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JP2021524852A - 抗ｍｕｃ１抗体−薬物コンジュゲート - Google Patents

抗ｍｕｃ１抗体−薬物コンジュゲート Download PDF

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JP2021524852A JP2020564569A JP2020564569A JP2021524852A JP 2021524852 A JP2021524852 A JP 2021524852A JP 2020564569 A JP2020564569 A JP 2020564569A JP 2020564569 A JP2020564569 A JP 2020564569A JP 2021524852 A JP2021524852 A JP 2021524852A
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Abstract

本開示は、がん抗原ＭＵＣ１に対する抗体薬物コンジュゲートに関する。特に、公知の抗ＭＵＣ１抗体のＣＤＲ−Ｈ２にあるグリコシル化部位を欠失させることより、抗原結合が向上された抗体が得られた。コンジュゲートは、抗ＭＵＣ１抗体にカップリングされたエキサテキカン誘導体からなる。【選択図】なし

Description

本発明は、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の分野に関する。本発明のＡＤＣは、抗ＭＵＣ１抗体または突然変異抗ＭＵＣ１抗体を含む。抗原結合親和性が増加された突然変異抗ＭＵＣ１抗体を有するＡＤＣが提供される。特に、ヒト化抗体ＰａｎｋｏＭａｂの突然変異型では、重鎖可変領域のアスパラギン５７が別のアミノ酸により置換されている。それにより、ＣＤＲ２領域のグリコシル化部位が欠失され、抗原結合親和性が増加される。ＡＤＣは、有意な抗腫瘍有効性を示した。具体的な実施形態では、本発明は、この抗体薬物コンジュゲートの治療使用および診断使用、ならびにそのような抗体薬物コンジュゲートを産生する方法に関する。
腫瘍関連抗原に対する抗体は、広く使用されている抗がん療法剤である。今日、多くの抗がん抗体がヒト療法に承認されている。こうした抗体の一部は、特定のがん細胞の生存または増殖に重要な、ある特定のシグナル経路を阻止することにより作用する。他の抗がん抗体は、例えば、ナチュラルキラー細胞を介して抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を惹起することにより、標的がん細胞に対する患者の免疫応答を活性化する。この機序は、抗体のＦｃ部分が免疫細胞のＦｃ受容体に結合することにより誘導される。
興味深く重要な抗体の群は、ムチンタンパク質に対する抗体である。ムチンは、脊椎動物の多くの上皮組織により産生される、高分子量であり高度にグリコシル化されているタンパク質のファミリーである。ムチンは、原形質膜での保留に有利な疎水性膜貫通ドメインが存在するため膜結合性であるムチンタンパク質と、粘膜表面に分泌されるかまたは分泌されて唾液の成分となるムチンとに細分化することができる。ヒトムチンタンパク質ファミリーは、膜結合型ＭＵＣ１を含む多くのファミリーメンバーで構成される。
ムチン産生の増加は、膵臓、肺、胸部、卵巣、結腸などのがんを含む多くの腺癌で生じる。ムチンは、喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、または嚢胞性線維症などの肺疾患でも過剰発現される。２つの膜ムチンＭＵＣ１およびＭＵＣ４は、疾患プロセスにおける病理学的関連が広範に研究されている。さらに、ムチンは、診断マーカーとしての可能性も調査されている。ムチンタンパク質に対する幾つかの抗体（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２０１１年１１月１日；１７巻（２１号）：６８２２〜３０ページ、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、２０１１年１月１４日；６巻（１号）：ｅ１５９２１）、特にＭＵＣ１が当技術分野で公知である。しかしながら、それらの治療有効性には依然として向上の余地があり得る。
以上の観点から、当技術分野には、特性が向上された治療用抗ＭＵＣ１抗体を提供する必要性が存在する。
ＡＤＣは、ペイロードを標的細胞へと特異的に送達することを担う３つの異なる成分（抗体、リンカー、および薬物／ペイロード）からなる。現在まで、４つのＡＤＣ（ゲムツズマブオゾガミシン（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標））、イノツズマブオゾガマイシン（Ｂｅｓｐｏｎｓａ（登録商標））、ブレンツキシマブベドチン（Ａｄｃｅｔｒｉｓ（登録商標））、トラスツズマブエムタンシン（Ｔ−ＤＭ１；Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標））が、市場への参入を獲得している。加えて、幅広い範囲の血液がんおよび固形腫瘍を標的とする６０個よりも多くのＡＤＣが開発中である。ＡＤＣは、新規がん化学療法の新しいパラダイムを創出した。モノクローナル抗体の特異性および低分子薬物の細胞傷害能力を有するため、ＡＤＣは、将来の精密医療ならびに組合せ治療の大部分を占めると有望視されている。したがって、さらなるＡＤＣを提供するための、ならびに疾患の治療および／または診断に関する手段、方法、および使用のための必要性が継続している。
ＡＤＣとして、エキサテキカンがリンカーを介して抗体（例えば、抗ＨＥＲ２抗体）にコンジュゲートされているＡＤＣが公知である（ＷＯ２０１４／０５７６８７、ＷＯ２０１５／１１５０９１）。しかしながら、エキサテキカンが抗ＭＵＣ１抗体にコンジュゲートされているＡＤＣは公知ではない。
本発明者らは、抗ＭＵＣ１抗体ＰａｎｋｏＭａｂの重鎖可変領域のグリコシル化部位欠失が、抗原結合を消失させず、むしろ意外にも抗体の抗原親和性を増加させたことを見出した。これは、グリコシル化部位が重鎖可変領域の第２の相補性決定領域（ＣＤＲ−Ｈ２）に位置するため、特に驚くべきことだった。ＣＤＲは、抗原結合に直接関与しエピトープとの接触を提供する抗体の領域である。したがって、一般には、ＣＤＲのアミノ酸の修飾は、抗原結合親和性に有害であることが予想される。加えて、ヒト化ＰａｎｋｏＭａｂ抗体は、大型炭水化物構造を保持するグリコシル化部位をＣＤＲ−Ｈ２に含む。この炭水化物構造は、抗原に対する結合インターフェースに直に存在するため、抗原結合に関与するとみなされていた。しかしながら、実施例にて実証されているように、炭水化物構造を保持するアミノ酸を置換することによりグリコシル化部位が欠失されているＰａｎｋｏＭａｂ変異体（ＰＭ−Ｎ５４Ｑ）は、抗原結合親和性の増加を示す。加えて、本発明者らは、ＰａｎｋｏＭａｂまたはＰａｎｋｏＭａｂ変異体（ＰＭ−Ｎ５４Ｑ）を含むコンジュゲートまたは抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）が、ＭＵＣ１陽性腫瘍に対して有意な抗腫瘍有効性を示し、ＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣが、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣと比較して有意な抗腫瘍有効性を示したことを見出した。
したがって、第１の態様では、本発明は、細胞傷害剤にコンジュゲートされた抗体を含むコンジュゲートであって、抗体は、ＭＵＣ１に結合することが可能であり、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、ならびに
（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域
を含む、コンジュゲートに関する。
第２の態様では、本発明は、本発明によるコンジュゲートを含む組成物に関する。
第３の態様によると、本発明は、医薬において、特にがんの治療、予防、または診断において使用するための本発明による組成物またはコンジュゲートを提供する。
第４の態様では、本発明は、それを必要とする対象のがんを治療するための方法であって、がんを有する対象に、本発明によるコンジュゲートの治療有効量を投与するステップを含む方法を提供する。
第５の態様では、本発明は、本発明によるコンジュゲートを含むキットまたはデバイス、ならびにがんなどのＭＵＣ１関連障害の診断、検出、またはモニタリングに有用な関連方法を提供する。
本発明の他の目的、特徴、利点、および態様は、当業者であれば、以下の説明および添付の特許請求の範囲から明白になるだろう。しかしながら、以下の説明、添付の特許請求の範囲、および特定の例は、本出願の好ましい実施形態を示すものであるが、例示のために提供されているに過ぎないことが理解されるべきである。本開示の発明の趣旨および範囲内にある種々の変更および改変は、当業者であれば、下記を読めば直ちに明白になるだろう。
定義
本明細書で使用される場合、以下の表現は、一般に、それらが使用される状況が別様に示す場合を除いて、好ましくは、下記に示されているような意味を有することが意図されている。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という表現は、本明細書で使用される場合、その文字通りの意味の他に、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」も含み、それらを具体的に指す。したがって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という発現は、主題が、具体的に列挙されている要素を「含み（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、さらなる要素を含まない実施形態を指し、ならびに具体的に列挙されている要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」主題が、さらなる要素を包含してもよくおよび／または実際に包含する実施形態を指す。同様に、「有する（ｈａｖｅ）」という表現は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」として理解されるべきであり、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」という表現も含み、それらを具体的に指す。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語は、可能な場合、特に、主題がそれらから本質的になる具体的に列挙されている要素に加えて、主題が、２０％もしくはそれよりも少ない、特に１５％もしくはそれよりも少ない、１０％もしくはそれよりも少ない、または特に５％もしくはそれよりも少ないさらなる要素を含む実施形態を指す。
「抗体」という用語は、特に、ジスルフィド結合により接続されている少なくとも２つの重鎖および２つの軽鎖を含むタンパク質を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成される。重鎖定常領域は、３つの、またはＩｇＭ型もしくはＩｇＥ型の抗体の場合は、４つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）を含み、第１の定常ドメインＣＨ１は可変領域に隣接しており、ヒンジ領域により第２の定常ドメインＣＨ２に接続されていてもよい。軽鎖定常領域は、１つの定常ドメインのみからなる。可変領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と名付けられているより保存されている領域に分散されている、相補性決定領域（ＣＤＲ）と名付けられている超可変性領域にさらに細分化することができ、各可変領域は、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含む。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。重鎖定常領域は、γ型、δ型、α型、μ型、またはε型重鎖など、任意の型であってもよい。好ましくは、抗体の重鎖は、γ鎖である。また、さらに、軽鎖定常領域は、κ型またはλ型軽鎖など、任意の型であってもよい。好ましくは、抗体の軽鎖は、κ鎖である。「γ（δ、α、μ、またはε）型重鎖」および「κ（λ）型軽鎖」という用語は、それぞれ、天然に存在する重鎖または軽鎖定常領域アミノ酸配列、特にヒト重鎖または軽鎖定常領域アミノ酸配列に由来する定常領域アミノ酸配列を有する抗体重鎖または抗体軽鎖を指す。特に、γ型（特にγ１型）重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列は、ヒトγ（特にヒトγ１）抗体重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列と少なくとも９５％、特に少なくとも９８％同一である。さらに、κ型軽鎖の定常ドメインのアミノ酸配列は、特に、ヒトκ抗体軽鎖の定常ドメインのアミノ酸配列と少なくとも９５％、特に少なくとも９８％同一である。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介することができる。抗体は、例えば、ヒト化抗体、ヒト抗体、またはキメラ抗体であってもよい。
抗体の抗原結合性部分は、通常、抗原と特異的に結合する能力を維持する抗体の全長または１つもしくは複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片により実施され得ることが示されている。抗体の結合性断片の例としては、以下のものが挙げられる：ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；各々が同じ抗原に結合する２つのＦａｂ断片を含み、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結されている二価断片であるＦ（ａｂ）２断片；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；およびＶＨドメインからなるｄＡｂ断片。
抗体の「Ｆａｂ部分」は、特に、重鎖および軽鎖可変領域（ＶＨおよびＶＬ）ならびに重鎖および軽鎖定常領域の第１のドメイン（ＣＨ１およびＣＬ）を含む抗体の部分を指す。抗体がこうした領域のすべてを含む訳ではない場合、「Ｆａｂ部分」という用語は、抗体に存在する領域ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１、およびＣＬのものを指すに過ぎない。好ましくは、「Ｆａｂ部分」は、天然抗体をパパインで消化することにより得られる、抗体の抗原結合活性を含む断片に対応する抗体の部分を指す。特に、抗体のＦａｂ部分は、その抗原結合部位または抗原結合能力を包含する。好ましくは、Ｆａｂ部分は、少なくとも抗体のＶＨ領域を含む。
抗体の「Ｆｃ部分」は、特に、重鎖定常領域２、３、および該当する場合は４（ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）を含む抗体の部分を指す。特に、Ｆｃ部分は、こうした領域の各々のうち２つを含む。抗体がこうした領域のすべてを含む訳ではない場合、「Ｆａｂ部分」という用語は、抗体に存在する領域ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４のものを指すに過ぎない。好ましくは、Ｆｃ部分は、少なくとも抗体のＣＨ２領域を含む。好ましくは、「Ｆｃ部分」は、天然抗体をパパインで消化することにより得られる、抗体の抗原結合活性を含まない断片に対応する抗体の部分を指す。特に、抗体のＦｃ部分は、Ｆｃ受容体に結合することが可能であり、したがって、例えば、Ｆｃ受容体結合部位またはＦｃ受容体結合能力を含む。
「抗体」および「抗体構築物」という用語は、本明細書で使用される場合、ある特定の実施形態では、それぞれ同じ種類の抗体または抗体構築物の集団を指す。特に、集団中の抗体または抗体構築物はすべて、抗体または抗体構築物を規定するために使用される特徴を示す。ある特定の実施形態では、集団中の抗体または抗体構築物はすべて、同じアミノ酸配列を有する。ＭＵＣ１と特異的に結合することが可能な抗体など、特定の種類の抗体への参照は、特に、その種類の抗体の集団を指す。
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、前記抗体の断片および誘導体も含む。特に、抗体の「断片または誘導体」は、前記抗体に由来し、同じ抗原に、特に同じエピトープに抗体として結合可能であるタンパク質または糖タンパク質である。したがって、抗体の断片または誘導体は、本明細書では一般に、機能性断片または誘導体を指す。特に好ましい実施形態では、抗体の断片または誘導体は、重鎖可変領域を含む。抗体の抗原結合機能は、全長抗体またはその誘導体の断片により実施され得ることが示されている。抗体の断片の例としては、以下のものが挙げられる：（ｉ）可変領域ならびに各重鎖および軽鎖の第１の定常ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域にてジスルフィド架橋により連結されている２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ）２断片；（ｉｉｉ）可変領域および重鎖の第１の定常ドメインＣＨ１からなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームの重鎖および軽鎖可変領域からなるＦｖ断片；（ｖ）単一のポリペプチド鎖からなるＦｖ断片であるｓｃＦｖ断片；（ｖｉ）共有結合で共に連結されている２つのＦｖ断片からなる（Ｆｖ）２断片；（ｖｉｉ）重鎖可変ドメイン；ならびに（ｖｉｉｉ）重鎖および軽鎖可変領域の付随が分子間でのみ生じ得るが分子内では生じ得ないように共有結合で共に連結されている重鎖可変領域および軽鎖可変領域からなるマルチボディ（ｍｕｌｔｉｂｏｄｙ）。抗体の誘導体は、特に、親抗体と同じ抗原に結合するかまたはそれと競合するが、それが由来する親抗体とは異なるアミノ酸配列を有する抗体が挙げられる。こうした抗体断片および抗体誘導体は、当業者に公知の従来技法を使用して得られる。
標的アミノ酸配列は、標的アミノ酸配列が、その長さ全体にわたって参照アミノ酸配列の対応する部分と少なくとも７５％、より好ましくは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性または同一性を共有する場合、参照アミノ酸配列に「由来する」または「対応する」。「対応する部分」は、例えば、標的抗体の重鎖可変領域（ＦＲＨ１）のフレームワーク領域１が、参照抗体の重鎖可変領域のフレームワーク領域１に対応することを意味する。特定の実施形態では、参照アミノ酸配列に「由来する」または「対応する」標的アミノ酸配列は、その長さ全体にわたって、参照アミノ酸配列の対応する部分と１００％相同性であるか、または特に１００％同一である。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の「相同性」または「同一性」は、好ましくは、参照配列の長さ全体にわたって、または相同性もしくは同一性が規定される配列に対応する参照配列の対応する部分の長さ全体にわたって、本発明により決定される。具体的なＣＤＲ配列または具体的な可変領域配列などの１つまたは複数のアミノ酸配列により規定される親抗体に由来する抗体は、特に、親抗体の対応するアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同性または同一であり、特に同一である、ＣＤＲ配列または可変領域配列などのアミノ酸配列を有する抗体である。ある特定の実施形態では、親抗体に由来する抗体（つまり、その誘導体）は、親抗体と同じＣＤＲ配列を含むが、可変領域の残りの配列が異なる。
また、「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、多価および多特異性抗体、つまり、各々が同じエピトープに結合する２つよりも多くの結合部位を有する抗体構築物、ならびに第１のエピトープに結合する１つまたは複数の結合部位、および第２のエピトープに結合する１つまたは複数の結合部位、および任意選択でさらなるエピトープに結合するさらなる結合部位さえ有する抗体構築物を指す。
「特異的結合」は、好ましくは、抗体などの作用剤が、別の標的との結合と比較して特異的であるエピトープなどの標的に対してより強力に結合することを意味する。結合が特異的か否かを決定するための基準の例としては、解離定数（本明細書では「ＫＤ」と呼ばれる）を挙げることができる。作用剤は、第２の標的の解離定数よりも低い解離定数（Ｋｄ）で第１の標的に結合する場合、第２の標的と比較して第１の標的により強力に結合する。好ましくは、作用剤が特異的に結合する標的の解離定数は、作用剤が特異的に結合しない標的の解離定数よりも、１００倍、２００倍、５００倍、または１０００倍より低い。さらに、「特異的結合」という用語は、特に、結合パートナー間の結合親和性を示し、親和性定数Ｋａは、少なくとも１０６Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０７Ｍ−１、より好ましくは少なくとも１０８Ｍ−１である。ある特定の抗原に対して特異的な抗体は、特に、少なくとも１０６Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０７Ｍ−１、より好ましくは少なくとも１０８Ｍ−１のＫａを有する親和性で、前記抗原に結合することが可能である抗体を指す。例えば、「抗ＭＵＣ１抗体」という用語は、特に、ＭＵＣ１と特異的に結合し、好ましくは、少なくとも１０６Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０７Ｍ−１、より好ましくは少なくとも１０８Ｍ−１のＫａを有する親和性でＭＵＣ１に結合することが可能な抗体を指す。
「ＭＵＣ１」という用語は、ムチン−１、多形性上皮ムチン（ＰＥＭ）、またはがん抗原１５−３としても知られているタンパク質ＭＵＣ１、特にヒトＭＵＣ１（アクセッション番号Ｐ１５９４１）を指す。ＭＵＣ１は、ムチンファミリーのメンバーであり、膜結合グリコシル化リンタンパク質をコードする。ＭＵＣ１は、１２０〜２２５ｋＤａのコアタンパク質質量を有し、この質量は、グリコシル化されると２５０〜５００ｋＤａに増加する。ＭＵＣ１は、細胞の表面を越えて２００〜５００ｎｍ伸長する。このタンパク質は、多くの上皮細胞の頂端表面に膜貫通ドメインにより係留されている。細胞外ドメインは、２０アミノ酸可変数タンデムリピート（ＶＮＴＲ、２０ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｖａｒｉａｂｌｅ ｎｕｍｂｅｒ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ）ドメインを含み、リピート数は、個体が異なれば２０から１２０までと様々である。こうしたリピートは、高度なＯ−グリコシル化を可能にするセリン残基、トレオニン残基、およびプロリン残基に富む。ある特定の実施形態では、「ＭＵＣ１」という用語は、腫瘍関連ＭＵＣ１（「ＴＡ−ＭＵＣ１」）を指す。ＴＡ−ＭＵＣ１は、がん細胞上に存在するＭＵＣ１である。このＭＵＣ１は、発現レベルが非常により高く、局在化されており、グリコシル化されている点で、非がん細胞上に存在するＭＵＣ１とは異なる。特に、ＴＡ−ＭＵＣ１は、がん細胞の細胞表面全体にわたって無極性的に存在するが、非がん細胞では、ＭＵＣ１は厳密に頂端性の発現を示すため、全身性に投与される抗体ではアクセスできない。さらに、ＴＡ−ＭＵＣ１は、ＭＵＣ１タンパク質骨格にある新しいペプチドエピトープ、およびトムゼン−フリーデンライヒ抗原アルファ（ＴＦα）などの新しい炭水化物腫瘍抗原を露出させる異常なＯ−グリコシル化を有する。
「ＴＦα」は、トムゼン−フリーデンライヒ抗原アルファまたはコア−１とも呼ばれ、癌細胞中のタンパク質のヒドロキシアミノ酸セリンまたはトレオニンに対してアルファ−アノマー配置でＯ−グリコシド連結されている二糖Ｇａｌ−β１，３−ＧａｌＮＡｃを指す。
「シアル酸」という用語は、特に、ノイラミン酸の任意のＮ−またはＯ−置換誘導体を指す。この用語は、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸および５−Ｎ−グリコリルノイラミン酸の両方を指すことができるが、好ましくは５−Ｎ−アセチルノイラミン酸のみを指す。シアル酸、特に、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸は、好ましくは、２，３−または２，６−連結により炭水化物鎖に付着されている。好ましくは、本明細書に記載の抗体には、２，３−ならびに２，６−カップリングシアル酸が両方とも存在する。
本発明による「グリカンの相対量」は、それぞれ、抗体調製物の抗体にまたは抗体を含む組成物中の抗体に付着されたグリカンの特定のパーセンテージまたはパーセンテージ範囲を指す。特に、グリカンの相対量は、抗体に含まれる、したがって抗体調製物中のまたは抗体を含む組成物中の抗体のペプチド鎖に付着されているすべてのグリカンの特定のパーセンテージまたはパーセンテージ範囲を指す。グリカンの１００％は、それぞれ、抗体調製物の抗体にまたは抗体を含む組成物中の抗体に付着されているすべてのグリカンを指す。例えば、二分ＧｌｃＮＡｃを保持するグリカンの相対量が１０％であることは、抗体に含まれている、したがって前記組成物中の抗体ポリペプチド鎖に付着されているすべてのグリカンの１０％は、二分ＧｌｃＮＡｃ残基を含むが、抗体に含まれている、したがって前記組成物中の抗体ポリペプチド鎖に付着されているすべてのグリカンの９０％は、二分ＧｌｃＮＡｃ残基を含まない、抗体を含む組成物を指す。１００％に相当するグリカンの対応する基準量は、組成物中の抗体に付着されているすべてのグリカン構造であるか、またはすべてのＮ−グリカン、つまり組成物中の抗体のアスパラギン残基に付着されているすべてのグリカン構造、またはすべての複合型グリカンのいずれであってもよい。グリカン構造の基準群は、一般に、明示的に示されるか、または当業者であれば状況から直接的に推定可能である。
「Ｎ−グリコシル化」という用語は、タンパク質のポリペプチド鎖のアスパラギン残基に付着されているすべてのグリカンを指す。こうしたアスパラギン残基は、一般に、アミノ酸配列Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（式中、Ｘａａは、プロリンを除く任意のアミノ酸であってもよい）を有するＮ−グリコシル化部位の一部である。同様に、「Ｎ−グリカン」は、ポリペプチド鎖のアスパラギン残基に付着されているグリカンである。「グリカン」、「グリカン構造」、「炭水化物」、「炭水化物鎖」、および「炭水化物構造」という用語は、本明細書では、一般に同義的に使用される。Ｎ−グリカンは、一般に、構造Ｍａｎα１，６−（Ｍａｎα１，３−）Ｍａｎβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１，４−ＧｌｃＮＡｃβ１−Ａｓｎを有し、Ａｓｎはポリペプチド鎖のアスパラギン残基である、２つのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基および３つのマンノース残基からなる共通コア構造を有する。Ｎ−グリカンは、３つの異なる型、すなわち複合型グリカン、ハイブリッド型グリカン、高マンノース型グリカンに細分化される。
本明細書に示されている数値、特に、具体的なグリコシル化特性の相対量は、好ましくは概数として理解されるべきである。特に、数値は、好ましくは、最大で１０％より高くおよび／またはより低く、特に最大で９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％より高くおよび／またはより低くてもよい。
用語「抗体薬物コンジュゲート」（ＡＤＣ）または「コンジュゲート」は、本明細書で使用される場合、一般に、抗体またはその抗原結合性断片と、化学療法剤、毒素、免疫療法剤、およびイメージングプローブなどの別の作用剤とが連結されていることを指す。連結は、共有結合であってもよく、または静電力などによる非共有結合相互作用であってもよい。当技術分野で公知であり、本明細書に記載されている種々のリンカーを、抗体薬物コンジュゲートを形成するために使用することができる。加えて、抗体薬物コンジュゲートは、免疫コンジュゲートをコードするポリヌクレオチドから発現させることができる融合タンパク質の形態で提供することができる。本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」は、元々は別々のタンパク質（ペプチドおよびポリペプチドを含む）をコード化していた２つまたはそれよりも多くの遺伝子または遺伝子断片を接合することにより創出されるタンパク質を指す。融合遺伝子の翻訳は、元のタンパク質の各々に由来する機能的特性を有する単一のタンパク質をもたらす。
「コンジュゲート」においては、２つまたはそれよりも多くの化合物が共に連結されている。ある特定の実施形態では、各化合物の特性の少なくとも一部が、コンジュゲートにおいて維持される。連結は、共有結合または非共有結合により達成することができる。好ましくは、コンジュゲートの化合物は、共有結合により連結されている。コンジュゲートの異なる化合物は、化合物の原子間の１つまたは複数の共有結合を介して互いに直接結合されていてもよい。その代わりに、化合物は、リンカー分子などの化学部分を介して互いに結合されていてもよく、リンカーは化合物の原子に共有結合で付着されている。コンジュゲートが２つよりも多くの化合物で構成されている場合、そうした化合物は、例えば、１つが次の化合物に付着されているか、または幾つかの化合物が各々１つの中央化合物に付着されていてもよい鎖コンフォメーションで連結されていてもよい。
「核酸」という用語は、一本鎖および二本鎖の核酸ならびにリボ核酸およびデオキシリボ核酸を含む。核酸は、天然に存在するならびに合成のヌクレオチドを含んでいてもよく、例えば、メチル化、５’−キャッピング、および／または３’−キャッピングにより、天然でまたは合成的に修飾されていてもよい。
「発現カセット」という用語は、特に、その中に導入されたコード核酸配列の発現を可能にし、調節することが可能な核酸構築物を指す。発現カセットは、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、および遺伝子の転写またはｍＲＮＡの翻訳を調節する他の制御エレメントを含んでいてもよい。発現カセットの正確な構造は、種または細胞タイプの関数として変動してもよいが、一般に、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、およびＣＡＡＴ配列など、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する５’−非転写配列ならびに５’−および３’−非翻訳配列を含む。より詳しくは、５’−非転写発現制御配列は、作動可能に接続した核酸の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。また、発現カセットは、エンハンサー配列または上流活性化因子配列を含んでいてもよい。
本発明によると、「プロモーター」という用語は、発現させようとする核酸配列の上流（５’）に位置し、ＲＮＡポリメラーゼの認識および結合部位を提供することにより配列の発現を制御する核酸配列を指す。「プロモーター」は、遺伝子の転写調節に関与するさらなる因子のさらなる認識および結合部位を含んでいてもよい。プロモーターは、原核生物遺伝子または真核生物遺伝子の転写を制御することができる。さらに、プロモーターは「誘導可能」であってもよく、つまり誘導剤に応答して転写を開始させてもよく、または転写が誘導剤により制御されない場合は、「構成的」であってもよい。誘導剤が存在しない場合、誘導可能なプロモーターの制御下にある遺伝子は発現されないか、または少ない程度にしか発現されない。誘導剤が存在すると、遺伝子のスイッチがオンになるか、または転写レベルが増加する。これは、一般に、特定の転写因子が結合することにより媒介される。
「ベクター」という用語は、本明細書ではその最も一般的な意味で使用され、例えば、核酸の原核細胞および／または真核細胞への導入および適切な場合はゲノムへの組込みを可能にする、前記核酸のための任意の媒介性ビヒクルを含む。この種類のベクターは、好ましくは、細胞にて複製および／または発現される。ベクターは、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージ、またはウイルスゲノムを含む。「プラスミド」という用語は、本明細書で使用される場合、一般に、染色体ＤＮＡとは独立して複製することができる染色体外遺伝物質の構築物、通常は環状ＤＮＡ二重鎖に関する。
本発明によると、「宿主細胞」という用語は、外因性核酸で形質転換またはトランスフェクトすることができる任意の細胞に関する。「宿主細胞」という用語は、本発明によると、原核細胞（例えば、大腸菌）または真核細胞（例えば、哺乳動物細胞、特にヒト細胞、酵母細胞、および昆虫細胞）を含む。ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギ、または霊長類に由来する細胞などの哺乳動物細胞が特に好ましい。細胞は、多数の組織タイプに由来してもよく、初代細胞および細胞株を含む。核酸は、単一のコピーまたは２つもしくはそれよりも多くのコピーの形態で宿主細胞に存在してもよく、一実施形態では、宿主細胞にて発現される。
「患者」という用語は、本発明によると、ヒト、非ヒト霊長類、または別の動物、特にウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、またはマウスおよびラットなどのげっ歯動物などの哺乳動物を意味する。特に好ましい実施形態では、患者はヒトである。
本発明による「がん」という用語は、特に、白血病、半水癌、黒色腫、癌腫、奇形腫、リンパ腫、肉腫、中皮腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、副腎がん、甲状腺がん、血液がん、皮膚がん、脳がん、子宮頸がん、腸管がん（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、肝臓がん、結腸がん、胃がん、腸がん（ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部がん、消化管がん、リンパ節がん、食道がん、結腸直腸がん、膵がん、耳鼻咽喉（ＥＮＴ）がん、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、子宮がん、卵巣がん、および肺がん、ならびにそれらの転移を含む。また、本発明によるがんという用語は、がん転移を含む。
用語「腫瘍」は、誤調節された細胞増殖により形成される一群の細胞または組織を意味する。腫瘍は、構造組織化および正常組織との機能的協調の部分的または完全な欠如を示す場合があり、通常は個別の組織塊を形成し、良性または悪性のいずれであってもよい。
用語「腫瘍」および「がん」は、同義的に使用される。
用語「転移」は、その元の部位から身体の別の部分へのがん細胞の伝搬を意味する。転移の形成は、非常に複雑なプロセスであり、通常は、がん細胞が原発腫瘍から脱離すること、身体循環に進入すること、および身体の他所の正常組織内に定着して増殖することを含む。腫瘍細胞が転移する場合、新しい腫瘍は、二次腫瘍または転移腫瘍と呼ばれ、その細胞は、通常は元の腫瘍中の細胞に類似する。これは、例えば、乳がんが肺に転移する場合、二次腫瘍は、異常な肺細胞ではなく異常な乳房細胞で構成されることを意味する。その場合、肺の腫瘍は、肺がんではなく転移性乳がんと呼ばれる。
「医薬組成物」という用語は、特に、ヒトまたは動物への投与に好適な組成物、つまり薬学的に許容される成分を含む組成物を指す。好ましくは、医薬組成物は、担体、希釈剤、または緩衝剤、保存剤、および張度調節剤などの医薬賦形剤と共に、活性化合物またはその塩もしくはプロドラッグを含む。本明細書に記載の数値範囲は、範囲を画定する数値を含む。本明細書で提供されている見出しは、全体として本明細書を参照することにより理解することができる本発明の種々の態様または実施形態を限定するものではない。一実施形態によると、方法の場合はある特定のステップを含むものとしてまたは組成物の場合はある特定の成分を含むものとして本明細書に記載されている主題は、それぞれのステップまたは成分からなる主題を指す。本明細書に記載の好ましい態様および実施形態を選択し組み合わせることが好ましく、好ましい実施形態のそれぞれの組合せに由来する特定の主題も、本開示に属する。
本発明は、ＣＤＲ−Ｈ２のグリコシル化部位が欠失されているヒト化抗ＭＵＣ１抗体ＰａｎｋｏＭａｂの変異体（ＰＭ−Ｎ５４Ｑ）の開発に基づく。グリコシル化部位の欠失は、重鎖可変領域のアミノ酸Ａｓｎ（アスパラギン）５７（すなわち、配列番号１１のアミノ酸番号５７）を、別のアミノ酸、特にＧｌｎ（グルタミン）で置換することにより達成された。Ａｓｎ５７は、炭水化物構造が付着されているグリコシル化部位のアクセプターアミノ酸残基である。炭水化物構造は、宿主細胞の酵素によりアスパラギン残基に移行させることしかできないため、このアスパラギン残基を別の残基で置換することにより、グリコシル化が消滅する。ＰａｎｋｏＭａｂのＣＤＲ−Ｈ２のグリコシル化部位の欠失は、驚くべきことに、抗体の抗原結合親和性を増加させたことが見出された。
こうした知見に照らして、本発明は、細胞傷害剤にコンジュゲートされた抗体を含むコンジュゲートであって、抗体は、ＭＵＣ１に結合することが可能であり、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、ならびに
（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域
を含む、コンジュゲートを提供する。
ＭＵＣ１に対する結合
抗体は、ＭＵＣ１のエピトープと特異的に結合する。エピトープは、ＭＵＣ１の細胞外タンデムリピートにある。ある特定の実施形態では、抗体は、グリコシル化依存的様式でＭＵＣ１に結合する。特に、抗体は、前記タンデムリピートのトレオニン残基が、Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ｔｎ）、シアリルα２−６Ｎ−アセチルガラクトサミン（ｓＴｎ）、ガラクトースβ１−３Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＴＦ）、またはガラクトースβ１−３（シアリルα２−６）Ｎ−アセチルガラクトサミン（ｓＴＦ）で、好ましくはＴｎまたはＴＦでグリコシル化されている場合、より強力に結合する。好ましくは、炭水化物部分は、α−Ｏ−グリコシド結合によりトレオニン残基に結合されている。ＭＵＣ１のタンデムリピートドメインにあるエピトープは、特に、アミノ酸配列ＰＤＴＲ（配列番号１３）またはＰＥＳＲ（配列番号１４）を含む。このエピトープに対する結合は、好ましくは、上記に記載のようにグリコシル化依存性であり、特に、上記に記載の炭水化物部分が、配列ＰＤＴＲまたはＰＥＳＲ（配列番号１３および１４）のトレオニン残基にそれぞれ付着されている場合、結合が増加する。
エピトープは、腫瘍関連ＭＵＣ１エピトープ（ＴＡ−ＭＵＣ１）である。ＴＡ−ＭＵＣ１エピトープは、特に、腫瘍細胞上に存在するが、正常細胞上には存在せず、および／または腫瘍細胞上に存在する場合は宿主循環中の抗体によりアクセス可能であるのみであり、正常細胞上に存在する場合はアクセス可能ではないＭＵＣ１のエピトープを指す。ある特定の実施形態では、ＴＡ−ＭＵＣ１エピトープを発現する細胞に対する抗体の結合は、正常な非腫瘍ＭＵＣ１を発現する細胞に対する結合よりも強力である。好ましくは、前記結合は、少なくとも１．５倍強力であり、好ましくは少なくとも２倍強力であり、少なくとも５倍強力であり、少なくとも１０倍強力であり、または少なくとも１００倍強力である。ＴＡ−ＭＵＣ１結合の場合、抗体は、好ましくは、グリコシル化ＭＵＣ１腫瘍エピトープと特異的に結合し、結合の強さは、同一の長さおよび同一のペプチド配列の非グリコシル化ペプチドに対する結合と比較して、少なくとも２倍、好ましくは４倍、または１０倍、最も好ましくは２０倍増加される。前記結合は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、または表面プラズモン共鳴（以下、「ＳＰＲ」と呼ぶ）分析などによりアッセイまたは決定することができる。ＳＰＲ分析に使用される装置の例としては、以下のものを挙げることができる：ＢｌＡｃｏｒｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｒｏｐ．製）、ＰｒｏｔｅＯｎ（商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製）、ＤＲＸ２バイオセンサー（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ＧｍｂＨ製）、ＳＰＲ−Ｎａｖｉ（商標）（ＢｉｏＮａｖｉｓ Ｏｙ Ｌｔｄ．製）、Ｓｐｒｅｅｔａ（商標）（Ｔｅｘａｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．製）、ＳＰＲｉ−ＰｌｅｘＩＩ（商標）（Ｈｏｒｉｂａ，Ｌｔｄ．製）、およびＡｕｔｏｌａｂ ＳＰＲ（商標）（Ｍｅｔｒｏｈｍ製）。細胞表面上に発現される抗原に対する抗体の結合は、フローサイトメトリーなどによりアッセイすることができる。
さらに、抗体は、配列番号１１または配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む参照抗体の抗原結合特性と同様の抗原結合特性を示すことができる。好ましくは、参照抗体は、ヒト化抗体ＰａｎｋｏＭａｂである。特に、抗体は、参照抗体と同じ抗原と特異的に結合し、好ましくはより高い親和性で前記抗原に結合する。すなわち、抗体は、好ましくは、参照抗体の解離定数よりも低い、より好ましくは１０％低い、少なくとも２０％低い、少なくとも３０％低い、または少なくとも５０％低い解離定数を有する親和性で抗原に結合する。さらに、抗体は、好ましくは、配列番号１１または配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む参照抗体と交差特異性を示す。特に、ヒト化抗体は、十分に高い濃度で存在する場合、ＭＵＣ１に対する参照抗体の結合を阻止することができる。これは、抗体が抗原ＭＵＣ１に既に結合している場合、ＭＵＣ１に対する参照抗体の結合が妨害されるとすれば可能である。
抗ＭＵＣ１抗体
ＭＵＣ１に結合することが可能な抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号４のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ−Ｌ１、アミノ酸配列５を有するＣＤＲ−Ｌ２、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含む。
ある特定の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。特に、重鎖可変領域は、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、特に少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む。こうした実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１、２、および３のアミノ酸配列を有するＣＤＲを依然として含む。したがって、配列番号９に対する任意の配列逸脱は、フレームワーク領域に位置するが、ＣＤＲには位置しない。特に、重鎖可変領域は、配列番号９のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号２のアミノ酸配列を有し、配列番号２の８位のアミノ酸は、グルタミン、アラニン、バリン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、リジン、およびアルギニン、特にグルタミン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、リジン、およびアルギニンからなる群から選択される。好ましくは、配列番号２の８位のアミノ酸は、グルタミン、ヒスチジン、トリプトファン、リジン、またはアルギニン、特にグルタミンである。特に、ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号７のアミノ酸配列を有する。
ある特定の実施形態では、ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号８のアミノ酸配列を有する。
具体的な実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。特に、重鎖可変領域は、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９５％、特に少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む。こうした実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含む。したがって、配列番号１０に対する任意の配列逸脱は、フレームワーク領域に位置するが、ＣＤＲには位置しない。特に、重鎖可変領域は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
具体的な実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。特に、重鎖可変領域は、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、特に少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む。こうした実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含む。したがって、配列番号１１に対する任意の配列逸脱は、フレームワーク領域に位置するが、ＣＤＲには位置しない。特に、重鎖可変領域は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。特に、軽鎖可変領域は、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、特に少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む。こうした実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号４、５、および６のアミノ酸配列を有するＣＤＲを依然として含む。したがって、配列番号１２に対する任意の配列逸脱は、フレームワーク領域に位置するが、ＣＤＲには位置しない。特に、軽鎖可変領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
具体的な実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲは、配列番号１、２、および３のアミノ酸配列を依然として有し、軽鎖可変領域は、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲは、配列番号４、５、および６のアミノ酸配列を依然として有する。特に、重鎖可変領域は、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲは、配列番号１、２、および３のアミノ酸配列を依然として有し、軽鎖可変領域は、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲは、配列番号４、５、および６のアミノ酸配列を依然として有する。
具体的な実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲは、配列番号１、７、および３のアミノ酸配列を依然として有し、軽鎖可変領域は、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲは、配列番号４、５、および６のアミノ酸配列を依然として有する。特に、重鎖可変領域は、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲは、配列番号１、７、および３のアミノ酸配列を依然として有し、軽鎖可変領域は、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲは、配列番号４、５、および６のアミノ酸配列を依然として有する。
具体的な実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲは、配列番号１、８、および３のアミノ酸配列を依然として有し、軽鎖可変領域は、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲは、配列番号４、５、および６のアミノ酸配列を依然として有する。特に、重鎖可変領域は、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲは、配列番号１、８、および３のアミノ酸配列を依然として有し、軽鎖可変領域は、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲは、配列番号４、５、および６のアミノ酸配列を依然として有する。
具体的な実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号２０のアミノ酸番号２０〜１３６により表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。特に、重鎖可変領域は、配列番号２０のアミノ酸番号２０〜１３６により表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、特に少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む。こうした実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含む。したがって、配列番号２０のアミノ酸番号２０〜１３６により表されるアミノ酸配列に対する任意の配列逸脱は、フレームワーク領域に位置するが、ＣＤＲには位置しない。特に、重鎖可変領域は、配列番号２０のアミノ酸番号２０〜１３６により表されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、配列番号２０の７６位のアミノ酸は、グルタミン、アラニン、バリン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、リジン、およびアルギニン、特にグルタミン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、リジン、およびアルギニンからなる群から選択される。好ましくは、配列番号２０の７６位のアミノ酸は、グルタミン、ヒスチジン、トリプトファン、リジン、またはアルギニン、特にグルタミンである。特に、ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号７のアミノ酸配列を含み、および／または重鎖可変領域は、配列番号２３のアミノ酸番号２０〜１３６により表されるアミノ酸配列を含む。
具体的な実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号２１のアミノ酸番号２１〜１３３により表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。特に、軽鎖可変領域は、配列番号２１のアミノ酸番号２１〜１３３により表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、特に少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む。こうした実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号４、５、および６のアミノ酸配列を有するＣＤＲを依然として含む。したがって、配列番号２１のアミノ酸番号２１〜１３３により表されるアミノ酸配列に対する任意の配列逸脱は、フレームワーク領域に位置するが、ＣＤＲには位置しない。特に、軽鎖可変領域は、配列番号２１のアミノ酸番号２１〜１３３により表されるアミノ酸配列を含む。
具体的な実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号２０のアミノ酸番号２０〜１３６により表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲは、配列番号１、７、および３のアミノ酸配列を依然として有し、軽鎖可変領域は、配列番号２１のアミノ酸番号２１〜１３３により表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲは、配列番号４、５、および６のアミノ酸配列を依然として有する。特に、重鎖可変領域は、配列番号２０のアミノ酸番号２０〜１３６により表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲは、配列番号１、７、および３のアミノ酸配列を依然として有し、軽鎖可変領域は、配列番号２１のアミノ酸番号２１〜１３３により表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲは、配列番号４、５、および６のアミノ酸配列を依然として有する。
具体的な実施形態では、重鎖は、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。特に、重鎖は、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９５％、特に少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む。こうした実施形態では、重鎖は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含む。したがって、配列番号１５に対する任意の配列逸脱は、フレームワーク領域に位置するが、ＣＤＲには位置しない。特に、重鎖は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、配列番号１５の５７位のアミノ酸は、グルタミン、アラニン、バリン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、リジン、およびアルギニン、特にグルタミン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、リジン、およびアルギニンからなる群から選択される。好ましくは、配列番号１５の５７位のアミノ酸は、グルタミン、ヒスチジン、トリプトファン、リジン、またはアルギニン、特にグルタミンである。特に、ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号７のアミノ酸配列を含み、および／または重鎖可変領域は、配列番号２２のアミノ酸番号２０〜１３６により表されるアミノ酸配列を含む。
具体的な実施形態では、重鎖は、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。特に、重鎖は、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、特に少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む。こうした実施形態では、重鎖は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含む。したがって、配列番号１９に対する任意の配列逸脱は、フレームワーク領域に位置するが、ＣＤＲには位置しない。特に、重鎖は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。
具体的な実施形態では、軽鎖は、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。特に、軽鎖は、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９５％、特に少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む。こうした実施形態では、軽鎖は、配列番号４、５、および６のアミノ酸配列を有するＣＤＲを依然として含む。したがって、配列番号１６に対する任意の配列逸脱は、フレームワーク領域に位置するが、ＣＤＲには位置しない。特に、軽鎖は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。
具体的な実施形態では、重鎖は、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲは、配列番号１、７、および３のアミノ酸配列を依然として有し、軽鎖可変領域は、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲは、配列番号４、５、および６のアミノ酸配列を依然として有する。特に、重鎖は、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲは、配列番号１、７、および３のアミノ酸配列を依然として有し、軽鎖は、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲは、配列番号４、５、および６のアミノ酸配列を依然として有する。
具体的な実施形態では、重鎖は、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲは、配列番号１、８、および３のアミノ酸配列を依然として有し、軽鎖は、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲは、配列番号４、５、および６のアミノ酸配列を依然として有する。特に、重鎖は、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲは、配列番号１、８、および３のアミノ酸配列を依然として有し、軽鎖は、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲは、配列番号４、５、および６のアミノ酸配列を依然として有する。
抗体は、その修飾形態を含みおよび包含する。抗体の修飾形態は、化学的または生物学的な修飾が提供されている抗体を意味する。化学的修飾形態は、アミノ酸骨格が化学部分とコンジュゲートされている形態、および化学的に修飾されているＮ−連結またはＯ−連結炭水化物鎖を有する形態などを含む。前記化学部分または形態は、毒性または細胞傷害性であってもよい。生物学的修飾形態は、翻訳後修飾（例えば、Ｎ−連結もしくはＯ−連結グリコシル化、Ｎ末端もしくはＣ末端プロセシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、またはメチオニンの酸化）を受けている形態、および原核生物宿主細胞を使用して発現させることによりＮ末端に付加されるメチオニン残基を含む形態などが挙げられる。また、そのような修飾形態は、抗体または抗原の検出または単離を可能にするように標識された形態、例えば、酵素標識形態、蛍光標識形態、または親和性標識形態を含むことが意図されている。そのような修飾形態は、抗体またはその抗原の検出または単離を可能にするように標識された形態、例えば、酵素標識形態、蛍光標識形態、および親和性標識形態も含むことが意図されている。本発明の抗体のそのような修飾形態は、元の抗体の安定性または血中滞留の向上、抗原性の低減、抗体または抗原の検出または単離などに有用である。
特に、抗体は、脱フコシル化、フコース低減、Ｎ−連結グリコシル化、Ｏ−連結グリコシル化、Ｎ末端プロセシング、Ｃ末端プロセシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化、重鎖の２３４位および２３５位（ＥＵインデックスによる）にある２つのロイシン（Ｌ）残基のアラニン（Ａ）への置換（ＬＡＬＡ）、プロリン残基のアミド化、およびカルボキシル末端の１つ、２つ、または３つのアミノ酸の欠失または欠如からなる群から選択される１つまたは複数の修飾を含んでいてもよい。具体的な実施形態では、抗体は、一方の重鎖または両方の重鎖の１つ、２つ、または３つのカルボキシル末端アミノ酸を欠如するか、または２つのカルボキシル末端アミノ酸を欠如し、一方の重鎖または両方の重鎖のカルボキシル末端プロリン残基がアミド化されている。
そのような修飾は、その抗体の任意の位置または所望の位置に製作することができる。その代わりに、同じまたは２つもしくはそれよりも多くの異なる修飾を、その中の１つまたは２つまたはそれよりも多くの位置に製作することができる。
例えば、哺乳動物細胞の培養により産生される抗体は、その重鎖のカルボキシル末端リジン残基を欠如することが知られている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ、７０５巻：１２９〜１３４ページ（１９９５））。また、重鎖の２つのカルボキシル末端アミノ酸残基（つまり、グリシンおよびリジン）を欠くこともあり、新たにカルボキシル末端に位置するプロリン残基がアミド化されることも知られている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３６０巻：７５〜８３ページ（２００７））。しかしながら、こうした重鎖配列のそのような欠如または修飾は、抗体がその抗原に結合する能力にも、抗体のエフェクター機能（補体活性化、抗体依存性細胞傷害性など）にも影響を及ぼさない。
ある特定の実施形態では、抗体は、重鎖のカルボキシル末端の１つまたは２つのアミノ酸の欠失または欠如を含み、アミド化残基（例えば、重鎖のカルボキシル末端部位のアミド化プロリン残基）を有する。しかしながら、抗体は、欠失突然変異体が抗原に結合する能力を維持する限り、上記に記載のタイプに限定されない。
ある特定の実施形態では、抗体の２つの重鎖は、全長重鎖および欠失突然変異体の重鎖からなる群から選択される重鎖の任意の１つのタイプで構成されていてもよく、またはそれらから選択される任意の２つのタイプの組合せで構成されていてもよい。欠失変異体重鎖の定量的な比は、抗体を産生する培養哺乳動物細胞のタイプおよび細胞の培養条件に依存する。
具体的な実施形態では、抗体は、両方が１つのカルボキシル末端アミノ酸残基を欠如する２つの重鎖を含んでいてもよい。
具体的な実施形態では、抗体は、配列番号１５または２２のアミノ酸番号１〜４４６により表されるアミノ酸配列を有する重鎖、および配列番号１６のアミノ酸番号１〜２１９により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。ある特定の実施形態では、配列番号１５の５７位のアミノ酸は、グルタミン、アラニン、バリン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、リジン、およびアルギニン、特にグルタミン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、リジン、およびアルギニンからなる群から選択される。好ましくは、配列番号１５の５７位のアミノ酸は、グルタミン、ヒスチジン、トリプトファン、リジン、またはアルギニンであり、特にグルタミンである。
具体的な実施形態では、抗体は、配列番号１９のアミノ酸番号１〜４４６により表されるアミノ酸配列を有する重鎖、および配列番号１６のアミノ酸番号１〜２１９により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体、または配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体と、ＴＡ−ＭＵＣ１に対する結合を競争する。
ある特定の実施形態では、抗体は、（ａ）ＭＵＣ１と特異的に結合するという特性、および／または（ｂ）ＭＵＣ１に結合することによりＭＵＣ１発現細胞内に内部移行される活性を有するという特性を有する。ある特定の実施形態では、抗体は、少なくとも１つの抗体重鎖を含む。特に、抗体は２つの抗体重鎖を含む。抗体重鎖は、特に、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む。ある特定の他の実施形態では、抗体重鎖は、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むが、ＣＨ１ドメインを含まない。さらなる実施形態では、重鎖の１つまたは複数の定常ドメインは、他のドメイン、特に、例えばアルブミンなどの類似ドメインにより置換されていてもよい。抗体重鎖は、γ鎖、α鎖、ε鎖、δ鎖、およびμ鎖を含む任意のタイプであってもよく、好ましくは、γ１鎖、γ２鎖、γ３鎖、およびγ４鎖を含むγ鎖であり、特にγ１鎖である。したがって、抗体は、好ましくは、ＩｇＧ１型抗体、ＩｇＧ３型抗体、またはＩｇＧ４型抗体などのＩｇＧ型抗体であり、特にＩｇＧ１型抗体である。
特に、抗体は、少なくとも１つの抗体軽鎖、特に２つの抗体軽鎖をさらに含む。抗体軽鎖は、特に、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含む。抗体軽鎖は、κ鎖またはλ鎖であってもよく、特にκ鎖である。
ある特定の実施形態では、抗体は、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖を含む。特に、抗体は、各々がＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む２つのγ１型の抗体重鎖、ならびに各々がＶＬドメインおよびＣＬドメインを含む２つのκ型の抗体軽鎖を含む。
代替的な実施形態では、抗体は、抗体軽鎖を含まない。こうした実施形態では、軽鎖可変領域は、重鎖可変領域のＮ末端に融合されていてもよく、または重鎖可変領域に対してＣ末端に挿入されている。軽鎖可変領域を重鎖の残りの部分に接続するペプチドリンカーが存在してもよい。
好ましい実施形態では、抗体はＦｃ領域を含む。抗体は、特に、各々がドメインＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む２つの重鎖、ならびに各々がドメインＶＬおよびＣＬを含む２つの軽鎖を含む抗体全体であってもよい。抗体は、特に、１つまたは複数のヒトＦｃγ受容体、特にヒトＦｃγ受容体ＩＩＩＡに結合することが可能である。代替的な実施形態では、抗体は、ヒトＦｃγ受容体ＩＩＩＡに結合しないかまたは著しくは結合せず、特に、いかなるヒトＦｃγ受容体にも結合しないかまたは著しくは結合しない。こうした実施形態では、抗体は、特に、ＣＨ２ドメインにグリコシル化部位を含まない。
代替的な実施形態では、抗体は、Ｆｃ領域を含まない。こうした実施形態では、抗体は、特に、単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）またはＦｃ領域を含まない別の抗体断片である。
抗ＭＵＣ１抗体のグリコシル化
抗ＭＵＣ１抗体は、１つまたは複数の抗体重鎖にＣＨ２ドメインを含んでいてもよい。ＩｇＧ型の天然ヒト抗体は、ＣＨ２ドメインにＮ−グリコシル化部位を含む。抗体に存在するＣＨ２ドメインは、Ｎ−グリコシル化部位を含んでいてもよく、または含んでいなくともよい。ある特定の実施形態では、抗体は、ＣＨ２ドメインにグリコシル化部位を含まない。特に、抗体は、ＩＭＧＴ／Ｅｕ付番方式による２９７位に対応する重鎖の位置にアスパラギン残基を含まない。例えば、抗体は、重鎖にＡｌａ２９７突然変異を含んでいてもよい。こうした実施形態では、抗体は、好ましくは、Ｆｃγ受容体に結合することにより抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または抗体依存性細胞性ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導する能力が強力に低減されているかまたは完全に欠如されている。この点で、能力の強力な低減は、特に、そのＣＨ２ドメインにＮ−グリコシル化部位を含み、ヒト細胞株またはＣＨＯ細胞株で産生することにより得ることができるグリコシル化パターン、例えば本明細書に記載のようなグリコシル化パターンなどの一般的な哺乳動物グリコシル化パターンを有する同じ抗体と比較して、１０％もしくはそれよりも低い、特に３％もしくはそれよりも低い、１％もしくはそれよりも低い、または０．１％もしくはそれよりも低い活性への低減を指す。こうした実施形態では、抗体は、特にＩｇＧ１型抗体である。
代替的な実施形態では、抗体に存在するＣＨ２ドメインは、Ｎ−グリコシル化部位を含む。このグリコシル化部位は、特に、ＩＭＧＴ／Ｅｕ付番方式による重鎖のアミノ酸位置２９７に対応するアミノ酸位置であり、アミノ酸配列モチーフ（ｍｏｔｉｖｅ）Ａｓｎ Ｘａａ Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（式中、Ｘａａはプロリン以外の任意のアミノ酸であってもよい）を有する。Ａｓｎ２９７のＮ−連結グリコシル化は、哺乳動物ＩｇＧならびに他の抗体アイソタイプの相同性領域にて保存されている。可変領域または他の配列修飾には任意選択の追加のアミノ酸が存在してもよいため、抗体のアミノ酸配列におけるこの保存されたグリコシル化部位の実際の位置は様々であり得る。好ましくは、抗体に付着されたグリカンは、好ましくは、少なくとも以下の構造：
Ａｓｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ−（Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ）２
を含み、式中、Ａｓｎは、抗体のポリペプチド部分のアスパラギン残基であり、ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ−アセチルグルコサミンであり、Ｍａｎは、マンノースである、二分岐複合型Ｎ−連結炭水化物構造である。末端ＧｌｃＮＡｃ残基は、ガラクトース残基をさらに保持してもよく、ガラクトース残基は、任意選択でシアル酸残基を保持してもよい。さらなるＧｌｃＮＡｃ残基（二分ＧｌｃＮＡｃと称される）が、ポリペプチドに最も近いＭａｎに付着されていてもよい。Ａｓｎに付着されているＧｌｃＮＡｃにフコースが結合していてもよい。こうした実施形態では、抗体は、特にＩｇＧ１型抗体である。
好ましい実施形態では、抗体は、Ｎ−グルコイルノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）を含まないかまたは検出可能な量のＮｅｕＧｃを含まない。さらに、抗体はまた、好ましくはＧａｌｉｌｉエピトープ（Ｇａｌα１，３−Ｇａｌ構造）を含まないかまたは検出可能な量のＧａｌｉｌｉエピトープを含まない。特に、ＮｅｕＧｃおよび／またはＧａｌα１，３−Ｇａｌ構造を保持するグリカンの相対量は、抗体の集団中の抗体のＣＨ２ドメインに付着されているグリカンの合計量の０．１％未満または０．０２％未満でさえある。
特に、抗体は、ヒトグリコシル化パターンを有する。こうしたグリコシル化特性のため、両方ともげっ歯動物産生系で知られている免疫原性非ヒトシアル酸（ＮｅｕＧｃ）またはＧａｌｉｌｉエピトープ（Ｇａｌ−Ｇａｌ構造）などのある特定の外来性糖構造により引き起こされることが知られている不要な副作用または不利益を意味する副作用を誘導する外来性免疫原性非ヒト構造は存在しないか、または例えば酵母系に由来することが知られている免疫原性高マンノース構造のような他の構造が回避される。
具体的な実施形態では、抗体は、二分ＧｌｃＮＡｃ残基を保持する検出可能な量のグリカンを有するグリコシル化パターンを含む。特に、二分ＧｌｃＮＡｃ残基を保持するグリカンの相対量は、組成物中の抗体のグリコシル化部位に付着されているグリカンの合計量の少なくとも０．５％、特に少なくとも１％である。さらに、ある特定の実施形態では、グリコシル化パターンは、組成物中の抗体に付着されているグリカンの合計量の少なくとも２５％の相対量の、少なくとも１つのガラクトース残基を保持するグリカンを含む。特に、少なくとも１つのガラクトース残基を保持するグリカンの相対量は、組成物中の抗体に付着されているグリカンの合計量の少なくとも３０％、特に少なくとも３５％、または少なくとも４０％である。具体的な実施形態では、グリコシル化パターンは、組成物中の抗体に付着されているグリカンの合計量の少なくとも１％の相対量の、少なくとも１つのシアル酸残基を保持するグリカンを含む。特に、少なくとも１つのシアル酸残基を保持するグリカンの相対量は、組成物中の抗体に付着されているグリカンの合計量の少なくとも１．５％、特に少なくとも２％である。
抗体は、大量のコアフコースまたは少量のコアフコースを有するグリコシル化パターンを有してもよい。フコシル化量の低減は、抗体がＡＤＣＣを誘導する能力を増加させる。ある特定の実施形態では、コアフコース残基を保持するグリカンの相対量は、組成物中の抗体に付着されているグリカンの合計量の４０％もしくはそれよりも低く、特に３０％もしくはそれよりも低く、または２０％もしくはそれよりも低い。代替的な実施形態では、コアフコース残基を保持するグリカンの相対量は、組成物中の抗体に付着されているグリカンの合計量の少なくとも６０％、特に少なくとも６５％、または少なくとも７０％である。
抗ＭＵＣ１抗体のＣＨ２ドメインのグリコシル化部位の存在または非存在および前記グリコシル化部位のグリカン構造中のフコースの存在または非存在により、抗体がＡＤＣＣを誘導する能力および前記ＡＤＣＣ誘導の強度を制御することができる。ＡＤＣＣ活性は、抗体のＦｃ部分のグリコシル化により増加され、前記グリコシル化のフコシル化量を低減させることによりさらに増加される。ある特定の応用では、ＡＤＣＣ活性の微調整が重要である。したがって、ある特定の状況では、ＣＨ２ドメインにグリコシル化部位を有していない抗体、ＣＨ２ドメインにグリコシル化部位を有し、大量のフコシル化を有する抗体、またはＣＨ２ドメインにグリコシル化部位を有し、少量のフコシル化を有する抗体が、最も有利であり得る。
抗ＭＵＣ１抗体の産生
抗体は、好ましくは、宿主細胞にて組換え的に産生される。抗体の産生に使用される宿主細胞は、抗体産生に使用することができる任意の宿主細胞であってもよい。好適な宿主細胞は、特に、真核生物宿主細胞、特に哺乳類宿主細胞である。例示的な宿主細胞としては、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞株などの酵母細胞、ＳＦ９およびＳＦ２１細胞株などの昆虫細胞、植物細胞、ＥＢ６６アヒル細胞株などのトリ細胞、ＣＨＯ、ＮＳ０、ＳＰ２／０、およびＹＢ２／０細胞株などのげっ歯動物細胞、ならびにＨＥＫ２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、ＣＡＰ、ＣＡＰ−Ｔ、ＡＧＥ１．ＨＮ、Ｍｕｔｚ−３、およびＫＧ１細胞株などのヒト細胞が挙げられる。
ある特定の実施形態では、抗体は、ヒト血液細胞株にて、特にヒト骨髄性白血病細胞株にて組換え的に産生される。抗体の産生に使用することができる好ましいヒト細胞株ならびに好適な産生手順は、ＷＯ２００８／０２８６８６Ａ２に記載されている。具体的な実施形態では、抗体は、ＮＭ−Ｈ９Ｄ８、ＮＭ−Ｈ９Ｄ８−Ｅ６、およびＮＭ−Ｈ９Ｄ８−Ｅ６Ｑ１２からなる群から選択されるヒト骨髄性白血病細胞株、およびそれらに由来する細胞株にて発現させることにより得られる。こうした細胞株は、ブダペスト条約の要件に従って、アクセッション番号ＤＳＭ ＡＣＣ２８０６（ＮＭ−Ｈ９Ｄ８；２００６年９月１５日に寄託された）、ＤＳＭ ＡＣＣ２８０７（ＮＭ−Ｈ９Ｄ８−Ｅ６；２００６年１０月５日に寄託された）、およびＤＳＭ ＡＣＣ２８５６（ＮＭ−Ｈ９Ｄ８−Ｅ６Ｑ１２；２００７年８月８日に寄託された）として、Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ ＧｍｂＨ，Ｒｏｂｅｒｔ−Ｒｏｓｓｌｅ−Ｓｔｒ．１０，１３１２５ Ｂｅｒｌｉｎ（ＤＥ）によりＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ），Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａβｅ ７Ｂ，３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ（ＤＥ）に寄託された。ＮＭ−Ｈ９Ｄ８細胞は、高度のシアリル化、高度の二分ＧｌｙｃＮＡｃ、高度のガラクトシル化、および高度のフコシル化を有するグリコシル化パターンを提供する。ＮＭ−Ｈ９Ｄ８−Ｅ６細胞およびＮＭ−Ｈ９Ｄ８−Ｅ６Ｑ１２細胞は、フコシル化の度合いが非常に低い以外は、ＮＭ−Ｈ９Ｄ８細胞のパターンに類似するグリコシル化パターンを提供する。他の好適な細胞株としては、アメリカ培養細胞系統保存機関に存在するヒト骨髄性白血病細胞株であるＫ５６２（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４３）ならびに上述のものに由来する細胞株が挙げられる。
さらなる実施形態では、抗体は、ＣＨＯ細胞にて組換え的に産生される。特に、抗体は、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−９０９６の細胞株など、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−細胞株にて組換え的に産生させることができる。
抗ＭＵＣ１抗体のコンジュゲート
本発明によると、抗体は、１つまたは複数の細胞傷害剤にコンジュゲートされている。細胞傷害剤は、抗体とのコンジュゲーションに好適な任意の細胞傷害剤であってもよい。１つよりも多くの細胞傷害剤が抗体に存在する場合、こうした細胞傷害剤は、同一であってもよくまたは異なっていてもよく、特にすべて同一である。細胞傷害剤と抗体とのコンジュゲーションは、当技術分野で公知の任意の方法を使用して達成することができる。細胞傷害剤は、特に融合または化学カップリングにより共有結合で、または非共有結合で抗体に付着されていてもよい。ある特定の実施形態では、細胞傷害剤は、特にリンカー部分を介して共有結合で抗体に付着されている。リンカー部分は、細胞傷害剤を抗体に付着させるのに好適な任意の化学的実体であってもよい。
細胞傷害剤に加えて、本発明によるコンジュゲートは、それにコンジュゲートされているさらなる作用剤を含んでいてもよい。さらなる作用剤は、好ましくは、疾患、特にがんの治療、診断、予後、および／またはモニタリングに有用である。例えば、さらなる作用剤は、放射性核種、化学療法剤、抗体または抗体断片、特に抗ＭＵＣ１抗体とは異なる特異性のもの、例えば免疫調節性標的を阻止または活性化するチェックポイント抗体、酵素、相互作用ドメイン、検出可能な標識、毒素、細胞溶解性成分、免疫調節剤、免疫エフェクター、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ抗原、およびリポソームからなる群から選択することができる。
特定の好ましい細胞傷害剤は、放射性核種、または化学療法剤などのがん細胞を死滅させることが可能な細胞傷害剤である。ある特定の好ましい実施形態では、化学療法剤は、コンジュゲートを形成する抗ＭＵＣ１抗体に付着されている。化学療法剤は、化合物が、抗腫瘍効果を有し、リンカー構造に接続することができる置換基または部分構造を有する限り、特に限定されない。腫瘍細胞にてリンカーの一部分または全体が切断されると、化学療法剤または抗腫瘍化合物部分が放出され、化学療法剤は抗腫瘍効果を示す。リンカーが、作用剤との接続位置で切断されると、化学療法剤は、その元の構造で放出され、その元の抗腫瘍効果を発揮する。
細胞障害剤としてコンジュゲートすることができる化学療法剤の具体的な例としては、シスプラチンなどのアルキル化剤、抗代謝物質、植物アルカロイドおよびテルペノイド、ビンカアルカロイド、ポドフィロトキシン、タキソールなどのタキサン、イリノテカンおよびトポテカンなどのトポイソメラーゼ阻害剤、ドキソルビシンなどの抗悪性腫瘍剤、またはマイタンシン／マイタンシノイドなどの微小管阻害剤が挙げられる。
化学療法剤は、特に、以下のものからなる群から選択することができる：Ｖ−ＡＴＰａｓｅ阻害剤、アポトーシス促進剤、Ｂｃｌ２阻害剤、ＭＣＬ１阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定化剤、微小管不安定化剤、ドラスタチン、マイタンシン、マイタンシノイド、アマトキシン、メチオニンアミノペプチダーゼ、タンパク質ＣＲＭ１の核外輸送阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ミトコンドリアにおけるリン酸転移反応の阻害剤、タンパク合成阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＨＦＲ阻害剤、微小管形成阻害剤、微小管安定化剤、アクチンの安定化剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、白金化合物、リボソーム阻害剤、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ阻害剤、および細菌毒素。具体的な実施形態では、抗ＭＵＣ１抗体に付着される化学療法剤は、マイタンシノイドなどの微小管阻害剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡアルキル化剤、およびＤＮＡ副溝結合剤からなる群から選択される。
一部の実施形態では、化学療法剤は、マイタンシンまたはマイタンシノイドである。コンジュゲーションに有用なマイタンシノイドの具体的な例としては、マイタンシノール、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン（ＤＭ１）、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシン（ＤＭ３）、およびＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシン（ＤＭ４）が挙げられる。特に、ＤＭ１またはＤＭ４が、抗ＭＵＣ１抗体に付着される。一部の実施形態では、抗ＭＵＣ１抗体に付着される化学療法剤は、ＤＮＡ副溝結合剤、特にピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ピロロベンゾジアゼピン二量体（ＰＢＤ二量体）、デュオカルマイシン、デュオカルマイシン−ヒドロキシベンズアミド−アザインドール（ＤＵＢＡ）、ｓｅｃｏ−デュオカルマイシン−ヒドロキシベンズアミド−アザインドール（ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡ）、またはドキソルビシンである。一部の実施形態では、抗ＭＵＣ１抗体に付着される化学療法剤は、ＤＮＡアルキル化剤、特にインドリノベンゾジアゼピンまたはオキサゾリジノベンゾジアゼピン（ｏｘａｚｏｌｉｄｉｎｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ）である。一部の実施形態では、抗ＭＵＣ１抗体に付着される化学療法剤は、ＤＮＡ損傷剤、特にカリチアマイシンである。一部の実施形態では、抗ＭＵＣ１抗体に付着される化学療法剤は、トポイソメラーゼＩ阻害剤、特にカンプトテシン、および７−エチル−１０−ヒドロキシ−カンプトテシン（ＳＮ−３８）、（Ｓ）−９−ジメチルアミノメチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（トポテカン）、（１Ｓ，９Ｓ）−１−アミノ−９−エチル−５−フルオロ−１，２，３，９，１２，１５−ヘキサヒドロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０Ｈ，１３Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１０，１３−ジオン（エキサテキカン（ＤＸ−８９５１））、およびＮ−［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］−２−ヒドロキシアセトアミド（ＤＸｄ）などのその誘導体である。一部の実施形態では、抗ＭＵＣ１抗体に付着される化学療法剤は、微小管形成の阻害剤、特にチューブリシン、アンサマイトシン、ポドフィロトキシン、またはビンブラスチンである。一部の実施形態では、抗ＭＵＣ１抗体に付着される化学療法剤は、微小管の安定化剤、特にパクリタキセルまたはエポチロンである。一部の実施形態では、抗ＭＵＣ１抗体に付着される化学療法剤は、アクチンの安定化剤、特にファロトキシンである。一部の実施形態では、抗ＭＵＣ１抗体に付着される化学療法剤は、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、特にテニポシド、ＸＫ４６９、ラゾキサン、アムサクリン、イダルビシン、またはメバロンである。一部の実施形態では、抗ＭＵＣ１抗体に付着される化学療法剤は、白金化合物、特にシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、四硝酸トリプラチン、フェナントリプラチン、ピコプラチン、またはサトラプラチンである。一部の実施形態では、抗ＭＵＣ１抗体に付着される化学療法剤は、リボソーム阻害剤、特にリシン、サポリン、アブリン、ジフテリア毒素、または菌体外毒素Ａである。一部の実施形態では、抗ＭＵＣ１抗体に付着される化学療法剤は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ阻害剤、特に、例えばアマニチンなどのアマトキシンである。一部の実施形態では、抗ＭＵＣ１抗体に付着される化学療法剤は、細菌毒素、特に炭疽毒素である。好適な抗体薬物コンジュゲートは、ＥＰ１６１５１７７４．３明細書およびその中で明示的に参照されているＬＵ９２６５９明細書にも記載されている。
好ましい実施形態では、化学療法剤は、（１Ｓ，９Ｓ）−１−アミノ−９−エチル−５−フルオロ−１，２，３，９，１２，１５−ヘキサヒドロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０Ｈ，１３Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１０，１３−ジオン（エキサテキカン（ＤＸ−８９５１））またはＤＸｄである。
エキサテキカン（ＤＸ−８９５１）は、以下の式：
Figure 2021524852
により表される抗腫瘍化合物である。
化合物は、例えば、米国特許出願公開第２０１６／０２９７８９０号明細書に記載の方法または他の公知の方法により容易に得ることができ、好ましくは、１位のアミノ基を、リンカー構造に対する連結位置として使用することができる。さらに、エキサテキカンを腫瘍細胞にて放出させることができるが、リンカーの一部分は依然としてそれに付着されている。しかしながら、この化合物は、そのような状態でさえ優れた抗腫瘍効果を発揮する。
ＤＸｄは、以下の式：
Figure 2021524852
により表される化合物である。
エキサテキカンまたはＤＸｄはカンプトテシン構造を有するため、酸性水性媒体（例えば、ｐＨ３程度の）では、ラクトン環が形成された（閉環）構造へと平衡がシフトするが、塩基性水性媒体（例えば、ｐＨ１０程度の）では、ラクトン環が開環された（開環）構造へと平衡がシフトすることが知られている。そのような閉環構造および開環構造に対応するエキサテキカン残基が導入されている薬物コンジュゲートも、等価な抗腫瘍効果を示すことが予想され、そのような薬物コンジュゲートはいずれも本発明の範囲に含まれるのは言うまでもない。ある特定の実施形態では、さらなる作用剤は、ポリペプチドまたはタンパク質である。このポリペプチドまたはタンパク質は、特に、抗体のポリペプチド鎖に融合されていてもよい。ある特定の実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質であるさらなる作用剤は、抗体の抗体軽鎖のＣ末端に融合されている。抗体が２つの抗体軽鎖を含む実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質であるさらなる作用剤は、２つの抗体軽鎖の各々のＣ末端に融合されていてもよい。さらなる実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質であるさらなる作用剤は、抗体の抗体重鎖のＣ末端に融合されている。抗体が２つの抗体重鎖を含む実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質であるさらなる作用剤は、２つの抗体重鎖の各々のＣ末端に融合されていてもよい。さらなる作用剤は、同一であってもよくまたは異なっていてもよく、特に、同じアミノ酸配列を有してもよい。ポリペプチドまたはタンパク質であるそのようなさらなる作用剤の好適な例は、サイトカイン、ケモカイン、抗体、抗原結合性断片、酵素、および相互作用ドメインからなる群から選択してもよい。
ある特定の実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質であるさらなる作用剤は、活性化シグナルを阻止および／または誘発するチェックポイント抗体である。それぞれの標的の例としては、活性化標的としてのＣＤ４０、ＣＤ３、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０リガンド）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、およびＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、阻害性標的としてのＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＣＤ８０、ＣＤ２４４、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、およびホスファチジルセリン、ならびにＰＤＬ１などのそれらの対応するリガンドが挙げられる。具体的な例では、抗ＭＵＣ１抗体は、本明細書に記載のような２つの重鎖および２つの軽鎖を含み、ＣＤ３と特異的に結合するｓｃＦｖ断片が、各重鎖のＣ末端に融合されているか、またはＰＤＬ１と特異的に結合するｓｃＦｖ断片が、各軽鎖のＣ末端に融合されている。
さらなる実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質であるさらなる作用剤は、ケモカイン、サイトカイン、または増殖因子などの免疫調節化合物である。この点で好適なサイトカインとしては、インターフェロン−α、インターフェロン−β、およびインターフェロン−γなどのインターフェロン、ならびにインターロイキンが挙げられる。好適な増殖因子としては、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦが挙げられる。
リンカーの具体的な例としては、以下の式（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
（ｂ）-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
（ｃ）-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
（ｄ）-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
（ｅ）-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, および
（ｆ）-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
のいずれかにより表される構造が挙げられ、式中、-(Succinimid-3-yl-N)-は、以下の式：
Figure 2021524852
により表される構造を有する。
具体的な実施形態では、リンカーは、以下の式（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
（ｂ）-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,および
（ｃ）-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
のいずれかにより表される構造を含む。
好ましい実施形態では、リンカーは、以下の式（ａ）：
（ａ）-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-
のいずれかにより表される構造を含む。
代替的な実施形態では、コンジュゲートは、以下の式により表される薬物−リンカー構造を有し、抗体は、以下の式により表される薬物リンカー構造にチオエーテル結合でコンジュゲートされており、星印＊は、抗体との接続点を表す。
Figure 2021524852
好ましい実施形態では、コンジュゲートは、以下の式：
Figure 2021524852
により表される薬物−リンカー構造を有し、
式中、ＡＢは抗体を表し、ｙは、抗体にコンジュゲートされた薬物−リンカー構造の単位の、１抗体当たりの平均数を表し、抗体は、上記式により表される薬物リンカー構造にチオエーテル結合でコンジュゲートされており、抗体は、上述の抗ＭＵＣ１抗体を表し、好ましくは、抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域または重鎖および軽鎖の以下の組合せａ）〜ｄ）：
（ａ）重鎖可変領域は、配列番号１０のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を有すること、
（ｂ）重鎖可変領域は、配列番号１１のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を有すること、
（ｃ）重鎖は、配列番号１５のアミノ酸配列を有し、軽鎖は、配列番号１６のアミノ酸配列を有すること、および
（ｄ）重鎖は、配列番号１９のアミノ酸配列を有し、軽鎖は、配列番号１６のアミノ酸配列を有すること
のいずれか１つである。
上述のコンジュゲートでは、１抗体分子当たりのコンジュゲートされた薬物分子（または細胞傷害剤）の数は、その有効性および安全性に影響を及ぼす重要な要因である。抗体−薬物コンジュゲート（またはコンジュゲート）の産生は、コンジュゲートされた薬物分子が一定数に到達するように、反応に使用される出発物質および試薬の量などの反応条件を指定することにより実施される。低分子量化合物の化学反応とは異なり、通常は、様々な数のコンジュゲートされた薬物分子を含む混合物が得られる。１抗体分子当たりのコンジュゲートされた薬物分子の数は、平均値、つまりコンジュゲートされた薬物分子の平均数として規定および示される。また、別様の指示がない限り、つまり、様々な数のコンジュゲートされた薬物分子を有する抗体−薬物コンジュゲート混合物に含まれる特定数のコンジュゲートされた薬物分子を有する抗体−薬物コンジュゲートを表す場合以外では、本発明によるコンジュゲートされた薬物分子の数は、通例では平均値を意味する。抗体分子にコンジュゲートされるエキサテキカン分子またはＤＸｄの数は、制御可能であり、１抗体当たりのコンジュゲートされた薬物分子の平均数として、およそ１〜１０個のエキサテキカン分子または１〜１０個のＤＸｄを、コンジュゲートすることができる。エキサテキカン分子またはＤＸｄの数は、好ましくは２〜８であり、より好ましくは４〜８、さらに好ましくは７〜８、およびまたさらに好ましくは８である。当業者であれば、本出願の例の説明に基づいて、必要な数の薬物分子を抗体分子にコンジュゲートするための反応を設計することができ、制御された数のコンジュゲートされたエキサテキカン分子を有する抗体−薬物コンジュゲートを得ることができることが留意されるべきである。
上記の好ましい実施形態では、コンジュゲートが腫瘍細胞の内部に移行された後、リンカー部分が切断され、次いでＤＸｄが放出され、抗腫瘍効果を発揮する。（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１６年１０月１５日；２２巻（２０号）：５０９７〜５１０８ページ、Ｅｐｕｂ ２０１６年３月２９日）。
種々の放射性または非放射性同位体で標識されたコンジュゲートも、本発明に含まれる。本発明のコンジュゲートを構成する１つまたは複数の原子は、自然界にはない比の原子同位体を含んでいてもよい。原子同位体の例としては、重水素（２Ｈ）、トリチウム（３Ｈ）、ヨウ素１２５（１２５Ｉ）、および炭素１４（１４Ｃ）が挙げられる。さらに、コンジュゲートは、トリチウム（３Ｈ）、ヨウ素１２５（１２５Ｉ）、炭素１４（１４Ｃ）、銅６４（６４Ｃｕ）、ジルコニウム８９（８９Ｚｒ）、ヨウ素１２４（１２４Ｉ）、フッ素１８（１８Ｆ）、インジウム１１１（１１１Ｉｎ）、炭素１１（１１Ｃ）、およびヨウ素１３１（１３１Ｉ）などの放射性同位体で放射性標識されていてもよい。放射性同位体で標識されたコンジュゲートは、療法剤または予防剤、アッセイ試薬などの研究用試薬、およびｉｎ ｖｉｖｏ診断用造影剤などの診断用の作用剤として有用である。放射能に関わらず、あらゆる同位体変異型のコンジュゲートが、本発明の範囲内である。
核酸、発現カセット、ベクター、細胞株、および組成物
本発明によるコンジュゲートの抗体部分は、核酸によりコードされていてもよい。前記核酸の核酸配列は、抗体をコードするのに好適な任意のヌクレオチド配列を有してもよい。しかしながら、好ましくは、核酸配列は、核酸を発現させようとする宿主細胞または生物の特定のコドン使用頻度、特にヒトコドン使用頻度に少なくとも部分的に適応している。核酸は、二本鎖または一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはｃＤＮＡなどの二本鎖ＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡであってもよい。核酸は、１つの連続核酸分子であってもよく、または各々が抗体の異なる部分をコードする幾つかの核酸分子で構成されていてもよい。ＰａｎｋｏＭａｂ変異体（ＰＭ−Ｎ５４Ｑ）の重鎖のヌクレオチド配列は、配列番号１７により表されてもよく、ＰａｎｋｏＭａｂ変異体（ＰＭ−Ｎ５４Ｑ）の軽鎖のヌクレオチド配列は、配列番号１８により表されてもよい。
抗体が抗体の軽鎖および重鎖などの１つよりも多くの異なるアミノ酸鎖で構成されている場合、核酸は、例えば、各々が抗体のアミノ酸鎖の１つをコードし、好ましくは別々のアミノ酸鎖を生成するためにＩＲＥＳエレメントなどの調節エレメントにより隔てられている幾つかのコード領域を含む単一の核酸分子であってもよく、または核酸は、各核酸分子が、抗体のアミノ酸鎖の１つを各々コードする１つまたは複数のコード領域を含む幾つかの核酸分子で構成されていてもよい。また、抗体をコードするコード領域に加えて、核酸は、例えば、他のタンパク質をコードしていてもよく、コード領域の転写および／または翻訳に影響を及ぼしてもよく、核酸の安定性または他の物理的もしくは化学的特性に影響を及ぼしてもよく、または機能を全く有していなくともよいさらなる核酸配列または他の修飾を含んでいてもよい。
発現カセットまたはベクターは、前記核酸および前記核酸と作動可能に接続したプロモーターを含んでいてもよい。加えて、発現カセットまたはベクターは、さらなるエレメント、特に核酸の転写および／もしくは翻訳、発現カセットもしくはベクターの増幅および／もしくは再生産、発現カセットもしくはベクターの宿主細胞ゲノムへの組込み、ならびに／または宿主細胞中の発現カセットもしくはベクターのコピー数に影響を及ぼし、および／または調節することが可能なエレメントを含んでいてもよい。抗体を発現するためのそれぞれの発現カセットを含む好適な発現カセットおよびベクターは、従来技術において周知であり、したがって本明細書ではさらなる説明を必要としない。
宿主細胞は、核酸、または発現カセットもしくはベクターを含んでいてもよい。宿主細胞は、任意の宿主細胞であってもよい。宿主細胞は、単離細胞であってもよく、または組織に含まれている細胞であってもよい。好ましくは、宿主細胞は、培養細胞、特に初代細胞、樹立細胞株の細胞、好ましくは腫瘍由来細胞である。好ましくは、宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）細胞、特にＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母細胞、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞、または哺乳動物細胞、特に腫瘍由来ヒト細胞などのヒト細胞、ＣＨＯなどのハムスター細胞、または霊長類細胞である。好ましい実施形態では、宿主細胞は、ヒト骨髄性白血病細胞に由来する。好ましくは、宿主細胞は、以下の細胞または細胞株：Ｋ５６２、ＫＧ１、ＭＵＴＺ−３、またはそれらに由来する細胞もしくは細胞株、またはこうした上述の細胞の少なくとも１つを含む細胞もしくは細胞株の混合物から選択される。宿主細胞は、好ましくは、ＮＭ−Ｈ９Ｄ８、ＮＭ−Ｈ９Ｄ８−Ｅ６、ＮＭ Ｈ９Ｄ８−Ｅ６Ｑ１２、および前記宿主細胞のいずれか１つに由来する細胞または細胞株からなる群から選択される。こうした細胞株およびそれらの特性は、ＷＯ２００８／０２８６８６Ａ２に詳細に記載されている。さらなる実施形態では、宿主細胞は、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−９０９６の細胞株など、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−細胞株である。好ましい実施形態では、宿主細胞は、特定のグリコシル化パターンを有する糖タンパク質、特に抗体を発現するために最適化される。好ましくは、発現カセットもしくはベクター中の核酸および／またはプロモーターおよびさらなるエレメントのコード領域のコドン使用頻度は、宿主細胞のタイプと適合性であり、より好ましくは使用される宿主細胞のタイプのために最適化されている。好ましくは、抗体は、上記に記載のような宿主細胞または細胞株により産生される。
抗体を産生するための方法では、本明細書に記載のような宿主細胞が使用される。本方法は、特に、抗体をコードする核酸を含む宿主を準備するステップ、抗体の発現に好適な条件下で宿主細胞を培養するステップ、および宿主細胞により発現された抗体を得るステップを含む。本明細書に記載の抗体は、前記方法により得てもよくまたは得ることができてもよい。
別の態様では、本発明は、本発明によるコンジュゲートを含む組成物を提供する。さらに、組成物は、溶媒、希釈剤、および賦形剤からなる群から選択される１つまたは複数のさらなる成分を含んでいてもよい。好ましくは、組成物は医薬組成物である。この実施形態では、組成物の成分は、好ましくは、すべて薬学的に許容される。組成物は、固形組成物もしくは流体組成物、特に、好ましくは水性の溶液、エマルジョン、もしくは懸濁物、または凍結乾燥粉末であってもよい。
医薬における使用
コンジュゲートは、特に、医薬において、特に、疾患、特に本明細書に記載のような疾患、好ましくはがん、感染症、炎症性疾患、移植片対宿主病、および免疫不全の治療、診断、予後、検出、および／またはモニタリングにおいて有用である。
したがって、さらなる態様では、本発明は、医薬において使用するためのコンジュゲートまたは組成物を提供する。好ましくは、医薬における使用は、例えば、がんなどの異常細胞増殖に関連する疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、または寄生虫感染症などの感染症、自己免疫疾患および炎症性腸疾患などの炎症性疾患、ならびに免疫不全などの免疫活性低減に関連する疾患の治療、予後、診断、検出、および／またはモニタリングにおける使用である。好ましい実施形態では、疾患はがんである。
好ましくは、がんは、好ましくは、免疫組織化学法、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、酵素免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイ、ドットブロット法、オクテルロニー試験、または対向免疫電気泳動法（ＣＩＥ）、またはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法により検出可能な、ＭＵＣ１（ＴＡ−ＭＵＣ１）の検出可能な発現を示す。がんは、特に、免疫組織化学法またはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法により検出可能であるＭＵＣ１（ＴＡ−ＭＵＣ１）発現を示す細胞を含む。がんは、抗ＭＵＣ１抗体の投与前に、ＭＵＣ１（ＴＡ−ＭＵＣ１）レベルが試験されていてもよい。
本発明は、本発明によるコンジュゲートを含むキットおよびデバイス、ならびにがんなどのＭＵＣ１関連障害の診断、検出、またはモニタリングに有用な関連方法をさらに提供する。一部の実施形態では、本発明のコンジュゲートを含む、試験または診断のためのサンドイッチＥＬＩＳＡキットが提供される。このキットは、ＭＵＣ１（ＴＡ−ＭＵＣ１）タンパク質標準物質の溶液、着色試薬、希釈のための緩衝溶液、固相用の抗体、検出用の抗体、および洗浄溶液などの１つまたは複数をさらに含んでいてもよい。好ましくは、抗原に結合されたコンジュゲートの量は、吸光法、蛍光法、ルミネセンス法、または放射性同位体（ＲＩ）法などの方法を応用することにより測定することができる。好ましくは、吸光度プレートリーダー、蛍光プレートリーダー、ルミネセンスプレートリーダー、またはＲＩ液体シンチレーション計数器などが測定に使用される。
抗体は、免疫組織化学法（ＩＨＣ）分析に使用することができる。
免疫組織化学法は、この手法が組織切片を抗原結合性抗体（一次抗体）と反応させること、および抗原と結合した一次抗体を検出することを含む限り、特に限定されない。
転移を含む様々な形態のがんを、本発明によるコンジュゲートで治療することができる。がんは、特に、結腸がん、肺がん、卵巣がん、三種陰性乳がんなどの乳がん、膵臓がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、消化管がん、腎臓がん、頭頸部がん、甲状腺がん、および尿路上皮がんからなる群から選択することができる。さらに、がんは、特に、胃がん、肝臓がん、膀胱がん、皮膚がん、前立腺がん、および血液がんから選択することができる。ある特定の実施形態では、がんは、転移性がんである。がんは、皮膚転移、リンパ節転移、肺転移、肝転移、腹膜転移、胸膜転移、および／または脳転移など、任意のタイプの転移を含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、がんは炎症性表現型を有する。こうした実施形態では、上記に記載のがんタイプはいずれも、炎症性がんであり得る。
ある特定の実施形態では、ウイルス感染症は、ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタインバーウイルス、インフルエンザウイルス、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、またはＣ型肝炎ウイルスにより引き起こされる。炎症性疾患は、炎症性腸疾患、骨盤内炎症性疾患、虚血性脳卒中、アルツハイマー病、喘息、尋常性天疱瘡、および皮膚炎／湿疹から選択することができる。自己免疫疾患は、セリアック病、１型糖尿病、グレーブス病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、白斑、乾癬性関節炎、アトピー性皮膚炎、硬皮症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変症、ギラン−バレー症候群、自己免疫性肝炎、および強直性脊椎炎からなる群から選択することができる。ある特定の実施形態では、疾患は、ＭＵＣ１、特にＴＡ−ＭＵＣ１を発現する細胞を含むかまたは関連する。例えば、治療しようとするがんは、ＭＵＣ１陽性、特にＴＡ−ＭＵＣ１陽性、つまりＭＵＣ１、特にＴＡ−ＭＵＣ１を発現するがん細胞を含む。
具体的な実施形態では、コンジュゲートは、別の療法剤と組み合わせて治療するために、特に、別の抗がん剤と組み合わせてがんを治療するために使用される。前記さらなる療法剤は、任意の公知の抗がん剤であってもよい。本発明によるコンジュゲートと組み合わせることができる好適な抗がん療法剤は、化学療法剤、他の抗体、免疫刺激剤、サイトカイン、ケモカイン、およびワクチンであってもよい。さらに、コンジュゲートによる療法は、放射線療法、外科手術、および／または中国伝統医学と組み合わせることができる。
コンジュゲートと組み合わせて使用することができる抗がん剤は、任意の化学療法剤、特に、ＭＵＣ１陽性がんの治療に有効であることが公知である化学療法剤から選択することができる。化学療法剤のタイプは、治療しようとするがんにも依存する。組合せパートナーは、以下のものからなる群から選択することができる：パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ）、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）、およびＳＢＴ−１２１４などのタキサン；シクロホスファミド；イマチニブ；パゾパニブ；カペシタビン；シタラビン；ビノレルビン；ゲムシタビン；ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、およびミトキサントロンなどのアントラサイクリン；アミノグルテチミド、テストラクトン（Ｔｅｓｌａｃ）、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ）、レトロゾール（Ｆｅｍａｒａ）、エキセメスタン（Ａｒｏｍａｓｉｎ）、ボロゾール（Ｒｉｖｉｚｏｒ）、ホルメスタン（Ｌｅｎｔａｒｏｎ）、ファドロゾール（Ａｆｅｍａ）、４−ヒドロキシアンドロステンジオン、１，４，６−アンドロスタトリエン−３，１７−ジオン（ＡＴＤ）、および４−アンドロステン−３，６，１７−トリオン（６−オキソ）などのアロマターゼ阻害剤；イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、ラメラリンＤ、エトポシド（ＶＰ−１６）、テニポシド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ミトキサントロン、アムサクリン、エリプチシン、オーリントリカルボン酸、およびＨＵ−３３１などのトポイソメラーゼ阻害剤；ｃｉｓ−ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ）（シスプラチン）、ｃｉｓ−ジアンミン（１，１−シクロブタンジカルボキシラト）白金（ＩＩ）（カルボプラチン）、および［（１Ｒ，２Ｒ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン］（エタンジオアト−Ｏ，Ｏ’）白金（ＩＩ）（オキサリプラチン）などの白金に基づく化学療法剤；オラパリブ、ルカパリブ、およびニラパリブなどのＰＡＲＰ阻害剤；イミキモドおよびレシキモドなどのＴＬＲアゴニスト；ならびに代謝拮抗剤、特にメトトレキサート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、およびプララトレキサートなどの抗葉酸剤、フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｕｒａｃｉｌ）、ゲムシタビン、フロクスウリジン、５−フルオロウラシル、およびテガフール−ウラシルなどのピリミジン類似体、およびプリン類似体、選択的エストロゲン受容体修飾因子、およびエストロゲン受容体下方制御因子。
さらに、治療用抗体を、さらなる組合せパートナーとして使用することもできる。治療用抗体は、抗ＭＵＣ１抗体とは異なるがん療法に有用な任意の抗体であってもよい。特に、さらなる抗体は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）、欧州医薬品庁（ＥＭＡ、以前はＥＭＥＡ）、および医薬品医療機器連邦研究所（ＢｆＡｒＭ、Ｂｕｎｄｅｓｉｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｒ Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ ｕｎｄ Ｍｅｄｉｚｉｎｐｒｏｄｕｋｔｅ）などの当局により、がん治療のために承認されている。組合せ治療に使用することができるさらなる抗体の例は、セツキシマブ、トムゾツキシマブ（Ｔｏｍｕｚｏｔｕｘｉｍａｂ）、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、およびネシツムマブなどの抗ＥＧＦＲ抗体；トラスツズマブ、チミグツズマブ（Ｔｉｍｉｇｕｔｕｚｕｍａｂ）、およびペルツズマブなどの抗ＨＥＲ２抗体；ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）などの抗ＶＥＧＦ抗体；アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）などの抗ＣＤ５２抗体；ブレンツキシマブ（Ａｄｃｅｔｒｉｓ）などの抗ＣＤ３０抗体；ゲムツズマブ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）などの抗ＣＤ３３抗体；ならびにリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ、Ｍａｂｔｈｅｒａ）、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ）、およびイブリツモマブ（Ｚｅｖａｌｉｎ）などの抗ＣＤ２０抗体である。本明細書に記載のがん療法との組合せに好適なさらなる例示的な抗体としては、以下のものからなる群から選択される抗原に対する抗体が挙げられる：トムゼン−フリーデンライヒ抗原（ＴＦα、ＴＦβ）、Ｔｎ、ルイスＹ、ＣＤ４４、葉酸受容体α、ＮｅｕＧｃ−ＧＭ３ガングリオシド、ＤＬＬ−３、ＲＡＮＫＬ、ＰＴＫ７、Ｎｏｔｃｈ−３、エフリンＡ４、インスリン様成長因子受容体１、アクチビン受容体様キナーゼ−１、クローディン−６、ジシアロガングリオシドＧＤ２、エンドグリン、膜貫通糖タンパク質ＮＭＢ、ＣＤ５６、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー２、組織因子、エクトヌクレオドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ３、ＣＤ７０、Ｐ−カドヘリン、メソテリン、６回膜貫通前立腺上皮抗原１（ＳＴＥＡＰ１）、癌胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）、ネクチン４、グアニリルシクラーゼＣ、溶質輸送体ファミリー４４メンバー４（ＳＬＣ４４Ａ４）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、亜鉛トランスポーターＺＩＰ６（ＬＩＶ１（ＺＩＰ６））、ＳＬＩＴおよびＮＴＲＫ様タンパク質６（ＳＬＩＴＲＫ６）、栄養芽層糖タンパク質（ＴＰＢＧ；５Ｔ４）、Ｆｙｎ３、炭酸脱水酵素９、ＮａＰｉ２ｂ、フィブロネクチンエクストラドメインＢ（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｅｘｔｒａ−ｄｏｍａｉｎ Ｂ）、エンドセリン受容体ＥＴＢ、ＶＥＧＦＲ２（ＣＤ３０９）、テネイシンｃ、コラーゲンＩＶ、およびペリオスチン。
コンジュゲートは、チェックポイント抗体、つまり免疫調節性標的を阻止または活性化する抗体とさらに組み合わせることができる。それにより、免疫応答の阻害シグナルを阻止することができ、および／または活性化シグナルを誘発することができる。それぞれの標的の例としては、活性化標的としてのＣＤ４０、ＣＤ３、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０リガンド）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、およびＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、阻害性標的としてのＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＣＤ８０、ＣＤ２４４、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、およびホスファチジルセリン、ならびにＰＤＬ１などのそれらの対応するリガンドが挙げられる。
さらなる実施形態では、コンジュゲートは、ケモカイン、サイトカイン、増殖因子、およびワクチンなどの免疫調節性化合物による治療と組み合わせることができる。この点で好適なサイトカインとしては、インターフェロン−α、インターフェロン−β、およびインターフェロン−γなどのインターフェロン、ならびにインターロイキンが挙げられる。好適な増殖因子としては、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦが挙げられる。
コンジュゲートは、好ましくは、原発腫瘍、そのような腫瘍の再発性腫瘍および／または転移の治療に使用され、特に、外科手術前、外科手術中、または外科手術後の治療に、および転移の予防または治療に使用される。コンジュゲートは、特に、アジュバント療法として患者を治療するためのものである。ある特定の実施形態では、コンジュゲートは、ネオアジュバント治療として、またはネオアジュバント−アジュバント併用療法として患者を治療するためのものである。さらに、コンジュゲートは、対処療法として患者を治療するためのものである。
コンジュゲートによるがん療法は、好ましくは、腫瘍増殖の阻害、および特に腫瘍サイズの低減をもたらす。さらに、治療により、さらなる転移の発生が予防され、および／または転移の数が低減される。治療は、好ましくは、無進行生存の増加および／または寿命の増加およびしたがって全生存の増加をもたらす。
本発明は、本発明によるコンジュゲートを使用して、疾患を治療、診断、予後、検出、および／またはモニタリングする方法をさらに提供する。医薬におけるコンジュゲートの使用の実施形態および例も同様に、医学的方法に適用される。特に、それを必要とする対象の疾患を治療するための方法であって、本発明によるコンジュゲートの治療有効量を対象に投与することを含む方法が提供される。
例えば、本発明は、それを必要とする対象のがんを治療するための方法であって、本発明によるコンジュゲートの治療有効量を、がんを有する対象に投与することを含む方法を提供する。具体的な実施形態では、がんは、ＴＡ−ＭＵＣ１を発現することにより特徴付けられる。がんは、卵巣がん、乳がん、膵臓がん、肺がん、結腸がん、胃がん、肝臓がん、腎臓がん、血液がん、子宮内膜がん、甲状腺がん、白血病、半水癌、黒色腫、癌腫、奇形腫、リンパ腫、肉腫、中皮腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、直腸がん、副腎がん、皮膚がん、脳がん、子宮頸がん、腸管がん、腸がん、頭頸部がん、消化管がん、リンパ節がん、食道がん、結腸直腸がん、耳鼻咽喉（ＥＮＴ）がん、前立腺がん、膀胱がん、子宮がん、およびそれらの転移からなる群から選択することができる。
さらに、本発明は、がんを診断、検出、またはモニタリングするための方法であって、試験試料を本発明によるコンジュゲートと接触させるステップを含む方法を提供する。
ＭＵＣ１結合親和性を増加させるための方法
抗体のＭＵＣＩ結合親和性を増加させる方法は、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ−Ｈ１、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、ならびに
（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域
を含んでいてもよく、
方法は、ＣＤＲ−Ｈ２の８位のアミノ酸残基を、アスパラギン以外の任意のアミノ酸残基に置換して、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２をもたらすステップを含む。
ＭＵＣ１結合親和性を増加させようとする抗体は、特に、ＣＤＲ−Ｈ２配列の８位にアスパラギンを含む以外は、本明細書に記載のような、ＭＵＣ１に結合することが可能な抗体である。
ある特定の実施形態では、ＭＵＣ１結合親和性を増加させようとする抗体の重鎖可変領域は、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。特に、重鎖可変領域は、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、特に少なくとも９８％同一あるアミノ酸配列を含む。こうした実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１、８、および３のアミノ酸配列を有するＣＤＲを依然として含む。したがって、配列番号１１に対する任意の配列逸脱は、フレームワーク領域に位置するが、ＣＤＲには位置しない。特に、重鎖可変領域は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、ＭＵＣ１結合親和性を増加させようとする抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。特に、軽鎖可変領域は、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、特に少なくとも９８％同一あるアミノ酸配列を含む。こうした実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号４、５、および６のアミノ酸配列を有するＣＤＲを依然として含む。したがって、配列番号１２に対する任意の配列逸脱は、フレームワーク領域に位置するが、ＣＤＲには位置しない。特に、軽鎖可変領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
具体的な実施形態では、ＭＵＣ１結合親和性を増加させようとする抗体の重鎖可変領域は、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲは、配列番号１、８、および３のアミノ酸配列を依然として有し、軽鎖可変領域は、配列番号１２のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲは、配列番号４、５、および６のアミノ酸配列を依然として有する。特に、重鎖可変領域は、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲは、配列番号１、８、および３のアミノ酸配列を依然として有し、軽鎖可変領域は、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲは、配列番号４、５、および６のアミノ酸配列を依然として有する。
例えば、ＭＵＣ１結合親和性を増加させようとする抗体は、ＷＯ２００４／０６５４２３Ａ２またはＷＯ２０１１／０１２３０９Ａ１に記載のような抗ＭＵＣ１抗体である。特に、ＭＵＣ１結合親和性を増加させようとする抗体は、ガチポツズマブ（ｇａｔｉｐｏｔｕｚｕｍａｂ）またはＰａｎｋｏＭａｂである。
ＭＵＣ１結合親和性を増加させる抗体は、特に、本明細書に記載のような、ＭＵＣ１に結合することが可能な抗体である。
ある特定の実施形態では、ＭＵＣ１結合は、本明細書に記載の通りである。ＴＡ−ＭＵＣ１結合親和性の増加は、特に、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３３％、または少なくとも５０％の増加を指す。好ましい実施形態では、ＭＵＣ１結合親和性は、少なくとも５０％増加される。ＭＵＣ１結合親和性は、実施例に記載のように、特に、例えば実施例４ａおよび４ｂに記載のように、表面プラズモン共鳴分析またはｓｗｉｔｃｈＳＥＮＳＥ（登録商標）技術（ＤＲＸ２バイオセンサー、Ｄｙｎａｍｉｃ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ＧｍｂＨ製）を使用して決定することができる。
ある特定の実施形態では、ＣＤＲ−Ｈ２の８位のアミノ酸残基を置換するステップは、抗体をコードする核酸に突然変異を導入することにより達成され、突然変異は、前記アミノ酸残基をコードするコドンに導入される。突然変異の導入は、任意の方法により実施することができる。幾つかの好適な方法が当技術分野で公知であり、当業者であれば、突然変異を導入するために必要な作業を実施することが可能である。その後、突然変異核酸を、例えば宿主細胞にて発現させることより、ＭＵＣ１結合親和性が増加された抗体を得ることができる。抗体を産生するための核酸、宿主細胞、および方法は、本明細書に記載されており、ＭＵＣ１結合親和性を増加させる方法のために使用することができる。
具体的な実施形態では、抗体のＭＵＣ１結合親和性を増加させる方法は、
（ａ）ＭＵＣ１結合親和性を増加させようとする抗体をコードする核酸を準備するステップ、
（ｂ）前記核酸に突然変異を導入して突然変異核酸を産生し、突然変異は、ＣＤＲ−Ｈ２の８位のアミノ酸残基をコードするコドンに、前記コドンがアスパラギン以外の任意のアミノ酸残基をコードするように導入されるステップ、および
（ｃ）突然変異核酸を発現させて、ＭＵＣ１結合親和性が増加された抗体を産生するステップを含む。
ＭＵＣ１結合親和性が増加された抗体を産生する方法は、
（ａ）
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ−Ｈ１、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、ならびに
（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域
を含む抗体をコードする核酸を準備するステップ、
（ｂ）前記核酸に突然変異を導入して突然変異核酸を産生し、突然変異は、ＣＤＲ−Ｈ２の８位のアミノ酸残基をコードするコドンに、前記コドンがアスパラギン以外の任意のアミノ酸残基をコードするように導入されるステップ、ならびに
（ｃ）突然変異核酸を宿主細胞にて発現させることより、ＭＵＣ１結合親和性が増加された抗体を産生するステップ
を含んでいてもよい。
他の態様のための、特に、抗体のＭＵＣ１結合親和性を増加させる方法のための、本明細書に記載されている実施形態、特徴、および例は、ＭＵＣ１結合親和性が増加された抗体を産生する方法にも同様に適用される。
ある特定の実施形態では、ＭＵＣ１結合親和性が増加された抗体を産生する方法は、ＭＵＣ１結合親和性が増加された抗体を処理するステップ（ｄ）をさらに含む。
例えば、ＭＵＣ１結合親和性が増加された抗体の処理は、細胞培養から抗体を単離することを含んでいてもよい。抗体の単離は、特に、細胞培養の残りの成分から抗体を分離することを指す。細胞培養培地からの抗体の分離は、例えば、クロマトグラフィー法により実施することができる。抗体を単離するための好適な方法および手段は、当技術分野で公知であり、当業者であれば容易に適用することができる。
任意選択で、得られた抗体を、例えば、さらなる作用剤を抗体に化学的または酵素的にカップリングすることなどの修飾ステップおよび／または所望の質および組成の抗体を産生するための製剤化ステップなどのさらなる処理ステップに供してもよい。そのようなさらなる処理ステップおよび方法は、当技術分野で一般に公知である。
さらなる実施形態では、ステップ（ｄ）は、抗体を含む医薬製剤を提供するステップをさらに含む。抗体を含む医薬製剤を提供すること、または抗体を医薬組成物として製剤化することは、特に、抗体を含む組成物の緩衝溶液または緩衝溶液成分を交換することを含む。さらに、このステップは、抗体を凍結乾燥することを含んでいてもよい。特に、抗体は、薬学的に許容される成分のみを含む組成物へと移される。
産生方法１
下記に示されている式（１）により表される抗体−薬物コンジュゲートであって、抗体はチオエーテルを介してリンカー構造に接続されている抗体−薬物コンジュゲートは、抗体を還元することによりジスルフィド結合から変換されたスルフヒドリル基を有する抗体を、公知の方法により得ることができる（例えば特許公開文献、米国特許出願第２０１６／２９７８９０号明細書に記載の方法（例えば、段落［０３３６］〜［０３７４］に記載の方法）により得ることができる）化合物（２）と反応させることにより産生することができる。この抗体−薬物コンジュゲートは、例えば、以下の方法により産生することができる。
Figure 2021524852
式中、ＡＢは、スルフヒドリル基を有する抗体（３ａ）を表し、
Ｌ１は、-(Succinimid-3-yl-N)-により表される構造を有し、
Ｌ１’は、以下の式：
Figure 2021524852
により表されるマレイミジル基を表す。
−Ｌ１−ＬＸは、以下の式のいずれかにより表される構造を有する。
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,および
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
それらの中で、もっと好ましいのは、以下のものである。
-(Succinimid-3-yl-N)- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-, および
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
さらに好ましいのは、以下のものである。
-(Succinimid-3-yl-N)- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,および
-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH--CH2CH2CH2-C(=O)-
（ＮＨ−ＤＸ）は、以下の式：
Figure 2021524852
により表される構造を有し、
これは、エキサテキカンの１位のアミノ基の１つの水素原子を除去することにより導出される基を表す。上記に記載の反応スキーム（式８）では、式（１）の化合物は、薬物からリンカー末端までの１つの構造部分が１つの抗体に接続されている構造を有するものと解釈することができる。しかしながら、この説明は、便宜的に示されるものであり、複数の上述の構造部分が１つの抗体分子に接続されている場合が実際には多く存在する。同じことが、下記に記載の産生方法の説明にも当てはまる。
具体的には、抗体−薬物コンジュゲート（１）は、公知の方法（例えば、特許公開文献、米国特許出願第２０１６／２９７８９０号明細書に記載の方法（例えば、段落［０３３６］〜［０３７４］に記載の方法）により得ることができる化合物（２）を、スルフヒドリル基を有する抗体（３ａ）と反応させることにより産生することができる。
抗体（３ａ）へのスルフヒドリル基の提供は、当業者に周知の方法により達成することができる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、５６〜１３６ページ、４５６〜４９３ページ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６））。方法の例としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：Ｔｒａｕｔ試薬を抗体のアミノ基と反応させること；Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアルカノアートを抗体のアミノ基と反応させ、続いてヒドロキシルアミンと反応させること；Ｎ−スクシンイミジル３−（ピリジルジチオ）プロピオネートを、抗体と反応させ、続いて還元剤と反応させること；抗体を、ジチオトレイトール、２−メルカプトエタノール、またはＴｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）などの還元剤と反応させて、スルフヒドリル基が形成されるように抗体の鎖間ジスルフィド結合を還元すること。
具体的には、鎖間ジスルフィド結合が部分的にまたは完全に還元された抗体は、抗体の鎖間ジスルフィド結合１つ当たり０．３〜３モル当量のＴＣＥＰを還元剤として使用し、キレート剤を含む緩衝液中で還元剤を抗体と反応させることにより得ることができる。キレート剤の例としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）を挙げることができる。キレート剤は、１ｍＭ〜２０ｍＭの濃度で使用することができる。リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、または酢酸ナトリウムなどの溶液を、緩衝溶液として使用することができる。具体的な例として、部分的にまたは完全に還元されたスルフヒドリル基を有する抗体（３ａ）は、４℃から３７℃にて１〜４時間にわたって抗体をＴＣＥＰと反応させることにより得ることができる。
薬物−リンカー部分に対するスルフヒドリル基の付加反応を実施することにより、薬物−リンカー部分をチオエーテル結合でコンジュゲートすることができることが留意されるべきである。
次いで、スルフヒドリル基を有する抗体（３ａ）１つ当たり２〜２０モル当量の化合物（２）を使用して、１抗体当たり２〜８つの薬物分子がコンジュゲートされている抗体−薬物コンジュゲート（１）を産生することができる。具体的には、そこに溶解されている化合物（２）を含む溶液を、スルフヒドリル基を有する抗体（３ａ）を含む緩衝液に添加して反応させてもよい。この状況では、酢酸ナトリウム溶液、リン酸ナトリウム、またはホウ酸ナトリウムなどを緩衝溶液として使用することができる。反応させるためのｐＨは５〜９であり、より好ましくはｐＨ７付近で反応を実施してもよい。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、またはＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）などの有機溶媒を、化合物（２）を溶解するための溶媒として使用することができる。反応は、１〜２０容積／容積％で有機溶媒に溶解されている化合物（２）を含む溶液を、スルフヒドリル基を有する抗体（３ａ）を含む緩衝溶液に添加することにより実施してもよい。反応温度は、０〜３７℃、より好ましくは１０〜２５℃であり、反応時間は、０．５〜２時間である。反応は、未反応化合物（２）とチオール含有試薬との反応性を不活化することにより終了させることができる。チオール含有試薬は、例えば、システインまたはＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）である。より具体的には、反応は、１〜２モル当量のＮＡＣを、使用されている化合物（２）に添加し、得られた混合物を室温で１０〜３０分間にわたってインキュベートすることにより終了させることができる。
抗体−薬物コンジュゲートの特定
産生された抗体−薬物コンジュゲート（例えば、抗体−薬物コンジュゲート（１））を、下記に記載の共通手順に従って、濃縮、緩衝液交換、精製、ならびに抗体濃度および１抗体分子当たりのコンジュゲートされた薬物分子の平均数の測定に供して、薬物−抗体コンジュゲート（１）を特定することができる。
１．共通手順Ａ：抗体または抗体−薬物コンジュゲートの水溶液の濃縮
Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（５０，０００ＭＷＣＯ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）容器に、抗体または抗体−薬物コンジュゲートの溶液を添加し、抗体または抗体−薬物コンジュゲートの溶液を、遠心分離機（Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ−１５Ｒ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を使用して遠心分離（２０００Ｇ〜４０００Ｇで５〜３０分間の遠心分離）することにより濃縮した。
２．共通手順Ｂ：抗体濃度の測定
ＵＶ検出器（Ｎａｎｏｄｒｏｐ １０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を使用して、製造業者により規定された方法に従って、抗体濃度の測定を実施した。この点で、抗体で異なる２８０ｎｍ吸光係数を使用した（１．３ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１〜１．８ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１）。
３．共通手順Ｃ：抗体の緩衝液交換
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５担体が使用されているＮＡＰ−２５カラム（カタログ番号１７−０８５２−０２、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｊａｐａｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、製造業者により規定された方法に従って、塩化ナトリウム（５０ｍＭ）およびＥＤＴＡ（２ｍＭ）を含むリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０）（本明細書ではＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡと呼ばれる）で平衡化した。抗体の水溶液を、ＮＡＰ−２５カラム１つ当たり２．５ｍＬの量でアプライし、その後３．５ｍＬのＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡで溶出させた画分（３．５ｍＬ）を収集した。この画分を共通手順Ａに従って濃縮した。共通手順Ｂを使用して抗体の濃度を測定した後、ＰＢＳ６．０／ＥＤＴＡを使用して抗体濃度を２０ｍｇ／ｍＬに調整した。
４．共通手順Ｄ：抗体−薬物コンジュゲートの精製
ＮＡＰ−２５カラムを、ソルビトール（５％）を含む酢酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ５．５；本明細書ではＡＢＳと呼ばれる）などの任意の市販の緩衝液で平衡化した。抗体−薬物コンジュゲートの水性反応溶液（およそ２．５ｍＬ）を、ＮＡＰ−２５カラムにアプライし、その後、製造業者により規定された量の緩衝液で溶出を実施して抗体画分を収集した。収集した画分をＮＡＰ−２５カラムに再びアプライし、緩衝溶液で溶出を実施したゲル濾過精製工程を、合計で２回または３回繰り返して、未コンジュゲート薬物リンカーおよび低分子量化合物（ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）、およびジメチルスルホキシド）を除く抗体−薬物コンジュゲートを得た。
５．共通手順Ｅ：抗体−薬物コンジュゲートの抗体濃度および１抗体分子当たりのコンジュゲートされた薬物分子の平均数の測定
抗体−薬物コンジュゲートのコンジュゲートされた薬物濃度は、抗体−薬物コンジュゲートの水溶液のＵＶ吸光度を２８０ｎｍおよび３７０ｎｍの２つの波長で測定し、その後下記に示されている計算を実施することにより算出することができる。
任意の所与の波長での総吸光度は、系に存在するすべての光吸収性化学種の吸光度の合計と等しい［吸光度の相加性］。したがって、抗体および薬物のモル吸光係数が、抗体と薬物とのコンジュゲーション前後で変わらないという仮説に基づくと、抗体−薬物コンジュゲートの抗体濃度および薬物濃度は、以下の等式により表される。
Ａ２８０＝ＡＤ，２８０＋ＡＡ，２８０＝εＤ，２８０ＣＤ＋εＡ，２８０ＣＡ 等式（１）
Ａ３７０＝ＡＤ，３７０＋ＡＡ，３７０＝εＤ，３７０ＣＤ＋εＡ，３７０ＣＡ 等式（２）
この状況中では、Ａ２８０は、抗体−薬物コンジュゲートの水溶液の２８０ｎｍでの吸光度を表し、Ａ３７０は、抗体−薬物コンジュゲートの水溶液の３７０ｎｍでの吸光度を表し、ＡＡ，２８０は、２８０ｎｍでの抗体の吸光度を表し、ＡＡ，３７０は、３７０ｎｍでの抗体の吸光度を表し、ＡＤ，２８０は、２８０ｎｍでのコンジュゲート前駆体の吸光度を表し、ＡＤ，３７０は、３７０ｎｍでのコンジュゲート前駆体の吸光度を表し、εＡ，２８０は、２８０ｎｍでの抗体のモル吸光係数を表し、εＡ，３７０は、３７０ｎｍでの抗体のモル吸光係数を表し、εＤ，２８０は、２８０ｎｍでのコンジュゲート前駆体のモル吸光係数を表し、εＤ，３７０は、３７０ｎｍでのコンジュゲート前駆体のモル吸光係数を表し、ＣＡは、抗体−薬物コンジュゲートの抗体濃度を表し、ＣＤは、抗体−薬物コンジュゲートの薬物濃度を表す。
この状況では、εＡ，２８０、εＡ，３７０、εＤ，２８０、およびεＤ，３７０に関しては、予備的に準備された値（計算に基づく推定値または化合物のＵＶ測定により得られる測定値）を使用する。例えば、εＡ，２８０は、公知の計算方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９５年、４巻、２４１１〜２４２３ページ）により、抗体のアミノ酸配列から推定することができる。εＡ，３７０は一般にゼロである。εＤ，２８０、およびεＤ，３７０は、使用したコンジュゲート前駆体がある特定のモル濃度に溶解されている溶液の吸光度を測定することにより、ランベルト−ベールの法則（吸光度＝モル濃度×モル吸光係数×セル光路長）に従って得ることができる。ＣＡおよびＣＤは、抗体−薬物コンジュゲートの水溶液のＡ２８０およびＡ３７０を測定し、次いでこうした値を代入することによって連立方程式（１）および（２）を解くことにより決定することができる。さらに、ＣＤをＣＡで除算することにより、１抗体当たりのコンジュゲートされた薬物分子の平均数を決定することができる。
６．共通手順Ｆ：抗体−薬物コンジュゲートの１抗体分子当たりのコンジュゲートされた薬物分子の平均数の測定−（２）
また、抗体−薬物コンジュゲートの１抗体分子当たりのコンジュゲートされた薬物分子の平均数は、上述の「５．共通手順Ｅ」に加えて、以下の方法を使用して高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析により決定することができる。以降、抗体をジスルフィド結合により薬物リンカーにコンジュゲートする場合に、コンジュゲートされた薬物分子の平均数をＨＰＬＣにより測定する方法を記載するものとする。この方法を参照すると、当業者であれば、抗体と薬物リンカーとの接続パターンに応じて、コンジュゲートされた薬物分子の平均数をＨＰＬＣにより適切に測定することが可能である。
Ｆ−１． ＨＰＬＣ分析用の試料の調製（抗体−薬物コンジュゲートの還元）
抗体−薬物コンジュゲート溶液（およそ１ｍｇ／ｍＬ、６０μＬ）を、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）の水溶液（１００ｍＭ、１５μＬ）と混合する。混合物を３７℃で３０分間インキュベートすることにより、抗体−薬物コンジュゲートの軽鎖と重鎖との間のジスルフィド結合を切断する。得られる試料をＨＰＬＣ分析に使用する。
Ｆ−２． ＨＰＬＣ分析
ＨＰＬＣ分析を、以下の測定条件下で実施する。
ＨＰＬＣ装置：Ａｇｉｌｅｎｔ１２９０ ＨＰＬＣ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）
検出器：紫外線吸光分光計（測定波長：２８０ｎｍ）
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｐｈｅｎｙｌ（２．１×５０ｍｍ、１．７μｍ、１３０オングストローム；Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．、Ｐ／Ｎ １８６００２８８４）
カラム温度：８０℃
移動相Ａ：０．１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および１５％２−プロパノールを含む水溶液
移動相Ｂ：０．０７５％ＴＦＡおよび１５％２−プロパノールを含むアセトニトリル溶液
勾配プログラム：１４％→３６％（０分から１５分）、３６％→８０％（１５分から１７分）、８０％→１４％（１７分から１７．０１分）、および１４％（１７．０１分から２５分）
試料注入：１０μＬ
または
ＨＰＬＣ装置：Ａｇｉｌｅｎｔ１２９０ ＨＰＬＣ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）
検出器：紫外線吸光分光計（測定波長：２８０ｎｍ）
カラム：ＰＬＲＰ−Ｓ（２．１×５０ｍｍ、８μｍ、１０００オングストローム；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｐ／Ｎ ＰＬ１９１２−１８０２）
カラム温度：８０℃
移動相Ａ：０．０４％水性ＴＦＡ溶液
移動相Ｂ：０．０４％ＴＦＡを含むアセトニトリル溶液
勾配プログラム：２９％→３６％（０分から１２．５分）、３６％→４２％（１２．５分から１５分）、４２％→２９％（１５分から１５．１分）、および２９％→２９％（１５．１分から２５分）
試料注入：１５μＬ
Ｆ−３．データ分析
Ｆ−３−１． 抗体の軽鎖および重鎖は、コンジュゲートされた薬物分子の数に応じてそれぞれＬｉおよびＨｉにより表される（ｉは、コンジュゲートされた薬物分子の数を表す。つまり、本発明によるコンジュゲートされた薬物分子の数は、Ｌ０、Ｌ１、Ｈ０、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３などにより表される）。
未コンジュゲート抗体軽鎖（Ｌ０）および重鎖（Ｈ０）と比較して、１つの薬物分子に結合された軽鎖（Ｌ１）、１つの薬物分子に結合された重鎖（Ｈ１）、２つの薬物分子に結合された重鎖（Ｈ２）、および３つの薬物分子に結合された重鎖（Ｈ３）は、コンジュゲートされた薬物分子の数に比例して、より高い疎水性を示し、したがってより長い滞留時間を有する。したがって、こうした鎖は、Ｌ０およびＬ１またはＨ０、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３の順序で溶出する。検出ピークは、滞留時間をＬ０およびＨ０と比較することにより、Ｌ０、Ｌ１、Ｈ０、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３のいずれかに帰属させることができる。
Ｆ−３−２． 薬物リンカーはＵＶを吸収するため、軽鎖または重鎖および薬物リンカーのモル吸光係数を使用し以下の数式に従って、コンジュゲートされた薬物リンカー分子の数に応じて、ピーク面積値を補正する。
［数式１］
ｉ個の薬物分子に結合された軽鎖のピーク面積の補正値（ＡＬｉ）
Figure 2021524852
εＬ，２８０：２８０ｎｍでの軽鎖のモル吸光係数
εＤ，２８０：２８０ｎｍでの薬物リンカーのモル吸光係数
ｉ：コンジュゲートされた薬物分子の数
［数式２］
ｉ個の薬物分子に結合された軽鎖のピーク面積の補正値（ＡＨｉ）
Figure 2021524852
εＨ，２８０：２８０ｎｍでの重鎖のモル吸光係数
εＤ，２８０：２８０ｎｍでの薬物リンカーのモル吸光係数
ｉ：コンジュゲートされた薬物分子の数
この状況では、公知の計算方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９５年、４巻、２４１１〜２４２３ページ）により各抗体の軽鎖または重鎖のアミノ酸配列から推定される値を、抗体の軽鎖または重鎖のモル吸光係数（２８０ｎｍ）として使用することができる。各薬物リンカーをメルカプトエタノールまたはＮ−アセチルシステインと反応させることによりマレイミド基をスクシンイミドチオエーテルに変換させた化合物の実際に測定されたモル吸光係数（２８０ｎｍ）を、薬物リンカーのモル吸光係数（２８０ｎｍ）として使用した。吸光度測定用の波長は、当業者であれば適切に設定することができるが、好ましくは、抗体のピークを測定することができる波長であり、より好ましくは２８０ｎｍである。
Ｆ−３−３． ピーク面積の補正値を合計するため、各鎖のピーク面積比（％）を以下の数式に従って算出する。
［数式３］
Figure 2021524852
Ｆ−３−４． 抗体−薬物コンジュゲートの１抗体分子当たりのコンジュゲートされた薬物分子の平均数を、以下の数式に従って算出する。
コンジュゲートされた薬物分子の平均数＝（Ｌ０ピーク面積比×０＋Ｌ０ピーク面積比×１＋Ｈ０ピーク面積比×０＋Ｈ１ピーク面積比×１＋Ｈ２ピーク面積比×２＋Ｈ３ピーク面積比×３）／１００×２
なお、コンジュゲートの量を確保するため、同様の条件下で産生された、ほとんど同じ（例えば、±１程度の）平均数のコンジュゲートされた薬物分子を有する複数のコンジュゲートを混合して、新しいロットを調製することができることが留意されるべきである。この場合、薬物分子の平均数は、混合前の薬物分子の平均数間に入る。
具体的な実施形態
下記には、本発明によるコンジュゲートの抗体部分の具体的な実施形態が記載されている。
実施形態１． ＭＵＣ１に結合することが可能な抗体であって、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、ならびに
（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域
を含む抗体。
実施形態２． ＣＤＲ−Ｈ２の８位のアミノ酸が、グルタミン、アラニン、バリン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、リジン、およびアルギニン、特にグルタミン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、リジン、およびアルギニンからなる群から選択され、特にグルタミンである、実施形態１に記載の抗体。
実施形態３． ＣＤＲ−Ｈ２の８位のアミノ酸が、グルタミン、ヒスチジン、アルギニン、トリプトファン、またはリジンである、実施形態１に記載の抗体。
実施形態４． ＣＤＲ−Ｈ２が、配列番号７のアミノ酸配列を有する、実施形態１から３のいずれか一項に記載の抗体。
実施形態５． ＣＤＲ−Ｈ２が、配列番号８のアミノ酸配列を有する、実施形態１に記載の抗体。
実施形態６． ＭＵＣ１に結合することが可能な抗体であって、
（ｉ）
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、ならびに
（ｉｉ）
（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域
を含む抗体。
実施形態７． ＭＵＣ１に結合することが可能な抗体であって、
（ｉ）
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、ならびに
（ｉｉ）
（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域
を含む抗体。
実施形態８． ＣＤＲ−Ｈ２の８位のアミノ酸が、グルタミン、アラニン、バリン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、リジン、およびアルギニン、特にグルタミン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、リジン、およびアルギニンからなる群から選択され、特にグルタミンである、実施形態６または７に記載の抗体。
実施形態９．ＣＤＲ−Ｈ２の８位のアミノ酸が、グルタミン、ヒスチジン、アルギニン、トリプトファン、またはリジンである、実施形態７または８に記載の抗体。
実施形態１０． ＭＵＣ１に結合することが可能な抗体であって、
（ｉ）
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ−Ｈ１、配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、ならびに
（ｉｉ）
（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域
を含む抗体。
実施形態１１． ＭＵＣ１に結合することが可能な抗体であって、
（ｉ）
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ−Ｈ１、配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、ならびに
（ｉｉ）
（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域
を含む抗体。
実施形態１２． ＭＵＣ１に結合することが可能な抗体であって、
（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および
（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
を含む抗体。
実施形態１３． 配列番号９の５７位のアミノ酸が、グルタミン、アラニン、バリン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、リジン、およびアルギニン、特にグルタミン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、リジン、およびアルギニンからなる群から選択され、特にグルタミンである、実施形態１２に記載の抗体。
実施形態１４． 配列番号９の５７位のアミノ酸が、グルタミン、ヒスチジン、アルギニン、トリプトファン、またはリジンである、実施形態１２に記載の抗体。
実施形態１５． ＭＵＣ１に結合することが可能な抗体であって、
（ｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および
（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
を含む抗体。
実施形態１６． ＭＵＣ１に結合することが可能な抗体であって、
（ｉ）配列番号２０または２３のアミノ酸番号２０〜１３６により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および
（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸番号２１〜１３３により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
を含む抗体。
実施形態１７． ＭＵＣ１に結合することが可能な抗体であって、
（ｉ）
（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２または７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖、ならびに
（ｉｉ）
（ａ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域
を含む抗体。
実施形態１８． ＭＵＣ１に結合することが可能な抗体であって、
（ｉ）配列番号１５または配列番号２２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および
（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
を含む抗体。
実施形態１９． ＭＵＣ１に結合することが可能な抗体であって、
（ｉ）
（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ−Ｈ１、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、ならびに
（ｉｉ）
（ａ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域
を含む抗体。
実施形態２０． ＭＵＣ１に結合することが可能な抗体であって、
（ｉ）配列番号１９のアミノ酸番号２０〜４６０により表されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および
（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸番号２１〜２３９により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
を含む抗体。
実施形態２１． 重鎖可変領域、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む少なくとも１つの重鎖を含む、実施形態１から２０のいずれか一項に記載の抗体。
実施形態２２． 各々が重鎖可変領域、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む２つの重鎖を含む、実施形態１から２０のいずれか一項に記載の抗体。
実施形態２３． ＩｇＧ型抗体、特にＩｇＧ１型抗体、ＩｇＧ２型抗体、またはＩｇＧ４型抗体である、実施形態２１または２２に記載の抗体。
実施形態２４． 軽鎖可変領域およびＣＬドメインを含む少なくとも１つの軽鎖を含む、実施形態１から２３のいずれか一項に記載の抗体。
実施形態２５． 各々が軽鎖可変領域およびＣＬドメインを含む２つの軽鎖を含む、実施形態１から２３のいずれか一項に記載の抗体。
実施形態２６． 軽鎖が、κ型軽鎖である、実施形態２４または２５に記載の抗体。
実施形態２７． ＣＨ２ドメインにＮ−グリコシル化部位を含まない、実施形態１から２６のいずれか一項に記載の抗体。
実施形態２８． 抗体重鎖のＣＨ２ドメインにＮ−グリコシル化部位を含む、実施形態１から２６のいずれか一項に記載の抗体。
実施形態２９． 以下の特徴：
（ｉ）二分ＧｌｃＮＡｃ残基を保持するグリカンの相対量は、組成物中の抗体のグリコシル化部位に付着されているグリカンの合計量の少なくとも０．５％であること、
（ｉｉ）少なくとも１つのガラクトース残基を保持するグリカンの相対量は、組成物中の抗体のグリコシル化部位に付着されているグリカンの合計量の少なくとも３０％であること、
（ｉｉｉ）コアフコース残基を保持するグリカンの相対量は、組成物中の抗体のグリコシル化部位に付着されているグリカンの合計量の少なくとも６０％であること
の１つまたは複数を有するグリコシル化パターンを有する、実施形態２８に記載の抗体。
実施形態３０． 以下の特徴：
（ｉ）二分ＧｌｃＮＡｃ残基を保持するグリカンの相対量は、組成物中の抗体のグリコシル化部位に付着されているグリカンの合計量の少なくとも０．５％であること、
（ｉｉ）少なくとも１つのガラクトース残基を保持するグリカンの相対量は、組成物中の抗体のグリコシル化部位に付着されているグリカンの合計量の少なくとも３０％であること、
（ｉｉｉ）コアフコース残基を保持するグリカンの相対量は、組成物中の抗体のグリコシル化部位に付着されているグリカンの合計量の４０％またはそれよりも少ないこと
の１つまたは複数を有するグリコシル化パターンを有する、実施形態２８に記載の抗体。
下記には、本発明によるコンジュゲートの具体的な実施形態が記載されている。
実施形態３１． それにコンジュゲートされているさらなる作用剤、好ましくは細胞傷害剤を含む、実施形態１から３０のいずれか一項に記載の抗体。
実施形態３２． 細胞傷害剤が、抗体にカップリングされている化学療法剤である、実施形態３１に記載の抗体。
実施形態３３． 化学療法剤が、マイタンシノイドなどの微小管阻害剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡアルキル化剤、およびＤＮＡ副溝結合剤からなる群から選択される、実施形態３２に記載の抗体。
実施形態３４． 化学療法剤が、マイタンシノール、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン（ＤＭ１）、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシン（ＤＭ３）、およびＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシン（ＤＭ４）からなる群から選択される、実施形態３２に記載の抗体。
実施形態３５． 化学療法剤が、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ピロロベンゾジアゼピン二量体（ＰＢＤ二量体）、デュオカルマイシン、デュオカルマイシン−ヒドロキシベンズアミド−アザインドール（ＤＵＢＡ）、ｓｅｃｏ−デュオカルマイシン−ヒドロキシベンズアミド−アザインドール（ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡ）、およびドキソルビシンからなる群から選択される、実施形態３２に記載の抗体。
実施形態３６． 化学療法剤が、インドリノベンゾジアゼピンおよびオキサゾリジノベンゾジアゼピンからなる群から選択される、実施形態３２に記載の抗体。
実施形態３７． 化学療法剤が、カリチアマイシンである、実施形態３２に記載の抗体。
実施形態３８． 化学療法剤が、カンプトテシン、７−エチル−１０−ヒドロキシ−カンプトテシン（ＳＮ−３８）、（Ｓ）−９−ジメチルアミノメチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（トポテカン）、（１Ｓ，９Ｓ）−１−アミノ−９−エチル−５−フルオロ−１，２，３，９，１２，１５−ヘキサヒドロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０Ｈ，１３Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１０，１３−ジオン（エキサテキカン（ＤＸ−８９５１））、およびＤＸｄからなる群から選択される、実施形態３２に記載の抗体。
実施形態３９． 化学療法剤が、以下の式：
Figure 2021524852
により表される抗腫瘍化合物である、実施形態３２に記載の抗体。
実施形態４０． 化学療法剤が、以下の式：
Figure 2021524852
により表される抗腫瘍化合物である、実施形態３２に記載の抗体。
実施形態４１． 加えて、ポリペプチドまたはタンパク質であるさらなる作用剤が、抗体のポリペプチド鎖に融合されている、実施形態３１に記載の抗体。
実施形態４２． ２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖を含み、ポリペプチドまたはタンパク質であるさらなる作用剤は、前記抗体重鎖のＣ末端の各々に、または前記抗体軽鎖のＣ末端の各々に融合されている、実施形態４１に記載の抗体。
実施形態４３． さらなる作用剤が、サイトカイン、ケモカイン、他の抗体、抗原結合性断片、酵素、および結合ドメインからなる群から選択される、実施形態４１または４２に記載の抗体。
実施形態４４． さらなる作用剤が、ＣＤ３と特異的に結合するｓｃＦｖ断片であり、前記さらなる作用剤の１つは、各抗体重鎖のＣ末端に融合されている、実施形態４２に記載の抗体。
実施形態４５． さらなる作用剤が、ＰＤＬ１と特異的に結合するｓｃＦｖ断片であり、前記さらなる作用剤の１つは、各抗体軽鎖のＣ末端に融合されている、実施形態４２に記載の抗体。
実施形態４６． 細胞傷害剤、好ましくは、ＤＸ−８９５１またはＤＸｄなどのトポイソメラーゼＩ阻害剤が、以下の式（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
（ｂ）-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
（ｃ）-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
（ｄ）-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
（ｅ）-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, および
（ｆ）-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
からなる群から選択される任意の構造を有するリンカーを介して、それにコンジュゲートされており、
抗体は、-(Succinimid-3-yl-N)の末端に接続されており、抗腫瘍化合物は、１位のアミノ基の窒素原子を接続位置として、式（ａ）〜（ｆ）の最も右側の−（ＣＨ２）ｎ２−Ｃ（＝Ｏ）−部分（ｎ２は、１または３の整数を表す）のカルボニル基に接続されており、ＧＧＦＧは、ペプチド結合を介して連結されているグリシン−グリシン−フェニルアラニン−グリシンからなるアミノ酸配列を表し、
-(Succinimid-3-yl-N)-は、以下の式：
Figure 2021524852
により表される構造を有し、その３位で抗体に接続されており、１位の窒素原子上でこの構造を含むリンカー構造のメチレン基に接続されている、
実施形態３１から４５のいずれか一項に記載の抗体。
実施形態４７． 細胞傷害剤にコンジュゲートされている実施形態１から３０のいずれか一項に記載の抗体を含むコンジュゲート。
実施形態４８． 細胞傷害剤が、化学療法剤である、実施形態４７に記載のコンジュゲート。
実施形態４９． 化学療法剤が、微小管阻害剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡアルキル化剤、およびＤＮＡ副溝結合剤からなる群から選択される、実施形態４８に記載のコンジュゲート。
実施形態５０． 化学療法剤が、マイタンシノール、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン（ＤＭ１）、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシン（ＤＭ３）、およびＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシン（ＤＭ４）からなる群から選択される、実施形態４８に記載のコンジュゲート。
実施形態５１． 化学療法剤が、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ピロロベンゾジアゼピン二量体（ＰＢＤ二量体）、デュオカルマイシン、デュオカルマイシン−ヒドロキシベンズアミド−アザインドール（ＤＵＢＡ）、ｓｅｃｏ−デュオカルマイシン−ヒドロキシベンズアミド−アザインドール（ｓｅｃｏ−ＤＵＢＡ）、およびドキソルビシンからなる群から選択される、実施形態４８に記載のコンジュゲート。
実施形態５２． 化学療法剤が、インドリノベンゾジアゼピンおよびオキサゾリジノベンゾジアゼピンからなる群から選択される、実施形態４８に記載のコンジュゲート。
実施形態５３． 化学療法剤が、カリチアマイシンである、実施形態４８に記載のコンジュゲート。
実施形態５４． 化学療法剤が、カンプトテシン、７−エチル−１０−ヒドロキシ−カンプトテシン（ＳＮ−３８）、（Ｓ）−９−ジメチルアミノメチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（トポテカン）、（１Ｓ，９Ｓ）−１−アミノ−９−エチル−５−フルオロ−１，２，３，９，１２，１５−ヘキサヒドロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０Ｈ，１３Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１０，１３−ジオン（エキサテキカン（ＤＸ−８９５１））、およびＤＸｄからなる群から選択される、実施形態４８に記載のコンジュゲート。
実施形態５５． 化学療法剤が、以下の式：
Figure 2021524852
により表される抗腫瘍化合物である、実施形態４８に記載のコンジュゲート。
実施形態５６． 化学療法剤が、以下の式：
Figure 2021524852
により表される抗腫瘍化合物である、実施形態４８に記載のコンジュゲート。
実施形態５７． ポリペプチドまたはタンパク質であるさらなる作用剤が、抗体のポリペプチド鎖に融合されている、実施形態４７に記載のコンジュゲート。
実施形態５８． 抗体が、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖を含み、ポリペプチドまたはタンパク質であるさらなる作用剤は、前記抗体重鎖のＣ末端の各々に、または前記抗体軽鎖のＣ末端の各々に融合されている、実施形態５７に記載のコンジュゲート。
実施形態５９． さらなる作用剤が、サイトカイン、ケモカイン、他の抗体、抗原結合性断片、酵素、および結合ドメインからなる群から選択される、実施形態５７または５８に記載のコンジュゲート。
実施形態６０． さらなる作用剤が、ＣＤ３と特異的に結合するｓｃＦｖ断片であり、前記さらなる作用剤の１つは、各抗体重鎖のＣ末端に融合されている、実施形態５８に記載のコンジュゲート。
実施形態６１． さらなる作用剤が、ＰＤＬ１と特異的に結合するｓｃＦｖ断片であり、前記さらなる作用剤の１つは、各抗体軽鎖のＣ末端に融合されている、実施形態５８に記載のコンジュゲート。
実施形態６２． 抗体が、以下の式（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
（ｂ）-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
（ｃ）-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
（ｄ）-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
（ｅ）-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, および
（ｆ）-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
からなる群から選択される任意の構造を有するリンカーを介して、さらなる作用剤または化学療法剤、好ましくはＤＸ−８９５１またはＤＸｄなどのトポイソメラーゼＩ阻害剤にコンジュゲートされており、
抗体は、-(Succinimid-3-yl-N)の末端に接続されており、抗腫瘍化合物は、１位のアミノ基の窒素原子を接続位置として、式（ａ）〜（ｆ）の最も右側の−（ＣＨ２）ｎ２−Ｃ（＝Ｏ）−部分（ｎ２は、１または３の整数を表す）のカルボニル基に接続されており、ＧＧＦＧは、ペプチド結合を介して連結されているグリシン−グリシン−フェニルアラニン−グリシンからなるアミノ酸配列を表し、
-(Succinimid-3-yl-N)-は、以下の式：
Figure 2021524852
により表される構造を有し、その３位で抗体に接続されており、１位の窒素原子上でこの構造を含むリンカー構造のメチレン基に接続されている、
実施形態４７から６１のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
実施形態６３． 抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域または重鎖および軽鎖の以下の組合せａ）〜ｆ）：
（ａ）重鎖可変領域は、配列番号１０のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を有すること、
（ｂ）重鎖可変領域は、配列番号１１のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を有すること、
（ｃ）配列番号１５または２２のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖、
（ｄ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖、
（ｅ）配列番号１５または２２のアミノ酸番号１〜４４６により表されるアミノ酸配列を有する重鎖、および配列番号１６のアミノ酸番号１〜２１９により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖、ならびに
（ｆ）配列番号１９のアミノ酸番号１〜４４６により表されるアミノ酸配列を有する重鎖、および配列番号１６のアミノ酸番号１〜２１９により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖
のいずれか１つを含み、抗体またはその抗原結合性断片が、以下の式（式中、星印＊は、抗体との接続点を表す）
Figure 2021524852
により表される薬物リンカーにチオエーテル結合でコンジュゲートされている、実施形態４７から６１のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
実施形態６４． 以下の式：
Figure 2021524852
により表され、
式中、ＡＢは抗体を表し、抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含み、ｙは、抗体にコンジュゲートされた薬物−リンカー構造の単位の、１抗体当たりの平均数を表し、ｙは、１から１０までの範囲、２から８までの範囲、３から８までの範囲、７から８までの範囲、または７．５から８までの範囲であり、抗体は、上記式により表される薬物リンカー構造にチオエーテル結合でコンジュゲートされている、コンジュゲートまたは抗体。
実施形態６５． 以下の式：
Figure 2021524852
により表され、
式中、ＡＢは抗体を表し、抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含み、ｙは、抗体にコンジュゲートされた薬物−リンカー構造の単位の、１抗体当たりの平均数を表し、ｙは、１から１０までの範囲、２から８までの範囲、３から８までの範囲、７から８までの範囲、または７．５から８までの範囲であり、抗体は、上記式により表される薬物リンカー構造にチオエーテル結合でコンジュゲートされている、コンジュゲートまたは抗体。
実施形態６６． 以下の式：
Figure 2021524852
により表され、
式中、ＡＢは抗体を表し、抗体は、配列番号１５または２２のアミノ酸配列を有する重鎖、および配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖を含み、ｙは、抗体にコンジュゲートされた薬物−リンカー構造の単位の、１抗体当たりの平均数を表し、ｙは、１から１０までの範囲、２から８までの範囲、３から８までの範囲、７から８までの範囲、または７．５から８までの範囲であり、抗体は、上記式により表される薬物リンカー構造にチオエーテル結合でコンジュゲートされている、コンジュゲートまたは抗体。
実施形態６７． 以下の式：
Figure 2021524852
により表され、
式中、ＡＢは抗体を表し、抗体は、配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖、および配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖を含み、ｙは、抗体にコンジュゲートされた薬物−リンカー構造の単位の、１抗体当たりの平均数を表し、ｙは、１から１０までの範囲、２から８までの範囲、３から８までの範囲、７から８までの範囲、または７．５から８までの範囲であり、抗体は、上記式により表される薬物リンカー構造にチオエーテル結合でコンジュゲートされている、コンジュゲートまたは抗体。
実施形態６８． 抗体が、脱フコシル化、フコース低減、Ｎ−連結グリコシル化、Ｏ−連結グリコシル化、Ｎ末端プロセシング、Ｃ末端プロセシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化、重鎖の２３４位および２３５位にある２つのロイシン（Ｌ）残基のアラニン（Ａ）への置換（ＬＡＬＡ）、プロリン残基のアミド化、およびカルボキシル末端の１つまたは２つのアミノ酸の欠失または欠如からなる群から選択される１つまたは複数の修飾を含む、実施形態３１から６７のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたは抗体。
実施形態６９． 抗体が、重鎖のカルボキシル末端の１つまたは２つのアミノ酸の欠失または欠如を含む、実施形態６８に記載のコンジュゲートまたは抗体。
実施形態７０． 抗体が、両方が１つのカルボキシル末端アミノ酸残基を欠如する２つの重鎖を含む、実施形態６９に記載のコンジュゲートまたは抗体。
実施形態７１． 以下の式：
Figure 2021524852
により表され、
式中、ＡＢは抗体を表し、抗体は、配列番号１５または２２のアミノ酸番号１〜４４６により表されるアミノ酸配列を有する重鎖、および配列番号１６のアミノ酸番号１〜２１９により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含み、ｙは、抗体にコンジュゲートされた薬物−リンカー構造の単位の、１抗体当たりの平均数を表し、ｙは、１から１０までの範囲、２から８までの範囲、３から８までの範囲、７から８までの範囲、または７．５から８までの範囲であり、抗体は、上記式により表される薬物リンカー構造にチオエーテル結合でコンジュゲートされている、コンジュゲートまたは抗体。
実施形態７２． 以下の式：
Figure 2021524852
により表され、
ＡＢは、抗体を表し、抗体は、配列番号１９のアミノ酸番号１〜４４６により表されるアミノ酸配列を有する重鎖、および配列番号１６のアミノ酸番号１〜２１９により表されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含み、ｙは、抗体にコンジュゲートされた薬物−リンカー構造の単位の、１抗体当たりの平均数を表し、ｙは、１から１０までの範囲、２から８までの範囲、３から８までの範囲、７から８までの範囲、または７．５から８までの範囲であり、抗体は、上記式により表される薬物リンカー構造にチオエーテル結合でコンジュゲートされている、コンジュゲートまたは抗体。
実施形態７３． １抗体分子当たりのコンジュゲートされた薬物分子の数が８である、実施形態３１から７２のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたは抗体。
実施形態７４． 実施形態３１から７３のいずれか一項に記載の抗体またはコンジュゲート、ならびに溶媒、希釈剤、および賦形剤からなる群から選択される１つまたは複数のさらなる成分を含む医薬組成物。
実施形態７５． 医薬において使用するための、実施形態３１から７３のいずれか一項に記載の抗体もしくはコンジュゲートまたは実施形態７４に記載の医薬組成物。
実施形態７６． がんなどの異常細胞成長に関連する疾患；細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、または寄生虫感染症などの感染症；自己免疫疾患および炎症性腸疾患などの炎症性疾患；および免疫不全などの免疫活性低減に関連する疾患の治療、予後、診断、検出、および／またはモニタリングに使用するための、実施形態３１から７３のいずれか一項に記載の抗体もしくはコンジュゲートまたは実施形態７４に記載の医薬組成物。
実施形態７７． がん、特にＴＡ−ＭＵＣ１を発現するがんの治療に使用するためであって、がんが、卵巣がん、乳がん、膵臓がん、肺がん、結腸がん、胃がん、肝臓がん、腎臓がん、血液がん、子宮内膜がん、甲状腺がん、白血病、半水癌、黒色腫、癌腫、奇形腫、リンパ腫、肉腫、中皮腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、直腸がん、副腎がん、皮膚がん、脳がん、子宮頸がん、腸管がん、腸がん、頭頸部がん、消化管がん、リンパ節がん、食道がん、結腸直腸がん、耳鼻咽喉（ＥＮＴ）がん、前立腺がん、膀胱がん、子宮がん、およびそれらの転移からなる群から選択される、実施形態７６に記載の抗体、コンジュゲート、または医薬組成物。
実施形態７８． 感染症の治療に使用するためであって、感染症が、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、および寄生虫感染症からなる群から選択される、実施形態７６に記載の抗体、コンジュゲート、または医薬組成物。
実施形態７９． 自己免疫疾患の治療に使用するためであって、自己免疫疾患が、セリアック病、１型糖尿病、グレーブス病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、および全身性エリテマトーデスからなる群から選択される、実施形態７６に記載の抗体、コンジュゲート、または医薬組成物。
実施形態８０． それを必要とする対象のがんを治療するための方法であって、がん、特にＴＡ−ＭＵＣ１を発現するがんを有する対象に、実施形態３１から７３のいずれか一項に記載のコンジュゲートもしくは抗体または実施形態７４に記載の組成物の治療有効量を投与するステップを含む方法。
実施形態８１． がんが、卵巣がん、乳がん、膵臓がん、肺がん、結腸がん、胃がん、肝臓がん、腎臓がん、血液がん、子宮内膜がん、甲状腺がん、白血病、半水癌、黒色腫、癌腫、奇形腫、リンパ腫、肉腫、中皮腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、直腸がん、副腎がん、皮膚がん、脳がん、子宮頸がん、腸管がん、腸がん、頭頸部がん、消化管がん、リンパ節がん、食道がん、結腸直腸がん、耳鼻咽喉（ＥＮＴ）がん、前立腺がん、膀胱がん、子宮がん、およびそれらの転移からなる群から選択される、実施形態８０に記載のがんを治療するための方法。
異なるＭＵＣ１ペプチドに対する抗ＭＵＣ１抗体のＥＬＩＳＡ結合曲線を示す図である。（Ａ）は、エピトープ配列ＰＤＴＲを含むＭＵＣ１ペプチドに対する、Ｆａｂグリコシル化を欠如するＰａｎｋｏＭａｂ Ｎ５４Ｑ（ＰＭ−Ｎ５４Ｑ）およびＦａｂグリコシル化を含むＰａｎｋｏＭａｂ（ＰＭ）の抗原結合を示す。ＭＵＣ１ペプチドのトレオニンは、Ｔｎ、ｓＴｎ、ＴＦ、またはｓＴＦでグリコシル化されている。（Ｂ）は、エピトープ配列変異体ＰＥＳＲを含むＭＵＣ１ペプチドに対する、ＰａｎｋｏＭａｂおよびＰＭ−Ｎ５４Ｑの結合を示す。ＭＵＣ１ペプチドのセリンは、Ｔｎでグリコシル化されている。（Ｃ）は、エピトープ配列ＰＤＴＲを含むＭＵＣ１ペプチドに対する、ＰＭ−Ｎ５４Ｑの結合を示す。ＭＵＣ１ペプチドのトレオニンは、Ｔｎでグリコシル化されているか、またはグリコシル化されていない。（Ｄ）は、一過性にトランスフェクトされた細胞の細胞培養上清から希釈されたＦａｂグリコシル化を含むＰａｎｋｏＭａｂと比較した、Ｔｎ−ＰＤＴＲ ＭＵＣ１ペプチドに対する幾つかのＮ５４Ｘ変異体の結合を示す。（Ｅ）は、Ｆａｂグリコシル化を有するＰａｎｋｏＭａｂと比較した、Ｆａｂグリコシル化を有しない３つの精製Ｎ５４Ｘ変異体の、Ｔｎ−ＰＤＴＲ、ＴＦ−ＰＤＴＲ、および非グリコシル化ＰＤＴＲ ＭＵＣ１ペプチドに対する結合曲線を示す。（Ｆ）は、Ｆａｂグリコシル化を有するＰａｎｋｏＭａｂと比較した、Ｔｎ−ＰＤＴＲ ＭＵＣ１ペプチドに対するＰＭ−Ｎ５４Ｑの２つのフレームワーク変異体の結合を示す。フレームワーク変異体ｍｆ−ａの場合、ＶＨでは９つのアミノ酸およびＶＬフレームワークでは３つのアミノ酸が突然変異されており、ｍｆ−ｂの場合、ＶＨでは９つのアミノ酸およびＶＬフレームワークでは４つのアミノ酸が突然変異されている。 グリコシル化ＰＤＴＲ−ＭＵＣ１ペプチドに対する、抗ＭＵＣ１抗体ＰＭおよびＰＭ−Ｎ５４Ｑの表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）結合を示す図である。様々な濃度のＰＭ−Ｎ５４ＱおよびＰａｎｋｏＭａｂの最大結合シグナルが、抗体濃度に対してプロットされている。 ＤＲＸ機器での蛍光接近感知（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｓｅｎｓｉｎｇ）の結果を示す図である。結合曲線および解離曲線が示されている。（Ａ）Ｆａｂグリコシル化を有するＰＭが、（Ｂ）Ｆａｂグリコシル化を有してしないＰＭ−Ｎ５４Ｑと比較されている。 非還元条件（左）および還元条件（右）下のＰＭ−Ｎ５４ＱおよびＰａｎｋｏＭａｂの電気泳動分離のＳＤＳアクリルアミドゲルを示す図である。レーン１：捕捉ステップ後のＰＭ−Ｎ５４Ｑ；レーン２：仕上げステップ後のＰＭ−Ｎ５４Ｑ；レーン３：捕捉ステップ後のＰａｎｋｏＭａｂ；レーン４：仕上げステップ後のＰａｎｋｏＭａｂ；レーン５：分子量マーカー。 Ｆａｂグリコシル化を欠如するＰＭ−Ｎ５４ＱおよびＦａｂグリコシル化されているＰａｎｋｏＭａｂを用いた等電点電気泳動アッセイのクマシーブルー染色ゲルを示す図である。レーン１：Ｆａｂグリコシル化を有するＰａｎｋｏＭａｂ；レーン２：Ｆａｂグリコシル化を有してないＰＭ−Ｎ５４Ｑ。 Ｆｃγ受容体ＩＩＩａに対する抗ＭＵＣ１抗体結合を示す図である。抗体ＰＭ−Ｎ５４ＱまたはＰａｎｋｏＭａｂの濃度を増加させることにより、ウサギ抗マウスカップリングアクセプタービーズが、ＦｃγＲＩＩＩａ負荷ドナービーズから押し出され、それにより検出された化学ルミネセンスが低減する。図６Ａでは低フコシル化抗体を、図６Ｂでは高フコシル化抗体をアッセイに適用した。 フローサイトメトリーにより分析した、腫瘍細胞株（Ａ）ＣａＯＶ−３および（Ｂ）ＨＳＣ−４に対する、抗ＭＵＣ１抗体ＰＭ−Ｎ５４Ｑ、ＰＭ−Ｎ５４Ｄ、およびＦａｂグリコシル化を有するＰＭの結合を示す図である。 Ａ）ＴＡ−ＭＵＣ１タンパク質の発現を示すがん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８に対する対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ、ネイキッドＰａｎｋｏＭａｂ、およびＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣの、Ｂ）ＴＡ−ＭＵＣ１タンパク質の発現を示さないがん細胞株ＨＣＴ−１５に対する対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ、ネイキッドＰａｎｋｏＭａｂ、およびＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣの、Ｃ）ＴＡ−ＭＵＣ１タンパク質の発現を示すがん細胞株ＮＣＩ−Ｈ４４１に対する対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ、ネイキッドＰａｎｋｏＭａｂ、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣ、ネイキッドＰＭ−Ｎ５４Ｑ、およびＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣの、Ｄ）ＴＡ−ＭＵＣ１タンパク質の発現を示すがん細胞株ＨＰＡＣに対する対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ、ネイキッドＰａｎｋｏＭａｂ、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣ、ネイキッドＰＭ−Ｎ５４Ｑ、およびＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣの細胞傷害活性を示す図である。細胞を６日間にわたって各化合物で処置し、細胞生存率（％）をＡＴＰアッセイにより算出した。データは平均±ＳＤ（Ｎ＝３）を表す。 ＭＤＡ−ＭＢ−４６８保持ヌードマウスに対する対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ、ネイキッドＰａｎｋｏＭａｂ、およびＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣの抗腫瘍有効性を示す図である。３ｍｇ／ｋｇの用量の対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ、ネイキッドＰａｎｋｏＭａｂ、およびＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣ、またはビヒクル（酢酸緩衝溶液）を、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８保持ヌードマウス（Ｎ＝６／群）の静脈内に単回用量投与した。推定腫瘍容積のデータは、平均±ＳＥＭを表す。矢印は、投与のタイミングを示す。ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣの投与２１日後の推定腫瘍容積を、スチューデントｔ−検定により、対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣの推定腫瘍容積またはネイキッドＰａｎｋｏＭａｂ処置群の推定腫瘍容積と比較した。＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＨＣＣ７０保持ヌードマウスに対する対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ、ネイキッドＰａｎｋｏＭａｂ、およびＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣの抗腫瘍有効性を示す図である。１０ｍｇ／ｋｇの用量の対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ、ネイキッドＰａｎｋｏＭａｂ、およびＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣ、またはビヒクル（酢酸緩衝溶液）を、ＨＣＣ７０保持ヌードマウス（Ｎ＝６／群）の静脈内に単回用量投与した。推定腫瘍容積のデータは、平均±ＳＥＭを表す。矢印は、投与のタイミングを示す。ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣの投与２１日後の推定腫瘍容積を、スチューデントｔ−検定により、対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ処置群またはネイキッドＰａｎｋｏＭａｂ処置群の推定腫瘍容積と比較した。＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＨＰＡＣ保持ヌードマウスに対する対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ、ネイキッドＰＭ−Ｎ５４Ｑ、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣ、およびＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣの抗腫瘍有効性を示す図である。１０ｍｇ／ｋｇの用量の対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ、ネイキッドＰＭ−Ｎ５４Ｑ、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣ、およびＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣ、またはビヒクル（酢酸緩衝溶液）を、ＨＰＡＣ保持ヌードマウス（Ｎ＝６／群）の静脈内に単回用量投与した。推定腫瘍容積のデータは、平均±ＳＥＭを表す。矢印は、投与のタイミングを示す。ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣおよびＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣの投与２１日後の推定腫瘍容積を、ダネット検定により、対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ処置群の推定腫瘍容積と比較した。＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＮＣＩ−Ｈ４４１保持ヌードマウスに対する対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ、ネイキッドＰａｎｋｏＭａｂ、ネイキッドＰＭ−Ｎ５４Ｑ、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣ、およびＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣの抗腫瘍有効性を示す図である。１０ｍｇ／ｋｇの用量のネイキッドＰａｎｋｏＭａｂ、ネイキッドＰＭ−Ｎ５４Ｑ、３ｍｇ／ｋｇの用量の対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣ、およびＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣ、またはビヒクル（酢酸緩衝溶液）を、ＮＣＩ−Ｈ４４１保持ヌードマウス（Ｎ＝６／群）の静脈内に単回用量投与した。推定腫瘍容積のデータは、平均±ＳＥＭを表す。矢印は、投与のタイミングを示す。ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣおよびＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣの投与３１日後の推定腫瘍容積を、ダネット検定により、対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ処置群の推定腫瘍容積と比較した。＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＯＶＣＡＲ−５保持ヌードマウスに対する対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ、ネイキッドＰａｎｋｏＭａｂ、ネイキッドＰＭ−Ｎ５４Ｑ、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣ、およびＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣの抗腫瘍有効性を示す図である。１０ｍｇ／ｋｇの用量の対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ、ネイキッドＰａｎｋｏＭａｂ、ネイキッドＰＭ−Ｎ５４Ｑ、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣ、およびＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣ、またはビヒクル（酢酸緩衝溶液）を、ＯＶＣＡＲ−５保持ヌードマウス（Ｎ＝６／群）の静脈内に単回用量投与した。推定腫瘍容積のデータは、平均±ＳＥＭを表す。矢印は、投与のタイミングを示す。ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣおよびＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣの投与１４日後の推定腫瘍容積を、ダネット検定により、対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ処置群の推定腫瘍容積と比較した。ＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣの投与１４日後の推定腫瘍容積を、スチューデントｔ−検定により、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣ処置群の推定腫瘍容積と比較した。＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＨＣＴ−１５保持ヌードマウスに対する対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣ、およびＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣの抗腫瘍有効性を示す図である。１０ｍｇ／ｋｇの用量の対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣ、およびＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣ、またはビヒクル（酢酸緩衝溶液）を、ＨＣＴ−１５保持ヌードマウス（Ｎ＝６／群）の静脈内に単回用量投与した。推定腫瘍容積のデータは、平均±ＳＥＭを表す。矢印は、投与のタイミングを示す。ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣおよびＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣの投与２１日後の推定腫瘍容積を、ダネット検定により、対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ処置群の推定腫瘍容積と比較した。＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ヒト化抗体ＰＭ Ｎ５４Ｑの重鎖のアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５だが、５７位のアミノ酸はＧｌｎである。すなわち配列番号２２）。 ヒト化抗体ＰＭ Ｎ５４ＱおよびＰａｎｋｏＭａｂの軽鎖のアミノ酸配列を示す図である（配列番号１６）。 ヒト化抗体ＰａｎｋｏＭａｂの重鎖のアミノ酸配列を示す図である（配列番号１９）。 キメラ抗体ＰＭ Ｎ５４Ｑの重鎖のアミノ酸配列を示す図である（配列番号２０だが、７６位のアミノ酸はＧｌｎである。すなわち配列番号２３）。 キメラ抗体ＰＭ Ｎ５４Ｑの軽鎖のアミノ酸配列を示す図である（配列番号２１）。
実施例１：
１． 抗ＭＵＣ１抗体の産生
カバット／Ｅｕ付番方式によるＡｓｎ５４（配列番号１１のアミノ酸位置５７）のコドンを、Ａｓｎ以外の任意のアミノ酸、特にＧｌｎのコドンに突然変異させることにより、ヒト化ＰａｎｋｏＭａｂ抗体の重鎖の核酸配列（例えば、ＷＯ２０１１／０１２３０９を参照）を修飾した。
１）ヒト骨髄性白血病由来細胞株での抗ＭＵＣ１抗体の産生
突然変異抗体のγ１型重鎖およびκ型軽鎖のコード配列を含むベクターを、ヒト骨髄性白血病由来細胞株ＮＭ−Ｈ９Ｄ８（ＤＳＭ ＡＣＣ２８０６）にトランスフェクトした。Ｎ５４Ｘ突然変異（ＰａｎｋｏＭａｂ Ｎ５４Ｘ／ＰＭ−Ｎ５４Ｘ、ＸはＮ／Ａｓｎ以外の任意のアミノ酸である）またはＶＨおよびＶＬのフレームワーク配列にアミノ酸突然変異を含む異なるαＭＵＣ１抗体を、得られたクローンで発現させて、ヒトグリコシル化パターンを有する構築物を産生させた。上清中のαＭＵＣ１抗体の濃度は、プロテインＡコーティングピンを使用したＯｃｔｅｔ測定により決定したか、またはプロテインＡクロマトグラフィーによる精製後にＵＶ２８０吸光度により定量化した。異なるαＭＵＣ１抗体の結合特性を、抗原−ＥＬＩＳＡにより決定し（実施例２を参照）、また、選択された精製抗体をスキャチャード分析により（実施例３を参照）、Ｂｉａｃｏｒｅにより（実施例４ａを参照）、ＤＲＸ２ ｓｗｉｔｃｈＳＥＮＳＥ（登録商標）技術により（実施例４ｂを参照）、またはフローサイトメトリーにより（実施例７）分析した。
加えて、ＰＭ−Ｎ５４ＱおよびＦａｂグリコシル化を有する非突然変異ＰａｎｋｏＭａｂも、フコースが低減された抗体を発現するヒト骨髄性白血病由来細胞株ＮＭ−Ｈ９Ｄ８−Ｅ６Ｑ１２（ＤＳＭ ＡＣＣ２８５６）で発現させた。ＮＭ−Ｈ９Ｄ８で発現された同じ抗体と共に、こうした抗体を精製し、Ｆｃガンマ受容体ＩＩＩＡに対するそれらの結合挙動について実施例６にて分析した。
２）ＣＨＯ細胞株での抗ＭＵＣ１抗体の産生
ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＧｅｎｅＡｒｔ（商標）により合成されたＰＭ−Ｎ５４Ｑコード配列（配列番号１７により表されるＰＭ−Ｎ５４Ｑの重鎖のヌクレオチド配列および配列番号１８により表されるＰＭ−Ｎ５４Ｑの軽鎖のヌクレオチド配列）を、発現ベクターにクローニングし、得られたプラスミドをＣＨＯ細胞にエレクトロ−トランスフェクトした。プールした細胞を選択圧力下で増殖させることを応用し、基本手順を用いてＰＭ−Ｎ５４Ｑ突然変異体抗体を製造した。ＣＨＯ細胞株で産生された抗ＭＵＣ１抗体（ＰＭ−Ｎ５４Ｑ）を、実施例８および９に使用した。
２． ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣ、Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣ、およびＤＸｄ
ＣＤＲ２−Ｈ２にグリコシル化部位を含む（Ｆａｂグリコシル化）ヒト化抗ＴＡ−ＭＵＣ１モノクローナル抗体を指すＰａｎｋｏＭａｂ−ＧＥＸ、およびＦａｂグリコシル化を欠如するヒト化抗ＴＡ−ＭＵＣ１モノクローナルを指すＰＭ−Ｎ５４Ｑ（実施例１−１）、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣ、およびＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣを、ＷＯ２０１４／０５７６８７およびＷＯ２０１５／１１５０９１などの公知の方法により産生した。ＰａｎｋｏＭａｂ−ＧＥＸ抗体は、配列番号１９を含む重鎖および配列番号１６を含む軽鎖を含み、したがって、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＧＥＸ抗体は、式２の薬物−リンカーに連結される。上記で言及したＰＭ−Ｎ５４Ｑ抗体は、配列番号１５を含む重鎖および配列番号１６を含む軽鎖を含み、したがって、ＰＭ−Ｎ５４Ｑ抗体は、式２の薬物−リンカーに連結される。
Figure 2021524852
そのようなＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣ構造およびＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣ構造は、以下の式５を示し（ｙ：１抗体分子当たりのコンジュゲートされた薬物分子の数は４〜８であり、すなわち１抗体当たりのコンジュゲートされた薬物分子の平均数（ｙ）：およそ８）、ＡＢは、ＰａｎｋｏＭａｂまたはＰＭ−Ｎ５４Ｑを表す。
Figure 2021524852
対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣは、哺乳動物細胞に結合しないヒト化ＩｇＧ１アイソタイプ対照モノクローナル抗体、ならびにＰｎａｋｏＭａｂ−ＡＤＣおよびＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣと同じ薬物−リンカーで構成されていた。ＡＤＣペイロード（ＤＸｄ）は、ＷＯ２０１４／０５７６８７およびＷＯ２０１５／１１５０９１などの公知の方法により産生した。
実施例２：抗原ＥＬＩＳＡ
Ｆａｂ部分のＮ−グリコシル化部位がノックアウトされているＰａｎｋｏＭａｂ Ｎ５４Ｘの抗原結合特性を、そのＦａｂ部分にＮ−グリコシル化部位を有するＰａｎｋｏＭａｂと比較した。
（グリコシル化）ＰａｎｋｏＭａｂ−ＧＥＸ（登録商標）と比較した、ＭＵＣ１特異的抗体ＰａｎｋｏＭａｂのＦａｂ脱グリコシル化型（ＰＭ−Ｎ５４Ｑ）の結合特徴を、ＥＬＩＳＡ研究にて、様々にグリコシル化されたおよびグリコシル化されていないＭＵＣ１由来タンデムリピートペプチドを使用して分析した。原則として、両抗体は、Ｔにおいて異なるグリコシル化を有するグリコシル化ＰＤＴＲペプチド（ＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴ（Ｘ）−ＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡ）に結合することにより同じ階調を示す。つまり、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃａｌｐｈａ（ＴＦ）を保持するＰＤＴＲペプチドに対して最も強力な結合が観察され、続いてシアリル化ＴＦおよびＧａｌＮＡｃａｌｐｈａ（Ｔｎ）Ｏ−グリコシル化だった。シアリル化ＧａｌＮＡｃａｌｐｈａ（ｓＴｎ）Ｏ−グリコシル化に対する結合は、著しくより低かった。ＰａｎｋｏＭａｂ−ＧＥＸ（登録商標）として、ＰＭ−Ｎ５４Ｑは、非グリコシル化ＭＵＣ１ ＰＤＴＲペプチドに対する結合親和性をほんのわずかしか示さず、適切な腫瘍特異性を示した（図１Ｃ）。
しかしながら、ＧａｌＮＡｃａｌｐｈａ（Ｔｎ）Ｏ−グリカンを保持するビオチン化糖ペプチドを使用したＴＡ−ＭＵＣ１抗原ＥＬＩＳＡでは、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＧＥＸ（登録商標）と比較して、４倍高い結合がＰＭ−Ｎ５４Ｑに見出された。ＰＭ−Ｎ５４Ｑは、シアリル化ＧａｌＮＡｃａｌｐｈａ（ｓＴｎ）でグリコシル化されると、約７倍良好に同じＭＵＣ１ペプチドに結合する。ＰＤＴＲ配列のトレオニンにおけるＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃａｌｐｈａ（ＴＦ）およびシアリル化ＴＦ（ｓＴＦ）に対する結合（図１Ａ）は、ＰＭ−Ｎ５４Ｑのほうが２倍良好だった。
両抗体は、ＰＤＴ（Ｔｎ）Ｒペプチドとの結合と比較して、セリンにＴｎグリコシル化を有するＭＵＣ１ペプチド変異体ＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＥ−Ｓ（Ｔｎ）−ＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡに対して強力に縮小された結合を示す。しかしながら、この場合も、Ｆａｂ脱グリコシル化ＰＭ−Ｎ５４Ｑは、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＧＥＸ（登録商標）よりも著しく強力に結合する（図１Ｂ）。
異なる他のＦａｂ脱グリコシル化ＰＭ−Ｎ５４Ｘ変異体を、そのＦａｂ部分にＮ−グリコシル化を有するＰａｎｋｏＭａｂと比較した。最初に、変異体はすべて、上清からのものを精製せずに直接比較した。濃度はＯｃｔｅｔで決定した。ＰＭ−Ｎ５４Ｘ変異体はすべて、Ｆａｂグリコシル化ＰＭよりも良好に結合した。加えて、アミノ酸側鎖の化学的特性に依存する明白な傾向が視認された。側鎖のカルボン酸基は、最も低い結合増強を示した。最良の結合は、１つまたは２つの窒素を有する（第一級または第二級アミンとして）アミノ酸で観察された（図１Ｄ）。
加えて、選択されたＦａｂ脱グリコシル化変異体（ＰＭ−Ｎ５４Ｈ、−Ｗ、および−Ｑ）を、プロテインＡクロマトグラフィーにより精製し、ＥＬＩＳＡで分析した（図１Ｅ）。それぞれ、Ｆａｂグリコシルを有するＰａｎｋｏＭａｂと比較して、ＴＦ−ＭＵＣ１ペプチドに対する結合の向上は約５〜８倍であり、Ｔｎ−ＭＵＣ１ペプチドに対しては約２〜３倍である。
さらに、ＰＭ−Ｎ５４Ｑの２つの異なるフレームワーク変異体を、Ｔｎグリコシル化ＰＤＴＲ−ＭＵＣ１ペプチドに対する結合について、ＥＬＩＳＡで分析した（図１Ｆを参照）。フレームワーク変異体ｍｆ−ａは、ＶＨに９つのアミノ酸突然変異およびＶＬフレームワークに３つのアミノ酸突然変異を有し、また、変異体ｍｆ−ｂは、ＶＨに９つのアミノ酸突然変異およびＶＬフレームワークに４つのアミノ酸突然変異を有する。突然変異変異体は両方とも、ＰＭ−Ｎ５４Ｑ抗体と比較して、同様の結合を示す。
実施例３：ＭＣＦ−７細胞およびＺＲ−７５−１細胞に対する抗ＭＵＣ１抗体の飽和結合分析
２つの要因：腫瘍細胞に対する抗体の親和性および結合部位の数が、抗体の治療適合性に特に重要である。
ＴＡ−ＭＵＣ−１陽性ヒト腫瘍細胞株に対するＭＵＣ１特異的抗体ＰａｎｋｏＭａｂ（ＰＭ−Ｎ５４Ｑ）のＦａｂ脱グリコシル化型の結合を、Ｆａｂグリコシル化ＰａｎｋｏＭａｂ−ＧＥＸ（登録商標）と比較して、ヒト乳房癌細胞株統ＺＲ−７５−１およびＭＣＦ−７に対する飽和結合分析により放射性同位体標識抗体を使用して評価した。抗体を、５０ｍＭ炭酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．７中の１２倍モル過剰のｐ−ＳＣＮ−ベンジル−ＤＴＰＡで、２時間３７℃にてキレート化し、続いて２〜８℃で終夜インキュベーションした。遊離キレート剤を、脱塩カラムおよび全量ろ過（５０ｋＤａカットオフ、ＰＢＳへの６×緩衝液交換）で除去した。キレート化抗体を、６ｍＭリン酸塩、１．６ｍＭ ＫＣｌ、８０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２Ｍ Ｎａアセテート、０．１Ｍ ＨＣｌ中で１時間３７℃にて、無担体１１１Ｉｎで放射性標識した（２μＣｉ／μｇ抗体）。８〜９倍容積の１０×濃縮ＰＢＳを添加することにより、調製物を中和した。約１／５０容積のウシ胎仔血清を、中和した標識抗体調製物に添加した。細胞結合手法毎に、１＊１０６細胞を使用した。幾つかの濃度の標識抗体を、ペレット化した細胞に添加した（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中３０〜１０００ｎｇ／２００μＬ）。再懸濁した細胞−抗体混合物を、ガンマ計数器で測定し、４℃で１時間インキュベートした。抗体が結合した細胞を遠心分離により分離し、４℃でさらに１時間１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄した。その後、細胞ペレットを、結合した１１１Ｉｎ標識抗体についてガンマ計数器で測定した。評価は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍの「１部位特異的ｋａ」で実施した。得られたデータは、表１に要約されている。データは、こうした腫瘍細胞に対するＰＭ−Ｎ５４Ｑの親和性が高く、結合部位数が非常に多いことを示す。結合は、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＧＥＸ（登録商標）よりも２．５倍より高く、結合部位の数もわずかに増加した。
Figure 2021524852
実施例４ａ：表面プラズモン共鳴（ＢｉａＣｏｒｅ）分析
ＴＡ−ＭＵＣ−１由来グリコシル化ペプチドに対する、ＭＵＣ１特異的抗体ＰａｎｋｏＭａｂのＦａｂ脱グリコシル化型（ＰＭ−Ｎ５４Ｑ）の結合を、表面プラズモン共鳴分析（Ｂｉａｃｏｒｅ）により評価した。ストレプトアビジンセンサーチップを、ビオチン化ＴＡ−ＭＵＣ１ペプチドでコーティングした（Ｔｎグリコシル化または非グリコシル化）。ＰａｎｋｏＭａｂおよびＰＭ−Ｎ５４Ｑを、ＨＰＳ−ＥＰで３，６００から４．９ｎＭまで１：３系列希釈した。希釈物を５０μＬ／分で注入した。各濃度の最大結合を、それぞれ応答ユニット（ＲＵ）として決定し、「１部位特異的結合」を使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで評価した。図２は、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＧＥＸ（登録商標）と比較して得られた、ＰＭ−Ｎ５４Ｑとの結合曲線を示す。ＰＭ−Ｎ５４ＱおよびＰａｎｋｏＭａｂ−ＧＥＸ（登録商標）の親和性（ＫＤ）は、それぞれ３８８ｎＭおよび６５２ｎＭであると算出された。したがって、この実験の設定では、親和性のほぼ２倍の増加が検出可能だった。
実施例４ｂ：蛍光接近感知法（ＤＲＸ２による、Ｄｙｎａｍｉｃ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ）
チップにスポッティングされた一本鎖ＤＮＡ（９６量体）およびリガンドにカップリングされた相補的ＤＮＡを使用する蛍光接近感知法は、結合定数および親和性を決定するための新しい方法である。本研究では、ストレプトアビジンを、ビオチン化ＴＡ−ＭＵＣ１ペプチドを捕捉するためのリガンドとして使用した。ペプチドに対するＰａｎｋｏＭａｂの結合は、蛍光の変化をもたらした。オンレートおよびオフレートは、結合および解離中に算出することができる。感度がより高いため、表面プラズモン共鳴と比較してより迅速な相互作用をモニターすることができる。これは、ＳＰＲとは異なるが、液体系で測定される「至適標準」法であるＫｉｎＥｘＡとより同等の結合動力学をもたらす。
ＰａｎｋｏＭａｂおよびＰＭ−Ｎ５４Ｑを、ＰＥ１４０緩衝液で３００ｎＭから３．６７ｎＭまで１：９ステップで希釈し、チップに結合したペプチドに適用した。結合曲線を、単一指数関数的グローバルフィッティングにより（機器のソフトウェアで）評価した。ＰＭおよびＰＭ−Ｎ５４Ｑの結合曲線は、図３Ａおよび３Ｂに例示的に示されている。ＰａｎｋｏＭａｂ変異体の計算された親和性は、表２に示されている。
Figure 2021524852
実施例５：生化学的特徴付け
非還元および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、抗体の純度および同一性を分析する。非還元ゲルのバンドパターンは、約１６０ｋＤａに主バンドを示し、重鎖および軽鎖ならびにそれらの組合せの理論的アーチファクト（約２５、５０〜５５、７５、１１０、１３５ｋＤａ）を示す。還元ゲルは、２５および５０〜５５ｋＤａに別個の軽鎖バンドおよび重鎖バンドを示す。Ｆａｂグリコシル化を欠如するため、ＰＭ−Ｎ５４Ｑは、予想通り、より小さな重鎖を有する（図４の右側を参照）。
電荷プロファイルは、等電点電気泳動により示されているように明らかに異なる（ＩＥＦ；図５を参照）。Ｆａｂグリコシル化は、かなりシアリル化されているが、Ｆｃグリコシル化は、最小限にシアリル化されているに過ぎない。したがって、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＧＥＸ（登録商標）は、ＰＭ−Ｎ５４Ｑよりも多くの荷電アイソフォームを有し、これは、Ｆａｂ部分の負荷電シアル酸のレベルがより高いことを反映する。
実施例６：Ｆｃγ受容体結合
ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）のＦｃγＲ結合アッセイは、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒのＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）技術に基づく。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）プラットフォームは、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒの簡単なビーズに基づく技術に依存し、洗浄ステップを必要としないため、伝統的なＥＬＩＳＡのより効率的な代替法である。
受容体結合アッセイでは、Ｈｉｓタグ付ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ ＧｍｂＨ）を、Ｎｉキレートドナービーズにより捕捉する。抗ＭＵＣ１抗体およびウサギ抗マウスカップリングアクセプタービーズは、ＦｃγＲに対する結合を競合する。ＦｃγＲとウサギ抗マウス結合アクセプタービーズとの相互作用の場合、ドナーおよびアクセプタービーズが近接近すると、６８０ｎｍでのレーザー励起時に発光がもたらされる。競合物質がない場合、最大シグナルが達成される（ｓｉｇｎａｌｍａｘ）。競合する場合、試験抗体がＦｃγＲに結合し、ｓｉｇｎａｌｍａｘは、濃度依存的様式で低減される。ＥｎＳｐｉｒｅ２３００多標識リーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して５２０〜６２０ｎｍを測定することにより（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）法）、化学ルミネセンスを定量化した。結果はすべて、複製試料の平均±標準偏差として表した。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェアによる非線形曲線フィッティング（シグモイド用量応答可変勾配（ｓｉｇｍｏｉｄａｌ ｄｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｌｏｐｅ））を使用して評価および算出した。その結果として、濃度依存性シグモイド曲線が得られた。この曲線は、上部プラトー、底部プラトー、傾き、およびＥＣ５０により規定される。
図６Ａおよび６Ｂに示されているように、ＰａｎｋｏＭａｂ Ｎ５４ＱおよびＰａｎｋｏＭａｂに対するＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性は同等だった。図Ａでは低フコシル化抗体および図Ｂでは高フコシル化抗体がアッセイに適用された。したがって、Ｆａｂグリコシル化の除去は、抗体の受容体相互作用に影響を及ぼさなかった。
実施例７：細胞性ＴＡ−ＭＵＣ１に対する結合
Ｎ５４ＱおよびＮ５４Ｄを一過性に発現させ、プロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。細胞表面ＴＡ−ＭＵＣ１に対する２つの変異体の結合を、２つの異なる癌細胞株を使用して、Ｆａｂグリコシル化を有するＰＭと比較した。舌扁平上皮癌系統ＨＳＣ−４は、ＴＡ−ＭＵＣ１を中程度に発現し、卵巣癌細胞株ＣａＯＶ−３は高度に発現する。腫瘍細胞を、系列希釈した抗体と共にインキュベートし、結合した抗体を、フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（重鎖および軽鎖）抗体を使用して検出した。バックグラウンド染色の対照のために、ヒトＩｇＧ対照が含まれていた。結合を、フローサイトメトリーにより分析した。
分析した構築物ＰＭ、ＰＭ−Ｎ５４Ｑ、およびＰＭ−Ｎ５４Ｄは、ヒトＩｇＧ１対照と比較して、ＴＡ−ＭＵＣ１を発現するＨＳＣ−４細胞およびＣａＯＶ−３細胞に対する強力で特異的な結合を示す（図７）。ＴＡ−ＭＵＣ１ｈｉｇｈＣａＯＶ−３細胞に対するＰＭ−Ｎ５４Ｄの結合は、Ｆａｂグリコシル化を有するＰＭと同等であったが、ＰＭ−Ｎ５４Ｑは、わずかにより良好な結合を示した（図７Ａ）。ＴＡ−ＭＵＣ１を中程度のレベルで発現するＨＳＣ−４癌細胞を使用すると、変異体ＰＭ−Ｎ５４Ｑは、ＰＭと比較して細胞性ＴＡ−ＭＵＣ１に対する結合が明らかにより優れていたが、ＰＭ−Ｎ５４Ｄは、Ｆａｂグリコシル化を有するＰＭと比較して結合が劣ることを示した（図７Ｂ）。
実施例８：ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣおよびＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性の評価
８．１ 細胞株
ＴＡ−ＭＵＣ１を中程度〜高度に発現する細胞として、ヒト乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ヒト膵がん細胞株ＨＰＡＣ、およびヒト肺がん細胞株ＮＣＩ−Ｈ４４１を使用した。ヒト結腸直腸がん細胞株ＨＣＴ−１５を、ＴＡ−ＭＵＣ１陰性細胞として使用した。こうした細胞株は、ＡＴＣＣから購入した。各細胞株を、使用説明書に従って培養した。各がん細胞株上のＴＡ−ＭＵＣ１の発現レベルを、フローサイトメトリーにより確認した。
８．２ ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性の評価
培養培地を使用することにより１．２５×１０４細胞／ｍＬの濃度を有するようにＭＤＡ−ＭＢ−４６８懸濁物を調製し、８０ｕＬ／ウェル（１０００細胞／ウェル）で黒色透明底９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。ブランクウェルの場合、培地のみを８０ｕＬ／ウェルでウェルに添加した（Ｎ＝３）。細胞はすべて、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８に適切な条件で終夜インキュベートした。
培養培地を使用することにより３．１×１０３細胞／ｍＬの濃度を有するようにＨＣＴ−１５懸濁物を調製し、８０ｕＬ／ウェル（２５０細胞／ウェル）で黒色透明底９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。ブランクウェルの場合、培地のみを８０ｕＬ／ウェルでウェルに添加した（Ｎ＝３）。細胞はすべて、ＨＣＴ−１５に適切な条件で終夜インキュベートした。
翌日に、各ネイキッドＰａｎｋｏＭａｂ、対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ、およびＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣを、５００ｎＭから０．２ｎＭまで各培養培地で３倍系列希釈した。こうした希釈溶液の２０マイクロリットルを、適切なウェルに添加した（終濃度：１００ｎＭ〜０．０４ｎＭ）。ブランクウェルおよび未処置ウェルの場合、２０ｕＬの各培養培地のみをウェルに添加した。プレートはすべて、各細胞株に適切な条件で６日間インキュベートした。
インキュベーションの後、各ウェルのＡＴＰの量を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏルミネセンス細胞生存アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用することにより測定した。ルミネセンスを、マルチラベルカウンター（ＡＲＶＯ Ｘ３、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｊａｐａｎ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）で測定した。このアッセイを三重反復で実施した。
各試料の細胞生存率を、以下の等式により算出した。
細胞生存率（％）＝１００×（Ｔ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ）
Ｔ：試験ウェルのルミネセンス強度
Ｃ：未処置ウェルの平均ルミネセンス強度
Ｂ：ブランクウェルの平均ルミネセンス強度
８．３ ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣとＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣとのｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性の比較
培養培地を使用することにより１．２５×１０４細胞／ｍＬの濃度を有するようにＨＰＡＣ懸濁物を調製し、８０ｕＬ／ウェル（１０００細胞／ウェル）で黒色透明底９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。ブランクウェルの場合、培地のみを８０ｕＬ／ウェルでウェルに添加した（Ｎ＝３）。細胞はすべて、ＨＰＡＣに適切な条件で終夜インキュベートした。
培養培地を使用することにより１．２５×１０４細胞／ｍＬの濃度を有するようにＮＣＩ−Ｈ４４１懸濁物を調製し、８０ｕＬ／ウェル（１０００細胞／ウェル）で黒色透明底９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。ブランクウェルの場合、培地のみを８０ｕＬ／ウェルでウェルに添加した（Ｎ＝３）。細胞はすべて、ＮＣＩ−Ｈ４４１に適切な条件で終夜インキュベートした。
翌日に、各ネイキッドＰａｎｋｏＭａｂ、ネイキッドＰＭ−Ｎ５４Ｑ、ｈＩｇＧ−ＡＤＣ、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣ、およびＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣを、５００ｎＭから０．２ｎＭまで各培養培地で３倍系列希釈した。こうした希釈溶液の２０マイクロリットルを、適切なウェルに添加した（終濃度：１００ｎＭ〜０．０４ｎＭ）。ブランクウェルおよび未処置ウェルの場合、２０ｕＬの各培養培地のみをウェルに添加した。プレートはすべて、各細胞株に適切な条件で６日間インキュベートした。
インキュベーションの後、各ウェルのＡＴＰの量を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏルミネセンス細胞生存アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用することにより測定した。ルミネセンスは、マルチラベルカウンター（ＡＲＶＯ Ｘ３、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｊａｐａｎ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）で測定した。このアッセイを三重反復で実施した。
各試料の細胞生存率を、以下の等式により算出した。
細胞生存率（％）＝１００×（Ｔ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ）
Ｔ：試験ウェルのルミネセンス強度
Ｃ：未処置ウェルの平均ルミネセンス強度
Ｂ：ブランクウェルの平均ルミネセンス強度
ＨＰＡＣおよびＮＣＩ−Ｈ４４１に対するＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣ対ＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣの細胞傷害活性の効力比、およびそれらの９５％ＣＩを、ＳＡＳリリース９．４（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｊａｐａｎ、東京、日本）に基づくＥＸＳＵＳ ｖｅｒ． ８．１（ＣＡＣ Ｃｒｏｉｔ、東京、日本）を使用することによる３パラメーターロジスティック平行線分析（３−ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｐａｒａｌｌｅｌ−ｌｉｎｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）（共通の傾き）を使用して、事後分析として算出した（Ｅｍａｘ：１００、Ｅｍｉｎ：推定値）。細胞傷害活性の効力における差異は、効力比の９５％ＣＩが１を含まない場合、有意であるとみなした。
実施例９：ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣおよびＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣのｉｎ ｖｉｖｏ有効性の評価
９．１ 細胞株
ＴＡ−ＭＵＣ１を中程度〜高度に発現する腫瘍細胞として、ヒト乳がん細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＨＣＣ７０、ヒト膵がん細胞株ＨＰＡＣ、およびヒト肺がん細胞株ＮＣＩ−Ｈ４４１を使用した。ヒト結腸直腸がん細胞株ＨＣＴ−１５を、ＴＡ−ＭＵＣ１陰性腫瘍細胞として使用した。こうした細胞株は、ＡＴＣＣから購入した。ヒト卵巣がん細胞株ＯＶＣＡＲ−５を国立がん研究所から購入し、ＴＡ−ＭＵＣ１低発現腫瘍細胞として使用した。各細胞株を、使用説明書に従って培養した。各がん細胞株上のＴＡ−ＭＵＣ１の発現レベルを、フローサイトメトリーおよびＩＨＣ染色により確認した。
９．２ ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣのｉｎ ｖｉｖｏ有効性の評価
ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を、マトリゲル（ＢＤ）に懸濁し、１×１０７細胞を、各雌ヌードマウスの身体右側に皮下移植し（０日目）、２０日目にマウスを無作為にグループ化した（Ｎ＝６）。グループ化した後、各ネイキッドＰａｎｋｏＭａｂ溶液、対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ溶液、またはＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣ溶液を、３ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内に単回用量投与した。ビヒクル（酢酸緩衝溶液）投与群を、対照群として確立した。投与後、各マウスの腫瘍の長さおよび幅を、２１日間にわたって週２回デジタルノギスで測定した。
ＨＣＣ７０細胞を、生理食塩水（株式会社大塚製薬工場）に懸濁し、１×１０７細胞を、各雌ヌードマウスの身体右側に皮下移植し（０日目）、１９日目にマウスを無作為にグループ化した（Ｎ＝６）。グループ化した後、各ネイキッドＰａｎｋｏＭａｂ溶液、対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ溶液、またはＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣ溶液を、１０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内に単回用量投与した。ビヒクル（酢酸緩衝溶液）投与群を、対照群として確立した。投与後、各マウスの腫瘍の長さおよび幅を、２１日間にわたって週２回デジタルノギスで測定した。
各マウスの推定腫瘍容積を、以下の等式により算出した。
推定腫瘍容積（ｍｍ３）＝１／２×長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）２
また、ビヒクル処置群の最後の測定日における各群の腫瘍成長阻害（ＴＧＩ、％）を、以下の等式により算出し、丸めて整数にした。
ＴＧＩ（％）＝（１−Ｔ／Ｃ）×１００
Ｔ：ネイキッドＰａｎｋｏＭａｂ、対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ、またはＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣの平均推定腫瘍容積（ｍｍ３）
Ｃ：ビヒクル処置群の平均推定腫瘍容積（ｍｍ３）
ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣの抗腫瘍有効性を評価するために、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣ処置群の最後の測定日（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８：４１日目、ＨＣＣ７０：４０日目）における各マウスの腫瘍容積を、スチューデントｔ−検定により対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ処置群の腫瘍容積またはネイキッドＰａｎｋｏＭａｂ処置群の腫瘍容積と比較した。統計分析はすべて、ＳＡＳシステム リリース９．２（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．）を使用して、事後分析として実施した。０．０５未満のＰ値を、統計的に有意であるとみなした。
９．３ ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣおよびＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣのｉｎ ｖｉｖｏ有効性の比較
ＨＰＡＣ細胞を、生理食塩水（株式会社大塚製薬工場）に懸濁し、３×１０６細胞を、各雌ヌードマウスの身体右側に皮下移植し（０日目）、１１日目にマウスを無作為にグループ化した（Ｎ＝６）。グループ化した後、各ネイキッドＰＭ−Ｎ５４Ｑ溶液、対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ溶液、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣ溶液、またはＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣ溶液を、１０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内に単回用量投与した。ビヒクル（酢酸緩衝溶液）投与群を、対照群として確立した。投与後、各マウスの腫瘍の長さおよび幅を、２１日間にわたって週２回デジタルノギスで測定した。
ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を、マトリゲル（ＢＤ）に懸濁し、５×１０６細胞を、各雌ヌードマウスの身体右側に皮下移植し（０日目）、７日目にマウスを無作為にグループ化した（Ｎ＝６）。グループ化した後、各ネイキッドＰａｎｋｏＭａｂ溶液またはネイキッドＰＭ−Ｎ５４Ｑ溶液を、１０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内に単回用量投与し、対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ溶液、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣ溶液、またはＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣ溶液を、３ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内に単回用量投与した。ビヒクル（酢酸緩衝溶液）投与群を、対照群として確立した。投与後、各マウスの腫瘍の長さおよび幅を、３１日間にわたって週２回デジタルノギスで測定した。
ＯＶＣＡＲ−５細胞を、生理食塩水（株式会社大塚製薬工場）に懸濁し、５×１０６細胞を、各雌ヌードマウスの身体右側に皮下移植し（０日目）、１２日目にマウスを無作為にグループ化した（Ｎ＝６）。グループ化した後、ネイキッドＰａｎｋｏＭａｂ溶液、ネイキッドＰＭ−Ｎ５４Ｑ溶液、対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ溶液、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣ溶液、またはＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣ溶液を、１０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内に単回用量投与した。ビヒクル（酢酸緩衝溶液）投与群を、対照群として確立した。投与後、各マウスの腫瘍の長さおよび幅を、２１日間にわたって週２回デジタルノギスで測定した。
ＨＣＴ−１５細胞を、生理食塩水（株式会社大塚製薬工場）に懸濁し、５×１０６細胞を、各雌ヌードマウスの身体右側に皮下移植し（０日目）、１０日目にマウスを無作為にグループ化した（Ｎ＝６）。グループ化した後、対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ溶液、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣ溶液、またはＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣ溶液を、１０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内に単回用量投与した。ビヒクル（酢酸緩衝溶液）投与群を、対照群として確立した。投与後、各マウスの腫瘍の長さおよび幅を、２１日間にわたって週２回デジタルノギスで測定した。
各マウスの腫瘍容積を、以下の等式により算出した。
推定腫瘍容積（ｍｍ３）＝１／２×長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）２
また、ビヒクル処置群の最後の測定日またはすべての群が生存している最後の日における各マウスの腫瘍成長阻害（ＴＧＩ、％）を、以下の等式に従って算出し、丸めて整数にした。
ＴＧＩ（％）＝（１−Ｔ／Ｃ）×１００
Ｔ：ネイキッドＰａｎｋｏＭａｂ、ネイキッドＰＭ−Ｎ５４Ｑ、対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣ、またはＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣの平均推定腫瘍容積（ｍｍ３）
Ｃ：ビヒクル処置群の平均推定腫瘍容積（ｍｍ３）
ＨＰＡＣ保持マウス、ＮＣＩ−Ｈ４４１保持マウス、ＯＶＣＡＲ−５保持マウス、およびＨＣＴ−１５保持マウスに対する各化合物の抗腫瘍有効性を評価するために、対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ処置群の最後の測定日（ＨＰＡＣ：３２日目、ＮＣＩ−Ｈ４４１：３８日目、ＨＣＴ−１５：３２日目）またはすべての群が生存している最後の日（ＯＶＣＡＲ−５：２６日目）における各マウスの腫瘍容積を、ダネット検定により、対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ処置群の腫瘍容積と比較した。加えて、３３日目のＯＶＣＡＲ−５保持ヌードマウスの腫瘍容積を、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣ処置群とＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣ処置群との間でスチューデントｔ−検定により比較した。統計分析はすべて、ＳＡＳシステム リリース９．２（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．）を使用して、事後分析として実施した。０．０５未満のＰ値を、統計的に有意であるとみなした。
実施例１０：結果
１０．１ ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、ＴＡ−ＭＵＣ１陽性がん細胞株および陰性細胞に対するＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣの細胞傷害活性
ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣが、ヒトがん細胞株に対する標的依存性および薬物依存性細胞傷害活性を示すか否かを調査するために、ヒト乳がん細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＴＡ−ＭＵＣ１陽性）およびヒト結腸直腸がん細胞ＨＣＴ−１５（ＴＡ−ＭＵＣ１陰性）に対する、ネイキッドＰａｎｋｏＭａｂ、対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ、およびＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性を評価した。図８に示されているように、ネイキッドＰａｎｋｏＭａｂおよびｈＩｇＧ−ＡＤＣは、各細胞株に対して活性をほとんど示さなかった（ＩＣ５０＞１００ｎＭ）。こうした条件下では、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣは、ＴＡ−ＭＵＣ１陽性細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４６８に対して用量依存性細胞傷害活性を示した（図８Ａ、ＩＣ５０＜１０ｎＭ）。しかし、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣは、ＴＡ−ＭＵＣ１陰性細胞ＨＣＴ−１５に対しては活性を示さなかった（図８Ｂ、ＩＣ５０＞１００ｎＭ）。こうした結果に基づき、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＴＡ−ＭＵＣ１陽性がん細胞株に対して標的依存性および薬物依存性細胞傷害活性を示すと結論付けた。
１０．２ ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣとＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣとの間の、ＴＡ−ＭＵＣ１陽性細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性の比較
抗原結合親和性の向上が細胞傷害活性の増強に寄与し得るか否かを調査するため、ヒト膵がん細胞株ＨＰＡＣおよびヒト肺がん細胞株ＮＣＩ−Ｈ４４１に対する、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣおよびＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性を評価した。それらに対するＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣの細胞傷害活性は、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣの細胞傷害活性よりも１．５倍強力だった（図８Ｃおよび図８Ｄ）。ＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣのＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣに対する、ＨＰＡＣに対する効力比は１．９１７であり（１．６１１〜２．２８０、９５％ＣＩ）、ＮＣＩ−Ｈ４４１に対する効力比は１．６６３であった（１．４９５〜１．８４９、ＥＣ５０の９５％ＣＩ）。こうしたデータは、ＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣの細胞傷害活性が、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣよりも有意に強力であることを実証した。こうした結果は、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣの抗原結合親和性の向上が、細胞死滅活性の有意な増強に寄与し得ることを示唆する。
１０．３ ＴＡ−ＭＵＣ１陽性腫瘍に対するＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣの抗腫瘍有効性
ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣが、ｉｎ ｖｉｔｒｏだけでなくｉｎ ｖｉｖｏでも有効性を示すか否かを調査するため、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８保持マウスに対するネイキッドＰａｎｋｏＭａｂ、対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ、およびＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣの抗腫瘍有効性を評価した。図９に示されているように、ネイキッドＰａｎｋｏＭａｂおよび対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ（３ｍｇ／ｋｇ、単回投与）は、抗腫瘍有効性を示さなかった（ＴＧＩは両方とも、４１日目で−１８％だった）。対照的に、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣ（３ｍｇ／ｋｇ、単回投与）は、腫瘍成長を著しく阻害した（ＴＧＩは、４１日目で９７％だった）。さらに、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣは、対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣおよびネイキッドＰａｎｋｏＭａｂと比較して有意な抗腫瘍有効性を示した（両方とも４１日目でＰ＜０．００１）。体重変化の点では、薬物治療により引き起こされる体重減少は、すべての薬物処置群で一切観察されなかった。
また、ＨＣＣ７０保持マウスに対するネイキッドＰａｎｋｏＭａｂ、対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ、およびＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣの抗腫瘍有効性を評価した。図１０に示されているように、ネイキッドＰａｎｋｏＭａｂおよび対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ（１０ｍｇ／ｋｇ、単回投与）は、こうした異種移植モデルに対して弱い抗腫瘍有効性を示した（ＴＧＩは、４０日目でそれぞれ１０％および２９％だった）。対照的に、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣ（１０ｍｇ／ｋｇ、単回投与）は、腫瘍成長を著しく阻害した（ＴＧＩは、４０日目で９５％だった）。さらに、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣは、対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣと比較して、統計的に有意な抗腫瘍有効性を示した（両方とも４０日目でＰ＜０．００１）。体重変化の点では、薬物治療により引き起こされる体重減少は、すべての薬物処置群で一切観察されなかった。こうした結果は、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣが、強力な抗腫瘍有効性を有し、種々のＴＡ−ＭＵＣ１陽性異種移植モデルに対して標的依存性および薬物依存性抗腫瘍有効性を示したことを示唆する。
１０．４ ｉｎ ｖｉｖｏでのＴＡ−ＭＵＣ１陽性腫瘍に対するＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣとＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣとの抗腫瘍有効性の比較
ＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣが、ＴＡ−ＭＵＣ１陽性腫瘍細胞に対して、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣと等しいかまたはそれよりも大きな抗腫瘍有効性を有するか否かを調査するため、種々のタイプのＴＡ−ＭＵＣ１陽性腫瘍細胞に対するＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣおよびＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣの抗腫瘍有効性を比較した。
初めに、本発明者らは、中程度〜高度なＴＡ−ＭＵＣ１発現を示すＨＰＡＣ腫瘍細胞およびＮＣＩ−Ｈ４４１腫瘍細胞に対するｉｎ ｖｉｖｏ有効性を評価した。図１１に示されているように、ネイキッドＰＭ−Ｎ５４Ｑおよび対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ（１０ｍｇ／ｋｇ、単回投与）は、ＨＰＡＣ保持マウスに対して弱い抗腫瘍有効性を示した（ＴＧＩは、３２日目でそれぞれ２７％および１８％だった）。対照的に、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣおよびＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣ（１０ｍｇ／ｋｇ、単回投与）は、腫瘍成長を著しく阻害した（ＴＧＩは両方とも、３２日目で９３％だった）。さらに、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣおよびＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣ（１０ｍｇ／ｋｇ、単回投与）は、対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣと比較して、統計的に有意な抗腫瘍有効性を示した（両方とも、３２日目でＰ＜０．００１）。体重変化の点では、薬物治療により引き起こされる体重減少は、すべての薬物処置群で一切観察されなかった。
図１２に示されているように、ネイキッドＰａｎｋｏＭａｂおよびネイキッドＰＭ−Ｎ５４Ｑ（１０ｍｇ／ｋｇ、単回投与）は、ＮＣＩ−Ｈ４４１保持マウスに対して弱い抗腫瘍有効性を示した（ＴＧＩは、３８日目でそれぞれ８％および１２％だった）。対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ処置群（３ｍｇ／ｋｇ、単回投与）は、投与後２週間にわたって抗腫瘍有効性を示したが、２１日後に腫瘍再成長が観察された（ＴＧＩは、３８日目で７１％だった）。対照的に、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣおよびＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣ（３ｍｇ／ｋｇ、単回投与）は、腫瘍成長を著しく阻害した（ＴＧＩは両方とも、３８日目で９９％だった）。さらに、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣおよびＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣは、対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣと比較して、統計的に有意な抗腫瘍有効性を示した（３８日目でそれぞれＰ＜０．００１）。体重変化の点では、薬物治療により引き起こされる体重減少は、すべての薬物処置群で一切観察されなかった。
次に、本発明者らは、ＴＡ−ＭＵＣ１が低発現であるＯＶＣＡＲ−５腫瘍細胞に対するｉｎ ｖｉｖｏ有効性を評価した。図１３に示されているように、ネイキッドＰａｎｋｏＭａｂ、ＰＭ−Ｎ５４Ｑ、および対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣ（１０ｍｇ／ｋｇ、単回投与）は、ＯＶＣＡＲ５保持マウスに対して抗腫瘍有効性をほとんど示さなかった（ＴＧＩは、２６日目でそれぞれ１％、１１％、および３％だった）。このモデルでは、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣ（１０ｍｇ／ｋｇ、単回投与）の抗腫瘍有効性は限定的だったが（ＴＧＩは、２６日目で３７％だった）、ＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣ（１０ｍｇ／ｋｇ、単回投与）は、強力な抗腫瘍有効性を示した（ＴＧＩは、２６日目で７３％だった）。さらに、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣおよびＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣは、対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣと比較して、統計的に有意な抗腫瘍有効性を示した（２６日目でそれぞれＰ＝０．０１およびＰ＜０．００１）。加えて、ＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣは、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣと比較して、統計的に有意な抗腫瘍有効性を示した（２６日目でＰ＜０．００１）。体重変化の点では、薬物治療により引き起こされる体重減少は、すべての薬物処置群で一切観察されなかった。
最後に、本発明者らは、ＴＡ−ＭＵＣ１が陰性であるＨＣＴ−１５腫瘍細胞に対するｉｎ ｖｉｖｏ有効性を評価した。
図１４に示されているように、ネイキッドＰａｎｋｏＭａｂおよびＰＭ−Ｎ５４Ｑ（１０ｍｇ／ｋｇ、単回投与）は、このモデルに対して抗腫瘍有効性をほとんど示さなかった（ＴＧＩは、３２日目でそれぞれ７％、４％だった）。さらに、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣ、ＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣ、および対照ｈＩｇＧ−ＡＤＣも、このモデルに対して抗腫瘍有効性をほとんど示さなかった（ＴＧＩは、３２日目でそれぞれ１５％、２２％、および２６％だった）。
こうした結果に基づき、ＰａｎｋｏＭａｂ−ＡＤＣおよびＰＭ−Ｎ５４Ｑ−ＡＤＣの抗腫瘍有効性は標的依存性および薬物依存性であると結論付けた。また、抗原結合親和性の向上は、ＴＡ−ＭＵＣ１陽性腫瘍細胞に対する抗腫瘍有効性の増強に寄与することができる。
寄託された生物学的物質の特定
細胞株ＤＳＭ ＡＣＣ２８０６、ＤＳＭ ＡＣＣ２８０７、およびＤＳＭ ＡＣＣ２８５６は、下記の表に示されている日付にて、Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ ＧｍｂＨ，Ｒｏｂｅｒｔ−Ｒｏｓｓｌｅ−Ｓｔｒ．１０，１３１２５ Ｂｅｒｌｉｎ（ＤＥ）によりＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ），Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａβｅ ７Ｂ，３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ（ＤＥ）に寄託された。
Figure 2021524852
実施形態１７． ＭＵＣ１に結合することが可能な抗体であって、
（ｉ）
（ａ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２または７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖、ならびに
（ｉｉ）
（ａ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖
を含む抗体。
実施形態１８． ＭＵＣ１に結合することが可能な抗体であって、
（ｉ）配列番号１５または配列番号２２のアミノ酸配列を有する重鎖、および
（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖
を含む抗体。
実施形態１９． ＭＵＣ１に結合することが可能な抗体であって、
（ｉ）
（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ−Ｈ１、配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖、ならびに
（ｉｉ）
（ａ）配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖
を含む抗体。
実施形態２０． ＭＵＣ１に結合することが可能な抗体であって、
（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖、および
（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖
を含む抗体。

Claims (55)

  1. 細胞傷害剤にコンジュゲートされた抗体を含むコンジュゲートであって、抗体は、ＭＵＣ１に結合することが可能であり、
    （ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、ならびに
    （ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域
    を含む、コンジュゲート。
  2. 配列番号２の８位のアミノ酸が、グルタミン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、リジン、およびアルギニンからなる群から選択されるか、またはＣＤＲ−Ｈ２が、配列番号７のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のコンジュゲート。
  3. 抗体の重鎖可変領域が、配列番号９のアミノ酸配列、または配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のコンジュゲート。
  4. 抗体の重鎖可変領域が、配列番号１０のアミノ酸配列、または配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  5. 抗体の軽鎖可変領域が、配列番号１２のアミノ酸配列、または配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  6. 抗体の重鎖可変領域が、配列番号１０のアミノ酸配列を有し、抗体の軽鎖可変領域が、配列番号１２のアミノ酸配列を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  7. 抗体が、Ｆｃ領域を含み、好ましくは、ＩｇＧ１型抗体、ＩｇＧ２型抗体、またはＩｇＧ４型抗体である、請求項１から６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  8. 抗体の重鎖が、配列番号１５、特に配列番号２２のアミノ酸配列を有し、抗体の軽鎖が、配列番号１６のアミノ酸配列を有する、請求項１から７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  9. ＣＤＲ−Ｈ２が、配列番号８のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のコンジュゲート。
  10. 抗体の重鎖可変領域が、配列番号１１のアミノ酸配列、または配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１または９に記載のコンジュゲート。
  11. 抗体の重鎖可変領域が、配列番号１２のアミノ酸配列、または配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１、９、および１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  12. 抗体の重鎖可変領域が、配列番号１１のアミノ酸配列を有し、抗体の軽鎖可変領域が、配列番号１２のアミノ酸配列を有する、請求項１および９から１１のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  13. 抗体が、Ｆｃ領域を含み、好ましくは、ＩｇＧ１型抗体、ＩｇＧ２型抗体、またはＩｇＧ４型抗体である、請求項１および９から１２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  14. 抗体の重鎖が、配列番号１９のアミノ酸配列を有し、抗体の軽鎖が、配列番号１６のアミノ酸配列を有する、請求項１および９から１３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  15. 抗体が、以下の特徴：
    （ｉ）二分ＧｌｃＮＡｃ残基を保持するグリカンの量が検出可能であること、
    （ｉｉ）少なくとも１つのガラクトース残基を保持するグリカンの相対量は、組成物中の抗体のＦｃグリコシル化部位に付着されているグリカンの合計量の少なくとも２５％であること
    の１つまたは複数を有するグリコシル化パターンを含む、請求項７、８、１３、および１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  16. 抗体が、哺乳動物細胞での産生により得ることができる、請求項１から１５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  17. 抗体が、ＮＭ−Ｈ９Ｄ８（ＤＳＭ ＡＣＣ２８０６）、ＮＭ−Ｈ９Ｄ８−Ｅ６（ＤＳＭ ＡＣＣ２８０７）、ＮＭ−Ｈ９Ｄ８−Ｅ６Ｑ１２（ＤＳＭ ＡＣＣ２８５６）、およびそれらに由来する細胞株からなる群から選択されるヒト細胞株での産生により得ることができる、請求項１から１６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  18. 抗体が、ＣＨＯ細胞株またはそれに由来する細胞株での産生により得ることができる、請求項１から１６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  19. 抗体が、（ｉ）請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を準備するステップ、（ｉｉ）抗体の発現に好適な条件下で宿主細胞を培養するステップ、および（ｉｉｉ）宿主細胞により発現された抗体を得るステップを含む産生方法により得ることができる、請求項１から１８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  20. 抗体が、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体、または配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体と、ＴＡ−ＭＵＣ１に対する結合を競合する、請求項１から１９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  21. 抗体が、ＭＵＣ−１と結合することによりＭＵＣ１発現細胞へと内部移行されるという活性を有する、請求項１から２０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  22. 細胞傷害剤が抗腫瘍剤である、請求項１から２１のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  23. 細胞傷害剤が化学療法剤である、請求項１から２２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  24. 化学療法剤が、微小管阻害剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡアルキル化剤、およびＤＮＡ副溝結合剤からなる群から選択される、請求項２３に記載のコンジュゲート。
  25. 化学療法剤がトポイソメラーゼＩ阻害剤である、請求項２４に記載のコンジュゲート。
  26. トポイソメラーゼＩ阻害剤が、以下の式：
    Figure 2021524852
    により表される抗腫瘍化合物である、請求項２５に記載のコンジュゲート。
  27. 抗体が、以下の式（ａ）〜（ｆ）：
    （ａ）-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
    （ｂ）-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
    （ｃ）-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
    （ｄ）-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
    （ｅ）-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,および
    （ｆ）-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
    からなる群から選択される任意の構造を有するリンカーを介して、細胞傷害剤または抗腫瘍化合物にコンジュゲートされており、
    抗体は、-(Succinimid-3-yl-N)の末端に接続されており、細胞傷害剤または抗腫瘍化合物は、１位のアミノ基の窒素原子を接続位置として、式（ａ）〜（ｆ）の最も右側のカルボニル基に接続されており、ＧＧＦＧは、ペプチド結合を介して連結されているグリシン−グリシン−フェニルアラニン−グリシンからなるアミノ酸配列を表し、
    -(Succinimid-3-yl-N)は、以下の式：
    Figure 2021524852
    により表される構造を有し、その３位で抗体に接続されており、１位の窒素原子上でこの構造を含むリンカー構造のメチレン基に接続されている、請求項１から２６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  28. リンカーが、以下の式（ａ）〜（ｃ）：
    （ａ）-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
    （ｂ）-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,および
    （ｃ）-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
    からなる群から選択される任意の式により表される、請求項２７に記載のコンジュゲート。
  29. リンカーが、以下の式（ａ）：
    （ａ）-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-
    により表される、請求項２７または２８に記載のコンジュゲート。
  30. 抗体が、以下の式（式中、星印＊は、抗体との接続点を表す）：
    Figure 2021524852
    により表される薬物リンカーにチオエーテル結合でコンジュゲートされている、請求項２６から２９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  31. 以下の式：
    Figure 2021524852
    により表され、
    式中、ＡＢは、その抗体を表し、ｙは、抗体にコンジュゲートされた薬物−リンカー構造の単位の、１抗体当たりの平均数を表し、抗体は、上記式により表される薬物リンカーにチオエーテル結合でコンジュゲートされている、請求項２６から３０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  32. 抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域または重鎖および軽鎖の以下の組合せａ）〜ｄ）：
    （ａ）重鎖可変領域は、配列番号１０のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を有すること、
    （ｂ）重鎖可変領域は、配列番号１１のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域は、配列番号１２のアミノ酸配列を有すること、
    （ｃ）重鎖は、配列番号２２のアミノ酸配列を有し、軽鎖は、配列番号１６のアミノ酸配列を有すること、および
    （ｄ）重鎖は、配列番号１９のアミノ酸配列を有し、軽鎖は、配列番号１６のアミノ酸配列を有すること
    のいずれか１つを含む、請求項３０または３１に記載のコンジュゲート。
  33. 以下の式：
    Figure 2021524852
    により表され、
    式中、ＡＢは抗体を表し、抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含み、ｙは、抗体にコンジュゲートされた薬物−リンカー構造の単位の、１抗体あたりの平均数を表し、抗体は、上記式により表される薬物リンカーにチオエーテル結合でコンジュゲートされている、コンジュゲート。
  34. 以下の式：
    Figure 2021524852
    により表され、
    式中、ＡＢは抗体を表し、抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含み、ｙは、抗体にコンジュゲートされた薬物−リンカー構造の単位の、１抗体あたりの平均数を表し、抗体は、上記式により表される薬物リンカーにチオエーテル結合でコンジュゲートされている、コンジュゲート。
  35. 以下の式：
    Figure 2021524852
    により表され、
    式中、ＡＢは抗体を表し、抗体は、配列番号２２のアミノ酸配列を有する重鎖、および配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖を含み、ｙは、抗体にコンジュゲートされた薬物−リンカー構造の単位の、１抗体あたりの平均数を表し、抗体は、上記式により表される薬物リンカーにチオエーテル結合でコンジュゲートされている、コンジュゲート。
  36. 以下の式：
    Figure 2021524852
    により表され、
    式中、ＡＢは抗体を表し、抗体は、配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖、および配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖を含み、ｙは、抗体にコンジュゲートされた薬物−リンカー構造の単位の、１抗体あたりの平均数を表し、抗体は、上記式により表される薬物リンカーにチオエーテル結合でコンジュゲートされている、コンジュゲート。
  37. 抗体が、脱フコシル化、フコース低減、Ｎ−連結グリコシル化、Ｏ−連結グリコシル化、Ｎ末端プロセシング、Ｃ末端プロセシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化、重鎖の２３４位および２３５位にある２つのロイシン（Ｌ）残基のアラニン（Ａ）への置換（ＬＡＬＡ）、プロリン残基のアミド化、およびカルボキシル末端の１つまたは２つのアミノ酸の欠失または欠如からなる群から選択される１つまたは複数の修飾を含む、請求項１から３６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  38. 抗体が、重鎖のカルボキシル末端の１つまたは２つのアミノ酸の欠失または欠如を含む、請求項３７に記載のコンジュゲート。
  39. 抗体が、両方が１つのカルボキシル末端アミノ酸残基を欠如する２つの重鎖を含む、請求項３８に記載のコンジュゲート。
  40. コンジュゲートされた細胞傷害剤、特に薬物リンカー構造の、１抗体当たりの平均数ｙが、１から１０までの範囲である、請求項１から３９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  41. コンジュゲートされた細胞傷害剤、特に選択された１つの薬物−リンカー構造の単位の、１抗体当たりの平均数ｙが、２から８までの範囲である、請求項１から４０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  42. コンジュゲートされた細胞傷害剤、特に選択された１つの薬物−リンカー構造の単位の、１抗体当たりの平均数ｙが、３から８までの範囲である、請求項１から４１のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  43. コンジュゲートされた細胞傷害剤、特に選択された１つの薬物−リンカー構造の単位の、１抗体当たりの平均数ｙが、７から８までの範囲である、請求項１から４２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  44. コンジュゲートされた細胞傷害剤、特に選択された１つの薬物−リンカー構造の単位の、１抗体当たりの平均数ｙが、７．５から８までの範囲である、請求項１から４３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  45. １抗体分子当たりのコンジュゲートされた細胞傷害剤の数が、８である、請求項１から４４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  46. 請求項１から４５のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む組成物。
  47. 医薬において使用するための、請求項１から４５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  48. がん、感染症、自己免疫疾患、または免疫不全障害の治療に使用するための、請求項４７に記載のコンジュゲートまたは請求項４６に記載の組成物。
  49. がんが、ＴＡ−ＭＵＣ１を発現することにより特徴付けられる、請求項４７または４８に記載のコンジュゲートまたは組成物。
  50. がんが、卵巣がん、乳がん、膵臓がん、肺がん、結腸がん、胃がん、肝臓がん、腎臓がん、血液がん、子宮内膜がん、甲状腺がん、白血病、半水癌、黒色腫、癌腫、奇形腫、リンパ腫、肉腫、中皮腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、直腸がん、副腎がん、皮膚がん、脳がん、子宮頸がん、腸管がん、腸がん、頭頸部がん、消化管がん、リンパ節がん、食道がん、結腸直腸がん、耳鼻咽喉（ＥＮＴ）がん、前立腺がん、膀胱がん、子宮がん、およびそれらの転移からなる群から選択される、請求項４９に記載のコンジュゲートまたは組成物。
  51. 組成物が、さらなる作用剤と組み合わせて使用される、請求項４６から５０のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたは組成物。
  52. それを必要とする対象のがんを治療するための方法であって、がんを有する対象に、実施形態１から４５のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたは請求項４６に記載の組成物の治療有効量を投与するステップを含む方法。
  53. がんが、ＴＡ−ＭＵＣ１を発現することにより特徴付けられる、請求項５２に記載の方法。
  54. がんが、卵巣がん、乳がん、膵臓がん、肺がん、結腸がん、胃がん、肝臓がん、腎臓がん、血液がん、子宮内膜がん、甲状腺がん、白血病、半水癌、黒色腫、癌腫、奇形腫、リンパ腫、肉腫、中皮腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、直腸がん、副腎がん、皮膚がん、脳がん、子宮頸がん、腸管がん、腸がん、頭頸部がん、消化管がん、リンパ節がん、食道がん、結腸直腸がん、耳鼻咽喉（ＥＮＴ）がん、前立腺がん、膀胱がん、子宮がん、およびそれらの転移からなる群から選択される、請求項５２または５３に記載のがんを治療するための方法。
  55. さらなる療法剤を投与するステップをさらに含む、請求項５４に記載のがんを治療するための方法。
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