物の腸内環境（例えば、ヒトの消化プロテアーゼの作用により、ヒトの腸）においても、また、昆虫または線虫の腸内環境においても切断され得る、切断可能な連結ユニットである。動物の腸、例えばヒトの腸、及び昆虫または線虫において利用可能な種々のプロテアーゼを、本明細書に提示する。一部の実施形態では、本発明のＤＮＡ構築物は、ＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａまたはＣｏｌｅｏｐｔｅｒａ昆虫種の腸内で切断可能な１つ以上の二元ペプチド及び／または三元ペプチドを含有する殺虫性及び／または殺線虫性ＴＰをコードする。ＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａまたはＣｏｌｅｏｐｔｅｒａ昆虫種の腸内で切断可能である二元ペプチド及び／または三元ペプチドをコードするものと同じＤＮＡ構築物は、ヒトの消化プロテアーゼの作用によってヒトの腸内でも切断可能である。

本明細書において開示されるように、ＴＰにインフレームで融合した切断可能な二元ペプチド及び／または三元ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ構築物も提示され、このＴＰは、適切な腸内プロテアーゼの存在下で、コードされた二元ペプチド及び／または三元ペプチドから放出され、意図される標的の昆虫または線虫において殺虫活性及び／または殺線虫活性をもたらす。種々の実施形態において、ＴＰは、ＣＲＩＰペプチド、ＩＣＫ ＴＰ、非ＩＣＫ ＴＰ、例えばイソギンチャクペプチド、ＴＭＯＦペプチド、及びＢｔタンパク質と一般的に呼ばれるクラスのＴＰであり得る。一部の実施形態では、ＴＰは、ポア形成殺虫性タンパク質（ＰＦＩＰ）及びシステインリッチ殺虫性タンパク質（ＣＲＩＰ）からなる群から選択されるタンパク質である。本発明の組成物及び方法は、開示内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている２０１３年３月８日に出願されたＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００４２号に記述されているものを含め、任意のアミノ酸ポリマーベースのＴＰを利用することができる。

本発明は、少なくとも１つの切断可能リンカー及び１つのＴＰを含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物にも関する。一部の実施形態では、核酸構築物は、ＤＮＡ核酸構築物であってもＲＮＡ核酸構築物であってもよい。本発明の一部の実施形態では、核酸構築物は、制御配列と適合性のある条件下で好適な宿主細胞におけるコーディング配列の発現を指示する１つ以上の制御配列に作動可能に連結した、少なくとも１つの殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするように作動可能である、少なくとも１つのコーディング配列を含み得る。「作動可能に連結した」という用語は、制御配列がコーディング配列の発現を指示するように、制御配列がポリヌクレオチドのコーディング配列に対して適切な位置に配置されている構成を意味する。

ポリヌクレオチドは、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質の発現をもたらすように様々な方法で操作することができる。発現ベクターによっては、ポリヌクレオチドをベクターに挿入する前に操作することが望ましいか、または必要な場合がある。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドを修飾するための技術は、当技術分野において周知である。

制御配列は、ポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識されるポリヌクレオチドであるプロモーターであるか、またはそれを含み得る。プロモーターは、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質の発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、変異体、切断型、及びハイブリッドのプロモーターを含め、宿主細胞において転写活性を示す任意のポリヌクレオチドであってよく、宿主細胞と同種あるいは異種である細胞外または細胞内のポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。

酵母宿主において、有用なプロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅトリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅメタロチオネイン（ＣＵＰ１）、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞で有用な他のプロモーターは、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｙｅａｓｔ ８：４２３−４８８に記述されている。

制御配列は、宿主細胞によって認識されると転写を終結させる転写ターミネーターであってもよい。ターミネーター配列は、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの３’末端に作動可能に連結している。宿主細胞において機能的である任意のターミネーターを使用してよい。細菌宿主細胞に好ましいターミネーターは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＨ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアルファアミラーゼ（ａｍｙＬ）、及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉリボソームＲＮＡ（ｒｒｎＢ）の遺伝子から得られる。酵母宿主細胞に好ましいターミネーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅチトクロムＣ（ＣＹＣ１）、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞で有用な他のターミネーターは、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２（上記）に記述されている。制御配列は、遺伝子の中でプロモーターの下流にあり、遺伝子の発現を増加させるコーディング配列の上流にある、ｍＲＮＡ安定化領域であってもよい。

制御配列は、宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域であるリーダーを含む場合もある。リーダー配列は、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５’末端に作動可能に連結している。宿主細胞において機能的である任意のリーダーを使用してよい。酵母宿主細胞に好適なリーダーは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３ホスホグリセリン酸キナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。

制御配列は、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質コーディング配列の３’末端に作動可能に連結しており、転写されると転写後のｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして宿主細胞に認識される配列である、ポリアデニル化配列を含む場合もある。宿主細胞において機能的である任意のポリアデニル化配列を使用してよい。酵母宿主細胞で有用なポリアデニル化配列は、Ｇｕｏ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ，１９９５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌ．１５：５９８３−５９９０に記述されている。

宿主細胞の増殖に対して殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質の発現を調節する調節配列を付加することが望ましい場合もある。調節系の例は、調節性化合物の存在をはじめとする化学的または物理的な刺激に応答して遺伝子の発現を開始または停止させるものである。原核細胞系における調節系としては、ｌａｃオペレーター系、ｔａｃオペレーター系、及びｔｒｐオペレーター系が挙げられる。酵母においては、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が使用され得る。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核細胞系では、これらの調節配列には、メトトレキサートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、及び重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子が含まれる。これらの場合において、殺虫性及び／または殺線虫性をコードするポリヌクレオチドは、調節配列に作動可能に連結することになる。

発現ベクター

本発明は、本発明の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチド、プロモーター、ならびに転写終止シグナル及び翻訳終止シグナルを含む組換え発現ベクターにも関する。種々のヌクレオチド及び制御配列をひとつに連結して、１つ以上の簡便な制限部位を含み得る組換え発現ベクターを産生することで、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチドのかかる部位での挿入または置換を可能にすることができる。代替的に、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む核酸構築物を適切な発現ベクターに挿入することによってポリヌクレオチドを発現させてもよい。発現ベクターを作出する際、コーディング配列は、コーディング配列が発現のための適切な制御配列に作動可能に連結するようにベクター内に位置付けられる。

組換え発現ベクターは、好都合にも組換えＤＮＡ手順に供することができ、かつポリヌクレオチドの発現をもたらし得る、任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であってよい。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞とベクターの適合性に左右される。ベクターは、線状プラスミドであっても閉環状プラスミドであってもよい。ベクターは、自律複製ベクター（すなわち、染色体外物質として存在し、複製が染色体複製に依存しないベクター）、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体であり得る。ベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を含み得る。代替的に、ベクターは、宿主細胞に導入されるとゲノム（例えば植物ゲノム）に組み込まれ、それが組み込まれた染色体（複数可）と共に複製されるものであってもよい。更に、単一のベクターもしくはプラスミド、または宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを併せて含有する２つ以上のベクターもしくはプラスミド、またはトランスポゾンを使用してもよい。

ベクターは、好ましくは、形質転換細胞、トランスフェクト細胞、形質導入細胞などの容易な選択を可能にする１つ以上の選択可能なマーカーを含有する。選択可能なマーカーは、その産物が殺生物剤またはウイルス抵抗性、重金属に対する抵抗性、栄養要求体に対する原栄養性などをもたらす遺伝子である。細菌性の選択可能なマーカーの例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのｄａｌ遺伝子、またはアンピシリン抵抗性、クロラムフェニコール抵抗性、カナマイシン抵抗性、ネオマイシン抵抗性、スペクチノマイシン抵抗性、もしくはテトラサイクリン抵抗性などの抗生物質抵抗性をもたらすマーカーである。酵母宿主細胞に好適なマーカーとしては、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、及びＵＲＡ３が挙げられるが、これらに限定されない。糸状菌宿主細胞において使用される選択可能なマーカーとしては、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、及びｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにそれらの同等物が挙げられるが、これらに限定されない。

ベクターは、好ましくは、宿主細胞のゲノムへのベクターの組み込み、またはゲノムに依存しない細胞内でのベクターの自律増殖を可能にするエレメント（複数可）を含有する。宿主細胞ゲノムへの組み込みのため、ベクターは、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの配列、あるいは、相同組換えまたは非相同組換えによるゲノムへの組み込みのためのベクターの任意の他のエレメントに依存し得る。代替的に、ベクターは、染色体（複数可）内の正確な位置（複数可）における宿主細胞のゲノムへの相同組換えによる組み込みを指示するための更なるポリヌクレオチドを含有してもよい。正確な位置における組み込みの可能性を増加させるために、組み込みエレメントは、相同組換えの確率を高めるために対応する標的配列に対して高度の配列同一性を有する核酸を、例えば１００〜１０，０００塩基対、４００〜１０，０００塩基対、及び８００〜１０，０００塩基対などの十分な数で含有すべきである。組み込みエレメントは、宿主細胞のゲノム内の標的配列と相同である任意の配列であってよい。更に、組み込みエレメントは、非コーディングポリヌクレオチドであってもコーディングポリヌクレオチドであってもよい。また一方では、ベクターは、非相同組換えによって宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。

自律増殖のために、ベクターは、ベクターが問題の宿主細胞中で自律的に複製することを可能にする複製起点を更に含んでもよい。複製起点は、細胞内で機能し、自律増殖を媒介する、任意のプラスミド複製開始点であってよい。「複製起点」または「プラスミド複製開始点」という用語は、プラスミドまたはベクターがインビボで複製することを可能にするポリヌクレオチドを意味する。細菌複製起点の例は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける複製を可能にするｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、及びｐＡＣＹＣ１８４、ならびにＢａｃｉｌｌｕｓにおける複製を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０、及びｐＡＭβ１の各プラスミド複製起点である。酵母宿主細胞において使用される複製起点の例は、２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１及びＣＥＮ３の組み合わせ、ならびにＡＲＳ４及びＣＥＮ６の組み合わせである。殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質の産生を増加させるために、本発明のポリヌクレオチドのコピーを２つ以上宿主細胞に挿入してよい。ポリヌクレオチドのコピー数は、配列の少なくとも１つの更なるコピーを宿主細胞ゲノムに組み込むこと、または増幅可能な選択可能なマーカー遺伝子をポリヌクレオチドと共に含めることによって増加させることができ、これで、選択可能なマーカー遺伝子の増幅されたコピーを含有する細胞、ひいてはポリヌクレオチドの更なるコピーが、適切な選択可能因子の存在下で細胞を培養することによって選択され得る。上述のエレメントをライゲートして本発明の組換え発現ベクターを構築するために使用される手順は、当業者に周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９（上記）を参照のこと）。

（４Ｂ）．構築物（ＴＰ−Ｌ）_ｎにインフレームで融合した二元ペプチドまたは三元ペプチドに融合したＥＲＳＰ

一部の実施形態では、各殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、（ＴＰ−Ｌ）_ｎ（式中、ＴＰは毒性タンパク質であり、Ｌは二元ペプチドまたは三元ペプチドであり、ｎは１〜２００の範囲の整数である）を含む構築物にインフレームで融合した二元ペプチドまたは三元ペプチドに融合したＥＲＳＰを含み得る。図４を参照のこと。これらの実施形態の一部では、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質中のＴＰは、同じであっても異なっていてもよい。

これらのＴＰのクラスは全て上述されており、これらのクラスは全て、本明細書に記述されるＤＮＡ構築物に組み込むことができ、ここで少なくとも１つのＴＰは、少なくとも１つの二元ペプチドまたは三元ペプチドと共にインフレームでコードされ、好ましくは２つ以上のＴＰが、少なくとも１つまたは少なくとも２つの切断可能な二元ペプチドまたは三元ペプチドにインフレームでフランキングされており、例えば、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）−ＴＰ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）、（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−Ｌ、（Ｌ−ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、または（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎである（式中、（Ｌ）は二元ペプチドまたは三元ペプチドであり、各Ｌは、同じであっても異なっていてもよく、ＴＰは、同じであっても異なっていてもよい毒性ペプチドであり、ｎは、１〜２００、好ましくは１〜１００、最も好ましくは１〜１０の範囲の整数である）。図４及び５を参照のこと。

一部の実施形態では、本発明は、１つ以上の二元ペプチド及び／または三元ペプチドと１つ以上のＴＰとを含み得る、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質、ならびに、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ構築物を提示する。二元ペプチド及び／または三元ペプチドの各々は同じであっても異なっていてもよく、ＴＰの各々は同じであっても異なっていてもよい。一部の実施形態では、本発明は、２つ以上の二元ペプチド及び／または三元ペプチドと２つ以上のＴＰとを含み得る、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質、ならびに、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ構築物を提示する。二元ペプチド及び／または三元ペプチドの各々は同じであっても異なっていてもよく、ＴＰの各々は同じであっても異なっていてもよい。例示的な一実施形態において、本発明は、作動可能なプロモーター（例えば同種または異種プロモーター）に作動可能に連結した少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むＤＮＡ構築物であって、ポリヌクレオチドが、１つ以上のＴＰと、２つ以上の切断可能な二元ペプチドまたは三元ペプチドとを有する殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードする、ＤＮＡ構築物を提示する。図２を参照のこと。

別の関連する態様において、本発明は、二元ペプチドまたは三元ペプチドのＮ末端にインフレームで融合したＥＲＳＰを含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質であって、二元ペプチドまたは三元ペプチドが、（ＴＰ−Ｌ）_ｎを含む構築物にインフレームで融合しているか、あるいは殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質が、二元ペプチドまたは三元ペプチドのＮ末端に融合したＥＲＳＰを含み、二元ペプチドまたは三元ペプチドが、（Ｌ−ＴＰ）_ｎを含む構築物にインフレームで融合している、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を提示する。

関連する実施形態では、本明細書に記述されるＤＮＡ構築物において、少なくとも１つのＴＰは、少なくとも１つの二元ペプチドまたは三元ペプチドと共にインフレームでコードされ、好ましくは２つ以上のＴＰが、少なくとも１つまたは少なくとも２つの切断可能な二元ペプチドまたは三元ペプチドにインフレームでフランキングされており、Ｘ領域及びＹ領域を含む切断可能な二元リンカーペプチド（Ｌ）は上述されており、上述のＸ領域及び／またはＹ領域に（Ｘ領域もしくはＹ領域のＮ末端側配列、またはＸ領域もしくはＹ領域のＣ末端側配列のいずれかに）インフレームで融合していてよい例示的なＺ領域（１〜４アミノ酸配列、例えば２アミノ酸配列）が、三元の切断可能な連結ペプチドを形成する。例示的なＺまたはスペーサーアミノ酸配列は、ＡＡ、ＡＦ、ＡＭ、ＡＮ、ＡＱ、ＡＶ、ＡＷ、ＡＹ、ＤＡ、ＤＤ、ＤＥ、ＤＦ、ＤＧ、ＤＩ、ＤＬ、ＤＰ、ＤＳ、ＤＴ、ＤＶ、ＤＷ、ＤＹ、ＥＡ、ＥＤ、ＥＥ、ＥＦ、ＥＧ、ＥＩ、ＥＬ、ＥＰ、ＥＳ、ＥＴ、ＥＶ、ＥＷ、ＥＹ、ＦＡ、ＦＤ、ＦＥ、ＦＦ、ＦＩ、ＦＫ、ＦＬ、ＦＭ、ＦＮ、ＦＱ、ＦＲ、ＦＳ、ＦＴ、ＦＶ、ＦＷ、ＦＹ、ＧＡ、ＧＤ、ＧＥ、ＧＦ、ＧＩ、ＧＬ、ＧＭ、ＧＮ、ＧＱ、ＧＳ、ＧＶ、ＧＷ、ＧＹ、ＨＡ、ＨＤ、ＨＥ、ＨＦ、ＨＨ、ＨＩ、ＨＫ、ＨＬ、ＨＮ、ＨＰ、ＨＱ、ＨＲ、ＨＳ、ＨＴ、ＨＶ、ＨＹ、ＩＡ、ＩＤ、ＩＥ、ＩＧ、ＩＨ、ＩＩ、ＩＫ、ＩＬ、ＩＭ、ＩＮ、ＩＰ、ＩＱ、ＩＲ、ＩＳ、ＩＴ、ＩＶ、ＩＷ、ＫＡ、ＫＤ、ＫＥ、ＫＦ、ＫＩ、ＫＬ、ＫＮ、ＫＱ、ＫＶ、ＫＹ、ＬＡ、ＬＤ、ＬＥ、ＬＧ、ＬＨ、ＬＩ、ＬＫ、ＬＬ、ＬＭ、ＬＮ、ＬＰ、ＬＱ、ＬＲ、ＬＳ、ＬＴ、ＬＶ、ＬＷ、ＭＡ、ＭＦ、ＭＧ、ＭＩ、ＭＫ、ＭＬ、ＭＭ、ＭＮ、ＭＱ、ＭＲ、ＭＳ、ＭＴ、ＭＶ、ＭＹ、ＮＡ、ＮＤ、ＮＥ、ＮＦ、ＮＩ、ＮＬ、ＮＭ、ＮＮ、ＮＱ、ＮＳ、ＮＴ、ＮＶ、ＮＹ、ＱＡ、ＱＤ、ＱＥ、ＱＦ、ＱＩ、ＱＬ、ＱＭ、ＱＮ、ＱＱ、ＱＳ、ＱＴ、ＱＶ、ＱＹ、ＲＡ、ＲＤ、ＲＥ、ＲＦ、ＲＩ、ＲＬ、ＲＮ、ＲＱ、ＲＶ、ＲＹ、ＳＡ、ＳＦ、ＳＧ、ＳＫ、ＳＮ、ＳＰ、ＳＱ、ＳＲ、ＳＳ、ＳＴ、ＳＶ、ＳＷ、ＳＹ、ＴＡ、ＴＦ、ＴＧ、ＴＫ、ＴＮ、ＴＰ、ＴＱ、ＴＲ、ＴＳ、ＴＴ、ＴＶ、ＴＷ、ＴＹ、ＶＡ、ＶＦ、ＶＭ、ＶＮ、ＶＱ、ＶＶ、ＶＷ、ＶＹ、ＷＡ、ＷＦ、ＷＩ、ＷＫ、ＷＬ、ＷＮ、ＷＰ、ＷＱ、ＷＲ、ＷＳ、ＷＴ、ＷＶ、ＷＷ、ＷＹ、ＹＡ、ＹＤ、ＹＥ、ＹＦ、ＹＩ、ＹＫ、ＹＬ、ＹＭ、ＹＮ、ＹＱ、ＹＲ、ＹＳ、ＹＴ、ＹＶ、ＹＷ、またはＹＹを含み得る。例示的な実施形態において、個々の本発明の三元ペプチドは、上記に開示された例示的な二元ペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端にインフレームで融合した２アミノ酸配列を含んでいてよく、この２アミノ酸配列は、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、またはＤＴである。

例示的な実施形態において、個々の本発明の三元ペプチドは、上記に開示された例示的な二元ペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端にインフレームで融合した２アミノ酸配列を含んでいてよく、この２アミノ酸配列は、ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、またはＭＶである。

一部の実施形態では、三元ペプチドのスペーサー部分（Ｚ領域）は、アミノ酸配列ＧＳを含み、これは二元ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端または両方にインフレームで融合していてよい。

種々の実施形態において、殺虫性及び／または殺線虫性ポリペプチド及びタンパク質、殺虫性及び／または殺線虫性ポリペプチド及びタンパク質をコードするＤＮＡ構築物及びポリヌクレオチドに使用され、また、トランスジェニック植物またはその一部に組み込まれる、本発明の例示的な二元ペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、または両末端のいずれかにおいて、ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、ＭＶ、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、もしくはＤＴの群から選択されるか、またはこれらからなるＺ領域またはスペーサー配列にインフレームで融合した、ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、もしくはＬＦＡＡＰＦから選択される二元ペプチドの群から選択されるか、またはこれらからなる、１つ以上の切断可能な三元ペプチドを含み得る。上記に関連する実施形態において、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、同じであるかまたは異なっているＴＰを含有する場合があり、二元ペプチドまたは三元ペプチドは、同じであっても異なっていてもよい。上記に関連する実施形態において、三元ペプチド（上文でＬと表記したもの）は、二元ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または両末端のいずれかにおいて、ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、ＭＶ、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、もしくはＤＴの群から選択されるか、またはこれらからなるＺ領域またはスペーサー配列にインフレームで融合した、ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、またはＬＦＡＡＰＦから選択される二元ペプチドのアミノ酸配列を含み得る。図４を参照のこと。上記に関連する実施形態において、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質の製造において有用なＴＰは、１つ以上のＩＣＫ ＴＰ、例えば、Ａｔｒａｃｉｎａｅ亜科に属するオーストラリアジョウゴグモから単離された殺虫性ＩＣＫペプチドの「ＡＣＴＸ」または「ＡＣＴＸペプチド」ファミリーから選択されるＴＰ、例えば、オメガＡＣＴＸ ＴＰ、カッパＡＣＴＸ ＴＰ、及びＵ−ＡＣＴＸ ＴＰ、例えば、Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｂから選択される１つ以上のＴＰを含んでよく（このＴＰは、１つより多い場合、同じであっても異なっていてもよい）、各殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、二元ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または両末端のいずれかにおいて、ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、ＭＶ、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、もしくはＤＴの群から選択されるか、またはこれらからなるＺ領域またはスペーサー配列にインフレームで融合した、ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、またはＬＦＡＡＰＦから選択される二元ペプチドのアミノ酸配列を含み得る、１つ以上の三元ペプチド（上文でＬと表記したもの）を更に含む。

種々の実施形態において、例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）−ＴＰ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）、（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−Ｌ、（Ｌ−ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、または（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ（式中、（Ｌ）は二元ペプチドまたは三元ペプチドであり、各Ｌは、同じであっても異なっていてもよく、ＴＰは、同じであっても異なっていてもよい毒性ペプチドであり、ｎは、１〜２００、好ましくは１〜１００、最も好ましくは１〜１０の範囲の整数である）を含み得る（例えば、図４に示される例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を参照のこと。ここでｎは、１〜２００、好ましくは１〜１００、最も好ましくは１〜１０の範囲の整数である）。関連する実施形態において、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、同じであるかまたは異なっているＴＰと、同じであるかまたは異なっている二元ペプチド及び／または三元ペプチドとを含有し得る。上記に関連する実施形態において、三元ペプチド（上文でＬと表記したもの）は、二元ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または両末端のいずれかにおいて、ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、ＭＶ、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、もしくはＤＴの群から選択されるか、またはこれらからなるＺ領域またはスペーサー配列にインフレームで融合した、ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、またはＬＦＡＡＰＦから選択される二元ペプチドのアミノ酸配列を含み得る。別の実施形態では、植物またはその一部は、作動可能なプロモーター（例えば同種または異種プロモーター）に作動可能に連結したポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドは、安定化ドメイン（ＳＴＡ）のＮ末端にインフレームで融合したＥＲＳＰを含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードする。図５及び６Ｃを参照のこと。

ＳＴＡは、二元ペプチドまたは三元ペプチドのＮ末端、あるいは（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−Ｌ、（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、またはＬ−（ＴＰ−Ｌ）_ｎを含む構築物のＮ末端のいずれかにインフレームで融合していてよい。

種々の実施形態において、例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質、及び／または、かかる殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を各々または組み合わせでコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ構築物は、構築物：（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、または（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ（式中、ＴＰは毒性タンパク質であり、Ｌは二元ペプチドまたは三元ペプチドであり、ｎは、１〜２００の範囲の整数、好ましくは１〜１００の範囲の整数、より好ましくは１〜１０の範囲の整数である）を含み得る。一部の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、同じであるかまたは異なっているＴＰを含有する場合があり、二元ペプチド及び／または三元ペプチドは、同じであっても異なっていてもよい。一部の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、Ｃ末端側ＴＰが、そのＣ末端において、二元ペプチドまたは三元ペプチドに融合しているか、または融合していない。上記に関連する実施形態において、（１）殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするＤＮＡ構築物またはポリヌクレオチドの製造において有用なＴＰは、１つ以上のＩＣＫ ＴＰ、例えば、Ａｔｒａｃｉｎａｅ亜科に属するオーストラリアジョウゴグモから単離された殺虫性ＩＣＫペプチドの「ＡＣＴＸ」または「ＡＣＴＸペプチド」ファミリーから選択されるＴＰ、例えば、オメガＡＣＴＸ ＴＰ、カッパＡＣＴＸ ＴＰ、及びＵ−ＡＣＴＸ ＴＰ、例えば、Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｂから選択される１つ以上のＴＰ、または配列番号５、６及び１７６１、１７６２、１７６７、１７７１〜１７７３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドもしくはタンパク質、及びそれらの変異形と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％の配列同一性または配列相同性を有するＴＰを含んでよく（このＴＰは、１つより多い場合、同じであっても異なっていてもよい）、各殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、二元ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または両末端のいずれかにおいて、ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、ＭＶ、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、もしくはＤＴの群から選択されるか、またはこれらからなるＺ領域またはスペーサー配列にインフレームで融合した、ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、またはＬＦＡＡＰＦから選択される二元ペプチドのアミノ酸配列を含み得る、１つ以上の三元ペプチド（上文でＬと表記したもの）を更に含む。

ＴＰに動作可能に融合した切断可能な連結ペプチドをコードするＤＮＡ構築物は、様々な宿主細胞特異的調節性成分を用いて構築され得る。一部の実施形態では、ＤＮＡ構築物は、発現、コード化タンパク質の合成、または遺伝子操作のために、様々な宿主細胞に形質転換され得る。一部の実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞、例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ細胞、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ細胞、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細胞、及びＲｈｉｚｏｂｉｕｍ細胞であり得る。種々の実施形態において、宿主細胞は植物細胞である。

一部の実施形態では、本明細書に記述される切断可能な連結ペプチドを含む殺虫性及び／または殺線虫性組成物は、殺虫性及び／または殺線虫性組成物を摂取するか、あるいは別様にこれと接触する昆虫及び／または線虫有害生物に、ＴＰを浸透させることを意図する。本発明は、二元ペプチドまたは三元ペプチドのいずれかを含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質またはポリペプチドを含む、植物またはその一部（本明細書において「植物またはその一部」とは、限定されるものではないが、植物及び植物の組織（例えば、植物の根、茎、葉、花、またはそれらの一部）、植物細胞、または該植物の植物種子を含むものと定義される）であって、二元ペプチド及び／または三元ペプチドが、少なくとも４個のアミノ酸から最大１６個までのアミノ酸を含有し、かつ２つまたは３つの異なる領域からなり、二元ペプチドは、２つの異なる領域を有し、三元ペプチドは、３つの異なる領域を有し、二元ペプチド及び／または三元ペプチドが、動物の腸内プロテアーゼ及び昆虫または線虫の腸内プロテアーゼの両方によって切断可能であり、一部の実施形態では、二元ペプチド及び／または三元ペプチドが、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）のＣ末端に作動可能に融合しており、かつＴＰのＮ末端に作動可能に融合している、植物またはその一部を提示する。

一部の実施形態では、本明細書に記述される切断可能な連結ペプチドを含む殺虫性及び／または殺線虫性組成物は、殺虫性及び／または殺線虫性組成物を摂取するか、あるいは別様にこれと接触する昆虫及び／または線虫有害生物に、ＴＰを浸透させるか、またはＴＰを摂取させることを意図する。本発明は、１つ以上の二元ペプチド及び／または三元ペプチドを含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質またはポリペプチドを含む、植物またはその一部（本明細書において「植物またはその一部」とは、限定されるものではないが、植物及び植物組織、植物細胞、または該植物の植物種子を含むものと定義される）であって、二元ペプチド及び／または三元ペプチドが、少なくとも４個のアミノ酸から最大１６個までのアミノ酸を含有し、かつ２つまたは３つの異なる領域からなり、二元ペプチドは、２つの異なる領域を有し、三元ペプチドは、３つの異なる領域を有し、二元ペプチド及び／または三元ペプチドが、動物の腸内プロテアーゼ（例えばヒトの腸内プロテアーゼ）及び昆虫または線虫の腸内プロテアーゼの両方によって切断可能であり、一部の実施形態では、二元ペプチド及び／または三元ペプチドが、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）のＣ末端に作動可能に融合しており、かつＴＰのＮ末端に作動可能に融合している、植物またはその一部を提示する。これらの実施形態の一部において、例示的な三元ペプチド（Ｌと表記される）は、二元ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または両末端のいずれかにおいて、ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、ＭＶ、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、もしくはＤＴの群から選択されるか、またはこれらからなるＺ領域またはスペーサー配列にインフレームで融合した、ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、またはＬＦＡＡＰＦから選択される二元ペプチドのアミノ酸配列を含み得る。

一部の実施形態では、本明細書に記述される切断可能な連結ペプチドを含む殺虫性及び／または殺線虫性組成物は、殺虫性及び／または殺線虫性組成物を摂取するか、あるいは別様にこれと接触する昆虫及び／または線虫有害生物に、ＴＰを浸透させるか、またはＴＰを摂取させることを意図する。本発明は、二元ペプチドまたは三元ペプチドのいずれかを含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質またはポリペプチドを含む、植物またはその一部（本明細書において「植物またはその一部」とは、限定されるものではないが、植物及び植物組織、植物細胞、または該植物の植物種子を含むものと定義される）であって、二元ペプチド及び／または三元ペプチドが、少なくとも４個のアミノ酸から最大１６個までのアミノ酸を含有し、かつ２つまたは３つの異なる領域からなり、二元ペプチドは、２つの異なる領域を有し、三元ペプチドは、３つの異なる領域を有し、二元ペプチド及び／または三元ペプチドが、動物の腸内プロテアーゼ及び昆虫または線虫の腸内プロテアーゼの両方によって切断可能であり、一部の実施形態では、二元ペプチド及び／または三元ペプチドが、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）のＣ末端に作動可能に融合しており、かつＴＰのＮ末端に作動可能に融合している、植物またはその一部を提示する。

関連する実施形態において、植物またはその一部は、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、この殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、二元ペプチドまたは三元ペプチドのＮ末端にインフレームで融合したＥＲＳＰを含む（この二元ペプチドまたは三元ペプチドは、（ＴＰ−Ｌ）ｎを含む構築物にインフレームで融合している）か、あるいは殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、二元ペプチド及び／またはリピート構築物（Ｌ−ＴＰ）ｎもしくは（ＴＰ−Ｌ）ｎにインフレームで融合したＥＲＳＰを含む。図４を参照のこと。種々の実施形態において、例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）−ＴＰ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）、（Ｌ−ＴＰ）ｎ−Ｌ、（Ｌ−ＴＰ−Ｌ）ｎ、（ＥＲＳＰ）−（ＴＰ−Ｌ）ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）ｎ−（Ｌ）、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）ｎ、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）ｎ−（Ｌ）、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）ｎ−（Ｌ）、または（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）ｎ（式中、（Ｌ）は二元ペプチドまたは三元ペプチドであり、各Ｌは、同じであっても異なっていてもよく、ＴＰは、同じであっても異なっていてもよい毒性ペプチドであり、ｎは、１〜２００、好ましくは１〜１００、最も好ましくは１〜１０の範囲の整数である）の構築物を含み得る。これらの実施形態の一部において、例示的な三元ペプチド（Ｌと表記される）は、二元ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または両末端のいずれかにおいて、ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、ＭＶ、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、もしくはＤＴの群から選択されるか、またはこれらからなるＺ領域またはスペーサー配列にインフレームで融合した、ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、またはＬＦＡＡＰＦから選択される二元ペプチドのアミノ酸配列を含み得る。上記に関連する実施形態において、（１）殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするＤＮＡ構築物またはポリヌクレオチドの製造において有用なＴＰは、１つ以上のＩＣＫ ＴＰ、例えば、Ａｔｒａｃｉｎａｅ亜科に属するオーストラリアジョウゴグモから単離された殺虫性ＩＣＫペプチドの「ＡＣＴＸ」または「ＡＣＴＸペプチド」ファミリーから選択されるＴＰ、例えば、オメガＡＣＴＸ ＴＰ、カッパＡＣＴＸ ＴＰ、及びＵ−ＡＣＴＸ ＴＰ、例えば、Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｂから選択される１つ以上のＴＰ、または配列番号５、６及び１７６１、１７６２、１７６７、１７７１〜１７７３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドもしくはタンパク質、及びそれらの変異形と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％の配列同一性または配列相同性を有するＴＰを含んでよく（このＴＰは、１つより多い場合、同じであっても異なっていてもよい）、各殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、二元ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または両末端のいずれかにおいて、ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、ＭＶ、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、もしくはＤＴの群から選択されるか、またはこれらからなるＺ領域またはスペーサー配列にインフレームで融合した、ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、またはＬＦＡＡＰＦから選択される二元ペプチドのアミノ酸配列を含み得る、１つ以上の三元ペプチド（上文でＬと表記したもの）を更に含む。

別の実施形態では、植物またはその一部は、作動可能なプロモーター（例えば同種または異種プロモーター）に作動可能に連結したポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドは、安定化ドメイン（ＳＴＡ）のＮ末端にインフレームで融合したＥＲＳＰを含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードする。図５を参照のこと。ＳＴＡは、二元ペプチドまたは三元ペプチドのＮ末端、あるいは（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−Ｌ、（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、またはＬ−（ＴＰ−Ｌ）_ｎを含む構築物のＮ末端のいずれかにインフレームで融合している。種々の実施形態において、例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、または（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ（式中、ＴＰは本明細書に記述される毒性タンパク質であり、Ｌは二元ペプチドまたは三元ペプチドであり、ｎは、１〜２００の範囲の整数、好ましくは１〜１００の範囲の整数、より好ましくは１〜１０の範囲の整数である）を含み得る。一部の実施形態では、上記に示した構築物を有する殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、同じであるかまたは異なっているＴＰと、同じであるかまたは異なっている二元ペプチド及び／または三元ペプチドとを含有し得る。これらの実施形態の一部において、上記に示した構築物を有する殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、配列番号５、６及び１７６１、１７６２、１７６７、１７７１〜１７７３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドもしくはタンパク質、及びそれらの変異形と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％の配列同一性または配列相同性を有するＴＰを含有してよく（このＴＰは、１つより多い場合、同じであっても異なっていてもよい）、各殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、二元ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または両末端のいずれかにおいて、ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、ＭＶ、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、もしくはＤＴの群から選択されるか、またはこれらからなるＺ領域またはスペーサー配列にインフレームで融合した、ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、またはＬＦＡＡＰＦから選択される二元ペプチドのアミノ酸配列を含み得る、１つ以上の三元ペプチド（上文でＬと表記したもの）を更に含む。

一部の実施形態では、Ｃ末端側ＴＰは、そのＣ末端において、二元ペプチドまたは三元ペプチドに融合しているか、または融合していない。図２、４、及び５を参照のこと。これらの実施形態の一部において、例示的な三元ペプチド（Ｌと表記される）は、二元ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または両末端のいずれかにおいて、ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、ＭＶ、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、もしくはＤＴの群から選択されるか、またはこれらからなるＺ領域またはスペーサー配列にインフレームで融合した、ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、またはＬＦＡＡＰＦから選択される二元ペプチドのアミノ酸配列を含み得る。

（ＴＰ−Ｌ）_ｎと書かれる場合があるＴＰ−リンカー構築物（リンカーは、切断可能な二元ペプチドまたは三元ペプチドを含むものと定義されている）、または図２に示されるバリエーションは、実際には長い形態で書かれる場合もあることが、読者には理解されよう。例えばｎが５である場合、（ＴＰ−Ｌ）_ｎを長い形態で書くと、ＴＰ−Ｌ−ＴＰ−Ｌ−ＴＰ−Ｌ−ＴＰ−Ｌ−ＴＰ−Ｌと記される。このような構築物が植物またはその一部などの系において作製及び産生された後、昆虫及び／または線虫の腸もしくは血リンパ環境内の昆虫及び／または線虫プロテアーゼによりＬすなわちリンカーが分断されることで、単一の毒性ペプチドを多数放出し、その毒性効果を発揮して、昆虫及び／または線虫を殺傷もしくは静止させるか、またはその採餌を減速させることができる。これが起こると、種々の状況に応じて、Ｌすなわちリンカーは、ＴＰすなわち毒性ペプチドのいずれかの側において、まず初めのアミノ酸長が１〜１６であったＬすなわちリンカーから残った０〜１６個のアミノ酸が依然として毒性ペプチドに結合していることが可能であるように、リンカー内の異なるアミノ酸同士の間、または毒性ペプチドとリンカーとの間で切断され得る。別の言い方をすれば、プロテアーゼ切断後、ＴＰは、リンカーのアミノ酸がそれに結合していなくてもよいし、あるいは、サイズが１から１６アミノ酸、しかしより多くの場合では２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４アミノ酸以上と様々である、リンカーの残余物からなる１つまたは２つの「スタブ」別称「小塊」を有していてもよい（一方または両方のスタブがＮ末端及び／またはＣ末端に融合している）。スタブは、Ｎ末端側、Ｃ末端側、またはＮ末端側及びＣ末端側の両方にあってもよい。これらのスタブは必ずしも同じサイズであるとは限らず、これは昆虫及び／またはヒトの腸内環境内でプロテアーゼによってどのように切断されるかに左右され、これは使用されるプロテアーゼ及びリンカーに応じて異なり得る。通常は、毒性ペプチドの両「側」にスタブが結合しており、両方のスタブが連結ペプチドの異なる部分を起源とする。時には、切断後のＴＰに結合しているスタブはないか、または１つしかない。

スタブのサイズは、出発リンカーの長さに応じて１〜１６アミノ酸の範囲であり得（そしてスタブは存在しない場合がある）、より多くの場合では、スタブは２〜１４アミノ酸、３〜１２、４〜８、または５〜７アミノ酸であるが、次のアミノ酸長：１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１０、１〜１１、２〜３、２〜４、２〜５、２〜６、２〜７、２〜８、２〜９、２〜１０、及び２〜１１、または３〜４、３〜５、３〜６、３〜７、３〜８、３〜９、３〜１０、及び３〜１１、または４〜５、４〜６、４〜７、４〜８、４〜９、４〜１０及び４〜１１；または５〜６、５〜７、５〜８、５〜９、５〜１０及び５〜１１；または６〜７、６〜８、６〜９、６〜１０及び６〜１１；または７〜８、７〜９、７〜１０、及び７〜１１；及び８〜９、８〜１０、または８〜１１、及び９〜１０または９〜１１、または１０もしくは１１アミノ酸長のうちのいずれでもよい。

よって、切断前の構築物をＴＰ−Ｌ−ＴＰ−Ｌ−ＴＰ−Ｌ−ＴＰ−Ｌ−ＴＰ−Ｌ（我々の上記の例、及び図２に方程式形態で示されている）と記すことができ、例えばリンカーが６ａａ（すなわちアミノ酸）を有する場合、プロテアーゼ切断後、ＴＰ−Ｌ−ＴＰ−Ｌ−ＴＰ−Ｌ−ＴＰ−Ｌ−ＴＰ−Ｌ構築物は、スタブを有する個々の毒性ペプチド（ＴＰ）に分割され、次のように記され得る。第１のペプチドは、ＴＰ−２ａａ（６ａａリンカーの片側からの２ａａ）であり得、次に、毒性ペプチドの他方の末端に結合したリンカーの最後の部分からの４ａａは、４ａａ−ＴＰ−２ａａとなり、第３のペプチドは４ａａ−ＴＰ−２ａａ、第４は４ａａ−ＴＰ−２ａａ、そして第５にして最後の切断されたＴＰは、最後のリンカーは切断されない場合があるため４ａａ−ＴＰ−６ａａと記されることになる。時に、構築物の最後のＴＰは別のＴＰに結合していないため、切断は必ずしも起こるとは限らない。あるいは、これが切断されて４ａａ−ＴＰ−２ａａが残る場合もある。こうしたペプチダーゼ切断後の毒性ペプチドに結合しているわずかなａａ断片が、我々が「スタブ」と呼ぶものであり、これらは典型的には、昆虫の腸内で切断から産生された切断後の毒性ペプチドの活性に影響したり、またはこれを阻害したりしない。

スタブは、図４にあるように（ＴＰ−Ｌ）_ｎまたは（Ｌ−ＴＰ）_ｎにＥＲＳＰが融合しているときに現れる場合もあり、そのような構築物におけるスタブは、ＥＲＳＰの小片を含む場合がある。かつ、または、図５にあるようにＳＴＡもしくはＢＡＡＳ、またはユビキチンや、構築物に使用されている何らかにＬ−ＴＰが更に融合している場合に現れる場合もある。スタブは、１アミノ酸以上から１６アミノ酸長まで、任意の長さのペプチドの任意の組み合わせであり得る。これらはＴＰに不規則に結合していてよい。スタブは、毒性ペプチドの前及び後で同じ長さまたは数のアミノ酸を有しない場合がある。

種々の実施形態において、本発明の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を発現するように作動可能である、本明細書に記述されるＤＮＡ構築物で形質転換された宿主細胞が提示される。種々の実施形態において、宿主細胞は、真核細胞、例えば、酵母細胞、例えば、Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の酵母細胞；植物細胞；及び哺乳動物細胞であり得る。

種々の実施形態において、ＴＰに動作可能に誘導した切断可能な連結ペプチドを含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするＤＮＡ構築物を用いて（一過性に、または安定に）形質転換される対象となる宿主細胞は、植物細胞である。一部の実施形態では、本明細書に記述されるＤＮＡ構築物で形質転換され得る植物細胞としては、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、キャッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、柑橘類、ココナツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバ、ワタ、ウリ科植物、キュウリ、ベイマツ、ナス、ユーカリ、アマ、ニンニク、ブドウ、ホップ、ニラ、レタス、タエダマツ、アワ、メロン、ナッツ、カラスムギ、オリーブ、タマネギ、装飾用植物、パーム、牧草、エンドウマメ、ピーナッツ、コショウ、キマメ、マツ、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ、ラジアータマツ、ダイコン、ナタネ、イネ、台木、ライムギ、ベニバナ、低木、ソルガム、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、スカッシュ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、モミジバフウ、サツマイモ、スイッチグラス、茶、タバコ、トマト、ライコムギ、芝草、スイカ、及びコムギ植物の細胞を挙げることができるが、これらに限定されない。

本発明は、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質が昆虫及び／または線虫によって摂取されると、昆虫及び／または線虫の腸内環境プロテアーゼが二元ペプチド及び／または三元ペプチドを切断することにより、融合したＴＰを遊離させ、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質に接触した昆虫及び／または線虫が殺傷されるか、静止するか、正常に機能できなくなるか、またはその給餌もしくは成長が減速するような、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を提示する。ある特定の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質に組み込まれるＴＰは、特定の昆虫もしくは線虫有害生物を標的とするように、または特定の植物もしくは植物が受ける特定の条件において発現するように選択され得る。一部の実施形態では、トランスジェニック植物、植物組織、もしくは植物種子によって産生される殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質、あるいは、植物に直接適用されるように配合された同じまたは異なるＴＰを有する１つ以上の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を含む組成物は、ＩＣＫ ＴＰ及びＢｔ ＴＰの組み合わせからなるＴＰを有する。トランスジェニック植物、植物組織、または植物種子は、殺虫性タンパク質、あるいは、オーストラリアジョウゴグモの任意の種、またはＡｔｒａｘ属もしくはＨａｄｒｏｎｙｃｈｅ属のオーストラリアジョウゴグモ、及びオーストラリアブルーマウンテンジョウゴグモＨａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａに由来する１つ以上のＩＣＫ ＴＰを含む殺虫性タンパク質をコードする、１つ以上のポリヌクレオチドを発現することができる。一部の実施形態では、本発明は、トランスジェニック植物またはその一部（例えば、植物組織、植物細胞、または植物種子）であって、構築物（Ｎ末端側からＣ末端側へ）（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）−ＴＰ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）、（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−Ｌ、（Ｌ−ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、または（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ（式中、（Ｌ）は二元ペプチドまたは三元ペプチドであり、各Ｌは、同じであっても異なっていてもよく、ＴＰは、同じであっても異なっていてもよい毒性ペプチドであり、ｎは、１〜２００、好ましくは１〜１００、最も好ましくは１〜１０の範囲の整数である）を含む殺虫性タンパク質を含有する、トランスジェニック植物またはその一部を提示する。

関連する実施形態において、トランスジェニック植物またはその一部は、同じであるかまたは異なっているＴＰと、同じであるかまたは異なっている二元ペプチド及び／または三元ペプチドとを含有し得る、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を発現し得る。関連する実施形態において、トランスジェニック植物またはその一部（例えば、植物組織、植物細胞、または植物種子）は、（Ｎ末端側からＣ末端側へ）（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）−ＴＰ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）、（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−Ｌ、（Ｌ−ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ（式中、（Ｌ）は二元ペプチドまたは三元ペプチドであり、各Ｌは、同じであっても異なっていてもよく、ＴＰは、同じであっても異なっていてもよい毒性ペプチドであり、ｎは、１〜２００、好ましくは１〜１００、最も好ましくは１〜１０の範囲の整数である）を含むか、これらからなる群から選択されるか、またはこれらからなる構築物を含む殺虫性タンパク質を発現するように、各々または組み合わせで作動可能である１つ以上のポリヌクレオチドを含有する。上記に関連する実施形態において、（１）殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするＤＮＡ構築物またはポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物またはその一部の製造において有用なＴＰは、１つ以上のＩＣＫ ＴＰ、例えば、Ａｔｒａｃｉｎａｅ亜科に属するオーストラリアジョウゴグモから単離された殺虫性ＩＣＫペプチドの「ＡＣＴＸ」または「ＡＣＴＸペプチド」ファミリーから選択されるＴＰ、例えば、オメガＡＣＴＸ ＴＰ、カッパＡＣＴＸ ＴＰ、及びＵ−ＡＣＴＸ ＴＰ、例えば、Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｂから選択される１つ以上のＴＰ、または配列番号５、６及び１７６１、１７６２、１７６７、１７７１〜１７７３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドもしくはタンパク質、及びそれらの変異形と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％の配列同一性または配列相同性を有する１つ以上のＴＰを含んでよく（このＴＰは、１つより多い場合、同じであっても異なっていてもよい）、各殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、二元ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または両末端のいずれかにおいて、ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、ＭＶ、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、もしくはＤＴの群から選択されるか、またはこれらからなるＺ領域またはスペーサー配列にインフレームで融合した、ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、またはＬＦＡＡＰＦから選択される二元ペプチドのアミノ酸配列を含み得る、１つ以上の三元ペプチド（上文でＬと表記したもの）を更に含む。

関連する実施形態では、発現ベクターにおいて、上文及び本明細書に記述される殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を発現するように作動可能であり、かつ構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にある１つ以上のポリヌクレオチドであって、発現ベクターが、宿主細胞（例えば植物細胞）内で一過性に発現するか、または、殺虫性タンパク質をコードするように作動可能なポリヌクレオチドが、植物もしくはその一部の核ＤＮＡに安定に組み込まれる、１つ以上のポリヌクレオチドが提示される。上記に関連する実施形態において、（１）殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするＤＮＡ構築物またはポリヌクレオチドの製造において有用なＴＰは、１つ以上のＩＣＫ ＴＰ、例えば、Ａｔｒａｃｉｎａｅ亜科に属するオーストラリアジョウゴグモから単離された殺虫性ＩＣＫペプチドの「ＡＣＴＸ」または「ＡＣＴＸペプチド」ファミリーから選択されるＴＰ、例えば、オメガＡＣＴＸ ＴＰ、カッパＡＣＴＸ ＴＰ、及びＵ−ＡＣＴＸ ＴＰ、例えば、Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｂから選択される１つ以上のＴＰを含んでよく（このＴＰは、１つより多い場合、同じであっても異なっていてもよい）、各殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、二元ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または両末端のいずれかにおいて、ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、ＭＶ、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、もしくはＤＴの群から選択されるか、またはこれらからなるＺ領域またはスペーサー配列にインフレームで融合した、ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、またはＬＦＡＡＰＦから選択される二元ペプチドのアミノ酸配列を含み得る、１つ以上の三元ペプチド（上文でＬと表記したもの）を更に含む。

一部の実施形態では、昆虫及び／または線虫有害生物を制御するための方法は、Ｂｔ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ＴＰ及びＩＣＫ（インヒビターシスチンノット）ＴＰの組み合わせを含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を含む製剤を、該昆虫及び／または線虫に適用することを含み得る。殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質からＴＰの少なくとも５０％が放出された後、Ｂｔ ＴＰのＩＣＫ ＴＰに対する比は、かかる放出後の乾燥重量に基づいて、少なくとも約９９：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５、５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、及び１：９９の比、またはこれらの値のうち任意の２つの任意の組み合わせから選択され得る。Ｂｔ ＴＰのＩＣＫ ＴＰに対する比は、かかる放出後の乾燥重量に基づいて、約５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、１：９９、０．５：９９．５、０．１：９９．９、及び０．０１：９９．９９の比、またはこれらの値のうち任意の２つの任意の組み合わせから選択されてもよい。製剤は、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質ならびに適切な賦形剤を含んでよい。あるいは、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、配合され植物に適用されると細菌株が殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を産生し、これが後に昆虫及び／または線虫有害生物により摂取されるような、１つ以上の細菌株の培養物によって発現させてもよい。種々の実施形態において、組成物中のＢｔ ＴＰ及びＩＣＫ ＴＰの総濃度は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９９％の濃度パーセント、またはこれらの値のうち任意の２つの間の任意の範囲から選択され、組成物のうち残りの百分率は、賦形剤からなる。本明細書に記述される殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質ならびに植物のうちのいずれも、昆虫及び／または線虫、それらの成長及び損害、特に植物への損害を制御するために使用され得る。一部の実施形態では、Ｂｔ ＴＰ及びＩＣＫ ＴＰの組み合わせを含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、植物、または昆虫の生息地、または保護を必要とする植物の生息地に散布することにより適用することができる。

一部の実施形態では、有害生物感染を制御するための例示的な方法は、本明細書に記述される、または本開示を所与として当業者が作製することのできる組成物のうちのいずれかを含み得る、Ｂｔ ＴＰ及びＩＣＫ ＴＰの組み合わせを含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を含む製剤を調製することを含む。記述される製剤の一部は、極性非プロトン性溶媒、及びまたは水の使用を含み、かつまたは極性非プロトン性溶媒が１〜９９重量％の量で存在する場合、極性プロトン性溶媒は１〜９９重量％の量で存在し、水は０〜９８重量％の量で存在する。この製剤には、Ｂｔ ＴＰがＤｉｐｅｌであり、ＩＣＫ ＴＰが、ハイブリッドＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａペプチド、あるいは、配列番号５、６及び１７６１、１７６２、１７６７、１７７１〜１７７３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはタンパク質、及びそれらの変異形と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％の配列同一性または配列相同性を有するＴＰである（このＴＰは、１つより多い場合、同じであっても異なっていてもよい）、製剤が含まれる。

極性非プロトン性溶媒製剤は、ＭＳＯを含有する場合に特に効果的である。以下の例は、本発明を説明することを意図するものであり、決して限定を意図するものではない。

一部の実施形態では、トランスジェニック植物もしくはその一部によって産生される、または植物に直接適用されるように配合される殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、Ｂｔ ＴＰ及びＴＭＯＦ ＴＰの組み合わせを含み、これは、単一の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質と組み合わせると、昆虫の棲む生息地にＴＰの組み合わせが適切に送達されたときに、昆虫の成長を阻害したり、動きを損なったり、または更にはそれを殺傷したりすることができる。噴霧乾燥粉末は、上文で詳解したＴＰの組み合わせを含む本明細書に記述される殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を一次活性剤として、そして１つ以上の種々の賦形剤及び発酵副産物を使用することによって作製することができる。

我々は、Ｂｔ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）タンパク質及びＴＭＯＦ ＴＰの両方を含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質組成物について記述する。一部の実施形態では、昆虫及び／または線虫有害生物を制御するための方法は、Ｂｔ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ＴＰ及びＴＭＯＦ ＴＰの組み合わせを含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を含む製剤を、該昆虫及び／または線虫に適用することを含み得る。殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質からＴＰの少なくとも５０％が放出された後、Ｂｔ ＴＰのＴＭＯＦ ＴＰに対する比は、かかる放出後の乾燥重量に基づいて、約９９：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５、５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、及び１：９９の比、またはこれらの値のうち任意の２つの任意の組み合わせのうちのいずれかまたは全てから選択され得る。製剤は、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質ならびに適切な賦形剤を含んでよい。あるいは、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、配合され植物に適用されると細菌株が殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を産生し、これが後に昆虫及び／または線虫有害生物により摂取されるような、１つ以上の細菌株の培養物によって発現させてもよい。種々の実施形態において、組成物中のＢｔ ＴＰ及びＴＭＯＦ ＴＰの総濃度は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９９％の濃度パーセント、またはこれらの値のうち任意の２つの間の任意の範囲から選択され、組成物のうち残りの百分率は、賦形剤からなる。本明細書に記述される殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質ならびに植物のうちのいずれも、昆虫及び／または線虫、それらの成長及び損害、特に植物への損害を制御するために使用され得る。一部の実施形態では、Ｂｔ ＴＰ及びＴＭＯＦ ＴＰの組み合わせを含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、植物、または昆虫の生息地、または保護を必要とする植物の生息地に散布することにより適用することができる。

一部の実施形態では、有害生物感染を制御するための例示的な方法は、本明細書に記述される、または本開示を所与として当業者が作製することのできる組成物のうちのいずれかを含み得る、Ｂｔ ＴＰ及びＴＭＯＦ ＴＰの組み合わせを含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を含む製剤を調製することを含む。記述される製剤の一部は、極性非プロトン性溶媒、及びまたは水の使用を含み、かつまたは極性非プロトン性溶媒が１〜９９重量％の量で存在する場合、極性プロトン性溶媒は１〜９９重量％の量で存在し、水は０〜９８重量％の量で存在する。ある特定の実施形態では、本明細書に提示されるように、任意の組み合わせのＴＰの殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、１つ以上の二元ペプチド及び／または三元ペプチドを含み得る。殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質には、スペーサーが三元ペプチドの二元ペプチド部分のＮ末端側または三元ペプチドの二元ペプチド部分のＣ末端側のいずれかに位置付けられている、三元ペプチドに連結した例示的な組み合わせにおける１つ以上のＴＰが含まれ得る。一部の実施形態では、スペーサーは、ジペプチド、例えばＧＳであり、これは、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質内のＴＭＯＦ ＴＰユニットに作動可能に連結していてよい。一部の実施形態では、スペーサージペプチドは、ＴＭＯＦ ＴＰのＮ末端側で連結しており、スペーサーは、ジペプチドがグリシン−セリンである実施形態を含め、ＴＭＯＦ ＴＰが本明細書に開示されるＴＭＯＦ配列のいずれかと少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性をもつ実施形態をＴＭＯＦ ＴＰが含む実施形態を含め、Ｂｔタンパク質が任意のＢｔ ＴＰである実施形態を含め、Ｂｔ ＴＰがＣｒｙまたはＣｙｔタンパク質である実施形態を含め、Ｂｔ ＴＰが、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ３、ＴＩＣ８５１、ＣｒｙＥＴ７０、Ｃｒｙ２２、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ２０１、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、二元殺虫性タンパク質ＣｒｙＥＴ８０、及びＣｒｙＥＴ７６、二元殺虫性タンパク質ＴＩＣ１００及びＴＩＣ１０１、殺虫性タンパク質ＥＴ２９またはＥＴ３７と殺虫性タンパク質ＴＩＣ８１０またはＴＩＣ８１２との組み合わせ、ならびに二元殺虫性タンパク質ＰＳ１４９Ｂ１からなる群から選択される実施形態を含め、Ｂｔ ＴＰが、Ｃｒｙタンパク質、Ｃｒｙ１Ａタンパク質、またはＣｒｙ１Ｆタンパク質から選択される実施形態を含め、Ｂｔ ＴＰがＣｒｙ１Ｆ−Ｃｒｙ１Ａ複合タンパク質である実施形態を含め、Ｂｔ ＴＰが、米国特許第７，３０４，２０６号の配列番号１０、１２、１４、２６、２８、または３４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む実施形態を含め、Ｂｔ内毒素がＤｉｐｅｌである実施形態を含め、Ｂｔタンパク質がＴｈｕｒｉｃｉｄｅである実施形態を含め、ジペプチドのＮ末端側にある１つの非極性アミノ酸と、ジペプチドのＣ末端側にある１つの極性アミノ酸とからなる。

一部の実施形態では、昆虫及び／または線虫有害生物を制御するための方法は、Ｂｔ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ＴＰ及びＴＭＯＦ ＴＰの組み合わせを含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を含む製剤を、該昆虫及び／または線虫に適用することを含み得る。殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質からＴＰの少なくとも５０％が放出された後、Ｂｔ ＴＰのＴＭＯＦ ＴＰに対する比は、かかる放出後の乾燥重量に基づいて、少なくとも約９９：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５、５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、及び１：９９の比、またはこれらの値のうち任意の２つの任意の組み合わせから選択され得る。Ｂｔ ＴＰのＴＭＯＦ ＴＰに対する比は、かかる放出後の乾燥重量に基づいて、約５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、１：９９、０．５：９９．５、０．１：９９．９、及び０．０１：９９．９９の比、またはこれらの値のうち任意の２つの任意の組み合わせから選択されてもよい。製剤は、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質ならびに適切な賦形剤を含んでよい。あるいは、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、配合され植物に適用されると細菌株が殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を産生し、これが後に昆虫及び／または線虫有害生物により摂取されるような、１つ以上の細菌株の培養物によって発現させてもよい。種々の実施形態において、組成物中のＢｔ ＴＰ及びＴＭＯＦ ＴＰの総濃度は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９９％の濃度パーセント、またはこれらの値のうち任意の２つの間の任意の範囲から選択され、組成物のうち残りの百分率は、賦形剤からなる。本明細書に記述される殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質ならびに植物のうちのいずれも、昆虫及び／または線虫、それらの成長及び損害、特に植物への損害を制御するために使用され得る。一部の実施形態では、Ｂｔ ＴＰ及びＴＭＯＦ ＴＰの組み合わせを含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、植物、または昆虫の生息地、または保護を必要とする植物の生息地に散布することにより適用することができる。

一部の実施形態では、有害生物感染を制御するための方法は、本明細書に記述されるＢｔ ＴＰ及びＴＭＯＦ ＴＰの組み合わせを発現する殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を発現する形質転換植物をもたらすことを含み、形質転換植物の平均的な葉において発現したＴＰの総量に対する重量百分率としてのＢｔ及びＴＭＯＦ ＴＰの各々の平均濃度は、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９９％、またはこれらの値のうち任意の２つの間の任意の範囲である。

一部の実施形態では、本明細書に記述されるＢｔ ＴＰ及びＴＭＯＦ ＴＰの組み合わせを発現する殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、トウモロコシ、ダイズ、ワタ、イネ、ソルガム、スイッチグラス、サトウキビ、アルファルファ、ジャガイモ、またはトマトにおいて発現する。一部の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、上述の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を有するトランスジェニック種子において発現する。

一部の実施形態では、形質転換植物は、適切にフォールディングされた本明細書に記述されるＢｔ ＴＰ及びＴＭＯＦ ＴＰの組み合わせを形質転換植物において発現させ、発現され適切にフォールディングされた本明細書に記述されるＢｔ ＴＰ及びＴＭＯＦ ＴＰの組み合わせを該植物中に蓄積させ、植物の収量あるいは昆虫及び／または線虫による損害に対する抵抗性を増加させ、作物及び天然または人工の森林における昆虫及び／または線虫有害生物を制御する。我々は、本明細書に記述される産物及びプロセスのうちのいずれかによって作製されるトランスジェニック植物について記述する。

（５）．トランスジェニック植物

本発明の方法は、宿主細胞、例えば植物にヌクレオチドまたはＤＮＡ構築物を導入することを含む。「導入すること」とは、ＤＮＡ構築物が植物の細胞内部に進入するような様式で構築物を植物に与えることを意図する。本発明の方法では、ＤＮＡ構築物を植物に導入するために特定の方法を使用する必要はなく、植物の少なくとも１つの細胞の内部にＤＮＡ構築物が進入することのみが必要である。ＤＮＡ構築物を植物に導入するための方法は当技術分野において公知であり、限定されるものではないが、安定形質転換法、一過性形質転換法、及びウイルス媒介法を含む。クローニング及び殺虫性タンパク質を含有する発現ベクターを含むポリヌクレオチドを形質転換させるための方法は、当技術分野において公知である。例えば、シグナルペプチド及び分子マーカーに融合した組換え殺虫性タンパク質を導入することにより植物をクローニングし形質転換させるための方法は、２０１３年３月８日に出願されたＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００４２号で確認することができ、この開示内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。一部の実施形態では、

「植物」とは、植物全体、その植物器官（例えば、葉、茎、根など）、種子、植物細胞、栄養繁殖体、胚、及び後代を意図する。植物細胞は、分化型であっても未分化型であってもよい（例えばカルス、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉細胞、根細胞、師部細胞、花粉）。

「トランスジェニック植物」または「形質転換植物」、または「安定に形質転換された」植物もしくは細胞もしくは組織とは、外因性核酸配列もしくはＤＮＡ断片を植物細胞に組み込んだ（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄまたはｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）植物を指す。これらの核酸配列には、外因性である、すなわち非形質転換植物細胞に存在しないもののほか、内因性である、すなわち非形質転換植物細胞に存在する場合があるものも含まれる。「異種」とは、概して、それらが存在する細胞または天然ゲノムの一部に対して内因性ではなく、感染、トランスフェクション、マイクロインジェクション、電気穿孔、マイクロプロジェクションなどによって細胞に付加された核酸配列を指す。

植物細胞の形質転換は、当技術分野で公知のいくつかの技術のうちの１つによって達成することができる。本発明のＤＮＡ構築物は、植物細胞での発現を達成または増強するように修飾され得る。典型的には、そのようなタンパク質を発現する構築物は、遺伝子の転写を推進するためのプロモーター、ならびに転写終結及びポリアデニル化を可能にするための３’非翻訳領域を含有する。そのような構築物の構成は、当技術分野で周知である。一部の事例では、結果として生じるペプチドが植物細胞内で分泌されるか、または別様にターゲティングされるように、遺伝子を工学操作することが有用な場合がある。例えば、小胞体へのペプチドの移送を促進するシグナルペプチドを含有するように遺伝子を工学操作してよい。イントロンのｍＲＮＡプロセシングが発現に必要とされるように、植物発現カセットを工学操作してイントロンを含有させることが好ましい場合もある。

種々の実施形態において、本発明の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ構築物は、未修飾の植物細胞に一過性もしくは安定に形質転換させてもよく、または、予め遺伝子改変された植物細胞に形質転換させてもよい。一実施形態において、本発明の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ構築物は、未修飾の植物細胞、すなわち、いかなる異種ＤＮＡまたはＲＮＡ物質による形質転換もトランスフェクションも予め受けていない植物細胞に安定に形質転換させてもよい。外来または異種の発現ベクターを安定に組み込むための方法を以下に記述する。他の実施形態では、１つの本発明の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするように作動可能なポリヌクレオチドを含む１つのＤＮＡ構築物で、遺伝子改変されていない植物細胞を形質転換させることができる。この実施形態において、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、１つのタイプのＴＰ、例えばＩＣＫモチーフＴＰのみを含有する。他の実施形態では、遺伝子改変されていない植物細胞を２つの異なるＤＮＡ構築物で形質転換させてもよく、各構築物は、１つの本発明の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするように作動可能なポリヌクレオチドを含み、各構築物の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、異なるＴＰを含み、例えば、一方のＤＮＡ構築物において、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、ＩＣＫモチーフＴＰの１つ以上のコピーを含み、他方のＤＮＡ構築物は、異なるＴＰ（例えばＢｔ ＴＰ）をコードするポリヌクレオチドを含む。両タイプの殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質の発現は、いずれかの殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質、あるいは両方一緒の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質の差次的発現をもたらすように、同じプロモーターまたは異なるプロモーター、及び他の制御配列を使用して操作され得る。

一部の実施形態では、トランスジェニック植物またはその一部は、１つ以上のＴＰを含有する１つ以上の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を産生または発現することができる。一実施形態において、ＴＰは、ＩＣＫ ＴＰ、例えばハイブリッドＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、例えば、配列番号５または６のアミノ酸配列を有するＴＰ（またはそれらの変異形）であり、かつ／または、発現したＩＣＫ ＴＰは、２０〜１００個のアミノ酸及び２〜４つのジスルフィド結合を含有してよく、かつまたは、ＩＣＫ ＴＰは、本明細書に記述されるＩＣＫ ＴＰ及び／またはＢｔ ＴＰ、ならびに配列番号５〜１５９３及び１７６１〜１７７５に示されるアミノ酸配列を有する任意のＴＰにおいて明確に例示されるもの、またはそれらの変異形のうちのいずれかと、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％以上の配列同一性を有する任意の殺虫性ペプチドである。

種々の実施形態において、トランスジェニック植物は、同じであっても異なっていてもよい１つ以上のＩＣＫ ＴＰ（例えば、オメガＡＣＴＸ ＴＰ、カッパＡＣＴＸ ＴＰ、またはＵ−ＡＣＴＸ ＴＰ、例えばハイブリッドＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ ＴＰ）、または配列番号５、６及び１７６１、１７６２、１７６７、１７７１〜１７７３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドもしくはタンパク質、及びそれらの変異形と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％の配列同一性または配列相同性を有するＴＰ（このＴＰは、１つより多い場合、同じであっても異なっていてもよい）を発現及び産生し得る。

別の実施形態では、トランスジェニック植物またはその一部は、同じであっても異なっていてもよい１つ以上のＢｔ ＴＰを発現及び産生し得る。トランスジェニック植物またはその一部は、同じタイプのＴＰまたは異なるＴＰを発現及び産生してよいが、トランスジェニック植物は、同じＤＮＡ構築物からＩＣＫ ＴＰ及びＢｔ ＴＰをコードし発現するように作動可能である単一のＤＮＡ構築物を有しないことを理解されたい。これら２つのタイプのＴＰは、植物またはその一部において発現及び産生され得るが、これら２つのタイプのＴＰは、本明細書に記述される別々のＤＮＡ構築物を起源とする。本明細書に開示されるトランスジェニック植物は、ＣｒｙもしくはＣｙｔタンパク質ＴＰをはじめとする既知のＢｔ ＴＰ、及び／またはＣｒｙ１、Ｃｒｙ３、ＴＩＣ８５１、ＣｒｙＥＴ７０、Ｃｒｙ２２、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ２０１、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、ＣｒｙＥＴ８０、及びＣｒｙＥＴ７６、ＴＩＣ１００、ＴＩＣ１０１、ＥＴ２９、ＥＴ３７、ＴＩＣ８１０、ＴＩＣ８１２、ＰＳ１４９Ｂ１からなる群から選択されるＢｔ ＴＰ、ならびにそれらの組み合わせを含有する殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を含有し、発現し、産生することができる。Ｂｔ ＴＰは、Ｃｒｙタンパク質、Ｃｒｙ１Ａタンパク質、もしくはＣｒｙ１Ｆタンパク質、またはＣｒｙ１Ｆ−Ｃｒｙ１Ａ複合タンパク質から選択することができる。または、米国特許第７，３０４，２０６号の配列番号１０、１２、１４、２６、２８、もしくは３４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、トランスジェニック植物は、Ｂｔ ＴＰ、例えばＤｉｐｅｌ及び／またはＴｈｕｒｉｃｉｄｅを含む、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を産生し得る。

一部の実施形態では、本明細書に記述されるＴＰを発現するトランスジェニック植物において、形質転換植物の平均的な葉において発現したＴＰの総量に対する重量百分率としてのＢｔ及びＩＣＫ ＴＰの各々の平均濃度は、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは９９％、またはこれらの値のうち任意の２つの間の任意の範囲である。

一部の実施形態では、本明細書に記述される殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、トウモロコシ、ダイズ、ワタ、イネ、ソルガム、スイッチグラス、サトウキビ、アルファルファ、ジャガイモ、またはトマトにおいて発現する。一部の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、上述の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を有するトランスジェニック種子において発現する。

他の実施形態では、本発明の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするように作動可能であるポリヌクレオチドを含むＤＮＡ構築物は、予め遺伝子修飾された植物細胞、例えば、別のＴＰ（例えば本明細書に記述されるＩＣＫモチーフＴＰまたはＢｔ ＴＰ）で予め形質転換された植物細胞において、一過性または安定に発現させることができる。この実施形態において、本発明のＤＮＡ構築物は、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質あるいは予め導入されたＴＰのいずれかの発現が、同じプロモーターによって制御され得るように、あるいは、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質ならびに予め導入されたＴＰの各々が、両方の差次的発現を促進するように異なるプロモーターもしくは発現条件を使用して制御され得るように、形質転換させることができる。ＤＮＡ構築物が、複数のＴＰを有する殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするように作動可能なポリヌクレオチドを含むか、あるいは単一のＴＰを含有する複数のＤＮＡ構築物の形質転換かにかかわらず、２つの異なるＢｔ ＴＰの形質転換は起こり得ないことを理解されたい。いずれの場合にせよ、単一のＴＰとして発現するか、あるいは同じ種のＢｔ ＴＰの複数のコピーを含有する殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質において発現するかにかかわらず、単一種のＢｔ ＴＰしか植物に形質転換され得ない。

一部の実施形態では、本発明は、Ｂｔ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ＴＰ及びＩＣＫ（インヒビターシスチンノット）ＴＰの組み合わせを含むトランスジェニック植物を提示する。このトランスジェニック植物は、Ｂｔ ＴＰを発現する第１の顕花植物と、ＩＣＫ ＴＰを発現する第２の顕花植物とを作出する、本明細書に提示されるＤＮＡ構築物の独立した別々の安定な遺伝子挿入から作製することができる。これらの植物のうちの１つの花粉を他の植物の雌花器官と交雑させると、Ｂｔ ＴＰを含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質と、ＩＣＫ ＴＰ遺伝形質を含む異なる殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質との両方を含有する遺伝子ハイブリダイゼーションが形成される。この性的交雑の後代、及び両方の形質の遺伝をもたらす更なる交雑により、Ｂｔ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ＴＰ及びＩＣＫ（インヒビターシスチンノット）ＴＰの組み合わせを含むトランスジェニック植物がもたらされる。

一部の実施形態では、トランスジェニック植物またはその一部は、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするＤＮＡ構築物によってコードされる殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を発現するように作動可能であり、この殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、二元ペプチドまたは三元ペプチドのＮ末端にインフレームで融合したＥＲＳＰを含む（この二元ペプチドまたは三元ペプチドは、（ＴＰ−Ｌ）_ｎを含む構築物にインフレームで融合している）か、あるいは殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、二元ペプチド及び／またはリピート構築物（Ｌ−ＴＰ）_ｎもしくは（ＴＰ−Ｌ）_ｎにインフレームで融合したＥＲＳＰを含む。種々の実施形態において、例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、（ＥＲＳＰ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）の構築物を含み得る。別の実施形態では、トランスジェニック植物またはその一部は、作動可能なプロモーターに作動可能に連結したポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドは、安定化ドメイン（ＳＴＡ）のＮ末端にインフレームで融合したＥＲＳＰを含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードする。ＳＴＡは、二元ペプチドまたは三元ペプチドのＮ末端、あるいは（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−Ｌ、（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、またはＬ−（ＴＰ−Ｌ）_ｎを含む構築物のＮ末端のいずれかにインフレームで融合している。種々の実施形態において、例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）−ＴＰ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）、（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−Ｌ、（Ｌ−ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、または（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ（式中、（Ｌ）は二元ペプチドまたは三元ペプチドであり、各Ｌは、同じであっても異なっていてもよく、ＴＰは、同じであっても異なっていてもよい毒性ペプチドであり、ｎは、１〜２００、好ましくは１〜１００、最も好ましくは１〜１０の範囲の整数である）の構築物を含み得る。一部の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、同じであるかまたは異なっているＴＰと、同じであるかまたは異なっている二元ペプチド及び／または三元ペプチドとを含有し得る。一部の実施形態では、Ｃ末端側ＴＰは、そのＣ末端において、二元ペプチドまたは三元ペプチドに融合しているか、または融合していない。上記に関連する実施形態において、トランスジェニック植物またはその一部は、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質の製造において有用な１つ以上のＴＰを含み得る。トランスジェニック植物またはその一部は、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を含んでよく、これは、１つ以上のＩＣＫ ＴＰ、例えば、Ａｔｒａｃｉｎａｅ亜科に属するオーストラリアジョウゴグモから単離された殺虫性ＩＣＫペプチドの「ＡＣＴＸ」または「ＡＣＴＸペプチド」ファミリーから選択されるＴＰ、例えば、オメガＡＣＴＸ ＴＰ、カッパＡＣＴＸ ＴＰ、及びＵ−ＡＣＴＸ ＴＰ、例えば、Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｂ、もしくはハイブリッドＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａペプチドから選択される１つ以上のＴＰ、または配列番号５、６及び１７６１、１７６２、１７６７、１７７１〜１７７３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドもしくはタンパク質、及びそれらの変異形と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％の配列同一性または配列相同性を有するＴＰを含んでよく（このＴＰは、１つより多い場合、同じであっても異なっていてもよい）、各殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、二元ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または両末端のいずれかにおいて、ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、ＭＶ、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、もしくはＤＴの群から選択されるか、またはこれらからなるＺ領域またはスペーサー配列にインフレームで融合した、ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、またはＬＦＡＡＰＦから選択される二元ペプチドのアミノ酸配列を含み得る、１つ以上の三元ペプチド（上文でＬと表記したもの）を更に含む。

種々の実施形態において、植物またはその一部、例えば植物細胞は、Ｂｔ ＴＰで予め形質転換されており、Ｂｔ ＴＰを含有する植物またはその一部、例えば植物細胞はその後、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするように作動可能なＤＮＡ構築物で形質転換され、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、１つ以上のＩＣＫ ＴＰ、例えば、Ａｔｒａｃｉｎａｅ亜科に属するオーストラリアジョウゴグモから単離された殺虫性ＩＣＫペプチドの「ＡＣＴＸ」または「ＡＣＴＸペプチド」ファミリーから選択されるＴＰ、例えば、オメガＡＣＴＸ ＴＰ、カッパＡＣＴＸ ＴＰ、及びＵ−ＡＣＴＸ ＴＰ、例えば、Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｂ、もしくはハイブリッドＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａペプチドから選択される１つ以上のＴＰ、または配列番号５、６及び１７６１、１７６２、１７６７、１７７１〜１７７３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドもしくはタンパク質、及びそれらの変異形と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％の配列同一性または配列相同性を有するＴＰを含んでよく（このＴＰは、１つより多い場合、同じであっても異なっていてもよい）、各殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、二元ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または両末端のいずれかにおいて、ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、ＭＶ、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、もしくはＤＴの群から選択されるか、またはこれらからなるＺ領域またはスペーサー配列にインフレームで融合した、ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、またはＬＦＡＡＰＦから選択される二元ペプチドのアミノ酸配列を含み得る、１つ以上の三元ペプチド（上文でＬと表記したもの）を更に含む。結果として生じる植物またはその一部、例えば植物細胞は、Ｂｔ ＴＰと１つ以上のＩＣＫモチーフＴＰを含有する殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質とを安定に発現する。

種々の実施形態では、安定な植物形質転換技術を使用して殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を植物ゲノムに組み込むこともでき、したがって、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を植物で安定に発現させ、世代を超えて形質転換植物を保護することができる。植物の安定な形質転換において、ＤＮＡ構築物を含む発現ベクターは環状であっても線状であってもよい。ベクターＤＮＡには、いくつかの重要な成分が含まれていなければならない。安定な植物形質転換のための殺虫性及び／または殺線虫性の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質ＯＲＦは、上述の一過性植物発現における研究に基づいて、植物における最適な発現のために慎重にデザインする必要がある。殺虫性及び／または殺線虫性の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質の発現は通常、トランスジェニック植物の全細胞の一部において転写を推進するプロモーターによって制御される。プロモーターは、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）由来の構成的３５Ｓプロモーターのような強力な植物ウイルスプロモーターであってよく、また、例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のヒドロペルオキシドリアーゼプロモーター（ｐＨＰＬ）、ダイズ由来のグリシンマックスポリユビキチン（Ｇｍｕｂｉ）プロモーター、異なる植物種（イネ、トウモロコシ、ジャガイモなど）由来のユビキチンプロモーターなどの強力な植物プロモーターであってもよい。植物転写ターミネーターは、多くの場合、ＯＲＦの終止コドンの後に存在し、ＲＮＡポリメラーゼ及びｍＲＮＡの転写を停止させる。殺虫性及び／または殺線虫性の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質の発現を評価するためには、例えば、ＧＵＳ染色アッセイのためのベータグルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）、ＵＶ光下での緑色蛍光検出のための緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子など、レポーター遺伝子を発現ベクターに含めることができる。形質転換植物の選択のためには、選択マーカー遺伝子が発現ベクターに通常含まれる。マーカー遺伝子発現産物は、特定の抗生物質、例えばカナマイシン、ハイグロマイシンなど、または特定の除草剤、例えばグリホサートなどに対する抵抗性を有する形質転換植物をもたらすことができる。植物形質転換のためにアグロインフェクション技術が採用される場合、Ｔ−ＤＮＡ部分を植物中に輸送するために、Ｔ−ＤＮＡの左境界配列及び右境界配列も発現ベクターに含まれる。構築された発現ベクターは、任意の数の確立された周知の形質転換技術を使用して植物細胞または組織に形質転換させることができる。アグロインフェクションは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株またはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ株を使用して植物を形質転換させるための非常に人気のある方法である。微粒子銃（遺伝子銃またはバイオリスティクスとも呼ばれる）技術も、植物形質転換のために非常に一般的に使用される。さほど一般的に使用されない他の形質転換法としては、組織電気穿孔、炭化ケイ素ウィスカー、ＤＮＡの直接注入などが挙げられる。形質転換後、形質転換された植物細胞または組織を植物再生培地に置き、形質転換に成功した植物細胞または組織をトランスジェニック植物へと再生させる。形質転換植物における殺虫性及び／または殺線虫性の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質ＯＲＦの組み込み及び発現の評価を行うことができる。

一部の実施形態では、「植物発現カセット」が「植物形質転換ベクター」に挿入され得る。例示的な植物形質転換ベクターは、植物形質転換を達成するために必要な１つ以上のＤＮＡベクターからなる場合がある。例えば、当技術分野では、１つより多くの連続したＤＮＡセグメントからなる植物形質転換ベクターを利用することが恒例である。これらのベクターは、当技術分野では「二元ベクター」と呼ばれることが多い。二元ベクターならびにヘルパープラスミドを有するベクターは、ほとんどの場合、効率的な形質転換を達成するために必要なＤＮＡセグメントのサイズ及び複雑さがかなり大きいＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換に使用され、別々のＤＮＡ分子に機能を分けることが有利である。二元ベクターは、典型的には、Ｔ−ＤＮＡ移入に必要とされるシス作用性配列（例えば左境界及び右境界）と、植物細胞における発現が可能であるように工学操作されている選択可能なマーカーと、「目的の遺伝子」（トランスジェニック植物の生成が所望される植物細胞における発現が可能であるように工学操作された遺伝子）とを含有する、プラスミドベクターを含有する。このプラスミドベクターには、細菌の複製に必要とされる配列も存在する。シス作用性配列は、植物細胞への効率的な移入及びその中での発現を可能にするようなかたちで配置されている。例えば、選択可能なマーカー遺伝子ならびに本明細書に記述される殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、左境界と右境界との間に位置する。多くの場合、第２のプラスミドベクターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍから植物細胞へのＴ−ＤＮＡ移入を媒介するトランス作用因子を含有する。このプラスミドは、当技術分野で理解されているように（Ｈｅｌｌｅｎｓ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５：４４６−４５１）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる植物細胞の感染、ならびに境界配列における切断によるＤＮＡの移入、及びｖｉｒ媒介性ＤＮＡ移入を可能にする、病原性機能（Ｖｉｒ遺伝子）を含むことが多い。いくつかのタイプのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株（例えば、ＬＢＡ４４０４、ＧＶ３１０１、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５など）を植物形質転換のために使用することができる。例えばマイクロプロジェクション、マイクロインジェクション、電気穿孔、ポリエチレングリコールといった他の方法では、植物を形質転換させるために第２のプラスミドベクターは必要ない。

一般的に、植物形質転換法は、標的植物細胞（例えば、未熟胚または成熟胚、懸濁培養物、未分化のカルス、プロトプラストなど）に異種ＤＮＡを移入した後に、最大閾値レベルの適切な選択（選択可能なマーカー遺伝子に左右される）を適用して、形質転換されていない細胞塊の群から形質転換された植物細胞を回収することを含む。外植片は、典型的に、新たに供給された同じ培地に移され、日常的に培養される。その後、最大閾値レベルの選択剤を添加した再生培地に形質転換細胞を置いた後、苗条に分化させる。次に苗条を選択的発根培地に移し、発根した苗条または小植物を回収する。その後、トランスジェニック小植物が成熟植物に成長し、稔性種子を生成する（例えば、Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ６：２７１−２８２、Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：７４５−７５０）。外植片は、典型的に、新たに供給された同じ培地に移され、日常的に培養される。トランスジェニック植物を生成するための技術及び方法の概説は、Ａｙｒｅｓ ａｎｄ Ｐａｒｋ（１９９４）Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １３：２１９−２３９、及びＢｏｍｍｉｎｅｎｉ ａｎｄ Ｊａｕｈａｒ（１９９７）Ｍａｙｄｉｃａ ４２：１０７−１２０に見出される。形質転換した材料は多くの細胞を含有するため、形質転換細胞と非形質転換細胞との両方が、対象となる標的のカルスまたは組織または細胞群のいずれにおいても存在する。非形質転換細胞を殺傷し、形質転換細胞を増殖させる能力により、形質転換植物の培養物がもたらされる。多くの場合、非形質転換細胞を除去する能力は、形質転換植物細胞の迅速な回収及びトランスジェニック植物の生成の成功を制限する。

形質転換プロトコール、ならびにヌクレオチド配列を植物に導入するためのプロトコールは、形質転換の標的となる植物または植物細胞のタイプ、すなわち単子葉植物または双子葉植物に応じて異なり得る。トランスジェニック植物の生成は、限定されるものではないが、マイクロインジェクション、電気穿孔、直接遺伝子移入、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる異種ＤＮＡの植物細胞への導入（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換）、粒子に付着した異種外来ＤＮＡの植物細胞への照射、弾道粒子加速、エアロゾルビーム形質転換（米国公開出願第２００１００２６９４１号、米国特許第４，９４５，０５０号、国際公開第ＷＯ９１／００９１５号、米国公開出願第２００２０１５０６６号）、Ｌｅｃ１形質転換、及びＤＮＡを移入するための種々の他の非粒子直接媒介方法を含む、いくつかの方法のうちの１つによって行われ得る。

葉緑体の形質転換のための方法は、当技術分野において公知である。例えば、Ｓｖａｂ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：８５２６−８５３０、Ｓｖａｂ ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：９１３−９１７、Ｓｖａｂ ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：６０１−６０６を参照のこと。この方法は、選択可能なマーカーを含有するＤＮＡの粒子銃送達、及び相同組換えによるプラスチドゲノムへのＤＮＡのターゲティングに依存する。更に、プラスチドの形質転換は、核コード型及びプラスチド指向性のＲＮＡポリメラーゼの組織優先的発現による、サイレントプラスチド媒介導入遺伝子のトランス活性化によって達成することができる。そのような系は、ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：７３０１−７３０５において報告されている。

異種外来ＤＮＡを植物細胞に組み込んだ後、培地中で最大閾値レベルの適切な選択を適用して非形質転換細胞を殺傷し、この選択処置から生存する推定的に形質転換された細胞を定期的に新鮮培地に移すことによって分離及び増殖させる。連続継代及び適切な選択の負荷により、プラスミドベクターで形質転換された細胞が特定され、増殖される。次に、分子学的方法及び生化学的方法を使用して、トランスジェニック植物のゲノムに組み込まれた目的の異種遺伝子の存在を確認することができる。

形質転換された細胞は、従来の方法に従って植物に成長させることができる。例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：８１−８４を参照のこと。その後、これらの植物を生育し、同じ形質転換系統または異なる系統のいずれかを受粉させ、結果として生じる所望される表現型の特徴を構成的に発現するハイブリッドを特定することができる。二世代以上を生育して、所望される表現型の特徴の発現が安定に維持され遺伝されることを確実にし、次に種子を採取して、所望される表現型の特徴の発現が達成されたことを確実にすることができる。このようにして、本発明では、本発明のヌクレオチド構築物（例えば本発明の発現カセット）がゲノムに安定に組み込まれた、形質転換された種子（別称「トランスジェニック種子」）がもたらされる。

（５Ａ）．植物形質転換の評価

異種外来ＤＮＡを植物細胞に導入した後、異種遺伝子の形質転換または植物ゲノムにおける組み込みが、組み込まれた遺伝子に関連する核酸、タンパク質、及び代謝物の解析などの種々の方法によって確認される。

ＰＣＲ解析は、形質転換された細胞、組織、または苗条に組み込まれた遺伝子の存在を、土壌に移植する前の早期段階でスクリーニングする高速の方法である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。ＰＣＲは、目的の遺伝子またはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍベクターバックグラウンドなどに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して行われる。

植物形質転換は、ゲノムＤＮＡのサザンブロット解析によって確認してもよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１、上記）。一般的には、全ＤＮＡを形質転換体から抽出し、適切な制限酵素で消化し、アガロースゲルで分画し、ニトロセルロースまたはナイロン膜に移す。次にこの膜または「ブロット」を、例えば放射標識^３２Ｐ標的ＤＮＡ断片でプローブして、導入された遺伝子の植物ゲノムへの組み込みを標準的技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１、上記）に従って確認する。

ノーザンブロット解析では、形質転換体の特定の組織からＲＮＡを単離し、ホルムアルデヒドアガロースゲルで分画し、当技術分野で日常的に使用されている標準的手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１、上記）に従ってナイロンフィルタにブロッティングする。次に、当技術分野で公知の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１、上記）により、Ｂｔタンパク質に由来する放射性プローブにフィルタをハイブリダイズすることにより、Ｂｔタンパク質によりコードされるＲＮＡの発現を試験する。

ウエスタンブロット、生化学的アッセイなどをトランスジェニック植物に行って、ＴＰに存在する１つ以上のエピトープに結合する抗体を使用した標準的手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１、上記）により、形質転換したＴＰの存在を確認してもよい。

したがって、本発明は、作動可能なプロモーター（例えば同種または異種プロモーター）に作動可能に連結したポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物またはその一部であって、ポリヌクレオチドが、本明細書に記述される二元ペプチドまたは三元ペプチドのいずれかを含むペプチドをコードする、トランスジェニック植物またはその一部を提示する。一部の実施形態では、二元ペプチドまたは三元ペプチドは、少なくとも４個のアミノ酸から最大１６個までのアミノ酸のアミノ酸配列を含み得る。二元ペプチドは２つの領域を有し、三元ペプチドは、同じ２つの領域及びスペーサーと呼ばれるもう１つの領域を有する。二元ペプチド及び／または三元ペプチドの各々は、動物の腸内プロテアーゼ、例えばヒトの消化管プロテアーゼ、及び昆虫または線虫の腸内プロテアーゼの両方によって切断可能である。種々の実施形態において、ポリヌクレオチドはまた、そのＣ末端において二元ペプチド及び／または三元ペプチドのＮ末端に融合した小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）をコードする。これらの実施形態において、二元ペプチド及び／または三元ペプチドはまた、ＴＰのＮ末端に作動可能に融合している。更に他の実施形態において、トランスジェニック植物は、作動可能なプロモーター（例えば同種または異種プロモーター）に作動可能に連結した少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むＤＮＡ構築物で形質転換された１つの細胞または複数の細胞を含有してもよく、このポリヌクレオチドは、２つ以上の切断可能な二元ペプチドまたは三元ペプチドを有する殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードする。殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、Ｃ末端において二元ペプチドまたは三元ペプチドのＮ末端にインフレームで融合したＥＲＳＰを含み、二元ペプチドまたは三元ペプチドは、そのＣ末端において、（ＴＰ−Ｌ）_ｎ（式中、ＴＰは毒性ペプチドまたはタンパク質であり、Ｌは二元ペプチドまたは三元ペプチドであり、ｎは、１〜２００、１〜１００、または１〜１０の範囲の整数である）を含む構築物にインフレームで融合している。これらの殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質において、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質の最後の、すなわちそのＣ末端におけるＴＰは、そのＣ末端において、二元ペプチドまたは三元ペプチドに融合していても融合していなくてもよい。種々の実施形態において、例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、（ＥＲＳＰ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）の構造を含み得る。別の実施形態では、植物またはその一部は、作動可能なプロモーター（例えば同種または異種プロモーター）に作動可能に連結したポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドは、安定化ドメイン（ＳＴＡ）のＮ末端にインフレームで融合したＥＲＳＰを含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードする。ＳＴＡは、二元ペプチドまたは三元ペプチドのＮ末端、あるいは（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−Ｌ、（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、またはＬ−（ＴＰ−Ｌ）_ｎを含む構築物のＮ末端のいずれかにインフレームで融合している。種々の実施形態において、例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）−ＴＰ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）、（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−Ｌ、（Ｌ−ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、または（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ（式中、（Ｌ）は二元ペプチドまたは三元ペプチドであり、各Ｌは、同じであっても異なっていてもよく、ＴＰは、同じであっても異なっていてもよい毒性ペプチドであり、ｎは、１〜２００、好ましくは１〜１００、最も好ましくは１〜１０の範囲の整数である）の構築物を含むか、またはこれらからなる群から選択されるか、またはこれらからなっていてよい。一部の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、同じであるかまたは異なっているＴＰと、同じであるかまたは異なっている二元ペプチド及び／または三元ペプチドとを含有し得る。一部の実施形態では、Ｃ末端側ＴＰは、そのＣ末端において、二元ペプチドまたは三元ペプチドに融合しているか、または融合していない。

一部の実施形態では、本明細書に記述される切断可能な連結ペプチドを含む殺虫性及び／または殺線虫性ペプチド組成物の発現を受容し得るトランスジェニック植物またはその一部としては、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、キャッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、柑橘類、ココナツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバ、ワタ、ウリ科植物、キュウリ、ベイマツ、ナス、ユーカリ、アマ、ニンニク、ブドウ、ホップ、ニラ、レタス、タエダマツ、アワ、メロン、ナッツ、カラスムギ、オリーブ、タマネギ、装飾用植物、パーム、牧草、エンドウマメ、ピーナッツ、コショウ、キマメ、マツ、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ、ラジアータマツ、ダイコン、ナタネ、イネ、台木、ライムギ、ベニバナ、低木、ソルガム、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、スカッシュ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、モミジバフウ、サツマイモ、スイッチグラス、茶、タバコ、トマト、ライコムギ、芝草、スイカ、及びコムギ植物を挙げることができる。一部の実施形態では、トランスジェニック植物は、本明細書に記述されるＤＮＡ構築物で初めに形質転換された細胞から生育してもよい。他の実施形態では、トランスジェニック植物は、特定の組織、または植物の一部、例えば葉、茎、花、萼片、果実、根、もしくは種子、またはそれらの組み合わせにおいて、コードされる殺虫性及び／または殺線虫性ペプチド組成物を発現し得る。

本発明の別の態様では、適切なプロテアーゼの存在下で切断されると殺有害生物活性を有する、殺虫性及び／または殺線虫性の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を発現する、トランスジェニック植物を生成してもよい。例として上述した方法を利用してトランスジェニック植物を生成してもよいが、トランスジェニック植物細胞を生成する様式は本発明に重要ではない。当技術分野で公知または記述されている方法、例えばＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換、バイオリスティック形質転換（例えば、Ｋｉｋｋｅｒｔ ＪＲ１，Ｖｉｄａｌ ＪＲ，Ｒｅｉｓｃｈ ＢＩ．，“Ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ／ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ．”，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００５；２８６：６１−７８を参照のこと。その開示内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれている）、及び非粒子媒介方法を使用してよい。殺虫性及び／または殺線虫性の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を発現する植物は、当技術分野で説明されている一般的な方法によって、例えば、カルスの形質転換、形質転換されたカルスの選択、及びそのようなトランスジェニックカルスからの稔性植物の再生によって単離され得る。そのようなプロセスでは、植物細胞における遺伝子の発現が形質転換細胞を特定または選択する能力をもたらす限り、任意の遺伝子を選択可能なマーカーとして使用してよい。

植物細胞に使用される、例えばクロラムフェニコール、アミノグリコシドＧ４１８、ハイグロマイシンなどに対する抵抗性のための、いくつかのマーカーが開発されている。葉緑体の代謝に関与する産物をコードする他の遺伝子を選択可能なマーカーとして使用することもできる。例えば、グリホサート、ブロモキシニル、またはイミダゾリノンなどの植物の除草剤に対する抵抗性をもたらす遺伝子が特に利用され得る。そのような遺伝子は報告されている（Ｓｔａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：６３１０−６３１４（ブロモキシニル抵抗性ニトリラーゼ遺伝子）、及びＳａｔｈａｓｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：２１８８（ＡＨＡＳイミダゾリノン抵抗性遺伝子））。更に、本明細書に開示される遺伝子は、細菌細胞または植物細胞の形質転換を鑑定するためのマーカーとして有用である。植物、その植物器官（例えば、葉、茎、根など）、種子、植物細胞、栄養繁殖体、胚、または後代における導入遺伝子の存在を検出するための方法は、当技術分野で周知である。一実施形態において、導入遺伝子の存在は、殺有害生物活性について試験することによって検出される。

殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を発現する稔性植物を殺有害生物活性について試験し、最適な活性を示す植物を更なる繁殖のために選択することができる。有害生物活性についてアッセイするための方法は、当技術分野において利用可能である。概して、切断されたＴＰを混合し、給餌アッセイにおいて使用する。例えば、Ｍａｒｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．ｏｆ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ ７８：２９０−２９３を参照のこと。

したがって、本発明は、トランスジェニック植物、つまり、形質転換される植物細胞において作動可能である作動可能なプロモーター（例えば同種または異種プロモーター）に作動可能に連結したポリヌクレオチドを含むＤＮＡ構築物で形質転換された植物またはその一部を提示する。一部の実施形態では、形質転換されたポリヌクレオチドは、二元ペプチドまたは三元ペプチドのいずれかを含むペプチドをコードし、このペプチドは、少なくとも４個のアミノ酸から最大１６個のアミノ酸を含有し、かつ２つまたは３つの異なる領域からなる。二元ペプチドは２つの異なる領域を有し、三元ペプチドは３つの異なる領域を有する。二元ペプチド及び三元ペプチドは、動物（例えばヒト）の腸内プロテアーゼ及び昆虫または線虫の腸内プロテアーゼの両方によって切断可能である。二元ペプチドまたは三元ペプチドは、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）のＣ末端に作動可能に融合しており、かつ、ＴＰのＮ末端に作動可能に融合している。種々の実施形態において、植物細胞は、作動可能なプロモーター（例えば同種または異種プロモーター）に作動可能に連結した少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むＤＮＡ構築物で形質転換され、このポリヌクレオチドは、１つ以上の切断可能な二元ペプチドまたは三元ペプチドを有する殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードする。殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、二元ペプチドまたは三元ペプチドのＮ末端にインフレームで融合したＥＲＳＰを含み、二元ペプチドまたは三元ペプチドは、（ＴＰ−Ｌ）_ｎ（式中、ＴＰは毒性タンパク質であり、Ｌは二元ペプチドまたは三元ペプチドであり、ｎは１〜２００の範囲の整数である）を含む構築物にインフレームで融合しており、Ｃ末端側ＴＰは、そのＣ末端において、二元ペプチドまたは三元ペプチドに融合しているか、または融合していない。一部の実施形態では、本発明は、トランスジェニック植物であって、トランスジェニック植物またはその一部において発現される殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質が、二元ペプチドまたは三元ペプチドのＮ末端にインフレームで融合したＥＲＳＰをコードするＤＮＡ構築物に由来し、二元ペプチドまたは三元ペプチドが、（ＴＰ−Ｌ）_ｎ（式中、ＴＰは毒性タンパク質であり、Ｌは二元ペプチドまたは三元ペプチドであり、ｎは１〜２００の範囲の整数である）を含む構築物にインフレームで融合しており、Ｃ末端側ＴＰが、そのＣ末端において、二元ペプチドまたは三元ペプチドに融合しているか、または融合していない、トランスジェニック植物を提示する。種々の実施形態において、例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、（ＥＲＳＰ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）の構造を含み得る。別の実施形態では、植物またはその一部は、作動可能なプロモーター（例えば同種または異種プロモーター）に作動可能に連結したポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドは、安定化ドメイン（ＳＴＡ）のＮ末端にインフレームで融合したＥＲＳＰを含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードする。ＳＴＡは、二元ペプチドまたは三元ペプチドのＮ末端、あるいは（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−Ｌ、（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、またはＬ−（ＴＰ−Ｌ）_ｎを含む構築物のＮ末端のいずれかにインフレームで融合している。種々の実施形態において、例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）−ＴＰ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）、（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−Ｌ、（Ｌ−ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、または（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ（式中、（Ｌ）は二元ペプチドまたは三元ペプチドであり、各Ｌは、同じであっても異なっていてもよく、ＴＰは、同じであっても異なっていてもよい毒性ペプチドであり、ｎは、１〜２００、好ましくは１〜１００、最も好ましくは１〜１０の範囲の整数である）を含む構築物を含み得る。一部の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、同じであるかまたは異なっているＴＰと、同じであるかまたは異なっている二元ペプチド及び／または三元ペプチドとを含有し得る。一部の実施形態では、Ｃ末端側ＴＰは、そのＣ末端において、二元ペプチドまたは三元ペプチドに融合しているか、または融合していない。上記に関連する実施形態において、（１）殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするＤＮＡ構築物またはポリヌクレオチドの製造において有用なＴＰは、１つ以上のＩＣＫ ＴＰ、例えば、Ａｔｒａｃｉｎａｅ亜科に属するオーストラリアジョウゴグモから単離された殺虫性ＩＣＫペプチドの「ＡＣＴＸ」または「ＡＣＴＸペプチド」ファミリーから選択されるＴＰ、例えば、１つ以上のＴＰ、例えばオメガＡＣＴＸ ＴＰ、カッパＡＣＴＸ ＴＰ、及びＵ−ＡＣＴＸ ＴＰ、例えば、Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｂ、もしくはハイブリッドＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａペプチドから選択されるもの、または配列番号５、６及び１７６１、１７６２、１７６７、１７７１〜１７７３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドもしくはタンパク質、及びそれらの変異形と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％の配列同一性または配列相同性を有するＴＰを含んでよく（このＴＰは、１つより多い場合、同じであっても異なっていてもよい）、各殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、二元ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または両末端のいずれかにおいて、ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、ＭＶ、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、もしくはＤＴの群から選択されるか、またはこれらからなるＺ領域またはスペーサー配列にインフレームで融合した、ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、またはＬＦＡＡＰＦから選択される二元ペプチドのアミノ酸配列を含み得る、１つ以上の三元ペプチド（上文でＬと表記したもの）を更に含む。

関連する実施形態において、トランスジェニック植物は、オーストラリアジョウゴグモまたはイソギンチャクに由来し得るＣＲＩＰ ＴＰの１つ以上のコピーを含有する殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を発現及び産生する。一部の実施形態では、本明細書に記述及び例示される形質転換植物の実例または抽象例は、Ａｔｒａｘ属もしくはＨａｄｒｏｎｙｃｈｅ属のオーストラリアジョウゴグモから選択されるクモ、またはＡｎｅｍｏｎｉａ ｖｉｒｉｄｉｓから選択されるイソギンチャクに由来するＣＲＩＰ ＴＰで形質転換される。トランスジェニック植物は、１つ以上のＩＣＫ ＴＰ、例えばハイブリッドＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａを含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を産生し得る。ＣＲＩＰ ＴＰは、発現したときに２０〜１００個のアミノ酸及び２〜４つのジスルフィド結合を含有するＩＣＫ ＴＰまたは非ＩＣＫ ＴＰであり得る。本明細書に開示されるトランスジェニックペプチドにおいて有用なＴＰは、配列番号５または６、配列番号３３〜１０３２及び配列番号１７６１〜１７７５ならびにそれらの変異形と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有し得る。種々の実施形態において、ＣＲＩＰ ＴＰのうちの１つ以上は、昆虫及び／または線虫の腸内環境において見出される適切なプロテアーゼによって殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質の二元ペプチド及び／または三元ペプチドが切断されると活性になり、これにより、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質から１つ以上のＴＰが放出され、昆虫または線虫においてその殺虫活性及び／または殺線虫活性が発揮される。

（６）．有害生物感染を制御するための方法

本発明の種々の実施形態では、有害生物の感染または寄生（交換可能に使用される）を制御するための方法が提示され、この有害生物は昆虫、線虫、または両方であり得る。一部の実施形態では、そのような有害生物感染を制御するための方法は、植物またはその一部を有害生物の食餌に供給することを含み、この植物またはその一部は、本明細書に記述される殺虫性及び／または殺線虫性ＴＰをコードするポリヌクレオチドを含有及び発現する。他の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を含有する組成物の適用により、組成物の非存在下で同じ有害生物に曝露された同様の植物と比較して、植物に影響を及ぼす有害生物の数、またはそのように組成物に接触した植物に対する有害生物感染の重症度が低減し、場合により植物の生存及び／または生育が可能になるように、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を含む殺虫有効量の組成物が、有害生物への曝露の前、または有害生物の感染もしくは寄生中に植物に適用される。

一部の実施形態では、植物は、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を構成的または誘導的に発現するように作動可能であるポリヌクレオチドを発現する。ポリヌクレオチドは、作動可能なプロモーター（例えば同種または異種プロモーター）に作動可能に連結していてよく、このポリヌクレオチドは、１つ以上の切断可能な二元ペプチドまたは三元ペプチドを有する殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードする。殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、（ＥＲＳＰ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）の構造を含み得る。別の実施形態では、植物またはその一部は、作動可能なプロモーター（例えば同種または異種プロモーター）に作動可能に連結したポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドは、本明細書に記述される殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードし、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、安定化ドメイン（ＳＴＡ）のＮ末端にインフレームで融合したＥＲＳＰを含む。ＳＴＡは、二元ペプチドまたは三元ペプチドのＮ末端、あるいは（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−Ｌ、（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、またはＬ−（ＴＰ−Ｌ）_ｎを含む構築物のＮ末端のいずれかにインフレームで融合している。種々の実施形態において、例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）−ＴＰ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）、（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−Ｌ、（Ｌ−ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、または（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ（式中、（Ｌ）は二元ペプチドまたは三元ペプチドであり、各Ｌは、同じであっても異なっていてもよく、ＴＰは、同じであっても異なっていてもよい毒性ペプチドであり、ｎは、１〜２００、好ましくは１〜１００、最も好ましくは１〜１０の範囲の整数である）の構築物を含むか、またはこれらからなる群から選択されるか、またはこれらからなっていてよい。一部の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、同じであるかまたは異なっているＴＰと、同じであるかまたは異なっている二元ペプチド及び／または三元ペプチドとを含有し得る。一部の実施形態では、Ｃ末端側ＴＰは、そのＣ末端において、二元ペプチドまたは三元ペプチドに融合しているか、または融合していない。上記及び本明細書において開示される上記の構築物において有用なＴＰは、配列番号５もしくは６、配列番号３３、及び／または配列番号３３〜１０３２から選択されるＴＰ、及びそれらの変異形と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有し得る。上記に関連する実施形態において、（１）殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするＤＮＡ構築物またはポリヌクレオチドの製造において有用なＴＰは、１つ以上のＩＣＫ ＴＰ、例えば、Ａｔｒａｃｉｎａｅ亜科に属するオーストラリアジョウゴグモから単離された殺虫性ＩＣＫペプチドの「ＡＣＴＸ」または「ＡＣＴＸペプチド」ファミリーから選択されるＴＰ、例えば、オメガＡＣＴＸ ＴＰ、カッパＡＣＴＸ ＴＰ、及びＵ−ＡＣＴＸ ＴＰ、例えば、Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｂから選択される１つ以上のＴＰ（このＴＰは、１つより多い場合、同じであっても異なっていてもよい）、または配列番号５、６及び１７６１、１７６２、１７６７、１７７１〜１７７３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドもしくはタンパク質、及びそれらの変異形と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％の配列同一性または配列相同性を有するＴＰを含んでよく（このＴＰは、１つより多い場合、同じであっても異なっていてもよい）、各殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、二元ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または両末端のいずれかにおいて、ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、ＭＶ、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、もしくはＤＴの群から選択されるか、またはこれらからなるＺ領域またはスペーサー配列にインフレームで融合した、ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、またはＬＦＡＡＰＦから選択される二元ペプチドのアミノ酸配列を含み得る、１つ以上の三元ペプチド（上文でＬと表記したもの）を更に含む。関連する実施形態において、有害生物感染を制御するための方法は、植物またはその一部、例えば植物組織、植物細胞、及び／または植物種子における殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質の発現及び合成をもたらす。殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、１つ以上のＴＰにインフレームで融合した１つ以上の切断可能リンカーペプチドを含む。一部の実施形態では、切断可能リンカーペプチドは、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４のアミノ酸配列［式中、各Ｘ_ｎ及び各Ｙ_ｎはアミノ酸であり、各Ｘｎ及び各Ｙｎはアミノ酸であり、Ｘ_１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、及びＶからなる群から選択され、Ｘ_２は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ_４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｙ_１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ_２は、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ_４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される］を含む二元ペプチドである。

一部の実施形態では、有害生物を制御する方法に使用される例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、１つ以上の例示的な二元ペプチド（ＸＹまたはＹＸ）を含む。一部の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、次のアミノ酸配列：ＡＦＶＲＬＦ（配列番号１５９４）、ＡＫＬＦＶ（配列番号１５９５）、ＡＬＦＡＬＫ（配列番号１５９６）、ＡＬＦＬＫ（配列番号１５９７）、ＡＬＦＬＲ（配列番号１５９８）、ＡＬＦＲ（配列番号１５９９）、ＡＬＦＲＬＲ（配列番号１６００）、ＡＬＫＡＬＦ（配列番号１６０１）、ＡＬＫＦＦ（配列番号１６０２）、ＡＬＫＦＬＶ（配列番号１６０３）、ＡＬＫＩＦＶ（配列番号１６０４）、ＡＬＫＬＦＶ（配列番号１６０５）、ＦＦＡＤＩＫ（配列番号１６０６）、ＦＦＡＬＫ（配列番号１６０７）、ＦＦＬＫ（配列番号１６０８）、ＦＦＬＲ（配列番号１６０９）、ＦＦＲＬＲ（配列番号１６１０）、ＦＧＹＲＩＫ（配列番号１６１１）、ＦＬＲＬＦ（配列番号１６１２）、ＦＹＡＲＲ（配列番号１６１３）、ＧＧＬＲＫＫ（配列番号１６１４）、ＩＦＶＡＬＫ（配列番号１６１５）、ＩＦＶＬＫ（配列番号１６１６）、ＩＦＶＬＲ（配列番号１６１７）、ＩＦＶＲ（配列番号１６１８）、ＩＦＶＲＬＲ（配列番号１６１９）、ＩＬＦＮＩＫ（配列番号１６２０）、ＬＦＡＡＰＦ（配列番号１６２１）、ＦＶＡＬＫ（配列番号１６２２）、ＬＦＶＬＫ（配列番号１６２３）、ＬＦＶＬＲ（配列番号１６２４）、ＬＦＶＲ（配列番号１６２５）、ＬＦＶＲＬＲ（配列番号１６２６）、ＬＦＶＲＶＦＬ（配列番号１６２７）、ＬＧＥＲ（配列番号１６２８）、ＬＫＡＬＦ（配列番号１６２９）、ＬＫＦＦ（配列番号１６３０）、ＬＫＩＦＶ（配列番号１６３１）、ＬＫＬＦＶ（配列番号１６３２）、ＬＲＡＬＦ（配列番号１６３３）、ＬＲＦＦ（配列番号１６３４）、ＬＲＩＦＶ（配列番号１６３５）、ＬＲＬＦＶ（配列番号１６３６）、ＲＡＬＦ（配列番号１６３７）、ＲＩＦＶ（配列番号１６３８）、ＲＬＦＶ（配列番号１６３９）、ＲＬＲＡＬＦ（配列番号１６４０）、ＲＬＲＦＦ（配列番号１６４１）、ＲＬＲＩＦＶ（配列番号１６４２）、ＲＬＲＬＦＶ（配列番号１６４３）、ＲＲＫＡＦＶ（配列番号１６４４）、ＲＲＫＬＩＦ（配列番号１６４５）、ＲＲＲＦＦＡ（配列番号１６４６）、ＶＦＧＲＫＧ（配列番号１６４７）、及びＹＦＶＲＫ（配列番号１６４８）を有する切断可能な二元ペプチドを含む。

種々の実施形態において、例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、次のアミノ酸配列構築物：Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、
Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｚ_１、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１−Ｚ_２、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１−Ｚ_２、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｚ_１−Ｚ_２、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１−Ｚ_２、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１−Ｚ_２、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｚ_１−Ｚ_２、
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Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、
Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４、Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｚ_１−Ｚ_２−Ｚ_３−Ｚ_４［式中、Ｘ_１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、及びＶからなる群から選択され、Ｘ_２は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ_４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｙ_１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ_２は、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ_４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される］を有する切断可能な三元ペプチドを含む。

関連する実施形態において、有害生物感染を制御するための方法は、植物またはその一部、例えば植物組織、植物細胞、及び／または植物種子における殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質の発現及び合成をもたらす。殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、上述の二元ペプチドを含み、かつ上記に開示された例示的な二元ペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端にインフレームで融合した２アミノ酸スペーサー配列（Ｚ領域）を含んでいてよく、この２アミノ酸スペーサー配列Ｚ_１Ｚ_２配列は、ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、及びＭＶのうちの１つ以上であり得る。

一部の実施形態では、上述の方法において使用される殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、次の例示的なアミノ酸配列（ＺＸＹまたはＸＹＺ）：ＡＦＶＲＬＦＧＳ（配列番号１６４９）、ＡＫＬＦＶＧＳ（配列番号１６５０）、ＡＬＦＡＬＫＧＳ（配列番号１６５１）、ＡＬＦＬＫＧＳ（配列番号１６５２）、ＡＬＦＬＲＧＳ（配列番号１６５３）、ＡＬＦＲＧＳ（配列番号１６５４）、ＡＬＦＲＬＲＧＳ（配列番号１６５５）、ＡＬＫＡＬＦＧＳ（配列番号１６５６）、ＡＬＫＦＦＧＳ（配列番号１６５７）、ＡＬＫＦＬＶＧＳ（配列番号１６５８）、ＡＬＫＩＦＶＧＳ（配列番号１６５９）、ＡＬＫＬＦＶＧＳ（配列番号１６６０）、ＦＦＡＤＩＫＧＳ（配列番号１６６１）、ＦＦＡＬＫＧＳ（配列番号１６６２）、ＦＦＬＫＧＳ（配列番号１６６３）、ＦＦＬＲＧＳ（配列番号１６６４）、ＦＦＲＬＲＧＳ（配列番号１６６５）、ＦＧＹＲＩＫＧＳ（配列番号１６６６）、ＦＬＲＬＦＧＳ（配列番号１６６７）、ＦＹＡＲＲＧＳ（配列番号１６６８）、ＧＧＬＲＫＫＧＳ（配列番号１６６９）、ＩＦＶＡＬＫＧＳ（配列番号１６７０）、ＩＦＶＬＫＧＳ（配列番号１６７１）、ＩＦＶＬＲＧＳ（配列番号１６７２）、ＩＦＶＲＧＳ（配列番号１６７３）、ＩＦＶＲＬＲＧＳ（配列番号１６７４）、ＩＬＦＮＩＫＧＳ（配列番号１６７５）、ＬＦＡＡＰＦＧＳ（配列番号１６７６）、ＬＦＶＡＬＫＧＳ（配列番号１６７７）、ＬＦＶＬＫＧＳ（配列番号１６７８）、ＬＦＶＬＲＧＳ（配列番号１６７９）、ＬＦＶＲＧＳ（配列番号１６８０）、ＬＦＶＲＬＲＧＳ（配列番号１６８１）、ＬＦＶＲＶＦＬＧＳ（配列番号１６８２）、ＬＧＥＲＧＳ（配列番号１６８３）、ＬＫＡＬＦＧＳ（配列番号１６８４）、ＬＫＦＦＧＳ（配列番号１６８５）、ＬＫＩＦＶＧＳ（配列番号１６８６）、ＬＫＬＦＶＧＳ（配列番号１６８７）、ＬＲＡＬＦＧＳ（配列番号１６８８）、ＬＲＦＦＧＳ（配列番号１６８９）、ＬＲＩＦＶＧＳ（配列番号１６９０）、ＬＲＬＦＶＧＳ（配列番号１６９１）、ＲＡＬＦＧＳ（配列番号１６９２）、ＲＩＦＶＧＳ（配列番号１６９３）、ＲＬＦＶＧＳ（配列番号１６９４）、ＲＬＲＡＬＦＧＳ（配列番号１６９５）、ＲＬＲＦＦＧＳ（配列番号１６９６）、ＲＬＲＩＦＶＧＳ（配列番号１６９７）、ＲＬＲＬＦＶＧＳ（配列番号１６９８）、ＲＲＫＡＦＶＧＳ（配列番号１６９９）、ＲＲＫＬＩＦＧＳ（配列番号１７００）、
ＲＲＲＦＦＡＧＳ（配列番号１７０１）、ＶＦＧＲＫＧＧＳ（配列番号１７０２）、ＹＦＶＲＫＧＳ（配列番号１７０３）、ＧＳＡＦＶＲＬＦ（配列番号１７０４）、ＧＳＡＫＬＦＶ（配列番号１７０５）、ＧＳＡＬＦＡＬＫ（配列番号１７０６）、ＧＳＡＬＦＬＫ（配列番号１７０７）、ＧＳＡＬＦＬＲ（配列番号１７０８）、ＧＳＡＬＦＲ（配列番号１７０９）、ＧＳＡＬＦＲＬＲ（配列番号１７１０）、ＧＳＡＬＫＡＬＦ（配列番号１７１１）、ＧＳＡＬＫＦＦ（配列番号１７１２）、ＧＳＡＬＫＦＬＶ（配列番号１７１３）、ＧＳＡＬＫＩＦＶ（配列番号１７１４）、ＧＳＡＬＫＬＦＶ（配列番号１７１５）、ＧＳＦＦＡＤＩＫ（配列番号１７１６）、ＧＳＦＦＡＬＫ（配列番号１７１７）、ＧＳＦＦＬＫ（配列番号１７１８）、ＧＳＦＦＬＲ（配列番号１７１９）、ＧＳＦＦＲＬＲ（配列番号１７２０）、ＧＳＦＧＹＲＩＫ（配列番号１７２１）、ＧＳＦＬＲＬＦ（配列番号１７２２）、ＧＳＦＹＡＲＲ（配列番号１７２３）、ＧＳＧＧＬＲＫＫ（配列番号１７２４）、ＧＳＩＦＶＡＬＫ（配列番号１７２５）、ＧＳＩＦＶＬＫ（配列番号１７２６）、ＧＳＩＦＶＬＲ（配列番号１７２７）、ＧＳＩＦＶＲ（配列番号１７２８）、ＧＳＩＦＶＲＬＲ（配列番号１７２９）、ＧＳＩＬＦＮＩＫ（配列番号１７３０）、ＧＳＬＦＡＡＰＦ（配列番号１７３１）、ＧＳＬＦＶＡＬＫ（配列番号１７３２）、ＧＳＬＦＶＬＫ（配列番号１７３３）、ＧＳＬＦＶＬＲ（配列番号１７３４）、ＧＳＬＦＶＲ（配列番号１７３５）、ＧＳＬＦＶＲＬＲ（配列番号１７３６）、ＧＳＬＦＶＲＶＦＬ（配列番号１７３７）、ＧＳＬＧＥＲ（配列番号１７３８）、ＧＳＬＫＡＬＦ（配列番号１７３９）、ＧＳＬＫＦＦ（配列番号１７４０）、ＧＳＬＫＩＦＶ（配列番号１７４１）、ＧＳＬＫＬＦＶ（配列番号１７４２）、ＧＳＬＲＡＬＦ（配列番号１７４３）、ＧＳＬＲＦＦ（配列番号１７４４）、ＧＳＬＲＩＦＶ（配列番号１７４５）、ＧＳＬＲＬＦＶ（配列番号１７４６）、ＧＳＲＡＬＦ（配列番号１７４７）、ＧＳＲＩＦＶ（配列番号１７４８）、ＧＳＲＬＦＶ（配列番号１７４９）、ＧＳＲＬＲＡＬＦ（配列番号１７５０）、ＧＳＲＬＲＦＦ（配列番号１７５１）、ＧＳＲＬＲＩＦＶ（配列番号１７５２）、ＧＳＲＬＲＬＦＶ（配列番号１７５３）、ＧＳＲＲＫＡＦＶ（配列番号１７５４）、ＧＳＲＲＫＬＩＦ（配列番号１７５５）、ＧＳＲＲＲＦＦＡ（配列番号１７５６）、ＧＳＶＦＧＲＫＧ（配列番号１７５７）、及びＧＳＹＦＶＲＫ（配列番号１７５８）のうちの１つ以上を有する切断可能な三元ペプチドを含み得る。

種々の実施形態において、上述の方法において使用される殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、二元ペプチドのＮ末端及び／または二元ペプチドのＣ末端にスペーサーが付加された、上文及び本明細書に記述される二元ペプチドのアミノ酸配列を有する切断可能な三元ペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされ得、ここでスペーサーは、１〜４個のアミノ酸、好ましくは２個のアミノ酸、例えばＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、もしくはＭＶを含むアミノ酸またはペプチドである。他の特定のスペーサーの例及びスペーサーとして使用するのに最適なアミノ酸を以下に提示する。上記に関連する実施形態において、（１）殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするＤＮＡ構築物またはポリヌクレオチドの製造において有用なＴＰは、１つ以上のＩＣＫ ＴＰ、例えば、Ａｔｒａｃｉｎａｅ亜科に属するオーストラリアジョウゴグモから単離された殺虫性ＩＣＫペプチドの「ＡＣＴＸ」または「ＡＣＴＸペプチド」ファミリーから選択されるＴＰ、例えば、オメガＡＣＴＸ ＴＰ、カッパＡＣＴＸ ＴＰ、及びＵ−ＡＣＴＸ ＴＰ、例えば、Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｂから選択される１つ以上のＴＰ（このＴＰは、１つより多い場合、同じであっても異なっていてもよい）、または配列番号５、６及び１７６１、１７６２、１７６７、１７７１〜１７７３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドもしくはタンパク質、及びそれらの変異形と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％の配列同一性または配列相同性を有するＴＰを含んでよく（このＴＰは、１つより多い場合、同じであっても異なっていてもよい）、各殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、二元ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または両末端のいずれかにおいて、ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、ＭＶ、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、もしくはＤＴの群から選択されるか、またはこれらからなるＺ領域またはスペーサー配列にインフレームで融合した、ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、またはＬＦＡＡＰＦから選択される二元ペプチドのアミノ酸配列を含み得る、１つ以上の三元ペプチド（上文でＬと表記したもの）を更に含む。

本明細書に記述される１つ以上のＴＰに融合した、例示的な二元ペプチド及び三元ペプチド、例えばＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、またはＩＦＶＲＬＲは、トランスジェニック植物によって発現及び合成されると有害生物感染に対抗することができる殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を産生するために使用され得る。種々の実施形態において、植物の有害生物感染を制御するための方法は、種子もしくは植物を圃場に植えること（この植物もしくは種子は、植物中で殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を発現するように作動可能である）、または、ポア形成殺虫性タンパク質（ＰＦＩＰ）及びシステインリッチ殺虫性タンパク質（ＣＲＩＰ）からなる群から選択される１つ以上のＴＰタンパク質（例えば、ＴＰは、インヒビターシステインノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質、非ＩＣＫタンパク質、Ｂｔタンパク質、またはこれらの任意の組み合わせであってよい）を含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を含有する組成物を適用すること、ならびに、有害生物の存在下において生存し続けること及び／または有害生物の存在下の圃場で生育することが可能な植物もしくは種子を圃場で生育することを含む。そのような実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を発現する、あるいは殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質で少なくとも部分的にコーティングされた植物を摂取した後に、有害生物の少なくとも一部が死亡することにより、有害生物感染が低減する。一実施形態において、有害生物感染を制御するための方法において有用なＴＰには、オメガＡＣＴＸ ＴＰ、カッパＡＣＴＸ ＴＰ、及びＵ−ＡＣＴＸ ＴＰ、例えば、Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｂ、もしくはハイブリッドＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａペプチドから選択される、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチド、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｂとして知られるＴＰ、または配列番号５、６及び１７６１、１７６２、１７６７、１７７１〜１７７３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはタンパク質、及びそれらの変異体または変異形と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％の配列同一性または配列相同性を有するＴＰを含め、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ、Ａｔｒａｘ ｒｏｂｕｓｔｕｓ、Ａｔｒａｘ ｆｏｒｍｉｄａｂｉｌｉｓ、Ａｔｒａｘ ｉｎｆｅｎｓｕｓに由来する、すなわちそれらを起源とするインヒビターシステインノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質が含まれ得る。

一部の実施形態では、植物の有害生物感染を制御する方法は、植物またはその一部によって合成された殺虫有効量の１つ以上のＴＰを、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質の形態で供給する。一部の実施形態では、昆虫及び／または線虫の腸内環境に曝露されると切断可能である１つ以上のＴＰを含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、植物またはその一部に形質転換されたＤＮＡ構築物から産生され得る。一部の実施形態では、例示的なＤＮＡ構築物は、１つ以上の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードし、各殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、二元ペプチドまたは三元ペプチドのＮ末端にインフレームで融合したＥＲＳＰを含み、二元ペプチドまたは三元ペプチドは、（ＴＰ−Ｌ）_ｎまたは（Ｌ−ＴＰ）_ｎ（式中、各ＴＰは毒性タンパク質であり、Ｌは二元ペプチドまたは三元ペプチドであり、ｎは１〜２００の範囲の整数である）を含む構築物にインフレームで融合しており、Ｃ末端側ＴＰは、そのＣ末端において、二元ペプチドまたは三元ペプチドに融合しているか、または融合していない。ｎが１より大きい場合、各ＴＰ及び各Ｌは、同じであっても異なっていてもよい。

他の実施形態では、そのような有害生物感染を制御するための例示的な方法は、植物またはその一部を有害生物の食餌に供給することを含み、この植物またはその一部は、本明細書に記述される１つ以上のＴＰを含む殺虫性及び／または殺線虫性の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有及び発現する。一部の実施形態では、植物は、ポリヌクレオチドを構成的または誘導的に発現する。ポリヌクレオチドは、作動可能なプロモーター（例えば同種または異種プロモーター）に作動可能に連結していてよく、このポリヌクレオチドは、１つ以上の切断可能な二元ペプチドまたは三元ペプチドを有する殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードする。殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、（ＥＲＳＰ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）の構造を含み得る。別の実施形態では、植物またはその一部は、作動可能なプロモーター（例えば同種または異種プロモーター）に作動可能に連結したポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドは、安定化ドメイン（ＳＴＡ）のＮ末端にインフレームで融合したＥＲＳＰを含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードする。ＳＴＡは、二元ペプチドまたは三元ペプチドのＮ末端、あるいは（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−Ｌ、（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、またはＬ−（ＴＰ−Ｌ）_ｎを含む構築物のＮ末端のいずれかにインフレームで融合している。種々の実施形態において、例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）−ＴＰ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）、（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−Ｌ、（Ｌ−ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、または（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ（式中、（Ｌ）は二元ペプチドまたは三元ペプチドであり、各Ｌは、同じであっても異なっていてもよく、ＴＰは、同じであっても異なっていてもよい毒性ペプチドであり、ｎは、１〜２００、好ましくは１〜１００、最も好ましくは１〜１０の範囲の整数である）の構築物を含み得る。一部の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、同じであるかまたは異なっているＴＰと、同じであるかまたは異なっている二元ペプチド及び／または三元ペプチドとを含有し得る。本明細書に開示されるトランスジェニック植物またはその一部において有用なＴＰは、配列番号５もしくは６、配列番号３３、及び／または配列番号３３〜１０３２から選択されるペプチド、及びそれらの変異形と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有し得る。一部の実施形態では、Ｃ末端側ＴＰは、そのＣ末端において、二元ペプチドまたは三元ペプチドに融合しているか、または融合していない。上記に関連する実施形態において、（１）殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするＤＮＡ構築物またはポリヌクレオチドの製造において有用なＴＰは、１つ以上のＩＣＫ ＴＰ、例えば、Ａｔｒａｃｉｎａｅ亜科に属するオーストラリアジョウゴグモから単離された殺虫性ＩＣＫペプチドの「ＡＣＴＸ」または「ＡＣＴＸペプチド」ファミリーから選択されるＴＰ、例えば、オメガＡＣＴＸ ＴＰ、カッパＡＣＴＸ ＴＰ、及びＵ−ＡＣＴＸ ＴＰ、例えば、Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ｂから選択される１つ以上のＴＰ、または配列番号５、６及び１７６１、１７６２、１７６７、１７７１〜１７７３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドもしくはタンパク質、及びそれらの変異形と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％の配列同一性または配列相同性を有するＴＰを含んでよく（このＴＰは、１つより多い場合、同じであっても異なっていてもよい）、ＤＮＡ構築物またはポリヌクレオチドは、（２）少なくとも１つの二元ペプチドまたは三元ペプチドにインフレームで融合した、１つ以上の三元ペプチド（上文でＬと表記したもの）を更にコードし、この三元ペプチドは、二元ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または両末端のいずれかにおいて、ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、ＭＶ、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、もしくはＤＴの群から選択されるか、またはこれらからなるＺ領域またはスペーサー配列にインフレームで融合した、ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、またはＬＦＡＡＰＦから選択される二元ペプチドのアミノ酸配列を含み得る。

一部の実施形態では、昆虫及び／または線虫有害生物の感染または寄生を制御するための方法は、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質の組み合わせを含むトランスジェニック植物の作出を含む場合があり、各殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質には、該昆虫及び／または線虫によって捕食されると殺虫活性及び／または殺線虫活性を発揮し、有害生物の感染及び／または寄生を制御、または低減、または排除する、Ｂｔ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ＴＰまたはＩＣＫ（インヒビターシスチンノット）ＴＰが含まれる。この植物は、Ｂｔ ＴＰを発現する顕花植物と、ＩＣＫ ＴＰを発現する第２の顕花植物とを作出する、ＤＮＡの独立した安定な遺伝子挿入から作製することができる。これらの植物のうちの１つの花粉を他の植物の雌花器官と交雑させると、Ｂｔ ＴＰ及びＩＣＫ ＴＰの両方の遺伝形質を含有する遺伝子ハイブリダイゼーションが形成される。この性的交雑の後代、及び両方の形質の遺伝をもたらす更なる交雑により、該昆虫及び／または線虫に対するＢｔ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ＴＰ及びＩＣＫ（インヒビターシスチンノット）ＴＰの組み合わせを含むトランスジェニック植物がもたらされる。

一部の実施形態では、本明細書に記述されるＤＮＡ構築物は、特定の植物または植物群、例えば特定のタイプの作物における特定の有害生物の寄生を処置するのに適している特定のＴＰを含有する殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードし得る。一実施形態において、本発明の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、Ｃｒｙ １Ａ．１０５、Ｃｒｙ２Ａｂ２、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ３Ｂｂｌ、Ｃｒｙ３４Ａｂ１、及びＣｒｙ３５Ａｂ１のうちの１つ以上から選択されるＴＰを含み得る。これらのＴＰは、特定の作物、例えばトウモロコシを処置するために、個々にまたは組み合わせて発現され得る。一部の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）−ＴＰ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）、（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−Ｌ、（Ｌ−ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、または（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ（式中、（Ｌ）は二元ペプチドまたは三元ペプチドであり、各Ｌは、同じであっても異なっていてもよく、ＴＰは、同じであっても異なっていてもよい毒性ペプチドであり、ｎは、１〜２００、好ましくは１〜１００、最も好ましくは１〜１０の範囲の整数である）の構造を有する。一部の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、同じであるかまたは異なっているＴＰと、同じであるかまたは異なっている二元ペプチド及び／または三元ペプチドとを含有してよく（ここでＴＰは、Ｃｒｙ １Ａ．１０５、Ｃｒｙ２Ａｂ２、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ３Ｂｂｌ、Ｃｒｙ３４Ａｂ１、及びＣｒｙ３５Ａｂ１から選択される毒性タンパク質、またはそれらの組み合わせであり、Ｌは二元ペプチドまたは三元ペプチドであり、ｎは、１〜２００の範囲の整数、好ましくは１〜１００の範囲の整数、より好ましくは１〜１０の範囲の整数である）、次のトウモロコシ有害生物：ヨーロッパアワノメイガ（ＥＣＢ）、サウスウエスタンコーンボーラー（ＳＷＣＢ）、サザンコーンストークボーラー（ＳＣＳＢ）、オオタバコガ（ＣＥＷ）、ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ）、ストークボーラー、モロコシマダラメイガ、サトウキビメイガ（ＳＣＢ）、ウエスタンビーンカットワーム（ＷＢＣ）、タマナヤガ、ウエスタンコーンルートワーム（ＷＣＲＷ）、ノーザンコーンルートワーム（ＮＣＲＷ）、またはメキシカンコーンルートワーム（ＭＣＲＷ）を処置するために使用することができる。

他の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）−ＴＰ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）、（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−Ｌ、（Ｌ−ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、または（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ（式中、（Ｌ）は二元ペプチドまたは三元ペプチドであり、各Ｌは、同じであっても異なっていてもよく、ＴＰは、同じであっても異なっていてもよい毒性ペプチドであり、ｎは、１〜２００、好ましくは１〜１００、最も好ましくは１〜１０の範囲の整数である）の構造を有する。一部の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、同じであるかまたは異なっているＴＰと、同じであるかまたは異なっている二元ペプチド及び／または三元ペプチドとを含有してよく（ここでＴＰは、ワタＣｒｙ １ＡＣである）、次のワタＰＩＰ（Ｂｏｌｌｇａｒｄ Ｉ及びＩＩ。まず１つの遺伝子、次に２つの遺伝子）の有害生物：アメリカタバコガ（ＣＢＷ）Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ（Ｂｏｄｄｉｅ）、ニセアメリカタバコガ（ＴＢＷ）Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、及びワタアカミムシ（ＰＢＷ）Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ（Ｓａｎｄｅｒｓ）を処置するために使用され得る。関連する実施形態において、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）−ＴＰ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）、（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−Ｌ、（Ｌ−ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、または（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ（式中、（Ｌ）は二元ペプチドまたは三元ペプチドであり、各Ｌは、同じであっても異なっていてもよく、ＴＰは、同じであっても異なっていてもよい毒性ペプチドであり、ｎは、１〜２００、好ましくは１〜１００、最も好ましくは１〜１０の範囲の整数である）の構造を有する。一部の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、同じであるかまたは異なっているＴＰと、同じであるかまたは異なっている二元ペプチド及び／または三元ペプチドとを含有してよく（ここでＴＰはワタＣｒｙ１Ａｃ及び／またはＣｒｙ２Ａｂである）、次のワタ有害生物：アメリカタバコガ（ＣＢＷ）Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ（Ｂｏｄｄｉｅ）、ニセアメリカタバコガ（ＴＢＷ）Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、ワタアカミムシ（ＰＢＷ）Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ（Ｓａｎｄｅｒｓ）、ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ）、シロイチモンジョトウ（ＢＡＷ）、及びソイビーンルーパー（ＳＢＬ）を処置するために使用され得る。

他の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）−ＴＰ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）−ＴＰ−（Ｌ）、（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−Ｌ、（Ｌ−ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−（Ｌ）、または（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ（式中、（Ｌ）は二元ペプチドまたは三元ペプチドであり、各Ｌは、同じであっても異なっていてもよく、ＴＰは、同じであっても異なっていてもよい毒性ペプチドであり、ｎは、１〜２００、好ましくは１〜１００、最も好ましくは１〜１０の範囲の整数である）の構造を有する。一部の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、同じであるかまたは異なっているＴＰと、同じであるかまたは異なっている二元ペプチド及び／または三元ペプチドとを含有してよく（ここでＴＰはダイズＣｒｙ１Ａｃである）、次のダイズＰＩＰ有害生物：ベルベットビーンキャタピラー（Ａｎｔｉｃａｒｃｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）、ソイビーンルーパー（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、ソイビーンアクシルボーラー（Ｅｐｉｎｏｔｉａ ａｐｏｒｅｍａ）、及びサンフラワールーパー（Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ ｎｕ）を処置するために使用され得る。

一部の実施形態では、本方法は、殺虫性及び／または殺線虫性の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質含有組成物をコードするＤＮＡ構築物を用いた、１つの植物細胞または複数の植物細胞の形質転換をもたらす。形質転換植物は、組換え植物、植物の一部、または植物もしくは植物の一部の産物であり得る。植物または植物の一部の形質転換を遂行してもよいが、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、植物宿主細胞、または動物宿主細胞をはじめとする宿主細胞において殺虫性及び／または殺線虫性組成物を組換え的に産生してもよい。一部の実施形態では、ＥＲＳＰ、１つ以上の切断可能な連結ペプチド、及び１つ以上のＴＰを含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質が、有害生物感染を制御または防止するために複数の植物または植物の圃場すなわち作物に適用される、ミリグラム、グラム、またはキログラム量の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を産生するように、酵母産生株または細菌産生株において合成され得る。一部の実施形態では、殺虫有効量の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、植物または植物の一部に局所適用される１つ以上の製剤で供給されてよく、この殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を含む細菌細胞、細菌胞子、真菌細胞、真菌胞子、またはパラ胞子結晶に配合される。代替的に、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を含有する殺虫性及び／または殺線虫性組成物は、植物の表面に直接適用してもよい。

本明細書で使用される場合、本明細書に記述される殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質の殺虫有効量としては、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質から切断されたＴＰが昆虫及び／または線虫の棲む生息地に適切に送達されたときに、昆虫及び／または線虫の成長を阻害したり、動きを損なったり、または更にはそれらを殺傷したりすることができる任意の量が挙げられる。種々の実施形態において、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質含有組成物は、粉末、エマルジョン、溶液、顆粒、微粉化粒子など、ならびに有害生物制御が所望される植物の表面に適用され得るＢｔタンパク質などの殺虫性タンパク質を適用するために当技術分野で使用される他の製剤及び組成物の形態として配合され得る。殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質からＴＰが少なくとも５０％切断及び放出されると仮定して、そのように分配されるＴＰの量は、当業者に公知のＣ_１８ｒｐＨＰＬＣ法を使用して数量化することができる。

本明細書に記述される実施形態において、１つ以上のＴＰ及び１つ以上の切断可能リンカーを含む本殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、様々な昆虫及び線虫に対して効果的である。本明細書に提示される方法、ならびに植物組織を捕食する昆虫及び／または線虫の制御及び／または排除を必要とする種々の他の方法を使用して、有害生物感染の制御、または防止、またはその重症度の低減を行ったり、植物またはその一部を食餌において摂取する昆虫及び／または線虫を殺傷したり、植物の生育可能性を最適化したり、有害生物感染の影響を受けやすい作物の収量を増加させたりすることができる。本明細書に記述される方法、組成物、及び手順の影響を受けやすい種々のタイプの昆虫及び線虫は、次の通りである。

昆虫及び線虫：昆虫は、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ目、Ｄｉｐｔｅｒａ目、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ目、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目、Ｍａｌｌｏｐｈａｇａ目、Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ目、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ目、Ｏｒｔｈｒｏｐｔｅｒａ目、Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ目、Ｄｅｒｍａｐｔｅｒａ目、Ｉｓｏｐｔｅｒａ目、Ａｎｏｐｌｕｒａ目、Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ目、Ｔｒｉｃｈｏｐｔｅｒａ目などから選択され得る。より特定すると、昆虫有害生物としては、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、及びＤｉｐｔｅｒａが挙げられる。

殺虫性ポリペプチドで処置するのに好適な農業、家庭及び／または医学／獣医学における重要性のある昆虫としては、限定されるものではないが、以下の綱及び目のメンバーが挙げられる。

Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ目は、Ａｄｅｐｈａｇａ亜目及びＰｏｌｙｐｈａｇａ亜目を含む。Ａｄｅｐｈａｇａ亜目は、Ｃａｒａｂｏｉｄｅａ上科及びＧｙｒｉｎｏｉｄｅａ上科を含む。Ｐｏｌｙｐｈａｇａ亜目は、Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｏｉｄｅａ上科、Ｓｔａｐｈｙｌｉｎｏｉｄｅａ上科、Ｃａｎｔｈａｒｏｉｄｅａ上科、Ｃｌｅｒｏｉｄｅａ上科、Ｅｌａｔｅｒｏｉｄｅａ上科、Ｄａｓｃｉｌｌｏｉｄｅａ上科、Ｄｒｙｏｐｏｉｄｅａ上科、Ｂｙｒｒｈｏｉｄｅａ上科、Ｃｕｃｕｊｏｉｄｅａ上科、Ｍｅｌｏｉｄｅａ上科、Ｍｏｒｄｅｌｌｏｉｄｅａ上科、Ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｏｉｄｅａ上科、Ｂｏｓｔｒｉｃｈｏｉｄｅａ上科、Ｓｃａｒａｂａｅｏｉｄｅａ上科、Ｃｅｒａｍｂｙｃｏｉｄｅａ上科、Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌｏｉｄｅａ上科、及びＣｕｒｃｕｌｉｏｎｏｉｄｅａ上科を含む。Ｃａｒａｂｏｉｄｅａ上科は、Ｃｉｃｉｎｄｅｌｉｄａｅ科、Ｃａｒａｂｉｄａｅ科、及びＤｙｔｉｓｃｉｄａｅ科を含む。Ｇｙｒｉｎｏｉｄｅａ上科は、Ｇｙｒｉｎｉｄａｅ科を含む。Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｏｉｄｅａ上科は、Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｄａｅ科を含む。Ｓｔａｐｈｙｌｉｎｏｉｄｅａ上科は、Ｓｉｌｐｈｉｄａｅ科及びＳｔａｐｈｙｌｉｎｉｄａｅ科を含む。Ｃａｎｔｈａｒｏｉｄｅａ上科は、Ｃａｎｔｈａｒｉｄａｅ科及びＬａｍｐｙｒｉｄａｅ科を含む。Ｃｌｅｒｏｉｄｅａ上科は、Ｃｌｅｒｉｄａｅ科及びＤｅｒｍｅｓｔｉｄａｅ科を含む。Ｅｌａｔｅｒｏｉｄｅａ上科は、Ｅｌａｔｅｒｉｄａｅ科及びＢｕｐｒｅｓｔｉｄａｅ科を含む。Ｃｕｃｕｊｏｉｄｅａ上科は、Ｃｏｃｃｉｎｅｌｌｉｄａｅ科を含む。Ｍｅｌｏｉｄｅａ上科は、Ｍｅｌｏｉｄａｅ科を含む。Ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｏｉｄｅａ上科は、Ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｄａｅ科を含む。Ｓｃａｒａｂａｅｏｉｄｅａ上科は、Ｐａｓｓａｌｉｄａｅ科及びＳｃａｒａｂａｅｉｄａｅ科を含む。Ｃｅｒａｍｂｙｃｏｉｄｅａ上科は、Ｃｅｒａｍｂｙｃｉｄａｅ科を含む。Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌｏｉｄｅａ上科は、Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌｉｄａｅ科を含む。Ｃｕｒｃｕｌｉｏｎｏｉｄｅａ上科は、Ｃｕｒｃｕｌｉｏｎｉｄａｅ科及びＳｃｏｌｙｔｉｄａｅ科を含む。

Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａの例としては、アメリカマメゾウムシＡｃａｎｔｈｏｓｃｅｌｉｄｅｓ ｏｂｔｅｃｔｕｓ、ハムシＡｇｅｌａｓｔｉｃａ ａｌｎｉ、コメツキムシ（Ａｇｒｉｏｔｅｓ ｌｉｎｅａｔｕｓ、Ａｇｒｉｏｔｅｓ ｏｂｓｃｕｒｕｓ、Ａｇｒｉｏｔｅｓ ｂｉｃｏｌｏｒ）、グレインビートルＡｈａｓｖｅｒｕｓ ａｄｖｅｎａ、サマーシェーファーＡｍｐｈｉｍａｌｌｏｎ ｓｏｌｓｔｉｔｉａｌｉｓ、家具の有害生物Ａｎｏｂｉｕｍ ｐｕｎｃｔａｔｕｍ、Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ属（ゾウムシ）、ピグミーマンゴールドビートルＡｔｏｍａｒｉａ ｌｉｎｅａｒｉｓ、ヒメマルカツオブシムシ（Ａｎｔｈｒｅｎｕｓ属、Ａｔｔａｇｅｎｕｓ属）、ヨツモンマメゾウムシＣａｌｌｏｓｏｂｒｕｃｈｕｓ ｍａｃｕｌａｔｕｓ、クリヤケシキスイＣａｒｐｏｐｈｉｌｕｓ ｈｅｍｉｐｔｅｒｕｓ、キャベツサヤゾウムシＣｅｕｔｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ａｓｓｉｍｉｌｉｓ、レイプウィンターステムウィービルＣｅｕｔｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｐｉｃｉｔａｒｓｉｓ、ハリガネムシＣｏｎｏｄｅｒｕｓ ｖｅｓｐｅｒｔｉｎｕｓ及びＣｏｎｏｄｅｒｕｓ ｆａｌｌｉ、バナナゾウムシＣｏｓｍｏｐｏｌｉｔｅｓ ｓｏｒｄｉｄｕｓ、ニュージーランドグラスグラブＣｏｓｔｅｌｙｔｒａ ｚｅａｌａｎｄｉｃａ、コガネムシＣｏｔｉｎｉｓ ｎｉｔｉｄａ、サンフラワーステムウィービルＣｙｌｉｎｄｒｏｃｏｐｔｕｒｕｓ ａｄｓｐｅｒｓｕｓ、オビカツオブシムシＤｅｒｍｅｓｔｅｓ ｌａｒｄａｒｉｕｓ、コーンルートワームＤｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、及びＤｉａｂｒｏｔｉｃａ ｂａｒｂｅｒｉ、インゲンテントウＥｐｉｌａｃｈｎａ ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ、オールドハウスボーラーＨｙｌｏｔｒｏｐｅｓ ｂａｊｕｌｕｓ、アルファルファタコゾウムシＨｙｐｅｒａ ｐｏｓｔｉｃａ、シャイニースパイダービートルＧｉｂｂｉｕｍ ｐｓｙｌｌｏｉｄｅｓ、タバコシバンムシＬａｓｉｏｄｅｒｍａ ｓｅｒｒｉｃｏｒｎｅ、コロラドハムシＬｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ、ヒラタキクイムシ（Ｌｙｃｔｕｓ属）、ポーレンビートルＭｅｌｉｇｅｔｈｅｓ ａｅｎｅｕｓ、コフキコガネＭｅｌｏｌｏｎｔｈａ ｍｅｌｏｌｏｎｔｈａ、アメリカンスパイダービートルＭｅｚｉｕｍ ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ、ゴールデンスパイダービートルＮｉｐｔｕｓ ｈｏｌｏｌｅｕｃｕｓ、グレインビートルＯｒｙｚａｅｐｈｉｌｕｓ ｓｕｒｉｎａｍｅｎｓｉｓ及びＯｒｙｚａｅｐｈｉｌｕｓ ｍｅｒｃａｔｏｒ、キンケクチブトゾウムシＯｔｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｓｕｌｃａｔｕｓ、マスタードビートルＰｈａｅｄｏｎ ｃｏｃｈｌｅａｒｉａｅ、アブラナノミハムシＰｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ、キスジノミハムシＰｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｓｔｒｉｏｌａｔａ、キャベツ茎ノミハムシＰｓｙｌｌｉｏｄｅｓ ｃｈｒｙｓｏｃｅｐｈａｌａ、Ｐｔｉｎｕｓ属（スパイダービートル）、コナナガシンクイムシＲｈｉｚｏｐｅｒｔｈａ ｄｏｍｉｎｉｃａ、アカアシチビコフキゾウムシＳｉｔｏｎａ ｌｉｎｅａｔｕｓ、ココクゾウムシ及びコクゾウムシＳｉｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ及びＳｉｔｏｐｈｉｌｕｓ ｇｒａｎａｒｉｅｓ、レッドサンフラワーシードウィービルＳｍｉｃｒｏｎｙｘ ｆｕｌｖｕｓ、ジンサンシバンムシＳｔｅｇｏｂｉｕｍ ｐａｎｉｃｅｕｍ、チャイロコメノゴミムシダマシＴｅｎｅｂｒｉｏ ｍｏｌｉｔｏｒ、コクヌストモドキＴｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃａｓｔａｎｅｕｍ及びＴｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃｏｎｆｕｓｕｍ、カツオブシムシ（Ｔｒｏｇｏｄｅｒｍａ属）、ならびにサンフラワービートルＺｙｇｏｇｒａｍｍａ ｅｘｃｌａｍａｔｉｏｎが挙げられるが、これらに限定されない。

Ｄｅｒｍａｐｔｅｒａ（ハサミムシ）の例としては、ヨーロッパハサミムシＦｏｒｆｉｃｕｌａ ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ、及びオオハサミムシＬａｂｉｄｕｒａ ｒｉｐａｒｉａが挙げられるが、これらに限定されない。

Ｄｉｃｔｖｏｎｔｅｒａの例としては、トウヨウゴキブリＢｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、チャバネゴキブリＢｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ、マデラゴキブリＬｅｕｃｏｐｈａｅａ ｍａｄｅｒａｅ、ワモンゴキブリＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ、及びクロゴキブリＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ｆｕｌｉｇｉｎｏｓａが挙げられるが、これらに限定されない。

Ｄｉｐｌｏｐｏｄａの例としては、スポテッドスネークミリピードＢｌａｎｉｕｌｕｓ ｇｕｔｔｕｌａｔｕｓ、フラットバックミリピードＢｒａｃｈｙｄｅｓｍｕｓ ｓｕｐｅｒｕｓ、及びヤケヤスデＯｘｉｄｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｓが挙げられるが、これらに限定されない。

Ｄｉｐｔｅｒａ目は、Ｎｅｍａｔｏｃｅｒａ亜目、Ｂｒａｃｈｙｃｅｒａ亜目、及びＣｙｃｌｏｒｒｈａｐｈａ亜目を含む。Ｎｅｍａｔｏｃｅｒａ亜目は、Ｔｉｐｕｌｉｄａｅ科、Ｐｓｙｃｈｏｄｉｄａｅ科、Ｃｕｌｉｃｉｄａｅ科、Ｃｅｒａｔｏｐｏｇｏｎｉｄａｅ科、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｉｄａｅ科、Ｓｉｍｕｌｉｉｄａｅ科、Ｂｉｂｉｏｎｉｄａｅ科、及びＣｅｃｉｄｏｍｙｉｉｄａｅ科を含む。Ｂｒａｃｈｙｃｅｒａ亜目は、Ｓｔｒａｔｉｏｍｙｉｄａｅ科、Ｔａｂａｎｉｄａｅ科、Ｔｈｅｒｅｖｉｄａｅ科、Ａｓｉｌｉｄａｅ科、Ｍｙｄｉｄａｅ科、Ｂｏｍｂｙｌｉｉｄａｅ科、及びＤｏｌｉｃｈｏｐｏｄｉｄａｅ科を含む。Ｃｙｃｌｏｒｒｈａｐｈａ亜目は、Ａｓｃｈｉｚａ門及びＡｓｃｈｉｚａ門を含む。Ａｓｃｈｉｚａ門は、Ｐｈｏｒｉｄａｅ科、Ｓｙｒｐｈｉｄａｅ科、及びＣｏｎｏｐｉｄａｅ科を含む。Ａｓｃｈｉｚａ門は、Ａｃａｌｙｐｔｒａｔａｅ節及びＣａｌｙｐｔｒａｔａｅ節を含む。Ａｃａｌｙｐｔｒａｔａｅ節は、Ｏｔｉｔｉｄａｅ科、Ｔｅｐｈｒｉｔｉｄａｅ科、Ａｇｒｏｍｙｚｉｄａｅ科、及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌｉｄａｅ科を含む。Ｃａｌｙｐｔｒａｔａｅ節は、Ｈｉｐｐｏｂｏｓｃｉｄａｅ科、Ｏｅｓｔｒｉｄａｅ科、Ｔａｃｈｉｎｉｄａｅ科、Ａｎｔｈｏｍｙｉｉｄａｅ科、Ｍｕｓｃｉｄａｅ科、Ｃａｌｌｉｐｈｏｒｉｄａｅ科、及びＳａｒｃｏｐｈａｇｉｄａｅ科を含む。

Ｄｉｐｔｅｒａの例としては、イエバエ（Ｍｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、アフリカントゥンブフライ（Ｃｏｒｄｙｌｏｂｉａ ａｎｔｈｒｏｐｏｐｈａｇａ）、ヌカカ（Ｃｕｌｉｃｏｉｄｅｓ属）、ミツバチシラミバエ（Ｂｒａｕｌａ属）、ビートフライＰｅｇｏｍｙｉａ ｂｅｔａｅ、ブユ（Ｃｎｅｐｈｉａ属、Ｅｕｓｉｍｕｌｉｕｍ属、Ｓｉｍｕｌｉｕｍ属）、ウマバエ（Ｃｕｔｅｒｅｂｒａ属、Ｇａｓｔｒｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｏｅｓｔｒｕｓ属）、ガガンボ（Ｔｉｐｕｌａ属）、アイナット（Ｈｉｐｐｅｌａｔｅｓ属）、汚物で繁殖するハエ（Ｃａｌｌｉｐｈｏｒａ属、Ｆａｎｎｉａ属、Ｈｅｒｍｅｔｉａ属、Ｌｕｃｉｌｉａ属、Ｍｕｓｃａ属、Ｍｕｓｃｉｎａ属、Ｐｈａｅｎｉｃｉａ属、Ｐｈｏｒｍｉａ属）、ニクバエ（Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ属、Ｗｏｈｌｆａｈｒｔｉａ属）；フリットフライＯｓｃｉｎｅｌｌａ ｆｒｉｔ、ショウジョウバエ（Ｄａｃｕｓ属、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属）、ヘッドフライ及びキャノンフライ（Ｈｙｄｒｏｔｅａ属）、コムギタマバエＭａｙｅｔｉｏｌａ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ、ホーンフライ及びバッファローフライ（Ｈａｅｍａｔｏｂｉａ属）、ウシアブ及びメクラアブ（Ｃｈｒｙｓｏｐｓ属、Ｈａｅｍａｔｏｐｏｔａ属、Ｔａｂａｎｕｓ属）、シラミバエ（Ｌｉｐｏｐｔｅｎａ属、Ｌｙｎｃｈｉａ属、及びＰｓｅｕｄｏｌｙｎｃｈｉａ属）、ミバエ（Ｃｅｒａｔｉｔｕｓ属）、蚊（Ａｅｄｅｓ属、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ属、Ｃｕｌｅｘ属、Ｐｓｏｒｏｐｈｏｒａ属）、スナバエ（Ｐｈｌｅｂｏｔｏｍｕｓ属、Ｌｕｔｚｏｍｙｉａ属）、ラセンウジバエ（Ｃｈｔｙｓｏｍｙａ ｂｅｚｚｉａｎａ及びＣｏｃｈｌｉｏｍｙｉａ ｈｏｍｉｎｉｖｏｒａｘ）、ヒツジシラミバエ（Ｍｅｌｏｐｈａｇｕｓ属）；サシバエ（Ｓｔｏｍｏｘｙｓ属）、ツェツェバエ（Ｇｌｏｓｓｉｎａ属）、及びウシバエ（Ｈｙｐｏｄｅｒｍａ属）が挙げられるが、これらに限定されない。

Ｉｓｏｎｔｅｒａ（シロアリ）の例としては、Ｈｏｄｏｔｅｎｎｉｔｉｄａｅ科、Ｋａｌｏｔｅｒｍｉｔｉｄａｅ科、Ｍａｓｔｏｔｅｒｍｉｔｉｄａｅ科、Ｒｈｉｎｏｔｅｎｎｉｔｉｄａｅ科、Ｓｅｒｒｉｔｅｒｍｉｔｉｄａｅ科、Ｔｅｒｍｉｔｉｄａｅ科、Ｔｅｒｍｏｐｓｉｄａｅ科の種が挙げられるが、これらに限定されない。

Ｈｅｔｅｒｏｐｔｅｒａの例としては、トコジラミＣｉｍｅｘ ｌｅｃｔｕｌａｒｉｕｓ、コットンステイナーＤｙｓｄｅｒｃｕｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、サンヘンプ有害生物Ｅｕｒｙｇａｓｔｅｒ ｉｎｔｅｇｒｉｃｅｐｓ、ミドリメクラガメＬｙｇｕｓ ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ、アオカメムシＮｅｚａｒａ ａｎｔｅｎｎａｔａ、ミナミアオカメムシＮｅｚａｒａ ｖｉｒｉｄｕｌａ、ならびにオオサシガメＰａｎｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｍｅｇｉｓｔｕｓ、Ｒｈｏｄｎｉｕｓ ｅｃｕａｄｏｒｉｅｎｓｉｓ、Ｒｈｏｄｎｉｕｓ ｐａｌｌｅｓｃａｎｓ、Ｒｈｏｄｎｉｕｓ ｐｒｏｌｉｘｕｓ、Ｒｈｏｄｎｉｕｓ ｒｏｂｕｓｔｕｓ、Ｔｒｉａｔｏｍａ ｄｉｍｉｄｉａｔａ、Ｔｒｉａｔｏｍａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ、及びＴｒｉａｔｏｍａ ｓｏｒｄｉｄａが挙げられるが、これらに限定されない。

Ｈｏｍｏｐｔｅｒａの例としては、アカマルカイガラムシＡｏｎｉｄｉｅｌｌａ ａｕｒａｎｔｉｉ、マメクロアブラムシＡｐｈｉｓ ｆａｂａｅ、ワタアブラムシまたはメロンアブラムシＡｐｈｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｉ、ヨーロッパリンゴアブラムシＡｐｈｉｓ ｐｏｍｉ、ミカントゲコナジラミＡｌｅｕｒｏｃａｎｔｈｕｓ ｓｐｉｎｉｆｅｒｕｓ、オレアンダースケールＡｓｐｉｄｉｏｔｕｓ ｈｅｄｅｒａｅ、ワタコナジラミＢｅｍｅｓｉａ ｔａｂａｃｉ、ダイコンアブラムシＢｒｅｖｉｃｏｒｙｎｅ ｂｒａｓｓｉｃａｅ、フタホシナシキジラミＣａｃｏｐｓｙｌｌａ ｐｙｒｉｃｏｌａ、スグリアブラムシＣｒｙｐｔｏｍｙｚｕｓ ｒｉｂｉｓ、ブドウネアブラムシＤａｋｔｕｌｏｓｐｈａｉｒａ ｖｉｔｉｆｏｌｉａｅ、ミカンキジラミＤｉａｐｈｏｒｉｎａ ｃｉｔｒｉ、ジャガイモヨコバイＥｍｐｏａｓｃａ ｆａｂａｅ、マメヨコバイＥｍｐｏａｓｃａ ｓｏｌａｎａ、ブドウヨコバイＥｍｐｏａｓｃａ ｖｉｔｉｓ、ワタムシＥｒｉｏｓｏｍａ ｌａｎｉｇｅｒｕｍ、ヨーロピアンフルーツスケールＥｕｌｅｃａｎｉｕｍ ｃｏｒｎｉ、モモコフキアブラムシＨｙａｌｏｐｔｅｒｕｓ ａｒｕｎｄｉｎｉｓ、ヒメトビウンカＬａｏｄｅｌｐｈａｘ ｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓ、ジャガイモアブラムシＭａｃｒｏｓｉｐｈｕｍ ｅｕｐｈｏｒｂｉａｅ、モモアカアブラムシＭｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ、ツマグロヨコバイＮｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ ｃｉｎｔｉｃｅｐｓ、トビイロウンカＮｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓ、虫こぶ形成アブラムシ（Ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ属）、ホップアブラムシＰｈｏｒｏｄｏｎ ｈｕｍｕｌｉ、ムギクビレアブラムシＲｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｐａｄｉ、オリーブカタカイガラムシＳａｉｓｓｅｔｉａ ｏｌｅａｅ、ムギミドリアブラムシＳｃｈｉｚａｐｈｉｓ ｇｒａｍｉｎｕｍ、ムギヒゲナガアブラムシＳｉｔｏｂｉｏｎ ａｖｅｎａｅ、及びオンシツコナジラミＴｒｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ ｖａｐｏｒａｒｉｏｒｕｍが挙げられるが、これらに限定されない。

Ｉｓｏｐｏｄａの例としては、オカダンゴムシＡｒｍａｄｉｌｌｉｄｉｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ及びホンワラジムシＯｎｉｓｃｕｓ ａｓｅｌｌｕｓが挙げられるが、これらに限定されない。

Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目は、Ｐａｐｉｌｉｏｎｉｄａｅ科、Ｐｉｅｒｉｄａｅ科、Ｌｙｃａｅｎｉｄａｅ科、Ｎｙｍｐｈａｌｉｄａｅ科、Ｄａｎａｉｄａｅ科、Ｓａｔｙｒｉｄａｅ科、Ｈｅｓｐｅｒｉｉｄａｅ科、Ｓｐｈｉｎｇｉｄａｅ科、Ｓａｔｕｒｎｉｉｄａｅ科、Ｇｅｏｍｅｔｒｉｄａｅ科、Ａｒｃｔｉｉｄａｅ科、Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ科、Ｌｙｍａｎｔｒｉｉｄａｅ科、Ｓｅｓｉｉｄａｅ科、及びＴｉｎｅｉｄａｅ科を含む。

Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａの例としては、Ａｄｏｘｏｐｈｙｅｓ ｏｒａｎａ（リンゴコカクモンハマキ）、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｏｌｏｎ（タマナヤガ）、Ａｒｃｈｉｐｓ ｐｏｄａｎａ（フルーツツリートートリックスモス）、Ｂｕｃｃｕｌａｔｒｉｘ ｐｙｒｉｖｏｒｅｌｌａ（ナシチビガ）、Ｂｕｃｃｕｌａｔｒｉｘ ｔｈｕｒｂｅｒｉｅｌｌａ（コットンリーフパーフォレイター）、Ｂｕｐａｌｕｓ ｐｉｎｉａｒｉｕｓ（パインルーパー）、Ｃａｒｐｏｃａｐｓａ ｐｏｍｏｎｅｌｌａ（コドリンガ）、Ｃｈｉｌｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ（ニカメイガ）、Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ（トウヒノシントメハマキ）、Ｃｏｃｈｙｌｉｓ ｈｏｓｐｅｓ（バンデッドサンフラワーモス）、Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ（サウスウエスタンコーンボーラー）、Ｅａｒｌｓ ｉｎｓｕｌａｎａ（エジプシャンボールワーム）、Ｅｕｐｈｅｓｔｉａ ｋｕｅｈｎｉｅｌｌａ（スジコナマダラメイガ）、Ｅｕｐｏｅｃｉｌｉａ ａｍｂｉｇｕｅｌｌａ（ヨーロピアングレープベリーモス）、Ｅｕｐｒｏｃｔｉｓ ｃｈｒｙｓｏｒｒｈｏｅａ（シロバネドクガ）、Ｅｕｐｒｏｃｔｉｓ ｓｕｂｆｌａｖａ（ドクガ）、Ｇａｌｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ（オオハチミツガ）、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ（アメリカタバコガ）、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ（アメリカタバコガ）、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ（ニセアメリカタバコガ）、Ｈｏｆｍａｎｎｏｐｈｉｌａ ｐｓｅｕｄｏｐｒｅｔｅｌｌａ（ブラウンハウスモス）、Ｈｏｍｅｏｓｏｍａ ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ（サンフラワーモス）、Ｈｏｍｏｎａ ｍａｇｎａｎｉｍａ（チャハマキ）、Ｌｉｔｈｏｃｏｌｌｅｔｉｓ ｂｌａｎｃａｒｄｅｌｌａ（キンモンホソガ）、Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ（マイマイガ）、Ｍａｌａｃｏｓｏｍａ ｎｅｕｓｔｒｉａ（テンマクケムシ）、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ（ヨトウガ幼虫）、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ（バーサアーミーワーム）、イモムシＭａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ及びＭａｎｕｄｕｃａ ｑｕｉｎｑｕｅｍａｃｕｌａｔａ、Ｏｐｅｒｏｐｈｔｅｒａ ｂｒｕｍａｔａ（フユシャク）、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ（ヨーロッパアワノメイガ）、Ｐａｎｏｌｉｓ ｆｌａｍｍｅａ（マツキリガ）、Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ（ワタアカミムシ）、Ｐｈｙｌｌｏｃｎｉｓｔｉｓ ｃｉｔｒｅｌｌａ（ミカンハモグリガ）、Ｐｉｅｒｉｓ ｂｒａｓｓｉｃａｅ（モンシロチョウ）、Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ（コナガ）、Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ ｎｉ（ソイビーンルーパー）、Ｓｐｉｌｏｓｏｍａ ｖｉｒｇｉｎｉｃａ（イエローベアーモス）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ（シロイチモンジョトウ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ツマジロクサヨトウ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ（コットンリーフワーム）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｕｒａ（ハスモンヨトウ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｐｒａｅｆｉｃａ（イエローストライプドアーミーワーム）、Ｓｙｌｅｐｔａ ｄｅｒｏｇａｔａ（ワタノメイガ）、Ｔｉｎｅｏｌａ ｂｉｓｓｅｌｌｉｅｌｌａ（コイガ）、Ｔｉｎｅｏｌａ ｐｅｌｌｉｏｎｅｌｌａ（イガ）、Ｔｏｒｔｒｉｘ ｖｉｒｉｄａｎａ（ヨーロピアンオークリーフローラー）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（イラクサキンウワバ）、ならびにＹｐｏｎｏｍｅｕｔａ ｐａｄｅｌｌａ（スモールアーミンモス）が挙げられるが、これらに限定されない。

Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａの例としては、イエコオロギＡｃｈｅｔａ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ、ツリーローカスト（Ａｎａｃｒｉｄｉｕｍ属）、トノサマバッタＬｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ、ツーストライプドグラスホッパーＭｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｂｉｖｉｔｔａｔｕｓ、ディファレンシャルグラスホッパーＭｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｄｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ、アカアシバッタＭｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ、ワタリバッタＭｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｐｅｓ、ノーザンモールクリケットＮｅｏｃｕｒｔｉｌｌａ ｈｅｘａｄｅｃｔｙｌａ、アカトビバッタＮｏｍａｄａｃｒｉｓ ｓｅｐｔｅｍｆａｓｃｉａｔａ、ショートウィングドモールクリケットＳｃａｐｔｅｒｉｓｃｕｓ ａｂｂｒｅｖｉａｔｕｓ、サザンモールクリケットＳｃａｐｔｅｒｉｓｃｕｓ ｂｏｒｅｌｌｉｉ、トーニーモールクリケットＳｃａｐｔｅｒｉｓｃｕｓ ｖｉｃｉｎｕｓ、及びサバクバッタＳｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ ｇｒｅｇａｒｉａが挙げられるが、これらに限定されない。

Ｐｈｔｈｉｒａｐｔｅｒａの例としては、ウシハジラミＢｏｖｉｃｏｌａ ｂｏｖｉｓ、ハジラミ類（Ｄａｍａｌｉｎｉａ属）、ネコジラミＦｅｌｉｃｏｌａ ｓｕｂｒｏｓｔｒａｔａ、ウシジラミＨａｅｍａｔｏｐｉｎｕｓ ｅｌｏｙｓｔｅｒｎｕｓ、テールスイッチシラミＨａｅｍａｔｏｐｉｎｕｓ ｑｕａｄｒｉｐｅｒｉｕｓｓｕｓ、ブタジラミＨａｅｍａｔｏｐｉｎｕｓ ｓｕｉｓ、カオジラミＬｉｎｏｇｎａｔｈｕｓ ｏｖｉｌｌｕｓ、アシジラミＬｉｎｏｇｎａｔｈｕｓ ｐｅｄａｌｉｓ、イヌジラミＬｉｎｏｇｎａｔｈｕｓ ｓｅｔｏｓｕｓ、ウシホソジラミＬｉｎｏｇｎａｔｈｕｓ ｖｉｔｕｌｉ、ニワトリオオハジラミＭｅｎａｃａｎｔｈｕｓ ｓｔｒａｍｉｎｅｕｓ、ニワトリハジラミＭｅｎｏｐｏｎ ｇａｌｌｉｎａｅ、ヒトジラミＰｅｄｉｃｕｌｕｓ ｈｕｍａｎｕｓ、ケジラミＰｈｔｈｉｒｕｓ ｐｕｂｉｓ、ケブカウシジラミＳｏｌｅｎｏｐｏｔｅｓ ｃａｐｉｌｌａｔｕｓ、及びイヌハジラミＴｒｉｃｈｏｄｅｃｔｅｓ ｃａｎｉｓが挙げられるが、これらに限定されない。

Ｐｓｏｃｏｐｔｅｒａの例としては、チャタテムシＬｉｐｏｓｃｅｌｉｓ ｂｏｓｔｒｙｃｈｏｐｈｉｌａ、Ｌｉｐｏｓｃｅｌｉｓ ｄｅｃｏｌｏｒ、Ｌｉｐｏｓｃｅｌｉｓ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ、及びＴｒｏｇｉｕｍ ｐｕｌｓａｔｏｒｉｕｍが挙げられるが、これらに限定されない。

Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａの例としては、トリノミＣｅｒａｔｏｐｈｙｌｌｕｓ ｇａｌｌｉｎａｅ、イヌノミＣｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ ｃａｎｉｓ、ネコノミＣｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ ｆｅｌｌｓ、ヒトノミＰｕｌｅｘ ｉｒｒｉｔａｎｓ、及びケオプスネズミノミＸｅｎｏｐｓｙｌｌａ ｃｈｅｏｐｉｓが挙げられるが、これらに限定されない。

Ｓｙｍｐｈｙｌａの例としては、ガーデンシンフィランＳｃｕｔｉｇｅｒｅｌｌａ ｉｍｍａｃｕｌａｔｅが挙げられるが、これに限定されない。

Ｔｈｙｓａｎｕｒａの例としては、オナガシミＣｔｅｎｏｌｅｐｉｓｍａ ｌｏｎｇｉｃａｕｄａｔａ、セスジシミＣｔｅｎｏｌｅｐｉｓｍａ ｑｕａｄｒｉｓｅｒｉａｔａ、セイヨウシミＬｅｐｉｓｍａ ｓａｃｃｈａｒｉｎａ、及びマダラシミＴｈｅｎｎｏｂｉａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａが挙げられるが、これらに限定されない。

Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａの例としては、タバコアザミウマＦｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ ｆｕｓｃａ、ヒラズハナアザミウマＦｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ ｉｎｔｏｎｓａ、ミカンキイロアザミウマＦｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、コットンバッドスリップスＦｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ ｓｃｈｕｌｔｚｅｉ、クリバネアザミウマＨｅｒｃｉｎｏｔｈｒｉｐｓ ｆｅｍｏｒａｌｉｓ、ダイズアザミウマＮｅｏｈｙｄａｔｏｔｈｒｉｐｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、ケリーズシトラススリップスＰｅｚｏｔｈｒｉｐｓ ｋｅｌｌｙａｎｕｓ、アボカドアザミウマＳｃｉｒｔｏｔｈｒｉｐｓ ｐｅｒｓｅａｅ、ミナミキイロアザミウマＴｈｒｉｐｓ ｐａｌｍｉ、及びネギアザミウマＴｈｒｉｐｓ ｔａｂａｃｉが挙げられるが、これらに限定されない。

線虫の例としては、Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ属、Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ属、及びＧｌｏｂｏｄｅｒａ属を含むネコブ線虫、シスト線虫、及びネグサレ線虫などの寄生性線虫、特に、Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｇｌｙｃｉｎｅｓ（ダイズシスト線虫）、Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｓｃｈａｃｈｔｉｉ（テンサイシスト線虫）、Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ａｖｅｎａｅ（ムギシスト線虫）、ならびにＧｌｏｂｏｄｅｒａ ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ及びＧｌｏｂｏｄｅｒａ ｐａｉｌｉｄａ（ジャガイモシスト線虫）を含むがこれらに限定されないシスト線虫のメンバーが挙げられるが、これらに限定されない。ネグサレ線虫としては、Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ属が挙げられるが、これに限定されない。

一実施形態において、本明細書に記述されるポリペプチド、ポリヌクレオチド、細胞、ベクターなどを含む殺虫性及び殺線虫性組成物は、外寄生生物を処置するために用いられ得る。外寄生生物としては、ノミ、マダニ、疥癬、ダニ、蚊、妨害（ｎｕｉｓａｎｃｅ）ハエ及びサシバエ、シラミ、ならびに前出の外寄生生物のうちの１つ以上を含む組み合わせが挙げられるが、これに限定されない。「ノミ」という用語は、Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ目の寄生ノミの通常種または偶生種、特にＣｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ種、特にＣ．ｆｅｌｌｓ及びＣ．ｃａｍｓ、ラットノミ（Ｘｅｎｏｐｓｙｌｌａ ｃｈｅｏｐｉｓ）、ならびにヒトノミ（Ｐｕｌｅｘ ｉｒｒｉｔａｎｓ）を含む。

本発明の昆虫有害生物は、限定されるものではないが、主要作物別に次のものが挙げられる：トウモロコシ：Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、ヨーロッパアワノメイガ；Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ、タマナヤガ；Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ、オオタバコガ；Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、ツマジロクサヨトウ；Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ、サウスウエスタンコーンボーラー；Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ、モロコシマダラメイガ；Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ、サトウキビメイガ；Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、ウエスタンコーンルートワーム；Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｌｏｎｇｉｃｏｒｎｉｓ ｂａｒｂｅｒｉ、ノーザンコーンルートワーム；Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉ、サザンコーンルートワーム；Ｍｅｌａｎｏｔｕｓ属、ハリガネムシ；Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ ｂｏｒｅａｌｉｓ、ノーザンマスクドチェイファー（コガネムシ類幼虫）；Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ ｉｍｍａｃｕｌａｔａ、サザンマスクドチェイファー（コガネムシ類幼虫）；Ｐｏｐｉｌｌｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ、マメコガネ；Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ ｐｕｌｉｃａｒｉａ、トウモロコシノミハムシ；Ｓｐｈｅｎｏｐｈｏｒｕｓ ｍａｉｄｉｓ、トウモロコシゾウムシ；Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｍａｉｄｉｓ、トウモロコシアブラムシ；Ａｎｕｒａｐｈｉｓ ｍａｉｄｉｒａｄｉｃｉｓ、トウモロコシ根アブラムシ；Ｂｌｉｓｓｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ、ヒメコガネナガカメムシ；Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ、アカアシバッタ；Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｐｅｓ、ワタリバッタ；Ｈｙｌｅｍｙａ ｐｌａｔｕｒａ、タネバエ；Ａｇｒｏｍｙｚａ ｐａｒｖｉｃｏｒｎｉｓ、コーンブロットリーフマイナー；Ａｎａｐｈｏｔｈｒｉｐｓ ｏｂｓｃｒｕｒｕｓ、アザミウマ；Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｍｉｌｅｓｔａ、トウゾクアリ；Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅ、ナミハダニ；ソルガム：Ｃｈｉｌｏ ｐａｒｔｅｌｌｕｓ、ソルガムボーラー；Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、ツマジロクサヨトウ；Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ、オオタバコガ；Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ、モロコシマダラメイガ；Ｆｅｌｔｉａ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ、グラニュレートカットワーム；Ｐｈｙｌｌｏｐｈａｇａ ｃｒｉｎｉｔａ、コガネムシ類幼虫；Ｅｌｅｏｄｅｓ、Ｃｏｎｏｄｅｒｕｓ、及びＡｅｏｌｕｓ属、ハリガネムシ；Ｏｕｌｅｍａ ｍｅｌａｎｏｐｕｓ、シリアルリーフビートル；Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ ｐｕｌｉｃａｒｉａ、トウモロコシノミハムシ；Ｓｐｈｅｎｏｐｈｏｒｕｓ ｍａｉｄｉｓ、トウモロコシゾウムシ；Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｍａｉｄｉｓ、トウモロコシアブラムシ；Ｓｉｐｈａ ｆｌａｖａ、イエローシュガーケーンアフィド；Ｂｌｉｓｓｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ、ヒメコガネナガカメムシ；Ｃｏｎｔａｒｉｎｉａ ｓｏｒｇｈｉｃｏｌａ、ソルガムタマバエ；Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ、カルミンハダニ；Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅ、ナミハダニ；コムギ：Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａｔａ、ヨトウムシ；Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、ツマジロクサヨトウ；Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ、モロコシマダラメイガ；Ａｇｒｏｔｉｓ ｏｒｔｈｏｇｏｎｉａ、ウエスタンカットワーム；Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ、モロコシマダラメイガ；Ｏｕｌｅｍａ ｍｅｌａｎｏｐｕｓ、シリアルリーフビートル；Ｈｙｐｅｒａ ｐｕｎｃｔａｔａ、ツメクサタコゾウムシ；Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉ、サザンコーンルートワーム；ロシアコムギアブラムシ；Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ ｇｒａｍｉｎｕｍ、ムギミドリアブラムシ；Ｍａｃｒｏｓｉｐｈｕｍ ａｖｅｎａｅ、イングリッシュグレインアフィド；Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ、アカアシバッタ；Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ、ディファレンシャルグラスホッパー；Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｐｅｓ、ワタリバッタ；Ｍａｙｅｔｉｏｌａ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ、コムギタマバエ；Ｓｉｔｏｄｉｐｌｏｓｉｓ ｍｏｓｅｌｌａｎａ、ムギアカタマバエ；Ｍｅｒｏｍｙｚａ ａｍｅｒｉｃａｎａ、ムギキモグリバエ；Ｈｙｌｅｍｙａ ｃｏａｒｃｔａｔａ、ウィートバルブフライ；Ｆｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ ｆｕｓｃａ、タバコアザミウマ；Ｃｅｐｈｕｓ ｃｉｎｃｔｕｓ、ウィートステムソーフライ；Ａｃｅｒｉａ ｔｕｌｉｐａｅ、チューリップサビダニ；ヒマワリ：Ｓｕｌｅｉｍａ ｈｅｌｉａｎｔｈａｎａ、サンフラワーバッドモス；Ｈｏｍｏｅｏｓｏｍａ ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ、サンフラワーモス；Ｚｙｇｏｇｒａｍｍａ ｅｘｃｌａｍａｔｉｏｎｉｓ、サンフラワービートル；Ｂｏｔｈｙｒｕｓ ｇｉｂｂｏｓｕｓ、クロマルコガネ；Ｎｅｏｌａｓｉｏｐｔｅｒａ ｍｕｒｔｆｅｌｄｔｉａｎａ、サンフラワーシードミッジ；ワタ：Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、コットンバッドワーム；Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ、アメリカタバコガ；Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ、シロイチモンジョトウ；Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ、ワタアカミムシ；Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ、ワタミハナゾウムシ；Ａｐｈｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｉ、ワタアブラムシ；Ｐｓｅｕｄａｔｏｍｏｓｃｅｌｉｓ ｓｅｒｉａｔｕｓ、ワタノミハムシ；Ｔｒｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ ａｂｕｔｉｌｏｎｅａ、バンデッドウイングドホワイトフライ；Ｌｙｇｕｓ ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ、ミドリメクラガメ；Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ、アカアシバッタ；Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ、ディファレンシャルグラスホッパー；
Ｔｈｒｉｐｓ ｔａｂａｃｉ、ネギアザミウマ；Ｆｒａｎｋｌｉｎｋｉｅｌｌａ ｆｕｓｃａ、タバコアザミウマ；Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ、カルミンハダニ；Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅ、ナミハダニ；イネ：Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ、サトウキビメイガ；Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、ツマジロクサヨトウ；Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ、オオタバコガ；Ｃｏｌａｓｐｉｓ ｂｒｕｎｎｅａ、グレープコラスピス；Ｌｉｓｓｏｒｈｏｐｔｒｕｓ ｏｒｙｚｏｐｈｉｌｕｓ、イネミズゾウムシ；Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、イネゾウムシ；Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ ｎｉｇｒｏｐｉｃｔｕｓ、イネヨコバイ；Ｂｌｉｓｓｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ、ヒメコガネナガカメムシ；Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ ｈｉｌａｒｅ、アオカメムシ；ダイズ：Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ、ソイビーンルーパー；Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ、ベルベットビーンキャタピラー；Ｐｌａｔｈｙｐｅｎａ ｓｃａｂｒａ、グリーンクローバーワーム；Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、ヨーロッパアワノメイガ；Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ、タマナヤガ；Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ、シロイチモンジョトウ；Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、コットンバッドワーム；Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ、アメリカタバコガ；Ｅｐｉｌａｃｈｎａ ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ、インゲンテントウ；Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ、モモアカアブラムシ；Ｅｍｐｏａｓｃａ ｆａｂａｅ、ジャガイモヨコバイ；Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ ｈｉｌａｒｅ、アオカメムシ；Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ、アカアシバッタ；Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ、ディファレンシャルグラスホッパー；Ｈｙｌｅｍｙａ ｐｌａｔｕｒａ、タネバエ；Ｓｅｒｉｃｏｔｈｒｉｐｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、ダイズアザミウマ；Ｔｈｒｉｐｓ ｔａｂａｃｉ、ネギアザミウマ；Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉ、イチゴハダニ；Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅ、ナミハダニ；オオムギ：Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、ヨーロッパアワノメイガ；Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ、タマナヤガ；Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ ｇｒａｍｉｎｕｍ、ムギミドリアブラムシ；Ｂｌｉｓｓｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ、ヒメコガネナガカメムシ；Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ ｈｉｌａｒｅ、アオカメムシ；Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｓｅｒｖｕｓ、クサギカメムシ；Ｄｅｌｉａ ｐｌａｔｕｒａ、タネバエ；Ｍａｙｅｔｉｏｌａ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ、コムギタマバエ；Ｐｅｔｒｏｂｉａ ｌａｔｅｎｓ、ホモノハダニ；アブラナ：Ｂｒｅｖｉｃｏｒｙｎｅ ｂｒａｓｓｉｃａｅ、ダイコンアブラムシ；Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ、ノミハムシ；Ｍａｍｅｓｔｒａ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ、バーサアーミーワーム；Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ、コナガ；Ｄｅｌｉａ種、ネクイムシ。

一部の実施形態では、殺虫性組成物は、前出の昆虫のうちの１つ以上を含む組み合わせを処置するために用いられ得る。

本発明のペプチドに対する感受性がある昆虫としては、Ｂｌａｔｔａｒｉａ、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ、Ｃｏｌｌｅｍｂｏｌａ、Ｄｉｐｔｅｒａ、Ｅｃｈｉｎｏｓｔｏｍｉｄａ、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ、Ｉｓｏｐｔｅｒａ、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、Ｎｅｕｒｏｐｔｅｒａ、Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ、Ｒｈａｂｄｉｔｉｄａ、Ｓｉｐｈｏｎｏｐｔｅｒａ、Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａが挙げられるが、これらに限定されない。属−種は次のように示される：Ａｃｔｅｂｉａ−ｆｅｎｎｉｃａ、Ａｇｒｏｔｉｓ−ｉｐｓｉｌｏｎ、Ａ．−ｓｅｇｅｔｕｍ、Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ−ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ、Ａｒｇｙｒｏｔａｅｎｉａ−ｃｉｔｒａｎａ、Ａｒｔｏｇｅｉａ−ｒａｐａｅ、Ｂｏｍｂｙｘ−ｍｏｒｉ、Ｂｕｓｓｅｏｌａ−ｆｕｓｃａ、Ｃａｃｙｒｅｕｓ−ｍａｒｓｈａｌｌ、Ｃｈｉｌｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ、Ｃｈｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ−ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ、Ｃ．−ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｃ．−ｐｉｎｕｓ ｐｉｎｕｓ、Ｃ．−ｒｏｓａｃｅｎａ、Ｃｎａｐｈａｌｏｃｒｏｃｉｓ−ｍｅｄｉｎａｌｉｓ、Ｃｏｎｏｐｏｍｏｒｐｈａ−ｃｒａｍｅｒｅｌｌａ、Ｃｔｅｎｏｐｓｕｅｓｔｉｓ−ｏｂｌｉｑｕａｎａ、Ｃｙｄｉａ−ｐｏｍｏｎｅｌｌａ、Ｄａｎａｕｓ−ｐｌｅｘｉｐｐｕｓ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉ、Ｄｉａｔｒａｅａ−ｓａｃｃｈａｒａｌｌｉｓ、Ｄ．−ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ、Ｅａｒｉａｓ−ｖｉｔｔｅｌｌａ、Ｅｌａｓｍｏｌｐａｌｐｕｓ−ｌｉｇｎｏｓｅｌｉｕｓ、Ｅｌｄａｎａ−ｓａｃｃｈａｒｉｎａ、Ｅｐｈｅｓｔｉａ−ｋｕｅｈｎｉｅｌｌａ、Ｅｐｉｎｏｔｉａ−ａｐｏｒｅｍａ、Ｅｐｉｐｈｙａｓ−ｐｏｓｔｖｉｔｔａｎａ、Ｇａｌｌｅｒｉａ−ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ−ｚｅａ、Ｈ．−ｐｕｎｃｔｉｇｅｒａ、Ｈ．−ａｒｍｉｇｅｒａ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ−ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａ−ｃｕｎｅａ、Ｌａｍｂｄｉｎａ−ｆｉｓｃｅｌｌａｒｉａ、Ｌｅｇｕｍｉｎｉｖｏｒａ−ｇｌｙｃｉｎｉｖｏｒｅｌｌａ、Ｌｏｂｅｓｉａ−ｂｏｔｒａｎａ、Ｌｙｍａｎｔｒｉａ−ｄｉｓｐａｒ、Ｍａｌａｃｏｓｏｍａ−ｄｉｓｓｔｒｉａ、Ｍａｍｅｓｔｒａ−ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｍ．ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ、Ｍａｎｄｕｃａ−ｓｅｘｔａ、Ｍａｒａｓｍｉａ−ｐａｔｎａｌｉｓ、Ｍａｒｕｃａ−ｖｉｔｒａｔａ、Ｏｒｇｙｉａ−ｌｅｕｃｏｓｔｉｇｍａ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ−ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ｏ．−ｆｕｒｎａｃａｌｉｓ、Ｐａｎｄｅｍｉｓ−ｐｙｒｕｓａｎａ、Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ−ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ、Ｐｅｒｉｌｅｕｃｏｐｔｅｒａ−ｃｏｆｆｅｅｌｌａ、Ｐｈｔｈｏｒｉｍａｅａ−ｏｐｅｒｃｕｌｌｅｌａ、Ｐｉａｎｏｔｏｒｔｒｉｘ−ｏｃｔｏ、Ｐｉａｔｙｎｏｔａ−ｓｔｕｌｔａｎａ、Ｐｉｅｒｉｓ−ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｐｌｏｄｉａ−ｉｎｔｅｒｐｕｎｃｔａｌａ、Ｐｌｕｔｅｌｌａ−ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ−ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ、Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ−ｎｕ、Ｓｃｉｒｏｐｏｐｈａｇａ−ｉｎｃｅｒｔｕｌａｓ、Ｓｅｓａｍｉａ−ｃａｌａｍｉｓｔｉｓ、Ｓｐｉｌｏｓｏｍａ−ｖｉｒｇｉｎｉｃａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ−ｅｘｉｇｕａ、Ｓ．−ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｓ．−ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ、Ｓ．−ｅｘｅｍｐｔａ、Ｓ．−ｌｉｔｕｒａ、Ｔｅｃｉａ−ｓｏｌａｎｉｖｏｒａ、Ｔｈａｕｍｅｔｏｐｏｅａ−ｐｉｔｙｏｃａｍｐａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ−ｎｉ、Ｗｉｓｅａｎａ−ｃｅｒｖｉｎａｔａ、Ｗｉｓｅａｎａ−ｃｏｐｕｌａｒｉｓ、Ｗｉｓｅａｎａ−ｊｏｃｏｓａ、Ｂｌａｔｔａｒｉａ−Ｂｌａｔｔｅｌｌａ、Ｃｏｌｌｅｍｂｏｌａ−Ｘｅｎｙｌｌａ、Ｃ．−Ｆｏｌｓｏｍｉａ、Ｅｃｈｉｎｏｓｔｏｍｉｄａ−Ｆａｓｃｉｏｌａ、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ−Ｏｎｃｏｐｅｌｔｒｕｓ、Ｈｅ．−Ｂｅｍｉｓｉａ、
Ｈｅ．−Ｍａｃｒｏｓｉｐｈｕｍ、Ｈｅ．−Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ、Ｈｅ．−Ｍｙｚｕｓ、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ−Ｄｉｐｒｉｏｎ、Ｈｙ．−Ａｐｉｓ、Ｈｙ．−Ｍａｃｒｏｃｅｎｔｒｕｓ、Ｈｙ．−Ｍｅｔｅｏｒｕｓ、Ｈｙ．−Ｎａｓｏｎｉａ、Ｈｙ．−Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ、Ｉｓｏｐｏｄａ−Ｐｏｒｃｅｌｌｉｏ、Ｉｓｏｐｔｅｒａ−Ｒｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓ、Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ−Ａｃｈｔａ、Ｐｒｏｓｔｉｇｍａｔａ−Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ、Ｒｈａｂｉｔｉｄａ−Ａｃｒｏｂｅｌｏｉｄｅｓ、Ｒ．−Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ、Ｒ．−Ｄｉｓｔｏｌａｂｒｅｌｌｕｓ、Ｒ．−Ｐａｎａｇｒｅｌｌｕｓ、Ｒ．−Ｐｒｉｓｔｉｏｎｃｈｕｓ、Ｒ．−Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ、Ｒ．−Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ、Ｒ．−Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ、Ｒ．−Ｐａｎａｇｒｅｌｌｕｓ、Ｒ．−Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ、Ｒ．−Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ、及びＳｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ−Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ。本明細書で使用される場合、昆虫有害生物及び線虫有害生物とは、殺虫性及び／または殺線虫性トランスジェニックタンパク質組成物ならびにそれらをコードするポリペプチドに対する感受性がある昆虫及び線虫の種である。

感受性の高い昆虫及び線虫の選択リスト。以下のリストは昆虫及び線虫の両方を含む。線虫にもまた、本出願及びクレームにおいて特定される組成物及び処置に対する感受性がある。以下の昆虫及び線虫は、本明細書及びクレームにおいて特定される組成物及び処置に対して特に好適であり感受性があるとみなされる。

ストークボーラー（Ｂｕｓｓｅｏｌａ ｆｕｓｃａ）、サザンコーンストークボーラー（Ｄｉａｔｒａｅａ ｃｒａｍｂｉｄｏｉｄｅｓ）、トゥルーアーミーワーム（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａ）、ウエスタンビーンカットワーム（Ｓｔｒｉａｃｏｓｔａ ａｌｂｉｃｏｓｔａ）、タマナヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、オオタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、ヨーロッパアワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、ウエスタンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）、サザンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉ）、ノーザンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｂａｒｂｅｒｉ）、西部ミドリメクラガメ（Ｌｙｇｕｓ Ｈｅｓｐｅｒｕｓ）、ミドリメクラガメ（Ｌｙｇｕｓ ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ）、ダイズシスト線虫（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｇｌｙｃｉｎｅｓ）、ネコブ線虫（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｈａｐｌａ）、ネグサレ線虫（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）、ワタアカミムシ（Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ）、アメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ）、オオタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、シュガーケーンストークボーラー（Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）、アジアアワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｆｕｒｎａｃａｌｉｓ）、ネイティブバッドワーム（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｐｕｎｃｔｉｇｅｒａ）、ニセアメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、シロイチモンジョトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）、ソイビーンルーパー（Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、ベルベットビーンキャタピラー（Ａｎｔｉｃａｒｃｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）、ソイビーンルーパー（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ ｉｎｃｌｕｄｅｓ）、ソイビーンアクシルボーラー（Ｅｐｉｎｏｔｉａ ａｐｏｒｅｍａ）、及びサンフラワールーパー（Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ ｎｕ）。

実施例１。二元及び三元の切断可能な連結ペプチドの特定及び単離

１．）ＦＲＥＴ調査及び切断可能な連結ペプチドの発見

昆虫及び／または線虫プロテアーゼならびにヒトの胃腸管系で切断可能な特性を有するリンカーを見出すため、本発明者らはレポーターアッセイとして、昆虫の腸内環境または擬似のヒト胃腸管環境のいずれかで切断するペプチドを特定するために、ＦＲＥＴ分子にカップリングしたペプチドライブラリ（色素及びクエンチャー）を使用した。図１に示されるように、ＦＲＥＴキットは、色素（四角が突き出ている黒丸）またはクエンチャー（四角形のくぼみがある黒丸）のいずれかに結合した一連のグリシンアミノ酸（横線柄）によって挟まれた３つの可変アミノ酸配列（格子柄の円）の区間を有するＦＲＥＴ分子のプールを含有する。図１は、可変領域が切断されなければ各ＦＲＥＴ分子はシグナルを出さないが、可変領域が切断されれば励起され得ることを説明している。切断が生じる速度（すなわち、プロテアーゼに対する配列の特異性）は、時間に対する蛍光シグナルが生じる速度、すなわち、その傾きによってランク付けすることができる。

使用したＦＲＥＴキット（カタログ番号ＰＳＲＥＰＬＩ００５、Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）は、プール当たり最大８つの異なるＦＲＥＴ分子からなる５１２個のプールを含有する。ＦＲＥＴ反応は非常にハイスループットであり、プールされた材料のプレートにマルチチャネルのローディングピペットで酵素を加え、検出可能な蛍光について１分間に１回プレートを読み取る。蛍光検出の出力が各反応について記録される。

ＦＲＥＴ試料は、製造元の推奨通りアッセイの直前に調製した（５μＬの５０％アセトニトリル水溶液を各ウェルに加え、プレートをシェーカー上で５分間撹拌する。次に４５μＬのアッセイバッファーを加え、再度５分間撹拌する）。この時点で、ＦＲＥＴプールに５０μＬの作業用酵素ストックを加えて反応を開始する準備が整った。マルチチャネルのリピートピペッターを使用し、５０μＬの作業用酵素ストックを（試験した酵素タイプの各々に対して）各ウェルに加えてから、プレートを直ちにプレートリーダー（ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ６．０ソフトウェアを備えたＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）に入れ、励起３２０ｎｍ、発光４２０ｎｍ、カットオフ４２０ｎｍの設定を使用して発光を読み取った。読み取りは１５分間にわたって１分毎に行った。プレートが完了したらアルミニウムシーラーでプレートを密閉し、−８０℃で保管した。

ペプシンまたはヒトの擬似胃液（ＳＧＦ）によるＦＲＥＴプールの切断を試験するため、アッセイバッファーは３５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ１．２であった。アッセイバッファーに１ｍｇ／ｍｌのペプシンを溶解させることにより、市販の酵素（Ｓｉｇｍａ Ｐ６８８７）酵素を調製した。次に、２５０μＬのストック酵素を５０ｍＬのアッセイバッファーに加えることにより、ペプシンストックを１：２００に希釈した。その後、この作業溶液を全てのプレートスクリーニングに使用した。

Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ目有害生物の腸内酵素または腸管内酵素によるＦＲＥＴプールの切断を試験するため、腸内酵素（ＣＥＬＯＰ）をサザンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ）から単離した。サザンコーンルートワームは、３齢幼虫としてＣｒｏｐ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ（Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＮ）から商業的に得た。昆虫を数分間にわたって冷パック上に置くことによって麻酔した後に解剖を開始した。腸を単離するために、後端を解剖プレートにピンで留め、別のピンを使用して頭部後ろの軟組織に切れ目を入れた。ピンを頭蓋の後ろに挿入してから、ピン留めされた昆虫から引き離し、消化管を頭部と共に体から引き抜いた。これで腸を収集することができた。約２０個の腸を１００ｍＭ ＰＢＳ ｐＨ５．７の溶液１００μＬと共に計量済み試験管に加えた、その後に計量して、加えた腸の質量を求めた。溶液を１〜２分間ボルテックスすることにより腸内容物を抽出した。次に試験管を１５，０００ｒｐｍで１分間回転させた。その後、液体層を０．２μｍマイクロスピンフィルタに移し、１５，０００ｒｃｆで１分間回転させた。フィルタを４００μＬの１００ｍＭ ＰＢＳバッファーｐＨ５．７で洗浄し、両方の回転から得た透過物を合わせた。滅菌濾過された腸内容物を次にバッファー中で１０ｍｇ／ｍＬに希釈し、−２０℃で保管した。次に作業用ストックを作るため、各プレートにつき、７００μＬストックをアッセイバッファーと混合して７ｍＬにすることにより、腸内容物を１０倍に希釈した。マルチチャネルのリピートピペッターを使用し、１倍の腸抽出物５０μＬを各ウェルに加え、上述のように直ちに読み取った。

Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目有害生物（ＬＥＰ）の腸内酵素によるＦＲＥＴプールの切断を試験するため、腸内酵素をオオタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）から単離した。オオタバコガ昆虫は、Ｂｅｎｚｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｃａｒｌｉｓｌｅ，ＰＡ）から卵として商業的に得た。孵化した幼虫を４／５齢（体長２０ｍｍ）まで人工飼料で飼育した後、腸を単離した。腸抽出の前にＣＯ_２を使用して幼虫を麻酔した。次に、幼虫の頭部及び尾部の両方を解剖プレートにピンで留めた。解剖鋏を使用してクチクラに切れ目を入れた。次に解剖鋏を切れ目に挿入し、昆虫の体に沿って縦方向にクチクラを切った。次にクチクラを慎重に引っ張り、広げてピンで留めて、消化管を露出させた。ＤＩ水を使用して昆虫を十分にすすぎ、血リンパを除去した。次に腸をピンセットで切除し、２００ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．１ １５０ｍＭ ＮａＣｌ（アッセイバッファー）の溶液５００μＬに入れた。加えた腸の総量を計算するため、試験管を事前に計量し、また後にも計量した。２００ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．１ １５０ｍＭ ＮａＣｌ中で７ｍｇ／ｍｌ（１０倍）のストック濃度までＣＥＷの腸を希釈した。これを、各プレートでアッセイバッファーにより２０倍まで新鮮に希釈した。マルチチャネルのリピートピペッターを使用し、１倍の腸抽出物５０μＬを各ウェルに加え、上述のように直ちに読み取った。

１．１）ＦＲＥＴペプチドプールのプロテアーゼ切断解析

ＦＲＥＴキット（カタログ番号ＰＳＲＥＰＬＩ００５、Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を、ＬＥＰ、ＣＯＬＥＯＰ、及びＳＧＦの腸内擬似プロテアーゼ環境に対して試験し、データを回収した。２つのタイプのデータ（時間に対する切断の傾き（生の傾きとして、あるいは、最も急な傾きが１００％であり、各傾きが最も高い傾きに対する百分率として表されるインデックス値として提示されている）、及び切断された成分）が生成された。第１のタイプのデータは、１０分間にわたる蛍光検出の傾きであった。反応の傾きにより、２つまたは３つのアミノ酸配列を、それらが種々のプロテアーゼ環境において切断する速度についてランク付けすることができた。表４は、各消化条件において切断した上位５０の配列を示す（ＳＧＦはヒトの胃腸管環境を表し、ＣＯＬＥＯＰはＣｏｌｅｏｐｔｅｒａ昆虫の腸内環境であり、ＬＥＰはＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目昆虫の腸内環境である）。表５には、消化条件下で切断しなかった試料配列が示され、これらは、Ｘ条件及びＹ条件下で切断可能でないマーカッシュに含まれない配列の例を表す。

表４。各消化条件；ＳＧＦ、ＣＯＬＥＯＰ、及びＬＥＰに関するプールされたＦＲＥＴスクリーニングから得られた代表的な切断可能配列

表５。各消化条件；ＳＧＦ、ＣＯＬＥＯＰ、及びＬＥＰに関するプールされたＦＲＥＴスクリーニングから得られた、５つの失敗した切断可能配列の例

各消化条件のウェルのうち上位５％に代表的であったアミノ酸を使用して、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３、及びＹ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４からなる群から選択されるアミノ酸配列［式中、各Ｘｎ及び各Ｙｎはアミノ酸であり、Ｘ_１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、及びＶからなる群から選択され、Ｘ_２は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ_４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｙ_１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ_２は、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ_４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される］を含む二元ペプチドを構成するマーカッシュ群を作出した。

ＸＹまたはＹＸ形式における、ＳＧＦ（擬似のヒト腸内環境）スクリーニングから発見された配列の一実施形態である、ヒト腸内プロテアーゼ切断可能基質は、次のペプチド：ＡＦＦ、ＡＦＧ、ＡＦＩ、ＡＦＬ、ＡＦＶ、ＡＦＹ、ＡＧＦ、ＡＧＬ、ＡＩＦ、ＡＩＬ、ＡＬＦ、ＡＬＧ、ＡＬＩ、ＡＬＬ、ＡＬＹ、ＡＹＦ、ＡＹＬ、ＤＦＦ、ＤＦＧ、ＤＦＩ、ＤＦＬ、ＤＦＹ、ＤＧＦ、ＤＧＬ、ＤＩＦ、ＤＬＦ、ＤＬＧ、ＤＬＹ、ＤＹＦ、ＤＹＬ、ＥＦＦ、ＥＦＧ、ＥＦＩ、ＥＦＬ、ＥＦＹ、ＥＧＦ、ＥＧＬ、ＥＩＦ、ＥＬＦ、ＥＬＧ、ＥＬＹ、ＥＹＦ、ＥＹＬ、ＦＦ、ＦＦＡ、ＦＦＤ、ＦＦＥ、ＦＦＦ、ＦＦＧ、ＦＦＩ、ＦＦＫ、ＦＦＬ、ＦＦＲ、ＦＦＳ、ＦＦＴ、ＦＦＶ、ＦＦＹ、ＦＧＡ、ＦＧＤ、ＦＧＥ、ＦＧＦ、ＦＧＩ、ＦＧＫ、ＦＧＬ、ＦＧＲ、ＦＧＳ、ＦＧＴ、ＦＧＶ、ＦＧＹ、ＦＬＶ、ＦＬＲ、ＦＹＡ、ＦＹＤ、ＦＹＥ、ＦＹＦ、ＦＹＧ、ＦＹＩ、ＦＹＫ、ＦＹＬ、ＦＹＲ、ＦＹＳ、ＦＹＴ、ＦＹＶ、ＦＹＹ、ＧＦＡ、ＧＦＤ、ＧＦＥ、ＧＦＦ、ＧＦＩ、ＧＦＫ、ＧＦＬ、ＧＦＲ、ＧＦＳ、ＧＦＴ、ＧＦＶ、ＧＦＹ、ＧＧＬ、ＧＩＦ、ＧＩＬ、ＧＬＦ、ＧＬＩ、ＧＬＬ、ＧＬＹ、ＧＹＦ、ＧＹＬ、ＩＦ、ＩＦＡ、ＩＦＦ、ＩＦＧ、ＩＦＩ、ＩＦＬ、ＩＦＶ、ＩＦＹ、ＩＧＦ、ＩＧＬ、ＩＩＦ、ＩＩＬ、ＩＬＦ、ＩＬＧ、ＩＬＩ、ＩＬＬ、ＩＬＹ、ＩＹＦ、ＩＹＬ、ＬＦＡ、ＬＦＦ、ＬＦＧ、ＬＦＩ、ＬＦＬ、ＬＦＶ、ＬＦＹ、ＬＧ、ＬＧＡ、ＬＧＥ、ＬＧＦ、
ＬＧＩ、ＬＧＬ、ＬＧＶ、ＬＧＹ、ＬＩＦ、ＬＩＧ、ＬＩＩ、ＬＩＬ、ＬＩＹ、ＬＬＦ、ＬＬＧ、ＬＬＩ、ＬＬＬ、ＬＬＹ、ＬＹＡ、ＬＹＦ、ＬＹＧ、ＬＹＩ、ＬＹＬ、ＬＹＶ、ＬＹＹ、ＮＦＦ、ＮＦＧ、ＮＦＩ、ＮＦＬ、ＮＦＹ、ＮＧＦ、ＮＧＬ、ＮＩＬ、ＮＬＧ、ＮＬＩ、ＮＬＬ、ＮＹＦ、ＮＹＬ、ＱＦＦ、ＱＦＧ、ＱＦＩ、ＱＦＬ、ＱＦＹ、ＱＧＦ、ＱＧＬ、ＱＩＬ、ＱＬＧ、ＱＬＩ、ＱＬＬ、ＱＹＦ、ＱＹＬ、ＳＦＦ、ＳＦＧ、ＳＦＩ、ＳＦＬ、ＳＦＹ、ＳＧＦ、ＳＧＬ、ＳＩＦ、ＳＩＬ、ＳＬＦ、ＳＬＧ、ＳＬＩ、ＳＬＬ、ＳＬＹ、ＳＹＦ、ＳＹＬ、ＴＦＦ、ＴＦＧ、ＴＦＩ、ＴＦＬ、ＴＦＹ、ＴＧＦ、ＴＧＬ、ＴＩＦ、ＴＩＬ、ＴＬＦ、ＴＬＧ、ＴＬＩ、ＴＬＬ、ＴＬＹ、ＴＹＦ、ＴＹＬ、ＶＦＦ、ＶＦＧ、ＶＦＩ、ＶＦＬ、ＶＦＹ、ＶＧＦ、ＶＧＬ、ＶＩＦ、ＶＩＬ、ＶＬＦ、ＶＬＧ、ＶＬＩ、ＶＬＬ、ＶＬＹ、ＶＹＦ、ＶＹＬ、ＹＦＡ、ＹＦＤ、ＹＦＥ、ＹＦＦ、ＹＦＧ、ＹＦＩ、ＹＦＫ、ＹＦＬ、ＹＦＲ、ＹＦＳ、ＹＦＴ、ＹＦＶ、ＹＦＹ、ＹＧＦ、ＹＧＬ、ＹＹＦ、ＹＹＬのうちの１つ以上を含み得る。

ＳＧＦスクリーニングから発見された配列の別の実施形態である、Ｙ ＳＧＦ切断可能ペプチドは、ＡＦＦ、ＡＦＩ、ＡＦＬ、ＡＦＹ、ＡＩＦ、ＡＩＬ、ＡＬＦ、ＡＬＩ、ＡＬＬ、ＡＬＹ、ＡＹＦ、ＡＹＬ、ＤＦＦ、ＤＦＩ、ＤＦＬ、ＤＦＹ、ＤＩＦ、ＤＬＦ、ＤＬＹ、ＤＹＦ、ＤＹＬ、ＹＦＬ、ＥＦＦ、ＥＦＩ、ＥＦＬ、０、ＥＦＹ、ＥＩＦ、ＥＬＦ、ＥＬＹ、ＥＹＦ、ＥＹＬ、ＦＦＡ、ＦＦＤ、ＦＦＥ、ＦＦＦ、ＦＦＩ、ＦＦＫ、ＦＦＬ、ＦＦＲ、ＦＦＳ、ＦＦＴ、ＦＦＶ、ＦＦＹ、ＦＹＡ、ＦＹＤ、ＦＹＥ、ＦＹＦ、ＦＹＩ、ＦＹＫ、ＦＹＬ、ＦＹＲ、ＦＹＳ、ＦＹＴ、ＦＹＶ、ＦＹＹ、ＩＦＡ、ＩＦＦ、ＩＦＩ、ＩＦＬ、ＩＦＶ、ＩＦＹ、ＩＩＦ、ＩＩＬ、ＩＬＦ、ＩＬＩ、ＩＬＬ、ＩＬＹ、ＩＹＦ、ＩＹＬ、ＬＦＡ、ＬＦＦ、ＬＦＩ、ＬＦＬ、ＬＦＶ、ＬＦＹ、ＬＩＦ、ＬＩＩ、ＬＩＬ、ＬＩＹ、ＬＬＦ、ＬＬＩ、ＬＬＬ、ＬＬＹ、ＬＹＡ、ＬＹＦ、ＬＹＩ、ＬＹＬ、ＬＹＶ、ＬＹＹ、ＮＦＦ、ＮＦＩ、ＮＦＬ、ＮＦＹ、ＮＩＬ、ＮＬＩ、ＮＬＬ、ＮＹＦ、ＮＹＬ、ＱＦＦ、ＱＦＩ、ＱＦＬ、ＱＦＹ、ＱＩＬ、ＱＬＩ、ＱＬＬ、ＱＹＦ、ＱＹＬ、ＳＦＦ、ＳＦＩ、ＳＦＬ、ＳＦＹ、ＳＩＦ、ＳＩＬ、ＳＬＦ、ＳＬＩ、ＳＬＬ、ＳＬＹ、ＳＹＦ、ＳＹＬ、ＴＦＦ、ＴＦＩ、ＴＦＬ、ＴＦＹ、ＴＩＦ、ＴＩＬ、ＴＬＦ、ＴＬＩ、ＴＬＬ、ＴＬＹ、ＴＹＦ、ＴＹＬ、ＶＦＦ、ＶＦＩ、ＶＦＬ、ＶＦＹ、ＶＩＦ、ＶＩＬ、ＶＬＦ、ＶＬＩ、ＶＬＬ、ＶＬＹ、ＶＹＦ、ＶＹＬ、ＹＦＡ、ＹＦＤ、ＹＦＥ、ＹＦＦ、ＹＦＩ、ＹＦＫ、ＹＦＬ、ＹＦＲ、ＹＦＳ、ＹＦＴ、ＹＦＶ、ＹＦＹ、ＹＹＦ、ＹＹＬのうちの１つ以上を含み得る。

一部の実施形態では、昆虫切断性から発見された例示的な配列である、Ｘ領域は、１つ以上の昆虫及び／または線虫の腸内プロテアーゼ切断可能ペプチド配列：ＡＡＧ、ＡＡＫ、ＡＡＲ、ＡＦＧ、ＡＦＫ、ＡＦＲ、ＡＧＦ、ＡＧＩ、ＡＧＫ、ＡＧＬ、ＡＧＮ、ＡＧＱ、ＡＧＲ、ＡＧＳ、ＡＧＴ、ＡＧＹ、ＡＩＧ、ＡＩＫ、ＡＩＮ、ＡＩＱ、ＡＩＲ、ＡＫＦ、ＡＫＧ、ＡＫＩ、ＡＫＫ、ＡＫＬ、ＡＫＮ、ＡＫＱ、ＡＫＲ、ＡＫＳ、ＡＫＴ、ＡＫＹ、ＡＬＧ、ＡＬＫ、ＡＬＮ、ＡＬＱ、ＡＬＲ、ＡＰＦ、ＡＰＧ、ＡＰＫ、ＡＰＲ、ＡＲＦ、ＡＲＧ、ＡＲＩ、ＡＲＫ、ＡＲＬ、ＡＲＮ、ＡＲＱ、ＡＲＲ、ＡＲＳ、ＡＲＴ、ＡＲＹ、ＡＳＧ、ＡＳＫ、ＡＳＲ、ＡＴＧ、ＡＴＫ、ＡＴＲ、ＡＶＧ、ＡＶＫ、ＡＶＲ、ＡＹＧ、ＡＹＫ、ＡＹＲ、ＤＧＫ、ＤＧＲ、ＤＩＧ、ＤＩＫ、ＤＩＲ、ＤＬＧ、ＤＬＫ、ＤＬＲ、ＥＧＫ、ＥＧＲ、ＥＩＧ、ＥＩＫ、ＥＩＲ、ＥＬＧ、ＥＬＫ、ＥＬＲ、ＥＲ、ＦＶＲ、ＧＡＦ、ＧＡＩ、ＧＡＫ、ＧＡＬ、ＧＡＲ、ＧＡＹ、ＧＦＫ、ＧＦＲ、ＧＩＫ、ＧＩＮ、ＧＩＱ、ＧＩＲ、ＧＫＡ、ＧＫＤ、ＧＫＥ、ＧＫＦ、ＧＫＩ、ＧＫＫ、ＧＫＬ、ＧＫＮ、ＧＫＱ、ＧＫＲ、ＧＫＳ、ＧＫＴ、ＧＫＶ、ＧＫＹ、ＧＬＫ、ＧＬＮ、ＧＬＱ、ＧＬＲ、ＧＮＡ、ＧＮＫ、ＧＮＲ、ＧＮＶ、ＧＰＫ、ＧＰＲ、ＧＱＡ、ＧＱＫ、ＧＱＲ、ＧＱＶ、ＧＲＡ、ＧＲＤ、ＧＲＥ、ＧＲＦ、ＧＲＩ、ＧＲＫ、ＧＲＬ、ＧＲＮ、ＧＲＱ、ＧＲＲ、ＧＲＳ、ＧＲＴ、ＧＲＶ、ＧＲＹ、ＧＳＩ、ＧＳＫ、ＧＳＬ、ＧＳＲ、ＧＴＩ、ＧＴＫ、ＧＴＬ、ＧＴＲ、ＧＶＦ、ＧＶＩ、ＧＶＫ、ＧＶＬ、ＧＶＲ、ＧＶＹ、ＧＹＫ、ＧＹＲ、ＩＧＡ、ＩＧＦ、ＩＧＩ、ＩＧＫ、ＩＧＬ、ＩＧＮ、ＩＧＱ、ＩＧＲ、ＩＧＳ、ＩＧＴ、ＩＧＶ、ＩＧＹ、ＩＩＧ、ＩＩＫ、ＩＩＲ、ＩＫＡ、ＩＫＦ、ＩＫＧ、ＩＫＩ、ＩＫＫ、ＩＫＬ、ＩＫＮ、ＩＫＱ、ＩＫＲ、ＩＫＳ、ＩＫＴ、ＩＫＶ、ＩＫＹ、ＩＬＧ、ＩＬＫ、ＩＬＲ、ＩＮＡ、ＩＮＧ、ＩＮＫ、ＩＮＲ、ＩＮＶ、ＩＰＧ、ＩＰＫ、ＩＰＲ、ＩＱＡ、ＩＱＧ、ＩＱＫ、ＩＱＲ、ＩＱＶ、ＩＲＡ、ＩＲＦ、ＩＲＧ、ＩＲＩ、ＩＲＫ、ＩＲＬ、ＩＲＮ、ＩＲＱ、ＩＲＲ、ＩＲＳ、ＩＲＴ、ＩＲＶ、ＩＲＹ、ＩＳＧ、ＩＳＫ、ＩＳＲ、ＩＴＧ、ＩＴＫ、ＩＴＲ、ＫＡＦ、ＫＡＧ、ＫＡＩ、ＫＡＫ、ＫＡＬ、ＫＡＲ、ＫＡＹ、ＫＦＦ、ＫＦＧ、ＫＦＫ、ＫＦＲ、ＫＧＡ、ＫＧＤ、ＫＧＥ、ＫＧＦ、ＫＧＩ、ＫＧＫ、ＫＧＬ、ＫＧＮ、ＫＧＱ、ＫＧＲ、ＫＧＳ、ＫＧＴ、ＫＧＶ、ＫＧＹ、ＫＩＧ、ＫＩＫ、ＫＩＮ、ＫＩＱ、ＫＩＲ、ＫＫＡ、ＫＫＤ、ＫＫＥ、ＫＫＦ、ＫＫＧ、ＫＫＮ、ＫＫＱ、ＫＫＳ、ＫＫＴ、ＫＫＶ、ＫＫＹ、ＫＬＧ、ＫＬＫ、ＫＬＮ、ＫＬＱ、ＫＬＲ、ＫＮＧ、ＫＮＫ、ＫＮＲ、ＫＰＧ、ＫＰＫ、ＫＰＲ、ＫＱＧ、ＫＱＫ、ＫＱＲ、ＫＲＡ、ＫＲＤ、ＫＲＥ、ＫＲＦ、ＫＲＧ、ＫＲＮ、ＫＲＱ、ＫＲＳ、ＫＲＴ、ＫＲＶ、ＫＲＹ、ＫＳＧ、ＫＳＩ、ＫＳＫ、ＫＳＬ、ＫＳＲ、ＫＴＧ、ＫＴＩ、ＫＴＫ、ＫＴＬ、ＫＴＲ、ＫＶＦ、ＫＶＧ、ＫＶＩ、ＫＶＫ、ＫＶＬ、ＫＶＲ、ＫＶＹ、ＫＹＧ、ＫＹＫ、ＫＹＲ、ＬＦＲ、ＬＧＡ、ＬＧＦ、ＬＧＩ、ＬＧＫ、ＬＧＬ、ＬＧＮ、ＬＧＱ、ＬＧＲ、ＬＧＳ、ＬＧＴ、ＬＧＶ、ＬＧＹ、ＬＩＧ、ＬＩＫ、ＬＩＲ、
ＬＫ、ＬＫＡ、ＬＫＦ、ＬＫＧ、ＬＫＩ、ＬＫＫ、ＬＫＬ、ＬＫＮ、ＬＫＱ、ＬＫＲ、ＬＫＳ、ＬＫＴ、ＬＫＶ、ＬＫＹ、ＬＬＧ、ＬＬＫ、ＬＬＲ、ＬＮＡ、ＬＮＧ、ＬＮＫ、ＬＮＲ、ＬＮＶ、ＬＰＧ、ＬＰＫ、ＬＰＲ、ＬＱＡ、ＬＱＧ、ＬＱＫ、ＬＱＲ、ＬＱＶ、ＬＲＡ、ＬＲＦ、ＬＲＧ、ＬＲＩ、ＬＲＫ、ＬＲＬ、ＬＲＮ、ＬＲＱ、ＬＲＲ、ＬＲＳ、ＬＲＴ、ＬＲＶ、ＬＲＹ、ＬＳＧ、ＬＳＫ、ＬＳＲ、ＬＴＧ、ＬＴＫ、ＬＴＲ、ＮＧＫ、ＮＧＲ、ＮＩＧ、ＮＩＫ、ＮＩＲ、ＮＬＧ、ＮＬＫ、ＮＬＲ、ＰＧＫ、ＰＧＲ、ＰＩＧ、ＰＩＫ、ＰＩＲ、ＰＫＧ、ＰＫＫ、ＰＫＲ、ＰＬＧ、ＰＬＫ、ＰＬＲ、ＰＲＧ、ＰＲＫ、ＰＲＲ、ＱＧＫ、ＱＧＲ、ＱＩＧ、ＱＩＫ、ＱＩＲ、ＱＬＧ、ＱＬＫ、ＱＬＲ、ＲＡＦ、ＲＡＧ、ＲＡＩ、ＲＡＫ、ＲＡＬ、ＲＡＲ、ＲＡＹ、ＲＦＦ、ＲＦＧ、ＲＦＫ、ＲＦＲ、ＲＧＡ、ＲＧＤ、ＲＧＥ、ＲＧＦ、ＲＧＩ、ＲＧＫ、ＲＧＬ、ＲＧＮ、ＲＧＱ、ＲＧＲ、ＲＧＳ、ＲＧＴ、ＲＧＶ、ＲＧＹ、ＲＩＧ、ＲＩＫ、ＲＩＮ、ＲＩＱ、ＲＩＲ、ＲＫＡ、ＲＫＤ、ＲＫＥ、ＲＫＦ、ＲＫＧ、ＲＫＫ、ＲＫＮ、ＲＫＱ、ＲＫＳ、ＲＫＴ、ＲＫＶ、ＲＫＹ、ＲＬＦ、ＲＬＦＬ、ＲＬＧ、ＲＬＫ、ＲＬＮ、ＲＬＱ、ＲＬＲ、ＲＮＧ、ＲＮＫ、ＲＮＲ、ＲＰＧ、ＲＰＫ、ＲＰＲ、ＲＱＧ、ＲＱＫ、ＲＱＲ、ＲＲＡ、ＲＲＤ、ＲＲＥ、ＲＲＦ、ＲＲＧ、ＲＲＫ、ＲＲＮ、ＲＲＱ、ＲＲＲ、ＲＲＳ、ＲＲＴ、ＲＲＶ、ＲＲＹ、ＲＳＧ、ＲＳＩ、ＲＳＫ、ＲＳＬ、ＲＳＲ、ＲＴＧ、ＲＴＩ、ＲＴＫ、ＲＴＬ、ＲＴＲ、ＲＶＦ、ＲＶＧ、ＲＶＩ、ＲＶＫ、ＲＶＬ、ＲＶＲ、ＲＶＹ、ＲＹＧ、ＲＹＫ、ＲＹＲ、ＶＡＧ、ＶＡＫ、ＶＡＲ、ＶＦＧ、ＶＦＫ、ＶＦＲ、ＶＧＦ、ＶＧＩ、ＶＧＫ、ＶＧＬ、ＶＧＮ、ＶＧＱ、ＶＧＲ、ＶＧＳ、ＶＧＴ、ＶＧＹ、ＶＩＧ、ＶＩＫ、ＶＩＮ、ＶＩＱ、ＶＩＲ、ＶＫＦ、ＶＫＧ、ＶＫＩ、ＶＫＫ、ＶＫＬ、ＶＫＮ、ＶＫＱ、ＶＫＲ、ＶＫＳ、ＶＫＴ、ＶＫＹ、ＶＬＧ、ＶＬＫ、ＶＬＮ、ＶＬＱ、ＶＬＲ、ＶＰＧ、ＶＰＫ、ＶＰＲ、ＶＲ、ＶＲＦ、ＶＲＧ、ＶＲＩ、ＶＲＫ、ＶＲＬ、ＶＲＮ、ＶＲＱ、ＶＲＲ、ＶＲＳ、ＶＲＴ、ＶＲＹ、ＶＳＧ、ＶＳＫ、ＶＳＲ、ＶＴＧ、ＶＴＫ、ＶＴＲ、ＶＶＧ、ＶＶＫ、ＶＶＲ、ＶＹＧ、ＶＹＫ、ＶＹＲを含み得る。

昆虫切断性から発見された配列の別の実施形態では、Ｘ領域は、１つ以上の昆虫及び／または線虫の腸内プロテアーゼ切断可能ペプチド配列：ＡＡＫ、ＡＡＲ、ＡＦＫ、ＡＦＲ、ＡＩＫ、ＡＩＮ、ＡＩＱ、ＡＩＲ、ＡＫＦ、ＡＫＩ、ＡＫＫ、ＡＫＬ、ＡＫＮ、ＡＫＱ、ＡＫＲ、ＡＫＳ、ＡＫＴ、ＡＫＹ、ＡＬＫ、ＡＬＮ、ＡＬＱ、ＡＬＲ、ＡＰＫ、ＡＰＲ、ＡＲＦ、ＡＲＩ、ＡＲＫ、ＡＲＬ、ＡＲＮ、ＡＲＱ、ＡＲＲ、ＡＲＳ、ＡＲＴ、ＡＲＹ、ＡＳＫ、ＡＳＲ、ＡＴＫ、ＡＴＲ、ＡＶＫ、ＡＶＲ、ＡＹＫ、ＡＹＲ、ＤＩＫ、ＤＩＲ、ＤＬＫ、ＤＬＲ、ＥＩＫ、ＥＩＲ、ＥＬＫ、ＥＬＲ、ＩＩＫ、ＩＩＲ、ＩＫＡ、ＩＫＦ、ＩＫＩ、ＩＫＫ、ＩＫＬ、ＩＫＮ、ＩＫＱ、ＩＫＲ、ＩＫＳ、ＩＫＴ、ＩＫＶ、ＩＫＹ、ＩＬＫ、ＩＬＲ、ＩＮＡ、ＩＮＫ、ＩＮＲ、ＩＮＶ、ＩＰＫ、ＩＰＲ、ＩＱＡ、ＩＱＫ、ＩＱＲ、ＩＱＶ、ＩＲＡ、ＩＲＦ、ＩＲＩ、ＩＲＫ、ＩＲＬ、ＩＲＮ、ＩＲＱ、ＩＲＲ、ＩＲＳ、ＩＲＴ、ＩＲＶ、ＩＲＹ、ＩＳＫ、ＩＳＲ、ＩＴＫ、ＩＴＲ、ＫＡＦ、ＫＡＩ、ＫＡＫ、ＫＡＬ、ＫＡＲ、ＫＡＹ、ＫＦＫ、ＫＦＲ、ＫＩＫ、ＫＩＮ、ＫＩＱ、ＫＩＲ、ＫＫＡ、ＫＫＤ、ＫＫＥ、ＫＫＦ、ＫＫＮ、ＫＫＱ、ＫＫＳ、ＫＫＴ、ＫＫＶ、ＫＫＹ、ＫＬＫ、ＫＬＮ、ＫＬＱ、ＫＬＲ、ＫＮＫ、ＫＮＲ、ＫＰＫ、ＫＰＲ、ＫＱＫ、ＫＱＲ、ＫＲＡ、ＫＲＤ、ＫＲＥ、ＫＲＦ、ＫＲＮ、ＫＲＱ、ＫＲＳ、ＫＲＴ、ＫＲＶ、ＫＲＹ、ＫＳＩ、ＫＳＫ、ＫＳＬ、ＫＳＲ、ＫＴＩ、ＫＴＫ、ＫＴＬ、ＫＴＲ、ＫＶＦ、ＫＶＩ、ＫＶＫ、ＫＶＬ、ＫＶＲ、ＫＶＹ、ＫＹＫ、ＫＹＲ、ＬＩＫ、ＬＩＲ、ＬＫＡ、ＬＫＦ、ＬＫＩ、ＬＫＫ、ＬＫＬ、ＬＫＮ、ＬＫＱ、ＬＫＲ、ＬＫＳ、ＬＫＴ、ＬＫＶ、ＬＫＹ、ＬＬＫ、ＬＬＲ、ＬＮＡ、ＬＮＫ、ＬＮＲ、ＬＮＶ、ＬＰＫ、ＬＰＲ、ＬＱＡ、ＬＱＫ、ＬＱＲ、ＬＱＶ、ＬＲＡ、ＬＲＦ、ＬＲＩ、ＬＲＫ、ＬＲＬ、ＬＲＮ、ＬＲＱ、ＬＲＲ、ＬＲＳ、ＬＲＴ、ＬＲＶ、ＬＲＹ、ＬＳＫ、ＬＳＲ、ＬＴＫ、ＬＴＲ、ＮＩＫ、ＮＩＲ、ＮＬＫ、ＮＬＲ、ＰＩＫ、ＰＩＲ、ＰＫＫ、
ＰＫＲ、ＰＬＫ、ＰＬＲ、ＰＲＫ、ＰＲＲ、ＱＩＫ、ＱＩＲ、ＱＬＫ、ＱＬＲ、ＲＡＦ、ＲＡＩ、ＲＡＫ、ＲＡＬ、ＲＡＲ、ＲＡＹ、ＲＦＫ、ＲＦＲ、ＲＩＫ、ＲＩＮ、ＲＩＱ、ＲＩＲ、ＲＫＡ、ＲＫＤ、ＲＫＥ、ＲＫＦ、ＲＫＮ、ＲＫＱ、ＲＫＳ、ＲＫＴ、ＲＫＶ、ＲＫＹ、ＲＬＫ、ＲＬＮ、ＲＬＱ、ＲＬＲ、ＲＮＫ、ＲＮＲ、ＲＰＫ、ＲＰＲ、ＲＱＫ、ＲＱＲ、ＲＲＡ、ＲＲＤ、ＲＲＥ、ＲＲＦ、ＲＲＮ、ＲＲＱ、ＲＲＳ、ＲＲＴ、ＲＲＶ、ＲＲＹ、ＲＳＩ、ＲＳＫ、ＲＳＬ、ＲＳＲ、ＲＴＩ、ＲＴＫ、ＲＴＬ、ＲＴＲ、ＲＶＦ、ＲＶＩ、ＲＶＫ、ＲＶＬ、ＲＶＲ、ＲＶＹ、ＲＹＫ、ＲＹＲ、ＶＡＫ、ＶＡＲ、ＶＦＫ、ＶＦＲ、ＶＩＫ、ＶＩＮ、ＶＩＱ、ＶＩＲ、ＶＫＦ、ＶＫＩ、ＶＫＫ、ＶＫＬ、ＶＫＮ、ＶＫＱ、ＶＫＲ、ＶＫＳ、ＶＫＴ、ＶＫＹ、ＶＬＫ、ＶＬＮ、ＶＬＱ、ＶＬＲ、ＶＰＫ、ＶＰＲ、ＶＲＦ、ＶＲＩ、ＶＲＫ、ＶＲＬ、ＶＲＮ、ＶＲＱ、ＶＲＲ、ＶＲＳ、ＶＲＴ、ＶＲＹ、ＶＳＫ、ＶＳＲ、ＶＴＫ、ＶＴＲ、ＶＶＫ、ＶＶＲ、ＶＹＫ、ＶＹＲを含み得る。

高ランクのＸ切断性条件とＹ切断性条件との両方を満たす共通の配列が多数存在しなかったため、Ｘカテゴリー及びＹカテゴリーにおいて発見された配列を統合して二元ペプチド及び三元ペプチドを構築した。この調査をラウンド２と呼び、上記ラウンド１のデータの組み合わせを用いた。これを試験した１つの方法は、ＦＲＥＴ分子として合成されるようにデザインされ順序付けられた、昆虫において切断可能な配列及びＳＧＦにおいて切断可能な配列（それぞれＸ領域及びＹ領域）のいくつかの組み合わせを含んだ。これを試験した別の方法は、一過性植物発現のためにＥＲＳＰ−ＳＴＡ−（ＴＰ−Ｌ）_ｎタンパク質をコードするＤＮＡとして合成されるようにデザインされ順序付けられた、昆虫において切断可能な配列及びＳＧＦにおいて切断可能な配列の組み合わせを含んだ。二元ペプチド及び三元ペプチドのもつ、昆虫において切断可能な性質と、ＳＧＦにおいて切断可能な性質とを例示するため、ＦＲＥＴ及び一過性に発現されたタンパク質の両方を使用した。

ラウンド１で観察されたトップヒットに基づく二元の組み合わせのサブセットを代表するＦＲＥＴ分子から得られたラウンド２のデータにより、種々の二元の組み合わせの階層的ランク付けを行った。ラウンド２のＦＲＥＴ分子を合成し、再懸濁し、ラウンド１において上述の切断酵素アッセイで試験した。二元の切断可能な連結ペプチドの多くの組み合わせを、ＬＥＰ、ＣＯＬＥＯＰ、及びＳＧＦの各条件に対して試験した。

これらのＥＲＳＰ−ＳＴＡ−（ＴＰ−Ｌ）ｎタンパク質（ここでＬはラウンド２のデータに基づく二元ペプチド及び三元ペプチドである）のバリエーションをコードするＤＮＡからタンパク質を一過性に発現させ、また、同じ切断酵素（ＬＥＰ、ＣＯＬＥＯＰ、及びＳＧＦ）で処置した。

ラウンド２のＦＲＥＴ実験を具体的に示すデータを以下のセクション１．１に列記する。ラウンド２の植物発現系を具体的に示すデータはセクション１．２に列記する。配列番号１５９４〜１７５８に列記したアミノ酸配列は、ＦＲＥＴ及び一過性植物発現の一方または両方として合成した。

ＡＦＶＲＬＦＧＳ（配列番号１６４９）、ＡＫＬＦＶＧＳ（配列番号１６５０）、ＡＬＦＡＬＫＧＳ（配列番号１６５１）、ＡＬＦＬＫＧＳ（配列番号１６５２）、ＡＬＦＬＲＧＳ（配列番号１６５３）、ＡＬＦＲＧＳ（配列番号１６５４）、ＡＬＦＲＬＲＧＳ（配列番号１６５５）、ＡＬＫＡＬＦＧＳ（配列番号１６５６）、ＡＬＫＦＦＧＳ（配列番号１６５７）、ＡＬＫＦＬＶＧＳ（配列番号１６５８）、ＡＬＫＩＦＶＧＳ（配列番号１６５９）、ＡＬＫＬＦＶＧＳ（配列番号１６６０）、ＦＦＡＤＩＫＧＳ（配列番号１６６１）、ＦＦＡＬＫＧＳ（配列番号１６６２）、ＦＦＬＫＧＳ（配列番号１６６３）、ＦＦＬＲＧＳ（配列番号１６６４）、ＦＦＲＬＲＧＳ（配列番号１６６５）、ＦＧＹＲＩＫＧＳ（配列番号１６６６）、ＦＬＲＬＦＧＳ（配列番号１６６７）、ＦＹＡＲＲＧＳ（配列番号１６６８）、ＧＧＬＲＫＫＧＳ（配列番号１６６９）、ＩＦＶＡＬＫＧＳ（配列番号１６７０）、ＩＦＶＬＫＧＳ（配列番号１６７１）、ＩＦＶＬＲＧＳ（配列番号１６７２）、ＩＦＶＲＧＳ（配列番号１６７３）、ＩＦＶＲＬＲＧＳ（配列番号１６７４）、ＩＬＦＮＩＫＧＳ（配列番号１６７５）、ＬＦＡＡＰＦＧＳ（配列番号１６７６）、ＬＦＶＡＬＫＧＳ（配列番号１６７７）、
ＬＦＶＬＫＧＳ（配列番号１６７８）、ＬＦＶＬＲＧＳ（配列番号１６７９）、ＬＦＶＲＧＳ（配列番号１６８０）、ＬＦＶＲＬＲＧＳ（配列番号１６８１）、ＬＦＶＲＶＦＬＧＳ（配列番号１６８２）、ＬＧＥＲＧＳ（配列番号１６８３）、ＬＫＡＬＦＧＳ（配列番号１６８４）、ＬＫＦＦＧＳ（配列番号１６８５）、ＬＫＩＦＶＧＳ（配列番号１６８６）、ＬＫＬＦＶＧＳ（配列番号１６８７）、ＬＲＡＬＦＧＳ（配列番号１６８８）、ＬＲＦＦＧＳ（配列番号１６８９）、ＬＲＩＦＶＧＳ（配列番号１６９０）、ＬＲＬＦＶＧＳ（配列番号１６９１）、ＲＡＬＦＧＳ（配列番号１６９２）、ＲＩＦＶＧＳ（配列番号１６９３）、ＲＬＦＶＧＳ（配列番号１６９４）、ＲＬＲＡＬＦＧＳ（配列番号１６９５）、ＲＬＲＦＦＧＳ（配列番号１６９６）、ＲＬＲＩＦＶＧＳ（配列番号１６９７）、ＲＬＲＬＦＶＧＳ（配列番号１６９８）、ＲＲＫＡＦＶＧＳ（配列番号１６９９）、ＲＲＫＬＩＦＧＳ（配列番号１７００）、ＲＲＲＦＦＡＧＳ（配列番号１７０１）、ＶＦＧＲＫＧＧＳ（配列番号１７０２）、ＹＦＶＲＫＧＳ（配列番号１７０３）。

二元ペプチドまたは三元ペプチドにおけるＸ切断性及びＹ切断性の両方の組み合わせを例示するラウンド２のＦＲＥＴから得られたデータを、表６に提示する。

表６。Ｘ切断条件とＹ切断条件との両方における切断性を示すＸ−Ｙの組み合わせの代表的な配列

実施例３。候補となる二元／三元の切断可能な連結ペプチドの植物タンパク質発現試験

二元または三元の切断可能な連結ペプチドが介在するＴＰの複数のコピーを含有するタンパク質のクローニング及び発現を、ＦＥＣＴと呼ばれるタバコ一過性発現系技術（Ｌｉｕ Ｚ＆Ｋｅａｒｎｅｙ ＣＭ，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，１０：８８。この開示内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれている）を使用して行った。ＦＥＣＴベクターは、アグロインフェクションのためのＴ−ＤＮＡ領域を含有し、これは、ウイルスコートタンパク質及びトリプル遺伝子ブロックをコードする遺伝子なしでＦｏｘｔａｉｌモザイクウイルスＲＮＡの発現を推進するＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターを含有する。コートタンパク質及びトリプルブロックの場所には、高レベルの一過性ウイルス発現のためのＰａｃＩ部位の後のＯＲＦがＮ’からＣ’へサブクローニングされることができるようにする一対のサブクローニング部位（ＰａｃＩ及びＡｖｒＩＩ）がある。この「武装解除した」ウイルスゲノムは、植物から植物への感染を防止する。ＴＰに二元または三元の切断可能な連結ペプチドが介在する種々のタンパク質を発現するようにサブクローニングされたＦＥＣＴベクターに加えて、トマトブッシースタントウイルス由来のＲＮＡサイレンシング抑制タンパク質であるＰ１９をコードする第２のＦＥＣＴベクターを共発現させ、導入されたＴ−ＤＮＡの転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を防止する。この一過性植物発現系を含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを、以下に記述するようにタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉に注入する。

図２〜５を参照しながら、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質、ならびに殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするＤＮＡ構築物の種々のデザインを説明する。一部の例では、二元または三元の切断可能な連結ペプチドが介在するＴＰリピートが示されている。ここで提示される例示的な実施形態に従って使用され得る例示的なＥＲＳＰモチーフは、以下に示す２４個のアミノ酸（Ｎ’からＣ’、一文字コード）：ＭＡＮＫＨＬＳＬＳＬＦＬＶＬＬＧＬＳＡＳＬＡＳＧ（配列番号４）からなる、オオムギアルファアミラーゼシグナルペプチド（ＢＡＡＳ）である。

タンパク質の一部に使用したトウモロコシユビキチンモノマーは、以下に示す７５個のアミノ酸（Ｎ’からＣ’、一文字コード）：ＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＳＳＤＴＩＤＮＶＫＡＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＦＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＡＤＹＮＩＱＫＥＳＴＬＨＬＶＬＲＬＲＧＧ（受託番号ＸＰ＿０２０４０４０４９．１、配列番号１７５９）からなるものであった。

ここに記述する例において有用である例示的なＴＰとしては、次のアミノ酸配列（Ｎ’からＣ’、一文字コード）：ＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＲＮＥＮＧＨＴＶＹＹＣＲＡ（配列番号６）を有するＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ、または次のアミノ酸配列（Ｎ’からＣ’、一文字コード）：ＧＳＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＲＮＥＮＧＨＴＶＹＹＣＲＡ（配列番号５）を有するＵ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａを挙げることができる。

別々の例において、３つの異なる介在する二元または三元の切断可能な連結ペプチド（Ｌ１〜Ｌ４の略語形態によって表される）を使用した（Ｎ’からＣ’、一文字コード）：
ＩＧＥＲ（Ｌ１）（配列番号１）
ＡＬＫＬＦＶＧＳ（Ｌ２）（配列番号１６６０）
ＩＦＶＲＬＲＧＳ（Ｌ３）（配列番号１６７４）
ＡＬＫＦＬＶＧＳ（Ｌ４）（配列番号１６５８）。

加えて、次のアミノ酸配列（Ｎ’からＣ’、一文字コード）：ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号１７６０）を有するヒスチジンタグが、構築された殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質の一部として使用されている。図６Ａ及び６Ｂに概略的に示されている次の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質：ＢＡＡＳ：ＵＢＩ：Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ：（Ｌ：Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ）_３：Ｈｉｓ１０及びＢＡＡＳ：（Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ：Ｌ）_３：Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ：Ｈ１０ ＯＲＦ ＤＮＡ（ここでＢＡＡＳはＥＲＳＰであり、Ｌは二元または三元の切断可能な連結ペプチドである）をＦＥＣＴ発現ベクターのＰａｃＩ及びＡｖｒＩＩ制限部位にクローニングして一過性ベクターを作出し、その後、次のような凍結解凍法を使用して、これをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株のＧＶ３１０１細胞に形質転換した：保存されたコンピテントなＧＶ３１０１細胞を氷上で解凍し、次に１〜５μｇの純粋な一過性ベクターＤＮＡと混合した。その後、この細胞とＤＮＡの混合物を５分間氷上に保ってから−８０℃に５分間移し、次に３７℃の水浴で５分間インキュベートした。凍結解凍処置した細胞を次に１ｍＬのＬＢ培地に希釈し、室温で２〜４時間にわたり揺動テーブル上で振盪した。細胞とＬＢの混合物を次に５，０００ｒｃｆで２分間スピンダウンして細胞をペレット化し、次に８００μＬのＬＢ上清を除去する。次に細胞を残りの液体に再懸濁してから、形質転換細胞とＬＢの混合物の全体積およそ２００μＬを、適切な抗生物質（１０μｇ／ｍＬリファンピシン、２５μｇ／ｍＬゲンタマイシン、及び５０μｇ／ｍＬカナマイシン）を含むＬＢ寒天プレート上に広げ、２８℃で２日間インキュベートした。その後、結果として生じた形質転換後のコロニーを採取し、形質転換ＤＮＡ解析のため、また形質転換ＧＶ３１０１細胞のグリセロールストックを作るために、適切な抗生物質を含むＬＢ培地のアリコート６ｍＬ中で培養した。

適切な抗生物質（上述の通り）を含むＬＢプレート上に、グリセロールストックから形質転換ＧＶ３１０１細胞を画線し、２８℃で２日間インキュベートした。形質転換ＧＶ３１０１細胞のコロニーを使用して、５ｍＬのＬＢ−ＭＥＳＡ培地（１０ｍＭ ＭＥＳ、２０μＭアセトシリンゴンを添加したＬＢ培地）及び上述のものと同じ抗生物質に播種し、２８℃で一晩増殖させた。一晩培養した細胞を５０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって収集し、１．０の最終ＯＤ６００で誘導培地（１０ｍＭ ＭＥＳ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μＭアセトシリンゴン）に再懸濁した。次に細胞を誘導培地中で２時間から一晩にわたって室温でインキュベートした。これでタバコ葉の一過性形質転換のための細胞の準備が整った。ＦＥＣＴはＰ１９発現と目的の遺伝子の発現との組み合わせを使用するため、ｐＦＥＣＴ−Ｐ１９で形質転換させたＧＶ３１０１細胞の細胞培養物と、目的の遺伝子の培養物とを等量でひとつに混合し、植物の葉に注入する前にタバコ葉に浸潤させた。ニードルの付いていない３ｍＬシリンジを使用し、処置した細胞をＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物に付着している葉の裏面に注入することにより浸潤させた。タバコ葉におけるタンパク質発現を浸潤後６〜８日に評価した。

シリンジ真空抽出技術を使用し、目的の遺伝子の完全長タンパク質をタバコから精製した。葉組織を丸め、ニードルポートにキャップをした６０ｍＬシリンジのバレル内に、１０ｍＬのバッファー（３５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、Ｒｏｃｈｅ ｃＯｍｐｌｅｔｅ Ｔａｂプロテアーゼインヒビター１錠、ＨＣｌを使用してｐＨ１．２）と共に入れた。次にプランジャーをバレルに挿入し、ニードルポートが上になるように反転させ、キャップを取り外し、プランジャーを押し入れることによって過剰な空気を除去した。空気の大部分が除去されたら、シリンジにキャップをし、プランジャーを可能な限り引き戻して真空を作り出し、３０秒間静止した。次に、真空がなくなるところまでプランジャーを戻すことにより、真空を徐々に解除した。その後、これをもう３回繰り返した。３回目の後、葉に軽い圧力を加えることによりシリンジから液体を排出させ、液体を保存し、このプロセスを再度繰り返した後に葉を処分した。抽出された液体を次に、Ｐａｌｌの０．２μｍナイロンシリンジフィルタを使用して滅菌濾過してから、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｖｉｖａ Ｓｐｉｎ ５００、１０Ｋ ｍｗｃｏにおいて、追加の２０ｍＬのバッファーで試料をすすぎ、試料をスピンダウンして、試料が約３０倍に濃縮されるまで濃縮させた。

その後、標準的なウエスタンブロッティング技術を使用して試料を解析した。１０μＬのタンパク質試料を９μＬのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ２×ＳＤＳローディングバッファー及び２μＬのＮｏｖｅｘ １０Ｘ還元剤と混合し、試料を８５℃で５分間加熱することにより、タンパク質ゲルのための試料を調製した。次に、上タンク内の０．１％チオグリコール酸ナトリウムを含む１×Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎトリシン泳動バッファーに浸したＮｏｖｅｘ Ｐｒｅｃａｓｔの１６％トリシンゲルに試料をロードし、泳動した。このゲルは、１５０Ｖで７５分間泳動した。次に、ｉＢＬＯＴシステムで７分間の転写プログラムを使用して、ゲルをＮｏｖｅｌ ＰＶＤＦ膜に転写した。転写が完了したら、次にブロット膜を容器に移し、５分間室温で穏やかに揺動させることにより、バッファーＡ（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌの１０×ＴＢＳ（０．２５Ｍトリスベース、１．３７Ｍ ＮａＣｌ、０．０３Ｍ ＫＣＬ、ｐＨ７．４）から作った１×ＴＢＳ）で洗浄した。これに続いて、バッファーＢ（１％のＢＳＡを含むバッファーＡ）を使用した１時間のブロッキングステップを行った。次に、ブロットをバッファーＣ（０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含むバッファーＢ）で５分間洗浄することで３回すすいだ。その後１時間にわたり、Ｍａｉｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈの抗Ｈｉｓ抗体をバッファーＣで１：１００００に希釈した。次にこのブロットを、バッファーＣで各回５分間にわたって３回すすいだ。その後１時間にわたり、ＢｉｏＲａｄのヤギ抗マウスＡＰ共役抗体（二次抗体）をバッファーＣで１：３０００に希釈した。次にこのブロットを、バッファーＣで各回５分間にわたって２回、そしてバッファーＡで５分間にわたって１回すすいだ。次にブロットをＢｉｏＲａｄ ＡＰ展開剤で展開し、水ですすぐことにより停止させる。その後、濃縮した試料のバンドを検証し、バンドの強度／濃度を同様にするために希釈した。次に、ｉＥＬＩＳＡにより、試料の濃度が１０〜２０ｎｇ／ｕｌであることも確認した。

ＦＥＣＴ発現系で一過性に形質転換させたタバコ葉のＩＣＫモチーフＴＰを定量的に評価するため、間接的ＥＬＩＳＡ（ｉＥＬＩＳＡ）アッセイを次のように行った。Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ＨＤ ９６ウェルプレートのウェルにおいて、葉から抽出したタンパク質１μＬを９９μＬのＣＢ２溶液（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に希釈し、必要に応じて段階希釈を行った。次に、抽出試料から得た葉タンパク質により、暗所で３時間、室温にてウェル壁をコーティングし、次にＣＢ２溶液を除去し、各ウェルを２００μＬのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で２回洗浄した。次に、１５０μＬのブロッキング溶液（Ｂｌｏｃｋ ＢＳＡと５％脱脂粉乳を含むＰＢＳ）を各ウェルに加え、暗所で１時間、室温にてインキュベートした。ブロッキング溶液を除去し、ＰＢＳでウェルを洗浄した後、１００μＬのウサギ抗Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ抗体（一次抗体）（ブロッキング溶液中１：２５０の希釈度）を各ウェルに加え、暗所で１時間、室温にてインキュベートした。次に一次抗体を除去し、各ウェルをＰＢＳで４回洗浄した。次に、１００μＬのＨＲＰ共役ヤギ抗ウサギ抗体（二次抗体、ブロッキング溶液中１：１０００の希釈度で使用）を各ウェルに加え、暗所で１時間、室温にてインキュベートした。二次抗体を除去し、ＰＢＳでウェルを洗浄した後、１００μＬの基質溶液（ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質溶液Ａと溶液Ｂとの１：１混合物、ＫＰＬ）を各ウェルに加え、十分な発色現像が現れるまで発色反応を続けさせた。次に、１００μＬのペルオキシダーゼ停止液を各ウェルに加え、反応を停止させた。ＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ−Ｍ２プレートリーダーを使用し、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏを制御ソフトウェアとして使用して、プレート内の各反応混合物の吸光度を４０５ｎｍで読み取った。純粋なＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａを段階希釈した既知の濃度の試料をｉＥＬＩＳＡアッセイにおいて上述と同様の様式で処置し、数量解析のための質量−吸光度標準曲線を生成した。

リンカーのペプシンによる切断性を判定するために、擬似胃液（ＳＧＦ、ブタ胃粘膜由来ペプシン１ｍｇ／ｍｌを含む３５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ１．２）でペプチドを消化する。精製したタンパク質試料をＳＧＦ：タンパク質１：３（ｖ：ｖ）で混合し、３７℃で振盪しながらインキュベートした。試料を０分、２分、及び１０分の時点で採取し、タンパク質ゲルのために直ちに調製する（上記参照）。次に、上述の技術を使用したウエスタンブロットでこれらの試料を泳動した。図６を参照のこと。

二元／三元ペプチドの昆虫による切断性を判定するために、サザンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ）から単離された腸抽出物でタンパク質を消化した。腸内容物の単離は実施例Ａ．１において説明されている。ペプチド消化の前に、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｖｉｖａ Ｓｐｉｎ ２０を使用し、１００ｍＭリン酸バッファー、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．８３へのタンパク質のバッファー交換を行い、最終体積を出発体積と同じに戻した。ＳＣＲ腸抽出物をＳＣＲ腸抽出物ストック：タンパク質（ｖ：ｖ）１：３の希釈度で使用し、５００ｒｐｍ、２５℃で振盪しながら消化を行った。試料を０分、３０分、及び２１０分の時点で採取した。次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び上述のウエスタンブロットのために試料を調製した。

二元／三元ペプチドは、ＣＥＷ腸抽出物（実施例Ａ．１に記述）に対する切断性についても試験した。上記のＳＣＲアッセイのために行ったのと同様に、２００ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．１ １５０ｍＭ ＮａＣｌへのペプチドのバッファー交換を行った。上文に列記したアッセイ条件をＳＣＲ腸抽出物の消化について繰り返した。

これらのプロトコールにより、候補となる三元の切断可能な連結ペプチドが介在する植物で発現したＴＰのコピーの作出及び検証を行った。切断性を増強するための更なるスペーサーが所望された。これについてはセクション１．３にて詳述する。

実施例４。ＦＲＥＴ調査及び複数の候補となる三元の切断可能な連結ペプチドを作製するスペーサー

実行した上記の実験から、２つの例示的な効果的な二元ペプチドであるＡＬＫＬＦＶ及びＩＦＶＲＬＲは、ヒト（ＳＧＦ）ならびに昆虫（ＬＥＰ）及び（ＣＯＬＥＯＰ）の擬似腸内環境において、ペプチドのＳＧＦにおける迅速な切断、ならびにＬＥＰ及びＣＯＬＥＯＰにおける迅速な切断をもたらした。

二元の切断可能な連結ペプチドが切断するためには、タンパク質分解酵素が配列を認識し、認識された配列に付着することができる必要がある。空間が狭い、または小さすぎる場合、消化効率が減速または低下し得る。条件に最も好ましいアミノ酸を使用して二元ペプチドを三元ペプチドにすることにより、ペプチドが切断する速度が増加するはずである。「スペーサー」の使用により、そのようなペプチダーゼ切断の増加及び殺虫活性の増加が可能になる。

スペーサー

潜在的なスペーサーについてスクリーニングするため、ＦＲＥＴペプチドを二元ペプチドＡＬＫＬＦＶＺ１Ｚ２と順序付け、Ｚ１位及びＺ２位のアミノ酸を変化させた。アミノ酸の一部は個々にスクリーニングし、一部はプールとしてスクリーニングした。各ペプチド２μＭの濃度で５０％アセトニトリル水溶液を使用し、ペプチドを再懸濁した。１つより多くのＦＲＥＴペプチドを含有するものについては、各ペプチドが２μＭとなるように再懸濁した（各々の分量が等しいことを前提とする）。次にこれらを再懸濁し、ラウンド１について上述したようにスクリーニングした。データは、Ｚ位において一部のアミノ酸が他のものよりも好ましいことを裏付けている。表７は、ＦＲＥＴペプチドの切断速度データに基づくＺ_１及びＺ_２の代表的なアミノ酸を示す。表７の傾きの値が大きいほど、スペーサーの一部である場合のアミノ酸の活性が大きい。表７で「傾き」と表示されている欄は、リンカーの切断速度を示す。

表７。Ｘ及びＹの両条件において二元ペプチドＡＬＫＬＦＶの切断速度を増加させる代表的なスペーサー配列

一過性タバコ発現系の遺伝子構築の一例は、図６Ａ及び６Ｂで確認することができる。図６Ａに示した例では、リンカー配列ＡＬＫＬＦＶＧＳ及びＩＦＶＲＬＲＧＳは、図６Ａの一部で（Ｌ）として表されている。ゲル（図７）においてこれらは、インタクトな４ｘ（ユビキチンあり及びなし）に関する上部２つのバンドとして示されている。リンカー配列ＩＧＥＲの例は、図６Ｂの一部に表されている。ゲルにおいてこれは、インタクトな４ｘに関する上部１つのバンドとして示されている。

実施例５。二元及び三元の切断可能な連結ペプチドを含有する殺虫性トランスジェニックタンパク質のクローニング及び発現

本実施例は、二元及び三元の切断可能な連結ペプチドとＴＰとを含有する殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を安定に発現するトランスジェニックトウモロコシ植物を回収する方法の一例を詳述する。本実施例の実行に当たっては、（１）ベクターデザイン、（２）植物形質転換及び再生、ならびに（３）インタクトなタンパク質の発現の検証という３つの構成要素がある。

第１の構成要素は、骨格（図８：白矢印）及びｔ−ＤＮＡ領域（図８：黒矢印）の２つの領域を有するベクターの作出を含む、トウモロコシ形質転換に必要とされる（標準的な二元）ベクターデザインである。骨格は、複製起点（Ｏｒｉまたはｏｒｉ）及び選択可能なマーカーという２つの構成要素を有する。本実施例に記述する骨格は、サブクローニング目的でＥ．ｃｏｌｉにおいて複製され得るように（例えば、高コピー数のＯｒｉであるＣｏｌＥ１）、また、プラスミドの増殖のためにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍにおいても複製され得るように（例えば、低コピー数ｏｒｉであるＯｒｉＶ及びそのｔｒｆＡ開始タンパク質）、２つのＯｒｉを有する。本実施例に記述する骨格は、カナマイシンに対する抵抗性のため、細菌のネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子を有する。この遺伝子により、プラスミドで形質転換したＥ．ｃｏｌｉまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの選択が可能になる。ｔ−ＤＮＡ領域は、境界と、組織培養培地におけるトランスジェニック植物細胞の選択のための発現カセットと、トランスジェニックプロモーターの安定な発現のための発現カセットとの３つの構成要素を含む。Ｔ−ＤＮＡの境界は、Ｔ−ＤＮＡに順方向でフランキングし、病原性遺伝子が複製して遺伝子形質転換のためにパッケージングする領域の境を定めるリピート配列（２５ｂｐ）である。本実施例における骨格及びＴ−ＤＮＡ配列は、開示内容の全体が参照により本明細書に組み込まれているＣｏｕｔｕ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ（２００７）１６：７７１−７８１によって公開されている。本実施例において、選択可能なマーカー及び目的の遺伝子（二元及び三元の切断可能な連結ペプチドとＴＰとを含有する殺虫性または殺線虫性の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質）の両方の発現カセットは、デザインにおいて同様であり、それらそれぞれのタンパク質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする領域のみが異なる。

この発現カセットの好例は、開示内容の全体が参照により本明細書に組み込まれているＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｑｕａｉｌ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．１９９６ Ｍａｙ；５（３）：２１３−８によって定義されているトウモロコシＵｂｉ−１プロモーター及び発現カセットである。植物由来の構成的に発現する遺伝子カセットのプロモーター領域をサブクローニングし、遺伝子を除去してマルチクローニング部位（ＭＣＳ）で置き換えると、他の目的の遺伝子を投入することができる。Ｕｂｉ−１の例の場合、９０６ｂｐプロモーター領域（ＵＢＩ−１ ｐｒｏｍ）は、８１ｂｐの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）と、ＭＣＳが後に続くＵｂｉ−１の１０２５ｂｐのイントロン（ＵＢＩ−１イントロン）との転写を促進する。カセットはターミネーター配列の挿入により終結し、本実施例のターミネーター配列は、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）３’非翻訳配列及びポリアデニル化シグナルの約２５０ｂｐである。選択可能なマーカーカセットでは、そのカセットを発現する細胞が組織培養培地に含まれる除草性化学物質に対する抵抗性をもつように、除草性化学物質に対する抵抗性を植物に与える遺伝子の挿入を使用することができる。本実施例において、選択可能なマーカー遺伝子は、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性をコードする遺伝子であり得る（開示内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５６４８４７７号を参照のこと）。二元及び三元の切断可能な連結ペプチドとＴＰとを含有する殺虫性トランスジェニックタンパク質の発現は、本明細書において、特に、かかる遺伝子がタバコにおいて一過性に発現される実施例Ａにおいて例示されている。標識された例示的なトウモロコシ形質転換ベクター例全体の線状組成は、図８において確認することができる。

本実施例の第２の構成要素は、標準的な二元ベクターによるトウモロコシ植物形質転換、及びサブ配列のトランスジェニック植物再生であり、これは当技術分野で周知であり、Ｆｒａｍｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｙ ２００２，Ｖｏｌ．１２９，ｐｐ．１３−２２及びＶｅｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ（２００８）２７：２９７−３０５によって定義及び記録されており、これらの開示内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。これらのプロトコールにより、上述のｔ−ＤＮＡを含むトランスジェニック植物が回収される。

このセクションの第３の構成要素は、インタクトなタンパク質の発現の検証である。トランスジェニック植物組織を調製して全可溶性タンパク質を単離することができ、これは、組換え的に生成されたＴＰ（本明細書において提示される実施例Ａに定義される通り）に特異的に結合する一次抗体を使用し、ｉＥＬＩＳＡで数量化することができる。タンパク質のインタクトな性質は、同様の全可溶性タンパク質単離の後にタンパク質ゲル及びウエスタンブロッティング手順（同じく本明細書の実施例Ａに定義及び例示されている通り）を使用して検証することができる。

実施例６。二元及び三元の切断可能な連結ペプチドを含有するＢｔ Ｃｒｙ殺虫性タンパク質のサブクローニング及び発現

一部の代表例において、修飾されたＴＰの発現及び合成のためのプロトコールを本明細書に提示する。以下に更に詳述する一例では、昆虫及び線虫ならびにヒトの腸内環境の内容物に曝露されると、Ｂｔタンパク質が、構成要素である昆虫プロテアーゼまたは線虫プロテアーゼによってより効率的に切断されるような、修飾されたＢｔタンパク質が記述される。二元または三元の切断可能ペプチドの存在によって、Ｂｔタンパク質の安定化領域または不活性領域がより完全に解離し、殺虫性及び殺線虫性ＴＰの産生が増強される。

本実施例は、二元及び三元の切断可能な連結ペプチド（Ｌ）を含有するように例示的なＢｔ ｃｒｙ ＴＰをサブクローニングする方法を詳述する。本実施例には、非殺虫性ドメイン（Ｂｔ_{ｉｎａｃｔｉｖｅ}）と殺虫性ドメイン（Ｂｔ_{ａｃｔｉｖｅ}）遺伝子との間に二元または三元の切断可能な連結ペプチド（Ｌ）を含有するようなＢｔ ｃｒｙ ＴＰ遺伝子配列の変換と、その遺伝子を発現する植物の作出という２つのステップがある。

二元または三元の切断可能ペプチド（Ｌ）をｃｒｙ遺伝子に挿入する最も単純な方法は、挿入された配列と共に遺伝子全体をコードするＤＮＡの合成を順序付けることである。

Ｂｔ ｃｒｙ ＴＰ遺伝子は任意の数の遺伝子であってよい。Ｂｔ ＴＰ遺伝子の好例はＣｒｙ３ａ遺伝子である。Ｃｒｙ３ａ遺伝子の変異形は、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて、受託番号ＡＸ７１２１７４：参照により全体が本明細書に組み込まれている特許ＷＯ０３０１８８１０の配列８（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｎ＆ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ｂｌａｓｔｈｏｍｅにてアクセス可能）として確認することができる。この配列は、開示内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている公開文献のＷａｌｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｊａｎｕａｒｙ ２００８ ｖｏｌ．７４ ｎｏ．２ ３６７−３７４から引用されている。この公開文献において著者らは、アルファヘリックス３とアルファヘリックス４との間のドメインＩループ内の「ＶＳＳ」の野生型３アミノ酸配列を「ＡＡＰＦ」の４アミノ酸配列に置き換え、非活性の１２ｋＤａドメインＩの、殺虫性または活性の５５ｋＤａの残部からの切断を増加させている。著者らは、このＡＡＰＦがＤｉａｂｒｏｔｉｃａの腸内のキモトリプシン／カテプシンＧ酵素によって認識され、完全長の６７ｋＤａタンパク質がより迅速に変換されて切断され、殺虫性の成熟型タンパク質である５５ｋＤａ形態になり、６７ｋＤａ形態と比較してウエスタンコーンルートワームの刷子縁膜に対する特異的結合を呈すると仮定している。このＡＡＰＦアミノ酸配列を、ＦＲＥＴ、及び我々のＡＡＰＦアミノ酸によって分離したＴＰ「Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」の酵母産生二量体により解析したところ、ＦＲＥＴもタンパク質もヒト消化管プロテアーゼによる切断性を示さなかった（データは示さない）。よって、上記に引用したＷａｌｔｅｒｓらの参考文献において使用されたペプチドアミノ酸配列ＡＡＰＦは、本明細書に記述される二元または三元の切断可能な連結ペプチドではない。

Ｃｒｙ３ａ遺伝子を二元または三元の切断可能な連結ペプチドが介在するものに変換する例として、ＡＡＰＦアミノ酸をコードする塩基対が除去され、それらの場所に（インフレームで）二元の切断可能な連結ペプチドＡＬＫＬＦＶまたは三元の切断可能な連結ペプチドＡＬＫＬＦＶＧＳのアミノ酸をコードするコドンがあるように、Ｗａｌｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．に記述されたＤＮＡ配列のクローニングを行った。これにより、切断可能な二元ペプチドまたは三元ペプチドがＢｔ ＴＰの不活性部分（Ｂｔ_{ｉｎａｃｔｉｖｅ}）とＢｔ ＴＰの活性部分（Ｂｔ_{ａｃｔｉｖｅ}）との間にインフレームで配置されている図３Ｂに図解されているように、プロペプチド（Ｂｔ_{ｉｎａｃｔｉｖｅ}）とＢｔ活性毒素（Ｂｔ_{ａｃｔｉｖｅ}）との間に切断可能な二元ペプチドまたは三元ペプチドが挿入されることになる。

二元及び／または三元の切断可能な連結ペプチドを含有するＢｔ Ｃｒｙ ＴＰの発現のためには、殺虫性遺伝子発現カセット内のマルチクローニング部位に上述のＤＮＡをサブクローニングし、これまでに実施例Ｂに記述されているようにトウモロコシにおいて形質転換させる。

実施例７。例示的な二元ペプチド

一部の実施形態では、本発明の二元ペプチドは、Ｘ配列及びＹ配列からＸ−ＹまたはＹ−Ｘの方向でＳＧＦスクリーニングＹセット及び昆虫切断性Ｘセットの配列を組み合わせることによってアセンブルすることができるアミノ酸配列を有する二元ペプチドである。

ＳＧＦスクリーニングから発見された配列、Ｙの一実施形態は、ＡＦＦ、ＡＦＧ、ＡＦＩ、ＡＦＬ、ＡＦＶ、ＡＦＹ、ＡＧＦ、ＡＧＬ、ＡＩＦ、ＡＩＬ、ＡＬＦ、ＡＬＧ、ＡＬＩ、ＡＬＬ、ＡＬＹ、ＡＹＦ、ＡＹＬ、ＤＦＦ、ＤＦＧ、ＤＦＩ、ＤＦＬ、ＤＦＹ、ＤＧＦ、ＤＧＬ、ＤＩＦ、ＤＬＦ、ＤＬＧ、ＤＬＹ、ＤＹＦ、ＤＹＬ、ＥＦＦ、ＥＦＧ、ＥＦＩ、ＥＦＬ、ＥＦＹ、ＥＧＦ、ＥＧＬ、ＥＩＦ、ＥＬＦ、ＥＬＧ、ＥＬＹ、ＥＹＦ、ＥＹＬ、ＦＦ、ＦＦＡ、ＦＦＤ、ＦＦＥ、ＦＦＦ、ＦＦＧ、ＦＦＩ、ＦＦＫ、ＦＦＬ、ＦＦＲ、ＦＦＳ、ＦＦＴ、ＦＦＶ、ＦＦＹ、ＦＧＡ、ＦＧＤ、ＦＧＥ、ＦＧＦ、ＦＧＩ、ＦＧＫ、ＦＧＬ、ＦＧＲ、ＦＧＳ、ＦＧＴ、ＦＧＶ、ＦＧＹ、ＦＬＶ、ＦＬＲ、ＦＹＡ、ＦＹＤ、ＦＹＥ、ＦＹＦ、ＦＹＧ、ＦＹＩ、ＦＹＫ、ＦＹＬ、ＦＹＲ、ＦＹＳ、ＦＹＴ、ＦＹＶ、ＦＹＹ、ＧＦＡ、ＧＦＤ、ＧＦＥ、ＧＦＦ、ＧＦＩ、ＧＦＫ、ＧＦＬ、ＧＦＲ、ＧＦＳ、ＧＦＴ、ＧＦＶ、ＧＦＹ、ＧＧＬ、ＧＩＦ、ＧＩＬ、ＧＬＦ、ＧＬＩ、ＧＬＬ、ＧＬＹ、ＧＹＦ、ＧＹＬ、ＩＦ、ＩＦＡ、ＩＦＦ、ＩＦＧ、ＩＦＩ、ＩＦＬ、ＩＦＶ、ＩＦＹ、ＩＧＦ、ＩＧＬ、ＩＩＦ、ＩＩＬ、ＩＬＦ、ＩＬＧ、ＩＬＩ、ＩＬＬ、ＩＬＹ、ＩＹＦ、ＩＹＬ、ＬＦＡ、ＬＦＦ、ＬＦＧ、ＬＦＩ、ＬＦＬ、ＬＦＶ、ＬＦＹ、ＬＧ、ＬＧＡ、ＬＧＥ、ＬＧＦ、ＬＧＩ、ＬＧＬ、ＬＧＶ、ＬＧＹ、ＬＩＦ、ＬＩＧ、ＬＩＩ、ＬＩＬ、ＬＩＹ、ＬＬＦ、ＬＬＧ、ＬＬＩ、ＬＬＬ、ＬＬＹ、ＬＹＡ、ＬＹＦ、ＬＹＧ、ＬＹＩ、ＬＹＬ、ＬＹＶ、ＬＹＹ、ＮＦＦ、ＮＦＧ、ＮＦＩ、ＮＦＬ、ＮＦＹ、ＮＧＦ、ＮＧＬ、ＮＩＬ、ＮＬＧ、ＮＬＩ、ＮＬＬ、ＮＹＦ、ＮＹＬ、ＱＦＦ、ＱＦＧ、ＱＦＩ、ＱＦＬ、ＱＦＹ、ＱＧＦ、ＱＧＬ、ＱＩＬ、ＱＬＧ、ＱＬＩ、ＱＬＬ、ＱＹＦ、ＱＹＬ、ＳＦＦ、ＳＦＧ、ＳＦＩ、ＳＦＬ、ＳＦＹ、ＳＧＦ、ＳＧＬ、ＳＩＦ、ＳＩＬ、ＳＬＦ、ＳＬＧ、ＳＬＩ、ＳＬＬ、ＳＬＹ、ＳＹＦ、ＳＹＬ、ＴＦＦ、ＴＦＧ、ＴＦＩ、ＴＦＬ、ＴＦＹ、ＴＧＦ、ＴＧＬ、ＴＩＦ、ＴＩＬ、ＴＬＦ、ＴＬＧ、ＴＬＩ、ＴＬＬ、ＴＬＹ、ＴＹＦ、ＴＹＬ、ＶＦＦ、ＶＦＧ、ＶＦＩ、ＶＦＬ、ＶＦＹ、ＶＧＦ、ＶＧＬ、ＶＩＦ、ＶＩＬ、ＶＬＦ、ＶＬＧ、ＶＬＩ、ＶＬＬ、ＶＬＹ、ＶＹＦ、ＶＹＬ、ＹＦＡ、ＹＦＤ、ＹＦＥ、ＹＦＦ、ＹＦＧ、ＹＦＩ、ＹＦＫ、ＹＦＬ、ＹＦＲ、ＹＦＳ、ＹＦＴ、ＹＦＶ、ＹＦＹ、ＹＧＦ、ＹＧＬ、ＹＹＦ、ＹＹＬである。

ＳＧＦスクリーニングから発見された配列、Ｙの別の実施形態は、ＡＦＦ、ＡＦＩ、ＡＦＬ、ＡＦＹ、ＡＩＦ、ＡＩＬ、ＡＬＦ、ＡＬＩ、ＡＬＬ、ＡＬＹ、ＡＹＦ、ＡＹＬ、ＤＦＦ、ＤＦＩ、ＤＦＬ、ＤＦＹ、ＤＩＦ、ＤＬＦ、ＤＬＹ、ＤＹＦ、ＤＹＬ、ＹＦＬ、ＥＦＦ、ＥＦＩ、ＥＦＬ、０、ＥＦＹ、ＥＩＦ、ＥＬＦ、ＥＬＹ、ＥＹＦ、ＥＹＬ、ＦＦＡ、ＦＦＤ、ＦＦＥ、ＦＦＦ、ＦＦＩ、ＦＦＫ、ＦＦＬ、ＦＦＲ、ＦＦＳ、ＦＦＴ、ＦＦＶ、ＦＦＹ、ＦＹＡ、ＦＹＤ、ＦＹＥ、ＦＹＦ、ＦＹＩ、ＦＹＫ、ＦＹＬ、ＦＹＲ、ＦＹＳ、ＦＹＴ、ＦＹＶ、ＦＹＹ、ＩＦＡ、ＩＦＦ、ＩＦＩ、ＩＦＬ、ＩＦＶ、ＩＦＹ、ＩＩＦ、ＩＩＬ、ＩＬＦ、ＩＬＩ、ＩＬＬ、ＩＬＹ、ＩＹＦ、ＩＹＬ、ＬＦＡ、ＬＦＦ、ＬＦＩ、ＬＦＬ、ＬＦＶ、ＬＦＹ、ＬＩＦ、ＬＩＩ、ＬＩＬ、ＬＩＹ、ＬＬＦ、ＬＬＩ、ＬＬＬ、ＬＬＹ、ＬＹＡ、ＬＹＦ、ＬＹＩ、ＬＹＬ、ＬＹＶ、ＬＹＹ、ＮＦＦ、ＮＦＩ、ＮＦＬ、ＮＦＹ、ＮＩＬ、ＮＬＩ、ＮＬＬ、ＮＹＦ、ＮＹＬ、ＱＦＦ、ＱＦＩ、ＱＦＬ、ＱＦＹ、ＱＩＬ、ＱＬＩ、ＱＬＬ、ＱＹＦ、ＱＹＬ、ＳＦＦ、ＳＦＩ、ＳＦＬ、ＳＦＹ、ＳＩＦ、ＳＩＬ、ＳＬＦ、ＳＬＩ、ＳＬＬ、ＳＬＹ、ＳＹＦ、ＳＹＬ、ＴＦＦ、ＴＦＩ、ＴＦＬ、ＴＦＹ、ＴＩＦ、ＴＩＬ、ＴＬＦ、ＴＬＩ、ＴＬＬ、ＴＬＹ、ＴＹＦ、ＴＹＬ、ＶＦＦ、ＶＦＩ、ＶＦＬ、ＶＦＹ、ＶＩＦ、ＶＩＬ、ＶＬＦ、ＶＬＩ、ＶＬＬ、ＶＬＹ、ＶＹＦ、ＶＹＬ、ＹＦＡ、ＹＦＤ、ＹＦＥ、ＹＦＦ、ＹＦＩ、ＹＦＫ、ＹＦＬ、ＹＦＲ、ＹＦＳ、ＹＦＴ、ＹＦＶ、ＹＦＹ、ＹＹＦ、ＹＹＬである。

昆虫切断性から発見された配列、Ｘの一実施形態は、ＡＡＧ、ＡＡＫ、ＡＡＲ、ＡＦＧ、ＡＦＫ、ＡＦＲ、ＡＧＦ、ＡＧＩ、ＡＧＫ、ＡＧＬ、ＡＧＮ、ＡＧＱ、ＡＧＲ、ＡＧＳ、ＡＧＴ、ＡＧＹ、ＡＩＧ、ＡＩＫ、ＡＩＮ、ＡＩＱ、ＡＩＲ、ＡＫＦ、ＡＫＧ、ＡＫＩ、ＡＫＫ、ＡＫＬ、ＡＫＮ、ＡＫＱ、ＡＫＲ、ＡＫＳ、ＡＫＴ、ＡＫＹ、ＡＬＧ、ＡＬＫ、ＡＬＮ、ＡＬＱ、ＡＬＲ、ＡＰＦ、ＡＰＧ、ＡＰＫ、ＡＰＲ、ＡＲＦ、ＡＲＧ、ＡＲＩ、ＡＲＫ、ＡＲＬ、ＡＲＮ、ＡＲＱ、ＡＲＲ、ＡＲＳ、ＡＲＴ、ＡＲＹ、ＡＳＧ、ＡＳＫ、ＡＳＲ、ＡＴＧ、ＡＴＫ、ＡＴＲ、ＡＶＧ、ＡＶＫ、ＡＶＲ、ＡＹＧ、ＡＹＫ、ＡＹＲ、ＤＧＫ、ＤＧＲ、ＤＩＧ、ＤＩＫ、ＤＩＲ、ＤＬＧ、ＤＬＫ、ＤＬＲ、ＥＧＫ、ＥＧＲ、ＥＩＧ、ＥＩＫ、ＥＩＲ、ＥＬＧ、ＥＬＫ、ＥＬＲ、ＥＲ、ＦＶＲ、ＧＡＦ、ＧＡＩ、ＧＡＫ、ＧＡＬ、ＧＡＲ、ＧＡＹ、ＧＦＫ、ＧＦＲ、ＧＩＫ、ＧＩＮ、ＧＩＱ、ＧＩＲ、ＧＫＡ、ＧＫＤ、ＧＫＥ、ＧＫＦ、ＧＫＩ、ＧＫＫ、ＧＫＬ、ＧＫＮ、ＧＫＱ、ＧＫＲ、ＧＫＳ、ＧＫＴ、ＧＫＶ、ＧＫＹ、ＧＬＫ、ＧＬＮ、ＧＬＱ、ＧＬＲ、ＧＮＡ、ＧＮＫ、ＧＮＲ、ＧＮＶ、ＧＰＫ、ＧＰＲ、ＧＱＡ、ＧＱＫ、ＧＱＲ、ＧＱＶ、ＧＲＡ、ＧＲＤ、ＧＲＥ、ＧＲＦ、ＧＲＩ、ＧＲＫ、ＧＲＬ、ＧＲＮ、ＧＲＱ、ＧＲＲ、ＧＲＳ、ＧＲＴ、ＧＲＶ、ＧＲＹ、ＧＳＩ、ＧＳＫ、ＧＳＬ、ＧＳＲ、ＧＴＩ、ＧＴＫ、ＧＴＬ、ＧＴＲ、ＧＶＦ、ＧＶＩ、ＧＶＫ、ＧＶＬ、ＧＶＲ、ＧＶＹ、ＧＹＫ、ＧＹＲ、ＩＧＡ、ＩＧＦ、ＩＧＩ、ＩＧＫ、ＩＧＬ、ＩＧＮ、ＩＧＱ、ＩＧＲ、ＩＧＳ、ＩＧＴ、ＩＧＶ、ＩＧＹ、ＩＩＧ、ＩＩＫ、ＩＩＲ、ＩＫＡ、ＩＫＦ、ＩＫＧ、ＩＫＩ、ＩＫＫ、ＩＫＬ、ＩＫＮ、ＩＫＱ、ＩＫＲ、ＩＫＳ、ＩＫＴ、ＩＫＶ、ＩＫＹ、ＩＬＧ、ＩＬＫ、ＩＬＲ、ＩＮＡ、ＩＮＧ、ＩＮＫ、ＩＮＲ、ＩＮＶ、ＩＰＧ、ＩＰＫ、ＩＰＲ、ＩＱＡ、ＩＱＧ、ＩＱＫ、ＩＱＲ、ＩＱＶ、ＩＲＡ、ＩＲＦ、ＩＲＧ、ＩＲＩ、ＩＲＫ、ＩＲＬ、ＩＲＮ、ＩＲＱ、ＩＲＲ、ＩＲＳ、ＩＲＴ、ＩＲＶ、ＩＲＹ、
ＩＳＧ、ＩＳＫ、ＩＳＲ、ＩＴＧ、ＩＴＫ、ＩＴＲ、ＫＡＦ、ＫＡＧ、ＫＡＩ、ＫＡＫ、ＫＡＬ、ＫＡＲ、ＫＡＹ、ＫＦＦ、ＫＦＧ、ＫＦＫ、ＫＦＲ、ＫＧＡ、ＫＧＤ、ＫＧＥ、ＫＧＦ、ＫＧＩ、ＫＧＫ、ＫＧＬ、ＫＧＮ、ＫＧＱ、ＫＧＲ、ＫＧＳ、ＫＧＴ、ＫＧＶ、ＫＧＹ、ＫＩＧ、ＫＩＫ、ＫＩＮ、ＫＩＱ、ＫＩＲ、ＫＫＡ、ＫＫＤ、ＫＫＥ、ＫＫＦ、ＫＫＧ、ＫＫＮ、ＫＫＱ、ＫＫＳ、ＫＫＴ、ＫＫＶ、ＫＫＹ、ＫＬＧ、ＫＬＫ、ＫＬＮ、ＫＬＱ、ＫＬＲ、ＫＮＧ、ＫＮＫ、ＫＮＲ、ＫＰＧ、ＫＰＫ、ＫＰＲ、ＫＱＧ、ＫＱＫ、ＫＱＲ、ＫＲＡ、ＫＲＤ、ＫＲＥ、ＫＲＦ、ＫＲＧ、ＫＲＮ、ＫＲＱ、ＫＲＳ、ＫＲＴ、ＫＲＶ、ＫＲＹ、ＫＳＧ、ＫＳＩ、ＫＳＫ、ＫＳＬ、ＫＳＲ、ＫＴＧ、ＫＴＩ、ＫＴＫ、ＫＴＬ、ＫＴＲ、ＫＶＦ、ＫＶＧ、ＫＶＩ、ＫＶＫ、ＫＶＬ、ＫＶＲ、ＫＶＹ、ＫＹＧ、ＫＹＫ、ＫＹＲ、ＬＦＲ、ＬＧＡ、ＬＧＦ、ＬＧＩ、ＬＧＫ、ＬＧＬ、ＬＧＮ、ＬＧＱ、ＬＧＲ、ＬＧＳ、ＬＧＴ、ＬＧＶ、ＬＧＹ、ＬＩＧ、ＬＩＫ、ＬＩＲ、ＬＫ、ＬＫＡ、ＬＫＦ、ＬＫＧ、ＬＫＩ、ＬＫＫ、ＬＫＬ、ＬＫＮ、ＬＫＱ、ＬＫＲ、ＬＫＳ、ＬＫＴ、ＬＫＶ、ＬＫＹ、ＬＬＧ、ＬＬＫ、ＬＬＲ、ＬＮＡ、ＬＮＧ、ＬＮＫ、ＬＮＲ、ＬＮＶ、ＬＰＧ、ＬＰＫ、ＬＰＲ、ＬＱＡ、ＬＱＧ、ＬＱＫ、ＬＱＲ、ＬＱＶ、ＬＲＡ、ＬＲＦ、ＬＲＧ、ＬＲＩ、ＬＲＫ、ＬＲＬ、ＬＲＮ、ＬＲＱ、ＬＲＲ、ＬＲＳ、ＬＲＴ、ＬＲＶ、ＬＲＹ、ＬＳＧ、ＬＳＫ、ＬＳＲ、ＬＴＧ、ＬＴＫ、ＬＴＲ、ＮＧＫ、ＮＧＲ、ＮＩＧ、ＮＩＫ、ＮＩＲ、ＮＬＧ、ＮＬＫ、ＮＬＲ、ＰＧＫ、ＰＧＲ、ＰＩＧ、ＰＩＫ、ＰＩＲ、ＰＫＧ、ＰＫＫ、ＰＫＲ、ＰＬＧ、ＰＬＫ、ＰＬＲ、ＰＲＧ、ＰＲＫ、ＰＲＲ、ＱＧＫ、ＱＧＲ、ＱＩＧ、ＱＩＫ、ＱＩＲ、ＱＬＧ、ＱＬＫ、ＱＬＲ、ＲＡＦ、ＲＡＧ、ＲＡＩ、ＲＡＫ、ＲＡＬ、ＲＡＲ、ＲＡＹ、ＲＦＦ、ＲＦＧ、ＲＦＫ、ＲＦＲ、ＲＧＡ、ＲＧＤ、ＲＧＥ、ＲＧＦ、ＲＧＩ、ＲＧＫ、ＲＧＬ、ＲＧＮ、ＲＧＱ、ＲＧＲ、ＲＧＳ、ＲＧＴ、ＲＧＶ、ＲＧＹ、ＲＩＧ、ＲＩＫ、ＲＩＮ、ＲＩＱ、ＲＩＲ、ＲＫＡ、ＲＫＤ、ＲＫＥ、ＲＫＦ、ＲＫＧ、ＲＫＫ、ＲＫＮ、ＲＫＱ、ＲＫＳ、ＲＫＴ、ＲＫＶ、ＲＫＹ、ＲＬＦ、ＲＬＦＬ、ＲＬＧ、ＲＬＫ、ＲＬＮ、ＲＬＱ、ＲＬＲ、ＲＮＧ、ＲＮＫ、ＲＮＲ、ＲＰＧ、ＲＰＫ、ＲＰＲ、ＲＱＧ、ＲＱＫ、ＲＱＲ、ＲＲＡ、ＲＲＤ、ＲＲＥ、ＲＲＦ、ＲＲＧ、ＲＲＫ、ＲＲＮ、ＲＲＱ、ＲＲＲ、ＲＲＳ、ＲＲＴ、ＲＲＶ、ＲＲＹ、ＲＳＧ、ＲＳＩ、ＲＳＫ、ＲＳＬ、ＲＳＲ、ＲＴＧ、ＲＴＩ、ＲＴＫ、ＲＴＬ、ＲＴＲ、ＲＶＦ、ＲＶＧ、ＲＶＩ、ＲＶＫ、ＲＶＬ、ＲＶＲ、ＲＶＹ、ＲＹＧ、ＲＹＫ、ＲＹＲ、ＶＡＧ、ＶＡＫ、ＶＡＲ、ＶＦＧ、ＶＦＫ、ＶＦＲ、ＶＧＦ、ＶＧＩ、ＶＧＫ、ＶＧＬ、ＶＧＮ、ＶＧＱ、ＶＧＲ、ＶＧＳ、ＶＧＴ、ＶＧＹ、ＶＩＧ、ＶＩＫ、ＶＩＮ、ＶＩＱ、ＶＩＲ、ＶＫＦ、ＶＫＧ、ＶＫＩ、ＶＫＫ、ＶＫＬ、ＶＫＮ、ＶＫＱ、ＶＫＲ、ＶＫＳ、ＶＫＴ、ＶＫＹ、ＶＬＧ、ＶＬＫ、ＶＬＮ、ＶＬＱ、ＶＬＲ、ＶＰＧ、ＶＰＫ、ＶＰＲ、ＶＲ、ＶＲＦ、ＶＲＧ、ＶＲＩ、ＶＲＫ、ＶＲＬ、ＶＲＮ、ＶＲＱ、ＶＲＲ、ＶＲＳ、ＶＲＴ、ＶＲＹ、ＶＳＧ、ＶＳＫ、ＶＳＲ、ＶＴＧ、ＶＴＫ、ＶＴＲ、ＶＶＧ、ＶＶＫ、ＶＶＲ、ＶＹＧ、ＶＹＫ、ＶＹＲである。

昆虫切断性から発見された配列、Ｘの別の実施形態は、ＡＡＫ、ＡＡＲ、ＡＦＫ、ＡＦＲ、ＡＩＫ、ＡＩＮ、ＡＩＱ、ＡＩＲ、ＡＫＦ、ＡＫＩ、ＡＫＫ、ＡＫＬ、ＡＫＮ、ＡＫＱ、ＡＫＲ、ＡＫＳ、ＡＫＴ、ＡＫＹ、ＡＬＫ、ＡＬＮ、ＡＬＱ、ＡＬＲ、ＡＰＫ、ＡＰＲ、ＡＲＦ、ＡＲＩ、ＡＲＫ、ＡＲＬ、ＡＲＮ、ＡＲＱ、ＡＲＲ、ＡＲＳ、ＡＲＴ、ＡＲＹ、ＡＳＫ、ＡＳＲ、ＡＴＫ、ＡＴＲ、ＡＶＫ、ＡＶＲ、ＡＹＫ、ＡＹＲ、ＤＩＫ、ＤＩＲ、ＤＬＫ、ＤＬＲ、ＥＩＫ、ＥＩＲ、ＥＬＫ、ＥＬＲ、ＩＩＫ、ＩＩＲ、ＩＫＡ、ＩＫＦ、ＩＫＩ、ＩＫＫ、ＩＫＬ、ＩＫＮ、ＩＫＱ、ＩＫＲ、ＩＫＳ、ＩＫＴ、ＩＫＶ、ＩＫＹ、ＩＬＫ、ＩＬＲ、ＩＮＡ、ＩＮＫ、ＩＮＲ、ＩＮＶ、ＩＰＫ、ＩＰＲ、ＩＱＡ、ＩＱＫ、ＩＱＲ、ＩＱＶ、ＩＲＡ、ＩＲＦ、ＩＲＩ、ＩＲＫ、ＩＲＬ、ＩＲＮ、ＩＲＱ、ＩＲＲ、ＩＲＳ、ＩＲＴ、ＩＲＶ、ＩＲＹ、ＩＳＫ、ＩＳＲ、ＩＴＫ、ＩＴＲ、ＫＡＦ、ＫＡＩ、ＫＡＫ、ＫＡＬ、ＫＡＲ、ＫＡＹ、ＫＦＫ、ＫＦＲ、ＫＩＫ、ＫＩＮ、ＫＩＱ、ＫＩＲ、ＫＫＡ、ＫＫＤ、ＫＫＥ、ＫＫＦ、ＫＫＮ、ＫＫＱ、ＫＫＳ、ＫＫＴ、ＫＫＶ、ＫＫＹ、ＫＬＫ、ＫＬＮ、ＫＬＱ、ＫＬＲ、ＫＮＫ、ＫＮＲ、ＫＰＫ、ＫＰＲ、ＫＱＫ、ＫＱＲ、ＫＲＡ、ＫＲＤ、ＫＲＥ、ＫＲＦ、ＫＲＮ、ＫＲＱ、ＫＲＳ、ＫＲＴ、ＫＲＶ、ＫＲＹ、ＫＳＩ、ＫＳＫ、ＫＳＬ、ＫＳＲ、ＫＴＩ、ＫＴＫ、ＫＴＬ、ＫＴＲ、ＫＶＦ、ＫＶＩ、ＫＶＫ、ＫＶＬ、ＫＶＲ、ＫＶＹ、ＫＹＫ、ＫＹＲ、ＬＩＫ、ＬＩＲ、ＬＫＡ、ＬＫＦ、ＬＫＩ、ＬＫＫ、ＬＫＬ、ＬＫＮ、ＬＫＱ、ＬＫＲ、ＬＫＳ、ＬＫＴ、ＬＫＶ、ＬＫＹ、ＬＬＫ、ＬＬＲ、ＬＮＡ、ＬＮＫ、ＬＮＲ、ＬＮＶ、ＬＰＫ、ＬＰＲ、ＬＱＡ、ＬＱＫ、ＬＱＲ、ＬＱＶ、ＬＲＡ、ＬＲＦ、ＬＲＩ、ＬＲＫ、ＬＲＬ、ＬＲＮ、ＬＲＱ、ＬＲＲ、ＬＲＳ、ＬＲＴ、ＬＲＶ、ＬＲＹ、ＬＳＫ、ＬＳＲ、ＬＴＫ、ＬＴＲ、ＮＩＫ、ＮＩＲ、ＮＬＫ、ＮＬＲ、ＰＩＫ、
ＰＩＲ、ＰＫＫ、ＰＫＲ、ＰＬＫ、ＰＬＲ、ＰＲＫ、ＰＲＲ、ＱＩＫ、ＱＩＲ、ＱＬＫ、ＱＬＲ、ＲＡＦ、ＲＡＩ、ＲＡＫ、ＲＡＬ、ＲＡＲ、ＲＡＹ、ＲＦＫ、ＲＦＲ、ＲＩＫ、ＲＩＮ、ＲＩＱ、ＲＩＲ、ＲＫＡ、ＲＫＤ、ＲＫＥ、ＲＫＦ、ＲＫＮ、ＲＫＱ、ＲＫＳ、ＲＫＴ、ＲＫＶ、ＲＫＹ、ＲＬＫ、ＲＬＮ、ＲＬＱ、ＲＬＲ、ＲＮＫ、ＲＮＲ、ＲＰＫ、ＲＰＲ、ＲＱＫ、ＲＱＲ、ＲＲＡ、ＲＲＤ、ＲＲＥ、ＲＲＦ、ＲＲＮ、ＲＲＱ、ＲＲＳ、ＲＲＴ、ＲＲＶ、ＲＲＹ、ＲＳＩ、ＲＳＫ、ＲＳＬ、ＲＳＲ、ＲＴＩ、ＲＴＫ、ＲＴＬ、ＲＴＲ、ＲＶＦ、ＲＶＩ、ＲＶＫ、ＲＶＬ、ＲＶＲ、ＲＶＹ、ＲＹＫ、ＲＹＲ、ＶＡＫ、ＶＡＲ、ＶＦＫ、ＶＦＲ、ＶＩＫ、ＶＩＮ、ＶＩＱ、ＶＩＲ、ＶＫＦ、ＶＫＩ、ＶＫＫ、ＶＫＬ、ＶＫＮ、ＶＫＱ、ＶＫＲ、ＶＫＳ、ＶＫＴ、ＶＫＹ、ＶＬＫ、ＶＬＮ、ＶＬＱ、ＶＬＲ、ＶＰＫ、ＶＰＲ、ＶＲＦ、ＶＲＩ、ＶＲＫ、ＶＲＬ、ＶＲＮ、ＶＲＱ、ＶＲＲ、ＶＲＳ、ＶＲＴ、ＶＲＹ、ＶＳＫ、ＶＳＲ、ＶＴＫ、ＶＴＲ、ＶＶＫ、ＶＶＲ、ＶＹＫ、ＶＹＲである。

実施例８。本発明の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を発現するトランスジェニック植物の殺虫効力

図８に記述されるベクターを使用してトランスジェニックトウモロコシ植物を作製した。ＳＴＡ、Ｌ、及びＴＰの構成要素を含むＯＲＦは図６Ｂに定義されており、トウモロコシ植物細胞に形質転換するよう作動可能なポリヌクレオチドとして調製した。６インチ間隔にて、１列当たり種子数１２５、６反復で種子を播種することにより、圃場試験を行った。ＵＴＣトウモロコシ系統が、トウモロコシ形質転換のための外植片として使用した親系統であり、トランスジェニックトウモロコシ系統が、図６Ｂの導入遺伝子を発現する、結果として得られたトランスジェニック植物であった。各植物に６００個のウエスタンコーンルートワームの卵を寄生させた後、作物が成熟に達したらスコアリングした。スコアリングは０〜３スケールによって行い、（Ｏｌｅｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｙ．Ｐａｒｋ，Ｔ．Ｍ．Ｎｏｗａｔｚｋｉ，ａｎｄ Ｊ．Ｊ．Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎ．２００５．Ｊ．Ｅｃｏｎ Ｅｎｔｏｍｏｌ．９８（１）：１−８）を使用して地下根茎の３つの輪生体（ｗｈｏｒｌ）の損傷をスコアリングした。０のスコアは損傷なしを表す。３のスコアは、３つ全ての根の輪生体が破壊されたことを表す。図９に示される、トランスジェニック植物がウエスタンコーンルートワームによる損傷の低減を示した、非トランスジェニック及びトランスジェニックのトウモロコシ植物の圃場試験データは、６反復の各々から５つランダムに選んだ３０の植物の平均スコアである。図６Ｂに示される殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を含むトランスジェニック植物は、トランスジェニックトウモロコシ系統を生成するための外植片として使用した非形質転換トウモロコシ系統で１．９０の損傷スコアと比較して、１．５５の損傷スコアを示した。トウモロコシに形質転換した場合の図６Ｂに示される殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質の使用は、トウモロコシ有害生物であるウエスタンコーンルートワームの制御における導入遺伝子の効力を例証している。

Claims (60)

1. ２つまたは３つの異なる領域からなる、少なくとも４個のアミノ酸から最大１６個までのアミノ酸を含有する二元ペプチドまたは三元ペプチドのいずれかからなるペプチドであって、前記二元ペプチドは、２つの異なる領域を有し、前記三元ペプチドは、３つの異なる領域を有し、前記二元ペプチド及び三元ペプチドが、動物の腸内プロテアーゼ及び昆虫または線虫の腸内プロテアーゼの両方によって切断可能である、前記ペプチド。
2. 前記二元ペプチドが、少なくとも４個のアミノ酸から最大８個までのアミノ酸を含有し、前記ペプチドが、２つの異なる領域を含み、前記領域のうちの一方が、動物の腸内プロテアーゼによって切断可能であり、他方の領域が、昆虫または線虫の腸内プロテアーゼによって切断可能である、請求項１に記載のペプチド。
3. 前記三元ペプチドが、少なくとも５個のアミノ酸から最大１６個までのアミノ酸を含有し、前記三元ペプチドが、二元ペプチド及びアミノ酸数１〜４のスペーサーを含む、請求項１に記載のペプチド。
4. 前記スペーサーが、アミノ酸配列ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、ＭＶ、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、またはＤＴを含む、請求項３に記載のペプチド。
5. 前記二元ペプチドが、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４からなる群から選択されるアミノ酸配列［式中、各Ｘ_ｎ及び各Ｙ_ｎはアミノ酸であり、各Ｘｎ及び各Ｙｎはアミノ酸であり、Ｘ_１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、及びＶからなる群から選択され、Ｘ_２は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ_４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｙ_１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ_２は、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ_３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ_４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される］を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の二元ペプチド。
6. 前記二元ペプチドが、アミノ酸配列：ＡＦＶＲＬＦ、ＡＫＬＦＶ、ＡＬＦＡＬＫ、ＡＬＦＬＫ、ＡＬＦＬＲ、ＡＬＦＲ、ＡＬＦＲＬＲ、ＡＬＫＡＬＦ、ＡＬＫＦＦ、ＡＬＫＦＬＶ、ＡＬＫＩＦＶ、ＡＬＫＬＦＶ、ＦＦＡＤＩＫ、ＦＦＡＬＫ、ＦＦＬＫ、ＦＦＬＲ、ＦＦＲＬＲ、ＦＧＹＲＩＫ、ＦＬＲＬＦ、ＦＹＡＲＲ、ＧＧＬＲＫＫ、ＩＦＶＡＬＫ、ＩＦＶＬＫ、ＩＦＶＬＲ、ＩＦＶＲ、ＩＦＶＲＬＲ、ＩＬＦＮＩＫ、ＬＦＡＡＰＦ、ＦＶＡＬＫ、ＬＦＶＬＫ、ＬＦＶＬＲ、ＬＦＶＲ、ＬＦＶＲＬＲ、ＬＦＶＲＶＦＬ、ＬＧＥＲ、ＬＫＡＬＦ、ＬＫＦＦ、ＬＫＩＦＶ、ＬＫＬＦＶ、ＬＲＡＬＦ、ＬＲＦＦ、ＬＲＩＦＶ、ＬＲＬＦＶ、ＲＡＬＦ、ＲＩＦＶ、ＲＬＦＶ、ＲＬＲＡＬＦ、ＲＬＲＦＦ、ＲＬＲＩＦＶ、ＲＬＲＬＦＶ、ＲＲＫＡＦＶ、ＲＲＫＬＩＦ、ＲＲＲＦＦＡ、ＶＦＧＲＫＧ、及びＹＦＶＲＫを有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド。
7. 前記二元ペプチドが、アミノ酸配列：ＩＦＶＡＬＫ、ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、ＬＦＡＡＰＦ、ＬＦＶＡＬＫ、ＬＲＬＦＶ、ＬＦＶＲＬＲ、またはＬＫＬＦＶを有する、請求項６に記載のペプチド。
8. 前記三元ペプチドが、ＩＦＶＡＬＫＧＳ、ＩＦＶＲＬＲＧＳ、ＡＬＫＬＦＶＧＳ、ＡＬＫＦＬＶＧＳ、ＲＲＫＡＦＶＧＳ、ＬＦＡＡＰＦＧＳ、ＬＦＶＡＬＫＧＳ、ＬＲＬＦＶＧＳ、ＬＦＶＲＬＲＧＳ、またはＬＫＬＦＶＧＳのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のペプチド。
9. 前記二元ペプチドが、アミノ酸配列ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、またはＬＦＡＡＰＦを有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド。
10. 前記三元ペプチドが、ＩＦＶＲＬＲＧＳ、ＡＬＫＬＦＶＧＳ、ＡＬＫＦＬＶＧＳ、ＲＲＫＡＦＶＧＳ、ＬＦＡＡＰＦＧＳ、ＧＳＩＦＶＲＬＲ、ＧＳＡＬＫＬＦＶ、ＧＳＡＬＫＦＬＶ、ＧＳＧＳＲＲＫＡＦＶ、またはＧＳＬＦＡＡＰＦのアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチド。
11. 前記二元ペプチドまたは三元ペプチドが、毒性タンパク質（ＴＰ）に連結している、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のペプチド。
12. 前記ＴＰのＣ末端にインフレームで連結した第２の二元ペプチドまたは三元ペプチドを更に含む、請求項１１に記載のペプチド。
13. 前記二元ペプチドまたは三元ペプチドが、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）のＣ末端に連結している、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のペプチド。
14. １つ以上の切断可能な連結ペプチドを有する殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質であって、前記殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質が、二元ペプチドまたは三元ペプチドのＮ末端にインフレームで融合したＥＲＳＰを含み、前記二元ペプチドまたは三元ペプチドが、（Ｌ−ＴＰ）_ｎ、（Ｌ−ＴＰ）_ｎ−Ｌ、（ＴＰ−Ｌ）_ｎ、またはＬ−（ＴＰ−Ｌ）_ｎ（式中、ＴＰは毒性タンパク質であり、Ｌは二元ペプチドまたは三元ペプチドであり、ｎは１〜２００の範囲の整数である）を含む構築物にインフレームで融合している、前記殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質。
15. 前記昆虫のプロテアーゼが、ＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａまたはＣｏｌｅｏｐｔｅｒａ昆虫種に由来するプロテアーゼである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のペプチドあるいは殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質。
16. 前記動物の腸内プロテアーゼが、ヒトの消化管プロテアーゼである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のペプチドあるいは殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質。
17. 前記ＴＰが、ポア形成殺虫性タンパク質（ＰＦＩＰ）及びシステインリッチ殺虫性タンパク質（ＣＲＩＰ）からなる群から選択されるタンパク質である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のペプチドあるいは殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質。
18. 前記ＴＰが、配列番号５〜１５９３及び１７６１〜１７７５に示されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはタンパク質と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％の配列同一性または配列相同性を有するペプチドまたはタンパク質である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のペプチドあるいは殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質。
19. 前記ＴＰが、配列番号５、６及び１７６１、１７６２、１７６７、１７７１〜１７７３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはタンパク質、及びそれらの変異形と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％の配列同一性または配列相同性を有するペプチドまたはタンパク質である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のペプチドあるいは殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質。
20. 前記ＴＰが、配列番号５、６、１７６１、１７６２、１７６７、１７７１〜１７７３、またはそれらの変異形のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項１９に記載のペプチドあるいは殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質。
21. 請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドあるいは殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
22. 請求項２１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
23. 請求項２２に記載のベクターを含む細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、植物宿主細胞、または動物宿主細胞。
24. 作動可能なプロモーターに連結したポリヌクレオチドを含むＤＮＡ構築物であって、前記ポリヌクレオチドが、二元ペプチドまたは三元ペプチドのいずれかを含む切断可能ペプチドをコードし、前記切断可能ペプチドが、少なくとも４個のアミノ酸から最大１６個までのアミノ酸を含有し、かつ２つまたは３つの異なる領域からなり、前記二元ペプチドは、２つの異なる領域を有し、前記三元ペプチドは、３つの異なる領域を有し、前記切断可能ペプチドが、動物の腸内プロテアーゼ及び昆虫または線虫の腸内プロテアーゼの両方によって切断可能であり、前記ポリヌクレオチドが、前記切断可能ペプチドにインフレームで融合した毒性ペプチドを更にコードする、前記ＤＮＡ構築物。
25. 前記三元ペプチドが、少なくとも５個のアミノ酸から最大１６個までのアミノ酸を含有し、前記三元ペプチドが、二元ペプチド及びアミノ酸数１〜４のスペーサーを含む、請求項２４に記載のＤＮＡ構築物。
26. 前記スペーサーが、アミノ酸配列ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、ＭＶ、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、またはＤＴを含む、請求項２５に記載のＤＮＡ構築物。
27. 前記二元ペプチドが、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４のアミノ酸配列［式中、各Ｘｎ及び各Ｙｎはアミノ酸であり、各Ｘｎ及び各Ｙｎはアミノ酸であり、Ｘ１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、及びＶからなる群から選択され、Ｘ２は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｙ１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ２は、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される］を含む、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物。
28. 前記二元ペプチドが、アミノ酸配列：ＡＦＶＲＬＦ、ＡＫＬＦＶ、ＡＬＦＡＬＫ、ＡＬＦＬＫ、ＡＬＦＬＲ、ＡＬＦＲ、ＡＬＦＲＬＲ、ＡＬＫＡＬＦ、ＡＬＫＦＦ、ＡＬＫＦＬＶ、ＡＬＫＩＦＶ、ＡＬＫＬＦＶ、ＦＦＡＤＩＫ、ＦＦＡＬＫ、ＦＦＬＫ、ＦＦＬＲ、ＦＦＲＬＲ、ＦＧＹＲＩＫ、ＦＬＲＬＦ、ＦＹＡＲＲ、ＧＧＬＲＫＫ、ＩＦＶＡＬＫ、ＩＦＶＬＫ、ＩＦＶＬＲ、ＩＦＶＲ、ＩＦＶＲＬＲ、ＩＬＦＮＩＫ、ＬＦＡＡＰＦ、ＦＶＡＬＫ、ＬＦＶＬＫ、ＬＦＶＬＲ、ＬＦＶＲ、ＬＦＶＲＬＲ、ＬＦＶＲＶＦＬ、ＬＧＥＲ、ＬＫＡＬＦ、ＬＫＦＦ、ＬＫＩＦＶ、ＬＫＬＦＶ、ＬＲＡＬＦ、ＬＲＦＦ、ＬＲＩＦＶ、ＬＲＬＦＶ、ＲＡＬＦ、ＲＩＦＶ、ＲＬＦＶ、ＲＬＲＡＬＦ、ＲＬＲＦＦ、ＲＬＲＩＦＶ、ＲＬＲＬＦＶ、ＲＲＫＡＦＶ、ＲＲＫＬＩＦ、ＲＲＲＦＦＡ、ＶＦＧＲＫＧ、及びＹＦＶＲＫを含む、請求項２７に記載のＤＮＡ構築物。
29. 前記二元ペプチドが、アミノ酸配列：ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、またはＬＦＡＡＰＦを含む、請求項２８に記載のＤＮＡ構築物。
30. 前記ポリヌクレオチドが、アミノ酸配列：ＡＦＶＲＬＦＧＳ、ＡＫＬＦＶＧＳ、ＡＬＦＡＬＫＧＳ、ＡＬＦＬＫＧＳ、ＡＬＦＬＲＧＳ、ＡＬＦＲＧＳ、ＡＬＦＲＬＲＧＳ、ＡＬＫＡＬＦＧＳ、ＡＬＫＦＦＧＳ、ＡＬＫＦＬＶＧＳ、ＡＬＫＩＦＶＧＳ、ＡＬＫＬＦＶＧＳ、ＦＦＡＤＩＫＧＳ、ＦＦＡＬＫＧＳ、ＦＦＬＫＧＳ、ＦＦＬＲＧＳ、ＦＦＲＬＲＧＳ、ＦＧＹＲＩＫＧＳ、ＦＬＲＬＦＧＳ、ＦＹＡＲＲＧＳ、ＧＧＬＲＫＫＧＳ、ＩＦＶＡＬＫＧＳ、ＩＦＶＬＫＧＳ、ＩＦＶＬＲＧＳ、ＩＦＶＲＧＳ、ＩＦＶＲＬＲＧＳ、ＩＬＦＮＩＫＧＳ、ＬＦＡＡＰＦＧＳ、ＬＦＶＡＬＫＧＳ、ＬＦＶＬＫＧＳ、ＬＦＶＬＲＧＳ、ＬＦＶＲＧＳ、ＬＦＶＲＬＲＧＳ、ＬＦＶＲＶＦＬＧＳ、ＬＧＥＲＧＳ、ＬＫＡＬＦＧＳ、ＬＫＦＦＧＳ、ＬＫＩＦＶＧＳ、ＬＫＬＦＶＧＳ、ＬＲＡＬＦＧＳ、ＬＲＦＦＧＳ、ＬＲＩＦＶＧＳ、ＬＲＬＦＶＧＳ、ＲＡＬＦＧＳ、ＲＩＦＶＧＳ、ＲＬＦＶＧＳ、ＲＬＲＡＬＦＧＳ、ＲＬＲＦＦＧＳ、ＲＬＲＩＦＶＧＳ、ＲＬＲＬＦＶＧＳ、ＲＲＫＡＦＶＧＳ、ＲＲＫＬＩＦＧＳ、ＲＲＲＦＦＡＧＳ、ＶＦＧＲＫＧＧＳ、ＹＦＶＲＫＧＳ、ＧＳＡＦＶＲＬＦ、ＧＳＡＫＬＦＶ、ＧＳＡＬＦＡＬＫ、ＧＳＡＬＦＬＫ、ＧＳＡＬＦＬＲ、ＧＳＡＬＦＲ、ＧＳＡＬＦＲＬＲ、ＧＳＡＬＫＡＬＦ、ＧＳＡＬＫＦＦ、ＧＳＡＬＫＦＬＶ、ＧＳＡＬＫＩＦＶ、ＧＳＡＬＫＬＦＶ、ＧＳＦＦＡＤＩＫ、ＧＳＦＦＡＬＫ、ＧＳＦＦＬＫ、ＧＳＦＦＬＲ、ＧＳＦＦＲＬＲ、ＧＳＦＧＹＲＩＫ、ＧＳＦＬＲＬＦ、ＧＳＦＹＡＲＲ、ＧＳＧＧＬＲＫＫ、ＧＳＩＦＶＡＬＫ、ＧＳＩＦＶＬＫ、ＧＳＩＦＶＬＲ、ＧＳＩＦＶＲ、ＧＳＩＦＶＲＬＲ、ＧＳＩＬＦＮＩＫ、ＧＳＬＦＡＡＰＦ、ＧＳＬＦＶＡＬＫ、ＧＳＬＦＶＬＫ、ＧＳＬＦＶＬＲ、ＧＳＬＦＶＲ、ＧＳＬＦＶＲＬＲ、ＧＳＬＦＶＲＶＦＬ、ＧＳＬＧＥＲ、ＧＳＬＫＡＬＦ、ＧＳＬＫＦＦ、ＧＳＬＫＩＦＶ、ＧＳＬＫＬＦＶ、ＧＳＬＲＡＬＦ、ＧＳＬＲＦＦ、ＧＳＬＲＩＦＶ、ＧＳＬＲＬＦＶ、ＧＳＲＡＬＦ、ＧＳＲＩＦＶ、ＧＳＲＬＦＶ、ＧＳＲＬＲＡＬＦ、ＧＳＲＬＲＦＦ、ＧＳＲＬＲＩＦＶ、ＧＳＲＬＲＬＦＶ、ＧＳＲＲＫＡＦＶ、ＧＳＲＲＫＬＩＦ、ＧＳＲＲＲＦＦＡ、ＧＳＶＦＧＲＫＧ、及びＧＳＹＦＶＲＫを含む三元ペプチドをコードする、請求項２４に記載のＤＮＡ構築物。
31. 前記昆虫のプロテアーゼが、ＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａまたはＣｏｌｅｏｐｔｅｒａ昆虫種に由来するプロテアーゼである、請求項２４に記載のＤＮＡ構築物。
32. 前記動物の腸内プロテアーゼが、ヒトの消化管プロテアーゼである、請求項２４に記載のＤＮＡ構築物。
33. 前記ＴＰが、ポア形成殺虫性タンパク質（ＰＦＩＰ）及びシステインリッチ殺虫性タンパク質（ＣＲＩＰ）からなる群から選択されるペプチドまたはタンパク質である、請求項２４〜３２のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物。
34. 前記ＴＰが、配列番号５〜１５９３及び１７６１〜１７７５に示されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはタンパク質と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％の配列同一性または配列相同性を有するペプチドまたはタンパク質である、請求項３３に記載のＤＮＡ構築物。
35. 前記ＴＰが、配列番号５、６及び１７６１、１７６２、１７６７、１７７１〜１７７３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはタンパク質、及びそれらの変異形と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％の配列同一性または配列相同性を有するペプチドまたはタンパク質である、請求項３４に記載のＤＮＡ構築物。
36. 前記ＴＰが、配列番号５、６、１７６１、１７６２、１７６７、１７７１〜１７７３、またはそれらの変異形のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するペプチドまたはタンパク質である、請求項３５に記載のＤＮＡ構築物。
37. 請求項２４〜３６のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物を含む宿主細胞。
38. 請求項３５に記載のＤＮＡ構築物を含む、請求項３７に記載の宿主細胞。
39. 前記宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞である、請求項３７に記載の宿主細胞。
40. 前記細菌細胞が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ細胞、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ細胞、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細胞、及びＲｈｉｚｏｂｉｕｍ細胞からなる群から選択される、請求項３９に記載の宿主細胞。
41. 前記植物細胞が、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、キャッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、柑橘類、ココナツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバ、ワタ、ウリ科植物、キュウリ、ベイマツ、ナス、ユーカリ、アマ、ニンニク、ブドウ、ホップ、ニラ、レタス、タエダマツ、アワ、メロン、ナッツ、カラスムギ、オリーブ、タマネギ、装飾用植物、パーム、牧草、エンドウマメ、ピーナッツ、コショウ、キマメ、マツ、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ、ラジアータマツ、ダイコン、ナタネ、イネ、台木、ライムギ、ベニバナ、低木、ソルガム、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、スカッシュ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、モミジバフウ、サツマイモ、スイッチグラス、茶、タバコ、トマト、ライコムギ、芝草、スイカ、及びコムギ植物の細胞からなる群から選択される、請求項３９に記載の宿主細胞。
42. 作動可能なプロモーターに連結したポリヌクレオチドを含む植物またはその一部であって、前記ポリヌクレオチドが、二元ペプチドまたは三元ペプチドのいずれかを含む切断可能ペプチドをコードし、前記切断可能ペプチドが、少なくとも４個のアミノ酸から最大１６個までのアミノ酸を含有し、かつ２つまたは３つの異なる領域からなり、前記二元ペプチドは、２つの異なる領域を有し、前記三元ペプチドは、３つの異なる領域を有し、前記切断可能ペプチドが、動物の腸内プロテアーゼ及び昆虫または線虫の腸内プロテアーゼの両方によって切断可能であり、前記ポリヌクレオチドが、前記切断可能ペプチドにインフレームで融合した毒性ペプチドを更にコードする、前記植物またはその一部。
43. 前記植物が、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、キャッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、柑橘類、ココナツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバ、ワタ、ウリ科植物、キュウリ、ベイマツ、ナス、ユーカリ、アマ、ニンニク、ブドウ、ホップ、ニラ、レタス、タエダマツ、アワ、メロン、ナッツ、カラスムギ、オリーブ、タマネギ、装飾用植物、パーム、牧草、エンドウマメ、ピーナッツ、コショウ、キマメ、マツ、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ、ラジアータマツ、ダイコン、ナタネ、イネ、台木、ライムギ、ベニバナ、低木、ソルガム、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、スカッシュ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、モミジバフウ、サツマイモ、スイッチグラス、茶、タバコ、トマト、ライコムギ、芝草、スイカ、及びコムギ植物からなる群から選択され、前記一部が、葉、茎、花、萼片、果実、根、または種子からなる群から選択される、請求項４２に記載の植物またはその一部。
44. 植物の有害生物感染を制御する方法であって、前記方法が、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を発現する前記植物もしくはその一部を、前記有害生物の食餌に供給すること、あるいは、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を含む組成物を、前記植物またはその一部の少なくとも一部分にコーティングして供給することを含み、前記殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質が、１つ以上の切断可能な二元ペプチドまたは三元ペプチドと、１つ以上のＴＰとを含み、前記二元ペプチド及び三元ペプチドが、動物の腸内プロテアーゼ及び昆虫または線虫の腸内プロテアーゼの両方によって切断可能である、前記方法。
45. 前記切断可能な二元ペプチドが、アミノ酸配列：Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３、Ｙ_１−Ｙ_２−Ｙ_３−Ｙ_４−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４［式中、各Ｘｎ及び各Ｙｎはアミノ酸であり、各Ｘｎ及び各Ｙｎはアミノ酸であり、Ｘ１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、及びＶからなる群から選択され、Ｘ２は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｙ１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ２は、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される］を含む、請求項４４に記載の植物の有害生物感染を制御する方法。
46. 前記二元ペプチドが、ＡＦＶＲＬＦ、ＡＫＬＦＶ、ＡＬＦＡＬＫ、ＡＬＦＬＫ、ＡＬＦＬＲ、ＡＬＦＲ、ＡＬＦＲＬＲ、ＡＬＫＡＬＦ、ＡＬＫＦＦ、ＡＬＫＦＬＶ、ＡＬＫＩＦＶ、ＡＬＫＬＦＶ、ＦＦＡＤＩＫ、ＦＦＡＬＫ、ＦＦＬＫ、ＦＦＬＲ、ＦＦＲＬＲ、ＦＧＹＲＩＫ、ＦＬＲＬＦ、ＦＹＡＲＲ、ＧＧＬＲＫＫ、ＩＦＶＡＬＫ、ＩＦＶＬＫ、ＩＦＶＬＲ、ＩＦＶＲ、ＩＦＶＲＬＲ、ＩＬＦＮＩＫ、ＬＦＡＡＰＦ、ＦＶＡＬＫ、ＬＦＶＬＫ、ＬＦＶＬＲ、ＬＦＶＲ、ＬＦＶＲＬＲ、ＬＦＶＲＶＦＬ、ＬＧＥＲ、ＬＫＡＬＦ、ＬＫＦＦ、ＬＫＩＦＶ、ＬＫＬＦＶ、ＬＲＡＬＦ、ＬＲＦＦ、ＬＲＩＦＶ、ＬＲＬＦＶ、ＲＡＬＦ、ＲＩＦＶ、ＲＬＦＶ、ＲＬＲＡＬＦ、ＲＬＲＦＦ、ＲＬＲＩＦＶ、ＲＬＲＬＦＶ、ＲＲＫＡＦＶ、ＲＲＫＬＩＦ、ＲＲＲＦＦＡ、ＶＦＧＲＫＧ、及びＹＦＶＲＫのアミノ酸配列を含む、請求項４４に記載の植物の有害生物感染を制御する方法。
47. 前記二元ペプチドが、アミノ配列ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、またはＬＦＡＡＰＦを含む、請求項４６に記載の植物の有害生物感染を制御する方法。
48. 前記切断可能な三元ペプチドが、少なくとも５個のアミノ酸から最大１６個までのアミノ酸を含有し、前記三元ペプチドが、二元ペプチド及びアミノ酸数１〜４のスペーサーを含む、請求項４４に記載の植物の有害生物感染を制御する方法。
49. 前記三元ペプチドが、そのＣ末端において、アミノ酸配列ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、ＭＶ、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、またはＤＴを含むジペプチドに融合している二元ペプチドを含む、請求項４８に記載の植物の有害生物感染を制御する方法。
50. 前記昆虫のプロテアーゼが、ＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａまたはＣｏｌｅｏｐｔｅｒａ昆虫種に由来するプロテアーゼである、請求項４４に記載の植物の有害生物感染を制御する方法。
51. 前記動物の腸内プロテアーゼが、ヒトの消化管プロテアーゼである、請求項４４に記載の植物の有害生物感染を制御する方法。
52. 前記ＴＰが、ポア形成殺虫性タンパク質（ＰＦＩＰ）及びシステインリッチ殺虫性タンパク質（ＣＲＩＰ）からなる群から選択されるタンパク質である、請求項４４〜５１のいずれか１項に記載の植物の有害生物感染を制御する方法。
53. 前記有害生物が、昆虫または線虫である、請求項４４に記載の植物の有害生物感染を制御する方法。
54. 前記有害生物が、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ及びＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａからなる群から選択される昆虫目の昆虫である、請求項５３に記載の植物の有害生物感染を制御する方法。
55. 前記ＴＰが、ポア形成殺虫性タンパク質（ＰＦＩＰ）及びシステインリッチ殺虫性ペプチド（ＣＲＩＰ）からなる群から選択されるペプチドまたはタンパク質である、請求項４４に記載の植物の有害生物感染を制御する方法。
56. 前記ＴＰが、インヒビターシステインノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質または非ＩＣＫタンパク質である、請求項５５に記載の植物の有害生物感染を制御する方法。
57. 前記ＴＰが、配列番号５、６及び１７６１、１７６２、１７６７、１７７１〜１７７３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはタンパク質、またはそれらの変異形と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％の配列同一性または配列相同性を有するペプチドまたはタンパク質である、請求項５６に記載の植物の有害生物感染を制御する方法。
58. 前記ＴＰが、配列番号５、６、１７６１、１７６２、１７６７、１７７１〜１７７３、またはそれらの変異形のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するペプチドまたはタンパク質である、請求項５７に記載の植物の有害生物感染を制御する方法。
59. 前記植物によって殺虫有効量の前記ＴＰが供給され、前記植物が、組換え植物、前記植物の一部、または前記植物もしくは前記植物の一部の産物である、請求項４４に記載の植物の有害生物感染を制御する方法。
60. 殺虫有効量の前記殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質が、前記植物または前記植物の一部に局所適用される１つ以上の製剤で供給され、前記１つ以上の製剤が、前記殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を含む細菌細胞、細菌胞子、真菌細胞、真菌胞子、またはパラ胞子結晶を含む、請求項４４に記載の植物の有害生物感染を制御する方法。