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KR20210013107A - 항-muc1 항체-약물 접합체 - Google Patents

항-muc1 항체-약물 접합체 Download PDF

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KR20210013107A
KR20210013107A KR1020207036382A KR20207036382A KR20210013107A KR 20210013107 A KR20210013107 A KR 20210013107A KR 1020207036382 A KR1020207036382 A KR 1020207036382A KR 20207036382 A KR20207036382 A KR 20207036382A KR 20210013107 A KR20210013107 A KR 20210013107A
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KR
South Korea
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antibody
amino acid
acid sequence
seq
cancer
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KR1020207036382A
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요한나 겔러트
안케 플레히너
도렌 바이겔트
안테 다니엘칙
아키코 나가세
Original Assignee
다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
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Publication date
Application filed by 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 filed Critical 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 암 항원 MUC1 에 대해 지향되는 항체 약물 접합체에 관한 것이다. 특히, 공지된 항-MUC1 항체의 CDR-H2 에서 글리코실화 부위를 결실시킴으로써 항원 결합이 개선된 항체가 수득되었다 접합체는 항 MUC1 항체에 커플링된 엑사테칸 유도체로 이루어진다.

Description

항-MUC1 항체-약물 접합체
본 발명은 항체 약물 접합체 (ADC) 의 분야와 관련된다. 본 발명의 ADC 는 항-MUC1 항체 또는 돌연변이된 항-MUC1 항체를 포함한다. 항원 결합 친화성이 증가된 돌연변이된 항-MUC1 항체를 포함하는 ADC 가 제공된다. 특히, 인간화 항체 PankoMab 의 돌연변이된 버전에서 중쇄 가변 영역의 아스파라긴 57 은 또다른 아미노산에 의해 치환된다. 그에 의해, CDR2 영역에서의 글리코실화 부위는 결실되고 항원 결합 친화성은 증가된다. ADC 는 유의한 항-종양 효능을 보였다. 특별한 구현예에서, 본 발명은 이러한 항체 약물 접합체의 치료적 및 진단적 용도 및 그러한 항체 약물 접합체의 생산 방법에 관한 것이다.
종양-연관 항원에 대한 항체는 암에 대한 치료제로 광범위하게 사용된다. 오늘날, 많은 항-암 항체가 인간 요법에 대해 승인되었다. 이들 항체 중 일부는 특이적 암 세포의 생존 또는 증식에 핵심적인 일정 신호전달 경로를 차단함으로써 작용한다. 다른 항-암 항체는 예를 들어 자연 살해 세포를 통한 항체-의존적 세포의 세포독성 (ADCC)을 개시시켜서, 표적화된 암 세포에 대항하여 환자의 면역 반응을 활성화시킨다. 이러한 기전은 면역 세포 상의 Fc 수용체에 항체의 Fc 부분의 결합을 통해 유도된다.
흥미롭고 중요한 항체군은 뮤신 단백질에 대한 것들이다. 뮤신은 척추동물에서 많은 상피 조직에 의해 생성되는 고분자량의 심하게 글리코실화된 단백질 패밀리이다. 그들은 원형질막 내에서 체류에 유리한 소수성 막-스패닝 도메인의 존재로 인해 막-결합된 뮤신 단백질, 및 점막 표면 상에 분비되거나 또는 분비되어 타액 성분이 되는 뮤신으로 세분될 수 있다. 인간 뮤신 단백질 패밀리는 막 결합 MUC1을 포함하여, 많은 패밀리 구성원으로 이루어진다.
증가된 뮤신 생산이 췌장, 폐, 유방, 난소, 결장 등의 암을 포함하여, 많은 선암종에서 일어난다. 뮤신은 또한 폐 질환 예컨대 천식, 기관지염, 만성 폐쇄성 폐 질환 또는 낭성 섬유증에서도 과발현된다. 2종의 막 뮤신, MUC1 및 MUC4는 질환 과정에서 그들의 병적 연루성에 관하여 광범위하게 연구되어 왔다. 게다가, 또한 뮤신은 진단 마커로서 그들의 가능성에 대해 조사되고 있다. 뮤신 단백질 (Clin. Cancer Res., 2011 Nov 1;17(21):6822-30, PLoS One, 2011 Jan 14;6(1):e15921), 특히 MUC1에 대한 몇몇 항체가 당분야에 공지되어 있다. 그러나, 그들의 치료적 효능은 여전히 개선시킬 수 있다.
이에 비추어, 개선된 특성을 갖는 치료적 항-MUC1 항체를 제공할 필요가 당해 기술분야에 존재한다.
ADC 는 표적화되는 세포로 페이로드를 특이적으로 전달하는 것을 책임지는 세 가지 상이한 성분 (항체, 링커, 및 약물/페이로드) 으로 이루어진다. 지금까지, 네 가지 ADC (젬투주맙 오조가미신 (Mylotarg®), 이노투주맙 오조가미신 (Besponsa®), 브렌투주맙 베도틴 (Adcetris®), 트라스투주맙 엠타신 (T-DM1; Kadcyla®)) 가 시장에 진출했다. 또한, 광범위한 혈액암 및 고형 종양을 표적화하는 60 개가 넘는 ADC 가 개발되고 있다. ADC 는 신규한 암 화학요법을 위한 새로운 패러다임을 창출했다. 모노클로날 항체의 특이성 및 소분자 약물의 세포독성 능력으로, ADC 는 정밀 의학 뿐만 아니라 조합 치료의 미래의 큰 부분임을 약속한다. 따라서 추가의 ADC 의 제공 및 및/또는 질환의 치료 및/또는 진단에 관한 수단, 방법 및 용도에 대한 지속적인 필요가 존재한다.
ADC 로서, 엑사테칸이 항체 (예를 들어 항-HER2 항체) 에 링커를 통해 접합되어 있는 ADC 가 공지되어 있다 (WO2014/057687, WO2015/115091). 그러나, 엑사테칸이 항-MUC1 항체에 접합되어 있는 ADC 는 공지되지 않았다.
본 발명의 요약
본 발명자는 항-MUC1 항체 PankoMab의 중쇄 가변 영역 내 글리코실화 부위의 결실이 항원 결합을 폐기시키지 않았지만, 예상치 않게 항체의 항원 친화성을 증가시켰다는 것을 발견하였다. 이것은 글리코실화 부위가 중쇄 가변 영역의 제2 상보성-결정 영역 (CDR-H2)에 위치하므로 특히 놀라웠다. CDR은 항원 결합에 직접적으로 관여하고 에피토프와의 접촉을 제공하는 항체의 영역이다. 그러므로, 일반적으로 CDR의 아미노산의 변형은 항원 결합 친화성에 불리할 것으로 예상된다. 인간화 PankoMab 항체는 거대한 탄수화물 구조를 보유하는, CDR-H2 내 글리코실화 부위를 추가로 포함한다. 이러한 탄수화물 구조는 항원에 대한 결합 계면에 직접적으로 존재하며, 그러므로 항원 결합에 관여하는 것으로 여겨졌었다. 그러나, 실시예에서 입증된 바와 같이, 탄수화물 구조를 보유하는 아미노산을 치환시켜 글리코실화 부위를 결실시킨 PankoMab 변이체 (PM-N54Q)는 증가된 항원 결합 친화성을 나타낸다. 또한, 본 발명자들은 PankoMab 또는 PankoMab 변이체 (PM-N54Q) 를 포함하는 접합체 또는 항체-약물 접합체 (ADC) 는 MUC1 양성 종양에 대해 유의한 항-종양 효능을 나타내고, PM-N54Q-ADC 는 PankoMab-ADC 와 비교하여 유의한 항-종양 효능을 보인다는 것을 발견했다.
그러므로, 제 1 양상에서, 본 발명은 세포독성제에 접합된 항체를 포함하는 접합체로서, 항체는 MUC1 에 결합할 수 있고, 항체는
(i) 상보성-결정 영역 (CDR) 으로서 SEQ ID NO: 1 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 SEQ ID NO: 3 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3 을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) 상보성-결정 영역 (CDR) 으로서 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, SEQ ID NO: 5 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 및 SEQ ID NO: 6 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3 을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 접합체에 관한 것이다.
제 2 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
제 3 양상에 따르면, 본 발명은 의학에서, 특히 암의 치료, 예방 또는 진단에서 사용을 위한 본 발명에 따른 조성물 또는 접합체를 제공한다.
제 4 양상에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 암에 걸린 대상체에게 치료 유효량의 본 발명에 따른 접합체를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
제 5 양상에서, 본 발명은 MUC1 연관 장애 예컨대 암의 진단, 검출 또는 모니터링에서 유용한 본 발명에 따른 접합체를 포함하는 키트 또는 장치 및 관련된 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적, 특성, 장점 및 양상은 하기 설명 및 첨부된 청구항을 통해서 당업자에게 자명해질 것이다. 그러나, 하기 설명, 첨부된 청구항, 및 본 출원의 바람직한 구현예를 의미하는 특별한 실시예는 오직 예시로서 제공된다는 것을 이해해야 한다. 개시된 발명의 사조 및 범주 내에서 다양한 변화 및 변형은 하기를 읽은 당업자에게 쉽게 자명해 질 것이다.
정의
본 명세서에서 사용되는 하기 표현들은 일반적으로 그들이 사용되는 문맥에서 달리 표시되는 정도를 제외하고, 바람직하게는 하기 기재된 바와 같은 의미를 갖는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 사용되는 표현 "포함하다"는 이의 문자 그대로의 의미 이외에, 또한 표현 "본질적으로 이루어지다" 및 "이루어지다"를 포함하고 특별히 이를 의미한다. 따라서, 표현 "포함하다"는 특별히 열거된 구성요소를 "포함하는" 주제가 추가의 구성요소를 포함하지 않는 구현예를 비롯하여 특별히 열거된 구성요소를 "포함하는" 주제가 추가 구성요소를 포함할 수 있고/있거나 실제로 포괄하는 구현예를 의미하는 것이다. 유사하게, 표현 "가지다"는 또한 표현 "본질적으로 이루어지다" 및 "이루어지다"를 포함하고 특별히 이를 의미하는, 표현 "포함하다"로서 이해되어야 한다. 가능한 경우 용어 "본질적으로 이루어지다"는 특히 주제가 본질적으로 이루어지는 특별히 열거된 구성요소이외에도 그 주제가 20% 이하, 특히 15% 이하, 10% 이하 또는 특히 5% 이하의 추가 구성요소를 포함하는 구현예를 의미한다.
용어 "항체"는 특히 디술피드 결합으로 연결된 적어도 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 단백질을 의미한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 중쇄 불변 영역 (CH)으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (VL) 및 경쇄 불변 영역 (CL)으로 구성된다. 중쇄-불변 영역은 3개 또는 - IgM- 또는 IgE-유형 항체의 경우에 - 4개의 중쇄-불변 도메인 (CH1, CH2, CH3 및 CH4)을 포함하고, 여기서 제1 불변 도메인 CH1 은 가변 영역에 인접하고 힌지 영역에 의해 제2 불변 도메인 CH2 에 연결될 수 있다. 경쇄-불변 영역은 오직 하나의 불변 도메인으로 이루어진다. 가변 영역은 보다 보존된, 프레임워크 영역 (FR)이라고 하는 영역 사이에 배치된 상보성 결정 영역 (CDR)이라고 하는 초가변성 영역으로 더욱 세분될 수 있으며, 각각의 가변 영역은 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 중쇄 불변 영역은 임의 유형 예컨대 γ-, δ-, α-, μ- 또는 ε-유형 중쇄일 수 있다. 바람직하게, 항체의 중쇄는 γ-사슬이다. 더 나아가서, 경쇄 불변 영역도 역시 임의 유형 예컨대 κ- 또는 λ-유형 경쇄일 수 있다. 바람직하게, 항체의 경쇄는 κ-사슬이다. 용어 "γ (δ-, α-, μ- 또는 ε) 유형 중쇄" 및 "κ- (λ) 유형 경쇄"는 천연 발생 중쇄 또는 경쇄 불변 영역 아미노산 서열, 특히 인간 중쇄 또는 경쇄 불변 영역 아미노산 서열로부터 유래된 불변 영역 아미노산 서열을 가지는, 각각 항체 중쇄 또는 항체 경쇄를 의미한다. 특히, γ 유형 (특히 γ1-유형) 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열은 인간 γ (특히 인간 γ1) 항체 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열과 적어도 95%, 특히 적어도 98%가 동일하다. 더 나아가서, κ 유형 경쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열은 인간 κ 항체 경쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열과 특히 적어도 95%, 특히 적어도 98%가 동일하다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적인 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)을 포함하여, 숙주 조직 또는 인자들에 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 항체는 예를 들어 인간화, 인간 또는 키메라 항체일 수 있다.
일반적으로 항체의 항원-결합 부분은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 전체 길이를 의미한다. 항체의 항원-결합 기능은 전체 길이 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다는 것이 확인되었었다. 항체의 결합 단편의 예는 Fab 단편으로서, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편; F(ab)2 단편으로서, 힌지 영역에서 디술피드 브릿지에 의해 연결된, 각각 동일 항원에 결합하는 2개 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 팔부의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; 및 VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편을 포함한다.
항체의 "Fab 부분"은 특히 중쇄 및 경쇄 가변 영역 (VH 및 VL) 및 중쇄 및 경쇄 불변 영역 (CH1 및 CL)의 제1 도메인을 포함하는 항체의 일부분을 의미한다. 항체가 모든 이들 영역을 포함하지 않는 경우라면, 용어 "Fab 부분"은 단지 항체에 존재하는 영역 VH, VL, CH1 및 CL 의 것들을 의미한다. 바람직하게, "Fab 부분"은 항체의 항원 결합 활성을 함유하는 파파인으로 천연 항체를 분해하여 수득된 단편에 상응하는 항체의 일부분을 의미한다. 특히, 항체의 Fab 부분은 항원 결합 부위 또는 이의 항원 결합 능력을 포괄한다. 바람직하게, Fab 부분은 항체의 VH 영역을 포함한다.
항체의 "Fc 부분"은 특히 중쇄 불변 영역 2, 3 및 - 적용가능한 경우에 - 4 (CH2, CH3 및 CH4)를 포함하는 항체의 부분을 의미한다. 특히, Fc 부분은 2개의 각각의 이들 영역을 포함한다. 항체가 모든 이들 영역을 포함하지 않는 경우라면, 용어 "Fc 부분"은 단지 항체에 존재하는 영역 CH2, CH3 및 CH4 의 것을 의미한다. 바람직하게, Fc 부분은 항체의 적어도 CH2 영역을 포함한다. 바람직하게, "Fc 부분"은 항체의 항원 결합 활성을 함유하지 않는 파파인으로 천연 항체를 분해하여 수득된 단편에 상응하는 항체의 부분을 의미한다. 특히, 항체의 Fc 부분은 Fc 수용체에 결합할 수 있고, 따라서 예를 들어 Fc 수용체 결합 부위 또는 Fc 수용체 결합 능력을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항체" 및 "항체 구성체"는 일정 구현예에서 동일 종류의 각각 항체 또는 항체 구성체의 개체군을 의미한다. 특히, 개체군의 모든 항체 또는 항체 구성체는 그 항체 또는 항체 구성체를 정의하기 위해 사용되는 특성을 나타낸다. 일정 구현예에서, 개체군 중 모든 항체 또는 항체 구성체는 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 특별한 항체 종류, 예컨대 MUC1에 특이적으로 결합할 수 있는 항체에 대한 언급은 특히 이러한 종류의 항체 개체군을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 또한 상기 항체의 단편 및 유도체를 포함한다. 항체의 "단편 또는 유도체"는 특히 상기 항체로부터 유래된 단백질 또는 당단백질이고 동일 항원, 특히 항체와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 항체의 단편 또는 유도체는 일반적으로 기능성 단편 또는 유도체를 의미한다. 특히 바람직한 구현예에서, 항체의 단편 또는 유도체는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 항체의 항원-결합 기능은 전체 길이 항체의 단편 또는 이의 유도체에 의해 수행될 수 있다는 것이 확인되었었다. 항체의 단편의 예는 (i) Fab 단편으로서, 가변 영역 및 각각의 중쇄 및 경쇄의 제1 불변 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab)2 단편으로서, 힌지 영역에서 디술피드 브릿지에 의해 연결된 2개 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) 중쇄의 제1 불변 도메인 CH1 및 가변 영역으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 팔부의 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로 이루어진 Fv 단편; (v) scFv 단편으로서, 단일 폴리펩티드 사슬로 이루어진 Fv 단편; (vi) 함께 공유적으로 연결된 2개 Fv 단편으로 이루어진 (Fv)2 단편; (vii) 중쇄 가변 도메인; 및 (viii) 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 회합이 분자내에서가 아니라 분자간에서만 일어날 수 있도록 하는 방식으로 함께 공유적으로 연결된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역으로 이루어진 멀티바디. 항체의 유도체는 특히 부모 항체와 동일한 항원에 결합하거나 또는 그와 경쟁하지만, 이것이 유도된 부모 항체와 상이한 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함한다. 이들 항체 단편 및 유도체는 당업자에게 공지된 통상의 기술을 사용해 수득된다.
표적 아미노산 서열은 표적 아미노산 서열이 이의 전체 길이 상에서 기준 아미노산 서열의 상응하는 부분과 적어도 75%, 보다 바람직하게 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 상동성 또는 동일성을 공유한다면 기준 아미노산 서열"로부터 유래"되거나 또는 그에 "상응한다". "상응하는 부분"은 예를 들어, 표적 항체의 중쇄 가변 영역 (FRH1)의 프레임워크 영역 1이 기준 항체의 중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역 1에 상응한다는 것을 의미한다. 특정 구현예에서, 기준 아미노산 서열로부터 "유래"되거나 또는 "상응하는" 표적 아미노산 서열은 이의 전체 길이 상에서 기준 아미노산 서열의 상응하는 부분과 100% 상동성이거나, 또는 특히 100% 동일하다. 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열의 "상동성 (homology)" 또는 "동일성 (identity)"은 바람직하게는 상동성 또는 동일성이 정의된 서열에 상응하는 기준 서열의 상응하는 부분의 전체 길이 상에서 또는 기준 서열의 전체 길이 상에서 본 발명에 따라서 결정된다. 하나 이상의 아미노산 서열, 예컨대 특이적 CDR 서열 또는 특이적 가변 영역 서열로 정의되는 부모 항체로부터 유래된 항체는 특히 부모 항체의 개별 아미노산 서열과 적어도 75%, 바람직하게 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%가 상동성이거나 또는 동일하고, 특히 동일한, 아미노산 서열, 예컨대 CDR 서열 또는 가변 영역 서열을 갖는 항체이다. 일정 구현예에서, 부모 항체로부터 유래된 (즉, 이의 유도체인) 항체는 부모 항체와 동일한 CDR 서열을 포함하지만, 가변 영역의 나머지 서열은 상이하다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 또한 다가 및 다중특이적 항체, 즉 각각 동일 에피토프에 결합하는 2개 초과의 결합 부위를 갖는 항체 구성체 및 제1 에피토프에 결합하는 하나 이상의 결합 부위 및 제2 에피토프에 결합하는 하나 이상의 결합 부위, 및 임의로 추가 에피토프에 결합하는 추가 결합 부위를 갖는 항체 구성체를 의미한다.
"특이적 결합"은 바람직하게 항체와 같은 작용제가 다른 표적과의 결합과 비교하여 그것이 특이적인 표적 예컨대 에피토프에 더 강하게 결합한다는 것을 의미한다. 결합이 특이적인지 아니면 특이적이지 않은지에 대한 확인 기준의 예는 해리 상수 (본원에서 "KD" 로서 언급됨) 를 포함할 후 있다. 작용제는 제2 표적에 대한 해리 상수에 비해서 낮은 해리 상수 (Kd)로 제1 표적에 결합한다면 제2 표적과 비교하여 제1 표적에 더 강력하게 결합한다. 바람직하게 작용제가 특이적으로 결합하는 표적에 대한 해리 상수는 작용제가 특이적으로 결합하지 않는 표적에 대한 해리 상수에 비해서 100배 초과, 200배 초과, 500배 초과 또는 1000배 초과로 더 낮다. 더 나아가서, 용어 "특이적 결합"은 특히 적어도 106 M-1, 바람직하게 적어도 107 M-1, 보다 바람직하게 적어도 108 M-1 의 친화성 상수 Ka 를 갖는 결합 파트너 간 결합 친화성을 의미한다. 일정 항원에 특이적인 항체는 특히 적어도 106 M-1, 바람직하게 적어도 107 M-1, 보다 바람직하게 적어도 108 M-1 의 Ka 를 갖는 친화성으로 상기 항원에 결합할 수 있는 항체를 의미한다. 예를 들어, 용어 "항-MUC1 항체"는 특히 MUC1에 특이적으로 결합하고, 바람직하게는 적어도 106 M-1, 바람직하게 적어도 107 M-1, 보다 바람직하게 적어도 108 M-1의 Ka 를 갖는 친화성으로 MUC1에 결합할 수 있는 항체를 의미한다.
용어 "MUC1"은 뮤신-1, 다형 상피 뮤신 (PEM) 또는 암 항원 15-3으로도 알려진 단백질 MUC1, 특히 인간 MUC1 (수탁 번호 P15941)을 의미한다. MUC1은 뮤신 패밀리의 구성원이고 막 결합된, 글리코실화 포스포단백질을 코딩한다. MUC1은 120-225 kDa의 코어 단백질 질량을 가지며 글리코실화되어 250-500 kDa 까지 증가된다. 이것은 세포의 표면을 넘어서 200-500 nm 까지 확장된다. 단백질은 경막 도메인에 의해서 많은 상피 세포의 첨단 표면에 앵커링된다. 세포외 도메인은 20개의 아미노산 VNTR (variable number tandem repeat) 도메인을 포함하고, 반복부의 개수는 상이한 개체에서 20 내지 120으로 가변적이다. 이들 반복부는 많은 O-글리코실화를 허용하는 세린, 트레오닌 및 프롤린 잔기가 풍부하다. 일정 구현예에서, 용어 "MUC1"은 종양-연관 MUC1 ("TA-MUC1")을 의미한다. TA-MUC1은 암 세포 상에 존재하는 MUC1이다. 이러한 MUC1은 이의 훨씬 높은 발현도, 이의 국재화 및 이의 글리코실화에 있어서 비암 세포에 존재하는 MUC1과 상이하다. 특히, TA-MUC1은 암 세포의 전체 세포 표면 상에서 무극성으로 존재하는 한편, 비암 세포에서 MUC1은 엄격하게 첨단부 발현을 가져서, 전신 투여된 항체가 접근불가하다. 더 나아가서, TA-MUC1은 MUC1 단백질 골격 상의 새로운 펩티드 에피토프 및 새로운 탄수화물 종양 항원 예컨대 톰센-프라이덴리히 (Thomsen-Friedenreich) 항원 알파 (TFα)를 노출시키는 이상 O-글리코실화를 갖는다.
톰센-프라이덴리히 항원 알파 또는 Core-1이라고도 불리는 "TFα"는 암종 세포에서 단백질의 히드록시 아미노산 세린 또는 트레오닌에 알파-아노머 입체형태로 O-글리코시드로 연결된 이당류 Gal-β1,3-GalNAc를 의미한다.
용어 "시알산"은 특히 뉴라민산의 임의의 N- 또는 O-치환된 유도체를 의미한다. 이것은 5-N-아세틸뉴라민산 및 5-N-글리코릴뉴라민산 둘 모두를 의미할 수 있지만, 바람직하게는 오직 5-N-아세틸뉴라민산만을 의미한다. 시알산, 특히 5-N-아세틸뉴라민산은 바람직하게 2,3- 또는 2,6-연결을 통해서 탄수화물 사슬에 부착된다. 바람직하게, 본 명세서에 기술된 항체에서, 2,3-커플링을 비롯하여 2,6-커플링된 시알산 둘 모두가 존재한다.
본 발명에 따른 "글리칸의 상대량"은 각각 항체를 포함하는 조성물 또는 항체 조제물의 항체에 부착된 글리칸의 특정 백분율 또는 백분율 범위를 의미한다. 특히, 글리칸의 상대량은 항체에 포함되고 따라서, 항체를 포함하는 조성물 또는 항체 조제물 중 항체의 폴리펩티드 사슬에 부착된 모든 글리칸의 특정 백분율 또는 백분율 범위를 의미한다. 100% 글리칸은 각각 항체를 포함하는 조성물 또는 항체 조제물의 항체에 부착된 모든 글리칸을 의미한다. 예를 들어, 10%의 이분형 GlcNAc를 보유하는 글리칸의 상대량은 항체에 포함되고 따라서 상기 조성물 중 항체 폴리펩티드 사슬에 부착된 모든 글리칸 중 10%가 이분형 GlcNAc 잔기를 포함하는 한편 항체에 포함되고 따라서 상기 조성물의 항체 폴리펩티드 사슬에 부착된 모든 글리칸의 90%가 이분형 GlcNAc 잔기를 포함하지 않는 것인 항체를 포함하는 조성물을 의미한다. 100%를 나타내는 글리칸의 상응하는 기준량은 조성물 중 항체에 부착된 모든 글리칸 구조, 또는 모든 N-글리칸, 즉 조성물 중 항체의 아스파라긴 잔기에 부착된 모든 글리칸 구조, 또는 모든 복합형 글리칸일 수 있다. 글리칸 구조의 기준 그룹은 일반적으로 명백하게 표시되거나 또는 당업자에 의한 상황으로부터 직접적으로 유도가능하다.
용어 "N-글리코실화"는 단백질의 폴리펩티드 사슬의 아스파라긴 잔기에 부착된 모든 글리칸을 의미한다. 이들 아스파라긴 잔기는 일반적으로 아미노산 서열 Asn - Xaa - Ser/Thr (여기서 Xaa는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산일 수 있음)을 갖는 N-글리코실화 부위의 일부이다. 유사하게, "N-글리칸"은 폴리펩티드 사슬의 아스파라긴 잔기에 부착된 글리칸이다. 용어 "글리칸", "글리칸 구조", "탄수화물", "탄수화물 사슬" 및 "탄수화물 구조"는 일반적으로 본 명세서에서 동의어로 사용된다. N-글리칸은 일반적으로 Manα1,6-(Manα1,3-)Manβ1,4-GlcNAcβ1,4-GlcNAcβ1-Asn (Asn은 폴리펩티드 사슬의 아스파라긴 잔기임)의 구조를 갖는, 2개의 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc) 잔기 및 3개 만노스 잔기로 이루어진 공통 코어 구조를 갖는다. N-글리칸은 3종의 상이한 유형, 즉 복합형 글리칸, 하이브리드형 글리칸 및 고만노스형 글리칸으로 세분된다.
본 명세서에 제공되는 수치, 특히 특정 글리코실화 성질의 상대량은 바람직하게는 추산 수치로서 이해되어야 한다. 특히, 수치는 바람직하게 최대 10% 더 높고/높거나, 더 낮을 수 있으며, 특히 최대 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%가 더 높고/높거나 낮을 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "항체 약물 접합체 (ADC)" 또는 "접합체" 는 일반적으로 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 또다른 작용제, 예컨대 화학치료제, 독소, 면역치료제, 이미징 프로브 등과의 연결을 지칭한다. 연결은 공유 결합, 또는 예컨대 정전기력을 통한 비-공유 상호작용일 수 있다. 당해 기술분야에서 알려진 본원에서 기재되는 다양한 링커가 항체 약물 접합체를 형성하기 위해 이용될 수 있다. 추가로, 항체 약물 접합체는 면역 접합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 발현될 수 있는 융합 단백질의 형태로 제공될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은, "융합 단백질" 은 원래는 별개의 단백질 (펩티드 및 폴리펩티드를 포함함) 에 대해 코딩하는 둘 이상의 유전자 또는 유전자 단편의 연결을 통해 생성된 단백질을 지칭한다. 융합 유전자의 번역은 각각의 원래의 단백질에서 유래하는 기능적 특성을 갖는 단일 단백질을 초래한다.
"접합체"에서 둘 이상의 화합물이 함께 연결된다. 일정 구현예에서, 각 화합물 유래 성질 중 적어도 일부는 접합체에 유지된다. 연결은 공유 또는 비공유 결합으로 달성될 수 있다. 바람직하게, 접합체의 화합물은 공유 결합을 통해서 연결된다. 접합체의 상이한 화합물은 화합물의 원자 간에 하나 이상의 공유 결합을 통해서 서로 직접적으로 결합될 수 있다. 대안적으로, 화합물은 링커 분자와 같은 화학 모이어티를 통해 서로 결합될 수 있으며 여기서 링커는 화합물의 원자에 공유적으로 부착된다. 접합체가 2개 초과의 화합물로 구성된다면, 이들 화합물은 예를 들어 사슬 입체형태로 연결될 수 있거나, 하나의 화합물이 다른 화합물에 부착될 수 있거나, 또는 몇몇 화합물이 각각 하나의 중심 화합물에 부착될 수 있다.
용어 "핵산"은 단일 가닥 및 이중 가닥 핵산 및 리보핵산을 비롯하여 데옥시리보핵산을 포함한다. 이것은 천연 발생을 비롯하여 합성 뉴클레오티드를 포함할 수 있고 예를 들어, 메틸화, 5'- 및/또는 3'-캡핑을 통해서 천연적으로 또는 합성적으로 변형될 수 있다.
용어 "발현 카세트"는 특히 그 안에 도입되는 코딩 핵산 서열의 발현을 가능하게 할 수 있고 조절할 수 있는 핵산 구성체를 의미한다. 발현 카세트는 프로모터, 리보솜 결합 부위, 인핸서, 및 유전자의 전사 또는 mRNA의 번역을 조절하는 다른 제어 엘리먼트를 포함할 수 있다. 발현 카세트의 정확한 구조는 종 또는 세포 유형의 기능에 따라서 다양할 수 있지만, 일반적으로 TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열 등과 같은, 각각 전사 및 번역의 개시에 관여되는 5'-비전사 및 5'- 및 3'-비번역 서열을 포함한다. 보다 특히, 5'-비전사 발현 제어 서열은 작동적으로 연결된 핵산의 전사 제어를 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함한다. 발현 카세트는 또한 인핸서 서열 또는 상류 활성인자 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따라서, 용어 "프로모터"는 발현시키고자 하는 핵산 서열의 상류 (5')에 위치되고 RNA-중합효소를 위한 인식 및 결합 부위를 제공하여 서열의 발현을 제어하는 핵산 서열을 의미한다. "프로모터"는 유전자의 전사 조절에 관여하는 추가 인자를 위한 추가 인식 및 결합 부위를 포함할 수 있다. 프로모터는 원핵생물 또는 진핵생물 유전자의 전사를 제어할 수 있다. 더 나아가서, 프로모터는 "유도성"일 수 있는데, 다시 말해서 유도제에 반응하여 전사를 개시할 수 있거나, 또는 전사가 유도제에 의해 제어되지 않으면 "항상성"일 수 있다. 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 유전자는 유도제가 부재하면 발현되지 않거나 또는 오직 적은 정도로만 발현된다. 유도제의 존재 하에서, 유전자 스위치가 켜지거나 또는 전사 수준이 증가된다. 이것은 일반적으로 특이적 전사 인자의 결합에 의해 매개된다.
용어 "벡터"는 이의 가장 일반적인 의미로 본 명세서에서 사용되며 상기 핵산이 예를 들어 원핵생물 및/또는 진핵생물 세포로 도입시킬 수 있고, 적절한 경우에, 게놈에 통합시킬 수 있는 핵산을 위한 임의의 매개자 비히클을 포함한다. 이러한 종류의 벡터는 바람직하게는 세포 내에서 복제되고/되거나 발현된다. 벡터는 플라스미드, 파지미드, 박테리오파지 또는 바이러스 게놈을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "플라스미드"는 일반적으로 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있는, 염색체외 유전 물질의 구성체, 일반적으로 원형 DNA 듀플렉스에 관한 것이다.
본 발명에 따라서, 용어 "숙주 세포"는 외생성 핵산이 형질전환 또는 형질감염될 수 있는 임의 세포에 관한 것이다. 용어 "숙주 세포"는 본 발명에 따라서 원핵생물 (예를 들어, 이. 콜라이 (E. coli)) 또는 진핵생물 세포 (예를 들어, 포유동물 세포, 특히 인간 세포, 효모 세포 및 곤충 세포)를 포함한다. 특히 바람직한 것은 포유동물 세포 예컨대 인간, 마우스, 햄스터, 돼지, 염소 또는 영장류 유래 세포이다. 세포는 다수의 조직 유형으로부터 유래될 수 있고 초대 세포 및 세포주를 포함할 수 있다. 핵산은 단일 카피 또는 둘 이상의 카피 형태로 숙주 세포에 존재할 수 있고, 일 구현예에서, 숙주 세포에서 발현된다.
용어 "환자"는 본 발명에 따라서 인간, 인간 이외의 영장류 또는 다른 동물, 특히 포유류 예컨대 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 또는 설치류 예컨대 마우스 및 래트를 의미한다. 특히 바람직한 구현예에서, 환자는 인간이다.
본 발명에 따른 용어 "암"은 특히 백혈병, 정상피종, 흑색종, 암종, 기형종, 림프종, 육종, 중피종, 신경아세포종, 신경교종, 직장암, 자궁내막암, 신장암, 부신암, 갑상선암, 혈액암, 피부암, 뇌암, 자궁경부암, 장관암, 간암, 결장암, 위암, 장암, 두경부암, 위장암, 림프절암, 식도암, 결장직장암, 췌장암, 이비인후 (ENT) 암, 유방암, 전립선암, 방광암, 자궁암, 난소암 및 폐암 및 이의 전이를 포함한다. 본 발명에 따른 용어 암은 또한 암 전이를 포함한다.
용어 "종양" 은 잘못조절된 세포 증식으로 인해 형성된 세포 또는 조직 그룹을 의미한다. 종양은 정상 조직과의 기능적 조화 및 구조적 조직의 부분 또는 완전 결핍을 보일 수 있고, 일반적으로 양성 또는 악성일 수 있는, 구별되는 조직 덩어리를 형성할 수 있다.
용어 "종양" 및 "암" 은 호환되게 사용된다.
용어 "전이" 는 이의 본래 부위에서 신체의 다른 부위로 암 세포의 확산을 의미한다. 전이의 형성은 매우 복잡한 과정이고 보통 원발성 종양으로부터 암 세포의 탈착, 신체 순환계로의 진입 및 신체 다른 곳의 정상 조직 내에서 성장되기 위한 정착을 포함한다. 종양 세포가 전이될 때, 새로운 종양은 속발성 또는 전이 종양이라고 하며, 이의 세포는 보통 본래 종양의 것을 닮는다. 이것은 예를 들어 유방암이 폐로 전이되면, 속발성 종양은 비정상적인 폐 세포가 아닌, 비정상적인 유방 세포로 구성된다는 것을 의미한다. 그러면 폐의 종양은 폐암이 아닌, 전이성 유방암이라고 한다.
용어 "약학 조성물"은 특히 인간 또는 동물에게 투여하기에 적합한 조성물, 즉 약학적으로 허용가능한 성분을 함유하는 조성물을 의미한다. 바람직하게, 약학 조성물은 활성 화합물 또는 이의 염 또는 프로드러그를 담체, 희석제 또는 약학 부형제 예컨대 완충제, 보존제 및 등장성 개질제와 함께 포함한다.
본 명세서에 기술된 수치 범위는 그 범위를 한정하는 수치를 포함한다. 본 명세서에 제공되는 제목은 전체로서 명세서를 참조하여 읽을 수 있는 본 발명의 다양한 양상 또는 구현예의 제한이 아니다. 일 구현예에 따라서, 방법의 경우에 일정 단계들을 포함하거나 또는 조성물의 경우에 일정 성분을 포함한다고 본 명세서에 기술되는 주제는 개별 단계 또는 성분으로 이루어진 주제를 의미한다. 본 명세서에 기술된 바람직한 양상 및 구현예를 선택하고 조합하는 것이 바람직하고 바람직한 구현예의 개별 조합으로부터 발생된 특별한 주제가 또한 본 개시에 속한다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 CDR-H2의 글리코실화 부위가 결실된 인간화 항-MUC1 항체 PankoMab의 변이체 (PM-N54Q) 의 개발을 기반으로 한다. 글리코실화 부위의 결실은 중쇄 가변 영역의 아미노산 Asn (아스파라긴) 57 (즉, SEQ ID NO:11 의 아미노산 No: 57) 을 다른 아미노산, 특히 Gln (글루타민)으로 치환시켜 달성되었다. Asn 57은 탄수화물 구조가 부착된 글리코실화 부위의 억셉터 아미노산 잔기이다. 다른 잔기에 의한 이러한 아스파라긴 잔기의 치환은 탄수화물 구조가 숙주 세포의 효소에 의해 아스파라긴 잔기에게로만 전달될 수 있기 때문에 글리코실화를 없애준다. PankoMab의 CDR-H2의 글리코실화 부위의 결실이 항체의 항원 결합 친화성을 증가시켰다는 것을 놀랍게도 발견하였다.
이들 발견에 비추어, 본 발명은 세포독성제에 접합된 항체를 포함하는 접합체로서, 항체는 MUC1 에 결합할 수 있고, 항체는
(i) 상보성-결정 영역 (CDR) 으로서 SEQ ID NO: 1 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 SEQ ID NO: 3 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3 을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) 상보성-결정 영역 (CDR) 으로서 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, SEQ ID NO: 5 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 및 SEQ ID NO: 6 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3 을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 접합체를 제공한다.
MUC1 에 대한 결합
항체는 MUC1의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 에피토프는 MUC1의 세포외 탠덤 반복부에 존재한다. 일정 구현예에서, 항체는 글리코실화-의존적 방식으로 MUC1에 결합한다. 특히, 항체는 상기 탠덤 반복부가 트레오닌 잔기에서 N-아세틸 갈락토사민 (Tn), 시알릴 α2-6 N-아세틸 갈락토사민 (sTn), 갈락토스 β1-3 N-아세틸 갈락토사민 (TF) 또는 갈락토스 β1-3 (시알릴 α2-6) N-아세틸 갈락토사민 (sTF), 바람직하게 Tn 또는 TF로 글리코실화되면 더 강력하게 결합한다. 바람직하게, 탄수화물 모이어티는 트레오닌 잔기에 α-O-글리코시드 결합을 통해서 결합된다. MUC1의 탠덤 반복부 도메인의 에피토프는 특히 아미노산 서열 PDTR (SEQ ID NO: 13) 또는 PESR (SEQ ID NO: 14)을 포함한다. 이러한 에피토프와의 결합은 바람직하게는 상기 기술된 바와 같이 글리코실화 의존적이고, 여기서 특히 결합은 상기 기술된 탄수화물 모이어티가 각각 서열 PDTR 또는 PESR (SEQ ID NO: 13 및 14)의 트레오닌 잔기에 부착되면 증가된다.
에피토프는 종양-연관 MUC1 에피토프 (TA-MUC1)이다. TA-MUC1 에피토프는 특히 종양 세포 상에 존재하지만 정상 세포 상에는 존재하지 않고/않거나 정상 세포에 존재할 때가 아닌 종양 세포 상에 존재할 때 숙주의 순환계 중 항체에 의해서만 접근가능한 MUC1의 에피토프를 의미한다. 일정 구현예에서, TA-MUC1 에피토프를 발현하는 세포와 항체의 결합은 정상, 비종양 MUC1을 발현하는 세포와의 결합에 비해서 더 강력하다. 바람직하게, 상기 결합은 적어도 1.5배 더 강력하거나, 바람직하게 적어도 2배 더 강력하거나, 적어도 5배 더 강력하거나, 적어도 10배 더 강력하거나 또는 적어도 100배 더 강력하다. TA-MUC1 결합의 경우에, 항체는 바람직하게 동일한 길이 및 동일한 펩티드 서열의 비-글리코실화 펩티드와의 결합과 비교하여 적어도 2의 배율, 바람직하게 4의 배율 또는 10의 배율, 가장 바람직하게 20의 배율만큼 결합 강도가 증가되도록 글리코실화 MUC1 종양 에피토프에 특이적으로 결합한다. 상기 결합은 ELISA, RIA, 표면 플라스몬 공명 (이하, "SPR"이라고 함) 분석 등에 의해 어세이 또는 결정될 수 있다. SPR 분석에서 사용되는 장비의 예는 BlAcore(TM) (GE Healthcare Bio-Sciences Crop. 제조), ProteOn(TM) (Bio-Rad Laboratories, Inc. 제조), DRX2 바이오센서 (Dynamic Biosensors GmbH 제조), SPR-Navi(TM) (BioNavis Oy Ltd. 제조), Spreeta(TM) (Texas Instruments Inc. 제조), SPRi-PlexII(TM) (Horiba, Ltd. 제조), 및 Autolab SPR(TM) (Metrohm 제조)을 포함할 수 있다. 세포 표면 상에 발현된 항원에 항체의 결합은 유세포측정법 등으로 어세이될 수 있다.
더 나아가서, 항체는 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 기준 항체의 것과 유사한 항원 결합 성질을 나타낼 수 있다. 바람직하게, 기준 항체는 인간화 항체 PankoMab이다. 특히, 항체는 기준 항체와 동일한 항원에 특이적으로 결합하고, 바람직하게 더 높은 친화성으로 상기 항원에 결합한다. 다시 말해서, 항체는 바람직하게 기준 항체에 비해 낮거나, 보다 바람직하게 적어도 10%가 낮거나, 적어도 20%가 낮거나, 적어도 30%가 낮거나 또는 적어도 50%가 낮은 해리 상수를 갖는 친화성으로 항원에 결합한다. 게다가, 항체는 바람직하게 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 기준 항체와 교차-특이성을 보인다. 특히, 인간화 항체는 충분히 높은 농도로 존재하면 MUC1과 기준 항체의 결합을 차단할 수 있다. 이것은 MUC1과 기준 항체의 결합이 항체가 항원 MUC1에 이미 결합했을 때 방해된다면 가능하다.
항-MUC1 항체
MUC1 에 결합할 수 있는 항체는 상보성-결정 영역 (CDR) 으로서 SEQ ID NO: 1 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 SEQ ID NO: 3 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3 을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 상보성-결정 영역 (CDR) 으로서 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, SEQ ID NO: 5 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 및 SEQ ID NO: 6 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3 을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특히, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열과 적어도 95%, 특히 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 이들 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 여전히 SEQ ID NO: 1, 2 및 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함한다. 그런 이유로, SEQ ID NO: 9에 대한 임의의 서열 편차가 CDR이 아닌 프레임워크 영역에 위치된다. 특히, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, CDR-H2는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 가지고, SEQ ID NO: 2의 위치 8의 아미노산은 글루타민, 알라닌, 발린, 히스티딘, 트립토판, 티로신, 리신 및 아르기닌; 특히 글루타민, 히스티딘, 트립토판, 티로신, 리신 및 아르기닌으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 바람직하게, SEQ ID NO: 2의 위치 8의 아미노산은 글루타민, 히스티딘, 트립토판, 리신 또는 아르기닌, 특히 글루타민이다. 특히, CDR-H2는 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 갖는다.
특정 구현예에서, CDR-H2 는 SEQ ID NO: 8 의 아미노산 서열을 갖는다.
특별한 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특히, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열과 적어도 95%, 특히 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 이들 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3을 포함한다. 그러한 이유로, SEQ ID NO: 10에 대한 임의의 서열 편차는 CDR이 아닌, 프레임워크 영역에 위치한다. 특히, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함한다.
특별한 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11 의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특히, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11 의 아미노산 서열과 적어도 95%, 특히 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 이들 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 1 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, SEQ ID NO: 8 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 SEQ ID NO: 3 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3 을 포함한다. 그러한 이유로, SEQ ID NO: 11 에 대한 임의의 서열 편차는 CDR이 아닌, 프레임워크 영역에 위치한다. 특히, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11 의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특히, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열과 적어도 95%, 특히 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 이들 구현예에서, 경쇄 가변 영역은 여전히 SEQ ID NO: 4, 5 및 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함한다. 그러한 이유로, SEQ ID NO: 12에 대한 임의의 서열 편차는 CDR이 아닌, 프레임워크 영역에 위치된다. 특히, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함한다.
특별한 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지며, 여기서 CDR은 여전히 SEQ ID NO: 1, 2 및 3의 아미노산 서열을 가지고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지며, 여기서 CDR은 여전히 SEQ ID NO: 4, 5 및 6의 아미노산 서열을 갖는다. 특히, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 가지며, 여기서 CDR은 여전히SEQ ID NO: 1, 2 및 3의 아미노산 서열을 가지고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 가지며, 여기서 CDR은 여전히 SEQ ID NO: 4, 5 및 6의 아미노산 서열을 갖는다.
특별한 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지며, 여기서 CDR은 여전히 SEQ ID NO: 1, 7 및 3의 아미노산 서열을 가지고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지며, 여기서 CDR은 여전히 SEQ ID NO: 4, 5 및 6의 아미노산 서열을 갖는다. 특히, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 가지며, 여기서 CDR은 여전히 SEQ ID NO: 1, 7 및 3의 아미노산 서열을 가지고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 가지며, 여기서 CDR은 여전히 SEQ ID NO: 4, 5 및 6의 아미노산 서열을 갖는다.
특별한 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11 의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지며, 여기서 CDR 은 여전히 SEQ ID NO: 1, 8 및 3 의 아미노산 서열을 가지고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 12 의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지며, 여기서 CDR은 여전히 SEQ ID NO: 4, 5 및 6 의 아미노산 서열을 갖는다. 특히, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11 의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 가지며, 여기서 CDR은 여전히 SEQ ID NO: 1, 8 및 3 의 아미노산 서열을 가지고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 12 의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 가지며, 여기서 CDR은 여전히 SEQ ID NO: 4, 5 및 6 의 아미노산 서열을 갖는다.
특별한 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 20의 아미노산 No 20 내지 136으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특히, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 20의 아미노산 No 20 내지 136으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 95%, 특히 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 이들 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3을 포함한다. 그러한 이유로, SEQ ID NO: 20의 아미노산 No 20 내지 136으로 표시되는 아미노산 서열에 대한 임의의 서열 편차는 CDR이 아닌, 프레임워크 영역에 위치된다. 특히, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 20의 아미노산 No 20 내지 136으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 20의 위치 76에서 아미노산은 글루타민, 알라닌, 발린, 히스티딘, 트립토판, 티로신, 리신 및 아르기닌; 특히 글루타민, 히스티딘, 트립토판, 티로신, 리신 및 아르기닌으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 바람직하게, SEQ ID NO: 20의 위치 76에서 아미노산은 글루타민, 히스티딘, 트립토판, 리신 또는 아르기닌, 특히 글루타민이다. 특히, CDR-H2는 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 갖고/갖거나 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 23의 아미노산 No 20 내지 136으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특별한 구현예에서, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 21의 아미노산 No 21 내지 133으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특히, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 21의 아미노산 No 21 내지 133으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 95%, 특히 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 이들 구현예에서, 경쇄 가변 영역은 여전히 SEQ ID NO: 4, 5 및 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함한다. 그러한 이유로, SEQ ID NO: 21의 아미노산 No 21 내지 133으로 표시되는 아미노산 서열에 대한 임의의 서열 편차는 CDR이 아닌, 프레임워크 영역에 위치된다. 특히, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 21의 아미노산 No 21 내지 133으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특별한 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 20의 아미노산 No 20 내지 136으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지고, 여기서 CDR은 여전히 SEQ ID NO: 1, 7 및 3의 아미노산 서열을 가지며, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 21의 아미노산 No 21 내지 133으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지며, 여기서 CDR은 여전히 SEQ ID NO: 4, 5 및 6의 아미노산 서열을 갖는다. 특히, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 20의 아미노산 No 20 내지 136으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 가지며, 여기서 CDR은 여전히 SEQ ID NO: 1, 7 및 3의 아미노산 서열을 가지고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 21의 아미노산 No 21 내지 133으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 가지며, 여기서 CDR은 여전히 SEQ ID NO: 4, 5 및 6의 아미노산 서열을 갖는다.
특별한 구현예에서, 중쇄는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특히, 중쇄는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열과 적어도 95%, 특히 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 이들 구현예에서, 중쇄는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3을 포함한다. 그러한 이유로, SEQ ID NO: 15에 대한 임의의 서열 편차는 CDR이 아닌, 프레임워크 영역에 위치된다. 특히, 중쇄는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 15의 위치 57에서 아미노산은 글루타민, 알라닌, 발린, 히스티딘, 트립토판, 티로신, 리신 및 아르기닌; 특히 글루타민, 히스티딘, 트립토판, 티로신, 리신 및 아르기닌으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 바람직하게, SEQ ID NO: 15의 위치 57에서 아미노산은 글루타민, 히스티딘, 트립토판, 리신 또는 아르기닌, 특히 글루타민이다. 특히, CDR-H2는 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 갖고/갖거나 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 No 20 내지 136으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특별한 구현예에서, 중쇄는 SEQ ID NO: 19 의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특히, 중쇄는 SEQ ID NO: 19 의 아미노산 서열과 적어도 95%, 특히 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 이들 구현예에서, 중쇄는 SEQ ID NO: 1 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, SEQ ID NO: 8 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 SEQ ID NO: 3 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3 을 포함한다. 그러한 이유로, SEQ ID NO: 19 에 대한 임의의 서열 편차는 CDR이 아닌, 프레임워크 영역에 위치한다. 특히, 중쇄는 SEQ ID NO: 19 의 아미노산 서열을 포함한다.
특별한 구현예에서, 경쇄는 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특히, 경쇄는 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열과 적어도 95%, 특히 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 이들 구현예에서, 경쇄는 여전히 SEQ ID NO: 4, 5 및 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함한다. 그러한 이유로, SEQ ID NO: 16에 대한 임의의 서열 편차는 CDR이 아닌, 프레임워크 영역에 위치된다. 특히, 경쇄는 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함한다.
특별한 구현예에서, 중쇄는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지며, 여기서 CDR은 여전히 SEQ ID NO: 1, 7 및 3의 아미노산 서열을 가지고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지며, 여기서 CDR은 여전히 SEQ ID NO: 4, 5 및 6의 아미노산 서열을 갖는다. 특히, 중쇄는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 가지며, 여기서 CDR은 여전히 SEQ ID NO: 1, 7 및 3의 아미노산 서열을 가지고, 경쇄는 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 가지며, 여기서 CDR은 여전히 SEQ ID NO: 4, 5 및 6의 아미노산 서열을 갖는다.
특별한 구현예에서, 중쇄는 SEQ ID NO: 19 의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지며, 여기서 CDR은 여전히 SEQ ID NO: 1, 8 및 3 의 아미노산 서열을 갖고, 경쇄는 SEQ ID NO: 16 의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지며, 여기서 CDR은 여전히 SEQ ID NO: 4, 5 및 6 의 아미노산 서열을 갖는다. 특히, 중쇄는 SEQ ID NO: 19 의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 가지며, 여기서 CDR은 여전히 SEQ ID NO: 1, 8 및 3 의 아미노산 서열을 갖고, 경쇄는 SEQ ID NO: 16 의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 가지며, 여기서 CDR은 여전히 SEQ ID NO: 4, 5 및 6 의 아미노산 서열을 갖는다.
항체는 이의 변형된 형태를 포함 및 포괄한다. 항체의 변형된 형태는 화학적 또는 생물학적 변형이 제공된 항체를 의미한다. 화학적으로 변형된 형태는 화학적 모이어티와 접합된 아미노산 뼈대를 갖는 형태, 화학적으로 변형된 N-연결 또는 O-연결 탄수화물 사슬을 갖는 형태 등을 포함한다. 상기 화학적 모이어티 또는 형태는 독성 또는 세포독성일 수 있다. 생물학적으로 변형된 형태는 번역후 변형 (예를 들어, N-연결 또는 O-연결 글리코실화, N-말단 또는 C-말단 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성질체화, 또는 메티오닌의 산화)을 겪은 형태, 원핵생물 숙주 세포를 사용한 발현에 의해 N-말단에 첨가된 메티오닌 잔기를 함유하는 형태 등을 포함한다. 이러한 변형된 형태는 또한 항체 또는 항원의 검출 또는 단리를 허용하도록 표지된 형태, 예를 들어, 효소-표지된 형태, 형광 표지된 형태, 또는 친화성-표지된 형태를 포함하는 것을 의미한다. 이러한 항체의 변형된 형태는 본래 항체의 안정성 또는 혈액 체류의 개선, 항원성의 감소, 항체 또는 항원의 검출 또는 단리 등에 유용하다.
특히, 항체는 탈푸코실화, 감소된 푸코스, N-연결 글리코실화, O-연결 글리코실화, N-말단 프로세싱, C-말단 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성질체화, 메티오닌의 산화, 중쇄 (LALA)의 위치 234 및 235 (EU 인덱스에 따름) 에서 2개의 류신 (L) 잔기의 알라닌 (A)으로의 치환, 프롤린 잔기의 아미드화 및 카르복실 말단에서 1개, 2개 또는 3개의 아미노산의 결실 또는 결여로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 특별한 구현예에서, 항체는 한쪽 또는 양쪽 중쇄에서 1개, 2개 또는 3개의 카르복실-말단 아미노산(들)이 결여되거나, 또는 2개의 카르복실-말단 아미노산이 결여되고 카르복실-말단 프롤린 잔기가 한쪽 또는 양쪽 중쇄에서 아미드화된다.
이러한 변형은 이의 항체의 임의 위치 또는 바람직한 위치에서 만들어질 수 있다. 대안적으로, 동일하거나 또는 둘 이상의 상이한 변형이 그의 1개 또는 2개 이상의 위치에서 만들어질 수 있다.
예를 들어, 배양된 포유동물 세포에 의해 생산된 항체는 이의 중쇄에 카르복실-말단 리신 잔기가 결여되는 것으로 알려져 있다 (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)). 가끔 중쇄의 2개의 카르복실-말단 아미노산 잔기 (즉, 글리신 및 리신)가 누락되고 카르복실 말단에 새롭게 위치된 프롤린 잔기가 아미드화된다는 것이 또한 알려져 있다 (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)). 그러나, 이들 중쇄 서열에서 이러한 결여 또는 변형은 이의 항원에 결합하는 항체의 능력이나 또는 항체의 이펙터 기능 (보체 활성화, 항체-의존적 세포독성 등)에 영향을 미치지 않는다.
특정 구현예에서, 항체는 중쇄의 카르복실 말단에서 1개 또는 2개의 아미노산(들)의 결실 또는 결여를 포함하고, 아미드화된 잔기 (예를 들어, 중쇄의 카르복실-말단 부위에 아미드화 프롤린 잔기)를 갖는다. 그러나, 항체는 결실 돌연변이체가 항원에 결합하는 능력을 유지하는 한 상기 기술된 유형에 국한되지 않는다.
특정 구현예에서, 항체의 2개의 중쇄는 전체 길이 중쇄 및 결실 돌연변이체의 중쇄로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중쇄의 어느 한 유형으로 구성될 수 있거나 또는 그로부터 선택된 임의의 2개 유형의 조합으로 구성될 수 있다. 결실 변이체 중쇄(들)의 정량적 비율은 항체를 생산하는 배양된 포유동물 세포의 유형, 및 세포의 배양 조건에 따라 좌우된다.
특별한 구현예에서, 항체는 2개의 중쇄를 포함할 수 있고, 이들 둘 모두는 하나의 카르복실-말단 아미노산 잔기가 결여된다.
특별한 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 15 또는 22의 아미노산 No 1 내지 446으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 SEQ ID NO: 16의 아미노산 No 1 내지 219로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 15의 위치 57에서 아미노산은 글루타민, 알라닌, 발린, 히스티딘, 트립토판, 티로신, 리신 및 아르기닌; 특히 글루타민, 히스티딘, 트립토판, 티로신, 리신 및 아르기닌으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 바람직하게, SEQ ID NO: 15의 위치 57에서 아미노산은 글루타민, 히스티딘, 트립토판, 리신 또는 아르기닌, 특히 글루타민이다.
특별한 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 19 의 아미노산 No 1 내지 446 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 SEQ ID NO: 16 의 아미노산 No 1 내지 219 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, 항체는 TA-MUC1과의 결합에 대해서, SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체, 또는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 경쟁한다.
특정 구현예에서, 항체는 다음의 성질을 갖는다: (a) MUC1과 특이적으로 결합, 및/또는 (b) MUC1과의 결합을 통해 MUC1-발현 세포로 내재화되는 활성 가짐. 특정 구현예에서, 항체는 적어도 하나의 항체 중쇄를 포함한다. 특히, 항체는 2개의 항체 중쇄를 포함한다. 항체 중쇄는 특히 VH 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. 일정한 다른 구현예에서, 항체 중쇄는 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하지만, CH1 도메인은 포함하지 않는다. 추가 구현예에서, 중쇄의 하나 이상의 불변 도메인은 다른 도메인, 특히 유사한 도메인 예컨대 예를 들어 알부민으로 치환될 수 있다. 항체 중쇄는 γ-, α-, ε-, δ- 및 μ-사슬을 포함한 임의 유형일 수 있고, 바람직하게는 γ1-, γ2-, γ3- 및 γ4-사슬, 특히 γ1-사슬을 포함한, γ-사슬이다. 그러한 이유로, 항체는 바람직하게 IgG-유형 항체 예컨대 IgG1-, IgG3- 또는 IgG4-유형 항체, 특히 IgG1-유형 항체이다.
특히, 항체는 적어도 하나의 항체 경쇄, 특히 2개의 항체 경쇄를 더 포함한다. 항체 경쇄는 특히 VL 도메인 및 CL 도메인을 포함한다. 항체 경쇄는 κ-사슬 또는 λ-사슬일 수 있고 특히 κ-사슬이다.
특정 구현예에서, 항체는 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄를 포함한다. 특히, 항체는 각각이 VH 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 γ1-유형의 2개 항체 중쇄, 및 각각의 VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하는, κ-유형의 2개 항체 경쇄를 포함한다.
대안적인 구현예에서, 항체는 항체 경쇄를 포함하지 않는다. 이들 구현예에서, 경쇄 가변 영역은 중쇄 가변 영역의 N-말단에 융합될 수 있거나 또는 중쇄 가변 영역의 C 말단에 삽입된다. 펩티드 링커는 중쇄의 나머지 부분과 경쇄 가변 영역을 연결시키기 위해 존재할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 항체는 Fc 영역을 포함한다. 항체는 특히 각각이 도메인 VH, CH1, 힌지 영역, CH2 및 CH3을 포함하는 2개의 중쇄, 및 각각의 도메인 VL 및 CL을 포함하는 2개 경쇄를 포함하는, 전체 항체일 수 있다. 항체는 특히 하나 이상의 인간 Fcγ 수용체, 특히 인간 Fcγ 수용체 IIIA에 결합할 수 있다. 대안적인 구현예에서, 항체는 인간 Fcγ 수용체 IIIA에 결합하지 않거나 또는 유의하게 결합하지 않고, 특히 임의의 인간 Fcγ 수용체에 결합하지 않거나 또는 유의하게 결합하지 않는다. 이들 구현예에서, 항체는 특히 CH2 도메인에 글리코실화 부위를 포함하지 않는다.
대안적인 구현예에서, 항체는 Fc 영역을 포함하지 않는다. 이들 구현예에서, 항체는 특히 단쇄 가변 영역 단편 (scFv)이거나 또는 Fc 영역을 포함하지 않는 다른 항체 단편이다.
항-MUC1 항체의 글리코실화
항-MUC1 항체는 하나 이상의 항체 중쇄에 CH2 도메인을 포함할 수 있다. IgG 유형의 천연 인간 항체는 CH2 도메인에 N-글리코실화 부위를 포함한다. 항체에 존재하는 CH2 도메인은 N-글리코실화 부위를 포함할 수도 있거나 또는 포함하지 않을 수도 있다. 특정 구현예에서, 항체는 CH2 도메인에 글리코실화 부위를 포함하지 않는다. 특히, 항체는 IMGT/Eu 번호매김 체계에 따른 위치 297에 상응하는 중쇄 내 위치에 아스파라긴 잔기를 포함하지 않는다. 예를 들어, 항체는 중쇄에 Ala297 돌연변이를 포함할 수 있다. 이들 구현예에서, 항체는 바람직하게 Fcγ 수용체와의 결합, 항체-의존적 세포의 세포독성 (ADCC) 및/또는 항체-의존적 세포의 식균작용 (ADCP) 및/또는 보체-의존적 세포독성 (CDC)을 통해서, 유도하는 능력이 완전하게 결여되거나 또는 강력하게 감소된 능력을 갖는다. 이와 관련하여 강력하게 감소된 능력은 특히 이의 CH2 도메인에 N-글리코실화 부위를 포함하고 일반적인 포유동물 글리코실화 패턴 예컨대 인간 세포주 또는 CHO 세포주에서 생산으로 수득가능한 것, 예를 들어 본 명세서에 기술된 바와 같은 글리코실화 패턴을 갖는 동일 항체와 비교하여 10% 이하, 특히 3% 이하, 1% 이하 또는 0.1% 이하의 활성 감소를 의미한다. 이들 구현예에서, 항체는 특히 IgG1-유형 항체이다.
대안적인 구현예에서, 항체에 존재하는 CH2 도메인은 N-글리코실화 부위를 포함한다. 이러한 글리코실화 부위는 특히 IMGT/Eu 번호매김 체계에 따른 중쇄의 아미노산 위치 297에 상응하는 아미노산 위치에 있고 아미노산 서열 모티프 Asn Xaa Ser/Thr을 가지며, 여기서 Xaa는 프롤린을 제외한 임의 아미노산일 수 있다. Asn297에서 N-연결 글리코실화는 포유동물 IgG를 비롯하여 다른 항체 이소타입의 상동성 영역에서 보존된다. 가변 영역에 존재할 수 있는 임의의 추가 아미노산 또는 다른 서열 변형으로 인해서, 이러한 보존된 글리코실화 부위의 실제 위치가 항체의 아미노산 서열에서 가변적일 수 있다. 바람직하게, 항체에 부착된 글리칸은 이중촉각형 복합체 유형 N-연결 탄수화물 구조이고, 바람직하게는 적어도 하기 구조를 포함한다:
Asn - GlcNAc - GlcNAc - Man - (Man - GlcNAc)2
여기서 Asn은 항체의 폴리펩티드 부분의 아스파라긴 잔기이고; GlcNAc는 N-아세틸글루코사민이며 Man은 만노스이다. 말단 GlcNAc 잔기는 임의로 시알산 잔기를 보유할 수 있는, 갈락토스 잔기를 더 포함할 수 있다. 추가의 GlcNAc 잔기 (이분형 GlcNAc라고 함)는 폴리펩티드에 가장 가까운 Man에 부착될 수 있다. 푸코스는 Asn에 부착된 GlcNAc에 결합될 수 있다. 이들 구현예에서, 항체는 특히 IgG1-유형 항체이다.
바람직한 구현예에서, 항체는 N-글리코릴 뉴라민산 (NeuGc) 또는 검출가능한 양의 NeuGc를 포함하지 않는다. 더 나아가서, 항체는 또한 바람직하게 Galili 에피토프 (Galα1,3-Gal 구조) 또는 검출가능한 양의 Galili 에피토프를 포함하지 않는다. 특히, NeuGc 및/또는 Galα1,3-Gal 구조를 보유하는 글리칸의 상대량은 항체의 개체군 중 항체의 CH2 도메인에 부착된 글리칸의 총량의 0.1% 미만 또는 심지어 0.02% 미만이다.
특히, 항체는 인간 글리코실화 패턴을 갖는다. 이들 글리코실화 성질로 인해서, 부작용을 유도하는 외래 면역원성 비인간 구조가 부재한데 이것은 일정 외래 당 구조 예컨대 면역원성 비인간 시알산 (NeuGc) 또는 Galili 에피토프 (Gal-Gal 구조)로서, 이들 둘 모두 설치류 생산 시스템으로 알려진 것들, 또는 예를 들어 효모 시스템의 것으로 알려진 면역원성 고-만노스 구조와 같은 다른 구조들에 의해 초래되는 것으로 알려진 원치않는 부작용 또는 단점을 피한다는 것을 의미한다.
특별한 구현예에서, 항체는 이분형 GlcNAc 잔기를 보유하는 글리칸의 검출가능한 양을 갖는 글리코실화 패턴을 포함한다. 특히, 이분형 GlcNAc 잔기를 보유하는 글리칸의 상대량은 조성물 중 항체의 글리코실화 부위에 부착된 글리칸의 총량 중 적어도 0.5%, 특히 적어도 1% 이다. 더 나아가서, 특정 구현예에서, 글리코실화 패턴은 조성물 중 항체에 부착된 글리칸의 총량 중 적어도 25%의 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 보유하는 글리칸의 상대량을 포함한다. 특히, 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 보유하는 글리칸의 상대량은 조성물 중 항체에 부착된 글리칸의 총량 중 적어도 30%, 특히 적어도 35% 또는 적어도 40% 이다. 특별한 구현예에서, 글리코실화 패턴은 조성물 중 항체에 부착된 글리칸의 총량 중 적어도 1%의 적어도 하나의 시알산 잔기를 보유하는 글리칸의 상대량을 포함한다. 특히, 적어도 하나의 시알산 잔기를 보유하는 글리칸의 상대량은 조성물 중 항체에 부착된 글리칸의 총량 중 적어도 1.5%, 특히 적어도 2% 이다.
항체는 높은 양의 코어 푸코스 또는 낮은 양의 코어 푸코스를 갖는 글리코실화 패턴을 가질 수 있다. 푸코실화의 감소된 양은 ADCC를 유도하는 항체의 능력을 증가시킨다. 특정 구현예에서, 코어 푸코스 잔기를 보유하는 글리칸의 상대량은 조성물 중 항체에 부착된 글리칸의 총량 중 40% 이하, 특히 30% 이하, 또는 20% 이하이다. 대안적인 구현예에서, 코어 푸코스 잔기를 보유하는 글리칸의 상대량은 조성물 중 항체에 부착된 글리칸의 총량 중 적어도 60%, 특히 적어도 65% 또는 적어도 70% 이다.
항-MUC1 항체의 CH2 도메인 내 글리코실화 부위의 존재 또는 부재 및 상기 글리코실화 부위에서 글리칸 구조 내 푸코스의 존재 또는 부재를 통해서, ADCC를 유도하는 항체의 능력 및 상기 ADCC 유도 강도가 제어될 수 있다. ADCC 활성은 항체의 Fc 부위의 글리코실화에 의해서, 그리고 또한 상기 글리코실화 중 푸코실화의 양을 감소시켜서 증가된다. 특정 적용 분야에서, ADCC 활성의 미세 조율이 중요하다. 그러므로, 특정 상황에서, CH2 도메인에 글리코실화 부위가 없는 항체, CH2 도메인에 글리코실화 부위가 있고 푸코실화의 양이 높은 항체, 또는 CH2 도메인에 글리코실화 부위가 있고 푸코실화의 양이 낮은 항체가 가장 유리할 수 있다.
항-MUC1 항체의 생산
항체는 바람직하게 숙주 세포에서 재조합적으로 생산된다. 항체의 생산에 사용되는 숙주 세포는 항체 생산에 사용될 수 있는 임의의 숙주 세포일 수 있다. 적합한 숙주 세포는 특히 진핵생물 숙주 세포, 특히 포유동물 숙주 세포이다. 에시적인 숙주 세포는 효모 세포 예컨대 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 세포주, 곤충 세포 예컨대 SF9 및 SF21 세포주, 식물 세포, 조류 세포 예컨대 EB66 오리 세포주, 설치류 세포 예컨대 CHO, NS0, SP2/0 및 YB2/0 세포주, 및 인간 세포 예컨대 HEK293, PER.C6, CAP, CAP-T, AGE1.HN, Mutz-3 및 KG1 세포주를 포함한다.
특정 구현예에서, 항체는 인간 혈액 세포주, 특히 인간 골수성 백혈병 세포주에서 재조합적으로 생산된다. 적합한 생산 절차를 비롯하여 항체의 생산에 사용할 수 있는 바람직한 인간 세포주는 WO 2008/028686 A2에 기술되어 있다. 특별한 구현예에서, 항체는 NM-H9D8, NM-H9D8-E6 및 NM-H9D8-E6Q12 및 이로부터 유래된 세포주로 이루어지는 군으로부터 선택되는 인간 골수성 백혈병 세포에서 발현에 의해 수득된다. 이들 세포주는 수탁 번호 DSM ACC2806 (NM-H9D8; 2006년 9월 15일 기탁), DSM ACC2807 (NM-H9D8-E6; 2006년 10월 5일 기탁) 및 DSM ACC2856 (NM-H9D8-E6Q12; 2007년 8월 8일 기탁)으로 부다페스트 조약의 요건에 따라 독일 생물 자원 센터 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) (DSMZ) (Inhoffenstrasse 7B, 38124 Braunschweig (DE))에 Glycotope GmbH (Robert-Roessle-Str. 10, 13125 Berlin (DE))가 기탁하였다. NM-H9D8 세포는 높은 정도의 시알릴화, 높은 정도의 이분형 GlycNAc, 높은 정도의 갈락토실화 및 높은 정도의 푸코실화를 갖는 글리코실화 패턴을 제공한다. NM-H9D8-E6 및 NM-H9D8-E6Q12 세포는 푸코실화의 정도가 매우 낮은 것을 제외하고는, NM-H9D8 세포와 유사한 글리코실화 패턴을 제공한다. 다른 적합한 세포주는 미국 생물 자원 센터 (American Type Culture Collection) (ATCC CCL-243)에 존재하는 인간 골수성 백혈병 세포주, K562를 비롯하여, 상기 언급된 것들 유래의 세포주를 포함한다.
추가 구현예에서, 항체는 CHO 세포에서 재조합적으로 생산된다. 특히, 항체는 CHO dhfr- 세포주 예컨대 ATCC No. CRL-9096의 세포주에서 재조합적으로 생산될 수 있다.
항-MUC1 항체의 접합체
본 발명에 따르면, 항체는 하나 이상의 세포독성제에 접합되어 있다. 세포독성제는 항체와의 접합에 적합한 임의의 세포독성제일 수 있다. 하나 초과의 세포독성제가 항체에 존재하면, 이들 세포독성제는 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있으며, 특히 모두 동일하다. 항체와 세포독성제의 접합은 당분야에 공지된 임의의 방법을 사용해 달성될 수 있다. 세포독성제는 공유적으로, 특히 융합 또는 화학적 커플링에 의해서, 또는 비공유적으로 항체에 접합될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포독성제는 특히 링커 모이어티를 통해서, 항체에 공유적으로 부착된다. 링커 모이어티는 세포독성제를 항체에 부착시키기 위해 적합한 임의의 화학적 독립체일 수 있다.
세포독성제에 더하여, 본 발명에 따른 접합체는 그에 접합된 추가 작용제를 추가로 포함할 수 있다. 추가 작용제는 바람직하게는 질환, 특히 암의 요법, 진단, 예후 및/또는 모니터링에서 유용하다. 예를 들어, 추가 작용제는 방사성핵종, 화학치료제, 항체 또는 항체 단편, 특히 항-MUC1 항체와 상이한 특이성의 것, 예를 들어 면역조절 표적을 차단 또는 활성화시키는 체크포인트 항체, 효소, 상호작용 도메인, 검출가능한 표지, 독소, 세포용해성 성분, 면역조절인자, 면역이펙터, MHC 클래스 I 또는 클래스 II 항원, 및 리포솜으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
특히 바람직한 세포독성제는 방사성핵종 또는 암 세포를 사멸시킬 수 있는 세포독성제, 예컨대 화학치료제이다. 일정 바람직한 구현예에서, 화학치료제는 접합체를 형성하는 항-MUC1 항체에 부착된다. 화학치료제는 화합물이 항종양 효과를 갖는 한 특별히 제한되지 않고, 링커 구조에 연결될 수 있는 치환기 또는 부분 구조를 갖는다. 종양 세포에서 링커의 일부 또는 전부의 절단시에, 화학치료제 또는 항종양 화합물 모이어티가 방출되어 화학치료제가 항종양 효과를 나타내게 된다. 링커는 연결 위치에서 작용제로 절단되므로, 화학치료제는 그것의 원래의 구조로 방출되어 그것의 원래의 항종양 효과를 발휘한다.
세포독성제로서 접합시킬 수 있는 화학치료제의 특별한 예는 알킬화제 예컨대 시스플라틴, 항-대사산물, 식물 알칼로이드 및 터페노이드, 빈카 알칼로이드, 포도필로톡신, 탁산 예컨대 탁솔, 토포이소머라제 억제제 예컨대 이리노테칸 및 토포테칸, 항신생물제 예컨대 독소루비신 또는 마이크로튜불린 억제제 예컨대 마이탄신/마이탄시노이드를 포함한다.
화학치료제는 특히 V-ATPase 억제제, 프로-아폽토시스제, Bcl2 억제제, MCL1 억제제, HSP90 억제제, IAP 억제제, mTor 억제제, 마이크로튜불 안정화제, 마이크로튜불 탈안정화제, 돌라스타틴, 마이탄신, 마이탄시노이드, 아마톡신, 메티오닌 아미노펩티다제, 단백질 CRM1의 핵 이출 억제제, DPPIV 억제제, 프로테아솜 억제제, 미토콘드리아 내 포스포릴 전달 반응의 억제제, 단백질 합성 억제제, 키나제 억제제, CDK2 억제제, CDK9 억제제, 키네신 억제제, HDAC 억제제, 토포이소머라제 I 억제제, DNA 손상제, DNA 알킬화제, DNA 인터컬레이터, DNA 작은 홈 결합제, DHFR 억제제, 마이크로튜불 형성의 억제제, 마이크로튜불의 안정화제, 액틴의 안정화제, 토포이소머라제 II 억제제, 플래티늄 화합물, 리보솜 억제제, RNA 중합효소 II 억제제 및 박테리아 독소로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 특별한 구현예에서, 항-MUC1 항체에 부착된 화학치료제는 마이크로튜불 억제제 예컨대 마이탄시노이드, 토포이소머라제 I 억제제, DNA 손상제, DNA 알킬화제 및 DNA 작은 홈 결합제로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 화학치료제는 마이탄신 또는 마이탄시노이드이다. 접합에 유용한 마이탄시노이드의 특별한 예는 마이탄시놀, N 2'-디아세틸-N 2'-(3-머캅토-1-옥소프로필)-마이탄신 (DM1), N 2'-디아세틸-N 2'-(4-머캅토-1-옥소펜틸)-마이탄신 (DM3), 및 N 2'-디아세틸-N 2'-(4-메틸-4-머캅토-1-옥소펜틸)-마이탄신 (DM4)을 포함한다. 특히, DM1 또는 DM4는 항-MUC1 항체에 부착된다. 일부 구현예에서, 항-MUC1 항체에 부착된 화학치료제는 DNA 작은 홈 결합제, 특히 피롤로벤조디아제핀 (PBD), 피롤로벤조디아제핀 이량체 (PBD 이량체), 두오카마이신, 두오카마이신-히드록시벤즈아미드-아자인돌 (DUBA), 세코-두오카마이신-히드록시벤즈아미드-아자인돌 (세코-DUBA) 또는 독소루비신이다. 일부 구현예에서, 항-MUC1 항체에 부착된 화학치료제는 DNA 알킬화제, 특히 인돌리노벤조디아제핀 또는 옥사졸리디노벤조디아제핀이다. 일부 구현예에서, 항-MUC1 항체에 부착된 화학치료제는 DNA 손상제, 특히 칼리케아미신이다. 일부 구현예에서, 항-MUC1 항체에 부착된 화학치료제는 토포이소머라제 I 억제제, 특히 캄프토테신 및 그것의 유도체 예컨대 7-에틸-10-히드록시-캄프토테신 (SN-38), (S)-9-디메틸아미노메틸-10-히드록시캄프토테신 (토포테칸), (1S,9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-1,2,3,9,12,15-헥사히드로-9-히드록시-4-메틸-10H,13H-벤조[데]피라노 [3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-10,13-디온 (엑사테칸 (DX-8951)) 및 N-[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[데]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]-2-히드록시아세타미드 (DXd) 이다. 일부 구현예에서, 항-MUC1 항체에 부착된 화학치료제는 마이크로튜불 형성의 억제제, 특히 튜불리신, 안사미토신, 포도필로톡신 또는 빈블라스틴이다. 일부 구현예에서, 항-MUC1 항체에 부착된 화학치료제는 마이크로튜불의 안정화제, 특히 파클리탁셀 또는 에포틸론이다. 일부 구현예에서, 항-MUC1 항체에 부착된 화학치료제는 액틴의 안정화제, 특히 팔로톡신이다. 일부 구현예에서, 항-MUC1 항체에 부착된 화학치료제는 토포이소머라제 II 억제제, 특히 테니포시드, XK469, 라족산, 암사크린, 이다루비신 또는 메바론이다. 일부 구현예에서, 항-MUC1 항체에 부착된 화학치료제는 플래티늄 화합물, 특히 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 네다플라틴, 트리플라틴 테트라니트레이트, 펜안트리플라틴, 피코플라틴 또는 사트라플라틴이다. 일부 구현예에서, 항-MUC1 항체에 부착된 화학치료제는 리보솜 억제제, 특히 리신, 사포린, 아브린, 디프테리아 독소 또는 외독소 A이다. 일부 구현예에서, 항-MUC1 항체에 부착된 화학치료제는 RNA 중합효소 II 억제제, 특히 아마톡신, 예컨대, 예를 들어, 아마니틴이다. 일부 구현예에서, 항-MUC1 항체에 부착된 화학치료제는 박테리아 독소, 특히 탄저균 독소이다. 적합한 항체 약물 접합체는 또한 여기서 명백하게 인용하는, EP 16 151 774.3 및 LU 92659에도 기술되어 있다.
바람직한 구현예에서, 화학치료제는 (1S,9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-1,2,3,9,12,15-헥사히드로-9-히드록시-4-메틸-10H,13H-벤조[데]피라노 [3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-10,13-디온 (엑사테칸 (DX-8951)) 또는 DXd 이다.
엑사테칸(DX-8951) 은 하기 식으로 표시되는 항종양 화합물이다:
[식 1]
Figure pct00001
화합물은, 예를 들어, 미국 특허 공보 No. US2016/0297890 에 기재된 방법 또는 다른 알려진 방법에 의해 용이하게 수득될 수 있고, 위치 1 에서의 아미노 기는 바람직하게는 링커 구조에 대한 연결 위치로서 사용될 수 있다. 나아가, 엑사테칸은 종양 세포에서 방출될 수 있지만, 링커의 일부는 여전히 그에 부착되어 있다. 그러나, 화합물은 그러한 상태에서도 우수한 항종양 효과를 발휘한다.
DXd 는 하기 식으로 표시되는 화합물이다:
[식 2]
Figure pct00002
엑사테칸 또는 DXd 는 캄프토테신 구조를 가지므로, 산성 수성 매질 (예를 들어, 대략 pH 3) 에서는 형성된 락톤 고리 (닫힌 고리) 를 갖는 구조로 평형이 이동하지만, 염기성 수성 매질 (예를 들어, 대략 pH 10) 에서는 열린 락톤 고리 (열린 고리) 를 갖는 구조로 평형이 이동한다고 알려져 있다. 그러한 닫힌 고리 구조에 상응하는 엑사테칸 잔기 및 열린 고리 구조가 도입된 약물 접합체도 또한 대등한 항종양 효과를 가질 것으로 예상되고, 말할 필요도 없이 임의의 그러한 약물 접합체는 본 발명의 범위에 포함된다. 특정 구현예에서, 추가 작용제는 단백질의 폴리펩티드이다. 이러한 폴리펩티드 또는 단백질은 특히 항체의 폴리펩티드 사슬에 융합될 수 있다. 특정 구현예에서, 추가 작용제인 폴리펩티드 또는 단백질은 항체의 항체 경쇄의 C 말단에 융합된다. 항체가 2개의 항체 경쇄를 포함하는 구현예에서, 추가 작용제인 폴리펩티드 또는 단백질은 2개 항체 경쇄의 각각의 C 말단에 융합될 수 있다. 추가 구현예에서, 추가 작용제인 폴리펩티드 또는 단백질은 항체의 항체 중쇄의 C 말단에 융합된다. 항체가 2개 항체 중쇄를 포함하는 구현예에서, 추가 작용제인 폴리펩티드 또는 단백질은 2개 항체 중쇄의 각각의 C 말단에 융합될 수 있다. 추가 작용제는 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있고 특히 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 이러한 추가 작용제의 적합한 예인 폴리펩티드 또는 단백질은 사이토카인, 케모카인, 항체, 항원 결합 단편, 효소, 및 상호작용 도메인으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
특정 구현예에서, 추가 작용제인 폴리펩티드 또는 단백질은 활성화 신호를 차단 및/또는 촉발시키는 체크포인트 항체이다. 각각의 표적의 예는 활성화 표적으로서 CD40, CD3, CD137 (4-1BB), OX40, GITR, CD27, CD278 (ICOS), CD154 (CD40 리간드), CD270 (HVEM) 및 CD258 (LIGHT), 억제성 표적으로서 CTLA4, PD1, CD80, CD244, A2AR, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), BTLA, IDO, KIR, LAG3, TIM-3, VISTA 및 포스파티딜 세린, 및 그들의 개별 리간드 예컨대 PDL1을 포함한다. 특별한 예에서, 항-MUC1 항체는 본 명세서에 기술된 바와 같이 2개의 중쇄 및 2개 경쇄를 포함하고, 여기서 CD3에 특이적으로 결합하는 scFv 단편은 각각의 중쇄의 C 말단에 융합되거나; 또는 PDL1에 특이적으로 결합하는 scFv 단편은 각각의 경쇄의 C 말단에 융합된다.
추가 구현예에서, 추가 작용제인 폴리펩티드 또는 단백질은 면역조절성 화합물 예컨대 케모카인, 사이토카인 또는 성장 인자이다. 이와 관련하여 적합한 사이토카인은 인터페론 예컨대 인터페론-α, 인터페론-β 및 인터페론-γ, 및 인터류킨을 포함한다. 적합한 성장 인자는 G-CSF 및 GM-CSF를 포함한다.
링커의 구체적인 예는 하기 식 (a) 내지 (f) 중 임의의 것으로 표시되는 구조를 포함한다:
(a) -(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
(b) -(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
(c) -(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
(d) -(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
(e) -(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, 및
(f) -(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, 여기에서 -(숙신이미드-3-일-N)- 은 하기 식으로 표시되는 구조를 갖는다:
[식 3]
Figure pct00003
특별한 구현예에서, 링커는 하기 식 (a) 내지 (c) 중 임의의 것으로 표시되는 구조를 포함한다:
(a) -(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
(b) -(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-, 및
(c) -(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
바람직한 구현예에서, 링커는 하기 식 (a) 중 임의의 것으로 표시되는 구조를 포함한다:
(a) -(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
대안적 구현예에서, 접합체는 하기 식으로 표시되는 약물-링커 구조를 가지며, 항체는 하기 식으로 표시되는 약물 링커 구조에 티오에테르 결합에 의해 접합되어 있으며, 별표* 는 항체로의 연결점을 나타낸다:
[식 4]
Figure pct00004
바람직한 구현예에서, 접합체는 하기 식으로 표시되는 약물-링커 구조를 가지며,
[식 5]
Figure pct00005
식에서 AB 는 항체를 나타내고, y 는 항체 당 항체에 접합된 약물-링커 구조의 단위의 평균수를 나타내고, 항체는 상기 식으로 표시되는 약물 링커 구조에 티오에테르 결합에 의해 접합되어 있고, 항체는 앞서 언급된 항-MUC1 항체를 나타내며, 바람직하게는 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, 또는 중쇄 및 경쇄의 하기 조합 a) 내지 d) 중 임의의 하나이다:
(a) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10 의 아미노산 서열을 갖고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 12 의 아미노산 서열을 갖는다,
(b) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11 의 아미노산 서열을 갖고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 12 의 아미노산 서열을 갖는다,
(c) 중쇄는 SEQ ID NO: 15 의 아미노산 서열을 갖고, 경쇄는 SEQ ID NO: 16 의 아미노산 서열을 갖는다, 및
(d) 중쇄는 SEQ ID NO: 19 의 아미노산 서열을 갖고, 경쇄는 SEQ ID NO: 16 의 아미노산 서열을 갖는다.
앞서 언급된 접합체에서, 항체 분자 당 접합된 약물 분자 (또는 세포독성제) 의 수는 그의 효능 및 안전성에 영향을 미치는 핵심 인자이다. 항체-약물 접합체 (또는 접합체) 의 생산은 변함 없는 수의 접합된 약물 분자를 획득하도록 반응에 사용되는 출발 물질 및 시약의 양과 같은 반응 조건을 명시하여 수행된다. 저분자량 화합물의 화학 반응과는 다르게, 상이한 수의 접합된 약물 분자를 함유하는 혼합물이 통상적으로 수득된다. 항체 분자 당 접합된 약물 분자의 수가 정의되고 평균 값, 즉, 접합된 약물 분자의 평균수로 표시된다. 다르게 명시되지 않으면, 즉, 상이한 수의 접합된 약물 분자를 갖는 항체-약물 접합체 혼합물에 포함되는 특정 수의 접합된 약물 분자를 갖는 항체-약물 접합체를 나타내는 경우를 제외하면, 본 발명에 따른 접합된 약물 분자의 수는 원칙적으로 또한 평균 값을 의미한다. 항체 분자에 접합된 엑사테칸 분자 또는 DXd 의 수는 제어가능하고, 항체 당 접합된 약물 분자의 평균수로서, 대략 1 내지 10 개 엑사테칸 분자 또는 1 내지 10 개 DXd 가 접합될 수 있다. 엑사테칸 분자 또는 DXd 의 수는 바람직하게는 2 내지 8, 더욱 바람직하게는 4 내지 8, 추가로 바람직하게는 7 내지 8, 더 추가로 바람직하게는 8 이다. 당업자는 본 출원의 실시예의 설명에 기초하여 요구되는 수의 약물 분자를 항체 분자에 접합시키기 위한 반응을 디자인할 수 있고, 제어되는 수의 접합된 엑사테칸 분자를 포함하는 항체-약물 접합체를 수득할 수 있다는 점에 유의해야 한다.
상기 바람직한 구현예에서, 접합체가 종양 세포의 내부에 이송된 후에, 링커 모이어티가 절단되고, 그 후 DXd 가 방출되어 항종양 효과를 발휘한다 (Clinical Cancer Research, 2016, Oct 15; 22(20):5097-5108, Epub 2016 Mar 29).
다양한 방사성 또는 비-방사성 동위원소로 표지된 접합체가 또한 본 발명에 포함된다. 본 발명의 접합체를 구성하는 하나 이상 원자는 원자 동위원소를 비자연적 비로 함유할 수 있다. 원자 동위원소의 예는 중수소 (2H), 삼중수소 (3H), 요오드-125 (1251), 및 탄소-14 (14C) 를 포함한다. 나아가, 접합체는 방사성 동위원소 예컨대 삼중수소 (3H), 요오드-125 (125I,), 탄소-14 (14C), 구리 64 (64Cu), 지르코늄-89 (89Zr), 요오드-124 (124I), 불소-18 (18F), 인듐-111 (111I), 탄소-11 (11C) 및 요오드-131 (131I) 로 방사성-표지될 수 있다. 방사성 동위원소로 표지된 접합체는 치료제 또는 예방제, 연구용 시약 예컨대 어세이 시약 및 진단용 물질 예컨대 인 비보 (in vivo) 진단 이미징제로서 유용하다. 방사능과 관련되지 않고, 임의의 동위원소 변이체 유형의 접합체가 본 발명의 범위 내에 있다.
핵산, 발현 카세트, 벡터, 세포주 및 조성물
본 발명에 따른 접합체의 항체 부분은 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 상기 핵산의 핵산 서열은 항체를 코딩하기에 적합한 임의의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 그러나, 바람직하게 핵산 서열은 핵산을 발현시키려는 숙주 세포 또는 유기체의 특이적 코돈 용법, 특히 인간 코돈 용법에 대해 적어도 부분적으로 적합화된다. 핵산은 이중 가닥 또는 단일 가닥 DNA 또는 RNA, 바람직하게 이중 가닥 DNA 예컨대 cDNA 또는 단일 가닥 RNA 예컨대 mRNA일 수 있다. 하나의 연속적인 핵산 분자일 수 있거나 또는 각각이 항체의 상이한 부분을 코딩하는, 몇개 핵산 분자로 구성될 수 있다. PankoMab 변이체 (PM-N54Q)의 중쇄의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 17로 표시될 수 있고, PankoMab 변이체 (PM-N54Q)의 경쇄의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 18로 표시될 수 있다.
항체가 하나 초과의 상이한 아미노산 사슬, 예컨대 항체의 경쇄 및 중쇄로 구성되면, 핵산은 예를 들어 별개의 아미노산 사슬을 생성시키기 위해서 바람직하게 조절 엘리먼트 예컨대 IRES 엘리먼트에 의해 이격된, 각각이 항체의 아미노산 사슬 중 하나를 코딩하는 몇개 코딩 영역을 함유하는 단일 핵산 분자일 수 있거나, 또는 핵산은 각각의 핵산 분자가 각각이 항체의 아미노산 사슬 중 하나를 코딩하는 하나 이상의 코딩 영역을 포함하는 것인 몇개의 핵산 분자로 구성될 수 있다. 항체를 코딩하는 코딩 영역 이외에도, 핵산은 또한 예를 들어, 다른 단백질을 코딩할 수 있거나, 코딩 영역(들)의 전사 및/또는 번역에 영향을 미칠 수 있거나, 핵산의 안정성 또는 다른 물리적 또는 화학적 성질에 영향을 미칠 수 있거나, 또는 전혀 기능을 갖지 않을 수도 있는, 추가 핵산 또는 다른 변형을 더 포함할 수도 있다.
발현 카세트 또는 벡터는 상기 핵산 및 상기 핵산에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 또한, 발현 카세트 또는 벡터는 추가 엘리먼트, 특히 핵산의 전사 및/또는 번역, 발현 카세트 또는 벡터의 증폭 및/또는 복제, 숙주 세포의 게놈으로 발현 카세트 또는 벡터의 통합, 및/또는 숙주 세포 내 발현 카세트 또는 벡터의 카피수에 영향을 미칠 수 있고/있거나 조절할 수 있는 엘리먼트를 포함할 수 있다. 항체를 발현시키기 위한 개별 발현 카세트를 포함하는 적합한 발현 카세트 및 벡터는 당분야에 충분히 공지되어 있으므로, 여기서 추가 설명은 필요로 하지 않는다.
숙주 세포는 핵산 또는 발현 카세트 또는 벡터를 포함할 수 있다. 숙주 세포는 임의의 숙주 세포일 수 있다. 단리된 세포 또는 조직에 포함된 세포일 수 있다. 바람직하게, 숙주 세포는 배양된 세포, 특히 초대 세포 또는 확립 세포주의 세포, 바람직하게 종양-유래 세포이다. 바람직하게, 박테리아 세포 예컨대 이. 콜라이 (E. coli), 효모 세포 예컨대 사카로마이세스 (Saccharomyces) 세포, 특히 에스. 세레비지아에 (S. cerevisiae), 곤충 세포 예컨대 Sf9 세포, 또는 포유동물 세포, 특히 인간 세포 예컨대 종양-유래 인간 세포, 햄스터 세포 예컨대 CHO, 또는 영장류 세포이다. 바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 인간 골수성 백혈병 세포로부터 유래된다. 바람직하게, 하기의 세포 또는 세포주로부터 선택된다: K562, KG1, MUTZ-3, 또는 이로부터 유래된 세포 또는 세포주, 또는 상기 언급된 세포 중 적어도 하나를 포함하는 세포 또는 세포주의 혼합물. 숙주 세포는 바람직하게 NM-H9D8, NM-H9D8-E6, NM H9D8-E6Q12, 및 상기 숙주 세포 중 어느 하나로부터 유래된 세포 또는 세포주로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 이들 세포주 및 그들 성질은 PCT-출원 WO 2008/028686 A2에 상세히 기술된다. 추가 구현예에서, 숙주 세포는 CHO dhfr- 세포주 예컨대 ATCC No. CRL-9096의 세포주이다. 바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 특이적 글리코실화 패턴을 갖는, 글리코단백질, 특히 항체의 발현을 위해 최적화된다. 바람직하게, 핵산의 코딩 영역의 코돈 용법 및/또는 발현 카세트 또는 벡터의 프로모터 및 추가 엘리먼트는 사용되는 숙주 세포의 유형과 상용성이고, 보다 바람직하게는 그를 위해 최적화된다. 바람직하게, 항체는 상기 기술된 바와 같은 숙주 세포 또는 세포주에 의해 생산된다.
항체 생산 방법은 본원에 기재된 바와 같은 숙주 세포를 사용할 수 있다. 방법은 특히 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계, 항체의 발현에 적합한 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 숙주 세포에 의해 발현된 항체를 수득하는 단계를 포함한다. 본원에 기재된 항체는 상기 방법으로 수득될 수 있거나 또는 수득가능할 수 있다.
또다른 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 접합체를 포함하는 조성물을 제공한다. 더 나아가서, 조성물은 용매, 희석제, 및 부형제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 성분을 포함할 수 있다. 바람직하게, 조성물은 약학 조성물이다. 이러한 구현예에서, 조성물의 성분은 바람직하게는 모두 약학적으로 허용가능하다. 조성물은 고형 또는 유체 조성물, 특히 - 바람직하게 수성 - 용액, 에멀션 또는 현탁액 또는 동결건조 분말일 수 있다.
의학에서의 용도
접합체는 특히 의학, 특히 질환, 특히 본 명세서에 기술된 바와 같은 질환, 바람직하게 암, 감염, 염증성 질환, 이식편 대 숙주 질환 및 면역결핍증의 요법, 진단, 예후, 검출 및/또는 모니터링에 유용하다.
그러므로, 추가 양상에서, 본 발명은 의학에서 사용하기 위한 접합체 또는 조성물을 제공한다. 바람직하게, 의학 용도는 질환 예컨대, 예를 들어 비정상 세포 성장과 연관된 질환 예컨대 암, 감염 예컨대 박테리아, 바이러스, 진균 또는 기생충 감염, 염증성 질환 예컨대 자가면역 질환 및 염증성 장 질환, 및 면역 활성 감소와 연관된 질환 예컨대 면역결핍증의 치료, 예후, 진단, 검출 및/또는 모니터링에서의 용도이다. 바람직한 구현예에서, 질환은 암이다.
바람직하게, 암은 바람직하게 면역조직화학, ELISA, RIA, 효소-연결 면역스폿 (ELISPOT) 어세이, 도트 블롯팅, 옥터로니 (Ouchterlony) 검사 또는 교차-면역전기영동 (CIE), 또는 인-시츄 하이브리드화에 의해 검출가능한, MUC1 (TA-MUC1) 의 검출가능한 발현을 갖는다. 특히 특히 면역조직화학 또는 인-시츄 하이브리드화에 의해 검출가능한 MUC1 또는 TA-MUC1 발현을 갖는 세포를 포함한다. 암은 항-MUC1 항체의 투여 이전에 MUC1 또는 TA-MUC1 수준에 대해 시험될 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 접합체를 포함하는 키트 및 장치, 및 질병 예컨대 암과 연관된 MUC1의 진단, 검출 또는 모니터링에서 유용한 연관 방법을 더 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 접합체를 포함하는 시험 또는 진단을 위한 샌드위치 ELISA 키트가 제공된다. 이러한 키트는 하나 이상의 MUC1 (TA-MUC1) 단백질 표준 용액, 착색 시약, 희석용 완충 용액, 고체상 용 항체, 검출용 항체, 및 세척 용액 등을 더 포함할 수 있다. 바람직하게, 항원에 결합된 접합체의 양은 흡광, 형광, 발광 또는 방사성동위원소 (RI) 방법과 같은 방법의 적용에 의해 측정될 수 있다. 바람직하게, 흡광 플레이트 판독기, 형광 플레이트 판독기, 발광 플레이트 판독기, RI 액상 섬광 계측기 등이 측정에 사용된다.
항체는 면역조직화학 (IHC) 분석에 사용될 수 있다.
면역조직화학은 이러한 접근법이 조직 절편을 항원-결합 항체 (1차 항체)와 반응시키는 단계 및 항원과 결합된 1차 항체를 검출하는 단계를 포함하는 한 특별히 제한되지 않는다.
전이를 포함한 상이한 형태의 암이 본 발명에 따른 접합체를 사용해 치료될 수 있다. 암은 특히 결장암, 폐암, 난소암, 유방암 예컨대 삼중 음성 유방암, 췌장암, 자궁경부암, 자궁내막암, 위장암, 신장암, 두경부암, 갑상선암 및 요로상피 암으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 암은 특히 위암, 간암, 방광암, 피부암, 전립선암 및 혈액암으로부터 더 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 암은 전이성 암이다. 이 암은 임의의 유형의 전이, 예컨대 피부 전이, 림프절 전이, 폐 전이, 간 전이, 복막 전이, 늑막 전이 및/또는 뇌 전이를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 암은 염증 표현형을 갖는다. 이들 구현예에서, 상기 기술된 임의의 암 유형은 염증성 암일 수 있다.
특정 구현예에서, 바이러스 감염은 인간 면역결핍 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 엡스타인 바 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 림프구성 맥락수막염 바이러스, B형 간염 바이러스 또는 C형 간염 바이러스에 의해 초래된다. 염증성 질환은 염증성 장 질환, 골반 염증성 질환, 허혈성 뇌졸중, 알츠하이머병, 천식, 심상성 천포창 및 피부염/습진으로부터 선택될 수 있다. 자가면역 질환은 셀리악병, 1형 진성 당뇨병, 그레이브스병, 염증성 장 질환, 다발성 경화증, 건선, 류마티스성 관절염, 전신 홍반 루푸스, 백반증, 건선성 관절염, 아토피 피부염, 피부경화증, 사르코이드증, 원발성 담즙성 경변증, 길랑-바레 증후군, 자가면역 간염 및 강직성 척추염으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 질환은 MUC1, 특히 TA-MUC1을 발현하는 세포를 포함하거나 또는 그와 연관된다. 예를 들어, 치료하려는 암은 MUC1 양성, 특히 TA-MUC1 양성이고, 다시 말해서, MUC1, 특히 TA-MUC1을 발현하는 암 세포를 포함한다.
특별한 구현예에서, 접합체는 다른 치료제와의 병용 치료, 특히 다른 항암제와의 병용으로 암의 치료를 위해 사용된다. 상기 추가 치료제는 임의의 기지 항암제일 수 있다. 본 발명에 따른 접합체와 병용할 수 있는 적합한 항암 치료제는 화학치료제, 다른 항체, 면역자극제, 사이토카인, 케모카인, 및 백신일 수 있다. 더 나아가서, 접합체에 의한 요법은 방사선 요법, 수술 및/또는 전통적인 중국 의학과 병용할 수 있다.
접합체와 병용하여 사용할 수 있는 항암제는 임의의 화학치료제, 특히 MUC1 양성 암의 치료에 유효하다고 공지된 화학치료제로부터 선택될 수 있다. 화학치료제의 유형은 또한 치료하려는 암에 따라 좌우된다. 병용 파트너는 탁산 예컨대 파클리탁셀 (Taxol), 도세탁셀 (Taxotere) 및 SB-T-1214; 사이클로포스파미드; 이마티닙; 파조파닙; 카페시타빈; 시타라빈; 비노렐빈; 젬시타빈; 안트라사이클린 예컨대 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 발루비신 및 미톡산트론; 아로마타제 억제제 예컨대 아미노글루테티미드, 테스토락톤 (Teslac), 아나스트로졸 (Arimidex), 레트로졸 (Femara), 엑스메스탄 (Aromasin), 보로졸 (Rivizor), 포르메스탄 (Lentaron), 파드로졸 (Afema), 4-히드록시안드로스텐디온, 1,4,6-안드로스타트리엔-3,17-디온 (ATD) 및 4-안드로스텐-3,6,17-트리온 (6-OXO); 토포이소머라제 억제제 예컨대 이리노테칸, 토포테칸, 캄프토테신, 라멜라린 D, 에토포시드 (VP-16), 테니포시드, 독소루비신, 다우노루비신, 미톡산트론, 암사크린, 엘립티신, 아우린트리카르복실산 및 HU-331; 플래티늄 기반 화학치료제 예컨대 시스-디아민디클로로플래티늄(II) (시스플라틴), 시스-디아민(1,1-시클로부탄디카르복실라토)플래티늄(II) (카르보플라틴) 및 [(1R,2R)-시클로헥산-1,2-디아민](에탄디오아토-O,O')플래티늄(II) (옥살리플라틴); PARP 억제제 예컨대 올라파립, 루카파립 및 니라파립; TLR 효현제 예컨대 이미퀴모드 및 레시퀴모드; 및 항대사산물제, 특히 안티폴레이트 예컨대 메토트렉세이트, 페메트렉세드, 랄티트렉세드 및 프랄라트렉세이트, 피리미딘 유사체 예컨대 플루오르우라실, 젬시타빈, 플록수리딘, 5-플루오로우라실 및 테가푸어-우라실, 및 푸린 유사체, 선택적 에스트로겐 수용체 조절인자 및 에스트로겐 수용체 하류 조절제로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
더 나아가서, 또한 치료 항체는 추가 병용 파트너로서 사용될 수 있다. 항-MUC1 항체와 상이한 암 요법에 유용한 임의의 항체일 수 있다. 특히, 추가 항체는 미국 식품 의약국 (U.S. Food and Drug Administration) (FDA), 유럽 의약청 (European Medicines Agency) (EMA, 구명칭 EMEA) 및 연방 의약품 및 의료기기 관리처 (Bundesinstitut fuer Arzneimittel und Medizinprodukte) (BfArM)와 같은 기관이 암 치료에 대해 승인한다. 병용 치료에 사용할 수 있는 추가 항체의 예에는 항-EGFR 항체 예컨대 세툭시맙, 토무조툭시맙, 파니투무맙, 잘루투무맙, 니모투주맙, 마투주맙 및 네시투무맙; 항-HER2 항체 예컨대 트라스투주맙, 티미구투주맙 및 페르투주맙; 항-VEGF 항체 예컨대 베바시주맙 (Avastin); 항-CD52 항체 예컨대 알렘투주맙 (Campath); 항-CD30 항체 예컨대 브렌툭시맙 (Adcetris); 항-CD33 항체 예컨대 젬투주맙 (Mylotarg); 및 항-CD20 항체 예컨대 리툭시맙 (Rituxan, Mabthera), 토시투모맙 (Bexxar) 및 이브리투모맙 (Zevalin)가 있다. 본 명세서에 기술된 암 요법과 병용하기에 적합한 추가의 예시적인 항체는 톰슨-프라이덴리히 항원 (TFα, TFβ), Tn, 루이스 Y, CD44, 폴레이트 수용체 α, NeuGc-GM3 강글리오시드, DLL-3, RANKL, PTK7, Notch-3, 에프린 A4, 인슐린-유사 성장 인자 수용체 1, 액티빈 수용체-유사 키나제-1, 클라우딘-6, 디시알로강글리오시드 GD2, 엔도글린, 경막 글리코단백질 NMB, CD56, 종양-연관 칼슘 신호 전달인자 2, 조직 인자, 엑토뉴클레오티드 파이로포스파타제/포스포디에스터라제 3, CD70, P-카데린, 메소테린, 전립선의 6개 경막 상피 항원 1 (STEAP1), 암배 항원-관련 세포 부착 분자 5 (CEACAM5), 넥틴 4, 구아닐릴 시클라제 C, 용질 운반체 패밀리 44 구성원 4 (SLC44A4), 전립선-특이적 막 항원 (PSMA), 아연 수송체 ZIP6 (LIV1 (ZIP6)), SLIT 및 NTRK-유사 단백질 6 (SLITRK6), 영양아층 글리코단백질 (TPBG; 5T4), Fyn3, 카본산 언히드라제 9, NaPi2b, 피브로넥틴 엑스트라-도메인 B, 엔도테린 수용체 ETB, VEGFR2 (CD309), 테나신 c, 콜라겐 IV 및 페리오스틴으로 이루어지는 군으로부터 선택된 항원에 대한 항체를 포함한다.
접합체는 체크포인트 항체, 즉 면역조절성 표적을 차단 또는 활성화시키는 항체와 더욱 병용할 수 있다. 그리하여, 면역 반응에 대한 억제 신호가 차단될 수 있고/있거나 활성화 신호가 촉발될 수 있다. 개별 표적의 예는 활성화 표적으로서 CD40, CD3, CD137 (4-1BB), OX40, GITR, CD27, CD278 (ICOS), CD154 (CD40 리간드), CD270 (HVEM) 및 CD258 (LIGHT), 억제 표적으로서 CTLA4, PD1, CD80, CD244, A2AR, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), BTLA, IDO, KIR, LAG3, TIM-3, VISTA 및 포스파티딜세린, 및 그들의 개별 리간드 예컨대 PDL1을 포함한다.
추가 구현예에서, 접합체는 면역조절성 화합물 예컨대 케모카인, 사이토카인, 성장 인자 및 백신에 의한 치료와 병용될 수 있다. 이와 관련하여 적합한 사이토카인은 인터페론 예컨대 인터페론-α, 인터페론-β 및 인터페론-γ, 및 인터류킨을 포함한다. 적합한 성장 인자는 G-CSF 및 GM-CSF를 포함한다.
접합체는 바람직하게 원발성 종양, 재발성 종양 및/또는 이러한 종양의 전이의 치료를 위해 사용되고, 특히 수술 이전, 그 동안 또는 그 이후의 치료 및 전이의 예방 또는 치료를 위해 사용된다. 접합체는 특히 보강 요법으로서 환자의 치료를 위한 것이다. 특정 구현예에서, 접합체는 신보강 요법으로서 또는 병용 신보강-보강 요법에서 환자의 치료를 위한 것이다. 더 나아가서, 접합체는 완화 요법으로서 환자의 치료를 위한 것이다.
접합체에 의한 암 요법은 바람직하게 종양 성장의 억제, 특히 종양 크기의 감소를 야기시킨다. 더 나아가서, 치료를 통해서 추가 전이의 발생이 예방되고/되거나 그들 수가 감소된다. 치료는 바람직하게 무진행 생존의 증가 및/또는 수명과 그에 따라 전체 생존의 증가를 야기시킨다.
본 발명은 본 발명에 따른 접합체를 사용한 질환의 요법, 진단, 예후, 검출 및/또는 모니터링의 방법을 더 제공한다. 의학에서 접합체의 용도의 구현예 및 예시가 또한 유사하게 의학 방법에 적용된다. 특히, 본 발명에 따른 접합체의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법이 제공된다.
예를 들어, 본 발명은 본 발명에 따른 접합체의 치료 유효량을 암에 걸린 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특별한 구현예에서, 암은 TA-MUC1을 발현하는 것을 특징으로 한다. 암은 난소암, 유방암, 췌장암, 폐암, 결장암, 위암, 간암, 신장암, 혈액암, 자궁내막암, 갑상선암, 백혈병, 정상피종, 흑색종, 암종, 기형종, 림프종, 육종, 중피종, 신경아세포종, 신경교종, 직장암, 부신암, 피부암, 뇌암, 자궁경부암, 장관암, 장암, 두경부암, 위장암, 림프절암, 식도암, 결장직장암, 이비인후 (ENT) 암, 전립선암, 방광암, 자궁암 및 이의 전이로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
더 나아가서, 본 발명은 본 발명에 따른 접합체와 시험 샘플을 접촉시키는 단계를 포함하는, 암을 진단, 검출 또는 모니터링하기 위한 방법을 제공한다.
MUC1 결합 친화성을 증가시키는 방법
항체의 MUC1 결합 친화성을 증가시키는 방법이 제공되며, 항체는
(i) 상보성-결정 영역 (CDR) 으로서 SEQ ID NO: 1 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, SEQ ID NO: 8 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 SEQ ID NO: 3 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3 을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) 상보성-결정 영역 (CDR) 으로서 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, SEQ ID NO: 5 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 및 SEQ ID NO: 6 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3 을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함할 수 있고,
방법은 CDR-H2의 위치 8의 아미노산 잔기를 아스파라긴을 제외한 임의의 아미노산 잔기로 치환시켜서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2를 생성시키는 단계를 포함한다.
MUC1 결합 친화성을 증가시키려는 항체는 특히 CDR-H2 서열의 위치 8에 아스파라긴을 포함하는 것을 제외하고, 본 명세서에 기술된 바와 같은 MUC1에 결합할 수 있는 항체이다.
특정 구현예에서, MUC1 결합 친화성을 증가시키고자 하는 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특히, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열과 적어도 95%, 특히 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 이들 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 여전히 SEQ ID NO: 1, 8 및 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함한다. 그리하여, SEQ ID NO: 11에 대한 임의의 서열 편차는 CDR이 아닌, 프레임워크 영역에 위치된다. 특히, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, MUC1 결합 친화성을 증가시키고자 하는 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특히, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열과 적어도 95%, 특히 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 이들 구현예에서, 경쇄 가변 영역은 여전히 SEQ ID NO: 4, 5 및 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함한다. 그리하여, SEQ ID NO: 12에 대한 임의의 서열 편차는 CDR이 아닌 프레임워크 영역에 위치된다. 특히, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함한다.
특별한 구현예에서, MUC1 결합 친화성을 증가시키려는 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지며, 여기서 CDR은 여전히 SEQ ID NO: 1, 8 및 3의 아미노산 서열을 가지고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지며, 여기서 CDR은 여전히 SEQ ID NO: 4, 5 및 6의 아미노산 서열을 갖는다. 특히, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 가지고, 여기서 CDR은 여전히 SEQ ID NO: 1, 8 및 3의 아미노산 서열을 가지며, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 가지고, 여기서 CDR은 여전히 SEQ ID NO: 4, 5 및 6의 아미노산 서열을 갖는다.
예를 들어, MUC1 결합 친화성을 증가시키려는 항체는 WO　2004/065423　A2 또는 WO　2011/012309　A1에 개시된 바와 같은 항-MUC1 항체이다. 특히, MUC1 결합 친화성을 증가시키려는 항체는 가티포투주맙 또는 PankoMab이다.
MUC1 결합 친화성이 증가된 항체는 특허 본 명세서에 기술된 바와 같이 MUC1에 결합할 수 있는 항체이다.
특정 구현예에서, MUC1 결합은 본 명세서에 기술된 바와 같다. MUC1 결합 친화성의 증가는 특히 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 33% 또는 적어도 50%의 증가를 의미한다. 바람직한 구현예에서, MUC1 결합 친화성은 적어도 50% 까지 증가된다. MUC1 결합 친화성은 특히 예를 들어 실시예 4a 및 b에 기술된 바와 같이, 표면 플라스몬 공명 분석 또는 switchSENSE® 기술 (DRX2 Biosensor, manufactured by Dynamic Biosensors GmbH)을 사용하여, 실시예에 기술된 바와 같이 결정할 수 있다.
특정 구현예에서, CDR-H2의 위치 8의 아미노산 잔기를 치환시키는 단계는 돌연변이를 항체를 코딩하는 핵산에 도입시켜 달성되고, 여기서 돌연변이는 상기 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈에 도입된다. 돌연변이의 도입은 임의의 방법으로 수행할 수 있다. 몇가지 적합한 방법이 당분야에 공지되어 있고 당업자는 돌연변이를 도입시키기 위해 필요한 작업을 수행할 수 있다. 그러면 증가된 MUC1 결합 친화성을 갖는 항체는 예를 들어 숙주 세포에서 돌연변이된 핵산을 발현시켜서 수득할 수 있다. 핵산, 숙주 세포 및 항체의 제조 방법은 본 명세서에 기술되어 있고 MUC1 결합 친화성을 증가시키기 위한 방법에 사용될 수 있다.
특별한 구현예에서, 항체의 MUC1 결합 친화성을 증가시키는 방법은
(a) MUC1 결합 친화성을 증가시키려는 항체를 코딩하는 핵산을 제공하는 단계;
(b) 돌연변이를 상기 핵산에 도입시켜서 돌연변이된 핵산을 생성시키는 단계로서, 돌연변이는 CDR-H2의 위치 8의 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈에 도입되어서 상기 코돈이 아스파라긴을 제외한 임의의 아미노산 잔기를 코딩하게 되는 것인 단계; 및
(c) 돌연변이된 핵산을 발현시켜서 증가된 MUC1 결합 친화성을 갖는 항체를 생성시키는 단계를 포함한다.
증가된 MUC1 결합 친화성을 갖는 항체를 제조하는 방법은
(a) (i) 상보성-결정 영역 (CDR)으로서 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) 상보성-결정 영역 (CDR)으로서 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 항체를 코딩하는 핵산을 제공하는 단계;
(b) 돌연변이를 상기 핵산에 도입시켜서 돌연변이된 핵산을 생성시키는 단계로서, 돌연변이는 CDR-H2의 위치 8의 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈에 도입되어서 상기 코돈이 아스파라긴을 제외한 임의의 아미노산 잔기를 코딩하게 되는 것인 단계; 및
(c) 숙주 세포에서 돌연변이된 핵산을 발현시켜서 증가된 MUC1 결합 친화성을 갖는 항체를 생성시키는 단계를 포함할 수 있다.
다른 양상, 특히 항체의 MUC1 결합 친화성을 증가시키는 방법에 대해 본 명세서에서 기술된 구현예, 특성 및 예는 또한 유사하게 증가된 MUC1 결합 친화성을 갖는 항체의 제조 방법에 적용된다.
특정 구현예에서, 증가된 MUC1 결합 친화성을 갖는 항체의 제조 방법은 (d) 증가된 MUC1 결합 친화성을 갖는 항체를 처리하는 단계를 더 포함한다.
예를 들어, 증가된 MUC1 결합 친화성을 갖는 항체를 처리하는 단계는 세포 배양으로부터 항체를 단리시키는 단계를 포함할 수 있다. 항체의 단리는 특히 세포 배양의 나머지 성분으로부터 항체의 분리를 의미한다. 세포 배양 배지로부터 항체의 분리는 예를 들어 크로마토그래피 방법을 통해 수행될 수 있다. 항체를 단리하기 위한 적합한 방법 및 수단은 당분야에 공지되어 있고 당업자가 쉽게 적용할 수 있다.
수득된 항체는 임의로는 추가의 처리 단계 예컨대 예를 들어 변형 단계 예컨대 항체와 추가 작용제의 화학적 또는 효소적 커플링, 및/또는 바람직한 품질의 항체 및 조성물을 제조하기 위한 제제화 단계를 겪을 수 있다. 이러한 추가의 처리 단계 및 방법은 일반적으로 당분야에 공지되어 있다.
추가 구현예에서, 단계 (d)는 항체를 포함하는 약학 제제를 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 항체를 포함하는 약학 제제의 제공 단계 또는 약학 조성물로서 항체의 제제화 단계는 특히 항체를 포함하는 조성물의 완충제 용액 또는 완충제 용액 성분을 교환시키는 단계를 포함한다. 더 나아가서, 이 단계는 항체의 동결건조를 포함할 수 있다. 특히, 항체는 오직 약학적으로 허용가능한 성분을 포함하는 조성물로 전달된다.
생산 방법 1
항체가 링커 구조에 티오에테르를 통해 연결되어 있는 아래 제시된 식 (1) 로 표시되는 항체-약물 접합체는 항체의 환원에 의해 다이설파이드 결합으로부터 전환된 설프히드릴 기를 갖는 항체를, 알려진 방법에 의해 수득가능한 (예를 들어, 특허 공개 문헌 US2016/297890 에 기재된 방법 (예를 들어, 단락 [0336] 내지 [0374] 에 기재된 방법) 에 의해 수득가능한) 화합물 (2) 와 반응시킴으로써 생산될 수 있다. 이러한 항체-약물 접합체는, 예를 들어, 하기 방법에 의해 생산될 수 있다.
[식 6]
Figure pct00006
식에서 AB 는 설프히드릴 기를 갖는 항체 (3a) 를 나타내며, 여기에서
L1 은 -(숙신이미드-3-일-N)- 로 나타내는 구조를 갖고,
L1' 는 하기 식으로 표시되는 말레이미딜 기를 나타낸다.
[식 7]
Figure pct00007
-L1-LX 는 하기 식 중 임의의 것으로 나타내는 구조를 갖는다:
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, 및
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
그들 중에서, 더욱 바람직한 것은 하기이다:
-(숙신이미드-3-일-N)- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-, 및
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
추가로 바람직한 것은 하기이다:
-(숙신이미드-3-일-N)- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, 및
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH--CH2CH2CH2-C(=O)-.
(NH-DX) 은 하기 식으로 표시되는 구조를 갖는다:
[식 8]
Figure pct00008
그리고 그것은 엑사테칸의 위치 1 에서 아미노 기의 하나의 수소 원자를 제거함으로써 유도되는 기를 나타낸다. 위에 기재된 반응식 (식 8) 에서, 식 (1) 의 화합물은 약물로부터 링커 말단으로 하나의 구조 모이어티가 하나의 항체에 연결되어 있는 구조를 갖는 것으로 해석될 수 있다. 그러나, 이러한 설명은 편의를 위해 제공되고, 실제로 많은 경우에 복수의 앞서 언급된 구조 모이어티가 하나의 항체 분자에 연결되어 있다. 아래 기재된 생산 방법의 설명에 대해서도 마찬가지이다.
구체적으로, 항체-약물 접합체 (1) 는 알려진 방법에 의해 수득가능한 (예를 들어, 특허 공개 문헌 US2016/297890 에 기재된 방법 (예를 들어, 단락 [0336] 내지 [0374] 에 기재된 방법) 에 의해 수득가능한) 화합물 (2) 를, 설프히드릴 기를 갖는 항체 (3a) 와 반응시킴으로써 생산될 수 있다.
항체 (3a) 상에 설프히드릴 기의 제공은 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 달성될 수 있다 (Hermanson, G.T, Bioconjugate Techniques, pp. 56-136, pp. 456-493, Academic Press (1996)). 방법의 예는 하기를 포함할 수 있으나, 그에 제한되지 않는다: 트라우트 시약을 항체의 아미노 기와 반응시킨다; N-숙신이미딜 S-아세틸티오알카노에이트를 항체의 아미노 기와 반응시키고, 그에 뒤이어 히드록실아민과 반응시킨다; N-숙신이미딜 3-(피리딜디티오)프로피오네이트를 항체와 반응시키고, 그에 뒤이어, 환원제와 반응시킨다; 항체를 환원제 예컨대 디티오트레이톨, 2-머캅토에탄올, 또는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드 (TCEP) 와 반응시켜 항체 내의 사슬간 다이설파이드 결합을 환원시켜, 설프히드릴 기를 형성시킨다.
구체적으로, 사슬간 다이설파이드 결합이 일부 또는 완전히 감소된 항체는 항체 중 사슬간 다이설파이드 결합 당 0.3 내지 3 몰 당량의 TCEP 를 환원제로서 사용하고, 킬레이트화제를 함유하는 완충액에서 환원제를 항체와 반응시킴으로써 수득될 수 있다. 킬레이트화제의 예는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 및 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA) 을 포함할 수 있다. 킬레이트화제는 1 mM 내지 20 mM 의 농도로 사용될 수 있다. 소듐 포스페이트, 소듐 보레이트, 소듐 아세테이트 등의 용액을 완충액으로서 사용할 수 있다. 구체적 예로서, 설프히드릴 기가 일부 또는 완전히 감소된 항체 (3a) 는 4℃ 내지 37℃ 에서 1 내지 4 시간 동안 항체를 TCEP 와 반응시킴으로써 수득될 수 있다.
약물-링커 모이어티에 대한 설프히드릴 기의 부가 반응을 수행함으로써, 약물-링커 모이어티는 티오에테르 결합에 의해 접합될 수 있다는 점에 유의해야 한다.
그 후, 설프히드릴 기를 갖는 항체 (3a) 당 2 내지 20 몰 당량의 화합물 (2) 을 사용하여, 항체 당 2 내지 8 개 약물 분자가 접합된 항체-약물 접합체 (1) 가 생산될 수 있다. 구체적으로, 그에 용해된 화합물 (2) 을 함유하는 용액을 반응을 위해 설프히드릴 기를 갖는 항체 (3a) 를 함유하는 완충액에 첨가할 수 있다. 이러한 상황에서, 소듐 아세테이트 용액, 소듐 포스페이트, 소듐 보레이트 등이 완충액으로서 사용될 수 있다. 반응을 위한 pH 는 5 내지 9 이며, 더욱 바람직하게는, 반응은 pH 7 근처에서 수행될 수 있다. 유기 용매 예컨대 디메틸 설폭시드 (DMSO), 디메틸포름아미드 (DMF), 디메틸아세타미드 (DMA), 또는 N-메틸-2-피롤리돈 (NMP) 이 화합물 (2) 를 용해시키기 위한 용매로서 사용될 수 있다. 1 내지 20% v/v 의 유기 용매에 용해된 화합물 (2) 를 함유하는 용액을 설프히드릴 기를 갖는 항체 (3a) 를 함유하는 완충액에 첨가함으로써 반응이 수행될 수 있다. 반응 온도는 0 내지 37℃, 더욱 바람직하게는 10 내지 25℃ 이고, 반응 시간은 0.5 내지 2 시간이다. 미반응 화합물 (2) 의 반응성을 티올-함유 시약으로 탈활성화시킴으로써 반응이 종결될 수 있다. 티올-함유 시약은, 예를 들어, 시스테인 또는 N-아세틸-L-시스테인 (NAC) 이다. 더욱 구체적으로, 1 내지 2 몰 당량의 NAC 를 사용되는 화합물 (2) 에 첨가하고, 수득된 혼합물을 실온에서 10 내지 30 분 동안 인큐베이션함으로써 반응이 종결될 수 있다.
항체-약물 접합체의 식별
생산된 항체-약물 접합체 (예를 들어, 항체-약물 접합체 (1)) 를 아래 기재된 통상적 절차에 따라 농축, 완충제 교환, 정제, 및 항체 농도 및 항체 분자 당 접합된 약물 분자의 평균수의 측정에 적용하여, 항체-약물 접합체 (1) 를 식별할 수 있다.
1. 통상적 절차 A: 항체 또는 항체-약물 접합체의 수성 용액의 농축.
Amicon Ultra (50,000 MWCO, Millipore Corporation) 컨테이너에, 항체 또는 항체-약물 접합체의 용액을 첨가하고, 항체 또는 항체-약물 접합체의 용액을 원심분리기 (Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.) 를 사용하여 원심분리 (2000 G 내지 4000 G 에서 5 내지 30 분 동안 원심분리) 에 의해 농축했다.
2. 통상적 절차 B: 항체 농도의 측정
UV 검출기 (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.) 를 사용하여, 항체 농도의 측정을 제조사에 의해 정의된 방법에 따라 수행했다. 이와 관련하여, 항체 사이에서 다른 280 nm 흡광 계수 (1.3 mL㎎-1㎝-1 내지 1.8 mL㎎-1㎝-1) 를 사용했다.
3. 통상적 절차 C: 항체를 위한 완충제 교환
Sephadex G-25 담체를 사용하여 NAP-25 칼럼 (Cat. No. 17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation) 을 제조사에 의해 정의된 방법에 따라 소듐 클로라이드 (50 mM) 및 EDTA (2 mM) 를 함유하는 포스페이트 완충제 (50 mM, pH 6.0) (본 명세서에서 PBS6.0/EDTA 로서 언급됨) 로 평형시켰다. 항체의 수성 용액을 NAP-25 칼럼 당 2.5 mL 의 양으로 적용하고, 그 후 3.5 mL 의 PBS6.0/EDTA 로 용출된 분획 (3.5 mL) 을 수집했다. 이 분획을 통상적 절차 A 에 의해 농축했다. 통상적 절차 B 를 사용하여 항체 농도를 측정한 후에, PBS6.0/EDTA 를 사용하여 항체 농도를 20 ㎎/mL 로 조정했다.
4. 통상적 절차 D: 항체-약물 접합체의 정제
NAP-25 칼럼을 임의의 상업적으로 입수가능한 완충액 예컨대 소르비톨 (5%) 을 함유하는 아세테이트 완충제 (10 mM, pH 5.5; 본 명세서에서 ABS 로서 언급됨) 로 평형시켰다. 항체-약물 접합체의 수성 반응 용액 (대략 2.5 mL) 을 NAP-25 칼럼에 적용하고, 그 후, 제조사에 의해 정의된 양의 완충액으로 용출을 수행하여, 항체 분획을 수집했다. 겔 여과 정제 과정 (여기에서 수집된 분획을 다시 NAP-25 칼럼에 적용하고, 용출을 완충액으로 수행했다) 을 총 2 또는 3 회 반복하여 비-접합된 약물 링커 및 저분자량 화합물 (트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드 (TCEP), N-아세틸-L-시스테인 (NAC), 및 디메틸 설폭시드) 을 배제한 항체-약물 접합체를 수득했다.
5. 통상적 절차 E: 항체-약물 접합체 중 항체 농도 및 항체 분자 당 접합된 약물 분자의 평균수의 측정
두 개의 파장 280 nm 및 370 nm 에서 항체-약물 접합체의 수성 용액의 UV 흡광도를 측정하고, 그 후 아래 제시된 계산을 수행함으로써 항체-약물 접합체 중 접합된 약물 농도를 계산할 수 있다.
임의의 제시된 파장에서의 총 흡광도는 시스템에 존재하는 모든 빛-흡수 화학종의 흡광도의 합계와 동일하다 [흡광도의 가성성]. 그러므로, 항체 및 약물의 몰 흡광 계수는 항체와 약물 사이의 접합 전과 후 사이에 다르지 않다는 가설에 기초하여, 항체-약물 접합체 중 항체 농도 및 약물 농도를 하기 등식으로 나타낸다:
A280 = AD,280 + AA,280 = εD,280CD + εA,280CA 등식 (1)
A370 = AD,370 + AA,370 = εD,370CD + εA,370CA 등식 (2)
이 맥락에서, A280 는 280 nm 에서의 항체-약물 접합체의 수성 용액의 흡광도를 나타내고, A370 는 370 nm 에서의 항체-약물 접합체의 수성 용액의 흡광도를 나타내고, AA,280 는 280 nm 에서의 항체의 흡광도를 나타내고, AA,370 는 370 nm 에서의 항체의 흡광도를 나타내고, AD,280 는 280 nm 에서의 접합체 전구체의 흡광도를 나타내고, AD,370 는 370 nm 에서의 접합체 전구체의 흡광도를 나타내고, εA,280 는 280 nm 에서의 항체의 몰 흡광 계수를 나타내고, εA,370 는 370 nm 에서의 항체의 몰 흡광 계수를 나타내고, εD,280 는 280 nm 에서의 접합체 전구체의 몰 흡광 계수를 나타내고, εD,370 는 370 nm 에서의 접합체 전구체의 몰 흡광 계수를 나타내고, CA 는 항체-약물 접합체 중 항체 농도를 나타내고, CD 는 항체-약물 접합체 중 약물 농도를 나타낸다.
이 맥락에서, εA,280, εA,370, εD,280, 및 εD,370 에 관하여, 미리 준비된 값 (계산에 기초하여 추정된 값 또는 화합물의 UV 측정에 의해 수득된 측정 값) 을 사용한다. 예를 들어, εA,280 은 항체의 아미노산 서열로부터 추정될 수 있다 알려진 계산 방법에 의해 (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423). εA,370 은 일반적으로 영이다. εD,280 및 εD,370 은 사용된 접합체 전구체가 특정 몰 농도로 용해되어 있는 용액의 흡광도를 측정함으로써 람베르트-비어 법칙 (흡광도 = 몰 농도 * 몰 흡광 계수 * 세포 경로 길이) 에 따라 수득될 수 있다. CA 및 CD 는 항체-약물 접합체의 수성 용액의 A280 및 A370 을 측정하고, 이들 값의 치환에 의해 동시 등식 (1) 및 (2) 를 풀어서 확인될 수 있다. 나아가, CD 를 CA 로 나누어서, 항체 당 접합된 약물 분자의 평균수를 확인할 수 있다.
6. 통상적 절차 F: 항체-약물 접합체 중 항체 분자 당 접합된 약물 분자의 평균수의 측정 - (2)
항체-약물 접합체 중 항체 분자 당 접합된 약물 분자의 평균수를 또한 앞서 언급된 "5. 통상적 절차 E" 에 더하여 하기 방법을 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 분석에 의해 확인할 수 있다. 이후, 항체가 다이설파이드 결합에 의해 약물 링커에 접합되어 있을 때 HPLC 에 의한 접합된 약물 분자의 평균수의 측정 방법이 설명될 것이다. 당업자는 이 방법을 참조하여, 항체와 약물 링커 사이의 연결 패턴에 따라, HPLC 에 의해 접합된 약물 분자의 평균수를 적절히 측정할 수 있다.
F-1. HPLC 분석을 위한 샘플의 제조 (항체-약물 접합체의 환원)
항체-약물 접합체 용액 (대략 1 ㎎/mL, 60 μL) 을 디티오트레이톨 (DTT) 의 수성 용액 (100 mM, 15 μL) 과 혼합한다. 혼합물을 37℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션함으로써, 항체-약물 접합체의 경쇄와 중쇄 사이의 다이설파이드 결합을 절단한다. 결과로 생긴 샘플을 HPLC 분석에서 사용한다.
F-2. HPLC 분석
HPLC 분석을 하기 측정 조건 하에 수행한다.
HPLC 시스템: Agilent 1290 HPLC 시스템 (Agilent Technologies, Inc.)
검출기: 자외선 흡광 분광계 (측정 파장: 280 nm)
칼럼: ACQUITY UPLC BEH 페닐 (2.1 * 50 ㎜, 1.7 μm, 130 Å; Waters Corp., P/N 186002884)
칼럼 온도: 80℃
이동상 A: 0.10% 트리플루오로아세트산 (TFA) 및 15% 2-프로판올을 함유하는 수성 용액
이동상 B: 0.075% TFA 및 15% 2-프로판올을 함유하는 아세토니트릴 용액
기울기 프로그램: 14%-36% (0 min-15 min), 36%-80% (15 min-17 min), 80%-14% (17 min-17.01 min.), 및 14% (17.01 min-25 min)
샘플 주입: 10 μL
또는
HPLC 시스템: Agilent 1290 HPLC 시스템 (Agilent Technologies, Inc.)
검출기: 자외선 흡광 분광계 (측정 파장: 280 nm)
칼럼: PLRP-S (2.1 * 50 ㎜, 8 μm, 1000 Å; Agilent Technologies, Inc., P/N PL1912-1802)
칼럼 온도: 80℃
이동상 A: 0.04% 수성 TFA 용액
이동상 B: 0.04% TFA 을 함유하는 아세토니트릴 용액
기울기 프로그램: 29%-36% (0 min-12.5 min), 36%-42% (12.5 min-15 min), 42%-29% (15 min-15.1 min), 및 29%-29% (15.1 min-25 min)
샘플 주입: 15 μL
F-3. 데이타 분석
F-3-1. 항체의 경쇄 및 중쇄는 접합된 약물 분자의 수에 따라, 각각, Li 및 Hi 로 표시된다 (여기에서 i 는 접합된 약물 분자의 수를 나타내며, 즉, 본 발명에 따른 접합된 약물 분자의 수는 L0, L1, H0, H1, H2, H3 등으로 표시된다).
비-접합된 항체 경쇄 (L0) 및 중쇄 (H0) 와 비교하여, 1 개의 약물 분자에 결합된 경쇄 (L1), 1 개의 약물 분자에 결합된 중쇄 (H1), 2 개의 약물 분자에 결합된 중쇄 (H2), 및 3 개의 약물 분자에 결합된 중쇄 (H3) 는 접합된 약물 분자의 수에 비례하여 더 높은 소수성을 나타내고, 그에 따라 더 긴 체류 시간을 갖는다. 이들 사슬은 그러므로 L0 및 L1 또는 H0, H1, H2, 및 H3 의 순서로 용출된다. 검출 피크는 L0 및 H0 와의 체류 시간의 비교에 의해 L0, L1, H0, H1, H2, 및 H3 중 임의의 것에 배정될 수 있다.
F-3-2. 약물 링커는 UV 를 흡수하므로, 피크 면적 값은 경쇄 또는 중쇄 및 약물 링커의 몰 흡광 계수를 사용하여 하기 수식에 따라 접합된 약물 링커 분자의 수에 대응하여 보정된다.
[수식 1]
i 개의 약물 분자(들)에 결합된 경쇄의 피크 면적의 보정된 값 (ALi)
Figure pct00009
εL,280: 280 nm 에서의 경쇄의 몰 흡광 계수
εD,280: 280 nm 에서의 약물 링커의 몰 흡광 계수
i: 접합된 약물 분자(들)의 수
[수식 2]
i 개의 약물 분자(들)에 결합된 중쇄의 피크 면적의 보정된 값 (AHi)
Figure pct00010
εH,280: 280 nm 에서의 중쇄의 몰 흡광 계수
εD,280: 280 nm 에서의 약물 링커의 몰 흡광 계수
i: 접합된 약물 분자(들)의 수
이 맥락에서, 알려진 계산 방법 (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423) 에 의해 각각의 항체의 경쇄 또는 중쇄의 아미노산 서열로부터 추정된 값은 항체의 경쇄 또는 중쇄의 몰 흡광 계수 (280 nm) 로서 사용될 수 있다. 각각의 약물 링커와 머캅토에탄올 또는 N-아세틸시스테인과의 반응에 의해 말레이미드 기가 숙신이미드 티오에테르로 전환된 화합물의 실제로 측정된 몰 흡광 계수 (280 nm) 를 약물 링커의 몰 흡광 계수 (280 nm) 로서 사용했다. 흡광도 측정을 위한 파장은 당업자에 의해 적절히 설정될 수 있으나, 바람직하게는 항체의 피크가 측정될 수 있는 파장이고, 더욱 바람직하게는 280 nm 이다.
F-3-3. 각각의 사슬의 피크 면적 비 (%) 는 하기 수식에 따라 피크 면적의 보정된 값의 전체에 대해 계산된다.
[수식 3]
Figure pct00011
F-3-4. 항체-약물 접합체 중 항체 분자 당 접합된 약물 분자의 평균수는 하기 수식에 따라 계산된다.
접합된 약물 분자의 평균수 = (L0 피크 면적 비 × 0 + L0 피크 면적 비 × 1 + H0 피크 면적 비 × 0 + H1 피크 면적 비 × 1 + H2 피크 면적 비 × 2 + H3 피크 면적 비 × 3) / 100 × 2
접합체의 양을 확실히 하기 위해서, 유사한 조건 하에 생산된, 접합된 약물 분자의 평균수가 거의 동일한 (예를 들어, 대략 ±1) 복수의 접합체를 혼합하여 새로운 로트를 제조할 수 있다는 점에 유의해야 한다. 이 경우에, 약물 분자의 평균수는 혼합 전에 약물 분자의 평균수 사이에 속한다.
특별한 구현예
하기에, 본 발명에 따른 접합체의 항체 부분의 특별한 구현예를 기술한다.
구현예 1. MUC1 에 결합할 수 있는 항체로서,
(i) 상보성-결정 영역 (CDR) 으로서 SEQ ID NO: 1 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 3 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3 을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) 상보성-결정 영역 (CDR) 으로서 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, SEQ ID NO: 5 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 6 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3 을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
구현예 2. 구현예 1 에 따른 항체에 있어서, CDR-H2 의 위치 8 의 아미노산의 위치 8 의 아미노산은 글루타민, 알라닌, 발린, 히스티딘, 트립토판, 티로신, 리신 및 아르기닌, 특히 글루타민, 히스티딘, 트립토판, 티로신, 리신 및 아르기닌, 특히 글루타민으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
구현예 3. 구현예 1 에 따른 항체에 있어서, CDR-H2 의 위치 8 의 아미노산은 글루타민, 히스티딘, 아르기닌, 트립토판, 또는 리신이다.
구현예 4. 구현예 1 내지 3에 따른 항체에 있어서, CDR-H2 는 SEQ ID NO: 7 의 아미노산 서열을 갖는다.
구현예 5. 구현예 1 에 따른 항체에 있어서, CDR-H2 는 SEQ ID NO: 8 의 아미노산 서열을 갖는다.
구현예 6. MUC1 에 결합할 수 있는 항체로서,
(i) (a) SEQ ID NO: 9 의 아미노산 서열과 적어도 90% 가 동일한 아미노산 서열을 갖고,
(b) 상보성-결정 영역 (CDR) 으로서 SEQ ID NO: 1 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 3 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3 을 포함하는, 중쇄 가변 영역, 및
(ii) (a) SEQ ID NO: 12 의 아미노산 서열과 적어도 90% 가 동일한 아미노산 서열을 갖고,
(b) 상보성-결정 영역 (CDR) 으로서 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, SEQ ID NO: 5 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 6 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3 을 포함하는, 경쇄 가변 영역
을 포함한다.
구현예 7. MUC1 에 결합할 수 있는 항체로서,
(i) (a) SEQ ID NO: 9 의 아미노산 서열과 적어도 95% 가 동일한 아미노산 서열을 갖고,
(b) 상보성-결정 영역 (CDR) 으로서 SEQ ID NO: 1 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 3 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3 을 포함하는, 중쇄 가변 영역, 및
(ii) (a) SEQ ID NO: 12 의 아미노산 서열과 적어도 95% 가 동일한 아미노산 서열을 갖고,
(b) 상보성-결정 영역 (CDR) 으로서 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, SEQ ID NO: 5 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 6 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3 을 포함하는, 경쇄 가변 영역
을 포함한다.
구현예 8. 구현예 6 또는 7 에 따른 항체에 있어서, CDR-H2 의 위치 8 의 아미노산은 글루타민, 알라닌, 발린, 히스티딘, 트립토판, 티로신, 리신 및 아르기닌, 특히 글루타민, 히스티딘, 트립토판, 티로신, 리신 및 아르기닌, 특히 글루타민으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
구현예 9. 구현예 7 또는 8 에 따른 항체에 있어서, CDR-H2 의 위치 8 의 아미노산은 글루타민, 히스티딘, 아르기닌, 트립토판, 또는 리신이다.
구현예 10. MUC1 에 결합할 수 있는 항체로서,
(i) (a) SEQ ID NO: 10 의 아미노산 서열과 적어도 90% 가 동일한 아미노산 서열을 갖고,
(b) 상보성-결정 영역 (CDR) 으로서 SEQ ID NO: 1 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, SEQ ID NO: 7 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 3 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3 을 포함하는, 중쇄 가변 영역, 및
(ii) (a) SEQ ID NO: 12 의 아미노산 서열과 적어도 90% 가 동일한 아미노산 서열을 갖고,
(b) 상보성-결정 영역 (CDR) 으로서 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, SEQ ID NO: 5 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 6 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3 을 포함하는, 경쇄 가변 영역
을 포함한다.
구현예 11. MUC1 에 결합할 수 있는 항체로서,
(i) (a) SEQ ID NO: 10 의 아미노산 서열과 적어도 95% 가 동일한 아미노산 서열을 갖고,
(b) 상보성-결정 영역 (CDR) 으로서 SEQ ID NO: 1 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, SEQ ID NO: 7 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 3 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3 을 포함하는, 중쇄 가변 영역, 및
(ii) (a) SEQ ID NO: 12 의 아미노산 서열과 적어도 95% 가 동일한 아미노산 서열을 갖고,
(b) 상보성-결정 영역 (CDR) 으로서 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, SEQ ID NO: 5 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 6 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3 을 포함하는, 경쇄 가변 영역
을 포함한다.
구현예 12. MUC1 에 결합할 수 있는 항체로서,
(i) SEQ ID NO: 9 의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) SEQ ID NO: 12 의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
구현예 13. 구현예 12에 따른 항체에 있어서, SEQ ID NO: 9 의 위치 57 에서 아미노산은 글루타민, 알라닌, 발린, 히스티딘, 트립토판, 티로신, 리신 및 아르기닌, 특히 글루타민, 히스티딘, 트립토판, 티로신, 리신 및 아르기닌, 특히 글루타민으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
구현예 14. 구현예 12에 따른 항체에 있어서, SEQ ID NO: 9 의 위치 57 에서 아미노산은 글루타민, 히스티딘, 아르기닌, 트립토판, 또는 리신이다.
구현예 15. MUC1 에 결합할 수 있는 항체로서,
(i) SEQ ID NO: 10 의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) SEQ ID NO: 12 의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
구현예 16. MUC1 에 결합할 수 있는 항체로서,
(i) SEQ ID NO: 20 또는 23 의 아미노산 No 20 내지 136 으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) SEQ ID NO: 21 의 아미노산 No 21 내지 133 으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
구현예 17. MUC1 에 결합할 수 있는 항체로서,
(i) (a) SEQ ID NO: 15 의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖고,
(b) 상보성-결정 영역 (CDR) 으로서 SEQ ID NO: 1 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, SEQ ID NO: 2 또는 7 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 SEQ ID NO: 3 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3 을 포함하는, 중쇄 및
(ii) (a) SEQ ID NO: 16 의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖고,
(b) 상보성-결정 영역 (CDR) 으로서 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, SEQ ID NO: 5 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 및 SEQ ID NO: 6 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3 을 포함하는, 경쇄 가변 영역
을 포함한다.
구현예 18. MUC1 에 결합할 수 있는 항체로서,
(i) SEQ ID NO: 15 또는 SEQ ID NO: 22 의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) SEQ ID NO: 16 의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역
을 포함한다.
구현예 19. MUC1 에 결합할 수 있는 항체로서,
(i) (a) SEQ ID NO: 19 의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖고,
(b) 상보성-결정 영역 (CDR) 으로서 SEQ ID NO: 1 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, SEQ ID NO: 8 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 SEQ ID NO: 3 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3 을 포함하는, 중쇄 가변 영역 및
(ii) (a) SEQ ID NO: 16 의 아미노산 서열과 적어도 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 갖고,
(b) 상보성-결정 영역 (CDR) 으로서 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, SEQ ID NO: 5 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 및 SEQ ID NO: 6 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3 을 포함하는, 경쇄 가변 영역
을 포함한다.
구현예 20. MUC1 에 결합할 수 있는 항체로서,
(i) SEQ ID NO: 19 의 아미노산 No 20 내지 460 으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및
(ii) SEQ ID NO: 16 의 아미노산 No 21 내지 239 으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역
을 포함한다.
구현예 21. 구현예 1 내지 20 중 어느 하나에 따른 항체에 있어서, 항체는 중쇄 가변 영역, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는, 적어도 하나의 중쇄를 포함한다.
구현예 22. 구현예 1 내지 20 중 어느 하나에 따른 항체에 있어서, 항체는 각각이 중쇄 가변 영역, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는, 2개의 중쇄를 포함한다.
구현예 23. 구현예 21 또는 22에 따른 항체에 있어서, 항체는 IgG-유형 항체, 특히 IgG1, IgG2 또는 IgG4-유형 항체이다.
구현예 24. 구현예 1 내지 23 중 어느 하나에 따른 항체에 있어서, 항체는 경쇄 가변 영역 및 CL 도메인을 포함하는 적어도 하나의 경쇄를 포함한다.
구현예 25. 구현예 1 내지 23 중 어느 하나에 따른 항체에 있어서, 항체는 각각이 경쇄 가변 영역 및 CL 도메인을 포함하는 2개 경쇄를 포함한다.
구현예 26. 구현예 24 또는 25에 따른 항체에 있어서, 경쇄는 κ-유형 경쇄이다.
구현예 27. 구현예 1 내지 26 중 어느 하나에 따른 항체에 있어서, 항체는 CH2 도메인에 N-글리코실화 부위를 포함하지 않는다.
구현예 28. 구현예 1 내지 26 중 어느 하나에 따른 항체에 있어서, 항체는 항체 중쇄의 CH2 도메인에 N-글리코실화 부위를 포함한다.
구현예 29. 구현예 28 에 따른 항체에 있어서, 항체는 하기 특징 중 하나 이상을 갖는 글리코실화 패턴을 갖는다:
(i) 조성물 중 항체의 글리코실화 부위에 부착된 글리칸의 총량 중 적어도 0.5%의 이분형 GlcNAc 잔기를 보유하는 글리칸의 상대량;
(ii) 조성물 중 항체의 글리코실화 부위에 부착된 글리칸의 총량 중 적어도 30%의 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 보유하는 글리칸의 상대량;
(iii) 조성물 중 항체의 글리코실화 부위에 부착된 글리칸의 총량 중 적어도 60%의 코어 푸코스 잔기를 보유하는 글리칸의 상대량.
구현예 30. 구현예 28 에 따른 항체에 있어서, 항체는 하기 특징 중 하나 이상을 갖는 글리코실화 패턴을 갖는다:
(i) 조성물 중 항체의 글리코실화 부위에 부착된 글리칸의 총량 중 적어도 0.5%의 이분형 GlcNAc 잔기를 보유하는 글리칸의 상대량;
(ii) 조성물 중 항체의 글리코실화 부위에 부착된 글리칸의 총량 중 적어도 30%의 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 보유하는 글리칸의 상대량;
(iii) 조성물 중 항체의 글리코실화 부위에 부착된 글리칸의 총량 중 40% 이하의 코어 푸코스 잔기를 보유하는 글리칸의 상대량.
하기에, 본 발명에 따른 접합체의 특별한 구현예를 기술한다.
구현예 31. 구현예 1 내지 30 중 어느 하나에 따른 항체에 있어서, 이에 접합된 추가 작용제, 바람직하게는 세포독성제를 포함한다.
구현예 32. 구현예 31 에 따른 항체에 있어서, 세포독성제는 항체에 커플링된 화학치료제이다.
구현예 33. 구현예 32 에 따른 항체에 있어서, 화학치료제는 마이크로튜불 억제제 예컨대 마이탄시노이드, 토포이소머라제 I 억제제, DNA 손상제, DNA 알킬화제 및 DNA 작은 홈 결합제로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
구현예 34. 구현예 32 에 따른 항체에 있어서, 화학치료제는 마이탄시놀, N 2'-데아세틸-N 2'-(3-머캅토-1-옥소프로필)-마이탄신 (DM1), N 2'-데아세틸-N 2'-(4-머캅토-1-옥소펜틸)-마이탄신 (DM3), 및 N 2'-데아세틸-N 2'-(4-메틸-4-머캅토-1-옥소펜틸)-마이탄신 (DM4) 으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
구현예 35. 구현예 32 에 따른 항체에 있어서, 화학치료제는 피롤로벤조디아제핀 (PBD), 피롤로벤조디아제핀 이량체 (PBD 이량체), 두오카마이신, 두오카마이신-히드록시벤즈아미드-아자인돌 (DUBA), 세코-두오카마이신-히드록시벤즈아미드-아자인돌 (세코-DUBA) 및 독소루비신으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
구현예 36. 구현예 32 에 따른 항체에 있어서, 화학치료제는 인돌리노벤조디아제핀 및 옥사졸리디노벤조디아제핀으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
구현예 37. 구현예 32 에 따른 항체에 있어서, 화학치료제는 칼리케아미신이다.
구현예 38. 구현예 32 에 따른 항체에 있어서, 화학치료제는 캄프토테신, 7-에틸-10-히드록시-캄프토테신 (SN-38), (S)-9-디메틸아미노메틸-10-히드록시캄프토테신 (토포테칸), (1S,9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-1,2,3,9,12,15-헥사히드로-9-히드록시-4-메틸-10H,13H-벤조[데]피라노 [3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-10,13-디온 (엑사테칸 (DX-8951)) 및 DXd 으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
구현예 39. 구현예 32 에 따른 항체에 있어서, 화학치료제는 하기 식으로 표시되는 항종양 화합물이다:
[식 1]
Figure pct00012
구현예 40. 구현예 32 에 따른 항체에 있어서, 화학치료제는 하기 식으로 표시되는 항종양 화합물이다:
[식 2]
Figure pct00013
구현예 41. 구현예 31 에 따른 항체에 있어서, 추가로 폴리펩티드 또는 단백질인 추가 작용제는 항체의 폴리펩티드 사슬에 융합되어 있다.
구현예 42. 구현예 41 에 따른 항체에 있어서, 항체는 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄를 포함하고, 폴리펩티드 또는 단백질인 추가 작용제는 상기 항체 중쇄의 C 말단 각각에 또는 상기 항체 경쇄의 C 말단 각각에 융합되어 있다.
구현예 43. 구현예 41 또는 42 에 따른 항체에 있어서, 추가 작용제는 사이토카인, 케모카인, 다른 항체, 항원 결합 단편, 효소 및 결합 도메인으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
구현예 44. 구현예 42 에 따른 항체에 있어서, 추가 작용제는 CD3 에 특이적으로 결합하는 scFv 단편이고, 상기 추가 작용제 중 하나는 각각의 항체 중쇄의 C 말단에 융합되어 있다.
구현예 45. 구현예 42 에 따른 항체에 있어서, 추가 작용제는 PDL1 에 특이적으로 결합하는 scFv 단편이고, 상기 추가 작용제 중 하나는 각각의 항체 경쇄의 C 말단에 융합되어 있다.
구현예 46. 구현예 31 내지 45 에 따른 항체에 있어서, 세포독성제, 바람직하게는 토포이소머라제 I 억제제 예컨대 DX-8951 또는 DXd 는 하기 식 (a) 내지 (f) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 임의의 구조를 갖는 링커를 통해 이에 접합되어 있다:
(a) -(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
(b) -(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
(c) -(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
(d) -(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
(e) -(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, 및
(f) -(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
여기에서 항체는 -(숙신이미드-3-일-N) 의 말단에 연결되어 있고, 항종양 화합물은 식 (a) 내지 (f) 의 가장 오른쪽에서 -(CH2)n2-C(=O)- 모이어티 (n2 은 1 또는 3 의 정수를 나타낸다) 의 카르보닐 기에 위치 1 에서의 아미노 기의 질소 원자를 연결 위치로 하여 연결되어 있으며, GGFG 는 펩티드 결합을 통해 연결된 글리신-글리신-페닐알라닌-글리신으로 이루어지는 아미노산 서열을 나타내고,
-(숙신이미드-3-일-N)- 은 하기 식으로 표시되는 구조를 갖는다:
[식 3]
Figure pct00014
이는 이의 위치 3 에서 항체에 연결되어 있고, 위치 1 에서의 질소 원자 상에서 이 구조를 함유하는 링커 구조 내의 메틸렌 기에 연결되어 있다.
구현예 47. 세포독성제에 접합된 구현예 1 내지 30 중 어느 하나에 따른 항체를 포함하는 접합체.
구현예 48. 구현예 47 에 따른 접합체에 있어서, 세포독성제는 화학치료제이다.
구현예 49. 구현예 48 에 따른 접합체에 있어서, 화학치료제는 마이크로튜불 억제제, 토포이소머라제 I 억제제, DNA 손상제, DNA 알킬화제 및 DNA 작은 홈 결합제로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
구현예 50. 구현예 48 에 따른 접합체에 있어서, 화학치료제는 마이탄시놀, N2'-데아세틸-N2'-(3-머캅토-1-옥소프로필)-마이탄신 (DM1), N2'-데아세틸-N2'-(4-머캅토-1-옥소펜틸)-마이탄신 (DM3), 및 N2'-데아세틸-N2'-(4-메틸-4-머캅토-1-옥소펜틸)-마이탄신 (DM4) 으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
구현예 51. 구현예 48 에 따른 접합체에 있어서, 화학치료제는 피롤로벤조디아제핀 (PBD), 피롤로벤조디아제핀 이량체 (PBD 이량체), 두오카마이신, 두오카마이신-히드록시벤즈아미드-아자인돌 (DUBA), 세코-두오카마이신-히드록시벤즈아미드-아자인돌 (세코-DUBA) 및 독소루비신으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
구현예 52. 구현예 48 에 따른 접합체에 있어서, 화학치료제는 인돌리노벤조디아제핀 및 옥사졸리디노벤조디아제핀으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
구현예 53. 구현예 48 에 따른 접합체에 있어서, 화학치료제는 칼리케아미신이다.
구현예 54. 구현예 48 에 따른 접합체에 있어서, 화학치료제는 캄프토테신, 7-에틸-10-히드록시-캄프토테신 (SN-38), (S)-9-디메틸아미노메틸-10-히드록시캄프토테신 (토포테칸), (1S,9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-1,2,3,9,12,15-헥사히드로-9-히드록시-4-메틸-10H,13H-벤조[데]피라노 [3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-10,13-디온 (엑사테칸 (DX-8951)) 및 DXd 로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
구현예 55. 구현예 48 에 따른 접합체에 있어서, 화학치료제는 하기 식으로 표시되는 항종양 화합물이다:
[식 1]
Figure pct00015
구현예 56. 구현예 48 에 따른 접합체에 있어서, 화학치료제는 하기 식으로 표시되는 항종양 화합물이다:
[식 2]
Figure pct00016
구현예 57. 구현예 47 에 따른 접합체에 있어서, 폴리펩티드 또는 단백질인 추가 작용제는 항체의 폴리펩티드 사슬에 융합되어 있다.
구현예 58. 구현예 57 에 따른 접합체에 있어서, 항체는 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄를 포함하고, 폴리펩티드 또는 단백질인 추가 작용제는 상기 항체 중쇄의 C 말단 각각에 또는 상기 항체 경쇄의 C 말단 각각에 융합되어 있다.
구현예 59. 구현예 57 또는 58 에 따른 접합체에 있어서, 추가 작용제는 사이토카인, 케모카인, 다른 항체, 항원 결합 단편, 효소 및 결합 도메인으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
구현예 60. 구현예 58 에 따른 접합체에 있어서, 추가 작용제는 CD3 에 특이적으로 결합하는 scFv 단편이고, 상기 추가 작용제 중 하나는 각각의 항체 중쇄의 C 말단에 융합되어 있다.
구현예 61. 구현예 58 에 따른 접합체에 있어서, 추가 작용제는 PDL1 에 특이적으로 결합하는 scFv 단편이고, 상기 추가 작용제 중 하나는 각각의 항체 경쇄의 C 말단에 융합되어 있다.
구현예 62. 구현예 47 내지 61 중 어느 하나에 따른 접합체에 있어서, 항체는 추가 작용제 또는 화학치료제, 바람직하게는 토포이소머라제 I 억제제 예컨대 DX-8951 또는 DXd 에 하기 식 (a) 내지 (f) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 임의의 구조를 갖는 링커를 통해 접합되어 있다:
(a) -(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
(b) -(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
(c) -(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
(d) -(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
(e) -(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, 및
(f) -(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
여기에서 항체는 -(숙신이미드-3-일-N) 의 말단에 연결되어 있고, 항종양 화합물은 식 (a) 내지 (f) 의 가장 오른쪽에서 -(CH2)n2-C(=O)- 모이어티 (n2 은 1 또는 3 의 정수를 나타낸다) 의 카르보닐 기에 위치 1 에서의 아미노 기의 질소 원자를 연결 위치로 하여 연결되어 있으며, GGFG 는 펩티드 결합을 통해 연결된 글리신-글리신-페닐알라닌-글리신으로 이루어지는 아미노산 서열을 나타내고,
-(숙신이미드-3-일-N)- 은 하기 식으로 표시되는 구조를 갖는다:
[식 3]
Figure pct00017
이는 이의 위치 3 에서 항체에 연결되어 있고, 위치 1 에서의 질소 원자 상에서 이 구조를 함유하는 링커 구조 내의 메틸렌 기에 연결되어 있다.
구현예 63. 구현예 47 내지 61 중 어느 하나에 따른 접합체에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기 식 (여기에서 별표* 는 항체로의 연결점을 나타낸다) 으로 표시되는 약물 링커에 티오에테르 결합에 의해 접합되어 있으며, 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 또는 중쇄 및 경쇄의 하기 조합 a) 내지 f) 중 임의의 하나를 포함한다:
(a) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10 의 아미노산 서열을 갖고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 12 의 아미노산 서열을 갖는다,
(b) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11 의 아미노산 서열을 갖고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 12 의 아미노산 서열을 갖는다,
(c) SEQ ID NO: 15 또는 22 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 16 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄,
(d) SEQ ID NO: 19 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 16 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄.
(e) SEQ ID NO: 15 또는 22 의 아미노산 No 1 내지 446 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 SEQ ID NO: 16 의 아미노산 No 1 내지 219 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄, 및
(f) SEQ ID NO: 19 의 아미노산 No 1 내지 446 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 SEQ ID NO: 16 의 아미노산 No 1 내지 219 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄:
[식 4]
Figure pct00018
구현예 64. 하기 식으로 표시되는, 접합체 또는 항체,
[식 5]
Figure pct00019
식에서 AB 는 항체를 나타내고, 항체는 SEQ ID NO: 10 의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 12 의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하고, y 는 항체에 접합된 항체 당 약물-링커 구조의 단위의 평균수를 나타내고, y 는 1 내지 10 범위, 2 내지 8 범위, 3 내지 8 범위, 7 내지 8 범위 또는 7.5 내지 8 범위이고, 항체는 상기 식으로 표시되는 약물 링커 구조에 티오에테르 결합에 의해 접합되어 있다.
구현예 65. 하기 식으로 표시되는, 접합체 또는 항체,
[식 5]
Figure pct00020
식에서 AB 는 항체를 나타내고, 항체는 SEQ ID NO: 11 의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 12 의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하고, y 는 항체에 접합된 항체 당 약물-링커 구조의 단위의 평균수를 나타내고, y 는 1 내지 10 범위, 2 내지 8 범위, 3 내지 8 범위, 7 내지 8 범위 또는 7.5 내지 8 범위이고, 항체는 상기 식으로 표시되는 약물 링커 구조에 티오에테르 결합에 의해 접합되어 있다.
구현예 66. 하기 식으로 표시되는, 접합체 또는 항체,
[식 5]
Figure pct00021
식에서 AB 는 항체를 나타내고, 항체는 SEQ ID NO: 15 또는 22 의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 SEQ ID NO: 16 의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하고, y 는 항체에 접합된 항체 당 약물-링커 구조의 단위의 평균수를 나타내고, y 는 1 내지 10 범위, 2 내지 8 범위, 3 내지 8 범위, 7 내지 8 범위 또는 7.5 내지 8 범위이고, 항체는 상기 식으로 표시되는 약물 링커 구조에 티오에테르 결합에 의해 접합되어 있다.
구현예 67. 하기 식으로 표시되는, 접합체 또는 항체,
[식 5]
Figure pct00022
식에서 AB 는 항체를 나타내고, 항체는 SEQ ID NO: 19 의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 SEQ ID NO: 16 의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하고, y 는 항체에 접합된 항체 당 약물-링커 구조의 단위의 평균수를 나타내고, y 는 1 내지 10 범위, 2 내지 8 범위, 3 내지 8 범위, 7 내지 8 범위 또는 7.5 내지 8 범위이고, 항체는 상기 식으로 표시되는 약물 링커 구조에 티오에테르 결합에 의해 접합되어 있다.
구현예 68. 구현예 31 내지 67 중 어느 하나에 따른 접합체 또는 항체에 있어서, 항체는 탈푸코실화, 감소된 푸코스, N-연결 글리코실화, O-연결 글리코실화, N-말단 프로세싱, C-말단 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성질체화, 메티오닌의 산화, 중쇄의 위치 234 및 235 에서 2개의 류신 (L) 잔기의 알라닌 (A) 으로의 치환 (LALA), 프롤린 잔기의 아미드화, 및 카르복실 말단에서 1개 또는 2개의 아미노산의 결실 또는 결여로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 포함한다.
구현예 69. 구현예 68 에 따른 접합체 또는 항체에 있어서, 항체는 중쇄의 카르복실 말단에서 1개 또는 2개의 아미노산(들)의 결실 또는 결여를 포함한다.
구현예 70. 구현예 69 에 따른 접합체 또는 항체에 있어서, 항체는 2개의 중쇄를 포함하며, 이들 둘 모두는 1개의 카르복실-말단 아미노산 잔기를 결여한다.
구현예 71. 하기 식으로 표시되는, 접합체 또는 항체,
[식 5]
Figure pct00023
식에서 AB 는 항체를 나타내고, 항체는 SEQ ID NO: 15 또는 22 의 아미노산 No 1 내지 446 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 SEQ ID NO: 16 의 아미노산 No 1 내지 219 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하고, y 는 항체에 접합된 항체 당 약물-링커 구조의 단위의 평균수를 나타내고, y 는 1 내지 10 범위, 2 내지 8 범위, 3 내지 8 범위, 7 내지 8 범위 또는 7.5 내지 8 범위이고, 항체는 상기 식으로 표시되는 약물 링커 구조에 티오에테르 결합에 의해 접합되어 있다.
구현예 72. 하기 식으로 표시되는, 접합체 또는 항체,
[식 5]
Figure pct00024
식에서 AB 는 항체를 나타내고, 항체는 SEQ ID NO: 19 의 아미노산 No 1 내지 446 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 SEQ ID NO: 16 의 아미노산 No 1 내지 219 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하고, y 는 항체에 접합된 항체 당 약물-링커 구조의 단위의 평균수를 나타내고, y 는 1 내지 10 범위, 2 내지 8 범위, 3 내지 8 범위, 7 내지 8 범위 또는 7.5 내지 8 범위이고, 항체는 상기 식으로 표시되는 약물 링커 구조에 티오에테르 결합에 의해 접합되어 있다.
구현예 73. 구현예 31 내지 72 중 어느 하나에 따른 접합체 또는 항체에 있어서, 항체 분자 당 접합된 약물 분자의 수는 8 이다.
구현예 74. 구현예 31 내지 73 중 어느 하나에 따른 항체 또는 접합체 및 용매, 희석제, 및 부형제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 성분을 포함하는 약학 조성물.
구현예 75. 의학에서 사용하기 위한, 구현예 31 내지 73 중 어느 하나에 따른 항체 또는 접합체 또는 구현예 74 에 따른 약학 조성물.
구현예 76. 이상 세포 성장과 연관된 질환 예컨대 암; 감염 예컨대 박테리아, 바이러스, 진균 또는 기생충 감염; 염증성 질환 예컨대 자가면역 질환 및 염증성 장 질환; 및 면역 활성 감소와 연관된 질환 예컨대 면역결핍증의 치료, 예후, 진단 및/또는 모니터링에서 사용을 위한, 구현예 31 내지 73 중 어느 하나에 따른 항체 또는 접합체 또는 구현예 74 에 따른 약학 조성물.
구현예 77. 암, 특히 TA-MUC1 발현 암의 치료에서 사용을 위한, 구현예 76 에 따른 항체, 접합체 또는 약학 조성물로서, 암은 난소암, 유방암, 췌장암, 폐암, 결장암, 위암, 간암, 신장암, 혈액암, 자궁내막암, 갑상선암, 백혈병, 정상피종, 흑색종, 암종, 기형종, 림프종, 육종, 중피종, 신경아세포종, 신경교종, 직장암, 부신암, 피부암, 뇌암, 자궁경부암, 장관암, 장암, 두경부암, 위장암, 림프절암, 식도암, 결장직장암, 이비인후 (ENT) 암, 전립선암, 방광암, 자궁암 및 이의 전이로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
구현예 78. 감염의 치료에서 사용을 위한 구현예 76 에 따른 항체, 접합체 또는 약학 조성물에 있어서, 감염은 박테리아 감염, 바이러스 감염, 진균 감염 및 기생충 감염으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
구현예 79. 자가면역 질환의 치료에서 사용을 위한 구현예 76 에 따른 항체, 접합체 또는 약학 조성물에 있어서, 자가면역 질환은 셀리악병, 1형 진성 당뇨병, 그레이브스 병, 염증성 장 질환, 다발성 경화증, 건선, 류마티스성 관절염 및 전신 홍반 루푸스로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
구현예 80. 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 암, 특히 TA-MUC1 발현 암에 걸린 대상체에게, 구현예 31 내지 73 중 어느 하나에 따른 접합체 또는 항체 또는 구현예 74 에 따른 조성물의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
구현예 81. 구현예 80 에 따른 암을 치료하는 방법에 있어서, 암은 난소암, 유방암, 췌장암, 폐암, 결장암, 위암, 간암, 신장암, 혈액암, 자궁내막암, 갑상선암, 백혈병, 정상피종, 흑색종, 암종, 기형종, 림프종, 육종, 중피종, 신경아세포종, 신경교종, 직장암, 부신암, 피부암, 뇌암, 자궁경부암, 장관암, 장암, 두경부암, 위장암, 림프절암, 식도암, 결장직장암, 이비인후 (ENT) 암, 전립선암, 방광암, 자궁암 및 이의 전이로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
도 1 은 상이한 MUC1 펩티드에 대한 항-MUC1 항체의 ELISA 결합 곡선을 도시한다. (A) 는 에피토프 서열 PDTR 을 포함하는 MUC1 펩티드에 대한 Fab 글리코실화를 결여하는 PankoMab N54Q (PM-N54Q) 및 Fab 글리코실화를 포함하는 PankoMab (PM) 의 항원 결합을 도시한다. MUC1 펩티드의 트레오닌은 Tn, sTn, TF 또는 sTF 로 글리코실화된다. (B) 는 에피토프 서열 변이체 PESR 을 포함하는 MUC1 펩티드에 대한 PankoMab 및 PM-N54Q 의 결합을 도시한다. MUC1 펩티드의 세린은 Tn 으로 글리코실화된다. (C) 는 에피토프 서열 PDTR 을 포함하는 MUC1 펩티드에 대한 PM-N54Q 의 결합을 도시한다. MUC1 펩티드의 트레오닌은 Tn 으로 글리코실화되거나 또는 글리코실화되지 않는다. (D) 는 일시적으로 형질감염된 세포의 세포 배양 상청액으로부터 희석된 Fab 글리코실화를 포함하는 PankoMab 와 비교하여 Tn-PDTR MUC1 펩티드에 대한 몇몇 N54X 변이체의 결합을 도시한다. (E) 는 Tn-PDTR, TF-PDTR 및 비글리코실화 PDTR MUC1 펩티드에 대한 Fab 글리코실화를 포함하는 PankoMab 와 비교하여 Fab 글리코실화를 결여하는 3종의 정제된 N54X 변이체의 결합 곡선을 도시한다. (F) 는 Fab 글리코실화 존재의 PankoMab 와 비교하여 Tn-PDTR MUC1 펩티드에 대한 PM-N54Q 의 2개 프레임워크 변이체의 결합을 도시한다. 프레임워크 변이체 mf-a 경우 9개의 아미노산이 VH 프레임워크에서 돌연변이되고 3개의 아미노산이 VL 프레임워크에 돌연변이되며, mf-b 의 경우도 역시 9개의 아미노산이 VH 프레임워크에서 돌연변이되고 4개의 아미노산이 VL 프레임워크에서 돌연변이된다.
도 2 는 글리코실화 PDTR-MUC1 펩티드에 대한 항-MUC1 항체 PM 및 PM-N54Q 의 표면 플라스몬 공명 (Biacore) 결합을 도시한다. PM-N54Q 및 PankoMab 의 상이한 농도의 최대 결합 신호는 항체 농도에 대해 도표화된다.
도 3 은 DRX 장비 상에서 형광 근접 감지 (Fluorescence Proximity Sensing) 의 결과를 도시한다. 결합 및 해리 곡선이 도시된다. (A) Fab 글리코실화 존재의 PM 을 (B) Fab 글리코실화 부재의 PM-N54Q 와 비교하였다.
도 4 는 비환원 (좌) 및 환원 (우) 조건 하에서 PM-N54Q 및 PankoMab의 전기영동 분리의 SDS 아크릴아미드 겔을 도시한다. 레인 1: 포획 단계 이후 PM-N54Q; 레인 2: 연마 단계 이후 PM-N54Q; 레인 3: 포획 단계 이후 PankoMab; 레인 4: 연마 단계 이후 PankoMab; 레인 5: 분자량 마커.
도 5 는 Fab 글리코실화를 결여하는 PM-N54Q 및 Fab-글리코실화된 PankoMab를 사용한 등전점 접속법 어세이의 쿠마시 블루 염색된 겔을 도시한다. 레인 1: Fab 글리코실화 존재의 PankoMab; 레인 2: Fab 글리코실화 부재의 PM-N54Q.
도 6 은 Fcγ 수용체 IIIa 에 대한 항-MUC1 항체 결합을 도시한다. 증가하는 농도의 항체 PM-N54Q 또는 PankoMab 가 FcγRIIIa 로딩된 도너 비드로부터 토끼-항-마우스 커플링된 억셉터 비드를 대체하여서, 검출된 화학발광도를 감소시킨다. 도 6A 에서, 저-푸코실화 항체, 및 도 6B 에서 고-푸코실화 항체가 어세이에 적용되었다.
도 7 은 유세포측정법으로 분석된 종양 세포주 (A) CaOV-3 및 (B) HSC-4 에 대한 항-MUC1 항체 PM-N54Q, PM-N54D 및 Fab 글리코실화 존재의 PM 의 결합을 도시한다.
도 8 은 A) TA-MUC1 단백질의 발현이 존재하는 암 세포주 MDA-MB-468 에 대한 컨트롤 hIgG-ADC, 네이키드 PankoMab 및 PankoMab-ADC 의 세포독성 활성, B) TA-MUC1 단백질의 발현이 부재하는 암 세포주 HCT-15 에 대한 컨트롤 hIgG-ADC, 네이키드 PankoMab 및 PankoMab-ADC 의 세포독성 활성, C) TA-MUC1 단백질의 발현이 존재하는 암 세포주 NCI-H441 에 대한 컨트롤 hIgG-ADC, 네이키드 PankoMab, PankoMab-ADC, 네이키드 PM-N54Q 및 PM-N54Q-ADC 의 세포독성 활성, D) TA-MUC1 단백질의 발현이 존재하는 암 세포주 HPAC 에 대한 컨트롤 hIgG-ADC, 네이키드 PankoMab PankoMab-ADC, 네이키드 PM-N54Q 및 PM-N54Q-ADC 의 세포독성 활성을 도시한다. 세포를 각각의 화합물로 6 일 동안 처리하고, 세포 생활력 (%) 을 ATP 어세이에 의해 계산했다. 데이타는 평균 ± SD (N = 3) 를 나타낸다.
도 9 는 MDA-MB-468-보유 누드 마우스에 대한 컨트롤 hIgG-ADC, 네이키드 PankoMab 및 PankoMab-ADC 의 항종양 효능을 도시한다. 컨트롤 hIgG-ADC, 네이키드 PankoMab 및 PankoMab-ADC (도스 3 ㎎/㎏) 또는 비히클 (아세테이트 완충액) 을 MDA-MB-468-보유 누드 마우스 (N = 6/군) 내로 정맥내에 싱글 도스 투여했다. 추정된 종양 부피의 데이타는 평균 ± SEM 을 나타낸다. 화살표는 투여의 타이밍을 보여준다. PankoMab-ADC 의 투여후 21 일에 추정된 종양 부피를 스튜던트 t-검정에 의해 컨트롤 hIgG-ADC 또는 네이키드 PankoMab 처리군의 경우와 비교했다. ***P < 0.001.
도 10 은 HCC70-보유 누드 마우스에 대한 컨트롤 hIgG-ADC, 네이키드 PankoMab 및 PankoMab-ADC 의 항종양 효능을 도시한다. 컨트롤 hIgG-ADC, 네이키드 PankoMab 및 PankoMab-ADC (도스 10 ㎎/㎏) 또는 비히클 (아세테이트 완충액) 을 HCC70-보유 누드 마우스 (N = 6/군) 내로 정맥내에 싱글 도스 투여했다. 추정된 종양 부피의 데이타는 평균 ± SEM 을 나타낸다. 화살표는 투여의 타이밍을 보여준다. PankoMab-ADC 의 투여후 21 일에 추정된 종양 부피를 스튜던트 t-검정에 의해 컨트롤 hIgG-ADC 또는 네이키드 PankoMab 처리군의 경우와 비교했다. ***P < 0.001.
도 11 은 HPAC-보유 누드 마우스에 대한 컨트롤 hIgG-ADC, 네이키드 PM-N54Q, PankoMab-ADC 및 PM-N54Q-ADC 의 항종양 효능을 도시한다. 컨트롤 hIgG-ADC, 네이키드 PM-N54Q, PankoMab-ADC 및 PM-N54Q-ADC (도스 10 ㎎/㎏) 또는 비히클 (아세테이트 완충액) 을 HPAC-보유 누드 마우스 (N = 6/군) 내로 정맥내에 싱글 도스 투여했다. 추정된 종양 부피의 데이타는 평균 ± SEM 을 나타낸다. 화살표는 투여의 타이밍을 보여준다. PankoMab-ADC 및 PM-N54Q-ADC 의 투여후 21 일에 추정된 종양 부피를 던네트 검정에 의해 컨트롤 hIgG-ADC 처리군의 경우와 비교했다. ***P < 0.001.
도 12 는 NCI-H441-보유 누드 마우스에 대한 컨트롤 hIgG-ADC, 네이키드 PankoMab, 네이키드 PM-N54Q, PankoMab-ADC 및 PM-N54Q-ADC 의 항종양 효능을 도시한다. 네이키드 PankoMab, 네이키드 PM-N54Q (도스 10 ㎎/㎏), 컨트롤 hIgG-ADC, PankoMab-ADC 및 PM-N54Q-ADC (도스 3 ㎎/㎏) 또는 비히클 (아세테이트 완충액) 을 NCI-H441-보유 누드 마우스 (N = 6/군) 내로 정맥내에 싱글 도스 투여했다. 추정된 종양 부피의 데이타는 평균 ± SEM 을 나타낸다. 화살표는 투여의 타이밍을 보여준다. PankoMab-ADC 및 PM-N54Q-ADC 의 투여후 31 일에 추정된 종양 부피를 던네트 검정에 의해 컨트롤 hIgG-ADC 처리군의 경우와 비교했다. ***P < 0.001.
도 13 은 OVCAR-5-보유 누드 마우스에 대한 컨트롤 hIgG-ADC, 네이키드 PankoMab, 네이키드 PM-N54Q, PankoMab-ADC 및 PM-N54Q-ADC 의 항종양 효능을 도시한다. 컨트롤 hIgG-ADC, 네이키드 PankoMab, 네이키드 PM-N54Q, PankoMab-ADC 및 PM-N54Q-ADC (도스 10 ㎎/㎏) 또는 비히클 (아세테이트 완충액) 을 OVCAR-5-보유 누드 마우스 (N = 6/군) 내로 정맥내에 싱글 도스 투여했다. 추정된 종양 부피의 데이타는 평균 ± SEM 을 나타낸다. 화살표는 투여의 타이밍을 보여준다. PankoMab-ADC 및 PM-N54Q-ADC 의 투여후 14 일에 추정된 종양 부피를 던네트 검정에 의해 컨트롤 hIgG-ADC 처리군의 경우와 비교했다. PM-N54Q-ADC 의 투여후 14 일에 추정된 종양 부피를 스튜던트 t-검정에 의해 PankoMab-ADC 처리군의 경우와 비교했다. ***P < 0.001.
도 14 는 HCT-15-보유 누드 마우스에 대한 컨트롤 hIgG-ADC, PankoMab-ADC 및 PM-N54Q-ADC 의 항종양 효능을 도시한다. 컨트롤 hIgG-ADC, PankoMab-ADC 및 PM-N54Q-ADC (도스 10 ㎎/㎏) 또는 비히클 (아세테이트 완충액) 을 HCT-15-보유 누드 마우스 (N = 6/군) 내로 정맥내에 싱글 도스 투여했다. 추정된 종양 부피의 데이타는 평균 ± SEM 을 나타낸다. 화살표는 투여의 타이밍을 보여준다. PankoMab-ADC 및 PM-N54Q-ADC 의 투여후 21 일에 추정된 종양 부피를 던네트 검정에 의해 컨트롤 hIgG-ADC 처리군의 경우와 비교했다. ***P < 0.001.
도 15 는 인간화 항체 PM N54Q 의 중쇄의 아미노산 서열을 도시한다 (SEQ ID No: 15, 여기에서 위치 57 에서의 아미노산은 Gln 임, 즉 SEQ ID No: 22).
도 16 는 인간화 항체 PM N54Q 및 PankoMab 의 경쇄의 아미노산 서열을 도시한다 (SEQ ID No: 16).
도 17 는 인간화 항체 PankoMab 의 중쇄의 아미노산 서열을 도시한다 (SEQ ID No: 19).
도 18 는 키메라 항체 PM N54Q 의 중쇄의 아미노산 서열을 도시한다 (SEQ ID No: 20, 여기에서 위치 76 에서의 아미노산은 Gln 임, 즉 SEQ ID No: 23).
도 19 는 키메라 항체 PM N54Q 의 경쇄의 아미노산 서열을 도시한다 (SEQ ID No: 21).
실시예
실시예 1:
1. 항-MUC1 항체의 생산
인간화 PankoMab 항체의 중쇄의 핵산 서열 (예를 들어, WO 2011/012309 참조)은 카밧 (Kabat)/Eu 번호매김 체계에 따른 Asn54에 대한 코돈 (SEQ ID NO: 11의 아미노산 위치 57)을 Asn을 제외한 임의의 아미노산, 특히 Gln에 대한 코돈으로 돌연변이시켜서 변형시켰다.
1) 인간 골수성 백혈병 유래 세포주에서 항-MUC1 항체의 생산
돌연변이된 항체의 γ1-유형 중쇄 및 κ-유형 경쇄의 코딩 서열을 포함하는 벡터를 인간 골수성 백혈병 유래 세포주 NM-H9D8 (DSM ACC2806)에게 형질감염시켰다. VH 및 VL의 프레임워크 서열에 N54X 돌연변이 (PankoMab N54X/PM-N54X로서, X는 N/Asn 제외한 임의 아미노산임) 또는 아미노산 돌연변이를 포함하는 상이한 αMUC1-항체는 인간 글리코실화 패턴을 갖는 구성체를 생산하게, 수득된 클론에서 발현시켰다. 상청액 중 αMUC1-항체의 농도는 단백질 A 코팅된 핀을 사용하는 Octet 측정으로 결정하였거나 또는 단백질 A 크로마토그래피에 의한 정제 이후 UV280 흡광도를 통해 정량하였다. 상이한 αMUC1-항체의 결합 특징은 항원-ELISA (실시예 2 참조)로 결정하였고, 선택된 정제된 항체는 또한 Scatchard 분석 (실시예 3 참조), Biacore (실시예 4a 참조), DRX2 switchSENSE® Technology (실시예 4b 참조), 또는 유세포측정 (실시예 7)으로 분석하였다.
또한, PM-N54Q 및 Fab-글리코실화 존재의 비돌연변이된 PankoMab를 또한 푸코스가 감소된 항체를 발현하는 인간 골수성 백혈병 유래 세포주 NM-H9D8-E6Q12 (DSM ACC2856)에서 발현시켰다. NM-H9D8에서 발현된 동일한 항체와 함께, 이들 항체를 정제하였고 실시예 6에서 Fc 감마 수용체 III A에 대한 그들 결합 거동에 대해 분석하였다.
2) CHO 세포주에서 항-MUC1 항체의 생산
ThermoFisher scientific의 GeneArt™을 통해서 합성된 PM-N54Q 코딩 서열 (SEQ ID NO: 17로 표시되는 PM-N54Q의 중쇄의 뉴클레오티드 서열 및 SEQ ID NO: 18로 표시되는 PM-N54Q의 경쇄의 뉴클레오티드 서열)을 발현 벡터에 클로닝하였고 최종 플라스미드는 CHO 세포에 전기-형질감염시켰다. 선별압 하에서 성장된 모아진 세포를 일반 절차를 사용하여 PM-N54Q 돌연변이체 항체를 제작하는데 적용하였다. CHO 세포주에서 생산된 항-MUC 1 항체 (PM-N54Q) 를 실시예 8 및 9 에서 사용했다.
2. PankoMab-ADC, N54Q-ADC 및 DXd
PankoMab-GEX [이는 CDR2-H2 에 글리코실화 부위 (Fab 글리코실화) 를 포함하는 인간화, 항-TA-MUC1 모노클로날 항체를 지칭한다], 및 PM-N54Q [이는 Fab 글리코실화를 결여하는 인간화 항-TA-MUC1 모노클로날 항체를 지칭한다] (실시예 1-1), PankoMab-ADC 및 PM-N54Q-ADC 를 예컨대 WO 2014/057687 및 WO 2015/115091 에서 알려진 방법에 의해 생산했다. PankoMab-GEX 항체는 SEQ ID NO: 19 를 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 16 를 포함하는 경쇄를 포함하며, 그에 따라 PankoMab-GEX 항체는 식 2 의 약물-링커에 연결되어 있다. 위에서 언급된 PM-N54Q 항체는 SEQ ID NO: 15 를 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 16 를 포함하는 경쇄를 포함하며, 그에 따라 PM-N54Q 항체는 식 2 의 약물-링커에 연결되어 있다.
[식 2]
Figure pct00025
그러한 PankoMab-ADC 및 PM-N54Q-ADC 구조는 하기 식 5 (y: 항체 분자 당 접합된 약물 분자의 수는 4 내지 8 임, 즉, 항체 당 접합된 약물 분자의 평균수 (y): 대략 8) 를 보이며, AB 는 PankoMab 또는 PM-N54Q 를 나타낸다.
[식 5]
Figure pct00026
컨트롤 hIgG-ADC 는 포유동물 세포에 결합하지 않는 인간화 IgG1 아이소타입 컨트롤 모노클로날 항체, 및 PnakoMab-ADC 및 PM-N54Q-ADC 와 동일한 약물-링커로 구성되었다. ADC 페이로드 (DXd) 를 예컨대 WO　2014/057687 및 WO 2015/115091 에서 알려진 방법에 의해 생산했다.
실시예 2: 항원 ELISA
Fab 부분의 N-글리코실화 부위가 녹아웃된, PankoMab N54X의 항원 결합 특징은 이의 Fab 부분에 N-글리코실화 부위를 갖는 PankoMab와 비교하였다.
(글리코실화) PankoMab-GEX®와 비교한 MUC1-특이적 항체 PankoMab (PM-N54Q)의 Fab-탈글리코실화 형태의 결합 특징은 상이하게 글리코실화 및 비글리코실화 MUC1-유래 탠덤 반복 펩티드를 사용하여 ELISA 연구에서 분석하였다. 원칙적으로, 양쪽 항체는 T에 상이한 글리코실화를 갖는 글리코실화 PDTR 펩티드 (APPAHGVTSAPD-T(X)-RPAPGSTAPPAHGVTSA)에 대한 결합을 통해 동일한 농담을 보인다: 가장 강력한 결합은 Galβ1-3GalNAcalpha (TF) 이후에 시알릴화 TF 및 GalNAcalpha (Tn) O-글리코실화를 보유하는 PDTR 펩티드에 대해 관찰되었다. 시알릴화 GalNAcalpha (sTn) O-글리코실화에 대한 결합은 유의하게 더 낮았다. PankoMab-GEX®처럼, PM-N54Q는 비글리코실화 MUC1 PDTR 펩티드에 대해 매우 적은 결합 친화성을 보여서 적절한 종양 특이성을 의미하였다 (도 1C).
그러나, PankoMab-GEX®와 비교하여, GalNAcalpha (Tn) O-글리칸을 보유하는 바이오틴화 글리코펩티드를 사용한 TA-MUC1 항원 ELISA에서 PM-N54Q에 대해 4배 더 높은 결합이 확인되었다. PM-N54Q는 시알릴화 GalNAcalpha (sTn)로 글리코실화될 때 동일한 MUC1 펩티드에 대해 약 7배 더 양호하게 결합된다. PDTR-서열의 트레오닌에서 Galβ1-3GalNAcalpha (TF) 및 시알릴화 TF (sTF)에 대한 결합 (도 1A)은 PM-N54Q에 대해 2배 더 양호하였다.
양쪽 항체는 PDT(Tn)R-펩티드에서의 것과 비교하여 세린에서 Tn 글리코실화를 갖는 MUC1 펩티드 변이체 APPAHGVTSAPE-S(Tn)-RPAPGSTAPPAHGVTSA에 대해 강력하게 감소된 결합을 보인다. 그러나, 또한 여기서 Fab-탈글리코실화 PM-N54Q는 PankoMab-GEX®에 비해서 유의하게 더 강력하게 결합한다 (도 1B).
상이한 다른 Fab-탈글리코실화 PM-N54X 변이체는 이의 Fab 부분에 N-글리코실화를 갖는 PankoMab와 비교하였다. 먼저, 모든 변이체는 정제없이, 직접 상청액으로부터 비교하였다. 농도는 Octet로 결정하였다. 모든 PM-N54X 변이체는 Fab-글리코실화 PM에 비해 더 양호하게 결합하였다. 또한, 아미노산 측쇄의 화학적 성질에 따른 분명한 경향을 볼 수 있었다. 측쇄에 카르복실산 기는 최저 결합 증강을 보였다. 최고 결합은 1개 또는 2개 질소 (1차 또는 2차 아민)를 갖는 아미노산에서 관찰되었다 (도 1D).
또한, 선택된 Fab-탈글리코실화 변이체 (PM-N54H, -W 및 -Q)는 단백질 A 크로마토그래피를 통해 정제되었고 ELISA 상에서 분석되었다 (도 1E). 각각 Fab-글리코실화를 갖는 PankoMab와 비교하여 TF-MUC1 펩티드에 대한 결합 개선은 약 5배 내지 8배였고 Tn-MUC1 펩티드의 경우는 약 2배 내지 3배이다.
더 나아가서, PM-N54Q의 2종의 상이한 프레임워크 변이체는 ELISA에서 Tn-글리코실화 PDTR-MUC1 펩티드에 대한 결합에 대해 분석되었다 (도 1F 참조). 프레임워크 변이체 mf-a는 VH에 9개의 아미노산 돌연변이 및 VL 프레임워크에 3개를 보유하고; 변이체 mf-b는 또한 VH에 9개의 아미노산 돌연변이 및 VL 프레임워크에 4개를 보유한다. 양쪽 돌연변이된 변이체는 PM-N54Q 항체와 비교하여 유사한 결합을 보인다.
실시예 3: MCF-7 및 ZR-75-1 세포에 대한 항-MUC1 항체의 포화 결합 분석
2가지 인자가 항체의 치료적 적합성에 특히 결정적이다: 종양 세포 상의 항체의 결합 부위 개수 및 친화성.
TA-MUC-1 양성 인간 종양 세포주 상에서 MUC1-특이적 항체 PankoMab (PM-N54Q)의 Fab-탈글리코실화 형태의 결합은 Fab-글리코실화 PankoMab-GEX®와 비교하여 인간 유선 암종 세포주 ZR-75-1 및 MCF-7 상에서 포화된 결합 분석을 통해 방사성표지된 항체를 사용해 평가되었다. 항체는 2시간 동안 37℃에서 50 mM 소듐 카보네이트, 150 mM NaCl, pH 8.7 중에 12배 몰 과량의 p-SCN-Benzyl-DTPA로 킬레이트시킨 후에, 2-8℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 유리 킬레이터는 탈염 컬럼 및 데드-엔드 여과 (50 kDa 컷-오프, PBS로 6x 완충액 교환)로 제거시켰다. 킬레이트된 항체는 6 mM 포스페이트, 1.6 mM KCl, 80 mM NaCl, 0.2 M Na-아세테이트, 0.1 M HCl 중에 37℃에서 1시간 동안 담체-무함유 111In (2 μCi/μg 항체)로 방사성표지시켰다. 조제물은 8-9배 부피의 10x 농축된 PBS의 첨가로 중화시켰다. 약 1/50 부피의 태아 소 혈청을 중화된 표지 항체 조제물에 첨가하였다. 세포 결합 접근법에 대해 1*106 세포가 사용되었다. 몇가지 농도의 표지된 항체를 펠렛화된 세포에 첨가하였다 (1% BSA/PBS 중 30-1000 ng/200 μL). 재현탁된 세포-항체 혼합물은 감마-계측기에서 측정하였고 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션시켰다. 항체가 결합된 세포는 원심분리를 통해 분리시켰고 추가 시간 동안 4℃에서 1% BSA/PBS로 세척하였다. 그 다음으로 세포 펠렛은 감마 계측기로 결합된 111In-표지 항체에 대해 측정되었다. 평가는 GraphPad Prism으로 "1-부위 특이적 ka"를 통해 수행하였다. 수득된 데이터는 표 1에 요약되어 있다. 데이터는 이들 종양 세포 상에서 PM-N54Q의 매우 높은 개수의 결합 부위 및 높은 친화성을 보여준다. 결합은 PankoMab-GEX®에 대한 것에 비해서 2.5배 초과로 더 높았고 또한 결합 부위의 개수는 약간 증가되었다.
표 1: 결합 상수 및 MUC1 + 종양 세포 상의 항원 결합 부위
Figure pct00027
실시예 4a: 표면 플라스몬 공명 (BiaCore) 분석
TA-MUC-1 유래 글리코실화 펩티드에 대한 MUC1-특이적 항체 PankoMab (PM-N54Q)의 Fab-탈글리코실화 형태의 결합은 표면 플라스몬 공명 분석 (Biacore)으로 평가하였다. 스트렙타비딘 센서 칩은 바이오틴화된 TA-MUC1 펩티드 (Tn 글리코실화 또는 비글리코실화)로 코팅하였다. PankoMab 및 PM-N54Q는 순차적으로 1:3으로 HPS-EP 중 3,600 내지 4.9 nM로 희석하였다. 희석물을 50 μL/분으로 주입하였다. 각 농도의 최대 결합은 각각 반응 유닛 (RU)로서 결정하였고, "1-부위 특이적 결합"을 사용해 GraphPad Prism으로 평가하였다. 도 2는 PankoMab-GEX®와 비교하여 PM-N54Q에 대해 수득된 결합 곡선을 도시한다. 388 nM 및 652 nM의 친화성 (KD)이 각각 PM-N54Q 및 PankoMab-GEX®에 대해 계산되었다. 그러므로, 이러한 실험 상황에서, 거의 2배의 친화성 증가가 검출가능하였다.
실시예 4b: 형광 근접 감지 (DRX 2 , Dynamic Biosensors에 의함)
결합 상수 및 친화성을 결정하기 위한 새로운 방법은 칩 상에 점적된 단일 가닥 DNA (96량체) 및 리간드에 커플링된 상보성 DNA를 사용하는 형광 근접 감지법이다. 본 연구에서 스트렙타비딘이 바이오틴화된 TA-MUC1 펩티드를 포획하기 위한 리간드로서 사용되었다. 펩티드에 대한 PankoMab의 결합 결과로 형광도 변화가 야기되었다. 온- 및 오프-속도는 결합 및 해리 동안 계산될 수 있다. 더 높은 감도로 인해서 표면 플라스몬 공명과 비교하여 더 빠른 상호작용을 모니터링할 수 있다. 이러한 결과로 SPR과 상이하지만 액체계에서 측정되는, "금본위" 방법 KinExA과 더 비슷한 결합 운동학이 야기된다.
PankoMab 및 PM-N54Q는 300 nM 부터 1:9 단계로 3.67 nM 까지 PE140 완충액 중에 희석하였고 칩-결합된 펩티드에 도포되었다. 결합 곡선은 단일-지수 전역 핏 (mono-exponential global fit) (장비 소프트웨어)을 통해 평가하였다. PM 및 PM-N54Q의 결합 곡선은 도 3A 및 B에 예시적으로 도시되어 있다. PankoMab 변이체의 계산된 친화성은 표 2에 표시되어 있다:
표 2: 항원 펩티드에 대한 PankoMab 변이체의 해리 상수
Figure pct00028
실시예 5: 생화학적 특징
비환원 및 환원 SDS-PAGE를 사용하여 항체의 순도 및 정체를 분석한다. 비환원 겔에서 밴드 패턴은 약 160 kDa에서 주요 밴드 및 중쇄 및 경쇄의 체계적 인공물 및 이의 조합 (∼25, 50-55, 75, 110, 135 kDa)을 보여준다. 환원 겔은 25 및 50-55 kDa에서 별개의 경쇄 및 중쇄 밴드를 보여준다. Fab 글리코실화 결여로 인해서 예상한 바와 같이 PM-N54Q는 더 작은 중쇄를 갖는다 (도 4, 우측 참조).
전하 프로파일은 등전점 집속 (IEF; 도 5 참조)으로 표시된 바와 같이, 분명하게 상이하다. Fab 글리코실화는 많이 시알릴화되는 반면, Fc 글리코실화는 오직 최소로 시알릴화된다. 따라서 PankoMab-GEX®는 PM-N54Q에 비해 더 하전된 이소폼을 가져서, Fab 부분에서 이의 더 높은 수준의 음으로 하전된 시알산을 반영한다.
실시예 6: Fcγ 수용체 결합
FcγRIIIa (CD16a)에 대한 FcγR 결합 어세이는 PerkinElmer의 AlphaScreen® 기술을 기반으로 한다. AlphaScreen® 플랫폼은 PerkinElmer의 단순 비드-기반 기술에 의존하며 세척 단계를 필요로 하지 않으므로 전통적인 ELISA에 대한 보다 효율적인 대안이다.
수용체 결합 어세이의 경우, His-태그된 FcγRIIIa (Glycotope GmbH)는 Ni-킬레이트 도너 비드를 통해 포획된다. 항-MUC1 항체 및 토끼-항-마우스 커플링된 억셉터 비드는 FcγR와의 결합에 대해 경쟁한다. FcγR와 토끼-항-마우스-결합된 억셉터 비드의 상호작용의 경우에, 도너 및 억셉터 비드는 밀접하게 근접하여 680 nm에서 레이저 여기시, 빛 방출을 초래한다. 최대 신호는 경쟁자없이 획득된다 (신호max). 시험 항체가 FcγR에 결합하는, 경쟁의 경우에, 신호max 는 농도-의존적 방식으로 감소된다. 화학발광은 520-620　nm (AlphaScreen® method)에서 EnSpire 2300 멀티라벨 리더 (PerkinElmer)를 사용한 측정으로 정량하였다. 모든 결과는 이중 샘플의 평균 ± 표준 편차로서 표시하였다. 데이터는 GraphPad Prism 5 소프트웨어와 비선형 그래프 핏팅 (S자형 용량-반응 가변 기울기)을 사용해 평가 및 계산하였다. 결과로서, 최고-평탄역, 최저-평탄역, 기울기 및 EC50 로 정의되는, 농도 의존적 S자형 그래프가 수득된다.
도 6A 및 B에 도시된 바와 같이, FcγRIIIa 결합 친화성은 PankoMab N54Q 및 PankoMab에 대해 비슷하여서 도 A에서 저-푸코실화 항체 및 도 B에서 고-푸코실화 항체가 어세이에 적용되었다. 그리하여, Fab 글리코실화의 제거는 항체와 수용체 상호작용에 영향을 미치지 않았다.
실시예 7: 세포 TA-MUC1와의 결합
N54Q 및 N54D는 일시적으로 발현시켰고 단백질 A 크로마토그래피로 정제하였다. 세포 표면 TA-MUC1에 대한 2종 변이체의 결합은 2종의 상이한 암종 세포주를 사용해 Fab 글리코실화 존재의 PM과 비교하였다. 혀 편평 세포 암종 세포주 HSC-4는 TA-MUC1을 중간 정도로 발현하고 난소 암종 세포주 CaOV-3은 높은 정도로 발현한다. 종양 세포들을 연속 희석된 항체와 인큐베이션시켰고 결합된 항체는 파이코에리쓰린-접합된 염소 항-인간 IgG (중쇄 및 경쇄) 항체를 사용해 검출하였다. 인간 IgG 대조군이 배경 염색에 대한 대조를 위해 포함되었다. 결합은 유세포측정으로 분석하였다.
분석된 구성체 PM, PM-N54Q 및 PM-N54D는 인간 IgG1 대조군과 비교하여 TA-MUC1 발현 HSC-4 및 CaOV-3 세포에 대한 강력하고 특이적인 결합을 보인다 (도 7). TA-MUC1high CaOV-3 세포에 대한 PM-N54D의 결합은 Fab 글리코실화 존재의 PM과 비슷하였지만 PM-N54Q는 약간 더 양호한 결합을 보였다 (도 7A). 중간 수준으로 TA-MUC1을 발현하는 HSC-4 암종 세포를 사용하면, 변이체 PM-N54Q는 PM과 비교하여 세포 TA-MUC1에 대한 결합에서 분명하게 우수하였지만 PM-N54D는 Fab 글리코실화 존재의 PM과 비교해 열등한 결합을 보였다 (도 7B).
실시예 8: PankoMab-ADC 및 PM-N54Q-ADC 의 인 비트로 (in vitro) 효능의 평가
8.1 세포주
인간 유방암 세포주 MDA-MB-468, 인간 췌장암 세포주 HPAC, 및 인간 폐암 세포주 NCI-H441 를 TA-MUC1 중 내지 고-발현 세포로서 사용했다. 인간 대장암 세포주 HCT-15 를 TA-MUC1 음성 세포로서 사용했다. 이들 세포주를 ATCC 로부터 구입했다. 각각의 세포주를 설명 매뉴얼에 따라 배양했다. 각각의 암 세포주 상에서 TA-MUC1 의 발현 수준을 유세포측정법에 의해 확인했다.
8.2 PankoMab-ADC 의 인 비트로 효능의 평가
배양 배지를 사용하여 1.25 × 104 세포/mL 의 농도를 갖는 MDA-MB-468 현탁액을 제조하고, 검은색 투명 바닥 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 80 uL/웰 (1000 세포/웰) 로 첨가했다. 블랭크 웰의 경우에, 배지 단독을 웰에 80 uL/웰 (N = 3) 로 첨가했다. 모든 세포를 MDA-MB-468 에 적절한 조건에서 밤새 인큐베이션했다.
배양 배지를 사용하여 3.1 × 103 세포/mL 의 농도를 갖는 HCT-15 현탁액을 제조하고, 현탁액을 검은색 투명 바닥 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 80 uL/웰 (250 세포/웰) 로 첨가했다. 블랭크 웰의 경우에, 배지 단독을 웰에 80 uL/웰 (N = 3) 로 첨가했다. 모든 세포를 HCT-15 에 적절한 조건에서 밤새 인큐베이션했다.
다음 날, 각각의 네이키드 PankoMab, 컨트롤 hIgG-ADC, 및 PankoMab-ADC 를 각각의 배양 배지로 500 nM 내지 0.2 nM 로 3-배 계단 희석했다. 20 ㎕ 의 이들 희석된 용액을 적절한 웰에 첨가했다 (최종 농도: 100 nM 내지 0.04 nM). 블랭크 웰 및 미처리 웰의 경우에, 20 uL 의 각각의 배양 배지 단독을 웰에 첨가했다. 모든 플레이트를 각각의 세포주에 적절한 조건에서 6 일 동안 인큐베이션했다.
인큐베이션 후에, 각각의 웰 내의 ATP 의 양을 CellTiter-Glo 발광 세포 생활력 어세이 (Promega) 를 사용하여 측정했다. 발광을 멀티라벨 카운터 (ARVO X3, PerkinElmer Japan Co., Ltd.) 에 의해 측정했다. 이 어세이를 트리플리케이트 (triplicate) 로 수행했다.
각각의 샘플의 세포 생활력을 하기 등식에 의해 계산했다:
세포 생활력 (%) = 100 × (T - B) / (C - B)
T: 시험 웰의 발광 강도
C: 미처리 웰의 평균 발광 강도
B: 블랭크 웰의 평균 발광 강도
8.3 PankoMab-ADC 와 PM-N54Q-ADC 사이의 인 비트로 효능의 비교
배양 배지를 사용하여 1.25 × 104 세포/mL 의 농도를 갖는 HPAC 현탁액을 제조하고, 검은색 투명 바닥 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 80 uL/웰 (1000 세포/웰) 로 첨가했다. 블랭크 웰의 경우에, 배지 단독을 웰에 80 uL/웰 (N = 3) 로 첨가했다. 모든 세포를 HPAC 에 적절한 조건에서 밤새 인큐베이션했다.
배양 배지를 사용하여 1.25 × 104 세포/mL 의 농도를 갖는 NCI-H441 현탁액을 제조하고, 검은색 투명 바닥 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 80 uL/웰 (1000 세포/웰) 로 첨가했다. 블랭크 웰의 경우에, 배지 단독을 웰에 80 uL/웰 (N = 3) 로 첨가했다. 모든 세포를 NCI-H441 에 적절한 조건에서 밤새 인큐베이션했다.
다음 날, 각각의 네이키드 PankoMab, 네이키드 PM-N54Q, hIgG-ADC, PankoMab-ADC, 및 PM-N54Q-ADC 를 각각의 배양 배지로 500 nM 내지 0.2 nM 로 3-배 계단 희석했다. 20 ㎕ 의 이들 희석된 용액을 적절한 웰에 첨가했다 (최종 농도: 100 nM 내지 0.04 nM). 블랭크 웰 및 미처리 웰의 경우에, 20 uL 의 각각의 배양 배지 단독을 웰에 첨가했다. 모든 플레이트를 각각의 세포주에 적절한 조건에서 6 일 동안 인큐베이션했다.
인큐베이션 후에, 각각의 웰 내의 ATP 의 양을 CellTiter-Glo 발광 세포 생활력 어세이 (Promega) 를 사용하여 측정했다. 발광을 멀티라벨 카운터 (ARVO X3, PerkinElmer Japan Co., Ltd.) 에 의해 측정했다. 이 어세이를 트리플리케이트로 수행했다.
각각의 샘플의 세포 생활력을 하기 등식에 의해 계산했다:
세포 생활력 (%) = 100 × (T - B) / (C - B)
T: 시험 웰의 발광 강도
C: 미처리 웰의 평균 발광 강도
B: 블랭크 웰의 평균 발광 강도
HPAC 및 NCI-H441 에 대한 PankoMab-ADC vs PM-N54Q-ADC 의 세포독성 활성의 효능 비, 및 그들의 95% CI 를 SAS Release 9.4 (SAS Institute Japan, Tokyo, Japan) (Emax: 100, Emin: 추정) 에 기초하는 EXSUS ver.8.1 (CAC Croit, Tolyo, Japan) 을 사용함으로써 3-파라미터 로지스틱 평행선 분석 (공통 기울기) 을 사용하여 사후 (post-hoc) 분석으로서 계산했다. 세포독성 활성의 역가의 차이는 95% CI 의 효능 비가 1 을 배제한 경우에 유의한 것으로 여겨졌다.
실시예 9: PankoMab-ADC 및 PM-N54Q-ADC 의 인 비보 효능의 평가
9.1 세포주
인간 유방암 세포주 MDA-MB-468 및 HCC70, 인간 췌장암 세포주 HPAC, 및 인간 폐암 세포주 NCI-H441 를 TA-MUC1 중 내지 고-발현 종양 세포로서 사용했다. 인간 대장암 세포주 HCT-15 를 TA-MUC1 음성 종양 세포로서 사용했다. 이들 세포주를 ATCC 로부터 구입했다. 인간 난소암 세포주 OVCAR-5 를 National Cancer Institute 로부터 구입하고, TA-MUC1 저-발현 종양 세포로서 사용했다. 각각의 세포주를 설명 매뉴얼에 따라 배양했다. 각각의 암 세포주 상에서 TA-MUC1 의 발현 수준을 유세포측정법 및 IHC 염색에 의해 확인했다.
9.2 PankoMab-ADC 의 인 비보 효능의 평가
MDA-MB-468 세포를 Matrigel (BD) 에 현탁시키고, 1 × 107 세포를 각각의 암컷 누드 마우스의 몸의 오른쪽에 피하 이식하고 (제 0 일), 제 20 일에 마우스를 무작위로 그룹화했다 (N = 6). 그룹화 후에, 각각의 네이키드 PankoMab, 컨트롤 hIgG-ADC, 또는 PankoMab-ADC 용액을 3 ㎎/㎏ 의 도스로 정맥내에 싱글 도스 투여했다. 비히클 (아세테이트 완충액) 투여군을 컨트롤 군으로서 확립했다. 투여 후에, 각각의 마우스의 종양 길이 및 너비를 디지털 캘리퍼를 사용하여 일주일에 두 번 21 일 동안 측정했다.
HCC70 세포를 생리 식염수 (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.) 에 현탁시키고, 1 × 107 세포를 각각의 암컷 누드 마우스의 몸의 오른쪽에 피하 이식하고 (제 0 일), 제 19 일에 마우스를 무작위로 그룹화했다 (N = 6). 그룹화 후에, 각각의 네이키드 PankoMab, 컨트롤 hIgG-ADC, 또는 PankoMab-ADC 용액을 10 ㎎/㎏ 의 도스로 정맥내에 싱글 도스 투여했다. 비히클 (아세테이트 완충액) 투여군을 컨트롤 군으로서 확립했다. 투여 후에, 각각의 마우스의 종양 길이 및 너비를 디지털 캘리퍼를 사용하여 일주일에 두 번 21 일 동안 측정했다.
각각의 마우스의 추정된 종양 부피를 하기 등식에 의해 계산했다:
추정된 종양 부피 (㎣) = 1/2 × 길이 (㎜) × 너비 (㎜)2
비히클 처리군의 마지막 측정일에 각각의 군의 종양 성장 저해 (TGI, %) 를 또한 하기 등식에 따라 계산하고, 정수로 반올림했다.
TGI (%) = (1 - T/C) × 100
T: 네이키드 PankoMab, 컨트롤 hIgG-ADC, 또는 PankoMab-ADC 의 평균 추정된 종양 부피 (㎣)
C: 비히클 처리군의 평균 추정된 종양 부피 (㎣)
PankoMab-ADC 의 항-종양 효능을 평가하기 위해서, PankoMab-ADC 처리군의 마지막 측정일 (MDA-MB-468: 제 41 일, HCC70: 제 40 일) 에 각각의 마우스의 종양 부피를 스튜던트 t-검정에 의해 컨트롤 hIgG-ADC 처리군 또는 네이키드 PankoMab 처리군의 경우와 비교했다. 모든 통계적 분석을 SAS System Release 9.2 (SAS Institute Inc.) 를 사용하여 사후 분석으로서 수행했다. 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 여겨졌다.
9.3 PankoMab-ADC 및 PM-N54Q-ADC 의 인 비보 효능의 비교
HPAC 세포를 생리 식염수 (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.) 에 현탁시키고, 3 × 106 세포를 각각의 암컷 누드 마우스의 몸의 오른쪽에 피하 이식하고 (제 0 일), 제 11 일에 마우스를 무작위로 그룹화했다 (N = 6). 그룹화 후에, 각각의 네이키드 PM-N54Q, 컨트롤 hIgG-ADC, PankoMab-ADC, 또는 PM-N54Q-ADC 용액을 10 ㎎/㎏ 의 도스로 정맥내에 싱글 도스 투여했다. 비히클 (아세테이트 완충액) 투여군을 컨트롤 군으로서 확립했다. 투여 후에, 각각의 마우스의 종양 길이 및 너비를 디지털 캘리퍼를 사용하여 일주일에 두 번 21 일 동안 측정했다.
NCI-H441 세포를 Matrigel (BD) 에 현탁시키고, 5 × 106 세포를 각각의 암컷 누드 마우스의 몸의 오른쪽에 피하 이식하고 (제 0 일), 제 7 일에 마우스를 무작위로 그룹화했다 (N = 6). 그룹화 후에, 각각의 네이키드 PankoMab 또는 네이키드 PM-N54Q 용액을 10 ㎎/㎏ 의 도스로 정맥내에 싱글 도스 투여하고, 컨트롤 hIgG-ADC, PankoMab-ADC, 또는 PM-N54Q-ADC 용액을 3 ㎎/㎏ 의 도스로 정맥내에 싱글 도스 투여했다. 비히클 (아세테이트 완충액) 투여군을 컨트롤 군으로서 확립했다. 투여 후에, 각각의 마우스의 종양 길이 및 너비를 디지털 캘리퍼를 사용하여 일주일에 두 번 31 일 동안 측정했다.
OVCAR-5 세포를 생리 식염수 (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.) 에 현탁시키고, 5 × 106 세포를 각각의 암컷 누드 마우스의 몸의 오른쪽에 피하 이식하고 (제 0 일), 제 12 일에 마우스를 무작위로 그룹화했다 (N = 6). 그룹화 후에, 네이키드 PankoMab, 네이키드 PM-N54Q, 컨트롤 hIgG-ADC, PankoMab-ADC, 또는 PM-N54Q-ADC 용액을 10 ㎎/㎏ 의 도스로 정맥내에 싱글 도스 투여했다. 비히클 (아세테이트 완충액) 투여군을 컨트롤 군으로서 확립했다. 투여 후에, 각각의 마우스의 종양 길이 및 너비를 디지털 캘리퍼를 사용하여 일주일에 두 번 21 일 동안 측정했다.
HCT-15 세포를 생리 식염수 (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.) 에 현탁시키고, 5 × 106 세포를 각각의 암컷 누드 마우스의 몸의 오른쪽에 피하 이식하고 (제 0 일), 제 10 일에 마우스를 무작위로 그룹화했다 (N = 6). 그룹화 후에, 컨트롤 hIgG-ADC, PankoMab-ADC, 또는 PM-N54Q-ADC 용액을 10 ㎎/㎏ 의 도스로 정맥내에 싱글 도스 투여했다. 비히클 (아세테이트 완충액) 투여군을 컨트롤 군으로서 확립했다. 투여 후에, 각각의 마우스의 종양 길이 및 너비를 디지털 캘리퍼를 사용하여 일주일에 두 번 21 일 동안 측정했다.
각각의 마우스의 종양 부피를 하기 등식에 의해 계산했다:
추정된 종양 부피 (㎣) = 1/2 × 길이 (㎜) × 너비 (㎜)2
비히클 처리군의 마지막 측정일 또는 모든 군이 살아 있는 마지막 날에 각각의 마우스의 종양 성장 저해 (TGI, %) 를 또한 하기 등식에 따라 계산하고, 정수로 반올림했다.
TGI (%) = (1 - T/C) × 100
T: 네이키드 PankoMab, 네이키드 PM-N54Q, 컨트롤 hIgG-ADC, PankoMab-ADC 또는 PM-N54Q-ADC 의 평균 추정된 종양 부피 (㎣)
C: 비히클 처리군의 평균 추정된 종양 부피 (㎣)
HPAC, NCI-H441, OVCAR-5, 및 HCT-15-보유 마우스에 대한 각각의 화합물의 항-종양 효능을 평가하기 위해서, 컨트롤 hIgG-ADC 처리군의 마지막 측정일 (HPAC: 제 32 일, NCI-H441: 제 38 일, HCT-15: 제 32 일) 또는 모든 군이 살아 있는 마지막 날 (OVCAR-5: Day 26) 에 각각의 마우스의 종양 부피를 던네트 검정에 의해 컨트롤 hIgG-ADC 처리군의 경우와 비교했다. 또한, 제 33 일에 OVCAR-5-보유 누드 마우스의 종양 부피를 스튜던트 t-검정에 의해 PankoMab-ADC 와 PM-N54Q-ADC 처리군 사이에서 비교했다. 모든 통계적 분석을 SAS System Release 9.2 (SAS Institute Inc.) 를 사용하여 사후 분석으로서 수행했다. 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 여겨졌다.
실시예 10: 결과
10.1 TA-MUC1 양성 암 세포주 및 음성 세포에 대한 PankoMab-ADC 의 인 비트로 세포독성 활성
PankoMab-ADC 가 인간 암 세포주에 대해 표적-의존적 및 약물-의존적 세포독성 활성을 보이는지 여부를 연구하기 위해서, 인간 유방암 세포 MDA-MB-468 (TA-MUC1 양성) 및 인간 대장암 세포 HCT-15 (TA-MUC1 음성) 에 대한 네이키드 PankoMab, 컨트롤 hIgG-ADC, 및 PankoMab-ADC 의 인 비트로 효능을 평가했다. 도 8 에서 보여지는 바와 같이, 네이키드 PankoMab 및 hIgG-ADC 는 각각의 세포주에 대해 적은 활성을 보였다 (IC50 > 100 nM). 이들 조건 하에서, PankoMab-ADC 는 TA-MUC1 양성 세포 MDA-MB-468 에 대해 도스-의존적 세포독성 활성을 보였다 (도 8A, IC50 <10 nM). 그러나 그것은 TA-MUC1 음성 세포 HCT-15 에 대해서는 활성을 보이지 않았다 (도 8B, IC50 >100 nM). 이들 결과에 기초하여, PankoMab-ADC 는 TA-MUC1 양성 암 세포주에 대해 인 비트로 표적-의존적 및 약물-의존적 세포독성 활성을 보인다는 결론을 내렸다.
10.2 TA-MUC1 양성 세포에 대한 PankoMab-ADC 와 PM-N54Q-ADC 사이의 인 비트로 세포독성 활성의 인 비트로 비교
항원 결합 친화성의 개선이 세포독성 활성의 향상에 기여할 수 있는지 여부를 연구하기 위해서, 인간 췌장암 세포주 HPAC 및 인간 폐암 세포주 NCI-H441 에 대한 PankoMab-ADC 및 PM-N54Q-ADC 의 인 비트로 효능을 평가했다. 그들에 대한 PM-N54Q-ADC 의 세포독성 활성은 PankoMab-ADC 의 세포독성 활성보다 1.5-배 넘게 더 강력했다 (도 8C 및 도 8D). HPAC 에 대한 PM-N54Q-ADC vs. PankoMab-ADC 의 효능 비는 1.917 (1.611 - 2.280, 95% CI) 였고, NCI-H441 에 대한 효능 비는 1.663 (1.495 내지 1.849, EC50 에서 95% CI) 였다. 이들 데이타는 PM-N54Q-ADC 의 세포독성 활성이 PankoMab-ADC 의 세포독성 활성보다 유의하게 더 강력하다는 것을 입증했다. 이들 결과는 PankoMab-ADC 의 항원 결합 친화성의 개선이 세포 사멸 활성의 유의한 향상에 기여할 수 있다는 것을 시사한다.
10.3 TA-MUC1 양성 종양에 대한 PankoMab-ADC 의 항-종양 효능
PankoMab-ADC 가 인 비트로 효능 뿐만 아니라 인 비보 효능을 보이는지 여부를 연구하기 위해서, MDA-MB-468-보유 마우스에 대한 네이키드 PankoMab, 컨트롤 hIgG-ADC, 및 PankoMab-ADC 의 항-종양 효능을 평가했다. 도 9 에서 보여지는 바와 같이, 네이키드 PankoMab 및 컨트롤 IgG-ADC (3 ㎎/㎏, 싱글 투여) 는 항-종양 효능을 보이지 않았다 (둘 모두 TGI 는 제 41 일에 -18% 였다). 이와 대조적으로, PankoMab-ADC (3 ㎎/㎏, 싱글 투여) 는 종양 성장을 현저히 저해했다 (TGI 는 제 41 일에 97% 였다). 더욱이, 컨트롤 hIgG-ADC 및 네이키드 PankoMab (둘 모두 제 41 일에 P<0.001 였다) 와 비교하여 그것은 유의한 항-종양 효능을 보였다. 체중 변화의 면에서, 약물 처리에 의해 야기되는 임의의 체중 손실이 모든 약물-처리군에서 관찰되지 않았다.
HCC70-보유 마우스에 대한 네이키드 PankoMab, 컨트롤 hIgG-ADC, 및 PankoMab-ADC 의 항-종양 효능을 또한 평가했다. 도 10 에서 보여지는 바와 같이, 네이키드 PankoMab 및 컨트롤 hIgG-ADC (10 ㎎/㎏, 싱글 투여) 는 이들 이종이식 모델에 대해 약한 항-종양 효능을 보였다 (TGI 는 제 40 일에 각각 10% 및 29% 였다). 이와 대조적으로, PankoMab-ADC (10 ㎎/㎏, 싱글 투여) 는 종양 성장을 현저히 저해했다 (TGI 는 제 40 일에 95% 였다). 더욱이, 컨트롤 hIgG-ADC 과 비교하여 그것은 통계적으로 유의한 항-종양 효능을 보였다 (둘 모두 제 40 일에 P<0.001 였다). 체중 변화의 면에서, 약물 처리에 의해 야기되는 임의의 체중 손실이 모든 약물-처리군에서 관찰되지 않았다. 이들 결과는 PankoMab-ADC 가 강한 항-종양 효능을 갖는다는 것을 시사하고, 그것은 다양한 TA-MUC1 양성 이종이식 모델에 대해 표적-의존적 및 약물-의존적 항-종양 효능을 보였다.
10.4 TA-MUC1 양성 종양에 대한 PankoMab-ADC 와 PM-N54Q-ADC 사이의 인 비보 항-종양 효능의 비교
PM-N54Q-ADC 가 TA-MUC1 양성 종양 세포에 대해 PankoMab-ADC 와 동일한 항-종양 효능 또는 PankoMab-ADC 보다 더 큰 항-종양 효능을 갖는지 여부를 연구하기 위해서, 다양한 유형의 TA-MUC1 양성 종양 세포에 대한 PankoMab-ADC 및 PM-N54Q-ADC 의 항-종양 효능을 비교했다.
처음에는, 우리는 중 내지 고 TA-MUC1 발현을 보이는 HPAC 및 NCI-H441 종양 세포에 대한 인 비보 효능을 평가했다. 도 11 에서 보여지는 바와 같이, 네이키드 PM-N54Q 및 컨트롤 hIgG-ADC (10 ㎎/㎏, 싱글 투여) 는 HPAC-보유 마우스에 대한 약한 항-종양 효능을 보였다 (TGI 는 제 32 일에 각각 27% 및 18% 였다). 이와 대조적으로, PankoMab-ADC 및 PM-N54Q-ADC (10 ㎎/㎏, 싱글 투여) 는 종양 성장을 현저히 저해했다 (둘 모두 TGI 는 제 32 일에 93% 였다). 더욱이, PankoMab-ADC 및 PM-N54Q-ADC (10 ㎎/㎏, 싱글 투여) 는 컨트롤 hIgG-ADC 과 비교하여 통계적으로 유의한 항-종양 효능을 보였다 (둘 모두 제 32 일에 P<0.001 였다). 체중 변화의 면에서, 약물 처리에 의해 야기되는 임의의 체중 손실이 모든 약물-처리군에서 관찰되지 않았다.
도 12 에서 보여지는 바와 같이, 네이키드 PankoMab 및 네이키드 PM-N54Q (10 ㎎/㎏, 싱글 투여) 는 NCI-H441-보유 마우스에 대해 약한 항-종양 효능을 보였다 (TGI 는 제 38 일에 각각 8% 및 12% 였다). 컨트롤 hIgG-ADC (3 ㎎/㎏, 싱글 투여) 처리군은 투여 후 2 주 동안 항-종양 효능을 보였지만, 제 21 일 후에 종양 재성장이 관찰되었다 (TGI 는 제 38 일에 71% 였다). 이와 대조적으로, PankoMab-ADC 및 PM-N54Q-ADC (3 ㎎/㎏, 싱글 투여) 는 종양 성장을 현저히 저해했다 (둘 모두 TGI 는 제 38 일에 99% 였다). 더욱이, PankoMab-ADC 및 PM-N54Q-ADC 는 컨트롤 hIgG-ADC 와 비교하여 통계적으로 유의한 항-종양 효능을 보였다 (제 38 일에 각각 P<0.001). 체중 변화의 면에서, 약물 처리에 의해 야기되는 임의의 체중 손실이 모든 약물-처리군에서 관찰되지 않았다.
그 다음으로, 우리는 TA-MUC1 저 발현을 보이는 OVCAR-5 종양 세포에 대한 인 비보 효능을 평가했다. 도 13 에서 보여지는 바와 같이, 네이키드 PankoMab, PM-N54Q 및 컨트롤 hIgG-ADC (10 ㎎/㎏, 싱글 투여) 는 OVCAR5-보유 마우스에 대해 적은 항-종양 효능을 보였다 (TGI 는 제 26 일에 각각 1%, 11% 및 3% 였다). 이 모델에서, PankoMab-ADC (10 ㎎/㎏, 싱글 투여) 의 항-종양 효능은 제한적이었으나 (TGI 는 제 26 일에 37% 였다), PM-N54Q-ADC (10 ㎎/㎏, 싱글 투여) 는 강한 항-종양 효능을 보였다 (TGI 는 제 26 일에 73% 였다). 더욱이, PankoMab-ADC 및 PM-N54Q-ADC 는 컨트롤 hIgG-ADC 와 비교하여 통계적으로 유의한 항-종양 효능을 보였다 (제 26 일에 각각 P=0.01 및 P<0.001). 또한, PM-N54Q-ADC 는 PankoMab-ADC 와 비교하여 통계적으로 유의한 항-종양 효능을 보였다 (제 26 일에 P<0.001). 체중 변화의 면에서, 약물 처리에 의해 야기되는 임의의 체중 손실이 모든 약물-처리군에서 관찰되지 않았다.
최종적으로, 우리는 TA-MUC1 음성인 HCT-15 종양 세포에 대한 인 비보 효능을 평가했다.
도 14 에서 보여지는 바와 같이, 네이키드 PankoMab 및 PM-N54Q (10 ㎎/㎏, 싱글 투여) 는 이 모델에 대해 적은 항-종양 효능을 보였다 (TGI 는 제 32 일에 각각 7%, 4% 였다). 더욱이, PankoMab-ADC, PM-N54Q-ADC 및 컨트롤 hIgG-ADC 는 또한 이 모델에 대해 적은 항-종양 효능을 보였다 (TGI 는 제 32 일에 각각 15%, 22%, 및 26% 였다).
이들 결과에 기초하여, PankoMab-ADC 및 PM-N54Q-ADC 의 항-종양 효능은 표적-의존적 및 약물-의존적이라는 결론을 내렸다. 그리고, 항원 결합 친화성의 개선은 TA-MUC1 양성 종양 세포에 대한 항-종양 효능의 향상에 기여할 수 있다.
기탁된 생물학적 물질의 확인
세포주 DSM ACC 2806, DSM ACC 2807 및 DSM ACC 2856 은 하기 표에 표시된 일자로 Glycotope GmbH (Robert-Roessle-Str. 10, 13125 Berlin (DE))가 독일 생물 자원 센터 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) (Inhoffenstrasse 7B, 38124 Braunschweig (DE))에 기탁하였다.
Figure pct00029
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) DSMACC2806 20060915 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) DSMACC2807 20061005 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) DSMACC2856 20070808
SEQUENCE LISTING <110> Daiichi Sankyo Company, Limited <120> Anti-MUC1 antibody-drug conjugate <130> PN838543 <150> EP18173253.8 <151> 2018-05-18 <160> 23 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 <400> 1 Asn Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H2 <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> Xaa is any amino acid except Asn <400> 2 Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Xaa Tyr Thr Thr His Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H3 <400> 3 His Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 <400> 4 Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Phe Phe 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L2 <400> 5 Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 <400> 6 Ala Gln Asn Leu Glu Leu 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Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Gly Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 20 <211> 460 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain <220> <221> VARIANT <222> (76)..(76) <223> Xaa is any amino acid except Asn <400> 20 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Met Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Pro Phe 35 40 45 Ser Asn Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Gly Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Xaa Tyr Thr Thr His 65 70 75 80 Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser 85 90 95 Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg His Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val 130 135 140 Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr 145 150 155 160 Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr 165 170 175 Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190 Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser 195 200 205 Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala 210 215 220 Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys 225 230 235 240 Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe 245 250 255 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val 260 265 270 Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe 275 280 285 Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro 290 295 300 Arg Glu Glu Gln Ile Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro 305 310 315 320 Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val 325 330 335 Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr 340 345 350 Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys 355 360 365 Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn 370 375 380 Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro 385 390 395 400 Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser 405 410 415 Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala 420 425 430 Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His 435 440 445 His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 21 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain <400> 21 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Asn Pro 20 25 30 Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser 35 40 45 Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Phe Phe Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 115 120 125 Val Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe 145 150 155 160 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp 165 170 175 Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp 180 185 190 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys 195 200 205 Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys 210 215 220 Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 235 <210> 22 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain <400> 22 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Pro Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Gln Tyr Thr Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg His Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Gly Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 23 <211> 460 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain <400> 23 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Met Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Pro Phe 35 40 45 Ser Asn Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Gly Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Gln Tyr Thr Thr His 65 70 75 80 Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser 85 90 95 Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg His Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val 130 135 140 Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr 145 150 155 160 Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr 165 170 175 Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190 Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser 195 200 205 Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala 210 215 220 Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys 225 230 235 240 Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe 245 250 255 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val 260 265 270 Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe 275 280 285 Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro 290 295 300 Arg Glu Glu Gln Ile Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro 305 310 315 320 Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val 325 330 335 Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr 340 345 350 Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys 355 360 365 Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn 370 375 380 Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro 385 390 395 400 Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser 405 410 415 Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala 420 425 430 Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His 435 440 445 His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 450 455 460

Claims (55)

  1. 세포독성제에 접합된 항체를 포함하는 접합체로서, 항체는 MUC1 에 결합할 수 있으며, 항체는
    (i) 상보성-결정 영역 (CDR) 으로서 SEQ ID NO: 1 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H1, SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H2 및 SEQ ID NO: 3 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-H3 을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    (ii) 상보성-결정 영역 (CDR) 으로서 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L1, SEQ ID NO: 5 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L2 및 SEQ ID NO: 6 의 아미노산 서열을 갖는 CDR-L3 을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 접합체.
  2. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO: 2 의 위치 8 에서의 아미노산은 글루타민, 히스티딘, 트립토판, 티로신, 리신 및 아르기닌으로 이루어지는 군으로부터 선택되거나, 또는 CDR-H2 는 SEQ ID NO: 7 의 아미노산 서열을 갖는 접합체.
  3. 제 1 항에 있어서, 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9 의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 9 의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 접합체.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10 의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 10 의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 접합체.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 12 의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 12 의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 접합체.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10 의 아미노산 서열을 갖고, 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 12 의 아미노산 서열을 갖는 접합체.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 Fc 영역을 포함하고, 바람직하게는 IgG1, IgG2 또는 IgG4-유형 항체인 접합체.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 중쇄는 SEQ ID NO: 15, 특히 SEQ ID NO: 22 의 아미노산 서열을 갖고, 항체의 경쇄는 SEQ ID NO: 16 의 아미노산 서열을 갖는 접합체.
  9. 제 1 항에 있어서, CDR-H2 는 SEQ ID NO: 8 의 아미노산 서열을 갖는 접합체.
  10. 제 1 항 또는 제 9 항에 있어서, 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11 의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 11 의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 접합체.
  11. 제 1 항, 제 9 항 및 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 12 의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 12 의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 접합체.
  12. 제 1 항 및 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11 의 아미노산 서열을 갖고, 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 12 의 아미노산 서열을 갖는 접합체.
  13. 제 1 항 및 제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 Fc 영역을 포함하고, 바람직하게는 IgG1, IgG2 또는 IgG4-유형 항체인 접합체.
  14. 제 1 항 및 제 9 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 중쇄는 SEQ ID NO: 19 의 아미노산 서열을 갖고, 항체의 경쇄는 SEQ ID NO: 16 의 아미노산 서열을 갖는 접합체.
  15. 제 7 항, 제 8 항, 제 13 항 및 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 하기 특징 중 하나 이상을 갖는 글리코실화 패턴을 포함하는 접합체:
    (i) 이분형 GlcNAc 잔기를 보유하는 글리칸의 검출가능한 양;
    (ii) 조성물 중 항체의 Fc 글리코실화 부위에 부착된 글리칸의 총량의 적어도 25% 의 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 보유하는 글리칸의 상대량.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 포유동물 세포에서의 생산에 의해 수득가능한 접합체.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 NM-H9D8 (DSM ACC 2806), NM-H9D8-E6 (DSM ACC 2807), NM-H9D8-E6Q12 (DSM ACC 2856) 및 그로부터 유래하는 세포주로 이루어지는 군으로부터 선택되는 인간 세포주에서의 생산에 의해 수득가능한 접합체.
  18. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 CHO 세포주 및 그로부터 유래하는 세포주에서의 생산에 의해 수득가능한 접합체.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 (i) 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계, (ii) 항체의 발현에 적합한 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 (iii) 숙주 세포에 의해 발현된 항체를 수득하는 단계를 포함하는 생산 방법에 의해 수득가능한 접합체.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 10 의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:12 의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체, 또는 SEQ ID NO:11 의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:12 의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 TA-MUC1 에 대한 결합에서 경쟁하는 접합체.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 MUC-1 에 대한 결합을 통해 MUC1-발현 세포 내로 내재화되는 활성을 갖는 접합체.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독성제는 항-종양제인 접합체.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독성제는 화학치료제인 접합체.
  24. 제 23 항에 있어서, 화학치료제는 마이크로튜불 억제제, 토포이소머라제 I 억제제, DNA 손상제, DNA 알킬화제 및 DNA 작은 홈 결합제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 접합체.
  25. 제 24 항에 있어서, 화학치료제는 토포이소머라제 I 억제제인 접합체.
  26. 제 25 항에 있어서, 토포이소머라제 I 억제제는 하기 식으로 표시되는 항종양 화합물인 접합체:
    Figure pct00030
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 하기 식 (a) 내지 (f) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 임의의 구조를 갖는 링커를 통해 세포독성제 또는 항종양 화합물에 접합되어 있는 접합체:
    (a) -(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
    (b) -(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
    (c) -(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
    (d) -(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
    (e) -(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, 및
    (f) -(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
    여기에서 항체는 -(숙신이미드-3-일-N) 의 말단에 연결되어 있고, 세포독성제 또는 항종양 화합물은 식 (a) 내지 (f) 의 가장 오른쪽에서 카르보닐 기에 위치 1 에서의 아미노 기의 질소 원자를 연결 위치로 하여 연결되어 있으며, GGFG 는 펩티드 결합을 통해 연결된 글리신-글리신-페닐알라닌-글리신으로 이루어지는 아미노산 서열을 나타내고,
    -(숙신이미드-3-일-N)- 은 하기 식으로 표시되는 구조를 갖는다:
    Figure pct00031

    이는 이의 위치 3 에서 항체에 연결되어 있고 위치 1 에서의 질소 원자 상에서 이 구조를 함유하는 링커 구조 내의 메틸렌 기에 연결되어 있다.
  28. 제 27 항에 있어서, 링커는 하기 식 (a) 내지 (c) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 임의의 식으로 표시되는 접합체:
    (a) -(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
    (b) -(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-, 및
    (c) -(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
  29. 제 27 항 또는 제 28 항에 있어서, 링커는 하기 식 (a) 로 표시되는 접합체:
    (a) -(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-.
  30. 제 26 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 하기 식 (여기에서 별표* 는 항체로의 연결점을 나타낸다) 으로 표시되는 약물 링커에 티오에테르 결합에 의해 접합되어 있는 접합체:
    Figure pct00032
  31. 제 26 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 식으로 표시되는 접합체;
    Figure pct00033

    식에서 AB 는 그의 항체를 나타내고, y 는 항체에 접합된 항체 당 약물-링커 구조의 단위의 평균수를 나타내고, 항체는 상기 식으로 표시되는 약물 링커에 티오에테르 결합에 의해 접합되어 있다.
  32. 제 30 항 또는 제 31 항에 있어서, 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, 또는 중쇄 및 경쇄의 하기 조합 a) 내지 d) 중 어느 하나를 포함하는 접합체:
    (a) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10 의 아미노산 서열을 갖고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 12 의 아미노산 서열을 가짐,
    (b) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11 의 아미노산 서열을 갖고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 12 의 아미노산 서열을 가짐,
    (c) 중쇄는 SEQ ID NO: 22 의 아미노산 서열을 갖고, 경쇄는 SEQ ID NO: 16 의 아미노산 서열을 가짐, 및
    (d) 중쇄는 SEQ ID NO: 19 의 아미노산 서열을 갖고, 경쇄는 SEQ ID NO: 16 의 아미노산 서열을 가짐.
  33. 하기 식으로 표시되는, 접합체,
    Figure pct00034

    식에서 AB 는 항체를 나타내고, 항체는 SEQ ID NO: 10 의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 12 의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하고, y 는 항체에 접합된 항체 당 약물-링커 구조의 단위의 평균수를 나타내고, 항체는 상기 식으로 표시되는 약물 링커에 티오에테르 결합에 의해 접합되어 있다.
  34. 하기 식으로 표시되는, 접합체,
    Figure pct00035

    식에서 AB 는 항체를 나타내고, 항체는 SEQ ID NO: 11 의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 12 의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하고, y 는 항체에 접합된 항체 당 약물-링커 구조의 단위의 평균수를 나타내고, 항체는 상기 식으로 표시되는 약물 링커에 티오에테르 결합에 의해 접합되어 있다.
  35. 하기 식으로 표시되는, 접합체,
    Figure pct00036

    식에서 AB 는 항체를 나타내고, 항체는 SEQ ID NO: 22 의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 SEQ ID NO: 16 의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하고, y 는 항체에 접합된 항체 당 약물-링커 구조의 단위의 평균수를 나타내고, 항체는 상기 식으로 표시되는 약물 링커에 티오에테르 결합에 의해 접합되어 있다.
  36. 하기 식으로 표시되는, 접합체,
    Figure pct00037

    식에서 AB 는 항체를 나타내고, 항체는 SEQ ID NO: 19 의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 SEQ ID NO: 16 의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하고, y 는 항체에 접합된 항체 당 약물-링커 구조의 단위의 평균수를 나타내고, 항체는 상기 식으로 표시되는 약물 링커에 티오에테르 결합에 의해 접합되어 있다.
  37. 제 1 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 탈푸코실화, 감소된 푸코스, N-연결 글리코실화, O-연결 글리코실화, N-말단 프로세싱, C-말단 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성질체화, 메티오닌의 산화, 중쇄의 위치 234 및 235 에서 2개의 류신 (L) 잔기의 알라닌 (A) 으로의 치환 (LALA), 프롤린 잔기의 아미드화, 및 카르복실 말단에서 1개 또는 2개의 아미노산의 결실 또는 결여로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 포함하는 접합체.
  38. 제 37 항에 있어서, 항체는 중쇄의 카르복실 말단에서 1개 또는 2개의 아미노산(들)의 결실 또는 결여를 포함하는 접합체.
  39. 제 38 항에 있어서, 항체는 2개의 중쇄를 포함하며, 이들 둘 모두는 1개의 카르복실-말단 아미노산 잔기를 결여하는 접합체.
  40. 제 1 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 당 접합된 세포독성제, 특히 약물-링커 구조의 평균수 y 는 1 내지 10 범위인 접합체.
  41. 제 1 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 당 접합된 세포독성제, 특히 선택된 하나의 약물-링커 구조의 단위의 평균수 y 는 2 내지 8 범위인 접합체.
  42. 제 1 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 당 접합된 세포독성제, 특히 선택된 하나의 약물-링커 구조의 단위의 평균수 y 는 3 내지 8 범위인 접합체.
  43. 제 1 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 당 접합된 세포독성제, 특히 선택된 하나의 약물-링커 구조의 단위의 평균수 y 는 7 내지 8 범위인 접합체.
  44. 제 1 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 당 접합된 세포독성제, 특히 선택된 하나의 약물-링커 구조의 단위의 평균수 y 는 7.5 내지 8 범위인 접합체.
  45. 제 1 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자 당 접합된 세포독성제의 수는 8 인 접합체.
  46. 제 1 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 따른 접합체를 포함하는 조성물.
  47. 제 1 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서, 의학에서 사용하기 위한 접합체.
  48. 암, 감염, 자가면역 질환 또는 면역결핍 장애의 치료에서 사용하기 위한 제 47 항에 따른 접합체, 또는 제 46 항에 따른 조성물.
  49. 제 47 항 또는 제 48 항에 있어서, 암은 TA-MUC1 을 발현하는 것을 특징으로 하는 접합체 또는 조성물.
  50. 제 49 항에 있어서, 암은 난소암, 유방암, 췌장암, 폐암, 결장암, 위암, 간암, 신장암, 혈액암, 자궁내막암, 갑상선암, 백혈병, 정상피종, 흑색종, 암종, 기형종, 림프종, 육종, 중피종, 신경아세포종, 신경교종, 직장암, 부신암, 피부암, 뇌암, 자궁경부암, 장관암, 장암, 두경부암, 위장암, 림프절암, 식도암, 결장직장암, 이비인후 (ENT) 암, 전립선암, 방광암, 자궁암 및 이의 전이로 이루어지는 군으로부터 선택되는 접합체 또는 조성물.
  51. 제 46 항 내지 제 50 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 추가 작용제와의 조합으로 사용되는 접합체 또는 조성물.
  52. 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 암에 걸린 대상체에게 제 1 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 따른 접합체 또는 제 46 항에 따른 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는 치료 방법.
  53. 제 52 항에 있어서, 암은 TA-MUC1 을 발현하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  54. 제 52 항 또는 제 53 항에 있어서, 암은 난소암, 유방암, 췌장암, 폐암, 결장암, 위암, 간암, 신장암, 혈액암, 자궁내막암, 갑상선암, 백혈병, 정상피종, 흑색종, 암종, 기형종, 림프종, 육종, 중피종, 신경아세포종, 신경교종, 직장암, 부신암, 피부암, 뇌암, 자궁경부암, 장관암, 장암, 두경부암, 위장암, 림프절암, 식도암, 결장직장암, 이비인후 (ENT) 암, 전립선암, 방광암, 자궁암 및 이의 전이로 이루어지는 군으로부터 선택되는 치료 방법.
  55. 제 54 항에 있어서, 추가 치료제를 투여하는 것으로 더 포함하는 치료 방법.
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