BR112017026193B1

BR112017026193B1 - Adsorventes, método de produção dos adsorventes e uso dos adsorventes

Info

Publication number: BR112017026193B1
Application number: BR112017026193-6A
Authority: BR
Inventors: Surya Kiran Chodavarapu; Feng Gu
Original assignee: W.R. Grace & Co-Conn
Priority date: 2015-06-05
Filing date: 2016-06-03
Publication date: 2021-09-14
Also published as: KR20180015239A; EP3302784A1; EP3302784A4; WO2016196906A1; ES2896897T3; HK1253897A1; KR102566292B1; EP3302784B1; PL3302784T3; BR112017026193A2; SG10201911134QA; CN107921407A; US10695744B2; US20180169610A1; JP2018517559A; CN107921407B

Abstract

agentes de clarificação para bioprocessamento de adsorventes e métodos de produção e uso dos mesmos. são revelados agentes de clarificação de adsorvente adequados para uso em procedimentos de bioprocessamento. são também revelados métodos de produção e uso dos agentes de clarificação de adsorvente.

Description

Campo da invenção

[001] A presente invenção refere-se a agentes de clarificação de adsorvente ade-quados para uso em procedimentos de bioprocessamento. A presente invenção refere- se, ainda, a métodos de produção e uso de agentes de clarificação de adsorvente para a remoção de ou separação de substâncias biológicas indesejáveis durante procedimentos de bioprocessamento.

Antecedentes

[002] Nos últimos anos, a indústria biofarmacêutica tem apresentado grandes aprimoramentos na produção de MAb que apresentam títulos de produto acima de 25 g/L, frequentemente associados a densidades celulares muito altas. Culturas celulares de alta densidade com >150 milhões de células/mL representam um grande desafio no processamento a jusante adicional devido a uma necessidade de remover uma grande quantidade de biomassa e níveis maiores de contaminantes de restos de células gerados durante a cultura celular e a coleta. A produção de substâncias biológicas (MAbs, em particular) geralmente envolve o processamento de um caldo de cultura celular complexo a partir do qual substâncias biológicas desejadas devem ser isoladas e purificadas enquanto se mantém a alta recuperação e qualidade geral do produto. Tradicionalmente, a centrifugação e uma combinação de técnicas de filtração (filtração de fluxo tangencial e filtração por profundidade) foi amplamente aceita como extremamente útil para clarificar esses complexos caldos de cultura celular. Entretanto, a melhora dos processos de cultura celular em mamíferos está fornecendo densidades celulares totais muito além dos níveis tradicionais de 20 x 106 células/mL das células CHO de >150 x 106 células/mL para PER. Células C6. Dessa forma, as limitações de ambas as técnicas de centrifugação e filtração são evidentes pelo alto teor de sólidos (<40%) dessas coletas.

[003] A centrifugação pode ser aplicada aos fluxos de alimentação do processo com altos níveis de sólidos, por exemplo. Entretanto, a recuperação do produto pode ser baixa devido ao maior volume de pélete e à necessidade de frequente remoção de sedimentos (especialmente na centrifugação contínua de larga escala). Adicionalmente, o rompimento das células devido às forças de cisalhamento geradas durante a centrifugação pode reduzir ainda mais a eficiência da clarificação da coleta e potencialmente danificar e/ou aprisionar o produto.

[004] Os filtros de profundidade são vantajosos, pois removem contaminantes e muitos são fornecidos em formato de uso único, reduzindo a necessidade de limpeza e validação. Entretanto, os filtros de profundidade são atualmente incapazes de tratar fluxos de alimentação com alto teor de sólidos e são frequentemente utilizados em série com a centrifugação. A TFF pode trabalhar com cargas com alto teor de sólidos, porém essa técnica pode exibir baixo rendimento devido à polarização de sólidos na superfície da membrana ao processar fluxos de alimentação altamente densos. A diluição excessiva de produto e a lise celular causada por forças de cisalhamento também podem limitar a utilidade da TFF.

[005] A floculação de coletas de cultura celular também tem sido amplamente usada para aumentar a capacidade de processamento de clarificação e as operações de filtração a jusante. As atuais técnicas incluem o uso de polímeros poli-iônicos solúveis (como DEAE dextrano, polímeros à base de acrila e polietileno amina) e materiais inorgânicos como terra diatomácea e perlitas, que removem células e restos de células. Entretanto, os polímeros devem ser subsequentemente removidos dos fluxos de processo, que exigem monitoramento e quantificação por testes em processo e testes de liberação de produto. Se a cromatografia IEX for incluída como uma etapa de purificação no processo a jusante, as capacidades de ligação serão amplamente afetadas pela natureza carregada dos floculantes. A alta viscosidade das soluções de estoque de policátions representa um desafio adicional de processo.

[006] Nos últimos anos, diversas novas técnicas de clarificação foram desenvolvidas. Por exemplo, (http://www.selectscience.net/product-news/sartorius- stedim-biotech), foi introduzida a tecnologia de coleta de uso único de culturas de alta densidade celular usando terra diatomácea (TD) como auxiliar de filtro. (Minow B., et al, Bioprocess Int., 1° de abril de 2014). Entretanto, devido à sua baixa área superficial (BET ~ 1 m2/g) e à natureza não porosa, a TD não tem função alguma na adsorção de proteínas e/ou outros tipos de produtos biológicos, mas somente como auxiliar de filtro.

[007] Em outros processos, os materiais particulados funcionalizados têm sido usados como adsorventes para clarificação de caldos celulares. Por exemplo, os métodos nas patentes WO2010043700 e WO2010043703 para clarificação ou remoção de proteínas de célula hospedeira pela utilização de material de troca aniô- nica no processo. As condições de propriedade ou ideais para os materiais de troca iônica não são descritas nos pedidos de patente.

[008] Os esforços continuam no sentido de desenvolver ainda mais materiais de clarificação e processos tendo agentes aprimorados na forma de materiais particu- lados funcionalizados de modo a melhorar a capacidade de ligação (por exemplo, a quantidade e a variedade de biomateriais que podem ser ligados aos agentes de clarificação de adsorvente) e/ou a seletividade de ligação dos materiais particulados fun- cionalizados.

Sumário

[009] A presente invenção aborda a necessidade na técnica de bioprocessos aprimorados pela descoberta de que o uso de determinados materiais de óxido inorgânico porosos funcionalizados permite melhor desempenho como adsorventes de clarificação. Os adsorventes da presente invenção inesperadamente fornecem excepcional capacidade de ligação, bem como seletividade de ligação em bioprocessos (por exemplo, biopurificação, biosseparação etc.) em comparação a materiais particulados funcionalizados conhecidos.

[010] Em particular, a presente invenção fornece bioprocessos aprimorados que empregam materiais de óxido inorgânico poliméricos funcionalizados que consistem em partículas porosas de óxido inorgânico tendo uma distribuição de tamanho de poro suficientemente ampla para permitir que as partículas possam se ligar seletivamente a uma ampla variedade de biomoléculas que incluem, mas não se limitam a, células, proteínas de célula hospedeira, ácidos nucleicos, restos de células, cro- matinas etc., de modo a remover esses materiais durante uma ou mais etapas de bioprocessamento. Em algumas modalidades, as partículas de óxido inorgânico porosas têm uma distribuição de tamanho de poro conforme medida por um valor de amplitude de distribuição de tamanho de poro 90 de ao menos cerca de 1,0. Em outras modalidades, em que as partículas porosas têm uma distribuição de tamanho de poro conforme medida por um valor de amplitude de distribuição de tamanho de poro 90 de até cerca de 5,0 a cerca de 10,0.

[011] Consequentemente, a presente invenção refere-se a partículas poliméri- cas porosas funcionalizadas de óxido inorgânico tendo uma distribuição de tamanho de poro especificada (também denominada, na presente invenção, “adsorventes”) que são úteis como agentes de clarificação em uma variedade de bioprocessos. Em uma modalidade exemplificadora, a presente invenção refere-se a adsorventes que compreendem material polimérico ligado covalentemente à superfície de partículas porosas de óxido inorgânico, em que as ditas partículas têm uma distribuição de tamanho de poro conforme medida por um valor de amplitude de distribuição de tamanho de poro 90 de ao menos cerca de 1,0. Em algumas modalidades desejadas, a invenção compreende os adsorventes úteis como um agente de clarificação para bioprocessamento, em que os adsorventes compreendem um material de polieletrólito ligado covalentemente à superfície das partículas porosas de óxido inorgânico, em que as partículas porosas tendo uma distribuição de tamanho de poro conforme medida por um valor de amplitude de distribuição de tamanho de poro 90 de até cerca de 5,0 a cerca de 10,0. Em modalidades preferenciais da invenção, o material polimérico compreende um poliele- trólito, por exemplo, polietileno imina. Em uma modalidade ainda mais preferencial da invenção, a partícula porosa de óxido metálico compreende sílica.

[012] A presente invenção refere-se, ainda, a métodos de produção de ad- sorventes na forma de material particulado funcionalizado. Em uma modalidade exemplificadora, o método de produção de adsorventes da presente invenção compreende: contato das partículas porosas de óxido metálico inorgânico com um ou mais reagentes sob condições de reação que resultam em ao menos um material polimérico ligado covalentemente ao menos a uma superfície das partículas de óxido metálico, em que as partículas de óxido metálico têm uma ampla distribuição de tamanho de poro conforme medida por um valor de amplitude de distribuição de tamanho de poro 90 de ao menos cerca de 1,0.

[013] A presente invenção é também direcionada a um método para a clarificação de uma mistura de bioprocesso durante um procedimento de bioprocessamento. O método permite a remoção ou separação das substâncias biológicas indesejáveis, por exemplo, restos de células, de uma mistura de bioprocessamento usando os absorventes da invenção.

[014] Essas e outras características e vantagens da presente invenção ficarão evidentes após uma revisão da seguinte descrição detalhada das modalidades reveladas e das reivindicações anexadas.

Breve descrição dos desenhos

[015] A Figura mostra graficamente a comparação em distribuições de tamanho de poro (a partir de porosimetria por intrusão de mercúrio) para duas sílicas diferentes.

Descrição detalhada

[016] Para permitir a compreensão dos princípios da presente invenção, seguem descrições de modalidades específicas da invenção e a terminologia específica é usada para descrever as modalidades específicas. No entanto, ficará entendido que não se pretende limitar do escopo da invenção com o uso de terminologia específica. Alterações, outras modificações e outras aplicações dos princípios da presente invenção discutidos são contempladas como normalmente ocorreria aos versados na técnica aos quais pertence a invenção.

[017] Deve ser observado que, conforme usadas na presente invenção e nas reivindicações anexadas, as formas singulares “um/uma”, “e”, e “o/a” incluem referentes no plural, salvo se o contexto claramente indicar o contrário. Dessa forma, por exemplo, a referência a “um óxido” inclui uma pluralidade destes óxidos e a referência a “óxido” inclui a referência a um ou mais óxidos e equivalentes destes conhecidos pelos versados na técnica, e assim por diante.

[018] O termo “cerca de” que modifica, por exemplo, a quantidade de um ingrediente em uma composição, concentrações, volumes, temperaturas de processo, tempos de processo, recuperações ou rendimentos, vazões, e valores similares, e faixas destes, empregado na descrição das modalidades da revelação, refere-se à variação na quantidade numérica que pode ocorrer, por exemplo, por procedimentos típicos de medição e manuseio; por erro acidental nestes procedimentos; por diferenças nos ingredientes usados para realizar os métodos; e considerações próximas semelhantes. O termo “cerca de” também abrange quantidades que diferem devido ao envelhecimento de uma formulação com uma concentração ou mistura inicial em particular, e quantidades que diferem devido à mistura ou processamento de uma formulação com uma concentração ou mistura inicial em particular. Se modificadas pelo termo “cerca de”, as reivindicações anexadas incluem equivalentes àquelas quantidades.

[019] Conforme usados na presente invenção, os termos “bioprocesso” ou “bio- processamento” se referem a um processo em batelada que forma, altera e/ou utiliza uma ou mais biomoléculas. O termo “bioprocesso” inclui, mas não se limita a, processos de biosseparação, processos de biopurificação, processos para formar produtos biofarmacêuticos, e processos para purificar produtos biofarmacêuticos. Conforme usado aqui, o termo “bioprocesso” ou “bioprocessamento” refere-se ao processamento que pode ocorrer antes de um processo de cromatografia (por exemplo, remoção de restos de células de uma batelada de material), não abrange processos cromatográficos (por exemplo, cromatografia líquida).

[020] Conforme usado aqui, o termo “biomolécula” significa qualquer molécula que é produzida por um organismo vivo, incluindo moléculas grandes como proteínas, polissacarídeos, lipídios e ácidos nucleicos; e moléculas pequenas, como metabólitos primários, metabólitos secundários e produtos naturais. Exemplos de biomoléculas incluem células e restos de células; anticorpos, proteínas e peptídeos; ácidos nuclei- cos, como DNA e RNA; endotoxinas; vírus; vacinas e similares. Outros exemplos de biomoléculas incluem aquelas mencionadas nas patentes WO 2002/074791 e U.S. 5.451.660.

[021] Conforme usado aqui, o termo “partículas porosas de óxido metálico inorgânico” inclui partículas que consistem de materiais de óxido metálico inorgânico tendo poros intrapartículas ou poros interpartículas em casos onde partículas menores são aglomeradas para formar partículas maiores de óxidos metálicos inorgânicos que incluem, mas não se limitam a, sílica, alumina, zircônia ou a combinação das mesmas.

[022] Conforme usado aqui, o termo “funcionalizada”, conforme se refere à superfície das partículas de óxido inorgânico, significa partículas porosas de metal inorgânico que tiveram a superfície modificada pela reação com ao menos um composto funcional para alterar a seletividade de ao menos uma porção da superfície da partícula, incluindo a área superficial na porção externa das partículas, e/ou na área superficial dos poros internos. A superfície funcionalizada das partículas pode ser utilizada para formar uma fase ligada (covalentemente ou ionicamente), uma superfície revestida (por exemplo, C18 de fase reversa ligado), uma superfície polimerizada (por exemplo, troca iônica), uma superfície inerente (por exemplo, material híbrido inorgâ- nico/orgânico), ou similares. Por exemplo, partículas porosas de óxido inorgânico que reagem com octadeciltriclorossilano formam uma “fase reversa” pela ligação covalente do silano à superfície inorgânica (por exemplo, C4, C8, C18 etc.). Em um outro exemplo, a reação das partículas inorgânicas com aminopropiltrimetoxissilano, seguida da quaternização do grupo amino, forma uma “fase de troca aniônica.” Em um terceiro exemplo, uma fase ligada pode ser formada pela reação das partículas inorgânicas com aminopropiltrimetoxissilano, seguida da formação de uma amida com um cloreto ácido. Outras fases ligadas incluem diol, ciano, cátion, afinidade, quiral, amino, C18, interação hidrofílica (HILIC), interação hidrofóbica (HIC), modo misturado, por exclusão de tamanho etc. Como parte da fase ligada ou superfície funcionalizada, um li- gante pode ser usado para demonstrar interação específica com a molécula alvo ou biomolécula alvo (ou seja, ligada), como aquelas definidas na patente U.S. 4.895.806.

[023] Conforme usado aqui, o termo “polieletrólito” é definido como um polímero compreendendo unidades de repetição como (i) um cátion, (ii) um ânion, ou (iii) um grupo funcional de eletrólito que se associa ou dissocia com um próton em soluções aquosas para formar uma carga positiva ou negativa. Por exemplo, os polieletrólitos catiônicos adequados para uso na presente invenção incluem, mas não se limitam a, polietileno imina (PEI), polialil amina, polivinil piridina, cloreto de polidialil dimetil amônio (pDAD- MAC), e copolímeros contendo grupos funcionais similares. Os polieletrólitos aniônicos adequados para uso na presente invenção incluem, mas não se limitam a, ácidos polia- crílicos, ácidos polimetacrílicos, ácidos poliestirenossulfônicos, ácidos nucleicos, e copo- límeros contendo grupos funcionais similares (por exemplo, ácido poli(estireno-co-ma- leico, ácido poli(estirenossulfônico-ácido co-maleico))

[024] Conforme usado aqui, o termo “polietileno imina” é definido como um polímero compreendendo unidades de repetição de uma amina ligada a um espaça- dor -CH2CH2-, em que o polímero pode ser linear ou ramificado e pode conter grupos amino primários, secundários e/ou terciários.

[025] Conforme usado aqui, o termo “área superficial de partícula BET” é definido como uma área superficial de partícula conforme medida pelo método de ad- sorção de nitrogênio de Brunauer Emmet Teller.

[026] Conforme usado aqui, o termo “distribuições de diâmetro (tamanho) médio de poro” foram medidas por intrusão de mercúrio usando um Autopore® IV 9520, disponível junto à Micrometriics Instrument Corporation (Norcross, GA, EUA).

[027] Conforme usado aqui, o termo “distribuição de tamanho de poro” significa a abundância relativa de cada tamanho de poro em um volume representativo de partículas inorgânicas porosas.

[028] Conforme usado aqui, o termo “diâmetro médio de poro” é o Diâmetro Médio de Poro (PD50) definido como o ponto médio no qual 50% do volume de poro é contribuição de poros menores e 50% é contribuição de poros maiores.

[029] Conforme usado aqui, o termo “volumes de poro”, mencionado na presente invenção, representa volumes cumulativos da intrusão de mercúrio em poros com tamanho de 50 a 10.000 A.

[030] Conforme usado aqui, o termo “peso molecular” é definido como a massa molar de uma única molécula de um composto ou polímero em particular.

[031] Conforme usado aqui, o “valor de amplitude de distribuição de tamanho de poro 90” é calculado como [(PD90 — PD10)/PD50], em que PD10 é o diâmetro de poro em contribuição de volume de poro cumulativo de 10%, PD50 é o diâmetro de poro em contribuição de volume de poro cumulativo de 50%, e PD90 é o diâmetro de poro em contribuição de volume de poro cumulativo de 90%, todos com base nos dados de intrusão de mercúrio.

Partículas porosas

[032] Como discutido acima, as partículas porosas de óxido metálico inorgânico úteis para preparar os adsorventes da presente invenção possuem uma ampla distribuição de tamanho de poro conforme medida por um valor de amplitude de distribuição de tamanho de poro 90 de ao menos cerca de 1,0 (ou ao menos cerca de 2,0, ou ao menos cerca de 3,0, ou ao menos cerca de 4,0, ou ao menos cerca de 5,0, ou ao menos cerca de 6,0, ou ao menos cerca de 7,5, desejavelmente de cerca de 5,0 a cerca de 10,0, mais desejavelmente de cerca de 7,5 a cerca de 8,5 e, em algumas modalidades, cerca de 7,8). A ampla distribuição de tamanho de poro permite a formação de agentes de clarificação de adsorvente que fornece excepcional capacidade de ligação, seletividade de ligação, bem como ligação de uma ampla variedade de biomoléculas.

[033] Em geral, as partículas porosas de óxido metálico inorgânico têm uma distribuição de tamanho de poro de cerca de 30 a cerca de 5000 A.

[034] Vantajosamente, a ampla distribuição de tamanho de poro das partículas porosas de óxido metálico inorgânico usadas para formar os adsorventes da presente invenção permite capacidade de ligação controlada, seletividade de ligação, e ligação de uma ampla variedade de biomoléculas pela escolha (1) do material poli- mérico específico ligado às superfícies das partículas de óxido metálico, (2) da quantidade de material polimérico ligado às superfícies das partículas de óxido metálico, e/ou (3) do peso molecular do material polimérico ligado às superfícies das partículas de óxido metálico. Conforme mostrado e discutido na seção de exemplos abaixo, a ampla distribuição de tamanho de poro das partículas de óxido metálico utilizadas para formar os adsorventes da presente invenção fornece mais flexibilidade e capa-cidade de ligação em comparação a adsorventes conhecidos e comercialmente disponíveis.

[035] Tipicamente, as partículas porosas de óxido metálico úteis para preparar os adsorventes da invenção têm um tamanho médio de poro de ao menos cerca de 100 A. Em uma outra modalidade, as partículas inorgânicas porosas têm um tamanho médio de poro de ao menos cerca de 150 A (ou ao menos cerca de 200 A; ou ao menos cerca de 250, ou ao menos cerca de 300 A; ou ao menos cerca de 350 A; ou ao menos cerca de 400 A, ou ao menos cerca de 500 A; ou ao menos cerca de 600 A; ou ao menos cerca de 800 A. Em algumas modalidades, as partículas inorgânicas porosas têm um tamanho médio de poro de cerca de 100 A a cerca de 800 A. Em algumas modalidades, as partículas inorgânicas porosas têm um tamanho médio de poro de cerca de 150 A a cerca de 250 A. Em outras modalidades, as partículas inorgânicas porosas têm um tamanho médio de poro menor que 2000 A. Em outras modalidades, as partículas inorgânicas porosas têm um tamanho médio de poro menor que 1000 A.

[036] As partículas de óxido metálico têm tipicamente um tamanho de partícula, conforme medido por uma dimensão de partícula média, menor que 150 μm. As partículas porosas de óxido metálico inorgânico têm tipicamente uma dimensão de partícula média de cerca de 1 μm, mais tipicamente, menor que cerca de 100 μm. Em algumas modalidades, as partículas inorgânicas porosas têm uma dimensão de partícula média de cerca de 10 a cerca de 50 μm, mais desejavelmente, cerca de 30 μm.

[037] Tipicamente, as partículas de óxido metálico têm tipicamente um formato irregular, porém pode ter qualquer formato (por exemplo, esférico, elíptico etc.). Independente do formato, as partículas porosas de óxido metálico inorgânico têm tipicamente uma dimensão de partícula média conforme discutido acima.

[038] Em modalidades adicionais, as partículas porosas de óxido metálico inorgânico podem ter uma razão de aspecto de ao menos cerca de 1,0 conforme medida, por exemplo, usando técnicas de Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM). Conforme usado aqui, o termo “razão de aspecto” é utilizado para descrever a razão entre (i) a dimensão de partícula média das partículas inorgânicas porosas e (ii) a dimensão de partícula média em seção transversal das partículas inorgânicas porosas, em que a dimensão de partícula em seção transversal é substancialmente perpendicular à maior dimensão de partícula das partículas inorgânicas porosas. Em algumas modalidades da presente invenção, as partículas inorgânicas porosas têm uma razão de aspecto de ao menos cerca de 1,1 (ou ao menos cerca de 1,2, ou ao menos cerca de 1,3, ou ao menos cerca de 1,4). Tipicamente, as partículas inorgânicas porosas têm uma razão de aspecto de cerca de 1,0 a cerca de 1,5.

[039] O volume de poro das partículas porosas de óxido metálico inorgânico conforme medido por intrusão de mercúrio em poros com tamanho de 50 a 10.000 A. Em uma outra modalidade, as partículas porosas de óxido metálico inorgânico, conforme medidas por intrusão de mercúrio em poros com tamanho de 50 a 10.000 A, são de ao menos cerca de 0,25 cc/g a 0,50 cc/g. Em uma modalidade exemplificadora da presente invenção, as partículas inorgânicas porosas têm um volume de poro, conforme medido por intrusão de mercúrio em poros com tamanho de 50 a 10.000 A, de ao menos cerca de 1,0 cc/g; ao menos cerca de 1,50 ou ao menos cerca de 1,77 cc/g. Em uma outra modalidade exemplificadora da presente invenção, as partículas inorgânicas porosas têm um volume de poro, conforme medido por intrusão de mercúrio em poros com tamanho de 50 a 10.000 A, de cerca de 1,0 cc/g a cerca de 3,0 cc/g.

[040] A área superficial das partículas porosas de óxido metálico inorgânico também tem uma área superficial, conforme medida pelo método de adsorção de nitrogênio BET (isto é, o método de Brunauer Emmet Teller) de ao menos cerca de 100 m2/g, ou ao menos cerca de 300 m2/g, ou ao menos cerca de 500 m2/g. Em uma modalidade exemplificadora da presente invenção, as partículas porosas de óxido inorgânico têm uma área superficial BET de cerca de 100 m2/g a cerca de 1000 m2/g, ou de 600 m2/g a cerca de 800 m2/g. Em uma outra modalidade exemplificadora da presente invenção, as partículas porosas de óxido inorgânico têm uma área superficial BET de cerca de 700 m2/g.

[041] As partículas porosas de óxido metálico inorgânico úteis para preparar os adsorventes da invenção podem compreender uma variedade de materiais inorgânicos incluindo, mas não limitada a, sílica, alumina, zircônia, ou misturas das mesmas. Em uma modalidade desejada, as partículas de óxido metálico compreendem sílica. Quando as partículas de óxido metálico compreendem sílica, as partículas desejavelmente compreendem sílica tendo uma pureza de ao menos cerca de 93% em peso de SiO2, ou ao menos cerca de 93% em peso de SiO2, ao menos cerca de 94% em peso de SiO2, ao menos cerca de 95% em peso de SiO2, ao menos cerca de 96% em peso de SiO2, ao menos cerca de 97% em peso de SiO2, ou ao menos cerca de 98% em peso de SiO2, até 100% em peso de SiO2, com base no peso total da partícula.

Adsorventes

[042] De acordo com a presente invenção, o absorvente compreende partículas porosas de óxido metálico conforme descrito na presente invenção acima e um material polimérico ligado covalentemente às superfícies das ditas partículas de óxido metálico. Em uma modalidade, os adsorventes compreendem ao menos uma porção bifuncional estendendo-se a partir das ditas superfícies das ditas partículas de óxido metálico, sendo que ao menos cada dita porção bifuncional compreende (i) um ou mais grupos funcionais capazes de se ligar às ditas superfícies, e tanto (iia) o dito material polimérico, quanto (iib) um ou mais grupos reativos capazes de se ligar ao dito material polimérico.

[043] Em uma outra modalidade, os adsorventes compreendem ao menos uma porção bifuncional estendendo-se a partir das superfícies das ditas partículas de óxido metálico, sendo que ao menos cada dita porção bifuncional compreende (i) um ou mais grupos funcionais capazes de se ligar às ditas superfícies, e (iia) o dito material polimérico.

[044] Em ainda outra modalidade, os adsorventes compreendem adicionalmente ao menos uma porção bifuncional estendendo-se a partir das ditas superfícies das ditas partículas de óxido metálico, sendo que ao menos cada dita porção bifuncional compreende (i) um ou mais grupos funcionais capazes de se ligar às ditas superfícies, e (iib) um ou mais grupos reativos capazes de se ligar ao dito material polimérico.

[045] A parcela bifuncional adequada que se estende desde a superfície da dita partícula de óxido metálico compreende anéis epóxi que podem reagir com grupos amina das cadeias poliméricas dos polieletrólitos. Em uma modalidade, ao menos uma parcela bifuncional compreendendo o adsorvente compreende o produto da reação da superfície de óxido metálico com um epóxi silano. Em uma modalidade preferencial, o epóxi silano compreende (3-glicidoxipropil)-trimetoxissilano.

[046] Em uma modalidade da invenção, o material polimérico é ligado cova- lentemente à superfície das partículas de óxido metálico por meio de uma ligação covalente que consiste em um ou mais átomos selecionados do grupo que consiste em C, O, Si e N.

[047] Tipicamente, o material polimérico compreende um polieletrólito. O poliele- trólito pode ser catiônico ou aniônico. Os materiais de polieletrólito catiônico adequados compreendem polietileno imina, polialil amina, polivinil piridina, cloreto de polidialil dimetil amônio (pDADMAC), um copolímero contendo um ou mais grupos funcionais catiônicos ou de formação catiônica, ou combinações dos mesmos. O polieletrólito catiônico também pode compreender um produto de reação das ditas partículas de óxido metálico e uma solução aquosa de trimetoxissilil-polietileno imina. Em uma modalidade preferencial, o material polimérico compreende polietileno imina. Em uma modalidade ainda mais preferencial, a polietileno imina tem (i) um peso molecular ponderal médio, Mw, e (ii) um peso molecular numérico médio, Mn, sendo que cada um é menor que cerca de 5000. Em ainda uma modalidade mais preferencial, a polietileno imina tem (i) um peso molecular ponderal médio, Mw, e (ii) um peso molecular numérico médio, Mn, sendo que cada um varia de cerca de 500 a cerca de 2500. ou (i) um peso molecular ponderal médio, Mw, variando de cerca de 800 a cerca de 2000, e (ii) um peso molecular numérico médio, Mn, variando de cerca de 600 a cerca de 1800.

[048] Em uma modalidade, o material polimérico compreende uma polietileno imina que tem a estrutura:

antes de ser ligada covalentemente às ditas superfícies, e n é um número maior ou igual a 1.

[049] Os materiais de polieletrólito aniônico adequados compreendem ácido po- liacrílico, ácido polimetacrílico, ácido poliestirenossulfônico, ácido nucleico, um copolí- mero contendo um ou mais grupos funcionais aniônicos ou de formação aniônica ou combinações dos mesmos. Em uma modalidade preferencial, o material de polieletrólito aniô- nico compreende ácido poliacrílico, ácido polimetacrílico, ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade mais preferencial, o material de polieletrólito aniônico compreende um ácido poliacrílico ou um ácido polimetacrílico tendo um peso molecular ponderal médio, Mw, maior que cerca de 50.000. Em uma modalidade ainda mais preferencial, o ácido poliacrílico ou o ácido polimetacrílico tem um peso molecular ponderal médio, Mw, de cerca de 100.000 a cerca de 250.000.

[050] A quantidade de material polimérico presente no absorvente é qualquer quantidade adequada para fornecer interações de carga com produtos biológicos e, portanto, seletivamente se liga a esses produtos biológicos de carga oposta. Em uma modalidade, os materiais poliméricos compreendem uma quantidade tal que menos que 100% das ditas superfícies das partículas de óxido metálico estejam ligadas ao dito material polimérico. Em uma outra modalidade, o dito material polimérico está presente no adsorvente em uma quantidade que representa até cerca de 20,0% em peso dos ditos adsorventes com base em um peso total dos ditos adsorventes. Em outras modalidades, o material polimérico está presente em uma quantidade que representa de cerca de 1,0 a cerca de 15,0% em peso dos ditos adsorventes com base em um peso total dos ditos adsorventes.

[051] Em uma modalidade preferencial da invenção, as partículas porosas de óxido metálico compreendendo os adsorventes compreendem partículas de sílica.

Métodos de produção de adsorventes

[052] Os absorventes da invenção são geralmente preparados pelo contato das partículas de óxido metálico com um ou mais reagentes sob condições de reação que resultam na ligação covalente do material polimérico às superfícies das partículas de óxido metálico. A etapa de contato pode utilizar um solvente. Em uma modalidade, a etapa de contato utiliza uma mistura de reação isenta de solvente orgânico.

[053] Em uma modalidade da invenção, um ou mais reagentes compreendem ao menos um composto bifuncional compreendendo (i) um ou mais grupos funcionais capazes de ligar o composto às superfícies das partículas de óxido metálico, e tanto (iia) o material polimérico quanto (iib) um ou mais grupos reativos capazes de se ligar ao material polimérico.

[054] Os reagentes adequados compreendendo ao menos um composto bi- funcional compreendendo (i) um ou mais grupos funcionais capazes de ligar o composto às superfícies das partículas de óxido metálico, e (iia) o material polimérico incluem, mas não se limitam a, polietileno iminas.

[055] Os reagentes adequados compreendendo ao menos um composto bi- funcional compreendendo (i) um ou mais grupos funcionais capazes de ligar o composto às superfícies das partículas de óxido metálico, e (iib) um ou mais grupos reativos capazes de se ligar ao material polimérico, incluem, mas não se limitam a, ácidos poliacrílicos.

[056] Também faz parte do escopo da invenção selecionar um ou mais reagentes, de modo a produzir adsorventes tendo um grau desejado de afinidade por um ou mais compostos biológicos em particular por atração devido às cargas opostas. Por exemplo, a afinidade de DNA negativamente carregado por superfícies positivamente carregadas. A quantidade de cada um de um ou mais reagentes também pode ser escolhida de modo a formar adsorventes tendo um grau desejado de cobertura de superfície da partícula pelo material polimérico.

Uso de adsorventes

[057] O adsorvente de acordo com a presente invenção compreende superfície porosa de óxidos metálicos inorgânicos funcionalizada com polieletrólitos. Para obter a adsorção de uma maior quantidade de substâncias biológicas indesejáveis, as exigências das moléculas porosas são alto volume de poro (>1,0 cc/g) e alto valor de amplitude de distribuição de tamanho de poro 90 (>1,0). Se essas condições forem atendidas com a ligação do polieletrólito carregado tanto positivamente quanto negativamente, os materiais adsorventes podem ser usados de forma eficaz como adsor- ventes e agentes de clarificação. Em uma modalidade, os adsorventes funcionaliza- dos são utilizados como um agente de clarificação para bioprocessamento, em que os adsorventes compreendem: partículas de óxido metálico tendo uma ampla distribuição de tamanho de poro conforme medida por um valor de amplitude de distribuição de tamanho de poro 90 de ao menos cerca de 1,0; e material polimérico ligado covalentemente às superfícies das partículas de óxido metálico.

[058] O absorvente pode ser utilizado pelo contato do adsorvente poroso fun- cionalizado em um vaso de bioprocessamento contendo produtos biológicos indesejáveis obtidos durante um procedimento de bioprocessamento; permitir um tempo de incubação suficiente para permitir a adsorção dos produtos biológicos indesejáveis ao adsorvente ou formação de pélete celular e uma camada de sobrenadante; separação da mistura resultante através tanto de filtração quanto de decantação ou bombeamento da camada de sobrenadante e, a seguir, extração da substância biológica desejada tanto dos filtrados quanto do sobrenadante ou realizando etapas adicionais de purificação, incluindo filtração por profundidade e etapas de cromatografia a jusante.

[059] Em uma modalidade, os adsorventes de acordo com a presente invenção são adicionados a um vaso de bioprocessamento contendo uma ou mais biomoléculas selecionadas do grupo que consiste em uma proteína, um polissacarídeo, um lipídio, um ácido nucleico, um metabólito, uma célula de mamífero, restos de células de mamífero, um anticorpo, um peptídeo, DNA, RNA, uma endotoxina, um vírus, uma vacina, uma enzima, ou qualquer combinação das mesmas. Em outra modalidade, o vaso de bioproces- samento contêm ao menos um entre: células hospedeiras, restos de células, proteínas de célula hospedeira, ácidos nucleicos, cromatinas, anticorpos, vírus ou vacinas. Os ad- sorventes funcionalizados se ligam a uma ou mais biomoléculas que entram em contato com os adsorventes. Após a etapa de ligação na qual os adsorventes se ligam a uma ou mais biomoléculas que entram em contato com os adsorventes, os adsorventes ligados a uma ou mais biomoléculas são separados dos outros componentes do procedimento de bioprocessamento.

[060] Deve ficar entendido que, embora os adsorventes e métodos citados acima sejam descritos como “compreendendo” um ou mais componentes ou etapas, os adsorventes e métodos citados acima podem “compreender,” “consistir em,” ou “consistir essencialmente em” qualquer dos componentes ou etapas acima descritas dos adsorventes e métodos. Consequentemente, quando a presente invenção, ou uma parte dela, tiver sido descrita com um termo não limitado como “compreendendo”, deve ficar prontamente entendido (salvo indicação em contrário) que a descrição da presente invenção, ou de parte dela, também deve ser interpretada para descrever a presente invenção, ou uma parte dela, utilizando os termos “consistindo essencialmente em” ou “que consiste em” ou variações destes conforme discutido abaixo.

[061] Conforme usados aqui, os termos “compreende”, “compreendendo”, “inclui”, “incluindo”, “tem”, “tendo”, “contém”, “contendo”, “caracterizado por” ou qualquer outra variação destes, devem abranger uma inclusão não exclusiva, sujeita a qualquer limitação explicitamente indicada em contrário, dos componentes mencionados. Por exemplo, um adsorvente e/ou método que “compreende” uma lista de elementos (por exemplo, componentes ou etapas) não é necessariamente limitada a somente esses elementos (ou componentes ou etapas), mas pode incluir outros elementos (ou componentes ou etapas) não expressamente listados ou inerentes ao adsorvente e/ou método.

[062] Conforme usadas aqui, as frases de transição “consiste em” e “que consiste em” excluem qualquer elemento, etapa ou componente não especificado. Por exemplo, as frases “consiste em” ou “que consiste em” usadas em uma reivindicação limitariam a reivindicação aos componentes, materiais ou etapas especificamente mencionados na reivindicação, exceto para impurezas comumente associadas a elas (por exemplo, impurezas dentro de um determinado componente). Quando a frase “consiste em” ou “que consiste em” aparece em uma cláusula do corpo de uma reivindicação, em vez de imediatamente após o preâmbulo, a frase “consiste em” ou “que consiste em” limita somente os elementos (ou componentes ou etapas) definidos naquela cláusula; outros elementos (ou componentes) não são excluídos da reivindicação como um todo.

[063] Conforme usadas aqui, as frases de transição “consiste essencialmente em” e “consistindo essencialmente em” são usadas para definir um adsor- vente e/ou método que inclui materiais, etapas, recursos, componentes, ou elementos, além daqueles literalmente revelados, contanto que esses materiais, etapas, recursos, componentes, ou elementos adicionais não afetem materialmente a(s) ca- racterística(s) básica(s) e nova(s) da invenção reivindicada. O termo “consistindo essencialmente em” é o meio-termo entre “compreendendo” e “que consiste em”.

[064] Ainda, deve ser entendido que os adsorventes e/ou métodos descritos na presente invenção podem compreender, consistir essencialmente em ou consistir em qualquer dos componentes e recursos descritos na presente invenção, conforme mostrado nas figuras com ou sem qualquer ou quaisquer recursos não mostrados nas figuras. Em outras palavras, em algumas modalidades, os adsorventes e/ou métodos da presente invenção não possuem nenhum recurso adicional que não aqueles mostrados nas figuras, e tais recursos adicionais, não mostrados nas figuras, são especificamente excluídos dos adsorventes e/ou métodos. Em outras modalidades, os adsorventes e/ou métodos da presente invenção possuem um ou mais recursos adicionais que não são mostrados nas figuras.

[065] A presente invenção é ainda ilustrada pelos exemplos a seguir, os quais não devem ser interpretados em hipótese alguma como imposição de limitações dentro do seu escopo. Ao contrário, deve ser claramente compreendido que se pode recorrer a várias outras modalidades, modificações e equivalentes destas que, após a leitura da descrição na presente invenção, podem ser sugeridas aos versados na técnica sem que se afaste do espírito da presente invenção e/ou do escopo das reivindicações anexadas.

Exemplos

[066] Os tamanhos médios de partícula foram determinados por difusão de luz de laser usando um Malvern Mastersizer 2000, disponível junto à Malvern Instrument Ltd. (de acordo com ASTM B822-10). O tamanho de partícula é definido como o tamanho médio de partícula por distribuição de volume. As áreas superficiais BET foram obtidas a partir da análise de sorção de nitrogênio descrita na literatura. O tamanho médio de poro, o volume de poro e a distribuição de tamanho de poro foram calculados com base na intrusão de mercúrio em poros com tamanho de 35 a 10.000 A. O volume de poro é definido como volume cumulativo de poro na mesma faixa de tamanho de poro, e o tamanho médio de poro é determinado como o diâmetro (tamanho) de poro no qual 50% do volume de poro é contribuição de poros menores e 50% do volume de poro é contribuição de poros maiores. A amplitude 90 é definida como uma amplitude de tamanho de poro relativa e calculada como (PD90 - PD10)/PD50, em que PD10 é o diâmetro de poro em volume cumulativo de 10% de contribuição de poro e PD50 e PD90 são conforme definidos como 50% e 90% de volume cumulativo de contribuição de poros com base em dados de mercúrio, respectivamente.

1. Ligação de polietileno imina (PEI) à superfície catiônica

[067] Seis diferentes graus de sílica (A, B, C, D, E, F), disponíveis junto à W. R. Grace, foram usados nestes exemplos, e suas propriedades (Área superficial BET, Volume de poro, Amplitude de distribuição de tamanho de poro 90 e tamanho médio de poro PD50) são listadas na Tabela I abaixo: Tabela I

[068] O tamanho de partícula destas sílicas varia de 5 μm a 70 μm. A sílica B é uma sílica comercial com o nome comercial Syloid® W900, a sílica C é uma sílica comercial com o nome comercial Davisil® XWP 500, a sílica F é uma sílica comercial com nome comercial Trisyl®. Todas essas estão disponíveis junto à W. R. Grace & Co. A sílica G é uma amostra de sílica ligada à PEI comercialmente disponível (Polietileno imina em gel de sílica, pó, 40-200 mesh da Sigma-Aldrich Corporation). A sílica H na Tabela é uma terra diatomácea (pó, adequado para a maioria das filtrações, da Sigma-Aldrich Corporation) e tentou-se ligação com PEHA usando o mesmo procedimento das outras amostras.

[069] As sílicas A e B tinham as propriedades de volumes de poro maiores que 1,0 cc/g e valores de amplitude 90 maiores que 1,0.

[070] Nos exemplos, pentaetileno-hexamina (PEHA) foi usada, uma mistura de poliaminas de molécula pequena para representar PEI em nossos exemplos.

[071] O processo de ligação consistia em duas etapas: 1). A ligação de superfície com epóxi silano (3-glicidoxipropil-trimetoxissilano), e então 2). A reação de PEHA com grupos epóxi de superfície (ligação de grupos amino nucleofílicos ao anel epóxi) leva à ligação de amina com abertura do anel epóxi, formando β-amino álcoois (N. Azizi, M. R. Saidi, Org. Lett., 2005, 7, 3649-3651).

1A. Procedimento de ligação inicial

[072] As amostras de sílica modificadas foram preparadas pelo tratamento das partículas de gel de sílica expostas (secas em um forno a 120°C de um dia para o outro) com epóxi silano. Um balão com reentrâncias de fundo redondo de 1 L foi carregado com partículas de sílica (100 g) e, então, 10 g (10% p/p para sílica) de epóxi silano são adicionados por gotejamento dentro do balão em rotação. A mistura foi mantida em rotação em um evaporador rotativo de um dia para o outro (16 horas). Uma pequena porção (2 g) da amostra foi separada e lavada com 10 ml de acetona cinco vezes e seca em um forno de 70°C durante 20 horas. A amostra seca foi submetida a análise elementar do teor de carbono usando um equipamento LECO.

1B. Reação da PEI

[073] 20 g de sílica ligada foram pesados a partir da amostra obtida em 1A acima e colocados em um frasco de Erlenmeyer. 6 g de PEHA foram pesados em um béquer pequeno (30% p/p para sílica) e misturados com 100 g de água DI para dissolver PEHA para fornecer ~15% de massa fluida de sílica para a reação). A mistura foi bem agitada e deixada sedimentar em um banho de água (65°C durante 30 min). Após a reação, a sílica foi ainda diluída com água DI e filtrada. Então, a sílica foi embebida com 50 ml de HCl 0,5 M durante 20 a 30 minutos e filtrada. A sílica resultante foi lavada com água DI três vezes (3 x 100 ml) e seca em uma pequena amostra a 90°C de um dia para o outro. A amostra seca foi enviada para análise de % de C. O restante da amostra foi seco dentro da capela em condições ambiente antes da análise.

1C. Teste de capacidade de ligação da batelada

[074] Dois compostos modelo foram usados nestes exemplos: 1. Oligonucle- otídeos de DNA (ácido desoxirribonucleico de esperma de arenque da Sigma-Aldrich), menos que 50 pares de base, PM < 15000. 2. Albumina sérica bovina (BSA) (pó liofilizado, cristalizado, >98,0% da Sigma), PM ~ 66000.

[075] Método de teste: As capacidades de ligação foram realizadas usando solução de BSA (5 mg/ml) em um pH de 8,0 com tampão de Tris-HC1 20 mM, ou solução de DNA (2 mg/ml) em pH 3,45 com tampão de fosfato de sódio 10 mM. As amostras secas de sílica foram pesadas em frascos e, então, as soluções de proteína (a adsorção UV/Vis foi medida em 280 nm usando um espectrofotômetro Ge- nesys®10S Bio UV-Vis). Após 2 horas, os sobrenadantes foram coletados e as adsor- ções foram novamente medidas sob as mesmas condições. O percentual de queda de sinal de UV/Vis foi calculado (quanto maior a queda antes e depois da adsorção, maior a capacidade de ligação). Três medições de adsorção paralelas foram realizadas para uma amostra e as médias foram calculadas e reportadas.

[076] A tabela a seguir mostra os resultados da capacidade de ligação dos Exemplos 1 a 10:Tabela 2

[077] Conforme mencionado acima, os Exemplos 1 a 6 foram realizados pelo tratamento da sílica seca com epoxisilano e, então, seguidos pela reação dos intermediários de sílica com PEHA. Os valores de % de C, calculados subtraindo-se o % de C total do % de C da sílica ligada ao epóxi, são indicações da quantidade total de aminas que são ligadas a partir das reações. Para a Amostra 7 (sílica PEI comercial) (as medições de BET e Hg foram realizadas depois que os grupos de superfície da amostra foram queimados colocando-se as amostras em uma mufla a 460°C em ar de um dia para o outro), a ligação de DNA e BSA foi medida usando o mesmo método de medição. A terra diatomácea (Sílica H) do Exemplo 8 também foi ligada com PEHA usando o mesmo procedimento. Como mostrado, o Exemplo 8 tem um nível muito baixo de quantidade de PEHA ligada (devido à área superficial muito baixa) e a quantidade de DNA adsorvido.

[078] Os resultados mostrados acima indicam que, para obter uma alta quantidade de DNA e BSA adsorvidos, é necessário alto volume de poro e de amplitude 90. As amostras 1, 2 e 3 tinham tanto um volume de poro quanto amplitude 90 maiores que 1,0, e essas amostras demonstraram maior ligação tanto de DNA quanto de BSA. Todas as outras amostras demonstraram menor ligação. No Exemplo 9, devido à sua alta área superficial, a sílica A não ligada tinha alguma capacidade de ligação de DNA e BSA, porém a ligação foi muito baixa em comparação à PEHA ligada da Amostra 1.

[079] A Figura a seguir mostra a comparação em distribuições de tamanho de poro (a partir da porosimetria por intrusão de mercúrio) para a Sílica A e a Sílica G. Como observado, a Sílica A tem a distribuição de tamanho de poro mais ampla variando de 50 A até mais que 5000 A.

2. Ligação de sílica com polímeros aniônicos para ligação de proteínas básicas 2A. Preparação

[080] A preparação de sílica ligada de polímero aniônico foi realizada misturando-se a solução aquosa neutra de polímeros (neutralizada por base como hidróxido de amônio ou hidróxido de sódio) com sílica e, então, submetendo a mistura ao cozimento a 190°C durante 5 horas para forçar a formação de ligação do polímero e os grupos de superfície. As soluções de ácido poli(acrílico) ou ácido poli(metacrílico) comerciais (da Sigma-Aldrich Corporation) foram obtidas por dissolução (ou diluição caso o produto comercial fosse uma solução aquosa) do polímero em água DI e o pH da solução é ajustado em 7-8 com hidróxido de amônio (ou hidróxido de sódio). A concentração das soluções foi de cerca de 18%.

[081] 20 g de sílica (Sílica A) foram misturados com a solução polimérica contendo cerca de 10 g de polímero (em peso líquido). A mistura foi colocada em um recipiente de cerâmica que foi colocado em um forno dentro de uma capela bem ventilada. A mistura foi aquecida a 90°C até que nenhum líquido fosse observado e, então, submetida a cozimento a 190°C durante 5 horas. A mistura resultante foi no-vamente transformada em uma pasta aquosa com água DI e lavada com 5 x 200 ml de NaC1 10% e 1 x 200 ml de NaHCO3, seguida de 3 x 100 ml de água DI.

2B. Avaliação da ligação à proteína

[082] O procedimento foi similar ao procedimento descrito em 1C, exceto pelo fato de que lisozima (de clara de ovo de galinha, pó liofilizado, >90% de proteína, >40.000 unidades/mg de proteína da Sigma) foi usada neste teste, e a concentração da proteína foi de 25 mg/ml em fosfato de sódio 50 mM, pH 7,0. A quantidade de proteína adsorvida foi medida pela quantidade de perda de sinal após 2 horas de incubação em temperatura ambiente, de UV/Vis no comprimento de onda de 280 nm, e calculada pelo coeficiente de absorção de lisozima.

[083] A Tabela 3 a seguir mostra os resultados da ligação à proteína dos Exemplos 11 a 14 abaixo:Tabela 3.

[084] A Tabela 3 mostra que a maior ligação à lisozima está associada ao alto peso molecular do polímero. As amostras de polímero de baixo peso molecular tiveram ligação similar àquela da sílica de controle ligada a não polímero (Amostra 14).

[085] Embora a invenção tenha sido descrita com um número limitado de mo-dalidades, essas modalidades específicas não pretendem limitar o escopo da invenção conforme descrito de outra forma e reivindicado na presente invenção. Pode ficar evidente para os versados na técnica, ao revisarem as modalidades exemplificadoras da presente invenção, que outras modificações, equivalentes e variações são possíveis. Todas as partes e porcentagens nos exemplos, bem como no restante do relatório descritivo, são expressas em peso, exceto onde especificado em contrário. Adicionalmente, qualquer intervalo de números mencionado no relatório descritivo e nas reivindicações, tal como aquele que representa um conjunto particular de propriedades, unidades de medida, condições, estados físicos ou porcentagens, tem por objetivo incorporar literalmente e expressamente no presente documento, por referência ou de outro modo, qualquer valor que se enquadra em tal intervalo, inclusive qualquer subconjunto de números dentro de qualquer intervalo assim mencionado. Por exemplo, sempre que um intervalo numérico com um limite inferior, RL, e um limite superior, RU, é revelado, qualquer número R que se enquadre na faixa é especificamente revelado. Em particular, os números R a seguir, dentro do intervalo, são especificamente revelados: R = RL + k(RU - RL), em que k é uma variável que varia de 1% a 100% com um incremento de 1%, por exemplo, k é 1%, 2%, 3%, 4%, 5% ... 50%, 51%, 52% ... 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%. Além disso, qualquer intervalo numérico representado por quaisquer dois valores de R, conforme calculados acima, também é especificamente revelado. Quaisquer modificações da invenção, além daquelas mostradas e descritas na presente invenção, ficarão evidentes aos versados na técnica a partir da descrição acima e dos desenhos em anexo. Tais modificações são destinadas a fazer parte do escopo das reivindicações anexadas. Todas as publicações citadas na presente invenção são incorporadas, a título de referência, em sua totalidade.

Claims

1. Adsorventes CARACTERIZADOS pelo fato de que compreendem: partículas de óxido metálico tendo uma ampla distribuição de tamanho de poro conforme medida por um valor de amplitude de distribuição de tamanho de poro 90 maior que 2,5; e material polimérico ligado covalentemente às superfícies das ditas partículas de óxido metálico.

2. Adsorventes, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADOS pelo fato de que as ditas partículas de óxido metálico têm um tamanho médio de partícula menor que cerca de 150 μm.

3. Adsorventes, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADOS pelo fato de que as ditas partículas de óxido metálico têm um tamanho médio de poro menor que cerca de 2000 A.

4. Adsorventes, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADOS pelo fato de que as ditas partículas de óxido metálico têm uma distribuição de tamanho de poro de cerca de 30 a cerca de 5000 A.

5. Adsorventes, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADOS pelo fato de que as ditas partículas de óxido metálico têm uma área superficial de partícula BET de ao menos cerca de 100 m2/g até cerca de 1000 m2/g.

6. Adsorventes, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADOS pelo fato de que as ditas partículas de óxido metálico têm um volume de poro, conforme medido por intrusão de mercúrio, de cerca de 1,0 mL/g até cerca de 2,0 mL/g.

7. Adsorventes, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADOS pelo fato de que as ditas partículas de óxido metálico têm um valor de amplitude de distribuição de tamanho de poro 90 de cerca de 2,8 a cerca de 7,8.

8. Adsorventes, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADOS pelo fato de que compreendem adicionalmente ao menos uma porção bifuncional estendendo-se a partir das ditas superfícies das ditas partículas de óxido metálico, cada da dita ao menos uma porção bifuncional compreendendo (i) um ou mais grupos funcionais capazes de se ligar às ditas superfícies, e (iia) o dito material polimérico, ou (iib) um ou mais grupos reativos capazes de se ligar ao dito material polimérico.

9. Adsorventes, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADOS pelo fato de que a dita ao menos uma porção bifuncional compreende um epóxi silano.

10. Adsorventes, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADOS pelo fato de que a dita ao menos uma porção bifuncional compreende (3- glicidoxipropil)-trimetoxissilano.

11. Adsorventes, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADOS pelo fato de que o dito material polimérico é ligado covalentemente às ditas superfícies por meio de uma ligação covalente que consiste em um ou mais átomos selecionados do grupo que consiste em C, O, Si e N.

12. Adsorventes, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADOS pelo fato de que o dito material polimérico compreende um polieletrólito catiônico.

13. Adsorventes, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADOS pelo fato de que o dito polieletrólito catiônico compreende polietileno imina, polialil amina, polivinil piridina, cloreto de polidialil dimetil amônio (pDADMAC), ou um copolímero contendo um ou mais grupos funcionais catiônicos ou de formação catiônica ou o produto de reação das ditas partículas de óxido metálico e uma solução aquosa de trimetoxisilil-polietileno imina.

14. Adsorventes, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADOS pelo fato de que o dito polieletrólito catiônico compreende polietileno imina tendo (i) um peso molecular ponderal médio, Mw, e (ii) um peso molecular numérico médio, Mn, cada um dos quais é menor que cerca de 5000.

15. Adsorventes, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADOS pelo fato de que o dito polieletrólito catiônico compreende polietileno imina tendo uma estrutura:

16. Adsorventes, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADOS pelo fato de que o dito material polimérico compreende um polieletrólito aniônico.

17. Adsorventes, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADOS pelo fato de que o polieletrólito aniônico compreende ácido poliacrílico, ácido polimetacrílico, ácido poliestirenossulfônico, ácido nucleico, ou um copolímero contendo um ou mais grupos funcionais aniônicos ou de formação aniônica.

18. Adsorventes, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADOS pelo fato de que o dito material polimérico está presente em uma quantidade que representa até cerca de 20,0% em peso dos ditos adsorventes com base em um peso total dos ditos adsorventes.

19. Adsorventes, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADOS pelo fato de que menos que 100% das ditas superfícies são ligadas ao dito material polimérico.

20. Adsorventes, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADOS pelo fato de que as ditas partículas de óxido metálico compreendem partículas de sílica.

21. Adsorventes, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADOS pelo fato de que são ligados a um ou mais compostos biológicos específicos, em que os um ou mais compostos biológicos específicos compreendem uma proteína, um polissacarídeo, um lipídio, um ácido nucleico, um metabólito, uma célula de mamífero, restos de células de mamífero, um anticorpo, um peptídeo, DNA, RNA, uma endotoxina, um vírus, uma vacina, uma enzima, ou qualquer combinação dos mesmos.

22. Adsorventes CARACTERIZADOS pelo fato de que compreendem: partículas de óxido metálico tendo uma ampla distribuição de tamanho de poro conforme medida por um valor de amplitude de distribuição de tamanho de poro 90 maior que 2,0; e um polieletrólito catiônico ligado covalentemente às superfícies das ditas partículas de óxido metálico, em que o dito polieletrólito catiônico compreende polietileno imina, polialil amina, polivinil piridina, cloreto de polidialil dimetil amônio (pDADMAC), ou um copolímero contendo um ou mais grupos funcionais catiônicos ou de formação catiônica ou o produto de reação das ditas partículas de óxido metálico e uma solução aquosa de trimetoxisilil-polietileno imina.

23. Adsorventes, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADOS pelo fato de que as ditas partículas de óxido metálico compreendem partículas de sílica tendo (i) uma ampla distribuição de tamanho de poro conforme medida por um valor de amplitude de distribuição de tamanho de poro 90 de cerca de 2,8 a cerca de 7,8, (ii) uma área superficial de partícula BET de ao menos cerca de 100 m2/g até cerca de 1000 m2/g, e (iii) um volume de poro, conforme medido por intrusão de mercúrio, de cerca de 1,0 mL/g a cerca de 2,0 mL/g.

24. Adsorventes, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADOS pelo fato de que o dito polieletrólito catiônico compreende polietileno imina.

25. Adsorventes CARACTERIZADOS pelo fato de que compreendem: partículas de óxido metálico tendo uma ampla distribuição de tamanho de poro conforme medida por um valor de amplitude de distribuição de tamanho de poro 90 de cerca de 2,8 a cerca de 7,8; e um material polimérico ligado covalentemente às superfícies das ditas partículas de óxido metálico, o dito material polimérico compreendendo polietileno imina.

26. Adsorventes, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADOS pelo fato de que as ditas partículas de óxido metálico compreendem partículas de sílica tendo (i) uma área superficial de partícula BET de ao menos cerca de 100 m2/g até cerca de 1000 m2/g, e (ii) um volume de poro, conforme medido por intrusão de mercúrio, de cerca de 1,0 mL/g a cerca de 2,0 mL/g.

27. Método de produção dos adsorventes, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 26, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: contatar as partículas de óxido metálico tendo uma ampla distribuição de tamanho de poro conforme medida por um valor de amplitude de distribuição de tamanho de poro 90 (i) maior que 2,0 ou (ii) maior que 2,5 com um ou mais reagentes sob condições de reação que resultam no material polimérico ligado covalentemente às superfícies das partículas de óxido metálico, em que a dita etapa de contato utiliza uma mistura de reação isenta de solvente orgânico.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que os um ou mais reagentes compreendem ao menos um composto bifuncional compreendendo (i) um ou mais grupos funcionais capazes de ligar o composto às superfícies das partículas de óxido metálico, e (iia) o material polimérico, ou (iib) um ou mais grupos reativos capazes de se ligar ao material polimérico.

29. Uso dos adsorventes, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 26, CARACTERIZADO pelo fato de que é como um agente de clarificação para bioprocessamento, em que os adsorventes são adicionados a um vaso de bioprocessamento contendo uma ou mais biomoléculas, as uma ou mais biomoléculas compreendendo uma proteína, um polissacarídeo, um lipídio, um ácido nucleico, um metabólito, uma célula de mamífero, restos de células de mamífero, um anticorpo, um peptídeo, DNA, RNA, uma endotoxina, um vírus, uma vacina, uma enzima, ou qualquer combinação dos mesmos.