KR100506766B1 - 환경 스트레스에 내성을 부여하는 신규한 펩타이드 및이를 포함하는 융합단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 (ATS) 영역 펩타이드 또는 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리영역의 아미노산 서열 중에서 10개 이상 50개 이하의 연속 아미노산 서열로 이루어지고 환경 스트레스에 대해 내성을 부여하는 펩타이드, 상기 펩타이드들과 융합 파트너 단백질이 결합되어 형성된 환경 스트레스 내성 융합 단백질, 이를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 이 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터 및 이 재조합 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 화학적 합성 또는 유전자 재조합으로 본 발명에 따른 펩타이드 및 환경 스트레스 내성 융합 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따라 제조된 융합 단백질은 환경 스트레스에 불안정한 단백질의 고유 성질을 나타내면서 추가로 열, pH 및/또는 금속과 같은 환경 스트레스에 대한 내성을 갖는다.

Description

환경 스트레스에 내성을 부여하는 신규한 펩타이드 및 이를 포함하는 융합단백질 {Novel Peptides Conferring Environmental Stress Resistance And Fusion Proteins Including Said Peptides}

본 발명은 환경 스트레스에 대해 내성을 부여하는 신규한 펩타이드 및 이를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 (ATS) 영역 펩타이드 또는 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리영역의 아미노산 서열 중에서 10개 이상 50개 이하의 연속 아미노산 서열로 이루어지고 환경 스트레스에 대해 내성을 부여하는 펩타이드, 상기 펩타이드와 융합 파트너 단백질이 결합되어 형성된 환경 스트레스 내성 융합 단백질, 이를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 이 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터 및 이 재조합 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포에 관한 것이다.

"환경 스트레스 내성 단백질"은 예를 들면 열, pH, 금속이온 등과 같은 외부 환경 요인에 대하여 물리적, 화학적 및 생물학적으로 안정성을 나타내는 단백질을 말한다. 이러한 단백질 부류 가운데 전형적인 것으로 물이 끓는 온도에서도 안정한 열안정성 단백질(heat stable protein)이 있다. 잘 알려진 열안정성 단백질의 예로는 고호열성(hyperthermophilic) 유기체로부터 유래된 단백질을 들 수 있다(Jaenicke R. and Bohm G., Curr. Opin. Struct. Biol., 8, 738-748 (1998); Rees D. C. and Adams M. W. W. Structure, 3, 251-254 (1995); Adams M. W. W., Ann. Rev. Microbiol. 47, 627-658 (1993)). 이들 단백질은 중온성 단백질들에 비하여 매우 높은(물의 끓는점 근처 또는 이상의) 융점(melting temperature; 이하, Tm이라 함)을 갖는다. 그러나, 온도가 Tm이상으로 증가하면, 대부분의 고호열성 단백질들도 변성되고 불용성 응집체가 된다(Klump et al., J. Biol. Chem., 267, 22681-22685 (1992); Klump et al., Pure. Appl. Chem., 66, 485-489 (1994); Cavagnero S et al., Biochemistry, 34, 9865-9873 (1995)).

최근에 알려진 열에 안정한 또 다른 그룹의 단백질들에는 고유 비구조성 단백질(intrinsically unstructured proteins)들이 있다(Plaxco, K. W. and Groβ M, Nature, 386, 657-658 (1997); Wright P. E. and Dyson H. J., J. Mol. Biol., 293, 321-331 (1999)). 고유 비구조성 단백질들이 열에 안정한 이유는 이들 구조가 열 처리에 의해 크게 변하지 않기 때문이다. 열역학적으로 말해, 고유 비구조성 단백질들은 실온에서도 그 형태가 거의 풀어져 있고 고온에서는 약간의 구조 변화를 겪기 때문에, 엄격한 의미에서 열에 "안정한" 단백질이라기 보다는 "내열성 단백질(heat resistant proteins; 이하 HRPs라 함)"이라는 용어가 더 적절하다(Kim T. D. et al, Biochemistry, 39, 14839-14846 (2000)). 따라서, HRPs는 열처리에 의해 응집되지 않는 단백질로서 고호열성 단백질 및 비구조성 단백질을 포함한다.

단백질의 열반응성은 Jurkat T 세포와 사람 혈청으로부터 열처리에 의해 응집되지 않는 HRPs를 정제하고 성상확인하는 과정을 통해 체계적으로 연구되었다 (Kim T. D. et al, Biochemistry, 39, 14839-14846 (2000)). Jurkat 세포 용해물과 사람 혈청으로부터 기원하는 단백질들의 내열성 연구로부터 다음 4가지 형태의 HRPs가 밝혀졌다. HRPs 그룹 I은 α-시누클레인과 α_s-카제인과 같은 비구조성 단백질을 말하며 이들 단백질은 온도에 관계없이 거의 풀어진(semi-unfolded) 형태를 지니고 있다. HRPs 그룹 Ⅱ는 사람 혈청 페투인(fetuin)과 알부민이 대표적인데 , 이들은 열처리하에서 비가역적인 형태변화를 나타내는 특성이 있다. HRPs 그룹 Ⅲ는 트랜스티레틴(transthyretin)과 소혈청 페투인(fetuin)이 대표적이며 가역적인 형태변화를 나타낸다. HRPs 그룹 Ⅳ는 고호열성 단백질과 같이 통상의 열안정성 단백질을 말하며 열에 의해 단백질 형태가 별로 변화되지 않음을 특징으로 한다.

대부분의 단백질은 온도가 증가됨에 따라 구조가 풀어지고(unfolded) 침전하는데 그러한 과정은 통상 비가역적이다(Bull, H. B and Breese, K, Arch. Biochem. Biophys, 156, 604-612 (1973)). 의학이나 공업 분야에서 널리 이용되는 호르몬이나 사이토카인 및 효소와 같은 대부분의 단백질은 열안정성을 비롯한 환경스트레스에 대한 내성을 개선하는 것이 큰 과제중 하나이다. 환경스트레스에 대한 내성이 향상되면 제품 수명이 길어지는 것은 물론 새로운 의약품이나 산업용 효소, 식품, 화학제품의 개발로 이어질 확률이 높다. 따라서, 새로운 환경스트레스 내성 단백질에 관한 본 발명은 매우 유용할 것이다.

본 발명자들은 열, pH, 금속 등과 같은 환경 스트레스에 대한 단백질의 성질을 연구하던 중 HRP 그룹 I인 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 (ATS) 영역으로 이루어진 펩타이드가 환경 스트레스에 대해 내성을 제공하는데 결정적인 역할을 하며, 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 영역을 단백질에 결합시켜 제조한 융합 단백질이 융합전 단백질의 고유 성질을 유지하면서도 환경 스트레스에 대해 내성을 갖는다는 것을 확인하고 이러한 환경 스트레스 내성 융합 단백질을 화학적 합성 또는 유전자 재조합에 의해 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리영역으로 이루어져 있으며 단백질과 결합하여 단백질의 고유 성질을 유지하면서도 환경 스트레스에 대해 내성을 갖도록 하는 펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리영역의 아미노산 서열 중에서 10개 이상 50개 이하의 아미노산 서열로 이루어져 있으며 단백질과 결합하여 단백질의 고유 성질을 유지하면서도 환경 스트레스에 대해 내성을 갖도록 하는 펩타이드를 제공한다.

본 발명은 상기 펩타이드와 융합 파트너 단백질이 결합된 것을 특징으로 하는 환경 스트레스 내성이 향상된 융합 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 시누클레인 C-말단 산성꼬리 영역으로 이루어진 펩타이드 또는 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리영역의 아미노산 서열 중에서 10개 이상 50개 이하의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 화학적 합성 또는 유전자 재조합에 의해 본 발명에 따른 환경 스트레스 내성 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드 또는 펩타이드가 단백질에 융합된 것을 특징으로 하는 환경 스트레스 내성이 향상된 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 제공한다.

본 발명은 환경 스트레스 내성 단백질을 코딩하는 DNA를 검출하기 위한 프라이머를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드 또는 환경 스트레스 내성이 향상된 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드 또는 환경 스트레스 내성이 향상된 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 제공한다.

본 발명은 단백질과 결합하여 단백질의 고유 성질을 유지하면서도 환경 스트레스에 대해 내성을 갖도록 하는 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리 (ATS) 영역으로 이루어진 펩타이드를 제공한다. 또한, 본 발명은 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리영역의 아미노산 서열 중에서 10개 이상 50개 이하의 아미노산 서열로 이루어져 있으며 단백질과 결합하여 단백질의 고유 성질을 유지하면서도 환경 스트레스에 대해 내성을 갖도록 하는 펩타이드를 제공한다.

본원에서 사용된 용어 "환경 스트레스"는 천연 또는 비천연 단백질에 변성을 일으킬 수 있는 물리적 또는 화학적 작용을 의미한다. 이와 관련하여, "단백질의 변성"은 단백질의 고차구조가 가열, 동결, 건조 등을 비롯한 물리적 작용이나 산, 알카리, 금속이온, 산화/환원제 또는 유기용매와 같은 화학적 작용 등에 의해서 고차 구조가 변한 것으로 일반적으로 생물학적 기능의 상실, 용해도의 감소, 반응성의 증감, 분해효소에 의한 분해 용이성, 결정성의 상실, 이화학적 성질의 변화, 변성 청색 이동 등을 수반하는 현상을 의미하는 것으로 이해한다. 본 발명에서 단백질에 변성을 일으킬 수 있는 환경 스트레스에는 온도, 수분, pH, 전해질, 환원당, 가압, 건조, 동결, 계면장력, 광선 등의 물리적 요인과 산, 알카리, 중성염, 유기용매, 금속이온, 산화환원제 등의 화학적 요인이 포함된다.

구체적으로, 본 발명에 의한 환경 스트레스 중에는 단백질을 변성시키는 온도, 수분, pH, 금속이온, 전해질 및 환원당이 포함된다. 대개의 단백질의 경우 60℃ 내지 70℃에서 변성되며 온도가 높아질수록 그 변성속도는 빨라진다. 예를 들어, 온도가 10℃ 상승할 때 알부민은 20배, 헤모글로빈은 13배 변성 반응속도가 상승한다. 그러나, 갑자기 온도를 급상승시키는 경우에는 응고온도가 더 높아질 수 있다. 단백질의 열변성에는 물이 필요한데 물은 폴리펩타이드 사슬이 풀어지거나 재결합할 때에 사슬의 움직임을 도와주게 되므로 물이 많으면 일반적으로 더 낮은 온도에서도 열변성이 일어난다. 단백질의 열변성은 pH와도 관계가 있는데 일반적으로 등전점쪽의 산성 pH에서 더 빨리 열변성이 일어난다. 생선조림을 할 때 식초를 조금 넣으면 빨리 살이 단단해 지는 것도 산성의 pH를 이용한 것이다. 또한, 단백질 변성은 전해질(염류)의 첨가에 의해서도 일어나며, 전해질의 첨가는 단백질이 가지고 있는 음전하를, 염화합물, 황산염 등의 전해질중의 양이온이 중화시켜 단백용액의 pH를 등전점으로 만들기 때문이다. 단백질에 열을 가할 때 환원당이 존재하면 비효소적 갈변인 마일라드(Maillard) 반응이 일어나 필수아미노산이 파괴된다.

또한, 본 발명에 의한 환경 스트레스 중에는 단백질에 변성을 일으킬 수 있는 가압 및 건조한 환경이 포함된다. 단백질은 일반적으로 5000에서 10000기압의 고압력을 가하거나 초음파를 쬐는 경우 변성된다. 특히, 가용성 단백질은 건조에 의해서도 변성하는데 건조가 진행되면서 폴리펩타이드 사슬사이의 수분이 소실되고 다시 인접한 펩타이드 사슬의 재결합이 일어나 견고한 상태가 되는 것이다.

본 발명에 의한 환경 스트레스 중에는 단백질에 변성을 일으킬 수 있는 동결 환경이 포함된다. 예를 들어, 육류를 동결하면 물이 결합력이 약하여 먼저 얼음결정으로 석출되므로 나머지 액 중의 염류농도가 높아져 염석이 되어 단백질이 변성한다. 본 발명의 추가의 환경 스트레스 중에는 단백질을 변성시키는 계면장력이 포함된다. 단백질의 계면에 단일분자막의 상태로 얇은 막으로 퍼질 때 변성하여 응고하게 된다. 나아가, 본 발명의 환경 스트레스에는 단백질을 변성시킬 수 있는 광선의 조사가 포함된다. 단백질에 광선이 조사되면, 단백질 3차구조의 결합이 절단되어 변성이 일어나게 된다. 산·알칼리, 중성염, 알코올이나 아세톤 같은 유기용매 및 금속이온들도 본 발명의 정의상 환경 스트레스에 포함된다. 단백질 용액에 산·알칼리를 가하면 (+), (-)전하가 변하기 때문에 고차구조와 관계가 깊은 이온결합에 변화를 일으켜 단백질이 변성된다.

"시누클레인 족(synuclein family)"은 열처리에 의해 응집되지 않는 것으로 잘 알려져 있는 내열성(heat resistant) 단백질로서, 그 종류로는 α-시누클레인, β-시누클레인, γ-시누클레인 및 시노레틴(synoretin)이 알려져 있다. 상기 시누클레인은 어류이상의 고등동물에 존재하는 단백질이며, 사람, 쥐, 새, 소 등에 존재함이 보고된 바 있다(Clayton and Geroge, Trends in Neurosicence 21, 249-254 (1998)). 본 발명에 따른 펩타이드는 바람직하게는 사람으로부터 유래된 α-시누클레인, β-시누클레인, 혹은 γ-시누클레인의 C-말단 산성꼬리 영역에서 유래하는 것이다.

"C-말단 산성꼬리 영역"은 상기 시누클레인 족으로부터 유래된 것으로, 바람직하게는 서열번호 1(α-시누클레인 유래), 서열번호 2(β-시누클레인 유래), 서열번호 3(γ-시누클레인 유래) 및 서열번호 4(시노레틴 유래)로 표시될 수 있다. 본원에서 사용된 "시누클레인 족의 C-말단 산성꼬리 (C-terminal acidic tail of synuclein family)"는 기술상의 간단명료성을 위해 필요에 따라 "ATS"로 약칭하기로 한다. 보다 구체적으로 "α-시누클레인의 C-말단 산성꼬리" (아미노산 잔기 96-140)은 같은 이유로 필요에 따라 "ATSα" 혹은 "Syn96-140"으로 약칭하기로 하며, "β-시누클레인의 C-말단 산성꼬리" (아미노산 잔기 85-134)은 "ATSβ"로 약칭하기로 하며, "γ-시누클레인의 C-말단 산성꼬리" (아미노산 잔기 96-127)은 "ATSγ"로 약칭하기로 한다.

특히, α-시누클레인은 140개의 아미노산으로 구성된 산성 시납스전(presynaptic) 단백질로서(Ueda K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 11282-11286 (1993); Jakes R. et al., FEBS lett., 345, 27-32 (1994)) 고유 비구조성 단백질 계열에 속한다(Eliezer D et al., J. Mol. Biol. 307, 1061-1073 (2001); Kim J., Molecules and Cells, 7, 78-83 (1997); Weinreb P. H. et al., Biochemistry, 35, 13709-13715 (1996)).

α-시누클레인은 천연의 상태에서는 본질적으로 비구조화되어 있기 때문에 많은 다른 종류의 단백질 또는 리간드와 반응할 수 있다(Kim J., Molecules and Cells, 7, 78-83 (1997); Weinreb P. H. et al., Biochemistry, 35, 13709-13715 (1996)). α-시누클레인은 작은 산성 인지질 소포체(vesicle), 계면활성제(detergent), 유기용매 및 일부 금속이온과 결합하여 2차 구조가 증가된다 (Eliezer D. et al., J. Mol. Biol., 307, 1061-1073 (2001); Kim T. D. et al., Protein Science, 9, 2489-2496 (2000); Davidson WS et al., J. Biol. Chem., 273-9443-9 (1998); Weinreb P. H. et al., Biochemisty, 35, 13709-13715 (1996); Paik SR et al., Biochem. J., 340, 821-8 (1999)). α-시누클레인은 비정상적인 1차 및 3차 구조 특성으로 인하여 높은 내열성을 지닌다.

도 1에 나타낸 바와 같이, α-시누클레인은 3개의 독립적인 영역인 아미노-말단 양친매성 영역(잔기 1-60), 소수성 NAC 영역(잔기 61-95) 및 카복실-말단 산성 꼬리(잔기 96-140)로 구성되어 있다(Lucking C. B. and Brice A. Cell. Mol. Life Sci., 57, 1894-1908 (2000); Iwai A. Biochim. Biophys. Acta. 1502, 95-109 (2000); Hashimoto M. and Masliah E., Brain Pathol., 9, 707-720 (1999); Lavedan C. Genom Res., 8, 871-880 (1998)). N-말단 영역은 종간에 상당히 잘 보존되어 있으며 C-말단 영역은 그 크기와 서열에 있어서 상당한 가변성을 지니고 있다. 시누클레인 계열의 C-말단 산성 꼬리 (ATS)는 그 크기와 서열이 매우 다양하다 (Lucking C. B. and Brice A., Cell Mol. Life Sci., 57, 1894-1908 (2000); Iwai A. Biochem. Biophys. Acta 1502, 95-109 (2000); Hashimoto M. and Masliah E. Brain Pathol., 9, 707-720 (1999); Lavedan C. Genome Res. 8, 871-880 (1998)). 이에 비하여 그 N-말단 양친매성 영역은 가오리(Torpedo)에서부터 사람에게까지 시누클레인 계열의 일원간에 그 서열이 강하게 보존되어 있다.

상기 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리영역 펩타이드 또는 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리영역의 아미노산 서열 중에서 10개 이상 50개 이하의 연속 아미노산 서열로 이루어지고 환경 스트레스에 대해 내성을 부여하는 펩타이드와 융합 파트너 단백질이 결합되어 형성된 융합 단백질을 제공한다.

"융합 파트너 단백질"이란 환경 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 것이 바람직한 임의의 단백질을 말하며, 특히 바람직하게는 그 자체로서 환경 스트레스에 불안정한 단백질이다. 본원에 사용된 용어 "환경 스트레스에 불안정한 단백질"이란 환경 스트레스에 의해 변성되는 단백질을 가리킨다. 변성의 정의는 위에 설명한 바와 같다. 환경 스트레스에 불안정한 단백질은 변성 요인에 따라 잘 알려져 있다.

본 발명에 따른 융합 파트너 단백질은 본 발명의 펩타이드가 결합하는 폴리펩타이드로서 본 발명의 펩타이드의 N-말단, C-말단 또는 N-말단과 C-말단 양쪽에 동시에 결합할 수 있다. 융합 파트너 단백질은 하나의 단백질 또는 서로 상이한 두 가지 이상의 단백질에서 기원하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 환경 스트레스 내성 융합 단백질은 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리영역 펩타이드 또는 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리영역의 아미노산 서열 중에서 10개 이상 50개 이하의 연속 아미노산 서열로 이루어지고 환경 스트레스에 대해 내성을 부여하는 펩타이드가 융합 파트너 단백질에 그 융합 단백질의 고유 성질에 영향을 미치지 않는 범위에서 그의 위치에 상관없이 결합되어 형성된 모든 융합 단백질을 의미한다.

한 그룹으로서, 본 발명에 따른 환경 스트레스 내성 융합 단백질은 융합 파트너 단백질의 N-말단에 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리영역 펩타이드 또는 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리영역의 아미노산 서열 중에서 10개 이상 50개 이하의 연속 아미노산 서열로 이루어지고 환경 스트레스에 대해 내성을 부여하는 펩타이드가 결합되어 형성된 융합 단백질을 포함한다.

다른 그룹으로서, 본 발명에 따른 환경 스트레스 내성 융합 단백질은 융합 파트너 단백질의 C-말단에 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리영역 펩타이드 또는 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리영역의 아미노산 서열 중에서 10개 이상 50개 이하의 연속 아미노산 서열로 이루어지고 환경 스트레스에 대해 내성을 부여하는 펩타이드가 결합되어 형성된 융합 단백질을 포함한다.

바람직한 한 그룹으로서, 본 발명에 따른 상기 환경 스트레스 내성 융합 단백질은, 바람직하게는 환경 스트레스에 대해 불안정한 것으로 알려진 단백질의 N-말단에 α-시누클레인의 NAC 영역과 산성꼬리 영역, 또는 α-시누클레인의 NAC 영역과 C-말단 산성 꼬리영역의 아미노산 서열 중에서 10개 이상 50개 이하의 연속 아미노산 서열로 이루어지고 환경 스트레스에 대해 내성을 부여하는 펩타이드가 결합되어 형성된 융합 단백질이다.

바람직한 한 그룹으로서, 본 발명에 따른 상기 환경 스트레스 내성 융합 단백질은, 바람직하게는 환경 스트레스에 대해 불안정한 것으로 알려진 단백질의 C-말단에 α-시누클레인 전체가 융합된 융합 단백질이다.

바람직한 한 그룹으로서, 본 발명에 따른 상기 환경 스트레스 내성 융합 단백질은, 바람직하게는 환경 스트레스에 대해 불안정한 것으로 알려진 단백질의 N-말단에 α-시누클레인 전체가 융합된 융합 단백질이다.

바람직한 한 그룹으로서, 본 발명에 따른 상기 환경 스트레스 내성 융합 단백질은, 바람직하게는 환경 스트레스에 대해 불안정한 것으로 알려진 단백질의 C-말단에 α-시누클레인의 NAC 영역과 산성꼬리 영역, 또는 α-시누클레인의 NAC 영역과 C-말단 산성 꼬리영역의 아미노산 서열 중에서 10개 이상 50개 이하의 연속 아미노산 서열로 이루어지고 환경 스트레스에 대해 내성을 부여하는 펩타이드가 결합되어 형성된 융합 단백질을 포함한다.

본 발명의 융합 단백질은 결합되는 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리영역 또는 연속하는 10개 이상 50개 이하의 아미노산 서열이 결합하는 부위 및 이에 융합하는 융합 파트너 단백질의 종류 및 수에 따라 수많은 형태의 단백질을 형성할 수 있다.

본 발명의 한가지 양태로서, 융합 파트너 단백질로는 환경 스트레스에 대해 불안정한 것으로 알려진 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Glutathione S-transferase, 이하 GST로 표기될 수 있다)와 디하이드로폴레이트 리덕테이즈 (Dihydrofolate reductase, 이하 DHFR)가 사용될 수 있다. 융합파트너 단백질의 다른 예로는 C-말단 산성 꼬리 영역을 제외한 α-시누클레인, α-시누클레인의 NAC 영역이 있다.

본 발명에서 예시적으로 사용된 GST는 세균에서 포유류까지 보편적으로 존재하며 생체 내에서 여러 가지 세포 독성물질을 무독화하는 작용을 하거나 산화적 피해로부터 세포방어 또는 지질, 빌리루빈(bilirubin), 헴, 스테로이드, 담즙염류 등 광범위한 소수성 및 양친매성 물질의 운반에 관여한다. 각종 암세포 또는 약제내성 세포 등에서 발견되고 화학요법에서 표적분자 또는 종양마커 분자로도 알려져 있으며 진단 등에 응용되고 있다. GST와 DHFR은 온도 스트레스에 의해 쉽게 침전되는 열에 불안정한 단백질로 알려져 있다. 본 발명에서, 단백질 시료를 열처리한 후 SDS 폴리아크릴아미드 겔로 정성 분석한 결과 GST와 DHFR이 열에 의해 응집되어 침전된 것으로 확인되었다. 따라서, GST와 DHFR은 열에 매우 불안정한 단백질인 것으로 확인되었다(실시예 3과 실시예 11).

또한, 본 발명에서 예시적으로 사용된 사람 유래의 α-시누클레인은 그의 열안정성을 조사한 결과 물이 끓는 온도(약 100℃이상)에서도 단백질이 침전되지 않았고, 따라서 α-시누클레인이 내열성이 있음이 확인되었다. 또한, 본 발명에서 상기 α-시누클레인 단백질을 효소 분해함으로써 획득한 일련의 결실돌연변이체의 열안정성을 조사한 결과, C-말단 산성 꼬리(잔기 96-140)영역이 시누클레인 단백질에 내열성을 부여하는데 결정적인 역할을 하는 것으로 밝혀졌다(실시예 4).

본 발명에서, 상기 확인된 GST의 열에 대한 성질과 α-시누클레인의 C-말단 산성 꼬리 영역의 내열성을 근거로, 열에 불안정한 GST의 C-말단에 α-시누클레인의 산성꼬리 영역을 포함한 펩타이드가 연결된 융합 단백질이 작제되었다. 예를 들면, 서열번호 5로 표시되는 GST의 C-말단에 α-시누클레인의 산성 꼬리 영역의 펩타이드(아미노산 서열96-140)가 결합되어 형성된 융합 단백질, 서열번호 6으로 표시되는 GST의 C-말단에 α-시누클레인의 NAC영역과 산성꼬리영역으로 구성된 펩타이드(아미노산 서열 61-140)가 결합되어 형성된 융합 단백질 및 서열번호 7로 표시되는 GST의 C-말단에 α-시누클레인 전체영역의 펩타이드(아미노산 서열 1-140)에 결합되어 형성된 융합 단백질이 작제되었다. 작제된 이들 융합 단백질은 100℃에서 30분간의 열처리에도 응집되지 않는 것으로 밝혀졌다. 또한, 본 발명에서 열에 불안정한 GST의 C-말단에 α-시누클레인의 산성꼬리 영역이 배제된 펩타이드가 연결된 융합 단백질이 작제되었다. 예를 들면, GST의 C-말단에 α-시누클레인의 NAC 영역의 펩타이드가 결합되어 형성된 융합 단백질 및 GST의 C-말단에 α-시누클레인의 양친매성 영역의 펩타이드가 결합되어 형성된 융합 단백질이 작제되었다. 이러한 융합 단백질은 100℃에서 30분간의 열처리에서 응집되어 침전된 것으로 밝혀졌다. 이상의 실험 결과는 α-시누클레인의 산성꼬리 영역이 GST에 내열성을 제공하는 결정적인 역할을 한다는 것을 입증한다 (실시예 5). 또한 α-시누클레인의 산성꼬리 영역이 GST가 pH나 금속이온에의해 응집되는 것도 효과적으로 막을 수 있는 것으로 나타났다 (실시예 10). 따라서 α-시누클레인의 산성꼬리 영역이 융합대상 단백질에 환경스트레스에 대한 내성을 부여하는 성질이 있음을 추정할 수 있다.

본 발명에서, α-시누클레인의 C-말단 산성 꼬리 (ATSα) 영역을 GST에 도입하였을 때 GST-ATSα융합단백질에 내열성을 부여할 수 있는 성질이 있다는 사실을 바탕으로 ATSα가 GST 이외의 다른 단백질에도 내열성을 부여할 수 있는지를 확인하기 위해 DHFR의 C-말단에 ATSα를 도입하여 GST-ATSα융합단백질을 제조하였다. 실험결과 야생형 DHFR과는 달리 DHFR-ATSα도 100℃에서 30분간의 열처리에 의해 침전되지 않는 것으로 나타났다. 이러한 실험결과는 ATSα가 GST뿐만 아니라 DHFR과 다른 스트레스에 불안정한 단백질의 스트레스에 대한 내성을 높여줄 수 있는 효과가 탁월함을 입증한다 (실시예 11).

본 발명에서, ATSα영역중 글루타메이트와 아스파테이트와 같이 음전하를 띤 아미노산이 밀집된 부분의 짧은 펩타이드들을 이용하여 일련의 GST-ATSα융합단백질의 결실돌연변이체들을 제조하여 이들의 열반응성을 조사하였다. 이들 결실돌연변이체들도 모두 야생형 GST에 비하여 내열성이 탁월한 것으로 나타났다. 구체적으로, ATSα의 모든 부위를 포함하는 GST-Syn96-140과 ATSα의 22개 아미노산부위를 포함하는 GST-Syn119-140은 농도에 관계없이 열처리 후에 전혀 침전이 되지 않았으나, ATSα의 11-13개의 아미노산만을 포함하는 GST-Syn103-115, GST-Syn114-126 및 GST-Syn130-140은 낮은 농도에서는 전혀 침전이 되지 않았으나 농도가 높아질수록 응집되는 양이 증가하였다. 이상의 결과를 종합해 보면, 이들 GST-ATSα 융합 단백질의 결실 돌연변이체들이 모두 야생형 GST에 비해 열에 대한 내성이 월등함을 보여주며, 흥미롭게도 ATSα의 길이에 따라 열에 대한 내성에 차이가 남을 보여준다. 따라서 표적단백질의 크기 및 성질에 따라 ATSα의 길이를 적당히 선택하면 최적의 효과를 얻을 것으로 기대한다 (실시예 12).

본 발명에서, α-시누클레인의 C-말단 산성 꼬리 (ATSα) 뿐만 아니라 β-시누클레인의 C-말단 산성 꼬리 (ATSβ)와 γ-시누클레인의 C-말단 산성 꼬리 (ATSγ) 도 GST에 스트레스에 대한 내성을 부여할 수 있는 성질이 있는지를 알아보기 위해 GST- ATSβ융합단백질과 GST-ATSγ융합단백질을 제조하여 이들 융합단백질의 열에 대한 내성을 조사한 결과 이들 모두 GST-ATSα융합단백질의 경우와 마찬가지로 열에 대한 내성이 매우 높음을 밝혀내었다. 따라서, ATSα뿐만 아니라 ATSβ와 ATSγ도 다른 단백질에 내열성을 부여할 수 있는 성질이 있는 펩타이드임을 알 수 있고, 이들을 환경스트레스에 내성을 갖는 융합단백질의 제조에 활용할 수 있음을 알 수 있다 (실시예 13).

본 발명에서, GST-폴리글루타메이트 융합단백질들을 제조하여 폴리글루타메이트도 스트레스에 대한 내성을 부여하는 성질이 있는지를 조사하여 보았는데, 폴리글루타메이트는 ATS와 ATS 유래 짧은 펩타이드에 비해 열에 대한 내성을 부여하는 능력이 훨씬 미약한 것으로 나타났다. 실제로 GST-Syn130-140이 같은 숫자의 글루타메이트 잔기를 포함하는 GST-E5보다 월등히 높은 내열성을 보였고, 두 배나 많은 숫자의 글루타메이트 잔기를 포함하는 GST-E10보다도 오히려 약간 높은 내열성을 보이는 것으로 나타났다 (실시예 14). 따라서 ATS가 환경스트레스에 대한 내성을 보이는 기전은 단순한 음전하량의 증가에 의한 단백질의 수용성이 증가하는 것 이외에도 ATS의 독특한 아미노산 서열이 중요한 역할을 하고 있음을 추정할 수 있다.

본 발명에 따라 제조된 융합 단백질은 100℃ 이상의 물이 끓는 온도에서 수분간 가열하여도 응집되거나 침전되지 않는 내열 특성을 지닌다(실시예 5). 천연 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST) 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제의 각 C-말단에 α-시누클레인의 C-말단 산성 꼬리 영역(아미노산 서열 96번부터 140번)을 결합시켜 제조한 융합 단백질 GST-Syn96-140의 T₅₀ 값을 측정한 결과, 각각 55.5℃와 57.5℃로 상기 산성 꼬리 영역이 융합 단백질의 열안정성을 증가시켰음을 보여주었다. 이 결과는 융합 단백질 GST-Syn96-140으로부터 관찰된 열안정성의 유의적인 증가가 산성 꼬리 영역이 단백질을 열에 의해 유도된 응집으로부터 보호하였음을 나타내는 것이다. 또한, 도 6b에 나타낸바와 같이, GST는 융점(70℃)보다 낮은 온도인 52℃에서 응집된 반면, 융합 단백질 GST-Syn96-140은 응집되지 않았다.

본 발명에 따르면 α-시누클레인의 C-말단 산성 꼬리 영역은 α-시누클레인 단백질이 내열성을 갖도록 하는 작용을 하는 것처럼 열 불안정성 단백질에 융합하여 내열성을 제공하는 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. α-시누클레인의 C-말단 산성 꼬리 영역은 음으로 하전된 잔기(residue)사이의 반발력에 의한 분자내의 불리한 반응을 형성할 수 있다. 이러한 개념은 C-말단 산성 꼬리가 결여된 α-시누클레인 결실 돌연변이체들과 NAC 펩타이드가 동일한 조건하에서 전체길이 α-시누클레인에 비해 더 빠르게 응집된다는 보고에 의해 뒷받침될 수 있다 (Serpell L. C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 4897-4902 (2000); Crowther R. A. et al., FEBS Letters, 436, 309-312 (1998); Han H. et al., Chem. Biol., 2, 163-169 (1995); Iwai A. et al., Biochemistry, 34, 10139-10145 (1995)). 따라서, α-시누클레인의 C-말단 산성 꼬리 영역은 이를 포함하는 단백질 또는 융합 단백질에 친수성을 증가시키고 이에 따라 단백질 또는 융합 단백질의 용해성을 증가시켜 열에 의해 유도된 단백질 또는 융합 단백질의 응집을 억제한다.

본 발명에 따라 제조된 내열성 융합 단백질은 열에 불안정한 단백질에 비해 수친화도(hydropathy)가 낮고 등전점(pI)이 낮은 특성이 있다 (실시예 6). 단백질의 용해성은 단백질의 총 전하(net charge)의 제곱에 비례한다(Tanford C., John Wiley and Sons, Inc. New York (1961)). 실제적으로, 열에 불안정한 단백질에 α-시누클레인의 산성 꼬리 영역의 도입은 이에 따라 생성된 융합 단백질의 pI와 수친화도를 유의적으로 감소시켰다(표 1).

본 발명에 따라 제조된 융합 단백질은 열에 의한 효소활성의 감소를 억제하는 특징이 있다. 본 발명에 따른 융합 단백질 GST-Syn96-140은 GST에 비해 T₅₀ 값이 높아짐을 확인하였다 (실시예 8).

또한, 본 발명에 따라 제조된 융합 단백질은 HRPs의 그룹 Ⅱ에 속한다(실시예 7). 본 발명에 따라 제조된 융합 단백질 GST-Syn96-140의 구조를 극-UV CD 스펙트럼으로 조사한 결과, 단백질이 잘 정돈된 2차 구조 요소를 포함함을 알 수 있었고 CD 스펙트럼은 100℃에서는 2차 구조 요소가 감소함을 보여주었지만, 전체적인 형태는 변화하지 않았다. 본 발명에 따른 융합 단백질은 이의 용액을 냉각 한 후 극-UV CD 스펙트럼한 결과 초기 스펙트럼(괘선)과 차이가 있었으며 이는 융합 단백질 GST-Syn96-140의 형태가 비가역적으로 변화되었음을 나타내는 것이다. 열처리한 GST-Syn96-140의 실온에서 측정한 CD 스펙트럼은 100℃에서와 유사하였고 이러한 결과는 상기 단백질이 2차 구조 요소와 불규칙-코일 형태의 2개의 독립적인 영역으로 구성되었음 보여주는 것이다(실시예 9).

α-시누클레인은 Fe²⁺, Al³⁺, Zn²⁺, Cu²⁺ 및 Ca²⁺를 포함하는 2가 양이온 및 금속 이온과 결합할 수 있다(Paik S. R. et al., Arch. Biochem. Biophys, 344, 325-334 (1997); Paik S. R. et al., Biochem J., 340, 821-8 (1999); Nielsen M. S. et al., J. Biol. Chem. In Press, (2001)). 금속 이온들(Fe²⁺, Al³⁺, Zn²⁺ 및 Cu²⁺)은 α-시누클레인과 결합한 다음 단백질의 자가-소중합(self-oligomerzation)을 유도한다. Cu²⁺와 Ca²⁺는 각각 해리상수 59μM, IC₅₀ 300μM로 α-시누클레인의 C-말단 산성 꼬리영역에 특이적으로 결합한다고 알려져 있다(Paik S. R. et al., Biochem J., 340, 821-8 (1999); Nielsen M. S. et al., J. Biol. Chem. In Press, (2001)). 한편, Fe²⁺, Al²⁺, Zn²⁺의 결합 사이트와 결합 상수는 아직 결정되지 않았다.

본 발명에 따라 제조된 내열성 융합 단백질은 2가 양이온 및 금속이온에 의해 응집되지 않는 특성이 있다. 본 발명에 따른 α-시누클레인의 산성 꼬리 영역과 함께 융합된 GST 단백질은 pH 및 금속에 의해 유도된 단백질 응집에 있어서도 내성을 나타내었으며 α-시누클레인의 산성 꼬리는 환경 스트레스로부터 단백질을 보호함으로써 실제적인 안정성을 증가시켰다 (실시예 10). 본 발명에 따르면 상기와 같은 2가 양이온의 결합이 α-시누클레인과 GST-α-시누클레인 융합 단백질의 열반응성에는 영향을 주지 않음을 밝혔다.

또한, 본 발명은 화학적 합성 또는 유전자 재조합에 의해 본 발명에 따른 시누클레인 족 C-말단 산성꼬리 영역 펩타이드 또는 시누클레인 족 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산 서열 중에서 10개 이상 50개 이하의 연속 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 제조방법을 제공한다.

단백질에 결합하여 환경 스트레스에 대해 내성을 갖도록 하는 본 발명의 펩타이드는 생화학 분야의 숙련가에게 일반적으로 널리 알려져 있는 화학적 합성에 의해 쉽게 제조될 수 있다(Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., NY (1983)). 대표적인 방법으로서 이들로 한정되는 것은 아니지만 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함된다(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, (1997); A Practical Approach, Atherton ＆ Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, (1989)).

본 발명에 따른 펩타이드는 보호된 아미노산간의 응축반응(condensation reaction)에 의하여 통상의 고체상 방법으로 C-말단으로부터 시작하여 제1의 아미노산, 제2의 아미노산, 제3의 아미노산과 같이 서열에 따라 순차적으로 진행하면서 합성할 수 있다. 응축 반응 후 보호기 및 C-말단 아미노산이 연결된 담체를 산분해(acid decomposition) 또는 아미놀리시스 (aminolysis)와 같은 공지의 방법에 의해 제거할 수 있다. 상기 언급된 펩타이드 합성법은 문헌에 상세히 기술되어 있다(Gross and Meienhofer's, The Peptides, vol 2., Academic Press (1980)).

본 발명에 따른 펩타이드의 합성을 위해 사용할 수 있는 고체상의 담체는 생화학 분야에서 통상 사용되는 담체로서 대표적으로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 치환된 벤질 형태의 폴리스티렌 수지(polystyrene resins of substituted benzyl type), 히드록시메틸페닐아세틱 아미드 형태의 폴리스티렌 수지, 치환된 벤즈히드릴폴리스티렌 수지, 펩타이드에 결합할 수 있는 기능기를 가진 폴리아크릴아미드 수지 등이 포함된다.

최초 보호 아미노산의 보호기들은 통상의 펩타이드 합성에 사용되는 보호기들로서 산 분해, 환원 또는 아미놀리시스와 같은 통상의 방법에 의해 쉽게 제거되는 것들이다. 아미노 보호기들의 구체 예로는 포르밀; 트리플루오로아세틸; 벤질옥시카보닐; (오르쏘- 또는 파라-)클로로벤질옥시카르보닐 및 (오르쏘- 또는 파라-)브로모벤질옥시카르보닐과 같은 치환된 벤질옥시카르보닐; t-부톡시카보닐 및 t-아밀록시카보닐과 같은 지방족 옥시카보닐 등이 있다. 아미노산의 카복실기들은 에스테르기로 전환시킴으로써 보호할 수 있다. 에스테르기로는 벤질 에스테르, 메톡시벤질 에스테르와 같은 치환된 벤질 에스테르; 시클로헥실 에스테르, 시클로헵틸 에스테르 또는 t-부틸 에스테르와 같은 알킬 에스테르 등이 있다. 구아니디노기는 보호기가 필요하지 않지만 니트로; 또는 토실, 메톡시벤젠슬포닐 또는 메시틸렌술포닐과 같은 아릴술포닐에의해 보호될 수 있다. 이미다졸의 보호기로는 토실, 벤질 및 디니트로페릴 등이 있다. 트립토판의 인돌기는 보호기가 없어도 되며 포밀 등으로 보호기를 붙일 수도 있다.

보호기 및 담체로부터 펩타이드를 분리하는 것은 여러 스캐빈저 (scavenger)하에 무수 하이드로플루오라이드에 의해 수행될 수 있다. 스캐빈저의 예로는 아니솔, (오르쏘-, 메타-, 파라-)크레솔, 디메틸술파이드, 씨오크레솔, 에탄엔디올 및 머캅토피리딘 등을 들 수 있는데 이들은 펩타이드 합성에서 통상 사용되는 것들이다.

다른 방도로서, 본 발명에 따른 펩타이드는 유전공학적 방법에 의하여 제조할 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라, 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제한다. 다르게는 DNA 서열은 본 분야에 공지된 표준 방법에 의해, 예를 들면 자동 DNA 합성기(예, 바이오써치, 어플라이드 바이오시스템스 등으로부터 구입할 수 있는 것)를 사용하여 합성할 수 있다. 예로서, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드는 문헌(Stein et al., Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988))에 기술된 방법에 의해 합성할 수 있다. 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오타이드는 조절된 유공 유리 중합체 지지체를 사용하여 제조할 수 있다(Sarin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451 (1988)).

작제된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환 또는 형질감염시키며, 생성된 형질전환체 또는 형질감염체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하고, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 코딩된 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수한다.

본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다.

본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.

본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염된 숙주 세포" 및 "형질전환된 숙주 세포"는 DNA의 세포로의 도입을 의미한다. 그 세포는 '숙주 세포'로 불리우며 원핵 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 전형적인 원핵 숙주 세포는 이. 콜라이의 각종 균주를 포함한다. 전형적인 진핵숙주 세포는 포유동물, 예를 들면 차이니즈 햄스터 난소 또는 인간 기원의 세포이다. 도입된 DNA 서열은 숙주 세포와 동일한 종으로부터 얻을 수 있거나, 숙주 세포와 다른 종의 것일 수 있거나, 또는 그것은 어떠한 이종 또는 상동성 DNA를 포함하는 하이브리드 DNA 서열일 수 있다.

용어 '벡터'는 적합한 숙주 내에서 DNA의 발현을 실시할 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드" 및 "벡터"는 때로 상호교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다. 포유동물 세포 배양물 발현을 위한 전형적인 발현 벡터는 예를 들면 pRK5 (EP 307,247호), pSV16B (WO 91/08291호) 및 pVL1392 (Pharmingen)을 기초로 한다.

용어 "조절 서열"이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 '작동가능하게 연결'된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는경우 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 상 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 접촉할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 사용한다.

본원 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 이종 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA로서 정의된다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 오리진을 더 포함하는 하나의 발현 벡터내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.

본 발명에 따른 펩타이드의 DNA 서열을 발현시키기 위해 매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 이용될 수 있다. 진핵 숙주에 적합한 발현 벡터로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 SV40, 소 유두종바이러스, 아네노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열이 포함된다. 세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터에는 pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, pUC벡터, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 이. 콜라이에서 얻는 것을 예시할 수 있는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, λgt10과 λgt11, NM989와 같은 매우 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다. 효모 세포에 유용한 발현 벡터는 2μ 플라스미드 및 그의 유도체이다. 곤충 세포에 유용한 벡터는 pVL 941이다.

또한, 본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열중 어느 것이라도 이들 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절 서열에는 상술한 발현 벡터의 구조 유전자와 연관된 발현 조절 서열을 포함한다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열, 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 RNA 폴리메라아제 프로모터 Φ10은 이. 콜라이에서 펩타이드를 발현시키는데 특히 유용하다.

상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본 발명의 DNA 서열을 발현시키는 데에는 매우 다양한 단핵세포성 숙주 세포가 이용될 수 있다. 이들 숙주에는 이. 콜라이, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO 및 마우스 세포와 같은 동물 세포, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 그린 원숭이 세포, 및 조직배양된 인간 세포 및 식물 세포들이 포함된다. 바람직한 숙주 생명체에는 이. 콜라이 및 바실러스 서브틸리스와 같은 세균, 그리고 조직배양된 포유동물 세포가 포함된다.

물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력, 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성 있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위 내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 대규모 배양으로 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다.

본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 펩타이드는 다양한 통상의 방법: HPLC, FPLC 등을 사용하는 정상 또는 역파지의 액체 크로마토그래피; 친화성 크로마토그래피(무기 리간드 또는 모노클로날 항체 등); 크기별 배제(size exclusion) 크로마토그래피; 고정된 금속 킬레이트(immobilized metal chelate) 크로마토그래피; 겔 전기영동 등을 이용하여 발효 또는 세포 배양액으로부터 분리 및 정제하여 실질적으로 순수한 펩타이드를 수득함으로써 얻을 수 있다. 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 범위 내에서, 가장 적합한 분리 및 정제 기술을 용이하게 선정할 수 있을 것이다. 본원에서 사용된 용어 "실질적으로 순수한 펩타이드"는 본 발명에 따른 펩타이드가 세균으로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다.

또한, 본 발명은 화학적 합성 또는 유전자 재조합에 의해 본 발명에 따른 환경 스트레스 내성 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 바람직하게는 본 발명에 따른 환경 스트레스 내성 융합 단백질은 유전자 재조합에 의해 제조될 수 있다. 상기한 바와 같이 단백질에 시누클레인의 C-말단 산성 꼬리 영역 펩타이드 또는 시누클레인의 C-말단 산성 꼬리영역의 아미노산 서열 중에서 10개 이상 50개 이하의 아미노산 서열과 결합된 융합 단백질을 제조하는 것은 생화학 및 유전공학 분야의 숙련가에게는 통상의 기술을 이용함으로써 달성될 수 있는 것으로 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리영역으로 이루어진 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 또한, 본 발명은 시누클레인 족의 C-말단 산성 꼬리영역의 아미노산 서열 중에서 10개 이상 50개 이하의 아미노산 서열로 이루어져 있으며 단백질과 결합하여 단백질의 고유 성질을 유지하면서도 환경 스트레스에 대해 내성을 갖도록 하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 펩타이드와 융합 파트너 단백질이 결합되어 형성된 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 제공한다.

특정 양태로, 열에 불안정한 단백질 GST의 C-말단에 α-시누클레인의 C-말단 산성꼬리 영역의 펩타이드가 연결된 융합 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열이 제공된다. 예를 들면, GST의 아미노산 서열 C-말단에 α-시누클레인의 C-말단 산성 꼬리 영역(아미노산 잔기 96-140)의 아미노산 서열이 연결된 융합단백질(GST-Syn96-140)을 코딩하는 DNA 서열(서열번호 8), GST의 아미노산 서열 C-말단에 α-시누클레인의 NAC 영역과 C-말단 산성 꼬리 영역(잔기 61-140)으로 구성된 펩타이드의 아미노산 서열이 연결된 융합단백질(GST-Syn61-140)을 코딩하는 DNA 서열(서열번호 9) 또는 GST의 아미노산 서열 C-말단에 α-시누클레인의 전체 아미노산 서열이 연결된 융합단백질(GST-Syn1-140)을 코딩하는 DNA 서열(서열번호 10)이 제공된다.

본 발명은 환경 스트레스 내성 단백질을 코딩하는 DNA를 검출하기 위한 프라이머를 제공한다. 본 발명의 다른 추가의 양태로서 상기 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터 및 이러한 재조합 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포가 제공된다.

본 발명은 하기 실시예로 보다 구체적으로 예시될 것이다. 그러나, 이들 실시예는 단지 본 발명의 구현 예이며 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

실시예 1

GST-시누클레인 융합 작제물 및 발현벡터의 제조

α-시누클레인은 N-말단 양친매성 영역(잔기1-60aa), 소수성 NAC 영역(잔기 61-95aa) 및 C-말단 산성 영역(잔기 96-140aa)의 3개의 독립적인 영역으로 구성되어 있다(도 1a). 상기 α-시누클레인의 각 영역과 열에 불안정한 단백질인 글루타치온 에스-트랜스퍼라제(glutathion S-transferase; GST)의 융합 단백질을 제조하기 위하여 α-시누클레인의 전체 영역과 GST를 융합한 GST-Syn1-140, 양친매성 영역과 GST를 융합한 GST-Syn1-60, NAC 영역과 GST를 융합한 GST-Syn61-95, NAC 및 산성 꼬리 영역과 GST를 융합한 GST-Syn61-140 및 산성 꼬리 영역과 GST를 융합한 GST-Syn96-140 융합 단백질을 코딩하는 5개의 GST-시누클레인 융합 작제물을 각각 합성하였다(도 1b).

GST-α-시누클레인 융합 작제물은 하기의 특정 프라이머로 α-시누클레인 유전자를 PCR 증폭하여 pGEX 발현벡터(Amersham Pharmacia Biotech)의 GST 유전자 뒤에 삽입함으로써 제조하였다. 전체 길이 α-시누클레인의 단백질 코딩 영역(잔기 1-140)은 밑줄친 Bg1II 제한 부위를 가진 프라이머 1(서열번호 11)과 밑줄친 Sa1I 제한 부위를 가진 프라이머 2(서열번호 12)를 사용하여 PCR 증폭하였으며 아미노-말단 양친매성 영역(잔기 1-60)은 프라이머 1(서열번호 11)과 Sa1I 제한 부위를 가진 프라이머 3(서열번호 13)으로 PCR 증폭하였다. NAC의 단백질 코딩영역(잔기 61-95)은 밑줄친 Bg1II 제한 부위를 포함하는 프라이머 4(서열번호 14)와 밑줄친 SaqII 제한 부위를 포함하는 프라이머 5(서열번호 15)를 사용하여 PCR 증폭하였으며, NAC 플러스 산성 꼬리(잔기 61-140)의 단백질 코딩영역은 프라이머 4(서열번호 14)와 프라이머 2(서열번호 12)를 사용하여 PCR 증폭하였다. C-말단 산성 꼬리(잔기 96-140)의 단백질 코딩영역은 밑줄친 KpnI 제한부위를 포함하는 프라이머 6(서열번호 16)과 밑줄친 Sa1I 제한부위를 포함하는 프라이머 7(서열번호 17)로 PCR 증폭하였다. 사용한 프라이머의 서열은 표 1에 나타내었다.

GST-시누클레인 융합 작제물의 제조를 위해 사용된 프라이머

프라이머		핵산서열	서열번호
1	센스	5'-GCGCTCGAGCCAGATCTGCCATGGATGTATTCATGA-3'	11
2	안티센스	5'-GCGCAAGCTTGTCGACTTAGGCTTCAGGTTCGTAGT-3'	12
3	안티센스	5'-GCGCAAGCTTGTCGACCTATTTGGTCTTCTCAGCCAC-3'	13
4	센스	5'-GCGCAGATCTCATATGGAGCAAGTGACA-3'	14
5	안티센스	5'-GCGCAAGCTTGTCGACCTAGACTTAGCCAGTGGC-3'	15
6	센스	5'-GCGCGGTACCGAGATCTGGATGAAAAAGGACCAGTTGGGC-3'	16
7	안티센스	5'-GCGCAAGCTTGTCGACTTAGGCTTCAGGTTCGTAGT-3'	17

각각의 증폭된 DNA는 1% 아가로스 겔을 이용하여 전기영동방법으로 정제하고 제한효소로 절단한 다음 pGEX 벡터(Pharmacia Biotech. Buckingamshire, UK)의 제한효소 부위에 연결하여 발현벡터를 작제하였다. 모든 작제물은 DNA 시퀀싱에 의해 그 서열을 확인하였다.

실시예 2

GST-시누클레인 융합단백질의 박테리아 발현 및 정제

GST-시누클레인 융합단백질을 발현시키기 위해 실시예 1에서 작제한 발현벡터를 대장균 BL21(DE3)plysS(Invitrogen)에 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균을 0.1mg/ml 암피실린(ampicillin)을 포함하는 LB배지에 접종하여 37℃에서 흡광도가 600nm에서 0.8이 될 때까지 배양한 다음 0.5mM IPTG로 유도한 후에 4시간 더 배양하였다. 배양액을 10,000rpm으로 10분간 원심분리하여 세포를 획득하고, 상기 세포를 인산 완충용액 염수(PBS, pH7.4)에 재현탁한 다음 초음파처리(ultrasonication)에 의해 파괴시켰다. 세포 잔해를 제거한 후 상등액을 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)로 정제하였다. 즉, 상기 상등액을 PBS로 평형된 글루타치온-세파로스 4B 컬럼(Peptron, Taejeon, Korea)에 통과시키고 PBS로 세척한 후 융합 단백질을 10mM GSH(Sigma, St. Louis, Mo)로 용출하였다. 용출된 GST-시누클레인 융합 단백질을 FPLC 겔 여과 컬럼(FPLC gel-filtration column)으로 추가로 정제한 다음 센트리콘 농축기(Amicon, Beverly, MA)로 단백질을 농축하였다.

실시예 3

α-시누클레인과 GST 단백질의 열반응성

α-시누클레인은 규칙적인 2차 구조가 결여되어 있고 아주 상당한 부분의 불규칙 코일(random-coil)을 포함하고 있는 '고유 비구조성 단백질' (Plaxco K. W. and Groβ M., Nature, 386, 657-658 (1997); Wright P. E. and Dyson H. J., J. Mol. Biol., 293, 321-331 (1999); Kim J., Molecules and Cells, 7, 78-83 (1997); Weinreb P. H. et al., Biochemistry, 35, 13709-13715 (1996))이다. 이전의 연구들은 α-시누클레인과 α_s-카제인과 같은 고유 비구조성 단백질이 온도에 관계없이 풀어진 유사한 형태를 갖고 있으며 그들의 풀어진 형태는 실온에서처럼 고온에서도 안정하기 때문에 내열성을 지닌다고 보고하였다 (Kim T. D. et al., Biochemistry, 39, 14839-14846 (2000)). 따라서, 이를 확인하고자 α-시누클레인과 GST 단백질의 열반응성을 열에 의해 유도된 단백질 응집을 정성 분석하여 비교하였다. 실험에 사용된 GST와 α-시누클레인 단백질은 각각의 유전자를 포함하고 있는 pGEX 벡터와 pRK172 발현벡터를 대장균에 형질전환시켜 재조합 단백질을 제조하였다(Jakes et al., FEBS Letters 345, 27-32 (1994)). 재조합 GST 단백질은 실시예 2와 동일한 방법으로 정제하고 재조합 α-시누클레인은 공지된 바와 같이 정제하였다 (Kim J., Molecules and Cells, 7, 78-83 (1997); Paik S. R. et al., Arch. Biochem. Biophys., 344, 325-334 (1997)).

GST와 α-시누클레인 단백질의 열에 의해 유도된 응집을 분석하기 위하여 각 시료를 열처리한 후 SDS 폴리아크릴아미드 겔로 정성 분석하였다. PBS에 현탁된 각 단백질 시료(0.6mg/ml)를 10분간 끓는 수욕에서 열처리하고 방냉하였다. 상기 단백질 시료를 15,000rpm에서 10분간 원심분리한 다음 상등액을 12% SDS 폴리아크릴아미드 겔로 분석하였다. SDS 폴리아크릴아미드 겔에 나타난 단백질 밴드를 쿠마시 블릴난트 블루(Coomassie Brillinant blue) R250으로 염색하여 확인하였다.

실험 결과, α-시누클레인 단백질의 경우에는 열처리하지 않은 경우와 열처리한 경우에도 모두 단백질 밴드가 나타났으나, GST 단백질의 경우에는 열처리하지 않은 경우에는 단백질 밴드를 확인할 수 있었으나 열처리한 후에는 단백질 밴드가 나타나지 않았다(도 2). 이는 예상한바와 같이, α-시누클레인은 열처리에 의해 침전되지 않았고 반면, GST 단백질은 침전되었기 때문이다. 따라서, α-시누클레인 단백질은 열에 안정한 단백질이고 GST는 열에 불안정한 단백질임을 알 수 있었다. 이와 같은 실험 결과는 pH 및 완충용액의 염농도와 단백질 농도를 고려하지 않아도 동일한 결과를 얻었다(데이터 생략).

실시예 4

α-시누클레인 결실 돌연변이체의 열반응성

다음으로 α-시누클레인의 내열성을 유도하는 영역이 어디인지를 일련의 결실돌연변이를 통하여 조사하였다. 실시예 2에서 제조한 GST-시누클레인 융합 단백질들을 1mg당 1unit의 트롬빈으로 상온에서 두시간 처리한 후 GST 단백질 부위와 α-시누클레인 부위로 절단하여 α-시누클레인 결실돌연변이체(deletion mutants)를 수득한 다음 각각의 결실 돌연변이체의 열안정성(thermal stability)을 조사하였다.

실시예 3과 동일한 방법으로 트롬빈에 의해 분해된 산물(cleaved products)과 천연형의 α-시누클레인 단백질의 열안정성을 조사하였다. 상기 수득한 α-시누클레인 결실 돌연변이체는 각각 산성꼬리를 포함하고 있는 2 결실 돌연변이체(Syn61-140aa, Syn96-140aa), α-시누클레인 N-말단(Syn1-60aa)을 포함하고 있는 결실 돌연변이체 및 소수성 NAC 영역(Syn61-95aa)을 포함하고 있는 결실 돌연변이체이다.

실험 결과, 천연형의 α-시누클레인 단백질(Syn1-140)과 C-말단 산성 꼬리를 포함하고 있는 2개의 결실 돌연변이체(Syn61-140, Syn96-140)는 열처리에 의해 침전되지 않아 SDS 폴리아크릴아미드 겔로 분석하였을 때 단백질 밴드가 나타났으며 따라서, 내열성을 지님을 알 수 있었다. 반면, α-시누클레인의 N-말단 영역(Syn1-60)과 NAC 영역(Syn61-95)은 열처리에 의해 침전되어 단백질 밴드가 나타나지 않았다 (도 3 M: 마커, 래인 1: 천연형 시누클레인(Syn1-140), 래인 2: N-말단 영역(Syn1-60), 래인 3: 소수성 NAC영역(Syn61-95) 래인 4:산성꼬리를 포함하는 NAC 영역(Syn61-140), 래인 5: 산성 꼬리 영역(Syn96-140)). 상기 실험 결과로부터, α-시누클레인의 C-말단 산성꼬리를 포함하는 결실 돌연변이체만이 내열성을 나타냄을 알 수 있었다. 따라서, C-말단 산성꼬리가 내열성을 지니도록 하는 원인임을 알 수 있었다. 본 발명자들의 데이터와 일치하여, 이전의 연구에서 α-시누클레인 단백질의 C-말단 절단형과 NAC 펩타이드가 천연형 단백질에 비해 사상체(filaments)로 더 용이하게 형성될 수 있음이 보고된 바 있다 (Serpell L. C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 4897-4902 (2000); Crowther R. A. et al., FEBS Letters, 436, 309-312 (1998); Han H. et al., Chem. Biol., 2, 163-169 (1995); Iwai A. et al., Biochemistry, 34, 10139-10145 (1995)). 이를 종합해보면, α-시누클레인 돌연변이 단백질의 C-말단 절단형은 천연형과 C-말단 산성꼬리를 함유한 단백질에 비해 실온에서와 고온에서 덜 안정적임을 알 수 있었다. 그 결과 C-말단 산성 꼬리가 α-시누클레인의 열용해성에 매우 중요한 역할을 함을 알 수 있었다.

실시예 5

GST-시누클레인 융합 단백질들의 열반응성

상기 실시예 2에서 제조한 각각의 GST-시누클레인 융합 단백질의 열반응성을 조사하였다. 열반응성은 실시예 3과 동일한 방법으로 GST-α-시누클레인 융합 단백질들을 10분간 수욕에서 끓인 후 단백질 용액을 원심분리하고 상등액은 SDS 폴리아클리아미드 겔로 분석하였다. 또한, GST-α-시누클레인 융합단백질들의 열반응성을 65℃에서 경과시간에 따라 360nm에서 흡광도를 모니터링함으로써 정량적으로 분석하였다(Lee G.J. and Vierling E., Method Enzymol., 290, 360-65 (1998); Horwitz J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10449-53 (1992)).

실험 결과, 도 4a에서 나타낸바와 같이, GST-Syn1-140, GST-Syn61-140 및 GST-Syn96-140은 열처리 전과 후에 모두 단백질 밴드가 나타났으며 이로부터 열처리에 의해서 침전되지 않음을 알 수 있었다. 따라서, 상기 단백질은 내열성을 지님을 알 수 있었다. 반면, GST-Syn1-60과 GST-Syn61-95는 열처리 전에는 단백질 밴드가 나타났으나, 열처리 후에는 단백질 밴드가 나타나지 않았다. 따라서, 상기 단백질은 열에 불안정하며 열처리에 의해 완전히 침전되었음을 알 수 있었다.

또한, GST-시누클레인 융합 단백질의 열에 의해 유도된 응집을 65℃에서 시간에 따라 혼탁도를 측정함으로써 정량적으로 분석한 결과, 도 4b에 나타낸바와 같이 GST 단백질의 OD₃₆₀은 열처리 후 2분이 지난 시점에서 극도로 증가하였고 대부분의 단백질들은 3분이 지나서 응집됨을 알 수 있었다. GST-Syn61-95는 GST 단백질과 유사하게 반응하였고 완전히 응집되었다. GST-Syn1-60의 응집은 비교적 지연됨에도 불구하고 열처리 후에 완전히 응집되었다. 도 4a의 결과와 일치하여 30분간의 열처리 후에도 GST-Syn1-140, GST-Syn61-140 및 GST-Syn96-140는 응집되지 않았다. 흥미롭게도, 이러한 3개의 내열성 GST-시누클레인 융합 단백질은 모두 α-시누클레인의 산성 꼬리를 포함하고 있었다. 상기와 같은 결과로부터 열에 불안정한 단백질은 α-시누클레인 산성 꼬리의 도입에 의해 내열성 단백질로 전환될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 6

α-시누클레인 결실돌연변이체, GST 및 GST-시누클레인 융합단백질의 pI값 및 수친화도(hydropathy)의 비교

이전에, Jurkat T 세포 여액과 사람 혈청으로부터 유래된 많은 내열성 단백질들이 강산성 단백질로 보고되었다. 이는 pI값이 단백질의 내열성과 관련이 있음을 암시해준다 (Kim T. D., et al., Molecules and Cells, 7, 78-83 (2000)). 높게 하전된 단백질은 고온에서도 용해될 수 있기 때문에 단백질의 용해도는 내열성을 결정하는 것에 있어서 중요한 역할을 한다고 추측된다. 이러한 가설을 검증하기 위하여, α-시누클레인 결실돌연변이체, GST 및 GST-시누클레인 융합단백질의 pI값 및 수친화도(hydropathy)를 비교하였다(표 2). pI 값과 수친화도는 프롯파람(ProtParam) 프로그램을 사용하여 계산하였다

실험 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, α-시누클레인, Syn61-140, Syn96-140, GST-Syn1-140, GST-Syn61-140 및 GST-Syn96-140과 같은 내열성 단백질의 pI값과 수친화도가 비정상적으로 낮게 나타났다. 반면에 Syn61-95를 제외하고 열에 불안정한 단백질은 pI값과 수친화도가 더 높음을 알 수 있었다. 흥미롭게도, 열에 불안정한 펩타이드인 Syn61-95는 pI값이 매우 낮고 수친화도가 매우 높음을 알 수 있었다. 따라서, pI값과 수친화도가 낮게 하전된 단백질들은 열에 의해 유도된 단백질 응집에 대해 내성을 가질 수 있음을 알 수 있었다.

α-시누클레인, α-시누클레인 결실 돌연변이체, GST 및 GST-시누클레인 융합 단백질의 등전점(pI)과 수친화도

단백질	온도 반응	pI 값a	수친화도b
α-시누클레인	HRc	4.67	-0.403
Syn1-60	HLd	9.52	-0.188
Syn61-95	HL	4.53	0.726
Syn61-140	HR	3.85	-0.564
Syn96-140	HR	3.76	-1.567
GST	HL	6.18	-0.390
GST-Syn1-140	HR	5.25	-0.378
GST-Syn1-60	HL	7.64	-0.349
GST-Syn61-95	HL	6.01	-0.244
GST-Syn61-140	HR	4.95	-0.435
GST-Syn96-140	HR	4.85	-0.560

^a pI 값은 프롯파람(ProtParam) 프로그램을 사용하여 계산하였다(www.expasy.ch).

^b 수친화도는 프롯파람 프로그램을 사용하여 계산하였다(www.expasy.ch).

^cHR, 내열성(heat-resistant)

^dHL, 열에 불안정성(heat-labile)

실시예 7

2가 양이온 결합의 영향

Cu²⁺와 Ca²⁺같은 2가 양이온은 마이크로몰(micromolar) 범위의 해리상수로 α-시누클레인의 C-말단 산성 꼬리영역에 특이적으로 결합한다고 알려져 있다 (Paik S. R. et al., Biochem. J., 340, 821-8 (1999); Nielsen M. S. et al., J. Biol. Chem. In Press (2001)). 결합 부위가 아직 밝혀지지 않았지만 Zn²⁺도 또한 α-시누클레인에 특이적으로 결합한다고 알려져 있다 (Paik S. R. et al., Biochem. J., 340, 821-8 (1999); Kim T. D. et al., Biochemistry, 39, 14839-14846 (2000)). α-시누클레인의 C-말단 산성 꼬리가 단백질의 내열성에 중요하기 때문에, 2가 양이온의 결합이 C-말단 산성 꼬리를 포함하는 열에 의해 유도된 GST-시누클레인 융합 단백질의 응집에 미치는 영향을 조사하였다. 2가 양이온으로는 CaCl₂, MgCl₂ 및 ZnCl₂를 사용하였다. α-시누클레인의 산성꼬리를 포함하는 융합단백질 GST-Syn1- 140, GST-Syn61-140 및 GST-Syn96-140을 각각의 2가 양이온0-1.0mM를 함유한 20mM 트리스-HCl 완충용액으로 최종농도 0.2mg/ml가 되도록 희석하였다. 이 단백질 용액을 65℃에서 30분간 반응시키고 360nm에서 겉보기 흡광도를 측정하였다.

실험 결과, 도 5a 및 도 5b에 나타낸바와 같이, 저농도의 2가 양이온은 열에 의해 유도된 융합 단백질의 응집에 영향을 주지 않았다. 그러나, 고농도에서는 비록 융합 단백질이 완전하게 침전되지는 않았으나 유의적으로 단백질 응집을 증가시키는데 영향을 주었다. 특히, Zn²⁺는 열에 의해 유도된 단백질 응집을 증가시키는데 영향을 주었다. α-시누클레인과 2가 양이온 사이의 해리 상수는 상당히 낮으며 대부분의 단백질들은 고농도의 금속이온에 의해 영향을 받는다. 이러한 결과는 α-시누클레인 C-말단 산성 꼬리에 2가 양이온의 특이적인 결합이 융합 단백질의 열반응성에는 영향을 주지 않음을 나타내는 것이다. 그러나, 고농도의 금속이온의 비특이적인 결합은 열처리하는 동안에 단백질의 응집을 더 유도함을 알 수 있었다.

실시예 8

열처리 후 GST-시누클레인 융합 단백질의 GST 활성

상술한 실시예들에서 천연형의 GST 단백질과 달리, 내열성 GST-시누클레인 융합 단백질은 내열성인 것으로 나타났다. 이는 열에 불안정한 단백질이 α-시누클레인의 산성 꼬리를 도입함으로써 내열성 단백질로 전환될 수 있음을 보여 주는 것이다. 이어서, 본 발명에 따른 내열성 GST-시누클레인 융합 단백질이 열처리 후에도 그 효소활성이 유지되는지를 조사하였다. GST 및 GST-시누클레인 융합 단백질들을 10분간 수욕에서 끓인 다음 실온에서 방냉한 후 열처리한 단백질의 촉매 활성을 비교하였다. 효소활성은 발색기질인 1-클로로-2,4-디니트로벤젠(DTNB)을 사용하여 분석하였다 (Habig W. H. et al., J. Biol. Chem., 249, 7130-7139 (1974)). 정제된 GST 및 GST-시누클레인 융합단백질을 최종 농도가 20μg/ml가 되도록 기질용액(pH7.4인 0.1M 인산 완충용액에 용해된 1mM GSH와 2mM DTNB)으로 희석하고 10분간 37℃에서 반응시켰다. 반응이 완료되면 효소활성을 350nm에서 흡광도를 측정함으로써 분석하였다. 이때 흡광도는 스펙트라맥스 250 마이크로플레이트 리더(Spectramax 250 microplate reader; Molecular Devices, CA, USA)로 측정하였다.

실험 결과, 도 6a에 나타낸바와 같이, GST 및 GST 융합 단백질들은 모두 상기와 같은 극단적인 조건하에서는 효소 활성을 완전히 상실하였다. 다음으로, 열처리 후에 초기 효소 활성이 50%가 되는 온도인 T₅₀ 값을 결정하는데 사용되는 열불활성 곡선(thermal inactivation curve)으로 GST 및 GST-Syn96-140의 열안정성(thermostability)을 정량적으로 측정하였다. 도 6b에 나타낸바와 같이, GST-Syn96-140의 T₅₀값은 GST에 비해 약 2℃가 높았다. 흥미롭게도, GST의 열불활성화(thermal inactivation)는 단백질의 열 응집과 상관관계가 있었으며 도입된 산성 꼬리가 융합 단백질의 열에 의한 응집을 방지하여 열불활성화로부터 효소를 보호할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 9

열에 의해 유도된 GST-Syn96-140의 2차 구조 변화

이전에, 열에 의해 유도된 α-시누클레인의 2차 구조 변화를 CD 분석으로 측정한 결과가 보고되었다 (Kim T. D. et al., Biochemistry, 39, 14839-14846 (2000)). α-시누클레인의 CD 스펙트럼은 단백질에 이차 구조 요소가 거의 완전히 결여되어 있음을 나타냈다. 100℃에서 α-시누클레인의 CD 스펙트럼은 25℃에서와 약간 다른 경향을 나타내었으나 불규칙 코일(random-coiled) 폴리펩타이드의 특성을 나타낸다. 이들의 결과와 일치하여, 풀어진(unfolded) 펩타이드에서 흔히 볼 수 있는 CD 신호의 온도에 따른 비례적 의존성(linear temperature-dependence) 이 관찰되었다.

본 발명자들은 열변성에 따른 GST의 CD 스펙트럼과 GST-시누클레인 융합 단백질의 CD 스펙트럼을 측정함으로써 2차 구조 변화를 분석하였다. CD 스펙트럼은 온도 조절 시스템이 장착된 Jasco-J715 분광편광계(Jasco, Japan)를 이용하여 연속 모드로 측정하였다. 극-UV CD의 측정은 25℃ 내지 100℃ 하에 0.5cm의 밴드넓이를 갖는 190-250nm의 파장범위, 1초 반응시간 및 10nm/min 스캔 속도에서 실행하였다. 측정된 스펙트럼을 완충용액 신호를 공제하여 교정한 5회 스캔의 평균치로 나타내었다. CD 데이터는 잉여타원율[θ]의 평균값(deg·cm²dmol-1)을 나타낸다. CD 측정을 위한 각각의 단백질 시료는 달리 특정되지 않는 한 10mM 인산나트륨 완충용액으로 제조하였고 모든 스펙트럼은 패스길이가 0.1cm인 큐벳에서 측정하였다.

열변성(Thermal denaturation) 실험은 승온속도 1℃/min으로 수행하였고 반응시간은 1초로 하였다. 온도 스캔 데이터는 25℃부터 100℃까지를 수집하였다. GST와 GST-Syn96-140의 농도는 각각 0.1mg/ml, 0.3mg/ml로 하였다. CD 스펙트럼은 달린 특정되지 않는 한 222nm 파장에서 0.5℃마다 측정하였다. 온도 변화의 가역성은 온도증가에 의해 기록된 스캔과 열에 의해 풀어진 단백질 시료를 냉각시키면서 기록된 스캔을 비교하여 관찰하였다.

실험 결과, 25℃에서 GST의 CD 스펙트럼은 도 7a에 나타낸 바와 같이 잘 정돈된 2차 구조 요소를 포함함을 알 수 있었다. 그러나, 100℃에서는 극-UV CD 스펙트럼이 단백질의 침전에 의해 거의 사라져 버렸다(데이터 제시되지 않음). 열에 의해 유도된 GST의 222nm에서의 타원율(ellipticity)의 변화는 GST의 융점(Tm)이 약 70℃임을 나타내었다. GST는 100℃에서 완전히 침전되었고 222nm에서는 CD 신호가 나타나지 않아 GST가 비가역적으로 침전되었음을 알 수 있었다(데이터 제시되지 않음). 이러한 결과는 GST 단백질이 온도가 증가됨에 따라 풀어지고 침전되는 전형적인 열 불안정성 단백질임을 증명해 주는 것이다.

GST-Syn96-140의 극-UV CD 스펙트럼은 도 7b에 나타내었다. 실온에서 GST-Syn96-140의 극-UV CD 스펙트럼(실선)은 단백질이 잘 정돈된 2차 구조 요소를 포함함을 보여주었다. CD 스펙트럼은 100℃에서는 2차 구조 요소가 감소함을 보여주었지만, 전체적인 형태는 변화하지 않았다(점선). 이러한 결과는 가열이 완전한 풀어짐을 유도하지는 않음을 의미한다. 흥미롭게도, 불규칙한 코일(random-coil) 폴리펩타이드의 특징으로 195nm에서 새로운 흡수 밴드가 나타났다. 단백질 용액을 냉각 한 후의 극-UV CD 스펙트럼은 초기 스펙트럼(괘선)과 차이가 있었으며 이는 GST-Syn96-140의 형태가 비가역적으로 변화되었음을 나타내는 것이다. 열처리한 GST-Syn96-140의 실온에서 측정한 CD 스펙트럼은 100℃에서와 유사하였고 이러한 결과는 상기 단백질이 2차 구조 요소와 불규칙-코일 형태의 2개의 독립적인 영역으로 구성되었음 보여주는 것이다. 가열에 의해 유도된 형태적 변화를 확인하기 위해, 온도에 따른 GST-Syn96-140의 용융곡선을 측정하였다. 222nm에서 열에 의해 유도된 타원율의 변화를 도 7b에 나타내었다. 흥미롭게도, 열에 의해 유도된 GST-Syn96-140의 풀어짐은 2단계로 이루어졌다. 62℃에서 첫 번째 변화가 일어나고 95℃에서 2번째 변화가 일어났다. 예상한대로, GST-Syn96-140의 온도 곡선은 비가역적으로 나타났다(점선).

GST-Syn96-140이 내열성 단백질인 반면, GST는 열에 불안정한 단백질이다. 상기 두 단백질의 안정성을 비교하기 위하여, 두 단백질의 융점(Tm)을 결정하는 것이 매우 유용하다. 그러나, 상기 단백질들은 펩타이드 도메인의 수가 다르기 때문에 GST-Syn96-140과 GST의 융점을 직접적으로 비교하는 것은 어렵다. 흥미롭게도, GST-Syn96-140의 Tm 값(첫번째 변화시 62℃)은 GST(70℃)에 비해 약간 낮게 나타났다. 주어진 단백질의 융점은 천연의 단백질과 온도에 의해 변성된 단백질사이에 자유 에너지의 변화와 관련이 있기 때문에, Tm은 단백질의 형태적 안정성에 대한 열역학적 변수로써 사용된다. 따라서, GST의 C-말단 산성 꼬리의 도입은 단백질의 온도증가와 같은 환경스트레스에 대한 안정성과 내열성에 유리하지만, 단백질의 고유한 열 안정성(intrinsic thermal stability)에는 불리함을 알 수 있었다.

실시예 10

pH 및 금속에 의해 유도된 단백질의 응집

pH에 의해 유도된 GST 및 GST-Syn96-140의 응집은 혼탁도를 pH에 따라 측정함으로써 조사하였다. 혼탁도의 측정은 360nm에서 pH 변화에 따른 겉보기 흡광도를 조사함으로써 측정하였다. 상기 단백질을 각기 다른 pH값을 갖는 완충용액으로 최종농도가 0.2mg/ml가 되도록 희석하였다. 완충용액으로는 0.1M 아세트산(pH4.0 및 pH5.0), 0.1M 구연산(pH6.0) 및 0.1M 트리스-HCl(pH7.4)를 사용하였다. 상기 완충용액으로 희석한 단백질 용액을 실온에서 1시간동안 반응시키고 겉보기 흡광도를 벡크만 흡광분광계(DU650, Beckman)로 측정하였다. 또한, 금속이온인 Zn²⁺,혹은 Cu²⁺에 의해 유도된 GST와 GST-Syn96-140의 응집을 측정하였다. 각 단백질을 0-1.0mM Zn²⁺,혹은 Cu²⁺를 함유한 20mM 트리스-HCl 완충용액으로 최종농도 0.2mg/ml가 되도록 희석하였다. 단백질 용액을 실온에서 30분간 반응시키고 360nm에서 겉보기 흡광도를 측정하였다.

실험 결과, pH에 의해 유도된 단백질의 응집은 도 8a에 나타낸바와 같다. GST 단백질의 OD₃₆₀은 pH7.4에서 pH5.0까지 점차적으로 증가하였고 pH4.0에서 최고값에 도달하였다. 반면에, GST-Syn96-140의 OD₃₆₀은 pH5.0까지 변화하지 않았으나 pH4.0에서 매우 증가하였으며 이는 산성 꼬리의 중성화에 기인한 것으로 사료된다. 이로부터 α-시누클레인의 C-말단 산성 꼬리 (ATSα, Syn96-140)가 강산성 조건에서는 보호효과가 크지 않지만 pH 4.0이상의 pH에 의해 유도된 응집으로부터 GST를 완벽하게 보호할 수 있음을 알 수 있었다. 금속이온에 의해 유도된 단백질의 응집은 도 8b에 나타낸 바와 같다. 실험결과, ATSα는 금속이온에 의해 유도된 응집으로부터도 GST를 보호할 수 있었다. GST 단백질의 OD₃₆₀은 0.2-1.0mM Zn²⁺를 처리하였을 때 점차 증가하였으며 GST-Syn96-140의 OD₃₆₀은 GST의 OD에 비해 항상 낮게 나타났다. 특히, ATSα는 Cu²⁺에 의해 유도된 응집으로부터 GST를 완벽하게 보호할 수 있는 것으로 나타났다. 이러한 결과로부터 ATSα가 금속이온에 의해 유도된 응집으로부터도 GST를 보호할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 11

ATSα가 스트레스에 의해 유도된 DHFR의 응집에 미치는 영향

ATSα(Syn96-140)를 GST 이외의 단백질에 융합시켰을 때도 융합단백질이 환경스트레스에 내성을 보이는지 알아보기 위해 본 발명자들은 DHFR의 C-말단영역에 ATSα를 포함하는 DHFR-시누클레인 융합 단백질의 하나인 DHFR-ATSα(DHFR-Syn96-140)를 작제하였다.

우선 DHFR 단백질 코딩영역을 E.coil 발현 벡터 pRSETA(Invitrogen)의 BamHⅠ 및 HindⅢ 제한부위에 서브클론하였다(pDHFR). 다음에 ATSα 코딩 영역을 밑줄친 KpnI 제한 부위를 포함하는 5'-올리고뉴클레오타이드 프라이머(서열번호 18)와 밑줄친 SalI 제한 부위를 포함하는 3'-올리고뉴클레오티드 프라이머(서열번호 19)으로 PCR 증폭하였다. 상기 증폭된 DNA를 겔 정제하고 KpnI/SalI 제한효소로 소화한 다음 같은 제한효소로 소화해둔 pDHFR 벡터에 연결한 다음 E.coli에 형질전환시킨 후 재조합벡터를 분리하였다. 상기 발현벡터(pDHFR-ATSα)를 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.

DHFR-시누클레인 융합 작제물의 제조에 사용된 프라이머

프라이머		핵산서열	서열번호
8	센스	GCGCGGTACCAAGGACCAGTTGGGCAAGAATG	18
9	안티센스	GCGCGTCGACTTAGG CTTCAGGTTCGTAGT	19

상기 발현벡터(pDHFR-ATSα)로 E.coli BL21(DE3)를 형질전환하였다. 형질전환된 박테리아를 암피실린 0.1mg/ml를 포함하는 LB배지에 접종하여 37℃에서 흡광도(A600)가 0.8이 될 때까지 배양한 다음 0.5mM IPTG를 첨가하여 4시간 동안 더 배양하였다. 배양액을 10,000rpm으로 10분간 원심분리하여 세포를 회수하고 인산 완충용액(PBS, pH7.4)에 재현탁한 후 초음파처리(ultrasonication)하여 세포를 용해시켰다. 상기에서 용해된 균체를 제거한 다음 상등액을 로딩완충액[0.3M NaCl 및 10mM 이미다졸을 포함하는 50mM 인산완충액(pH 8.0)]으로 평형화시켜 둔 Ni-NTA 컬럼에 로딩하였다. 상기 로딩완충액을 세척한 다음, 단백질을 250mM 이미다졸을 포함하는 동일한 완충액으로 용출시켰다. 상기 DHFR-ATSα를 FPLC 겔-여과 컬럼으로 더 정제하였다. 정제된 단백질을 센트리콘(Amicon, Beverly, MA)으로 농축하고 완충액을 교환하였다. 이렇게 작제된 DHFR-ATSα융합 단백질의 열에 대한 내성을 DHFR의 그것과 비교하였다. PBS에 현탁된 각 단백질 시료(0.2mg/ml)를 10분간 65℃와 100℃ 수욕에서 각각 열처리하고 방냉하였다. 상기 단백질 시료를 15,000rpm에서 10분간 원심분리한 다음 상등액을 12% SDS 폴리아크릴아미드 겔로 분석하였다. SDS 폴리아크릴아미드 겔에 나타난 단백질 밴드를 쿠마시 블릴난트 블루(Coomassie Brillinant blue) R250으로 염색하여 확인하였다.

실험 결과, 도 9에서 나타낸 바와 같이, DHFR-ATSα은 열처리 전과 65℃와 100℃ 열처리후에 모두 단백질 밴드가 나타났으며 이로부터 열처리에 의해서 침전되지 않음을 알 수 있었다. 따라서, 상기 단백질은 내열성을 지님을 알 수 있었다. 반면, DHFR은 열처리전에는 단백질 밴드가 나타났으나, 65℃와 100℃ 열처리 후에는 모두 단백질 밴드가 나타나지 않았다. 따라서, 상기 단백질은 열에 불안정하며 열처리에 의해 완전히 침전되었음을 알 수 있었다. 이러한 사실은, 야생형 DHFR은 열에 의한 스트레스에 의해 쉽게 침전되는 열에 불안정한 단백질인데 반해 본 발명에 따른 DHFR-ATSα는 매우 높은 내열성을 지니고 있는 것으로 나타나 ATSa가 GST뿐만 아니라 DHFR과 다른 단백질에도 열에 대한 내성을 부여할 수 있는 성질이 있는 펩타이드임을 보여준다.

실시예 12

α-시누클레인의 C-말단 산성 꼬리 영역 아미노산으로 구성된 펩타이드 단편을 포함하는 GST-시누클레인 융합 단백질의 열에 대한 내성

ATSα는 45개의 아미노산(잔기 96-140)으로 구성되어 있으며 15개의 Glu/Asp 잔기가 이 영역에 걸쳐 분산되어 있다. 본 발명자들은 상기 ATSα 영역 아미노산으로 구성된 펩타이드 단편을 포함하는 일련의 GST-시누클레인 융합 단백질(GST-ATSα)의 결실돌연변이체가 열에 대한 내성을 갖는지 여부를 조사하였다. 이를 위해 pGEX 벡터에 ATSα 유전자 일부분을 연결하여 일련의 GST-ATSα 결손 돌연변이체를 제조하였다. ATSα 일부분을 코딩하는 DNA는 자동 DNA 합성기를 사용하여 화학적으로 합성하였다 (표 4, 서열번호 20-27). 올리고뉴클레오타이드 서열번호 20와 21은 GST-Syn103-115를 제작하기 위한 센스와 안티센스 DNA이며, 올리고뉴클레오타이드 서열번호 22과 23는 GST-Syn114-126를 제작하기 위한 센스와 안티센스 DNA이며, 올리고뉴클레오타이드 서열번호 24과 25는 GST-Syn119-140를 제작하기 위한 센스와 안티센스 DNA이며, 올리고뉴클레오타이드 서열번호 26와 27은 GST-Syn130-140를 제작하기 위한 센스와 안티센스 DNA이다. 합성된 센스와 안티센스 DNA 짝을 각각 어닐링(annealing)한 후 pGEX 벡터의 BamHI 및 EcoRI 제한 부위에 ATSα 유전자 부분을 연결시킴으로써 다음과 같은 일련의 GST-ATSα 결손 돌연변이체의 발현 벡터를 제조하였다. ATSα의 13개 아미노산(잔기 103-115)을 포함하는 GST-Syn103-115; ATSα의 13개 아미노산(잔기 114-126)을 포함하는 GST-Syn114-126; ATSα의 22개 아미노산(잔기 119-140)을 포함하는 GST-Syn119-140; 및 ATSα의 11개 아미노산(잔기 130-140)을 포함하는 GST-Syn130-140을 각각 제조하였다 (도 10a). 상기 모든 발현벡터(pGST-Syn103-115, pGST-Syn114-126, pGST-Syn119-140 및 pGST-Syn130-140)는 DNA 시퀀싱에 의해 그 서열을 확인하였다.

GST-ATSα(GST-Syn96-140)의 C-말단 결실돌연변이체 제조에 사용된 프라이머

프라이머		핵산서열	서열번호
10	센스	GATCCAATGAAGAAGGAGCCCCACAGGAAGGCATTCTGGAAGATTAAG	20
11	안티센스	AATTCTTAATCTTCCAGAATGCCTTCCTGTGGGGCTCCTTCTTCATTG	21
12	센스	GATCCGAAGATATGCCTGTAGATCCTGACAATGAGGCTTATGAATAAG	22
13	안티센스	AATTCTTATTCATAAGCCTCATTGTCAGGATCTACAGGCATATCTTCG	23
14	센스	GATCCGATCCTGACAATGAGGCTTATGAAATGCCTTCTGAGGAAGGGTATCAAGACTACGAACCTGAAGCCTAAG	24
15	안티센스	AATTCTTAGGCTTCAGGTTCGTAGTCTTGATACCCTTCCTCAGAAGGCATTTCATAAGCCTCATTGTCAGGATCG	25
16	센스	GATCCGAGGAAGGGTATCAAGACTACGAACCTGAAGCCTAAG	26
17	안티센스	AATTCTTAGGCTTCAGGTTCGTAGTCTTGATACCCTTCCTCG	27

발현벡터 pGST-Syn103-115, pGST-Syn114-126, pGST-Syn119-140 및 pGST-Syn130-140을 E.coli BL21(DE3)에 형질전환한 다음 재조합 단백질을 글루타티온-세파로스 4B 비드를 사용한 친화성 컬럼크로마토그래피로 정제하였다. 상기 GST-ATSα 융합 단백질들을 FPLC 겔-여과 컬럼으로 더 정제한 다음, 각각 열에 대한 내성을 조사하였다. 우선 각 시료를 열처리한 후 SDS 폴리아크릴아미드 겔로 정성 분석하였다. PBS에 현탁된 각 단백질 시료(0.6mg/ml)를 10분간 끓는 수욕에서 열처리하고 방냉하였다. 상기 단백질 시료를 15,000rpm에서 10분간 원심분리한 다음 상등액을 12% SDS 폴리아크릴아미드 겔로 분석하였다. SDS 폴리아크릴아미드 겔에 나타난 단백질 밴드를 쿠마시 블릴난트 블루(Coomassie Brillinant blue) R250으로 염색하여 확인하였다.

실험 결과, 도 10b에서 나타낸 바와 같이 이들 GST-ATSα융합 단백질의 결실 돌연변이체들을 높은 농도 (0.6mg/ml)에서 10분간 100℃에서 열처리했을 때, ATSα의 모든 부위를 포함하는 GST-Syn96-140과 ATSα의 22개 아미노산부위를 포함하는 GST-Syn119-140은 열처리 후에도 전혀 침전이 되지 않았으나, ATSα의 11-13개의 아미노산만을 포함하는 GST-Syn103-115, GST-Syn114-126 및 GST-Syn130-140은 대부분 침전되고 일부만 수용액 중에 남아 있었다. 반면에 이들 GST-ATSα 융합 단백질의 결실 돌연변이체들을 낮은 농도 (0.2mg/ml)에서 같은 조건으로 열처리했을 때는 이들 모두 전혀 응집되지 않았다 (데이타 생략).

또한, 상기 GST-ATSα 결실돌연변이체들의 열반응성을 단백질의 농도를 0.2mg/ml로 고정시키고 65℃에서 경과시간에 따라 360nm에서 흡광도를 모니터링함으로써 정량적으로 분석하였다 (Lee G.J. and Vierling E., Method Enzymol., 290, 360-65 (1998); Horwitz J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10449-53 (1992)). 실험 결과, 도 10c에 나타낸 바와 같이 GST 단백질의 OD360은 열처리 후 2분이 지난 시점에서 극도로 증가하였고 3분이 지난 후에는 모두 응집되었다. 반면에 상기 GST-ATSα 결실돌연변이체들은 같은 조건하에서 10분간의 열처리 후에도 전혀 응집되지 않았다. 다음 실험으로 상기 GST-ATSα 결실돌연변이체들의 농도를 0.2m/ml에서 1.0mg/ml까지 변화시키면서 80℃에서 10분간 열처리한 후에 360nm에서 흡광도를 모니터링함으로써 정량적으로 분석하였다. 실험 결과, 도 12d에 나타낸 바와 같이 ATSα의 모든 부위를 포함하는 GST-Syn96-140과 ATSα의 22개 아미노산부위를 포함하는 GST-Syn119-140은 농도에 관계없이 열처리 후에 전혀 침전이 되지 않았으나, ATSα의 11-13개의 아미노산만을 포함하는 GST-Syn103-115, GST-Syn114-126 및 GST-Syn130-140은 낮은 농도에서는 전혀 침전이 되지 않았으나 농도가 높아질수록 응집되는 양이 증가하였다. 단백질의 응집이 농도에 비례한다는 사실은 주지의 사실이다. 이상의 결과를 종합해 보면, 이들 GST-ATSα 융합 단백질의 결실 돌연변이체들이 모두 야생형 GST에 비해 열에 대한 내성이 월등함을 보여주며, 흥미롭게도 ATSα의 길이에 따라 열에 대한 내성에 차이가 남을 보여준다. 따라서, 표적단백질의 크기 및 성질에 따라 ATSα의 길이를 적당히 선택하면 최적의 효과를 얻을 것으로 기대한다.

실시예 13

β-시누클레인 또는 γ-시누클레인의 C-말단 산성 꼬리 영역을 포함하는 GST-시누클레인 융합 단백질의 열에 대한 내성

인간에서 발견되는 β-시누클레인 및 γ-시누클레인도 α-시누클레인과 더불어 시누클레인 가족을 이루는 단백질 구성원으로 이들은 서로 아미노산 서열상 높은 유사성을 보인다. 특히, 시누클레인 N-말단 양친매성 영역은 가오리로부터 사람에 이르기까지 시누클레인 계열의 일원간에 강하게 보존되어 있다. 그러나, 시누클레인 계열의 일원간에 C-말단 산성 꼬리 영역은 그 크기와 서열이 매우 다양하다 (Lavedan C., Genome Research, 8, 871-880 (1998); Lucking C. B and Brice A. Cell Mol Life Sci, 57, 1894-1908 (2000); Iwai A. Biochem. Biophys. Acta, 1502, 95-109 (2000); Hashimoto M. and Masliah E. Brain Pathol. 9, 707-720 (1999)). 본 발명자들은 β-시누클레인의 산성꼬리(이하, ATSβ라함) 및 γ-시누클레인의 산성꼬리(이하, ATSγ라 함)영역을 포함하는 GST-ATSβ 및 GST-ATSγ 융합 단백질의 경우에도 열에 대한 내성을 보이는지를 조사하였다.

pGEX벡터에 ATSβ(잔기 85-134)와 ATSγ(잔기 96-127)를 각각 서브클로닝하여 GST-ATSβ 및 GST-ATSγ 융합 단백질을 제조하였다 (도 11a). 상기 ATSβ 단백질 코딩 영역은 밑줄친 BamHI 제한 부위를 포함하는 5'-올리고뉴클레오타이드 프라이머(서열번호 28)와 밑줄친 XhoI 제한 부위를 포함하는 3'-올리고뉴클레오티드 프라이머(서열번호 29)로 PCR 증폭하였다. ATSγ 단백질 코딩 영역은 밑줄친 BamHI 제한부위를 포함하는 5'-올리고뉴클레오타이드 프라이머(서열번호 30)와 밑줄친 EcoRI 제한 부위를 포함하는 3'-올리고뉴클레오티드 프라이머(서열번호 31)로 PCR 증폭하였다.

GST-ATSβ 및 GST-ATSγ의 제조에 사용된 프라이머

프라이머		핵산서열	서열번호
18	센스	AGCTAAGGATCCAAGAGGGAGGAATTCC	28
19	안티센스	AAGTAACTCGAGCTACGCCTCTGGCTCATA	29
20	센스	AAGAATGGATCCCGCAAGGAGGACTTGA	30
21	안티센스	AATAGCGAATTCCTAGTCTCCCCCACTCT	31

상기 증폭된 DNA를 겔 정제하고 적합한 효소로 소화한 다음 적합한 효소로 소화해둔 pGEX 벡터에 연결하고 겔 정제하였다. 상기 발현벡터 pGST-ATSβ 및 pGST-ATSγ의 서열을 DNA 시퀀싱으로 확인하였다. 발현 벡터 pGST-ATSβ 및 pGST-ATSγ를 E. coil BL21(DE3)에 형질전환하고 재조합 GST-시누클레인 융합 단백질 GST-ATSβ 및 GST-ATSγ를 글루타티온-세파로스 4B 비드를 사용한 친화성 컬럼크로마토그래피로 정제하였다. 상기 GST-시누클레인 융합 단백질을 FPLC 겔-여과 컬럼으로 더 정제하였다. 이렇게 작제된 GST-ATSβ 및 GST-ATSγ가 각각 열에 대한 내성을 보이는지를 조사하였다. 우선 PBS에 현탁된 각 단백질 시료(0.6mg/ml)를 10분간 끓는 수욕에서 열처리하고 방냉하였다. 상기 단백질 시료를 15,000rpm에서 10분간 원심분리한 다음 상등액을 12% SDS 폴리아크릴아미드 겔로 분석하였다. SDS 폴리아크릴아미드 겔에 나타난 단백질 밴드를 쿠마시 블릴난트 블루(Coomassie Brillinant blue) R250으로 염색하여 확인하였다. 실험 결과, 도 11b에서 나타낸 바와 같이, GST-ATSα뿐만 아니라 GST-ATSβ 및 GST-ATSγ도 열처리 후에 모두 단백질 밴드가 나타났으며 이로부터 열처리에 의해서 침전되지 않음을 알 수 있었다. 따라서, 상기 융합단백질은 매우 높은 내열성을 지님을 알 수 있었다.

또한, 상기 GST-ATS 융합단백질들의 열반응성을 단백질의 농도를 0.2mg/ml로 고정시키고 65℃에서 경과시간에 따라 360nm에서 흡광도를 모니터링함으로써 정량적으로 분석하였다 (Lee G.J. and Vierling E., Method Enzymol., 290, 360-65 (1998); Horwitz J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10449-53 (1992)). 실험 결과, 도 11c에 나타낸 바와 같이 GST 단백질은 2-3분이 지난 후에는 모두 응집되었다. 반면에 상기 GST-ATS 융합단백질들은 같은 조건하에서 10분간의 열처리 후에도 전혀 응집되지 않았다. 다음 실험으로 상기 GST-ATS 융합단백질들의 농도를 0.2m/ml에서 1.0mg/ml까지 변화시키면서 80℃에서 10분간 열처리한 후에 360nm에서 흡광도를 모니터링함으로써 정량적으로 분석하였다. 실험 결과, 도 11d에 나타낸 바와 같이 GST 단백질은 낮은 농도에서도 모두 응집된 반면, 상기 GST-ATS 융합단백질들은 같은 조건하에서 농도에 관계없이 열처리 후에도 거의 응집되지 않았다. 이상의 결과를 종합해 보면, ATSα뿐만 아니라 ATSβ와 ATSγ도 다른 단백질에 내열성을 부여할 수 있는 성질이 있는 펩타이드임을 알 수 있고, 이들을 환경스트레스에 내성을 갖는 융합단백질의 제조에 활용할 수 있음을 알 수 있다. 더불어, 시노레틴의 아미노산 서열이 γ-시누클레인과 매우 유사하기 때문에, 시노레틴의 산성 꼬리도 동일한 용도로 사용될 수 있으리라 추정된다.

실시예 14

폴리글루타메이트로 구성된 산성 꼬리를 포함하는 GST-폴리글루타메이트 융합단백질의 열에 대한 내성

시누클레인의 C-말단 산성꼬리 영역에는 Glu/Asp 잔기와 같이 음전하를 띠는 아미노산 잔기가 다수 분포되어 있는 특징이 있다. 본 발명자들은 마지막으로 폴리글루타메이트와 같이 순수하게 음전하를 띤 펩타이드 단편을 포함하는 GST-폴리글루타메이트 융합단백질도 열에 대한 내성을 갖는지 여부를 조사하였다. 이를 위해 pGEX 벡터에 폴리글루타메이트 유전자 부분을 연결하여 일련의 GST-폴리글루타메이트 융합단백질을 제조하였다 (도 12a). 폴리글루타메이트 펩타이드를 코딩하는 DNA는 자동 DNA 합성기를 사용하여 화학적으로 합성하였다 (표 6, 서열번호 32-35). 올리고뉴클레오타이드 서열번호 32과 33는 GST-E5 (글루타메이트 잔기 5개 포함)를 제작하기 위한 센스와 안티센스 DNA이며, 올리고뉴클레오타이드 서열번호 34와 35는 GST-E10 (글루타메이트 잔기 10개 포함)를 제작하기 위한 센스와 안티센스 DNA이다. 합성된 센스와 안티센스 DNA 짝을 각각 어닐링한 후 pGEX 벡터의 BamHI 및 EcoRI 제한 부위에 폴리글루타메이트 유전자 부분을 연결시킴으로써 일련의 GST-폴리글루타메이트 융합단백질을 지령하는 발현벡터를 제조하였다. 상기 모든 발현벡터 (pGST-E5와 pGST-E10)는 DNA 시퀀싱에 의해 그 서열을 확인하였다.

GST-폴리글루타메이트 융합 단백질의 제조에 사용된 프라이머

프라이머		핵산서열	서열번호
22	센스	GATCCGAAGAAGAAGAAGAATAA	32
23	안티센스	AATTCTTATTCTTCTTCTTCTTCG	33
24	센스	GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAATAAG	34
25	안티센스	AATTCTTATTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCG	35

발현벡터 pGST-E5 및 pGST-E10을 E.coli BL21(DE3)에 형질전환한 다음 재조합 단백질을 글루타티온-세파로스 4B 비드를 사용한 친화성 컬럼크로마토그래피로 정제하였다. 상기 GST-폴리글루타메이트 융합 단백질들을 FPLC 겔-여과 컬럼으로 더 정제한 다음 (도 12b), 각각 열에 대한 내성을 조사하였다. 우선 PBS에 현탁된 각 단백질 시료(0.6mg/ml)를 10분간 끓는 수욕에서 열처리하고 방냉하였다. 상기 단백질 시료를 15,000rpm에서 10분간 원심분리한 다음 상등액을 12% SDS 폴리아크릴아미드 겔로 분석하였다. 실험 결과, GST-E5와 GST-E10 융합단백질 모두 상기와 같은 열처리 후에 단백질 밴드가 사라졌으며 이로부터 열처리에 의해서 완전히 침전되었음을 알 수 있었다 (데이타 생략). 따라서, 상기 단백질은 이러한 극단적인 조건하에서는 내열성이 없음을 알 수 있었다.

또한, 상기 GST-폴리글루타메이트 융합단백질들의 열반응성을 단백질의 농도를 0.2mg/ml로 고정시키고 65℃에서 경과시간에 따라 360nm에서 흡광도를 모니터링함으로써 정량적으로 분석하였다 (Lee G.J. and Vierling E., Method Enzymol., 290, 360-65 (1998); Horwitz J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10449-53 (1992)). 실험 결과, 도 12c에 나타낸 바와 같이 GST 단백질은 65℃에서 2-3분이 지난 후에는 모두 응집되었고, GST-E5 융합단백질들도 같은 조건하에서 상당량이 응집된 반면, GST-E10 융합단백질은 65℃에서 10분간의 열처리 후에도 거의 응집되지 않았다. 다음 실험으로 상기 GST-폴리글루타메이트 융합단백질들의 농도를 0.2m/ml에서 1.0mg/ml까지 변화시키면서 80℃에서 10분간 열처리한 후에 360nm에서 흡광도를 모니터링함으로써 정량적으로 분석하였다. 실험 결과, 도 12d에 나타낸바와 같이 GST 단백질은 낮은 농도에서도 모두 응집되었고 GST-E5 융합단백질도 높은 농도에서는 대부분 응집되었다. 반면에, GST-E10 융합단백질들은 같은 조건하에서 열처리 후에 일부만 응집되었으며 농도가 높아질수록 응집되는 양이 현저하게 증가하는 양상을 나타내었다. 이상의 결과를 종합해 보면, 폴리글루타메이트의 길이가 늘어날수록 음전하가 증가하여 표적단백질에 열에 대한 내성을 부여하는 성질이 높아짐을 알 수 있다. 그러나 흥미롭게도 폴리글루타메이트 꼬리는 같은 숫자의 글루타메이트 잔기를 포함하는 ATS에 비해 열에 대한 내성을 부여하는 능력이 현저하게 떨어짐을 알 수 있다. 실제로 GST-Syn130-140이 같은 숫자의 글루타메이트 잔기를 포함하는 GST-E5보다 월등히 높은 내열성을 보이고 있고, 두 배나 많은 숫자의 글루타메이트 잔기를 포함하는 GST-E10보다도 오히려 약간 높은 내열성을 보이고 있다 (도 10d와 도 12d 비교). 따라서 ATS가 환경스트레스에 대한 내성을 보이는 기전은 단순한 음전하량의 증가에 의한 단백질의 수용성이 증가하는 것 이외에도 ATS의 독특한 아미노산 서열이 중요한 역할을 하고 있음을 추정할 수 있다. 아울러 본 발명자들은 흥미롭게도 양전하를 띠는 폴리-아르기닌과 같은 펩타이드는 열에 대한 내성을 부여하는 성질이 거의 없음을 관찰하여 (데이타 생략), ATS의 독특한 아미노산 서열이 환경스트레스에 대한 내성을 부여하는데 있어 매우 중요한 역할을 하고 있음을 뒷받침해 주는 결과를 얻었다.

시누클레인의 C-말단 산성 꼬리 (ATS)영역 펩타이드 또는 시누클레인의 C-말단 산성 꼬리영역의 아미노산 서열 중에서 10개 이상 50개 이하의 연속 아미노산 서열로 이루어지고 환경 스트레스에 대해 내성을 부여하는 펩타이드 또는 상기 펩타이드들을 포함하는 폴리펩타이드와 융합 파트너 단백질이 결합되어 형성된 환경 스트레스 내성 융합 단백질은 이의 구성 요소인 융합 파트너 단백질의 고유 성질을 유지하면서 각종 환경 스트레스에 대한 내성을 나타내기 때문에 의학, 생명공학, 식품 등의 많은 분야에서 산업적으로 매우 유용하게 사용될 것으로 기대된다.

도 1a는 N-말단 양친매성 영역(잔기 1-60), 소수성 NAC 영역(잔기 61-95) 및 C-말단 산성 꼬리(ATSα, 잔기 96-140)로 이루어진 α-시누클레인의 구성도이다.

도 1b는 열 불안정성 단백질 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)의 C-말단에 α-시누클레인 전체, 양친매성 영역, NAC 영역, NAC와 산성 꼬리 영역 및 산성 꼬리 영역의 펩타이드가 각각 결합되어 형성된 융합 단백질 GST-Syn1-140, GST-Syn1-60, GST-Syn61-95, GST-Syn61-140 및 GST-Syn96-140의 구성도이다.

도 2는 α-시누클레인과 GST 단백질의 열반응성을 보여주는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 결과이다(래인 1: 열처리하지 않은 α-시누클레인; 래인 2: 열처리하지 않은 GST; 래인 3: 열처리한 α-시누클레인; 래인 4: 열처리한 GST).

도 3은 GST-α-시누클레인 융합 단백질을 트롬빈으로 처리하여 생성된 α-시누클레인 결실 돌연변이체의 열반응성을 보여주는 SDS-PAGE 결과이다.

도 4a는 GST-α-시누클레인 융합 단백질을 끓이기 전(왼쪽 패널)과 후(오른쪽 패널)의 GST-α-시누클레인 융합 단백질의 열반응성을 보여주는 SDS-PAGE 결과이다(래인 1: GST-Syn1-140; 래인 2: GST-Syn1-60; 래인 3: GST-Syn61-95; 래인 4: GST-Syn61-140; 래인 5: GST-Syn96-140).

도 4b는 GST-α-시누클레인 융합 단백질들의 열에 의해 유도된 응집을 흡광도 측정값으로 나타낸 그래프이다.

도 5a는 GST-Syn1-140의 열에 의해 유도된 응집에 미치는 2가 양이온의 영향을 흡광도 측정값으로 나타낸 그래프이다.

도 5b는 GST-Syn61-140 및 GST-Syn96-140의 열에 의해 유도된 응집에 미치는 2가 양이온의 영향을 흡광도 측정값으로 나타낸 그래프이다.

도 6a는 GST와 GST-시누클레인 융합 단백질을 열처리하기 전과 열처리한 후의 GST 활성을 비교하기 위해 측정한 흡광도를 그래프로 나타낸 것이다(■: 열처리 전; □:열처리 후)

도 6b는 GST와 GST-시누클레인 융합 단백질의 온도변화에 따른 GST활성 (좌측)과 단백질응집 (우측)을 측정한 그래프이다(-●-: GST; -○-: GST-Syn96-140; 바는 표준편차를 나타냄).

도 7a는 GST의 극-UV CD 스펙트럼과 융점 곡선을 나타낸 그래프이다(삽입된 그래프는 222nm에서의 온도에 따른 GST 단백질의 몰농도 타원율의 평균을 나타낸 것이다).

도 7b는 GST-Syn96-140(B)의 극-UV CD 스펙트럼과 융점 곡선을 나타낸 그래프이다(실선: 25℃에서 측정; 점선: 100℃에서 측정; 괘선: 100℃에서 25℃로 냉각 후 측정).

도 8a는 pH에 의해 유도된 GST 및 GST-Syn96-140의 응집을 나타낸 그래프이다.

도 8b는 금속에 의해 유도된 GST 및 GST-Syn96-140의 응집을 나타낸 그래프이다.

도 9는 디하이드로폴레이트 리덕테이즈 (DHFR)와 DHFR-Syn96-140 융합 단백질을 열처리하기 전과 65℃와 100℃에서 각각 10분간 열처리한 후의 이들 단백질의 열반응성을 보여주는 SDS-PAGE 결과이다 (마지막 레인은 크기 마커 단백질임).

도 10a는 α-시누클레인의 C-말단 산성 꼬리 (ATSα) 영역 아미노산으로 구성된 펩타이드 단편을 포함하는 GST-ATSα 융합 단백질 결실돌연변이체들의 모식도이다.

도 10b는 ATSα로 구성된 펩타이드 단편을 포함하는 GST-ATSα융합 단백질 결실돌연변이체들을 0.6mg/ml 농도에서 끓이기 전 (위 패널)과 끓인 후 (아래 패널)의 열반응성을 보여주는 SDS-PAGE 결과이다.

도 10c는 GST-ATSα융합 단백질 결실돌연변이체들의 0.2mg/ml 농도에서 65℃ 열처리에 의해 유도된 응집을 흡광도 측정값으로 나타낸 그래프이다 (1: GST; 2: GST-Syn103-115; 3: GST-Syn114-126; 4: GST-Syn130-140; 5: GST-Syn119-140).

도 10d는 GST-ATSα융합 단백질 결실돌연변이체들의 0.2mg/ml-1.0mg/ml 농도구간에서 10 분간 80℃로 열처리한 후 유도된 응집을 흡광도 측정값으로 나타낸 그래프이다 (1: GST; 2: GST-Syn103-115; 3: GST-Syn114-126; 4: GST-Syn130-140; 5: GST-Syn119-140; 6: GST-Syn96-140).

도 11a는 α-시누클레인, β-시누클레인 또는 γ-시누클레인의 C-말단 산성 꼬리 영역 (ATSα, ATSβ또는 ATSγ)을 포함하는 GST-ATS 융합 단백질들의 모식도이다.

도 11b는 GST-ATS 융합 단백질들(GST-ATSα, GST-ATSβ 및 GST-ATSγ)을 0.6mg/ml 농도에서 10분간 끓인 후의 열반응성을 보여주는 SDS-PAGE 결과이다.

도 11c는 GST-ATS 융합 단백질들의 0.2mg/ml 농도에서 65℃ 열처리에 의해 유도된 응집을 흡광도 측정값으로 나타낸 그래프이다 (1: GST; 2: GST-ATSα; 3: GST-ATSβ; 4: GST-ATSγ).

도 11d는 GST-ATS 융합 단백질들의 0.2mg/ml-1.0mg/ml 농도구간에서 10 분간 80℃로 열처리한 후 유도된 응집을 흡광도 측정값으로 나타낸 그래프이다 (1: GST; 2: GST-ATSα; 3: GST-ATSβ; 4: GST-ATSγ).

도 12a는 폴리글루타메이트 꼬리를 포함하는 GST-폴리글루타메이트 융합 단백질들(GST-E5와 GST-E10)의 모식도이다.

도 12b는 정제된 GST-E5와 GST-E10 융합단백질들을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.

도 12c는 GST-E5와 GST-E10 융합 단백질들의 0.2mg/ml 농도에서 65℃ 열처리에 의해 유도된 응집을 흡광도 측정값으로 나타낸 그래프이다 (1: GST; 2: GST-E5; 3: GST-E10).

도 12d는 GST-E5와 GST-E10 융합 단백질들의 0.2mg/ml-1.0mg/ml 농도구간에서 10 분간 80℃로 열처리한 후 유도된 응집을 흡광도 측정값으로 나타낸 그래프이다 (1: GST; 2: GST-E5; 3: GST-E10).

<110> ATGEN CO., LTD. <120> Novel Peptides Conferring Environmental Stress Resistance And Fusion Proteins Including Said Peptides <160> 35 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 45 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(45) <223> Acidic tail amino acid sequence 96-140 of alpha-synuclein <400> 1 Lys Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly 1 5 10 15 Ile Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met 20 25 30 Pro Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala 35 40 45 <210> 2 <211> 50 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(50) <223> Acidic tail amino acid sequence 85-134 of beta-synuclein <400> 2 Lys Arg Glu Glu Phe Pro Thr Asp Leu Lys Pro Glu Glu Val Ala Gln 1 5 10 15 Glu Ala Ala Glu Glu Pro Leu Ile Glu Pro Leu Met Glu Pro Glu Gly 20 25 30 Glu Ser Tyr Glu Asp Pro Pro Gln Glu Glu Tyr Gln Glu Tyr Glu Pro 35 40 45 Glu Ala 50 <210> 3 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(32) <223> Acidic tail amino acid sequence 96-127 of gamma-synuclein <400> 3 Ala Lys Glu Asp Leu Arg Asp Ser Ala Pro Gln Gln Glu Gly Val Ala 1 5 10 15 Ser Lys Glu Lys Glu Glu Val Ala Glu Glu Ala Gln Ser Gly Gly Asp 20 25 30 <210> 4 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(32) <223> Acidic tail amino aicd sequence 96-127 of synoretin <400> 4 His Lys Glu Ala Leu Lys Gln Pro Val Pro Ser Gln Glu Asp Glu Ala 1 5 10 15 Ala Lys Ala Glu Glu Gln Val Ala Glu Glu Thr Lys Ser Gly Gly Asp 20 25 30 <210> 5 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-Syn96-140 fusion protein <400> 5 Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu 20 25 30 Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu 35 40 45 Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys 50 55 60 Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80 Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu 85 90 95 Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser 100 105 110 Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125 Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn 130 135 140 Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160 Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 165 170 175 Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr 180 185 190 Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala 195 200 205 Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg 210 215 220 Gly Ser Glu Ile Trp Met Lys Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu 225 230 235 240 Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp 245 250 255 Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu 260 265 270 Pro Glu Ala 275 <210> 6 <211> 308 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-Syn61-140 fusion protein <400> 6 Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu 20 25 30 Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu 35 40 45 Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys 50 55 60 Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80 Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu 85 90 95 Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser 100 105 110 Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125 Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn 130 135 140 Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160 Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 165 170 175 Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr 180 185 190 Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala 195 200 205 Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg 210 215 220 Gly Ser His Met Glu Gln Val Thr Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr 225 230 235 240 Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile 245 250 255 Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu 260 265 270 Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro 275 280 285 Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr 290 295 300 Glu Pro Glu Ala 305 <210> 7 <211> 367 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-Syn1-140 fusion protein <400> 7 Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu 20 25 30 Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu 35 40 45 Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys 50 55 60 Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80 Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu 85 90 95 Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser 100 105 110 Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125 Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn 130 135 140 Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160 Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 165 170 175 Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr 180 185 190 Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala 195 200 205 Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg 210 215 220 Gly Ser Ala Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu 225 230 235 240 Gly Val Val Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala 245 250 255 Ala Gly Lys Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys 260 265 270 Glu Gly Val Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu 275 280 285 Gln Val Thr Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val 290 295 300 Ala Gln Lys Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly 305 310 315 320 Phe Val Lys Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln 325 330 335 Glu Gly Ile Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr 340 345 350 Glu Met Pro Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala 355 360 365 <210> 8 <211> 829 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-Syn96-140 fusion protein <400> 8 atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60 ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120 tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180 ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240 atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300 gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360 gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420 acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480 gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540 aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600 tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660 ctggttccgc gtggatccga gatctggatg aaaaaggacc agttgggcaa gaatgaagaa 720 ggagccccac aggaaggaat tctggaagat atgcctgtgg atcctgacaa tgaggcttat 780 gaaatgcctt cttgaggaag ggtatcaaga ctacgaacct gaagcctaa 829 <210> 9 <211> 928 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-Syn61-140 fusion protein <400> 9 atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60 ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120 tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180 ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240 atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300 gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360 gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420 acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480 gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540 aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600 tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660 ctggttccgc gtggatctca tatggagcaa gtgacaaatg ttggaggagc agtggtgacg 720 ggtgtgacag cagtagccca gaagacagtg gagggagcag ggagcattgc agcagccact 780 ggctttgtca aaaaggacca gttgggcaag aatgaagaag gagccccaca ggaaggaatt 840 ctggaagata tgcctgtgga tcctgacaat gaggcttatg aaatgccttc ttgaggaagg 900 gtatcaagac tacgaacctg aagcctaa 928 <210> 10 <211> 1105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-Syn1-140 fusion protein <400> 10 atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60 ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120 tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180 ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240 atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300 gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360 gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420 acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480 gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540 aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600 tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660 ctggttccgc gtggatctgc catggatgta ttcatgaaag gactttcaaa ggccaaggag 720 ggagttgtgg ctgctgctga gaaaaccaaa cagggtgtgg cagaagcagc aggaaagaca 780 aaagagggtg ttctctatgt aggctccaaa accaaggagg gagtggtgca tggtgtggca 840 acagtggctg agaagaccaa agagcaagtg acaaatgttg gaggagcagt ggtgacgggt 900 gtgacagcag tagcccagaa gacagtggag ggagcaggga gcattgcagc agccactggc 960 tttgtcaaaa aggaccagtt gggcaagaat gaagaaggag ccccacagga aggaattctg 1020 gaagatatgc ctgtggatcc tgacaatgag gcttatgaaa tgccttcttg aggaagggta 1080 tcaagactac gaacctgaag cctaa 1105 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gcgctcgagc cagatctgcc atggatgtat tcatga 36 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gcgcaagctt gtcgacttag gcttcaggtt cgtagt 36 <210> 13 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gcgcaagctt gtcgacctat ttggtcttct cagccac 37 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gcgcagatct catatggagc aagtgaca 28 <210> 15 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gcgcaagctt gtcgacctag acttagccag tggc 34 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gcgcggtacc gagatctgga tgaaaaagga ccagttgggc 40 <210> 17 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gcgcaagctt gtcgacttag gcttcaggtt cgtagt 36 <210> 18 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gcgcggtacc aaggaccagt tgggcaagaa tg 32 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gcgcgtcgac ttaggcttca ggttcgtagt 30 <210> 20 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 gatccaatga agaaggagcc ccacaggaag gcattctgga agattaag 48 <210> 21 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 aattcttaat cttccagaat gccttcctgt ggggctcctt cttcattg 48 <210> 22 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gatccgaaga tatgcctgta gatcctgaca atgaggctta tgaataag 48 <210> 23 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 aattcttatt cataagcctc attgtcagga tctacaggca tatcttcg 48 <210> 24 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 gatccgatcc tgacaatgag gcttatgaaa tgccttctga ggaagggtat caagactacg 60 aacctgaagc ctaag 75 <210> 25 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 aattcttagg cttcaggttc gtagtcttga tacccttcct cagaaggcat ttcataagcc 60 tcattgtcag gatcg 75 <210> 26 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 gatccgagga agggtatcaa gactacgaac ctgaagccta ag 42 <210> 27 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 aattcttagg cttcaggttc gtagtcttga tacccttcct cg 42 <210> 28 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 agctaaggat ccaagaggga ggaattcc 28 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 aagtaactcg agctacgcct ctggctcata 30 <210> 30 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 aagaatggat cccgcaagga ggacttga 28 <210> 31 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 aatagcgaat tcctagtctc ccccactct 29 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 gatccgaaga agaagaagaa taa 23 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 aattcttatt cttcttcttc ttcg 24 <210> 34 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 gatccgaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaataag 39 <210> 35 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 aattcttatt cttcttcttc ttcttcttct tcttcttcg 39

Claims (19)

1. (삭제)
2. (삭제)
3. (삭제)
4. (정정)

   α-시누클레인의 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산잔기 103-115, 아미노산잔기 114-126, 아미노산잔기 119-140, 아미노산잔기 130-140, β-시누클레인의 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산잔기 85-134, γ-시누클레인 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산잔기 96-127 및 시노레틴의 C-말단 산성꼬리 영역 아미노산잔기 96-127 중에서 선택되는 환경 스트레스에 대해 내성을 부여하는 펩타이드.
5. (정정)

   제 4항에 있어서, 상기 시누클레인이 사람으로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 펩타이드.
6. (정정)

   제 4항에 있어서, 환경 스트레스가 열, pH 또는 금속이온인 펩타이드.
7. (정정)

   제 4항에 있어서, 시누클레인족의 C-말단 산성꼬리 영역이 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 펩타이드.
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. (정정)

    제 4항에 따른 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
15. 삭제
16. 서열번호 11과 서열번호 12의 염기쌍, 서열번호 11과 서열번호 13의 염기쌍, 서열번호 14와 서열번호 15, 서열번호 14와 서열번호 12의 염기쌍, 서열번호 16과 서열번호 17의 염기쌍, 서열번호 18과 서열번호 19의 염기쌍, 서열번호 20과 서열번호 21의 염기쌍, 서열번호 22과 서열번호 23의 염기쌍, 서열번호 24과 서열번호 25의 염기쌍, 서열번호 26과 서열번호 27의 염기쌍, 서열번호 28과 서열번호 29의 염기쌍, 서열번호 30과 서열번호 31의 염기쌍, 서열번호 32과 서열번호 33의 염기쌍 및 서열번호 34과 서열번호 35의 염기쌍으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 환경 스트레스 내성 융합단백질을 코딩하는 DNA를 검출하기 위한 프라이머 쌍.
17. 제 14항에 따른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터.
18. 제 17항에 따른 재조합 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포.
19. 삭제