JP4026724B2 - 毛管電気泳動のためのポリビニルアルコール（ｐｖａ）をベースとする共有結合の安定した親水性コーティング - Google Patents

Description

発明の分野
この発明は、面のコーティング、さらに詳しくは、毛管電気泳動カラムに適切なコーティングに関するものである。
発明の背景
毛管電気泳動分離技術は、生物学関連サイエンスの分野で広い用途をもつ。ペプチド類、プロテイン類、オリゴヌクレオチド類およびオリゴ糖類のような分子スピシーズは、緩衝液内で電界を作用させて拡散させることにより分離される。通常、この分離は、壁が薄く、径が細い毛管内で行われ、電気泳動分離の間、ゾーンをこわしてしまう熱の放散をなくすようにしている。
ゾーンのくずれを起こす他のメカニズムとしては、不均一な電気浸透、過剰な電気浸透流および毛管内面への溶質の吸着がある。しかしながら、これらの問題は、電気泳動毛管内壁を種々のポリマー物質でコーティングすることにより、なくしたり、克服できる。
米国特許第４，６８０，２０１号において、Hjertenは、細いボアの毛管の内壁にポリアクリルアミドの単分子ポリマーコーティングを施し、例えば、γ−メタクリルオキシプロピルトリメトキシシランといった二官能試薬により毛管壁に結合する方法を記載している。
米国特許第５，０７４，９８２号のNovotny他は、電気泳動分離に使用のシリカ毛管の内壁に、加水分解安定性のためにグリニャール試薬を用いて、二官能試薬コーティングを施すことができることを記載している。
溶融シリカ毛管面への被膜として吸着されたポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を熱的に不動態化させることは、分析化学66:2038-2046(1994)にGilges他が記載している。これらのコーティングは、幅広いｐＨにわたる分離に安定しているが；しかしながら、バッファーｐＨが高いと、ＰＶＡ分子の吸着度と分析物対壁の反応の抑制が弱められる。
発明の概要
本発明は、全般的には、毛管電気泳動カラムにおけるような、面に適切なコーティングと、それらの調製方法を特徴とする。この発明のマイクロ毛管カラムは、大まかに言えば、内部キャビティと、内面をもつ壁とを有する微細毛管を含み、該壁の内面は、該内面に付着し、有機溶剤中で有機化合物と共重合できる官能基および該官能基と共重合した有機化合物のポリマーとを含む相互結合ポリマーコーティングを有している。該コーティングは、該カラム壁に共有または非共有付着でき、さらに、コーティングマテリアルの層を付加することができる。有機化合物は、ビニルエステルであることが好ましく、最も好ましいものは、酢酸ビニルであり、コーティングの露出面を形成する付着したポリマーは、ポリビニルアルコールであり、その水酸基は、所望の態様で誘導体化できる。最も好ましい毛管カラムにおいては、コーティングマテリアルには、Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ結合によって該カラムに共有付着のポリビニルアルコールをベースとするポリマーが含まれる。
発明の方法は、大まかに言えば、毛管壁の内面をモディファイして、有機溶剤中で有機化合物と共重合できる官能基を付着させ、有機溶剤中の有機化合物溶液をマイクルキャピラリーの内部キャビティ内へ導入し；有機化合物の分子を付着した官能基と共重合させ、マイクロキャピラリーカラムの内面に相互結合のポリーマー性コーティングマテリアルを付着させたマイクロキャピラリーを提供することを含む。付着した官能基は、共有結合のビニル基であり、有機化合物は、ビニルエステルであり、ポリビニルエステルの生成された相互接続のポリマー性コーティングマテリアルは、ポリマーホモログ反応でモディファイされて、所望のポリビニルアルコールコーティングを形成することが好ましいものである。
他の点においては、発明の方法は、付着の疎水性ポリマーコーティングマテリアルを親水性コーティングマテリアルへ直接コンバートすることで、親水性ポリマーコーティングをもったカラムを形成することを概ね特徴とする。結果としての親水性ポリマーコーティングは、該カラムの意図する用途に応じて酸性、塩基性または中性官能機能をもつことができる。
“ＣＥカラム”または“マイクロキャピラリーカラム”の用語には、毛管電気泳動を行うことができる全ての形状のベッセルが含まれるものである。例えば、毛管電気泳動のために、チップの面に微細構造で作られたオープングルーブをもつチップスを使うことも知られている。
発明のコーティングは、ＣＥカラムまたは一般的な面モディフィケーションにとって適切な新規で安定した面を創る。該コーティングは、幅広いｐＨの範囲にわたって安定であり、所望に応じて、各種の付加的層をグラトしたり、および／または吸着したりすることが極めて効率よく行えるものである。毛管電気泳動に使用のとき、該コーティングは、電気浸透流を抑制し、または、これをコントロールし、カラム面への分析物の吸着を防ぐ。
図面の簡単な記述
発明の他の特徴ならびに利点は、添付図面を関連させての、発明の好ましい以下の実施例の記述から明らかになるものであって、図面において：
図１は、相互連結されたポリビニルアルコールをベースとするポリマーコーティングがＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合によってカラムの内壁に共有付着している本発明の一実施例のコーティングされたマイクロキャピラリーカラムの断面を示し；
図２は、発明の方法の一つの実施例の面モディフィケーション工程において行われる、オリゴマー・ビニルシラノール化合物の混合体を作るビニルトリメトキシシランの加水分解と濃縮を示し；
図３は、発明の方法の一つの実施例の面モディフィケーション工程において行われる、図２のオリゴマー・ビニルシラノール化合物の付着とキュアリングとを示し；
図４は、発明の方法の一つの実施例による、共有結合の疎水性ポリマー（酢酸ポリビニル）を作るモノマー酢酸ビニルと、図３の付着したオリゴマー・ビニルシラノール化合物との共重合を示し；
図５は、共有結合の疎水性ポリマー（酢酸ポリビニル）の親水性相当部（ポリビニルアルコールまたはＰＶＡ）への転換を示し；
図６から図９は、発明のマイクロキャピラリーカラムを用いての、ｐＨ値が４．４、８．８、６．２および１０．０それぞれにおけるプロテインのオープンチューブ毛管ゾーン電気泳動を示し；
図１０は、発明のマイクロキャピラリーカラムを用いての、プロテインの等電集束を示し；
図１１は、発明のマイクロキャピラリーカラムを用いての、ヘモグロビン変異体の等電集束を示し；
図１２は、発明のマイクロキャピラリーカラムを用いての、ＨａｅIIIで蒸解されたΦＸ１７４のオープンチューブ毛管ゾーン電気泳動を示し；
図１３は、発明のマイクロキャピラリーカラムを用いての、ＤＮＡシーケンシングリアクション・プロダクツのポリマー網状組織（ネットワーク）分離を示し；そして
図１４は、発明のマイクロキャピラリーカラムを用いての、種々の長さをもつポリ-ｄＡオリゴヌクレオチド類のポリマー網状組織（ネットワーク）分離を示す。
発明の詳細な記述
毛管電気泳動に適用されるものとしての発明は、生物高分子物質の分離にすぐれたパフォーマンスをもつ極めて安定した親水性被膜のマイクロキャピラリーカラムを得るための新規の方法を提供する。図１に示すように、発明の好ましいマイクロキャピラリーカラムは、溶融シリカ微細毛管１０を含み、これは、内壁１２と、Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ結合１６により内壁１２に共有付着された相互連結ポリビニルアルコールをベースとするポリマーコーティング１４とを有する。
発明の好ましい方法は、概論すれば、第１の工程として、反応官能体としての遊離ビニル基を残しながら、反応性が高いビニル・シラノール・オリゴマーで毛管のシリカ面をシラン化する工程を含む。次に、面が変性された溶融シリカ毛管の内部キャビティにおいて、疎水性モノマー（酢酸ビニル）を有機溶剤中でアンカーされたビニル基と共重合させる。この工程では、共有結合された疎水性ポリマー（酢酸ポリビニル）は、親水性のもの（ポリビニルアルコールまたはＰＶＡ）へコンバートされる。（少量の酢酸基が残存することが有り得る。）発明のポリビニルアルコールでコートされた毛管を作る手順は、簡単で、信頼性があり、再現可能なものである。毒性がある化学品は、一切含まれていない。出来上がった親水性被膜は、化学的および加水分解的に極めて安定で、幅広いｐＨ範囲にわたり、生物高分子物質の分離が効率良く行える。
以下の工程（実施例においてさらに詳しく記載する）によって、溶融シリカ毛管の面にポリビニルアルコール被膜が共有付着して、安定な被膜になる：
有機化合物のモノマーとの共重合のために、安定した共有結合基を得る溶融シリカ毛管の面の変性（モディフィケーション）。
面の変性を反復再現できるようにするために、まず毛管を酸で処理して、個々の溶融シリカ毛管の面の品質の相違（メーカーの相違、バッチ・ツー・バッチからのエージングヒストリーの相違）を直す。この工程の結果、反応性シラノール基を数多く露出させることにより毛管面が一層活性化し、面もより均一になる。毛管の壁は、面のシラノールをオリゴマー・ビニルシラノール化合物の混合物と反応させることで、実際にモディファイされる。図２を参照すると、これらの化合物は、ビニルトリメトキシシラン２２を限定した量の０．１Ｍ ＨＣｌと反応させることで溶液内で得られる。酸は、保護のメトキシ基を切り離し、シランを面反応性が高いポリシラノール・スピシーズ（ビニルシランエトリオール）２４へコンバートする。さらに、ビニルシランエトリオールは、オリゴマー２６に濃縮する。限定された量で存在する水が該混合物における該化合物の重合とクロスリンキングを防ぎ、これらの沈殿をなくす。これらのシラン化混合物は、数日にわたり安定していることに注目すべきである。
図３を参照すると、オリゴマー２６を毛管面１２に引き続いて付着すること（オリゴマー・シラノール基３０と共に面のシラノール基２８が濃縮されることにより）の結果、Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ結合１６は、極めて安定し、酢酸ビニルと共重合可能な共有結合されたビニル基をもつ面になる。オレフィン系非官能シランを使用することで、付着の分子における加水分解的に不安定な官能基を除くものである。さらに、ビニルシラン基は熱的に安定しているから、モディファイされた面を高温（１１０℃、１時間）でキュアリングすることができ、結合ケミストリーの安定度を高める。
毛管内の酢酸ビニルを有機溶剤中で重合すること。
図４に示すように、酢酸ビニルモノマー３４を毛管面１２の共有結合されたビニルシランのビニル基３２と共重合させることで、共重合された結果の酢酸ポリビニル３６がシリカ面に共有結合される。（図４の酢酸ポリビニル３６の表示における点線は、酢酸ビニルモノマーの二重結合の早期ロケーションを示す。当業者は、酢酸ビニルのポリマーに対し、酢酸ポリビニルと言っているが、これらのポリマーには、ビニル基は最早含まれていない。）
毛管内の有機溶剤中で重合を開始するが、この重合は、α，α’−アゾジイ２ブチロニトリルまたは過酸化ベンゾイルのような、前記モノマーの沸点以下で分解しだすラジカル・イニシエーターの熱分解により開始される。適切な環境のものとでは、重合溶液をモディファイされた毛管壁に薄いフィルム状でデポジットできる。この重合工程においては、例えば、アクリルアミドの重合のように、酸素量をトレースすることに神経を払う必要がない。酢酸エチルのような有機溶剤は、良好な重合収率をもたらす。有機溶剤中で生じたポリマー溶液の粘度は、極めて低く、したがって、４０％に達するモノマーを重合に使用でき、高いグラフト密度が保証される（面のビニル基との共重合および、それによってのポリマーの共有付着）。さらに、ポリマー溶液の過剰分を毛管から簡単に追い出すことができる（水溶液中のアクリルアミドを用いる。該密度リミットは、約７％モノマーである）。
共有結合の疎水性ポリマー（酢酸ポリビニル）を親水性のもの（ポリビニルアルコール又はＰＶＡ）にコンバートすること
疎水性酢酸ポリビニルポリマーを毛管面に結合した後、該コーティングを所望のフォルムであるポリビニルアルコール（ＰＶＡ）へコンバートしなければならない。図５を参照すると、ポリマー・ホモログ反応においては、共有結合された酢酸ポリビニル３６は、室温でナトリウム・メチラート溶液を毛管にフラッシングすることで、脱アセチル化される。塩基触媒による脱アセチル化は、環境温度でも極めて効率的である；この工程は、ナトリウム・メチラート溶液を短時間−約１５分、毛管内にフラッシングすることで簡単に行える。エステル基を非水溶性のコンディションで加水分解するので、シランのケミストリーは、このストロングの塩基による影響を受けない。加水分解の溶剤としての無水メタノールが生じたポリビニルアルコール１４を沈殿させるから、シラン結合ケミストリーをポリマーの下に隠蔽する。この工程によって、親水性の共有付着したポリビニルアルコール被膜をもつマイクロキャピラリーが得られる。
例えば、毛管内におけるアクリルアミドの水溶液の重合と比較して、上記した工程は、いくつかの利点を有する。重合化溶液を毛管内に注入した後、ラジカル・イニシエーターの熱分解により重合が開始されるので、全体の手順すべてが順調に、コントロール可能に行える。これに対し、コンベンショナルの水溶液中におけるアクリルアミドの重合は、成分（例えば、ＴＥＭＥＤ、ＡＰＳ、アクリルアミド・モノマー類）がコンバインされるや否や開始され、該溶液を素早く取り扱って早熟なポリマー形成を防がなければならない。有機媒体における重合により、ポリマー溶液の濃度を一層低下することができ、その結果、より濃度が高いモノマーを使用できる。これによって、グラフト重合密度が高くなり、一層良好なパフォーマンスと安定性が得られる。重合形成後、４０％酢酸ビニルによって、過剰の有機溶剤を毛管から簡単にプッシュアウトできるもので、一方、水中においては、７％アクリルアミドがほぼそのリミットである。記載した条件のもとで重合可能な液体有機化合物は、実際に、付加溶剤なしに使用できる。この場合、重合が十分に達成された後、過剰な化合物は、毛管から排出される。
有機溶剤における重合は、水における重合よりも酸素に対しセンシティブでなく、この点で、脱ガス工程が不要で、メーカーから供給される化学品を使用できる。これによって、工程全体が極めて容易簡便なものとなり、得らる結果も信頼に足るものになる。最後に、ケミカルズ（酢酸ビニル、酢酸エチルおよび過酸化ベンゾイル）は、通常これまでの重合に使用されているもの、例えば、水溶性アクリルアミドに比べ毒性が極めて低い。
使用
上記した方法によって、幅広いｐＨ値にわたりプロテインを分離する優秀なパフォーマンスをもつ毛管が得られる（図６〜図９参照）。ｐＨがほぼ中性（ｐＨ＝６．２０、図８）であっても、ノーマルなバッファーコンディションにおいてプロテインの優れた分離が行える。電圧５４０Ｖ／ｃｍ、ｐＨ１０でコンスタントに使用の毛管は、７日後のマイグレーションタイムにおいて、なんら効率またはシフトのロスを示さなかった。これに対し、アクリルアミドまたはアクリラートをベースとするポリマー類すべては、高いｐＨにおける官能基の加水分解により電荷されてしまうことが分かっている。このコンディションにより、劣化がピークに達し、ポリアクリルアミドでコーティングされたＣＥカラムにおける高いｐＨで分離されたサンプルに対するマイグレーションタイムにシフトが生ずる。さらに、発明の方法により作られた毛管は、等電フォーカッシングに使用して満足のゆく結果が得られた。それらの化学的安定性によって、すぐれたマイグレーションタイム再現性を達成できた。
発明の方法により、種々の他のビニルエステル類どれでも毛管カラムの内面へ共有結合するポリビニルアルコール・コーティングを作るために使用できる。さらに、好ましいエステルである酢酸ビニルに加えて、他の適切なビニルエステル類には、プロピオン酸塩、酪酸塩、安息香酸塩またはラウリル酸塩が含まれる。さらに、発明の方法は、毛管壁に付着した官能基と、有機溶剤中で共重合可能な有機化合物からコーティング層を形成するためにも有効である。適度の疎水性のモノマー（例えば、ビニルピロリドン、ヒドロキシルアルキル（メス）アクリル酸塩など）を使用して、重合ホモログ転換を引き続いて発生させずに、水溶性バッファー内でバイオポリマーのＣＥ分離に使用できる十分な親水性をもつ付着のポリマーを作ることができる。
アンカーされた官能基は、カラム壁に共有または非共有付着されることができる。ビニルエステル類と共重合できる官能基には、ビニル基が含まれることが好ましいいが、有機溶剤中で共重合可能な官能基（アリル基、アクリル基、メタアクリル基または他の二重結合を含む基のようなもの）もまた含まれる。他の官能基も他の重合可能な有機化合物との重合に使用できる。
毛管は、溶融シリカで作られていることが好ましく、アンカーされた官能基は、記載したシラン・カップリング・ケミストリーによって、カラムの内面へ共有付着されるものが好ましい；しかしながら、他のカップリング方法も当業者にとって自明である。また、毛管は、適当な官能基をすでに含んでいるもの、または、共重合可能な基を該面に結合させる有機ポリマーで作ることもできる。
分離技術にとって重要な他の面のコーティング（シリカゲル、ポリスチレンなど）も発明の方法を用いて簡単に行える。ＰＶＡコーティングに関する、ここでの記載の好ましい方法は、モノマーと共重合可能な基でモディファイされた全てのシリカ面（またはポリマー面）に適用できる。このプロセスは、プロテインのサイズ排除クロマトグラフィーのために、特にプロテイン吸着度が低い面が特に望ましいＨＰＬＣにとり極めて重要度が高い。
発明の方法により作られたコーティング（被膜）は、これを簡単に誘導体化し、または、モディファイして、面ケミストリーを変えたり、または、付加的なコーティング層を付着できる。例えば、毛管内で、または、シリカゲルの面で共有結合のＰＶＡコーティング（記載のとおり調製）へモディフィケーションするには、二（または多）官能試薬（ジエポキサイド、ジイソシアネート、酸無水物類のようなもの）によるクロスリンキングが含まれる；ポリヒドロキシのコーティングをポリエーテル類、ポリエステル類などへ化学的にコンバートするには、水酸基とモノマーまたはポリマー試薬との化学反応；エポキサイドまたはアセタールにおけるように、隣接の水酸基ファンクショナリティーのリンキング；または、官能性面と、電荷を導入し、その結果、面にイオン交換キャパシティをもたらせる基との反応による。熱処理の結果、該コーティング（被膜）のフィジカルモディフィケーション（ポリマー層のオリエンテーション、水素結合、部分結晶化）またはケミカルモディフィケーション（部分的または全体的濃縮と、したがって、クロスリンキング）が行われる。１，２−および１，３ジオール類の分布に影響する重合の条件または重合後のケミカルコンバージョンのモディフィケーションも可能である。
ＰＶＡで被膜されたカラムにホウ酸塩含有バッファーを使用すると、ＰＶＡ水酸基と共に錯体が形成される。高いｐＨにおいての形成された面のチャージが被覆されていない溶融シリカ毛管に匹敵するＥＯＦを与える。かくて、ＰＶＡが被覆された毛管は、切り替え可能な（バッファーにより）ＥＯＦをもつ毛管とみなされる；ＰＶＡ被覆のＨＰＬＣサポートと共に、ホウ酸塩は、ダイナミック・カチオン交換体を生むのに用いることができる。
ＰＶＡ被覆シリカ面で可能な面ケミストリーは、該面がポリヒドロキシ化合物（多価アルコール）として認められることができる点から広い範囲の化学反応が見込まれる。この特性は、抗体または他のバイオスペシフィック試薬がヒドロキシ基と反応する基を介して被覆された面へ簡単に結合されるので、親和力のあるＣＥまたはＨＰＬＣのための親和性マトリックス形成に有用である。付着した抗体の下のＰＶＡ被膜により、吸着度が確実に低くされ、かくして、固有でない反応を排除する。
以下の実施例は、本発明の利点を示すために、そして、これを作り、使用する通常の知識の人を助けるために提示したものである。これらの実施例は、いかなる点においても、記載の範囲を限定するものではない。
実施例 Ｉ
共有結合されたポリビニルアルコール（ＰＶＡ）被膜の毛管の調製：
Ａ） 長さ約６０ｃｍで、内径が７５μｍのポリイミド被覆溶融シリカ毛管を温度１１０℃、２時間にわたり濃縮ＨＣｌ／Ｈ₂Ｏ（１：１）でリンスして、シラン結合ケミストリーがうまくゆくように、シラノール濃度が高い面を作る。ついで、該毛管をリンスしてｐＨを中性にし、ゆるやかにヘリウムを流しで乾燥する。
Ｂ） シラン化溶液を準備する。これは、２ｍｌのビニルトリメトキシシランと、０．４ｍｌの０．１Ｍ ＨＣｌとを混合して作る。攪拌すると、イニシャルの二つのフェーズミクスチュアーは、アルコキシシラン基の加水分解と、高い発熱反応であるメタノールの遊離とにより均質になる。ビニルシラノールの加水分解と濃縮には、１時間あればよい。オリゴマー・ビニルシラノール類の溶液を１時間にわたり複数の毛管に強制的に通し、夜通しそのままにしておく。翌日、該毛管をメタノールでリンスする。ヘリウムをゆるやかに流しながら、温度１１０℃でキュアリングする。
Ｃ） ３ｍｌの酢酸エチルと、２ｍｌの酢酸ビニルとを混合し、酢酸ビニルの濃度を４０％（Ｖ／Ｖ）として、重合溶液を調製する。酢酸エチルに１００μｌの過酸化ベンゾイル５％溶液を添加し、イニシエーターの濃度を０．２５％にする。Ｂ）からのビニルがモディファイされた毛管に重合溶液を充填し、７５℃、２０時間で重合を行う。ついでポリマー溶液を排出し、酢酸エチルとメタノールとで毛管をリンスし、結合していない酢酸ポリビニルを除去する。
Ｄ） 共有結合した酢酸ポリビニルをポリビニルアルコールへコンバートするために、Ｃ）からの被覆された毛管（複数）をメタノール中で０．５Ｍナトリウム・メチラートの溶液で１５分にわたりリンスする。その後、メタノールで毛管をリンスし、ついでヘリウムの流れで乾燥する。
実施例 II（図６）
サンプル：（１）リソチーム、（２）シトクロムＣ、（３）ミオグロビン、（４）トリプシノゲン、（５）α−キモトリプシノーゲンＡ（それぞれ０．１ｍｇ／ｍｌ）。被膜：実施例Ｉに記載のＰＶＡ。条件：ｉ．ｄ．＝７５μｍ；Ｌ＝３０／３７ｃｍ；バッファー；２０ｍＭ ε−アミノカプロン酸、ｐＨ＝４．４０；注入：５ｋＶで４秒；分離電圧：２０ｋＶ。
実施例 III（図７）
サンプル：（１）グルコース−６−フォスファテデヒドロギナーゼ、（２）トリプシン・インヒビター、（３）Ｌ−アスパラギナーゼ、（４）α−ラクトアルブミン（それぞれ０．１ｍｇ／ｍｌ）。被膜：実施例Ｉ。条件：ｉ．ｄ．＝７５μｍ；Ｌ＝３０／３７ｃｍ；バッファー：２０ｍＭ ＴＡＰＳ／ＡＭＰＤ、ｐＨ＝８．８０；注入：５ｋＶ、４秒；分離電圧：２０ｋＶ。
実施例 IV（図８）
サンプル：（１）リソチーム、（２）キトクロム、（３）ミオグロビン、（４）トリプシノゲン、（５）α−キモトリプシノーゲンＡ（それぞれ０．１ｍｇ／ｍｌ）。被膜：実施例Ｉ。条件：ｉ．ｄ．＝７５μｍ；Ｌ＝３０／３７ｃｍ；バッファー：２０ｍＭ ＴＲＩＳ／カコジル酸、ｐＨ＝８．８０；注入：５ｋＶ、４秒；分離電圧：２０ｋＶ。
実施例 Ｖ（図９）
サンプル：（１）グルコース−６−フォスファテデヒドロギナーゼ、（２）トリプシン・インヒビター、（３）Ｌ−アスパラギナーゼ、（４）α−ラクトアルブミン（それぞれ０．１ｍｇ／ｍｌ）。被膜：実施例Ｉ。条件：ｉ．ｄ．＝７５μｍ；Ｌ＝３０／３７ｃｍ；バッファー：２０ｍＭ ＣＡＰＳ／ＮａＯＨ、ｐＨ＝１０．０；注入：５ｋＶ、４秒；分離電圧：２０ｋＶ。
実施例 VI（図１０）
サンプル：（Ａ）ミオグロビン（ｐｌ＝７．２）、（Ｂ）炭酸脱水酵素Ｉ（ｐｌ＝６．６）、（Ｃ）炭酸脱水酵素II（ｐｌ＝５．９）、（Ｄ）β−ラクトグロブリンＡ（ｐｌ＝５．１）（各プロテイン０．１ｍｇ／ｍｌを１：１でＰｈａｒｍａｌｙｔｅ２％（３−１０）と混合）。被膜：実施例Ｉ。条件：ｉ．ｄ．＝５０μｍ；Ｌ＝３０／３７ｃｍ；フォーカッシング：２５ｋＶで；動態化：１０分後の低圧スタート（２５ｋＶ）；陽極液：２０ｍＭ Ｈ₃ＰＯ₄；陰極液：２０ｍＭ ＮａＯＨ。
実施例 VII（図１１）
サンプル：ヘモグロビン・ヴァリアンツＣ（ｐｌ＝７．４５）、Ｓ（ｐｌ＝７．２０）、Ｆ（ｐｌ＝７．００）およびＡ（ｐｌ＝６．９５）（それぞれ０．１ｍｇ／ｍｌを１：１で２％ ａｍｐｈｏｒｉｎｅ混合体と混合（Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ、ＳｅｒｖａｌｙｔｅおよびＡｍｐｈｏｌｙｔｅ））。
被膜：実施例Ｉ。条件：ｉ．ｄ．＝５０μｍ；Ｌ＝３０／４０ｃｍ；フォーカッシング：３０ｋＶで；動態化：１５分後ハイドロダイナミック（ｄ Ｈ＝５ｃｍ）スタート（３０ｋＶ）；陽極液：０．５％酢酸；０．２５％水酸化アンモニウム。
実施例 VIII（図１２）
サンプル：Ｈａｅ IIIでダイジェストしたΦＸ１７４。被膜：実施例Ｉ。条件：ｉ．ｄ．＝１００μｍ；Ｌ＝２６．７５／２７．５０ｃｍ；ふるいマトリックス：４０ｍＭ ＴＡＰＳ／ＴＲＩＳにおける１％メチルセルロース（２％で４０００ｃｐｓが与えられる）；注入：５ｋＶで５秒；分離電圧：５ｋＶ。
実施例 IX（図１３）
サンプル：Ｍ１３ｍｐ１８でのジデオキシチミジネトリフォスフェートでターミネートされたＦＡＭラベル・プライマー・シーケンシング反応。被膜：実施例Ｉ。条件：ｉ．ｄ．＝１００μｍ；Ｌ＝３０／４０ｃｍ；ふるいマトリックス：３０％ホルムアミドおよび３．５Ｍユリアをもつ４０ｍＭ ＴＲＩＳ／ＴＡＰＳにおける４％Ｔ ＬＰＡ；分離電圧：８ｋＶ；注入：８ｋＶで５秒。
実施例 Ｘ（図１４）
サンプル：ポリ−ｄＡオリゴヌクレオチド １２−１８、２５−３０および４０−６０。被膜：実施例Ｉ。条件：ｉ．ｄ．＝１００μｍ；Ｌ＝２０／２７ｃｍ；ふるいマトリックス：１０％ポリアミド＋４５％ＤＭＳＯ＋１０％ユリア＋３５％ＴＡＰＳ／ＴＲＩＳ（５０ｍＭ）；注入：１０ｋＶで８秒；分離電圧：２０ｋＶ；温度：４０℃。
実施例 ＸＩ
ポリビニルアルコールと共にＨＰＬＣで使用のための静止フェーズをコーティング。溶融シリカ面のために実施例Ｉ（Ｂ）に記載したように、または、当業者によく知られている他の方法（E.P.Plueddemann，シラン・カップリング・エイジェンツ．プレナム，ニューヨーク（１９８２））によりポアサイズが３００Åで粒径５μｍのシリカゲルをビニル基でモディファイする。シリカゲル５ｇを１０ｍｌの酢酸ビニルと３０ｍｌの酢酸エチルの溶液に懸濁する。２５ｍｇの過酸化ベンゾイルを添加した後、該懸濁液を攪拌し、リフラックスしながら、２０時間にわたり、７５℃まで加熱する。ついでポリマー溶液をＧ４フィルターじょうごで除去し、酢酸ポリビニルがコートされたシリカゲルを酢酸エチルとメタノールで洗い、共有吸着していないポリマーを除去する。メタノール中のナトリウム・メチラート０．１Ｍ溶液で１５分間シリカゲルを攪拌して、結合された酢酸ポリビニルをＰＶＡへホモログ転換する。ついでシリカゲルをメタノールで洗い、温度６０℃で乾燥する。
実施例 ＸII
実施例ＸＩのＰＶＡ被覆のシリカゲルをＨＰＬＣカラムへパックし、プロテイン、ヌクレオチドおよび合成ポリマーのハイパフォーマンス（または高圧）サイズ・イクスクルージョン・クロマトグラフィ（ＳＥＣ）が有機溶剤または水溶性溶剤中で行うことができる。
実施例 ＸIII
ＰＶＡ被覆された面から親和性マトリックスの調製は、例えば、G.T.Hermanson、A.K.Mallia、P.K.Smithのインモビライズド・アッフィニティ・リガンド・テクニックス，アデミック・プレス，サンジエゴ（１９９２）に記載されているように、当業者に熟知の方法により調製できる。
発明の他の実施例は、この明細書を熟考すること、または、ここに記載の発明のプラクティスすれば、当業者に明らかになるものである。明細書ならびに実施例は、単なる参考であって、発明の真の範囲とスピリットは、以下の請求の範囲により示されるものである。

Claims (25)

1. 以下の構成の、高精度で高性能な電気泳動のための内面被覆の毛細管カラム；
   内部キャビティと、内面をもつ壁とを有する毛細管カラムであって、前記壁の内面は、前記壁の前記内面に共有結合的に結合してなり、前記内面において重合して得られるビニルアルコール共重合体からなる、重合体鎖に沿って相互結合した、ポリマー性の表面変性コーティングを有し、前記コーティングはｐＨ４．４〜ｐＨ１０．０のｐＨ範囲でも前記壁に安定に留まり、かつ共有結合的に結合しているものである。
2. 前記毛細管は、溶融シリカ、ガラス、ポリテトラフルオロエチレンおよびポリエーテル・エーテル・ケトンからなる群から選ばれる材料で作られる請求項１の内面被覆の毛細管カラム。
3. 前記コーティングは、さらに変成されるものである請求項１の内面被覆の毛細管カラム。
4. 前記コーティングは、さらに、被覆剤の追加の層を備える請求項１の内面被覆の毛細管カラム。
5. 被覆材料の前記追加の層が前記ビニルアルコール共重合体の水酸基に結合してなる請求項４の内面被覆の毛細管カラム。
6. 以下の構成の、高精度で高性能な電気泳動のための内面被覆の毛細管カラム：
   内部キャビティと、内面をもつ壁とを有する毛細管カラムであって、前記壁の前記内面は、重合体鎖に沿って相互に結合するポリマーコーティングを有し、前記相互に結合するポリマーコーティングは、前記内面に結合し、有機溶剤中でビニルエステルのモノマー類またはオリゴマー類と共重合できる官能基から形成され、さらに前記相互に結合するポリマーコーティングは、前記内面において重合して得られるビニルアルコール共重合体からなるものである前記毛細管カラム。
7. 前記マイクロキャピラリーは、溶融シリカ、ガラス、ポリテトラフルオロエチレンおよびポリエーテル・エーテル・ケトンからなる群から選ばれる材料からなるものである請求項６の内面被覆の毛細管カラム。
8. 前記被膜は、さらに、前記ビニルアルコール共重合体の水酸基に共有結合したコーティングマテリアルの付加層を備える請求項６の内面被覆の毛細管カラム。
9. 前記被覆において、前記ビニルアルコール共重合体は、遊離水酸基を含む請求項１または６の内面被覆の毛細管カラム。
10. 前記被覆において、前記ビニルアルコール共重合体は、誘導体化された水酸基を含む請求項１または６の内面被覆の毛細管カラム。
11. 前記ビニルアルコール共重合体の前記誘導体化された水酸基は、誘導体化されてエポキサイドまたはアセタールを形成する隣接の炭素原子にある水酸基を備える請求項１０の内面被覆の毛細管カラム。
12. 前記内面に結合した前記官能基は、ビニルシラン、ビニルエーテル、アリルエステル、アリルエーテルおよびメタクリル酸誘導体からなる群から選ばれるものである請求項６の内面被覆の毛細管カラム。
13. 前記ビニルアルコール共重合体は、前記壁の前記内面にSi-O-Si結合により共有結合的に結合してなる請求項１の内面被覆の毛細管カラム。
14. 面に被膜を形成する方法であって、前記方法は、以下のシーケンシャルな工程からなる方法：
    被膜を結合する面を準備し、前記面には、有機溶剤中で疎水性有機化合物と共重合可能な官能基が結合している準備工程；
    前記結合して変性された面を有機溶剤中の前記有機化合物のモノマーまたはオリゴマーの溶液にさらす工程；そして
    前記有機化合物の分子を前記結合した官能基と前記面において共重合させ、これによって、前記面に重合体鎖に沿って相互に連結した疎水性ポリマー・コーティング材料を形成させる工程；および
    前記工程で得られた疎水性ポリマーコーティングを親水性に変性する工程。
15. 前記面は、溶融シリカ、ガラス、ポリテトラフルオロエチレンおよびポリエーテル・エーテル・ケトンからなる群から選ばれる材料からなる請求項１４の方法。
16. 前記官能基は、ビニルシラン、アリルシランおよびメタクリルシランからなる群から選ばれたものである請求項１４の方法。
17. 前記官能基は、前記面に共有結合的に結合する請求項１４の方法。
18. 面に被膜を形成する方法であって、前記方法は、以下のシーケンシャルな工程からなる方法：
    被膜を結合させる面を準備する工程；
    前記面をビニルシラノール・オリゴマーで変成して、有機溶剤中で疎水性有機化合物と共重合可能な官能性ビニル基を結合させる工程；
    前記変性された面を有機溶剤中の前記有機化合物のモノマーまたはオリゴマーの溶液にさらす工程；そして
    前記有機化合物の分子を前記結合した官能性ビニル基と共重合させ、これによって、前記面において重合してなり、かつそれと重合体鎖に沿って相互に連結した疎水性ポリマー・コーティング材料を結合させる工程；および前記疎水性ポリマーを親水性に変換する工程。
19. 前記有機化合物はビニルエステルからなり、そして開始剤を含む前記ビニルエステルの溶液を加熱して、前記結合した官能基と前記モノマーとの共重合が開始するものである請求項１４または１８の方法。
20. 前記面が毛細管カラムであり、前記毛細管カラムは内部キャビティーと内表面を有する面を有し、前記コーティングは前記内表面上に形成される請求項１４または１８の方法。
21. （ａ）前記有機化合物がビニルエステルのモノマーからなり、そして（ｂ）、前記毛細官中で開始剤を含む前記ビニルエステルの溶液を加熱して、前記結合した官能基と前記モノマーとの共重合が開始するものである請求項２０の方法。
22. 以下の構成の相互に連結したポリマーコーティングをもつ、コーティング面：
    コーティングされる表面；および
    前記表面に結合した相互に連結するポリマーコーティング；この相互連結のポリマーコーティングは、前記表面に重合体鎖に沿って結合し、有機溶剤中で有機化合物のモノマーまたはオリゴマーと共重合可能である官能基から形成され、前記相互連結のポリマーコーティングは、有機溶剤中で前記官能基と前記モノマーまたはオリゴマーとの共重合により前記表面において形成される前記有機化合物のポリマーからなるものである前記コーティング面。
23. 以下の構成の相互に連結したポリマーコーティングをもつ、コーティング面：
    コーティングされる表面；および
    前記表面に結合する相互に連結するポリマーコーテイング；この相互連結のポリマーコーティングは、前記表面に重合体鎖に沿って結合し、有機溶剤中でビニルエステルのモノマーまたはオリゴマーと共重合可能である官能基から形成されており、前記相互連結のポリマーコーティングは、有機溶剤中で前記官能基と前記モノマーまたはオリゴマーとを共重合させることにより前記表面において形成されるビニルアルコール共重合体からなるものである前記コーティング面。
24. 以下の構成からなる相互に連結するポリマーコーティングをもつ、コーティング面：
    コーティングされる表面；および
    主としてビニルアルコールまたはその誘導体の共重合体からなる表面変性コーティングであって、前記コーティングは前記表面で重合されてなり、かつそれと重合体鎖に沿って相互連結しており、前記コーティングはｐＨ４．４〜ｐＨ１０．０のｐＨ範囲でも前記表面に安定に留まり、かつ共有結合的に結合しているものである前記コーティング面。
25. 前記コーティングにおいて、前記ビニルアルコールまたはその誘導体の共重合体が、Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ結合により前記表面に共有結合的に結合している請求の範囲２４のコーティング面。

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