DE3627063A1 - Verfahren zur abtrennung und reinigung von biopolymeren durch affinitaetschromatographie - Google Patents
Verfahren zur abtrennung und reinigung von biopolymeren durch affinitaetschromatographieInfo
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Description
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren
zur Abtrennung und Reinigung von Biopolymeren durch
Affinitätschromatographie mit Hilfe von porösem Silica
gel und daran oberflächlich kovalent gebundenen Affini
tätsliganden.
Für die Affinitätschromatographie werden in erster Li
nie poröse Träger wie Dextrane, Agarosen, Acrylamid
etc. eingesetzt, die Porengrößenverteilungen zwischen
200 und 1000 Å aufweisen. An diese Materialien sind
beispielsweise kovalent Antikörper gebunden. Mit derar
tigen Materialien ist es möglich, Proteine wie Insulin,
Interferone etc. im industriellen Maßstab zu reinigen.
In der US-PS 44 15 665 ist eine spezielle Methode zur
kovalenten Bindung von biologisch aktiven organischen
Substanzen an polymere Träger beschrieben, zu denen
unter anderem Agarose, Cellulose und Silicagel zählen.
Verwendet wurde in den Beispielen 4 und 5 ein poröses
Silicagel unbestimmter Porengröße und unbestimmter Korn
größe. Kovalent gebunden wurde N6-(6-Aminohexyl)-Adeno
sin-5′-Monophosphat. Dieses Material ist jedoch nicht
für die Affinitätschromatographie geeignet.
Die Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, das Ver
fahren zur Abtrennung und Reinigung von Biopolymeren
durch Affinitätschromatographie mit Hilfe von porösem
Silicagel und daran oberflächlich kovalent gebundenen
Affinitätsliganden zu verbessern, so daß hiermit eine
rasche, zuverlässige und hochspezifische Abtrennung und
Reinigung von Biopolymeren möglich ist.
Dabei soll einerseits der meistens sehr teure Affini
tätsligand, wie zum Beispiel Antikörper, optimal ausge
nutzt werden, zum anderen auch die Menge des Trägerma
terials so klein wie möglich gehalten werden, um unnö
tige Verluste und Verdünnungen zu vermeiden. Intensive
Untersuchungen verschiedener poröser Träger, verschie
dener Affinitätsliganden und verschiedener durch die
Affinitätschromatographie zu reinigender Biopolymere
haben zu dem überraschenden Ergebnis geführt, daß die
oben genannte Aufgabe optimal dadurch gelöst werden
kann, daß Silicagele verwendet werden mit definierten
engen Porengrößenbereichen, welche jeweils das fünf-
bis zwanzigfache der Größe des zu reinigenden Materials
aufweisen.
Werden Silicagele verwendet mit undefinierten und brei
ten Porengrößenbereichen, kann keines der oben genann
ten Ziele optimal gelöst werden. Werden Silicagele mit
definierten engen Porengrößenbereichen eingesetzt, wel
che zwar größer sind als das zu reinigende Material,
jedoch kleiner als das fünffache der Größe des zu rei
nigenden Materials, werden die teuren und wertvollen
Affinitätsliganden nur unvollständig ausgenutzt. Außer
dem wächst bei kleineren Porengrößenbereichen bereits
die Menge an ausgebluteten Affinitätsliganden bzw. ver
unreinigenden Fragmenten derselben. Werden Silicagele
eingesetzt mit Porengrößenbereichen, die größer sind
als das zwanzigfache der Größe des zu reinigenden Mate
rials, so sinkt die Oberfläche des Materials in so er
heblichem Maße, daß unnötig große Mengen Silicagel ein
gesetzt werden müssen und ein unnötig großes Volumen
von Elutionsflüssigkeit eingesetzt werden muß, um die
ursprünglich gebundenen Biopolymeren wieder aus dem
Material auszuwaschen.
Dies ist insbesondere bei therapeutisch einzusetzenden
Biopolymeren außerordentlich unerwünscht.
Innerhalb des erfindungsgemäßen Bereiches vom fünf- bis
zwanzigfachen der Größe des zu reinigenden Materials
ist der untere Bereich bevorzugt für praktisch kugel
förmige Biopolymere und der obere Bereich für langge
streckte und sperrige Biopolymere.
Weiterhin ist der untere Porengrößenbereich bevorzugt,
wenn relativ kleine Affinitätsliganden mit relativ kur
zen Spacern an die Oberfläche des Silicagels gebunden
sind, während der obere Porengrößenbereich bevorzugt
ist, wenn größere und sperrige Affinitätsliganden und/
oder längerkettige Spacer zur Bindung der Affinitätsli
ganden an die Oberfläche des Silicagels zum Einsatz
kommen.
Als oberflächlich kovalent gebundene Affinitätsliganden
kommen in erster Linie Antikörper in Frage, jedoch auch
andere mehr oder weniger große Substanzen mit spezifi
scher Affinität zu dem zu reinigenden Biopolymeren. Ein
typisches Beispiel hierfür ist das Protein A aus Sta
phylococcus aureus oder rekombinantes Protein A, wel
ches eine spezifische Affinität zu Immunglobulinen (IgG)
aufweist.
Besonders bedeutungsvoll ist das erfindungsgemäße Ver
fahren für die Abtrennung und Reinigung von Proteinen,
Glykoproteinen und/oder Nukleinsäuren, von Viren oder
Vaccinen, von Zellorganellen, prokaryontischen oder
eukaryontischen Zellen, Micellen oder Vesikeln, von
Chylomikronen, VLDL- (very low density), LDL- (low den
sity) und HDL- (high density) Lipoproteinen sowie Pro
teinkomplexen.
Es handelt sich somit insbesondere um Biopolymere mit
Größen von mindestens 50 bis 100 Å bis hinaus zu Biopo
lymeren mit Größen von 5000 und mehr Å. Erfindungsge
mäß werden somit poröse Silicagele eingesetzt mit de
finierten engen Porengrößenbereichen von mindestens 300
Å, vorzugsweise jedoch zwischen 500 und 10 000 Å. Prin
zipiell könnten auch Silicagele mit noch größeren Po
rengrößen eingesetzt werden, jedoch ist es bisher tech
nisch schwierig, Silicagele mit engen Porengrößenberei
chen dieser Größenordnung herzustellen.
Einige typische Anwendungsgebiete für das erfindungsge
mäße Verfahren sind im folgenden zusammengestellt:
- - Lebend-Vaccine (Pockenviren, ⌀ca. 2500 Å)
- - attenuierte Virusstämme (Maul- und Klauenseuche-Vi ren, ⌀ca. 2500 Å)
- - recombinante Vaccine hergestellt durch gentechnolo gische Expressionsverfahren aus höheren Zellkulturen oder Bakterien (z. B. Hepatis B-Virus Hüllproteinkom plexe, ⌀ca. 500 Å)
- - Vaccine auf der Basis von Vesikeln und Micellen (⌀ca. 100-500 Å).
- - Mitochondrien (⌀ca. 5000 Å)
- - Microbodies
- - z. B. Entfernung von Mykoplasmen (⌀ca. 1000Å) und Tumorzellen (⌀ca. 100 000 Å) aus Medien oder Blut
- - kleine Proteine: Lymphokine wie z. B. Interferon und TNF (MW 10 000-20 000)
- - mittlere Proteine: gewebsspezifische Plasminogenakti vatoren (MW ca. 65 000) IgG (MW 150 000, ⌀ca. 150 Å) Urokinase (⌀ca. 90 Å)
- - große Proteine: IgM (MW ca. 900 000 Å, ⌀ca. 900 Å) Blutfaktoren wie z. B. Faktor VIII (MW<1 Mio., ⌀<500Å)
- - Entfernung von Immunkomplexen wie Rheumafaktoren (MW 500 000, ⌀ca.<500 Å) durch Blutwäsche
- - Enzymkomplexe wie Fettsäuresynthethase (MW ca. 2,3 Mio.)
- - filamentöse Komplexe wie Microtubulin, Actinkomplexe
- - Ribosomen
- - Chylomikronen (⌀ca. 1000-10 000 Å)
- - VLDL (very low density lipoproteins), ⌀ca. 300- 500 Å
- - LDL (⌀ca. 200-250 Å)
- - HDL (⌀<100 Å)
Die kovalente Bindung der Affinitätsliganden an die
Oberfläche der Poren des Silicagels erfolgt in an sich
bekannter Weise, beispielsweise durch Umsetzung eines
Silans, welches durch anschließende Reaktionen am orga
nischen Rest aktiviert werden kann zur Umsetzung mit
den Affinitätsliganden.
Eine besonders schonende und deshalb bevorzugte Aktivie
rung besteht im Aufbau von Alkyl- bzw. Arylsulfonsäure
estern. Da diese in besonders schonender Weise mit Ami
nogruppen, Hydroxylgruppen und Sulfhydrylgruppen der
Affinitätsliganden reagieren und diese dadurch schonend
kovalent an das Silicagel binden. Prinzipiell sind aber
auch alle anderen bekannten Kupplungsreagenzien geeig
net, sofern diese nicht zu einer elektrischen Aufladung
des Affinitätsliganden oder einer sonstigen, die Affini
tät beeinflussenden Denaturierung führen. Prinzipiell
können sowohl kürzere als auch längere Spacer zwischen
Silicagel und den Affinitätsliganden eingebaut werden.
Besonders bevorzugt sind jedoch solche mit nur 2 bis 5
Kohlenstoffatomen. Kürzere Spacer können zu einer unnö
tigen sterischen Behinderung der Reaktion zwischen Af
finitätsliganden und zu reinigenden Biopolymeren füh
ren. Längere Spacer führen zu einer unnötigen Vergeu
dung des innerhalb der Poren zur Verfügung stehenden
freien Raumes, ohne den Wirkungsgrad der Affinitätsli
ganden zu erhöhen.
In den nachfolgenden Bezugsbeispielen ist die Herstel
lung von einigen Silicageln beschrieben, die ober
flächlich so aktiviert sind, daß sie verschiedene Af
finitätsliganden schonend kovalent binden können. In
den anschließenden Beispielen ist beschrieben, wie spe
zielle Affinitätsliganden oberflächlich kovalent gebun
den werden und die so entstandenen porösen Silicagele
zur effizienten Affinitätschromatographie der entspre
chenden Biopolymeren eingesetzt werden können.
Synthese von Diol-Silicagel
50 g poröses Silicagel mit einer Porengröße von 1000 Å
und einer Partikelgröße von ca. 60 µm werden in einem
500 ml Dreihalskolben bei einem Druck von <1 mbar 12
Stunden bei einer Temperatur von 150°C getrocknet und
aktiviert. Nach dem Abkühlen wird belüftet und mit 50
ml destilliertem γ-Glycidyloxypropyltrimethoxysilan in
200 ml absolutem Toluol und 1 ml absolutem Tributylamin
versetzt. Die Umsetzung erfolgt 12 Stunden bei 111°C,
der Rückflußtemperatur von Toluol. Nach der Reaktion
wird das Produkt Epoxy-Silicagel abgesaugt und zweimal
mit 250 ml Toluol, dreimal mit 250 ml Aceton und zwei
mal mit 0,005 M HCl gewaschen und abgesaugt. Das Epoxy-
Silicagel wird in 250 ml 0,005 M HCl suspendiert und in
2 Stunden bei 90°C die Epoxy-Gruppe zur Diol-Gruppe
gespalten.
Das Produkt Diol-Silicagel wird abgesaugt, fünfmal mit
H2O und zweimal mit Aceton gewaschen und bei 50°C ge
trocknet.
Aktivierung von Diol-Silicagel mit Tosylchlorid
50 g trockenes Diol-Silicagel mit 1000 Å Porengröße,
synthetisiert nach Bezugsbeispiel 1, wird in einem 500
ml Dreihalskolben bei einem Druck von <1 mbar 2 Stunden
bei 70°C getrocknet, um eventuell vorhandene Feuchtig
keit zu entfernen. Nach der Trocknung wird belüftet und
mit 250 ml absolutem Aceton und 1 ml absolutem Pyridin
versetzt, die Suspension im Vakuum entgast und an einen
Rührer angeschlossen. Zu dieser Suspension werden 10
mmol Tosylchlorid, gelöst in 50 ml absolutem Aceton,
unter ständigem Rühren langsam zugetropft. Nach der
Reaktion bei Raumtemperatur 20 bis 24°C für 30 Minuten
wird das Tosyl-aktivierte Silicagel abgesaugt und mit
Aceton, Aceton:2 mM HCl der Zusammensetzungen 75 : 25,
50 : 50, 25 : 75 gewaschen und abschließend mit 1 mM HCl
gewaschen, abgesaugt und gefriergetrocknet.
Aktivierung von Diol-Silicagel mit Trichlormethansul
fonsäurechlorid
50 g trockenes Diol-Silicagel mit 2500 Å Porengröße,
synthetisiert nach Bezugsbeispiel 1, wird in einem 500
ml Dreihalskolben bei einem Druck von <1 mbar 2 Stunden
bei 70°C getrocknet, um eventuell vorhandene Feuchtig
keit zu entfernen. Nach der Trocknung wird belüftet und
mit 250 ml absolutem Aceton und 1 ml absolutem Pyridin
versetzt und an einen Rührer angeschlossen. Die Suspen
sion wird unter Vakuum entgast und mit einem Eisbad auf
0°C gekühlt. Zu dieser Suspension werden 10 mmol Tri
chlormethansulfonsäurechlorid, gelöst in 50 ml absolu
tem Aceton, unter ständigem Rühren langsam zugetropft.
Nach der Reaktion bei 0°C für 30 Minuten wird das Tri
chlormethansulfonsäurechlorid-aktivierte Silicagel ab
gesaugt und mit Aceton, Aceton:2 mH HCl der Zusammen
setzungen 75 : 25, 50 : 50, 25 : 75 gewaschen und abschlie
ßend mit 1 mM HCl gewaschen und gefriergetrocknet.
Aktivierung von Dio-Silicagel mit 2,4,6-Trinitroben
zolsulfonsäurechlorid
50 g trockenes Diol-Silicagel mi5 5000 Å Porengröße,
synthetisiert nach Bezugsbeispiel 1, wird in einem 500
ml Dreihalskolben bei einem Druck von <1 mbar 2 Stunden
bei 70°C getrocknet, um eventuell vorhandene Feuchtig
keit zu entfernen.
Nach der Trocknung wird belüftet und mit 250 ml absolu
tem Aceton und 1 ml absolutem Pyridin versetzt und an
einen Rührer angeschlossen. Die Suspension wird unter
Vakuum entgast und mit einem Eisbad auf 0°C gekühlt. Zu
dieser Suspension werden 10 mmol 2,4,6-Trinitrobenzol
sulfonsäurechlorid, gelöst in 50 ml absolutem Aceton,
unter ständigem Rühren langsam zugetropft. Nach der
Reaktion bei 0°C für 30 Minuten wird das 2,4,6-Trini
trobenzolsulfonsäurechlorid-aktivierte Silicagel abge
saugt und mit Aceton, Aceton:2 mM HCl der Zusammenset
zungen 75 : 25, 50 : 50, 25 : 75 gewaschen und abschließend
mit 1 mM HCl gewaschen und gefriergetrocknet.
Aktivierung von Diol-Silicagel mit 2,2,2-Trifluorethan
sulfonsäurechlorid (Tresylchlorid)
50 g trockenes Diol-Silicagel mit 10 000 Å Porengröße,
synthetisiert nach Bezugsbeispiel 1, wird in einem 500
ml Dreihalskolben bei einem Druck von <1 mbar 2 Stunden
bei 70°C getrocknet, um eventuell vorhandene Feuchtig
keit zu entfernen. Nach der Trocknung wird belüftet und
mit 250 ml absolutem Aceton und 1 ml absolutem Pyridin
versetzt und an einen Rührer angeschlossen. Die Suspen
sion wird unter Vakuum entgast und mit einem Eisbad auf
0°C gekühlt. Zu dieser Suspension werden 10 mmol Tresyl
chlorid unter ständigem Rühren langsam zugetropft. Nach
der Reaktion bei 0°C für 30 Minuten wird das Tresylchlo
rid-aktivierte Silicagel abgesaugt und mit Aceton, Ace
ton:2 mM HCl der Zusammensetzungen 75 : 25, 50 : 50, 25 : 75
gewaschen und abschließend mit 1 mM HCl gewaschen und
gefriergetrocknet.
Reinigung von Human-Immunglobulinen (IgG) mit Protein A-
Affinitätschromatographie
A: 10 g Sulfonylchlorid aktiviertes Silicagel mit ei
ner Porengröße von 1000 Å werden in 50 ml 0,1 M Na-
Phosphatpuffer, pH 8.0, suspendiert und im Vakuum ent
gast. Zu dieser Suspension werden 300 mg Protein A (aus
Staphyloccus aureus oder recombinantes Protein A)
gelöst in 15 ml 0,1 M Na-Phosphatpuffer, pH 8.0, zuge
geben. Die Suspension wird 6 Stunden bei 4°C geschüt
telt, um eine hohe Immobilisierung von Protein A zu
gewährleisten. Nach der Reaktion wird das Produkt Pro
tein A-Silicagel abfiltriert, in 100 ml 0,1 M Mercapto
ethanol, 0,1 M Na-Phosphatpuffer, pH 8.0, suspendiert
und 2 Stunden geschüttelt, um nicht abreagierte Sulfo
nylgruppen zu blockieren. Nach der Blockierungsreaktion
wird das Produkt fünfmal mit 0,1 M Na-Phosphatpuffer,
pH 7.0, gewaschen.
B: 10 g Protein A-Silicagel-1000 Å (1000 Å) werden in
eine 1,27 cm × 15 cm Chromatographiesäule mit Einlaß-
und Auslaßadapter gepackt und zweimal mit 3 Säulenvolu
mina 0,1 M Na-Phosphatpuffer, pH 7.0, und 2 Säulenvolu
mina 0,05 M Na-Citratpuffer, pH 3.0, gewaschen und 0,1
M Na-Phosphatpuffer, pH 7.0, äquilibriert. Die IgG-Pro
be, bestehend aus 1000 mg rohem Human-IgG, wurde in
100 ml 0,1 M Na-Phosphatpuffer, pH 7.0, gelöst und mit
einer Flußgeschwindigkeit von 10 ml/min auf die Säule
adsorbiert. Verunreinigungen mit anderen Proteinen und
unspezifisch gebundenes IgG werden mit 2 Säulenvolumina
0,1 M Na-Phosphatpuffer, pH 7.0, ausgewaschen und das
spezifisch gebundene Human-IgG mit 0,05 M Citratpuffer,
pH 3,0, und einer Flußgeschwindigkeit von 1 ml/min elu
iert.
Die Bindekapazität von Protein A-Silicagel (Porengröße
1000 Å+ wurde zu 25 mg IgG/ml Säulenvolumen bestimmt.
Reinigung von Human-Immunglobulinen (IgG) mit Anti-Hu
man-IgG Antikörpern durch Affinitätschromatographie
A: 200 mg Anti-Human-IgG Antikörper werden analog Bei
spiel 1A an 10 g Sulfonyl aktiviertes Silicagel mit
einer Porengröße von 2500 Å immobilisiert.
B: Entsprechend Beispiel 1 B wird das Anti-Human-IgG
Silicagel-2500 in eine Chromatograhiesäule gepackt und
äquilibriert. Nach der Bindung von rohem Human-IgG wer
den die unspezifisch gebundenen Proteine mit 0,1 M Na-
Phosphatpuffer, pH 7.0, ausgewaschen und das spezifisch
gebundene Human-IgG mit 0,05 M Citratpuffer, pH 3.0,
und einer Flußgeschwindigkeit von 1 ml/min eluiert. Die
Bindekapazität von Anti-Human-IgG Silicagel (Porengröße
2500 Å) wurde zu 10 mg Human IgG/ml Säulenvolumen be
stimmt.
Reinigung von human IgM mit Maus Anti-human-IgM Anti
körper Affinitätschromatographie
A: 10 mg Anti-human-IgM Antikörper werden analog Bei
spiel 1 an 10 g Sulfonyl aktiviertes Silicagel mit
einer Porengröße von 10 000Å immobilisiert.
B: Entsprechend Beispiel 1 B wird das Anti-human-IgM
Antikörper-Silicagel-10 000 in eine Chromatograhiesäule
gepackt und äquilibriert.
Nach der Bindung von rohem Human-IgM werden die unspe
zifisch gebundenen Proteine mit 0,1 M Na-Phosphatpuf
fer, pH 7.0, ausgewaschen und das spezifisch gebundene
Human-IgM mit 0,05 M Citratpuffer, pH 3.0, und einer
Flußgeschwindigkeit von 1 ml/min eluiert. Die Bindeka
pazität von Maus Anti-Human-IgM Silicagel (Porengröße
10 000 Å) wurde zu 0,75 mg IgM/ml Säulenvolumen be
stimmt.
Claims (9)
1. Verfahren zur Abtrennung und Reinigung von Biopolymeren
durch Affinitätschromatographie mit Hilfe von porösem
Silicagel und daran oberflächlich kovalent gebundenen
Affinitätsliganden, dadurch gekennzeichnet, daß Silica
gele verwendet werden mit definierten engen Porengrößen
bereichen, welche jeweils das fünf- bis zwangzigfache
der Größe des zu reinigenden Materials aufweisen.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
Silicagele verwendet werden mit definierten engen Po
rengrößen im Bereich von 500 bis 10 000 Å.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich
net, daß als Affinitätsliganden Antikörper verwendet
werden.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß das zu reinigende Material Protei
ne, Glykoproteine und/oder Nukleinsäuren sind.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß das zu reinigende Material Viren
oder Vaccine sind.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß das zu reinigende Material Zellor
ganellen sind.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß das zu reinigende Material prokaryo
tische oder eukaryotische Zellen sind.
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß das zu reinigende Material Micel
len, Vesikel, Chylomikronen, VLDL-, LDL- und/oder HDL-
Lipoproteine sind.
9. Verwendung von porösem Silicagel definierter enger Po
rengrößenbereiche mit daran oberflächlich kovalent ge
bundenen Affinitätsliganden für die Affinitätschromato
graphie von Biopolymeren mit Größen von 1/5 bis 1/20
der jeweiligen Porengröße des Silicagels.
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