PT2612862T - Quinazolinonas como inibidores de fosfatidilinositol 3-quinase delta humana - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "QUINAZOLINONAS COMO INIBIDORES DE FOSFATIDILINOSITOL 3- QUINASE DELTA HUMANA"

Descrição do campo da invenção A presente invenção refere-se genericamente a enzimas fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K), e mais particularmente a inibidores selectivos de actividade de PI3K e métodos de utilização de tais inibidores.

Antecedentes da Invenção A sinalização celular via fosfoinositidos 3'-fosforilados tem sido implicada numa variedade de processos celulares, por exemplo, transformação maligna, sinalização do fator de crescimento, inflamação e imunidade (ver Rameh e outros., J. Biol. Chem., 274:8347-8350 (1999) para uma revisão). A enzima responsável por gerar estes produtos de sinalização fosforilada é fosfatidilinositol 3-quinase (PI 3-quinase; PI3K). PI3K foi originalmente identificada como uma actividade associada com oncoproteinas virais e do receptor do factor de crescimento de tirosina-quinases que fosforilam o fosfatidilinositol (PI) e os seus derivados fosforilados no 3'-hidroxilo do anel de inositol (Panayotou e outros, Trends Cell Biol. 2:358-60 (1992)).

Os niveis de fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato (PIP3), o produto primário da activação de PI 3-cinase, aumenta após o tratamento das células com uma grande variedade de agonistas. Acredita-se, portanto, que a activação PI 3-quinase está envolvida numa variedade de respostas celulares incluindo o crescimento celular, diferenciação e apoptose (Parker e outros, Curr. Biol., 5:577-99 (1995); Yao e outros, Science, 267:2003-05 (1995)). Embora os alvos a jusante dos lipidos fosforilados gerados após a activação PI 3-quinase não tenham sido bem caracterizados, os dados emergentes sugerem que as proteínas contendo o domínio plecstrina-homologia e domínio FYVE são activadas quando existe ligação a vários lipidos de fosfatidilinositol (Sternmark e outros, J. Cell. Sei., 122:4175-83 (1999); Lemmon e outros, Trends Cell Biol., 7:237-42 (1997)). In vitro, algumas isoformas da proteína quinase C (PKC) são directamente activadas por PIP3 e a proteína quinase relacionada com PKC, PKB, tem sido demonstrado que é activada pela PI 3-quinase (Burgering e outros, Nature, 376:. 599 -602 (1995)).

Actualmente, a família de enzimas da PI3-quinase está dividida em três classes com base nas suas especificidades de substrato. As PI3Ks de Classe I pode fosforilar o fosfatidilinositol (PI), fosfatidilinositol-4-fosfato, e fosfatidilinositol-4,5-bifosfato (PIP2) para produzir fosfatidilinositol-3-fosfato (PIP), fosfatidilinositol-3,4-bifosfato, e fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato, respectivamente. As Pl3Ks de Classe II fosforilam PI e fosfatidilinositol-4-fosfato, enquanto as Pl3Ks de Classe I só pode fosforilar PI. A purificação inicial e a clonagem molecular de de PI 3-quinase revelaram que era um heterodimero que consiste em subunidades p85 e pllO (Otsu e outros, Cell, 65:91-104 (1991); Hiles e outros, Cell, 70:419-29 (1992)). Desde então, foram identificadas quatro PI3K de Classe I distintas, designadas PI3K α, β, δ e γ, cada uma composta por 110 kDa subunidade catalítica distinta e uma subunidade reguladora. Mais especificamente, três das subunidades catalíticas, isto é, pllOa, ρΙΙΟβ, e ρΙΙΟγ, cada uma interage com a mesma subunidade reguladora, isto é, p85, enquanto ρΙΙΟγ interage com uma subunidade reguladora plOl distinta. Como descrito abaixo, os padrões de expressão de cada um destes PI3K em células e tecidos humanos são igualmente distintos. Apesar de uma grande quantidade de informações tenha sido acumulada sobre as funções celulares das PI 3-quinases em geral, os papéis desempenhados pelas isoformas individuais são em grande parte desconhecidos.

Tem sido descrita a clonagem de pllOa bovina. Esta proteína foi identificada como a proteína relacionada com a Saccharomyces cerevisiae: Vps34p, uma proteína envolvida no processamento da proteína vacuolar. Também foi demonstrado que o produto pllOa recombinante se associa com p85a, para se obter uma actividade de PI3K em células COS-1 transfectadas. Ver Hiles e outros, Cell, 70, 419-29 (1992).

A clonagem de uma segunda isoforma humana pllO, designada ρΙΙΟβ, é descrita em Hu e outros, Mol. Cell. Biol., 13:7677-88 (1993). É dito que esta isoforma se associa a p85 em células, e para ser expressa ubiquamente, como ρΙΙΟβ mRNA foi encontrada em vários tecidos humanos e de ratinho, bem como em células endoteliais da veia umbilical humana, células T Jurkat leucémicas humanas, células 293 de rim embrionário humano, fibroblastos 3T3 de ratinho, células HeLa, e células de carcinoma da bexiga de rato NBT2. Uma expressão tão vasta sugere que a isoforma ρΙΙΟβ é amplamente importante nas vias de sinalização. A identificação da isoforma pllOõ de PI 3-quinase é descrita em Chantry e outros, J. Biol. Chem., 272:19236-41 (1997) . Observou-se que a isoforma pllOõ humana é expressa de um modo restrito ao tecido. É expressa em niveis elevados em linfócitos e tecidos linfóides, sugerindo que a proteína pode ter um papel na sinalização no sistema imunitário mediada por PI 3-quinase. Os pormenores sobre a isoforma pllOõ também pode ser encontrados nas Patentes dos E.U.A. n.°s 5.858.753; 5.822.910; e 5.985.589. Ver também, Vanhaesebroeck e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A., 94:4330-5 (1997), e Publicação Internacional WO 97/46688.

Em cada um dos subtipos Ρΐ3Κα, β, e δ, os actos de subunidade p85 para localizar a PI 3-quinase na membrana do plasma através da interaeção do seu domínio SH2 com resíduos de tirosina fosforilada (presente num contexto de sequência apropriado) em proteínas alvo (Rameh e outros, Cell, 83: 821-30 (1995) ) . Duas isoformas de p85 foram identificadas, p85a, que é expressa ubiquamente, e ρ85β, que se encontra principalmente no cérebro e tecidos infóides (Volinia e outros, Oncogene, 7:789-93 (1992)). A associação da subunidade p85 com as subunidades catalíticas PI 3-quinase ρΙΙΟα, β, ou δ parece ser necessária para a actividade catalítica e a estabilidade destas enzimas. Além disso, a ligação de proteínas Ras, também regula positivamente a actividade de Pl3-quinase. A clonagem de ρΙΙΟγ revelou ainda mais a complexidade dentro da família de enzimas PI3K (Stoyanov e outros, Science, 269:690-93 (1995)). A isoforma ρΙΙΟγ está intimamente relacionada com pllOa e ρΙΙΟβ (45-48% de identidade no domínio catalítico), mas, como mencionado, não faz uso de p85 como uma subunidade alvo. Em vez disso, ρΙΙΟγ contém um domínio adicional designado um "domínio de homologia plecstrina" próximo do seu terminal amino. Este domínio permite a interação de ρΙΙΟγ com as subunidades βγ de proteínas G heterotriméricas e essa interação parece regular a sua actividade. A subunidade reguladora plOl para Pl3Kgamma foi originalmente clonada em suínos, e o ortólogo humano foi identificado subsequentemente (Krugman e outros, J. Biol. Chem, 274:17152-8 (1999)). A interacção entre a região N-terminal de plOl com a região N-terminal de ρΙΙΟγ parece ser crítica para a activação através de Ρΐ3Κγ através do acima mencionado Θβγ.

Um polipéptido de PI3K constitutivamente activo é descrito na Publicação Internacional n.° WO 96/25488. Esta publicação descreve a preparação de uma proteína de fusão quimérica, em que um fragmento de 102 resíduos de p85 conhecido como a região interSH2 (iSH2) é fundido através de uma região de ligação ao terminal N de P110 de murino. O domínio iSH2 p85 aparentemente é capaz de activar a actividade de PI3K de uma forma comparável a p85 intacta (Klippel e outros, Mol. Cell. Biol., 14:2675-85 (1994)) .

Assim, PI 3-quinases podem ser definidas pela sua identidade de aminoácidos ou pela sua actividade. Os membros adicionais desta família de genes de crescimento inclui quinases de lípidos e de proteínas mais distantemente relacionadas, incluindo Vps34 TORI, T0R2 de Saccharomyces cerevisiae (e os seus homólogos de mamíferos tais como FRAP e mTOR), o produto do gene ataxia telangiectasia (ATR), e a subunidade catalítica de proteína quinase dependente de ADN (ADN-PK) . Ver em geral, Hunter, Cell, 83:1-4 (1995) .

A Pl3-quinase também parece estar envolvida num certo número de aspectos da activação dos leucócitos. Tem sido demonstrado que a actividade PI 3-quinase associada a p85 que se associa fisicamente com o domínio citoplásmico de CD28, que é uma molécula co-estimuladora importante para a activação de células T em resposta ao antigénio (Pages e outros, Nature, 369:327-29 (1994); Rudd, Immunity, 4: 527-34 (1996)). A activação de células T através de CD28 reduz o limiar de activação por antigénio e aumenta a amplitude e a duração da resposta proliferativa. Estes efeitos estão ligados a aumentos na transcrição de um certo número de genes incluindo a interleucina-2 (IL2), um importante factor de crescimento de células T (Fraser e outros, Science, 251:313-16 (1991)). A mutação de CD28 de modo a que ele não possa interagir com PI 3-quinase leva a um fracasso para iniciar a produção de IL2, sugerindo um papel critico para a PI 3-quinase na activação das células T.

Inibidores específicos contra membros individuais de uma família de enzimas fornecem ferramentas valiosas para decifrar as funções de cada enzima. Dois compostos, LY294002 e wortmanina, têm sido amplamente utilizados como inibidores da PI 3-quinase. Estes compostos, contudo, são inibidores de PI3K não específicos, uma vez que não fazem a distinção entre os quatro membros PI 3-quinases da Classe I. Por exemplo, os valores de IC5o de wortmanina perante cada uma das várias PI3-quinases de Classe I estão na ordem de 1-10 nM. Da mesma forma, os valores de IC5o para LY294002 perante cada uma destas PI 3-quinases é de cerca de 1 μΜ (Furman e outros, Ann. Rev. Biochem., 67:481-507 (1998)). Assim, a utilidade destes compostos no estudo dos papéis de PI 3-quinases de Classe I individuais é limitada.

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Vortmanina

Com base em estudos utilizando wortmanina, existem evidências de que a função PI 3-quinase é também necessária para alquns aspectos da sinalização dos leucócitos através de receptores acoplados à proteína G (Thelen e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91:4960-64 (1994)). Além disso, foi demonstrado que a wortmanina e LY294002 bloqueiam a migração de neutrófilos e a libertação de superóxido. No entanto, porque estes compostos não fazem distinção entre as diversas isoformas de PI3K, ainda não está claro qual isoforma ou isoformas PI3K particulares estão envolvidas nesses fenómenos.

Tendo em vista as considerações acima, é claro que ao conhecimento existente tem faltas em relação a características estruturais e funcionais das enzimas PI 3- quinase, incluindo localização subcelular, estados de ativação, as afinidades de substrato, e similares. Além disso, as funções que estas enzimas desempenham tanto em tecidos normais e doentes continua por ser elucidada. Em particular, a função de PI3K5 em leucócitos não tem sido previamente caracterizada, e o conhecimento sobre a sua função na fisiologia humana permanece limitado. A coexpressão nestes tecidos de outras isoformas PI3K tem até agora confundido os esforços para segregar as actividades de cada uma das enzimas. Além disso, a separação das actividades das diferentes isozimas PI3K pode não ser possível sem a identificação de inibidores que demonstrem características de inibição selectiva. Na verdade, os requerentes presentemente não estão cientes de que tais inibidores de isozimas PI3K selectivos, ou melhor, específicos, tenham sido demonstrados.

Assim, existe uma necessidade na técnica para posterior caracterização estrutural do polipéptido PI3K5. Existe também uma necessidade para a caracterização funcional de PI3K5. Além disso, a compreensão da PI3K5 requer mais elaboração das interacções estruturais de pllOõ, tanto com a sua subunidade reguladora e com outras proteínas na célula. Permanece também uma necessidade para os inibidores selectivos ou específicos de isozimas PI3K, de tal modo que as funções de cada isoenzima possam ser melhor caracterizadas. Em particular, os inibidores selectivos ou específicos de PI3K5 são desejáveis para explorar o papel desta isozima e para o desenvolvimento de produtos farmacêuticos para modular a actividade da isozima.

Sumário da Invenção

Um aspecto da presente invenção é proporcionar compostos capazes de inibir a actividade biológica de PI3K5 humana. Um outro aspecto da presente invenção consiste em proporcionar compostos que inibem selectivamente PI3K5 em comparação com as outras isoformas de PI3K. Ainda um outro aspecto da divulgação é fornecer um método de modulação selectiva da actividade PI3K5 humana, e, assim, promover o tratamento médico de doenças mediadas por disfunção PI3K5. Ainda um outro aspecto da divulgação é fornecer um método de caracterizar a função de PI3K5 humana.

Outro aspecto da presente divulgação é proporcionar um método de interromper a função de leucócitos que compreende o contacto dos leucócitos com um composto que inibe selectivamente a actividade de fosfatidilinositol 3-quinase delta (PI3K5) nos leucócitos. Os leucócitos podem compreender células selecionadas a partir do grupo que consiste em neutrófilos, linfócitos B, linfócitos T, e basófilos.

Por exemplo, nos casos em que os leucócitos compreendem neutrófilos, o método compreende a interrupção de, pelo menos, uma função de neutrófilos selecionada a partir do grupo que consiste na libertação de superóxido estimulada, exocitose estimulada, e migração quimiotáctica. De preferência, o método não perturba substancialmente a fagocitose bacteriana ou morte bacteriana pelos neutrófilos. Nos casos em que os leucócitos compreendem linfócitos B, o método compreende a interrupção da proliferação dos linfócitos B ou produção de anticorpos pelos linfócitos B. Nos casos em que os leucócitos compreendem linfócitos T, o método compreende a interrupção da proliferação dos linfócitos T. Nos casos em que os leucócitos compreendem basófilos, o método compreende a interrupção da libertação de histamina pelos basófilos. É preferido que o inibidor PI3K5 seja selectivo. É preferido que o inibidor PI3K5 seja, pelo menos, cerca de 100 vezes selectivo para a inibição da ρΙΙΟδ relativa a pllOa, pelo menos cerca de 40 vezes selectivo relativamente a ρΙΙΟβ, e, pelo menos, cerca de 10 vezes selectivo relativamente a ρΙΙΟγ num ensaio bioquímico.

Os compostos da presente invenção são como definidos nas reivindicações. Também são descritos os compostos que são capazes de inibir a actividade PI3K5 e têm uma fórmula estrutural (I):

em que X e Y, independentemente, são N ou CRC; Z é N-R7 ou 0; R1 são o mesmo e são hidrogénio, halo, ou Ci-3alquilo; R2 e R3, independentemente, são hidrogénio, halo, ou Ci_ 3alquilo; R4 é hidrogénio, halo, 0Ra, CN, C2_6alquinilo, C (=0) Ra, C(=0)NRaRb, C3-6heterocicloalquilo, Ci_3alquileno C3-6hetero-cicloalquilo, 0Ci-3alquileno0Ra, 0Ci-3alquilenoNRaRb, OCi-3alquileno C3-6cicloalquilo, OC3-6heterocicloalquilo, OCi- 3alquilenoC=CH, ou 0Ci-3alquilenoC (=0) NRaRb; R5 é Ci_3alquilo, CH2CF3, fenilo, CH2C=CH, Ci-3alquilenoORe, Ci-4alquilenoNRaRb, ou Ci-4alquilenoNHC (=0) 0Ra, R6 é hidrogénio, halo, ou NRaRb; R7 é hidrogénio ou R5 e R7 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um anel saturado com cinco ou seis membros; R8 é Ci-3alquilo, halo, CF3, ou CH2C3-6heterocicloalquilo; n é 0, 1, ou 2;

Ra é hidrogénio, Ci_4alquilo, ou CH2C6H5;

Rb é hidrogénio ou Ci-3alquilo; e Rc é hidrogénio, Ci-3alquilo ou halo, em que os grupos R1 são diferentes de hidrogénio, R2 e R4 são o mesmo; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco ou solvato (por exemplo, hidrato).

Também são descritos os compostos de fórmula estrutural (II) e capazes de inibir a actividade PI3K5:

em que X, Y, Z, R1 a R8, Ra, Rb, Rc e n são como definidos acima, ou um seu sal f armaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco ou solvato (por exemplo, hidrato).

Outro aspecto da presente divulgação é proporcionar um método de tratamento de uma condição médica mediada por neutrófilos compreendendo a administração a um mamifero com necessidade do mesmo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de fórmulas estruturais (I) ou (II). Exemplos de condições médicas que podem ser tratadas de acordo com o método incluem as patologias caracterizadas por uma função de neutrófilos indesejável selecionada a partir do grupo que consiste na libertação de superóxido estimulada, exocitose estimulada, e migração quimiotáctica. De preferência, de acordo com o método, a actividade fagocitica ou morte bacteriana pelos neutrófilos é substancialmente inibida.

Ainda um outro aspecto da presente divulgação é proporcionar um método para interromper uma função de osteoclastos compreendendo osteoclastos em contacto com um composto de fórmulas estruturais (I) ou (II).

Outro aspecto da presente divulgação é proporcionar um método de melhorar um distúrbio de reabsorção óssea num mamífero com necessidade do mesmo, compreendendo a administração ao mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de fórmulas estruturais (I) ou (II) . Um distúrbio de reabsorção óssea preferido passível de tratamento de acordo com o método é a osteoporose.

Ainda um outro aspecto da presente divulgação é fornecer um método de inibir o crescimento ou a proliferação de células cancerosas de origem hematopoiética compreendendo o contacto das células cancerosas com um composto de fórmulas estruturais (I) ou (II). 0 método pode ser vantajoso na inibição do crescimento ou proliferação de cancros selecionados a partir do grupo que consiste em linfomas, mielomas múltiplos e leucemias.

Outro aspecto da presente divulgação é proporcionar um método de inibição da actividade de quinase de um polipéptido PI3K5 compreendendo o contacto do polipéptido PI3K5 com um composto de fórmulas estruturais (I) ou (II).

Ainda um outro aspecto da presente divulgação é proporcionar um método para interromper a função leucocitária compreendendo leucócitos em contacto com um composto de fórmulas estruturais (I) ou (II). São aqui descritos compostos de fórmulas estruturais (I) ou (II) que inibem a actividade PI3K5 em ensaios bioquímicos e à base de células, e apresentam um benefício terapêutico no tratamento de condições médicas em que a actividade de PI3K5 é xcessiva ou indesejável.

Um outro aspecto da presente invenção é proporcionar composições farmacêuticas que compreendem um ou mais compostos de fórmulas estruturais (I) ou (II) , e a utilização das composições em um tratamento terapêutico, em que a inibição do polipéptido PI3K5, in vivo ou ex vivo, proporciona um benefício terapêutico ou é de investigação ou interesse de diagnóstico

Um outro aspecto da presente invenção é fornecer um artigo de fabrico para uso farmacêutico humano compreendendo: (a) uma composição farmacêutica que compreende um composto de fórmulas estruturais (I) ou (II); e, (b) um recipiente, que compreende ainda, opcionalmente, uma bula, desde que a composição seja útil no tratamento de uma doença ou distúrbio mediado pela actividade PI3KÕ.

Um outro aspecto da presente invenção é o de proporcionar: (a) uma composição farmacêutica que compreende um composto de fórmulas estruturais (I) ou (II); e, (b) um recipiente, que compreende ainda, opcionalmente, uma bula, desde que a composição seja útil no tratamento de um distúrbio de reabsorção óssea ou de um cancro de origem hematopoiética.

Estes e outros aspectos e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir da seguinte descrição pormenorizada das formas de realização preferidas, que são proporcionados para melhorar a compreensão da invenção, sem limitar o âmbito da invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS A presente invenção proporciona compostos que inibem selectivamente a actividade de PI3K5. A presente divulgação proporciona ainda métodos de utilização dos compostos para inibir a actividade PI3K5, incluindo métodos de modular selectivamente a actividade da isozima PI3K5 em células, especialmente leucócitos, osteoclastos, e células cancerosas. Os métodos incluem aplicações in vitro, in vivo e ex vivo.

De particular benefício, são métodos de utilização dos compostos da invenção para modular selectivamente a actividade PI3K5 em cenários clínicos para melhorar doenças ou distúrbios mediados pela actividade de PI3K5. Assim, o tratamento de doenças ou distúrbios caracterizados por actividade excessiva ou inadequada de PI3K5 pode ser tratada através da administração de moduladores selectivos de PI3K5.

Além disso, a invenção proporciona composições farmacêuticas que compreendem um inibidor selectivo PI3K5 de fórmulas estruturais (I) ou (II) . Também são fornecidos artigos de manufactura compreendendo um composto inibidor selectivo de PI3K5 (ou uma composição farmacêutica que compreende o composto) e as instruções para a utilização do composto. Outros métodos da invenção incluem permitir a caracterização adicional do papel fisiológico da isozima.

Os métodos aqui descritos beneficiam com a utilização de compostos que inibem selectivamente, e de um modo preferido inibem especificamente, a actividade de PI3K5 em células, incluindo células in vitro, in vivo ou ex vivo. As células tratadas pelos métodos aqui descritos incluem as que expressam PI3K5 endógeno, em que endógeno indica que as células expressam a introdução de PI3K5 recombinante ausente nas células de um ou mais polinucleótidos que codificam um polipéptido PI3K5 ou um seu fragmento biologicamente activo. Os métodos aqui descritos, também incluem a utilização de células que expressam PI3K5 exógeno, em que um ou mais polinucleótidos que codificam PI3K5 ou um seu fragmento biologicamente activo foi introduzido na célula utilizando processos recombinantes.

As células podem estar in vivo, isto é, num sujeito vivo, por exemplo, um mamífero, incluindo seres humanos, em que um inibidor PI3K5 podem ser utilizado terapeuticamente para inibir a actividade PI3K5 no indivíduo. Alternativamente, as células podem ser isoladas como células discretas ou num tecido, por ex vivo ou em métodos in vitro. Os métodos in vitro abrangidos pela invenção podem compreender a etapa de contacto de uma enzima PI3K5 ou um seu fragmento biologicamente activo com um composto inibidor da presente invenção. A enzima PI3K5 pode incluir uma enzima isolada e purificada, em gue a enzima é isolada a partir de uma fonte natural (por exemplo, células ou tecidos que normalmente expressam uma modificação do polipéptido PI3K5 ausente por tecnologia recombinante) ou isolados a partir de células modificadas por meio de técnicas recombinantes para expressar a enzima exógena.

Os compostos da invenção inibem potentemente pllOõ. A potência é tipicamente expressa como a concentração de um composto necessário para alcançar um determinado resultado. Quanto maior a potência, menos composto é necessário para executar a função pretendida. A potência in vitro é tipicamente expressa em termos de valores de IC50 medidos utilizando um ensaio de resposta-dose. Os valores de IC50 podem ser medidos por contacto de um sistema de ensaio sensível com um composto de interesse ao longo de um intervalo de concentrações, incluindo as concentrações às quais nenhum ou o efeito mínimo é observada, através de concentrações mais elevadas nas quais um efeito parcial é observado, a concentrações saturantes em que um máximo efeito é observado. Teoricamente, tais ensaios de efeito resposta-dose de compostos inibidores pode ser descrito como uma curva sigmoidal que expressa um certo grau de inibição como uma função da concentração quando representada graficamente numa escala logarítmica. A curva também passa teoricamente por um ponto no qual a concentração é suficiente para reduzir a actividade da enzima pllOõ a um nivel de 50% da diferença entre a actividade de enzima minima e máxima observada no ensaio. Esta concentração é definida como Concentração Inibidora a 50% de inibição ou valores de IC5o·

Os valores de IC50 podem ser determinados utilizando técnicas convencionais de ensaio bioquímico (acelular) ou técnicas de ensaio à base de células bem conhecidos dos vulgares peritos na arte. Um exemplo de tal ensaio é proporcionado nos exemplos abaixo. De preferência, os valores de IC50 são obtidos por realização do ensaio relevante, pelo menos, duas vezes, com o valor de IC50 expresso como o valor médio (média aritmética, ou "médio") dos valores individuais obtidos. Mais preferivelmente, o ensaio é repetido de 3 a 10 (ou mais) vezes, com o valor de IC5o expresso como a média dos valores obtidos. Ainda mais preferivelmente, o ensaio é executado um número de vezes suficiente para gerar um valor de IC50 médio estatisticamente fiável, utilizando métodos estatísticos conhecidos dos vulgares peritos na arte.

Os compostos de fórmula (I) e (II) exibem valores de IC50 inesperadamente baixos em relação ao PI3K5, correspondendo a uma potência in vitro inesperadamente elevada. Em várias formas de realização, os compostos de fórmulas (I) e (II), quando ensaiados tal como descrito no Exemplo 14 abaixo, exibem valores IC50 de PI3K5 de menos do que cerca de 250 nm, menos de cerca de 200 nM, menos de cerca de 150 nM, menos de cerca de 125 nM, menos de cerca de 100 nM, menos de cerca de 75 nM, menos de cerca de 50 nM, menos de cerca de 25 nM, menos de cerca de 10 nM, e em outros menos de cerca de 5 nM. Noutras formas de realização, os compostos da invenção exibem valores de IC5o de cerca de 0,1 nM a cerca de 5 nM.

Os compostos das fórmulas (I) e (II) são inibidores selectivos de PI3K5. 0 termo "inibidor selectivo de PI3K5", tal como aqui utilizado refere-se a um composto que inibe a isozima PI3K5 de forma mais eficaz do que outras isozimas da família de PI3K. Um composto "inibidor selectivo de PI3KÕ" é entendido como sendo mais selectivo do que os compostos de PI3K5 convencionalmente e genericamente designados inibidores de PI3K, por exemplo, wortmanina ou LY294002. Concomitantemente, wortmanina e LY294002 são considerados "inibidores seletivos de PI3K." Além disso, os compostos da presente invenção regulam selectiva e negativamente a expressão ou actividade de Ρΐ3Κδ e possuem propriedades farmacológicas aceitáveis para utilização nos métodos terapêuticos da invenção.

Deste modo, um inibidor selectivo pode, alternativamente, ser entendido como referindo-se a, pelo menos, um composto que exibe uma concentração inibitória de 50% (IC50) em relação à Ρΐ3Κδ que é pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 150 vezes de, pelo menos cerca de 200 vezes, pelo menos cerca de 250 vezes, pelo menos cerca de 300 vezes, pelo menos cerca de 350 vezes, pelo menos cerca de 400 vezes, pelo menos cerca de 500 vezes, pelo menos cerca de 600 vezes, pelo menos cerca de 700 vezes, pelo menos cerca de 800 vezes, pelo menos cerca de 900 vezes, ou pelo menos cerca de 1000 vezes menor do que o valor de IC5o para Pl3Ka. Em formas de realização alternativas, o termo inibidor selectivo pode ser entendido como referindo-se a, pelo menos, um composto que exibe um IC5o em relação ao PI3K5 que é pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 30 vezes, pelo menos cerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 60 vezes, pelo menos cerca de 70 vezes, pelo menos cerca de 80 vezes, pelo menos cerca de 90 vezes, ou pelo menos cerca de 100 vezes mais baixa do que o IC5o para Ρΐ3Κγ. Em formas de realização adicionais, o termo inibidor selectivo pode ser entendido como referindo-se a, pelo menos, um composto que exibe um IC50 em relação ao PI3K5 que é pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 30 vezes, pelo menos cerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 75 vezes, pelo menos cerca de lOOvezes, pelo menos cerca de 125 vezes, pelo menos cerca de 150 vezes, pelo menos cerca de 175 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes, pelo menos cerca de 250 vezes, pelo menos cerca de 300 vezes ou pelo menos cerca de 350 vezes mais baixa do que o IC50 para Ρΐ3Κβ. Os inibidores selectivos são tipicamente administrados numa quantidade tal que inibem selectivamente PI3K5, como descrito acima.

Os compostos preferidos da presente invenção, por conseguinte, tem um baixo valor de IC50 versus PI3K5 (isto é, o composto é um inibidor potente), e são selectivos no que diz respeito à inibição da PI3K5 em relação a pelo menos um dos Ρΐ3Κα, Ρΐ3Κβ, e ΡΙ3Κγ. "Jn vivo" significa dentro de um sujeito vivo, como dentro de um animal ou humano. Neste contexto, os agentes podem ser usados terapeuticamente in vivo para retardar ou eliminar a proliferação de células aberrantemente replicantes. Os agentes também podem ser utilizados in vivo como um profilático para prevenir a proliferação celular aberrante ou a manifestação de sintomas a ela associados. "Ex vivo" significa fora de um sujeito vivo. Exemplos de populações de células ex vivo incluem culturas de células e as amostras biológicas tais como amostras de fluidos ou tecidos de seres humanos ou animais. Tais amostras podem ser obtidas por métodos bem conhecidos na arte. As amostras de líquidos biológicos exemplificativas incluem sangue, fluido cerebrospinal, urina, saliva. As amostras de tecidos exemplificativos incluem tumores e biópsias. Neste contexto, os presentes compostos podem estar em numerosas aplicações, tanto terapêuticas como experimentais. 0 termo "recipiente" significa qualquer recipiente e encerramento do mesmo, portanto, adequado para o armazenamento, transporte, distribuição e/ou manuseamento de um produto farmacêutico. 0 termo "bula" significa a informação que acompanha o produto que fornece uma descrição de como administrar o produto, juntamente com os dados de segurança e eficácia necessários para permitir que o médico, farmacêutico ou paciente tome uma decisão informada a respeito do uso do produto. Para um produto farmacêutico aprovado para utilização em seres humanos ou animais, a autoridade de aprovação pode especificar o conteúdo da bula, e tal bula pode ser referida informalmente como a "etiqueta" para o produto.

Numa forma de realização, a presente divulgação proporciona um método para inibir a função leucocitária. Mais particularmente, a presente divulgação proporciona métodos de inibir ou suprimir a função de neutrófilos e linfócitos T e B. No que diz respeito aos neutrófilos, inesperadamente verificou-se que a inibição da actividade PI3K5 inibe funções dos neutrófilos. Por exemplo, tem-se observado que os compostos da presente divulgação provocam a inibição das funções dos neutrófilos clássicos, tais como a produção de superóxido estimulada, exocitose estimulada, e migração quimiotáctica. No entanto, foi ainda observado que um método da presente divulgação permite a eliminação de determinadas funções de neutrófilos, sem afectar substancialmente outras funções destas células. Por exemplo, tem-se observado que a fagocitose de bactérias por neutrófilos não é substancialmente inibida pelos compostos inibidores selectivos PI3K5 da presente divulgação.

Assim, a presente divulgação inclui métodos para inibir a função de neutrófilos, sem inibir substancialmente a fagocitose de bactérias. As funções dos neutrófilos adequados para inibição de acordo com o presente método incluem qualquer função mediada pela actividade ou expressão de PI3K5. Tais funções incluem, sem limitação, libertação estimulada de superóxido, exocitose ou desqranulação estimulada, migração quimiotáctica, a adesão ao endotélio vascular (por exemplo, ligação/rolamento dos neutrófilos, desencadeamento da actividade dos neutrófilos, e/ou de fixação dos neutrófilos ao endotélio) , diapedese transmural, ou emigração através do endotélio para os tecidos periféricos. Em geral, estas funções podem ser colectivamente denominadas "funções inflamatórias", dado que são tipicamente relacionados com a resposta dos neutrófilos à inflamação. As funções inflamatórias de neutrófilos podem ser distinguidas das funções de morte bacteriana exibidas por essas células, por exemplo, fagocitose e morte de bactérias. Por conseguinte, a presente divulgação inclui ainda métodos de tratamento de estados de doença nos quais uma ou mais das funções inflamatórias de neutrófilos são anormais ou indesejáveis.

Os compostos da presente invenção podem ser utilizados para inibir uma resposta imune endógena estimulada por pelo menos um factor endógeno sem inibir substancialmente a uma resposta imune estimulada exógena por pelo menos um factor exógeno, como divulgado no documento E.U.A. 2005/0043239 Al.

Os compostos da presente invenção também podem ser utilizados para inibir uma resposta imune endógena estimulada por pelo menos um factor endógeno sem inibir substancialmente a capacidade de resposta imune, como descrito em E.U.A. 2005/0043239 Al. Por conseguinte, os compostos da invenção permitem, com vantagem, um tratamento de condições associadas a uma resposta imune endógena estimulada indesejável por pelo menos um factor endógeno sem comprometer a capacidade para combater a infecção.

Os compostos da presente invenção também podem ser utilizados para inibir a acumulação de leucócitos tal como descrito no documento E.U.A. 2005/0054614 Al. Os compostos também podem ser utilizados para inibir a ligação de leucócitos a células endoteliais e para inibir a transmigração dos leucócitos em tecido inflamado, tal como divulgado no documento E.U.A. 2005/0043239 Al. Por conseguinte, os compostos da invenção permitem, com vantagem, um tratamento de indivíduos com uma condição inflamatória em que se verifica que os leucócitos se acumulam no local do insulto ou tecido inflamado.

Foi ainda demonstrado que PI3K5 desempenha um papel na proliferação de linfócitos estimulada, incluindo as células B e as células T. Além disso, PI3K5 parece desempenhar um papel na secreção estimulada de anticorpos pelas células B. Os compostos inibidores de PI3K5 selectivos da presente invenção têm sido utilizados para demonstrar que estes fenómenos podem ser anulados pela inibição da PI3K5. Assim, a presente divulgação inclui métodos de utilização de compostos de fórmulas estruturais (I) ou (II) para inibir a proliferação de linfócitos, ou para a inibição da produção de anticorpos pelos linfócitos B. Outros métodos permitidos pela presente divulgação incluem métodos para o tratamento de estados de doença em que uma ou mais destas funções dos linfócitos é anormal ou indesejável.

Os métodos da presente divulgação podem ser postos em prática utilizando os compostos de fórmulas estruturais (I) ou (II) . Os métodos podem ser postos em prática utilizando uma mistura racémica dos compostos, ou um enantiómero específico. Em formas de realização preferidas, o enantiómero S dos compostos é utilizado nos presentes métodos.

Os métodos podem ser postos em prática utilizando, por exemplo, os seguintes compostos:

Os métodos descritos podem ser postos em prática utilizando compostos que exibem actividade inibidora PI3K5. Em particular, os métodos descritos podem ser postos em prática utilizando compostos que possuem a fórmula estrutural geral (I) :

em que X e Y, independentemente, são N ou CRC; Z é N-R7 ou 0; R1 são o mesmo e são hidrogénio, halo, ou Ci_3alquilo; R2 e R3, indeendentemente, são hidrogénio, halo, ou Ci_3alquilo; R4 é hidrogénio, halo, 0Ra, CN, C2-6alquinilo,C(=0)Ra, C (=0) NRaRb, C3-6heterocicloalquilo, Ci-3alquileno C3- 6heterocicloalquilo, OCi-3alquilenoORa, OCi-3alquilenoNRaRb, OCi-3alquileno C3-6CÍcloalquilo, OC3-6heterocicloalquilo, OCi- 3alquilenoC=CH, ou OCi_3alquilenoC (=0) NRaRb; R5 é Cl-3alquilo, CH2CF3, fenilo, CH2C=CH, Ci-3alquilenoORe, Ci-4alquilenoNRaRb, ou Ci-4alquilenoNHC (=0) 0Ra, R6 é hidrogénio, halo, ou NRaRb; R7 é hidrogénio ou R5 e R7 são tomados em conjunto com os átomos aos quais estão ligados para formar um anel saturado com cinco ou seis membros; R8 é Ci-3alquilo, halo, CF3, ou CH2C3-6heterocicloalquilo; n é 0, 1, ou 2;

Ra é hidrogénio, Ci_4alquilo, ou CH2C6H5;

Rb é hidrogénio ou Ci_3alquilo; e Rc é hidrogénio, Ci-3alquilo ou halo, em que os grupos R1 são diferentes de hidrogénio, R2 e R4 são o mesmo; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, ou pró-fármaco ou solvato (por exemplo, hidrato).

Os compostos da presente invenção são inibidores selectivos da actividade PI3K5. Os compostos exibem inibição de PI3K5 em ensaios bioquímicos, e selectivamente impedem a função de células em ensaios baseados em células que expressam PI3K5. Como aqui descrito, os presentes compostos têm demonstrado uma capacidade para inibir certas funções dos neutrófilos e outros leucócitos, bem como funções de osteoclastos.

Os compostos aqui divulgados têm as fórmulas estruturais gerais (I) ou (II), ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, pró-fármaco ou um seu solvato:

em que X, Y, Z, R1 a R8, Ra, Rb, Rc, e n são como acima definido.

Exibem potência aumentada em relação a outros compostos são compostos em que R8 é Ci-3alquilo, F, Cl, ou CF3. Em alternativa, n é 0 (de forma a que não existe substituinte R8) .

Exibindo tal potência aumentada, X e Y são, independentemente, N ou CH. Exibindo ainda mais potência aumentada, X é N e Y é CH. Em alternativa, X e Y podem ambos ser CH. Exibindo ainda mais potência aumentada, R6 é hidrogénio, halo, ou NH2.

Inesperadamente, a potência contra PI3K5 é conservada quando R1 é o mesmo. Nas fórmulas estruturais (I) e (II), R2 e R4 podem variar desde que R1 seja H. Quando R1 é H, a rotação livre é permitida inesperadamente sobre a ligação que liga o substituinte fenilo do anel ao anel de quinazolina, e os compostos vantajosamente não exibem atropisomerismo (isto é, a formação de diasterómero múltiplo é evitada). Alternativamente, R2 e R4 podem ser o mesmo de modo a que os compostos não exibam, vantajosamente, atropisomerismo.

Tal como aqui utilizado, o termo "alquilo" é definido como de cadeia linear e grupos de hidrocarbonetos ramificados contendo o número indicado de átomos de carbono, por exemplo, metilo, etilo e grupos propilo e butilo de cadeia linear e ramificados.

Os termos "Ci_3alquileno" e "Ci-9alquileno" são definidos como grupos de hidrocarbonetos contendo o número indicado de átomos de carbono e um átomo de hidrogénio a menos que o grupo alquilo correspondente. 0 termo "C2-6alquinilo" é definido como um grupo de hidrocarboneto contendo o número indicado de átomos de carbono e uma ligação tripla carbono-carbono. 0 termo "C3_6cicloalquilo" é definido como um grupo de hidrocarboneto cíclico contendo o número indicado de átomos de carbono. 0 termo "C3_6heterocicloalquilo" é definido de modo semelhante ao cicloalquilo, excepto que o anel contém um ou dois heteroátomos selecionados a partir do grupo consistindo de 0, NRa, e S. 0 termo "halo" é definido como fluoro, bromo, cloro, e iodo.

Em formas de realização preferidas, Z representa N-R7, e o sistema de anel bicíclico contendo X e Y é

Noutras formas de realização preferidas, R1 é hidrogénio, flúor, cloro, metilo, ou

R2 é hidrogénio, metilo, cloro, ou fluoro; R3 é hidrogénio ou fluoro; R6 é NH2, hidrogénio ou fluoro; R7 é hidrogénio ou R5 e R7 são tomados em conjunto para formar

.....

jf

OU

.....> —«í

E geralmente aceite que os sistemas biológicos podem exibir respostas muito sensíveis à natureza estereoquimica absoluta dos compostos aos quais são expostos. Ver, E.J. Ariens, Medicinal Research Reviews, 6:451-66 (1986); E.J.

Ariens, Medicinal Research Reviews, 7:367-87 (1987); K.W.

Fowler, Handbook of Stereoisomers: Therapeutic Drugs, CRC Press, editado por Donald P. Smith, pp. 35-63 (1989); e S.C. Stinson, Chemical and Engineering News, 75:38-70 (1997).

Portanto, os compostos da presente invenção incluem todos os estereoisómeros e isómeros geométricos possíveis dos compostos de fórmula estrutural (I), e incluem não apenas os compostos racémicos, mas também os isómeros opticamente activos. Nas formas de realização preferidas, um composto da presente invenção é o S-enantiómero.

Quando um composto de fórmula estrutural (I) é desejado como um enantiómero simples, pode ser obtido quer por resolução do produto final ou por síntese estereoespecífica a partir de qualquer material de partida isomericamente puro ou da utilização de um reagente auxiliar quiral. Por exemplo, ver Z. Ma e outros, Tetrahedron: Asymmetry, 8(6), pages 883-88 (1997) . A resolução do produto final, um intermediário ou um material de partida pode ser conseguida por qualquer método adequado conhecido na arte. Os estereoisómeros específicos, em particular, enantiómeros S dos compostos da presente invenção, exibem uma excelente capacidade para inibir a actividade de cinase de PI3K5. Métodos para identificar reguladores negativos de Atividade ΡΙ3Κδ A proteína PI3K5, bem como os seus fragmentos com actividade biológica, podem ser utilizados para o rastreio de compostos inibidores putativos em qualquer uma das variedades de técnicas de rastreio de fármacos. Um inibidor de PI3K5 é um composto que diminui ou anula a capacidade de PI3K5 para realizar qualquer das suas funções biológicas. Um exemplo de tais compostos é um agente que diminui a capacidade de um polipéptido PI3K5 para fosforilar o fosfatidilinositol ou para segmentar estruturas apropriadas dentro de uma célula. A selectividade de um composto que regula negativamente a actividade de PI3K5 pode ser avaliada comparando a sua actividade sobre Ρΐ3Κδ com a sua actividade sobre outras proteínas. Os inibidores selectivos incluem, por exemplo, anticorpos e outras proteínas ou péptidos que se ligam especificamente a um polipéptido Ρΐ3Κδ, oligonucleótidos que se ligam especificamente a polipéptidos Ρΐ3Κδ, e outros compostos não-peptídicos (por exemplo, moléculas orgânicas isoladas ou sintéticas) que interagem especificamente com polipéptidos Ρΐ3Κδ. Os inibidores também incluem compostos como os descritos acima, mas que interagem com um parceiro de ligação específico de polipéptidos Ρΐ3Κδ.

Os alvos presentemente preferidos para o desenvolvimento de inibidores selectivos de Ρΐ3Κδ incluem, por exemplo: (1) regiões citoplasmáticas de polipéptidos Ρΐ3Κδ que contactam com outras proteínas e/ou localizam a Ρΐ3Κδ dentro de uma célula; (2) as regiões de polipeptídeos Ρΐ3Κδ que ligam parceiros de ligação específicos; (3) as regiões dos polipeptídeos PI3KÕ que ligam substrato; (4) locais alostéricos reguladores dos polipéptidos PI3K5 que podem ou não podem interagir directamente com o local activo em consequência do sinal de regulação; (5) as regiões dos polipeptideos PI3K5 que medeiam a multimerização. Por exemplo, um alvo para o desenvolvimento de moduladores da interacção reguladora identificada de p85 com pllOõ, que pode estar envolvida na activação e/ou localização subcelular da porção pllOõ. Ainda outros moduladores seletivos incluem aqueles que reconhecem sequências regulatórias ou codificantes de PI3K5 nucleotideos especificas. Os moduladores da actividade PI3K5 podem ser terapeuticamente úteis no tratamento de uma ampla variedade de doenças e condições fisiológicas em que a actividade aberrante PI3K5 está envolvida.

Assim, são aqui descritos métodos de caracterização da potência de um composto de teste como inibidor do polipéptido PI3K5, método que compreende os passos de (a) actividade de medição de um polipéptido PI3K5 na presença de um composto de teste referido; (b) comparação da actividade do polipéptido PI3K5 na presença do composto de teste com a actividade do polipéptido PI3K5 na presença de uma quantidade equivalente de um composto de referência (por exemplo, um composto tendo uma potência conhecida contra PI3K5), em que uma menor actividade do polipéptido PI3KÕ na presença do composto de teste do que na presença de a referência indica que o composto de ensaio é um inibidor mais potente do que o composto de referência, e uma actividade mais elevada do polipéptido PI3KÕ na presença do composto de teste do que na presença de a referência indica que o composto de ensaio é um inibidor menos potente do que o composto de referência. São aqui divulgados métodos de caracterização da potência de um composto de teste como um inibidor do polipéptido PI3K5, compreendendo os passos de (a) determinação de uma quantidade de um composto de referência (por exemplo, um composto inibidor PT3K5 da presente invenção) que inibe uma actividade de um polipéptido PI3K5 por uma percentagem inibidora de referência, definindo assim uma quantidade inibidora de referência para o composto de referência; (b) determinação de uma quantidade de um composto de teste que inibe uma actividade de um polipéptido PI3K5 por uma percentagem inibidora de referência, definindo assim uma quantidade inibidora de referência para o composto de teste; (c) comparação da quantidade inibidora de referência para o composto de teste com a quantidade inibidora de referência do composto de referência, em que uma quantidade inibidora de referência mais baixa para o composto de teste do que para o composto de referência indica que o composto de teste é um inibidor mais potente do que o composto de referência, e uma quantidade de referência de inibição mais elevada para o composto de teste do que para o composto de referência indica que o composto de ensaio é um inibidor menos potente do que o composto de referência. Num aspecto, o método utiliza uma quantidade inibidora de referência, que é a quantidade do composto que inibe a actividade do polipéptido PI3K5 em 50%, 60%, 70%, ou 80%. Num outro aspecto, o método utiliza uma quantidade inibidora de referência, que é a quantidade do composto que inibe a actividade do polipéptido PI3K5 em 90%, 95% ou 99%. Estes métodos compreendem a determinação da quantidade inibidora de referência dos compostos num ensaio bioquímico in vitro, num ensaio à base de células in vitro, ou num ensaio in vivo. São aqui divulgados métodos de identificação de um inibidor da actividade PI3K5, compreendendo os passos de (i) actividade de medição de um polipéptido PI3K5 na presença e ausência de um composto de teste, e (ii) identificar como um inibidor um composto de teste que diminua a actividade PI3K5 e que compita com um composto da invenção para se ligar a PI3K5 Além disso, são descritos métodos para identificação de compostos que inibem a actividade PI3K5, compreendendo os passos de (i) o contacto de um polipéptido Ρΐ3Κδ com um composto da presente invenção na presença e na ausência de um composto de teste, e (ii) identificar um composto de teste como inibidor da actividade Ρΐ3Κδ em que o composto compete com um composto da invenção para se ligar a PI3K5. Por conseguinte, a divugação proporciona um método para o rastreio de candidatos a inibidores de actividade de ΡΙ3Κδ e/ou para confirmar o mecanismo de acção de tais candidatos inibidores. Tais métodos podem ser empregues contra outras isoformas PI3K em paralelo para determinar a actividade comparativa do composto de teste através das isoformas e/ou em relação a um composto da invenção.

Nestes métodos, o polipéptido ΡΙ3Κδ pode ser um fragmento de ρΙΙΟδ que exibe actividade de quinase, isto é, um fragmento compreendendo o local catalítico de pllOõ. Alternativamente, o polipéptido PI3K5 pode ser um fragmento do domínio de ligação de p85 pllOõ e proporciona um método para identificar os moduladores alostéricos da PI3KÕ. Os métodos podem ser empregues em células de células que expressam PI3K5 ou suas subunidades, quer endogenamente quer exogenamente. Assim, o polipéptido empregue em tais métodos pode estar livre em solução, afixado a um suporte sólido, modificado para ser apresentado numa superfície celular ou localizado intracelularmente. A modulação da actividade ou a formação de complexos de ligação entre o polipéptido PI3K5 e o agente a testar podem, em seguida, ser medidas.

Os polipéptidos de PI3K humanos são passíveis de ensaios bioquímicos ou rastreio de alto rendimento (HTS) de base celular de acordo com métodos conhecidos e praticados na arte, incluindo sistemas de ensaio de melanóforos para investigar interacções receptor ligando, sistemas de ensaio à base de levedura, e sistemas de expressão de células de mamíferos. Para uma revisão, ver Jayawickreme e outros, Curr Opin Biotechnol., 8:629-34 (1997). Os ensaios de HTS automatizados e miniaturizados são também compreendidos como descrito, por exemplo, em Houston e outros, Curr Opin Biotechnol., 8:734-40 (1997).

Tais ensaios de HTS são utilizados para rastrear bibliotecas de compostos para identificar os compostos particulares que apresentam uma propriedade desejada. Qualquer biblioteca de compostos pode ser usada, incluindo bibliotecas químicas, bibliotecas de produtos naturais, e bibliotecas combinatórias aleatórias compreendendo oligopéptidos ou oligonucleótidos concebidos, ou outros compostos orgânicos. As bibliotecas químicas podem conter compostos conhecidos, análogos estruturais próprios de compostos conhecidos, ou compostos que são identificados a partir de rastreio de produtos naturais.

As bibliotecas de produtos naturais são colecções de materiais isolados a partir de fontes naturais, tipicamente microrganismos, animais, plantas ou organismos marinhos. Os produtos naturais são isolados das suas fontes por fermentação de microorganismos, seguida de isolamento e extração dos caldos de fermentação ou por extracção directa a partir dos próprios microorganismos ou tecidos (plantas ou animais). As bibliotecas de produtos naturais incluem policetídeos, péptidos nonribosomal, e variantes (incluindo variantes que ocorrem não naturalmente) da mesma. Para uma revisão, ver Cane e outros, Science, 282:63-68 (1998).

As bibliotecas combinatórias são compostas de um grande número de compostos relacionados, tais como peptídeos, oligonucleótidos ou outros compostos orgânicos como uma mistura. Tais compostos são relativamente simples de projetar e preparar por protocolos tradicionais automatizados de síntese, PCR, clonagem, ou métodos sintéticos próprios. Têm particular interesse bibliotecas de péptidos e combinatórias de oligonucleótidos.

Ainda outras bibliotecas de interesse incluem bibliotecas de péptidos, proteínas, peptidomiméticos, recolha sintética multiparalela, de recombinação, e de polipéptidos.Para uma revisão da química combinatória e bibliotecas criadas deste modo, ver Myers, Curr Opin Biotechnol, 8:701-07 (1997).

Utilizações terapêuticas dos inibidores da actividade PI3K5. A divulgação providencia um método para inibir selectivamente ou especificamente a actividade de PI3K5, terapeuticamente ou profilacticamente, usando compostos da invenção. 0 método compreende a administração de um inibidor selectivo ou específico da actividade de PI3K5 a um indivíduo com necessidade do mesmo numa quantidade suficiente para inibir a actividade de PI3K5. 0 método pode ser empregue para o tratamento de seres humanos ou animais que sofrem de, ou estão sujeitos a, uma condição cujos sintomas ou patologia são mediados pela expressão ou actividade de PI3K5. "Tratar", tal como aqui utilizado refere-se à prevenir que uma doença ocorra num animal que pode estar predisposto à doença, mas ainda não foi diagnosticado como a tendo; inibir a doença, isto é, parar o seu desenvolvimento; aliviar a doença, isto é, provocar a sua regressão; ou melhorar a doença, isto é, reduzir a severidade dos sintomas associados com a doença. "Doença" pretende abranger desordens médicas, doenças, condições, síndromes, e semelhantes, sem limitação.

Os métodos da divulgação abarcam os vários modos de tratamento de um sujeito animal, preferencialmente um mamífero, mais preferencialmente um primata, e ainda mais preferencialmente um ser humano. Entre os animais de mamíferos que podem ser tratados são, por exemplo, os seres humanos; animais de companhia (animais de estimação), incluindo cães e gatos; animais de quinta, incluindo vacas, cavalos, ovelhas, porcos e cabras; animais de laboratório, incluindo ratinhos, ratos, coelhos, cobaias, e primatas não-humanos; e espécimes zoológicos. Animais não mamíferos incluem, por exemplo, aves, peixes, répteis e anfíbios.

Um método da presente divulgação pode ser utilizado para tratar sujeitos, terapeuticamente ou profilacticamente, sofrendo de, ou sujeitos a uma doença inflamatória. Um aspecto da presente invenção deriva do envolvimento de PI3K5 na mediação de aspectos do processo inflamatório. Sem pretender estar ligado a qualquer teoria, teoriza-se que, dado que a inflamação envolve processos tipicamente mediados por leucócitos (por exemplo, neutrófilos ou linfócitos) activação e transmigração quimiotáctica, e porque PI3K5 pode mediar estes fenómenos, antagonistas de PI3K5 podem ser utilizado para suprimir lesões associadas com a inflamação. "Doença inflamatória", tal como aqui utilizado, pode referir-se a qualquer doença, distúrbio ou síndrome em que uma resposta inflamatória excessiva ou não regulada conduz a sintomas inflamatórios excessivos, danos do tecido hospedeiro ou perda da função do tecido. "Doença inflamatória" também se refere a um estado patológico mediado pelo influxo de leucócitos e/ou quimiotaxia de neutrófilos. "Inflamação", tal como aqui utilizado, refere-se a uma resposta localizada e protectora induzida por uma lesão ou destruição dos tecidos, que serve para destruir, diluir, ou emparedar (sequestrar) , tanto o agente prejudicial como o tecido danificado. A inflamação está associada a um influxo de leucócitos e/ou quimiotaxia de neutrófilos. A inflamação pode resultar da infecção com organismos e virus patogénicos e de meios não infecciosos tais como trauma ou reperfusão após enfarte do miocárdio ou acidente vascular cerebral, resposta imunitária a antigénios estranhos e respostas auto-imunes. Por conseguinte, doenças inflamatórias susceptíveis da invenção englobam doenças associadas às reações do sistema de defesa especifico, bem como com as reações do sistema de defesa não especifico.

Tal como aqui utilizado, o termo "sistema de defesa especifico" refere-se ao componente do sistema imunitário que reage à presença de antigénios específicos. Exemplos de inflamação resultante de uma resposta do sistema de defesa especifico incluem a resposta clássica a antigénios estranhos, doenças auto-imunes e resposta de hipersensibilidade do tipo retardada mediada por células-T. As doenças inflamatórias crónicas, a rejeição de tecidos transplantados e de órgãos sólidos, por exemplo, rim e transplantes de medula óssea, e doença de enxerto versus hospedeiro (GVHD), são outros exemplos de reações inflamatórias do sistema de defesa específico. 0 termo "sistema de defesa não especifico" tal como aqui utilizado refere-se a desordens inflamatórias que são mediadas por leucócitos que são incapazes de memória imunológica (por exemplo, granulócitos e macrófagos). Exemplos de inflamação que resultam, pelo menos em parte, de uma reação do sistema de defesa não especifico incluem a inflamação associada a condições tais como a sindrome de dificuldade respiratória (aguda) (ARDS) em adultos ou sindromes de lesões em múltiplos órgãos; lesão de reperfusão; glomerulonefrite aguda; artrite reativa; dermatoses com componentes inflamatórios agudos; meningite purulenta aguda ou outras doenças inflamatórias do sistema nervoso central, tais como acidente vascular cerebral; lesões térmicas; doença inflamatória intestinal; sindromes associados a transfusão de granulócitos; e toxicidade induzida por citocina. "Doença auto-imune" como aqui utilizado refere-se a qualquer grupo de doenças em que a lesão do tecido está associada com respostas humorais ou mediadas por células aos próprios constituintes do corpo. "Doença alérgica", tal como aqui utilizado refere-se a quaisquer sintomas, danos no tecido ou perda da função do tecido resultante da alergia. "Doença artrítica", tal como aqui utilizado refere-se a qualquer doença que é caracterizada por lesões inflamatórias das articulações atribuíveis a uma variedade de etiologias. "Dermatite", tal como aqui utilizado, refere-se a qualquer uma de uma grande família de doenças da pele que são caracterizadas por inflamação da pele atribuível a uma variedade de etiologias. "Rejeição de transplante", tal como aqui utilizado refere-se a qualquer reação imunitária dirigida contra o tecido enxertado, tais como órgãos e células (por exemplo, medula óssea) , caracterizado por uma perda de função do enxerto e tecidos circundantes, dor, inchaço, leucocitose e trombocitopenia .

Os métodos terapêuticos da presente divulgação incluem métodos para o tratamento de doenças associadas com a activação de células inflamatórias. "Activação das células inflamatórias" refere-se à indução de um estimulo (incluindo, mas não se limitando a, citoquinas, antigénios, ou auto-anticorpos) de uma resposta celular proliferativa, a produção de mediadores solúveis (incluindo, mas não se limitando a citoquinas, radicais de oxigénio, enzimas, prostanóides ou aminas vasoactivas) ou a expressão da superfície celular de números novos ou aumentados de mediadores (incluindo, mas não se limitando a, os principais antigénios de histocompatibilidade ou moléculas de adesão de células) em células inflamatórias (incluindo, mas não se limitando a monócitos, macrófagos, linfócitos T, linfócitos B, granulócitos (isto é, leucócitos polimorfonucleares, tais como neutrófilos, basófilos e eosinófilos), mastócitos, células dendríticas, células de Langerhans e células endoteliais). Será apreciado por pessoas peritas na arte que a activação de um ou uma combinação destes fenótipos nestas células pode contribuir para a iniciação, perpetuação ou exacerbação de uma desordem inflamatória.

Foi descoberto que os compostos da presente invenção inibem a libertação de superóxido pelos neutrófilos. Superóxido é libertado por neutrófilos em resposta a qualquer um de uma variedade de estímulos, incluindo sinais de infecção, tal como um mecanismo de morte celular. Por exemplo, é sabido que a libertação de superóxido é induzida pelo factor de necrose tumoral alfa (TNFa), que é libertado por macrófagos, mastócitos, linfócitos e em contacto com os componentes da parede celular bacteriana, tais como lipopolissacáridos (LPS). TNFa é um activador extraordinariamente potente e promíscuo de processos inflamatórios, estando envolvido na activação de neutrófilos e de vários outros tipos de células, a indução de leucócitos/adesão de células endoteliais, pirexia, a produção aumentada de MHC de classe I, e estimulação da angiogénese. Alternativamente, a libertação de superóxido pode ser estimulada por formil-Met-Leu-Phe (fMLP) ou outros péptidos bloqueados no terminal-N de metionina formilada. Tais péptidos não são normalmente encontrados em eucariotas, mas são fundamentalmente característica de bactérias, e sinalizam a presença de bactérias para o sistema imunológico. Os leucócitos que expressam o receptor de fMLP, por exemplo, neutrófilos e macrófagos, são estimulados a migrar em direcção aos gradientes destes péptidos (isto é, quimiotaxia) para os locais de infecção. Tal como aqui demonstrado, os compostos da presente invenção inibem a libertação estimulada de superóxido por neutrófilos em resposta quer de TNFa ou fMLP. Outras funções de neutrófilos, incluindo exocitose estimulada e migração quimiotáctica dirigida, também têm demonstrado ser inibidas pelos inibidores de PI3K5 da invenção. Por conseguinte, é esperado que os compostos da presente invenção sejam úteis no tratamento de desordens, tais como desordens inflamatórias, que são mediadas por qualquer ou todas estas funções dos neutrófilos. A presente invenção permite que os métodos de tratamento de doenças tais como doenças artríticas, tais como artrite reumatóide, artrite monoarticulares, osteoartrite, artrite gotosa, espondilite; doença de Behcet; sépsis, choque séptico, choque endotóxico, sepsis gram negativa, sepsis gram positiva e síndroma do choque tóxico; síndrome de lesão de múltiplos órgãos secundária a septicemia, trauma ou hemorragia; desordens oftálmicas, tais como conjuntivite alérgica, conjuntivite vernal, uveite, e oftalmopatia associada à tiróide; granuloma eosinofílica; distúrbios pulmonares ou respiratórios, tais como a asma, bronquite crónica, rinite alérgica, SDRA, doença inflamatória pulmonar crónica (por exemplo, doença pulmonar crónica obstrutiva), silicose, sarcoidose pulmonar, pleurisia, alveolite, vasculite, enfisema, pneumonia, bronquiectasia, e oxigénio pulmonar toxicidade; lesão de reperfusão do miocárdio, cérebro ou extremidades; fibrose, tal como fibrose cística; formação de quelóides ou cicatrizes formação; aterosclerose; doenças auto-imunes, tais como lúpus eritematoso sistémico (SLE), tiroidite auto-imune, esclerose múltipla, algumas formas de diabetes, e síndrome de Reynaud; distúrbios de rejeição de transplantes, tais como GVHD e rejeição de aloenxertos; glomerulonefrite crónica; doenças inflamatórias do intestino, tais como doença crónica inflamatória do intestino (CIBD), doença de Crohn, colite ulcerativa, e enterocolite necrotizante; dermatoses inflamatórias, tais como dermatite de contacto, dermatite atópica, psoríase ou urticária; febre e mialgias devido a infecção; desordens inflamatórias do sistema nervoso central ou periférico, tais como a meningite, encefalite, e cerebral ou lesão da espinal medula devido a traumatismo menor; Sindrome de Sjogren; doenças envolvendo diapedese de leucócitos; hepatite alcoólica; pneumonia bacteriana; doenças complexo antigene-anticorpo mediada; choque hipovolêmico; Diabetes Mellitus Tipo I; hipersensibilidade aguda e tardia; estados de doença devido a discrasia de leucócitos e metástase; lesões térmicas; granulócitos sindromes associadas à transfusão; e toxicidade induzida por citocina. 0 método pode ter utilidade no tratamento de indivíduos sofrendo de, ou sujeitos a, lesão de reperfusão, isto é, ferimentos resultantes de situações em que um tecido ou órgão experimenta um período de isquemia, seguido de reperfusão. 0 termo "isquemia" refere-se a anemia de tecido localizada devido à obstrução do fluxo de sangue arterial. A isquemia transiente seguida de reperfusão caracteristicamente resulta na activação de neutrófilos e transmigração através do endotélio dos vasos sanguíneos na área afectada. A acumulação de neutrófilos ativados por sua vez resulta na geração de metabólitos reativos de oxigénio, que danificam oscomponentes do tecido ou órgão envolvidos. Este fenómeno de "lesão de reperfusão" é comummente associado a condições tais como acidente vascular cerebral (incluindo isquemia global e focal), choque hemorrágico, isquemia miocárdica ou enfarte, transplante de órgãos, e vasoespasmo cerebral. Para ilustrar, a lesão de reperfusão ocorre no término dos procedimentos de bypass cardíaco ou durante a parada cardíaca, quando o coração, uma vez impedido de receber sangue, começa a aspergir. Espera-se que a inibição da actividade PI3K5 resulte em valores reduzidos de lesão de reperfusão em tais situações.

No que diz respeito ao sistema nervoso, a isquemia global ocorre quando o fluxo sanguíneo para o cérebro inteiro cessa durante um período. A isquemia global pode resultar de uma parada cardíaca. A isquemia focal ocorre quando uma parte do cérebro é privada do seu fornecimento normal de sangue. A isquemia focal pode resultar de oclusão tromboembólica de um vaso cerebral, lesão traumática da cabeça, edema ou tumor cerebral. Mesmo se transiente, tanto a isquemia global e focal podem causar danos neuronais generalizados. Embora danos no tecido nervoso ocorram horas mais ou mesmo dias após o início da isquemia, alguns danos permanentes no tecido nervoso podem desenvolver-se nos minutos iniciais após a cessação do fluxo sanguíneo para o cérebro. A isquemia também pode ocorrer no coração em enfarte do miocárdio e outras doenças cardiovasculares nas quais as artérias coronárias são obstruídas em resultado de aterosclerose, trombo, ou espasmo. Assim, acredita-se que a invenção seja útil no tratamento de danos no tecido cardíaco, especialmente danos que resultam da isquémia cardíaca ou causada por lesão de reperfusão em mamíferos.

Noutro aspecto, os inibidores selectivos de PI3K5 da presente invenção podem ser empregues em métodos de tratamento de doenças de ossos, em particular doenças nas quais a função de osteoclastos é anormal ou indesejável. Como mostrado abaixo, os compostos da presente invenção inibem a função dos osteoclastos in vitro. Consequentemente, a utilização de tais compostos e de outros inibidores selectivos PI3K5 pode ser de valor no tratamento de osteoporose, doença de Paget, e distúrbios relacionados com a reabsorção óssea.

Num aspecto adicional, a presente invenção inclui métodos de utilização de compostos inibidores PI3K5 para inibir o crescimento ou a proliferação de células cancerosas de origem hematopoiéticas, de preferência células cancerígenas de origem linfóide, e com maior preferência, células cancerosas relacionadas com ou derivadas de linfócitos B ou progenitores de linfócitos B. Os cancros sensíveis ao tratamento utilizando os métodos da presente invenção incluem, sem limitação, linfomas, por exemplo, tumores malignos dos tecidos linfóides e reticuloendoteliais, tais como linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkins, linfomas não-Hodgkin, linfomas linfocíticos e semelhantes; mielomas múltiplos; leucemias, tais como leucemias linfocíticas, leucemias mielóides (mielogénica crónica), e semelhantes. Numa forma de realização preferida, os presentes compostos inibitórios de Ρΐ3Κδ podem ser usados para inibir ou controlar o crescimento ou a proliferação de células de leucemia mielóide crónica (mielóides). Outras células cancerosas, de origem hematopoiética ou de outra, que expressam ρΙΙΟδ também podem ser tratadas por administração de um inibidor de PI3K5 da presente invenção (C. Sawyer e outros, Cancer Research, 63(7), 1667-75 (2003)).

Noutro aspecto, a divulgação inclui um método para suprimir uma função de basófilos e/ou mastócitos, desse modo permitindo o tratamento de doenças ou desordens caracterizadas por actividade excessiva ou indesejável de basófilos e/ou mastócitos. De acordo com o método, um composto presente pode ser utilizado para inibir selectivamente a expressão ou actividade de PI3K5 nos basófilos e/ou mastócitos. De preferência, o método emprega um inibidor de PI3K5 numa quantidade suficiente para inibir a libertação de histamina estimulada pelos basófilos e/ou mastócitos. Consequentemente, a utilização de inibidores selectivos de PI3K5 presentes pode ser de valor no tratamento de doenças caracterizadas por uma libertação de histamina, isto é, doenças alérgicas, incluindo desordens tais como doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC), asma, ARDS, enfisema, e desordens relacionadas.

Composições Farmacêuticas de Inibidores de Actividade de PI3K5

Um composto da presente invenção pode ser administrado como o produto químico puro, mas é típico e preferível, administrar o composto na forma de uma composição ou formulação farmacêutica. Por conseguinte, a presente invenção proporciona composições farmacêuticas que compreendem um modulador presente de actividade de PI3K5 e um transportador, adjuvante ou veiculo farmacêutico biocompativel. A composição pode incluir a modulação de actividade de PI3K5 quer como o único agente activo ou em combinação com outros agentes, tais como oligo- ou polinucleótidos, oligo- ou polipéptidos, fármacos, hormonas ou misturado com um excipiente ou outros veículos farmaceuticamente aceitáveis. Os veículos e outros ingredientes podem ser considerados farmaceuticamente aceitável, na medida em que sejam compatíveis com outros ingredientes da formulação e não deletérios para o seu recipiente.

As técnicas para a formulação e administração de composições farmacêuticas podem ser encontradas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed., Mack Publishing Co, Easton, PA, 1990. As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser fabricadas utilizando qualquer método convencional, por exemplo, mistura, dissolução, granulação, fabrico de drageias, levigação, emulsificação, encapsulação, aprisionamento, solidificação em rotação com enregelamento, secagem por pulverização ou liofilização. Uma formulação farmacêutica óptima pode ser determinada por um perito na arte dependendo da via de administração e da dosagem desejada. Tais formulações podem influenciar o estado físico, estabilidade, taxa de libertação in vivo e taxa de depuração in vivo do agente administrado. Dependendo da condição a ser tratada, estas composições farmacêuticas podem ser formuladas e administradas sistemicamente ou localmente.

As composições farmacêuticas são formuladas para conter veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados e, opcionalmente, podem compreender excipientes e auxiliares que facilitam o processamento dos compostos activos em preparações que podem ser utilizadas farmaceuticamente. 0 modo de administração geralmente determina a natureza do veiculo. Por exemplo, as formulações para administração parentérica podem compreender soluções aquosas dos compostos activos em forma solúvel em água. Os veículos apropriados para administração parentérica podem ser selecionados de entre soro fisiológico, soro fisiológico tamponado, dextrose, água, e outras soluções fisiologicamente compatíveis. Os veículos preferidos para administração parentérica são tampões fisiologicamente compatíveis tais como solução de Hanks, solução de Ringer, ou solução salina tamponada fisiologicamente. Para administração em tecido ou celular, são usados penetrantes apropriados para a barreira particular a ser permeada na formulação. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na arte. Para as preparações que compreendem proteínas, a formulação pode incluir materiais de estabilização, tais como polióis (por exemplo, sacarose) e/ou agentes tensioactivos (por exemplo, surfactantes não iónicos), e semelhantes.

Alternativamente, as formulações para administração parentérica podem compreender dispersões e suspensões dos compostos activos como suspensões preparadas para injecção oleosas apropriadas. Os solventes e veículos lipofílicos adequados incluem óleos gordos, tais como óleo de sésamo, e ésteres de ácidos gordos sintéticos, tais como oleato de etilo ou triglicéridos, ou lipossomas. As suspensões aquosas para injecção podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, tais como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol, dextrano, e suas misturas. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizadores ou agentes adequados que aumentam a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas. Os polímeros aquosos que proporcionam solubilização sensível ao pH e/ou libertação sustentada do agente activo também podem ser usado como revestimentos ou estruturas de matriz, por exemplo, polímeros metacrílicos, tais como a série EUDRAGIT® disponível a partir de Rohm America Inc. (Piscataway, NJ) . Emulsões, por exemplo, óleo-em-água e dispersões água-em-óleo, também podem ser utilizadas, opcionalmente estabilizadas por um agente emulsionante ou dispersante (materiais tensoactivos; surfactantes) . As suspensões podem conter agentes de suspensão tais como álcoois isoestearílicos etoxilados, polioxietileno sorbitol e ésteres de sorbitano, celulose microcristalina, meta-hidróxido de alumínio, bentonite, ágar-ágar, goma de tragacanto, e suas misturas.

Os lipossomas que contêm o agente activo também podem ser utilizados para administração parentérica. Os lipossomas são geralmente derivados de fosfolípidos ou outras substâncias lipídicas. As composições na forma de lipossoma podem também conter outros ingredientes, tais como estabilizantes, conservantes, excipientes e semelhantes. Os lípidos e fosfolípidos preferidos incluem fosfatidilcolinas (lecitina), tanto naturais como sintéticas. Métodos de formar lipossomas são conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Prescott (Ed.), Methods in Cell Biology, Vol. XIV, p. 33, Academic Press, Nova Iorque (1976).

As composições farmacêuticas que compreendem ο agente em dosagens adequadas para administração oral podem ser formuladas utilizando transportadores farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na arte. As preparações formuladas para administração oral podem estar na forma de comprimidos, pílulas, cápsulas, saquetas, drageias, pastilhas, líquidos, géis, xaropes, pastas, elixires, suspensões, ou pós. Como ilustração, as preparações farmacêuticas para utilização oral podem ser obtidas combinando os compostos activos com um excipiente sólido, opcionalmente moendo a mistura resultante, e processando a mistura de grânulos, após a adição de auxiliares adequados, se desejado, para obterem comprimidos ou núcleos de drageias. As formulações orais podem empregar transportadores líquidos de tipo similar aos descritos para utilização parentérica, por exemplo, soluções aquosas tamponadas, suspensões, e outros semelhantes.

As formulações orais preferidas incluem comprimidos, drageias e cápsulas de gelatina. Estas preparações podem conter um ou mais excipientes, que incluem, sem limitação: a) diluentes, tais como açúcares, incluindo lactose, dextrose, sacarose, manitol, ou sorbitol; b) aglutinantes, tais como silicato de alumínio de magnésio, amido de milho, trigo, arroz, batata, etc; c) materiais de celulose, tais como metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, e carboximetilcelulose de sódio, polivinilpirrolidona, gomas, tais como goma arábica e goma tragacanto, e proteínas, tais como gelatina e colagénio; d) desintegrantes ou agentes de solubilização, tais como pirrolidona de polivinilo de ligação cruzada, amidos, ágar, ácido algínico ou um seu sal, tal como alginato de sódio, ou composições efervescentes; e) lubrificantes, como sílica, talco, ácido esteárico ou seu sal de magnésio ou de cálcio, e polietileno glicol; f) aromatizantes e adoçantes; g) corantes e pigmentos, por exemplo, para identificar o produto ou para caracterizar a quantidade (dosagem) do composto activo; e h) outros ingredientes, tais como conservantes, estabilizantes, agentes de inchamento, agentes emulsionantes, promotores de solução, sais para regulação da pressão osmótica e tampões.

As cápsulas de gelatina incluem cápsulas de encaixe feitas de gelatina, bem como cápsulas moles seladas feitas de gelatina e um revestimento, tal como glicerina ou sorbitol. As cápsulas de encaixe podem conter o(s) ingrediente (s) activo (s) misturado(s) com agentes de enchimento, aglutinantes, lubrificantes, e/ou estabilizadores, etc. Em cápsulas moles, os compostos activos podem ser dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, tais como óleos gordos, parafina líquida, ou polietilenoglicol líquido com ou sem estabilizantes.

Os núcleos de drageias podem ser proporcionados com revestimentos adequados tais como soluções concentradas de açúcar, que também podem conter goma-arábica, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenoglicol, e/ou dióxido de titânio, soluções de laca, e solventes orgânicos adequados ou misturas de solventes. A composição farmacêutica pode ser proporcionada como um sal do agente activo. Os sais são mais solúveis em solventes aquosos ou outros protónicos do que as formas de ácido ou de base livre correspondentes. Os sais farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na arte. Os compostos que contêm partes ácidas podem formar sais farmaceuticamente aceitáveis com catiões adequados. Os catiões farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, por exemplo, metal alcalino (por exemplo, sódio ou potássio) e catiões alcalino-terrosos (por exemplo, cálcio ou magnésio).

Os compostos de fórmula estrutural (I) e (II) que contêm porções básicas podem formar sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis com ácidos adequados. Por exemplo, Berge e outros, J. Pharm. Sei., 66:1 (1977), descreve sais farmaceuticamente aceitáveis em detalhe. Os sais podem ser preparados in situ durante o isolamento e purificação finais dos compostos da invenção ou separadamente fazendo reagir uma função base livre com um ácido adequado.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos da invenção, geralmente são preferidos nos métodos da invenção, Tal como aqui utilizado, o termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" refere-se a sais ou formas zwitteriónicas dos compostos de fórmulas estruturais (I) ou (II) . Os catiões farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, por exemplo, metal alcalino (por exemplo, sódio ou potássio) e catiões alcalino-terrosos metálicos (por exemplo, cálcio ou magnésio). Além disso, os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos de fórmulas estruturais (I) ou (II) que contêm um centro básico são sais de adição de ácido formados com ácidos farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos de ácidos que podem ser empregues para formar sais farmaceuticamente aceitáveis incluem ácidos inorgânicos tais como ácido clorídrico, bromídrico, sulfúrico e fosfórico, e ácidos orgânicos tais como ácido oxálico, maleico, succínico, malónico e cítrico. Exemplos não limitativos de sais de compostos da invenção incluem, mas não estão limitados a, sais de hidrocloreto, bromidrato, iodidrato, sulfato, bissulfato, 2-hidroxietanossulfonato, fosfato, fosfato de hidrogénio, acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, digluconato, glicerolfosfato, hemissulfato, heptanoato, hexanoato, formato, succinato, malonato, fumarato, maleato, metanossulfonato, mesitilenossulfonato, naftilenossulfonato, nicotinato, 2-naftalenossulfonato, oxalato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, tricloroacetato, trifluoroacetato, glutamato, bicarbonato, paratoluenossulfonato, undecanoato, lactato, citrato, tartarato, gluconato, sulfonato de benzeno, e p-toluenossulfonato. Além disso, os grupos amino disponíveis presentes nos compostos da invenção podem ser quaternizados com cloretos, brometos e iodetos de metilo, etilo, propilo, butilo; sulfatos de dimetilo, dietilo, dibutilo, diamilo; e cloretos, brometos, e iodetos de decilo, laurilo, miristilo e esterilo; e brometos de benzilo e fenetilo. À luz do exposto, qualquer referência a compostos da presente invenção que aparecem aqui, pretende incluir os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, solvatos, derivados quaternários, e pró-fármacos. As composições que compreendem um composto da invenção formulado num transportador farmaceuticamente aceitável podem ser preparadas, colocadas num recipiente apropriado, e rotuladas para tratamento de uma condição indicada. Por conseguinte, há também é contemplado um artigo de fabrico, tal como um recipiente que compreende uma forma de dosagem de um composto da invenção e um rótulo que contém as instruções de utilização do composto. Os kits também são contemplados. Por exemplo, um kit pode compreender uma forma de dosagem de uma composição farmacêutica e um folheto informativo com instruções para utilização da composição no tratamento de uma condição médica. Em ambos os casos, as condições indicadas no rótulo podem incluir o tratamento de desordens inflamatórias, cancro, e outros semelhantes. Métodos de Administração de Inibidores de Atividade de PI3K5

As composições farmacêuticas que compreendem um inibidor da actividade e PI3K5 podem ser administradas ao sujeito por qualquer método convencional, incluindo parenteral e enteral técnicas. As modalidades de administração parentérica incluem aquelas em que a composição é administrada por uma via que não seja através do tracto gastrointestinal, por exemplo, injecções intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramedular, intramuscular, intra-articular, intratecal, intraventricular. As modalidades de administração entérica incluem, por exemplo, administração oral, bucal, sublingual, e rectal. As modalidades de administração transepitelial incluem, por exemplo, a administração transmucosa e transdérmica. A administração transmucosa inclui, por exemplo, administração entérica, bem como nasal, inalação, e administração pulmonar profunda; administração vaginal; e bucal e sublingual. A administração transdérmica inclui as modalidades transdérmica ou transcutânea passiva ou activa, incluindo, por exemplo, emplastros e dispositivos de iontoforese, assim como a aplicação tópica de pomadas, pastas ou unguentos. A administração parentérica pode também ser realizada utilizando uma técnica de elevada pressão, por exemplo, POWDERJECT®.

As técnicas cirúrgicas incluem implantação de composições depósito (reservatório), bombas osmóticas, e semelhantes. Uma via de administração preferida para o tratamento de inflamação podem ser de entrega local ou tópica para desordens localizadas, tais como a artrite, ou para entrega sistémica distúrbios distribuídas, por exemplo, para administração intravenosa ou lesão de reperfusão para as condições sistémicas, tais como septicemia. Para outras doenças, incluindo aquelas que envolvem o tracto respiratório, por exemplo, doença pulmonar obstrutiva crónica, asma e enfisema, a administração pode ser realizada por inalação ou administração pulmonar profunda de sprays, aerossóis, pós, e outros semelhantes.

Para o tratamento de doenças neoplásicas, especialmente leucemias e outros cancros distribuídos, a administração parentérica é tipicamente preferido. A formulação dos compostos para os optimizar para biodistribuição após a administração parentérica seria desejável. Os compostos inibidores de PI3K5 podem ser administrados antes de, durante, ou após a administração de quimioterapia, radioterapia e/ou cirurgia.

Além disso, o índice terapêutico dos compostos inibidores de PI3K5 pode ser melhorado através da modificação ou derivatização de compostos para entrega dirigida a células cancerosas que expressam um marcador que identifica as células como tal. Por exemplo, os compostos podem ser ligados a um anticorpo que reconhece um marcador que é selectivo ou específico para as células cancerosas, de modo que os compostos são colocados na proximidade das células para exercerem os seus efeitos localmente, como previamente descrito (ver, por exemplo, Pietersz e outros, Immunol. Rev., 129:57 (1992); Trail e outros, Science, 261:212 (1993); e Rowlinson-Busza e outros, Curr. Opin. Oncol., 4:1142 (1992)). A entrega dirigida ao tumor destes compostos melhora o beneficio terapêutico por, entre outras coisas, minimizar potenciais efeitos tóxicos não específicos que podem resultar do tratamento por radiação ou quimioterapia. Num outro aspecto, compostos inibidores de PI3K5 e radioisótopos ou agentes quimioterapêuticos podem ser conjugados com o mesmo anticorpo anti-tumoral.

Para o tratamento de doenças da reabsorção óssea ou distúrbios mediados por osteoclastos, os inibidores de PI3K5 podem ser entregues por qualquer método adequado. A administração focal pode ser desejável, tal como por injecção intra articular. Em alguns casos, pode ser desejável acoplar os compostos a uma porção que pode dirigir os compostos ao osso. Por exemplo, um inibidor de PI3K5 pode ser acoplado a compostos com elevada afinidade para a hidroxiapatite, que é um dos principais constituintes dos ossos. Isto pode ser conseguido, por exemplo, por adaptação de um método de acoplamento de tetraciclina desenvolvido para entrega direccionada de estrogénio no osso (Orme e outros, Bioorg. Med. Chem. Lett., 4(11) : 1375-80 (1994)).

Para ser eficaz terapeuticamente na modulação dos alvos no sistema nervoso central, os agentes utilizados devem penetrar facilmente a barreira sanguínea do cérebro quando administrados perifericamente. Os compostos que não podem penetrar a barreira sangue cérebro, no entanto, podem ainda ser eficazmente administrados por uma via intravenosa.

Como observado acima, as características do próprio agente e a formulação do agente pode influenciar o estado físico, estabilidade, taxa de libertação in vivo e taxa de depuração in vivo do agente administrado. Tal informação farmacocinética e farmacodinâmica pode ser recolhida através de estudos pré-clínicos in vitro e in vivo, mais tarde confirmada em seres humanos no decurso de ensaios clínicos. Assim, para qualquer composto utilizado no método da invenção, uma dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios bioquímicos e/ou à base de células. Em seguida, a dosagem pode ser formulada em modelos animais para atingir uma variedade de concentrações circulantes desejável que modula a expressão ou actividade de PI3K5. À medida que estudos em humanos forem realizados, mais informações surgirão em relação aos níveis de dosagem adequados e duração do tratamento para várias doenças e condições. A toxicidade e eficácia terapêutica de tais compostos podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou animais experimentais, por exemplo, para determinação da DL50 (a dose letal para 50% da população) e a ED5o (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A proporção entre efeitos tóxicos e terapêuticos da dose é o "índice terapêutico", que, tipicamente, é expresso como a razão LD5o/ED5o. Os compostos que exibem índices terapêuticos grandes, isto é, a dose tóxica é substancialmente maior do que a dose eficaz, são preferidos. Os dados obtidos a partir de tais ensaios de culturas celulares e estudos animais adicionais podem ser usados na formulação de uma gama de dosagem para utilização humana. A dosagem de tais compostos situa-se preferencialmente dentro de uma gama de concentrações que inclui a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade em circulação.

De acordo com a presente invenção, pode ser utilizado qualquer regime de administração eficaz para regular o momento e a sequência de doses. Os compostos e composições farmacêuticas adequados para utilização na presente invenção incluem aqueles em que o ingrediente activo é administrado numa quantidade eficaz para atingir a finalidade pretendida. Mais especificamente, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" significa uma quantidade suficiente para modular a expressão ou actividade de PI3K5, e, assim, o tratamento de um indivíduo sofrendo de uma indicação, ou para aliviar os sintomas existentes da indicação. A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz está bem dentro da capacidade dos peritos na arte, especialmente à luz da divulgação detalhada aqui proporcionada.

Os níveis exemplificativos de dosagem para um ser humano são da ordem de desde cerca de 0,001 miligramas de agente activo por quilograma de peso corporal (mg/kg) a cerca de 1000 mg/kg. Tipicamente, as unidades de dosagem do agente activo compreendem entre cerca de 0,01 mg a cerca de 1000 mg, de preferência desde cerca de 0,1 mg a cerca de 100 mg, dependendo da indicação, via de administração, e da severidade da condição, por exemplo. Dependendo da via de administração, uma dose adequada pode ser calculada de acordo com o peso corporal, área de superfície corporal ou tamanho do órgão. 0 regime de dosagem final é determinado pelo médico assistente, tendo em vista a boa prática médica, tendo em consideração vários factores que modificam a acção de fármacos, por exemplo, a actividade especifica do composto, a identidade e a gravidade do estado de doença, a resposta do paciente, a idade, condição, peso corporal, sexo, e dieta do paciente, e a gravidade de qualquer infecção. Fatores adicionais que podem ser tomadas em consideração incluem o tempo e a frequência de administração, combinações de fármacos, sensibilidades de reação e tolerância/resposta à terapia. 0 refinamento adicional da dosagem apropriada para o tratamento envolvendo qualquer uma das formulações aqui mencionadas é rotineiramente feito pelos peritos sem experimentação indevida, especialmente à luz da informação de dosagem e ensaios divulgados, bem como os dados farmacocinéticos observadas em ensaios clínicos humanos. As doses apropriadas podem ser determinadas através da utilização dos ensaios estabelecidos para a determinação da concentração do agente num fluido corporal, ou outra amostra em conjunto com os dados de resposta à dose. A frequência de administração depende dos parâmetros farmacocinéticos do agente e da via de administração. A dosagem e a administração são ajustadas para proporcionar níveis suficientes da porção activa ou para manter o efeito desejado. Por conseguinte, as composições farmacêuticas podem ser administradas numa dose única, doses múltiplas discretas, infusão contínua, depósitos de libertação sustentada, ou suas combinações, como requerido para manter o nível mínimo desejado do agente. Composições farmacêuticas de acção curta (isto é, com uma meia vida reduzida) podem ser administradas uma vez por dia ou mais do que uma vez por dia (por exemplo, duas, três, ou quatro vezes por dia). As composições farmacêuticas de acção prolongada podem ser administradas a cada 3 a 4 dias, todas as semanas, ou uma vez a cada duas semanas. Bombas, tais como bombas subcutâneas, intraperitoneais ou subdurais, podem ser usadas para infusão continua.

Os exemplos seguintes são proporcionados para auxiliar ainda mais a compreensão da invenção, e pressupõem uma compreensão de métodos convencionais bem conhecidos para as pessoas que têm conhecimentos correntes na técnica a que os exemplos se referem, por exemplo, a construção de vectores e plasmideos, a inserção de genes que codificam polipéptidos em tais vectores e plasmideos, ou a introdução de vectores e plasmideos em células hospedeiras. Tais métodos são descritos em detalhe em numerosas publicações incluindo, por exemplo, Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Ausubel e outros (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994); e Ausubel e outros (Eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 4a edição, John Wiley & Sons, Inc. (1999). Os materiais e condições particulares descritos a seguir destinam-se a exemplificar aspectos particulares da invenção e não devem ser interpretados para limitar o seu âmbito razoável. EXEMPLO 1

Preparação e purificação do recombinante PI3Koí, β, e δ

Os complexos heterodiméricos de PI3K recombinantes constituídos por uma subunidade catalítica pllO e uma subunidade reguladora p85 foram sobre-expresso utilizando o sistema de expressão de baculovírus BAC-TO-Bac® HT (GIBCO/BRL), e depois purificados para utilização em ensaios bioquímicos. As quatro PI 3-quinases Classe 1 foram clonadas em vectores de baculovírus, como se segue: ρΙΙΟδ: Uma versão marcada com FLAG® de ρΙΙΟδ humana (SEQ ID NOS: 1 e 2) (ver Chantry e outros, J. Biol. Chem., 272:19236-41 (1997)) foi subclonado utilizando técnicas padrão de ADN recombinante no local BamHl-Xbal do vector de expressão de células de insecto pFastbac HTB (Life Technologies, Gaithersburg, MD), de tal modo que o clone estava em enquadramento com a etiqueta His do vetor. 0 sistema de FLAG® está descrito nas Patentes dos E.U.A. n.°s 4.703.004; 4.782.137; 4.851.341; e 5.011.912, e reagentes estão disponíveis de Eastman Kodak Co. pllOa: Semelhante ao método utilizado para ρΙΙΟδ, descrito acima, uma versão marcada com FLAG® de pllOa (ver Volinia e outros, Genomics, 24 (3): 427-77 (1994)) foi subclonado em locais BamHl-HindIII de pFastbac HTb (Life

Technologies) de tal modo que o clone estava em enquadramento com a etiqueta His do vector. ρΙΙΟβ: A ρΙΙΟβ (ver Hu e outros, Mol. Cell. Biol., 13:7677-88 (1993)) o clone foi amplificado a partir da biblioteca de ADNc de baço humano pronto MARATHON® (Clontech, Palo Alto CA) , de acordo com o protocolo do fabricante utilizando os seguintes iniciadores:

Primário 5'

Primário 3'

(SEQ ID N. ° : 4) 0 primário 5' foi construído para conter uma etiqueta FLAG® em enquadramento com a sequência de ρΙΙΟβ. Após a amplificação, a sequência de ΕΡΑ6®-ρ110β foi subclonada utilizando técnicas recombinantes padrão nos locais EcoRl-Notl de pFastbac HTa (Life Technologies), de tal modo que o clone estava em enquadramento com a marca His do vector. ρΙΙΟγ: 0 clone ρΙΙΟγ ADNc (ver Stoyanov e outros, Science, 269:690-93 (1995)) foi amplificado a partir da biblioteca de ADNc de baço humano pronto MARATHON® (Clontech, Paio Alto CA) , de acordo com o protocolo do fabricante utilizando os seguintes primários:

Primário 5'

(SEQ ID N°:5)

Primário 3'

(SEQ ID N° : 6)

Uma etiqueta FLAG® foi subsequentemente ligada à extremidade 5' da sequência p110Y e foi clonada nos locais BamEl- Spel de pFastbac HTb (Life Technologies) utilizando técnicas padrão de ADN recombinante, com a sequência de FLAG®-110γ enquadrada com a etiqueta His do vector. ρ85α: Um fragmento BamHl-EcoRl do ADNc de p85 marcado com FLAG® (ver Skolnik e outros, Cell., 65:83-89 (1991)) foi subclonado nos locais BamHl-EcoRl do vector pFastBac duplo (Life Technologies).

Os baculovirus recombinantes contendo os clones acima foram gerados utilizando o protocolo recomendado pelo fabricante (Life Technologies). Baculovirus expressando a etiqueta His ρΙΙΟα, ρΙΙΟβ, ou subunidade catalítica pllOõ e subunidade p85 foram co-infectados em células de insecto Sf21. Para enriquecer o complexo de enzimas heterodiméricas, uma quantidade em excesso de baculovirus expressando a subunidade p85 foi infectada, e a subunidade catalítica pllO marcada com His complexada com p85 foi purificada numa coluna de afinidade de níquel. Já que ρ110γ não está associado a p85, as células Sf21 foram infectadas com baculovirus recombinantes expressando apenas ρΙΙΟγ marcada com His. Numa abordagem alternativa, plOl pode ser clonado em baculovírus, para permitir a expressão co com o seu parceiro de ligação ρΙΙΟγ preferido.

As células Sf21 infectadas pós-72 horas (3 litros), foram colhidas e homogeneizadas num tampão hipotónico (20 mM HEPES-KOH, pH 7,8, KC1 5 mM, cocktail completo de inibidor de protease (Roche Biochemicals, Indianapolis, IN) , utilizando um homogeneizador Dounce. Os homogenatos foram centrifugados a 1.000 x g durante 15 min. Os sobrenadantes foram centrifugados adicionalmente a 10.000 x g durante 20 min, seguido de ultracentrifugação a 100.000 x g durante 60 min. A fracção solúvel foi carregada de imediato em 10 mL de HITRAP® coluna de afinidade de níquel (Pharmacia, Piscataway, NJ) equilibrada com 50 mL de tampão A (50 mM HEPES-KOH, pH 7,8, 0,5 M de NaCl., Imidazol 10 mM). A coluna foi lavada extensivamente com tampão A e eluída com um gradiente linear de imidazol 10-500 mM. A subunidade p85 livre foi removida da coluna durante o passo de lavagem e apenas o complexo enzima heterodimérica eluiu a 250 mM de imidazole. As alíquotas de fracções de níquel foram analisadas por electroforese em 10% gel SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE), coradas com Vermelho SYPRO® (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR), e quantificadas com Storm® phosphorimager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) . As fracções activas foram reunidas e directamente carregadas numa coluna de heparina Hi-trap 5 mL pré equilibrada com tampão B que continha 50 mM de HEPES-KOH, pH 7,5, NaCl 50 mM, ditiotreitol 2 mM (DTT) . A coluna foi lavada com 50 ml de tampão B e eluída com um gradiente linear de NaCl 0,05-2 M. Um único pico contendo o complexo de enzima PI3K eluiu a NaCl 0,8 Μ. A análise em gel de SDS-poliacrilamida mostrou que as fracções purificadas de enzima PI3K continham um complexo estequiométrico 1:1 de subunidades pllO e p85. O perfil proteico do complexo da enzima durante cromatografia com heparina correspondem ao de actividade de esfingosina-quinase. As fracções activas foram reunidas e congeladas em azoto liquido. EXEMPLOS 2-6:

Dado que PI3K5 é expressa em niveis significativos em leucócitos, é importante para estudar os efeitos da inibição selectiva PI3K5 das funções dos leucócitos. Consequentemente, foram examinados os efeitos de inibição PI3K5 em vários tipos de leucócitos. Os neutrófilos foram examinados para determinar os efeitos que a inibição selectiva de PI3KÕ pode provocar (Exemplo 2, abaixo). Surpreendentemente verificou-se que a inibição selectiva da actividade Ρΐ3Κδ parece estar significativamente associada com a inibição de algumas mas não todas as funções caracteristicas de neutrófilos activados. Além disso, os efeitos da inibição Ρΐ3Κδ na função de células B e células T foram também testados (Exemplos 3-4, a seguir). Além disso, como Ρΐ3Κδ também é expressa em osteoblastos, foi estudado o efeito de inibição de Ρΐ3Κδ na função destas células especializadas (Exemplo 5, abaixo). EXEMPLO 2

Caracterização do Papel de PI3K5 na Função Neutrófila

Os efeitos de um inibidor PI3K5 da invenção na função de neutrófilos, tais como a geração de superóxido, a exocitose de elastase, quimiotaxia, e morte bacteriana podem ser testados. A. Preparação de neutrófilos a partir de sangue humano

Aliquotas (8 ml) de sangue heparinizado de voluntários saudáveis são colocados em camadas em almofadas de 3 mL de 7,3% FICOLL® (Sigma, St. Louis, MO) e 15,4% HYPAQUE® (Sigma) e centrifugados a 900 rpm durante 30 min à temperatura ambiente numa centrífuga de bancada (Beckman). Os eritrócitos residuais são removidos por lise hipotónica com NaCl a 0,2%. A preparação de neutrófilos é lavada duas vezes com HBSS contendo 0,1% de gelatina e utilizada imediatamente. B. Medição da produção de superóxido a partir de neutrófilos A geração de superóxido é uma das marcas de ativação de neutrófilos. Uma variedade de activadores potência a produção de superóxido por neutrófilos. O efeito de um inibidor de PI3K5 presente na geração de superóxido por três agonistas diferentes: TNFla, IgG e fMLP, cada um representando classes separadas de activador, é medido. 0 superóxido gerado pelos neutrófilos é medido por monitorização de uma alteração na absorvância após redução do citocromo C por modificação do método descrito por Green e outros, (Pp. 14.5.1-14.5.11 em Supp. 12, Curr. Protocols Immunol. (Eds., Colligan e outros) (1994)), como se segue. As cavidades individuais de uma placa de 96 cavidades são revestidas durante a noite a 4°C com 50 μΐ de 2 mg/mL de solução de fibrinogénio humano ou IgG. As cavidades são lavadas com PBS e os seguintes reagentes são adicionados a cada cavidade: 50 pL de HBSS ou superóxido dismutase (1 mg/mL), 50 mL de HBSS ou TNFla (50 ng/mL), 50 pL de citocromo C (2,7 mg/ml), e 100 pL da suspensão de neutrófilos humanos purificados (2 x 106 células/mL). A placa é centrifugada durante 2 min a 200 rpm e a absorvância a 550 nm foi monitorizada durante 2 horas. Para medir as quantidades relativas de superóxido gerado, os valores obtidos a partir das cavidades contendo superóxido dismutase são subtraídos de todas, e normalizados para os valores obtidos a partir das cavidades sem qualquer inibidor.

Os compostos da presente invenção inibem a produção de superóxido induzida por TNF pelos neutrófilos de uma forma dependente da concentração. Além disso, a geração de superóxido induzida por IgG não foi significativamente inibida pelos compostos da presente invenção. O efeito dos compostos da presente invenção sobre a geração de superóxido induzida por um outro potente indutor, o péptido formilado bacteriano Met-Leu-Phe (fMLP), também pode ser estudado. Como a produção de superóxido induzida por THF, a geração de superóxido induzida por fMLP também é inibida compostos da presente invenção. Estes resultados mostram que os compostos inibidores de PI3K5 da presente invenção podem prevenir a indução de estimulo especifico da produção de superóxido por neutrófilos, indicando que PI3K5 está envolvido neste processo. C. Medição da exocitose elastase de neutrófilos

Além da geração de superóxido, os neutrófilos activados também respondem libertando várias proteases que são responsáveis pela destruição da cartilagem e tecidos durante a inflamação. Como uma indicação da libertação de protease, o efeito do presente composto em exocitose elastase é medido. A exocitose elastase é quantificada pela modificação do procedimento descrito por Ossanna e outros (J. Clin. Invest., 77:1939-51 (1986)), como o seguinte. No final do período de incubação, a placa foi centrifugada durante 5 min a 1000 rpm, e 90 μΐ do sobrenadante são transferidos para 10 yL de solução a 10 mM de um péptido de substrato de elastase, MeO-suc-Ala-AlaPro-Val-pNA, em que MeO-suc = metoxi-succinilo; pNA = p-nitroanilida (Calbiochem, San Diego, CA). A absorvância a 410 nm é monitorizada durante 2 horas em um leitor de placas de 96 cavidades. Para medir as quantidades relativas de elastase de exocitose, todos os valores de absorvância são normalizados para os valores sem qualquer inibidor. Os compostos inibidores de PI3K5 da presente invenção inibem significativamente a elastase de exocitose induzida fMLP, e fazê-lo de uma forma dependente da dose.

D. Medição da migração de neutrófilos humanos induzida por fMLP

Os neutrófilos possuem a capacidade intrínseca para migrar através dos tecidos, e são um dos primeiros tipos de células a chegar aos locais de inflamação ou lesão do tecido. 0 efeito dos presentes compostos sobre a migração de neutrófilos para um gradiente de concentração de fMLP é medido. No dia antes dos ensaios de migração serem realizados, placas de 6 cavidades são revestidas com proteína recombinante ICAM-1/Fc (Van der Vieren e outros, Immunity, 3:683-90 (1995)) (25 yg/mL em tampão de bicarbonato, pH 9.3) e deixadas durante a noite a 4°C. Após a lavagem, solução de agarose a 1%, em meio RPMI-1640 com 0,5% de albumina de soro bovino (BSA), é adicionada às cavidades com ou sem um inibidor, e as placas são colocadas num frigorífico antes de perfurar orifícios no gel de agarose para criar placas (1 furo central, rodeado por 6 periféricos por cavidade).

Os neutrófilos humanos são obtidos como descrito acima, e ressuspensos em meio RPMI suplementado com BSA a 0,5% em 5 x 106 células/ml. Após combinação dos volumes iguais de suspensão de neutrófilos e meio (quer com DMSO ou uma diluição em série do composto em teste em DMSO), os neutrófilos são divididos em alíquotas nos orifícios periféricos, enquanto o orifício central recebe fMLP (5 μΜ) . As placas são incubadas a 37 °C na presença de C02 a 5% durante 4 h, seguindo-se a terminação da migração através da adição de solução de glutaraldeido a 1% em D-PBS. Depois de remover a camada de agarose, as cavidades são lavadas com água destilada e secas. A análise da migração de neutrófilos é conduzida num microscópio invertido Nikon DIAPHOT® (objectiva lx) da estação de trabalho de video usando o programa NIH 1.61. Utilizando programas Microsoft Excel e Table Curve 4 (SPSS Inc., Chicago, IL), um índice de migração é obtido para cada uma das condições estudadas. 0 índice de migração é definido como a área sob a curva que representa o número de neutrófilos que migraram versus a distância de migração líquida por célula.

Os compostos inibidores de PI3K5 da presente invenção têm um efeito sobre a migração de neutrófilos, inibição desta actividade de forma dependente da dose. E. Medição da capacidade bactericida de neutrófilos

Dado que os compostos inibidores de PI3K5 da presente invenção afectam certas funções do neutrófilo, tem interesse se os compostos afectam a morte bacteriana mediada por neutrófilos. 0 efeito dos compostos sobre a morte de Staphylococcus aureus mediada por neutrófilos é estudada de acordo com o método descrito por Clark e Nauseef (pp. 7.23.4-7.23.6 no Vol. 2, Supp. 6, Curr. Protocol Immunol. (Eds., Colligan e outros) (1994)). Os neutrófilos humanos purificados (5 x 106 células/mL) (tratados com DMSO ou uma diluição em série do composto presente em DMSO) são misturados com soro autólogo. As células de S. aureus cultivadas durante a noite são lavadas, ressuspensas em HBSS e adicionadas aos neutrófilos opsonizado de soro numa proporção de 10:1. Os neutrófilos são permitidos para internalizar as bactérias por fagocitose por incubação a 37 °C durante 20 min. As bactérias não internalizadas são mortas por 10 unidades/ml de lisostafina a 37°C durante 5 min e a mistura total é rodada a 37°C. As amostras são retiradas em vários momentos até 90 min e os neutrófilos são lisados por diluição em água. As bactérias viáveis são contadas por plaqueamento de diluições apropriadas na placa tripticase-soja-agar e contando as colónias de S. aureus após o crescimento durante a noite. A morte de S. aureus mediada por neutrófilos é semelhante em amostras tratadas com DMSO (controlo) e com um composto presente. Portanto, um inibidor PI3K5 não afecta significativamente a capacidade dos neutrófilos para matar S. aureus, sugerindo que PI3K5 não está envolvido nesta via da função dos neutrófilos. EXEMPLO 3

Caracterização do papel da PI3KÕ na Função de Linfócitos B

Os efeitos de um inibidor de Pl3-quinase nas funções das células B, incluindo os indices clássicos, tais como a produção de anticorpos e a proliferação induzida por estimulo especifico são também estudados. A. Preparação e estimulação de células B de sangue periférico humano

Sangue heparinizado (200 mL) de voluntários saudáveis é misturado com um volume igual de D-PBS, colocado em 10 x 10 mL de FICOLL-PAQUE® (Pharmacia) , e centrifugado a 1600 rpm durante 30 min à temperatura ambiente. As células mononucleares de sangue periférico (PBMC) são recolhidas a partir do FICOLL®/interface de soro, sobrepostas em 10 mL de soro bovino fetal (FBS) e centrifugadas a 800 rpm durante 10 min para remover as plaquetas. Após lavagem, as células são incubadas com a mistura de anticorpos DYNAL® (kit de células B) (Dynal Corp, Lake Success, NY) durante 20 min a 4-8°C. Após a remoção do anticorpo não ligado, PBL são misturados com de esferas magnéticas revestidas com IgG anti-rato (Dynal) durante 20 min a 4-8°C com agitação suave, seguida por eliminação de células não-B marcados sobre o separador de esféras magnéticas. Este procedimento é repetido mais uma vez. As células B foram ressuspensas em RPMI-1640 com FBS a 10%, e mantidas em gelo até à sua utilização.

B. Medição da produção de anticorpos por células B humanas

Para estudar a produção de anticorpos, células B são aliquotadas em 50-75 x 103 células/cavidade em placas de 96 cavidades com ou sem inibidor, para a qual a IL-2 (100 U/mL) e células de Staphylococcus aureus PANSORBIN® (Calbiochem) (1:90.000) foram adicionadas. Parte do meio é removido após 24-36 horas, e meio fresco (com ou sem inibidor) e IL-2 são adicionados. As culturas são incubadas a 37°C, na presença de um incubador de CO2 durante 7 dias adicionais. As amostras de cada condição (em triplicado) são removidas e analisadas quanto a IgG e IgM, conforme medido por ELISA. Resumidamente, placas IMMULON® 4 de 96 cavidades são revestidas (50 pL/cavidade) com ambos os 150 ng/mL de IgG anti-humano de burro (H+L) (Jackson ImmunoResearch, West Grove PA), ou de 2 mg/mL IgG + IgM anti-humano de burro (H+L) (Jackson ImmunoResearch) em tampão de bicarbonato, e deixadas durante a noite a 4°C. Depois de se lavar três vezes com solução salina tamponada com fosfato contendo 0,1% de TWEEN®-80 (PBST) (350 μΐ/cavidade) , e do bloqueio com soro de cabra a 3% em PBST (100 1/cavidade) durante 1 h à temperatura ambiente, as amostras (100 pL/avidade) de meio de células B gasto diluídas em PBST são adicionados. Para placas de IgG a gama de diluição é de 1:500 a 1:10.000, e para IgM de 1:50 a 1: 1.000 . Após 1 hora, as placas são expostas a IgG anti-humano conjugado com biotina (100 ng/mL) ou anti-humano IgM (200 ng/mL) (Jackson ImmunoResearch) durante 30 min, seguido de estreptavidina-HRP (1:20.000) durante 30 minutos, e, finalmente, uma solução de TMB (1:100) com H2O2 (1:10.000) durante 5 minutos, com 3 lavagens com PBST entre os passos. O desenvolvimento da cor é interrompido pela solução de H2SO4 e as placas foram lidas num leitor de placas de ELISA.

Os compostos da presente invenção inibiram a produção de anticorpos. C. Medição da Proliferação de Células B em resposta à estimulação de células IgM de superfície

Na experiência acima, as células B são estimuladas usando PANSORBIN®. A resposta do efeito que os compostos resultantes da presente invenção sobre a proliferação de células B, quando são estimuladas através do IgM da sua superfície celular usando anticorpos anti-IgM também foi medida. Esplenócitos de murino (Balb/c) são colocados em placas de microtitulação de 96 cavidades a 2 x 105 células por cavidade em 10% de FBS/RPMI. As diluições apropriadas de inibidor de teste em meio completo são adicionadas às células e as placas são incubadas durante 30-60 minutos antes da adição do estímulo. Após a pré-incubação com o inibidor de ensaio, uma preparação F(ab')2 de anticorpo de cabra específico para a cadeia μ de IgM de ratinho é adicionado aos poços a uma concentração final de 25 pg/mL. As placas são incubadas a 37°C durante 3 dias e 1 pCi de [3H]-timidina é adicionada a cada cavidade para as últimas quatro horas de cultura. As placas são colhidas para filtros de fibra, lavadas, e a incorporação do marcador radioactivo é determinada usando um contador beta (Matrix 96, Packard Instrument Co., Downers Grove, IL) e expressa como contagens por minuto (CPM).

Os compostos da presente invenção inibem a proliferação de células B anti-IgM-estimulado de um modo dependente da dose. Porque os compostos da presente invenção inibem a proliferação de células B, imaginou-se que esses compostos e outros inibidores PI3K5 poderiam ser utilizados para suprimir a proliferação indesejável de células B em contextos clínicos. Por exemplo, na malignidade de células B, as células B de vários estágios de diferenciação mostram proliferação não regulada. Com base nos resultados apresentados acima, pode inferir-se que inibidores selectivos de PI3K5 podem ser utilizados para controlar, limitar ou inibir o crescimento de tais células. EXEMPLO 4

Caracterização do papel da PI3K5 na Função de Linfócitos T A proliferação de células T em resposta à co-estimulação de CD3+CD28 é medida. As células T são purificadas a partir de sangue humano saudável por seleção negativa utilizando pérolas magnéticas revestidas com anticorpos de acordo com o protocolo do fabricante (Dynal) e ressuspensas em meio RPMI. As células são tratadas com DMSO ou uma diluição em série de um composto presente em DMSO e plaqueadas a 1 x 105 células/cavidade numa placa de 96 cavidades pré-revestidas com IgG de cabra anti-rato. Anticorpos monoclonais de ratinho anti-CD3 e anti-CD28 que são adicionados a cada cavidade a 0,2 ng/mL e 0,2 yg/mL, respectivamente. A placa é incubada a 37°C durante 24 h e [3H]-timidina (1 yCi/cavidade) é adicionado. Após outra incubação de 18 horas, as células são colhidas com um colector de células automático, lavadas, e a radioactividade incorporada foi quantificada.

Embora os presentes compostos inibidores PI3K5 tenham inibido a proliferação induzida por anti-CD28 e anti-CD3 de células T, um efeito que não é tão forte como um efeito sobre as células B ou em algumas das funções dos neutrófilos. Consequentemente, os presentes compostos não são tóxicos para as células em geral. EXEMPLO 5

Caracterização do papel da PI3KÕ na Função de Osteoclastos

Para analisar o efeito dos compostos inibidores de PI3K5 presentes em osteoclastos, as células de medula óssea de ratinho são isoladas e diferenciadas dos osteoclastos pelo tratamento das células com factores estimulantes de colónias de macrófagos-1 (mCSF-1) e ligando osteoprotegerina (OPGL) em meio contendo soro (aMEM com FBS inactivado por calor a 10%; Sigma), durante 3 dias. No quarto dia, quando os osteoclastos se desenvolveram, o meio é removido e as células são colhidas. Os osteoclastos são plaqueados em fatias de dentina em 105 células/cavidade em meio de crescimento, isto é, aMEM contendo 1% de soro e 2% de BSA com 55 yg/mL de OPGL e 10 ng/mL mCSF-1. Após 3 h, o meio é mudado para 1% de soro e 1% de BSA, com ou sem osteopontina (25 yg/mL) e os inibidores de PI3K (100 nM). 0 meio é trocado a cada 24 horas, com osteopontina fresca e os inibidores. Em 72 h, o meio é removido, e as superficies de dentina lavadas com água para remover os detritos celulares e coradas com hematoxilina ácido. O excesso de corante é lavado e as profundezas da cavidade são quantificadas por microscopia confocal.

Os presentes inibidores da PI3-quinase tiveram um efeito inibidor sobre a função dos osteoclastos. Ambos os inibidores não-especificos LY294002 e wortmanina inibiram a actividade dos osteoclastos. No entanto, os presentes compostos inibidores PI3K5 tiveram um efeito maior, e em alguns casos, inibiram quase completamente a actividade dos osteoclastos. EXEMPLO 6

Caracterização do papel da PI3K5 na Função de

Basófilos

Avaliação do efeito de um composto da invenção na função de basófilos é testada usando um ensaio convencional de libertação de histamina, geralmente em conformidade com o método descrito em Miura e outros, J. Immunol., 162:4198-206 (1999). Resumidamente, basófilos enriquecidos são pré-incubados com compostos de teste a várias concentrações de 0,1 nM a 1.000 nM durante 10 min a 37°C. Em seguida, IgE de cabra anti-humano policlonal (0,1 yg mL) ou fMLP é adicionado, e deixado incubar durante mais 30 min. A histamina libertada para o sobrenadante é medida utilizando uma técnica fluorométrica automatizada.

Uma diminuição dependente da dose na libertação de histamina foi observada para os presentes compostos, quando os basófilos são estimulados com anti-IgE. Esta supressão da libertação de histamina era essencialmente de 100% a 1.000 nM. O presente composto não provocou qualquer efeito quando os basófilos foram estimulados com fMLP. Para comparação, o inibidor não selectivo de PI3K LY294002 é testado em 0,1 nM e 10.000 nM, mostrando perto de 100% de inibição da libertação de histamina na concentração mais elevada.

Isto indica que os presentes inibidores da actividade PI3K5 podem ser utilizado para suprimir a libertação de histamina, que é um dos mediadores de alergia. Uma vez que a actividade de vários PI 3-quinases é necessária para tráfego, secreção e exocitose de proteínas em muitos tipos de células, o acima exposto sugere que a libertação de histamina por outras células, tais como mastócitos, também pode ser interrompida por inibidores delta-selectivos de PI 3-quinase.

EXEMPLOS DE SÍNTESE QUÍMICA

Exemplos específicos não limitativos são fornecidos abaixo. É entendido na técnica que os grupos de protecção podem ser utilizados quando necessário de acordo com princípios gerais da química de síntese. Estes grupos protectores são removidos nos passos finais da síntese, sob condições ácidas, básicas ou hidrogenolíticas prontamente aparentes para os peritos na arte. Ao empregar a manipulação e protecção apropriadas de quaisquer funcionalidades químicas, a síntese dos compostos de fórmulas estruturais (I) ou (II) não especificamente estabelecida aqui pode ser realizada por métodos análogos aos esquemas e procedimentos sintéticos demonstrados descritos abaixo.

Salvo indicação em contrário, todos os materiais de partida foram obtidos de fornecedores comerciais e utilizados sem purificação adicional. Todas as reações e fracções cromatográficas foram analisadas por cromatografia em camada fina (TLC) sobre placas de gel de silica de 250 mm, visualizadas com luz ultravioleta (UV) ou mancha de iodo (I2) . Os produtos intermediários foram tipicamente purificados por cromatografia flash ou cromatografia líquida de alta eficiência de fase inversa.

As seguintes abreviaturas são usadas nos exemplos sintéticos: aq (aquoso), h (hora), min (minutos), sat'd (saturado), eq (equivalentes), THF (tetra-hidrofurano), RT (temperatura ambiente), Et3N (trietilamina), Zn (pó de zinco metálico), n-BuOH (álcool n-butílico), n-BuLi (n-butil-lítio), t-BuOH (álcool butílico terciário), NaCl (cloreto de sódio), MgS04 (sulfato de magnésio), BOC (C(=0)0tBu), CDCI3 (clorofórmio deuterado), MtBe (éter metálico terc-butilo), H2O (água), CHCI3 (clorofórmio), HC1 (ácido clorídrico), MeOH (metanol), NaOH (hidróxido de sódio), NaOMe (metóxido de sódio), TFA (ácido trifluoroacético), K2CO3 (carbonato de potássio), SOCI2 (cloreto de tionilo), CH2CI2 (cloreto de metileno), EtOAc (acetato de etilo), DMF (dimetilformamida), EtOH (etanol), DMSO (sulfóxido de dimetilo), NaHC03 (bicarbonato de sódio) , TLC (cromatografia de camada fina), HPLC (cromatografia líquida de alta eficiência),

espectrometria de ionização de massa (ESI-MS) ou MS(ES), HOBT (hidroxibenzotriazole), EDC

(etildietilaminopropilcarbodiimida), DIEA (diisopropiletilamina), HOAc (ácido acético) , ACCUFLUOR® NFSi (N-fluorobis(fenilsulfonil)amina) e outros, as abreviaturas padrão similares são aqui utilizadas. EXEMPLO 7 (Referência)

PREPARAÇÃO DO INTERMEDIÁRIO COMPOSTO 4-cloro-5-fluoro-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina (1)

Uma solução de 9-cloro-5-bromo-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina (800 mg, 3,45 mmol) em THF (50 mL) a -78°C foi tratada com n-BuLi (1,6 M em hexano, 2,2 eq, 7,6 mmol, 4,7 mL) , gota a gota, e agitada durante 30 minutos à mesma temperatura. A mistura foi tratada com uma solução de ACCUFLUOR® NFSI (2,0 eq, 7 mmol, 2,2 g) em THF (10 mL) . A mistura de reação foi deixada aquecer até à temperatura ambiente, foi agitada durante 10 h e, em seguida, concentrada até à secura. O resíduo foi dissolvido em EtOAc (100 mL) , lavado com água (3 x 15 mL) e salmoura (15 mL) , seco com Na2S04, e purificado por HPLC de fase inversa (10 x 250 mm coluna Luna C18, 4,7 mL/min, 10-90% de acetonitrilo em água durante 20 min) para proporcionar o composto intermediário 1. ESI-MS m/z = 172,1 (MH+) . A reação descrita acima e do composto intermédio 1 são mostrados abaixo.

2-amino-6-morfolin-4-ilmetil-N-fenil-benzamida(2) 0 composto intermediário 2 foi preparado de acordo com os procedimentos estabelecidos nos passos A-F a seguir. Éster metilico do ácido 6-nitro-benzóico (3)

Passo A: Uma solução de ácido 6-nitro-benzóico em benzeno foi tratada com cloreto de tionilo (2,5 eq) e agitou-se ao refluxo durante 8 h. Após a evaporação, o resíduo foi dissolvido em clorofórmio e depois tratado com metanol. Depois de se agitar ao refluxo durante 3 h, a mistura foi evaporada para fornecer o composto 3. Éster metilico do ácido 2-bromometil-6-nitro-benzóico (4)

Passo B: Uma mistura do composto 3 (2 g), N-bromossuccinimida (1,93 g), e peróxido de benzoilo (0,124 g) em tetracloreto de carbono (30 mL) foi agitada a refluxo durante a noite. Após arrefecimento, os sólidos foram removidos por filtração e o filtrado foi concentrado para produzir o composto 4 como um óleo amarelo em bruto. Éster metilo do ácido 2-morfolin-4-ilmetil-6-nitro-benzóico (5)

Passo C: Uma mistura do composto 4 (3,5 g, produto em bruto), morfolina (0,99 g), carbonato de potássio (2,89 g), e iodeto de potássio (1,66 g) em DMF (22 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. A mistura de reação foi vertida em água (30 mL) e extraída com acetato de etilo (3 x 30 mL) . Os extractos orgânicos combinados foram lavados com salmoura (30 mL) , secos sobre sulfato de sódio, e concentrados até se obter um resíduo. O material em bruto foi purificado por cromatografia flash (gel de sílica, 30-50% acetato de etilo/hexanos) para produzir o composto 5 como um sólido amarelo. Ácido 2-morfolin-4-ilmetil-6-nitro-benzóico (6)

Passo D: Uma solução do composto 5 (0,85 g) e NaOH (0,304 g) numa mistura de água (9 mL), metanol (5 mL), e THF (45 mL) foi agitada a refluxo durante 24 h e concentrada até à secura. O resíduo foi dissolvido em água, e a solução foi arrefecida a 0°C e ajustada a pH 7 com hidrogénio sulfato de potássio a 10%. A mistura foi concentrada até à secura, o resíduo foi tratado com metanol, e filtrado para remover os sólidos. O filtrado foi concentrado para se obter o composto 6 como um sólido amarelo. 2-morfolin-4-ilmetil-6-nitro-N-fenil-benzamida (7)

Passo E: Uma solução do composto 6 (0,62 g, 2,3 mmol) em THF (50 mL) foi tratada com cloreto de tionilo (0,94 mL) , agitada à temperatura ambiente durante 4 h, e evaporada até à secura. O resíduo foi dissolvido em THF (50 mL) e tratado com anilina (0,58 mL, 6,4 mmol) e diisopropiletilamina (1,12 mL, 6,4 mmol). A mistura de reação foi agitada durante 4 h, concentrada, dissolvida em diclorometano (50 mL) , lavada com bicarbonato de sódio aquoso saturado (25 mL) e salmoura (25 mL) , seca com sulfato de sódio, e concentrada. O resíduo em bruto do composto 7 foi em seguida purificado por cromatografia flash (5% de metanol em diclorometano). 2-amino-6-morfolin-4-ilmetil-N-fenil-benzamida(2)

Passo F: Uma solução do composto 7 (0,3 g) e 10% Pd/C (30 mg) em metanol (35 mL) foi agitada sob hidrogénio (1 atm) durante 1,5 h. A mistura foi filtrada através de um leito de CELITE® e o filtrado foi concentrado para proporcionar um produto sólido amarelo, o composto intermediário 2. ESI-MS m/z = 312 (MH+) .

Os passos A-F e os compostos 2-7 são mostrados no esquema de reação abaixo.

3- morfolin-4-ilmetil-fenil*ini na (8) 0 composto intermediário 8 (mostrado abaixo) foi preparado de acordo com os procedimentos estabelecidos nos passos A e B. 4- (3-nitrobenzil)morfolina (9)

Passo A: Um balão de 250 mL, de um gargalo e fundo redondo eguipado com um agitador magnético e condensador de refluxo foi carregado com l-clorometil-3-nitrobenzeno (10,0 g, 58,3 mmol), morfolina (15,0 g, 175 mmol) e tolueno (75 mL), e a solução foi aquecida a refluxo durante 2,5 h. A mistura de reação foi deixada arrefecer até à temperatura ambiente e depois lavada com hidróxido de sódio aquoso IN (2 x 50 mL) . A camada aquosa foi extraída com acetato de etilo (3 x 50 mL), e os extractos combinados foram secos sobre sulfato de sódio e concentrados sob pressão reduzida para se obter o composto 9 como um sólido esbranquiçado.

3-morfolin-4-ilmetil-fenilamina (8)

Passo B: Um balão de 250 ml, com três gargalos de fundo redondo equipado com um agitador mecânico e de condensador de refluxo foi carregado com o composto 9 (12,7 g, 57,4 mmol), ferro em pó (40,0 g, 71,7 mmol), ácido clorídrico 2N (20 ml) e etanol (75 mL) . A suspensão resultante foi aquecida a refluxo durante 2 h. Após este tempo, a mistura foi deixada arrefecer e filtrada através de uma almofada de CELITE® 521. 0 filtrado foi concentrado sob pressão reduzida, o resíduo diluído com água (100 mL) e alcalinizou-se com carbonato de potássio sólido até pH 10. A mistura foi extraída com acetato de etilo (3 x 75 mL) e os extractos orgânicos combinados foram secos sobre sulfato de sódio anidro e concentrados sob pressão reduzida para produzir o composto 8 como um óleo viscoso escuro. ΧΗ NMR (CDC13) δ (ppm) 7,09 (t, 1H, J = 8,1 Hz), 6,70 (m, 2H) , 6,58 (m, 1H) , 3,70 (m, 4H) , 3,40 (bs, 2H) , 2,44 (m, 4H). O composto intermediário 8 é mostrado abaixo.

W} 6-bromo-9-(2-trimetilsilanil-etoximetil)-9H-purina (10)

Um balão de 500 ml, de um gargalo e fundo redondo equipado com um agitador magnético foi carregado com 6-bromopurina (10,4 g, 52,0 mmol), carbonato de potássio (21,5 g, 156 mmol), crivos moleculares de 4Ã (22,6 g) , dimetilformamida (200 mL) e cloreto de 2-(trimetilsilil)etoximetilo (13,2 g, 78,0 mmol). A mistura de reação foi agitada durante 18 h à temperatura ambiente, em seguida filtrada com o auxilio de CELITE®521. A concentração do filtrado sob alto vácuo, seguido por cromatografia em coluna forneceu um rendimento de 57% do composto intermédio 10 como um sólido quase branco, m.p. 49-52°C; 1H NMR (DMSOdô) δ (ppm) 8,95 (s, 1H) , 8,86 (s, 1H) , 3,69 (t, 2H, J = 8,0 Hz), 0,93 (t, 2H, J = 8,2 Hz), 0,08 (s, 9H) ; m/z = 330 (M+H) . O composto intermédio 10 é mostrado abaixo.

Ϊ. : 0 ) 2-Amino-6-bromo-9-(2-trimetilsililetoxi)metil-9H-purina (11) O composto intermédio 11 foi preparado utilizando o método descrito acima com respeito ao composto intermédio 10, mas foi usada 2-amino-6-bromopurina no lugar de 6-bromopurina. O composto intermédio 11 é mostrado abaixo.

MM 2-di-tert-butiloxicarbonilamino-6-bromo-9-(2-trimetilsililetoxi)metil-9H-urina (12)

Um balão de 250 ml, de um gargalo e fundo redondo equipado com um agitador magnético foi purgado com azoto e carregado com o composto intermédio 11 (11,7 g, 34,0 mmol), dicarbonato de di-terc-butilo (22,2 g, 102 mmol), DMAP (581 mg, 4,76 mmol) e tetra-hidrofurano anidro (150 mL). A mistura de reação foi agitada durante 18 horas à temperatura ambiente e depois evaporada até à secura. A cromatografia em coluna do resíduo produziu o composto resultante intermédio 12 como um sólido branco, m.p 93-95°C; *H NMR (DMSO-de) δ (ppm) 8,99 (s, 1H) , 5,71 (s, 2H), 3,66 (t, 2H, J = 8,0 Hz), 1,47 (s, 18H) , 0,92 (t, 2H, J= 8,2 Hz); m/z = 546 (M+H) . O composto intermédio 12 é mostrado abaixo.

{12} 6-cloro-9-(2-trimetilsilanil-etoximetil)-9H-purina (13) 0 composto intermédio 13 foi preparado utilizando o método descrito acima com respeito ao composto intermédio 10, mas foi usada 6-cloropurina no lugar de 6-bromopurina. 0 composto intermédio 13 é mostrado abaixo.

iltl

PROCEDIMENTOS GERAIS

Os compostos da presente invenção podem ser preparados pelos seguintes métodos. Os compostos adicionais são preparados utilizando um dos seguintes métodos e selecionando materiais de partida e reagentes apropriados. Os procedimentos gerais e procedimentos específicos para a síntese dos compostos da presente invenção também estão indicados na Patentes dos E.U.A. n.°s 6.518.277. EXEMPLO 8 (Referência)

PREPARAÇÃO DE COMPOSTO

Os compostos de acordo com a fórmula geral I (mostradas acima) foram preparados de acordo com os procedimentos sintéticos exemplificativos descritos abaixo. 5-metil-3-fenil-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-propil]-3H-quinazolin-4-ona (14) 0 composto (14) foi preparado de acordo com os procedimentos estabelecidos nos passos A-D a seguir. 2-amino-6-metil-N-fenil-benzamida (15)

Passo A: 0 cloreto de tionilo (14,5 mL, 198 mmol) foi adicionado a uma solução de ácido 2-amino-6-metilbenzóico (10,0 g, 66,1 mmol) em benzeno (250 mL) . A suspensão resultante foi aquecida a refluxo e agitada durante a noite. Após o arrefecimento, a reação foi concentrada in vácuo, e o resíduo resultante foi dissolvido em clorofórmio (300 mL). Foi adicionada anilina (15 mL, 165 mmol), e a mistura aquecida a refluxo. Após três horas, a reação foi deixada a arrefecer e a suspensão resultante foi filtrada. O filtrado foi sujeito a cromatografia flash, e o produto em bruto recristalizado a partir de isopropanol para proporcionar o composto 15 como um sólido cristalino amarelo. MS (ES): m/z 227 (M+H), 134. 1H NMR (300 MHz, DMSO-de) δ 10,26 (s, 1H) , 7,75 (d, 2H, J = 7,9 Hz), 7,32 (t, 2H, J = 7,8 Hz), 7,07 (t, 1H, J = 7,3 Hz), 7,00 (t, 1H, J = 7,8 Hz), 6,58 (d, 1H, J = 8,1 Hz), 6,46 (d, 1H, J = 7,4 Hz), 4,98 (br, s, 2H) , 2,21 (s, 3H) . A reação descrita acima e o composto 15 são mostrados abaixo.

Éster benzilo do ácido [1-(5-metil-4-oxo-3-fenil- 3,4-dihidroquinazolin-2-il)propil] -carbâimco (16)

Passo B: O composto 15 (1,20 g, 5,30 mmol) foi combinado com éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-il do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico (2,13 Çf/ 6,36 mmol), dimetilaminopiridina (915 mg, 7,49 mmol), e diisopropiletilamina (1,10 mL, 6,36 mmol) em tolueno (15 mL). A mistura foi aquecida a 110°C e agitada a essa temperatura durante 22 horas. Após o arrefecimento, a reação foi purificada por cromatografia flash para fornecer a quinazolinona (16) como um sólido amarelo pálido. MS (ES):

A reação descrita acima e do composto intermédio 16 são mostrados abaixo.

2-(1-amino-propil)-5-metil-3-fenil-3H-quinazolin-4- ona (17)

A reação descrita acima e o composto intermédio 17 são mostrados abaixo.

Passo C: Uma quantidade catalítica de 10% Pd/C foi adicionada a uma solução do composto 16 (691 mg, 1,62 mmol) em etanol (8 mL) . A mistura resultante foi colocada sob uma atmosfera de hidrogénio (pressão de balão) e deixada a agitar à temperatura ambiente durante a noite. A reação foi filtrada, e o filtrado foi concentrado in vácuo. 0 resíduo em bruto resultante foi purificado por cromatografia flash, para se obter a amina livre, composto 17, como um óleo amarelo pálido. (ES): m/z 294 (M+H), 237.

Passo C (procedimento alternativo) : 0 ácido trifluoroacético foi adicionado a uma solução do composto 16 de amina protegida com Boc em diclorometano. A solução resultante foi deixada a agitar à temperatura ambiente até LCMS ou TLC indicar o consumo completo do material de partida. A reação foi concentrada in vácuo, e o resíduo foi purificado por cromatografia flash para se obter a amina livre 17. 5-metil-3-fenil-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-propil]-3H-quinazolin-4-ona (14)

Passo D: 0 composto 17 (100 mg, 0,341 mmol) foi combinado com 6-bromopurina (75 mg, 0,375 mmol) e diisopropiletilamina (65 uL, 0,375 mmol) em n-butanol (1,0 mL). A reação foi selada, aquecida a 120°C e agitada durante 18 horas. A solução foi deixada arrefecer, em seguida, concentrada in vácuo. 0 resíduo resultante foi purificado por HPLC preparativa para proporcionar o composto 14 como um sólido cor de azeitona. (ES) : m/z 412 (M+H) , 206. XH NMR (300 MHz, DMSO-ds) δ 8, 96 - 9, 06 (br, m, 1H) , 8,53 (br, s, 1H) , 8,51 (s, 1H) , 7,68 (t, 1H, J = 7,8 Hz), 7,45 - 7, 62 (m, 6H) , 7,31 (d, 1H, J = 7,3 Hz), 4,76 - 4, 86 (m, 1H) , 2,73 (s, 3H) , 1,98 -2,11 (m, 1H) , 1,76 - 1, 94 (m, 1H) , 0,79 (t, 3H, J = 7,2 Hz). A reação descrita acima e o composto intermédio 14 são mostrados abaixo.

2- [1-(2-fluoro-9H-purin-6-ilamino)-etil]-5-metil-3-fenil-3H-quinazolin-4-ona (18) 0 composto 18 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usada 2-fluoro-6-cloropurina no lugar de 6-bromopurina no passo D. ESI-MS m/z 416,1 (MH+). 0 composto 18 é mostrado abaixo.

tm 3- (2,6-difluoro-fenil)-5-metil-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-quinazolin-4-ona (19) 0 composto 19 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usada 2,6-difluorolanilina no lugar de anilina no passo A, éster do ácido 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C. ESI-MS m/z 434,1 (MH+). 0 composto 19 é mostrado abaixo.

2-[1-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-(2,6-difluorofenil)-5-metil-3H-quinazolin-4-ona (20) 0 composto 20 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usada 2, 6-difluorolanilina no lugar de anilina no passo A, éster do ácido 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C e 2-amino-6-bromopurina foi utilizada no lugar de 6-bromopurina no passo D. ESI-MS m/z 434,1 (MH+). O composto 20 é mostrado abaixo.

(2 Ο ϊ 3-(2,6-difluoro-fenil)-2-[1-(2-fluoro-9H-purin-6-ilamino) -etil] -5-metil-3H-cfuinazolin-4-ona (21) 0 composto 21 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas 2, 6-difluoroanilina foi usada no lugar de anilina no passo A, éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilaminopropiónico foi usado no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2- benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C, e 2-fluoro-6-cloropurina foi usada no lugar de 6-bromopurina no passo D. !HNMR (MeOH-d4) : δ 8,22-8,17 (m, 1H) ; 7,76-7, 62 (m, 2H); 7,47-7,45 (m, 1 H); 7,38-7,33 (m, 1,2H); 7,30-7,17 (m, 1H) ; 6, 88-6, 75 (m, 1H) ; 5, 30-5, 27 (m, 0,5H); 5, 09-5, 07 (m, 0,5H) ; 2,778 (s, 3H) ; 1, 62-1,50 (m, 3H) . O composto 21 é mostrado abaixo.

(Η)

0 composto 22 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usada 2, 6-difluorolanilina no lugar de anilina no passo A, éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc- butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C e 4-cloro-7H-pirrolo[2,3—d]pirimidina foi utilizada no lugar de 6-bromopurina no passo D. . ESI-MS m/z 433 (MH+) . 0 composto 22 é mostrado abaixo.

,· ;*n y, s <£ íí. j· 2-[1-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-propil]-5-metil-3-fenil-3H-quinazolin-4-ona (23) 0 composto 23 foi preparado utilizando ο procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usada 2-amino-6-bromopurina no lugar de 6-bromopurina no passo D. MS (ES) : m/z 427 (M+H) , 214. 0 composto 23 é mostrado abaixo.

Í233 5-metil-3-fenil-2-[1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-ilamino)-propil]-3H-quinazolin-4-ona (24) 0 composto 24 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usada 7-deaza-6-cloropurina no lugar de 6-bromopurina no passo D. MS (ES) : m/z 411 (M+H), 206. O composto 24 é mostrado abaixo.

"|$4>

0 composto 25 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usada 2-fluoro-6-cloropurina no lugar de 6-bromopurina no passo D. MS (ES) : m/z 430 (M+H) , 446. O composto 25 é mostrado abaixo.

(25)

O composto 26 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxo- pirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C. MS (ES): m/z 398 (M+H). 0 composto 26 é mostrado abaixo.

'm) 2-[1-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-5-metil-3-fenil-3H-quinazolin-4-ona (27) 0 composto 27 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C e 2-amino-6-bromopurina foi usada no lugar de 6-bromopurina no passo D. ESI-MS m/z 413.1 (MH+). 0 composto 27 é mostrado abaixo.

ί 2 ^ ) 2-[2-_benziloxi-1-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-5- metil-3-fenil-3H-quinazolin-4-ona (28) 0 composto 28 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 3-benziloxi-2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2- benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C. MS (ES) : m/z 504 (M + H) , 396, 261. O composto 28 é mostrado abaixo.

2- [i- í 9-amino-9H-purin-6-ilainino) -2-benziloxi-etil]-5-metil-3-fenil-3H-quinazolin-4-ona (29) O composto 29 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 3-benziloxi-2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2- benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C e 2-amino-6-bromopurina foi usada no lugar de 6-bromopurina no passo D. MS (ES) : m/z 519 (M+H) , 411, 261. 0 composto 29 é mostrado abaixo.

(fSS 2-[2-benziloxi-l-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-ilamino) -etil] -5-metil-3-fenil-3H-cruinazolin-4-ona (30) O composto 30 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 3-benziloxi-2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2- benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C e 4-cloro-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina foi usada no lugar de 6-bromopurina no passo D. MS (ES): m/z 503 (M+H), 395. O composto 30 é mostrado abaixo.

(3i); 2-[2-benziloxi-l-(2-fluoro-9H-purin-6-ilamino)-etil]-5-metil-3-fenil-3H-guinazolin-4-ona (31) 0 composto 31 foi preparado utilizando ο procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 3-benziloxi-2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2- benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C e 2-fluoro-6-cloropurina foi usada no lugar de 5-bromopurina no passo D. MS (ES) : m/z 522 (M+H) , 414, 261. 0 composto 31 é mostrado abaixo.

O;? 3-(4-fluoro-fenil)-5-metil-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-quinazolin-4-ona (32) 0 composto 32 foi preparado utilizando ο procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas com as seguintes alterações: 4-fluoroanilina foi usada no lugar de anilina no passo A, éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-tert-butoxicarbonilamino-propiónico foi usado no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutírico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi usado no passo C. ESI-MS m/z 416,1 (MH+). 0 composto 32 é mostrado abaixo.

í 39 s Ϊ. f 2-[1-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-(4-fluorofenil)-5-metil-3H-quinazolin-4-ona (33) 0 composto 33 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usada 4-fluorolanilina no lugar de anilina no passo A, éster do ácido 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C e 2-amino-6-bromopurina foi utilizada no lugar de 6-bromopurina no passo D. ESI-MS m/z 431,1 (MH+) . 0 composto 33 é mostrado abaixo.

(3 3 í 3-(4-fluoro-fenil)-2-[1-(2-fluoro-9H-purin-6-ilamino)-etil]-5-metil-3H-quinazolin-4-ona (34) 0 composto 34 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usada 4-fluoroanilina no lugar de anilina no passo A, éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C e 2-fluoro-6-cloropurina foi utilizada no lugar de 6-bromopurina no passo D. ESI-MS m/z 434,1 (MH+) . 0 composto 34 é mostrado abaixo.

(34} 3-(4-difluoro-fenil)-5-metil-2-[1-(7H-pirrolo[2,3-d] pirimidin-4-ilamino) -etil] -3H-cfuinazolin-4-ona (35) 0 composto 35 foi preparado utilizando ο procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usada 4-fluoroanilina no lugar de anilina no passo A, éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C e 4-cloro-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina foi utilizada no lugar de 6-bromopurina no passo D. ESI-MS m/z 415,1 (MH+) . 0 composto 35 é mostrado abaixo.

<33} 5-metil-3-fenil-2-[1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-ilamino)-etil]-3H-quinazolin-4-ona (36) 0 composto 36 foi preparado utilizando ο procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C e 4-cloro-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina foi usada no lugar de 6-bromopurina no passo D. ESI-MS m/z 397 (MH+). 0 composto 36 é mostrado abaixo.

Iclll 3-(3-fluoro-fenil)-5-metil-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-quinazolin-4-ona (37) 0 composto 37 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usada 3-fluoroanilina no lugar de anilina no passo A, éster do ácido 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C. 1HNMR (dmso-d6): 8,30-8,28 (m, 2H); 7,70-7,49 (m, 3H); 7,44-7,30 (m, 4H); 4,91-4,88 (m, 1H); 2,72-2,68 (m, 3h) ; 1,50-1,48 (m, 3H) . O composto 37 é mostrado abaixo.

(371 2-[1-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-(3-fluorofenil)-5-metil-3H-guinazolin-4-ona (38) O composto 38 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usada 3-fluoroanilina no lugar de anilina no passo A, éster do ácido 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C, e 2-amino-6-bromopurina foi usada no lugar de 6-bromopurina no passo D. ΧΗ NMR (dmso-dg) : 8,16-8,12 (m, 1H) ; 7,74-7, 69 (m, 1H) ; 7, 62-7,53 (m, 2H) ; 7,46-7,12 (m,

6H) ; 4,96 (bs, 1H); 2,74-2, 67 (m, 3H) ; 1,47-1,45 (m, 3H) . O composto 38 é mostrado abaixo.

Í38Í 3-(3-fluoro-fenil)-5-metil-2-[1-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-ilamino)-etil]-3H-quinazolin-4-ona (39) 0 composto 39 foi preparado utilizando ο procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usada 3-fluoroanilina no lugar de anilina no passo A, éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C e 4-cloro-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina foi utilizada no lugar de 6-bromopurina no passo D. ESI-MS m/z 415,1 (MH+) 0 composto 39 é mostrado abaixo.

P3> 5-metil-3-fenil-2-[1-(9H-purin-6-il)-pirrolidin-2-il]-3H-quinazolin-4-ona (40) O composto 40 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado éster 2-(2,5-dioxo-pirrolidin-l-il) éster 1-terc-butilo do ácido pirrolidina-1,2-dicarboxílico no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2- benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C. MS (ES): m/z 424 (M+H), 212. O composto 40 é mostrado abaixo.

(40* 2-[2-hidroxi-l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-5-metil-3-fenil-3H-quinazolin-4-ona (41)

Uma suspensão de composto 28 (60 mg, 0,097 mmol),

Pd (OH) 2 (cat.), e Na2<003 aquoso (0,5 mL) em etanol (2,5 mL) foi hidrogenada a 45 psi durante 14 dias. A mistura foi filtrada para remover os solventes, e o filtrado resultante foi purificado por HPLC para proporcionar o produto 41 como um sólido branco. MS (ES): m/z 414 (M+H), 396, 261. O composto 41 é mostrado abaixo.

{41)

0 composto 42 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido terc-butoxicarbonilamino-fenil-acético no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção tfa) foi n?c\ · m/z 460 (M+H) , 325. O composto utilizado no passo C. MS (bz)· 42 é mostrado abaixo.

(42) 2-[(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-fenil-metil]-5-metil-3-fenil-3H-quinazolin-4-ona (43) 0 composto 43 foi preparado utilizando ο procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido terc-butoxicarbonilamino-fenil-acético no lugar de éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C e 2-amino-6-bromopurina foi usada no lugar de 6-bromopurina no passo D. MS (ES): m/z 475 (M+H). 0 composto 43 é mostrado abaixo.

2-[(2-fluoro-9H-purin-6-ilamino)-fenil-metil]-5-metil-3-fenil-3H-cruinazolin-4-ona (44) 0 composto 44 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido terc-butoxicarbonilamino-fenil-acético no lugar de éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C e 2-fluoro-6-cloropurina foi usada no lugar de 6-bromopurina no passo D. MS (ES) : m/z 478 (M+H) , 325. 0 composto 44 é mostrado abaixo.

N4) 5-metil-3-fenil~2-Γ fenil-(7H-pirolo[2,3-d]pirimidin-4-ilamino)-metil]-3H-quinazolin-4-ona (45) 0 composto 45 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido terc-butoxicarbonilamino-fenil-acético no lugar de éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C e 4-cloro-7H-pirrolo[2,3—d]pirimidina foi usada no lugar de 6-bromopurina no passo D. MS (ES) : m/z 459 (M+H), 230. O composto 45 é mostrado abaixo.

{451 5-fluoro-3-fenil-2-fc(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-quinazolin-4-ona (46) 0 composto 4 6 foi preparado utilizando ο procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado ácido 2-amino-6-fluoro-benzóico no lugar de ácido 2-amino-6-metil-benzóico acid no passo A, éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C. ESI-MS m/z 402,3 (MH+) . O composto 46 é mostrado abaixo.

(4 2-[1-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-5-fluoro-3-fenil-3H-quinazolin-4-ona (47). 0 composto 47 foi preparado utilizando ο procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado ácido 2-amino-6-fluoro-benzóico no lugar de ácido 2-amino-6-metil-benzóico no passo A, éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C e 2-amino-6 bromopurina foi usada no lugar de 6-bromopurina no passo D. ESI-MS m/z 417,2 (MH+). 0 composto 47 é mostrado abaixo.

1 2-[1-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-5-cloro-3-fenil-3H-cfuinazolin-4-ona (48) 0 composto 48 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado ácido 2-amino-6-clorobenzóico no lugar de ácido 2-amino-6-metilbenzóico no passo A, éster 2,5-dioxopirrolidin- 1-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C e 2-amino-6 bromopurina foi usada no lugar de 6-bromopurina no passo D. MS (ES): m/z 433 (M+H), 177. 0 composto 48 é mostrado abaixo.

í*8> Éster benzilo do ácido [5-(5-metil-4-oxo-3-fenil- 3,4-dihidro-guinazolin-2-il)-5-(9H-purin-6-ilamino)-pentil]-carbâmico (49) 0 composto 49 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 6-benziloxicarbonilamino-2-terc-butoxicarbonilamino hexanóico no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C. ESI-MS m/z 589 (MH+) . 0 composto 49 é mostrado abaixo.

0 composto 50 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 6-benziloxicarbonilamino-2-terc-butoxicarbonilamino hexanóico no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C e 2-amino-6-bromopurina foi usada no lugar de 6-bromopurina no passo D. ESI-MS m/z 604 (MH+) . O composto 50 é mostrado abaixo.

|5Dí Éster benzilo do ácido [4-(5-metil-4-oxo-3-fenil- 3,4-dihidro-quinazolin-2-il)-4-(9H-purin-6-ilamino)-butil]-carbâmico (51) 0 composto 51 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 6-benziloxicarbonilamino-2-terc-butoxicarbonilamino pentanóico no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C. ESI-MS m/z 575 (MH+) . 0 composto 51 é mostrado abaixo.

ÍSU Éster benzilo do ácido [4-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-4-(5-metil-4-oxo-3-fenil-3,4-dihidro-quinazolin-2-il)-butil]carbâmico (52) 0 composto 52 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 6-benziloxicarbonilamino-2-terc-butoxicarbonilamino pentanóico no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2- benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C e 2-amino-6-bromopurina foi usada no lugar de 6-bromopurina no passo D. ESI-MS m/z 590 (MH+) . O composto 52 é mostrado abaixo.

{52} 3-fenil-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-inazolin-4-ona (53) O composto 53 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado ácido antranilico no lugar de ácido 2-amino-6-metil-benzóico no passo A, éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2- benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C. MS (ES): m/z 384,1 (M+H). O composto 53 é mostrado abaixo.

< 'Λ \ 2-[5-amino-l-(9H-purin-6-ilamino)-pentil]-5-metil-3-fenil-3H-guinazolin-4-ona) (54)

Uma mistura de composto 49 (28,5 mg) e paládio sobre carbono (10 mg, 10% de Pd) em etanol (2 mL) foi agitada com hidrogénio (40 psi) durante 48 h. A mistura foi filtrada através de CELITE® e o filtrado foi concentrado para dar o produto 54. ESI-MS m/z 455 (MH+) . O composto 54 é mostrado abaixo.

(54 i 2-[5-amino-l-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-pentil]-5-metil-3-fenil-3H-guinazolin-4-ona (55) O composto 55 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usad o composto 50 no lugar do composto 49. ESI-MS m/z 470 (MH+) . 0 composto 55 é mostrado abaixo.

2-[1-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-(2,6-dimetil-fenil)-5-metil-3H-quinazolin-4-ona (56) O composto 56 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usada 2,6-dimetilanilina no lugar de anilina no passo A, éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc- butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C e 2-amino-6-bromopurina foi utilizada no lugar de 6-bromopurina no passo D. ESI-MS m/z 441 (MH+) . 0 composto 56 é mostrado abaixo.

(SS) 3-(2,6-dimetil-fenil)-5-metil-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-quinazolin-4-ona (57) O composto 57 foi preparado utilizando ο procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usada 2,6-dimetilanilina no lugar de anilina no passo A, éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc- butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C. ESI-MS m/z 4026 (MH+). O composto 57 é mostrado abaixo.

5-morfolin-4-ilmetil-3-fenil-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-quinazolin-4-ona (58) 0 composto 58 foi preparado utilizando os passos B, C e D do procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas o composto intermédio 2 foi usado em lugar do produto do passo A no passo B (o passo A tornou-se assim desnecessário), éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2- benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C. ESI-MS m/z 483 (MH+) . 0 composto 58 é mostrado abaixo.

(5S) 2-(1-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-5-morfolin-4ilmetil-3-fenil-3H-quinazolin-4-ona (59) 0 composto 59 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 58, mas foi usada 2-amino-6-bromopurina no lugar de 6-bromopurina no passo D. ESI-MS m/z 498 (MH+) . 0 composto 59 é mostrado abaixo.

CS3)

O composto 60 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 54, mas foi usad o composto 52 no lugar do composto 49. ESI-MS m/z 456 (MH+) . O composto 60 é mostrado abaixo.

1601 6-fluoro-3-fenil-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-quinazolin-4-ona (61) 0 composto 61 foi preparado utilizando ο procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado ácido 2-amino-5-fluoro-benzóico no lugar de ácido 2-amino-5-metil-benzóico acid no passo A, éster do ácido 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo. ESI-MS m/z 402 (MH+) . O composto 61 é mostrado abaixo.

^ &amp; Λ :ϊ 2-[1-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-6-fluoro-3-fenil-3H-quinazolin-4-ona (62) O composto 62 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 61, mas foi usada 2-amino-6-bromopurina no lugar de 6-bromopurina no passo D. ESI-MS m/z 417 (MH+) . O composto 62 é mostrado abaixo.

(€2)

0 composto 63 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-il do ácido 2-benziloxicarbonilamino-3-tert-butoxi-propiónico no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2- benziloxicarbonilaminobutírico no passo B. MS (ES) : m/z 470 (M+H), 396, 261. O composto 63 é mostrado abaixo.

í«lf

O composto 64 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi m-toluidina no lugar de anilina no passo A, éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C. 1H NMR (dmso-d6) : 8,41-8,36 (m, 2H) ; 7,71-7,66 (m, 1H) ; 7,53-7,51 (m, 5H) ; 4,97 (m, 1H) ; 2,72 (s, 3H) ; 2,39 (s, 1,5H) ; 2,09 (s, 1,5H); 1,50-1,48 (m, 3H) . O composto 64 é mostrado abaixo.

2-[1-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-(3-metil-fenil) -5-metil-3H-quinazolin-4-ona (65) 0 composto 65 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usada m-toluidina no lugar de anilina no passo A, éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C e 2-amino-6-bromopurina foi utilizada no lugar de 6-bromopurina no passo D. 1H NMR (dmso): 8,94-8,92 (m, 1H); 8,18 (s, 1H) ; 7,75-7, 68 (m, 1H) ; 7,58-7,51 (m, 1H) ; 5, 07-4, 96 (m, 1H) ; 2,79-2,73 (m, 3H); 2,40 (s, 1,5H); 1,91 (s, 1,5H); 1,48-1,43 (m, 3H). O composto 65 é mostrado abaixo.

CêS) 3-(3-cloro-fenil)-5-metil-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-quinazolin-4-ona (66) O composto 66 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usada 3-cloroanilina no lugar de anilina no passo A, éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C. ^ NMR (dmso-dô) : 8,40-8,31 (m, 2H) ; 7,73-7,66 (m, 1H); 7,55-7,32 (m, 6H); 5,04-4,86 (m, 1H); 2,72 (s, 3H); 1,52-1,50 (m, 3H). O composto 66 é mostrado abaixo.

t § ξ> j 2- [1- (2-amino-9H-purin-6-ilanii.no) -etil] -3- (3-clorofenil)-5-metil-3H-quinazolin-4-ona (67) 0 composto 67 foi preparado utilizando ο procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 66, mas foi usada 2-amino-6-bromopurina no lugar de 6-bromopurina no passo D. ESI-MS m/z 447,2 (MH+) . 0 composto 67 é mostrado abaixo.

2-[1-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-2-hidroxi-etil]-5-metil-3-fenil-3H-quinazolin-4-ona (68) 0 composto 68 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 6- benziloxicarbonilamino-3-terc-butoxi-propiónico no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2- benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e 2-amino-6-bromopurina foi utilizada no lugar de 6-bromopurina no passo D. A 2-[1-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-2-tert-butoxi-etil]-5-metil-3-fenil-3H-quinazolin-4-ona obtida foi então dissolvida em ácido trifluoroacético e deixada em agitação à temperatura ambiente durante 5 horas· A purificação por LC proporcionou o produto 68 como um sólido branco. MS (ES): m/z 429 (M+H), 215, 206, 151. O composto 68 é mostrado abaixo.

tm 2-[1-(2-ami no-9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-(3-fluoro-fenil)-3H-quinazolin-4-ona (69)

O composto 69 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usada 3-fluorolanilina no lugar de anilina no passo A, éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C e 2-amino-6-bromopurina foi utilizada no lugar de 6-bromopurina no passo D. ESI-MS m/z 417,1 (MH+) . O composto 69 é mostrado abaixo.

2-[1-(2-amino-9H-purin-6-ilamincd -etil]-3-(2,6-difluoro-fenil)-3H-quinazolin-4-ona (70) 0 composto 70 foi preparado utilizando ο procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usada 2,6-difluorolanilina no lugar de anilina no passo A, éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-

butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C e 2-amino-6-bromopurina foi utilizada no lugar de 6-bromopurina no passo D. ESI-MS m/z. 435, 1 (MH+) . O composto 70 é mostrado abaixo.

2-[1-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-propil]-5-fluoro-3-fenil-3H-quinazolin-4-ona (71) 0 composto 71 foi preparado utilizando ο procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado ácido 2-amino-5-fluorobenzóico no lugar de ácido 2-amino-5-metilbenzóico no passo A e 2-amino-6-bromopurina foi usada no lugar de 6-bromopurina no passo D. ESI-MS m/z 431 (MH+). 0 composto 71 é mostrado abaixo.

{71) 5-cloro-3-(3-fluoro-fenil)-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-quinazolin-9-ona (72) 0 composto 72 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado ácido 2-amino-6-clorobenzóico no lugar de ácido 2-amino-6-metilbenzóico e 3-fluorolanilina no lugar de anilina no passo A, éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C. ESl'MS m/z 436, 1 (MH+) . 0 composto 72 é mostrado abaixo.

r?2í 2- [1- (2-amino-9H-purin-6-ilainino) -etil] -5-cloro-3-(3-fluoro-fenil)-3H-quina2olin-4-ona (73) 0 composto 73 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado ácido 2-amino-6-clorobenzóico no lugar de ácido 2-amino-6-metil-benzóico e 3-fluoroanilina no lugar de anilinano passo A, éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2- benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C e 2-amino-6 bromopurina foi usada no lugar de 6-bromopurina no passo D. ESI-MS m/z 451,1 (MH+) . 0 composto 73 é mostrado abaixo.

{73} 3-fenil-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-5-trifluorometil-3H-qinazolin-4-ona (74) 0 composto 74 foi preparado utilizando ο procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usada 2-amino-N-fenil-6-trifluorometil-benzamida no lugar do composto 15 no passo A, éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2- benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado. MS (ES): m/z 452 (M+H). 0 composto 74 é mostrado abaixo.

(li) 2-amino-N-fenil-6-trifluorometil-benzamida foi preprada pela adição de anilina (1,0 eq.) a uma suspensão de trihidrato de ácido 2-amino-6-(trifluorometil)-benzóico (1,0 g, 4,0 mmol, 1,3 eq.) e poliestireno-carbodiimida (3,6 g, 1,1-1,7 eq.) em THF (40 mL) . A reação foi agitada à temperatura ambiente durante 18 horas, e depois filtrada. O filtrado foi concentrado in vacuo e purificado por cromatografia flash para fornecer 2-amino-N-fenil-6-trifluorometil-benzamida como sólido amarelo. 3-(2,6-difluoro-fenil)-5-metil-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-propil]-3H-quinazolin-4-ona (75) O composto 75 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usada 2, 6-difluoroanilina no lugar de anilida no passo A. ESI-MS m/z 448 (MH+). O composto 75 é mostrado abaixo.

t?$) 3-(2,6-difluoro-fenil)-5-metil-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-quinazolin-4-ona (76) O composto 76 foi preparado utilizando ° procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usada 2, 6-difluoroanilina no lugar de anilina no passo A, éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc- butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C. ESI-MS m/z 434,1 (MH+) . 0 composto 76 é mostrado abaixo.

Í75) 2-[1-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-propil]-3-(2,6-difluoro-fenil)-5-metil-3H-quinazolin-4-ona (77) 0 composto 77 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 75, mas foi usada 2-amino-6-bromopurina no lugar de 6-bromopurina no passo D. ESI-MS m/z 463 (MH+) . 0 composto 77 é mostrado abaixo.

ill) 2- [1-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etill-3-(2,6-difluorofenil) -5-metil-3H-quinazolin-4-ona (78) 0 composto 78 foi preparado utilizando ο procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 76, mas foi usada 2-amino-6-bromopurina no lugar de 6-bromopurina no passo D. ESI-MS m/z 449 (MH+) . 0 composto 78 é mostrado abaixo.

i?!l 3- (3,5-dicloro-fenil)-5-metil-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-quinazolin-4-ona (79) 0 composto 79 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usada 3, 5-dicloroanilina no lugar de anilina no passo 1 e éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C. ESI-MS m/z 467 (MH+) . 0 composto 79 é mostrado abaixo.

lilt I

0 composto 80 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usada 2,6-dicloroanilina no lugar de anilina no passo A, éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C. ESI-MS m/z 467 (MH+) . O composto 80 é mostrado abaixo.

«' Ο Λ - I * 2-[1-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-(2,6-diclorofenil) -5-metil-3H-cfuinazolin-4-ona (81) 0 composto 81 foi preparado utilizando ο procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 80, mas foi usada 2-amino-6-bromopurina no lugar de 6-bromopurina no passo D. ESI-MS m/z 482 (MH+) . 0 composto 81 é mostrado abaixo.

5-cloro-3-fenil-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-propil]-3H-quinazolin-4-ona (82) 0 composto 82 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado ácido 2-amino-6-cloro-benzóico no lugar de ácido 2-amino-6-metil-benzóico no passo A, éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C. ESI-MS m/z 432 (MH+) . O composto 82 é mostrado abaixo.

(82} 2-[1-(2-*mi no-9H-purin-6-ilamino)-propil]-5-cloro-3-fenil-3H-quinazolin-4-ona (83) 0 composto 83 foi preparado utilizando ο procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usada 2-amino-6-bromopurina no lugar de 6-bromopurina no passo D. ESI-MS m/z 447 (MH+) . 0 composto 83 é mostrado abaixo.

(S3} 5-metil-3-fenil-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-butil]-3H-guinazolin-4-ona (84) 0 composto 84 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilamino-pentanóico no lugar de éster 2,5-dioxo- pirrolidin 1 ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B. MS (ES): m/z 426 (M+H), 213. 0 composto 84 é mostrado abaixo .

£84)

0 composto 85 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2- benziloxicarbonilamino-pentanóico no lugar de éster 2,5-dioxo- pirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B e 2-amino-6-bt°m°Purina foi usada no lugar de 6- , . ^ n MS (ES) : m/z 441 (M+H) , 221. 0 composto bromopunna no passo D- v '' 85 é mostrado abaixo.

(85) 2-[1-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-(3,5-difclorofenil)-5-metil-3H-quinazolin-4-ona (86) 0 composto 86 foi preparado utilizando ο procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usada 2-amino-6-bromopurina no lugar de 6-bromopurina no passo D. ESI-MS m/z 482 (MH+) . 0 composto 86 é mostrado abaixo.

{86} 5-metil-3-(3-morfolin-4-ilmetil-fenil)-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-quinazolin-4-ona (87) 0 composto 87 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas o composto intermédio 8 foi foi usada no lugar de anilina no passo A e éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C. ESI-MS m/z 497 (MH+) . 0 composto 87 é mostrado abaixo.

(δη 2-[1-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-5-metil-3-(3-morfolin-4-ilmetil-fenil)-3H-quinazolin-4-ona (88) 0 composto 88 foi preparado utilizando ο procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 87, mas foi usada 2-amino-6-bromopurina no lugar de 6-bromopurina no passo D. ESI-MS m/z 498 (MH+) . 0 composto 88 é mostrado abaixo.

(88 > 2-[1-(5-bromo-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-ilamino)-etil]-5-metil-3-fenil-3H-quinazolin-4-ona (89) 0 composto 89 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas éster 2,5-dioxopirrolindi-l-ilo de ácido 2-tert-butoxicarbonilamino-propiónico foi usado no lugar de éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc- butoxicarbonilamino'butírico no passo B, o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C e 4-cloro-5-bromo-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina (preparada como em J. Med. Chem. 1988, 31, 2086-2092) foi usada no lugar de 6-bromopurina no passo D. ESI-MS m/z 411,1 (MH+) . O composto 89 é mostrado abaixo.

(89) 5-metil-2-[1-(5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-ilamino)-etil]-3-fenil-3H-quinazolin-4-ona (90) O composto 90 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C e 4-cloro-5-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina (preparada como em J. Med. Chem. 1990, 33, 1984— 1992) foi usada no lugar de 6-bromopurina no passo D. ESI-MS m/z 411,1 (MH+) . O composto 90 é mostrado abaixo.

{90) 2—[1—(5-fluoro-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-ilamino)-etil]-5-metil-3-fenil-3H-quinazolin-4-ona (91) 0 composto 91 foi preparado utilizando ο procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C e o composto intermédio 1 foi usado no lugar de 6-bromopurina. ESI-MS 415,1 (MH+) . 0 composto 91 é mostrado abaixo.

(91) 2-[2-hidroxi-l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-fenil-3H-quinazolin-4-ona (92) 0 composto 92 foi preparado por adição de ácido trifluoroacético a uma solução de 2-[2-terc-butoxi-l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-fenil-3H-quinazolin-4-ona em diclorometano. A reação foi agitada à temperatura ambiente durante 18 horas, e depois concentrada in vacuo.. A purificação por LC proporcionou o produto como um sólido branco. MS (ES): m/z 400 (M+H), 382, 200, 136. O composto 92 é mostrado abaixo.

(923 2-[2-terc-butoxi-l-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-fenil-3H-quinazolin-4-ona foi preparada utilizando o procedimento geral descrito acima em relação ao composto 14, mas o ácido 2-amino-6-clorobenzoico foi usado no lugar de ácido 2-amino-6-metilbenzóico no passo A, éster 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino-3-terc-butóxi-propiónico foi usado no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-1-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e as condições utilizadas no passo C removem tanto o grupo protector benzilo como o substituinte cloro no Anel-A. 3-(3,5-difluoro-fenil)-5-metil-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-propil]-3H-quinazolin-4-ona (93) 0 composto 93 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usada 3,5-difluoroanilina no lugar de anilina no passo A. ESI-MS m/z 498 (MH+). 0 composto 93 é mostrado abaixo.

2-[1-(2-amino-9H-purin-6-alamino)-propil]-3-(3,5-difluoro-fenil)-5-metil-3H-quinazolin-4-ona (94) 0 composto 94 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 90, mas foi usada 2-amino-6-bromopurina no lugar de 6-bromopurina no passo D. ESI-MS I 463 (MH+) . O composto 94 é mostrado abaixo.

3-(3,5-difluoro-fenil)-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-quinazolin-4-ona (95) 0 composto 95 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado ácido antranilico no lugar de ácido 2-amino-6-metilbenz+oico e 3,5-difluoroanilina no lugar de anilina no passo A, éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C. ESI-MS m/z 420 (MH+) . O composto 95 é mostrado abaixo.

2- [1-(5-bromo-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-ilamino)-etil]-3-(3-fluoro-fenil)-5-metil-3H-quinazolin-4-ona (96) 0 composto 96 foi preparado utilizando ο procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usada 30-fluoroanilina no lugar de anilina no passo A, éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C. ESI-MS m/z 494 (MH+) . 0 composto 96 é mostrado abaixo.

3- (3-difluoro-fenil)-5-metil-2-[1-(5-metil-H-pirrolo [2,3-d] pirimidin-4-ilamino) -etil] -3H-cruinazolin-4-ona (97) 0 composto 97 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usada 3-fluoroanilina no lugar de anilina no passo A, éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc- butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C. ESI-MS m/z 429 (MH+) . 0 composto 97 é mostrado abaixo.

3-fenil-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-propil]-3H-quinazolin-4-one (98) 0 composto 98 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado ácido antranilico no lugar de ácido 2-amino-6-metil-benzóico no passo A. MS (ES) : m/z 398 (M+H) , 199. 0 composto 98 é mostrado abaixo.

(iití 2- [1- (2-amino-9H-_urin-6-ilamino) -etil] -3- (3,5- difluoro-fenil)-3H-quinazolin-4-ona (99) 0 composto 99 foi preparado utilizando ο procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 95, mas foi usada 2-amino-6-bromopurina no lugar de 6-bromopurina no passo D. ESI-MS m/z 435 (MH+) . 0 composto 96 é mostrado abaixo.

2-[1-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-propil]-3-3-fenil-3H-guinazolin-4-ona (100) 0 composto 100 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado ácido antranilico no lugar de ácido 2-amino-6-metilbenzóico no passo A e 2-amino-6-bromopurina foi usada no lugar de 6-bromopurina no passo D. MS (ES) : m/z 413 (M+H) , 207. O composto 100 é mostrado abaixo.

{100} 6,7-difluoro-3-fenil-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-quinazolin-4-ona (101) 0 composto 101 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado ácido 2-amino-4,5-difluoro-benzóico no lugar de ácido 2-amino-6-metil-benzóico no passo A, éster 2,5-dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C. ESI-MS m/z 420 (MH+) . O composto 101 é mostrado abaixo.

CiOil 6-fluoro-3-(3-fluoro~fenil)-2-[1-(9H-purin-6-ilamino) -etil] -3H-quinazolin-4-ona (102) O composto 102 foi preparado utilizando ο procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 14, mas foi usado ácido 2-amino-5-fluoro-benzóico no lugar de ácido 2-amino-6-metil-benzóico no passo A, éster 2,5- dioxopirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino propiónico no lugar de éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido 2-benziloxicarbonilaminobutirico no passo B, e o procedimento alternativo (desprotecção TFA) foi utilizado no passo C. ESI -MS m/z 420 (MH*) . O composto 102 é mostrado abaixo.

ÍM2} 2-[4-dietilamino-l-(9H-purin-6-ilamino)-butil]-5-metil-3-fenil-3H-quinazolin-4-ona (103)

O composto 103 fo preparado seguindo os passos A-D abaixo. Éster terc-butilico do ácido [4-amino-1-(5-metil-4-oxo-3-fenil-3,4-dihidroguinazolin-2-il)-butil]-carbâmico (104)

Passo A: Um balão de 10 mL de fundo redondo de um gargalo, equipado com um agitador magnético foi purgado com azoto e carregado com paládio a 10% sobre carbono (30 mg, 50% molhado). Uma solução de éster terc-butilico do ácido [4-benziloxicarbonilamino-1-(5-metil-4-oxo-3-fenil-3, 4-dihidro-quinazolin-2-il)-butil) -carbâmico (produto do passo B Do procedimento para o composto 51) (100 mg, 0,18 mmol) em etanol (2 mL) e polimetilsilidrosiloxano (130 mg) foram depois adicionados sequencialmente. A reação foi agitada a 50°C durante 3 horas e, em seguida, arrefecida até à temperatura ambiente. A mistura foi filtrada através de uma almofada de CELITE® e o filtrado foi evaporado até à secura. A purificação subsequente do produto bruto resultante por cromatografia em coluna proporcionou um rendimento de 62% do composto 101 como um sólido branco. 1H NMR (CD3OD) δ 7.55-7,69 (m, 5H), 7,33-7,49 (m, 2H), 7,30 (d, 1H, J = 7,3 Hz), 4,29 (m, 1H), 2,77 (s, 3H), 2,38-2,47 (m, 21-1), 1,72-1,88 (m, 1H), 1,57-1,79 (m, 1H), 1,13-1,55 (m, 4H), 1,40 (s, 9H). A reação descrita acima e o composto intermédio 104 são mostrados abaixo.

Éster terc-butilo do ácido [4-Dietilamino-l-(5-metil-4-oxo-3-fenil-3,4-dihidroguinazolin-2-il)-butil]-carbâmico (105)

Passo B: Um balão de 10 mL de fundo redondo de um gargalo, equipado com um agitador magnético foi purgado com azoto e carregado o composto 104(100 mg, 0,24 mmol) e 1,2-dicloroetano (2 mL) . Adicionou-se subsequentemente acetaldeido (42 mg, 0,85 mmol) e triacetoxiborohidreto de sódio (400 mg, 1, 90 mmol) . A mistura de reação foi agitada durante 18 h à temperatura ambiente, evaporada até à secura, e o resíduo resultante foi dissolvido em metanol (20 mL). Esta solução metanólica foi tratada com paládio a 10% sobre carbono (5 mg, 50% molhado), agitada durante 30 min, evaporada até à secura e repartida entre 20 mL de carbonato de potássio a 10% e 20 mL de cloreto de metileno. A camada orgânica foi separada e seca sobre sulfato de sódio. A filtração da camada orgânica seguida por concentração forneceu o composto 105 como um óleo amarelo, o qual foi utilizado sem qualquer purificação adicional.

A reação descrita acima e o composto intermédio 105 são mostrados abaixo.

2-(l-amino-4-dietilamino-buti)-5-meti-3-fenil-3H-guinazolin-4-ona (106) 0 procedimento de desprotecção alternativo descrito acima em relação à preparação do composto 14 (e especificamente a preparação do composto 17) foi utilizado para desproteger o composto 105. A reação e o composto 106 são mostrados abaixo.

2-[4-Dietilamino-l-(9H-purin-6-ilamino)-butil]-5-metil-3-fenil-3H-quinazolin-4-ona (103) O composto 103 foi então preparado seguindo o procedimento geral proporcionado acima no passo D do procedimento para o composto 14, mas o composto 106 foi utilizado como a amina livre. ESI-MS m/z 497 (MH+) . A reação e o composto 103 são mostrados abaixo.

EXEMPLO 9

PREPARAÇÃO DE COMPOSTO

Os compostos de acordo com a fórmula geral I (mostrada acima), incluindo compostos quirais com a fórmula geral II (mostrada acima), foram preparados de acordo com os passos A-E do esquema sintético mostrado abaixo.

Passo A

t

Cassis -S'.

PasioC

Passe©

Passo c

(S)-5-fluoro-3-fenil-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-propil]-3H-quinazolin-4-ona (107) A síntese de um composto de acordo com a fórmula I é primeiro exemplificada utilizando os passos A-E abaixo, que proporcionam um procedimento de síntese para o composto 107, cuja estrutura é mostrada abaixo.

uo-q 2-fluoro-6-nitro-N-fenil-benzamida (108)

Passo A: Uma solução de ácido 2-fluoro-6- nitrobenzóico (100 g, 0,54 mol) e dimetilformamida (5 mL) em diclorometano (600 mLfoi tratada gota a gota com cloreto de oxalilo (2 M em diclorometano, 410 mL, 0,8 mol, 1,5 eq) durante 30 min. Após agitação durante 2 h à temperatura ambiente, a reação foi concentrada para um xarope laranja com alguns sólidos presentes. O xarope foi dissolvido em dioxano seco (80 mL) e adicionado lentamente a uma suspensão de anilina (49 mL, 0,54 mol, 1 eq) e bicarbonato de sódio (90 g, 1,08 mol, 2 eq) numa mistura de dioxano (250 mL) e água (250 mL) a 6°C. A temperatura atingiu 27°C no final da adição. Após 30 min, a mistura de reação foi tratada com água (1,2 L). O precipitado foi recolhido por filtração sob vácuo, lavado com água (300 mL), seco ao ar no funil e seco em vácuo a 50°C durante 24 h para fornecer um produto sólido esbranquiçado (139 g, 99%).

A reação descrita acima e o composto 108 são mostrados abaixo.

Éster terc-butilo do ácido (S)-[1-(2-fluoro-6-nitro-benzoil)-fenil-aminocarbonil]-propi-carbâmico (109)

Passo B: Uma suspensão do composto 108 (0,5 mol) e dimetilformamida (5 mL) em cloreto de tionilo (256 mL, 2,5 mol, 5 eq) foi agitada a 85°C durante 5 horas. Concentrou-se a mistura de reação in vacuo para se obter um xarope castanho. 0 xarope foi dissolvido em diclorometano (200 mL) e foi lentamente adicionado a uma solução de ácido N-BOC-L-2-aminobutírico (112 g, 0,55 mol, 1,1 eq) e trietilamina (77 mL, 0,55 mol, 1,1 eq) em diclorometano (600 mL) a 10°C. Após agitação à temperatura ambiente durante 3 h, os sais foram removidos por filtração e a solução foi lavada com 100 mL de água, bicarbonato de sódio saturado, água, ácido cítrico a 5% e cloreto de sódio saturado. A fase orgânica foi seca sobre sulfato de magnésio e concentrada até se obter um xarope vermelho. 0 xarope foi dissolvido em diclorometano (450 mL) e purificado por cromatografia flash num tampão de gel de silica (15 x 22 cm, 4 L de silica seca) eluido com hexanos/acetato de etilo (10%, 8 L; 15%, 8 L; 20%, 8 L, 25%, 4 L) para render o composto 109 como um sólido esbranquiçado (147 g, 66%). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8,13 (d, J = 8,0 Hz, 1H) , 7,84 (t, J = 8,6 Hz, 1H), 7,78-7, 67 (m, 1H) , 7, 65-7,49 (m, 3H), 7,40-7,28 ( m, 2H) , 7,19 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 4,05 (s largo, 1H), 1,75-1,30 (m, 2H) , 1,34 (s, 9H) , 0.93 (s largo, 3H) . ESI-MS m/z 446, 3 (MH+) . A reação descrita acima e o composto 109 são mostrados abaixo.

Éster terc-butilo do ácido (S)-[1-(5-fluoro-4-oxo-3-fenil-3,4-dihidro-quinazolin-2-il)-propil]-carbâmico (110)

Passo C: Uma solução de composto 109 (125 mmol, 1 eq) em ácido acético (500 mL) foi tratada com pó de zinco (48,4 g, 740 mmol, 6 eq) adicionada em 3 porções, e deixou-se a mistura de reação arrefecer abaixo de 35°C entre adições. Após agitação durante 2 h à temperatura ambiente, os sólidos foram filtrados por filtração sob vácuo e lavados com ácido acético (50 mL). O filtrado foi concentrado in vacuo, dissolvido em EtOAc (400 mL) , lavado com água (300 mL) , e a camada aquosa foi extraída com EtOAc (300 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água (200 mL) , bicarbonato de sódio saturado (2 x 200 mL), NaCl saturado (100 mL), secas com MgS04 e concentradas num xarope. O xarope foi dissolvido em tolueno (200 mL) e purificado por cromatografia flash num tampão de gel de sílica (13 x 15 cm, 2 L de sílica seca) eluído com hexanos/acetato de etilo (10%, 4 L; 15%, 4 L; 17,5%, 8 L, 25%, 4 L) para render o composto 110 como um sólido espumoso esbranquiçado (33,6 g, 69%). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 7,83 (td, J = 8,2, 5,7 Hz, 1H) , 7, 64-7,48 (m, 5H), 7,39 (d largo, J = 7,6 Hz, 1H) , 7,30 (dd, J = 8,3 Hz, 1H) , 7,23 (d, J = 7,6 Hz, 1H) , 4,02-3, 90 (m, 1H) , 1,76-1, 66 (m, 1H) , 1, 62-1, 46 (m, 1H), 1,33 (s, 9H), 0,63 (t, J = 7.3 Hz, 3H). ESI-MS m/z 398,3 (MH+). A reação descrita acima e o composto 110 são mostrados abaixo.

(S)-2-(1-amino-propil)-5-fluoro-3-fenil-3H-guinazolin-4-ona (111)

Passo D: Uma solução do composto 110 (85 mmol) em diclorometano (60 mL) foi tratada com ácido trifluoroacético (60 mL) . A mistura de reação foi agitada durante 1 hora, concentrada in vacuo e repartida entre diclorometano (150 mL) e K2CO3 a 10% (quantidade suficiente para manter o pH acima de 10). A camada aquosa foi extraída com diclorometano adicional (100 mL) e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água (50 mL) e salmoura (50 mL) . Após secagem com Mgso4, a solução foi concentrada para proporcionar o composto 111 como um sólido esbranquiçado (22 g, 88%). J-H NMR (300 MHz, CDC13) δ 7, 73-7, 65 (m, 1H) , 7, 62-7,49 (m, 4H) , 7,32-7,22 (m, 2H) , 7,13- 7,06 (m, 1H) , 3,42 (dd, J= 7,5, 5,2 Hz, 1H) , 1, 87-1,70 (m, 1H), 1, 58-1,43 (m, 1H) , 0,80 (t, J = 7,4 Hz, 3H) . ESI-MS m/z 298,2 (MH+) . A reação descrita acima e o composto 111 são mostrados abaixo.

Passo E: Uma suspensão do composto 111 (65,6 mmol, 1 eq), 6-bromopurina (14,6 g, 73,4 mmol, 1,1 eq) e DIEA (24,3 mL, 140 mmol, 2 eq) em terc-butanol (40 mL) foi agitada durante 24 h a 80°C. A mistura reaccional foi concentrada in vacuo e tratada com água para fornecer um produto bruto sólido que foi recolhido por filtração sob vácuo, lavado com água e seco ao ar. Metade do produto bruto sólido obtido foi dissolvido em MeOH (600 mL) , concentrado sobre gel de sílica (300 mL seco) e purificado por cromatografia flash (7,5 x 36 cm, eluído com 10 L de MeOH a 4%/CH2Cl2) para se obter um produto sólido. O produto sólido foi então dissolvido em EtOH (250 mL) e concentrado in vacuo no composto 107 como um sólido amarelo claro (7,2 g, 50%) .

O composto 112 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 107, mas foi usado ácido 2-nitrobenzóico no lugar de ácido 2-fluoro-6-nitrobenzóico no passo A e N-BOC-L-alanina foi usada no lugar de ácido N-BOC-L-2-aminobutirico no passo B. ESI-MS m/z 384,3 (MH+) . Pureza quiral 99,5:0,5 (S:R). 0 composto 112 é mostrado abaixo.

UU;s

0 composto 113 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 107, mas foi usado ácido 2-nitro-5-fluorobenzóico no lugar de ácido 2-fluoro-6-nitrobenzóico no passo A e N-BOC-L-alanina foi usada no lugar de ácido N-B0C-L-2-aminobutírico no passo B. ESI-MS m/z 402,3 (MH+) . Pureza quiral 99,9:0,1 (S:R). O composto 113 é mostrado abaixo.

O composto 114 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 107, mas foi usado ácido 2-nitro-5-metilbenzóico no lugar de ácido 2-fluoro-6-nitrobenzóico e 3,5-difluoroanilina no lugar de anilina no passo A e N-BOC-L-alanina foi usada no lugar de ácido N-B0C-L-2-aminobutírico no passo B. ESI-MS m/z 434,3 (MH+) . 0 composto 114 é mostrado abaixo.

11141 (S)-5-fluoro-2-[1-(2-fluoro-9H-purin-6-ilamino)-etil] -3-fenil-3H-quinazolin-4-ona (115) 0 composto 115 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 107, mas foi usado ácido 2-nitro-6-fluorobenzóico no lugar de ácido 2-fluoro-6-nitrobenzóico no passo A e N-BOC-L-alanina foi usada no lugar de ácido N-BOC-L-2-aminobutírico no passo B e 6-cloro-2-fluoropurina foi usada no lugar de 6-bromopurins no passo E. ESI-MS m/z 420,3 (MH+) . Pureza quiral 100:0 (S:R). O composto 115 é mostrado abaixo.

(U5) (S)-3-(3-fluoro-fenil)-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-quinazolin-4-ona (116) 0 composto 116 foi preparado utilizando ο procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 107, mas foi usado ácido 2-nitrobenzóico no lugar de ácido 2-fluoro-6-nitrobenzóico e 3-fluoroanilina no lugar de anilina no passo A e N-BOC-L-alanina foi usada no lugar de ácido N-BOC-L-2-aminobutirico no passo B. ESI-MS m/z 402,3 (MH+) .

Pureza quiral 96:4 (S:R). O composto 116 é mostrado abaixo.

(1161 (S)-5-cloro-3-(3,5-difluoro-fenil)-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-propil]-3H-quinazolin-4-ona (117) 0 composto 117 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 107, mas foi usado ácido 2-nitro-5-clorobenzóico no lugar de ácido 2-fluoro-6-metilbenzóico e 3,5-difluoroanilina no lugar de anilina no passo A. ESI-MS m/z 468,3 (MH+) . Pureza quiral 100:0 (S:R). O composto 117 é mostrado abaixo. ί £:>&amp;&amp;

* ^ * * ί (S)-3-(2,6-difluoro-fenil)-5-metil-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-quinazolin-4-ona (118) 0 composto 118 foi preparado utilizando um passo B alternativo relativamente à preparação do composto 107, mas o procedimento geral descrito acima para o composto 107 foi de outro modo geralmente seguido para cada um dos passos A, C e D. N-(2,6-difluoro-fenil)-2-metil-6-nitro-benzamida (118a)

Passo A: O composto 118a foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 107, mas foi usado ácido 2-nitro-5-metilbenzóico no lugar de ácido 2-fluoro-6-metilbenzóico e 2,6-difluoroanilina no lugar de anilina. Éster terc-butilo do ácido L-{2-[(2,6-difluoro-fenil)-(2-metil-6-nitro-benzoil)-amino]-l-metil-2-oxo-etil}-carbâmico (118b)

Passo B: 0 Composto 118b foi preparado por tratamento de uma solução do composto 118a (13,8 g, 47 mmol) em THF (200 mL) gota a gota com uma solução de hexametildissilazida de potássio (KHMDS) (0,5 M em tolueno, 95 mL, 47 mmol, 1 eq) a 0°C e agitando a mistura de reação durante 30 min à mesma temperatura. A mistura de reação foi então tratada com éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo do ácido L-2-terc- butoxicarbonilamino-propiónico (13,5 g, 47 mmol, 1 eq) e agitada à mesma temperatura durante mais 30 minutos. Extinguiu-se a mistura de reação com água (50 mL) e concentrou-se in vacuo. O resíduo foi dissolvido em acetato de etilo (300 mL) e lavado com 100 mL de cada um dos seguintes: (1) água, (2) bicarbonato de sódio saturado, (3) água, (4) ácido cítrico a 5%, (5) água e (6) salmoura. A camada orgânica foi seca com

MgS04 e concentrada até se obter um xarope. O material em bruto foi dissolvido em diclorometano (75 mL) e purificado por cromatografia flash em gel de sílica (7,5 x 40 cm), eluído com EtOAc a 20% e hexanos (10 L de 20% e depois 6 L de 33%).

As etapas C e D foram realizadas como descrito relativamente à preparação do composto 107. ESI-MS m/z 434,3 (MH+). Pureza quiral 100:0 (S:R). O composto 118 é mostrado abaixo.

12181 (S)-3-(2,6-difluoro-fenil)-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-quinazolin-4-ona (119) 0 composto 119 foi preparado utilizando ο procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 118, mas foi usado ácido 2-nitrobenzóico no lugar de ácido 2-nitro-5-metilbenzóico ESI-MS m/z 420,3 (MH+) . Pureza quiral 100:0 (S:R). O composto 119 é mostrado abaixo.

í Ii8| 5-Metil-3-fenil-2-[3,3,3-trifluoro-l-(9H-purin-6-ilamino) -propil] -3H-quinazolin-4-ona (120) O composto 120 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 107, mas foi usado ácido 2-metil-6-nitrobenzóico no lugar de ácido 2-fluoro-6-nitrobenzóico no passo A e ácido 2-terc-butoxicarbonilamino-4,4,4-trifluoro-butírico no lugar de ácido 2-terc-butoxicarbonilamino-butírico no passo B. ESI-MS m/z 466 (MH+). 0 composto 120 é mostrado abaixo.

uao* EXEMPLO 10 (Referência)

PREPARAÇÃO DE COMPOSTO

Os compostos com a fórmula geral I (mostrada acima) foram preparados de acordo com os passos A-D do esquema sintético intitulado "Procedimento C" mostrado abaixo. Um esquema sintético alternativo intitulado "Esquema D" ilustra vias sintéticas adicionais para compostos com a fórmula I.

Procedimento C:

p_35SO_8 .

PassoC

Esquema D

A síntese de compostos de acordo com o Procedimento C e Esquema D é primeiro exemplificada pelo procedimento de síntese para 3-(3-hidroxi-fenil)-5-metil-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-quinazolin-4-ona, também referido como composto 121, cuja estrutura é mostrada abaixo.

3-(3-hidroxi-fenil)-5-metil-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-quinazolin-4-ona (121) 0 composto 121 foi preparado seguindo os passos A-N-D abaixo e utilizando o composto 122 (abaixo) no passo A. 3-(terc-butil dimetilsililoxi) fenilamina (122)

Um balão de 250 ml, com três gargalos de fundo redondo equipado com um agitador magnético foi purgado com azoto e carregado com cloreto de terc-butildimetilsililo (12,5 g, 82,8 mmol), imidazole (7,64 g, 112 mmol) e DMF anidro (60 mL) . 3-aminofenol (10,0 g, 91,7 mmol) foi adicionado à solução resultante. Após agitação durante 12 h à temperatura ambiente, a mistura de reação foi vertida em água (300 mL). A suspensão resultante foi extraída com hexano (3 x 300 mL) , e os extractos foram combinados, secos sobre sulfato de sódio e filtrados. A concentração do filtrado seguida por cromatografia em coluna forneceu o composto 122 como um óleo amarelo claro. 1H NMR (DMSO-d6) δ (ppm), 6,84 (t, 1H, J = 7,9 Hz), 6,16 (d, 1H, J = 6,7 Hz), 6,10 (m, 1H) , 5,97 (d, 1H, J = 9,1 Hz), 4,98 (s, 2H) , 0,95 (s, 9H), 0,16 (s, 6H); m/z = 224 (M+H). 2-amino-6-metil-N- [ (3-terc-butil-dimetil-silanoxi) -fenill]-benzamida (123)

Passo A: Um balão de 5-L, com três gargalos de fundo redondo equipado com um borbulhador de gás, um agitador mecânico e condensador de refluxo foi carregado com ácido 6- amino-2-metilbenzóico (25 g, 16,8 mmol), tolueno (300 mL) e cloreto de tionilo (50 mL). A mistura de reação foi submetida a refluxo durante 1 h até cessar a libertação de gás. A mistura resultante foi então arrefecida e concentrada sob pressão reduzida a 50°C. Foram adicionados THF anidro (400 mL) e DIEA (90 mL) ao resíduo resultante, seguido pelo composto 122 (37 g, 1,0 eq) . A mistura de reação resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 2 horas, depois temperada pela adição de carbonato de potássio aquoso a 20% (250 mL). A camada orgânica foi separada e concentrada até à secura sob pressão reduzida. A trituração do resíduo com MtBE (70 mL), filtração e secagem proporcionou o composto 123. A preparação do composto 123 é geralmente mostrada acima como passo A do Procedimento C. Éster terc-butilo do ácido l-{[3-(3-Hidroxi-fenil)-5-metil-4-oxo-3,4-dihidro-quinazolin-2-il]-etil}carbâmico (124)

Passo B: Um balão de 100 mL, com três gargalos de fundo redondo equipado com um agitador mecânico e condensador de refluxo foi purgado com azoto e carregado com o composto 123 (10 g, 28 mmol), éster de N-hidroxissuccinimida de N-terc-butiloxicarbonilalanina (9,60 g, 1,0 eq), DMAP (1,90 g), DIEA (6 mL), crivos moleculares 4Ã (1,20 g) e tolueno anidro (100 mL) . A mistura resultante foi aquecida num banho de óleo a 80°C durante 24 h. Adicionou-se 1-hidroxibenzotriazole (3,78 g) à reação, e o aquecimento continuou durante mais 48 h. Após arrefecimento, adicionou-se tolueno (10 mL) e CELITE® (0,70 g) à mistura de reação quente, seguido por filtração e evaporação do filtrado para fornecer um resíduo castanho. 0 resíduo foi dissolvido em CH2C12 (15 mL) e tratado com uma solução de fluoreto de tetrabutilamónio (5,12 g) em MeOH (15 mL) . Após agitação durante 1 h à temperatura ambiente, a mistura de reação foi evaporada até à secura sob pressão reduzida e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna para dar 81% de rendimento do composto 124 como um sólido esbranquiçado. A preparação do composto 124 é geralmente mostrada acima como passo B do Procedimento C. 2- (1-amino-etil)-3-(3-hidroxi-fenil)-5-metil-3H-quinazolin-4-ona (125)

Passo Cl: Carregou-se um balão de 100 mL com três gargalos de fundo redondo equipado com um agitador magnético com o composto 124 (4,50 g, 11,18 mmol) em CH2C12 (15 mL) e TFA (15 mL) . Depois de se agitar durante 1 h à temperatura ambiente, concentrou-se a mistura sob pressão reduzida para se obter o composto 125, que foi utilizado tal como no passo seguinte. 3- (3-hidroxi-fenil)-5-metil-2-{1-[9-(2-trimetilsilanil-etoximetil)-9H-purin-6-ilamino]-etil}-3H-guinazolin-4-ona (126)

Passo C2: Carregou-se um balão de 50 mL com um gargalos de fundo redondo, purgado com azoto, equipado com um agitador magnético e condensador de refluxo com o composto 125 (2,4 g, 8,16 mmol), o composto intermédio 10 (2,70 g, 1,0 eq) , n-butanol (20 mL) , e DIEA (4,2 mL) . A mistura foi agitada a 100°C durante 4 horas e, em seguida, arrefecida até à temperatura ambiente. A concentração da mistura de reação sob alto vácuo seguida por cromatografia em coluna forneceu o composto como um sólido branco. A preparação do composto 126 é geralmente mostrada acima como passo C do Procedimento C. 3-(3-hidroxi-fenil)-5-metil-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-quinazolin-4-ona (121)

Passo D: Um balão de 100 mL, com um gargalo de fundo redondo, equipado com um agitador mecânico foi carregado com o composto 126 (294 mg, 0,5 mmol), MeOH (15 mL) e ácido ácido clorídrico 4N (15 mL) , e a mistura de reação foi aquecida durante 5 horas a 40°C. A evaporação do metanol sob pressão reduzida seguida de alcalinização até pH 10 com carbonato de potássio aquoso a 10% forneceu um precipitado branco. O precipitado foi filtrado, lavado com água e seco sob vácuo durante a noite à temperatura ambiente para fornecer o composto 121 como um sólido branco. m/z= 414 (M+H) . A preparação do composto 121 é geralmente mostrada acima como passo D do Procedimento C. 3-(3-metoxi-fenil)-5-metil-2-{1-[9-(2-trimetilsilanil-etoximetil)-9H-purin-6-ilamino]-etil}-3H-quinazolin-4-ona (127)

Carregou-se um balão de 100 mL com um gargalo de fundo redondo, equipado com um agitador magnético com o composto 126 (370 mg, 0,68 mmol), carbonato de potássio (235 mg, 1,70 mmol), e DMF (4 mL). A mistura resultante foi agitada durante 5 min, e foi então adicionado iodeto de metilo (435 mg, 3,10 mmol). Após agitação durante mais 1 h à temperatura ambiente, a mistura de reação foi evaporada até à secura sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna para um rendimento de 82% do composto 127 como um óleo amarelo claro. 1H NMR (CD30D) δ (ppm) 8,20 (m, 2H) , 6,99-7,66 (m, 7 H) , 5,58 (s, 2H) , 5,15 (bs, 1H) , 3,62 (dt, 2H, J = 1,8, 8,0 Hz), 3,32 (s, 3H), 2,78 (s, 3H), 1,55 (m, 3H), 0,88 (m, 2H) , -0,07 (s, 9H); m/z = 558 (M+H) . 3-(3-metoxi-fenil)-5-metil-2-{1-[9H-purin-6-ilamino]-etil}-3H-quinazolin-4-ona (128) O composto 127 foi feito reagir de acordo com o procedimento descrito acima para o composto 121 (passo D) para proporcionar o composto 128. m/z= 428 (M+H). A estrutura do composto 128 é mostrada abaixo.

3-(3-Metoxi-fenil)-5-metil-2-[1-(9H-purin-6- ilamino) -etil] -3H-quinazolin-4-ona_(128)_3- [3- (2- dimetilamino-etóxi)-fenil]-5-metil-2-{1-[9H-purin-6-ilamino]-etil}-3H-quinazolin-4-ona (129)

Tratou-se o composto 126 (300 mg, 0,54 mmol) com sal hidrocloreto de 2-cloroetil dimetilamina, a 90°C durante 17 horas, utilizando o procedimento descrito acima para o composto 127. O composto resultante foi então tratado com HC1 4N, em MeOH, utilizando o procedimento descrito para o composto 121 (passo D) . Foi obtido o composto 129. m/z= 485 (M+H) . A estrutura do composto 129 é mostrada abaixo.

3-[3-(2-Dimetilamino-etóxi)-feni]-5-metil-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-quinazolin-4-ona (129) 3-(3-ciclopropilmetoxi-fenil)-5-metil-2-{1-[9H-purin-6-ilamino]-etil}-3H-quinazolin-4-ona (130) O composto 126 (300 mg, 0,54 mmol) foi tratado com bromometilciclopropano utilizando o procedimento descrito para o composto 127, à temperatura ambiente durante 24 horas. Este intermédio foi tratado com HC1 4N de acordo com o procedimento

descrito para o composto 121 (passo D) . m/z= 468 (M+H) . A estrutura do composto 130 é mostrada abaixo.

5-metil-3-(3-prop-2-iniloxi-fenil)-2-{1-[9H-purin-6-ilamino]-etil}-3H-quinazolin-4-ona (131) O composto 126 (300 mg, 0,54 mmol) foi tratado com brometo de propargilo à temperatura ambiente durante 24 horas utilizando o procedimento descrito acima para o composto 127. Este intermédio foi então tratado com HC1 4N de acordo com o procedimento descrito para o composto 121 (passo D). m/z=467 (M+H). A estrutura do composto 131 é mostrada abaixo.

5-metil-3-(3-prop-2-iniloxi-fenil)-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-quinazolin-4-ona (131) 2-{1-[2-amino-9H-purin-6-ilamino]etil}-3-(3-hidroxifenil)-5-metil-3H-quinazolin-4-ona (132) 0 composto 132 foi preparado de acordo com os procedimentos estabelecidos nos passos Ae B a seguir. 2-{1- [2-di_terc-butiloxicarbonilamino-9- (2- trimetilsililetoximetil)-9H-purin-6-ilamino]etil}-3- (3-hidroxifenil) -5-metil-3H-quinazolin-4-ona (133)

Passo A: Carregou-se um balão de 50 mL com um gargalo de fundo redondo, purgado com azoto, equipado com um agitador magnético e condensador de refluxo com o composto 125 (3,02 g, 10,2 mmol) , o composto intermédio 12 (5,56 g, 1,0 eq) , n-butanol (20 mL), e DIPEA (6 mL). A mistura foi agitada a 100°C durante 1 hora e, em seguida, arrefecida até à temperatura ambiente. A concentração da mistura de reação sob alto vácuo seguida por cromatografia em coluna forneceu o composto 133 como um sólido branco. 2-{1- [2-amino-9H-purin-6-ilaitiino] etil} -3- (3-hidroxifenil)-5-metil-3H-quinazolin-4-ona (132)

Passo B: O composto 133 foi dissolvido em MeOH (3 mL) , tratado com HC1 4N (3 mL) e aquecido a 40°C durante 6 h. A mistura de reação foi então concentrada até aproximadamente metade do volume e repartida entre água (5 mL) e acetato de etilo (10 mL) . A camada aquosa foi separada, basifiçada com carbonato de potássio até pH 10 e filtrada. Após lavagem do bolo de filtração com água (5 mL) e secagem sob vácuo, o composto 132 foi obtido como um sólido branco, m/z=429 (M+H). A estrutura do composto 132 é mostrada abaixo.

2-[1-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-(3-hidroxifenil)-5-metil-3H-quinazolin-4-ona (132) 2-{1-[2-amino-9H-purin-6-ilamino]etil}-3-(3-metoxifenil)-5-metil-3H-quinazolin-4-ona (134)

Tratou-se o composto 133 (300 mgs, 0,39 mmol) com iodeto de metilo utilizando o procedimento descrito acima para o composto 127. Este intermediário foi então tratado com HCl 4N em metanol de acordo com o procedimento descrito acima para o composto 132 (passo B) . m/z= 443 (M+H) . A estrutura do composto 134 é mostrada abaixo.

.n-6-ilamino)-etil]-3-(3- 2- [1- (2-3ΐηίηο-9Η-ρυί11 _lin-4-ona (134) metoxifenil) -5-metil-3H-quinazo

„ . 133 (231 mgs, 0,30 mmol) com

Tratou-se o composto ^ brometo de ciclopropilmetilo utilizando o procedimento descrito acima para o composto 127. O intermediário gerado foi então tratado com HC1 4N em MeOH de acordo com o procedimento descrito acima para o composto 132 (passo B). m/z= 483 (M+H). A estrutura do composto 135 é mostrada abaixo.

Tratou-se o composto 133 (231 mgs, 0,30 mmol) com brometo de propargilo utilizando o procedimento descrito acima para o composto 127. O intermediário gerado foi então tratado com HC1 4N em MeOH de acordo com o procedimento descrito acima para o composto 132 (passo B). m/z= 467 (M+H). A estrutura do composto 136 é mostrada abaixo.

2- [1-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-5-metil-3-(3-prop-2-iniloxi-fenil)-3H-quinazolin-4-ona (136) 3- (3-etinil-fenil)-5-metil-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-quinazolin-4-ona (137) O composto 137 foi preparado de acordo com os procedimentos estabelecidos nos passos A-C a seguir. Éster 3-(5-metil-4-oxo-2-{1-[9-(2-trimetilsilanil-etoximetil) -9H-purin-6-ilamino] -etil} -4H-cfuinazolin-3-il) -fenilo do ácido ácido trifluorometanossulfónico (138)

Passo A: Um balão de 50 mL de fundo redondo de três gargalos, equipado com um agitador magnético foi purgado com azoto e carregado com o composto 126 (500 mg, 0,92 mmol), trietilamina (218 mg, 2,16 mmol), cloreto de metileno anidro (10 mL) e N-feniltrifluorometanossulfonimida (496 mg, 1,39 mmol) . Após agitação durante 2 h à temperatura ambiente, a mistura de reação foi repartida entre cloreto de metileno (50 mL) e carbonato de potássio aquoso a 10% (50 mL) . A fase orgânica foi searada, seca sobre sulfato de sódio e filtrada. A concentração do filtrado seguida por cromatografia em coluna rendeu 77% do composto 138 como um óleo esbranquiçado. 1H NMR (DMSO-dô) δ (ppm) 8,32 (bs, 1H) , 7,48-8,18 (m, 7H) , 7,30 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 5,51 (s, 2H), 4,75-4,85 (m, 1H), 3,55 (t, 2H, J = 8,0 Hz), 2,72 (s, 3H) , 1,46 (d, 3H, J = 6,6 Hz), 0,83 (dt, 2H, J = 1,6, 8,1 Hz), -0,09 (s, 9H) . 5-Metil-2-{l-[9-(2-trimetilsililetoximetil)-9H-purin-6-ilamino]etil}-3-(3-trimetilsililetinilfenil)-3H-quinazolin-4-ona (139)

Passo B: Um frasco de reação de 5 mL equipado com um agitador magnético foi purgado com azoto e carregado com o composto 138 (220 mg, 0,33 mmol), diclorobis(trifenilfosfina)paládio (II) (27,1 mg, 0,039 mmol) e DMF anidro (1 mL ). Foram adicionados trietilamina (146 mg, 1,44 mmol) e (trimetilsilil)acetileno (102 mg, 1,04 mmol) e a mistura de reação foi agitada durante 10 h a 90°C e durante 8 h adicionais a 100°C. A evaporação da mistura de reação até à secura seguida de purificação por cromatografia em coluna deu 63% de rendimento do composto 139 como um sólido esbranquiçado.

Passo C: 0 composto 139 (113 mgs, 0,18 mmol) foi tratado com HC1 4N em MeOH de acordo com o procedimento descrito para o composto 121 (passo D) . Isto proporcionou o composto 137. m/z= 422 (M+H) . A estrutura do composto 137 é mostrada abaixo.

O composto 140 foi preparado de acordo com os procedimentos estabelecidos nos passos A e B a seguir.

Passo A: Um frasco de reação de 5 mL equipado com um agitador magnético foi carregado com composto 138 (200 mg, 0,300 mmol), tetraquis (trifenilfosfina)paládio (34,0 mg, 0,029 mmol), cianeto de zinco (70 mg, 0,60 mmol) e DMF anidra 1 mL) . O frasco foi purgado com azoto, aquecido a 120°C durante 3,5 horas e depois arrefeceu-se até à temperatura ambiente e vertido numa solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio (25 mL). A suspensão resultante foi extraída com hexano (3 x 20 mL), e os extractos foram combinados, secos sobre sulfato de sódio e filtrados. A concentração do filtrado seguida por cromatografia em coluna rendeu 66% do composto 141 como um sólido branco.

Passo B: O composto 141 foi feito tratado com HCL 4N em MeOH durante 1 hora, usando o procedimento descrito acima para o composto 121 (passo B) para proporcionar o composto 140. m/z= 423 (M+H) . A estrutura do composto 140 é mostrada abaixo.

0 composto 142 foi preparado de acordo com os procedimentos estabelecidos nos passos A e B a seguir.

Passo A: Um balão de 100 mL de fundo redondo de três gargalos, equipado com um agitador magnético e condensador de refluxo foi purgado com azoto e carregado com o composto 140 (219 mg, 0,40 mmol) e cloreto de metileno anidro (15 mL) . Adicionou-se N,N-dietilhidroxilamina (146 mg, 1,64 mmol) à solução resultante e aqueceu-se a mistura de reação durante 16 horas a 50°C, arrefeceu-se até à temperatura ambiente e depois evaporou-se à secura sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna para um rendimento de 97% do composto 143 como um sólido branco, m.p. 195-197°C;

Passo B: 0 composto 143 foi feito tratado com HCL 4N em MeOH durante 1,5 horas, usando o procedimento descrito acima para o composto 121 (passo D) para proporcionar o composto 142. m/z= 441 (M+H) . A estrutura do composto 142 é mostrada abaixo.

0 composto 139 foi tratado com HC1 4N em MeOH a 70°C durante 16 horas de acordo com o procedimento descrito para o composto 121 (passo D). Esta reação produziu o composto 144, cuja estrutura é mostrada abaixo. m/z=440 (M+H)

3-(3-acetil-fenil)-5-metil-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-quinazolin-4-ona (144) 2-(3-(5-metil-4-oxo-2-{1-[9H-purin-6-ilamino]-etil}-4H-quinazolin-3-il-fenixi acetamida (145)

Tratou-se o composto 126 (300 mg, 0,54 mmol) com 2 bromoacetamida utilizando o procedimento descrito acima para o composto 127. A reação estava sob refluxo durante 24 horas em CH3CN. Este intermediário foi tratado com HCL 4N em MeOH durante 1 hora, usando o procedimento descrito acima para o composto 121 (passo D) para proporcionar o composto 145. m/z= 471 (M+H). A estrutura do composto 145 é mostrada abaixo.

2-(3-{5-Metil-4-oxo-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-4H-quinazolin-3-il}-fenóxi)-acetamida (145) 5-metil-2-{l-[9H-purin-6-ilamino]-etil}-3-[3-(tetrahidropuran-4-iloxi)-fenil]-3H-quinazolin-4-ona (146)

Um balão de 25 mL de fundo redondo de três gargalos, equipado com um agitador magnético foi purgado com azoto e carregado com o composto 126 (270 mgs, 0,5 mmol) , tetrahidropirano-4-ol (60 uL), trifenilfosfina (560 mg), THF (5 mL) e azodicarboxilato de dietilo (340 uL). Após agitação durante 16 h à temperatura ambiente, a mistura de reação foi evaporada até à secura e o resíduo foi dissolvido em metanol (3 mL), tratado com ácido clorídrico 4N (3 mL) e aquecida a 40°C durante 6 h. A mistura de reaçõ foi então concentrada até aproximadamente metade do volume e repartida entre água (5 mL) e acetato de etilo (10 mL). A camada aquosa foi separada, basificada com carbonato de potássio até pH 10 e filtrada. Após lavagem do bolo de filtração com água (5 mL) e secagem sob vácuo, obteve-se o composto 146. m/z = 498 (M+H) . A estrutura do composto 146 é mostrada abaixo.

Tratou-se o composto 126 (300 mgs, 0,540 mmol) com tolueno éster 2-metóxi etilo do ácido 4-sulfónico a 50C durante 42 h utilizando o procedimento descrito acima para o composto 127. O intermediário gerado foi então tratado com HC1 4N em MeOH, utilizando o procedimento descrito para o composto 121 (passo D). m/z= 487 (M+H).

O composto 148 foi preparado de acordo com os procedimentos estabelecidos nos passos A e B a seguir.

Passo A: 0 composto 149 foi obtido a partir de ácido 6-amino-3-fluoro-benzóico utilizando os procedimentos descritos acima para os compostos 123, 124, 125 e 126.

Passo B: 0 composto 148 foi obtido a partir do composto 149 utilizando o procedimento descrito para o composto 146. m/z=502 (M+H). A estrutura do composto 148 é mostrada abaixo.

0 composto 150 foi obtido seguindo o procedimento geral descrito para o composto 146/ mas utilizou-se 3 dimetilamino-1-propanol em vez de tetrahidropiran-4-ol. m/z= 499 (M+H). A estrutura do composto 150 ® mostrada abaixo.

2-[1-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-(3-etinil-fenil)-5-metil-3H-quinazolin-4-ona (151) 0 composto 151 foi preparado de acordo com os procedimentos estabelecidos nos passos A e B a seguir. Éster 3-{2-[1-(2-di-terc-butiloxicarbonilamino-9-(2-trimetilsililetoximetil)-purin-6ilamino)-etil]-5-metil-4- oxo-4H-quinazolin-3-il} -fenil_do_ácido trifluorometanossulfónico (152)

Passo A: O composto 152 foi obtido a partir do composto 133, o qual foi feito reagir de acordo com o procedimento descrito para o composto 138. 2-[1-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-(3-etinil-fenil)-5-metil-3H-quinazolin-4-ona (151)

Passo B: 0 composto 151 foi obtido a partir do composto 152, o qual foi feito reagir de acordo com o procedimento descrito para os compostos 139 e 137 (passo C) . m/z=437 (M+H). A estrutura do composto 151 é mostrada abaixo.

2- [1-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-3- (3-etinil-fenil)-5-metil-3H-quinazolin-4-ona (151) 3- {2-[1-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-5-metil- 4-oxo-4H-quinazolin-3-il}-benzonitrila (153) 0 composto 153 foi obtido a partir do composto 152, o qual foi feito reagir de acordo com o procedimento descrito para os compostos 141 e 140 (passo D) . m/z= 438 (M+H) . A estrutura do composto 153 é mostrada abaixo.

0 composto 154 foi obtido começando por fazer reagir o composto 152 de acordo com o procedimento para o composto 141. Este produto de reação foi então feito reagir adicionalmente de acordo com o procedimento para os compostos 143 e 142 (passo B). m/z= 456 (M+H). A estrutura do composto 154 é mostrada abaixo.

0 composto 155 foi obtido começando por fazer reagir o composto 151 de acordo com o procedimento para o composto 139. Este produto de reação foi tratado de acordo com o procedimento para o composto 144. m/z= 455 (M+H). A estrutura do composto 155 é mostrada abaixo.

0 composto 156 foi preparado de acordo com os procedimentos estabelecidos nos passos A e B a seguir. 5-me til-3-(3-morfolino-4-il-fenil)-2-{l-[9-(2-trimetilsilaniletoximetil)-9H-purin-6-ilamino]-etil}-3Hquinazolin-4-ona (157)

Passo A: Um frasco de reação de 3 mL foi carregado com o composto 138 (96,1 mg, 0,142 mmol), acetato de paládio(II) (3,20 mg, 0,014 mmol), carbonato de césio (84,2 mg, 0,258 mmol) e (+)-BINAP (isto é, 2,2'-bis(difenilfosfino)-1,1'-binaftilo) (13,8 mg, 0,022 mmol). O frasco foi então lavado com azoto durante 10 min. Foram então adicionados tolueno (0,3 mL) e morfolina (18 pL) , e a solução foi aquecida a 100°C durante 6 h. Subsequentemente, a solução foi diluída com diclorometano (5 mL) , filtrada e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. A HPLC preparativa do resíduo produziu o composto 157 como um óleo amarelo. 1H NMR (CH3OD) δ (ppm) 8,24-8,30 (m, 2H) , 7,48-7,72 (m, 3H) , 7,33 (m, 2H) , 6,94-7,13 (m, 3H), 5,56 e 5,64 (dois s, CH2 proporção de rotâmero 1:10), 5,15-5,30 (m, 1H) , 3,90 (m, 2H) , 3,76 (m, 2H) , 3,67 (m, 2H) , 3,28 (m, 1H) , 2,97-3,15 (m, 3H) , 2,84 (s, 3H) , 1,62 (m, 3H) , 0, 96 (m, 2H) , -0,03 (s, 9H) . 5-metil-3-(3-morfolin-4-il-fenil)-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-quinazolin-4-ona (156)

Passo B: O composto 156 foi preparado por reação do composto 157 de acordo com o procedimento para a preparação do composto 137 (passo final C) . m/z=483 (M+H) . A estrutura do composto 156 é mostrada abaixo.

0 composto 158 foi preparado seguindo o procedimento descrito para o composto 129, mas utilizou-se o composto 133 em vez do coposto 126. m/z= 498 (M+H). A estrutura do composto 158 é mostrada abaixo.

0 composto 159 foi preparado por reação do composto 133 de acordo com o procedimento para a preparação do composto 147. m/z=487 (M+H). A estrutura do composto 159 é mostrada abaixo.

2-[1-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-[3- (2-metoxi-etoxi)-fenil]-5-metil-3H-quinazolin-4-ona (159) 2-[1-(2-amino-9H-purin-6-ilamino)-etil]-3-[3-(2-dimetilamino-etoxi)-fenil]-5-metil-3H-quinazolin-4-ona (160) 0 composto 160 foi preparado por reação do composto 133 de acordo com o procedimento para a preparação do composto 146. m/z= 500 (M+H) . A estrutura do composto 160 é mostrada abaixo.

EXEMPLO 11 (Referência)

PREPARAÇÃO DE COMPOSTO

Os compostos com a fórmula geral I (mostrada acima) foram preparados de acordo com os passos A-D do esquema sintético intitulado "Procedimento E" mostrado abaixo. 0 Procedimento E proporciona um método alternativo adicional de preparação de compostos com uma variedade de cadeias laterais ligadas ao ligante entre os anéis de quinazolinona e purina dos compostos da invenção. Embora seja exemplificado um grupo funcional propargilo, o método ilustrado no Procedimento E é aplicável a muitos grupos funcionais conhecidos.

Procedimento E:

0 composto 161 foi preparado de acordo com os procedimentos estabelecidos nos passos A-D abaixo.

Passo A: Carregou-se um balão de fundo redondo de 100 mL com um gargalo, equipado com um agitador magnético e um condensador de refluxo com 2-aminometil-5-metil-3-fenil-3H-quinazolin-4-ona (2,91g, 11,0 mmol), benzidrilidenoamina (2,39 g, 13,2 mmol) e 1,2-dicloroetano (15 mL). A mistura de reação foi aquecida a refluxo durante 4 h sob atmosfera de azoto e depois arrefecida até à temperatura ambiente. A concentração sob pressão reduzida seguida por purificação por cromatografia em coluna proporcionou o composto 162 como um sólido cor de laranja, m.p. 49°C (dec); XH NMR (DMSO-d6) δ (ppm) 7,22-7,78 (m, 17H), 6,74 (m, 1H), 4,17 (s, 2H), 2,74 (s, 3H); m/z = 430 (M+H). A reação descrita acima e o composto 162 são mostrados abaixo.

2-[1-(Benzidrilideno-amino)-but-3-inil]-5-metil-3-fenil-3H-quinazolin-4-ona (163)

Passo B: Um balão de 25 mL de fundo redondo de um gargalo, equipado com um agitador magnético foi purgado com azoto e carregado o composto 162 (500 mg, 1,20 mmol) e THF anidro (4 mL). Uma solução 1 M de terc-butóxido de potássio em THF (1,40 mL, 1,40 mmol) foi adicionada numa única porção. Após agitação durante 20 minutos à temperatura ambiente, adicionou-se uma solução a 80% de brometo de propargilo em tolueno (210 pL, 1,89 mmol) e agitou-se a mistura de reação durante mais 15 minutos à temperatura ambiente. Adicionou-se então bicarbonato de sódio aquoso saturado (5 mL), separaram-se as camadas e extraiu-se a camada aquosa com acetato de etilo (2 x 10 mL) . Os extractos orgânicos combinados foram secos sobre sulfato de sódio, filtrados e concentrados sob pressão reduzida. A purificação do resíduo por cromatografia em coluna proporcionou o produto como um sólido amarelo. XH NMR (CD3OD) δ 7,72 (m, 2H) , 7,29-7, 67 (m, 3H) , 6,77 (m, 3H) , 4,61 (t, 1H, J = 7,1 Hz), 3,01-3,11 (m, 1H) , 2,76 (s, 3H) , 2,57 (m, 1H), 2,23 (t, 1H, J = 2,5 Hz). A reação descrita acima e o composto 163 são mostrados abaixo.

2-(l-amino-but-3-inil)-5-metil-3-fenil-3H-quinazolin-4-ona (164)

Passo C: Um balão de 50 mL de fundo redondo de um gargalo, equipado com um agitador magnético foi carregado o composto 163 (193 mg, 0,41 mmol) e éter dietilo (5 mL). Uma solução 2 N de ácido clorídrico (5 mL) foi adicionada numa porção. Após agitação durante 1,5 h à temperatura ambiente, foi adicionado cloreto de sódio (750 mg, 12,8 mmol) à mistura de reação, e a agitação continuou durante mais 10 min. O precipitado resultante foi filtrado, lavado sequencialmente com éter dietílico (0,5 mL), ácido clorídrico 2N (1 mL) e MtBE (2x1 mL). A secagem sob vácuo a 45°C durante 2 h proporcionou o produto como um sólido rosa. 1H NMR (DMSO-dg) δ 8,82 (s, 3H) , 7,79 (t, 1H, J = 7,7 Hz), 7,41-7,66 (m, 6H), 7,42 (d, 1H, J= 7,3 Hz), 3,91 9s, 1H) , 3,11 (m, 1H) , 2,87 (m, 1H) , 2,75 (s, θΓΤ, 0 . „ rn . ΊΓΤ, a reação descrita acima e o composto 3H), 2,54-2,67 (m, 1H)· ^ 164 são mostrados abaix°*

5-metil-3-feniJL-2~ t1" (9H-purin-6-ilamino) -but-3- inil]-3H-quinazolin-4-ona (161)

Passo D: 0 composto 161 foi preparado por reação do composto 164 preparado seguindo o procedimento para a preparação do composto 14 (passo D) utilizando três equivalentes de diisopropiletilamina em vez de um. ESI-MS m/z= 422 (MH+) . A reação descrita acima e o composto 161 são mostrados abaixo.

2- Γ1 — (2-aiíiino-9H-purin-6-ilamino) -but-3-inil] -5-metil-3-fenil-3H-guinazolin-4-ona (165) 0 composto 165 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 161, mas foi usada 2-amino-6-bromopurina no lugar de 6-bromopurina no passo D. ESI-MS m/z= 437 (MH+). EXEMPLO 12 (Referência)

PREPARAÇÃO DE COMPOSTO

Os compostos com a fórmula geral I (mostrada acima) foram preparados de acordo com os passos A-D do esquema sintético intitulado "Procedimento K" mostrado abaixo. 0 Procedimento K proporciona um método alternativo adicional de preparação de tais compostos através de um intermediário oxazina (passo C).

Procedimento K:

5-cloro-3-(3,5-difluoro-fenil)-2-[1-(9H-purin-6-ilamino) -etil] -3H-quinazolin-9-ona (166) 0 composto 166 foi preparado de acordo com os procedimentos estabelecidos nos passos A-E abaixo. 2-amino-6-cloro-N-(3,5-difluoro-fenil)-benzamida (167)

Passo A: 0 composto 167 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 15 (Passo A) , mas foi usado ácido 2-amino-6-clorobenzóico no lugar de ácido 2-amino-6-metilbenzóico e 3,5-difluoroanilina no lugar de anilina. A reação descrita acima e o composto 167 são mostrados abaixo.

Éster terc-butilo do ácido {1-[3-cloro-2-(3,5-difluoro-fenilcarbamoil)-fenilcarbamoil]-etil}-carbâmico (168)

Passo B: Um balão de 100 mL de fundo redondo de um gargalo, equipado com um agitador magnético e condensador de refluxo foi carregado com o composto 167 (10,6 mmol), éster de N-hidroxisuccinimida N-tert-butiloxicarbonil-D,L-alanina (3,64 g, 12, mmol), 4-N,N-dimetilaminopiridina (710 mg, 5,82 mmol) e crivos moleculares 4Ã (3,00 g) . O balão foi purgado com azoto, e tolueno anidro (15 mL) e N,N-diisopropiletilamina (1,64 g, 2,22 mmol) foi adicionada. A mistura de reação foi aquecida a 90°C durante 7 h, e a suspensão resultante filtrou-se a quente. A concentração do filtrado sob pressão reduzida proporcionou um sólido castanho claro, o qual foi purificado por cromatografia em coluna (gel de silica, EtOAc/hexanos). Isto proporcionou um rendimento de 86% do composto 168 na forma de um sólido branco, m.p. 194-196°C (dec.); 1H NMR (DMSO-ds) δ (ppm) 10,96 (s, 1H) , 9,46 (s, 1H) , 7,84 (d, 1H, J = 7,8 Hz), 7,51-7,36 (m, 4H) , 7,19 (d, 1H, J = 6,8 Hz), 6,99 (t, 1H, J = 9,3 Hz), 4,10 (t, 1H, J = 7,0 Hz), 1,31 (s, 9H) , 1,16 (d, 3H, J = 6,9 Hz); m/z = 454 (M+H) . A reação descrita acima e o composto 168 são mostrados abaixo.

Éster terc-butilo do ácido {1-[5-cloro-4-(3,5— difluoro-fenilimino)-4H-benzo[d][1,3]oxazin-2-il]-etil}-carbâmico (169)

Passo C: Um balão de 100 mL de fundo redondo de três gargalos, equipado com um agitador magnético e termómetro foi purgado com azoto e carregado com o composto 168 (3,30 mmol), cloreto de metileno anidro (25 mL) e N,N-diisopropiletilamina (4,60 g, 35,7 mmol) e trifenilfosfina (3,98 g, 15,2 mmol). A mistura de reação foi então arrefecida a 0-5°C num banho de gelo/água. Adicionou-se então iodo (3,61 g, 14,2 mmol) em porções à mistura de reação ao longo de 1 h. Uma vez completada a adição, removeu-se o banho de arrefecimento e agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante mais 30 minutos. A reação foi então interrompida com carbonato de potássio aquoso a 10% (25 mL) , a camada orgânica foi separada, seca sobre sulfato de sódio, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. A cromatografia em coluna do sólido resultante (gel de sílica, EtOAc/hexanos) deu um rendimento de 52% do composto 169 como um sólido branco, m.p. 117-118°; 1H NMR (DMSO-de) δ (ppm) 7,72-7,60 (m, 2H) , 7,42 (dd, 1H, J = 7,6 Hz, 1,3 Hz), 7,31 (d, 1H, J = 7,0 Hz), 6,95 (t, 1H, J = 9,3 Hz), 6,82 (m, 2H) , 4,27 (m, 1H), 1,33 (s, 9H), 1,28 (d, 3H, J = 7,2 Hz); m/z = 436 (M+H). A reação descrita acima e o composto 169 são mostrados abaixo.

2-(1-amino-etil)-5-cloro-3-(3,5-difluoro-fenil)-3H-quinazolin-4-ona (170)

Passo D: Uma solução do composto 169 (1,68 mmol) em piperidina (2 mL) foi agitada durante 3 h à temperatura ambiente. A evaporação da mistura de reação até à secura sob alto vácuo forneceu uma espuma amarela. Esta espuma foi dissolvida numa solução 4M de cloreto de hidrogénio em 1,4-dioxano (4 mL) e agitada durante 17 h à temperatura ambiente. A mistura de reação foi então concentrada até à secura, basificada com carbonato de potássio aquoso a 10% (40 mL) e extracção com MTBE (3 x 20 mL) . Combinando os extractos orgânicos, secando sobre sulfato de sódio e concentrando até à secura obteve-se um resíduo sólido. Este resíduo foi dissolvido em d-clorofórmio (5 mL) e aquecido durante 15 h a 50°C. Depois de arrefecer até à temperatura ambiente, a mistura de reação foi lavada com água (3 x 10 mL), seca sobre sulfato de sódio e evaporada até à secura, proporcionando um rendimento de 98% do composto 170 como um sólido branco, m.p. 200-202°C; XH NMR (CDC13) δ (ppm) 7,65 (m, 2H) , 7,49 (m, 1H) , 7,01 (t, 1H, J = 6,6 Hz), 6,89 (m, 2H) , 3,68 (m, 1H) , 1,33 (d, 3H, J = 6, 6 Hz), 1,25 (s, 2H); m/z = 336 (M+H). A reação descrita acima e o composto 170 são mostrados abaixo.

5-cloro-3-(3,5-difluoro-fenil)-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-quinazolin-9-ona (166)

Passo E: O composto 166 foi preparado por reação do composto 170 de acordo com o procedimento para a preparação do composto 107 (procedimento final) . ESI-MS m/z 454,3 (MH+) . A reação descrita acima e o composto 166 são mostrados abaixo.

0 composto 171 foi preparado seguindo o procedimento geral para o composto 161 (passos A-E), mas o éster 2,5-dioxo- pirrolidin-l-ilo do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino-butirico substituiu o éster de N-hidroxissuccinimida N-terc-butiloxicarbonil-D,L-alanina no passo B e 2-amino-6-bromopurina foi usada no lugar de 6-bromopurina no passo E. ESI-MS m/z 459,3 (MH+). A estrutura do composto 171 é mostrada abaixo.

ίΠϋ

0 composto 172 foi preparado seguindo o procedimento geral para o composto 161 (passos A-E) , mas a 2-amino-6- bromopurina foi usada no lugar de 6-bromopurina no passo E. A estrutura do composto 172 é mostrada abaixo.

3-(3,5-difluoro-fenil)-6-fluoro-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-etil]-3H-quinazolin-4-ona (173) 0 composto 173 foi preparado utilizando o procedimento geral descrito acima com respeito ao composto 161 (passos A-E), mas foi usado ácido 2-amino-5-fluorobenzóico no lugar de ácido 2-amino-6-clorobenzóico no passo A. ESI-MS m/z= 438,2 (MH+) . A estrutura do composto 173 é mostrada abaixo.

(173) 5-cloro-3-(2,6-difluoro-fenil)-2-[1-(9H-purin-6-ilamino)-propil]-3H-quinazolin-4-ona (174) 0 composto 174 foi preparado seguindo o procedimento geral para o composto 161 (passos A-E), mas o 2,6-

difluoroanilina substituiu anilina no passo A e 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo de 2-terc-butoxicarbonilamino-butírico foi usada no lugar de éster de N-hidroxisuccinimida de N-terc-butiloxicarbonil-D,L-alanina. ESI-MS m/z 468,2 (MH+) . A estrutura do composto 174 é mostrada abaixo.

{%*} 4} 2-[1-(2-amino-9H-purin-6-alamino)-propil]-5-cloro- 3-(2,6-difluoro-fenil)-3H-quinazolin-4-ona (175) 0 composto 174 foi preparado seguindo o procedimento geral para o composto 161 (passos A-E), mas o 2,6- difluoroanilina substituiu anilina no passo A, éster 2,5-dioxo-pirrolidin-l-ilo de 2-terc-butoxicarbonilamino-butírico foi usado no lugar de éster de N-hidroxisuccinimida de N-terc-butiloxicarbonil-D,L-alanina no passo B, e 2-amino-6-bromopurina foi usadan o lugar de 6-bromopurina no passo E. ESI-MS m/z 483,2 (MH+) . A estrutura do composto 175 é mostrada abaixo.

U7S! EXEMPLO 13 (Referência)

PREPARAÇÃO DE COMPOSTO

Os compostos com a fórmula geral I (mostrada acima) foram preparados de acordo com os passos A-G do esquema sintético intitulado "Procedimento L" mostrado abaixo.

5-metil-3-fenil-2-[1-(9H-purin-6-ilóxi)-etil]-3H-quinazolin-4-ona (176) 0 composto 17 6 foi preparado de acordo com os procedimentos estabelecidos nos passos A-G abaixo. Éster 1-(3-metil-2-fenilcarbamoil-fenilcarbamoil)-etilo de ácido acético (177)

Passo A: Adicionou-se cloreto de cloreto (S)-2-acetoxipropionilo (5,469 g, 36,32 mmol) a uma solução do composto 15 (6, 788 g, 30 mmol) em diclorometano (150 mL) .

Formou-se imediatamente um precipitado. A reação foi agitada durante 25 h e o precipitado foi filtrado. O filtrado foi lavado com solução saturada de bicarbonato de sódio (3 x 50 mL) e seco (MgS04) . A filtração e a concentração do filtrado forneceram um sólido castanho (7,6 g) . A purificação por cromatografia flash (1:2 EtOAc:hexanos-> EtOAc-> 10:1

EtOAc:MeOH) seguida por recristalização das fracções impuras a partir de EtOAc:hexanos forneceu o composto 177 como um sólido. ESI-MS m/z= 341 (MH+) . A reação descrita acima e o composto 177 são mostrados abaixo.

Éster_1- (5-metil-4-fenilimino-4H-benzo [d] [1,3] — oxazin-2-il)-etilo de ácido acético (178)

Passo B: Dissolveu-se o composto 177 (0,34 g, 1,0 mmol) em diclorometano (25 mL). Adicionou-se trifenilfosfina (1,311 g, 5 mmol) à solução, seguida de iodo (1,269 g, 5 mmol) e DIEA (1,9 mL, 11 mmol). A reação foi tapada e agitada durante 4 dias. A reação foi interrompida pela adição de uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio (25 mL). A camada orgânica foi separada, seca sobre (MgS04) filtrada e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para fornecer uma goma castanha escura (2,886 g) A purificação por cromatografia flash (CH2C12) forneceu o composto 178 imino-1,3-oxazina como um óleo amarelo. ESI-MS m/z= 323 (MH+) . A reação descrita acima e o composto 178 são mostrados abaixo.

Éster_l-metil-2- (3-metil-2-fenilcarbamoil- fenilimino)-2-piperid.in-l-il-etilo de ácido acético (179)

Passo C: Adicionou-se piperidina (1 mL) ao composto 178 (0,161 g, 0,5 mmol) e agitou-se a mistura de reação durante 19,5 h. A mistura de reação foi então concentrada sob pressão reduzida para dar uma goma amarela. A trituração com 1:4 EtOAc:hexanos forneceu uma pequena quantidade de composto 179 (0,041 g) . A cromatografia rápida (1:4 EtOAc:hexanos) do filtrado forneceu apenas uma mistura parcialmente separável dos produtos esperados, o composto 179 de acetoxiquinazolinona e a hidroxiquinazolinona (massa total 0,122 g) . ESI-MS m/z= 408 (MH+) . A reação descrita acima e o composto 179 são mostrados abaixo.

Éster_1- (5-metil-4-oxo-3-fenil) -3,4-dihidro- quinazolin-2-il)-etilo de ácido acético (180)

Passo D: Dissolveu-se o composto 179 (0,037 g, 0,09 mmol) em acetonitrilo (10 mL) e aqueceu-se a mistura de reação ao refluxo durante 3 h. O solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo dissolvido numa mistura de acetato de etilo (10 mL) e HCl 1M (5 mL) . Após separação da camada aquosa, lavou-se a camada orgânica com HCl 1M (2x5 mL) , solução saturada de bicarbonato de sódio (3x5 mL) , água (2x5 mL) e salmoura saturada (5 mL) . A solução foi seca (MgS04) , filtrada e o filtrado concentrado sob pressão reduzida para fornecer o composto 180. ESI-MS m/z = 323 (MH+) . O produto estava quase totalmente racémico neste ponto (pureza quiral era 46:54 S:R). A reação descrita acima e o composto 180 são mostrados abaixo.

2-(1-hidroxi-etil)-5-metil-3-fenil-3H-quinazolin-4- ona (181)

Passo E: Dissolveu-se o composto 180 (0,011 g, 0,034 mmol) em metanol (2 mL) e adicionou-se carbonato de poti^sio (0,012 g, 0,085 mmol). A mistura de reação foi agitada durante 20 min, e depois foi adicionada água (20 mL) . A mistura foi extraída com acetato de etilo (3 x 10 mL) e os extractos orgânicos combinados foram lavados com salmoura saturada (10 mL) . A solução foi seca (MgSCL) , filtrada e o filtrado concentrado sob pressão reduzida para fornecer o composto 181. ESI-MS m/z = 281 (MH+) . A reação descrita acima e o composto 181 são mostrados abaixo.

5-metil-3-fenil-2-{l-[9-(2-trimetilsilanil-etoximetil)-9H-purin-6-iloxi]-etil}-3H-quinazolin-4-ona (182)

Passo F: Tratou-se uma solução do composto 181 (0,069 g, 0,25 mmol) em THF (5 mL) com hidreto de sódio (0, 007 g, 0,27 mmol) e agitou-se durante 10 min. Adicionou-se à mistura de reação uma solução do composto intermediário 13 (0,077 g, 0,27 mmol) em THF (1 mL) . O balão contendo originalmente o composto intermediário 13 foi lavado com THF adicional (1 mL) e as lavagens foram também adicionadas à mistura de reação. Deixou-se prosseguir a reação e adicionou-se mais hidreto de sódio (0,005 g, 0,21 mmol) a 21,5 h e 23 h. A reação foi interrompida após um total de 24 h por adição de solução saturada de cloreto de amónio (5 mL). A mistura foi extraída com diclorometano (3x5 mL) , e os extractos orgânicos combinados foram secos sobre MgS04. Após filtração, o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida e o resíduo foi purificado por cromatografia flash (1:1 EtOAc hexanos -> 3:2 EtOAc:hexanos) para fornecer o composto 182. ESI-MS m/z = 529 (MH+). A reação descrita acima e o composto 182 são mostrados abaixo.

5-Metil-3-fenil-2-[1-(9H-purin-6-iloxi)-etil]-3H-cfuinazolin-4-ona (176)

Dissolveu-se o composto 182 (0,053 g, 0,1 mmol) numa mistura de metanol (2 mL) e HC1 4M (2 mL). A mistura de reação foi agitada e aquecida a 40°C durante 3h. A mistura de reação foi removida da fonte de calor e deixada arrefecer. A mistura de reação foi então filtrada através de um tampão de papel de filtro GFA (fibra de vidro) e o filtrado foi concentrado para remover apenas o metanol. O resíduo foi ajustado para pH 10 por adição de solução de carbonato de potássio a 10%. O sólido resultante foi recolhido por filtração e purificado por RP-HPLC (coluna C18 Luna, 10x250 mm, 4,7 mL/min, CH3CN 10-90% em água em 18 min, com todos os solventes contendo 0,05% de ácido fórmico) para fornecer o composto 176 como um sólido branco fofo após liofilização. 1H NMR (400 MHz, d6-DMSO) δ 13,40, br s, 1H; 8,40, s, 1H; 8,35, s, 1H; 7,66, t, J = 7,8 Hz, 1H; 7,48 - 7,58, m, 4H; 7,31-7,36, m, 2H; 7,20 - 7,23, m, 1H; 5,65, q, J = 6,6 Hz, 1H; 2,73, s, 3H; 1,65, d, J = 6,6 Hz, 3H. ESI-MS m/z= 399 (MH+) . A reação descrita acima e o composto 17 6 são mostrados abaixo.

EXEMPLO 14

Ensaios Bioquímicos de Potência e Selectividade PI3K

Ensaio Bioquímico utilizando μΜ ATP

Utilizando o método descrito no Exemplo 2, os compostos da invenção foram testados quanto à actividade inibitória e à potência contra PI3K5, e para a selectividade para PI3K8 em relação a outras isoenzimas PI3K de Classe I. Na Tabela 1, os valores de IC50 (mM) são fornecidos para Ρΐ3Κδ ("Delta") e podem ser calculados para as outras isoformas utilizando as proporções de valores de IC5o discutidos abaixo. Para ilustrar a selectividade dos compostos, as proporções dos valores de IC50 dos compostos para Pl3Ka, ΡΙ3Κβ e Ρΐ3Κγ em relação a PI3K5 são dadas, respectivamente, como "Proporção Alfa/Delta", "Proporção Beta/Delta" e "Proporção Gsmma/Delta".

Os ensaios de selectividade iniciais foram realizados de forma idêntica ao protocolo de ensaio de selectividade no Exemplo 2, excepto utilizando 100 mL de Ecoscint para detecção radiomarcada. Os ensaios de selectividade subsequentes foram realizados de forma semelhante utilizando stocks de substrato 3X, excepto que continham 0,05 mCi/mL γ[32 P]ATP e 3 mM PIP2. Os ensaios subsequentes de selectividade também utilizaram os mesmos stocks de enzima 3X, excepto que agora continham 3 nM de qualquer isoforma PI3K dada.

Para todos os ensaios de selectividade, os compostos de teste foram pesados e dissolvidos em stocks de 10-50 mM em DMSO a 100% (dependendo das respectivas solubilidades) e armazenados a -20°C. Os compostos foram descongelados (à temperatura ambiente ou 37°C), diluídos para 300 μΜ em água a partir dos quais foi feita uma série de diluição de 3 vezes em água. A partir destas diluições, adicionaram-se 20 mL às cavidades de ensaio ao longo dos "water blanks" utilizados para o controlo da enzima (positivo) e do controlo sem enzima (fundo). O restante do ensaio foi realizado essencialmente de acordo com o protocolo de ensaio de selectividade no Exemplo 2. _ Tabela 1 _ _

EXEMPLO 15

Dados de ensaio baseados em células para inibidores da actividade de PI3K5

Usando os métodos descritos no Exemplo 2, os compostos da invenção foram testados para a actividade inibidora e potência num ensaio de neutrófilos (PMN) a libertação de elastase. Os dados destes ensaios estão apresentados na Tabela 1. Na Tabela 1, os valores mostrados são concentrações eficazes do composto (EC50; μΜ) .

Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência especifica a certas formas de realização preferidas, podem ser realizadas outras modificações no âmbito da invenção tal como é definido nas reivindicações abaixo. Consequentemente, não devem ser colocadas limitações na invenção para além das especificamente citadas nas reivindicações.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

Claims (12)

REIVINDICAÇÕES

1. Um sal farmaceuticamente aceitável do composto:

em que o sal farmaceuticamente aceitável é selecionado do grupo que consiste em hidrocloreto, hidrobrometo, iodidrato e sal de fosfato.

2. 0 sal farmaceuticamente aceitável de acordo com a reivindicação 1, em que o sal farmaceuticamente aceitável é o sal hidrocloreto.

3. 0 sal farmaceuticamente aceitável de acordo com a reivindicação 1 em que o composto é o enantiómero S.

4. 0 sal farmaceuticamente aceitável de acordo com a reivindicação 1 em que o composto é

e o sal farmaceuticamente aceitável é o sal hidrocloreto.

5. Uma composição farmacêutica compreendendo um sal farmaceuticamente aceitável de acordo com a reivindicação 1 e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

6. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, em que o sal farmaceuticamente aceitável é o sal hidrocloreto.

7. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, em que o composto é o enantiómero S.

8. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, em que o sal farmaceuticamente aceitável é o sal hidrocloreto.

9. Um kit que compreende o sal f armaceuticamente aceitável de acordo com a reivindicação 1.

10. O kit de acordo com a reivindicação 9, em que o sal farmaceuticamente aceitável é o sal hidrocloreto.

11. O kit de acordo com a reivindicação 9 em que o composto é o enantiómero S.

12. O kit de acordo com a reivindicação 11, em que o sal farmaceuticamente aceitável é o sal hidrocloreto. REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor, a mesma não faz parte do documento da patente Europeia, ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o EPO declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição.

Literatura que não é de patentes, citada na Descrição