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WO2007065461A1 - Verfahren zur sorption von mindestens einem nukleinsäuremolekül unter verwendung säureaktivierter schichtsilicate - Google Patents

Verfahren zur sorption von mindestens einem nukleinsäuremolekül unter verwendung säureaktivierter schichtsilicate Download PDF

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Publication number
WO2007065461A1
WO2007065461A1 PCT/EP2005/013236 EP2005013236W WO2007065461A1 WO 2007065461 A1 WO2007065461 A1 WO 2007065461A1 EP 2005013236 W EP2005013236 W EP 2005013236W WO 2007065461 A1 WO2007065461 A1 WO 2007065461A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
acid molecule
layered silicate
layer
acid
Prior art date
Application number
PCT/EP2005/013236
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ulrich Sohling
Thomas Scheper
Cornelia Kasper
Kirstin Suck
Daniel Riechers
Original Assignee
Süd-Chemie AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Süd-Chemie AG filed Critical Süd-Chemie AG
Priority to US12/096,402 priority Critical patent/US20090221809A1/en
Priority to PCT/EP2005/013236 priority patent/WO2007065461A1/de
Priority to EP05819297A priority patent/EP1960519A1/de
Publication of WO2007065461A1 publication Critical patent/WO2007065461A1/de

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    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/42—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the development mode, e.g. by displacement or by elution
    • B01D15/424—Elution mode

Definitions

  • the invention relates to a method for the sorption of at least one nucleic acid molecule from a liquid medium using a layer which comprises at least one acid-activated layered silicate.
  • the method can be used in particular for the enrichment, depletion, removal, extraction or separation of nucleic acid molecules from or in liquid media.
  • Another field of application for such separation processes and the adsorbents used for this is the depletion of DNA in waste water, especially in production processes with genetically modified organisms, such as Bacteria or fungi.
  • adsorbents are already known in the prior art, in particular those based on silanized silicate particles (silica gel) or functionalized celluloses.
  • US Pat. No. 4,029,583 describes a chromatographic carrier material made of silica gel which is suitable for the separation of proteins, peptides and nucleic acids and which has a cavity diameter of up to 50 nm and on which a stationary phase with an anion or cation exchanger is formed by means of a silanizing reagent Groups are bound that interact with the substances to be separated.
  • the silanized silica gel is brought into contact with water, with the risk that the stationary phase polymerizes and closes the pores of the carrier material.
  • nucleic acid mixtures can be separated into their constituents with high resolution and at high throughput speed if a chromatographic support material is used in which the diameter of the cavities is one to twenty times the largest dimension of the nucleic acid to be isolated or the largest dimension of the largest of all nucleic acids contained in the mixture.
  • a chromatographic support material is used in which the diameter of the cavities is one to twenty times the largest dimension of the nucleic acid to be isolated or the largest dimension of the largest of all nucleic acids contained in the mixture.
  • a silanizing reagent which has a flexible chain group, which in turn is converted to the finished support material by reaction with a reagent which forms an anion or cation exchanger.
  • EP 0 496 822 (WO 91/05606, DE 393 50 98) describes a chromatographic support material whose cavities are one to twenty times the size of the largest dimension of the nucleic acids to be separated, which can be obtained by using a starting support material with a cavity size of 10 up to 1000 nm, a specific surface area of 5 to 800 m 2 / g and a grain size of 3 to 500 ⁇ m with a silanizing reagent, which is characterized in that the silanizing reagent has at least one reactive group already reacted with a primary or secondary hydroxyalkylamine or contains a reactive group which can be reacted with a hydroxyalkylamine, such as an epoxy group or halogen atoms, which is reacted with a hydroxyalkylamine in a further reaction step.
  • a disadvantage of the prior art sorption systems is that they are either relatively expensive or do not meet the requirements in terms of the binding capacity, the binding kinetics and / or the recovery rate of the absorbed nucleic acid (s). Due to the increasing importance of separating or purifying nucleic acids from different media, there is a constant need for improved sorbents for nucleic acids.
  • sorbents which comprise at least one acid-activated phyllosilicate can be used particularly advantageously to achieve this object.
  • Such acid-activated phyllosilicates show a surprisingly high binding capacity for nucleic acids "" * O """exceeds that of commercial adsorption systems of the prior art. Furthermore, they exhibit particularly rapid binding kinetics. It is also advantageous that the bound nucleic acid can be removed again virtually quantitatively from the sorbent.
  • the acid-activated layered silicate used according to the invention as a sorption agent can be used particularly advantageously for the sorption of at least one nucleic acid molecule from a liquid medium if it is present in a layer with a layer thickness of at least one millimeter.
  • the liquid medium with the at least one nucleic acid molecule can then be passed through the layer containing the at least one acid-activated layered silicate.
  • One aspect of the present invention thus relates to a method for the sorption of at least one nucleic acid molecule from a liquid medium, comprising the following steps: a. Providing a liquid medium containing at least one nucleic acid molecule;
  • step c Passing the liquid medium with the at least one nucleic acid molecule according to step a. through the layer according to step b. in order to sorb the at least one nucleic acid molecule in the layer.
  • the liquid medium with the at least one nucleic acid molecule is thus passed through the Layer containing the at least one acid activated
  • Layered silicate passed through. This passage can be done in any way. In many cases, the capillary forces or gravity will be sufficient to allow the liquid medium with the at least one nucleic acid molecule to flow through the layer with the acid-activated one
  • a pressure can also be applied to enable or accelerate the passage of the liquid medium through the layer, depending on the viscosity of the liquid medium containing the at least one nucleic acid molecule.
  • a vacuum or vacuum can be applied below the layer, so that the liquid medium with the at least one nucleic acid molecule through the layer with the acid-activated
  • Layer are sorbed with the acid-activated layered silicate.
  • the sorbents disclosed here are thus suitable both for separating nucleic acids and for enriching or enriching them from corresponding solutions / media in order to obtain or remove them.
  • the almost quantitative recovery rate when eluting with conventional, usually high-salt buffers shows that it is also possible to recover the bound nucleic acid.
  • Preferred elution buffers have a pH of 8 or more.
  • the areas of application for such sorbents are diverse. Without restricting this invention to the following examples, a few possible applications should be mentioned: For example, separation of nucleic acids from a multicomponent gene is conceivable. mix or the depletion of DNA from wastewater from biotechnological production residues with genetically modified organisms.
  • the sorbent and method according to the invention can also be used for all molecular biological, microbiological or biotechnological methods in connection with nucleic acids, in particular their enrichment or depletion, separation, transient or permanent immobilization or other utilization. Exemplary methods and procedures can be found in relevant textbooks such as Sambrook et al. , "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", CoId Spring Harbor Press 2001 and are familiar to the person skilled in the art.
  • the present method can also be used in the context of the chromatographic separation of nucleic acids. Nucleic acids are to be understood primarily as DNA and RNA species, including genomic DNA and cDNA and their fragments, mRNA, tRNA, rRNA and other nucleic acid derivatives of natural or synthetic origin of any length.
  • biomolecule is understood to be a molecule which has, as building blocks, nucleotides or nucleosides (nucleobases), amino acids, monosaccharides and / or fatty acids.
  • nucleic acid (molecule) also includes other biomolecules.
  • use for the sorption of nucleic acids is particularly preferred.
  • Layered silicates can be used all natural or synthetic layered silicates or mixtures thereof, which can be activated by an acid, ie in which Katio - - can be exchanged for protons in the intermediate layers. Two-layer and in particular three-layer silicates are preferred. Acid-activatable sheet silicates are familiar to the person skilled in the art and include, in particular, the smectic or montmorillonite-containing sheet silicates, such as bentonite.
  • both so-called nature-active and non-nature-active layered silicates can be used, in particular di- and trioctahedral layered silicates of the serpentine, kaolin and talc pyrophylite group, smectites, vermiculites, II-lite and chlorites as well as those of the sepiolite-palygorskite group, such as montmorillonite , Natronite, saponite and vermiculite or hectorite, beidellite, palygorskite as well as alternating storage minerals (mixed layer mineral). Mixtures of two or more of the above materials can of course also be used.
  • the layered silicate used according to the invention can also contain further constituents (including, for example, non-acid-activated layered silicates) which do not impair the intended use of the acid-activated clay, in particular its sorption capacity, or even have useful properties.
  • further constituents including, for example, non-acid-activated layered silicates
  • Layered silicates from the montmorillonite / beidellite series such as e.g. Montmorillonite, bentonite, natronite, saponite and hectorite. Bentonites are most preferred, since surprisingly particularly advantageous binding capacities and kinetics for nucleic acids are achieved here.
  • acid-activated phyllosilicates in particular can advantageously be used in the processes according to the invention which have an iron content, calculated as Fe 2 O 3 , based on the total amount of acid-activated phyllosilicate used, of less than 6% by weight. %, preferably less than 4% by weight, more preferably less than 3% by weight, in particular _ y - have less than 2.5 wt .-%. It was found that when using such an acid-activated layer silicate with a low iron content a particularly gentle and
  • the layer with the at least one acid-activated layered silicate has a layer thickness of more than 0.3 cm, preferably more than 0.5 cm.
  • Layer thickness will depend on the volume of the liquid medium with the at least one nucleic acid molecule and the concentration of the nucleic acids contained in the liquid medium. In many cases, however, the layer thickness will be between about 0.1 and 100 cm.
  • the exact preferred particle size is Oil packs are often influenced by the porosity of the frits used and in some cases can also be between 5 and 10 ⁇ m, determined on the basis of the dry sieve residue (as stated above).
  • the permeability of the layer with the acid-activated layered silicate is particularly favorable for the preferred aqueous or alcoholic media and at the same time good sorption of the nucleic acid molecules onto the. particulate acid-activated layered silicate is made possible.
  • the acid-activated layered silicate has a swellability of less than 15 ml / 2 g, in particular less than 10 ml / 2 g.
  • Such swellability of the acid-activated layered silicate makes it particularly easy to use layers suitable for sorption of nucleic acids, e.g. produce in the form of columns.
  • a method for determining the swellability (sediment volume) is given below in the method section.
  • weathering products of clays with a specific surface area of more than 200 m 2 / g, a pore volume of more than 0.5 ml / g and a cation exchange capacity of more than 35 meq / 100 g in acid-activated form have also proven to be useful .
  • raw clays for acid activation whose cation exchange capacity is above 40 meq / 100 g, preferably in the range from 45 to 85 meq / 100 g.
  • the specific BET surface area is particularly preferably in the range from 170 to 280 m 2 / g, in particular between 180 and 260 m 2 / g.
  • the pore volume is preferably in the range from 0.7 to 1.0 ml / 100 g, in particular in the range of 0.80 to 1.0 ml / 100g.
  • Acid activation of such raw clays can be carried out as specified herein.
  • Such clays are described, for example, in DE 103 56 894.8 by the same applicant, which in this regard is expressly incorporated by reference into the present description.
  • the two-layer and the three-layer layer silicates can advantageously be used in the layers for sorption of nucleic acids and other biomolecules even without acid activation.
  • the smectitic layered silicates such as bentonite are particularly preferred.
  • a non-activated layered silicate can be used instead of the acid-activated layered silicate, or a mixture of both as the sorbent according to the invention. Otherwise, the information given in relation to the method and the use of the sorbent apply accordingly in the present description.
  • the sorbent used in the layer according to the invention or the layer itself is based on at least one acid-activated layered silicate, ie at least 50% by weight, preferably at least 75% by weight, more preferably at least 90% by weight, in particular at least 95% by weight or even at least 98% by weight of the sorbent or layer according to the invention consist of one (or more) acid-activated layered silicate (s), as defined herein.
  • the sorbent according to the invention or the layer consists essentially or completely of at least one _ I 2 - acid activated layered silicate.
  • the sorbent used according to the invention can also be used together with other sorbents or other components which appear suitable to the person skilled in the art, for example in the context of the method according to the invention.
  • the acid-activated layered silicate has an average pore diameter, determined by the BJH method (DIN 66131), between approximately 2 nm and 25 nm, in particular between approximately 4 and approximately 10 nm.
  • the pore volume, determined by the CCl 4 method according to the method part, of pores up to 80 nm in diameter is between approximately 0.15 and 0.80 ml / g, in particular between approximately 0.2 and 0.7 ml / G.
  • the corresponding values for pores up to 25 nm in diameter are in the range between approximately 0.15 and 0.45 ml / g, in particular 0.18 to 0.40 ml / g.
  • the corresponding values for pores up to 14 nm are in the range between approximately 0.10 and 0.40 ml / g, in particular approximately 0.12 to 0.37 ml / g.
  • the pore volumes for pores between 14 and 25 nm in diameter can be, for example, between 0.02 and 0.3 ml / g.
  • the pore volume of pores with 25 to 80 nm can be in the same range, for example.
  • the porosimetry of the acid-activated layered silicates can also be influenced in a targeted manner via the conditions in the acid activation of the layered silicates, ie in particular the amount or concentration of the acid used, the temperature and the duration of the acid treatment. For example, a stronger acid activation with an increased amount of acid or at an elevated temperature over a longer period of time can result in a larger one - -
  • Porosity of the layered silicates are brought about, especially in the region of the smaller pores with a diameter of less than 50 nm, in particular less than 10 nm, determined by the CCl 4 method according to the method part.
  • the micropore volume of the layered silicate can be increased.
  • the cation exchange capacity is decreasing.
  • the sorption capacity of the acid-activated layered silicate or its absorption and desorption rate via acid activation in individual cases can be optimized on the basis of routine examination of a number of differently acid-activated layered silicates.
  • the pores / cavities in the sorbents according to the invention can be modified in the manner provided in accordance with EP 0 104 210 or US 4,029,583 (see above).
  • the acid-activated phyllosilicates used according to the invention are generally produced by:
  • Layered silicates treated with at least one acid are brought into contact with the acid (s).
  • the acid any method for the acid activation of phyllosilicates which is known to the person skilled in the art can be used here, including the methods described in WO 99/02256, US Pat. No. 5,008,226 and US Pat. No. 5,869,415, which are expressly incorporated by reference into the description.
  • any organic or inorganic acids or mixtures thereof can be used.
  • acid can be sprayed on using a so-called SMBE process (Surface Modified Bleaching Earth).
  • SMBE process Surface Modified Bleaching Earth
  • the activation of the layered silicate is thus carried out in the aqueous phase.
  • the acid is brought into contact with the layered silicate as an aqueous solution.
  • the procedure can be such that the layered silicate, which is preferably provided in the form of a powder, is first slurried in water. Then the acid (eg in concentrated form) is added.
  • the layered silicate can also be suspended directly in an aqueous solution of the acid, or the aqueous solution of the acid can be applied to the layered silicate.
  • the aqueous acid solution can, for example, be sprayed onto a preferably broken or powdered layered silicate, the amount of water preferably being chosen to be as small as possible and, for example, a concentrated acid or acid solution being used.
  • the amount of acid can preferably be selected between 1 and 10% by weight, particularly preferably between 2 and 6% by weight, of an acid, in particular a strong acid, for example a mineral acid such as sulfuric acid, based on the anhydrous layered silicate (atro). If necessary, excess water can be evaporated and the activated layered silicate can then be ground to the desired fineness. As already explained above, no washing step is required in this embodiment of the method according to the invention, but is possible.
  • the water content of the acid-activated layered silicate obtained is usually adjusted to a proportion of less than 20% by weight, preferably less than 15% by weight.
  • the acid itself can be chosen as desired. Both mineral acids and organic acids or mixtures of the above acids can be used - - be used. Conventional mineral acids can be used, such as hydrochloric acid, phosphoric acid or sulfuric acid, with sulfuric acid being preferred. Concentrated or diluted acids or acid solutions can be used. Solutions of, for example, citric acid or oxalic acid can be used as organic acids.
  • mineral acids and organic acids or mixtures of the above acids can be used - - be used. Conventional mineral acids can be used, such as hydrochloric acid, phosphoric acid or sulfuric acid, with sulfuric acid being preferred. Concentrated or diluted acids or acid solutions can be used. Solutions of, for example, citric acid or oxalic acid can be used as organic acids.
  • citric acid or oxalic acid can be used as organic acids.
  • Another preferred activation option is the boiling of the layered silicates in an acid, in particular hydrochloric or sulfuric acid. Different degrees of activation can be set here by the appropriate concentrations of acid and cooking times, and the pore volume distribution can be set in a targeted manner. Such activated
  • Layered silicates are often referred to as bleaching earths. After the materials have dried, they are ground using standard methods.
  • the "classic" activation which is preferable in the invention in many cases, is activated at temperatures of about 100 0 C to the boiling point (boiling point).
  • the SMBE process is usually carried out at room temperature, with elevated temperatures allowing better acid activations in individual cases.
  • the influence of temperature is far less with the SMBE process than with the "classic" activation (so-called HBPE process).
  • the dwell time (duration of acid activation) in the HBPE process is, for example, between about 8 hours, for example when using hydrochloric acid, and 12 to 15 hours, for example when using sulfuric acid.
  • the HBPE process attacks the layer structure, which results in areas with silica, in addition to structurally largely unchanged areas.
  • 3% by weight of H 2 SO 4 are added (100 + 3).
  • the analysis of the processed material then usually reveals acidity - - keep in the range of 0.4 to 1.0%, ie a large part of the acid is consumed (exchange of H + ions for other cations etc.). A small part may be consumed by the lime it contains.
  • the contact times with the acid are often around 15 minutes in the laboratory.
  • the layered silicate is activated in such a way that the cation exchange capacity (CEC) of the acid-activated layered silicate used is less than 50 meq / 100 g, in particular less than 40 meq / 100 g.
  • Activation is particularly preferably carried out by means of an at least 1 molar, in particular at least 2 molar acid solution at elevated temperature, in particular at more than 30 ° C., more preferably more than 60 ° C.
  • the layer silicates are advantageously activated an acid with a pKa value of less than 4, in particular less than 3, more preferably less than 2.5 is used.
  • strong mineral acids in particular hydrochloric acid, sulfuric acid or nitric acid or mixtures thereof, in particular in concentrated form, are preferably used.
  • the preferred amount of acid is more than 1% by weight, in particular more than 2% by weight, particularly preferably at least 3% by weight of acid, more preferably at least 4% by weight of acid, based on the amount of layered silicate to be activated (determined from Drying at 130 0 C).
  • the exchangeable (metal) cations are essentially completely replaced by protons by the acid activation of the layered silicate, ie more than 90%, in particular more than 95%, particularly more preferably more than 98%. This can be determined on the basis of the CEC and its ion proportions before and after acid activation.
  • the acid activation does not require that the excess acid and the salts formed during the activation are washed out. Rather, after the acid has been fed in, as is customary for acid activation, no washing step is carried out, but the treated layered silicate is dried and then, if necessary, ground to the desired particle size.
  • the sorbent used according to the invention can be used in the form of a powder, granulate or any shaped body.
  • the sorbents can be used in any form, including supported or immobilized forms.
  • use in the separation of different nucleic acid components on the basis of their molecular weight is also conceivable.
  • the application form of the adsorbents according to the invention is not limited to the examples given.
  • the layer used according to the invention with the at least one acid-activated layered silicate will be a layer in a column or cartridge, as is usually used for the passage of a liquid medium.
  • these can be chromatography columns, including gravity or centrifugation columns, solid phase chromatography, filter cartridges or membranes.
  • the grain or shaped body size of the acid-activated layered - - Licenses depend on the respective application. All grain sizes or agglomerate sizes are possible here.
  • the acid-activated layered silicate in powder form in particular with a D 5 ⁇ o value of 1 to 1,000 are used in particular from 5 to 500 microns in order.
  • Typical usable granules are in the range (D 50 , by volume) between 100 ⁇ m to 5,000 ⁇ m, in particular 200 to 2,000 ⁇ m particle size.
  • the above-mentioned dry sieve residues are particularly preferred for the layers or column packs used according to the invention.
  • it is advantageous to use moldings made from or with the acid-activated layered silicates for example in the case of chromatography columns, including gravity or centrifugation columns,
  • the sorbent used according to the invention can be in immobilized form.
  • the sorbent can be placed in a filter cartridge, a
  • HPLC cartridge or a comparable dosage form can be embedded. Embedding in gels, such as agarose gels or other gel-like or matrix-like structures, is also preferably possible. Such applications are often sold as part of so-called kits for the purification of nucleic acid molecules, such as, for example, the products from Quiagen, such as Quiagen genomic tip or the like.
  • the medium containing the nucleic acid molecules of interest is generally sent through a column or filter cartridge or the like containing the sorbent. It can then be washed with suitable buffers to remove adhering contaminants. Finally there follows an elution step to obtain the nucleic acid molecules of interest. _
  • the acid-activated layered silicate has a BET surface area (determined according to DIN 66131) of at least 50 to 800 m 2 / g, in particular at least 100 to 600 m 2 / g, particularly preferably of at least 130 to 500 m 2 / g g, on. Interaction with the nucleic acid is apparently facilitated by the high surface area, with the possibility of desorption surprisingly being retained.
  • the nucleic acids are DNA or RNA molecules in double-stranded or single-stranded form with one or more nucleotide units.
  • the method according to the invention is particularly advantageous in the case of media which contain oligonucleotides or nucleic acids with at least 10 bases (pairs), preferably with at least 100 bases (pairs), in particular at least 1000 bases (pairs).
  • the method according to the invention can also be used with nucleic acids between 1 and 10 bases (pairs) or with quite large nucleic acid molecules, such as plasmids or vectors with, for example, 1 to 50 kB or longer genomic or c-DNA fragments. Restriction-digested DNA and RNA fragments, synthetic or natural oligo- and polymers from nucleic acids, cosmids etc. are also included.
  • the chromatographic separation of biological macromolecules such as long-chain oligonucleotides, high-molecular nucleic acids, tRNA, 5S-rRNA, other rRNA species, single-stranded DNA, double-stranded DNA (eg plasmids or fragments of genomic DNA) etc. is of interest Surprisingly, an improved resolution can be achieved at a high throughput speed.
  • the carrier materials used can be used in a wide temperature range and are highly loadable.
  • the carrier material also shows high pressure resistance and a long service life.
  • nucleic acids such as high-purity plasmid DNA
  • the protocols known in the prior art for the highly pure purification of nucleic acids are often costly and / or time-consuming, are not suitable for use on a large scale or are not safe enough for therapeutic purposes, since toxic solvents or enzymes of animal origin, such as e.g. RNAse can be used.
  • a liquid medium is understood to mean any non-solid medium, including low or high viscosity and fluid media. It will preferably be polar media in which the biomolecules or nucleic acid molecules of interest are generally contained. For example, it can also be a colloidal solution, a suspension, a dispersion, a solution or an emulsion.
  • the particularly preferred aqueous or alcoholic media are understood to mean all media containing water or alcohol, including aqueous-alcoholic media.
  • all media are also included in which water is completely miscible or completely mixed with other solvents.
  • alcohols such as methanol, ethanol and C 3 - to Cio-alcohols with one or more OH groups or acids are to be mentioned.
  • Solvents that are completely miscible with water and their mixtures with water and alcohol are also conceivable. In particular acts - - In practice, these are aqueous, aqueous-alcoholic or alcoholic media.
  • Typical examples are aqueous or alcoholic buffer systems as used in science and industry, industrial or non-industrial waste water, process waste water, fermentation residues or media, media from medical or biological research, liquid or fluid contaminated sites and the like.
  • the sorbent according to the invention can contain further components in the layer as long as these do not unacceptably impair the adsorption of the nucleic acids and, if provided, their desorption.
  • additional components can include, but are not limited to, organic or inorganic binders (see below), other sorbents for biomolecules or other inorganic or organic substances of interest from the medium which are known to the person skilled in the art, or also carriers such as glass, plastic or ceramic materials or the like include.
  • the sorbent particles can be combined in the layer used to form larger agglomerates, granules or shaped bodies or applied to a carrier by means of a suitable binder.
  • the shape and size of such superordinate structures, which contain the primary sorbent or layered silicate particles, depends on the particular application desired. It is therefore possible to use all shapes and sizes familiar to the person skilled in the art and suitable in individual cases. For example, in many cases agglomerates with a diameter of more than 10 ⁇ m, in particular more than 50 ⁇ m, may be preferred. In the case of a bed for chromatography columns and the like, one can - -
  • Spherical shape of the agglomerates may be advantageous.
  • Possible carriers are, for example, calcium carbonate, plastics or ceramic materials.
  • any binder familiar to the person skilled in the art can also be used as long as the attachment or incorporation of the biomolecules in or onto the sorbent in the layer is not impaired too much or ensures the stability of the particle agglomerates or moldings required for the particular application is.
  • the following can be used as binders: agar-agar, alginates, chitosans, pectins, gelatins, lupine protein isolates or gluten.
  • the acid-activated phyllosilicates themselves already provide particularly favorable surfaces for the sorption of nucleic acids. According to the invention, there is therefore preferably no (additional) use or treatment of the layered silicate with cationic polymers and / or polycations (multivalent cations). Furthermore, according to the invention, preferably no other polymers (eg polysaccharides), polyelectrolytes, polyanions and / or complexing agents (for modifying the layered silicate) are used. According to a particularly preferred embodiment of the invention, in particular no cationic polymer such as an aminated polysaccharide polymer or polycation is used. In particular, according to a further preferred embodiment of the invention, the acid-activated layered silicate used in accordance with the invention is not modified or treated with a (cationic) polymer or a polycation. - -
  • the method according to the invention can be used both for enrichment (i.e. increasing the concentration of the desired nucleic acid molecule (s)) as well as for enrichment (i.e. reducing the concentration of the desired nucleic acid molecule (s)) or for separating several different nucleic acid molecules.
  • the layer containing the nucleic acid molecules can be disposed of in a further step.
  • Disposal can be carried out, for example, by thermal treatment to remove the layered silicate containing the biomolecules, the layered silicate being able to be disposed of after the thermal disintegration of the nucleic acid molecules.
  • nucleic acids it is possible to remove nucleic acids from media in a targeted manner.
  • This plays a major role in wastewater treatment, for example, since in most countries there are strict legal regulations for removing nucleic acids and other biomolecules from wastewater.
  • the depletion or removal of nucleic acid molecules from culture media can also be carried out.
  • an undesirable increase in viscosity can occur in bioreactors due to the high concentration of nucleic acid molecules contained in the medium, in particular high-molecular nucleic acids.
  • Efficient and biologically compatible removal of the disruptive nucleic acid molecules from the culture medium can take place here using the method according to the invention. - 4 -
  • nucleic acid molecules in many cases it is desirable to increase the concentration of nucleic acid molecules in a medium or to obtain these nucleic acid molecules as pure as possible.
  • the extraction or purification of desired nucleic acids from solutions is one of the standard procedures in biological and medical research.
  • the nucleic acid molecule can be desorbed or recovered from the sorbent in the layer, as a result of which the layer can also be used again, if appropriate after renewed acid activation of the layered silicate contained therein.
  • At least one washing step can take place.
  • a conventional aqueous or alcohol-containing buffer can be used to remove impurities that are deposited in the layer next to the nucleic acid molecules.
  • a non-limiting example of a suitable buffer is 50 ⁇ m citrate buffer (pH 4.0).
  • the acid-activated phyllosilicates have a high binding capacity for nucleic acid molecules over a very wide pH range.
  • liquid media with both acidic and basic pH for sorption of the nucleic acid molecules contained therein can thus be passed through the layer with the acid-activated layered silicate.
  • the liquid medium is passed through or the nucleic acid molecule is sorbed in the layer at a pH between about pH 3 and pH 8, in particular between about pH 6 and pH 8.
  • These conditions can be simple - 2 - can be provided by adjusting the pH of the liquid medium.
  • the advantageous binding of the nucleic acid molecules to the layer with the acid-activated layered silicate over a wide pH range can also be used to separate a nucleic acid molecule from protein constituents which are also contained in the liquid medium, for example.
  • the layer can be washed with a series of buffers adjusted to different pH values or a pH gradient buffer in order to detach and wash out proteins with different isoelectric points from the layer.
  • the pH value at which these protein impurities (as a rule depending on their isoelectric point) have the lowest sorption on the acid-activated layered silicate can be determined on the basis of preliminary tests.
  • Another aspect of the present invention relates to a layered composition
  • a layered composition comprising at least one acid-activated layered silicate and at least one nucleic acid molecule, the layer thickness being at least one millimeter.
  • such a layered composition can advantageously be used, for example, to separate, recover or purify a nucleic acid molecule from a liquid medium.
  • Another aspect of the present invention thus also relates to the use of an acid-activated
  • Another aspect relates to the use of such an acid-activated layered silicate as an inorganic vector for introducing biomolecules into cells or as a pharmaceutical composition, in particular as a reservoir for the storage and controlled release of biomolecules, preferably nucleic acids.
  • the sorbents according to the invention are also suitable for efficiently introducing these biomolecules into prokaryotic or eukaryotic cells.
  • biomolecules in particular nucleic acids, can be “packaged” in a particularly advantageous manner for introduction into cells.
  • the basic mechanism of such an introduction using the example of DNA-LDH nanohybrids is described, for example, in the reference Choy et al., Angew.
  • the specified (average) pore diameters, volumes and areas were determined using a fully automatic nitrogen adsorption measuring device (ASAP 2000, company Micretrics) according to the manufacturer's standard program (BET, BJH, t-plot and DFT).
  • the percentages of the proportion of certain pore sizes relate to the total pore volume of pores between 1.7 and 300 nm in diameter (BJH Adsorption Pore Distribution Report).
  • the desiccator connected to the graduated cold trap, manometer and vacuum pump is now evacuated to the boil of the contents. 10 ml of carbon tetrachloride are evaporated and collected in the cold trap.
  • the contents of the desiccator are then left to balance for 16 to 20 hours at room temperature, and then air is slowly let into the desiccator. After removing the desiccator lid, the weighing jar is closed immediately and weighed back on the analytical balance.
  • the suspension to be measured was adjusted to pH 7 in each case.
  • the zeta potential of the particles was determined using the Zetaphoremeter II from Particle Metrix according to the principle of microelectrophoresis.
  • the rate of migration of the particles was measured in a known electric field.
  • the particle movements that take place in a measuring cell are observed with the aid of a microscope.
  • the direction of migration provides information about the type of charge (positive or negative) and the particle velocity is directly proportional to the electrical interfacial charge of the particles or to the zeta potential.
  • the particle movements in the measuring cell are recorded by means of image analysis and after the measurement the particle paths covered are calculated and the resulting particle speed is determined.
  • the particle sizes (distribution) are determined using the Malvern method.
  • a Malvern Mastersizer was used according to the manufacturer's instructions.
  • Approx. 2- Put 3 g (1 coffee spoon) of the sample to be examined in the "dry powder feeder” and set the correct measuring range depending on the sample (the coarser the sample, the higher the weight).
  • a sample (approx. 1 knife tip) is placed in the water bath until the measuring range is reached (the coarser the higher the weight), and stirred for 5 minutes in the ultrasonic bath. The measurement is then carried out.
  • the NH 4 + bentonite is filtered off through a membrane filter and washed with deionized water (approx. 800 ml) until it is largely free of ions.
  • deionized water approximately 800 ml
  • Evidence of the freedom from ions in the wash water is carried out on NH 4 + ions with the sensitive Neßlers reagent.
  • the number of washes can vary between 30 minutes and 3 days depending on the key.
  • the washed NH 4 + clay is removed from the filter, h dried, milled at 110 0 C 2, screened (63 micron sieve), and again at 110 0 C for 2 hours dried.
  • the NH 4 + content of the clay is then determined by elemental analysis.
  • the CEC of the clay was determined in a conventional manner via the NH 4 + content of the NH 4 + clay, which was determined by elemental analysis of the N content.
  • the Vario EL 3 device from Elementar-Heraeus, Hanau, DE was used according to the manufacturer's instructions. The information is given in mval / 100 g clay (meq / 100g).
  • the swellability was determined as follows: A calibrated 100 ml measuring cylinder is washed with 100 ml dist. Filled with water. 2.0 g of the substance to be measured are slowly added to the water surface in portions of 0.1 to 0.2 g. After the material has dropped, the next quantum is given up. After the addition has ended, wait 1 hour and then read off the volume of the swollen substance in ml / 2 g.
  • This analysis is based on the total digestion of the layered silicate. After the solids have dissolved, the individual components are analyzed using conventional specific analysis methods, e.g. ICB, analyzed and quantified.
  • sample digestion about 10 g of the sample to be examined are finely ground and dried in a drying cabinet at 120 ° C. for 2 hours to constant weight. Approx. 1.4 g of the dried sample are placed in a platinum crucible and the sample weight is determined to an accuracy of 0.001 g. The sample is then mixed in the platinum crucible with 4 to 6 times the amount by weight of a mixture of sodium carbonate and potassium carbonate (1: 1). The mixture is provided with the platinum crucible into a Simon-Müller furnace and 2 - melted 850 C 0 - 3 hours at 800th The platinum crucible with the melt is taken out of the oven with a platinum tongs and left to cool.
  • the cooled melt is rinsed into a saucepan with a little distilled water and carefully mixed with concentrated hydrochloric acid. After the evolution of gas has ended, the solution is evaporated to dryness. The backlog will - - again in 20 ml conc. Hydrochloric acid was taken up and again evaporated to dryness. Evaporation with hydrochloric acid is repeated once more. The residue is mixed with approx. 5 - 10 ml hydrochloric acid
  • the SiO 2 is incinerated and weighed with the filter.
  • the filtrate collected in the silicate determination is transferred to a 500 ml volumetric flask and supplemented with distilled water up to the calibration mark.
  • the iron determination (or also for aluminum, calcium and magnesium) is then carried out from this solution using FAAS.
  • the location of the maximum excitation and emission wavelength of unbound Hoechst dye shifts from 340 nm and 510 nmi to 355 nm and 465 nm for dye bound to DNA .
  • the fluorescence intensity of a sample incubated with the fluorochrome can be determined by means of a fluorescence photometer. Since the wavelength of the excitation and emission maximum of the fluorochrome shifts when it is attached to the DNA, the bound dye can be selectively excited, thereby avoiding a strong background signal.
  • Hoechst 33342 stock solution 10 mg-ml-1 Hoechst 33342 in ddH2O Ix TNE buffer: 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0.2 M NaCl in 1000 ml ddH2O, pH 7.4)
  • the fluorescence intensity of the samples is measured by excitation at 360 nm and detection at 460 nm in the fluorescence photometer.
  • a raw clay with a montmorillonite content between 70 to 80% is slurried in water and purified by centrifugation.
  • the slurry obtained is then subjected to acid activation.
  • the concentrations are adjusted so that 56% bentonite is mixed with 44% 36% by weight hydrochloric acid and the mixture is boiled at a temperature of 95 to 99 ° C. for 8 hours.
  • the mixture is then washed with water until the residual chloride content is less than or equal to 5%, based on the solid.
  • 10 g of solid is boiled in 100 ml of distilled water and filtered through a pleated filter.
  • the filtrate is titrated with silver nitrate solution to determine the residual chloride content.
  • Finally drying takes place to a residual moisture content of 8 to 10% by weight.
  • the end product obtained has a weight of 430 to 520 g / l. Particularly preferred particle sizes can be set by sieving or additional grinding.
  • Adsorbent 1 25 4.13> 25 5.41
  • Adsorbent 1 was characterized according to the BJH method and BET method (DIN 66131) with regard to the average pore diameter and the BET surface area. The following values resulted:
  • the DNA concentration was determined photometrically. A wavelength of 260 nm was set for the measurement. In order to calibrate the method with the DNA salt used, a measurement was carried out using a series of concentrations. The calibration line obtained was used for the photometric determination of the DNA concentration in the adsorption experiments. - -
  • a herring sperm DNA solution with a concentration of 1 mg / ml, 2 mg / ml, 5.63 mg / ml and 9.9 mg / 1 was prepared and adjusted to pH 8 using 1OmM Tris / HCL and ImM EDTA . Then 0.1 g of the adsorbents were each mixed with 5 ml of the DNA solution and shaken for 1 hour at room temperature. The mixture was then centrifuged at 2500 rpm for 15 minutes and the supernatant was sterile filtered. Finally, the DNA concentration in the supernatant was measured and from this the binding capacity for DNA was calculated. The results are summarized in the following table and in the following graphic:
  • BK binding capacity - ⁇ converted into mg DNA based on 1 g of the adsorbents
  • the adsorbent type according to the invention has a significantly higher binding capacity than the comparison anion exchanger. Consequently _ _ Binding capacities of adsorbents that are commercially available according to the state of the art are reached or exceeded.
  • the adsorbents according to the invention have a much faster DNA binding because the corresponding amounts of DNA are already bound after 1 hour compared to the adsorption time of 16 hours for the comparison material.
  • Two further raw clays with a montmorillonite content between 70 to 80% were activated with acid analogously to the method described in Section 1.
  • the end products were dried to a residual moisture content of 8 to 10% by weight.
  • the end products obtained had bulk densities between 460 to 510 g / l.
  • Particularly preferred particle sizes can be set by sieving or additional grinding. Materials with dry sieve residues of more than 90% at 5, 10 and 35 ⁇ m were used.
  • Adsorbents A and B were characterized according to the BJH method and BET method (DIN 66131) with regard to the average pore diameter and the BET surface area. The following values resulted:
  • the materials adsorbent A and adsorbent B were packed in a chromatography column (15 ⁇ 50 mm with 10 ⁇ m PTEE frits) and loaded with DNA at different flow rates (DNA sodium salt from herring sperm, Sigma D6898).
  • the columns were packed in detail as follows: 1000 mg of the adsorbent (A or B) were slurried in a 15 ml falcon tube with 5 ml of 50 mM citrate buffer (pH 4.0) and into that with a stamp down completed column pipetted.
  • the second column end piece is put on, the column is connected to an FPLC system so that the mobile phase flows through it from bottom to top.
  • the FPLC pump is set to the flow rate for which the capacity of the adsorber is to be determined.
  • the movable plunger of the column is slowly hand-tightened during equilibration with 50 ml 50 mM citrate buffer (pH 4.0) and then relieved by a quarter turn of the thread.
  • the DNA content of the run was determined by fluorescence photometry in accordance with the method described in the method section by labeling with the fluorescent dye Hoechst 33342 (Sigma, Steinheim). The difference between the amounts of DNA in the run and the solution applied is assumed to be bound to the adsorber. If you divide this difference by the mass of the adsorber used, you get its load at the associated flow rate.
  • the measured values for adsor bens A and B are shown as mean values of a double determination in FIG.
  • the flow rate was converted with the area of the column cross section into the flow speed with the unit cm / h.
  • the capacities determined under the specified test conditions were both adsorbents above 12 ⁇ g / mg 1 for a flow rate of 16.8 cm / h.
  • the weakly basic anion exchanger (Genomic Tip) from Qiagen has a dynamic capacity of 0.2 ⁇ g-mg-1 for genomic DNA.
  • Elution buffer 50 mM Tris in ddH 2 O, pH 8.0
  • adsorbent A 1000 mg were charged in flow mode (see above) with 25 ml of a DNA solution with a concentration of 1 mg / ml in 50 mM citrate buffer pH 4.
  • the column was rinsed with 20 ml of 50 mM citrate buffer (pH 4).
  • the DNA was eluted with 30 ml of elution buffer.
  • the DNA content of the run, the wash and the elution fractions were determined. The results are shown in Table 10 below as the mean of a duplicate determination.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Sorption von mindestens einem Nukleinsäuremolekül aus einem flüssigen Medium, umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellen eines flüssigen Mediums, enthaltend mindestens ein Nukleinsäuremolekül; b) Bereitstellen einer Schicht enthaltend mindestens ein säureaktiviertes Schichtsilicat, wobei die Schicht für das flüssige Medium durchlässig ist und die Schichtdicke bei mindestens 1 mm liegt; c) Durchleiten des flüssigen Mediums mit dem mindestens einen Nukleinsäuremolekül gemäss Schritt (a) durch die Schicht gemäss Schritt (b), um das mindestens eine Nukleinsäuremolekül in der Schicht zu sorbieren.

Description

VERFAHREN ZUR SORPTION VON MINDESTENS EINEM
NUKLE INSÄUREMOLEKÜL UNTER VERWENDUNG
SÄUREAKTIVIERTER S CH I CHTS IL I CATE
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Sorption von mindestens einem Nukleinsäuremolekül aus einem flüssigen Medium unter Verwendung einer Schicht, die mindestens ein säureaktiviertes Schichtsilicat umfasst. Das Verfahren kann insbesondere zur Anreicherung, Abreicherung, Entfernung, Gewinnung oder Auftrennung von Nukleinsäuremolekülen aus bzw. in flüssigen Medien verwendet werden.
Die Abtrennung bzw. Aufreinigung von Biomolekülen hat eine immer weiter steigende technische und wissenschaftliche Bedeutung. So sind Trennprozesse zur Aufreinigung oder Abrei- _ ^ _ cherung von DNA einerseits für die Grundlagenforschung von Bedeutung, wobei genetisches Material z.B. isoliert und gereinigt werden muss, um genetisch modifizierte Organismen zu erzeugen. Dies wird derzeit aber auch immer mehr in indus- trieller Anwendung durchgeführt. So werden bereits einige in der Medizin verwendete Wirkstoffe gentechnisch hergestellt.
Ein weiteres Anwendungsfeld für solche Trennprozesse bzw. die dazu eingesetzten Adsorbentien stellt die Abreicherung von DNA in Abwässern dar, insbesondere bei Produktionsprozessen mit genetisch modifizierten Organismen, wie z.B. Bakterien oder Pilzen.
Im Stand der Technik sind bereits eine Vielzahl von Adsorbentien bekannt, insbesondere solche, die auf silanisierten Si- licatpartikeln (Kieselgel) oder funktionalisierten Cellulosen basieren.
In der US-A 4,029,583 wird ein zur Trennung von Proteinen, Peptiden und Nukleinsäuren geeignetes chromatographisches Trägermaterial aus Silicagel beschrieben, welches einen Hohlraumdurchmesser von bis zu 50 nm aufweist, und an das mittels eines Silanisierungsreagenzes eine stationäre Phase mit Anio- nen- oder Kationenaustauscher bildenden Gruppen gebunden ist, die mit den zu trennenden Substanzen in Wechselwirkung treten. Das silanisierte Silicagel wird mit Wasser in Berührung gebracht, wobei die Gefahr besteht, dass die stationäre Phase polymerisiert und die Poren des Trägermaterials schließt.
Gemäß der EP-B 0 104 210 können Nukleinsäuregemische mit hoher Auflösung und bei hoher Durchsatzgeschwindigkeit in ihre Bestandteile aufgetrennt werden, wenn ein chromatographisches Trägermaterial verwendet wird, bei dem der Durchmesser der Hohlräume das ein- bis zwanzigfache der größten Abmessung der jeweils zu isolierenden Nukleinsäure oder der größten Abmessung der größten aller im Gemisch enthaltenen Nukleinsäuren beträgt. Zur Herstellung des chromatographischen Trägermaterials wird dieses zunächst mit einem Silanisierungsreagenz umgesetzt, welches eine flexible Kettengruppe aufweist, die ihrerseits wiederum durch Reaktion mit einem Anionen- oder Kationenaustauscher bildenden Reagenz zum fertigen Trägermaterial umgewandelt wird.
Die EP 0 496 822 (WO 91/05606, DE 393 50 98) beschreibt ein chromatographisches Trägermaterial, dessen Hohlräume die ein- bis zwanzigfache Größe der größten Abmessung der zu trennenden Nukleinsäuren aufweisen, welches dadurch erhältlich ist, dass ein Ausgangsträgermaterial einer Hohlraumgröße von 10 bis 1000 nm, einer spezifischen Oberfläche von 5 bis 800 m2/g und einer Korngröße von 3 bis 500 μm mit einem Silanisierungsreagenz umgesetzt wird, das dadurch gekennzeichnet ist, dass das Silanisierungsreagenz mindestens eine bereits mit einem primären oder sekundären Hydroxyalkylamin umgesetzte reaktive Gruppe aufweist oder eine mit einem Hydroxyalkylamin umsetzbare reaktionsfähige Gruppe wie eine Epoxygruppe oder Halogenatome enthält, die in einer weiteren Reaktionsstufe mit einem Hydroxyalkylamin zur Reaktion gebracht wird.
Der Artikel von T. G. Lawson et al., "Separation of synthetic oligonucleotides on columns of microparticulate", Analytical Biochemistry (1983), 133(1), 85-93, beschreibt die Trennung von synthetischen Oligonukleotiden an Säulen basierend auf mikropartikulärem Siliciumdioxid oder Kieselgel, welches mit vernetztem Polyethylenimin beschichtet wurde. Die Beschich- tung wurde hierbei durch ein Durchpumpen der Polyethylenimin- lösung durch die Kieselgelsäule erzielt. Das in diesem Artikel beschriebene Verfahren lässt sich nur für Kleinmengen einsetzen. Weiterhin bezieht sich dieser Artikel nur auf mit Polyethylenimin modifizierte Kieselgelpartikel.
Weitere Adsorbentiensysteme sind in der US 2003003272, der EP 1 162 459 und der EP 281 390 beschrieben. Der Artikel "Nuk- leinsäureaufreinigung durch Kationen-Komplexierung" von Prof. Dr. Michael Lorenz, Molzym GmbH & Co. KG, Bremen in Laborwelt. Nr. 4/2003, Seite 40, beschreibt ein neues Verfahren zur Nuk- leinsäureaufreinigung mit speziellen Mini Spin Säulen. Lt. Angaben des Artikels beruhen diese auf einer Matrix, in der ein Tonmineral mit Sand vermischt wurde. Zur Art der Tonminerale ist nichts ausgesagt.
Nachteilig an den Sorptionssystemen des Standes der Technik ist, dass sie entweder verhältnismäßig teuer sind oder in der Bindungskapazität, der Bindungskinetik und/oder der Wiedergewinnungsrate der absorbierten Nukleinsäure (n) nicht den Anforderungen entsprechen. Aufgrund der steigenden Bedeutung der Abtrennung oder Aufreinigung von Nukleinsäuren aus unterschiedlichen Medien besteht ein ständiger Bedarf nach verbesserten Sorptionsmitteln für Nukleinsäuren.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein verbessertes Verfahren zur Sorption von Nukleinsäuren bereitzustellen, das effizient und einfach zur An- oder Abreiche- rung, zur Entfernung oder Gewinnung, oder zur Auftrennung von Nukleinsäuren eingesetzt werden kann und die Nachteile des Standes der Technik vermeidet.
Erstaunlicherweise wurde nun gefunden, dass sich zur Lösung dieser Aufgabe besonders vorteilhaft Sorptionsmittel verwenden lassen, die mindestens ein säureaktiviertes Schichtsili- cat umfassen. Solche säureaktivierten Schichtsilicate zeigen eine überraschend hohe Bindekapazität für Nukleinsäuren, die ""* O """ diejenige von kommerziellen Adsorptionssystemen des Standes der Technik noch übertrifft. Weiterhin zeigen sie eine besonders rasche Bindungskinetik. Vorteilhaft ist außerdem, dass sich die gebundene Nukleinsäure praktisch quantitativ wieder von dem Sorptionsmittel entfernen lässt.
Weiterhin wurde gefunden, dass sich das erfindungsgemäß als Sorptionsrαittel verwendete säureaktivierte Schichtsilicat besonders vorteilhaft zur Sorption von mindestens einem Nuk- leinsäuremolekül aus einem flüssigen Medium einsetzen lässt, wenn es in einer Schicht mit einer Schichtdicke von mindestens einem Millimeter vorliegt. Zur Sorption kann dann das flüssige Medium mit dem mindestens einen Nukleinsäuremolekül durch die Schicht, enthaltend das mindestens eine säureaktivierte Schichtsilicat, durchgeleitet werden.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Sorption von mindestens einem Nukleinsäuremolekül aus einem flüssigen Medium, umfassend die folgenden Schritte: a. Bereitstellen eines flüssigen Mediums, enthaltend mindestens ein Nukleinsäuremolekül;
b. Bereitstellen einer Schicht, enthaltend mindestens ein säureaktiviertes Schichtsilicat, wobei die Schicht für das flüssige Medium durchlässig ist und die Schichtdicke bei mindestens 1 mm liegt;
c. Durchleiten des flüssigen Mediums mit dem mindestens einen Nukleinsäuremolekül gemäß Schritt a. durch die Schicht gemäß Schritt b., um das mindestens eine Nukleinsäuremolekül in der Schicht zu sorbieren.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird somit das flüssige Medium mit dem mindestens einen Nukleinsäuremolekül durch die Schicht, enthaltend das mindestens eine säureaktivierte
Schichtsilicat, durchgeleitet. Dieses Durchleiten kann in beliebiger Weise erfolgen. In vielen Fällen werden die Kapillarkräfte oder die Schwerkraft ausreichen, um ein Durchströmen des flüssigen Mediums mit dem mindestens einen Nuklein- säuremolekül durch die Schicht mit dem säureaktivierten
Schichtsilicat zu bewerkstelligen. Gegebenenfalls kann auch ein Druck angelegt werden, um das Durchleiten des flüssigen Mediums durch die Schicht zu ermöglichen bzw. zu beschleunigen, je nach der Viskosität des flüssigen Mediums, enthaltend das mindestens eine Nukleinsäuremolekül . Genauso kann unterhalb der Schicht ein Unterdruck bzw. Vakuum angelegt werden, so dass das flüssige Medium mit dem mindestens einen Nukleinsäuremolekül durch die Schicht mit dem säureaktivierten
Schichtsilicat gesaugt wird. Dadurch kann auch die gewünschte Durchleitgeschwindigkeit in Abhängigkeit von dem verwendeten flüssigen Medium vom Fachmann leicht routinemäßig eingestellt werden. Während des Durchleiten des flüssigen Mediums mit dem mindestens einen Nukleinsäuremolekül kann dieses in der
Schicht mit dem säureaktivierten Schichtsilicat sorbiert werden.
Die hier offenbarten Sorptionsmittel sind somit sowohl geeignet Nukleinsäuren aufzutrennen, als auch aus entsprechenden Lösungen/Medien an- oder abzureichern, um sie zu gewinnen oder zu entfernen. Die fast quantitative Widerfindungsrate bei Elution mit üblichen, in der Regel hochsalzhaltigen Puffern zeigt, dass es auch möglich ist, die gebundene Nukleinsäure wieder zurückzugewinnen. Bevorzugte Elutionspuffer weisen einen pH-Wert von 8 oder mehr auf. Die Einsatzgebiete für solche Sorptionsmittel sind vielfältig. Ohne dass diese Erfindung auf die folgenden Beispiele beschränkt ist, sollen einige möglichen Anwendungen angeführt werden: Denkbar ist z.B. eine Abtrennung von Nukleinsäuren aus einem Vielstoffge- misch oder die Abreicherung von DNA aus Abwässern aus biotechnologischen Produktionsrückständen mit genetisch modifizierten Organismen. Allgemein kann das erfindungsgemäße Sorptionsmittel und Verfahren auch für alle molekularbiologischen, mikrobiologischen oder biotechnologischen Methoden im Zusammenhang mit Nukleinsäuren, insbesondere deren An- oder Abreicherung, Auftrennung, transienter oder permanenter Immobilisierung oder sonstiger Verwertung eingesetzt werden. Beispielhafte Methoden und Verfahren finden sich in einschlägigen Lehrbüchern wie Sambrook et al . , "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", CoId Spring Harbour Press 2001 und sind dem Fachmann geläufig. Auch im Rahmen der chromatographischen Auftrennung von Nukleinsäuren kann das vorliegende Verfahren eingesetzt werden. Unter Nukleinsäuren sind dabei in erster Linie DNA- und RNA-Spezies zu verstehen, einschließlich von genomischer DNA und cDNA sowie deren Fragmente, mRNA, tRNA, rRNA sowie weitere Nukleinsäurederivate natürlichen oder synthetischen Ursprungs mit beliebiger Länge.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist jedoch prinzipiell auch geeignet für die Abtrennung oder Aufreinigung von Proteinen und anderen Biomolekülen. Unter Biomolekül wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Molekül verstanden, das als Bausteine Nukleotide bzw. Nukleoside (Nukleobasen) , Aminosäuren, Monosaccharide und/oder Fettsäuren aufweist. Nach einem Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst die Bezugnahme in der Beschreibung auf "Nukleinsäure (molekül) " also auch andere Biomoleküle. Besonders bevorzugt ist jedoch die Verwendung zur Sorption von Nukleinsäuren.
Als Ausgangsstoffe für die erfindungsgemäß eingesetzten
Schichtsilicate können alle natürlichen oder synthetischen Schichtsilicate oder deren Mischungen verwendet werden, die sich durch eine Säure aktivieren lassen, d.h. in denen Katio- - - nen in den Zwischenschichten gegen Protonen ausgetauscht werden können. Bevorzugt sind Zwei-, und insbesondere Drei- schichtsilicate. Säureaktivierbare Schichtsilicate sind dem Fachmann geläufig und umfassen insbesondere die smektitischen oder montmorillonithaltigen Schichtsilicate, wie Bentonit. Allgemein können sowohl sogenannte naturaktive als auch nicht-naturaktive Schichtsilicate verwendet werden, insbesondere di- und trioktaedrische Schichtsilicate der Serpentin-, Kaolin- und Talkpyrophylitgruppe, Smektite, Vermiculite, II- lite und Chlorite sowie solche der Sepiolith-Palygorskit- Gruppe, wie z.B. Montmorillonit, Natronit, Saponit und Vermi- culit oder Hectorit, Beidellit, Palygorskit sowie Wechsellagerungsminerale (mixed layer mineral) . Natürlich können auch Gemische aus zwei oder mehreren der vorstehenden Materialien eingesetzt werden. Weiterhin kann das erfindungsgemäß eingesetzte Schichtsilicat auch noch weitere Bestandteile enthalten (auch z.B. nicht säureaktivierte Schichtsilicate), welche die vorgesehene Verwendung des säureaktivierten Tones, insbesondere dessen Sorptionsfähigkeit nicht beeinträchtigen oder sogar nützliche Eigenschaften aufweisen.
Besonders bevorzugt sind Schichtsilicate aus der Montmorillonit/Beidellit Reihe wie z.B. Montmorillonit, Bentonit, Natronit, Saponit und Hectorit. Am meisten bevorzugt sind Bentoni- te, da hier überraschend besonders vorteilhafte Bindungskapazitäten und -kinetiken für Nukleinsäuren erzielt werden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde auch gefunden, dass besonders solche säureaktivierten Schichtsilicate vorteilhaft in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, die einen Eisengehalt, berechnet als Fe2O3, bezogen auf die Gesamtmenge an eingesetztem säureaktiviertem Schichtsilicat, von weniger als 6 Gew.-%, bevorzugt weniger als 4 Gew.-%, weiter bevorzugt weniger als 3 Gew.-%, insbesondere _ y — weniger als 2,5 Gew.-%, aufweisen. So wurde festgestellt, dass bei Verwendung eines solchen säureaktivierten Schichtsi- licats mit geringem Eisengehalt eine besonders schonende und
,1 effiziente Sorption bzw. Aufreinigung der Nukleinsäuremolekü- , Ie möglich ist. Es wird angenommen, ohne dass die Erfindung auf die Annahme dieses theoretischen Mechanismus beschränkt wäre, dass durch die geringen Eisenverunreinigungen des säureaktivierten Schichtsilicats unerwünschte Redoxreaktionen, die durch Eisen katalysiert werden könnten, vermieden werden. Dadurch können schädliche Einflüsse solcher Redoxreaktionen auf die Nukleinsäuremoleküle bzw. andere Komponenten in dem flüssigen Medium minimiert bzw. vermieden werden. Ein Verfahren zur Bestimmung des Eisengehaltes im Rahmen der Silicat- analyse ist nachstehend im Methodenteil angegeben.
Nach einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform weist die Schicht mit dem mindestens einen säureaktivierten Schichtsilicat eine Schichtdicke von mehr als 0,3 cm, bevorzugt mehr als 0,5 cm, auf. Die im Einzelfall gewählte
Schichtdicke wird, wie dem Fachmann ersichtlich, von dem Volumen des flüssigen Mediums mit dem mindestens einen Nuklein- säuremolekül sowie der Konzentration der in dem flüssigen Medium enthaltenden Nukleinsäuren abhängen. In vielen Fällen wird jedoch die Schichtdicke zwischen etwa 0,1 und 100 cm liegen.
Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass sich säureaktivierte Schichtsilicate in Teilchenform mit einem Trockensiebrückstand von weniger als 10%, insbesondere weniger als 5%, weiter bevorzugt weniger als 1% bei 5 μm, insbesondere bei 10 μm, weiter bevorzugt bei 35 μm (unter Verwendung entsprechender Feinsiebe) , besonders vorteilhaft zur Herstellung einer Schicht bzw. Säulenpackung eignen. Die genaue bevorzugte Teilchengröße wird bei der Sau- lenpackung häufig auch durch die Porositäten der verwendeten Fritten beeinflusst werden und kann in einigen Fällen auch zwischen 5 und 10 μm, bestimmt anhand des Trockensiebrückstandes (wie vorstehend angegeben) liegen. Es hat sich gezeigt, dass bei einer solchen Teilchengröße die Durchlässigkeit der Schicht mit dem säureaktivierten Schichtsilicat für die bevorzugten wässrigen oder alkoholischen Medien besonders günstig ist und gleichzeitig eine gute Sorption der Nuklein- säuremoleküle an das . teilchenförmige säureaktivierte Schichtsilicat ermöglicht wird.
Nach einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform weist dabei das säureaktivierte Schichtsilicat eine Quellfähigkeit von weniger als 15 ml/2g, insbesondere weniger als 10 ml/2g auf. Weiter bevorzugt ist eine Quellfähigkeit von etwa 1 bis 15 ml/2g, insbesondere von 2 bis 10 ml/2g. Durch eine solche Quellfähigkeit des säureaktivierten Schichtsilicats lassen sich besonders gut zur Sorption von Nukleinsäuren geeignete Schichten, z.B. in Form von Säulen herstellen. Eine Methode zur Bestimmung der Quellfähigkeit (des Sedimentvolumens) ist nachstehend im Methodenteil angegeben.
Nach einer erfindungsgemäßen Ausführungsform haben sich auch Verwitterungsprodukte von Tonen mit einer spezifischen Oberfläche von mehr als 200 m2/g, einem Porenvolumen von mehr als 0,5 ml/g und einer Kationenaustauschfähigkeit von mehr als 35 meq/100g in säureaktivierter Form als brauchbar erwiesen.
Besonders bevorzugt werden nach dieser speziellen Ausführungsform zur Säureaktivierung Rohtone, deren Kationen-aus- tauschfähigkeit über 40 meq/100g, vorzugsweise im Bereich von 45 bis 85 meq/lOOg liegen. Die spezifische BET-Oberfläche liegt besonders bevorzugt im Bereich von 170 bis 280 m2/g, insbesondere zwischen 180 und 260 m2/g. Das Porenvolumen liegt vorzugsweise im Bereich von 0,7 bis 1,0 ml/100g, insbesondere im Bereich von 0,80 bis 1,0 ml/100g. Die Säureaktivierung solcher Rohtone kann wie hierin näher spezifiziert durchgeführt werden. Solche Tone sind beispielsweise in der DE 103 56 894.8 der gleichen Anmelderin beschrieben, die diesbezüglich ausdrücklich durch Bezugnahme in die vorliegende Be-• Schreibung aufgenommen wird.
Es wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch gefunden, dass insbesondere die zweischichtigen und die dreischichtigen Schichtsilicate bereits ohne Säureaktivierung vorteilhaft in den Schichten zur Sorption von Nukleinsäuren und anderen Biomolekülen verwendet werden können. Besonders bevorzugt sind dabei die smektitischen Schichtsilicate (s.o.) wie Bentonit. Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann also ein nicht aktiviertes Schichtsilicat anstelle des säureaktivierten Schichtsilicats, oder eine Mischung aus beiden als erfindungsgemäßes Sorptionsmittel eingesetzt werden. Ansonsten gelten die in Bezug auf das Verfahren und die Verwendung des Sorptionsmittels genannten Angaben in der vorliegenden Beschreibung entsprechend.
Nach einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform basiert das in der Schicht erfindungsgemäß eingesetzte Sorptionsmittel oder die Schicht selbst jedoch auf mindestens einem säureaktivierten Schichtsilicat, d.h. mindestens 50 Gew.-%, vorzugsweise mindestens 75 Gew.-%, weiter bevorzugt mindestens 90 Gew.-%, insbesondere mindestens 95 Gew.-% oder sogar mindestens 98 Gew.-% des erfindungsgemäßen Sorptionsmittels bzw. der Schicht bestehen aus einem (oder mehreren) säureaktivierten Schichtsilicat (en) , wie hierin definiert. Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird kein Silica oder Silica- gel verwendet. Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht das erfindungsgemäße Sorptionsmittel bzw. die Schicht im Wesentlichen oder vollständig aus mindestens einem _ I2 - säureaktivierten Schichtsilicat . Das erfindungsgemäß eingesetzte Sorptionsmittel kann jedoch auch mit anderen dem Fachmann geeignet erscheinenden Sorptionsmitteln oder weiteren Komponenten zusammen in der Schicht eingesetzt werden, beispielsweise im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß Anspruch 1.
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Nach einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform weist das säureaktivierte Schichtsilicat einen durchschnittlichen Porendurchmesser, bestimmt nach der BJH-Methode (DIN 66131) , zwischen etwa 2 nm und 25 nm, insbesondere zwischen etwa 4 und etwa 10 nm auf.
Nach einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform liegt das Porenvolumen, bestimmt nach der CCl4-Methode gemäß Methodenteil, von Poren bis 80 nm Durchmesser zwischen etwa 0,15 und 0,80 ml/g, insbesondere zwischen etwa 0,2 und 0,7 ml/g. Die entsprechenden Werte für Poren bis zu 25 nm Durchmesser liegen im Bereich zwischen etwa 0,15 und 0,45 ml/g, insbesondere 0,18 bis 0,40 ml/g. Die entsprechenden Werte für Poren bis zu 14 nm liegen im Bereich zwischen etwa 0,10 und 0,40 ml/g, insbesondere etwa 0,12 bis 0,37 ml/g. Die Porenvolumina für Poren zwischen 14 und 25 nm Durchmesser können beispielsweise zwischen 0,02 und 0,3 ml/g liegen. Das Porenvolumen von Poren mit 25 bis 80 nm kann beispielsweise im gleichen Bereich liegen.
Über die Bedingungen bei der Säureaktivierung der Schichtsilica- te, d.h. insbesondere die Menge bzw. Konzentration der eingesetzten Säure, der Temperatur und der Dauer der Säurebehandlung, kann auch die Porosimetrie der säureaktivierten Schichtsilicate gezielt beeinflusst werden kann. So kann z.B. durch eine stärkere Säureaktivierung mit einer erhöhten Säuremenge oder bei einer erhöhten Temperatur über eine längere Zeitdauer eine größere - -
Porosität der Schichtsilicate bewirkt werden, vor allem im Bereich der kleineren Poren mit einem Durchmesser von weniger als 50 nm, insbesondere weniger als 10 nm, bestimmt nach der CCl4- Methode gemäß Methodenteil. So kann durch eine Erhöhung der zur Säureaktivierung verwendeten Säuremenge das Mikroporenvolumen des Schichtsilicats gesteigert werden. Gleichzeitig nimmt die Kationenaustauschkapazität ab. Somit kann für die jeweils interessierende Nukleinsäurespezies die Sorptionsfähigkeit des säureaktivierten Schichtsilicats bzw. dessen Ab- und Desorptionsra- te über die Säureaktivierung im Einzelfall, anhand routinemäßiger Untersuchung einer Reihe unterschiedlich säureaktivierter Schichtsilicate, optimiert werden. Beispielsweise können über die Säureaktivierung die Poren/Hohlräume in den erfindungsgemäßen Sorptionsmitteln in der gemäß EP 0 104 210 oder US 4,029,583 (s.o.) vorgesehenen Weise modifiziert werden.
Die erfindungsgemäß eingesetzten säureaktivierten Schichtsilicate werden allgemein dadurch hergestellt, dass man
Schichtsilicate mit mindestens einer Säure behandelt. Dazu werden die Schichtsilicate mit der (den) Säure (n) in Kontakt gebracht. Im Prinzip kann dabei jedes dem Fachmann geläufige Verfahren zur Säureaktivierung von Schichtsilicaten verwendet werden, einschließlich der in der WO 99/02256, der US- 5,008,226 und der US-5,869,415 beschriebenen Verfahren, die insoweit ausdrücklich durch Bezugnahme in die Beschreibung aufgenommen werden. Es können allgemein beliebige organische oder anorganische Säuren oder deren Gemische verwendet werden. Beispielsweise kann ein Aufsprühen von Säure nach einem sogenannten SMBE Prozess (Surface Modified Bleaching Earth) erfolgen. Hier findet die Aktivierung an der Oberfläche der Schichtsilicate statt, ohne dass in einer Lösung bzw. Dispersion gearbeitet wird. Bei einer ersten Ausführungsform wird somit die Aktivierung des Schichtsilicats in wässriger Phase durchgeführt. Dazu wird die Säure als wässrige Lösung mit dem Schichtsilicat in Kontakt gebracht. Es kann dabei so vorgegangen werden, dass zunächst das Schichtsilicat, welches vorzugsweise in Form eines Pulvers bereitgestellt wird, in Wasser aufgeschlämmt wird. Anschließend wird die Säure (z.B. in konzentrierter Form) zugegeben. Das Schichtsilicat kann jedoch auch direkt in einer wässrigen Lösung der Säure aufgeschlämmt werden, oder die wässrige Lösung der Säure auf das Schichtsilicat aufgegeben werden. Nach einer vorteilhaften Ausführungsform kann die wässrige Säurelösung beispielsweise auf ein vorzugsweise gebrochenes oder pulverförmiges Schichtsilicat aufgesprüht werden, wobei die Wassermenge bevorzugt möglichst gering gewählt wird und z.B. eine konzentrierte Säure bzw. Säurelösung eingesetzt wird. Die Säuremenge kann vorzugsweise zwischen 1 und 10 Gew.-%, besonders bevorzugt zwischen 2 und 6 Gew.-% einer Säure, insbesondere einer starken Säure, z.B. einer Mineralsäure wie Schwefelsäure, bezogen auf das wasserfreie Schichtsilicat (atro) , gewählt werden. Soweit erforderlich, kann überschüssiges Wasser abgedampft und das aktivierte Schichtsilicat dann bis zur gewünschten Feinheit gemahlen werden. Wie bereits oben erläutert, ist auch bei dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kein Waschschritt erforderlich, aber möglich. Nach Aufgabe der wässrigen Lösung der Säure wird lediglich, soweit erforderlich, bis zum Erreichen des gewünschten Feuchtigkeitsgehalts getrocknet. Meist wird der Wassergehalt des erhaltenen säureaktivierten Schichtsilicats auf einen Anteil von weniger als 20 Gew.-%, bevorzugt weniger als 15 Gew.-%, eingestellt.
Für die oben beschriebene Aktivierung mit einer wässrigen Lösung einer Säure bzw. einer konzentrierten Säure kann die Säure an sich beliebig gewählt werden. Es können sowohl Mineralsäuren, als auch organische Säuren oder Gemische der vorstehenden Säuren - - verwendet werden. Es können übliche Mineralsäuren verwendet werden, wie Salzsäure, Phosphorsäure oder Schwefelsäure, wobei Schwefelsäure bevorzugt ist. Es können konzentrierte oder verdünnte Säuren bzw. Säurelösungen verwendet werden. Als organische Säuren können Lösungen von z.B. Citronensäure oder Oxalsäure verwendet werden. |
Eine weitere bevorzugte Aktivierungsmöglichkeit stellt das Kochen der Schichtsilicate in einer Säure, insbesondere Salzoder Schwefelsäure, dar. Hierbei lassen sich durch die geeigneten Konzentrationen an Säure und Kochzeiten unterschiedliche Aktivierungsgrade einstellen und die Porenvolumenvertei- lung lässt sich gezielt einstellen. Solche aktivierten
Schichtsilicate werden häufig auch als Bleicherden bezeichnet. Nach dem Trocknen der Materialien werden diese nach gängigen Verfahren gemahlen.
Bei der "klassischen" Aktivierung, die erfindungsgemäß in vielen Fällen bevorzugt wird, wird bei Temperaturen um etwa 1000C bis zum Kochpunkt (Siedepunkt) aktiviert. Demgegenüber wird bei dem SMBE-Verfahren üblicherweise bei Raumtemperatur gearbeitet, wobei erhöhte Temperaturen in Einzelfällen bessere Säureaktivierungen ermöglichen. Der Einfluss der Temperatur ist jedoch beim SMBE-Verfahren weit geringer als bei der "klassischen" Aktivierung (sogenanntes HBPE-Verfahren) . Die Verweilzeit (Dauer der Säureaktivierung) liegt beim HBPE- Verfahren z.B. zwischen ca. 8 Stunden, z.B. bei Verwendung von Salzsäure, und 12 bis 15 Stunden z.B. bei Verwendung von Schwefelsäure. Im Unterschied zum SMBE-Verfahren wird beim HBPE-Verfahren die Schichtstruktur angegriffen, woraus Bereiche mit Kieselsäure resultieren, neben strukturell weitgehend unveränderten Arealen. Beim SMBE-Verfahren werden beispielsweise 3 Gew.-% H2SO4 aufgegeben (100 + 3). Die Analyse des aufgearbeiteten Materials ergibt dann üblicherweise Säurege- - - halte im Bereich von 0,4 bis 1,0%, d.h. ein Großteil der Säure wird verbraucht (Austausch H+-Ionen gegen andere Kationen etc.). Ein geringer Teil wird gegebenenfalls durch enthaltenen Kalk verbraucht. Beim SMBE-Verfahren liegen die Kontaktzeiten mit der Säure labormäßig häufig bei etwa 15 Minuten.
Es wurde gefunden, dass je nach verwendetem Schichtsilicat eine Aktivierung mit geringen Säuremengen bereits ausreichen kann, um überraschend gute Sorptionsmittel zu erhalten.
Nach einer besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungs- form wird das Schichtsilicat in einer Weise aktiviert, dass die Kationenaustauschkapazität (Cation Exchange Capacity, CEC) des eingesetzten säureaktivierten Schichtsilicats bei weniger als 50 meq/100 g, insbesondere bei weniger als 40 meq/ 100 g liegt. Besonders bevorzugt erfolgt dabei die Aktivierung mittels einer mindestens 1 molaren, insbesondere mindestens 2 molaren Säurelösung bei erhöhter Temperatur, insbesondere bei mehr als 300C, weiter bevorzugt mehr als 600C. Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird zur vorteilhaften Aktivierung der Schicht- silicate eine Säure mit einem pKs-Wert von weniger als 4, insbesondere weniger als 3, weiter bevorzugt weniger als 2,5 eingesetzt. Bevorzugt werden z.B. starke mineralische Säuren, insbesondere Salzsäure, Schwefelsäure oder Salpetersäure bzw. deren Mischungen, insbesondere in konzentrierter Form eingesetzt. Die bevorzugte Säuremenge liegt bei mehr als 1 Gew.-%, insbesondere mehr als 2 Gew.-%, besonders bevorzugt mindestens 3 Gew.-% Säure, weiter bevorzugt mindestens 4 Gew.-% Säure bezogen auf die zu aktivierende Schichtsilicatmenge (bestimmt nach Trocknung bei 1300C) . Nach einer besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform werden durch die Säureaktivierung des Schichtsilicats die austauschbaren (Metall-) Kationen (Zwischenschicht- Kationen) im wesentlichen vollständig gegen Protonen ausgetauscht, d.h. zu mehr als 90%, insbesondere mehr als 95%, beson- ders bevorzugt mehr als 98%. Dies kann anhand der CEC und deren Ionenanteilen vor bzw. nach der Säureaktivierung bestimmt werden.
Nach einer Ausführungsform ist es bei der Säureaktivierung nicht erforderlich, dass die überschüssige Säure und die bei der Aktivierung entstehenden Salze ausgewaschen werden. Vielmehr wird nach Aufgabe der Säure, wie bei der Säureaktivierung üblich, kein Waschschritt durchgeführt, sondern das behandelte Schicht- silicat getrocknet und dann ggf. auf die gewünschte Korngröße vermählen.
Das erfindungsgemäß eingesetzte Sorptionsmittel (säureaktivierte Schichtsilicat) kann in Form eines Pulvers, Granulats oder eines beliebig geformten Formkörpers eingesetzt werden. Generell kann die Verwendung der Sorptionsmittel in jeder beliebigen Form einschließlich von geträgerten bzw. immobilisierten Formen erfolgen. Beispielsweise ist auch ein Einsatz bei der Auftrennung von verschiedenen Nukleinsäurekomponenten anhand ihres Molekulargewichts denkbar. Die Anwendungsform der erfindungsgemäßen Adsorbentien ist dabei nicht auf die angeführten Beispiele beschränkt.
Bei der erfindungsgemäß eingesetzten Schicht mit dem mindestens einen säureaktivierten Schichtsilicat wird es sich in vielen Fällen um eine Schicht in einer Säule oder Kartusche handeln, wie sie üblicherweise zum Durchleiten eines flüssigen Mediums verwendet wird. Es kann sich hier beispielsweise um Chromatographiesäulen, einschließlich von Schwerkraftoder Zentrifugationssäulen, Festphasen-Chromatographien, Filterpatronen oder Membranen handeln.
Allgemein wird die Korn- bzw. Formkörpergröße des erfindungsgemäß als Sorptionsmittel verwendeten säureaktivierten Schichtsi- - - licats also von der jeweiligen Anwendung abhängen. Alle Korngrößen bzw. Agglomeratgrößen sind hier möglich. Beispielsweise kann das säureaktivierte Schichtsilicat in Pulverform, insbesondere mit einem D5o~Wert von 1 bis 1.000 um insbesondere von 5 bis 500 μm eingesetzt werden. Typische brauchbare Granulate liegen im Bereich (D50, volumenbezogen) zwischen 100 um bis 5.000 μm, insbesondere 200 bis 2.000 μm Teilchengröße. Allerdings sind für die erfindungsgemäß eingesetzten Schichten bzw. Säulenpackungen die vorstehend angegebenen Trockensiebrückstände besonders bevorzugt. Bei vielen Anwendungen kann vorteilhaft auf Formkörper aus bzw. mit den säureaktivierten Schichtsilicaten zurückgegriffen werden, beispielsweise bei Chromatographiesäulen, einschließlich von Schwerkraft- oder Zentrifugationssäulen,
Festphasenchromatographien, Filterpatronen, Membranen etc..
Nach einer besonders bevorzugten, erfindungsgemäßen Ausführungsform kann, wie vorstehend erwähnt, das erfindungsgemäß eingesetzte Sorbens in immobilisierter Form vorliegen. Beispielsweise kann das Sorbens in eine Filterpatrone, eine
HPLC-Patrone oder eine vergleichbare Darreichungsform eingebettet sein. Auch eine Einbettung in Gele, wie z.B. Agarose- gele oder andere gelartige oder matrixartige Strukturen ist bevorzugt möglich. Solche Applikationen werden häufig im Rahmen von sogenannten Kits zur Aufreinigung von Nukleinsäuremo- lekülen verkauft, wie z.B. die Produkte der Firma Quiagen, wie Quiagen genomic tip oder dergleichen. Dabei wird allgemein das die interessierenden Nukleinsäuremoleküle enthaltende Medium durch eine das Sorbens enthaltende Säule bzw. Filterpatrone oder dergleichen geschickt. Anschließend kann mit geeigneten Puffern gewaschen werden, um anhaftende Verunreinigungen zu entfernen. Es folgt schließlich ein Elutions- schritt zur Gewinnung der interessierenden Nukleinsäuremoleküle . _
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform weist das säureaktivierte Schichtsilicat eine BET- Oberfläche (bestimmt nach DIN 66131) von mindestens 50 bis 800 m2/g, insbesondere mindestens 100 bis 600 irι2/g, besonders bevorzugt von mindestens 130 bis 500 m2/g, auf. Durch die hohe Oberfläche wird offenbar die Interaktion mit der Nukleinsäure erleichtert, wobei die Desorptionsmöglichkeit überraschend erhalten bleibt.
Nach einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform handelt es sich bei den Nukleinsäuren um DNA- oder RNA-Moleküle in doppelsträngiger oder einsträngiger Form mit einem oder mehreren Nukleotidbausteinen.
In Bezug auf Nukleinsäuren ist das erfindungsgemäße Verfahren besonders vorteilhaft bei Medien, die Oligonukleotide bzw. Nukleinsäuren mit mindestens 10 Basen (paaren) , vorzugsweise mit mindestens 100 Basen (paaren) , insbesondere mindestens 1000 Basen (paaren) enthalten. Natürlich lässt sich dass erfindungsgemäße Verfahren auch bei Nukleinsäuren zwischen 1 und 10 Basen (paaren) einsetzen bzw. bei recht großen Nuklein- säuremolekülen, wie Plasmiden oder Vektoren mit beispielsweise 1 bis 50 kB oder längeren genomischen oder c-DNA-Frag- menten. Genauso umfasst sind Restriktionsverdaute DNA- und RNA-Fragmente, synthetische oder natürliche Oligo- und Polymere aus Nukleinsäuren, Cosmide etc..
Von Interesse ist z.B. die chromatographische Trennung von biologischen Makromolekülen wie langkettigen Oligonukleotiden, hochmolekularen Nukleinsäuren, tRNA, 5S-rRNA, anderen rRNA- Spezies, einsträngiger DNA, doppelsträngiger DNA (z.B. Plasmide oder Bruchstücke genomischer DNA) etc.. Dabei kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren überraschend eine verbesserte Auflösung bei hoher Durchsatzgeschwindigkeit erzielt werden. Die verwendeten Trägermaterialien sind dabei in einem weiten Temperaturbereich einsetzbar und zeigen eine hohe Beladbarkeit . Auch zeigt das Trägermaterial eine hohe Druckbeständigkeit und eine lange Lebensdauer.
Auch steigt der Bedarf an hochreinen Nukleinsäuren, wie z.B. hochreine Plasmid DNA für moderne biotechnologische, aber auch medizinische Entwicklung, wie z.B. auf dem Gebiet der Gentherapie. Die im Stand der Technik bekannten Protokolle zur hochreinen Aufreinigung von Nukleinsäuren sind dabei häufig kosten- und/oder zeitintensiv, nicht geeignet zum Einsatz im Großmaßstab oder für therapeutische Zwecke nicht sicher genug, da toxische Lösungsmittel oder Enzyme tierischer Herkunft, wie z.B. RNAse verwendet werden.
Unter flüssigem Medium wird erfindungsgemäß jedes nicht feste Medium verstanden, einschließlich von niedrig- oder hochviskosen und fluiden Medien. Bevorzugt wird es sich um polare Medien handeln, in denen die interessierenden Biomoleküle bzw. Nukleinsäuremoleküle in der Regel enthalten sind. Beispielsweise kann es sich auch um eine kolloidale Lösung, eine Suspension, eine Dispersion, eine Lösung oder Emulsion handeln.
Unter den besonders bevorzugten wässrigen oder alkoholischen Medien werden erfindungsgemäß alle wasser- oder alkoholhaltigen Medien, einschließlich wässrig-alkoholische Medien, verstanden. Allgemein sind auch alle Medien umfasst, in denen Wasser mit anderen Lösungsmitteln vollständig mischbar bzw. vollständig gemischt ist. Anzuführen sind insbesondere Alkohole, wie Methanol, Ethanol sowie C3- bis Cio-Alkohole mit einer oder mehreren OH-Gruppen oder auch Säuren. Denkbar sind also auch mit Wasser vollständig mischbare Lösemittel sowie deren Mischungen mit Wasser und Alkohol. Insbesondere handelt - - es sich in der Praxis hierbei um wässrige, wässrig-alkoholi- sche oder alkoholische Medien.
Typische Beispiele sind wässrige oder alkoholische Puffersysteme, wie sie in der Wissenschaft und Industrie verwendet werden, industrielle oder nicht-industrielle Abwässer, Prozessbrauchwässer, Fermentationsrückstände bzw. -medien, Medien aus der medizinischen oder biologischen Forschung, flüssige oder fluide Altlasten und dergleichen.
Das erfindungsgemäße Sorptionsmittel kann in der Schicht weitere Komponenten enthalten, solange diese die Adsorption der Nukleinsäuren, und soweit vorgesehen, auch deren Desorption nicht inakzeptabel beeinträchtigt. Solche zusätzlichen Komponenten können, ohne hierauf beschränkt zu sein, organische oder anorganische Bindemittel (siehe unten) , weitere dem Fachmann geläufige Sorptionsmittel für Biomoleküle oder andere interessierende anorganische oder organische Substanzen aus dem Medium, oder auch Trägerstoffe wie Glas, Kunststoff- oder keramische Materialien oder dergleichen umfassen.
So können nach einer vorteilhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform in der eingesetzten Schicht die Sorptionsmittelteilchen über ein geeignetes Bindemittel zu größeren Agglome- raten, Granulaten bzw. Formkörpern verbunden oder auf einen Träger aufgebracht werden. Die Form und Größe solcher übergeordneter Strukturen, die die primären Sorptionsmittel- oder Schichtsilicatteilchen enthalten, richtet sich nach der jeweils gewünschten Anwendung. Es können somit alle dem Fachmann geläufigen und im Einzelfall geeigneten Formen und Größen eingesetzt werden. Beispielsweise können in vielen Fällen Agglomerate mit einem Durchmesser von mehr als 10 μm, insbesondere mehr als 50 μm bevorzugt sein. Bei einer Schüttung für Chromatographiesäulen und dergleichen kann dabei eine - -
Kugelform der Agglomerate vorteilhaft sein. Mögliche Träger sind beispielsweise Calciumcarbonat, Kunststoffe oder keramische Materialien.
Auch kann jedes dem Fachmann geläufige Bindemittel verwendet werden, solange die An- bzw. Einlagerung der Biomoleküle in bzw. an das Sorptionsmittel in der Schicht nicht zu stark , beeinträchtigt wird bzw. die für die jeweilige Anwendung zu erfordernde Stabilität der Teilchenagglomerate bzw. Formkörper gewährleistet ist. Beispielsweise, ohne hierauf beschränkt zu sein, können als Bindemittel verwendet werden: Agar-Agar, Alginate, Chitosane, Pektine, Gelatinen, Lupi- nenproteinisolate oder Gluten.
Wie vorstehend bereits ausgeführt, wurde nach einem erfindungsgemäßen Aspekt überraschend gefunden, dass die säureaktivierten Schichtsilicate selbst bereits besonders günstige Oberflächen zur Sorption von Nukleinsäuren bereitstellen. Bevorzugt erfolgt erfindungsgemäß somit keine (zusätzliche) Verwendung bzw. Behandlung des Schichtsilicats mit kationischen Polymeren und/oder Polykationen (multivalenten Kationen) . Weiterhin werden erfindungsgemäß vorzugsweise keine sonstigen Polymere (z.B. Polysaccharide), Polyelektrolyte, Polyanionen und/oder komplexbildende Agentien (zur Modifikation des Schichtsilicats) verwendet. Nach einer besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird insbesondere kein kationisches Polymer wie z.B. ein aminiertes PoIy- saccharidpolymer oder Polykation eingesetzt. Insbesondere wird nach einer weiter bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform das erfindungsgemäß verwendete säureaktivierte Schichtsilicat nicht mit einem (kationischen) Polymer oder einem Polykation modifiziert bzw. behandelt. - -
Das erfindungsgemäße Verfahren kann sowohl zur Anreicherung (d.h. Erhöhung der Konzentration des/der gewünschten Nuklein- säuremoleküle) als auch Abreicherung (d.h. Verringerung der Konzentration des/der gewünschten Nukleinsäuremoleküle) oder Auftrennung mehrerer unterschiedlicher Nukleinsäuremoleküle genutzt werden.
Wenn das erfindungsgemäße Verfahren auf eine Entfernung oder Entsorgung von Nukleinsäuremolekülen abzielt, kann in einem weiteren Schritt die die Nukleinsäuremoleküle enthaltende Schicht entsorgt werden. Die Entsorgung kann dabei beispielsweise durch thermische Behandlung zur Entfernung des die Biomoleküle enthaltenden Schichtsilicats erfolgen, wobei nach der thermischen Desintegration der Nukleinsäuremoleküle das Schichtsilicat entsorgt werden kann.
So ist es nach einem ersten erfindungsgemäßen Aspekt möglich, Nukleinsäuren gezielt aus Medien zu entfernen. Dies spielt beispielsweise bei der Abwasseraufbereitung eine große Rolle, da hier in den meisten Staaten strenge gesetzliche Vorschriften zur Entfernung von Nukleinsäuren und anderen Biomolekülen aus Abwässern bestehen.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann auch die Abreicherung bzw. Entfernung von Nukleinsäuremolekülen aus Kulturmedien durchgeführt werden. So kann es beispielsweise in Bioreaktoren aufgrund der im Medium enthaltenen hohen Konzentration an Nukleinsäuremolekülen, insbesondere hochmolekularen Nukleinsäuren, zu einem unerwünschten Anstieg der Viskosität kommen. Hier kann über das erfindungsgemäße Verfahren eine effiziente und biologisch verträgliche Entfernung der störenden Nukleinsäuremoleküle aus dem Kulturmedium erfolgen. - 4 -
Genauso ist es in vielen Fällen erwünscht, die Konzentration an Nukleinsäuremolekülen in einem Medium zu erhöhen bzw. diese Nukleinsäuremoleküle möglichst in reiner Form zu gewinnen.
Beispielsweise gehört die Gewinnung bzw. Aufreinigung gewünschter Nukleinsäuren aus Lösungen zu den Standardprozeduren in der biologischen und medizinischen Forschung. Dabei kann erfindungsgemäß in einem weiteren Schritt das Nukleinsäu- remolekül von dem Sorptionsmittel in der Schicht wieder desor- biert bzw. gewonnen werden, wodurch die Schicht auch erneut eingesetzt werden kann, gegebenenfalls nach erneuter Säureaktivierung des darin enthaltenen Schichtsilicats .
Nach einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform kann nach der Sorption des mindestens einen Nukleinsäuremoleküls in der Schicht mit dem säureaktivierten Schichtsilicat mindestens ein Waschschritt erfolgen. Dabei kann ein üblicher wässriger oder alkoholhaltiger Puffer verwendet werden, um Verunreinigungen, die neben den Nukleinsäuremolekülen in der Schicht angelagert sind, zu entfernen. Ein nicht-beschränkendes Beispiel für einen geeigneten Puffer ist 5OmM Citratpuf- fer (pH 4,0) .
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde auch unerwartet gefunden, dass die säureaktivierten Schichtsilicate über einen sehr breiten pH-Bereich eine hohe Bindungskapazität für Nukleinsäuremoleküle aufweisen. Vorteilhafterweise können somit flüssige Medien mit sowohl saurem als auch basischem pH-Wert zur Sorption der darin enthaltenen Nukleinsäuremoleküle durch die Schicht mit dem säureaktivierten Schichtsilicat geleitet werden. Nach einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform erfolgt das Durchleiten des flüssigen Mediums bzw. die Sorption des Nukleinsäuremoleküls in der Schicht bei einem pH-Wert zwischen etwa pH 3 und pH 8, insbesondere zwischen etwa pH 6 und pH 8. Diese Bedingungen können einfach - 2 - durch Einstellen des pH-Wertes des flüssigen Mediums bereitgestellt werden. Die vorteilhafte Bindung der Nukleinsäuremo- leküle an die Schicht mit dem säureaktivierten Schichtsilicat über einen breiten pH-Bereich kann nach einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt auch dazu genutzt werden, um ein Nuklein- säuremolekül von beispielsweise im flüssigen Medium ebenfalls enthaltenen Proteinbestandteilen abzutrennen. So kann die Schicht nach dem Durchleiten des flüssigen Mediums (enthaltend das Nukleinsäuremolekül) mit einer Reihe von auf verschiedene pH-Werte eingestellten Puffern bzw. einem pH-Gradientenpuffer gewaschen werden, um Proteine mit unterschiedlichen isoelektrischen Punkten aus der Schicht zu lösen und auszuwaschen. Soweit die zur erwartenden Proteinverunreinigungen bekannt sind, kann anhand von Vorversuchen auch derjenige pH-Wert bestimmt werden, bei dem diese Proteinverunreinigungen (in der Regel in Abhängigkeit von ihrem isoelektrischen Punkt) die geringste Sorption an das säureaktivierte Schichtsilicat aufweisen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine schichtförmige Zusammensetzung, enthaltend mindestens ein säureaktiviertes Schichtsilicat und mindestens ein Nukleinsäuremolekül, wobei die Schichtdicke bei mindestens einem Millimeter liegt. Wie hierin ausgeführt, kann eine solche schichtförmige Zusammensetzungen beispielsweise zur Abtrennung, Gewinnung oder Aufreinigung eines Nukleinsäuremoleküls aus einem flüssigen Medium vorteilhaft verwendet werden.
Wie vorstehend ausgeführt, ist eine geringe Eisenverunreinigung des eingesetzten säureaktivierten Schichtsilicats vorteilhaft. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft somit auch die Verwendung eines säureaktivierten
Schichtsilicats mit einer geringen Eisenverunreinigung, wie vorstehend definiert, zur Sorption, insbesondere zur Abtren- - 6 - nung, Gewinnung oder Aufreinigung eines Nukleinsäuremoleküls aus einem flüssigen Medium. Ein weiterer Aspekt betrifft die Verwendung eines solchen säureaktivierten Schichtsilicats als anorganischer Vektor zum Einbringen von Biomolekülen in Zellen oder als pharmazeutische Zusammensetzung, insbesondere als Reservoir zur Speicherung und kontrollierten Freisetzung von Biomolekülen, bevorzugt Nukleinsäuren.
So wurde überraschenderweise gefunden, dass sich die erfindungsgemäßen Sorptionsmittel auch zu einer effizienten Ein- schleusung dieser Biomoleküle in prokaryontische oder eukary- ontische Zellen eignen. Offenbar lassen sich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren Biomoleküle, insbesondere Nukleinsäuren, in besonders vorteilhafter Weise zur Einschleusung in Zellen "verpacken". Der prinzipielle Mechanismus einer solchen Einschleusung am Beispiel von DNA-LDH-Nanohybriden ist beispielsweise in der Literaturstelle Choy et al., Angew.
Chem. 2000, 112 (22), Seiten 4207-4211, sowie in der EP 0 987 328 A2 beschrieben, auf die diesbezüglich verwiesen wird und die hiermit durch Bezugnahme im Hinblick auf das Verfahren in die Beschreibung aufgenommen werden. Die Verwendung als pharmazeutische Zusammensetzung, insbesondere als Reservoir zur Speicherung und kontrollierten Freisetzung von Biomolekülen, bevorzugt von Nukleinsäuren, ist als solche in der WO
01/49869 beschrieben, auf die diesbezüglich verwiesen und die hiermit durch Bezugnahme in die Beschreibung aufgenommen wird.
Methodenteil
1. BET-Oberflache
Die vorliegend angegebenen BET-Oberflächen wurden nach DIN
66131 bestimmt. - 7 -
2. Porosimetrie
Die angegebenen (mittleren) Porendurchmesser, -Volumina und -flächen wurden unter Verwendung eines vollautomatischen Stickstoff-Adsorptionsmessgerätes (ASAP 2000, Firma Micro- metrics) nach dem Standardprogramm des Herstellers (BET, BJH, t-plot und DFT) bestimmt. Die prozentualen Angaben zum Anteil bestimmter Porengrößen beziehen sich auf das Gesamtporenvolu- men an Poren zwischen 1,7 und 300 nm Durchmesser (BJH Adsorption Pore Distribution Report) .
Soweit angegeben, wurde die Porosimetrie nach der CCl4-Methode wie folgt durchgeführt:
Reagenzien:
Tetrachlorkohlenstoff (CCl4)
Paraffin (flüssig), Fa. Merck, (Best.Nr. 7160.2500)
Durchführung :
1 bis 2 g des zu prüfenden Materials werden in einem kleinen Wägegläschen bei 1300C im Trockenschrank getrocknet. Anschließend wird im Exsikkator abgekühlt, genau gewogen und das Gläschen in einen Vakuum-Exsikkator gestellt, der je nach dem zu messenden Mikroporenvolumen die folgenden Paraffin/ Tetrachlorkohlenstoff-Mischungsverhältnisse enthält : -
Paraffin (ml) CCI4 (ml) Mikroporen (A)
26 184 800
47,9 162,1 390
66,5 143,5 250
82,5 127,5 180
96,4 113,6 140
108,7 101,3 115
Der mit graduierter Kühlfalle, Manometer und Vakuumpumpe verbundene Exsikkator wird nun bis zum Sieden des Inhalts evakuiert. 10 ml Tetrachlorkohlenstoff werden verdampft und in der Kühlfalle aufgefangen.
Sodann lässt man den Exsikkatorinhalt 16 bis 20 Stunden bei Raumtemperatur ausgleichen, anschließend lässt man langsam Luft in den Exsikkator. Nach Abnehmen des Exsikkatordeckels wird das Wägegläschen sofort verschlossen und auf der Analysenwaage zurückgewogen.
Auswertung:
Die Werte werden in Milligramm Tetrachlorkohlenstoff- Adsorption pro Gramm Substanz durch Gewichtszunahme errechnet. Durch Dividieren mit der Dichte des Tetrachlorkohlenstoffs ergeben sich die
Porenvolumen in ml/g Substanz. Auswaage - Einwaage = Gewichtszunahme
g Substanz x Einwaage x Dichte CCl4 = ml/g Substanz.
(Tetrachlorkohlenstoff bei 2O0C, d = 1,595 g/cm3) - -
3 . Messung des Zeta-Potentials
Von den zu untersuchenden Adsorbentien wurde jeweils eine wässrige Suspension mit dest. Wasser hergestellt. Die zu messende Suspension wurde jeweils auf pH 7 eingestellt. Das Ze- ta-Potential der Teilchen wurde mittels des Zetaphoremeters II der Firma Particle Metrix nach dem Prinzip der Mikro- elektrophorese bestimmt. Dabei wurde die Wanderungsgeschwindigkeit der Teilchen in einem bekannten elektrischen Feld gemessen. Die Partikelbewegungen, die in einer Messzelle stattfinden, werden mit Hilfe eines Mikroskops beobachtet. Die Wanderungsrichtung gibt Aussage über die Art der Ladung (positiv oder negativ) und die Teilchengeschwindigkeit ist direkt proportional zur elektrischen Grenzflächenladung der Teilchen bzw. zum Zeta-Potential. Die Partikelbewegungen in der Messzelle werden mittels Bildanalyse festgehalten und nach Ablauf der Messung werden die zurückgelegten Partikelbahnen berechnet und die daraus resultierende Teilchengeschwindigkeit ermittelt.
Unter Berücksichtung der Suspensionstemperatur und der elektrischen Leitfähigkeit wurde hieraus das Zeta-Potential (angegeben in mV) errechnet.
Überraschenderweise wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung gefunden, dass gute Ergebnisse auch mit Schichtsilicaten mit negativem Zeta-Potential erzielt werden können.
4. Bestimmung der Teilchengrößen und Teilchengrößenverteilung
Soweit nicht anders angegeben, erfolgt die Bestimmung der Teilchengrößen (Verteilung) nach dem Malvern-Verfahren. Hierzu wurde ein Mastersizer der Fa. Malvern nach den Angaben des Herstellers eingesetzt. Zur Bestimmung der Luft werden ca. 2- 3 g (1 Kaffeelöffel) von der zu untersuchenden Probe in den „Dry powder feeder" gegeben und je nach Probe auf den richtigen Messbereich eingestellt (je gröber die Probe, desto höher die Einwaage) .
Zur Bestimmung in Wasser wird eine Probe (ca. 1 Messerspitze) ins Wasserbad gegeben bis Messbereich erreicht ist (je gröber desto höher die Einwaage) , und 5 Min. im Ultraschallbad gerührt. Anschließend erfolgt die Messung.
5. Kationenaustauschkapazität (CEC)
Prinzip: Der Ton wird mit einem großen Überschuss an wässriger NH4C1-Lösung behandelt, ausgewaschen und die auf dem Ton verbliebene NH4 +-Menge mittels Elementaranalyse bestimmt.
Me+ (Ton) ~+ NH4 + NH4 + (Ton) "+Me+
(Me+= H+, K+, Na+, 1/2 Ca2+, 1/2 Mg2+....)
Geräte: Sieb, 63 μm; Erlenmeyer-Schliffkolben, 300 ml; Analysenwaage; Membranfilternutsche, 400 ml; Cellulose-Nitrat-Filter, 0,15 um (Fa. Sartorius) ; Trockenschrank; Rückflusskühler; Heizplatte; Destillationseinheit, VAPODEST-5 (Fa. Gerhardt, No.
6550); Messkolben, 250 ml; Flammen-AAS
Chemikalien: 2N NH4C1-Lösung; Neßlers-Reagens (Fa. Merck,
Art. Nr. 9028); Borsäure-Lösung, 2 %-ig; Natronlauge, 32 %-ig; 0,1 N Salzsäure; NaCl-Lösung, 0,1 %-ig; KCl-Lösung, 0,1 %-ig.
Durchführung: 5 g Ton werden durch ein 63 um-Sieb gesiebt und bei 1100C getrocknet. Danach werden genau 2 g auf der Analysenwaage in Differenzwägung in den Erlenmeyer-Schliffkolben eingewogen und mit 100 ml 2N NH4Cl-LÖsung versetzt. Die Suspension wird unter Rückfluss eine Stunde lang gekocht. Bei stark CaCO3- - - haltigen Bentoniten kann es zu einer Ämmoniak-Entwicklung kommen. In diesen Fällen muss solange NH4C1-Lösung zugegeben werden, bis kein Ammoniak-Geruch mehr wahrzunehmen ist. Eine zusätzliche Kontrolle kann mit einem feuchten Indikator-Papier durchgeführt werden. Nach einer Standzeit von ca. 16 h wird der NH4 +-Bentonit über eine Membranfilternutsche abfiltriert und bis zur weitgehenden Ionenfreiheit mit vollentsalztem Wasser (ca. 800 ml) gewaschen. Der Nachweis der Ionenfreiheit des Waschwassers wird auf NH4 +-Ionen mit dem dafür empfindlichen Neßlers- Reagens durchgeführt. Die Waschzahl kann je nach Tonart zwischen 30 Minuten und 3 Tagen variieren. Der ausgewaschene NH4 +-TOn wird vom Filter abgenommen, bei 1100C 2 h lang getrocknet, gemahlen, gesiebt (63 μm-Sieb) und nochmals bei 110 0C 2 h lang getrocknet. Danach wird der NH4 +-Gehalt des Tons mittels Elementaranalyse bestimmt.
Berechnung der CEC: Die CEC des Tons wurde in herkömmlicher Weise über den NH4 +-Gehalt des NH4 +-Tons, der über Elementaranalyse des N-Gehalts ermittelt wurde, bestimmt. Hierzu wurde das Gerät Vario EL 3 der Firma Elementar- Heraeus, Hanau, DE, nach den Angaben des Herstellers eingesetzt. Die Angaben erfolgen in mval/100 g Ton (meq/100g) .
Beispiel: Stickstoff-Gehalt = 0,93 %;
Molekulargewicht: N = 14,0067 g/mol
0,93 x 1000
CEC = = 66,4 mVal/100g
14,0067
CEC = 66,4 meq/100 g NH4 +-Bentonit - -
6. Quellfähigkeit (Sedimentvolumen)
Die Quellfähigkeit wurde wie folgt bestimmt: Ein kalibrierter 100 ml-Messzylinder wird mit 100 ml dest. Wasser gefüllt. 2,0 g der zu messenden Substanz werden in Portionen von 0,1 bis 0,2 g langsam auf die Wasseroberfläche gegeben. Nach dem Absinken des Materials wird das nächste Quantum aufgegeben. Nach Beendigung der Zugabe wartet man 1 Stunde und liest dann das Volumen der aufgequollenen Substanz in ml/2 g ab.
7. Silikatanalyse: (a) ProbenaufSchluss
Diese Analyse beruht auf dem Totalaufschluss des Schichtsilica- tes. Nach dem Auflösen der Feststoffe werden die Einzelkomponenten mit herkömmlichen spezifischen Analysemethoden, wie z.B. ICB, analysiert und quantifiziert.
Für den ProbenaufSchluss werden ca. 10 g der zu untersuchenden Probe fein vermählen und 2 Stunden lang im Trockenschrank bei 120 0C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Ca. 1,4 g der getrockneten Probe werden in einen Platintiegel gegeben und die Probeneinwaage bis zu einer Genauigkeit von 0,001 g ermittelt. Danach wird die Probe im Platintiegel mit der 4 bis 6-fachen Gewichtsmenge einer Mischung aus Natriumcarbonat und Kaliumcar- bonat (1 : 1) vermischt. Die Mischung wird mit dem Platintiegel in einen Simon-Müller-Ofen gestellt und 2 - 3 Stunden bei 800 - 850 0C geschmolzen. Der Platintiegel mit der Schmelze wird mit einer Platinzange aus dem Ofen genommen und zum Abkühlen Stehen gelassen. Die abgekühlte Schmelze wird mit wenig destilliertem Wasser in eine Kasserolle gespült und vorsichtig mit konzentrierter Salzsäure versetzt. Nach Beendigung der Gasentwicklung wird die Lösung bis zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird - - erneut in 20 ml konz. Salzsäure aufgenommen und erneut zur Trockene eingedampft. Das Eindampfen mit Salzsäure wird noch einmal wiederholt. Der Rückstand wird mit ca. 5 - 10 ml Salzsäure
(12 %) angefeuchtet, mit ca. 100 ml dest. Wasser versetzt und erwärmt. Unlösliches SiO2 wird abfiltriert, der Rückstand drei Mal mit heißer Salzsäure (12 %) gewaschen und dann mit heißem Wasser (dest.) gewaschen, bis das Filtratwasser chlorijdfrei ist.
(b) Silikatbestimmung
Das SiO2 wird mit dem Filter verascht und ausgewogen.
(c) Bestimmung von Eisen (und Aluminium, Calcium und Magnesium)
Das bei der Silikatbestimmung gesammelte Filtrat wird in einen 500 ml Messkolben überführt und bis zur Eichmarke mit destilliertem Wasser ergänzt. Aus dieser Lösung wird dann mittels FAAS die Eisenbestimmung (bzw. auch für Aluminium-, Calcium- und Magnesium) durchgeführt.
(d) Bestimmung von Kalium, Natrium und Lithium
500 mg der getrockneten Probe werden auf 0,1 mg genau in einer Platinschale eingewogen. Danach wird die Probe mit ca. 1 - 2 ml dest. Wasser durchfeuchtet und 4 Tropfen konzentrierte Schwefelsäure zugegeben. Danach wird dreimal mit ca. 10 - 20 ml konz. HF bis zur Trockene im Sandbad eingedampft. Zuletzt wird mit H2SO4 befeuchtet und auf der Ofenplatte bis zur Trockene abgeraucht.- Nach kurzem Glühen der Platinschale werden ca. 40 ml dest. Wasser und 5 ml Salzsäure (18 %) zugegeben und die Mischung aufgekocht. Die erhaltene Lösung wird in einen 250 ml Messkolben überführt und bis zur Eichmarke mit dest. Wasser ergänzt. Aus dieser Lösung wird mittels EAS der Natrium-, Kalium- und Lithiumgehalt ermittelt. - -
8. DNA-Quantifizierung durch Fluoreszenz-Markierung
Zur Bestimmung des DNA Gehaltes von Lösungen, die für die Adsorptionsuntersuchungen im dynamischen System eingesetzt wurden, wurde die Methode der fluoreszenzphotometrische Quantifizierung von DNA mittels des Fluoreszenz-Markers Hoechst 33342 (2 ' - (4-Ethoxyphenyl) -5- (4-methyl-l-piperazinyl) -2,5'- bi-lH-benzimidazol• 3HCl ) eingesetzt, (Fa. Sigma, Steinheim). Diese basiert auf der nicht interkalativen Bindung des Farbstoffs an das Basenpaar Adenin-Thymin der DNA. Durch die Bindung des Fluorochroms an die DNA vervielfacht sich dessen Fluoreszenzintensität um den Faktor 60. Die Lage des Maximums der Anregungs- und Emissionswellenlänge von ungebundenem Hoechst-Farbstoff verschiebt sich von 340 nm und 510 nπi zu 355 nm und 465 nm für an DNA gebundenen Farbstoff. Mittels eines Fluoreszenzphotometers kann die Fluoreszenzintensität einer mit dem Fluorochrom inkubierten Probe bestimmt werden. Da sich die Wellenlänge des Anregungs- und Emissionsmaximums des Fluorochroms bei der Anlagerung an die DNA verschieben, lässt sich der gebundene Farbstoff selektiv anregen, wodurch ein starkes Hintergrundsignal vermieden wird.
Für dieses Verfahren wurden folgende Stammlösungen eingesetzt :
Hoechst-33342-Stammlösung. : 10 mg-ml-1 Hoechst 33342 in ddH2O Ix TNE-Puffer: 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,2 M NaCl in 1000 ml ddH2O, pH 7,4)
Es wurde nun wie folgt eine Kalibrationsgerade zur Fluores- zenzphotometrischen Bestimmung der DNA-Konzentration erstellt:
• Auf eine schwarze 96-Loch-Platte (Nunc, Roskilde, Dänemark) werden jeweils 10 μl Probe sowie eine Standardreihe - - mit DNA-Konzentrationen von 100 μg-ml"1 bis 4750 μg-ml x dreifach aufgetragen.
• Die Proben werden mit 200 μl einer Mischung aus 100 μl
Hoechst-33342-Stammlösung mit 20 ml Ix TNE-Puffer (10 niM Tris, 1 mM EDTA, 0,2 M NaCl in 1000 ml ddH2O, pH 7,4) versetzt.
• Die Proben werden 30 min lang unter Lichtausschluss und unter Schütteln bei 120 rpm inkubiert.
• Die Fluoreszenzintensität der Proben wird durch Anregung bei 360 nm und Detektion bei 460 nm im Fluoreszenzphotometer gemessen.
Analog wie im letzten Abschnitt beschrieben wurde mit den DNA haltigen Lösungen bei der Untersuchung der DNA Bindung an die sauer aktivierte Bentonite in den dynamischen Systemen verfahren. Dabei wurde die vorher erstellte Kalibrationsgerade zur Bestimmung der DNA Gehalte benutzt.
Die Erfindung wird nachstehend anhand von nicht-beschränkenden Beispielen näher erläutert.
Es zeigen:
Fig. 1 zeigt die DNA-Beladung der erfindungsgemäßen Adsorben- tien A und B bei verschiedenen pH-Werten
Fig. 2 zeigt die DNA-Beladung der erfindungsgemäßen Adsorben- tien A und B bei verschiedenen Flussgeschwindigkeiten durch eine Säulenpackung. - -
Beispiele
1. Herstellung eines Sorptionsmittels
Ein Rohton mit einem Montmorillonitgehalt zwischen 70 bis 80% wird in Wasser aufgeschlämmt und über Zentrifugation aufgereinigt. Die erhaltene Slurry wird dann einer Säureaktivierung unterworfen. Hierbei werden die Konzentrationen so eingestellt, dass 56% Bentonit mit 44% 36 Gew.-%iger Salzsäure versetzt werden und 8 Stunden bei einer Temperatur von 95 bis 990C gekocht wird. Anschließend wird mit Wasser so lange gewaschen, bis der Restchloridgehalt bei kleiner oder gleich 5%, bezogen auf den Feststoff liegt. Zur Analyse des Restchloridgehalts wird 10g Feststoff in 100 ml destilliertem Wasser gekocht und über einen Faltenfilter abfiltriert. Das Filtrat wird zur Bestimmung des Restchloridgehaltes mit Silbernitrat-Lösung titriert. Schließlich erfolgt eine Trocknung auf eine Restfeuchte von 8 bis 10 Gew.-%. Das erhaltene Endprodukt hat ein Gewicht von 430 bis 520 g/l. Durch ein Absieben bzw. zusätzliche Vermahlung lassen sich besonders bevorzugte Partikelgrößen einstellen.
2. Charakterisierung des Sorptionsmittels
Die charakteristischen Daten dieses Sorptionsmittels (Adsor- bens 1) und des entsprechenden Mahlgrads sind in den folgenden Tabellen angeführt. Die Charakterisierung der Oberfläche zeigt, dass in Lösungen ein negatives Zeta-Potential vorliegt. Die Oberflächenladungsdichte ist jedoch relativ klein. Hier können bei speziellen modifizierten Materialien Werte über 200 μeq/g erzielt werden. - -
Tabelle 1: Oberflächenladungsdichte und Zeta-Potential
Figure imgf000039_0001
Tabelle 2 : Teilchengrößenverteilung
Probe Teilchen« größenverteilung Teilchengrößenverteilung
in Luft in Wasser
μm [%] μm [%]
Adsorbens 1 > 25 4,13 > 25 5,41
> 20 6,14 > 20 9,15
> 10 18,56 > 10 30,00
< 5 57,42 < 5 38,42
< 2 27,57 < 2 7,61
< 1 10,79 < 1 0,87
Das Adsorbens 1 wurde nach der BJH-Methode und BET-Methode (DIN 66131) bezüglich des durchschnittlichen Porendurchmessers und der BET-Oberflache charakterisiert. Es ergaben sich folgende Werte:
- -
Tabelle 3: BET-Oberflache und Porendurchmesser
Figure imgf000040_0001
Nach der CCl4-Methode (vgl. oben) ergaben sich folgende Werte:
Tabelle 4 : Porendurchmesser und Porenvolumen
Figure imgf000040_0002
Um die Eignung des neuen Adsorbenstyps für eine Bindung von DNA zu testen, wurden Adsorptionsexperimente von Heringssperma DNA (Aldrich) durchgeführt.
Zur Konzentrationsbestimmung bei den Adsorptionsexperimenten wurde die DNA-Konzentration photometrisch bestimmt. Dabei wurde zur Messung eine Wellenlänge von 260 nm eingestellt. Zur Kalibration des Verfahrens mit dem eingesetzten DNA-Salz wurde eine Messung mit einer Konzentrationsreihe durchgeführt. Die erhaltene Kalibrationsgerade wurde zur photometrischen Bestimmung der DNA-Konzentration bei den Adsorptionsexperimenten eingesetzt. - -
Für die Adsorptionsexperimente wurde eine Heringssperma DNA- Lösung mit einer Konzentration von 1 mg/ml, 2 mg/ml, 5,63 mg/ml und 9,9 mg/1 hergestellt und mittels 1OmM Tris/HCL und ImM EDTA auf pH 8 eingestellt. Anschließend wurden 0,1 g der Adsorbentien jeweils mit 5 ml der DNA-Lösung versetzt und 1 Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt. Anschließend wurde 15 Minuten mit 2500 rpm zentrifugiert und der Überstand wurde steril filtriert. Schließlich wurde die DNA-Konzentration im Überstand gemessen und daraus die Bindungskapazität für DNA berechnet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle sowie in der folgenden Graphik zusammengestellt:
Tabelle 5: DNA-Bindungskapazitäten
Figure imgf000041_0001
BK = Bindungskapazität -^ umgerechnet in mg DNA bezogen auf 1 g der Adsorbentien
Um die gebundene DNA aus den Adsorbentien zurück zu gewinnen, wird mit 1,5 molarer Natriumchloridlösung in 10 mM Tris HCL pH 8,5 1 Stunde eluiert (Elutionsvolumen: 100 ml), 15 min. bei 2500 rpm zentrifugiert, der Überstand steril filtriert und die Absorption gemessen. Tabelle 4: Elution der gebundenen DNA
Figure imgf000042_0001
Dabei wurde gefunden, dass die gebundene DNA nahezu quantitativ aus den Adsorbentien wieder zurückgewonnen werden kann. Dies zeigt den potentiellen Einsatz der neuen Adsorbentien sowohl beim Abtrennen als auch zum Aufreinigen von DNA.
Um die Bindungskapazität der erfindungsgemäßen Adsorbentien für DNA im Vergleich zum Stand der Technik einordnen zu können, wurden analoge Bindungsversuche mit einem kommerziell erhältlichen Anionenaustauscher (Quiagen®, genomic Tip) durchgeführt. Die Matrix wurde aus der Säule entnommen und auf vergleichbare Korngröße wie das erfindungsgemäße Material vermählen. Die Vergleichsergebnisse sind in der folgende Tabelle aufgelistet.
Tabelle 5 : Vergleichsergebnisse zur DNA-Bindungskapazität mit kommerziell erhältlichem Adsorbens
Figure imgf000042_0002
Wie der Vergleich der Tabelle 3 und Tabelle 4 zeigt, weist der erfindungsgemäße Adsorbenstyp eine wesentlich höhere Bindekapazität auf als der Vergleichs-Anionentauscher . Somit _ _ werden Bindekapazitäten von Adsorbentien, die nach dem Stand der Technik komerziell erhältlich sind, erreicht bzw. übertroffen. Hinzu kommt, dass die erfindungsgemäßen Adsorbentien eine wesentlich schnellere DNA-Bindung aufweisen, weil die entsprechenden DNA Mengen bereits nach 1 Stunde gebunden sind im Vergleich zur Adsorptionszeit von 16 Stunden bei dem Vergleichsmaterial .
Die Daten legen nahe, dass bei den erfindungsgemäßen Adsorbentien insbesondere für große Biomoleküle die Bindestellen wesentlich besser zugänglich sind als für das Vergleichs- adsorbens .
2. Herstellung weiterer Sorptionsmittel (erfindungsgemäß)
Zwei weitere Rohtone mit einem Montmorillonitgehalt zwischen 70 bis 80% wurden analog zu dem in Abschnitt 1 beschriebenen Verfahren mit Säure aktiviert. Die Endprodukte wurden auf eine Restfeuchte von 8 bis 10 Gew.-% getrocknet. Die erhaltenen Endprodukte hatten Schüttgewichte zwischen 460 bis 510 g/l. Durch ein Absieben bzw. zusätzliche Vermahlung lassen sich besonders bevorzugte Partikelgrößen einstellen. Es wurden Materialien mit Trockensiebrückständen von mehr als 90% bei 5, 10 und 35 μm verwendet.
Charakterisierung der Sorptionsmittel
Die charakteristischen Daten der vorstehenden Sorptionsmittel (Adsorbens A bzw. B) sind in den folgenden Tabellen angeführt. - -
Tabelle 6: Oberflächenladungsdichte und Zeta-Potential
Figure imgf000044_0001
Die Adsorbentien A und B wurden nach der BJH-Methode und BET- Methode (DIN 66131) bezüglich des durchschnittlichen Porendurchmessers und der BET-Oberflache charakterisiert. Es ergaben sich folgende Werte:
Tabelle 7 : BET-Oberflache und Porendurchmesser
Figure imgf000044_0002
Nach der CClή-Methode (vgl. oben) ergaben sich folgende Werte: Tabelle 8 : Porendurchmesser und Porenvolumen
Figure imgf000045_0001
Die Silcatanalyse ergab folgende Werte:
Tabelle 9: Silcatanalyse
Figure imgf000045_0002
Für beide Adsorbentien A und B konnte eine vergleichbare DNA- Bindungskapazität wie vorstehend für Adsorbens 1 beschrieben nachgewiesen werden. Eine Untersuchung der DNA-Bindekapazität bei verschiedenen pH-Werten (pH 3 bis pH 8) ergab eine gute DNA-Beladung über den gesamten pH-Bereich, wie in Fig. 1 dargestellt. - -
Untersuchung der DNA-Bindung an eine Schicht des Sorptions- mittels (im dynamischen System)
Um die Eignung der Sorptionsmittel zur DNA-Bindung bzw. Abtrennung im erfindungsgemäßen Verfahren zu überprüfen, wurden die Materialien Adsorbens A und Adsorbens B in einer Chromatographiesäule (15x50 mm mit 10 um PTEE-Fritten) gepackt und bei verschiedenen Flussraten mit DNA beladen (DNA Natriumsalz aus Heringssperma , Sigma D6898) . Die Säulen wurden im Einzelnen wie folgt gepackt: 1000 mg des Adsorbens (A oder B) wurden in einem 15 ml-Falconröhrchen mit 5 ml 50 mM Citrat-Puffer (pH 4,0) auf- geschlämmt und in die mit einem Stempel nach unten abgeschlossene Säule pipettiert. Das zweite Säulenendstück wird aufgesetzt, die Säule wird mit einer FPLC-Anlage so verbunden, dass sie von der mobilen Phase von unten nach oben durchströmt wird. Die FPLC-Pumpe wird auf die Flussrate eingestellt, für die die Kapazität des Adsorbers ermittelt werden soll. Der bewegliche Stempel der Säule wird während der Equilibrierung mit 50 ml 50 mM Citrat-Puffer (pH 4,0) langsam handfest angezogen und anschließend um eine Viertel-Gewindedrehung entlastet.
Zur Beladung der Säule mit DNA wurden jeweils 25 ml einer DNA- Lösung mit einer DNA-Konzentration von 1 mg/ml in 50 mM Citrat- puffer (pH 4) mittels einer FPLC-Pumpe durch die mit 1000 mg Adsorbens A bzw. B gepackten Säulen gepumpt.
Es wurden Kapazitäten für die Flussraten 0,5, 1, 3, 5 und
10 ml/min ermittelt. Der DNA-Gehalt des Durchlaufs wurde fluo- reszenzphotometrisch gemäß dem im Methodenteil beschriebenen Verfahren durch Markierung mit dem Fluoreszenz-Farbstoff Hoechst 33342 (Fa. Sigma, Steinheim) bestimmt. Die Differenz der DNA- Mengen im Durchlauf und der aufgetragenen Lösung wird als an den Adsorber gebunden angenommen. Dividiert man diese Differenz durch die eingesetzte Masse des Adsorbers, so erhält man dessen Beladung bei der zugehörigen Flussrate. Die Messwerte für Adsor- bens A und B sind als Mittelwerte einer Doppelbestimmung in Fig.2 dargestellt. Die Flussrate wurde mit der Fläche des Säulenquerschnitts in die Flussgeschwindigkeit mit der Einheit cm/h umgerechnet . Die unter den angegebenen Versuchsbedingungen ermittelten Kapazitäten lagen beide Adsorbentien bei über 12 μg/mg1 für eine Flussgeschwindigkeit von 16,8 cm/h.
Nach den Herstellerangaben weist der schwach basische Anionen- austauscher (Genomic Tip) der Firma Qiagen eine dynamische Kapazität von 0,2 μg-mg-1 für genomische DNA auf.
Elution der gebundenen DNA
Zur Elution von an die Adsorbentien gebundener DNA wurde der nachstehende Puffer verwendet. Alle Chromatographieschritte wurden bei einer Flussrate von 1 ml/min durchgeführt.
Elutionspuffer: 50 mM Tris in ddH2O, pH 8,0
1000 mg Adsorbens A wurden im Durchflussbetrieb (siehe oben) mit 25 ml einer DNA-Lösung mit einer Konzentration von 1 mg/ml in 50 mM Citrat-Puffer pH 4 beladen. Die Säule wurde mit 20 ml 50 mM Citratpuffer (pH 4 gespült) . Die Elution der DNA wurde mit 30 ml Elutionspuffer durchgeführt. Der DNA-Gehalt des Durchlaufs, der Wasch- und der Elutionsfraktion wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 10 als Mittelwerte einer Doppelbestimmung angegeben.
Tabelle 10
Figure imgf000047_0001
Somit ergibt sich eine Wiederfindungsrate im Eluat, ausgedrückt als % der DNA-Beladung, von mehr als 85%.

Claims

- - PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Sorption von mindestens einem Nukleinsäure- molekül aus einem flüssigen Medium, umfassend die folgenden Schritte:
a. Bereitstellen eines flüssigen Mediums, enthaltend mindestens ein Nukleinsäuremolekül;
b. Bereitstellen einer Schicht enthaltend mindestens ein säureaktiviertes Schichtsilicat, wobei die Schicht für das flüssige Medium durchlässig ist und die
Schichtdicke bei mindestens 1 mm liegt;
c. Durchleiten des flüssigen Mediums mit dem mindestens einen Nukleinsäuremolekül gemäß Schritt a. durch die Schicht gemäß Schritt b., um das mindestens eine Nukleinsäuremolekül in der Schicht zu sorbieren.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das säureaktivierte Schichtsilicat einen Eisengehalt, berechnet als Fe2Cb bezogen auf die Gesamtmenge an eingesetztem säureaktiviertem Schichtsilicat, von weniger als 6 Gew.-%, bevorzugt weniger als 4 Gew.-%, weiter bevorzugt weniger als 3 Gew-%, insbesondere weniger als 2,5 Gew.-% aufweist.
3. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Schichtdicke der Schicht gemäß Anspruch 1, Schritt b. bei mehr als 0,3 cm, bevorzugt bei mehr als 0,5 cm, insbesondere zwischen 0,1 und 100 cm liegt.
4. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das säureaktivierte Schichtsilicat eine Quellfähigkeit von nicht mehr als 15 ml/2g, insbesondere nicht - - mehr als 10 ml/2g aufweist, weiter bevorzugt von 1 bis 15 ml/2g, insbesondere von 2 bis 10 ml/2g.
5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das säureaktivierte Schichtsilicat in Teilchenform mit einem Trockensiebrückstand von weniger als 10%, insbesondere weniger als 5%, weiter bevorzugt weniger als 1% bei 5 um, insbesondere bei 10 um, weiter bevorzugt bei 35 um, eingesetzt wird.
6. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem flüssigen Medium um ein wässriges oder alkoholisches Medium handelt.
7. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Schichtsilicat ausgewählt ist aus der Gruppe der natürlichen oder synthetischen Schichtsilicate.
8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Schichtsilicat nicht mit einem kationischen Polymer oder Polykation behandelt ist.
9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kationenaustauschkapazität des säureaktivierten Schichtsilicats bei weniger als 70 meq/100 g, insbesondere bei weniger als 50 meq/100 g, weiter bevorzugt bei weniger als 40 meq/100 g liegt.
10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das säureaktivierte Schichtsilicat eine BET-Oberfläche von mindestens 50 m2/g, insbesondere mindestens 100 m2/g, besonders bevorzugt von mindestens 130 m2/g, aufweist. - -
11. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das säureaktivierte Schichtsilicat, vorzugsweise in Granulatform, eine Korngröße (D50) von 100 bis 500 um, insbesondere von 200 bis 2.000 um, aufweist.
12. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das säureaktivierte Schichtsilicat eine Porosimetrie wie folgt aufweist: Poren bis 80 nm Durchmesser zwischen etwa 0,15 und 0,80 rhl/g, insbesondere zwischen etwa 0,2 und 0,7 ml/g; Poren bis zu 25 nm Durchmesser zwischen etwa 0,15 und 0,45 ml/g, insbesondere 0,18 bis 0,40 ml/g; Poren bis zu
14 nm zwischen etwa 0,10 und 0,40 ml/g, insbesondere etwa 0,12 bis 0,37 ml/g, jeweils bestimmt nach der CCl4-Methode.
13. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der mittlere Porendurchmesser nach der BJH-Methode des säureaktivierten Schichtsilicats zwischen 2 und 25 nm, insbesondere zwischen 4 und 20 nm, liegt.
14. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Nukleinsäuremolekül ausgewählt ist aus Mono-, Oligo- und Polynukleotiden oder deren Mischungen.
15. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Nukleinsäuremolekül ausgewählt ist aus Ribonukleinsäuren (RNA) und Desoxyribonukleinsäuren (DNA) oder deren Mischungen.
16. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Nukleinsäuremolekül mindestens 10 Nukleotidbausteine, vorzugsweise mindestens 100 Nukleotidbausteine und besonders bevorzugt mindestens 1000 - -
Nukleotidbausteine aufweist.
17. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem vorzugsweise wässrigen oder alkoholischen Medium mit dem mindestens einen Nukleinsäuremole- kül um eine kolloidale Lösung, Suspension, Dispersion, Lösung oder Emulsion handelt.
18. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Schicht mit dem sorbierten Nuleinsäure- molekül nach Schritt c. von Anspruch 1 mit einem wässrigen oder alkoholischen Puffer gewaschen wird, um Verunreinigungen zu entfernen.
19. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt c. von Anspruch 1 eine Abtrennung bzw. Desorption des mindestens einen Nukleinsäuremole- küls aus der Schicht erfolgt, wodurch das Nukleinsäuremolekül gewonnen wird und die Schicht gegebenenfalls erneut zur Sorption mindestens eines Nukleinsäuremoleküls eingesetzt werden kann.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt c. von Anspruch 1 in einem weiteren Schritt die Schicht zusammen mit dem Nukleinsäuremolekül entsorgt wird.
21. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Schicht im wesentlichen oder vollständig aus mindestens einem säureaktivierten Schichtsilicat besteht.
22. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Desorption bzw. Abtrennung des mindestens einen Nukleinsäuremoleküls in einer alkalischen (pH 8 oder mehr) Pufferlösung, insbesondere einer Hochsalz-Pufferlösung, vorzugsweise mit mehr als 1 M NaCl, erfolgt.
23. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine säureaktivierte
Schichtsilicat in der Schicht mit einem Bindemittel zu Teilchenaggregaten oder Formkörpern verbunden oder auf einen Träger aufgebracht ist.
24. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Bindemittel um Alginat, Agar-Agar, Chitosane, Pektine, Gelatine, Lupinenproteinisolate oder Gluten handelt.
25. Schichtförmige Zusammensetzung, enthaltend mindestens ein säureaktiviertes Schichtsilicat und mindestens ein Nukleinsäu- remolekül, wobei die die Schichtdicke bei mindestens 1 mm liegt.
26. Verwendung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 24 oder einer schichtförmigen Zusammensetzung gemäß Anspruch 25 zur Abtrennung, Gewinnung oder Aufreinigung eines Nuleinsäuremoleküls .
27. Verwendung gemäß Anspruch 26 zur Abtrennung eines Nuklein- säuremoleküls von Proteinbestandteilen in einem flüssigen Medium.
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