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CN110382538A - 结合muc1和cd3的多特异性抗体构建体 - Google Patents

结合muc1和cd3的多特异性抗体构建体 Download PDF

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CN110382538A CN201880013557.5A CN201880013557A CN110382538A CN 110382538 A CN110382538 A CN 110382538A CN 201880013557 A CN201880013557 A CN 201880013557A CN 110382538 A CN110382538 A CN 110382538A
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Abstract

本发明涉及针对癌抗原MUC1和T细胞抗原CD3的多特异性抗体构建体。特别地，多特异性抗体构建体将T细胞募集到癌症部位。多特异性抗体构建体的设计显示出强抗原结合和高T细胞活化。

Description

结合MUC1和CD3的多特异性抗体构建体
发明领域
本发明涉及抗体领域。提供了针对癌抗原和免疫细胞抗原的多特异性抗体构建体。特别地，多特异性抗体构建体将T细胞募集(通过与CD3结合)至癌症部位(通过与癌抗原MUC1结合)。多特异性抗体构建体的设计在所提供的特定环境中显示出明显的优势，特别是强抗原结合和高T细胞活化。在具体的实施方案中，本发明涉及这些多特异性抗体构建体的治疗和诊断用途。
发明背景
针对肿瘤相关抗原的抗体是广泛使用的针对癌症的治疗剂。今天，许多抗癌抗体被批准用于人类治疗。这些抗体中的一些通过阻断对特定癌细胞的存活或增殖至关重要的某些信号传导途径起作用。其他抗癌抗体活化患者针对被靶向的癌细胞的免疫应答，例如启动通过天然杀伤细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。通过抗体Fc部分与免疫细胞上的Fc受体的结合诱导该机制。
一组有趣且重要的抗体是针对粘蛋白的抗体。粘蛋白是由脊椎动物中的许多上皮组织产生的高分子量、高度糖基化的蛋白质家族。它们可以细分为由于存在有利于保留在质膜中的疏水跨膜结构域而膜结合的粘蛋白，以及分泌到粘膜表面或分泌成唾液成分的粘蛋白。人粘蛋白家族由许多家族成员组成，包括膜结合的MUC1。
在许多腺癌中发生增加的粘蛋白产生，包括胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌等。粘蛋白也在肺病如哮喘、支气管炎、慢性阻塞性肺病或囊性纤维化中过度表达。已经关于它们在疾病过程中的病理学意义广泛研究了两种膜粘蛋白MUC1和MUC4。此外，还研究了粘蛋白作为诊断标志物的潜力。针对粘蛋白特别是MUC1的几种抗体是本领域已知的。然而，仍可以改善它们的治疗功效。
鉴于此，本领域需要提供具有增加的治疗功效的治疗性抗MUC1抗体构建体。
发明概述
本发明人已经发现，通过将抗MUC1抗体与抗CD3抗原结合片段组合可以改善抗MUC1抗体。CD3是T细胞的特征性表面蛋白，其与T细胞受体(TCR)一起形成TCR-CD3复合物。同时结合抗癌抗原MUC1和T细胞抗原CD3使得能够将细胞毒性T淋巴细胞(CTL)募集到肿瘤部位。CTL的募集是有意义的，因为它们是介导抗肿瘤作用的最有效细胞之一。令人惊讶的是，本发明人发现，结合MUC1和CD3的多特异性抗体构建体的特定设计导致显著更强的CD3结合并且还显著增加T细胞活化。在该优良设计中，抗CD3抗原结合片段与抗MUC1抗体模块的重链的C末端融合。如实验所证明的，与类似的抗体构建体(其中抗CD3抗原结合片段与抗MUC1抗体模块的轻链的C末端融合)相比，该构建体设计与CD3结合更强并诱导增加的T细胞介导的ADCC和T细胞增殖。
因此，在第一方面，本发明涉及多特异性抗体构建体，其包含
(i)抗MUC1抗体模块，该抗体模块包含至少一条抗体重链，和
(ii)抗CD3抗原结合片段；
其中抗原结合片段与抗体模块的重链的C末端融合。
在第二方面，本发明提供了编码根据本发明的多特异性抗体构建体的核酸。此外，在第三方面，提供了包含根据本发明的核酸和与所述核酸可操作地连接的启动子的表达盒或载体，并且，在第四方面，提供了包含根据本发明的核酸或表达盒或载体的宿主细胞。
在第五方面，本发明涉及包含根据本发明的多特异性抗体构建体的药物组合物。
根据第六方面，本发明提供了根据本发明的多特异性抗体构建体或药物组合物，其用于医学，特别是用于治疗癌症、感染、移植物抗宿主病或自身免疫疾病。
根据以下描述和所附权利要求，本发明的其他目的、特征、优点和方面对于本领域技术人员而言将变得显而易见。然而，应该理解，以下描述、所附权利要求和指示本申请的优选实施方案的具体实施例仅以举例说明的方式给出。通过阅读以下内容，本领域技术人员将容易明白在所公开发明的精神和范围内的各种变化和修改。
定义
如本文所用，以下表述通常旨在优选具有如下所述的含义，除非使用它们的上下文另有说明。
除了其字面含义之外，本文所用的表述“包含”还包括并且具体地指代表述“基本上由......组成”和“由......组成”。因此，表述“包含”是指其中“包含”具体列出的元素的主题不包含其他元素的实施方案以及其中“包含”具体列出的元素的主题可以和/或确实包含其他元素的实施方案。同样，表述“具有”应理解为表述“包含”，还包括并且具体地指代表述“基本上由......组成”和“由......组成”。在可能的情况下，术语“基本上由......组成”特别是指其中除了基本上组成主题的具体列出的元素以外主题包含20％或更少、特别是15％或更少、10％或更少、或尤其是5％或更少的其他元素的实施方案。
术语“抗体”特别是指包含通过二硫键连接的至少两条重链和两条轻链的蛋白质。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。重链恒定区包含三个或(在IgM-或IgE-型抗体的情况下)四个重链恒定结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)，其中第一个恒定结构域CH1与可变区相邻并且可以通过铰链区连接到第二恒定结构域CH2。轻链恒定区仅由一个恒定结构域组成。可变区可以进一步细分为散布有更保守的区域(称为框架区(FR))的高变区(称为互补决定区(CDR))，其中每个可变区包含三个CDR和四个FR。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。重链恒定区可以是任何类型，例如γ-、δ-、α-、μ-或ε-型重链。优选地，抗体的重链是γ链。此外，轻链恒定区也可以是任何类型，例如κ-或λ-型轻链。优选地，抗体的轻链是κ链。术语“γ-(δ-、α-、μ-或ε-)型重链”和“κ-(λ-)型轻链”分别指具有衍生自天然存在的重链或轻链恒定区氨基酸序列，尤其是人重链或轻链恒定区氨基酸序列的恒定区氨基酸序列的抗体重链或抗体轻链。特别地，γ-型(特别是γ1-型)重链的恒定结构域的氨基酸序列与人γ(尤其是人γ1的同种异型之一)抗体重链的恒定结构域的氨基酸序列至少95％，特别是至少98％相同。此外，κ型轻链恒定结构域的氨基酸序列与人κ抗体轻链的同种异型之一的恒定结构域的氨基酸序列特别地至少95％，特别是至少98％相同。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q))的结合。抗体可以是例如人源化、人或嵌合抗体。
抗体的抗原结合部分通常是指抗体的全长或一个或多个片段，其保留特异性结合抗原的能力。已经显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段进行。抗体的结合片段的实例包括Fab片段，其是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，其是包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段，每个Fab片段与相同的抗原结合；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；和由VH结构域组成的dAb片段。
抗体的“Fab部分”特别是指包含重链和轻链可变区(VH和VL)以及重链和轻链恒定区的第一结构域(CH1和CL)的抗体的一部分。在抗体不全包含这些区域的情况下，术语“Fab部分”仅指区域VH、VL、CH1和CL中存在于抗体中的那些。优选地，“Fab部分”是指抗体的一部分，其对应于通过用木瓜蛋白酶消化天然抗体而获得的含有抗体的抗原结合活性的片段。特别地，抗体的Fab部分包括抗原结合位点或其抗原结合能力。优选地，Fab部分至少包含抗体的VH区。
抗体的“Fc部分”特别是指包含重链恒定区2、3和(在适用的情况下)4(CH2、CH3和CH4)的抗体的一部分。特别地，Fc部分包括这些区域中的每一个的两个。在抗体不全包含这些区域的情况下，术语“Fc部分”仅指区域CH2、CH3和CH4中的存在于抗体中的那些。优选地，Fc部分至少包含抗体的CH2区。优选地，“Fc部分”是指抗体的一部分，其对应于通过用木瓜蛋白酶消化天然抗体而获得的不含抗体的抗原结合活性的片段。特别地，抗体的Fc部分能够结合Fc受体，因此，例如，包含Fc受体结合位点或Fc受体结合能力。
如本文所用，术语“抗体”和“抗体构建体”在某些实施方案中分别指相同种类的抗体或抗体构建体群。特别地，群体的所有抗体或抗体构建体都显示出用于定义抗体或抗体构建体的特征。在某些实施方案中，群体中的所有抗体或抗体构建体具有相同的氨基酸序列。提及特定种类的抗体或抗体构建体，例如特异性结合MUC1的表位和CD3的表位的多特异性抗体构建体，特别是指这种种类的抗体或抗体构建体的群体。
如本文所用的术语“抗体”还包括所述抗体的片段和衍生物。抗体的“片段或衍生物”特别地是蛋白质或糖蛋白，其来源于所述抗体并且能够结合相同的抗原，特别是结合与抗体相同的表位。因此，本文抗体的片段或衍生物通常是指功能片段或衍生物。在特别优选的实施方案中，抗体的片段或衍生物包含重链可变区。已经显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体或其衍生物的片段执行。抗体片段的实例包括(i)Fab片段，其是由每条重链和轻链的可变区和第一恒定区组成的单价片段；(ii)F(ab)2片段，其是包含两个Fab片段的二价片段，所述Fab片段在铰链区通过二硫键连接；(iii)由重链的可变区和第一恒定区CH1组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的重链和轻链可变区组成的Fv片段；(v)scFv片段，其是由单一多肽链组成的Fv片段；(vi)由共价连接在一起的两个Fv片段组成的(Fv)2片段；(vii)重链可变结构域；和(viii)由重链可变区和轻链可变区组成的多体，所述重链可变区和轻链可变区以重链和轻链可变区的缔合仅可发生在分子间而不是分子内的方式共价连接在一起。抗体的衍生物特别包括结合与亲本抗体相同的抗原但具有与衍生其的亲本抗体不同的氨基酸序列的抗体。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段和衍生物。
如果靶氨基酸序列在其整个长度上与参考氨基酸序列的相应部分具有至少75％、更优选至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性或同一性，则靶氨基酸序列“来源于”或“对应于”参考氨基酸序列。“相应部分”是指，例如，靶抗体的重链可变区的框架区1(FRH1)对应于参照抗体的重链可变区的框架区1。在特定实施方案中，“来源于”或“对应于”参照氨基酸序列的靶氨基酸序列在其整个长度上与参考氨基酸序列的相应部分是100％同源的，或特别是100％相同的。氨基酸序列或核苷酸序列的“同源性”或“同一性”优选根据本发明在参考序列的整个长度上或在参考序列的相应部分(其对应于定义同源性或同一性的序列)的整个长度上确定。衍生自亲本抗体的抗体(其由一个或多个氨基酸序列(例如特定CDR序列或特定可变区序列)定义)特别是具有氨基酸序列例如CDR序列或可变区序列的抗体，该氨基酸序列与亲本抗体的各氨基酸序列至少75％、优选至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％同源或相同，尤其是相同。在某些实施方案中，衍生自亲本抗体(即其衍生物)的抗体包含与亲本抗体相同的CDR序列，但在可变区的其余序列中不同。
如本文所用的术语“抗体”还指多价和多特异性抗体，即具有各自结合相同表位的多于两个结合位点的抗体构建体，和具有结合第一表位的一个或多个结合位点和结合第二表位的一个或多个结合位点以及任选甚至与其他表位结合的其他结合位点的抗体构建体。
“特异性结合”优选是指试剂例如抗体与其特异于的靶标例如表位的结合相较于与另一靶标的结合更强。如果试剂结合第一靶标的解离常数(Kd)低于第二靶标的解离常数，则其与第一靶标的结合相较于第二靶标更强。优选地，试剂特异性结合的靶标的解离常数比所述试剂不特异性结合的靶标的解离常数低超过100倍、200倍、500倍或超过1000倍。此外，术语“特异性结合”特别指示结合配偶体之间的结合亲和力具有至少106M-1、优选至少107M-1、更优选至少108M-1的亲和常数Ka。特异于某种抗原的抗体特别是指能够以具有至少106M-1、优选至少107M-1、更优选至少108M-1的Ka的亲和力结合所述抗原的抗体。例如，术语“抗MUC1抗体”特别是指特异性结合MUC1的抗体，并且其优选能够以具有至少106M-1、优选至少107M-1、更优选至少108M-1的Ka的亲和力结合MUC1。
本文提及的“抗体模块”是指衍生自抗体并且能够特异性结合抗原的多肽构建体。特别地，抗体模块包含至少一条，尤其是两条抗体重链和任选地至少一条，尤其是两条抗体轻链。
如本文所用的术语“抗原结合片段”是指衍生自抗体的多肽构建体，其能够特异性结合抗原，但不包含天然抗体的全部元件。特别地，抗原结合片段不包含抗体的一些或所有恒定结构域，并且可以包含仅一个而不是两个抗原结合位点。
“CD3”是指T细胞共受体CD3(分化簇3)，特别是人CD3。它通常由四条不同的多肽链组成，CD3γ链、CD3δ链和两条CD3ε链。与T细胞受体(TCR)一起，CD3可以形成TCR-CD3复合物。
术语“MUC1”是指蛋白质MUC1，也称为粘蛋白-1、多态性上皮粘蛋白(PEM)或癌抗原15-3，特别是人MUC1。MUC1是粘蛋白家族的成员，并且编码膜结合的糖基化磷蛋白。MUC1具有120-225kDa的核心蛋白质质量，其通过糖基化增加至250-500kDa。它延伸超出细胞表面200-500纳米。该蛋白质通过跨膜结构域锚定在许多上皮细胞的顶端表面上。细胞外结构域包括20个氨基酸的可变数目串联重复(VNTR)结构域，其中在不同的个体中重复的数目从20到120变化。这些重复序列富含丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸残基，其允许进行重度O-糖基化。在某些实施方案中，术语“MUC1”指肿瘤相关的MUC1(“TA-MUC1”)。TA-MUC1是存在于癌细胞上的MUC1。该MUC1与存在于非癌细胞上的MUC1的不同之处在于其高得多的表达水平、其定位和其糖基化。特别地，TA-MUC1无极地存在于癌细胞的整个细胞表面上，而在非癌细胞中，MUC1具有严格的顶端表达，因此不能用于全身施用的抗体。此外，TA-MUC1具有异常的O-糖基化，其暴露MUC1蛋白骨架上的新肽表位和新的碳水化合物肿瘤抗原，例如Thomsen-Friedenreich抗原α(TFα)。
“TFα”，也称为Thomsen-Friedenreich抗原α或Core-1，是指二糖Gal-β1,3-GalNAc，其在癌细胞中以α-异构体构型与蛋白质的羟基氨基酸丝氨酸或苏氨酸O-糖苷连接。
术语“唾液酸”特别是指神经氨酸的任何N-或O-取代的衍生物。它可以指5-N-乙酰神经氨酸和5-N-羟乙酰神经氨酸，但优选仅指5-N-乙酰神经氨酸。唾液酸特别是5-N-乙酰神经氨酸优选通过2,3-或2,6-键联附接到碳水化合物链上。优选地，在本文所述的抗体中，存在2,3-以及2,6-偶联的唾液酸。
根据本发明的“相对量的聚糖”是指分别与抗体制剂或包含抗体的组合物中的抗体附接的聚糖的特定百分比或百分比范围。特别地，聚糖的相对量是指抗体中包含的和因此与抗体制剂或包含抗体的组合物中的抗体的多肽链附接的所有聚糖的特定百分比或百分比范围。100％的聚糖是指分别与抗体制剂或包含抗体的组合物中的抗体附接的所有聚糖。例如，10％的携带二等分GlcNAc的聚糖的相对量是指这样的包含抗体的组合物，其中抗体中包含的和因此与所述组合物中的抗体多肽链附接的所有聚糖的10％包含二等分GlcNAc残基，而抗体中包含的和因此与所述组合物中的抗体多肽链附接的所有聚糖的90％不包含二等分GlcNAc残基。代表100％的聚糖的相应参考量可以是与组合物中的抗体附接的所有聚糖结构，或所有N-聚糖即与组合物中抗体的天冬酰胺残基附接的所有聚糖结构，或所有复合型聚糖。聚糖结构的参考组通常由技术人员明确指出或直接从环境中得出。
术语“N-糖基化”是指与蛋白质多肽链的天冬酰胺残基附接的所有聚糖。这些天冬酰胺残基通常是具有氨基酸序列Asn-Xaa-Ser/Thr的N-糖基化位点的一部分，其中Xaa可以是除脯氨酸外的任何氨基酸。同样，“N-聚糖”是与多肽链的天冬酰胺残基附接的聚糖。术语“聚糖”、“聚糖结构”、“碳水化合物”、“碳水化合物链”和“碳水化合物结构”通常在本文中同义使用。N-聚糖通常具有由两个N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基和三个甘露糖残基组成的共同核心结构，具有结构Manα1,6-(Manα1,3-)Manβ1,4-GlcNAcβ1,4-GlcNAcβ1-Asn，其中Asn是多肽链的天冬酰胺残基。N-聚糖被细分为三种不同类型，即复合型聚糖、杂合型聚糖和高甘露糖型聚糖。
本文给出的数字，特别是特定糖基化性质的相对量，优选理解为近似数。特别地，该数字优选地可以高达10％更高和/或更低，特别是高达9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％更高和/或更低。
术语“核酸”包括单链和双链核酸和核糖核酸以及脱氧核糖核酸。它可以包含天然存在的以及合成的核苷酸，并且可以是天然或合成修饰的，例如通过甲基化、5'-和/或3'-加帽修饰。
术语“表达盒”特别是指能够实现和调节其中引入的编码核酸序列的表达的核酸构建体。表达盒可包含启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件。表达盒的确切结构可以根据物种或细胞类型而变化，但通常包括分别参与转录和翻译起始的5'-非转录和5'-和3'-非翻译序列，例如TATA框、加帽序列、CAAT序列等。更具体地，5'-非转录的表达控制序列包含启动子区，其包括用于可操作地连接的核酸的转录控制的启动子序列。表达盒还可包含增强子序列或上游激活子序列。
根据本发明，术语“启动子”是指位于待表达的核酸序列的上游(5')并通过提供RNA聚合酶的识别和结合位点来控制序列的表达的核酸序列。“启动子”可以包括参与基因转录调节的其他因子的其他识别和结合位点。启动子可以控制原核或真核基因的转录。此外，启动子可以是“可诱导的”，即响应诱导剂引发转录，或者如果转录不受诱导剂控制，则可以是“组成型的”。如果不存在诱导剂，则在诱导型启动子控制下的基因不表达或仅在很小程度上表达。在诱导剂存在下，基因被打开或转录水平增加。通常，这通过特异性转录因子的结合来介导。
术语“载体”在本文中以其最一般的含义使用，并且包括用于核酸的任何中间媒介物，其使得所述核酸能够例如被引入原核和/或真核细胞中，并且在适当时，被整合到基因组中。这种类型的载体优选在细胞中复制和/或表达。载体包括质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒基因组。本文所用的术语“质粒”通常涉及染色体外遗传物质的构建体，通常是环状DNA双链体，其可独立于染色体DNA复制。
根据本发明，术语“宿主细胞”涉及可以用外源核酸转化或转染的任何细胞。根据本发明，术语“宿主细胞”包括原核(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如哺乳动物细胞特别是人细胞、酵母细胞和昆虫细胞)。特别优选哺乳动物细胞，例如来自人、小鼠、仓鼠、猪、山羊或灵长类动物的细胞。细胞可以衍生自多种组织类型，并且包括原代细胞和细胞系。核酸可以以单拷贝或两个或更多个拷贝的形式存在于宿主细胞中，并且在一个实施方案中，在宿主细胞中表达。
根据本发明的术语“患者”是指人、非人灵长类动物或其他动物，特别是哺乳动物，例如牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫或啮齿动物，例如小鼠和大鼠。在特别优选的实施方案中，患者是人。
根据本发明的术语“癌症”特别包括白血病，精原细胞瘤，黑素瘤，癌，畸胎瘤，淋巴瘤，肉瘤，间皮瘤，神经母细胞瘤，神经胶质瘤，直肠癌，子宫内膜癌，肾癌，肾上腺癌，甲状腺癌，血癌，皮肤癌，脑癌，宫颈癌，肠道癌，肝癌，结肠癌，胃癌，肠癌，头颈癌，胃肠癌，淋巴结癌，食道癌，结肠直肠癌，胰腺癌，耳、鼻和喉(ENT)癌症，乳腺癌，前列腺癌，膀胱癌，子宫癌，卵巢癌和肺癌及其转移癌。根据本发明的术语癌症还包括癌症转移。
“肿瘤”是指由错误调节的细胞增殖形成的一组细胞或组织。肿瘤可能显示部分或完全缺乏与正常组织的结构组织和功能协调，并且通常形成明显的组织块，其可以是良性的或恶性的。
“转移”是指癌细胞从其原始部位扩散到身体的另一部分。转移的形成是一个非常复杂的过程，并且通常涉及癌细胞从原发肿瘤脱离、进入体循环并沉降至体内其他部位的正常组织内生长。当肿瘤细胞转移时，新肿瘤称为继发性或转移性肿瘤，其细胞通常与原始肿瘤相似。这意味着，例如，如果乳腺癌转移到肺部，则继发性肿瘤由异常的乳腺细胞组成，而不是由异常的肺细胞组成。然后将肺中的肿瘤称为转移性乳腺癌，而不是肺癌。
术语“药物组合物”特别是指适合施用至人或动物的组合物，即含有药学上可接受的组分的组合物。优选地，药物组合物包含活性化合物或其盐或前药以及载体、稀释剂或药物赋形剂，例如缓冲剂、防腐剂和张力调节剂。
本文描述的数字范围包括定义该范围的数字。本文提供的标题不是对本发明的各个方面或实施方案(其可以通过参考整个说明书来阅读)的限制。根据一个实施方案，本文描述为在方法的情况下包括某些步骤或在组合物的情况下包含某些成分的主题是指由各个步骤或成分组成的主题。优选选择和组合本文所述的优选方面和实施方案，并且由优选实施方案的相应组合产生的具体主题也属于本公开内容。
发明详述
本发明基于双特异性抗体构建体的开发，其中特异性结合CD3的scFv片段与靶向MUC1的抗癌抗体融合。已建立的抗MUC1抗体通过与肿瘤相关的MUC1结合并募集并活化细胞毒性免疫细胞而发挥其抗癌活性。免疫细胞特别是天然杀伤细胞(NK细胞)的结合和活化是通过抗体Fc部分与免疫细胞上的Fcγ受体尤其是FcγRIIIa的相互作用来实现的。活化后，启动抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。杀死肿瘤细胞也可以由高效细胞毒性T淋巴细胞介导。鉴于此，本发明人通过将抗CD3结合片段附接于这些抗体，进一步改善了已建立的抗MUC1抗体的功效。CD3是细胞毒性T淋巴细胞的细胞表面蛋白，并且抗CD3结合片段将所述细胞毒性T淋巴细胞募集到抗MUC1抗体靶向的肿瘤部位。
本发明人惊奇地发现，在这方面，抗CD3结合片段与抗MUC1抗体的重链的C末端的附接导致显著改善的CD3结合和T细胞活化，包括T细胞介导的ADCC活性和T细胞增殖。相反，在抗MUC1抗体的轻链的C末端包含抗CD3结合片段的双特异性构建体显示降低的CD3结合和T细胞活化。这是非常令人惊讶的，因为在相关技术领域中，T细胞结合结构域和癌细胞结合结构域之间的短距离是非常有利的(参见，例如，Bluemel,C.等人(2010)Cancer ImmunolImmunother 59:1197-1209；Chames,P.and Baty,D.(2009)mAbs1(6):539-547)。与此相反，与其中抗CD3结合片段附接在轻链的C末端的构建体相比，在本发明的其中抗CD3结合片段与重链的C末端附接的抗体构建体中结合结构域之间的距离大得多。在靶向肿瘤抗原HER2和CD3的对照构建体中，两个结合位点之间的短距离确实是有益的，如本领域所教导的。在本文中，与在重链C末端相比，在轻链C末端携带CD3结合位点的构建体的T细胞活化更强。
本教导内容用两种不同的抗MUC1抗体验证。PankoMab特异性结合MUC1的细胞外重复区域中的TA-MUC1表位，其仅在肿瘤细胞上是可接近的。KaroMab与Thomson-Friedenreich抗原(其是存在于MUC1上的碳水化合物结构，其也仅在肿瘤细胞上是可接近的)结合。对于抗癌抗体PankoMab和KaroMab，用其中抗CD3 scFv片段与抗癌抗体的重链的C末端融合的抗体构建体获得了优异的CD3结合和T细胞活化。
鉴于这些发现，本发明提供了一种多特异性抗体构建体，其包含
(i)抗MUC1抗体模块，该抗体模块包含至少一条抗体重链，和
(ii)抗CD3抗原结合片段；
其中抗原结合片段与抗体模块的重链的C末端融合。
多特异性抗体构建体是蛋白质构建体，其包含两个或更多个特异性结合不同抗原的不同抗原结合位点。至少一个抗原结合位点特异性结合MUC1的表位，并且至少一个其他抗原结合位点特异性结合CD3。多特异性抗体构建体可包含多于一个特异性结合MUC1表位的抗原结合位点，该抗原结合位点可具有相同的氨基酸序列。特别地，特异性结合MUC1表位的所有抗原结合位点是抗MUC1抗体模块的一部分。此外，多特异性抗体构建体可包含多于一个特异性结合CD3的抗原结合位点，所述抗原结合位点可具有相同的氨基酸序列。特异性结合CD3的抗原结合位点可以是相同抗原结合片段的一部分，或者可以存在于单独的抗原结合片段中。
抗原结合位点包含至少一个抗体可变区，特别是抗体重链可变区。在具体的实施方案中，抗原结合位点包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区。抗原结合位点的抗原重链可变区和抗体轻链可变区可以通过肽接头彼此融合。在某些实施方案中，抗原结合位点是单链可变区片段(scFv)。
抗MUC1抗体模块
抗MUC1抗体模块包含至少一个特异性结合MUC1表位的抗原结合位点。在某些实施方案中，抗体模块包含至少两个，尤其是恰好两个特异性结合MUC1表位的抗原结合位点。这些抗原结合位点可以不同或相同，特别是具有相同的氨基酸序列。在具体的实施方案中，抗体模块的抗原结合位点包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区。
抗MUC1抗体模块包含至少一条抗体重链。在某些实施方案中，抗体模块包含两条抗体重链。抗体重链特别包含VH结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。在某些其他实施方案中，抗体重链包含CH2结构域和CH3结构域，但不包含CH1结构域。在进一步的实施方案中，重链的一个或多个恒定结构域可以被其他结构域特别是相似的结构域例如白蛋白替换。抗体重链可以是任何类型，包括γ-、α-、ε-、δ-和μ-链，并且优选是γ-链，包括γ1-、γ2-、γ3-和γ4-链，尤其是γ1链。因此，抗体模块优选是IgG型抗体模块，特别是IgG1型抗体模块。
在优选的实施方案中，抗体模块包含Fc区。抗体模块尤其可以是完整抗体，其包含两条重链以及两条轻链，每条重链包含结构域VH、CH1、铰链区、CH2和CH3，每条轻链包含结构域VL和CL。特别地，抗体模块能够结合一种或多种人Fcγ受体，尤其是人Fcγ受体IIIA。在某些实施方案中，抗体模块不与人Fcγ受体IIIA结合或与其不显著结合。在这些实施方案中，抗体模块特别地在CH2结构域中不包含糖基化位点。
特别地，抗体模块还包含至少一条抗体轻链，尤其是两条抗体轻链。抗体轻链特别地包含VL结构域和CL结构域。抗体轻链可以是κ链或λ链，尤其是κ链。在某些实施方案中，抗体模块包含两条抗体重链和两条抗体轻链。
在替代实施方案中，抗体模块不包含抗体轻链。在这些实施方案中，抗体模块的抗体重链可另外地包含轻链可变区。特别地，轻链可变区与重链的N末端融合或在C末端插入至重链可变区。可以存在肽接头以将轻链可变区与重链的其余部分连接。
抗MUC1抗体模块特异性结合MUC1的表位。表位可以特异于MUC1，即它不存在于其他分子上，或者它可以是在其他分子上也存在的表位。
在某些实施方案中，抗体模块以糖基化依赖性方式结合MUC1。特别地，如果抗体模块被糖基化，尤其是在细胞外串联重复区中糖基化，则抗体模块与MUC1更强地结合。在具体的实施方案中，如果抗体模块用N-乙酰半乳糖胺(Tn)、唾液酸α2-6N-乙酰半乳糖胺(sTn)、半乳糖β1-3N-乙酰半乳糖胺(TF)或半乳糖β1-3(唾液酸α2-6)N-乙酰半乳糖胺(sTF)，优选用Tn或TF进行O-糖基化，则抗体模块与MUC1更强地结合。
在某些实施方案中，抗体模块特异性结合MUC1的细胞外串联重复区中的表位。特别地，如果所述串联重复区在苏氨酸残基处用N-乙酰半乳糖胺(Tn)、唾液酸α2-6N-乙酰半乳糖胺(sTn)、半乳糖β1-3N-乙酰半乳糖胺(TF)或半乳糖β1-3(唾液酸α2-6)N-乙酰半乳糖胺(sTF)，优选用Tn或TF糖基化，则抗体模块更强地结合。优选地，碳水化合物部分通过α-O-糖苷键与苏氨酸残基结合。
在特定实施方案中，抗体模块能够特异性结合MUC1的串联重复结构域中的表位，其包含氨基酸序列PDTR(SEQ ID NO：19)或PDTRP(SEQ ID NO：20)。如上所述，与该表位的结合优选是糖基化依赖性的，其中特别是如果上述碳水化合物部分分别与序列PDTR或PDTRP(SEQ ID NO：19和20)的苏氨酸残基附接，则结合增加。
在某些实施方案中，抗体模块特异性结合肿瘤相关的MUC1表位(TA-MUC1)。TA-MUC1表位特别是指MUC1的表位，其存在于肿瘤细胞上但不存在于正常细胞上和/或仅当存在于肿瘤细胞上而不是存在于正常细胞上时才能被宿主循环中的抗体接近。上述表位，特别是存在于MUC1的串联重复结构域中的表位，可以是肿瘤相关的MUC1表位。在某些实施方案中，抗体模块与表达TA-MUC1表位的细胞的结合强于与表达正常的非肿瘤MUC1的细胞的结合。优选地，所述结合强至少1.5倍、优选强至少2倍、强至少5倍、强至少10倍或强至少100倍。特别地，TA-MUC1在其细胞外串联重复区域中被至少一个N-乙酰半乳糖胺(Tn)或半乳糖β1-3N-乙酰半乳糖胺(TF)糖基化。在某些实施方案中，抗体模块特异性结合TA-MUC1的细胞外串联重复区中的该表位，所述TA-MUC1包含N-乙酰半乳糖胺(Tn)或半乳糖β1-3N-乙酰半乳糖胺(TF)。特别地，所述表位包含MUC1串联重复区的至少一个PDTR或PDTRP(SEQ ID NO：19或20)序列，并且在PDTR或PDTRP(SEQ ID NO：19或20)序列的苏氨酸处被N-乙酰半乳糖胺(Tn)或半乳糖β1-3N-乙酰半乳糖胺(TF)，优选通过α-O-糖苷键糖基化。对于TA-MUC1结合，抗体模块优选特异性结合糖基化的MUC1肿瘤表位，使得与相同长度和相同肽序列的非糖基化肽的键相比，键的强度至少增加因数2，优选因数4或因数10，最优选因数20。
在下文中，描述了特异性结合TA-MUC1的抗体模块的具体实施方案。
在某些实施方案中，抗体模块包含至少一个重链可变区，其包含具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的互补决定区CDR-H1、具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR-H2和具有SEQID NO：5的氨基酸序列的CDR-H3，或包含具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的互补决定区CDR-H1、具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR-H2和具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR-H3。根据一个实施方案，抗体模块中存在的重链可变区包含SEQ ID NO：7、8或9的氨基酸序列，或与所述序列之一具有至少75％、特别是至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少97％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体模块的重链可变区包含氨基酸序列，(i)其包含一组CDR，其中CDR-H1具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，CDR-H2具有SEQ ID NO：3氨基酸序列和CDR-H3具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列，或其中CDR-H1具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，CDR-H2具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列和CDR-H3具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列；和(ii)其与SEQ ID NO：7、8和9中的任一个尤其是SEQ ID NO：9具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。
抗体模块可以进一步包含至少一个轻链可变区，其包含具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的互补决定区CDR-L1，具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDR-L2和具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDR-L3，或者包含具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的互补决定区CDR-L1，具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR-L2和具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDR-L3。根据一个实施方案，抗体模块中存在的轻链可变区包含SEQ ID NO：16、17、18、52或53的氨基酸序列，或与所述序列之一具有至少75％、特别是至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少97％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体模块的轻链可变区包含氨基酸序列，(i)其包含一组CDR，其中CDR-L1具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列，CDR-L2具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列和CDR-L3具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列，或其中CDR-L1具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列，CDR-L2具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列和CDR-L3具有SEQ IDNO：15的氨基酸序列；和(ii)其与SEQ ID NO：16、17、18、52和53中的任何一个尤其是SEQ IDNO：18具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。
在特别优选的实施方案中，抗体模块包含至少一个特别是两个包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的重链可变区和至少一个特别是两个包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的轻链可变区。在另一个实施方案中，抗体模块衍生自包含一种或多种上述序列的抗体，特别是来自嵌合或人源化形式的抗体PankoMab，如例如WO2004/065423和WO 2011/012309中所述的，或来自抗体Gatipotuzumab。
在具体的实施方案中，抗体模块特异性结合Thomsen-Friedenreich抗原TFα。TFα是二糖结构Gal-β1,3-GalNAc，其以α-异头构型O-糖苷连接至癌细胞中蛋白质的羟基氨基酸丝氨酸或苏氨酸。癌细胞中TFα的主要携带者之一是MUC1。TFα尤其存在于MUC1的细胞外区域中的串联重复区的O-糖基化位点。因此，抗体模块尤其与MUC1上的TFα结合。
在下文中，描述了特异性结合TFα的抗体模块的具体实施方案。
在某些实施方案中，抗体模块包含至少一个重链可变区，其包含具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的互补决定区CDR-H1，具有SEQ ID NO：22或23的氨基酸序列的CDR-H2和具有SEQ ID NO：24、25或26的氨基酸序列的CDR-H3。特别地，重链可变区包含具有SEQ ID NO：21、22和24的氨基酸序列的CDR。在一个实施方案中，抗体模块中存在的重链可变区包含SEQID NO：27至32中任一项的氨基酸序列或与所述序列之一具有至少75％、特别是至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少97％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体模块的重链可变区包含氨基酸序列，(i)其包含一组CDR，其中CDR-H1具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列，CDR-H2具有SEQ ID NO：22的氨基酸序列和CDR-H3具有SEQ ID NO：24或25的氨基酸序列；和(ii)其与SEQ ID NO：27至32中的任一个具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。
抗体模块可以进一步包含至少一个轻链可变区，其包含具有SEQ ID NO：33、34或35的氨基酸序列的互补决定区CDR-L1，具有SEQ ID NO：36或37的氨基酸序列的CDR-L2，和具有SEQ ID NO：38或39的氨基酸序列的CDR-L3。特别地，重链可变区包含具有SEQ ID NO：33、36和38的氨基酸序列的CDR。在一个实施方案中，抗体模块中存在的轻链可变区包含SEQID NO：40、41和42中任一项的氨基酸序列或与所述序列之一具有至少75％、特别是至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少97％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体模块的轻链可变区包含氨基酸序列，(i)其包含一组CDR，其中CDR-L1具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列，CDR-L2具有SEQ ID NO：36的氨基酸序列和CDR-L3具有SEQ ID NO：38的氨基酸序列；和(ii)其与SEQ ID NO：40、41和42中的任一个具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。
在特别优选的实施方案中，抗体模块包含至少一个，特别是两个包含SEQ ID NO：27、29、30或31的氨基酸序列的重链可变区和至少一个，特别是两个包含SEQ ID NO：40、41或42的氨基酸序列的轻链可变区。在另一个实施方案中，抗体模块衍生自包含一种或多种上文所述序列的抗体。
抗CD3抗原结合片段
抗CD3抗原结合片段包含至少一个特异于CD3的抗原结合位点。特别地，抗原结合片段包含抗体重链可变区(VH结构域)。在具体的实施方案中，抗原结合片段另外包含抗体轻链可变区(VL结构域)，其与VH结构域一起形成抗原结合位点。VH结构域和VL结构域可以由相同的多肽链或由单独的多肽链形成。特别地，它们由相同的多肽链形成，并且特别地抗原结合片段是单链片段。VH结构域和VL结构域可以通过肽接头彼此连接。如本文所述的肽接头可用于将VH结构域和VL结构域彼此连接。在由单一多肽链形成的包含VH结构域和VL结构域的抗原结合片段中，VH结构域可以位于VL结构域的N末端或C末端，并且特别是位于VL结构域的N末端。在某些实施方案中，抗原结合片段是特异性结合CD3的单链可变区片段(scFv)。
抗CD3抗原结合片段可包含多于一个抗原结合位点，但特别是仅包含一个抗原结合位点。在某些实施方案中，抗原结合片段不包含任何抗体恒定区结构域。
抗原结合片段特异性结合CD3的表位。特别地，抗原结合片段特异性结合CD3ε。在具体的实施方案中，特别是仅当其与CD3δ复合时，抗原结合片段以构象依赖性方式特异性结合CD3ε。
在某些实施方案中，抗原结合片段包含至少一个重链可变区，其包含具有SEQ IDNO：43的氨基酸序列的互补决定区CDR-H1，具有SEQ ID NO：44的氨基酸序列的CDR-H2和具有SEQ ID NO：45的氨基酸序列的CDR-H3。根据一个实施方案，存在于抗原结合片段中的重链可变区包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列或者与所述序列之一具有至少75％、特别是至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少97％的同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合片段的重链可变区包含氨基酸序列，(i)其包含一组CDR，其中CDR-H1具有SEQID NO：43的氨基酸序列，CDR-H2具有SEQ ID NO：44的氨基酸序列和CDR-H3具有SEQ ID NO：45的氨基酸序列；和(ii)其与SEQ ID NO：46中的任一个具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。
抗原结合片段可以进一步包含至少一个轻链可变区，其包含具有SEQ ID NO：47的氨基酸序列的互补决定区CDR-L1，具有SEQ ID NO：48的氨基酸序列的CDR-L2和具有SEQ IDNO：49的氨基酸序列的CDR-L3。根据一个实施方案，抗原结合片段中存在的轻链可变区包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列或与所述序列之一具有至少75％、特别是至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少97％的同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗原结合片段的轻链可变区包含氨基酸序列，(i)其包含一组CDR，其中CDR-L1具有SEQ ID NO：47的氨基酸序列，CDR-L2具有SEQ ID NO：48的氨基酸序列和CDR-L3具有SEQ ID NO：49的氨基酸序列，和(ii)其与SEQ ID NO：50中的任何一个具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。
在特别优选的实施方案中，抗原结合片段包含至少一个，特别是一个包含SEQ IDNO：46的氨基酸序列的重链可变区和至少一个，特别是一个包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的轻链可变区。在另一个实施方案中，抗体模块衍生自包含一种或多种上述序列的抗体。
在进一步的实施方案中，抗原结合片段可以衍生自任何抗CD3抗体。可以衍生抗原结合片段的抗CD3抗体的合适实例包括OKT3、TR66、UCHT1、CLB-T3、L2K、DiL2K和WO2008/119567A2中公开的抗CD3抗体。在某些实施方案中，抗原结合片段包含重链可变区，其氨基酸序列与这些抗CD3抗体中的任何一个的重链可变区具有至少85％、特别是至少90％、或至少95％、特别是100％的同一性。优选地，抗原结合片段还包含轻链可变区，其氨基酸序列与同样的抗CD3抗体的轻链可变区具有至少85％、特别是至少90％、或至少95％、特别是100％的同一性。
多特异性抗体构建体
多特异性抗体构建体包含特别地至少一个特异性抗MUC1抗体模块和至少一个抗CD3抗原结合片段。在某些实施方案中，多特异性抗体构建体包含至少两个，特别是恰好两个抗CD3抗原结合片段。抗原结合片段可以相同或不同，特别是具有相同的氨基酸序列。至少一个抗原结合片段与抗体模块重链的C末端融合。
在其中多特异性抗体构建体包含两个抗原结合片段的具体实施方案中，抗体模块还包含两条重链，并且每个抗原结合片段与抗体模块的不同重链的C末端融合。在某些实施方案中，抗原结合片段与抗体模块的重链的C末端融合，并且另一抗原结合片段与第一抗原结合片段的C末端融合。如果抗体模块包含两条重链，则这两条重链都可能是这种情况。
抗原结合片段可以通过肽键与抗体模块重链的C末端直接融合，或通过肽接头间接融合。直接融合是指其中抗原结合片段的序列直接在抗体模块的重链序列之后而在这两个序列之间没有任何中间氨基酸的实施方案。通过肽接头的融合是指其中一个或多个氨基酸存在于抗体模块的重链序列和抗原结合片段的序列之间的实施方案。这些一个或多个氨基酸在抗体模块的重链和抗原结合片段之间形成肽接头。
发现多特异性抗体构建体的稳定性可以通过特异性设计抗原结合片段与抗体模块重链的C末端的附接来改善。特别地，在某些应激条件下，包含抗体模块的重链和抗原结合片段的融合多肽可以退化，并且抗原结合片段可以从抗体模块的重链切割下来。如实施例中所证明的，这可以通过重链C末端的突变来防止。在某些实施方案中，特别是在抗体模块是IgG型抗体模块和/或具有γ型重链的实施方案中，抗体模块的重链的C末端氨基酸残基不是赖氨酸残基。通常，IgG抗体的γ型重链具有赖氨酸残基作为C末端的最后一个氨基酸。该赖氨酸残基的取代或缺失抑制融合多肽的降解。在具体的实施方案中，抗体模块的γ型重链的C末端的赖氨酸残基缺失或被另一种氨基酸取代，优选缺失。
肽接头原则上可以具有任何数量的氨基酸和适合连接抗体模块的重链和抗原结合片段的任何氨基酸序列。在某些实施方案中，肽接头包含至少3个、优选至少5个、至少8个、至少10个、至少15个或至少20个氨基酸。在进一步的实施方案中，肽接头包含50个或更少、优选45个或更少、40个或更少、35个或更少、30个或更少、25个或更少或20个或更少的氨基酸。特别地，肽接头包含5至25个氨基酸，尤其是10至20个氨基酸。在具体的实施方案中，肽接头由甘氨酸和丝氨酸残基组成。甘氨酸和丝氨酸可以以2比1、3比1、4比1或5比1(甘氨酸残基数比丝氨酸残基数)的比例存在于肽接头中。例如，肽接头可以包含四个甘氨酸残基后接一个丝氨酸残基的序列，以及特别地该序列的1、2、3、4、5或6个重复序列。具体实例是这样的肽接头，其包含2个重复的氨基酸序列GGGGS(SEQ ID NO：51)、3个重复的氨基酸序列GGGGS(SEQ ID NO：51)和4个重复的氨基酸序列GGGGS(SEQ ID NO：51)或由其组成。尤其是可以使用由3或4个重复的氨基酸序列GGGGS(SEQ ID NO：51)组成的肽接头。在具体的实施方案中，多特异性抗体构建体包含在抗体模块的重链的C末端和抗原结合片段的N末端之间的包含3或4个重复的氨基酸序列GGGGS(SEQ ID NO：51)的肽接头和/或在抗原结合片段的VH结构域和VL结构域之间的包含3或4个重复的氨基酸序列GGGGS(SEQ ID NO：51)的肽接头。在其他实施方案中，肽接头包含在人中不显示或仅显示轻微的免疫原性潜力的序列，优选序列是人序列或天然存在序列。在进一步优选的实施方案中，肽接头和相邻氨基酸不显示或仅显示轻微的免疫原性。如上所述的肽接头也可用于连接多特异性抗体构建体的其他元件，例如存在于一个抗原结合片段中的重链可变区和轻链可变区。
多特异性抗体构建体特别是双特异性抗体构建体。双特异性抗体构建体特异性结合MUC1的表位和CD3的表位，但不包含特异性结合另一种抗原的任何其他抗原结合位点。在替代实施方案中，多特异性抗体构建体包含一个或多个特异性结合其他抗原的其他抗原结合位点。这些其他抗原结合位点可以存在于多特异性抗体构建体的任何位置。在某些实施方案中，其他的抗原结合位点与抗体模块的抗体轻链的C末端融合。特别地，如果抗体模块包含两条抗体轻链，则一个或多个抗原结合位点尤其是一个抗原结合位点与抗体模块的每条抗体轻链的C末端融合。这些抗原结合位点可以相同或不同，特别是具有相同的氨基酸序列。其他的抗原结合位点可以特异性结合任何抗原，尤其是免疫细胞的肿瘤相关抗原或检查点抗原。此类抗原的合适实例可选自EGFR、HER2、PD-1、PD-L1、CD40、CEA、EpCAM、CD7、CD28、GITR、ICOS、OX40、4-1BB、CTLA-4、TFa、LeY、CD160、半乳凝素-3、半乳凝素-1。
在某些实施方案中，多特异性抗体构建体包含一种或多种与其缀合的其他药剂。其他的药剂可以是适合与多特异性抗体构建体缀合的任何药剂。如果多特异性抗体构建体中存在多于一种其他药剂，则这些其他药剂可以相同或不同，特别是全部相同。使用本领域已知的任何方法可以实现其他药剂与多特异性抗体构建体的缀合。其他的药剂可以共价地(特别是通过融合或化学偶联)或非共价地附接到多特异性抗体构建体上。在某些实施方案中，其他的药剂共价(尤其是通过接头部分)附接至多特异性抗体构建体。接头部分可以是适合于将其他药剂附接至多特异性抗体构建体的任何化学实体。
在某些实施方案中，其他药剂是多肽或蛋白质。该多肽或蛋白质可以特别地与抗体模块的多肽链或抗原结合片段的多肽链融合。在某些实施方案中，作为多肽或蛋白质的其他药剂与抗体模块的抗体轻链的C末端融合。在其中抗体模块包含两条抗体轻链的实施方案中，可以将作为多肽或蛋白质的其他药剂与两条抗体轻链中的每一条的C末端融合。多肽或蛋白质可以相同或不同，特别是具有相同的氨基酸序列。作为多肽或蛋白质的此类其他药剂的合适实例可选自细胞因子、趋化因子、抗体模块、抗原结合片段、酶和相互作用结构域。
其他的药剂优选用于疾病特别是癌症的治疗、诊断、预后和/或监测。例如，其他的药剂可选自放射性核素、化学治疗剂、可检测标记、毒素、溶细胞成分、免疫调节剂、免疫效应物和脂质体。
多特异性抗体构建体的糖基化
抗MUC1抗体模块可包含一条或多条抗体重链中的CH2结构域。IgG类型的天然人抗体在CH2结构域中包含N-糖基化位点。存在于抗体模块中的CH2结构域可以包含或不包含N-糖基化位点。
在某些实施方案中，抗体模块中存在的CH2结构域不包含N-糖基化位点。特别地，根据IMGT/Eu编号系统，抗体模块在重链中对应于位置297的位置不包含天冬酰胺残基。例如，抗体模块可以在重链中包含Ala297突变。在这些实施方案中，多特异性抗体构建体优选具有强烈降低的通过结合Fcγ受体诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力或完全缺乏此能力。在这方面强烈降低的能力特别是指与在其CH2结构域中包含N-糖基化位点并具有共同的哺乳动物糖基化模式(例如可通过在人细胞系或CHO细胞系中产生而获得的那些，例如本文所述的糖基化模式)的相同多特异性抗体构建体相比，降低至10％或更低、特别是3％或更低、1％或更低或0.1％或更低的活性。
令人惊讶地发现，在抗体模块的CH2结构域中不包含N-糖基化位点的多特异性抗体构建体能够活化天然杀伤细胞(NK细胞)，尽管这些构建体不能结合NK细胞的Fcγ受体。据信多特异性抗体构建体募集并活化T细胞，其进而活化NK细胞。
在替代实施方案中，抗体模块中存在的CH2结构域包含N-糖基化位点。该糖基化位点特别是在对应于根据Kabat编号的重链的氨基酸位置297的氨基酸位置，并且具有氨基酸序列基序Asn Xaa Ser/Thr，其中Xaa可以是除脯氨酸外的任何氨基酸。Asn297处的N-连接糖基化在哺乳动物IgG以及其他抗体同种型的同源区域中是保守的。由于可以存在于可变区的可选的额外氨基酸或其他序列修饰中，该保守糖基化位点的实际位置可以在抗体的氨基酸序列中变化。优选地，与抗体模块附接的聚糖是双触角复合型N-连接碳水化合物结构，优选至少包含以下结构：
Asn-GlcNAc-GlcNAc-Man-(Man-GlcNAc)2
其中Asn是抗体模块的多肽部分的天冬酰胺残基；GlcNAc是N-乙酰葡糖胺，Man是甘露糖。末端GlcNAc残基可以进一步携带半乳糖残基，其任选地可以携带唾液酸残基。另一个GlcNAc残基(称为二等分GlcNAc)可以与最接近多肽的Man附接。岩藻糖可以与附接于Asn的GlcNAc结合。
在优选的实施方案中，多特异性抗体构建体不包含N-羟乙酰神经氨酸(NeuGc)或可检测量的NeuGc。此外，多特异性抗体构建体优选地还不包含Galili表位(Galα1,3-Gal结构)或可检测量的Galili表位。特别地，携带NeuGc和/或Galα1,3-Gal结构的聚糖的相对量小于多特异性抗体构建体群体中与抗体模块的CH2结构域附接的聚糖总量的0.1％或甚至小于0.02％。
特别地，多特异性抗体构建体具有人糖基化模式。由于这些糖基化特性，不存在诱导副作用的外来免疫原性非人结构，这意味着避免了已知由某些外来糖结构(例如对于啮齿动物生产系统已知的免疫原性非人唾液酸(NeuGc)或Galili表位(Gal-Gal结构)或其他结构，如从例如酵母系统已知的免疫原性高甘露糖结构)引起的不希望的副作用或缺点。
在具体的实施方案中，多特异性抗体构建体在抗体模块的CH2结构域处包含糖基化模式，其具有可检测量的携带二等分GlcNAc残基的聚糖。特别地，携带二等分GlcNAc残基的聚糖的相对量为组合物中与抗体模块的CH2结构域的糖基化位点附接的聚糖总量的至少0.5％，尤其是至少1％。此外，在某些实施方案中，CH2结构域处的糖基化模式包含相对量的携带至少一个半乳糖残基的聚糖，其是组合物中与抗体模块的CH2结构域附接的聚糖总量的至少30％。特别地，携带至少一个半乳糖残基的聚糖的相对量是组合物中与抗体模块的CH2结构域附接的聚糖总量的至少40％，特别是至少45％或至少50％。
多特异性抗体构建体可以在抗体模块的CH2结构域处具有糖基化模式，其具有大量的核心岩藻糖或少量的核心岩藻糖。在CH2结构域处减少量的岩藻糖基化增加了多特异性抗体构建体诱导ADCC的能力。在某些实施方案中，携带核心岩藻糖残基的聚糖的相对量是组合物中与抗体模块的CH2结构域附接的聚糖总量的40％或更少，特别是30％或更少或20％或更少。在替代实施方案中，携带核心岩藻糖残基的聚糖的相对量是组合物中与抗体模块的CH2结构域附接的聚糖总量的至少60％，特别是至少65％或至少70％。
通过抗MUC1抗体模块的CH2结构域中糖基化位点的存在或不存在以及所述糖基化位点处的聚糖结构中岩藻糖的存在或不存在，可以控制多特异性抗体构建体通过抗体模块的Fc部分诱导ADCC的能力和所述ADCC诱导的强度。由细胞毒性T淋巴细胞介导的ADCC已经通过将所述T淋巴细胞募集到肿瘤部位而启动。这通过多特异性抗体构建体的两个结合位点(结合肿瘤细胞的抗MUC1抗体模块和结合细胞毒性T淋巴细胞的抗CD3抗原结合片段)来实现。由T细胞和NK细胞介导的总体ADCC活性可以通过抗体模块的Fc部分的糖基化来增加，并进一步通过减少所述糖基化中的岩藻糖基化的量来增加。在Fc-糖基化，特别是在低岩藻糖基化的情况下，由NK细胞介导的ADCC被添加到由T细胞介导的ADCC中。在某些应用中，ADCC活性的微调很重要。因此，在某些情况下，在抗体模块的CH2结构域中没有糖基化位点的多特异性抗体构建体，在抗体模块的CH2结构域中具有糖基化位点并具有大量岩藻糖基化的多特异性抗体构建体，或在抗体模块的CH2结构域中具有糖基化位点并且具有少量岩藻糖基化的多特异性抗体构建体可能是最有利的。
多特异性抗体构建体优选在宿主细胞中重组产生。用于产生多特异性抗体构建体的宿主细胞可以是可用于产生抗体的任何宿主细胞。合适的宿主细胞特别是真核宿主细胞，尤其是哺乳动物宿主细胞。示例性宿主细胞包括酵母细胞如巴斯德毕赤酵母细胞系，昆虫细胞如SF9和SF21细胞系，植物细胞，禽类细胞如EB66鸭细胞系，啮齿动物细胞如CHO、NS0、SP2/0和YB2/0细胞系和人细胞如HEK293、PER.C6、CAP、CAP-T、AGE1.HN、Mutz-3和KG1细胞系。
在某些实施方案中，多特异性抗体构建体在人血细胞系中特别是在人髓样白血病细胞系中重组产生。可用于产生多特异性抗体构建体的优选人细胞系以及合适的生产方法描述于WO 2008/028686A2中。在一个具体实施方案中，通过在选自NM-H9D8、NM-H9D8-E6和NM-H9D8-E6Q12的人髓样白血病细胞系中表达获得多特异性抗体构建体。这些细胞系以保藏号DSM ACC2806(NM-H9D8；保藏于2006年9月15日)、DSM ACC2807(NM-H9D8-E6；保藏于2006年10月5日)和DSM ACC2856(NM-H9D8-E6Q12；保藏于2007年8月8日)根据布达佩斯条约的要求在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ),Inhoffenstraβe 7B,38124Braunschweig(DE)由Glycotope GmbH、Robert--Str.10,13125Berlin(DE)保存。NM-H9D8细胞提供具有高度唾液酸化、高度二等分GlycNAc、高度半乳糖基化和高度岩藻糖基化的糖基化模式。NM-H9D8-E6和NM-H9D8-E6Q12细胞提供与NM-H9D8细胞类似的糖基化模式，除了岩藻糖基化程度非常低。其他合适的细胞系包括K562(存在于美国典型培养物保藏中心(ATCC CCL-243)中的人髓样白血病细胞系)以及衍生自上述细胞系的细胞系。
核酸、表达盒、载体、细胞系和组合物
在另一方面，本发明提供了编码多特异性抗体构建体的核酸。所述核酸的核酸序列可以具有适合编码多特异性抗体构建体的任何核苷酸序列。然而，优选地，核酸序列至少部分地调整适合于其中待表达核酸的宿主细胞或生物的特定密码子使用，特别是人密码子使用。核酸可以是双链或单链DNA或RNA，优选双链DNA如cDNA或单链RNA如mRNA。它可以是一个连续的核酸分子，或者它可以由几个核酸分子组成，每个核酸分子编码多特异性抗体构建体的不同部分。
如果多特异性抗体构建体由多于一条不同的氨基酸链组成，例如抗体模块的轻链和重链，则核酸可以是例如含有几个编码区(各自编码多特异性抗体构建体的氨基酸链之一，优选通过诸如IRES元件的调节元件分开)的单个核酸分子以产生单独的氨基酸链，或者核酸可以由几个核酸分子组成，其中每个核酸分子包含一个或多个编码区，每个编码区编码多特异性抗体构建体的氨基酸链之一。除了编码多特异性抗体构建体的编码区之外，核酸还可以包含其他核酸序列或其他修饰，例如，其可以编码其他蛋白质，可以影响编码区的转录和/或翻译，可以影响核酸的稳定性或其他物理或化学性质，或者可能根本没有功能。
在另一方面，本发明提供了表达盒或载体，其包含根据本发明的核酸和与所述核酸可操作地连接的启动子。此外，表达盒或载体可以包含其他元件，特别是能够影响和/或调节核酸的转录和/或翻译、表达盒或载体的扩增和/或复制、将表达盒或载体整合到宿主细胞的基因组中、和/或宿主细胞中表达盒或载体的拷贝数的元件。合适的表达盒和包含用于表达抗体的各自表达盒的载体在现有技术中是公知的，因此这里不需要进一步描述。
此外，本发明提供了宿主细胞，其包含根据本发明的核酸或根据本发明的表达盒或载体。宿主细胞可以是任何宿主细胞。它可以是分离的细胞或组织中包含的细胞。优选地，宿主细胞是培养的细胞，特别是原代细胞或已建立的细胞系的细胞，优选肿瘤衍生的细胞。优选地，它是细菌细胞诸如大肠杆菌，酵母细胞诸如酵母菌属细胞，特别是酿酒酵母，昆虫细胞诸如Sf9细胞，或哺乳动物细胞，特别是人细胞诸如肿瘤衍生的人细胞，仓鼠细胞诸如CHO或灵长类动物细胞。在本发明的一个优选实施方案中，宿主细胞衍生自人髓样白血病细胞。优选地，其选自下列细胞或细胞系：K562、KG1、MUTZ-3或由其衍生的细胞或细胞系，或包含至少一种上述细胞的细胞或细胞系的混合物。宿主细胞优选选自NM-H9D8、NM-H9D8-E6、NM H9D8-E6Q12，以及衍生自任何所述宿主细胞的细胞或细胞系，或包含至少一种上述细胞的细胞或细胞系的混合物。这些细胞系及其性质在PCT申请WO2008/028686A2中详细描述。在优选的实施方案中，宿主细胞被优化用于表达具有特定糖基化模式的糖蛋白，特别是抗体。优选地，根据本发明的核酸的编码区中的密码子使用和/或启动子和表达盒或载体的其他元件与所用宿主细胞的类型相容，并且更优选地，针对所用宿主细胞的类型进行优化。优选地，多特异性抗体构建体由如上所述的宿主细胞或细胞系产生。
另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含多特异性抗体构建体、核酸、表达盒或载体或宿主细胞。该组合物还可含有多于一种这些组分。此外，该组合物可包含一种或多种选自溶剂、稀释剂和赋形剂的其他组分。优选地，该组合物是药物组合物。在该实施方案中，组合物的组分优选都是药学上可接受的。该组合物可以是固体或流体组合物，特别是溶液优选水溶液、乳液或悬浮液或冻干粉末。
在医学中的用途
多特异性抗体构建体尤其可用于医学，特别是用于疾病(特别是本文所述的疾病，优选癌症、感染、炎性疾病、移植物抗宿主病和免疫缺陷)的治疗、诊断、预后和/或监测。
因此，在另一方面，本发明提供了多特异性抗体构建体、核酸、表达盒或载体、宿主细胞或组合物用于医学的用途。优选地，在医学中的用途是用于治疗、预后、诊断和/或监测疾病，例如与异常细胞生长相关的疾病例如癌症，感染诸如细菌、病毒、真菌或寄生虫感染的，炎性疾病诸如自身免疫疾病和炎性肠病，以及与免疫活性降低相关的疾病例如免疫缺陷。在优选的实施方案中，疾病是癌症。优选地，癌症选自卵巢癌、乳腺癌例如三阴性乳腺癌、肺癌和胰腺癌。癌症还可以特别选自结肠癌、胃癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、皮肤癌、子宫颈癌、前列腺癌、胃肠癌和血癌。
在某些实施方案中，病毒感染由人免疫缺陷病毒、单纯疱疹病毒、Epstein Barr病毒、流感病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒引起。炎性疾病可选自炎性肠病、盆腔炎性疾病、缺血性中风、阿尔茨海默氏病、哮喘、寻常性天疱疮和皮炎/湿疹。自身免疫疾病可选自乳糜泻，1型糖尿病，格雷夫斯病，炎性肠病，多发性硬化症，银屑病，类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，白癜风，银屑病关节炎，特应性皮炎，硬皮病，结节病，原发性胆汁性肝硬化，格林-巴利综合征，自身免疫性肝炎和强直性脊柱炎。在某些实施方案中，疾病包含表达MUC1的细胞或与其表达MUC1的细胞相关联。例如，待治疗的癌症是MUC1阳性的，即包含表达MUC1的癌细胞。
在具体的实施方案中，多特异性抗体构建体与另一种治疗剂，尤其是另一种抗癌剂组合使用。所述其他治疗剂可以是任何已知的抗癌药物。可以与多特异性抗体构建体组合的合适的抗癌治疗剂可以是化学治疗剂、抗体、免疫刺激剂、细胞因子、趋化因子和疫苗。此外，使用多特异性抗体构建体的疗法可以与放射疗法、外科手术和/或中药结合。
具体实施方案
在下文中，描述了本发明的具体实施方案。
实施方案1.一种多特异性抗体构建体，其包含
(i)抗MUC1抗体模块，该抗体模块包含至少一条抗体重链，和
(ii)抗CD3抗原结合片段；
其中抗原结合片段与抗体模块的重链的C末端融合。
实施方案2.根据实施方案1的多特异性抗体构建体，其中所述抗MUC1抗体模块包含两条重链，每条重链包含VH结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
实施方案3.根据实施方案1或2的多特异性抗体构建体，其中所述抗MUC1抗体模块包含两条轻链，每条轻链包含VL结构域和CL结构域。
实施方案4.根据实施方案1至3中任一项的多特异性抗体构建体，其中所述抗MUC1抗体模块是IgG型抗体模块，特别是IgG1型抗体模块，其任选地在重链的C末端上不具有赖氨酸残基。
实施方案5.根据实施方案1至4中任一项的多特异性抗体构建体，其中所述抗MUC1抗体模块具有κ链。
实施方案6.根据实施方案1至5中任一项的多特异性抗体构建体，其中所述抗MUC1抗体模块特异性结合TA-MUC1表位。
实施方案7.根据实施方案6的多特异性抗体构建体，其中所述抗MUC1抗体模块包含一组重链CDR序列，其中CDR-H1具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，CDR-H2具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列和CDR-H3具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列，或CDR-H1具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，CDR-H2具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列和CDR-H3具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
实施方案8.根据实施方案6或7的多特异性抗体构建体，其中所述抗MUC1抗体模块包含与SEQ ID NO：7、8和9中的任何一个至少80％相同的抗体重链可变区序列。
实施方案9.根据实施方案1至5中任一项的多特异性抗体构建体，其中所述抗MUC1抗体模块特异性结合TFα。
实施方案10.根据实施方案9的多特异性抗体构建体，其中所述抗MUC1抗体模块包含一组重链CDR序列，其中CDR-H1具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列，CDR-H2具有SEQ ID NO：22或23的氨基酸序列，和CDR-H3具有SEQ ID NO：24、25或26的氨基酸序列。
实施方案11.根据实施方案9或10的多特异性抗体构建体，其中所述抗MUC1抗体模块包含与SEQ ID NO：27至32中的任一个至少80％相同的抗体重链可变区序列。
实施方案12.根据实施方案1至11中任一项的多特异性抗体构建体，其中所述抗CD3抗原结合片段包含至少一个VH结构域和任选至少一个VL结构域。
实施方案13.根据实施方案1至12中任一项的多特异性抗体构建体，其中所述抗CD3抗原结合片段不包含任何抗体恒定区结构域。
实施方案14.根据实施方案1至13中任一项的多特异性抗体构建体，其中所述抗CD3抗原结合片段是scFv片段。
实施方案15.根据实施方案1至14中任一项的多特异性抗体构建体，其中所述抗CD3抗原结合片段特异性结合CD3ε。
实施方案16.根据实施方案1至15中任一项的多特异性抗体构建体，其中所述抗CD3抗原结合片段包含一组重链CDR序列，其中CDR-H1具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列，CDR-H2具有SEQ ID NO：44的氨基酸序列，和CDR-H3具有SEQ ID NO：45的氨基酸序列。
实施方案17.根据实施方案1至16中任一项的多特异性抗体构建体，其中所述抗CD3抗原结合片段包含与SEQ ID NO：46中的任一个至少80％相同的抗体重链可变区序列。
实施方案18.根据实施方案1至17中任一项的多特异性抗体构建体，其中所述抗CD3抗原结合片段在VH结构域和VL结构域之间包含肽接头。
实施方案19.根据实施方案1至18中任一项的多特异性抗体构建体，其中所述多特异性抗体构建体包含两个抗CD3抗原结合片段，其各自与抗体模块的不同重链的C末端融合。
实施方案20.根据实施方案1-19中任一项的多特异性抗体构建体，其中所述多特异性抗体构建体在抗体模块的重链的C末端和抗原结合片段之间包含肽接头。
实施方案21.根据实施方案1至20中任一项的多特异性抗体构建体，其中所述多特异性抗体构建体是双特异性抗体构建体。
实施方案22.根据实施方案1至21中任一项的多特异性抗体构建体，其中所述抗体模块在CH2结构域中不包含N-糖基化位点。
实施方案23.根据实施方案1至21中任一项的多特异性抗体构建体，其中所述抗体模块在抗体重链的CH2结构域中包含N-糖基化位点。
实施方案24.实施方案23的多特异性抗体构建体，其中所述抗体模块在抗体重链的CH2结构域中具有糖基化模式，其具有一个或多个以下特征。
(i)携带二等分GlcNAc残基的聚糖的相对量为组合物中与抗体模块的CH2结构域的糖基化位点附接的聚糖总量的至少0.5％；
(ii)携带至少一个半乳糖残基的聚糖的相对量为组合物中与抗体模块的CH2结构域附接的聚糖总量的至少30％；
(iii)携带核心岩藻糖残基的聚糖的相对量为组合物中与抗体模块的CH2结构域附接的聚糖总量的至少60％。
实施方案25.根据实施方案23的多特异性抗体构建体，其中所述抗体模块在抗体重链的CH2结构域中具有糖基化模式，其具有一个或多个以下特征。
(i)携带二等分GlcNAc残基的聚糖的相对量为组合物中与抗体模块的CH2结构域的糖基化位点附接的聚糖总量的至少0.5％；
(ii)携带至少一个半乳糖残基的聚糖的相对量为组合物中与抗体模块的CH2结构域附接的聚糖总量的至少30％；
(iii)携带核心岩藻糖残基的聚糖的相对量为组合物中与抗体模块的CH2结构域附接的聚糖总量的40％或更少。
实施方案26.根据实施方案1至25中任一项的多特异性抗体构建体，其包含与其缀合的其他药剂。
实施方案27.根据实施方案26的多特异性抗体构建体，其中所述其他药剂是与抗体模块的多肽链或与抗原结合片段的多肽链融合的多肽或蛋白质。
实施方案28.根据实施方案27的多特异性抗体构建体，其中所述抗体模块包含至少一条抗体轻链，并且所述其他药剂是与所述抗体轻链的C末端融合的多肽或蛋白质。
实施方案29.根据实施方案26至28中任一项的多特异性抗体构建体，其中所述其他药剂选自细胞因子、趋化因子、抗体模块、抗原结合片段、酶和结合结构域。
实施方案30.编码根据实施方案1至29中任一项的多特异性抗体构建体的核酸。
实施方案31.一种表达盒或载体，其包含根据实施方案30的核酸和与所述核酸可操作地连接的启动子。
实施方案32.一种宿主细胞，其包含根据实施方案30的核酸或根据实施方案31的表达盒或载体。
实施方案33.一种药物组合物，其包含根据实施方案1至29中任一项的多特异性抗体构建体和一种或多种选自溶剂、稀释剂和赋形剂的其他组分。
实施方案34.根据实施方案1至29中任一项的多特异性抗体构建体或根据实施方案33的药物组合物，其用于医学中。
实施方案35.根据实施方案1至29中任一项的多特异性抗体构建体或根据实施方案33的药物组合物，其用于治疗、预后、诊断和/或监测与异常细胞生长相关的疾病例如癌症，感染例如细菌、病毒、真菌或寄生虫感染，炎性疾病如自身免疫疾病和炎性肠病，移植物抗宿主病，和与免疫活性降低相关的疾病例如免疫缺陷。
实施方案36.实施方案35的多特异性抗体构建体或药物组合物，其用于治疗癌症，其中所述癌症选自乳腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、血液癌、肺癌和卵巢癌。
实施方案37.根据实施方案35的多特异性抗体构建体或药物组合物，其用于治疗感染，其中所述感染选自细菌感染、病毒感染、真菌感染和寄生虫感染。
实施方案38.根据实施方案35的多特异性抗体构建体或药物组合物，其用于治疗自身免疫疾病，其中所述自身免疫疾病选自乳糜泻、1型糖尿病、格雷夫斯病、炎性肠病、多发性硬化、银屑病、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮。
实施方案39.一种多特异性抗体构建体，其包含
(i)抗MUC1抗体模块，该抗体模块包含两条人γ-型抗体重链和两条人κ-型抗体轻链，每条重链包含VH结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域，和每条轻链包含VL结构域和CL结构域；和
(ii)两个抗CD3抗原结合片段，各自包含VH结构域、肽接头和VL结构域；
其中每个抗原结合片段通过肽接头与抗体模块的不同重链的C末端融合。
实施方案40.根据实施方案39的多特异性抗体构建体，其中所述抗MUC1抗体模块的每个VH结构域包含与SEQ ID NO：7、8和9中的任一个具有至少80％同一性，尤其是100％同一性的氨基酸序列，和一组重链CDR序列，其中CDR-H1具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，CDR-H2具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列和CDR-H3具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列，或CDR-H1具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，CDR-H2具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列和CDR-H3具有SEQID NO：6的氨基酸序列。
实施方案41.根据实施方案40的多特异性抗体构建体，其中所述抗MUC1抗体模块的每个VL结构域包含与SEQ ID NO：16、17或18中的任一个具有至少80％同一性，尤其是100％同一性的氨基酸序列，和一组重链CDR序列，其中CDR-L1具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列，CDR-L2具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列和CDR-L3具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列，或CDR-L1具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列，CDR-L2具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列和CDR-L3具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列。
实施方案42.实施方案39的多特异性抗体构建体，其中所述抗MUC1抗体模块的每个VH结构域包含与SEQ ID NO：27至32中的任一个具有至少80％同一性，尤其是100％同一性的氨基酸序列，和一组重链CDR序列，其中CDR-H1具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列，CDR-H2具有SEQ ID NO：22或23的氨基酸序列，和CDR-H3具有SEQ ID NO：24、25或26的氨基酸序列。
实施方案43.根据实施方案42的多特异性抗体构建体，其中所述抗MUC1抗体模块的每个VL结构域包含与SEQ ID NO：40至42中的任一个具有至少80％同一性，尤其是100％同一性的氨基酸序列，和一组重链CDR序列，其中CDR-L1具有SEQ ID NO：33、34或35的氨基酸序列，CDR-L2具有SEQ ID NO：36或37的氨基酸序列和CDR-L3具有SEQ ID NO：38或39的氨基酸序列。
实施方案44.根据实施方案39至43中任一项的多特异性抗体构建体，其中每个抗CD3抗原结合片段的VH结构域包含与SEQ ID NO：46具有至少80％同一性，尤其是100％同一性的氨基酸序列，和一组重链CDR序列，其中CDR-H1具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列，CDR-H2具有SEQ ID NO：44的氨基酸序列，和CDR-H3具有氨基酸SEQ ID NO：45的序列。
实施方案45.实施方案44的多特异性抗体构建体，其中每个抗CD3抗原结合片段的VL结构域包含与SEQ ID NO：50具有至少80％同一性，尤其是100％同一性的氨基酸序列，和一组重链CDR序列，其中CDR-L1具有SEQ ID NO：47的氨基酸序列，CDR-L2具有SEQ ID NO：48的氨基酸序列，和CDR-L3具有SEQ ID NO：49的氨基酸序列。
实施方案46.根据实施方案39至45中任一项的多特异性抗体构建体，其在抗体模块的重链的C末端和抗原结合片段的N末端之间包含肽接头，其包含3或4个重复的氨基酸序列GGGGS(SEQ ID NO：51)，和在抗原结合片段的VH结构域和VL结构域之间包含肽接头，其包含3或4个重复的氨基酸序列GGGGS(SEQ ID NO：51)。
实施方案47.根据实施方案39至46中任一项的多特异性抗体构建体，其中抗MUC1抗体模块的重链是γ1型重链。
实施方案48.根据实施方案39至47中任一项的多特异性抗体构建体，其中所述抗MUC1抗体模块在重链的C末端不包含赖氨酸残基。
实施方案49.根据实施方案39至48中任一项的多特异性抗体构建体，其中所述抗体模块在每条抗体重链的CH2结构域中不包含N-糖基化位点。
实施方案50.根据实施方案49的多特异性抗体构建体，其中所述抗体模块在重链中对应于根据IMGT/Eu编号系统的297位的位置处不包含天冬酰胺残基，特别地在重链中包含Ala297突变。
实施方案51.根据实施方案39至48中任一项的多特异性抗体构建体，其中所述抗体模块在每条抗体重链的CH2结构域中包含N-糖基化位点。
实施方案52.根据实施方案51的多特异性抗体构建体，其中所述抗体模块在抗体重链的CH2结构域中具有糖基化模式，其中携带核心岩藻糖残基的聚糖的相对量为多特异性抗体构建体的组合物中与抗体模块的CH2结构域附接的聚糖总量的至少60％，尤其是至少65％或至少70％。
实施方案53.根据实施方案51的多特异性抗体构建体，其中抗体模块在抗体重链的CH2结构域中具有糖基化模式，其中携带核心岩藻糖残基的聚糖的相对量为多特异性抗体构建体的组合物中与抗体模块的CH2结构域附接的聚糖总量的40％或更少，尤其是30％或更少或20％或更少。
实施方案54.根据实施方案39至53中任一项的多特异性抗体构建体，其用于治疗与异常细胞生长相关的疾病例如癌症，感染例如细菌、病毒、真菌或寄生虫感染，炎性疾病，自身免疫疾病，移植物抗宿主病和免疫缺陷。
实施方案55.根据实施方案39至53中任一项的多特异性抗体构建体，其用于治疗卵巢癌、乳腺癌例如三阴性乳腺癌、肺癌或胰腺癌。
附图
图1显示了包含附接于抗MUC1抗体的轻链C末端(αMUC1-αCD3-Cκ)或重链C末端(αMUC1-αCD3-CH3)的抗CD3scFv片段的双特异性抗体构建体。
图2显示了双特异性构建体对T细胞的活化和增殖。在αMUC1-αCD3-CH3-NA存在下，将含有T细胞的PBMC与具有不同MUC1表达水平的靶细胞一起孵育。无靶细胞和单特异性αMUC1抗体用作对照。通过CD69(A)和CD25(B)表达测定T细胞的活化以及通过分裂细胞数(C)测定增殖。
图3显示了双特异性构建体对NK细胞的活化和增殖。在αMUC1-αCD3-CH3-NA存在下，将含有NK细胞的PBMC与具有不同MUC1表达水平的靶细胞一起孵育。无靶细胞和单特异性αMUC1抗体用作对照。通过CD69(A)和CD25(B)表达测定NK细胞的活化以及通过分裂细胞数(C)测定增殖。
图4显示双特异性构建体与其靶抗原的结合。将αMUC1-αCD3-CH3和αMUC1-αCD3-Cκ与表达双特异性构建体的相应抗原但非其他特异性的抗原的细胞系一起孵育。针对HER2和CD3的其他双特异性构建体以及针对各肿瘤抗原的单特异性抗体用作对照。测定与MUC1(A)、HER2(B)和CD3(C)的结合。
图5显示由双特异性构建体引发的针对靶细胞的T细胞介导的ADCC。将预活化T细胞(A、B)或含有非预活化T细胞的PBMC(C、D)与αMUC1-αCD3-CH3和αMUC1-αCD3-Cκ(A、C)或αHER2-αCD3-CH3和αHER2-αCD3-Cκ(B、D)分别在MUC1+或HER2+靶细胞的存在下孵育。测定取决于双特异性抗体构建体浓度的靶细胞的特异性裂解。针对各靶抗原的单特异性抗体用作对照。
图6显示了由靶向TFα的双特异性构建体引发的针对靶细胞的T细胞介导的ADCC。在TFα-MUC1+靶细胞的存在下，将预活化的T细胞与αTFα-αCD3-CH3一起孵育。测定取决于双特异性抗体构建体浓度的靶细胞的特异性裂解。针对TFα的单特异性抗体用作对照。
图7显示αMUC1-αCD3-CH3和不靶向MUC1的类似双特异性抗体与CD3+细胞的结合。
图8显示了取决于靶细胞的存在的用αMUC1-αCD3-CH3刺激的免疫细胞的细胞因子释放。显示了在存在或不存在MUC1+MCF-7靶细胞的情况下与不同浓度的αMUC1-αCD3-CH3孵育48小时后PBMC上清液中IFN-γ、TFN-α和IL-6的浓度。
图9显示了取决于靶细胞的存在的αMUC1-αCD3-CH3的T细胞活化。针对活化标志物CD69(A、C)和CD25(B、D)呈阳性的CD4+(A、B)或CD8+(C、D)T细胞的百分比在存在或不存在MUC1+MCF-7靶细胞的情况下在与αMUC1-αCD3-CH3或不靶向MUC1的对照双特异性抗体孵育后通过流式细胞术测定。
图10显示αMUC1-αCD3-CH3抗体将T细胞募集至肿瘤部位。显示了在存在或不存在αMUC1-αCD3-CH3的情况下与PBMC共培养的肿瘤球状体的组织切片(A)。T细胞被染成深色。测定取决于αMUC1-αCD3-CH3的存在的每个肿瘤球状体的CD8+T细胞数(B)。
图11显示用αMUC1-αCD3-CH3处理的肿瘤细胞中TA-MUC1的上调。显示了在存在或不存在αMUC1-αCD3-CH3的情况下培养的肿瘤球状体的组织切片。TA-MUC1+细胞被染成深色。
图12显示αMUC1-αCD3-CH3对旁观者免疫细胞的刺激。在存在或不存在靶细胞的情况下，将PBMC与αMUC1-αCD3-CH3一起孵育。通过流式细胞术确定对于它们各自的活化标记物呈阳性的特异性免疫细胞的百分比。(A)B细胞，(B)单核细胞，(C)天然杀伤T细胞，(D)天然杀伤细胞。
图13显示了双特异性αCD3-CH3抗体的稳定性分析。分离抗体的重链并通过UPLC-MS分析其分子量。上图：暴露于高应激的αMUC1-αCD3-CH3；中图：在无应激下产生的αMUC1-αCD3-CH3；下图：暴露于高应激的αTFα-αCD3-CH3，其中抗体重链的C末端赖氨酸缺失。具有C末端αCD3-scFv的完整重链的分子量：约77kDa；没有C末端αCD3-scFv的重链的分子量：约49kDa。
实施例
实施例1：特异性结合MUC1和CD3的双特异性抗体构建体的产生。
产生双特异性T细胞接合构建体，其由MUC1特异性结合部分和CD3结合部分组成。MUC1结合部分是人源化的全长IgG1分子，其具有典型的抗体Y形。CD3结合通过将抗CD3单链可变片段与αMUC1 IgG的每个Cκ-(αMUC1-αCD3-Cκ)或CH3结构域(αMUC1-αCD3-CH3)融合来实现。构建体的一般结构如图1所示。
在构建体αMUC1-αCD3-CH3-wt中，抗TA-MUC1抗体PankoMab(gatipotuzumab)用作MUC1结合部分，和具有抗CD3抗体TR66的可变区的scFv构建体用作CD3结合部分。通过(Gly4Ser)4接头将抗CD3 scFv与PankoMab的CH3结构域的C末端融合。构建体αMUC1-αCD3-Cκ-wt与αMUC1-αCD3-CH3-wt相同，除了抗CD3 scFv与PankoMab的Cκ结构域的C末端融合。
构建体αMUC1-αCD3-CH3-NA对应于“wt”构建体，除了PankoMab重链中的Asn297Ala突变，其使CH2结构域中的糖基化位点无效。因此，“NA”构建体在PankoMab的Fc部分中未被糖基化。
构建体在人髓样白血病来源的细胞系NM-H9D8-E6Q12(DSM ACC2856)中表达，产生具有人糖基化模式的构建体，其在wt构建体的PankoMab CH2结构域中具有约10％的低量的岩藻糖基化。另外，αMUC1-αCD3-CH3-wt构建体也在相关细胞系NM-H9D8(DSM ACC2806)中产生，产生在PankoMab CH2结构域中具有约90％的高量的岩藻糖基化的糖基化构建体。
使用抗TFα抗体KaroMab代替PankoMab作为MUC1结合部分来产生了类似的构建体。
使用无血清培养基的产率足以用于随后的纯化、生物化学评估和针对癌细胞系的双特异性抗体作用机制的生物功能评估。此外，为了评估产生大量αMUC1-αCD3-CH3的可行性，在无血清条件下在生物反应器中培养高产细胞克隆。
治疗性双特异性抗体的一个主要挑战是产生足够量的重组蛋白。为了研究在与大规模良好生产规范(GMP)生产相容的条件下高产率生产的可行性，在2L生物反应器中培养产生αMUC1-αCD3-CH3的细胞。在使用无血清培养基的连续灌注过程的受控环境中，达到了高细胞密度。最大细胞浓度为3×107个活细胞/mL，这是旋转培养物中的最大细胞密度的约10倍。更重要的是，一旦培养物达到最大灌注速率，αMUC1-αCD3-CH3滴度达到50μg/mL，并且灌注过程持续时间的平均滴度为28μg/mL。因此，在2L/d的灌注速率下，该过程平均每天产生47mgαMUC1-αCD3-CH3。在30天内收获上清液。细胞活力高于90％。通过渗出从生物反应器中除去细胞以避免细胞浓度超过3×107个活细胞/mL并确保培养物有足够的营养供应。在培养30天内总αMUC1-αCD3-CH3抗体产量为1.4g。
通过蛋白A层析纯化αMUC1-αCD3-CH3，并使用LC-MS分析完整抗体链的分子量。相比之下，αMUC1-αCD3-CH3也从超过40天的特殊长生物反应器运行结束时收获的最后上清液中纯化。
实施例2：T细胞活化和增殖
为了研究双特异性构建体的T细胞活化，通过流式细胞术在CD4+和CD8+T细胞上分析48小时后活化标记物CD69和CD25的表达。为此目的，将来自健康供体的人PBMC与αMUC1-αCD3-CH3-NA或作为对照的αMUC1一起在指定浓度下孵育48小时。48小时后，收获PBMC并分别用荧光标记的αCD45、αCD4、αCD8、αCD25、αCD69、αCD56、αCD14和αCD19抗体染色。为了单独分析活细胞，使用DAPI(Sigma-Aldrich)。在Attune NxT(Thermo Fisher)流式细胞仪中分析细胞。在不存在或存在具有不同水平的MUC1表达的细胞系的情况下分析T细胞活化，其中效应细胞和靶细胞之间的比例为5：1。
除T细胞活化外，T细胞募集双特异性的另一种作用机制是诱导T细胞增殖。为了测量T细胞增殖，用CellTraceTMViolet(Thermo Fisher)标记来自健康供体的PBMC，并在不存在或存在具有不同水平的MUC1表达的细胞系的情况下与αMUC1-αCD3-CH3-NA或作为对照的αMUC1一起孵育，其中效应细胞和靶细胞之间的比例为5：1。如果T细胞增殖，则对每一代的增殖细胞稀释CellTraceTM染料。5天后，收获PBMC并分别用荧光标记的αCD45、αCD4、αCD8、αCD56、αCD14和αCD19抗体染色。为了单独分析活细胞，使用7-AAD(Calbiochem)。在AttuneNxT(Thermo Fisher)流式细胞仪中分析细胞。
结果表明，αMUC1-αCD3-CH3能够通过同时结合MUC1+细胞系和T细胞上的CD3来诱导T细胞活化和T细胞增殖。如对于CD4+T细胞所显示的，与多种MUC1+细胞系和αMUC1-αCD3-CH3一起孵育导致T细胞活化标记物CD69(图2A)和CD25(图2B)的表达增加。另外，如对于CD8+T细胞所显示的，由于MUC1+细胞系和T细胞上的CD3的同时结合，诱导了T细胞增殖(图2C)。
实施例3：NK细胞活化和增殖
为了研究NK细胞活化，通过流式细胞术在48小时后分析活化标记物CD69和CD25的表达。为此目的，将来自健康供体的人PBMC与指定浓度的αMUC1-αCD3-CH3-NA一起孵育48小时。48小时后，收获PBMC并分别用荧光标记的αCD45、αCD4、αCD8、αCD25、αCD69、αCD56、αCD14和αCD19抗体染色。为了单独分析活细胞，使用DAPI(Sigma-Aldrich)。在Attune NxT(Thermo Fisher)流式细胞仪中分析细胞。在不存在或存在具有不同水平的MUC1表达的细胞系的情况下分析NK细胞活化，其中效应细胞和靶细胞之间的比例为5:1。
如果NK细胞被活化，则它们开始增殖。为了测量NK细胞增殖，用CellTraceTMViolet(Thermo Fisher)标记来自健康供体的PBMC，并在不存在或存在具有不同水平的MUC1表达的细胞系的情况下与αMUC1-αCD3-CH3-NA或作为对照的αMUC1一起孵育5天，其中效应细胞和靶细胞之间的比例为5:1。如果NK细胞增殖，则对每一代的增殖细胞稀释CellTraceTM染料。5天后，收获PBMC并分别用荧光标记的αCD45、αCD4、αCD8、αCD56、αCD14和αCD19抗体染色。为了单独分析活细胞，使用7-AAD(Calbiochem)。在Attune NxT(Thermo Fisher)流式细胞仪中分析细胞。
结果表明αMUC1-αCD3-CH3-NA能够诱导NK细胞活化和NK细胞增殖。在Asn297处没有N-Glykan的αMUC1-αCD3-CH3-NA仅能够通过αCD3结合部分结合T细胞并且不显示NK细胞结合。令人惊讶的是，观察到NK细胞活化和增殖，这取决于MUC1+细胞系和αMUC1-αCD3-CH3-NA的存在。可能由于αMUC1-αCD3-CH3介导的T细胞活化和随后的刺激性细胞因子的释放，诱导了NK细胞的额外活化。因此，尽管没有直接的NK细胞结合，但与αMUC1-αCD3-CH3-NA孵育导致NK细胞活化，如活化标记物CD69(图3A)和CD25(图3B)以及NK细胞增殖(图3C)的上调所显示的。
实施例4：特异性抗原的结合
通过流式细胞术分析αMUC1、αMUC1-αCD3-Cκ和αMUC1-αCD3-CH3以及αHER2、αHER2-αCD3-Cκ和αHER2-αCD3-CH3与人TA-MUC1和HER2表达肿瘤细胞的结合特性。具有强TA-MUC1和中等HER2表达但不存在CD3表达的乳腺癌细胞系ZR-75-1用于测定TA-MUC1和HER2结合。为了分析CD3结合，使用CD3+但TA-MUC1和Her2阴性的Jurkat细胞。简言之，收获靶细胞并与连续稀释的指定抗体一起孵育。然后，洗涤细胞并与二抗山羊抗hIgG(H+L)-RPE-缀合的抗体在4℃下在黑暗中孵育。在FACS Canto II(Becton Dickinson)流式细胞仪中通过流式细胞术分析细胞。
αMUC1、αMUC1-αCD3-Cκ和αMUC1-αCD3-CH3显示出与TA-MUC1+细胞系ZR-75-1相当的结合(图4A)。向Cκ结构域或CH3结构域添加αCD3 scFv均不影响TA-MUC1的结合。用HER2靶向构建体获得了类似的结果，因为αHER2、αHER2-αCD3-Cκ和αHER2-αCD3-CH3显示出与HER2+细胞系ZR-75-1相当的结合(图4B)。相对的，分析αMUC1-αCD3-CH3以及αHER2-αCD3-CH3与CD3+Jurkat细胞的结合显示与其各自的Cκ-融合对应物αMUC1-αCD3-Cκ和αHER2-αCD3-Cκ相比CD3的结合增加(图4C)。
实施例5：ADCC测定
T细胞介导的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)是T细胞接合抗体的主要机制。在TA-MUC1或HER2结合后，双特异性抗体通过与其表面上的CD3结合而募集T细胞，导致含有促进TA-MUC1+或HER2+肿瘤细胞的细胞死亡的穿孔素和颗粒酶的细胞毒性颗粒的释放。使用预活化的T细胞作为效应细胞，αMUC1-αCD3-Cκ和αMUC1-αCD3-CH3(图5A)以及αHER2-αCD3-Cκ和αHER2-αCD3-CH3(图5B)显示TA-MUC1+和HER2+乳腺癌细胞系T-47D的有效裂解。令人惊讶的是，与αMUC1-αCD3-Cκ相比，由αMUC1-αCD3-CH3介导的T细胞ADCC增强(图5A)，而与αHER2-αCD3-CH3相比，αHER2-αCD3-Cκ显示出更强的T细胞ADCC活性(图5B)。用HER2结合构建体获得的结果与强烈支持T细胞结合结构域和癌细胞结合结构域之间的短距离的最近的报道一致，因为肿瘤细胞膜和T细胞的更加接近被描述为增强T细胞活化和所介导的细胞毒性(参见，例如，Bluemel,C.等人(2010)Cancer Immunol Immunother 59:1197-1209；Chames,P.and Baty,D.(2009)mAbs 1(6):539-547)。与此相反，其中抗CD3结合片段与重链的C末端附接的αMUC1-αCD3-CH3的结合结构域之间的距离与其中抗CD3结合片段与轻链的C末端附接的αMUC1-αCD3-Cκ相比要大得多。然而，与αMUC1-αCD3-Cκ相比，αMUC1-αCD3-CH3诱导增加的T-47D细胞的特异性裂解。类似于TA-MUC1和HER2靶向构建体，使用αTFα-αCD3-CH3和预活化的T细胞作为效应细胞，诱导了前列腺癌细胞系DU-145的特异性裂解(图6)。如所预期的，当预活化的T细胞用作效应细胞时，不募集T细胞的亲本抗体αMUC1(图5A)、αHER2(图5B)和αTFα(图6)均没有诱导特异性裂解。
对于使用预活化T细胞的T细胞ADCC测定，首先通过磁珠分离技术(UntouchedTMHuman T cells Kit,Thermo Fisher)分离T细胞，然后将分离的T细胞活化5天(用于T细胞扩增和活化的HumanT-Activator CD3/CD28，Thermo Fisher)。选择这种T细胞预活化方法以获得仅基于结合TA-MUC1的过程和导致细胞死亡的穿孔素和颗粒酶释放的结果，从而排除在不同测定中分析的T细胞活化的潜在差异。然后使用活化的T细胞比较靶向TA-MUC1或HER2的不同双特异性构建体。该测定作为铕释放测定进行。简而言之，通过电穿孔将靶细胞加载铕(Eu3+)，并将其在双特异性构建体存在下，以10：1的效应物对靶细胞比例(E：T比率)与预活化的T细胞孵育5小时。使用荧光板读数器Infinite F200(Tecan Austria GmbH)定量向上清液的铕释放(指示抗体介导的细胞死亡)。通过用triton-X-100孵育靶细胞实现最大释放，并且在仅含有靶细胞但不含抗体和PBMC的样品中测量自发释放。
特异性细胞毒性计算如下：
％特异性裂解＝(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)×100。
在用预活化的T细胞分析T细胞介导的ADCC后，建立使用未刺激的PBMC作为效应细胞的不同测定设置。因此，除TA-MUC1或HER2结合和穿孔素和颗粒酶的释放外，该测定设置还解释了T细胞活化的差异。使用未刺激的PBMC作为效应细胞，证实了用预活化的T细胞获得的结果。αMUC1-αCD3-Cκ和αMUC1-αCD3-CH3(图5C)以及αHER2-αCD3-Cκ和αHER2-αCD3-CH3(图5D)显示TA-MUC1+和HER2+乳腺癌细胞系MCF-7的有效裂解。与αMUC1-αCD3-Cκ相比，αMUC1-αCD3-CH3介导的特异性裂解再次增强(图5C)，而与αHER2-αCD3-CH3相比，αHER2-αCD3-Cκ显示出更强的细胞毒活性(图5D)。用HER2结合构建体获得的结果再次与强烈支持T细胞结合结构域和癌细胞结合结构域之间的短距离的最近的报道一致。与此相反，与αMUC1-αCD3-Cκ相比，αMUC1-αCD3-CH3诱导增加的T-47D细胞的特异性裂解。当未刺激的PBMC用作效应细胞时，不募集T细胞的亲本抗体αMUC1(图5C)和αHER2(图5D)均未诱导特异性裂解，表明在该实验中使用的低E：T比率下，T细胞是介导细胞毒性的主要效应细胞群。
PBMC ADCC测定作为乳酸脱氢酶(LDH)释放测定进行。因此，在裂解测定前一天，将TA-MUC1+和HER2+人乳腺癌MCF-7细胞接种在96孔平底板中。第二天从健康供体血沉棕黄层中分离PBMC，并以10：1的最终E：T比率与αMUC1、αMUC1-αCD3-Cκ、αMUC1-αCD3-CH3、αHER2、αHER2-αCD3-Cκ和αHER2-αCD3-CH3一起加入至靶细胞中。在24小时至48小时后，通过定量释放到细胞上清液中的乳酸脱氢酶(LDH)(细胞毒性检测试剂盒(LDH)，Roche)来评估靶细胞杀伤。通过用triton-X-100孵育靶细胞实现最大释放，并且在仅含有靶细胞和PBMC但不含抗体的样品中测量抗体非依赖性细胞死亡。
实施例6：脱靶效应
为了分析双特异性抗体的安全性，根据抗体的特异性靶细胞的存在来测定免疫细胞的细胞因子释放。在不存在靶细胞的情况下免疫细胞的活化和细胞因子释放是脱靶效应，其可能导致人类患者的不良副作用。
将PBMC在含有或不含有MUC1+MCF-7细胞的情况下与αMUC1-αCD3-CH3一起孵育48小时。48小时后，收集上清液，分析细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-6的浓度。在MUC1+靶细胞存在下，αMUC1-αCD3-CH3介导的T细胞活化导致剂量依赖性细胞因子释放(参见图8)。在没有靶细胞的情况下，未检测到细胞因子释放。因此，双特异性抗体显示出非常好的靶特异性，具有特别低的脱靶效应。
在另一个实验中，使用非靶向T细胞接合双特异性抗体分析双特异性抗体的特异性，所述非靶向T细胞接合双特异性抗体不与MUC1结合但在其他方面与αMUC1-αCD3-CH3相同。
与CD3+Jurkat细胞的结合证明两种双特异性抗体对表达CD3的免疫细胞具有相同的亲和力(参见图7)。然而，只有靶向双特异性抗体αMUC1-αCD3-CH3能够活化免疫细胞。用靶向或非靶向双特异性抗体和MUC1+MCF-7细胞孵育PBMC仅在靶向αMUC1-αCD3-CH3的存在下显示CD4+和CD8+T细胞的活化(参见图9)。这表明只有双特异性抗体αMUC1-αCD3-CH3的特异性结合靶细胞和募集免疫细胞才能活化免疫细胞。
实施例7：T细胞募集
为了证明免疫细胞向肿瘤部位的募集，建立了3D体外模型。将PBMC添加到肿瘤球状体中，并用双特异性抗体刺激共培养物。在用αMUC1-αCD3-CH3处理后，肿瘤球状体中CD8+T细胞的数量显著增加(参见图10)。因此，双特异性抗体有效地将免疫细胞募集到肿瘤部位。
实施例8：MUC1的上调
使用实施例7的3D模型分析用双特异性抗体处理对靶肿瘤中肿瘤相关MUC1表达的影响。将PBMC加入肿瘤球状体中，并用双特异性抗体αMUC1-αCD3-CH3刺激共培养物。用抗体处理后，观察到TA-MUC1的上调(参见图11)。因此，在治疗开始后，肿瘤靶向甚至通过肿瘤细胞中上调的TA-MUC1表达得到改善。
实施例9：旁观者免疫细胞活化
作为次要效应，CD3+免疫细胞尤其是T细胞的活化也导致双特异性抗体对其他免疫细胞的活化。为了证明这一点，在MUC1+靶细胞存在下将PBMC与αMUC1-αCD3-CH3一起孵育48小时。48小时后，通过流式细胞术分析不同的免疫细胞亚群的特异性活化标记物的表达(参见图12)。没有靶细胞的孵育用作阴性对照。
如图所示，αMUC1-αCD3-CH3在MUC1+靶细胞的存在下活化B细胞、单核细胞、NKT细胞和NK细胞。在没有这些靶细胞的情况下，未观察到免疫细胞的活化。这些结果表明，在MUC1+靶细胞的存在下，αMUC1-αCD3-CH3还活化旁观者免疫细胞。
实施例10：通过LC-MS分析完整抗体链的分子量
分析了双特异性抗体的稳定性。如上文实施例1中所述产生αMUC1-αCD3-CH3和αTFα-αCD3-CH3。此外，具有相同双特异性形式但在重链的C末端和接头序列之间具有突变序列的参照抗体(Fc部分的最后一个氨基酸(K447)被缺失)以类似的方式产生。通过从旋转烧瓶中的长批量生产的上清液中纯化抗体来产生应激的样品。
将抗体样品变性并用DTT处理以减少二硫键。随后通过与Rapid PNGase F(NEB)孵育实现去糖基化。将样品注入C4柱并通过UPLC-MS使用含有0.1％甲酸的H2O/AcN梯度进行分析。用ESI-QTOF-MS(ImpactHD，Bruker)获得质谱。得到的光谱在数据分析(Bruker)中处理，采用0.7的背景扣除和MaxEnt算法用于反映轻链(～24kDa)和重链(～77kDa)的预期质量范围的20-80kDa之间的电荷解卷积。
观察到双特异性抗体的完整重链(76.8kDa)的信号和重链的位置K447处αCD3单链片段的潜在损失，导致49.3kDa的质量。结果总结在图13中。如所证明的，如实施例1中所述产生的双特异性抗体(“正常”)未显示重链的任何降解。然而，来自具有高度死细胞的培养晚期的应激的双特异性抗体显示出降解的片段(“应激的”)。对αTFα-αCD3-CH3抗体进行的序列突变(重链中K447的缺失)使构建体稳定，因为没有可检测到的片段(“应激的K447del”)。
保藏的生物材料的标识
细胞系DSM ACC 2806、DSM ACC 2807和DSM ACC 2856在如下表所示的日期由Glycotope GmbH,Robert--Str.10,13125Berlin(DE)保藏于DSMZ-DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Inhoffenstraβe 7B,38124Braunschweig(DE)。
细胞系名称 保藏号 保藏人 保藏日期
NM-H9D8 DSM ACC 2806 Glycotope GmbH 2006年9月15日
NM-H9D8-E6 DSM ACC 2807 Glycotope GmbH 2006年10月5日
NM-H9D8-E6Q12 DSM ACC 2856 Glycotope GmbH 2007年8月8日
序列表
<110> 葛莱高托普有限公司
<120> 结合MUC1和CD3的多特异性抗体构建体
<130> 59 304 K
<150> LU100152
<151> 2017-03-29
<160> 53
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 5
<212> PRT
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<213> 人工
<220>
<223> 抗TA-MUC1 CDR H1
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<213> 人工
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<223> 抗TA-MUC1 CDR H2
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Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Thr Thr His Tyr Ala Glu Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 抗TA-MUC1 CDR H2
<400> 4
Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 抗TA-MUC1 CDR H3
<400> 5
His Tyr Tyr Phe Asp Tyr
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<213> 人工
<220>
<223> 抗TA-MUC1 CDR H3
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Gly Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TA-MUC1重链可变区
<400> 7
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala
20 25 30
Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Leu Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Val Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Leu Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Gly Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
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<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TA-MUC1重链可变区
<400> 8
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Leu Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Thr Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Val Ser Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Thr Gly Leu Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg His Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
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<211> 117
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 抗TA-MUC1重链可变区
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Pro Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Thr Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg His Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 抗TA-MUC1 CDR L1
<400> 10
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Phe Phe
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<213> 人工
<220>
<223> 抗TA-MUC1 CDR L1
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Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
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<212> PRT
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<213> 人工
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<223> 抗TA-MUC1 CDR L2
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Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
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<220>
<223> 抗TA-MUC1 CDR L3
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Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Pro Thr
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<211> 9
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<213> 人工
<220>
<223> 抗TA-MUC1 CDR L3
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Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr
1 5
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<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TA-MUC1轻链可变区
<400> 16
Asp Leu Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Leu Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
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Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
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Pro Lys Leu Leu Leu Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Leu
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
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Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Arg Ala
<210> 17
<211> 114
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<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TA-MUC1轻链可变区
<400> 17
Asp Leu Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Leu Thr Tyr Phe Phe Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Leu Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Leu Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
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Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Leu
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
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Leu Glu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Arg Ala
<210> 18
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 抗TA-MUC1轻链可变区
<400> 18
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Asn Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Phe Phe Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 19
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 表位
<400> 19
Pro Asp Thr Arg
1
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 表位
<400> 20
Pro Asp Thr Arg Pro
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TFα CDR-H1
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1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TFα CDR-H2
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Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
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Gly
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TFα CDR-H2
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Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
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<213> 人工序列
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<223> 抗TFα CDR-H3
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<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TFα CDR-H3
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TFα CDR-H3
<400> 26
Tyr Asp Asn His Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 27
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TFα重链可变区
<400> 27
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
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50 55 60
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Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TFα重链可变区
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
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100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 29
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TFα重链可变区
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 30
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TFα重链可变区
<400> 30
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
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50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 31
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TFα重链可变区
<400> 31
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
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Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
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100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 32
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TFα重链可变区
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Asp Ala Ala Gly Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 33
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TFα CDR-L1
<400> 33
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 34
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TFα CDR-L1
<400> 34
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 35
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TFα CDR-L1
<400> 35
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TFα CDR-L2
<400> 36
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TFα CDR-L2
<400> 37
Glu Val Ser Ser Arg Phe Ser
1 5
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TFα CDR-L3
<400> 38
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr
1 5
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TFα CDR-L3
<400> 39
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr
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<210> 40
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TFα轻链可变区
<400> 40
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
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Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
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Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
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Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 41
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TFα轻链可变区
<400> 41
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
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50 55 60
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Arg
<210> 42
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TFα轻链可变区
<400> 42
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 43
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 CDR-H1
<400> 43
Gly Tyr Thr Phe Thr Arg
1 5
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 CDR-H2
<400> 44
Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr
1 5
<210> 45
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 CDR-H3
<400> 45
Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 46
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3重链可变区
<400> 46
Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 47
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 CDR-L1
<400> 47
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn
1 5 10
<210> 48
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 CDR-L2
<400> 48
Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser
1 5
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 CDR-L3
<400> 49
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
1 5
<210> 50
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3轻链可变区
<400> 50
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 51
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头重复序列
<400> 51
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 52
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TA-MUC1轻链可变区
<400> 52
Asp Leu Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Leu Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Leu Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Leu
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Arg
<210> 53
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TA-MUC1轻链可变区
<400> 53
Asp Leu Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Leu Thr Tyr Phe Phe Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Leu Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Leu Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Leu
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Arg
PCT/RO/134表

Claims (16)

1.一种多特异性抗体构建体，其包含
(i)抗MUC1抗体模块，所述抗体模块包含至少一条抗体重链，和
(ii)抗CD3抗原结合片段；
其中所述抗原结合片段与所述抗体模块的重链的C末端融合。
2.根据权利要求1所述的多特异性抗体构建体，其中所述抗MUC1抗体模块包含
(a)两条重链，每条重链包含VH结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域；和
(b)包含VL结构域和CL结构域的两条轻链。
3.根据权利要求1或2所述的多特异性抗体构建体，其中所述抗MUC1抗体模块特异性结合TA-MUC1表位并包含抗体重链可变区，其包含
(i)与SEQ ID NO：7、8和9中的任何一个至少80％相同的氨基酸序列，和
(ii)一组重链CDR序列，其中CDR-H1具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，CDR-H2具有SEQID NO：3的氨基酸序列和CDR-H3具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列，或CDR-H1具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，CDR-H2具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列和CDR-H3具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
4.根据权利要求1或2所述的多特异性抗体构建体，其中所述抗MUC1抗体模块特异性结合TFα并且包含抗体重链可变区，其包含
(i)与SEQ ID NO：27至32中的任一个至少80％相同的氨基酸序列，和
(ii)一组重链CDR序列，其中CDR-H1具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列，CDR-H2具有SEQID NO：22或23的氨基酸序列，和CDR-H3具有SEQ ID NO：24、25或26的氨基酸序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的多特异性抗体构建体，其中所述抗CD3抗原结合片段包含VH结构域、VL结构域和VH结构域与VL结构域之间的肽接头；并且特别地是scFv片段。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的多特异性抗体构建体，其中所述抗CD3抗原结合片段特异性结合CD3ε并且包含抗体重链可变区，其包含
(i)与SEQ ID NO：46中的任一个至少80％相同的氨基酸序列；和
(ii)一组重链CDR序列，其中CDR-H1具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列，CDR-H2具有SEQID NO：44的氨基酸序列，和CDR-H3具有SEQ ID NO：34的氨基酸序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的多特异性抗体构建体，其中所述多特异性抗体构建体包含两个抗CD3抗原结合片段，其各自与抗体模块的不同重链的C末端融合。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的多特异性抗体构建体，其中所述抗体模块在CH2结构域中不包含N-糖基化位点。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的多特异性抗体构建体，其中所述抗体模块在抗体重链的CH2结构域中包含N-糖基化位点。
10.根据权利要求9所述的多特异性抗体构建体，其中所述抗体模块在抗体重链的CH2结构域中具有糖基化模式，其中携带核心岩藻糖残基的聚糖的相对量是多特异性抗体构建体的组合物中与抗体模块的CH2结构域附接的聚糖总量的至少60％。
11.根据权利要求9所述的多特异性抗体构建体，其中所述抗体模块在抗体重链的CH2结构域中具有糖基化模式，其中携带核心岩藻糖残基的聚糖的相对量是多特异性抗体构建体的组合物中与抗体模块的CH2结构域附接的聚糖总量的40％或更少。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的多特异性抗体构建体，其包含与其缀合的其他药剂。
13.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至12中任一项所述的多特异性抗体构建体和一种或多种选自溶剂、稀释剂和赋形剂的其他组分。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的多特异性抗体构建体或根据权利要求13所述的药物组合物，其用于医学。
15.根据权利要求1至12中任一项所述的多特异性抗体构建体或根据权利要求13所述的药物组合物，其用于治疗、预后、诊断和/或监测与异常细胞生长相关的疾病例如癌症，感染例如细菌、病毒、真菌或寄生虫感染，炎性疾病如自身免疫疾病和炎性肠病，移植物抗宿主病，和与免疫活性降低相关的疾病例如免疫缺陷。
16.根据权利要求15所述的多特异性抗体构建体或药物组合物，其用于治疗癌症，其中所述癌症选自乳腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、血液癌、肺癌和卵巢癌。
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