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JP4758984B2 - 抗ｃｓ１抗体の治療的使用 - Google Patents

抗ｃｓ１抗体の治療的使用 Download PDF

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Description

（発明の分野）
本発明は、疾患（自己免疫および癌に関する疾患が挙げられる）の処置におけるアンタゴニストおよび抗体の分野に関する。本発明は、さらに、これらの疾患を検出、同定、および調節するための方法に関する。
（発明の背景）
免疫グロブリン発現の増加は、多くの疾患の特徴である。免疫グロブリンの高レベルの分泌により、種々の障害（過粘稠血症候群（倦怠感、頭痛、息切れ、精神錯乱、胸痛、腎臓損傷および腎不全、視覚問題、およびレイノー現象（血液循環（特に、指、つま先、鼻、および耳）の減少）を引き起こす消耗性障害が挙げられる）が引き起こされる。寒冷凝集素病、混合性クリオグロブリン血症、高ガンマグロブリン血症、シェーグレン症候群、粘液水腫性苔癬、およびゴーシェ病は、免疫グロブリン発現の増加に関連する疾患の例である。
自己のタンパク質を標的とする免疫グロブリン発現の増加は、自己免疫疾患を代表する特徴である。自己免疫疾患は、自己抗原を自己として認識するような免疫系の不全である。自己免疫疾患では、免疫が誤って細胞、組織、および器官を標的として自己を攻撃し、最終的に生理系の破壊をもたらす。自己免疫および自己免疫疾患は、元来は多因子性であり、これらの因子としては、自己免疫の発生および自己抗原に対する自己抗体の産生に関与する遺伝性素因、宿主因子（例えば、免疫調節の制御の脆弱性、抑制性Ｔ細胞の欠損、または制御に抵抗するＢ細胞のポリクローナル刺激）、環境因子、および抗原駆動性の機構が挙げられる。
胃腸管障害および全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）は、自己免疫疾患の２つの例である。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（胃腸管障害の亜群）は、全世界で約４００万人の個体が罹患している不治の障害群である。再発性炎症性腸疾患の病因は、現在のところ不明である。胃腸管細胞（リンパ球が含まれる）の自己免疫媒介性の破壊という説がある。遺伝性炎症性腸疾患モデルにおける異常なホモタイプの凝集が、これまでに実証されており、ＮＯＤ２（自己免疫障害に関与する遺伝子）の変異は、患者をクローン病にかかりやすくすることが示されている。非特許文献１；非特許文献２。
ＩＢＤは、ほとんどの場合、小腸および結腸で発症するが、胃腸管の任意の部分に関与し得る。米国のみで１００万人以上がＩＢＤと診断されており、毎年１０，０００人以上が新たにＩＢＤと診断されている。ＩＢＤ患者の生活の質の劇的な影響に起因して、数万時間の喪失が毎年必要とされ、これは１年で最大１０億ドルの労働時間の損失に値する。
ＩＢＤは、一定範囲の胃腸管および腸外症状（下痢、直腸出血、腹痛、体重減少、皮膚および眼の障害、ならびに小児における成長の遅延および性的な成熟の遅延が挙げられる）を引き起こす。ＩＢＤの２つの型は、類似の症状および生理学的徴候を示すが、消化管に影響を与える様式が異なる潰瘍性大腸炎およびクローン病である。潰瘍性大腸炎は、結腸粘膜（最も頻繁には直腸で起る）の全部または一部の潰瘍性炎症によって特徴づけられる。その症状としては、直腸出血および尿意ひっ迫、テネスムス、および下痢が含まれる。潰瘍性大腸炎は、深刻な短期合併症および長期合併症を伴う。最も重篤な短期合併症は、激症潰瘍、中毒性巨大結腸、および穿孔である。重篤な長期合併症には、骨粗鬆症および結腸直腸癌が含まれる。
クローン病は、口腔から肛門までの胃腸管の任意の部分で罹患し得る慢性貫壁性炎症である。クローン病は、非連続的であり、１つ以上の関連する領域の間に非罹患領域を伴う。疾患後期では、粘膜は、介在正常粘膜が混在した深部縦走潰瘍形成に起因する敷石像を発現する。
ほとんどのクローン病患者は、腹痛および腹部圧通、慢性もしくは夜間下痢、直腸出血、体重減少、および発熱の症状を伴う。クローン病は、長期間を経て原発性炎症性疾患から以下の２つの臨床パターンの１つへと進行する：狭窄（閉塞性）または貫通性（瘻管性）。狭窄形態では、貫壁性炎症により、腸壁中の線維筋の増殖が生じ、次いで管腔が狭まる。閉塞の症状は、ＣＤの進行につれて共通になる。貫通形態において、洞管が腸壁を介して炎症通路として形成し、漿膜表面を突破し、隣接する組織を閉塞し、皮膚さえも貫通する。
潰瘍性大腸炎およびクローン病は、一般的に、臨床上の基準、内視鏡的基準、および組織学的基準を使用して診断する。しかし、今までのところ、１つの所見で、ある疾患と別の疾患を絶対的に診断する伝統的な診断技術は確立されていない。さらに、約２０％の患者が、クローン病と潰瘍性大腸炎との間に位置する臨床像を有する。このプロフィールに適合する患者は、不定型潰瘍を有するといわれる。
ＩＢＤの症状は、患者の幸福、生活の質、および機能する能力に大きな影響を与え得る。炎症期間が長期化し、頻度が増し、重症度に依存して生活が大打撃を受ける。ＩＢＤは、慢性であり、そして代表的には３０歳までに発症するので、患者は、一般的に生涯にわたる処置が必要である。潜在的な標的および診断マーカーの同定のための疾患状態における新規のタンパク質および化合物の役割の解明は、炎症性腸疾患患者の現行の処置の改良に有益である。
ＳＬＥは、皮膚、腎臓、脳、および心臓を含む多くの器官および組織の損傷を含む病原的結果を有し得る、種々の広範に分布する分子に対する自己抗体の産生によって特徴づけられる。現在承認されているＳＬＥの処置は、ステロイド、免疫抑制性の薬物、免疫調節薬、および抗マラリア薬を介した非特異的な免疫抑制および症状の制御を包含する。しかし、これらの処置アプローチは、腎臓毒性および早死にのリスクを生じる。したがって、リンパ球の活性化および自己抗体の産生を特異的に妨害する新規のアプローチを開発することが望ましい。
免疫グロブリンおよび／またはＢ細胞の増加した発現が重要な役割を果たす他の自己免疫疾患としては、特発性血小板減少症、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、自己免疫性溶血性貧血、および重症筋無力症が挙げられる。Ｂ細胞および／または増加した免疫グロブリンの役割の証明は、ステロイド、免疫抑制性の因子、および／または抗ＣＤ２０抗体（Ｂ細胞を標的する）で処置された患者を使用した研究によってもたらされる。これらの疾患の症状の改善は、Ｂ細胞および／または血清免疫グロブリンの減少と相関し、このことは、Ｂ細胞が種々の自己免疫疾患において果たす極めて重要な役割を明らかにする。
免疫グロブリン発現の増加は、悪性疾患においても見られ得る。自己免疫障害と同様に、癌の病因は、元来、同様に多因子性である。米国で２番目の死因である癌は、細胞の増殖が制限されなくなるＤＮＡの変異に関係している。遺伝性素因は、喫煙および化学的変異誘発のような環境因子と合わせて、多くの癌の発症において大きな役割を果たす。
癌は、身体の任意の組織または器官で起こり得る。形質細胞性新生物（多発性骨髄腫、「孤立性」骨髄腫、髄外性形質細胞種、形質細胞性白血病、マクログロブリン血症（ヴァルデンストレームマクログロブリン血症が挙げられる）、Ｈ鎖病、原発性アミロイドーシス、意味不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）が挙げられる）は、免疫グロブリン発現の増加に関連する。慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）（非形質細胞性新生物）もまた、免疫グロブリンの高レベルの発現に関連する。
骨髄腫は、単一クローン由来の形質細胞の腫瘍であり、これは、代表的には二次リンパ組織を起源とし、その後骨髄組織に転移して存在する。骨髄腫は、一般的に、骨髄および隣接する骨の構造物に影響を与え、骨痛および病的骨折または病変（骨溶性の骨損傷）、異常出血、貧血、および感染に対する感受性の増加を一次症状とする。疾患の進行段階には、腎不全、骨格の変形、脊髄の圧縮、および高カルシウム血症が含まれる。骨髄腫は、骨の破骨細胞による再吸収を誘導し、それにより骨構造を破壊し、そして血漿中のカルシウム濃度を増加させることによって骨細胞に影響を与える。骨髄腫の病因は、現在のところ不明である。放射線による損傷、癌遺伝子の変異、家族性の原因、および異常なＩＬ６発現との関連が推定されている。
多発性骨髄腫は、複数の起源を有する形質細胞性腫瘍である。多発性骨髄腫は、全ての形質細胞性悪性腫瘍の約１０％を占め、そして成人で最も一般的な骨腫瘍癌であり、年間発症率は１００，０００人あたり３〜４人である。米国では、多発性骨髄腫は、非ホジキンリンパ腫に次いで２番目に多い血液の悪性腫瘍であり、米国のみで約５０，０００例であり、そして毎年約１３，５００例が新規に報告されている。多発性骨髄腫と診断された患者の予後の見通しは悪く、この見通しは、この疾患が進行した患者では数ヵ月から１年間でしかない。
伝統的に骨髄腫および多発性骨髄腫（以後「骨髄腫」と呼ぶ）を処置する分野は、化学療法、放射線療法、および外科手術からなる。さらに、他は健康な患者には、骨髄移植が推奨される。患者の治癒率は３０％に達し、骨髄移植は、骨髄腫が治癒し得る、唯一公知の方法である。しかし、高齢であるか骨髄移植手順に耐えることができない個体に対しては、化学療法が最も適切である。
現行の診断手順としては、Ｘ線、骨髄穿刺、血液検査および尿検査（ベンスジョーンズタンパク質の存在を検出するため）、ならびに赤血球沈降速度アッセイが挙げられる。骨髄腫性形質細胞の潜在的な細胞表面マーカーも同定されており、これらとしては、ＣＤ３８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＤ２０が挙げられる。非特許文献３。他の非Ｂ細胞系列のマーカーとしては、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３９、ＣＤｗ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ５４、ＣＤ５６、およびＣＤ７１、ならびに非凝集抗原（Ｒ１−３、ＰＣＡ−１、ＰＣＡ−２、ＰＣ１、６２Ｂ１、８Ａ、８Ｆ６、およびＭＭ４）が挙げられる。非特許文献３、前出；非特許文献４。さらに、Ｍタンパク質として公知である異常な抗体の出現は、多発性骨髄腫の指標である。Ｍタンパク質産生の増加は、消耗性の副作用（倦怠感、頭痛、息切れ、精神錯乱、胸痛、腎臓損傷および腎不全、視覚問題、およびレイノー現象（血液循環（特に、指、つま先、鼻、および耳）の減少が挙げられる）を引き起こす多発性骨髄腫における過粘稠血症候群に関与している。低温条件下で血中のＭタンパク質が粒子を形成する場合に、クリオグロブリン血症が起こる。これらの粒子は、微小血管を遮断し、そして寒冷気候において痛みならびにつま先、指、および他の末端のしびれを引き起こし得る。染色体欠失、β−２ミクログロブリンのレベルの上昇、血清クレアチニンレベル、およびＩｇＡイソタイプ化（ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ）のような予後指標もまた、研究されている。非特許文献５。
ＣＳ１（ＳＬＡＭＦ７，１９Ａ；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿０２１１８１．３、非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８を参照のこと）は、免疫グロブリンスーパーファミリーのＣＤ２サブセットのメンバーである。ＣＤ２ファミリーの分子は、リンパ球の同時活性化、増殖、分化、および付着、ならびに免疫グロブリン分泌、サイトカイン産生、およびＮＫ細胞の細胞傷害性のような広範な免疫調節性機能に関与する。ＣＤ２、ＣＤ５８、およびＣＤ１５０のようなＣＤ２ファミリーのいくつかのメンバーは、乾癬、慢性関節リウマチ、および多発性硬化症のような多くの自己免疫疾患および炎症性疾患において役割を果たすか、または役割を果たすことが提唱されてきた。
ＣＳ１（ＣＲＡＣＣ、１９Ａ、ＡＰＥＸ−１、およびＦＯＡＰ１２としても公知）は、Ｂｏｌｅｓ，Ｋ．ら（非特許文献９を参照のこと）によって単離され、そしてクローニングされた。ＣＳ１がＮＫ細胞媒介性細胞傷害およびリンパ球の付着において役割を果たすことが報告されている（非特許文献１０；非特許文献８）。
特許文献１は、ＡＰＥＸ−１に対するモノクローナル抗体および産生されたＡＰＥＸ−１の組換え細胞外ドメインを検出するためのそのモノクローナル抗体の使用を開示する。特許文献２は、ＣＳ１に結合して、ＮＫ細胞の活性化をもたらすナチュラルキラー細胞表面受容体のペプチドに対するモノクローナル抗体を開示している。これらの出願は、本明細書において、その全体が参考として援用される。しかし、Ｂ細胞による免疫グロブリン産生、および／または骨髄腫の増殖および／または発生を阻害することができる抗体は、上記で引用された刊行物では開発も開示もされていない。また、自己免疫疾患または癌においてＣＳ−１が過剰発現している証拠も、上記で引用された刊行物では開発も開示もされていない。
国際公開第０１／４６２６０号パンフレット 米国特許出願公開第２００３／０１１３３３２号明細書 Ｎｉ，Ｊ．ら、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙ ｉｎ Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｈｅｒｉｔａｂｌｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６年、第１６９巻、ｐ．７−１５ Ｏｇｕｒａ，Ｙ．ら、「Ａ ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ＮＯＤ２ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ Ｃｒｏｈｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｎａｔｕｒｅ、２００１年、第４１１巻、ｐ．６０３−６０６ Ｒｕｉｚ−Ａｒｕｇｅｌｌｅｓ ＧＪおよびＳａｎ Ｍｉｇｕｅｌ ＪＦ、「Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ」、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．，１９９４年、第６９巻、ｐ．６８４−９０ Ｌｅｏ Ｒら、「Ｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌｓ」、Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１９９２年、第６４巻、ｐ．１３２−９ Ｔｒｉｃｏｔ Ｇら、「Ｐｏｏｒ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ」、Ｂｌｏｏｄ、１９９５年、第８６巻、ｐ．４２５０−２ ＢｏｌｅｓおよびＭａｔｈｅｗ、「Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ」、２００１年、第５２巻、ｐ．３０２−３０７ Ｂｏｕｃｈｏｎら、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、２００１年、第１６７巻、ｐ．５５１７−５５２１ Ｍｕｒｐｈｙら、「Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．」、２００２年、第３６１巻、ｐ．４３１−４３６ Ｂｏｌｅｓ，Ｋ．ら、「Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ」、２００１年、第５２巻、ｐ．３０２−３０７ Ｂｏｕｃｈｏｎ，Ａ．ら、「Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ．」、２００１年、ｐ．５５１７−５５２１
標的および診断マーカーの可能性があるものを同定するために、疾病状態における新規なタンパク質および化合物の役割を明らかにすることは、ＩＢＤ、ＳＬＥ、ＲＡおよび骨髄腫に苦しむ患者を含む、自己免疫および癌の患者の現行の処置法を改善するために望ましい。したがって、本明細書において提供されるのは、これらの病気、特にＣＳ１を処置および診断するための分子標的である。また、本明細書において提供されるのは、抗ＣＳ１抗体のような中和抗体を含む、ＣＳ１に結合して、これを中和するアンタゴニストである。
（発明の概要）
本発明は、Ｌｕｃ９０によって認識されるヒトＣＳ１エピトープに結合する抗体または抗原結合フラグメントを提供する。Ｌｕｃ９０、ならびに、同じエピトープを共有する、Ｌｕｃ３４、Ｌｕｃ６９およびＬｕｃＸを含むその他の抗体は、免疫グロブリンの分泌およびＣＳ１発現細胞の死滅を阻害する能力がある。
本発明は、また、Ｌｕｃ６３によって認識されるヒトＣＳ１エピトープに結合する抗体または抗原結合フラグメントを提供する。Ｌｕｃ６３、ならびに、同じエピトープを共有する、Ｌｕｃ４、Ｌｕｃ１２、Ｌｕｃ２３、Ｌｕｃ２９、Ｌｕｃ３２、およびＬｕｃ３７などその他の抗体は、免疫グロブリンの分泌およびＣＳ１発現細胞の死滅を阻害する能力がある。
本発明は、さらに、ＣＳ１を発現する細胞に対する細胞傷害性効果を誘発するか、または、ＣＳ１を発現する細胞のＡＤＣＣ媒介性細胞傷害性を含む、免疫細胞によって媒介される細胞傷害性を促進する抗体または抗原結合フラグメントを提供する。
本発明は、さらに、細胞を有効量の抗ＣＳ１抗体に接触させる工程を包含する、ＣＳ１発現細胞を死滅させる方法を提供する。ＣＳ１発現細胞には、例えば多発性骨髄腫に由来する形質細胞癌細胞、および、例えば慢性リンパ球性白血病に由来する非形質細胞癌細胞などがある。さらに、ＣＳ１発現細胞には、活性化Ｂ細胞または活性化Ｔ細胞の白血球、およびＳＬＥおよび慢性関節リウマチを患っている患者からの白血球が含まれる。
本発明は、さらに、形質細胞性癌、ＳＬＥ、慢性関節リウマチ、または炎症性腸疾患を患う個体を処置する方法を提供する。
（発明の詳細な説明）
本発明は、血小板、赤血球、内皮細胞（ＨｕＶＥＣ）、腎臓細胞、気管支気道細胞、末梢気道細胞、前立腺細胞、肝細胞、または胸部細胞上では有意なＣＳ１タンパク質発現が検出されないという本発明者らの発見に一部分基づいている。ＣＳ１発現はリンパ特異的で、多発性骨髄腫患者および形質細胞性白血病患者を含む患者の細胞上で検出される。発現は、形質細胞上でのみ検出され、骨髄試料の他の細胞型では有意なレベルで検出することはできない。したがって、本発明は、骨髄腫、多発性骨髄腫、骨の「孤立性」骨髄腫、髄外性形質細胞腫、形質細胞性白血病、マクログロブリン血症（ヴァルデンストレームマクログロブリン血症を含む）、重鎖病、原発性アミロイドーシス、および意味不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）を含む形質細胞新生物が挙げられるが、これに限定されない癌を処置するための治療薬剤として抗ＣＳ１抗体を使用することの実現可能性を実証したものである。また、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を含む、免疫グロブリンの発現上昇に関連する非形質細胞性新生物も、抗ＣＳ１療法による恩恵を受ける。
さらに、以前の研究によって、ＣＳ１タンパク質は、インビトロでＰＷＭ（ヤマゴボウマイトジェン）によって活性化された末梢血Ｂ細胞、記憶／エフェクター対ナイーブ末梢血ＢおよびＴリンパ球のサブセット、または末梢血のＣＤ１４＋単球／マクロファージで発現されることが明らかにされた。また、以前の研究では、免疫グロブリン産生におけるＣＳ１の役割は明らかになっていない。その結果、ＣＳ１と自己免疫疾患との間の相関関係はこれまで確認されていない。また、本発明は、ＣＳ１のＲＮＡおよびタンパク質発現が、自己抗体産生に関与し、自己免疫疾患の発症に重要な役割を果たすと考えられている細胞サブセットである、活性化された末梢血Ｂ細胞において強力に上方制御されているという本発明者らの発見にも一部分基づいている。さらに、本発明によって、ＳＬＥ患者の末梢血Ｂリンパ球におけるＣＳ１ ＲＮＡの発現が、ＩＢＤに苦しむ患者におけると同様、同年齢の健康な成人のＢ細胞と比較して高いことが明らかにされている。本発明は、ＣＳ−１が関節リウマチ（ＲＡ）滑膜中の湿潤性形質細胞上で発現されることを明らかにしている。本発明は、ＣＳ１が抗体産生に関与していること、および、ＣＳ１に対する抗体が、健康な成人および狼瘡患者のＢ細胞によって分泌されるＩｇＭおよびＩｇＧを減少させることも明らかにしている。次に、本発明のデータは、ＣＳ１が、自己免疫疾患、特に、ＳＬＥ、ＩＢＤ、およびＲＡの成立に重要な役割を果たしていることを示唆している。寒冷凝集素症、免疫性水疱症（水疱性類天疱瘡、天疱瘡、疱疹状皮膚炎、線状ＩｇＡ症、および後天性表皮水疱症を含む）、混合型クリオグロブリン血症、高ガンマグロブリン血症、シェーグレン症候群、自己免疫性貧血、ぜんそく、重症筋無力症、多発性硬化症、心筋または心膜の炎症、アトピー性皮膚炎、乾癬、粘液水腫性苔癬、およびゴーシェ病を含む、免疫グロブリン、Ｂ細胞、および／またはＢ細胞産物の増加に関連するその他の疾患も、抗ＣＳ１処置から利益を受ける。
さらに、骨髄腫および形質細胞性白血病を含む自己免疫疾患および形質細胞癌を処置するために抗ＣＳ１抗体を用いることの実現可能性を調べるための研究はこれまで行われてこなかった。理想的な治療用抗体は、主に標的細胞に結合しなければならない。別の細胞や組織に結合すると、それらの細胞や組織に潜在的損傷をもたらし、および／または治療用抗体を枯渇させて、所望の処置効果を達成するためには、過剰量の抗体を患者に送達することが必要となる可能性がある。より重要なのは、血小板に結合する抗体には、例えば、血小板活性化（過剰な凝固をもたらす可能性がある）、または血小板減少（血液凝固ができなくなる可能性がある）などの副作用があるかもしれないことである。したがって、抗体が多様な細胞や組織に結合する場合、特に、血小板に結合する場合には、通常、その抗体を治療薬剤として使用するのは適当ではない。本発明は、血小板、赤血球、ＨｕＶＥＣ、腎臓細胞、気管支気道細胞、小気道細胞、前立腺細胞、肝細胞および胸部細胞の上では有意なＣＳ１タンパク質発現が検出されないという本発明者らの発見に一部分基づいている。したがって、本発明は、自己免疫疾患、および骨髄腫および形質細胞性白血病を含む形質細胞癌を処置するための治療薬剤として抗ＣＳ１抗体を使用することの実現可能性を実証した。
したがって、本発明は、ＣＳ１に結合するアンタゴニストに関する。このような実施形態の例示的実施形態には、中和抗ＣＳ１抗体および抗体フラグメントが含まれる。これらの抗体は、ＣＳ１の少なくとも１つの生物活性を中和する。これらの抗体は、ＣＳ１に結合し、そして（ａ）リンパ球による免疫グロブリンの分泌および／または産生を阻害すること、および（ｂ）ＣＳ１を発現する細胞の溶解を誘導することからなる群より選択される１つ以上の活性の能力をもつ。
上記に概説した目的に従って、本発明は、例えば自己免疫疾患などのさまざまな疾患、およびさまざまな型の骨髄腫を含む、さまざまな規定の癌症状を処置するための新規の方法を提供する。また、そのような疾患を診断および予後評価する方法、およびそのような症状を調節する組成物をスクリーニングする方法も提供する。本発明は、例えば上記疾患において選択的に発現されるマーカーのモニタリングおよびスクリーニングを含むような処置の治療効果をモニターする方法も提供する。
特に、ＳＬＥ、ＲＡ、およびＩＢＤなどの自己免疫疾患、ならびに骨髄腫および形質細胞性白血病などの癌症状において選択的に発現されるマーカーを同定することによって、その発現を診断、予後、または治療の方法に利用することが可能になる。そのため、本発明は、それらマーカーを選択的に同定するのに有用なさまざまな組成物（例えば核酸、ポリペプチド、抗体、および低分子アゴニスト／アンタゴニスト）を定義する。それらマーカーは、実際には非常に異なった処置を必要とする可能性がある疾患のサブセットを分子的に特徴付けるのに有用であり得る。さらに、それらマーカーは、自己免疫疾患、骨髄腫、および形質細胞性白血病に関連した病気、例えば、そのような症状におけると同様の組織に感染する病気、または類似した誘導／維持機構をもつ病気においても重要である。例えば、腫瘍の過程または特徴も標的とすることができる。診断的および予後的な用途は、例えば、サブセットに関連するが別の病気に対して、自己免疫疾患、骨髄腫および形質細胞性白血病のステージを見分けるため、またはそのような症状の治療対策を決定するために利用可能にされる。検出方法は、核酸に基づき得る（例えばＰＣＲもしくハイブリダイゼーション技術）か、またはタンパク質に基づき得る（例えばＥＬＩＳＡ、画像化、ＩＨＣなど）。診断は、定性的でも定量的でもよく、発現レベルの上昇または低下を検出することができる。
（定義）
用語「ＣＳ１タンパク質」または「ＣＳ１ポリヌクレオチド」または「ＣＳ１関連転写物」は：（１）ＣＳ１遺伝子（表２）のヌクレオチド配列またはこれと会合（ＣＳ１遺伝子（表２）のヌクレオチド配列またはこれと会合するヌクレオチド配列およびその保存的に改変された改変体によってコードされるアミノ酸配列を含む免疫原に対して惹起された結合パートナー（例えば、ポリクローナル抗体）へのＣＳ１遺伝子（表２）の結合）するヌクレオチド配列に対して、好ましくは少なくとも約２５、５０、１００、２００、５００、１０００、またはそれより多いヌクレオチドの領域にわたって約６０％より大きい（６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％）ヌクレオチド配列の同一性を有し、好ましくは約９２％、９４％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより大きいヌクレオチド配列の同一性を有し；（３）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＣＳ１（表２）およびその保存的に改変された改変体の核酸配列またはその相補体と特異的にハイブリダイズするか；あるいは（４）ＣＳ１遺伝子（表２）のヌクレオチド配列もしくはこれと会合するヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列に対して、好ましくは少なくとも約２５、５０、１００、２００、５００、１０００、またはそれより多いアミノ酸の領域にわたって約６０％より大きい（６５％、７０％、７５％、８０％、８５％）アミノ酸配列の同一性を有し、好ましくは９０％、９１％、９３％、９５％、９７％、９８％、９９％、またはそれより大きいアミノ酸配列の同一性を有する、核酸ならびにポリペプチドの多型改変体、アレル、変異体、および種間のホモログをいう。ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、代表的には、哺乳動物に由来し、この哺乳動物としては、霊長類（例えば、ヒト）、げっ歯類（例えば、ラット、マウス、ハムスター）、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、または他の哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない。「ＣＳ１ポリペプチド」および「ＣＳ１ポリヌクレオチド」は、天然に存在する形態または組換え形態の両方を含む。
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 「全長」ＣＳ１タンパク質または「全長」ＣＳ１核酸は、通常、１つ以上の天然に存在する野生型ＣＳ１ポリヌクレオチド配列または野生型ＣＳ１ポリペプチド配列中に含まれるエレメントを含む、ＣＳ１ポリペプチド配列もしくはＣＳ１ポリヌクレオチド配列、またはそれらの改変体をいう。「全長」は、選択的スプライシングを含む翻訳後のプロセシングもしくは翻訳後のスプライシングの種々の段階の前、またはその後であり得る。
本明細書中で使用される場合、「生物学的サンプル」は、例えば、ＣＳ１タンパク質、ＣＳ１ポリヌクレオチド、またはＣＳ１転写物の核酸またはポリペプチドを含む生物学的組織または生物学的流体のサンプルである。このようなサンプルとしては、霊長類（例えば、ヒト）またはげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）から単離された組織が挙げられるが、これらに限定されない。生物学的サンプルとしてはまた、生検サンプルおよび剖検サンプルのような組織の切片、組織学的目的のために採取した凍結切片、記録用サンプル、血液、血漿、血清、痰、糞、涙、粘液、毛髪、皮膚などが挙げられ得る。生物学的サンプルとしてはまた、外植片ならびに患者の組織由来の初代細胞培養物および／または形質転換細胞培養物が挙げられる。生物学的サンプルは、代表的に、真核生物（最もの好ましくは、霊長類（例えば、チンパンジーまたはヒト）、ウシ、イヌ、ネコ、げっ歯類（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ）のような哺乳動物、またはトリ、爬虫類、または魚類）の生物体から得られる。家畜およびペットも目的とする。
「生物学的サンプルの提供」は、本発明に記載される方法で使用するための生物学的サンプルを得ることを意味する。ほとんどの場合、これは、動物からの細胞サンプルの取出しによって行われるが、予め単離された（例えば、別のヒトによって、別の時間にて、そして／または別の目的のために単離された）細胞を使用すること、またはインビボで本発明を実施することによっても達成され得る。処置または結果の履歴を有する記録用の組織または材料は、特に有用である。
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈における、用語「同一」または「同一性」の％は、例えば、下記の初期設定のパラメータを使用したＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを使用するか、手動のアラインメントおよび目視検査によって測定された場合、同一であるか、または特定の％でアミノ酸残基またはヌクレオチドと同一である（例えば、比較ウインドウまたは指定された領域において最大限に一致するように比較および整列を行った場合に、特定の領域について約７０％の同一性、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９３％、９５％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の同一性である）２つ以上の配列または部分配列をいう。以下、このような配列を、「実質的に同一」であるという。この定義はまた、試験配列の相補体をいうか、またはこれに適用され得る。この定義はまた、欠失および／または挿入、置換、ならびに天然に存在する改変体（例えば、多型またはアレル改変体）、および人為的な改変体を含む。下記のように、好ましいアルゴリズムは、ギャップなどを説明し得る。好ましくは、同一性は、少なくとも約２５アミノ酸長または２５ヌクレオチド長である領域、より好ましくは約５０〜１００アミノ酸長または約５０〜１００ヌクレオチド長の領域にわたって存在する。
配列比較のために、代表的には、１つの配列は、参照配列として機能し、この参照配列は、試験配列と比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列は、コンピュータに入力され、部分配列の座標が指定され、そして必要な場合には、配列アルゴリズムのプログラムパラメータが指定される。好ましくは、初期設定のプログラムパラメータが使用されても、代替的なパラメータが指定されてもよい。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性の％を計算する。
本明細書中で使用される場合、「比較ウインドウ」は、２つの配列が最適に整列された後に、ある配列が参照配列の同数の連続する位置と比較され得る、代表的に、約２０〜６００、通常は約５０〜２００、より通常には約１００〜１５０からなる群より選択される連続する位置のセグメントに対する参照を含む。比較のための配列のアラインメントに関する方法は、周知である。比較のための最適な配列のアラインメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９の局所相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３の相同性アラインメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４−２４４８の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または手動のアラインメントおよび目視検査（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、（１９９５年および補遺）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｗｉｌｅｙを参照のこと）によって行われ得る。
配列同一性の％および配列類似性の％を決定するのに適したアルゴリズムの好ましい例としては、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載される、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが挙げられる。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、本発明の核酸およびタンパク質の配列同一性の％を決定するために、本明細書中に記載されるパラメータと共に使用される。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列された場合に、いくつかの正の値の閾値スコアＴに適合するか、またはこれを満たす、クエリー配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、最初に高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定する工程を包含する。Ｔは、隣接するワードのスコア閾値をいう（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，前出）。これらの最初の隣接ワードヒットは、これらを含むより長いＨＳＰを見出す検索を開始するためのシードとして機能する。このワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加され得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、例えば、ヌクレオチド配列に対してはパラメータＭ（一致する残基の対についてのリワードスコア（ｒｅｗａｒｄ ｓｃｏｒｅ）；常に＞０）およびＮ（ミスマッチの残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスが使用されて、累積スコアが計算される。各方向におけるワードヒットの伸長は、以下の場合に中止される：累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘに低下した場合；１つ以上の負のスコアリング残基アラインメントの蓄積に起因して累積スコアが０以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、初期設定として、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列では、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期設定として、３のワード長、１０の期待値（Ｅ）、ならびに５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−９１９を参照のこと）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計的分析を行う。例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７を参照のこと。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの基準は、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する最小確率和（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））である。例えば、核酸は、試験核酸と基準核酸との比較における最小確率和が約０．２未満であり、より好ましくは約０．０１未満であり、最も好ましくは約０．００１未満である場合に、参照配列に類似すると見なされる。Ｌｏｇ値は、負の大きな数（例えば、５、１０、２０、３０、４０、４０、７０、９０、１１０、１５０、１７０など）であり得る。
２つの核酸配列が実質的に同一であることの指標は、第１の核酸によってコードされたポリペプチドが、第２の核酸によってコードされたポリペプチドに対して惹起された抗体と免疫学的に交差反応性であることである。したがって、ポリペプチドは、代表的に、例えば、２つのペプチドが保存的な置換によってのみ異なる場合、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、２つの分子またはその相補体がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であることのなお別の指標は、同じプライマーを使用してこれらの配列が増幅され得ることである。
「宿主細胞」は、発現ベクターを含み、そして発現ベクターの複製または発現を支持する天然に存在する細胞または形質転換細胞である。宿主細胞は、培養細胞、外植片、およびインビボの細胞などであり得る。宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉのような原核細胞、酵母、昆虫、両生類のような真核細胞、またはＣＨＯ、ＨｅＬａおよび黒色腫のような哺乳動物細胞であり得る（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｃａｔａｌｏｇまたはウェブサイトを参照のこと）。
用語「単離」、「精製」、または「生物学的に純粋」とは、ネイティブな状態において見出されるように、その材料に通常は伴う成分を実質的にか、または本質的に含まない物質をいう。純度および均一性は、代表的に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーのような分析化学的技術を使用して決定される。調製物中に存在する優勢な種であるタンパク質または核酸は、実質的に精製される。特に、単離核酸は、天然にこの遺伝子に隣接し、そしてこの遺伝子によってコードされるタンパク質以外のタンパク質をコードするいくつかのオープンリーディングフレームから分離される。いくつかの実施形態において、用語「精製」は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルに本質的に１つのバンドを生じることを示す。好ましくは、このことは、核酸またはタンパク質が、少なくとも約８５％の純度、より好ましくは少なくとも９５％の純度、最も好ましくは少なくとも９９％の純度であることを意味する。他の実施形態において、「純度」または「精製」は、精製される組成物からの少なくとも１種の夾雑物または成分の除去を意味する。この意味において、精製は、精製された化合物が均一（例えば、１００％の純度）であることを必要としない。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーをいうために、本明細書中で交換可能に使用される。この用語は、１個以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃ）であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマー、改変された残基を含むもの、および天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用する。
用語「アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸ならびに天然に存在するアミノ酸と同様に機能する、アミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物をいう。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、および後に改変されるアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリン）である。アミノ酸アナログは、天然に存在するアミノ酸（と基本的化学構造例えば、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）に結合されるα炭素）と基本化学構造が同一である化合物をいう。このようなアナログは、改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または改変されたペプチド骨格を有し得るが、天然に存在するアミノ酸のようなある程度の基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣物とは、あるアミノ酸の一般的な化学構造と異なるが、別のアミノ酸と同様に機能する構造を有する化学化合物をいう。
本明細書中で、アミノ酸は、その一般的に公知の三文字表記のいずれか、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｎｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎが推奨する一文字表記のいずれかによって称される。同様に、ヌクレオチドは、一般に受け入れられている一文字表記によって称され得る。
「保存的に改変された改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一であるか、または関連した（例えば、天然に隣接する）配列をいう。遺伝暗号の縮重に起因して、非常に多くの機能的に同一の核酸は、ほとんどのタンパク質をコードする。例えば、これらのＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵは、それぞれ、アミノ酸であるアラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって特定される各位置において、コドンは、コードされるポリペプチドを変更することなく、記載される対応する別のコドンに変更され得る。このような核酸のバリエーションは、「サイレントバリエーション（ｓｉｌｅｎｔ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）」であり、保存的に改変されたバリエーションの１種である。ポリペプチドをコードする本明細書中に記載の各核酸配列はまた、核酸のサイレントバリエーションを記載する。特定の文脈において、核酸中の各コドン（通常メチオニンについてのみのコドンであるＡＵＧおよび通常トリプトファンについてのみのコドンであるＴＧＧを除く）は、機能的に類似する分子が得られるように改変され得る。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のサイレントバリエーションは、発現産物に対しては記載される配列中に暗示的にあるが、必ずしも実際のプローブ配列に対してあるわけではない。
アミノ酸配列に関して、当業者は、コード配列中の単一のアミノ酸または少数の％のアミノ酸を変更するか、付加するか、もしくは欠失する核酸配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列、もしくはタンパク質配列の個々の置換、欠失、または付加が、これらの変化が化学的に類似するアミノ酸によるアミノ酸の置換を生じる場合に、「保存的に改変された改変体」であることを認識する。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は周知である。このような保存的に改変された改変体は、本発明の多型改変体、種間のホモログ、およびアレルに加えられ、これらを除外しない。代表的には、保存的置換としては、以下の相互置換が挙げられる：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）シトシン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、（１９８４）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｆｒｅｅｍａｎを参照のこと）。
ポリペプチド構造のような高分子構造は、種々の組織化のレベルに関して記載され得る。この組織化の一般的考察については、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓら編、（２００１）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ（第４版）、Ｇａｒｌａｎｄ；ならびにＣａｎｔｏｒおよびＳｃｈｉｍｍｅｌ、（１９８０）、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｐａｒｔ Ｉ：Ｔｈｅ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ Ｆｒｅｅｍａｎを参照のこと。「一次構造」とは、特定のペプチドのアミノ酸配列をいう。「二次構造」とは、ポリペプチド内の局所的に順序立てられた三次元構造をいう。これらの構造は、一般的に、ドメインとして公知である。ドメインは、多くの場合、ポリペプチドの小型ユニット（ｃｏｍｐａｃｔ ｕｎｉｔ）を形成し、そして代表的には、２５アミノ酸長〜約５００アミノ酸長である、ポリペプチドの部分である。代表的なドメインは、低組織化部分（例えば、β−シートおよびα−ヘリックスの伸び）から構成される。「三次構造」とは、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造をいう。「四次構造」とは、通常、独立した三次元ユニットの非共有結合による会合によって形成された三次元構造をいう。他の用語もまた、汎用される用語として公知である。
本明細書中で使用される、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、もしくは「ポリヌクレオチド」、または文法上の等価物は、少なくとも２つの互いに共有結合したヌクレオチドを意味する。オリゴヌクレオチドは、代表的に、約５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２５、３０、４０、５０、またはそれ以上のヌクレオチド長から約１００ヌクレオチド長までである。核酸およびポリヌクレオチドは、より長い長さ（例えば、２００、３００、５００、１０００、２０００、３０００、５０００、７０００、１０，０００など）を含む、任意の長さのポリマーである。本発明の核酸は、一般的に、ホスホジエステル結合を含むが、いくつかの場合において、少なくとも１つの異なる結合（例えば、ホスホラミデート結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、またはＯ−メチルホスホロアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、（１９９２）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓを参照のこと））；ならびにペプチド核酸骨格およびペプチド核酸結合を有し得る核酸アナログが含まれる。他の核酸のアナログとしては、正の骨格（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｋｂｏｎｅ）、非イオン性骨格、および非リボース骨格を有するアナログが挙げられる（米国特許第５，２３５，０３３号および同第５，０３４，５０６号、ならびにＳａｎｇｈｖｉおよびＣｏｏｋ編、（１９９４）、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０の第６章および第７章に記載のアナログが挙げられる）。１つ以上の炭素環式糖を含む核酸もまた、核酸の１つの定義に含まれる。リボース−ホスフェート骨格の改変は、種々の理由（例えば、生理学的環境下においてこのような分子の安定性および半減期を増加させるためか、またはバイオチップにおけるプローブとして）に起因してなされ得る。天然に存在する核酸と核酸アナログとの混合物が作製され得るか；あるいは、異なる核酸アナログと、天然に存在する核酸と核酸アナログとの混合物との混合物が作製され得る。
種々の参考文献は、このような核酸アナログを開示し、これらのアナログとしては、例えば、以下を有するものが挙げられる：ホスホラミデート結合（Ｂｅａｕｃａｇｅら、（１９９３）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９：１９２５−１９６３およびその参考文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ、（１９７０）、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００−３８０３；Ｓｐｒｉｎｚｌら、（１９７７）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９−５８９；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、（１９８６）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：３４８７−４９９；Ｓａｗａｉら、（１９８４）、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、（１９８８）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０−４４７１；ならびにＰａｕｗｅｌｓら、（１９８６）、Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃｒｉｐｔａ ２６：１４１−１４９）、ホスホロチオエート結合（Ｍａｇら、（１９９１）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：１４３７−４４１；および米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート結合（Ｂｒｉｌｌら、（１９８９）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３２１−２３２２）、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、（１９９２）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓを参照のこと）、ならびにペプチド核酸骨格および結合（Ｅｇｈｏｌｍ、（１９９２）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５−１８９７；Ｍｅｉｅｒら、（１９９２）、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８−１０１０；Ｎｉｅｌｓｅｎ、（１９９３）、Ｎａｔｕｒｅ ３６５：５６６−５６８；Ｃａｒｌｓｓｏｎら、（１９９６）、Ｎａｔｕｒｅ ３８０：２０７（これら全てが参考として援用される）を参照のこと）が含まれる。他のアナログ核酸には、正の骨格（Ｄｅｎｐｃｙら、（１９９５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：６０９７−１０１；非イオン性骨格（米国特許第５，３８６，０２３号，同第５，６３７，６８４号，同第５，６０２，２４０号，同第５，２１６，１４１号および同第４，４６９，８６３号；Ｋｉｅｄｒｏｗｓｋｉら、（１９９１）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ ３０：４２３−４２６；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、（１９８８）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０−４４７１；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、（１９９４）、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ １３：１５９７；ＳａｎｇｈｖｉおよびＣｏｏｋ編、（１９９４）、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０の第２章および第３章；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、（１９９４）、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５−３９８；Ｊｅｆｆｓら、（１９９４）、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ ３４：１７；Ｈｏｒｎら、（１９９６）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３７：７４３）、および非リボース骨格（米国特許第５，２３５，０３３号および同第５，０３４，５０６号ならびにＳａｎｇｈｖｉおよびＣｏｏｋ編、（１９９４）、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０の第６章およびに第７章に記載されるものが挙げられる）。１つ以上の炭素環式糖を含む核酸も核酸の１つの定義に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓら（１９９５）Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．ｐｐ １６９−１７６を参照のこと）。いくつかの核酸アナログは、Ｒａｗｌｓ、（１９９７年６月２日、３５ページ）、Ｃ＆Ｅ Ｎｅｗｓに記載されている。
ペプチド核酸アナログを含むペプチド核酸（ＰＮＡ）が特に好ましい。ペプチド核酸は、ペプチド結合によって結合した反復Ｎ−（２−アミノイエチル）−グリシン単位から作製された骨格を有する。異なる塩基（プリンおよびピリミジン）は、メチレンカルボニル結合によって骨格に連結される。これらの骨格は、天然に存在する核酸の高荷電ホスホジエステル骨格と比較して、中性条件下で実質的に非イオン性である。これにより、少なくとも２つの利点が得られる。ＰＮＡ骨格は、改善されたハイブリダイズ動態を示し、ＰＮＡ鎖とＤＮＡ鎖との間よりも強いＰＮＡ／ＤＮＡ鎖の間の結合を生じる。ＰＮＡは、ミスマッチと完全に一致した塩基対とでは融点（Ｔｍ）がより大きく異なる。ＤＮＡおよびＲＮＡは、代表的には、内部ミスマッチのためにＴｍは２〜４℃低下する。非イオン性ＰＮＡ骨格では、この低下は７〜９℃付近である。同様に、その非イオン性に起因して、これらの骨格に結合した塩基のハイブリダイゼーションは、塩濃度に対して、比較的、非感受性である。さらに、ＰＮＡは、細胞酵素によって分解されず、したがってより安定であり得る。
核酸は、規定されるように、一本鎖または二本鎖であり得るか、二本鎖配列または一本鎖配列の一部を含み得る。一本鎖の描写は相補鎖の配列も定義するので、本明細書中に記載の配列はまた配列の相補体を提供する。核酸は、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの両方）、ＲＮＡ、または核酸がデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの組み合わせ、ならびに塩基（ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンなどが含まれる）の組み合わせを含み得るハイブリッドであり得る。「転写物」は、代表的には、天然に存在するＲＮＡ（例えば、プレｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、またはｍＲＮＡ）をいう。本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオシド」は、ヌクレオチドならびにヌクレオシドおよびヌクレオチドのアナログ、ならびにアミノ改変ヌクレオシドのような改変ヌクレオシドを含む。さらに、「ヌクレオシド」には、天然に存在しないアナログ構造が含まれる。したがって、例えば、それぞれ塩基を含むペプチド核酸の個々の単位は、本明細書中においてヌクレオシドと称される。
「標識」または「検出可能な部分」は、顕微鏡手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、生理学的手段、化学的手段、または他の物理的手段によって検出可能な組成物である。一般的に、標識は、以下の３つのクラスに分類される：ａ）放射性同位体または重同位体であり得る同位体標識；ｂ）抗体、抗原、またはエピトープタグであり得る免疫標識；およびｃ）着色色素または蛍光色素。標識は、ＣＳ１の核酸、タンパク質、および抗体に組み込まれ得る。例えば、標識は、直接的かまたは間接的のいずれかで検出可能なシグナルを生成し得るべきである。これらの検出可能な部分は、放射性同位体（３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、または１２５Ｉなど）、高電子密度試薬、蛍光化合物もしくは化学発光化合物（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、またはルシフェリン）、または酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで一般的に使用されているもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテンおよびタンパク質、または検出可能にし得る他の実体（例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、または西洋ワサビペルオキシダーゼ）であり得る。抗体と標識とを結合体化する方法は公知である。例えば、Ｈｕｎｔｅｒら、（１９６２）、Ｎａｔｕｒｅ １４４：９４５；Ｄａｖｉｄら、（１９７４）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：１０１４−１０２１；Ｐａｉｎら、（１９８１）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９−２３０；およびＮｙｇｒｅｎ、（１９８２）、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３０：４０７−４１２を参照のこと。
「エフェクター」、「エフェクター部分」、または「エフェクター成分」は、抗体に対して、リンカーまたは化学結合を介して共有結合（連結または結合体化）されるか、イオン結合、ファンデルワールス結合、静電結合、または水素結合を介して非共有結合（連結または結合体化）される分子である。「エフェクター」は、例えば、放射性化合物、蛍光化合物、酵素もしくは基質、エピトープタグのようなタグ、毒素；活性化可能な部分、化学療法剤；リパーゼ；抗生物質；化学誘因部分、免疫調節物質（ｍｉｃＡ／Ｂ）、または例えば、「強力な（ｈａｒｄ）」β放射線を放射する放射性同位体が挙げられる検出部分を含む種々の分子であり得る。
「標識核酸プローブまたは標識オリゴヌクレオチド」は、プローブの存在がこのプローブに結合した標識の存在を検出することによって検出され得るように、例えば、リンカーもしくは化学結合を介して標識に共有結合されるか、イオン結合、ファンデルワールス結合、静電結合、または水素結合を介して標識に非共有結合されるものである。あるいは、高親和性相互作用を使用した方法により、結合パートナーの対の一方が他方（例えば、ビオチン、ストレプトアビジン）に結合する同一の結果を達成し得る。
本明細書中で使用される場合、「核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」は、１つ以上の化学結合の型を介して（通常は相補的な塩基対形成を介して（例えば、水素結合形成を介して））相補配列の標的核酸に結合し得る核酸である。本明細書中で使用される場合、プローブとしては、天然（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ）または改変塩基（７−デアザグアノシン、イノシンなど）が挙げられ得る。さらに、プローブ中の塩基は、ホスホジエステル結合以外の連結（好ましくは、ハイブリダイズを機能的に妨害しないもの）によって接続され得る。したがって、例えば、プローブは、構成塩基がホスホジエステル結合よりもむしろペプチド結合によって接続されるペプチド核酸であり得る。プローブは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存して、プローブ配列との完全な相補性を欠く標的配列と結合し得る。プローブは、好ましくは、例えば、同位体、発色団、ルミフォア、色原体で、直接的に標識されるか、または例えば、後にストレプトアビジン複合体が結合し得るビオチンで、間接的に標識される。プローブの有無についてのアッセイにより、選択した配列または部分配列の有無を検出し得る。診断または予後は、ゲノムレベルまたはＲＮＡもしくはタンパク質の発現レベルに基づき得る。
用語「組換え」は、例えば、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターに関して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが、異種の核酸もしくはタンパク質の導入またはネイティブな核酸もしくはタンパク質の変更によって改変されていること、あるいは細胞がこのようにして改変された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、天然（非組換え）形態の細胞内で見出されない遺伝子を発現するか、その他にネイティブな遺伝子を異常に発現するか、過小発現するか、または全く発現しない。本明細書中の用語「組換え核酸」は、一般的には核酸の操作（例えば、ポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを使用）により最初にインビトロで形成された、天然において通常では見出されない形態の核酸を意味する。この様式では、異なる配列の作動可能な連結が、行われる。したがって、直鎖形態の単離された核酸、または通常では接続されないＤＮＡ分子をライゲーションすることによってインビトロで形成された発現ベクターは、両方とも本発明の目的のための組換えと見なされる。一旦組換え核酸が作製され、そして宿主細胞または宿主生物に再導入されると、この核酸は、例えば、インビトロ操作よりもむしろインビボでの宿主細胞の細胞機構を使用して非組換え的に複製されるが、一旦組換えで生成されるが次いで非組換え的に複製されるこのような核酸はさらに、本発明の目的のための組換えと見なされることが理解される。
同様に、「組換えタンパク質」は、例えば、上記のような組換え核酸の発現による組換え技術を使用して作製されたタンパク質である。組換えタンパク質は、少なくとも１つ以上の特徴によって天然に存在するタンパク質と区別される。これらのタンパク質は、その野生型宿主中で通常は会合しているタンパク質および化合物のいくつかまたはほとんどからの単離または精製が可能であり、したがって実質的に純粋であり得る。単離されたタンパク質は、所与のサンプル中の総タンパク質の好ましくは少なくとも約０．５重量％、より好ましくは少なくとも約５重量％を構成するその天然状態で通常は会合している物質の少なくともいくつかを含んでいない。実質的に純粋なタンパク質は、総タンパク質の少なくとも約７５重量％を構成し、少なくとも約８０重量％が好ましく、少なくとも約９０重量％が特に好ましい。この定義は、異なる生物または宿主細胞におけるある生物由来のＣＳ１タンパク質の産生を含む。あるいは、これらのタンパク質は、タンパク質が増加した濃度レベルで作られるように、誘導プロモーターまたは高発現プロモーターの使用によって通常見られるよりもかなり高い濃度で作製され得る。あるいは、以下で議論されるように、タンパク質は、エピトープタグの付加またはアミノ酸の置換、挿入、および欠失があるように、通常は天然で見出されない形態であり得る。
核酸の一部に関して使用される場合、用語「異種」は、核酸が、天然において互いに同一の関係で通常は見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、この核酸は、代表的に、組換え的に生成され、新規の機能的核酸を作製するために配列された無関係の遺伝子からの２つ以上の配列（例えば、ある供給源由来のプロモーターおよび別の供給源由来のコード領域）を有する。同様に、異種タンパク質とは、多くの場合、天然において互いに同一の関係で見出されない２つ以上の部分配列（例えば、融合タンパク質）をいう。
「プロモーター」は、代表的には、核酸の転写を導く核酸制御配列のアレイである。本明細書中で使用される場合、「プロモーター」は、転写開始部位付近の必要な核酸配列（例えば、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合、ＴＡＴＡエレメント）を含む。プロモーターはまた、必要に応じて、転写開始部位から数千塩基対も離れて存在することができる遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含む。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境条件および発生条件下で活性なプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境的調節または発生調節下で活性である。用語「作動可能に連結された」とは、核酸発現制御配列（プロモーターまたは転写因子結合部位のアレイなど）と第２の核酸配列との間の機能的結合をいい、例えば、この発現制御配列は、この第２の配列に対応する核酸の転写を導く。
「発現ベクター」は、宿主細胞中で特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを有する組換えまたは合成によって生成された核酸構築物である。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、または核酸フラグメントの一部であり得る。代表的に、発現ベクターは、プロモーターに作動可能に連結された転写されるべき核酸を含む。
語句「と選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」とは、配列が複合混合物（例えば、全細胞またはライブラリーＤＮＡもしくはライブラリーＲＮＡ）中に存在する場合のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での特定のヌクレオチド配列への選択的な分子の結合、二重鎖形成、またはハイブリダイズをいう。
語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブが、代表的には核酸の複合混合物中で、その標的部分配列とハイブリダイズするが他の配列とはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる環境下では異なる。より長い配列は、より高い温度にて特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ、（１９９３）、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（第２４巻）Ｅｌｓｅｖｉｅｒの「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ」に見出される。一般的に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度、ｐＨにおける特定の配列についての融点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低く選択される。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする（定義されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度での）温度である（標的配列が過剰に存在する場合、Ｔｍでは、５０％のプローブが、平衡状態で占有される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３において約１．０Ｍ未満のナトリウムイオンであり、代表的には約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、そして温度が、短いプローブ（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）に対しては少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば、約５０ヌクレオチド超）に対しては少なくとも約+６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような脱安定剤（ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）の添加によって達成され得る。選択的ハイブリダイゼーションまたは特異的ハイブリダイゼーションのために、正のシグナルは、代表的に、バックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、以下のとおりであり得る：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％のＳＤＳ（４２℃でインキュベーション）または５×ＳＳＣ、１％のＳＤＳ（６５℃でインキュベーション）ならびに６５℃にて０．２×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳでの洗浄。ＰＣＲについて、約３６℃が低いストリンジェンシーの増幅に対しては代表的であるが、アニーリング温度はプライマーの長さに依存して約３２℃〜４８℃の間で変化し得る。高いストリンジェンシーのＰＣＲ増幅について、約６２℃が代表的であるが、高ストリンジェンシーのアニーリング温度は、プライマーの長さおよび特異性に依存して約５０℃〜６５℃の範囲であり得る。高いストリンジェンシーの増幅または低いストリンジェンシーの増幅のための代表的なサイクル条件は、９０℃〜９５℃で３０〜１２０秒の変性段階、３０秒間〜１２０秒間持続するアニーリング段階、および約７２℃で１〜２分間の伸長段階を含む。低いストリンジェンシーの増幅反応および高いストリンジェンシーの増幅反応についてのプロトコールおよび指針は、例えば、Ｉｎｎｉｓら、（１９９０）、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹに提供されている。
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、これらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合、なお実質的に同一である。このことは、例えば、核酸のコピーが遺伝暗号によって許容される最大限のコドン縮重を使用して作製される場合に起こる。このような場合、核酸は、代表的には中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の例としては、３７℃における４０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳの緩衝液中でのハイブリダイゼーションおよび４５℃における１×ＳＳＣでの洗浄が挙げられる。正のハイブリダイゼーションは、代表的に、バックグラウンドの少なくとも２倍である。代替的なハイブリダイゼーション条件および洗浄条件が利用されて、類似するストリンジェンシーの条件が提供され得る。ハイブリダイゼーションのパラメータを決定するためのさらなる指針は、多くの参考文献（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、（１９９１および補遺）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｗｉｌｅｙ）に提供されている。
語句「細胞形態学の変化」または「細胞の特徴の変化」とは、インビトロまたはインビボでの細胞の形態学または増殖特性の任意の変化（例えば、細胞の生存度、細胞増殖、成長因子もしくはケモカイン因子の分泌、細胞形態学の変化、炎症特異的マーカーの増加もしくは喪失、適切な動物宿主に注射した場合の炎症の誘導もしくは抑制能力、および／または適切な宿主における疾患状態（例えば、自己免疫障害および癌性の状態）の誘導）をいう。例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、（１９９４）、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（第２版）Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓのｐｐ．２３１−２４１を参照のこと。
「疾患細胞」とは、新規の遺伝物質の取り込みを必ずしも含まない自発的または誘導性の表現型の変化をいう。例えば、骨髄腫形成は、形質転換ウイルスの感染および新規のゲノムＤＮＡの組み込みまたは外来ＤＮＡの取り込みによって引き起こされ得るが、骨髄腫形成はまた、自発的に生じるかまたは薬剤への曝露後に生じ、それにより既存遺伝子の発現または変化を誘導し得る。腫瘍増殖は、形態学的変化、異常な細胞増殖、および／または非形態学的変化のような、表現型およびタンパク質発現の変化に関連する。Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、（２０００）、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（第４版）Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓを参照のこと。同様に、自己免疫疾患プロセスの影響を受けた細胞もまた、表現型およびタンパク質発現の変化に関連する。
分子、抗体、薬物、薬学的に活性な薬剤、または薬学的処方物の「有効」量は、分子、抗体、薬物、薬剤、または処方物の所望の効果を提供するのに十分な量を意味する。
「被験体」または「患者」は、本明細書中で交換可能に使用され、これらは、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトをいう。
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」または「免疫グロブリン」とは、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる１つ以上のポリペプチドからなるタンパク質をいう。認識されている免疫グロブリン遺伝子としては、κ定常領域遺伝子、λ定常領域遺伝子、α定常領域遺伝子、γ定常領域遺伝子（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、δ定常領域遺伝子、ε定常領域遺伝子、およびμ定常領域遺伝子ならびに無数の免疫グロブリン可変Ｖ領域遺伝子（下に示すように、Ｈ（重）およびＬ（軽）鎖の両方にＶ遺伝子は存在する）が挙げられる。全長免疫グロブリン「軽鎖」（約２５Ｋｄまたは２１４アミノ酸）は、ＮＨ２末端（約１１０アミノ酸）にて可変領域遺伝子（Ｖ−κまたはＶ−λ）、そしてＣＯＯＨ末端にてκ定常領域遺伝子またはλ定常領域遺伝子によってそれぞれコードされる。全長免疫グロブリン「重鎖」（約５０Ｋｄまたは４４６アミノ酸）は、同様に、可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸）および他の上記の定常領域遺伝子の１つ（例えば、γ（約３３０アミノ酸をコードする））によってコードされる。
免疫グロブリンの１つの形態は、抗体の基本構造単位を構成する。この形態は四量体であり、免疫グロブリン鎖の２つの同一の対（各対は１つの軽鎖および１つの重鎖を有する）からなる。各対では、軽鎖および重鎖の可変領域は一緒になって抗原への結合を担い、これらの定常領域は抗体エフェクター機能を担う。四量体抗体に加えて、免疫グロブリンは、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、および（Ｆａｂ’）２ならびに二機能性ハイブリッド抗体（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７、１０５（１９８７））および一本鎖（例えば、Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５、５８７９−５８８３（１９８８）およびＢｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２、４２３−４２６（１９８８）（本明細書中で参考として援用される））が挙げられる種々の他の形態で存在し得る。（一般的に、Ｈｏｏｄら、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｂｅｎｊａｍｉｎ、Ｎ．Ｙ．，第２版（１９８４）、ならびにＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒおよびＨｏｏｄ、Ｎａｔｕｒｅ、３２３、１５−１６（１９８６）（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
免疫グロブリンの軽鎖または重鎖の可変領域は、３つの超可変領域によって中断されている、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる「フレームワーク」領域からなる。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は、正確に規定されている（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｅ．Ｋａｂａｔら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９８３）を参照；これは、本明細書において参考として援用される）。さまざまな軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、一つの種内で比較的保存されている。本明細書において、「ヒトのフレームワーク領域」とは、天然に存在するヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域に実質的に（約８５％またはそれ以上、通常は９０〜９５％またはそれ以上）同一なフレームワーク領域である。ある抗体のフレームワーク領域、すなわち、構成軽鎖および重鎖のフレームワーク領域を組み合わせたものは、ＣＤＲを配置し整列させる働きをする。ＣＤＲは、抗原のエピトープへの結合に主に関与する。
抗体はまた、例えば、種々のペプチダーゼでの消化によって産生された多くの十分に特徴づけられたフラグメントとして存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域中のジスルフィド結合の下で抗体を消化して、Ｆ（ａｂ）’２（それ自体がジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に接続された軽鎖であるＦａｂの二量体）を産生する。Ｆ（ａｂ）’２は、穏やかな条件下で還元されて、ヒンジ領域中のジスルフィド結合が破壊され、それにより、Ｆ（ａｂ）’２二量体はＦａｂ’単量体へと変換され得る。Ｆａｂ’単量体は、本質的に、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂである（Ｐａｕｌ編、（１９９９）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版）Ｒａｖｅｎを参照のこと）。種々の抗体フラグメントは、インタクトな抗体の消化に関して定義されるが、当業者は、このようなフラグメントが化学的にか、または組換えＤＮＡ法の使用によってｄｅ ｎｏｖｏで合成され得ることを認識する。したがって、本明細書中で使用される場合、用語「抗体」はまた、全抗体の修飾によって産生された抗体フラグメント、組換えＤＮＡ法を使用してｄｅ ｎｏｖｏで合成した抗体フラグメント（例えば、単鎖Ｆｖ）、またはファージディスプレイライブラリーを使用して同定した抗体フラグメントを含む（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、（１９９０）、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４を参照のこと）。
「キメラ抗体」は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が、異なるかもしくは変更されたクラスおよび／または種の定常領域、またはキメラ抗体に新規の性質を付与する完全に異なる分子（例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物、エフェクター機能、化学誘因物質、免疫調節因子など）に連結されるように定常領域またはその一部が変更されているか、置換されているか、または交換された抗体分子；あるいは（ｂ）可変領域またはその一部が、異なるかもしくは変更された抗原特異性を有する可変領域によって変更されているか、置換されているか、または交換された抗体分子である。
用語「ヒト化抗体」または「ヒト化免疫グロブリン」とは、ヒトフレームワーク、非ヒト抗体由来の少なくとも１つ、好ましくは全ての相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、存在する任意の定常領域がヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一（すなわち、少なくとも約８５％〜９０％同一、好ましくは少なくとも９５％同一）である免疫グロブリンをいう。したがって、おそらくＣＤＲを除くヒト化免疫グロブリンの全ての部分は、１つ以上のネイティブなヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５３０１，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６１号；同第５，６９３，７６２号；および同第６，１８０，３７０号（これらおよび他の米国特許／特許出願は、その全体が参考として援用される）を参照のこと。
抗体（例えば、組換え抗体、モノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体）の調製のための多くの技術が公知である。例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、（１９７５）、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７；Ｋｏｚｂｏｒら、（１９８３）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２；Ｃｏｌｅら、（１９８５）、Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ａｎｄ Ｓｅｌｌ、（１９８５）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｍｙｅｌｏｍａ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｌｉｓｓのｐｐ．７７−９６；Ｃｏｌｉｇａｎ、（１９９１）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、（１９８８）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ；ならびにＧｏｄｉｎｇ、（１９８６）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。単鎖抗体の産生のための技術（米国特許第４，９４６，７７８号）は、本発明のポリペプチドに対する抗体を産生するために適合され得る。また、トランスジェニックマウス、または他の哺乳動物のような他の生物が使用されて、ヒト化抗体が発現され得る。あるいは、ファージディスプレイ技術が使用されて、選択した抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロマーＦａｂフラグメントが同定され得る。例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、（１９９０）、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４；Ｍａｒｋｓら、（１９９２）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３を参照のこと。
用語「エピトープ」とは、免疫応答を誘発し、そして抗体によって特異的に結合され得るタンパク質の任意の部分（決定基）をいう。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸またはＧＡＧ側鎖のような分子の活性な表面集団からなり、そして通常、特異的な三次元構造特性および特異的な電荷特性を有する。一方の抗体の結合を減少させるか、または排除するタンパク質中のアミノ酸変異がまた、他方の抗体の結合を減少されるか、または排除する場合および／または抗体がタンパク質への結合に関して競合する場合（すなわち、一方の抗体のタンパク質への結合が他方の抗体の結合を減少または消滅させる場合）、２つの抗体は、実質的に同一のタンパク質のエピトープ（またはタンパク質の重複エピトープ）に結合するといわれる。２つの抗体が同じエピトープに対して実質的に結合するか否かの決定は、当該分野で公知の方法（例えば、競合アッセイ）によって行なわれる。対照抗体（例えば、本明細書中に記載される抗ＣＳ１抗体の１つ）と任意の試験抗体との間の抗体競合研究の実施において、対照抗体を、検出可能な標識（例えば、ビオチン、酵素標識、放射性標識、または蛍光標識）で最初に標識して、その後の同定を可能にし得る。対照（標識された）抗体と実質的に同じエピトープに結合する試験（標識されていない）抗体は、対照抗体の結合を遮断し得るはずであり、それにより対照抗体の結合を減少させるはずである。
例示的な実施形態において、抗体がＬｕｃモノクローナル抗体の同じエピトープに実質的に結合する場合（Ｌｕｃモノクローナル抗体とは本発明の産生された抗ＣＳ１モノクローナル抗体をいう）、この抗体は、Ｌｕｃモノクローナル抗体が結合するＣＳ１エピトープと重複するＣＳ１のエピトープと結合するはずである。重複領域は、１個のアミノ酸残基から数百個のアミノ酸残基までの範囲であり得る。次いで、この抗体は、ＣＳ１へのＬｕｃモノクローナル抗体の結合と競合し、そして／またはこれを遮断し、それにより、競合アッセイにおいてＣＳ１へのＬｕｃモノクローナル抗体の結合を、好ましくは少なくとも約５０％減少させるはずである。
エピトープが、少なくとも１０５Ｍ−１の結合親和性、好ましくは１０６Ｍ−１〜１０７Ｍ−１の結合親和性、より好ましくは１０８Ｍ−１〜１０９Ｍ−１の結合親和性、さらにより好ましくは１０１０Ｍ−１またはそれより強い結合親和性で抗体に結合する場合、エピトープは、抗体によって認識される。
用語「に由来する」は、「から得られる」、「によって産生される」、または「から伝わる」を意味する。
（ＣＳ１抗原および抗体）
配列番号２は、全長野生型ヒトＣＳ１のアミノ酸配列を示す。「機能的に活性な」ＣＳ１フラグメントまたはＣＳ１誘導体は、抗原活性、免疫原性活性、天然の細胞基質に結合する能力などのような全長野生型ＣＳ１タンパク質に関連する１つ以上の機能活性を示す。ＣＳ１のタンパク質、誘導体、およびフラグメントの機能活性は、当業者に公知である種々の方法によってアッセイされ得る（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｍｅｒｓｅｔ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９８））。本明細書中の目的のために、機能的に活性なフラグメントとしてはまた、結合ドメインのようなＣＳ１ポリペプチドの１つ以上の構造ドメインを含むフラグメントが挙げられる。タンパク質ドメインは、ＰＦＡＭプログラムを使用して同定され得る（Ｂａｔｅｍａｎ Ａ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：２６０−２（１９９９））。
ＣＳ１ポリペプチド誘導体は、代表的に、一定の程度の配列同一性または配列類似性を、配列番号２またはそのフラグメントと共有する。ＣＳ１誘導体は、当該分野で公知である種々の方法によって産生され得る。これらを生じる操作は、遺伝子レベルまたはタンパク質レベルで起こり得る。例えば、クローニングされたＣＳ１遺伝子配列（例えば、配列番号１）は、制限エンドヌクレアーゼを使用して適切な部位で切断され（Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｔ．Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ ３１７：４１５（１９８６））、次いでさらに酵素的に修飾され、所望される場合、その後単離し、インビトロでライゲーションされ、発現されて所望の誘導体を産生し得る。あるいは、ＣＳ１遺伝子は、インビトロまたはインビボで変異されて、翻訳配列、開始配列、および／もしくは終止配列が作製され、そして／または破壊されるか、あるいはコード領域中のバリエーションを生じ、そして／または新規の制限エンドヌクレアーゼ部位が形成されるか、もしくは先在するエンドヌクレアーゼ部位が破壊されて、さらなるインビトロ修飾が促進され得る。化学的変異誘発、インビトロ部位特異的変異誘発（Ｃａｒｔｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４３３１（１９８６））、またはＴＡＢリンカー（Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．から入手可能）の使用のような種々の変異誘発技術が、当該分野で公知である。
１つの局面において、本発明の抗体は、ＣＳ１の生物活性の少なくとも１つ、好ましくは全てを中和する。ＣＳ１の生物活性としては、以下が挙げられる：１）その細胞基質（例えば、そのリガンド）の結合活性（例えば、これらの中和抗体は、そのリガンドの少なくとも１つ、好ましくは全てに対するＣＳ１の結合と競合し得るか、または完全に遮断し得るべきである）；２）シグナル伝達活性；および３）ＣＳ１によって誘導される細胞応答。
本発明は、以下のハイブリドーマ細胞株を提供する：Ｌｕｃ２、Ｌｕｃ３、Ｌｕｃ１５、Ｌｕｃ２２、Ｌｕｃ２３、Ｌｕｃ２９、Ｌｕｃ３２、Ｌｕｃ３４、Ｌｕｃ３５、Ｌｕｃ３７、Ｌｕｃ３８、Ｌｕｃ３９、Ｌｕｃ５６、Ｌｕｃ６０、Ｌｕｃ６３、Ｌｕｃ６９、ＬｕｃＸ．１、ＬｕｃＸ．２またはＬｕｃ９０。ハイブリドーマ細胞株Ｌｕｃ９０は、登録番号ＰＴＡ ５０９１としてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １５４９、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１０８）に寄託された。このハイブリドーマ細胞株の寄託は、２００３年３月２６日にＡＴＣＣによって認められた。ハイブリドーマ細胞株Ｌｕｃ６３もまた、上に記載される住所のＡＴＣＣに寄託された。Ｌｕｃ６３抗体の寄託は、２００４年５月６日にＡＴＣＣによって認められた。
本発明は、以下のハイブリドーマ細胞株によって産生されたモノクローナル抗体を提供する：Ｌｕｃ２、Ｌｕｃ３、Ｌｕｃｌ５、Ｌｕｃ２２、Ｌｕｃ２３、Ｌｕｃ２９、Ｌｕｃ３２、Ｌｕｃ３４、Ｌｕｃ３５、Ｌｕｃ３７、Ｌｕｃ３８、Ｌｕｃ３９、Ｌｕｃ５６、Ｌｕｃ６０、Ｌｕｃ６３、Ｌｕｃ６９、ＬｕｃＸ．１、ＬｕｃＸ．２またはＬｕｃ９０（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ ５０９１）。これらのモノクローナル抗体は、本明細書中で以下、それぞれ以下の抗体として名付けられる：Ｌｕｃ２、Ｌｕｃ３、Ｌｕｃ１５、Ｌｕｃ２２、Ｌｕｃ２３、Ｌｕｃ２９、Ｌｕｃ３２、Ｌｕｃ３４、Ｌｕｃ３５、Ｌｕｃ３７、Ｌｕｃ３８、Ｌｕｃ３９、Ｌｕｃ５６、Ｌｕｃ６０、Ｌｕｃ６３、Ｌｕｃ６９、ＬｕｃＸ．１、ＬｕｃＸ．２およびＬｕｃ９０。
本発明は、本明細書中に記載されるＬｕｃモノクローナル抗体のいずれか１つと同一のエピトープに実質的に結合する抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）を提供する。
本発明は、１つ以上の上記のＬｕｃモノクローナル抗体と同一のエピトープに実質的に結合しない抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）を提供する。
抗体競合の評価のための種々の免疫学的スクリーニングアッセイが使用されて、本発明の抗体と同一のエピトープと実質的に結合するか、または本発明の抗体と異なるエピトープに結合する抗体が同定され得る。
対照抗体と任意の試験抗体（種またはアイソタイプに無関係）との間の抗体競合研究の実施では、対照抗体は、検出可能な標識（例えば、ビオチンまたは酵素標識（さらにまたは放射性標識））で最初に標識されて、その後の同定が可能となり得る。この場合において、非標識抗体を、ＣＳ１タンパク質を発現する細胞と予め混合するか、またはインキュベートする。次いで、標識された抗体は、プレインキュベートされた細胞に添加される。結合した標識の強度が、測定される。標識された抗体が重複エピトープへの結合によって標識されていない抗体と競合する場合、この強度は、陰性対照である標識されていない抗体（ＣＳ１に結合しない既知の抗体）による結合と比較して減少する。
アッセイは、抗体の競合に基づいた一定範囲の免疫学的アッセイのいずれか１つであり得、対照抗体は、その標識を検出する手段（例えば、ビオチン化抗体の場合のストレプトアビジンの使用、酵素標識と結合した発色基質の使用（例えば、ペルオキシダーゼ酵素との３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質の使用）、または放射性標識もしくは蛍光標識の単純な検出）によって検出される。対照抗体と同一のエピトープに結合する抗体は、結合に関して有効に競合し得、それにより、結合した標識の減少によって証明されるように、対照抗体の結合を著しく（例えば、少なくとも５０％）減少させ得る。
完全に無関係な抗体の非存在下における（標識）対照抗体の反応性は、対照高値である。対照低値は、標識されていない試験抗体とＣＳ１発現細胞とをインキュベートし、その後、細胞／抗体混合物と正確に同じ型の標識された対照抗体とをインキュベートすることによって競合が生じ、そして標的抗体の結合を減少させる場合に得られる。試験アッセイにおいて、試験抗体の存在下における標識された抗体の反応性の著しい減少は、実質的に同一のエピトープを認識する試験抗体の指標である。
あらゆる種を起源とするＣＳ１に対する抗体は、本発明に含まれる。天然の抗体の非限定的な例としては、ヒト、ニワトリ、ヤギ、およびヒト抗体を産生するように遺伝子操作されたトランスジェニックげっ歯類を含むげっ歯類（例えば、ラット、マウス、ハムスター、およびウサギ）由来の抗体が挙げられる（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇら、ＷＯ９３／１２２２７；米国特許第５，５４５，８０６号；およびＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら、ＷＯ９１／１０７４１；米国特許第６，１５０，５８４号（これらは、その全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。天然の抗体は、ポリペプチド（好ましくは、ヒトポリペプチド）のような抗原を用いて免疫された後の宿主動物によって産生された抗体である。好ましい実施形態において、本発明の抗体は、ＣＳ１に結合し、そして／またはＣＳ１を中和する単離された天然の抗体である。
遺伝子的に変更された抗ＣＳ１抗体は、上記の天然の抗体と機能的に等価であるべきである。改良された安定性および／または治療有効性を提供する改変抗体が、好ましい。改変抗体の例としては、アミノ酸残基の保存的置換、および抗原結合の有用性を著しく不利に変更しないアミノ酸の１つ以上の欠失または付加を伴う抗体が挙げられる。置換は、治療有用性が維持される限り、１つ以上のアミノ酸残基の変化または改変から領域の完全な再設計までの範囲であり得る。本発明の抗体は、翻訳後に改変（例えば、アセチル化および／またはリン酸化）されても、合成によって改変（例えば、標識基の結合）されてもよい。好ましい遺伝子的に変更された抗体は、キメラ抗体およびヒト化抗体である。
キメラ抗体は、２つの異なる抗体に由来し、好ましくは別の種に由来する可変領域および定常領域を有する抗体である。好ましくは、キメラ抗体の可変領域はマウスに由来し、定常領域はヒトに由来する。
１つの実施形態において、マウス可変領域は、本明細書中に記載されるモノクローナル抗体のいずれか１つに由来する。キメラ抗体を産生するために、２つの異なる種に由来する部分（例えば、ヒト定常領域およびマウス可変領域またはマウス結合領域）は、従来技術によって化学的に１つに接続されても、遺伝子操作技術を使用して単一の連続するタンパク質として調製されてもよい。キメラ抗体の軽鎖部分および重鎖部分の両方のタンパク質をコードするＤＮＡ分子は、連続するタンパク質として発現され得る。キメラ抗体を作製する方法は、米国特許第５，６７７，４２７号；米国特許第６，１２０，７６７号；および米国特許第６，３２９，５０８号（これらの各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される）に開示される。
本発明で使用される遺伝子的に改変された抗体としては、ＣＳ１を中和するヒト化抗体が挙げられる。１つの実施形態において、このヒト化抗体は、マウスドナー免疫グロブリンのＣＤＲ、重鎖フレームワークおよび軽鎖フレームワーク、ならびにヒトアクセプター免疫グロブリンの定常領域を含む。１つの例において、ヒト化抗体は、本明細書中に記載されるいずれか１つの抗体のヒト化バージョンである。ヒト化抗体を作製する方法は、米国特許第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６１号；同第５，６９３，７６２号；および同第６，１８０，３７０号（これらの各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される）に開示される。
抗ＣＳ１完全ヒト抗体もまた、本発明に含まれる。本発明の好ましい実施形態において、完全ヒト抗体は、本明細書中に記載されるＣＳ１活性を中和する単離されたヒト抗体である。
ＣＳ１に対する完全ヒト抗体は、種々の技術によって産生される。１つの例は、トリオーマ法である。このアプローチで使用される基本的アプローチおよび細胞融合パートナーの例（ＳＰＡＺ−４）は、Ｏｅｓｔｂｅｒｇら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ２：３６１−３６７（１９８３）；Ｏｅｓｔｂｅｒｇ、米国特許第４，６３４，６６４号；およびＥｎｇｌｅｍａｎら、米国特許第４，６３４，６６６号（これらの各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されている。
ＣＳ１に対するヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１セグメントをコードする導入遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック動物から産生され得る。これらの性質を有する動物の作製および性質は、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇら、ＷＯ９３／１２２２７；米国特許第５，５４５，８０６号；Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら、ＷＯ９１／１０７４１；米国特許第６，１５０，５８４号（これらは、その全体が本明細書中に参考として援用される）に詳細に記載される。
種々の組換え抗体ライブラリー技術もまた利用されて、完全ヒト抗体が産生され得る。例えば、１つのアプローチは、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）に概説される一般的プロトコールにしたがって、ヒトＢ細胞からＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることである。ＣＳ１またはそのフラグメントに結合する抗体が、選択される。次いで、このような抗体（またはその結合フラグメント）をコードする配列は、クローニングされ、そして増幅される。Ｈｕｓｅによって記載されたプロトコールは、ファージディスプレイ技術と組み合わせて、さらに有効になる。例えば、Ｄｏｗｅｒら、ＷＯ ９１／１７２７１およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＷＯ ９２／０１０４７；米国特許第５，９６９，１０８号（これらの各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。これらの方法において、メンバーがその外部表面上に異なる抗体を提示するファージライブラリーが、産生される。抗体は、通常、ＦｖフラグメントまたはＦａｂフラグメントとして提示される。所望の特異性を有する抗体を提示するファージは、ＣＳ１またはそのフラグメントに対する親和性を向上させることによって選択される。
Ｃｏｉａ Ｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １：２５４（１−２）：１９１−７（２００１）；Ｈａｎｅｓ Ｊ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８（１２）：１２８７−９２（２０００）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５（２４）：１４１３０−５（１９９８）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４（１０）：４９３７−４２（１９９７）（これらの各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、真核生物リボソームもまた、標的抗原（例えば、ＣＳ１）に対してスクリーニングすることによって抗体ライブラリーを提示し、そして結合ヒト抗体を単離するための手段として使用され得る。
酵母システムもまた、抗体などの哺乳動物の細胞表面タンパク質または分泌タンパク質をスクリーニングするのに適切である。抗体ライブラリーは、標的抗原に対するヒト抗体を得る目的のために酵母細胞の表面上に提示され得る。このアプローチは、Ｙｅｕｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１８（２）：２１２−２０（２００２）；Ｂｏｅｄｅｒ，Ｅ．Ｔ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（６）：５５３−７（１９９７）（これらの各々は、その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載される。あるいは、ヒト抗体ライブラリーは、細胞内で発現され、そして酵母ツーハイブリッドシステムを介してスクリーニングされ得る（ＷＯ０２００７２９Ａ２（これは、その全体が本明細書中に参考として援用される））。
ＣＳ１に対する結合特異性を保持する抗ＣＳ１抗体のフラグメントもまた、本発明に含まれる。これらの抗原結合フラグメントの例としては、本明細書中に記載される任意の抗ＣＳ１抗体の部分的もしくは完全な重鎖または軽鎖、可変領域、あるいはＣＤＲ領域が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の好ましい実施形態において、上記抗体フラグメント（抗原結合フラグメント）は、短縮鎖である（カルボキシル末端で切断）。好ましくは、これらの短縮鎖は、１つ以上の免疫グロブリン活性（例えば、補体結合活性）を有する。短縮鎖の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｆａｂフラグメント（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる）；Ｆｄフラグメント（ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなる）；Ｆｖフラグメント（抗体の単鎖のＶＬおよびＶＨドメインからなる）；ｄａｂフラグメント（ＶＨドメインからなる）；単離されたＣＤＲ領域；二価フラグメントである（Ｆａｂ’）２フラグメント（ジスルフィド結合によってヒンジ領域で連結された２つのＦａｂフラグメントが挙げられる）。これらの短縮鎖は、従来の生化学的技術（例えば、酵素切断）または組換えＤＮＡ技術によって産生され得、これらの技術の各々は、当該分野において公知である。これらのポリペプチドフラグメントは、当該分野で周知の方法による インタクトな抗体のタンパク質分解性の切断、または部位特異的変異誘発を使用したベクター中の所望の位置（例えば、Ｆａｂフラグメントを産生するためのＣＨ１または（Ｆａｂ’）２フラグメントを産生するためのヒンジ領域の後）における終止コドンの挿入によって、産生され得る。単鎖抗体は、ＶＬコード領域およびＶＨコード領域と、ＶＬタンパク質フラグメントおよびＶＨタンパク質フラグメントを連結するペプチドリンカーをコードするＤＮＡとを接続することによって産生され得る。
免疫グロブリン関連遺伝子は、別々の機能的領域（それぞれ１つ以上の異なる生物活性を有する）を含むので、抗体フラグメントの遺伝子は、他の遺伝子由来の機能的領域（例えば、酵素、米国特許第５，００４，６９２号（これは、その全体が本明細書中に参考として援用される））と融合して、新規の性質を有する融合タンパク質（例えば、免疫毒素）または結合体が産生され得る。
本発明は、免疫毒素における抗ＣＳ１抗体の使用を含む。抗体を含む免疫毒素である結合体は、当該分野で広範に記載されている。この毒素は、従来のカップリング技術によって抗体にカップリングされ得るか、またはタンパク質毒素部分を含む免疫毒素は、融合タンパク質として産生され得る。本発明の結合体は、このような免疫毒素を得るための対応する方法で使用され得る。このような免疫毒素の例示は、Ｂｙｅｒｓ，Ｂ．Ｓ．ら、Ｓｅｍｉｎａｒｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２：５９−７０（１９９１）およびＦａｎｇｅｒ，Ｍ．Ｗ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １２：５１−５４（１９９１）に記載される。
組換えＤＮＡ技術が使用されて、任意の発現系（細菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、および哺乳動物細胞（例えば、ＮＳＯ細胞）のような原核生物発現系および真核生物発現系が挙げられる）において、組換え抗ＣＳ１抗体、およびキメラ抗ＣＳ１抗体もしくはヒト化抗ＣＳ１抗体、または任意の他の遺伝子的に変更された抗ＣＳ１抗体、ならびにそれらのフラグメントもしくは結合体が産生され得る。
一旦産生されると、本発明の完全な抗体、その二量体、各軽鎖および重鎖、または他の免疫グロブリン形態は、当該分野で標準的な手順（硫酸アンモニウム沈殿、親和性カラム、カラムクロマトグラフィ、ゲル電気泳動などが挙げられる）によって精製され得る（一般的に、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．，１９８２）を参照のこと）。薬学的使用に関して、少なくとも約９０〜９５％の均一性を有する実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８〜９９％またはそれ以上の均一性を有することが最も好ましい。一旦精製（部分的か、または望ましくは均一に）されると、ポリペプチドは、治療（体外が含まれる）に、またはアッセイ手順、免疫蛍光染色などの開発および実施に使用され得る（一般的に、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（ＬｅｆｋｏｖｉｔｓおよびＰｅｒｎｉｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９７９年および１９８１年）を参照のこと）。実施例に記載されるように、単離されたかまたは精製された抗ＣＳ１抗体は、そのＣＳ１の生物活性を中和する能力についてさらにスクリーニングされ得る。
（ＣＳ１の構造モデル）
ヒトＣＳ１遺伝子のオープンリーディングフレーム（配列番号１）は、３３５アミノ酸残基のポリペプチド（配列番号２）をコードする。予測されたタンパク質の配列は、推定シグナルペプチド配列、および約２２５アミノ酸残基の細胞外ドメイン、その後に約２５アミノ酸残基の１個の膜貫通ドメインおよび約８５アミノ酸残基の細胞内ドメインをもっていた。細胞外ドメインは、７つの推定Ｎ結合型グリコシル化部位を含んでいた。ＣＳ１の予測されたタンパク質配列の相同性は、それがＩｇスーパーファミリーの一員であることを示している。ＣＳ１タンパク質配列のアラインメントは、他のＣＤ２サブセットの受容体と比較して多くの保存残基を含む類似した構造を示している。細胞質領域は、２Ｂ４およびＳＬＡＭに見られる新規のチロシンモチーフのうち２つを含んでいる。
ＣＳ１の細胞外ドメインの構造モデルは、２つの免疫グロブリン様ドメインからなると予測されている。ＣＤ２（ＰＤＢコード：１ＨＮＦ）におけると同様、Ｎ末端ドメイン１（Ｖドメイン）は、免疫グロブリン様ドメインのＶサブセットの一員であり、ドメイン２（Ｃ２ドメイン）はＣ２サブセットの一員である。細胞外ドメインは、そのＣ末端で、ほぼ２２６位のアミノ酸残基で始まる膜貫通ドメインを結合している。
Ｖドメイン（約２３位のアミノ酸残基から約１２２位のアミノ酸残基まで）において、このドメインの中心にあるＴｒｐ−５３は保存されていて、その直近のすべての残基は、ＣＤ２の残基（Ｌｅｕ−９０およびＶａｌ−１０５）と同じであるか、または、保存的に（ＣＤ２ではＰｈｅがＴｙｒ−１２０に）置換されている。ＣＤ２におけると同様、Ｖドメインにはドメイン内ジスルフィド架橋がない。Ｃ２ドメイン（約１２８位のアミノ酸残基から約２２５位のアミノ酸残基まで）では、２つのドメイン内ジスルフィド結合が保存されており（Ｃｙｓ−１５１−Ｃｙｓ−１９５；Ｃｙｓ−１４５−Ｃｙｓ ２１５）、前者の直近にあるすべての残基は、ドメインの中心において、ＣＤ２の残基（Ｐｒｏ−１３１）と同じであるか、または、保存的に置換されている（ＣＤ２におけるＩｌｅ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅに対し、ＣＳ１では、それぞれＶａｌ−１３３、Ｉｌｅ−１６１、Ｌｅｕ−１８０）。また、ドメイン間のリンカー領域（約１２３位のアミノ酸残基から約１２７位のアミノ酸残基まで）は、ＣＳ１およびＣＤ２の間で長さが一致しており、いくらかの保存を示す（ＣＳ１におけるＶａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕに対しＣＤ２ではＩｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ）。
７つのＮ結合型グリコシル化部位と考えられる部位があり、２つ（Ａｓｎ−５６およびＡｓｎ−９８）はＶドメインに、そして５つ（Ａｓｎ−１４２、Ａｓｎ−１４８、Ａｓｎ−１７２、Ａｓｎ−１７６、およびＡｓｎ−２０４）はＣ２ドメインに存在する。
ＣＳ１と、ＣＤ抗原性によって規定されるタンパク質との間にある配列およびモチーフに関する構造の類似性は、ＣＳ１タンパク質が、炎症、癌、および免疫疾患などの病気の標的である可能性があることを示唆している。Ｌｕｃ抗体など、抗ＣＳ１抗体の治療への使用には、免疫グロブリン産生の阻害、リンパ球が自己免疫疾患および癌においてＣＳ１タンパク質を発現する機能を阻害することが含まれる。
（ＣＳ１核酸の使用）
上記したように、ＣＳ１配列は、まず、表２のＣＳ１配列との実質的な核酸配列および／またはアミノ酸配列の相同性または結合によって同定される。このような相同性は、全体的な核酸またはアミノ酸の配列に基づくことができ、通常、相同性プログラムまたはハイブリダイゼーション条件のいずれかを用いて決定される。一般的には、ｍＲＮＡ上で連結された配列は、同じ分子に見出される。
配列の同一性の％は、ＢＬＡＳＴのようなアルゴリズムを使用して決定され得る。好ましい方法は、初期設定パラメータに設定された（それぞれ１および０．１２５に設定された重複スパンおよび重複フラクションで）ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモジュールを利用する。アラインメントは、整列されるべき配列へのギャップの導入を含み得る。さらに、記載される核酸よりも多いかまたは少ないヌクレオチドを含む配列のために、相同性の％は、ヌクレオシドの総数に対する相同なヌクレオシドの数に基づいて決定され得る。したがって、例えば、同定した配列よりも短い配列の相同性は、より短い配列中のヌクレオシドの数を使用して決定される。
１つの実施形態において、核酸の相同性は、ハイブリダイゼーション研究によって決定される。したがって、例えば、高ストリンジェンシーの下で記載される核酸またはその相補体とハイブリダイズするか、または天然に存在するｍＲＮＡにおいても見出される核酸は、相同な配列と見なされる。別の実施形態において、より低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が使用される；例えば、中程度かまたは低いストリンジェンシーの条件が、使用され得る（Ａｕｓｕｂｅｌ、前出およびＴｉｊｓｓｅｎ、前出を参照のこと）。
本発明のＣＳ１核酸配列（例えば、表２中の配列）は、より大きな遺伝子のフラグメントであり得る（例えば、これらは核酸セグメントである）。本文脈中の「遺伝子」は、コード領域、非コード領域、ならびにコード領域と非コード領域との混合物を含む。したがって、本明細書中に提供される配列を使用し、より長い配列または全長配列のいずれかをクローニングする周知の技術を使用して、ＣＳ１遺伝子の、いずれかの方向に伸長された配列が得られ得る（Ａｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）。多くが、インフォマティクスによって行なわれ、多くの配列は、１つの遺伝子に対応する複数の配列を含むように集団化され得る（例えば、ＵｎｉＧｅｎｅのようなシステム）。
本発明のＣＳ１核酸は、いくつかの方法で使用される。１つの実施形態において、ＣＳ１に対する核酸プローブが、作製され、そして以下に概説されるスクリーニング法および診断法または投与（例えば、遺伝子治療、ワクチン、ＲＮＡｉ、および／またはアンチセンスの用途）のために使用されるバイオチップに接着される。あるいは、ＣＳ１タンパク質のコード領域を含むＣＳ１核酸は、再びスクリーニング目的または患者への投与のために、ＣＳ１タンパク質の発現のための発現ベクター中におかれ得る。
別の実施形態において、ＣＳ１核酸（図面に概説される核酸配列および／またはその相補体の両方）の核酸プローブが、作製される。バイオチップに接着される核酸プローブは、ＣＳ１核酸（例えば、標的配列（例えば、サンドイッチアッセイにおけるサンプルの標的配列または他のプローブ配列に対する標的配列のいずれか））と実質的に相補的であるように設計され、このことにより、標的配列と本発明のプローブとのハイブリダイゼーションが生じる。下記に概説されるように、この相補性は、完全である必要はなく、標的配列と本発明の一本鎖核酸との間のハイブリダイゼーションを妨害する任意の数の塩基対ミスマッチが存在し得る。しかし、変異の数が非常に多く、それによってハイブリダイゼーションが最も低いストリンジェントのハイブリダイゼーション条件下でさえ起こり得ない場合、この配列は相補的標的配列ではない。したがって、本明細書中の「実質的に相補的な」は、本明細書中に概説されるように、プローブが、通常の反応条件下（特に、高いストリンジェンシーの条件）で標的配列とハイブリダイズするのに十分に相補的であることを意味する。
核酸プローブは、一般的に、一本鎖であるが、部分的に一本鎖であり得、そして部分的に二本鎖であり得る。プローブの鎖形成性（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）は、標的配列の構造、組成、および性質によって決定される。一般的に、核酸プローブは、約８〜１００塩基長の範囲であり、約１０〜８０塩基の範囲が好ましく、約３０〜５０塩基の範囲が特に好ましい。すなわち、一般的には全遺伝子を使用しない。いくつかの実施形態において、数百塩基までの非常に長い核酸が、使用され得る。
別の実施形態において、１つの配列あたり１つを超えるプローブが使用され、重複プローブまたは標的の異なる部分に対するプローブとともに使用される。すなわち、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のプローブ（３つが好ましい）が使用されて、特定の標的に対して重複性が構築される。プローブは、重複している（例えば、共通のいくつかの配列を有する）か、または個別であり得る。いくつかの場合において、ＰＣＲプライマーが使用されて、感度をより高くするためにシグナルが増幅され得る。
核酸は、広範な種々の方法で固体支持体に接着され得るか、または固定化され得る。「固定化される」および本明細書中の文法上の等価物は、核酸プローブと固体支持体との間の会合または結合が、概説される結合、洗浄、分析、および除去の条件下で安定であるために十分であることを意味する。結合は、代表的に、共有結合または非共有結合であり得る。「非共有結合」および本明細書中の文法上の等価物は、静電気的、親水性、および疎水性の相互作用の１つ以上を意味する。分子（例えば、ストレプトアビジン）の支持体への共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）およびビオチン化プローブのストレプトアビジンの非共有結合は、非共有結合に含まれる。「共有結合」および本明細書中の文法上の等価物は、２つの部分（固体支持体およびプローブ）が少なくとも１つの結合（σ結合、π結合、および配位結合が含まれる）によって結合されることを意味する。共有結合は、プローブと固体支持体との間で直接形成され得るか、架橋リンカーによってか、または固体支持体もしくはプローブのいずれかもしくは両方の分子への特定の反応基の導入によって形成され得る。固定化はまた、共有結合的相互作用と非共有結合的相互作用との組み合わせを含み得る。
一般的に、プローブは、広範な種々の方法においてバイオチップに接着され得る。本明細書中に記載されるように、核酸は、最初に合成されて、次いでバイオチップに接着され得るか、またはバイオチップ上で直接合成され得る。
バイオチップは、適切な固体基質を含む。「基質」、「固体支持体」、または本明細書中の他の文法上の等価物は、核酸プローブの接着または会合のために改変され得、そして少なくとも１つの検出方法に従う物質を意味する。多くの場合、基質は、個々の分離および同定に適切な個別の各部位を含み得る。考えられる基質の数は非常に多く、ガラスおよび修飾されたガラスまたは官能化ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレン、およびスチレンと他の物質とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン（登録商標）Ｊなどが挙げられる）、多糖類、ナイロンもしくはニトロセルロース、樹脂、シリカもしくはシリカベースの物質（シリコーンおよび修飾されたシリコーンが挙げられる）、炭素、金属、無機ガラス、プラスチックなどが挙げられるが、これらに限定されない。一般的に、基質は、光学的に検出を可能にし、感知可能に蛍光を発しない。ＷＯ ００５５６２７を参照のこと。
一般的に、基質は平面であるが、基質の他の形状は、同様に使用され得る。例えば、サンプルの容量を最小限にするために、プローブは、フロースルーサンプル分析用チューブの内面に配置され得る。同様に、基質は可撓性である（例えば、可撓性の発泡体（特定のプラスチックから作製された独立気泡発泡体が挙げられる））。
１つの実施形態において、バイオチップおよびプローブの表面は、化学官能基で誘導体化されて、次いでこれら２つは結合され得る。したがって、例えば、バイオチップは、化学官能基（アミノ基、カルボキシル基、オキソ基、およびチオール基が挙げられるが、これらに限定されないアミノ基が特に好ましい）で誘導体化される。これらの官能基を使用して、プローブは、プローブ上の官能基を使用して接着され得る。例えば、アミノ基を含む核酸は、例えば、周知のリンカー（例えば、周知のホモ二官能性リンカーまたはヘテロ二官能性リンカー）を使用して、アミノ基を含む表面に接着され得る（１９９４ Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ ｃａｔａｌｏｇ、架橋リンカーについての技術的部分、１５５〜２００ページを参照のこと）。さらに、いくつかの場合において、アルキル基（置換ヘテロアルキル基およびヘテロアルキル基が含まれる）のようなさらなるリンカーが、使用され得る。
この実施形態において、オリゴヌクレオチドが合成され、次いで固体支持体表面に接着される。５’末端または３’末端のいずれかが、固体支持体に接着され得るか、内部ヌクレオシドへの結合を介して接着され得る。別の実施形態において、固体支持体への固定は非常に強力であり得るが、非共有性である。例えば、ストレプトアビジンで共有結合的にコーティングされた表面に結合し、接着を生じるビオチン化オリゴヌクレオチドが、作製され得る。
あるいは、オリゴヌクレオチドは、表面上に合成され得る。例えば、光重合化合物および光重合技術を利用する光活性化技術が、使用される。別の実施形態において、核酸は、ＷＯ ９５／２５１１６；ＷＯ ９５／３５５０５；米国特許第５，７００，６３７号および同第５，４４５，９３４号ならびにそれらに記載される引用文献（それらの全ては、明白に参考として援用される）に記載されるような公知の光リソグラフィー技術を使用して合成され得；接着のこれらの方法は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）（ＤＮＡマイクロアレイチップ）技術の基礎をなす。
多くの場合、増幅ベースのアッセイは、ＣＳ１結合性配列の発現レベルを測定するために行なわれ得る。これらのアッセイは、代表的には逆転写と組み合わせて行なわれる。このようなアッセイにおいて、ＣＳ１結合性核酸配列は、増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、または、ＰＣＲ）においてテンプレートとして作用する。定量的増幅において、増幅産物の量は、最初のサンプル中のテンプレートの量に比例する。適切な対照との比較は、ＣＳ１結合性ＲＮＡの量の測定を提供する。定量的増幅の方法は、周知である。定量的ＰＣＲの詳細なプロトコールは、例えば、Ｉｎｎｉｓら、（１９９０）、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに提供される。
いくつかの実施形態において、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（蛍光オリゴヌクレオチドプローブ）ベースのアッセイが使用されて、発現が測定される。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ベースのアッセイは、５’の蛍光色素および３’の消光剤を含む蛍光性オリゴヌクレオチドプローブを使用する。プローブは、ＰＣＲ産物とハイブリダイズするが、３’末端の遮断剤によってそれ自体は、伸長され得ない。その後のサイクルでＰＣＲ産物が増幅する場合、ポリメラーゼ（例えば、ＡＭＰＬＩＴＡＱ（登録商標）（ＤＮＡポリメラーゼ））の５’ヌクレアーゼ活性により、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブが切断される。この切断によって５’の蛍光色素と３’の消光剤が分離し、それにより、増幅の関数として蛍光の増加を生じる（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒによって提供された文献を参照のこと）。
他の適切な増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ、（１９８９）、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０−５６９、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、（１９８８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０８０およびＢａｒｒｉｎｇｅｒら、（１９９０）、Ｇｅｎｅ ８９：１１７−１２２を参照のこと）、転写増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（Ｋｗｏｈら、（１９８９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３−１１７７）、自律配列複製（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４−１８７８）、ドットＰＣＲ、リンカーアダプターＰＣＲなどが挙げられるが、これらに限定されない。
（核酸からのＣＳ１タンパク質の発現）
１つの実施形態において、例えば、ＣＳ１タンパク質をコードするＣＳ１核酸が使用されて、次いで下記の診断アッセイ用の試薬の開発に使用され得るＣＳ１タンパク質を発現する種々の発現ベクターが作製される。タンパク質を発現するための発現ベクターおよび組換えＤＮＡ技術は、周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，前出およびＦｅｒｎａｎｄｅｚおよびＨｏｅｆｆｌｅｒ編、（１９９９）、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。発現ベクターは、自律複製型の染色体外ベクターまたは宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであり得る。一般的に、これらの発現ベクターは、ＣＳ１タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結された転写調節核酸および翻訳調節核酸を含む。用語「制御配列」とは、特定の宿主生物中での作動可能に連結されたコード配列の発現のために使用されるＤＮＡ配列をいう。原核生物に適切な制御配列としては、例えば、プロモーター、必要に応じたオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを使用することが公知である。
核酸は、これが別の核酸配列と機能的関係におかれた場合に、「作動可能に連結される」。例えば、プレシーケンスまたは分泌リーダーのためのＤＮＡは、これがポリペプチドの分泌に関与する前タンパク質として発現される場合に、ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結されるか；プロモーターまたはエンハンサーは、これらが配列の転写に影響を与える場合に、コード配列に作動可能に連結されるか；またはリボゾーム結合部位は、これが翻訳を促進するように配置された場合に、コード配列に作動可能に連結される。一般的に、「作動可能に連結される」は、連結されたＤＮＡ配列が連続し、分泌リーダーの場合、連続し、かつ読み取り状態（ｒｅａｄｉｎｇ ｐｈａｓｅ）にあることを意味する。しかし、エンハンサーは連続する必要はない。代表的に、連結工程は、従来の制限酵素認識部位でのライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、従来の慣例にしたがって、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたは合成オリゴヌクレオチドリンカーが、使用される。転写調節核酸および翻訳調節核酸は、一般的に、ＣＳ１タンパク質の発現のための使用される宿主細胞に適切である。種々の宿主細胞のための、適切な発現ベクターおよび適切な調節配列の多くの型が、公知である。
一般的に、転写および翻訳調節配列としては、プロモーター配列、リボゾーム結合部位、転写開始および終止配列、翻訳開始配列および翻訳終止配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列が挙げられ得るが、これらに限定されない。１つの実施形態において、調節配列は、プロモーター配列ならびに転写開始配列および転写終止配列を含む。
プロモーター配列は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターのいずれかであり得る。プロモーターは、天然に存在するプロモーターまたはハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。１つを超えるプロモーターのエレメントを組み合わせたハイブリッドプロモーターもまた公知であり、そして本発明に有用である。
発現ベクターは、さらなるエレメントを含み得る。例えば、発現ベクターは、２つの複製系を有し得、したがって２つの生物中（例えば、発現のための哺乳動物細胞または昆虫細胞ならびにクローニングおよび増幅のための原核生物宿主中）でこのベクターが保持され得る。さらに、発現ベクターを組み込むために、発現ベクターは、多くの場合、宿主細胞ゲノムに相同な少なくとも１つの配列を含み、好ましくは発現構築物に隣接した２つの相同配列を含む。組み込みベクターは、ベクター中での封入のために、適切な相同配列を選択することによって宿主細胞中の特定の遺伝子座へ方向付けられ得る。ベクターを組み込むための構築物が、利用可能である。例えば、ＦｅｒｎａｎｄｅｚおよびＨｏｅｆｆｌｅｒ、前出；ならびにＫｉｔａｍｕｒａら、（１９９５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：９１４６−９１５０を参照のこと。
さらに、別の実施形態において、発現ベクターは、形質転換宿主細胞の選択を可能にするための選択マーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は周知であり、使用する宿主細胞によって変わる。
通常、本発明のＣＳ１タンパク質は、ＣＳ１タンパク質の発現を誘導するか、またはそれもたらすのに適切な条件下で、ＣＳ１タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することによって産生される。ＣＳ１タンパク質発現に適切な条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択によって変化し、慣習的な実験または最適化によって容易に確認される。例えば、発現ベクター中での構成的プロモーターの使用は、宿主細胞の成長および増殖を最適化する必要がある一方で、誘導性プロモーターの使用は、誘導のための適切な成長条件を必要とする。さらに、いくつかの実施形態において、回収のタイミングは、重要である。例えば、昆虫細胞発現で使用されるバキュロウイルスシステムは、溶菌ウイルスであり、従って、回収時期の選択は、生成物の収率に極めて重要であり得る。
適切な宿主細胞としては、酵母、細菌、古細菌、真菌、昆虫、および動物の細胞（哺乳動物細胞が挙げられる）が挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび他の酵母、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓｆ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、アカパンカビ、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍静脈内皮細胞）、ＴＨＰ１細胞（マクロファージ細胞株）、ならびに種々の他のヒト細胞およびヒト細胞株が、特に目的とされる細胞である。
１つの実施形態において、上記ＣＳ１タンパク質は、哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現系が使用され得、そしてこの発現系としては、レトロウイルス系およびアデノウイルス系が挙げられる。１つの発現ベクター系は、一般的に、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０１９およびＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０４８に記載されるようなレトロウイルスベクター系である。ウイルス遺伝子は、多くの場合、高度に発現され、広範な宿主範囲を有するので、哺乳動物ウイルス遺伝子に由来するプロモーターが、哺乳動物プロモーターとして特に使用されるプロモーターである。例としては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス哺乳動物腫瘍ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、およびＣＭＶプロモーター（例えば、ＦｅｒｎａｎｄｅｚおよびＨｏｅｆｆｌｅｒ、前出を参照のこと）が挙げられる。代表的に、哺乳動物細胞によって認識される転写終結配列およびポリアデニル化配列は、翻訳終止コドンに対して３’側に存在し、従ってプロモーターエレメントと共にコード配列に隣接する調節領域である。転写ターミネーターおよびポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０由来のものが挙げられる。
哺乳動物宿主ならびに他の宿主中に異種核酸を導入する方法が、利用可能であり、そしてこの方法は、使用される宿主細胞によって変わる。この技術としては、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ウイルス感染、リポソーム中へのポリヌクレオチドのカプセル化、および核へのＤＮＡの直接的なマイクロインジェクションが挙げられる。
別の実施形態において、ＣＳ１タンパク質は、細菌系において発現される。バクテリオファージ由来のプロモーターもまた、使用され得る。さらに、合成プロモーターおよびハイブリッドプロモーターもまた、有用である；例えば、ｔａｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーター配列およびｌａｃプロモーター配列のハイブリッドである。さらに、細菌プロモーターとしては、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合して転写を開始する能力を有する天然に存在する非細菌起源のプロモーターが挙げられ得る。機能的プロモーター配列に加えて、有効なリボゾーム結合部位が、望ましい。発現ベクターは、細菌中でＣＳ１タンパク質を分泌するシグナルペプチド配列を含み得る。タンパク質は、成長培地中に分泌される（グラム陽性菌）か、または細胞の内膜と外膜との間に位置する細胞膜周辺腔に分泌される（グラム陰性菌）。細菌発現ベクターはまた、形質転換された細菌株の選択を可能にするための選択マーカー遺伝子を含み得る。適切な選択遺伝子としては、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、およびテトラサイクリンのような薬物に対する耐性を細菌に付与する遺伝子が挙げられる。選択マーカーとしてはまた、生合成遺伝子（例えば、ヒスチジン、トリプトファン、およびロイシンの生合成経路における生合成遺伝子）が挙げられる。これらの構成要素は、発現ベクター中に構築される。細菌用の発現ベクターは周知であり、そしてとりわけ、これらとしては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｖｉｄａｎｓのためのベクターが挙げられる（例えば、ＦｅｒｎａｎｄｅｚおよびＨｏｅｆｆｌｅｒ、前出）。細菌発現ベクターは、塩化カルシウム処理およびエレクトロポレーションなどのような技術を使用して、細菌宿主細胞に形質転換される。
１つの実施形態において、ＣＳ１タンパク質は、例えば、昆虫細胞を形質転換するための発現ベクター（特に、バキュロウイルスベースの発現ベクター）を使用して、昆虫細胞中で産生される。
別の実施形態において、酵母細胞中にＣＳ１タンパク質を産生する。酵母発現系は周知であり、そしてこれは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓおよびＣ．ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓおよびＫ．ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、ならびにＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのための発現ベクターを含む。
ＣＳ１タンパク質はまた、利用可能な技術を使用して、融合タンパク質として作製され得る。したがって、例えば、モノクローナル抗体の作製のために、所望のエピトープが小さい場合、ＣＳ１タンパク質は、キャリアタンパク質と融合されて、免疫原を形成し得る。あるいは、ＣＳ１タンパク質は、発現を増加させるためかまたは他の理由のために、融合タンパク質として作製され得る。例えば、ＣＳ１タンパク質がＣＳ１ペプチドである場合、ペプチドをコードする核酸は、発現を目的として他の核酸に連結され得る。検出エピトープタグとの融合が、なされ得る（例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ６、ｍｙｃ、ＨＡなど）。
さらに別の実施形態において、ＣＳ１タンパク質は、発現後に精製または単離される。ＣＳ１タンパク質は、どのような他の成分がサンプル中に存在するのか、および精製される産物に対する要件（例えば、天然の高次構造または変性）に依存して、種々の方法によって単離または精製され得る。標準的な精製方法としては、硫酸アンモニウム沈殿、電気泳動技術、分子技術、免疫学的技術、およびクロマトグラフ技術（イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーが挙げられる）、およびクロマトフォーカシングが挙げられる。例えば、ＣＳ１タンパク質は、標準的な抗ＣＳ１タンパク質抗体カラムを使用して精製され得る。タンパク質濃縮と組み合わせた限外濾過技術およびダイアフィルトレーション技術はまた、有用である。例えば、Ｗａｌｓｈ、（２００２）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｗｉｌｅｙ；Ｈａｒｄｉｎら編、（２００１）、Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ；Ｗｉｌｓｏｎら編、（２０００）、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；およびＳｃｏｐｅｓ、（１９９３）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇを参照のこと。必要な精製の程度は、ＣＳ１タンパク質の用途に依存して変わる。いくつかの例において、精製は必要とされない。
一旦発現され、必要に応じて精製されると、ＣＳ１タンパク質および核酸は、多くの用途において有用である。これらは、免疫選択試薬、ワクチン試薬、スクリーニング因子、治療用実体として使用されてもよく、抗体産生のために使用されてもよく、転写インヒビターまたは翻訳インヒビターなどとして使用されてもよい。
（ＣＳ１タンパク質の改変体）
本明細書中で決定されるように、天然に存在する配列のアミノ酸改変体もまた、ＣＳ１タンパク質の１つの実施形態に含まれる。好ましくは、この改変体は、好ましくは約７５％を超えて野生型配列と相同であり、より好ましくは約８０％超、さらにより好ましくは約８５％超、最も好ましくは９０％超が野生型配列と相同である。いくつかの実施形態において、相同性は、約９３％〜９５％程度の高さであるか、または９８％程度の高さである。核酸に関しては、この文脈における相同性は、配列類似性または配列同一性を意味し、同一性が好ましい。この相同性は、核酸相同性について上記に概説されるように、標準的な技術を使用して決定される。
本発明のＣＳ１タンパク質は、野生型アミノ酸配列より短くても長くてもよい。したがって、１つの実施形態において、本明細書中の野生型配列の一部またはフラグメントは、ＣＳ１タンパク質の定義の範囲内に含まれる。さらに、上記に概説されるように、本発明のＣＳ１核酸が使用されて、さらなるコード領域が得られ、したがってさらなるタンパク質配列が得られ得る。
１つの実施形態において、ＣＳ１タンパク質は、野生型配列と比較した場合、ＣＳ１タンパク質の誘導体または改変体である。すなわち、以下でより完全に概説されるように、誘導体ＣＳ１ペプチドは、多くの場合、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失、または挿入を含み、アミノ酸の置換が、特に好ましい。アミノ酸の置換、挿入、または欠失は、ＣＳ１ペプチド内の多数の残基位置で起こり得る。
アミノ酸配列改変体もまた、本発明のＣＳ１タンパク質の１つの実施形態に含まれる。これらの改変体は、代表的に、以下の３つの分類の１つ以上に含まれる：置換型改変体、挿入型改変体、または欠失型改変体。これらの改変体は、通常、上記に概説されるように、改変体をコードするＤＮＡを産生するためのカセット変異誘発もしくはＰＣＲ変異誘発または他の技術を使用する、ＣＳ１タンパク質をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異的変異誘発、およびその後の組換え細胞培養におけるＤＮＡの発現によって調製される。しかし、約１００〜１５０残基までを有する変異ＣＳ１タンパク質フラグメントは、確立された技術を使用したインビトロ合成によって調製され得る。アミノ酸配列改変体は、この改変の所定の性質（ＣＳ１タンパク質のアミノ酸配列の天然に存在するアレルまたは種間のバリエーションとは別の特徴）によって特徴付けられる。改変体は、代表的に、天然に存在するアナログと類似の定性的生物活性を示すが、特徴が改変された改変体もまた、選択され得る。
アミノ酸配列バリエーションの導入部位または導入領域は、多くの場合、予め決定されるが、変異自体が、予め決定される必要はない。例えば、所与の部位での変異の実行を最適化にするために、ランダム変異誘発が、標的コドンまたは標的領域で行われ得、そして発現したＣＳ１改変体は、所望の活性の最適な組み合わせについてスクリーニングされ得る。公知の配列を有するＤＮＡ中の所定の部位において置換変異を行うための技術は、周知である（例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発およびＰＣＲ変異誘発）。変異のスクリーニングは、多くの場合、ＣＳ１タンパク質活性のアッセイを使用して行われる。
アミノ酸置換は、代表的には１残基であり；挿入は、通常、約１〜２０アミノ酸の規模であるが、非常に大きな挿入が、許容され得る。欠失は、一般的には約１〜２０残基の範囲であるが、いくつかの場合において、欠失は、非常に大きくてよい。
置換、欠失、挿入、またはその組み合わせが使用されて、最終的な誘導体に到達し得る。一般的に、これらの変化は分子の変化を最小化するために、数個のアミノ酸において行われる。しかし、より大きな変化が、特定の環境下で許容され得る。ＣＳ１タンパク質の特徴において、小さい変更が望まれる場合、置換は、一般的に、記載されるアミノ酸置換の関係に従って行われる。
改変体は、代表的に、同一の定性的生物活性を本質的に示し、そして天然に存在するアナログと同一の免疫応答を誘発するが、改変体はまた、必要に応じてＣＳ１タンパク質の特徴を改変するように選択される。あるいは、改変体は、ＣＳ１タンパク質の生物活性が変化するように設計され得る。例えば、グリコシル化部位は、付加されても変更されても、除去されてもよい。
機能または免疫学的同一性における大幅な変化は、ときとして上記される置換より保存的でない置換を選択することによってなされる。例えば、変化領域のポリペプチド骨格構造（例えば、αヘリックス構造またはβシート構造）；標的部位での分子の電荷もしくは疎水性；または側鎖の大部分に、より著しく影響を与える置換が、行われ得る。一般的に、ポリペプチドの性質に最も大きい変化を生じると予想される置換は、以下の置換である：（ａ）親水性残基（例えば、セリンまたはトレオニン）が、疎水性残基（例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、またはアラニン）で置換されること（またはその逆）；（ｂ）システインまたはプロリンが、別の残基で置換されること（またはその逆）；（ｃ）正電荷の側鎖を有する残基（例えば、リジン、アルギニン、またはヒスチジン）が、負電荷の残基（例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸）で置換されること（またはその逆）；（ｄ）かさ高い側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラニン）が、側鎖を含まない残基（例えば、グリシン）で置換されること（またはその逆）；または（ｅ）ペプチド結合の回転自由度を変化させるプロリン残基が、組み込まれるか、または置換されること。
改変体は、代表的に、類似の定性的生物活性を示し、そして天然に存在するアナログと同一の免疫応答を誘発するが、改変体はまた、必要に応じて皮膚ＣＳ１タンパク質の特徴を改変するように選択される。あるいは、改変体は、ＣＳ１タンパク質の生物活性が変更されるように設計され得る。例えば、グリコシル化部位は、変更されても除去されてもよい。
ＣＳ１ポリペプチドの共有結合の改変は本発明の範囲内に含まれる。共有結合改変の１つの型は、ＣＳ１ポリペプチドの標的化アミノ酸残基と、ＣＳ１ポリペプチドの選択された側鎖またはＮ末端残基もしくはＣ末端残基と反応し得る有機誘導体化剤との反応が含まれる。二官能性剤による誘導体化は、例えば、以下で十分に記載されるように抗ＣＳ１ポリペプチド抗体を精製するための方法またはスクリーニングアッセイにおいて使用するために、ＣＳ１ポリペプチドを水不溶性支持マトリックスまたは水不溶性支持表面に架橋するのに有用である。一般的に使用される架橋剤としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル）、ホモ二官能性イミドエステル（３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）のようなジスクシンイミジルエステルが挙げられる）、二官能性マレイミド（例えばビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン）、およびメチル−３−（（ｐ−アジドフェニル）ジチオ）プロピロイミデートのような薬剤が挙げられる。
他の改変としては、グルタミニル残基およびアスパラギニル残基の、それぞれ対応するグルタミル残基およびアスパルチル残基への脱アミド化、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリニル残基、トレオニル残基、またはチロシル残基の水酸基のリン酸化、リジン側鎖、アルギニン側鎖、およびヒスチジン側鎖のアミノ基のメチル化（例えば、ｐｐ．７９−８６、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、（１９９２）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｆｒｅｅｍａｎ）、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびにＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
本発明の範囲内に含まれるＣＳ１ポリペプチドの共有結合改変の別の型は、このポリペプチドのネイティブなグリコシル化様式の変更を含む。「天然のグリコシル化様式の変更」は、本明細書中の目的のために、ネイティブなＣＳ１ポリペプチド配列に見出される１つ以上の炭水化物部分の欠失および／またはネイティブなＣＳ１ポリペプチド配列中に存在しない１つ以上のグリコシル化部位の付加を意味することを意図する。グリコシル化パターンは、多くの方法で変更され得る。ＣＳ１関連配列を発現する異なる細胞型は、異なるグリコシル化様式を生じ得る。
ＣＳ１ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はまた、そのアミノ酸配列を変更することよって行われ得る。この変更は、例えば、（Ｏ結合グリコシル化部位について）ネイティブな配列のＣＳ１ポリペプチドへの１つ以上のセリン残基またはトレオニン残基の付加、またはそれらによる置換によってなされ得る。ＣＳ１アミノ酸配列は、特に、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生成されるように予め選択した塩基でＣＳ１ポリペプチドをコードするＤＮＡを変異することによるＤＮＡレベルでの変化によって、必要に応じて変更され得る。
ＣＳ１ポリペプチドの炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的カップリングまたは酵素的カップリングによるものである。例えば、ＷＯ ８７／０５３３０；ＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ、（１９８１）、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．のｐｐ．２５９−３０６を参照のこと。
ＣＳ１ポリペプチドに存在する炭水化物部分の除去は、化学的にまたは酵素的に達成されても、グリコシル化の標的として作用するアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によって達成されてもよい。化学的脱グリコシル化技術が適用可能である。例えば、ＳｏｊａｒおよびＢａｈｌ、（１９８７）、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２−５７およびＥｄｇｅら、（１９８１）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１−１３７を参照のこと。ポリペプチドの炭水化物部分の酵素的切断は、種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用によって行われ得る。例えば、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら、（１９８７）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０−３５９を参照のこと。
ＣＳ１ポリペプチドの共有結合改変の別の型は、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号に示される様式での種々の非タンパク質性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン）の１つへのＣＳ１ポリペプチドの連結を含む。
本発明のＣＳ１ポリペプチドはまた、別の異種ポリペプチドまたは異種アミノ酸配列に融合したＣＳ１ポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で改変され得る。１つの実施形態において、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合し得るエピトープを提供するタグポリペプチドとＣＳ１ポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的に、ＣＳ１ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端におかれる。ＣＳ１ポリペプチドのこのようなエピトープタグ化形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を使用して検出され得る。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体またはエピトープタグに結合するアフィニティーマトリックスの別の型を使用したアフィニティー精製によってＣＳ１ポリペプチドが容易に精製されることを可能にする。代替的な実施形態において、キメラ分子は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域とのＣＳ１ポリペプチドの融合を含み得る。キメラ分子の二価形態のために、このような融合は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域への融合であり得る。
種々のタグポリペプチドおよびそれらの各抗体が、利用可能である。例としては、以下が挙げられる：ポリ−ヒスチジンタグ（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ）またはポリ−ヒスチジン−グリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ＨＩＳ６および金属キレート化タグ、ｆｌｕＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５（Ｆｉｅｌｄら、（１９８８）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：２１５９−２１６５）；ｃ−ｍｙｃタグならびにその８Ｆ９抗体、３Ｃ７抗体、６Ｅ１０抗体、Ｇ４抗体、Ｂ７抗体、および９Ｅ１０抗体（Ｅｖａｎら、（１９８５）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５：３６１０−３６１６）；ならびに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙら、（１９９０）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ３（６）：５４７−５５３）。他のタグポリペプチドとしては、以下が挙げられる：Ｆｌａｇ−ペプチド（Ｈｏｐｐら、（１９８８）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４−１２１０）；ＫＴ３エピトープペプチド（Ｍａｒｔｉｎら、（１９９２）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１９２−１９４）；チューブリンエピトープペプチド（Ｓｋｉｎｎｅｒら、（１９９１）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１５１６３−１５１６６）；ならびにＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ（Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈら、（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６３９３−６３９７）。
下記に概説されるように、クローニングされ、そして発現される他の生物（例えば、チンパンジー、カニクイザルおよびアカゲザル）由来のＣＳ１タンパク質もまた、含まれる。したがって、プローブ配列またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の縮重プライマー配列が使用されて、ヒトまたは他の生物由来の他の関連ＣＳ１タンパク質が見出され得る。特に有用なプローブおよび／またはＰＣＲプライマー配列は、ＣＳ１核酸配列の固有の領域を含む。好ましいＰＣＲプライマーは、約１５〜３５ヌクレオチド長であり、約２０〜３０ヌクレオチド長が好ましく、必要に応じてイノシンを含み得る。ＰＣＲ反応の条件は、十分に記載されている（例えば、Ｉｎｎｉｓ，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、前出）。
さらに、さまざまな生物に由来するアミノ酸部分を含むよう構築されたキメラＣＳ１タンパク質が含まれる。例えば、キメラＣＳ１タンパク質は、ヒトＣＳ１の１〜６７位のアミノ酸をマウスＣＳ１の６８〜２２４位のアミノ酸に融合することによって、またあるいは、ヒトＣＳ１の１〜１５１位のアミノ酸をマウスＣＳ１の１４９〜２２４位のアミノ酸に融合することによって、また、さらにあるいは、ヒトＣＳ１の１〜１６９位のアミノ酸をマウスＣＳ１の１６７〜２２４位のアミノ酸に融合することによって構築される。逆に、キメラＣＳ１タンパク質は、マウスＣＳ１の１〜６７位のアミノ酸をヒトＣＳ１の６８〜２２７位のアミノ酸に融合することによって、またあるいは、マウスＣＳ１の１〜１３１位のアミノ酸をヒトＣＳ１の１３５〜２２７位のアミノ酸に融合することによって、また、さらにあるいは、マウスＣＳ１の１〜１６６位のアミノ酸をヒトＣＳ１の１７０〜２２７位のアミノ酸に融合することによっても構築される。
さらに、表２の核酸によってコードされるタンパク質よりも長いＣＳ１タンパク質は、例えば、伸長配列の解明、エピトープまたは精製タグの付加、他の融合配列の付加などによって、作製され得る。
ＣＳ１核酸によってコードされるＣＳ１タンパク質を同定することもできる。したがって、本明細書中に概説するように、ＣＳ１タンパク質は、配列表の配列またはその相補体とハイブリダイズする核酸によってコードされる。
（ＣＳ１タンパク質への結合パートナー）
（ＣＳ１抗体）
本発明のＣＳ１抗体は、ＣＳ１タンパク質に特異的に結合する。本明細書中の「特異的に結合する」は、抗体が、少なくとも約０．１ｍＭのＫｄ、より通常には少なくとも約１μＭのＫｄ、好ましくは少なくとも約０．１μＭまたはそれ以下のＫｄ、最も好ましくは０．０１μＭまたはそれ以下のＫｄでタンパク質に結合することを意味する。多くの場合、特定の標的に結合するが関連配列に結合しない選択性もまた、重要である。
１つの実施形態において、ＣＳ１タンパク質が、結合パートナー（例えば、免疫グロブリンの抗体）を産生するために使用される場合、ＣＳ１タンパク質は、全長タンパク質と少なくとも１つのエピトープまたは決定基を共有する必要がある。本明細書中の「エピトープ」または「決定基」は、代表的に、ＭＨＣに関連して、抗体またはＴ細胞受容体を産生および／または結合するタンパク質部分を意味する。したがって、ほとんどの場合、より小さなＣＳ１タンパク質に対して作製された抗体は、全長タンパク質（特に、線状エピトープ）に結合し得る。別の実施形態において、エピトープは固有である；すなわち、固有のエピトープに対して産生された抗体は、交差反応性をほとんど示さないか、または全く示さない。さらに別の実施形態において、このエピトープは、表に示されるタンパク質配列から選択される。
ポリクローナル抗体を調製する方法が存在する（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ、前出およびＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出）。ポリクローナル抗体は、例えば、免疫化剤、および所望される場合にはアジュバントの、１回または複数回の注射によって哺乳動物中で惹起され得る。代表的に、免疫化剤および／またはアジュバントは、複数回の皮下注射または腹腔内注射によって哺乳動物に注射される。免疫化剤は、表２の核酸によってコードされるタンパク質またはそのフラグメントもしくはその融合タンパク質を含み得る。これは、免疫される哺乳動物で免疫原性を示すことが公知のタンパク質と免疫化剤とを結合体化するのに有用であり得る。このような免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、および大豆トリプシンインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。利用され得るアジュバントの例としては、フロイント完全アジュバントおよびＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコレート）が挙げられる。種々の免疫化プロトコールが、使用され得る。
あるいは、抗体は、モノクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、（１９７５）、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５に記載のようなハイブリドーマ法を使用して調製され得る。ハイブリドーマ法において、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物は、代表的に、免疫化剤に特異的に結合する抗体を産生するか、またはこれを産生し得るリンパ球を誘発するための免疫化剤によって免疫される。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫され得る。免疫化剤は、代表的に、表の核酸によってコードされたポリペプチドまたはそのフラグメントまたは融合タンパク質を含む。一般的に、ヒト起源の細胞が望ましい場合に、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用され、または非ヒト哺乳動物の供給源が望ましい場合に、脾臓細胞またはリンパ節細胞が使用される。次いで、リンパ球は、ポリエチレングリコールのような適切な融合剤を使用して不死化細胞株と融合されて、ハイブリドーマ細胞を形成する（例えば、Ｇｏｄｉｎｇ、（１９８６）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓのｐｐ．５９−１０３：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞（特に、げっ歯類起源、ウシ起源、またはヒト起源の細胞）である。通常、ラット細胞株またはマウス細胞株が、利用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは融合していない不死化細胞の成長または生存を阻害する１種以上の物質を含む適切な培養培地中で培養され得る。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、代表的に、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨害する物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む（「ＨＡＴ培地」）。
１つの実施形態において、上記抗体は、二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するか、または同じ抗原上の２つのエピトープに対する結合特異性を有する、モノクローナル抗体（好ましくは、ヒト抗体またはヒト化抗体）である。１つの実施形態において、一方の結合特異性は、表の核酸によってコードされるタンパク質またはそのフラグメントに対する特異性であり、他方は、別の抗原（好ましくは細胞表面タンパク質、細胞表面受容体、または細胞表面受容体サブユニット（好ましくはＣＳ１特異的である抗原））に対する特異性である。あるいは、四量体型技術は、多価試薬を作製し得る。
別の実施形態において、抗体は、低レベルのフコースを有するか、またはフコースを欠く。フコースを欠く抗体は、特に低い抗体用量で、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）活性の増強と相関した。Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら、（２００２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ，Ｔ．ら、（２００３）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６。フコースを含まない抗体を調製する方法は、ラット骨髄腫ＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２）における増殖を含む。ＹＢ２／０細胞は、ポリペプチドのフコシル化に必要な酵素（α１，６−フコシルトランスフェラーゼ）をコードする低レベルのＦＵＴ８ ｍＲＮＡを発現する。
ＡＤＣＣ活性を増加させるための代替的な方法としては、ＣＳ１抗体のＦｃ部分の変異（特に、ＦｃγＲ受容体の抗体親和性を増加させる変異）が挙げられる。変異したＦｃと増加したＦｃγＲ結合との間の相関は、標的化された細胞傷害性細胞ベースのアッセイを使用して実証された。Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら、（２００１）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７６：６５９１−６６０４；Ｐｒｅｓｔａら、（２００２）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０：４８７−４９０。Ｆｃ領域の特異的な変異によるＡＤＣＣ活性を増加させるための方法は、２３４、２３５、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６９、２９６、２９７、２９８、２９９、３１３、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０および３３２からなる群より選択される位置での少なくとも１つのアミノ酸置換を含むＦｃ改変体を包含し、Ｆｃ領域中の残基の番号付けは、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスの番号付けである。好ましい実施形態において、Ｆｃ改変体は、Ｌ２３４Ｄ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｎ、Ｌ２３４Ｑ、Ｌ２３４Ｔ、Ｌ２３４Ｈ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３５Ｓ、Ｌ２３５Ｎ、Ｌ２３５Ｑ、Ｌ２３５Ｔ、Ｌ２３５Ｈ、Ｌ２３５Ｙ、Ｌ２３５Ｉ、Ｌ２３５Ｖ、Ｌ２３５Ｆ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｑ、Ｓ２３９Ｆ、Ｓ２３９Ｔ、Ｓ２３９Ｈ、Ｓ２３９Ｙ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２４０Ａ、Ｖ２４０Ｔ、Ｖ２４０Ｍ、Ｆ２４１Ｗ、Ｆ２４１Ｌ、Ｆ２４１Ｙ、Ｆ２４１Ｅ、Ｆ２４１Ｒ、Ｆ２４３Ｗ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｙ、Ｆ２４３Ｒ、Ｆ２４３Ｑ、Ｐ２４４Ｈ、Ｐ２４５Ａ、Ｐ２４７Ｖ、Ｐ２４７Ｇ、Ｖ２６２Ｉ、Ｖ２６２Ａ、Ｖ２６２Ｔ、Ｖ２６２Ｅ、Ｖ２６３Ｉ、Ｖ２６３Ａ、Ｖ２６３Ｔ、Ｖ２６３Ｍ、Ｖ２６４Ｌ、Ｖ２６４Ｉ、Ｖ２６４Ｗ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６４Ｒ、Ｖ２６４Ｆ、Ｖ２６４Ｍ、Ｖ２６４Ｙ、Ｖ２６４Ｅ、Ｄ２６５Ｇ、Ｄ２６５Ｎ、Ｄ２６５Ｑ、Ｄ２６５Ｙ、Ｄ２６５Ｆ、Ｄ２６５Ｖ、Ｄ２６５Ｉ、Ｄ２６５Ｌ、Ｄ２６５Ｈ、Ｄ２６５Ｔ、Ｖ２６６Ｉ、Ｖ２６６Ａ、Ｖ２６６Ｔ、Ｖ２６６Ｍ、Ｓ２６７Ｑ、Ｓ２６７Ｌ、Ｅ２６９Ｈ、Ｅ２６９Ｙ、Ｅ２６９Ｆ、Ｅ２６９Ｒ、Ｙ２９６Ｅ、Ｙ２９６Ｑ、Ｙ２９６Ｄ、Ｙ２９６Ｎ、Ｙ２９６Ｓ、Ｙ２９６Ｔ、Ｙ２９６Ｌ、Ｙ２９６Ｉ、Ｙ２９６Ｈ、Ｎ２９７Ｓ、Ｎ２９７Ｄ、Ｎ２９７Ｅ、Ａ２９８Ｈ、Ｔ２９９Ｉ、Ｔ２９９Ｌ、Ｔ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｓ、Ｔ２９９Ｖ、Ｔ２９９Ｈ、Ｔ２９９Ｆ、Ｔ２９９Ｅ、Ｗ３１３Ｆ、Ｎ３２５Ｑ、Ｎ３２５Ｌ、Ｎ３２５１、Ｎ３２５Ｄ、Ｎ３２５Ｅ、Ｎ３２５Ａ、Ｎ３２５Ｔ、Ｎ３２５Ｖ、Ｎ３２５Ｈ、Ａ３２７Ｎ、Ａ３２７Ｌ、Ｌ３２８Ｍ、Ｌ３２８Ｄ、Ｌ３２８Ｅ、Ｌ３２８Ｎ、Ｌ３２８Ｑ、Ｌ３２８Ｆ、Ｌ３２８Ｉ、Ｌ３２８Ｖ、Ｌ３２８Ｔ、Ｌ３２８Ｈ、Ｌ３２８Ａ、Ｐ３２９Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｙ、Ａ３３０Ｖ、Ａ３３０Ｉ、Ａ３３０Ｆ、Ａ３３０Ｒ、Ａ３３０Ｈ、Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２Ｎ、Ｉ３３２Ｑ、Ｉ３３２Ｔ、Ｉ３３２Ｈ、Ｉ３３２Ｙ、およびＩ３３２Ａからなる群より選択される少なくとも１つの置換を含み、Ｆｃ領域中の残基の番号付けは、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスの番号付けである。Ｆｃ改変体はまた、Ｖ２６４Ｌ、Ｖ２６４Ｉ、Ｆ２４１Ｗ、Ｆ２４１Ｌ、Ｆ２４３Ｗ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４１Ｌ／Ｆ２４３Ｌ／Ｖ２６２Ｉ／Ｖ２６４Ｉ、Ｆ２４１Ｗ／Ｆ２４３Ｗ、Ｆ２４１Ｗ／Ｆ２４３Ｗ／Ｖ２６２Ａ／Ｖ２６４Ａ、Ｆ２４１Ｌ／Ｖ２６２Ｉ、Ｆ２４３Ｌ／Ｖ２６４Ｉ、Ｆ２４３Ｌ／Ｖ２６２Ｉ／Ｖ２６４Ｗ、Ｆ２４ｌＹ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｔ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｒ／Ｖ２６２Ｅ／Ｖ２６４Ｒ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｅ、Ｆ２４１Ｒ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｒ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｒ、Ｌ３２８Ｍ、Ｌ３２８Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２３８Ｍ／Ｉ３３２Ｅ、Ｐ２４４Ｈ、Ｐ２４５Ａ、Ｐ２４７Ｖ、Ｗ３１３Ｆ、Ｐ２４４Ｈ／Ｐ２４５Ａ／Ｐ２４７Ｖ、Ｐ２４７Ｇ、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｒ／Ｖ２６２Ｅ／Ｖ２６４Ｒ／Ｉ３３２Ｅ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｆ２４１Ｒ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｒ／Ｉ３３２Ｅ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｒ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ、Ｄ２６５Ｇ、Ｄ２６５Ｎ、Ｓ２３９Ｅ／Ｄ２６５Ｇ、Ｓ２３９Ｅ／Ｄ２６５Ｎ、Ｓ２３９Ｅ／Ｄ２６５Ｑ、Ｙ２９６Ｅ、Ｙ２９６Ｑ、Ｔ２９９Ｉ、Ａ３２７Ｎ、Ｓ２６７Ｑ／Ａ３２７Ｓ、Ｓ２６７Ｌ／Ａ３２７Ｓ、Ａ３２７Ｌ、Ｐ３２９Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｙ、Ｉ３３２Ｄ、Ｎ２９７Ｓ、Ｎ２９７Ｄ、Ｎ２９７Ｓ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｄ２６５Ｙ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｄ２６５Ｙ／Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｄ２６５Ｆ／Ｎ２９７Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｑ／Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２Ｎ、Ｉ３３２Ｑ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６４Ｆ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２６３Ｉ、Ｖ２６６Ｉ、Ｔ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｓ、Ｔ２９９Ｖ、Ｎ３２５Ｑ、Ｎ３２５Ｌ、Ｎ３２５Ｉ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｆ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｑ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｑ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｑ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｑ、Ｙ２９６Ｄ、Ｙ２９６Ｎ、Ｆ２４１Ｙ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｔ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ２３４Ｄ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｎ、Ｌ２３４Ｑ、Ｌ２３４Ｔ、Ｌ２３４Ｈ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３５Ｓ、Ｌ２３５Ｎ、Ｌ２３５Ｑ、Ｌ２３５Ｔ、Ｌ２３５Ｈ、Ｌ２３５Ｙ、Ｌ２３５Ｉ、Ｌ２３５Ｖ、Ｌ２３５Ｆ、Ｓ２３９Ｔ、Ｓ２３９Ｈ、Ｓ２３９Ｙ、Ｖ２４０Ａ、Ｖ２４０Ｔ、Ｖ２４０Ｍ、Ｖ２６３Ａ、Ｖ２６３Ｔ、Ｖ２６３Ｍ、Ｖ２６４Ｍ、Ｖ２６４Ｙ、Ｖ２６６Ａ、Ｖ２６６Ｔ、Ｖ２６６Ｍ、Ｅ２６９Ｈ、Ｅ２６９Ｙ、Ｅ２６９Ｆ、Ｅ２６９Ｒ、Ｙ２９６Ｓ、Ｙ２９６Ｔ、Ｙ２９６Ｌ、Ｙ２９６Ｉ、Ａ２９８Ｈ、Ｔ２９９Ｈ、Ａ３３０Ｖ、Ａ３３０Ｉ、Ａ３３０Ｆ、Ａ３３０Ｒ、Ａ３３０Ｈ、Ｎ３２５Ｄ、Ｎ３２５Ｅ、Ｎ３２５Ａ、Ｎ３２５Ｔ、Ｎ３２５Ｖ、Ｎ３２５Ｈ、Ｌ３２８Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｎ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｑ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｖ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｈ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ａ、Ｉ３３２Ｔ、Ｉ３３２Ｈ、Ｉ３３２Ｙ、Ｉ３３２Ａ、Ｓ２３９Ｅ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｑ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｖ２６４Ｉ／Ｓ２９８Ａ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｖ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｉ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｌ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｆ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｙ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｈ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｔ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｅ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｄ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｅ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｎ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｑ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｈ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｔ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｖ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｆ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｈ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、およびＳ２３９Ｄ／２６４Ｉ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅからなる群より選択され得、Ｆｃ領域中の残基の番号付けは、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスの番号付けである。本明細書中に参考として援用されるＰＣＴ ＷＯ２００４／０２９２０７（２００４年４月８日）も参照のこと。
抗体に関連するＡＤＣＣ活性は、上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出（損傷の際に原形質膜に急速に放出される）の測定によってモニタリングされ得、そして定量化され得る。
抗体処置を用いて細胞の細胞傷害性を促進するための他の代替的な実施形態は、抗体結合細胞に細胞死をもたらすシグナル伝達カスケードの抗体媒介性刺激を含む。さらに、先天性免疫系の抗体媒介性刺激（例えば、ＮＫ細胞による）はまた、腫瘍細胞またはウイルス感染細胞の死をもたらし得る。
（診断用途のためのＣＳ１配列の検出）
１つの局面において、遺伝子のＲＮＡ発現レベルは、自己免疫障害または癌（例えば、骨髄腫）の表現型における異なる細胞状態について決定される。発現プロフィールを得るために、正常組織（例えば、障害を受けていない）および患部組織中の遺伝子の発現レベル（および、いくつかの場合、以下に概説されるように、予後に関する障害の重症度の変化について）は、評価される。特定の細胞状態または発生の時点の遺伝子発現プロフィールは、本質的に、細胞の状態の「フィンガープリント」である。２つの状態は、同様に発現される特定の遺伝子を有し得る一方で、多くの遺伝子の評価は、細胞状態を反映する遺伝子発現プロフィールの作製を同時に可能にする。異なる状態の細胞における発現プロフィールの比較により、これらの状態の各々における遺伝子の重要な情報（遺伝子の上方制御および下方制御の両方を含む）が得られる。次いで、診断が、実施されるか、または確認されて、組織サンプルが正常組織または患部組織の遺伝子発現プロフィールを有するか否かが決定され得る。このことは、関連する状態の分子的な診断を提供する。
「差別的発現」または本明細書中で使用される文法上の等価物は、細胞および組織内ならびにそれらの間の一過性および／または細胞の遺伝子発現パターンの定性的相違または定量的相違をいう。したがって、差別的に発現される遺伝子は、例えば、正常組織と患部組織との間でその発現が定性的に変化し得る（活性化または不活化が含まれる）。遺伝子は、別の状態に対して特定の状態でオンまたはオフになり得るので、２つ以上の状態を比較することができる。定量的に調節された遺伝子は、状態内または細胞型内で標準的な技術で検出可能な発現パターンを示す。いくつかの遺伝子は、一方の状態または細胞型で発現するが、その両方では発現しない。あるいは、発現の相違は、例えば、発現が増減する（例えば、遺伝子発現は、上方制御され、増加した転写物の量を生じるか、または下方制御され、減少した転写物の量を生じる）という点で、定量的であり得る。発現が異なる程度は、以下に概説されるように、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）（ＤＮＡマイクロチップアレイ）発現アレイの使用によるような、標準的な特徴付け技術を介する定量化に十分な大きさであることを必要とする。Ｌｏｃｋｈａｒｔ、（１９９６）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：１６７５−１６８０を参照のこと。他の技術としては、定量逆転写酵素ＰＣＲ、ノーザン分析、およびＲＮａｓｅ保護が挙げられるが、これらに限定されない。上記に概説されるように、好ましくは、発現の変化（例えば、上方制御または下方制御）は、少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約１００％、より好ましくは少なくとも約１５０％、より好ましくは少なくとも約２００％であり、３００％から少なくとも１０００％までが特に好ましい。
評価は、遺伝子転写物レベルまたはタンパク質レベルで行われ得る。遺伝子発現の量は、遺伝子転写物のＲＮＡ等価物またはＤＮＡ等価物に対する核酸プローブを使用してモニタリングされ得、そして遺伝子発現レベルまたは最終遺伝子産物自体（タンパク質）の量は、例えば、ＣＳ１タンパク質に対する抗体および標準的な免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡなど）または他の技術（質量分析、二次元ゲル電気泳動アッセイなどが挙げられる）によってモニタリングされ得る。ＣＳ１に対応するタンパク質（例えば、疾患の表現型において重要であると同定されたタンパク質）は、疾患の診断試験で評価され得る。別の実施形態において、遺伝子発現のモニタリングは、多くの遺伝子について同時に行われる。複数のタンパク質発現のモニタリングも、同じく行われ得る。
この実施形態において、ＣＳ１核酸プローブは、特定の細胞中のＣＳ１配列の検出および定量化のために、本明細書中に概説されるようにバイオチップに接着される。アッセイは、以下の実施例にさらに記載される。ＰＣＲ技術が使用されて、より高い感度が提供され得る。
１つの実施形態において、ＣＳ１をコードする核酸が、検出される。ＣＳ１タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡが検出され得るが、ＣＳ１タンパク質をコードするｍＲＮＡを検出する方法が特に目的とされる。ｍＲＮＡを検出するためのプローブは、そのｍＲＮＡと相補的であり得、かつハイブリダイズするヌクレオチド／デオキシヌクレオチドプローブであり、そしてこのプローブとしては、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。プローブはまた、本明細書中に定義されるように、検出可能な標識を含む必要がある。１つの方法において、ｍＲＮＡは、ナイロンメンブレンのような固体支持体上への試験されるべき核酸の固定およびプローブとサンプルとのハイブリダイゼーションの後に検出される。非特異的結合プローブを除去するための洗浄後、この標識は検出される。別の方法において、このｍＲＮＡの検出は、インサイチュで行われる。この方法において、透過処理された細胞サンプルまたは組織サンプルは、プローブを標的ｍＲＮＡにハイブリダイズさせるのに十分な時間、検出可能に標識された核酸プローブに接触される。非特異的結合プローブを除去するための洗浄後、標識は検出される。例えば、骨髄腫タンパク質をコードするｍＲＮＡに対して相補的であるジゴキシゲニン標識リボプローブ（ＲＮＡプローブ）は、ジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン二次抗体との結合によって検出され、そしてこのプローブを、ニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートで発色される。
別の実施形態において、本明細書中に記載される３つのタンパク質のクラス由来の種々のタンパク質（分泌タンパク質、膜貫通タンパク質、または細胞内タンパク質）は、診断アッセイで使用される。ＣＳ１タンパク質、抗体、核酸、改変タンパク質、およびＣＳ１配列を含む細胞は、診断アッセイで使用される。これは、個々の遺伝子レベルまたは対応するポリペプチドレベルで行われ得る。１つの実施形態において、発現プロフィールは、好ましくは発現プロフィール遺伝子および／または対応するポリペプチドをモニタリングするための高処理スクリーニング技術と組み合わせて使用される。
本明細書中に記載され、そして定義されるように、ＣＳ１タンパク質は、ＳＬＥ、ＲＡ、およびＩＢＤのような自己免疫障害、ならびに骨髄腫および形質細胞性白血病のような癌性状態の疾患マーカーとして適用される。さらに、ＣＳ１は、予後または診断目的のマーカーとして適用される。推定の患部組織中のこれらのタンパク質の検出は、このような状態の検出予後、または診断、ならびに治療ストラテジーの選択を可能にする。１つの実施形態において、抗体が使用されて、ＣＳ１が検出される。好ましい方法は、ゲル（代表的に、変性および還元タンパク質ゲルであるが、ゲルの別の型（等電点電気泳動ゲルなどが含まれる）も可能である）での電気泳動によってサンプルからタンパク質を分離する。タンパク質の分離後、ＣＳ１は、例えば、ＣＳ１に対して惹起された抗体による免疫ブロッティングによって検出される。
別の方法では、ＣＳ１に対する抗体は、インサイチュ画像化技術（例えば、組織学）で適用される。例えば、Ａｓａｉら編、（１９９３）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、（第３７巻）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。この方法において、細胞は、骨髄腫タンパク質に対する１つから多数の抗体に接触される。非特異的な抗体結合を除去するための洗浄後、抗体の存在が検出される。１つの実施形態において、抗体は、検出可能な標識を含む二次抗体と共にインキュベートすることによって検出される。別の方法において、ＣＳ１に対する一次抗体は、検出可能な標識（例えば、基質に作用し得る酵素マーカー）を含む。別の実施形態において、複数一次抗体のそれぞれ１つは、異なる検出可能な標識を含む。この方法は、特に、ＣＳ１と上記される状態の他のマーカーとの同時スクリーニングで適用される。多くの他の組織学的画像化技術もまた、本発明によって提供される。
１つの実施形態において、上記標識を異なる波長の放射を検出し、そして区別する能力を有する蛍光光度計で検出する。さらに、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）が、この方法において使用され得る。
別の実施形態において、抗体は、血液、血清、血漿、糞、および他のサンプルから自己免疫障害（例えば、ＳＬＥ、ＲＡ、およびＩＢＤ）および癌（例えば、骨髄腫および形質細胞性白血病）を診断するのに適用される。したがって、このようなサンプルは、ＣＳ１の存在について精査されるか、または試験されるべきサンプルとして有用である。抗体が使用されて、これまでに記載された免疫アッセイ技術（ＥＬＩＳＡ、免疫ブロッティング（ウェスタンブロッティング）、免疫沈降、およびＢＩＡＣＯＲＥテクノロジーなどが挙げられる）によってＣＳ１が検出され得る。逆に、抗体の存在は、内因性ＣＳ１タンパク質に対する免疫応答を示し得る。
別の実施形態において、標識されたＣＳ１核酸プローブの組織アレイへのインサイチュハイブリダイゼーションが、行われる。例えば、患部組織および／または正常組織を含む組織サンプルのアレイが、作製される。次いで、インサイチュハイブリダイゼーション（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、前出を参照のこと）が、行われる。個体と標準との間のフィンガープリントを比較する場合、診断、予後、または予想は所見に基づき得る。診断を示す遺伝子は予後を示す遺伝子と異なり得、そして細胞の状態の分子プロフィールは、応答性の状態と不応性の状態との間の区別をもたらし得るか、または結果を予想し得ることがさらに理解される。
１つの実施形態において、ＣＳ１タンパク質、抗体、核酸、改変タンパク質、およびＣＳ１配列を含む細胞は、予後のアッセイにおいて使用される。上記のように、長期の予後に関して疾患状態、臨床上の情報、病理学的情報、または他の情報に相関する遺伝子発現プロフィールが、作製され得る。再び、これは、タンパク質レベルまたは遺伝子レベルで行われ得、遺伝子の使用が好ましい。単一または複数の遺伝子は、種々の組み合わせで有用であり得る。上記のように、ＣＳ１プローブは、組織または患者におけるＣＳ１配列の検出および定量化のためにバイオチップに接着され得る。このアッセイは、診断のために上記で概説されるように進行する。ＰＣＲ法は、より高感度かつ正確な定量化を提供し得る。
予後のアッセイで有用な遺伝子は、患者の疾患の段階に従って異なって発現される遺伝子である。１つの実施形態において、この遺伝子は、患者の段階によって固有に発現され得る。別の実施形態において、この遺伝子は、患者の段階によって異なるレベルで発現され得る。例えば、骨髄腫において、患者は、疾患の範囲および位置にしたがって以下の３つの異なる段階に分類される：段階Ｉ、段階ＩＩ、および段階ＩＩＩ。段階Ｉでは、症状は、軽微であるか存在せず、多数の患者は骨髄腫の症状を示さない。陽性の診断は、腫瘍細胞の存在である；しかし、赤血球の数は、正常であるか正常範囲をわずかに下回り、血中のカルシウムの増加は検出不可能であり、血中および尿中のＭタンパク質のレベルは非常に低く、そして検出可能な骨損傷は、Ｘ線では見ることができない。段階ＩＩでは、癌細胞は、より多数で蔓延している。腎機能が、影響を受け得、ほとんどの患者について、予後の診断は、悪化する。段階ＩＩＩでは、貧血、高カルシウム血症、進行した骨損傷、および血中および尿中の高レベルのＭタンパク質が生じる。自己免疫障害におけるタンパク質発現と異なる段階との相関はまた、このような障害の予後の決定で有用であることが明らかであり得る。固有に発現されるか、または段階によって異なる発現レベルを有する、異なる段階で発現される遺伝子の相関を使用して、患者の寛解誘導の実現可能性が決定され得る。これは、骨髄腫患者がほとんど症状を示さない、疾患のより初期の段階で特に有用である。さらに、β−２ミクログロブリン（腎臓損傷の指標）ならびに高レベルの血清アルブミンおよび乳酸デヒドロゲナーゼなどの長期合併症の発症を示す発現された遺伝子もまた、予後のツールとして有用であり得る。
固有に発現されるか、または段階によって異なる発現レベルを有する、異なる段階で発現される遺伝子の相関はまた、本発明に開示される治療法を使用する処置の有効性を決定するためにモニタリングされ得る。例えば、本発明のアンタゴニストによって治療された患者は、マーカー（例えば、ＣＳ１または障害特異的マーカーと組み合わせたＣＳ１が挙げられる）のモニタリング（例えば、骨髄腫の処置についてのＭタンパク質のモニタリング）によって、このアンタゴニストの治療の有効性についてモニタリングされ得る。これらの特異的マーカーのモニタリングは、本発明の治療効力の決定、ならびに本発明の異なる指標についての投薬量の決定および処置の方法の検討において重要である。
（インビボモデル系としての疾患障害の誘導）
（炎症性腸疾患）
インビボ実験モデルは、炎症性腸疾患の病理学的プロセスの調査のために開発された。Ｓａｒｔｏｒ ＲＢ，Ａｌｉｍｅｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：８９−９６（１９９７）。例えば、ノックアウトトランスジェニックマウスが、作製され得、このノックアウトトランスジェニックマウス中では、炎症性腸疾患遺伝子が破壊されているか、炎症性腸疾患遺伝子が挿入されている。ノックアウトトランスジェニックマウスは、相同組換えによるマーカー遺伝子または他の異種遺伝子の、マウスゲノム中の内因性炎症性腸疾患遺伝子部位への挿入によって作製され得る。このようなマウスはまた、内因性炎症性腸疾患遺伝子を炎症性腸疾患遺伝子の変異したバージョンで置換するか、または内因性炎症性腸疾患遺伝子を、例えば、発癌物質への曝露により変異させることによって作製され得る。
ＤＮＡ構築物は、胚性幹細胞の核に導入される。新たに操作された遺伝子損傷を含む細胞は、宿主マウスの胚に注射され、この胚はレシピエントの雌に再移植される。これらの胚のいくつかは、部分的に変異細胞株に由来する生殖細胞を有するキメラマウスに成長する。したがって、キメラマウスの交配することによって、導入された遺伝子損傷を含む新規のマウス系統を得ることが可能である（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉら、（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２を参照のこと）。キメラ標的化マウスは、Ｈｏｇａｎら、（１９８８）、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ；およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ編、（１９８７）、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．に従って得られ得る。
他のモデルは、動物モデルの非遺伝子操作を使用して構築され得る。特に、１つのモデルが、低分子スクリーニングにおいて広範に使用されてきた。このモデルは、ハプテン２，４，−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）の溶液による単回結腸内攻撃誘発によって、ラットまたはマウスに大腸炎を誘導する。Ｍｏｒｒｉｓ ＧＰら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ９６：７９５−８０３（１９８９）；Ｂｏｕｇｈｔｏｎ−Ｓｍｉｔｈ ＮＫ、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．９４：６５−７２（１９８８）。ＴＮＢＳによる処置は、２〜３日後に最下点に達し、そして２１日目まで持続し得る激症性局所炎症反応を生じ、この反応は、攻撃誘発の強さに依存する。
ＴＮＢＳ処置によって生じた炎症反応は、クローン病の多数の巨視的特徴、組織学的特徴、および免疫学的特徴を再現すると考えられる。Ｇｒｉｓｈａｍ ＭＢら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １０１：５４０−５４７（１９９１）；Ｙａｍａｄａ Ｙら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １０２：５２４−５３４（１９９２）；Ｔｏｒｒｅｓ ＭＩら、Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ ４４：２５２３−２９（１９９９）；Ｎｅｒｕａｔｈ Ｍ、Ｆｕｓｓ Ｉ、Ｓｔｒｏｂｅｒ Ｗ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：５１−６２（２０００）。貫壁性炎症および腸壁の肥厚を伴う開放性潰瘍形成が、観察される。組織学的特徴としては、陰窩構造の歪み、陰窩萎縮、肉芽腫、巨細胞、基底リンパ球凝集、および炎症性浸潤の存在が挙げられる。
上記モデルは、結腸炎症を研究および検証し、炎症性腸疾患の局面に取り組むために使用された。Ｈｏｆｆｍａｎ Ｐら、Ｇｕｔ ４１：１９５−２０２（１９９７）；Ｊａｃｏｂｓｏｎ Ｋ、ＭｃＨｕｇｈ Ｋ、Ｃｏｌｌｉｎｓ ＳＭ、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１２：１５６−６２（１９９７）。
他の動物モデルとしては、ＨＬＡ−Ｂ２７トランスジェニックラット（Ｈａｍｍｅｒ ＲＥら、Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｆｅｎｉｃ ｒａｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＨＬＡ−Ｂ２７ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ ｂ２Ｍ：Ａｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ＨＬＡ−Ｂ２７ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，Ｃｅｌｌ ６３：１０８８−１１１２（１９９０））、トランスジェニックＩＬ−２欠損マウス（Ｂａｕｍｇａｒｔ ＤＣら、Ｍｅｃｈａｎｓｉｓｍｓ ｏｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ ｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８７：５２−６６（１９９８））、ｍｄｒ１ａ欠損マウス（Ｐａｎｗａｌａ ＣＭら、Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｍｉｃｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ，ｍｄｒ１ａ，ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｄｅｖｅｌｏｐ ｃｏｌｉｔｉｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：５７３３−４４（１９９８））、およびＩＬ１０欠損マウス（Ｆｒｅｅｍａｎ ＨＪ、Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０ ｇｅｎｅ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｃｏｌｉｔｉｓ、Ｃａｎａｄｉａｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（２００３））が挙げられる。
（骨髄腫）
インビボ実験モデルが、骨髄腫の病理学的プロセスの調査のために開発された。Ｓａｒｔｏｒ ＲＢ、Ａｌｉｍｅｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：８９−９６（１９９７）。例えば、ノックアウトトランスジェニックマウスが作製され得、このノックアウトトランスジェニックマウス中では、骨髄腫遺伝子が、破壊されるか、骨髄腫遺伝子が、挿入される。ノックアウトトランスジェニックマウスは、相同組換えによるマーカー遺伝子または他の異種遺伝子のマウスゲノム中の内因性骨髄腫遺伝子部位への挿入によって作製され得る。このようなマウスはまた、内因性骨髄腫遺伝子を骨髄腫遺伝子の変異したバージョンで置換するか、または、例えば、発癌物質への曝露により内因性骨髄腫遺伝子を変異させることによって作製され得る。
ＤＮＡ構築物は、胚性幹細胞の核に導入される。新たに操作された遺伝子損傷を含む細胞は、宿主マウスの胚に注射され、この胚はレシピエント雌に再移植される。これらの胚のいくつかは、部分的に変異細胞株に由来する生殖細胞を有するキメラマウスに成長する。したがって、キメラマウスを交配することによって、導入された遺伝子損傷を含む新規のマウス系統を得ることが可能である（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉら、（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２を参照のこと）。キメラ標的化マウスは、Ｈｏｇａｎら、（１９８８）、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ；およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ編、（１９８７）、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．に従って得られ得る。
他のモデルは、動物モデルの非遺伝子操作を使用して構築され得る。例えば、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスへのＢ細胞腫瘍（例えば、ＬＬＣ細胞）の注射は、肺転移を誘導し得る。他の動物モデルは、ＳＣＩＤマウスを利用し、そして骨髄腫様特徴を誘導するために、Ｂ細胞腫瘍株（例えば、ＨｓＳｕｌｔａｎ細胞（ＡＴＣＣ）または多発性骨髄腫株（例えば、Ｌ３６３、ＬＰ−１、ＯＰＭ−２、またはＲＰＭＩ８２２６が挙げられるが、これらに限定されない）を注射する。さらに他の動物モデルとしては、ヒト胎児骨（ＦＢ）をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの皮下部位へ移植し、次いで多発性骨髄腫を有する患者から得られた原発性骨髄単核細胞をＦＢに接種することによって作製されたヒト多発性骨髄腫のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスモデルが挙げられる。Ｓｈａｎｇ−Ｙｉ Ｈ．ら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｐａｔｈｏｌ．１６４：７４７−７５６（２００４）を参照のこと。マウス形質細胞腫モデル（その形成はプリスタンオイル（２，６，１０，１２−テトラメチルペンタデカン）処理によって誘導される）もまた、使用され得る。さらに、ＳＣＩＤマウス、ＳＣＩＤ／ベージュマウス、またはＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの骨髄に骨髄腫細胞が直接注射されたマウスモデル（同所注射モデル）もまた、使用され得る。
骨髄腫細胞におけるような形質転換された細胞は、それらの正常な対応物よりも増加した量の特定の因子（本明細書中で以下、「骨髄腫特異的マーカー」）を放出する。例えば、骨髄腫細胞中の発現において、ＣＤ３８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＤ２０は、増加される。Ｒｕｉｚ−Ａｒｕｇｅｌｌｅｓ ＧＪおよびＳａｎ Ｍｉｇｕｅｌ ＪＦ，Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．６９：６８４−９０（１９９４）。
これらの因子の放出を測定する種々の技術は、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、（１９９８）、前出に記載されている。Ｕｎｋｅｌｅｓｓら、（１９７４）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９：４２９５−４３０５；ＳｔｒｉｃｋｌａｎｄおよびＢｅｅｒｓ、（１９７６）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１：５６９４−５７０２；Ｗｈｕｒら、（１９８０）、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４２：３０５−３１２；Ｍｉｈｉｃｈ編、（１９８５）、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ ＰｌｅｎｕｍのＧｕｌｌｉｎｏ「Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｔｕｍｏｒ ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ」、ｐｐ．１７８−１８４；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、（１９８５）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５：１１１−１３０も参照のこと。
（処置方法）
（自己免疫疾患の処置）
１つの局面において、本発明は、白血球の増殖、付着、分化、活性化、および／または同時活性化を減少させる方法に関し、この方法は、白血球を本明細書中に記載されるＣＳ１のアンタゴニストに接触させる工程を包含する。
別の局面において、本発明は、リンパ球（例えば、Ｂ細胞）による免疫グロブリンの分泌（または産生）を減少させる方法に関し、この方法は、白血球を本明細書中に記載されるＣＳ１のアンタゴニストに接触させる工程を包含する。本発明のアンタゴニストは、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ）の産生を少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％減少させ得る。変化の％は、抗体の第１の用量の投与前（０日目）の免疫グロブリン濃度を、投与後（ｘ日目）の免疫グロブリン濃度から減算し、これを第１の用量前（０日目）の免疫グロブリン濃度で除算し、１００を掛けることにより計算する（例えば、［（ｘ日目−０日目）／０日目］×１００）。
なお別の局面において、本発明は、ＣＳ１を発現する細胞のアポトーシスまたは細胞溶解を誘導する方法に関し、この方法は、細胞を本明細書中に記載されるＣＳ１に対する抗体と接触させる工程を包含する。好ましい実施形態において、誘導は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して達成される。一般に、本発明の抗体は、エフェクター細胞（ナチュラルキラー細胞またはマクロファージなど）の存在下で標的細胞（ＣＳ１を発現する細胞）の表面上の抗原に結合する。エフェクター細胞上のＦｃ受容体は、結合した抗体を認識する。Ｆｃ受容体の架橋は、エフェクター細胞に細胞溶解またはアポトーシスによって標的細胞を死滅させるようにシグナルを伝達する。細胞溶解は、溶解した細胞からの標識もしくは乳酸デヒドロゲナーゼの放出のいずれかの検出、または標的細胞の生存性の減少の検出（例えば、アネキシンアッセイ）によって検出され得る。アポトーシスについてのアッセイは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイによって行われ得る（Ｌａｚｅｂｎｉｋら、Ｎａｔｕｒｅ：３７１、３４６（１９９４））。細胞傷害性はまた、当該分野で公知の検出キット（例えば、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）の細胞傷害性検出キット）によって直接検出され得る。好ましくは、本発明の抗体は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または８０％の細胞傷害性を標的細胞に対して誘導する。この％は、実施例に開示される方法によって計算される。
上記アンタゴニストは、インビトロ（例えば、白血球が培養される細胞培養環境へアンタゴニストを添加することによる）、エキソビボ、またはインビボ（例えば、被験体へアンタゴニストを投与することによる）で白血球と接触させられ得る。
好ましい実施形態において、白血球は、ａ）活性化リンパ球（例えば、Ｂ細胞および／またはＴ細胞（好ましくは、ＣＤ１９＋Ｂ細胞および／またはＣＤ３＋Ｔ細胞））；ｂ）ＣＤ１４＋活性化細胞および／もしくはナイーブな細胞；ｃ）活性化および／もしくは非活性化樹状細胞；ならびに／またはｃ）ＣＤ５６＋ＮＫおよび／もしくはＮＫＴ細胞である。
好ましい局面において、本発明は、Ｂ細胞によって免疫グロブリン分泌を減少させる方法を、それを必要とする被験体において提供し、この方法は、被験体に有効量のＣＳ１のアンタゴニストを投与する工程を包含する。
別の好ましい局面において、本発明は、ＣＳ１発現細胞の細部傷害性、細胞溶解、および／またはアポトーシスを、それを必要とする被験体において誘導する方法を提供し、被験体に有効量のＣＳ１の抗体を投与する工程を包含する。
アンタゴニスト（好ましくは、本発明の抗体）は、自己免疫疾患（アジソン病、耳の自己免疫疾患、眼の自己免疫疾患（例えば、ブドウ膜炎）、自己免疫性肝炎、クローン病、糖尿病（Ｉ型）、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、乾癬、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、潰瘍性大腸炎、および／または血管炎が挙げられるが、これらに限定されない）の予防または治療に使用され得る。
好ましい実施形態において、本発明の方法によって予防および／または処置され得る自己免疫疾患は、ＳＬＥ、ＲＡ、またはＩＢＤである。ＳＬＥ、ＲＡ、またはＩＢＤの症状が発症した被験体に投与された後、抗ＣＳ１抗体は、症状の重症度を軽減し得るはずである。あるいは、抗ＣＳ１抗体は、被験体がＳＬＥ、ＲＡ、またはＩＢＤの任意の臨床症状を発症する前に被験体に投与され得る。このような抗体の予防的投与は、被験体が任意のＳＬＥ、ＲＡ、またはＩＢＤを発症することを完全に予防するか、または少なくとも被験体の、抗体処置を行わない状態において見られるような重篤な症状を予防するはずである。ＳＬＥ、ＲＡ、またはＩＢＤの症状の重症度は、当該分野において公知であるＳＬＥ、ＲＡ、またはＩＢＤの標準的な臨床試験（例えば、抗ＤＮＡ抗体の血清レベル、タンパク尿、および患者の死亡率）によって、測定され得る。
治療方法は、通常、ヒト患者に適用されるが、他の哺乳動物に適用され得る。
（癌処置）
骨髄腫細胞の増殖を減少させるための治療方法もまた含まれ、この方法は、骨髄腫細胞を骨髄腫タンパク質のアンタゴニスト（好ましくは、本明細書中に記載されるＣＳ１抗体のような抗体または他のアンタゴニスト）と接触させる工程を包含する。例えば、この抗体は、インビトロ（骨髄腫細胞を培養する細胞培養環境へのアンタゴニストの添加によるなど）、エキソビボ、またはインビボ（例えば、被験体へのアンタゴニストの投与による）で骨髄腫細胞と接触され得る。別の局面において、本発明は、骨髄腫細胞の増殖を減少させる方法を提供し、この方法は、有効量の骨髄腫タンパク質アンタゴニストを被験体に投与する工程を包含する。
１つの局面において、アンタゴニスト（好ましくは、本発明の抗体）は、骨髄腫の予防または処置のために使用され得る。骨髄腫の症状を発症した被験体に投与された後、上記抗体またはアタゴニストは、症状の重症度を軽減し得るはずである。あるいは、本発明の抗体は、被験体が骨髄腫の任意の臨床症状を発症する前に被験体に投与され得る。骨髄腫の症状の重症度は、当該分野において公知である骨髄腫の標準的な臨床試験（骨密度Ｘ線分析、β−２ミクログロブリンレベル、または高カルシウム血症など）によって測定され得る。治療方法は、通常、ヒト患者に適用されるが、他の哺乳動物に適用され得る。
なお別の局面において、本発明は、ＣＳ１を発現する細胞のアポトーシスまたは細胞溶解を誘導する方法に関し、細胞を本明細書中に記載されるＣＳ１に対する抗体に接触させる工程を包含する。好ましい実施形態において、この誘導は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によって行われる。一般的に、本発明の抗体は、エフェクター細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞またはマクロファージ）の存在下で標的細胞（ＣＳ１を発現する細胞）の表面上の抗原に結合する。エフェクター細胞上のＦｃ受容体は、結合した抗体を認識する。Ｆｃ受容体の架橋は、エフェクター細胞に細胞溶解またはアポトーシスによって標的細胞を死滅させるようにシグナルを伝達する。細胞溶解は、溶解細胞からの標識もしくは乳酸デヒドロゲナーゼの放出の検出、または標的細胞の生存性の減少の検出（例えば、アネキシンアッセイ）によって検出され得る。アポトーシスについてのアッセイは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイによって行われ得る（Ｌａｚｅｂｎｉｋら、Ｎａｔｕｒｅ：３７１、３４６（１９９４））。細胞傷害性はまた、当該分野で公知の検出キット（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の細胞傷害性検出キット）によって直接検出され得る。好ましくは、本発明の抗体は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または８０％の細胞傷害性を標的細胞に対して誘導する。この％は、実施例に開示される方法によって計算される。
上記アンタゴニストは、インビトロ（例えば、白血球が培養される細胞培養環境へアンタゴニストを添加することによる）、エキソビボ、またはインビボ（例えば、被験体へアンタゴニストを投与することによる）で白血球と接触させられ得る。
好ましい実施形態において、白血球は、ａ）活性化リンパ球（例えば、Ｂ細胞および／またはＴ細胞（好ましくは、ＣＤ１９＋Ｂ細胞および／またはＣＤ３＋Ｔ細胞））；ｂ）ＣＤ１４＋活性化細胞および／もしくはナイーブな細胞；ｃ）活性化および／もしくは非活性化樹状細胞；ならびに／またはｃ）ＣＤ５６＋ＮＫおよび／もしくはＮＫＴ細胞である。
好ましい局面において、本発明は、Ｂ細胞によって免疫グロブリン分泌を、それを必要とする被験体において減少させる方法を提供し、この方法は、被験体に有効量のＣＳ１のアンタゴニストを投与する工程を包含する。このようなＢ細胞による免疫グロブリン分泌の減少は、骨髄腫の合併症（過粘稠血症候群が挙げられる）を軽減するのに役立ち得る。
本発明の別の好ましい態様は、ＣＳ１を発現する細胞の細胞傷害性、細胞溶解、および／またはアポトーシスを、それを必要とする被験体において誘導する方法を提供し、この方法は、有効量のＣＳ１の抗体を被験体に投与する工程を包含する。
（治療薬の投与）
アンタゴニスト（例えば、本発明の抗体）を投与する種々の方法が存在する。非経口投与が好ましい。抗体は、ボーラスとして患者に対して静脈内に投与されても、長期間の連続注入によるか、筋肉内、皮下、腹腔内、または脳脊髄内の経路によって投与されてもよい。経口経路、局所経路、吸入経路、または当業者に公知の他の送達手段もまた、本発明に包含される。
本発明の薬学的組成物は、受容可能なキャリア（好ましくは、水性キャリア）に溶解したアンタゴニスト（例えば、抗体）、またはそのカクテルの溶液を共通して含有する。種々の水性キャリア（例えば、注射用水（ＷＦＩ）またはリン酸、クエン酸、酢酸などによって、代表的にはｐＨ５．０〜８．０、最も多くの場合にはｐＨ６．０〜７．０に緩衝化され、そして／または等張にするための塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウムなど）を含む水）が、使用され得る。キャリアはまた、活性タンパク質を保護するために賦形剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリソルベート８０、糖、またはアミノ酸）を含み得る。これらの処方物中のアンタゴニスト（例えば、抗体）の濃度は、約０．１〜１００ｍｇ／ｍｌで広範に変化するが、多くの場合、１〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲である。処方されたモノクローナル抗体は、特に非経口投与に適し、そして静脈内注入として投与されても、皮下注射、筋肉内注射、または静脈内注射によって投与されてもよい。非経口的に投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に公知であるか、または明らかであり、そして、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（第１５版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０）（これは、本明細書中に参考として援用される）に、より詳細に記載される。本発明は、本明細書中に記載される抗体のいずれか１つを含有する薬学的組成物を提供する。
上記組成物は、ＣＳ１とその細胞基質との間の相互作用を阻害する工程、罹患細胞の付着を阻害する工程、または上記障害の臨床症状を防止するか、そして／もしくは軽減する工程を包含する予防的および／または治療的な処置のために投与され得る。これらの所望の効果のいずれか１つの達成に適した量は、「有効量」と定義される。この抗体は、単回または複数回の投与によって送達され得る。
疾患の処置を目的として、アンタゴニスト（例えば、抗体）の適切な投薬量は、疾患の重症度および経過、患者の臨床歴および応答、抗体の毒性、ならびに主治医の判断に依存する。このアンタゴニストは、患者に対して１回かまたは一連の処置にわたって、適切に投与される。最初の候補投薬量が、患者に投与され得る。適切な投薬量および処置レジメンは、当業者に公知である従来技術を使用して療法の進行をモニタリングすることによって確立され得る。
さらに、上記アンタゴニスト（例えば、抗体）は、実質的に純粋な形態で、単独で利用されても、当業者に公知である自己免疫疾患用治療剤と共に使用されてもよい。この抗体による処置と組み合わせて使用され得る他の療法としては、アンチセンス核酸分子または生物製剤（例えば、さらなる治療用抗体）の投与が挙げられる。したがって、本発明の処置は、この処置が自己免疫疾患の処置のための別の因子と連続的に施され得るか、またはそれと組み合わせて施され得る様式で処方される。自己免疫障害および骨髄腫を処置するために、この抗体は、多くの場合、抗体を１種以上の他の免疫抑制薬および免疫調節剤の後か、またはそれらと組み合わせて投与される。
（診断および／または予後（診断）の用途で使用するためのキット）
上記で示唆された診断用途および研究用途における使用のために、キットもまた、本発明によって提供される。診断用途および研究用途において、このようなキットは、以下の少なくとも１つを備える：アッセイ試薬、緩衝液、ＣＳ１特異的な核酸もしくは抗体、ハイブリダイゼーションプローブおよび／またはプライマー、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ドミナント陰性なＣＳ１ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、ＣＳ１関連配列の低分子インヒビターなど。
さらに、上記キットは、本発明の方法の実施のための説明書（例えば、プロトコール）を含む説明書類を備え得る。説明書類は、代表的に、文書または印刷物を含むが、これらに限定されない。このような説明書を保存し、そしてそれらをエンドユーザーに伝達し得る媒体は、本発明によって意図される。このような媒体としては、電子的保存媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）および光学的媒体（例えば、ＣＤ ＲＯＭ）などが挙げられるが、これらに限定されない。このような媒体は、このような説明書類を提供するインターネットサイトのアドレスを含み得る。
本発明はまた、ＣＳ１関連配列のモジュレーターをスクリーニングするためのキットを提供する。このようなキットは、容易に利用可能な材料および試薬から調製され得る。例えば、このようなキットは、以下の材料の１つ以上を備え得る：ＣＳ１会合性ポリペプチドまたはＣＳ１会合性ポリヌクレオチド、反応チューブ、およびＣＳ１関連活性試験のための説明書。必要に応じて、このキットは、生物学的に活性なＣＳ１タンパク質を含む。広範なキットおよび構成要素は、このキットに関して意図されるユーザーおよびそのユーザーの特定のニーズに依存して、本発明にしたがって調製され得る。診断は、代表的に、複数の遺伝子または生成物の評価を包含する。代表的に、これらの遺伝子は、履歴または結果のデータで同定され得る疾患における重要なパラメータとの相関に基づいて選択される。
（実施例１：ＣＳ１の単離および同定）
ＣＳ１を、正常な健常成体の末梢血由来のＢ細胞サブセット（ナイーブ 対 記憶Ｂ細胞＋プラスマＢ細胞（ｐｌａｓｍａ Ｂ ｃｅｌｌｓ））のｃＤＮＡサブトラクションライブラリーから同定した。ＣＳ１は、記憶Ｂ細胞およびプラスマＢ細胞の間で優先的に発現した。サブトラクションライブラリーを、以下に記載されるプロトコールによって作製した。
（Ｂ細胞サブセットの単離：）
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、標準的なＦｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ勾配を使用して９人の健常な成人ドナーから単離した。Ｂ細胞を、以下の標準的な陰性選択プロトコールによってＰＢＭＣから単離した。ＰＢＭＣを、精製したマウス抗ヒトＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ６６、およびグリコホリンＡの抗体カクテル中でインキュベートした。インキュベーションおよび洗浄の後、ヤギ抗マウス磁性Ｄｙｎａｌビーズを、細胞１個あたり７〜１０ビーズで添加した。その後、この抗体結合細胞を、標準的なＤｙｎａｌ磁性ホルダーを使用して単離して、上清中に濃縮Ｂ細胞を遊離させた。次いで、回収した上清を、ＲＰＭＩ＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で洗浄した。
（Ｂ細胞サブセット（ナイーブＢ細胞 対 記憶Ｂ細胞＋プラスマＢ細胞の分取））
Ｄｙｎａｌ濃縮Ｂ細胞を、標準的な染色プロトコールに従って、ＩｇＤ−ＦＩＴＣ、ＣＤ３８−ｃｙｃｈｒｏｍｅ、ＣＤ１９−ＡＰＣ、およびＣＤ２７−ＰＥで染色した。ナイーブＢ細胞（ＩｇＤ＋ＣＤ１９＋ＣＤ３８ｉｎｔ／−ＣＤ２７−）対記憶Ｂ細胞およびプラスマＢ細胞（ＩｇＤ−ＣＤ１９＋ＣＤ３８ｉｎｔ／＋ＣＤ２７＋）の２つの個別の集団を、ｓｐｅｃｔｒａ ｐｈｙｓｉｃｓ空冷アルゴンレーザ（４８８ｎｍ）および６３５ｎｍのダイオードレーザならびにＦＩＴＣ（５３０／４０ｎｍ）、ＰＥ（５８０／３０ｎｍ）、ＡＰＣ（６７０／２０ｎｍ）、およびサイクローム（ＰＥ−Ｃｙ５）（６７０／３０ｎｍ）の検出のためのフィルターを備えるＭｏＦｌｏ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ−ＭＬＳで分取した。分取したＢ細胞を、純度についてＭｏＦｌｏ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで分析し、そして９７％（記憶Ｂ細胞およびプラスマＢ細胞）および９８％（ナイーブＢ細胞）の純度であることが見出された。分取した細胞を、Ｔｒｉｚｏｌ中におき、そして−７０℃で保存した。
（ｃＤＮＡライブラリーの作製）
ｃＤＮＡサブトラクションライブラリーを、標準的なＲＤＡ法（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）であるサブトラクティブハイブリダイゼーション（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）プロトコールの使用によって、分取したＢ細胞サブセットから作製した。サブトラクションライブラリーは、ナイーブｃＤＮＡを２回差し引く場合は記憶Ｂ細胞＋プラスマＢ細胞ｃＤＮＡライブラリーを含み、そして記憶＋プラスマｃＤＮＡを２回差し引く場合はナイーブＢ細胞ｃＤＮＡライブラリーを含む。標準的な分子生物学技術を使用して、ｃＤＮＡサブトラクションライブラリーを標準的なプラスミドベクターにライゲーションし、エレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ（ＤＨ−１０Ｂ）細胞に形質転換した。形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、選択用抗生物質の存在下でＬＢ寒天プレート上にプレートした。単一の細菌コロニー（それぞれ１つの特異的インサートを示す）を、標準的なコロニーＰＣＲを使用して増幅した。
（差別的発現のスクリーニングおよび確認）
ｃＤＮＡサブトラクションライブラリーのインサートを変性し、そして２つの同一のナイロンフィルターにブロッティングし、そして２つの異なる標識がなされた変性プローブ−（記憶＋プラスマ）−（ナイーブｃＤＮＡ）（２回差し引く）およびナイーブ−（記憶＋プラスマ）ｃＤＮＡ（２回差し引く）と個別にハイブリダイズさせた。このインサートが２つのプローブのうちの１つに対して優勢に、そして選択的にハイブリダイズする場合、サブトラクションライブラリーのｃＤＮＡインサートをポジティブと見なした。ＣＳ１のｃＤＮＡクローンは、（記憶＋プラスマ）−ナイーブｃＤＮＡプローブ（２回差し引く）と選択的にハイブリダイズした。
（ＣＳ１の同定）
ポジティブクローンで形質転換した細菌細胞を増殖させ、そしてＤＮＡを、製造者のプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｆｏｒｎｉａ）にしたがって、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）Ｍｉｎｉ−Ｐｒｅｐキット（インビトロ診断用調製物）を使用して単離した。精製プラスミドを配列決定し、そしてＤＮＡ配列の同一性を、ＮＣＢＩデータベースを検索することによって決定した。
（ＣＳ１遺伝子発現の特徴付けおよび確認）
選択したポジティブクローン（ＣＳ１を含む）の優先的発現を、ドットブロット分析によって確認した。分取したナイーブＢ細胞 対 記憶Ｂ細胞＋プラスマＢ細胞から単離した等量の（非サブトラクション）ｃＤＮＡ（２０ｎｇ）を、ナイロンフィルターにスポットし、そしてポジティブクローンのために標識ｃＤＮＡインサートとハイブリダイズした。これらのアッセイでは、ｃＤＮＡを、２つの個別の分類（ｎ＝９（健常成体）およびｎ＝１０健常成体、それぞれ純度は９７％超および９８％超）から得た末梢血Ｂ細胞サブセットから合成した。フィルターを洗浄し、そしてハイブリダイズしたプローブからのシグナルをオートラジオグラフィーによって検出した。ｃＤＮＡが、分取したナイーブＢ細胞 対 記憶Ｂ細胞＋プラスマＢ細胞の両方のセットにわたって、記憶Ｂ細胞＋プラスマＢ細胞のｃＤＮＡに優先的にハイブリダイズする場合、クローンをポジティブと見なした。このデータは、ＣＳ１がプラスマＢ細胞および記憶Ｂ細胞中で優勢に発現されることを示した。
（ＣＳ１はリンパ組織で主に発現される）
ドットブロットを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入し、以下の組織から作製したｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡから合成したｃＤＮＡから調製した：脾臓、リンパ節、骨髄、小腸、脳、肺、骨格筋、心臓、腎臓、および肝臓。ドットブロットを、製造者の推奨（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＤＩＧキット）にしたがって、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ＣＳ１ ＤＮＡを使用して精査し、そして化学発光（アルカリホスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体およびＣＤＰ−Ｓｔａｒ）によって可視化した。この結果は、ＣＳ１が主にリンパ組織（脾臓、リンパ節、骨髄、および小腸−おそらくパイエル板中の残存リンパ球による）で発現され、他の非リンパ器官（脳、肺、骨格筋、心臓、腎臓、および肝臓）では存在しないか発現が低いことを示す。
（実施例２：ＣＳ１の示差的発現）
（ヒト細胞）
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、標準的なＦｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ勾配からの単離によって得た。次いで、単離したＰＢＭＣを、新鮮な培養培地に２×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。ＰＢＭＣを、３μｇ／ｍｌの濃度で３日間、フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）によってか、または１０μｇ／ｍｌの濃度で８日間、アメリカヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）によって刺激した。非刺激対照ＰＢＭＣを、いかなる刺激も与えずに調製した。細胞を、１０％ ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびグルコース添加剤を含むＲＰＭＩ培地において、３７℃の７％ ＣＯ２中で培養した。
（マウス細胞）
脾臓を、２匹のＢａｌｂ／ｃマウスから得た。脾臓を、１００ミクロンのフィルターに入れた。細胞をばらばらにし、ＰＢＳで洗浄し、１，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。赤血球を、２ｍｌの溶解緩衝液にて３７℃で２分間溶解した。細胞を、２回洗浄し、１０ｍｌの培地に再懸濁し、そして計数した。非刺激細胞の一部を、直接凍結した。残りの細胞を、５μｇ／ｍｌの濃度のｃｏｎ Ａで３日間か、または１μｇ／ｍｌの濃度のＬＰＳで３日間刺激した。細胞を、１０％ＦＢＳ、抗生物質、およびグルコース添加剤を含むＤＭＥＭ培地中で培養した。
（狼瘡患者 対 年齢適合健常個体由来のＢリンパ球）
Ｂ細胞を、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ１９抗体で細胞を染色することよって、狼瘡患者および健常な個体の末梢血単核細胞から分取した。細胞を、実施例１に記載のように、ＭｏＦＬｏ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ−ＭＬＳで分取した。細胞を、ＲＮＡ分析のために、滅菌培地に回収した。
（リアルタイムＰＣＲのための全ＲＮＡの単離）
細胞を１回洗浄し、ＴｒｉｚｏｌＴＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）に入れ、そして全ＲＮＡを、製造者のプロトコールにしたがって単離した。全ＲＮＡを、ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅ（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ）で処理した。ＤＮａｓｅ消化ＲＮＡを、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで一晩沈殿させた。ＲＮＡを、７５％エタノールで洗浄し、そしてヌクレアーゼを含まない水に溶解した。単離したＲＮＡを定量し、そしてその完全性を、アガロースゲルで分析した。
（リアルタイムＰＣＲ）
全ＲＮＡ（２μｇ）を、標準的なＴａｑｍａｎ逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用することによって、１００μｌの反応混合物中の狼瘡患者 対 健常な個体の分取Ｂリンパ球から逆転写した。ＰＣＲ反応を、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックスを使用して準備した。ＣＳ１プライマーを、狼瘡患者および健常個体のｃＤＮＡ中でのＣＳ１の発現レベルを試験するためにミックス中に組み込んだ。ＣＳ１プライマーを、公開された配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＸＭ−００１６３５、ＡＦ３９０８９４）から設計した。β−アクチンプライマーおよび１８Ｓ ｒＲＮＡプライマーを、正規化の対照として使用した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアを使用してプライマーを設計した。ＰＣＲ増幅産物は、ＣＳ１プライマーについては８５ｂｐであり、β−アクチンプライマーについては８４ｂｐであり、そして１８Ｓ ｒＲＮＡプライマーについては６１ｂｐであった。リアルタイムＰＣＲを、推奨プロトコールを使用してＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＧｅｎｅＡｍｐ ５７００ ＳＤＳシステムで行った。
（新規のマウスＬｙ９のリアルタイムＰＣＲ）
全ＲＮＡ（２μｇ）を、標準的なＴａｑｍａｎ逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して１００μｌの反応混合物中でｃｏｎＡ、ＬＰＳ、および非刺激サンプルから逆転写した。ＰＣＲ反応を、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックスを使用して準備した。新規のマウスＬｙ９に特異的なプライマーを、公開された配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ４６７９０９）から設計し、刺激ｃＤＮＡサンプル 対 非刺激ｃＤＮＡサンプルにおける発現レベルを試験するために、この混合物に組み込んだ。１８Ｓ ｒＲＮＡプライマーを、正規化のために使用した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入したＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアを使用してプライマーを設計した。ＰＣＲ増幅産物は、マウスＬｙ９プライマーについては６５ｂｐであり、そして１８Ｓ ｒＲＮＡプライマーについては６１ｂｐであった。リアルタイムＰＣＲを、推奨プロトコールを使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＧｅｎｅＡｍｐ５７００配列検出システムで行った。
（マイクロアレイアッセイ：サンプル調製、標識マイクロチップ、およびフィンガープリント）
活性化白血球集団および非活性化白血球集団の発現プロフィールを、遺伝子チップを使用して、決定し、かつ分析した。特注のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）オリゴヌクレオチドマイクロアレイは、約３５，０００個の固有のｍＲＮＡ転写物の調査を可能にする。
ＲＮＡを、記載されるように、単離し、そして遺伝子チップ分析を行った（Ｈｅｎｓｈａｌｌら、（２００３）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６３：４１９６−４２０３；Ｈｅｎｓｈａｌｌら、（２００３）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２：６００５−１２；Ｇｌｙｎｎｅら、（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ ４０３：６７２−６７６；Ｚｈａｏら、（２０００）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１４：９８１−９９３（その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
・ＱｉａｇｅｎのＲＮＥＡＳＹ（登録商標）（全ＲＮＡからのポリＡ＋ ｍＲＮＡの精製）キットでの全ＲＮＡからのポリＡ＋ ｍＲＮＡの精製または全ＲＮＡの浄化
ｏｌｉｇｏｔｅｘ懸濁液を３７℃に加熱し、そしてＲＮＡに添加する直前に混合した。溶出緩衝液を、７０℃でインキュベートした。緩衝液中に沈殿が存在する場合、２×結合緩衝液を、６５℃に温め得ることに留意のこと。全ＲＮＡを、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ Ｈａｎｄｂｏｏｋの１６ページの表２にしたがって、ＤＥＰＣ処理水、２×結合緩衝液、およびＯｌｉｇｏｔｅｘと混合した。この混合物を、６５℃で３分間インキュベートし、その後室温で１０分間インキュベートした。
チューブを、１４，０００ｇ〜１８，０００ｇで２分間遠心分離した。遠心分離機が「穏やかな設定」を有する場合、これを使用すべきであることに留意のこと。上清を、Ｏｌｉｇｏｔｅｘペレットを破壊することなく除去した。少量の溶液を、Ｏｌｉｇｏｔｅｘの喪失を減少させるためにのこし得る。上清を、一定の満足な結合およびポリＡ＋ ｍＲＮＡの溶出が起きたことを確信するまで、保持するべきである。
ペレットを洗浄緩衝液ＯＷ２に穏やかに再懸濁し、スピンカラム上にピペッティングする。スピンカラムを、最大速度（可能な場合、穏やかな設定）で１分間遠心分離した。遠心分離後、スピンカラムを、新規の回収チューブに移し、洗浄緩衝液ＯＷ２に穏やかに再懸濁し、本明細書中にされるように再び遠心分離した。
スピンカラムを新規のチューブに移し、２０〜１００μｌの予め加熱（７０℃）した溶出緩衝液で溶出した。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ樹脂を、上下にピペッティングすることによって穏やかに再懸濁し、次いで上記のように遠心分離した。溶出手順を、新鮮な溶出緩衝液を使用して繰り返した。その他に、溶出容量を小さくする必要がある場合、第１の溶出のみを使用し得る。
吸光度を、ブランクとして希釈した溶出緩衝液を使用して読み取った。
・エタノール沈殿
ｃＤＮＡ合成を進行させる前に、ｍＲＮＡを沈殿させた。いくつかの残存成分またはＯｌｉｇｏｔｅｘ精製手順からの溶出緩衝液は、ｍＲＮＡの下流の酵素反応を阻害する。
０．４倍容量の７．５Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ＋２．５倍容量の冷１００％エタノールを溶出物に添加した。この溶液を、−２０℃で１時間から一晩（または−７０℃で２０〜３０分間）沈殿させた。沈殿溶液を、１４，０００〜１６，０００×ｇにて４℃で３０分間遠心分離した。ペレットを、０．５ｍｌの８０％エタノール（−２０℃）で洗浄し、次いで１４，０００〜１６，０００×ｇにて室温で５分間遠心分離した。８０％エタノール洗浄を、１回繰り返した。ペレットを、フード（ｈｏｏｄ）で乾燥させた。（急激に吸引しないこと）。ペレットを、１μｇ／μｌの濃度のＤＥＰＣ Ｈ２Ｏに懸濁した。
・ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙキットを使用して全ＲＮＡを浄化する工程
１００μｇを超えないＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙカラムに添加すればよい。サンプル容量を、ＲＮａｓｅを含まない水で１００μｌに調整し、３５０μｌの緩衝液ＲＬＴを、サンプルに添加し、次いで２５０μｌのエタノール（１００％）をサンプルに添加した。溶液を、ピペッティング（遠心分離しないこと）によって混合し、次いでサンプルを、ＲＮｅａｓｙミニスピンカラムに付与した。ミニスピンカラムを、１０，０００ｒｐｍ超で１５秒間遠心分離した。収率について問題ある場合、流出物（ｆｌｏｗｔｈｒｏｕｇｈ）は、再度カラムに適用され得、そして再度遠心分離され得る。
カラムを、新規の２ｍｌ回収チューブに移し、５００μｌの緩衝液ＲＰＥを添加し、そして１０，０００ｒｐｍ超で１５秒間遠心分離した。流出物を破棄した。５００μｌの緩衝液ＲＰＥをミニスピンカラムに再度添加し、１０，０００ｒｐｍ超で１５秒間遠心分離した。流出物を再度破棄し、最大速度で２分間遠心分離して、カラムの膜を乾燥させた。このカラムを、新規の１．５ｍｌ回収チューブに移し、３０〜５０μｌのＲＮａｓｅを含まない水をカラムの膜に直接適用した。カラムを、１０，０００ｒｐｍ超で１分間遠心分離し、溶出を繰り返した。
吸光度の読み取りを、行った。必要に応じて、溶出液を、酢酸アンモニウムおよび２．５倍容量の１００％エタノールで沈殿させてもよい。
（Ｇｉｂｃｏの「ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（登録商標）Ｃｈｏｉｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」キットを使用してｃＤＮＡを作製する工程）
・第１のｃＤＮＡ鎖の合成
５μｇの全ＲＮＡまたは１μｇのポリＡ＋ ｍＲＮＡを、出発物質として使用した。全ＲＮＡのために、２μｌのＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（登録商標）ＲＴ（ｃＤＮＡ合成のために逆転写酵素を使用するキット）を使用した（ポリＡ＋ ｍＲＮＡのために１μｌのＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（登録商標）ＲＴを使用する）。第１の鎖の合成混合物の最終容量は、２０μｌであるべきである。ＲＮＡの容量は、１０μｌを超えない容量でなければならない。ＲＮＡを、１μｌの１００ｐｍｏｌ Ｔ７−Ｔ２４オリゴと７０℃で１０分間インキュベートした。氷上で、７μｌの（４μｌの５×第１の鎖の緩衝液、２μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ、および１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ）混合物を添加した。混合物を、３７℃で２分間インキュベートし、次いでＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（登録商標）ＲＴを添加した。
混合物を、３７℃で１時間インキュベートした。
・第２の鎖の合成
第１の鎖の反応物を氷上においた。
混合物に、以下を添加した：
９１μｌのＤＥＰＣ Ｈ２Ｏ
３０μｌの５×第２の鎖の緩衝液
３μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物
１μｌの１０Ｕ／μｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ
４μｌの１０Ｕ／μｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ
１μｌの２Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｈ
２つを超えるサンプルが存在する場合、上記を混合物にすべきである。添加した混合物を、１６℃で２時間インキュベートした。
２μｌのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを添加し、１６℃で５分間さらにインキュベートした。１０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを添加して、反応を停止した。
・ｃＤＮＡの浄化
ゲルチューブ中でのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）精製を使用して、ｃＤＮＡを浄化した。
ＰＬＧ（フェーズロックゲル）チューブを、最大速度で３０秒間遠心分離し、新規のＰＬＧチューブに移した。同容量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールを添加し、激しく振盪した（ボルテックスしないこと）。チューブを最大速度で５分間遠心分離した。上部の水相の溶液を、新規のチューブに移した。水溶液を、７．５倍容量の５ＭのＮＨ４Ｏａｃおよび２．５倍容量の１００％エタノールの添加によってエタノール沈殿を行った。直ちに、このチューブを、最大速度にて室温で２０分間遠心分離した。この上清を除去し、ペレットを８０％冷エタノールで２回洗浄した。できる限りエタノールを除去し、次いでペレットを風乾させた。このペレットを、３μｌのＲＮａｓｅを含まない水に再懸濁した。
・インビトロ転写（ＩＶＴ）およびビオチンによる標識
１．５μｌのｃＤＮＡを、薄壁ＰＣＲチューブにピペッティングした。ＮＴＰ標識混合物を、室温でＰＣＲチューブに添加した。
ＮＴＰ標識混合物：
２μｌのＴ７ １０×ＡＴＰ（７５ｍＭ）（Ａｍｂｉｏｎ）
２μｌのＴ７ １０×ＧＴＰ（７５ｍＭ）（Ａｍｂｉｏｎ）
１．５μｌのＴ７ １０×ＣＴＰ（７５ｍＭ）（Ａｍｂｉｏｎ）
１．５μｌのＴ７ １０×ＵＴＰ（７５ｍＭ）（Ａｍｂｉｏｎ）
３．７５μｌの１０ｍＭ Ｂｉｏ−１１−ＣＴＰ
０．７５μｌの１０ｍＭ Ｂｉｏ−１６−ＵＴＰ
２μｌの１０×Ｔ７転写緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ）
２μｌの１０×Ｔ７酵素混合物（Ａｍｂｉｏｎ）
全反応の最終容量は、２０μｌであった。チューブを、ＰＣＲ機器中で、３７℃で６時間インキュベートした。
（ＩＶＴ産物のＲＮｅａｓｙ浄化）
手順については上記を参照のこと。
標識ｃＲＮＡを、エタノール沈殿させ、断片化ステップに適合する容量に再懸濁した。
・断片化
約１５μｇの標識ＲＮＡを、以下の技術を使用して断片化した。断片化反応容量を、ハイブリダイゼーション形成緩衝液によってマグネシウムが沈殿する問題に起因して、約１０μｌの容量に最小化するが、２０μｌを超えないようにした。
このＲＮＡを、１×断片化緩衝液中での９４℃で３５分間のインキュベーションによって断片化した。
５×断片化緩衝液：
２００ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸（ｐＨ８．１）
５００ｍＭのＫＯＡｃ
１５０ｍＭのＭｇＯＡｃ
標識ＲＮＡ転写物を、断片化の前後に分析した。サンプルを、６５℃で１５分間加熱し、転写物のサイズ範囲の適切な見解を得るために１％アガロース／ＴＢＥゲルで電気泳動を行った。
・マイクロチップアレイ
全ての実験で使用したＥＯＳ ＨｕＯ３マイクロチップアレイは、ヒトゲノムの第１のドラフトに基づいた既知のエクソンおよびＦＧＥＮＥＳＨ推定のエクソンの両方を含む４６，０００個の固有の配列を示す５９，６８０個のプローブセットを備える、特別に生産されたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｃ ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）オリゴヌクレオチドアレイである。Ｈｕ０３プローブセットは、完全に一致するプローブのみからなり、ほとんどのプローブセットは６〜７個のプローブを有する。
・マイクロチップアレイ上のハイブリダイゼーション
２００μｌ（１０μｇのｃＲＮＡ）のハイブリダイゼーション混合物を、チップ上にピペッティングした。複数のハイブリダイゼーションが行われる場合（５チップセットによる循環など）、３００μｌまたはそれ以上の最初のハイブリダイゼーション混合物を作製することが勧められる。
ハイブリダイゼーション混合物：断片化標識ＲＮＡ（最終濃度５０ｎｇ／μｌ）
５０ｐＭの９４８−ｂ対照オリゴ
１．５ｐＭのＢｉｏＢ
５ｐＭのＢｉｏＣ
２５ｐＭのＢｉｏＤ
１００ｐＭのＣＲＥ
０．ｌｍｇ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡ
０．５ｍｇ／ｍｌのアセチル化ＢＳＡ
上記を１×ＭＥＳハイブリダイゼーション緩衝液で３００μｌにする。
フィコエリトリンと結合体化したストレプトアビジンを使用して、ハイブリダイゼーションのシグナルを可視化した。
・遺伝子発現データの正規化
遺伝子発現データを、所望のγ分布に実験による強度の経験累積分布をマッピングするための逆γ関数を使用して、固定γ分布に対する各アレイからのプローブレベル強度のデータをフィットさせることによって正規化した。この手順は、１つまたは２つのパラメータよりもむしろ強度の全分布を固定するという点で、よりストリンジェントであること以外は、他のチップあたりの正規化手順（例えば、標準値へ各チップの平均およびＳＤを固定する工程）に類似する。チップあたりの正規化の目的は、非生物学的因子（すなわち、技術上のノイズ）に起因するという想定の下にチップ間の変動を除去することである。分布についての尺度母数を選択して、任意の平均値３００を有する分布を入手し、そして０．８１の形状パラメータを選択して、良好なサンプル中で認められる経験的な分布の代表的な形状を再現した。
平均強度の１つの基準を、構成プローブの強度のＴｕｋｅｙの３項平均を使用して各プローブセットについて計算した。３項平均は、外れ値の影響に耐える中心傾向の基準である。最後に、バックグラウンドを、それぞれの平均強度基準に適用して、非特異的ハイブリダイゼーションを補正した。乱雑な配列を含む４９１個のプローブセットからなる「ヌル」プローブセットの平均強度基準を、チップ上の他のプローブセット全てから差し引いた。
本明細書中で使用した製品についての解説書は、その全体が本明細書中に援用される。
（本明細書中に提供される標識化プロトコール）
ハイブリダイゼーション反応：
非ビオチン化ＩＶＴ（ＲＮｅａｓｙカラムで精製された）から開始する（組織からＩＶＴへの工程については実施例１を参照のこと）
ＩＶＴアンチセンスＲＮＡ；４μｇ： μｌ
ランダムヘキサマー（１μｇ／μｌ）：４μｌ
Ｈ２Ｏ： μｌ
全容量：１４μｌ
−７０℃で１０分間インキュベートする。氷上に置く。
逆転写：
５×第１の鎖の緩衝液（ＢＲＬ）：６μｌ
０．１Ｍ ＤＴＴ：３μｌ
５０×ｄＮＴＰ混合物：０．６μｌ
Ｈ２Ｏ：２．４μｌ
Ｃｙ３ ｄＵＴＰまたはＣｙ５ ｄＵＴＰ（１ｍＭ）：３μｌ
ＳＳ ＲＴ ＩＩ（ＢＲＬ）：１μｌ
全容量：１６μｌ
−ハイブリダイゼーション反応物に添加する
−３０分間、４２℃でインキュベートする
−１μｌのＳＳＩＩを添加し、さらに１時間静置する
氷上に置く
−５０×ｄＮＴＰ混合物（２５ｍＭの冷ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ、１０ｍＭのｄＴＴＰ：それぞれ２５μｌの１００ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ；１０μｌの１００ｍＭ ｄＴＴＰ、１５μｌのＨ２Ｏに対して）
ＲＮＡ分解：
−１．５μｌの１Ｍ ＮａＯＨ／２ｍＭ ＥＤＴＡを添加し、６５℃で１０分間インキュベートする
Ｈ２Ｏ ８６μｌ
１０ＮのＮａＯＨ １０μｌ
５０ｍＭのＥＤＴＡ ４μｌ
Ｕ−Ｃｏｎ３０
１サンプルあたり５００μｌのＴＥを７０００ｇで１０分間スピンし、精製のために流出物を保存する。
Ｑｉａｇｅｎ精製：
−ｕ−ｃｏｎ回収物質を５００μｌの緩衝液ＰＢに懸濁する
−ｗ／ノーマルＱｉａｇｅｎプロトコールを進める
ＤＮＡｓｅ消化：
−１μｌの１００倍希釈のＤＮＡｓｅ／３０μｌのＲｘを添加し、そして３７℃で１５分間インキュベートする
−５分間、９５℃で酵素を変性させる
サンプル調製：
−以下を添加する：
Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ：１０μｌ
５０×ｄＮＴＰｓ：１μｌ
２０×ＳＳＣ：２．３μｌ
ピロリン酸ナトリウム：７．５μｌ
１０ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ（１μｌの１０倍希釈物）
最終容量：２１．８μｌ
−ｓｐｅｅｄ ｖａｃで乾燥させる
−１５μｌＨ２Ｏに再懸濁する
−０．３８μｌの１０％ ＳＤＳを添加する
−２分間、９５℃で加熱する
−室温で２０分間、徐々に冷却する
スライドに置き、６４℃で一晩ハイブリダイズさせる。
ハイブリダイゼーション後の洗浄工程：
３×ＳＳＣ／０．０３％ ＳＤＳ：３７．５ｍｌの２０×ＳＳＣ＋０．７５ｍｌの１０％ ＳＤＳを含む２５０ｍｌのＨ２Ｏで２分間
１×ＳＳＣ：１２．５ｍｌの２０×ＳＳＣを含む２５０ｍｌのＨ２Ｏで５分間
０．２×ＳＳＣ：２．５ｍｌの２０×ＳＳＣを含む２５０ｍｌのＨ２Ｏで５分間
スライドを、１０００ＲＰＭで１分間の遠心分離で乾燥させる
適切な光電子増倍管設定および蛍光チャネルでスキャンする。
（ＣＳ１は白血球中で過剰発現するが、種々の型の非リンパ組織では過剰発現しない）
ＣＳ１の発現プロフィールを評価するために、白血球および他の組織から単離したｍＲＮＡを、リアルタイムＰＣＲによって分析した。この結果は、ｍＲＮＡ発現レベルがほとんどの他の正常な成体組織のｍＲＮＡ発現レベルよりも白血球においてずっと高いことを示す。ベースラインのレベルを上回るＣＳ１発現を示さない他の正常な成体組織には、脂肪、副腎、大動脈、大動脈弁、虫垂、冠状動脈、膀胱、骨、骨髄、乳房、気管支、子宮頸部、脳、脊髄、横隔膜、子宮内膜、精巣上体、食道、胆嚢、神経節、心臓、喉頭、唇、肝臓、肺、筋肉、子宮筋層、迷走神経、網、口腔粘膜、卵巣、膵臓、副甲状腺、咽頭粘膜、胎盤、前立腺、網膜、唾液線、皮膚、胃、滑膜、精巣、胸腺、甲状腺、舌、気管、臍帯、尿管、子宮、膣、または静脈が含まれていた。ＣＳ１ ｍＲＮＡは、結腸（２／１１）、腎臓（１／２０）、小腸（１／３）、脾臓、および扁桃腺（２／４）の選択されたサンプル中で発現した。この結果は、ＣＳ１は白血球で主に発現され、自己免疫疾患の良好な標的であることを示した。
（ＣＳ１発現は複数の活性化白血球集団で増加する）
ＣＳ１発現と白血球の活性化との間の相関を評価するために、ＣＳ１ ｍＲＮＡ発現を、複数の活性化白血球集団および複数の非活性化白血球集団において分析した。この結果は、対応する非活性化対照集団と比較して、活性化Ｂ細胞、成熟ＤＣ細胞、活性化ＣＤ３細胞（低レベルから中程度の増加）、活性化ＣＤ４細胞（低レベルの増加）、および活性化ＣＤ８細胞（ドナーに依存して、低レベルから中程度の増加）でＣＳ１発現が増加したことを示す。これらの結果は、ＣＳ１の過剰発現が数種の白血球サブセットの活性化と相関することを示した。
（実施例３：ＣＳ１に対するモノクローナル抗体の生成のための抗原の産生）
（クローニング）
ヒトＣＳ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を、ＣＳ１の細胞外ドメイン（ＣＳ１ ＥＣＤ）に隣接するプライマーを使用して、Ｒａｊｉ細胞から単離した。ＰＣＲ産物をゲル精製し、そしてＩｇＧ３の定常領域（ヒトＦｃ−γ３）をコードするベクターにライゲーションした。ＣＳ１ ＥＣＤ−Ｆｃγ３を含むプラスミドを大量に精製し、そしてＤＮＡ配列決定によって確認した。
（ＣＳ１ ＥＣＤ−Ｆｃγ３の安定なトランスフェクション）
５０μｇのＣＳ１ ＥＣＤ−Ｆｃγ３プラスミドを、Ｆｓｐ１酵素で線状化し、そしてこのＤＮＡを、エタノール中で沈殿させ、洗浄し、そして５００μｌの滅菌ＰＢＳに再懸濁した。ＮＳＯ細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、１ｍｌのＰＢＳあたり２×１０７個の細胞を再懸濁した。１×１０７個の細胞の量を、トランスフェクションに使用した。
５００μｌのＮＳＯ細胞を、５００μｌのＰＢＳ中のＤＮＡと合わせた。細胞を、ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ ｐｕｌｅｒによって１．５Ｖかつ３μＦにてエレクトロポレーションに供した。細胞を１００ｍｌのＤＭＥＭ完全培地に添加し、そして１０個の９６ウェルプレートにプレートした。１μｇ／ｍｌのミコフェノール酸選択培地を、トランスフェクションから２４時間後に添加した。ポジティブトランスフェクト体を、１０日後にスクリーニングし、４８ウェルプレートおよび２４ウェルプレート中に増やした。ポジティブトランスフェクト体を再度スクリーニングし、そして高産生のものをタンパク質精製のために増やした。
（ＣＳ１ ＥＣＤ−Ｆｃγ３タンパク質の精製）
ＣＳ１−ＥＣＤＦｃγ３融合タンパク質を発現する安定なトランスフェクト体を、グルコース添加剤を含む６００ｍｌのＤＭＥＭ完全培地中で５日間増やした。融合タンパク質を、プロテインＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムで精製し、そして１×ＰＢＳに対して透析した。ＣＳ１ ＥＣＤ−Ｆｃγ３の還元形態および非還元形態を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅによって分析した。ＣＳ１ ＥＣＤ Ｆｃγ３をまた、抗ＨｕＩｇＧを使用するウェスタンブロットによって分析し、そしてＮ末端配列決定によって確認した。精製ＣＳ１−Ｆｃ−γ３融合タンパク質を使用して、マウスを免疫した。
（ＣＳ１ ＥＣＤ−ｍｙｃ−ＧＰＩ融合タンパク質の産生）
ＣＳ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を、ＣＳ１の細胞外ドメインに隣接するプライマーを使用して、Ｒａｊｉ細胞から単離した。ＰＣＲ産物をゲル精製し、そして細胞表面発現のためのｍｙｃタグおよびグリコシルホスファチジルイノシトール連結を発現するベクター（ｍｙｃ−ＧＰＩベクター）中にライゲーションした。ＣＳ１ ＥＣＤ−ｍｙｃ−ＧＰＩを含むプラスミドを大量に精製し、そしてＤＮＡ配列決定によって確認した。
（ＣＳ１ ＥＣＤ−ｍｙｃ−ＧＰＩの安定なトランスフェクション）
５０μｇのＣＳ１ ＥＣＤ−ｍｙｃ−ＧＰＩプラスミドを、Ｆｓｐ１酵素で線状化し、そしてこのＤＮＡをエタノール中に沈殿させ、洗浄し、そして５００μｌの滅菌ＰＢＳに再懸濁した。ＮＳＯ細胞を、冷ＰＢＳで２回洗浄し、１ｍｌのＰＢＳあたり２×１０８個を再懸濁した。１×１０８個の細胞の量を、トランスフェクションに使用した。
５００μｌのＮＳＯ細胞を、５００μｌのＰＢＳ中のＤＮＡと合わせた。細胞を、ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ ｐｕｌｅｒによって１．５Ｖかつ３μＦにてエレクトロポレーションに供した。細胞を、１μｇ／ｍｌのミコフェノール酸選択培地と共に５％ ＣＯ２中にて３７℃で増殖させ、その後９６ウェルプレートにサブクローニングした。ポジティブトランスフェクト体を、抗ｍｙｃ抗体でスクリーニングした。高産生のＣＳ１ ＥＣＤ−ｍｙｃ−ＧＰＩトランスフェクト体を選択し、そしてインビトロアッセイのために増やした。
（実施例３：抗ＣＳ１モノクローナル抗体の産生）
（ヒトＣＳ１の免疫原）
精製した組換えヒトＣＳ１ ＥＣＤ−γ３融合タンパク質を使用して、足蹠を介してＢａｌｂ／ｃマウスを免疫した（ＣＳ１ ＥＣＤとは、上記されるＣＳ１の細胞外ドメインをいう）。簡単に述べれば、マウスを、後足蹠において、全容量が２５μｌの１０μｇのタンパク質と同量のＲｉｂｉアジュバントとで免疫した。足蹠における免疫を、４〜５日間隔で４回行った。
（ａ．細胞融合）
ＣＳ１−ＥＣＤ−γ３で免疫した２匹のマウスを屠殺した。膝窩大腿および仙骨のリンパ節を、マウスから取り出した。リンパ球をこの組織から単離し、そしてハイブリドーマを、標準的な手順によって作製した。簡単に述べれば、ハイブリドーマを、リンパ球とマウス骨髄腫細胞株（ＮＳＯ細胞）との間のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１５００媒介性の融合によって作製した。融合細胞を、１プレートあたり１０７個の細胞の密度で９６ウェルプレートにプレートした。融合細胞の選択を、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）培地を使用して行った。
（ｂ．ハイブリドーマのスクリーニング）
ハイブリドーマによって分泌された抗体の特異性を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）ベースのＣＳ１発現細胞への結合アッセイによって決定した。ＦＡＣＳアッセイを、標準的なプロトコールを使用して行った。表面ＣＳ１細胞外ドメインを発現するＮＳＯの安定なトランスフェクト体（２×１０５個）を、５０μｌのハイブリドーマ培養上清を含む５０μｌの氷冷ＰＢＳに氷上で１時間再懸濁した。強い洗浄後、細胞を、フィコエリトリンと結合体化したヤギ抗マウスＩｇＧ特異的抗体と氷上で１時間インキュベートした。細胞を再び洗浄し、そして細胞表面結合抗体を、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎを使用するＦＡＣＳによって検出した。表１に示すように、抗体（Ｌｕｃ２、Ｌｕｃ３、Ｌｕｃｌ５、Ｌｕｃ２０、Ｌｕｃ２２、Ｌｕｃ２３、Ｌｕｃ２９、Ｌｕｃ３２、Ｌｕｃ３４、Ｌｕｃ３５、Ｌｕｃ３７、Ｌｕｃ３８、Ｌｕｃ３９、Ｌｕｃ５６、Ｌｕｃ６０、Ｌｕｃ６３、またはＬｕｃ９０）は、ＣＳ１でトランスフェクトしたＮＳＯ−ＣＳ１細胞に強く結合したが、ＮＳＯ−ＦｃＲｎに結合しなかった。抗ヒトＣＳ１抗体は、Ｋ５６２細胞およびＤａｕｄｉ細胞（ネイティブなＣＳ１を発現することが公知である）に結合したが、陰性対照であるＪｕｒｋａｔ細胞に結合しなかった。これらのデータは、産生された抗ＣＳ１抗体がＣＳ１と特異的に結合し得ることを示す。ＣＳ１−γ３融合タンパク質へのＬｕｃ抗体の結合 対 陰性対照であるＡＲ−Ｇ３（γ３融合タンパク質）へのＬｕｃ抗体の結合についてのアッセイ（ＥＬＩＳＡによる）からの結果もまた、表に示した。Ｌｕｃ抗体は、ＣＳ１−γ３に特異的に結合し、そして陰性対照であるＡＲ−γ３融合タンパク質に結合しなかった。
Figure 0004758984
 （産生した抗ＣＳ１モノクローナル抗体のアミノ酸配列）
抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、標準的な技術を使用してクローニングした。簡単に述べれば、１×１０６個〜５×１０６個の細胞由来の全ＲＮＡを使用し、ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用してｃＤＮＡを調製し、そして可変領域を、マウス重鎖定常領域およびマウス軽鎖定常領域に相補的な遺伝子特異的プライマーを使用してＰＣＲで増幅した。
抗体Ｌｕｃ９０、Ｌｕｃ６３、およびＬｕｃ３４の成熟重鎖ならびに成熟軽鎖のアミノ酸配列を、表４に示す。表４は、以下を提供する：Ｌｕｃ９０の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号３）および軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号４）；Ｌｕｃ６３の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号５）および軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号６）；ならびにＬｕｃ３４の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号７）および軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号８）。配列番号９、配列番号１０および配列番号１１は、それぞれ、Ｌｕｃ９０重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４は、それぞれ、Ｌｕｃ９０軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７は、それぞれ、Ｌｕｃ６３重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０は、それぞれ、Ｌｕｃ６３軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３は、それぞれ、Ｌｕｃ３４重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６は、それぞれ、Ｌｕｃ３４軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
（表４：ＣＳ１抗体のアミノ酸配列）
Figure 0004758984
 （実施例４：ＣＳ１抗体の特徴付け）
フローサイトメトリー競合アッセイを使用して、１５の異なる抗ＣＳ１モノクローナル抗体のエピトープ特異性を決定した。表面ＣＳ１を発現するＮＳＯの安定なトランスフェクト体（２×１０５個）を、５０μｌの抗ＣＳ１抗体（Ｌｕｃ２３、Ｌｕｃ２９、Ｌｕｃ３４、Ｌｕｃ３５、Ｌｕｃ３７、Ｌｕｃ３８、Ｌｕｃ６３、およびＬｕｃ９０の対合組み合わせ（ｐａｉｒｗｉｓｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を含む）と共に氷上で１時間インキュベートした。並行して、アイソタイプの対照抗体（ＡＩＰ−１３）を、陰性対照として使用した。ビオチン化抗ＣＳ１モノクローナル抗体（Ｌｕｃ２３、Ｌｕｃ３４、Ｌｕｃ３７、Ｌｕｃ３８、Ｌｕｃ６３、およびＬｕｃ９０）を、１μｇ／ｍｌにて細胞／抗体混合物と一緒に氷上でさらに３０分間インキュベートした。強い洗浄後、細胞を、フィコエリトリンと結合体化したストレプトアビジンと一緒に氷上で１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、そして細胞表面結合ビオチン化抗体を、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎを使用したＦＡＣＳによって検出した。
非標識抗体（Ｌｕｃ２３、Ｌｕｃ３４、Ｌｕｃ３７、Ｌｕｃ３８、Ｌｕｃ６３、およびＬｕｃ９０）を、互いに１５μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、および０．６μｇ／ｍｌの濃度で競合する能力について試験し、そして競合抗体または遮断抗体を、１μｇ／ｍｌで添加した。ＡＩＰ−１３を、陰性対照として使用した。なぜならば、ＡＩＰ−１３は、ＣＳ１と結合せず、そしていかなるＬｕｃ抗体とも競合しないからである。ＭＦＩの顕著な減少は、対照抗体のＭＦＩと比較して、Ｍａｂ 対 非標識抗ＣＳ１ Ｍａｂに基づき、ビオチン化抗ＣＳ１による細胞表面ＣＳ１に対する少なくとも５０％の競合を示した。
この競合アッセイは、いくつかのＬｕｃ抗体が別のエピトープに接触することを示した。Ｌｕｃ３８は、Ｌｕｃ３７、２３、９０、および６３のエピトープとは異なったエピトープに接触する。Ｌｕｃ６３は、Ｌｕｃ３７、２３、９０、および３８のエピトープとは別の異なった重複しないエピトープに接触する。Ｌｕｃ９０は、Ｌｕｃ３７、２３、６３、および３８のエピトープとは別の異なった重複しないエピトープに接触する。Ｌｕｃ２３は、Ｌｕｃ９０、６３、および３８のエピトープとは異なった別の重複しないエピトープに接触する。Ｌｕｃ３７は、Ｌｕｃ９０、６３、および３８によって接触されるエピトープとは異なった、さらに別の重複しないエピトープに接触する。Ｌｕｃ６３は、Ｌｕｃ３４と重複するエピトープに接触し、一方、Ｌｕｃ９０は、Ｌｕｃ３４と重複するエピトープに接触する。Ｌｕｃ３７は、Ｌｕｃ２３のエピトープと重複するエピトープに接触する。Ｌｕｃ３４は、すべてのＬｕｃ抗体の結合を遮断するか、顕著に低下させて、広範な露出されたエピトープに接触し得るか、または、ＣＳ１に対して高い親和性を有するかのいずれかである。Ｌｕｃ３７、Ｌｕｃ２３、およびＬｕｃ３８は、Ｌｕｃ３４抗体によるＣＳ１への結合を遮断しない。Ｌｕｃ３７、Ｌｕｃ２３、およびＬｕｃ３８に対するエピトープをＣＳ１の二次構造の中に「埋め込む」ことができるか、または、ＣＳ１に対する親和性を、Ｌｕｃ３４抗体の親和性よりも低くすることができる。
３つのモノクローナル抗体の相対的親和性をまた、Ｂｉａｃｏｒｅ分析によって試験した。ヒトＣＳ１−Ｆｃ融合タンパク質と抗ヒトＣＳ１モノクローナルマウス抗体Ｌｕｃ３４．１、Ｌｕｃ６３．２、およびＬｕｃ９０Ｈ１との間のＳＰＲＫｉｎｅｔｉｃｓ測定によるＣＳ１ ＭＡｂの動態解析を、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して行った。再生条件を、異なるフローセルに１００００ＲＵを超える各抗体を固定し、そしてその表面上へＣＳ１−Ｆｃを注入し、次いで最良の緩衝液が各抗体からのＣＳ１−Ｆｃのクリアランスを最適化することが見出されるまで、一連の異なる緩衝液を試験することによって確立した。１０ｍＭグリシン（ｐＨ２．０）の緩衝液は、最適な再生緩衝液であることが見出され、そして直ちに１０サイクルのＣＳ１−Ｆｃ注入および緩衝液再生に対してその再現性を試験した。この緩衝液は、抗体表面の再現可能性（ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｙ）を再生するのに適切であることが見出された。したがって、１０ｍＭグリシン（ｐＨ２．０）を、ＣＳ１−Ｆｃおよび抗体ＢＩＡｃｏｒｅ実験のための再生緩衝液に指定した。
自家産生ＣＳ１抗体を、ＢＩＡｃｏｒｅアミンカップリング試薬（Ｎ−エチル−Ｎ’−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド、ＥＤＣ；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ＮＨＳ；および塩酸エタノールアミン（ｐＨ８．５））によって９９．４ＲＵ〜１３３．７ＲＵの範囲の低反応単位（ＲＵ）で研究用グレードのＣＭ５センサーチップに固定した。アッセイを、室温で流速３０μｌ／分にて行った。３分間のＣＳ１−Ｆｃの会合段階の後に、各結合サイクルの解離をモニタリングするために、１サイクルごとに異なるＣＳ１−Ｆｃ濃度のランニング緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３００ｍＭ塩化ナトリウム、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｐ−２０（ｐＨ７．４））を１０分間注入した。再生表面を、１０ｍＭグリシン（ｐＨ２．０）を使用して再生させた。各ＣＳ−Ｆｃと抗体対との結合速度を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｅプログラムを使用して、１２種の異なる濃度（１０２４ｎＭ、５１２ｎＭ、２５６ｎＭ、１２８ｎＭ、６４ｎＭ、３２ｎＭ、１６ｎＭ、８ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ）のＣＳ１−Ｆｃから２連で収集したセンサーグラム（ｓｅｎｏｒｇｒａｍ）データの大域分析から計算した。二重参照（ｄｏｕｂｌｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｉｎｇ）を各分析に適用して、基準表面および緩衝液のみの対照によるバックグラウンド応答を排除した。結合親和性（ＫＤ）を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｅソフトウェアによる二価分析物モデルを使用して、一連の分析物濃度から得たセンサーグラムの会合段階および解離段階を同時にフィットさせることによって得た。実験を３回行って、データの標準偏差を調べた。
Ｌｕｃ９０．Ｈ１、Ｌｕｃ６３．２、およびＬｕｃ３４．１の結合親和性が以下に要約されている。Ｌｕｃ９０．Ｈ１は、これら３つの抗体の中で最も高い親和性を有する。Ｌｕｃ９０．Ｈ１の結合親和性はＬｕｃ６３．２より５．５倍高く、Ｌｕｃ３４．１より２８倍高い。
Figure 0004758984
（抗ＣＳ１抗体による免疫組織学的染色）
ＣＳ１で形質転換された細胞も、抗ＣＳ１抗体による免疫組織学的染色について調べられた。１０μｇ／ｍｌの量の抗ＣＳ１モノクローナル一次抗体を、ＣＳ１でトランスフェクションされた細胞に添加した。そして、細胞を血清でブロックし、ビオチン−抗マウスＩｇと一緒にインキュベートした。次に、アビジン−ペルオキシダーゼを細胞と混合して、ＡＥＣ（標準的なペルオキシダーゼ試薬）で発色させた。ＡＥＣの赤色で陽性染色を示す一方、被検細胞の核をヘマトキシリン（青）で対比染色した。これらのデータによって、ＣＳ１でトランスフェクションされた細胞が、抗ＣＳ１抗体であるＬｕｃ２３、Ｌｕｃ３８、およびＬｕｃ６３により陽性に染色されることが示され、産生された抗ＣＳ１抗体が、細胞表面上に発現したＣＳ１と結合できることが示された。したがって、抗ＣＳ１抗体は、溶液中での末梢血液細胞表面における発現の検出だけでなく、一般的には組織切片（例えば、患者のリンパ節または組織生検）を解析するのに用いられる免疫組織化学検査法（ＩＨＣ）による検出において利用するのにも適している。
炎症を起こした扁桃腺の免疫組織学的染色が、２つの抗ＣＳ１抗体、Ｌｕｃ９０およびＬｕｃ６３を用いて例示された。ＣＤ１３８による染色によって、形質細胞および上皮細胞が染色される。染色の重複パターンから、ＣＳ１抗体が炎症を起こした扁桃腺の形質細胞を染色することは明らかである。
慢性関節リウマチ患者の関節から採取された滑膜組織の免疫組織学的染色が、抗ＣＳ１Ｌｕｃ６３を用いて実証された。ＣＤ１３８による染色から分かるように、形質細胞は滑膜に浸透した。染色の重複パターンから、抗ＣＳ１抗体が、慢性関節リウマチ患者の関節の形質細胞を染色することは明らかである。
これらの結果は、ＣＳ１を発現する形質細胞が、炎症を起こした扁桃腺、およびリウマチ性関節炎患者の関節にも存在したことを示しており、抗ＣＳ１抗体を、これらの病気の処置に実際に使用できることを示唆している。
（ＣＳ１タンパク質の発現パターン）
産生されたＬｕｃ抗体を用い、ＦＡＣＳ解析によって、ＣＳ１タンパク質の発現をさらに調べた。標準的なフィコール・ハイパーク勾配遠心（Ｆｉｃｏｌｌ Ｈｙｐａｑｕｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）法によって、健康な個体および狼瘡患者からＰＢＭＣを単離した。標準的な手順に従って示されたように、ＰＢＭＣを抗体で染色した。ＰＢＭＣをヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）で活性化させるために、ＰＷＭを１：１００の希釈率でＰＢＭＣに添加し、その後７％のＣＯ２中に３７℃で８日間置いた。ＰＷＭで刺激された細胞を回収し、抗体染色の前に洗浄した。本明細書で用いられたマウス抗ＣＳ１抗体はＬｕｃ９０（ＩｇＧ２ｂ）、Ｌｕｃ６３、Ｌｕｃ３８、およびその他の産生された抗ＣＳ１のＬｕｃ抗体である。アイソタイプ対照抗体は、アイソタイプ適合マウスＩｇＧ抗体であった。
これらの結果によって、ＣＳ１が、活性化Ｂ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（活性化およびナイーブとも）、ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）、ＮＫＴ細胞（ＣＤ５６＋ＣＤ３＋）、ＣＤ１４＋／ｌｏ白血球（単球および／またはマクロファージ）、およびＣＤ４＋Ｔ細胞（インビトロ活性化細胞上では低レベル）で陽性に発現することが示された。ＣＳ１は、健康な成人および狼瘡患者に由来する、これらの細胞集団で発現した。健康な成人から採取された非活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞、血小板、ＨｕＶＥＣ、腎臓細胞、気管支気道細胞、小気道細胞、前立腺細胞、肝細胞、および胸部細胞では、ＣＳ１タンパク質の有意な発現が検出されなかった。
活性化Ｂ細胞の染色は、ＰＷＭによって活性化されたＰＢＭＣの染色によって示されるが、非活性ＰＢＭＣのアイソタイプ対照染色は、バックグラウンドの蛍光として示された。理想的に治療抗体が主に標的細胞に結合し、他の細胞および組織、特に血小板には結合しないので、ＣＳ１の発現パターンは有意である。データは、抗ＣＳ１抗体が治療抗体の適当な候補であることを示唆している。
（実施例５：ＣＳ１抗体のヒト化）
本実施例では、マウス抗ＣＳ１モノクローナル抗体Ｌｕｃ６３（ＭｕＬｕｃ６３）のヒト化について説明する。ＭｕＬｕｃ６３のヒト化は、実質的にＱｕｅｅｎ、Ｃ．らの手順（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９−１００３３（１９８９））に従って行われた。まず、ＭｕＬｕｃ６３のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列それぞれに相同性が高いヒトのＶＨおよびＶＬのセグメントを同定した。次に、ＣＤＲ配列を、ＣＤＲの構造を維持するのに重要なフレームワークのアミノ酸とともに、選択されたヒトのフレームワーク配列の中に移植した。得られたヒト化モノクローナル抗体（ＨｕＬｕｃ６３）をマウス骨髄腫細胞株ＮＳ０の中で発現させた。ヒト化ＨｕＬｕｃ６３抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、同じアッセイでＭｕＬｕｃ６３について測定されたＥＣ５０値６６．１ｎｇ／ｍｌと同様なＥＣ５０値７０．１ｎｇ／ｍｌで組換えヒトＣＳ１に結合し、ＨｕＬｕｃ６３がヒトＣＳ１に対する高い結合親和性を保持していることを示した。
（ＭｕＬｕｃ６３可変領域ｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定）
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いて、ＭｕＬｕｃ６３を産生する約５×１０７個のハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出した。供給業者のプロトコールに従って、ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて２本鎖ｃＤＮＡを合成した。重鎖および軽鎖に対する可変領域ｃＤＮＡを、マウスγ鎖およびκ鎖のＣ領域のそれぞれにアニールする３’プライマー、およびＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キットに提供されていた５’ユニバーサルプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって増幅した。ＶＨのＰＣＲでは、３’プライマーは５’−ＡＧＣＴＧＧＧＡＡＧＧＴＧＴＧＣＡＣＡＣ−３’という配列である。ＶＬのＰＣＲでは、３’プライマーは５’−ＴＴＣＡＣＴＧＣＣＡＴＣＡＡＴＣＴＴＣＣ−３’という配列である。配列決定を行うために、ＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡをｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にサブクローニングした。ＤＮＡの配列決定は、製造業者の指示に従い、蛍光ジデオキシ鎖のターミネーター（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いるＰＣＲサイクル配列決定反応によって行われた。
４つのプラスミドクローンが、重鎖および軽鎖それぞれについて配列決定された。典型的なマウス重鎖および軽鎖の可変領域と相同性がある独自の配列を同定した。このｃＤＮＡ配列を、ＭｕＬｕｃ６３の重鎖および軽鎖のＶ領域の推定アミノ酸配列とともに表５および表６に示す。
表５は、それぞれのシグナルペプチド配列（配列番号２９および３４）を含む、Ｌｕｃ６３の重鎖可変領域（配列番号２７）および軽鎖可変領域（配列番号２８）を提供する。配列番号３０〜３２および３５〜３７は、それぞれ重鎖および軽鎖の可変領域のＣＤＲを示している。配列番号３３は、Ｌｕｃ６３の重鎖可変領域のＣＤＲ２におけるＮＹＴからＮＹＡ（イタリック体）への単一のアミノ酸変異を示している。
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 表６は、マウスＬｕｃ６３の重鎖可変領域（配列番号３８）、ヒト重鎖可変領域のフレームワーク配列（配列番号３９）、ヒトＪＨ１ｃＤＮＡ（配列番号４０）、およびヒト化Ｌｕｃ６３重鎖可変領域（配列番号４１）を提示する。また、マウス軽鎖可変領域（配列番号４２）、ヒト軽鎖可変領域のフレームワーク（配列番号４３）およびヒト化Ｌｕｃ６３軽鎖可変領域（配列番号４４）も提示される。
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 。
（ＨｕＬｕｃ６３のＶ領域の設計）
抗体Ｖ領域のヒト化は、Ｑｕｅｅｎ，Ｃ．ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９−１００３３（１９８９））によって概説されているように行われた。まず、ＭｕＬｕｃ６３の可変領域の分子モデルを、コンピュータープログラムＡＢＭＯＤおよびＥＮＣＡＤ（Ｌｅｖｉｔｔ，Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６８：５９５−６２０（１９８３））を用いて構築した。次に、ヒト抗体ｃＤＮＡ配列に対するホモロジー検索に基づいて、ヒトＶＨ配列Ｅ５５ ３−１４（Ｃｕｉｓｉｎｉｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍ．２３：１１０−１１８（１９９３））およびＪセグメントＪＨ１（Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．ら、Ｃｅｌｌ ２７： ５８３−５９１（１９８１））を選択して、ＨｕＬｕｃ６３の重鎖可変領域のフレームワークを提示した。ＨｕＬｕｃ６３の軽鎖可変領域については、ｃＤＮＡのＶＬ配列ＩＩＩ−２Ｒ（Ｍａｎｈｅｉｍｅｒ−Ｌｏｒｙら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１６３９−１６５２（１９９１））が用いられた。ＭｕＬｕｃ６３のＶＨとアクセプターのヒトフレームワークとの間のフレームワークアミノ酸の同一性は８１．６％（７１／８７）であったが、ＭｕＬｕｃ６３ＶＬとアクセプターのヒトフレームワークとの間の同一性は７６．３％（６１／８０）であった。ＭｕＬｕｃ６３、ＨｕＬｕｃ６３、およびＶＨおよびＶＬに対するヒトアクセプターのアミノ酸配列のアラインメントは、それぞれ表７および表８に示されている。表７は、ＶＨ領域のアミノ酸配列のアラインメントを示している。ＭｕＬｕｃ６３およびＨｕＬｕｃ６３のＶＨ領域のアミノ酸配列（それぞれ配列番号４５および４７）、ならびにヒトＥ５５ ３−１４およびＪＨ１セグメント（配列番号４６）が１文字コードで示されている。ＣＤＲ配列は、カバット（Ｋａｂａｔ）（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ ｅｄ．，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））の定義の基づいており、ＭｕＬｕｃ６３のＶＨ配列中に下線で示されている。ナンバリングもＫａｂａｔに従っている。ヒトのＶＨセグメント中のＣＤＲ配列は、図では省かれている。ＨｕＬｕｃ６３のＶＨ配列中に一本線の下線を施したアミノ酸は、ＣＤＲ配列と接触すると推定されていたため、対応するマウス残基と置換した。Ｎ結合型グリコシル化部位（ＮＹＴ）の可能性がある部位を除去するためにＣＤＲ２中に作出したトレオニン（Ｔ）のアラニン（Ａ）への変異は、２重下線で示されている。表８は、ＶＬ領域のアミノ酸配列のアラインメントを示している。ＭｕＬｕｃ６３およびＨｕＬｕｃ６３のＶＬ領域のアミノ酸配列（それぞれ配列番号４８および５０）、ならびにヒトＩＩＩ−２Ｒの配列（配列番号４９）が１文字コードで示されている。カバット（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））の定義に基づくＣＤＲ配列を、ＭｕＬｕｃ６３のＶＬ配列中に下線で示し、ナンバリングもカバットに従っている。ヒトＶＬセグメント中のＣＤＲ配列は、図では省かれている。ＨｕＬｕｃ６３のＶＬ配列中に一本線の下線を施したアミノ酸は、ＣＤＲ配列に接触すると推定されていたため、対応するマウス残基と置換した。
Figure 0004758984
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 コンピューターモデルがＣＤＲとの顕著な接触を示唆したフレームワーク位置において、ＭｕＬｕｃ６３のＶ領域に由来するアミノ酸で、本来のヒトのフレームワークアミノ酸を置換した。これは、重鎖の２８位、４８位、４９位、６６位および６８位の残基で行われた（表７）。軽鎖については、６０位の残基で置換が行われた（表８）。ここで用いられたナンバリング方式はカバットの方式（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ ｅｄ．， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））であることに留意すべきである。
さらに、ＭｕＬｕｃ６３のアミノ酸配列を調べたところ、ＶＨ領域のＣＤＲ２にＮ結合型グリコシル化が可能な部位が明らかになった。このようなＮ結合型グリコシル化部位は一般的なＮ−Ｘ−Ｔ／Ｓという配列を持っている（ここで、Ｎ＝アスパラギン、Ｘ＝任意のアミノ酸、およびＳ／Ｔ＝セリンまたはトレオニンである）。可変ドメインにＮ結合型グリコシル化の存在は、ＨｕＬｕｃ６３を治療用抗体として開発する過程で、望ましくない効果を有する可能性があるため、ヒト化設計においてトレオニンをアラニンで置換する変異によって、ＣＤＲ２（Ｎ−Ｙ−Ｔ）中のグリコシル化部位の可能性がある部位を除去した。
（ＨｕＬｕｃ６３のＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子の構築）
ＨｕＬｕｃ６３のＶＨおよびＶＬのそれぞれをコードする遺伝子を、シグナルペプチド、スプライス供与体シグナル、および後に哺乳類の発現ベクターにクローニングするための適当な制限酵素部位を含むミニエクソンとして設計した。ＶＨおよびＶＬのミニエクソンにおけるスプライス供与体シグナルは、それぞれ、対応するヒト生殖細胞系のＪＨ６配列およびＪＫ４配列に由来していた。ＨｕＬｕｃ６３のＶＨミニエクソンおよびＶＬミニエクソンのシグナルペプチド配列は、それぞれ、対応するＭｕＬｕｃ６３のＶＨ配列およびＶＬ配列に由来していた。Ｌｕｃ６３のＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子のヌクレオチド配列が、推定アミノ酸配列とともに、表５および表６に示されている。
ＨｕＬｕｃ６３のＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子を、長さ３３から４３塩基の範囲で重複する合成オリゴヌクレオチドの伸長およびＰＣＲ増幅によって構築した（Ｓｔｅｍｍｅｒら、Ｇｅｎｅ １６４：４９−５３（１９９５））。ＰＣＲ増幅したフラグメントをＱｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製し、ＭｌｕＩおよびＸｂａＩで消化した。ＨｕＬｕｃ６３のＶＨ遺伝子をｐＨｕＨＣｇ１．Ｄにサブクローニングして、プラスミドｐＨｕＨＣｇ１．Ｄ−ＨｕＬｕｃ６３を作製した。ＨｕＬｕｃ６３のＶＬ遺伝子を、κ軽鎖発現ベクターであるｐＯＫＴ３．Ｖｋ．ｒｇの誘導体であるｐＨｕＣｋａｐｐａ．ｒｇｐｔ．ｄＥ（Ｃｏｌｅ，Ｍ．Ｓ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３６１３−３６２１（１９９７））にサブクローニングして、プラスミドｐＨｕＣｋａｐｐａ．ｒｇｐｔ．ｄＥ−ＨｕＬｕｃ６３を作製した。
（ＨｕＬｕｃ６３の発現）
組織培養細胞の一時的形質転換によって、ＨｕＬｕｃ６３のＩｇＧ１／κ抗体を産生した。ヒト胚腎臓細胞株２９３−Ｈ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）および非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中で維持した。標準培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋非必須アミノ酸）を用いて形質転換する前日に、２９３−Ｈ細胞を、６ウェルプレートに１ウエル当たり１×１０６個の細胞を容積２．５ｍｌでプレートした。トランスフェクションの日に、ウエル当たり４μｇのプラスミドＤＮＡを、２５０μｌのハイブリドーマＳＦＭ（Ｈ−ＳＦＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で希釈した。ウエル当たり１０μｌのリポフェクタミン２０００試薬（ＬＦ２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、Ｈ−ＳＦＭ２５０μｌに希釈した。希釈したＤＮＡを、希釈ＬＦ２０００と混合して、２０分間インキュベートし、ＤＮＡ−ＬＦ２０００複合体を形成させた。５００μｌのＤＮＡ−ＬＦ２０００複合体を、各ウエルに添加し、プレートを前後に揺動させて混合した。細胞は、解析用に上清を回収する前に５日間インキュベートした。
ＨｕＬｕｃ６３の発現をサンドウィッチＥＬＩＳＡによって測定した。Ｉｍｍｕｌｏｎ ４ＨＢＸプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ）を、ｐＨ９．４の炭酸ナトリウム−重炭酸緩衝液０．２Ｍ中で、１．８μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ鎖特異的ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）１００μｌ／ウエルによって４℃で一晩被覆し、洗浄用緩衝液（０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ）で洗浄して、ＴＢＳ中１５０μｌ／ウエルのＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて、室温で３０分間ブロックした。洗浄用緩衝液で洗浄してから、ＨｕＬｕｃ６３を含む試料をＥＬＩＳＡ緩衝液（１％ＢＳＡおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ）で適当に希釈し、ウエル当たり１００μｌをＥＬＩＳＡプレートに塗布した。標準として、ヒト化抗ＣＤ３３ ＩｇＧ１／κモノクローナル抗体ＨｕＭ１９５（Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８： １１４９−１１５４（１９９２））を用いた。プレートを室温で１時間インキュベートし、洗浄用緩衝液で洗浄した後、希釈度１：１０００のＨＲＰ結合体化ヤギ抗ヒトκ鎖ポリクローナル抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）をウエル当り１００μｌ用いて、結合抗体を検出した。室温で１時間インキュベートし、洗浄用緩衝液で洗浄した後、１００μｌ／ウエルのＡＢＴＳ基質（ＫＰＬ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を加えて発色させた。１００μｌ／ウエルの２％シュウ酸を添加して発色を停止させた。ＶｅｒｓａＭａｘマイクロプレート読み取り装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、４１５ｎｍでの吸光度を読み取った。
（ＭｕＬｕｃ６３およびＨｕＬｕｃ６３の結合特性）
直接結合ＥＬＩＳＡ法によって、ヒトＣＳ−１に対するＭｕＬｕｃ６３およびＨｕＬｕｃ６３の親和性を解析した。９６ウエルのＥＬＩＳＡプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ ４ ＨＢＸプレート、Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ）のウエルを、室温で一晩、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの可溶性ヒトＣＳ１−ヒトＦｃγ３の融合タンパク質１００μｌで被覆した。洗浄緩衝液で洗浄した後、ウエルを、１５０μｌのＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで室温にて３０分間、ブロックした。一時的に発現したＨｕＬｕｃ６３抗体または精製したＭｕＬｕｃ６３抗体をＥＬＩＳＡ緩衝液に適当に希釈して、ＥＬＩＳＡプレートに塗布した（ウエル当たり１００μｌ）。ＥＬＩＳＡプレートを室温で１時間インキュベートして、洗浄緩衝液で洗浄した。次いで、ＥＬＩＳＡ緩衝液で１：１０００に希釈した１００μｌのＨＲＰ結合体化ヤギ抗ヒトＣκ抗体またはＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＣκ抗体（どちらもＳｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈから入手）を、それぞれ、ＨｕＬｕｃ６３プレートおよびＭｕＬｕｃ６３プレートの各ウエルに添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄緩衝液で洗浄した後、１００μｌのＡＢＴＳ基質（ＫＰＬ）を各ウエルに添加した。２％のシュウ酸をウエル当たり１００μｌ添加して、発色を停止させた。ＶＥＲＳＡＭａｘマイクロプレート読み取り装置を用いて、４１５ｎｍでの吸光度を読み取った。ＥＬＩＳＡ結合実験の結果、ＭｕＬｕｃ６３およびＨｕＬｕｃ６３が、濃度依存的にヒトＣＳ１−Ｆｃγ３に結合することが示された。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍコンピューターソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて得られたＨｕＬｕｃ６３のＥＣ５０値は７０．１ｎｇ／ｍｌであった。これはｍｕＬｕｃ６３について得られたＥＣ５０値６６．１ｎｇ／ｍｌと類似しており、マウス抗ＣＳ１モノクローナル抗体ＭｕＬｕｃ６３のヒト化に成功したこと、ＨｕＬｕｃ６３がヒトＣＳ１に対して高い結合親和性を保持したことを示している。
（実施例６ 自己免疫疾患におけるＣＳ１の役割）
（ＣＳ１は、非刺激細胞と比較して、刺激Ｔ細胞および刺激Ｂ細胞において大量に発現する）
ＣＳ１の発現を測定するために、ヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）刺激剤およびフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）刺激剤を用いて、末梢血Ｔリンパ球およびＢリンパ球を刺激するようインビトロアッセイを設定した。並行して、刺激を与えない非刺激対照用末梢血単球を調製した。ポリＡ＋ｍＲＮＡを単離し、これらの試料から標準的な技術を用いてｃＤＮＡを合成した。ＣＳ１特異的オリゴヌクレオチドプライマー（上記参照）を用いてＰＣＲによりＣＳ１遺伝子を増幅し、Ｂｉｏｒａｄ Ｇｅｌ Ｄｏｃ ２０００を用いて発現を定量した。シグナル強度を、対照であるヒトβ−アクチンに対して標準化した。リアルタイムＰＣＲ解析によって、ＣＳ１が、未刺激細胞と比較して、活性化末梢血Ｂ細胞においては約２３倍の上方制御、および活性化末梢血Ｔリンパ球においては約３０倍の上方制御を示すことが示された。
（ＣＳ１は、同年齢の健康な成人の末梢血Ｂリンパ球と比較して、狼瘡患者の末梢血Ｂリンパ球において上方制御されている）
健常な個体と比較して、狼瘡患者におけるＣＳ１発現を評価するために、健常な成人に対し、狼瘡患者のＣＤ１９＋細胞を細胞選別して、末梢血Ｂリンパ球のプールを単離した。ポリＡ＋ｍＲＮＡを単離し、標準的な技術を用いてｃＤＮＡを合成した。ＣＳ１に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲによってＣＳ１発現を評価した。リアルタイムＰＣＲデータによって、健常個体と比較すると、ＣＳ１は、狼瘡患者由来のＢリンパ球においては約２倍上方制御されることが示された。β−アクチンで標準化して、健常個体のｃＤＮＡと比較すると、狼瘡患者由来のＢリンパ球のｃＤＮＡでは、ＣＳ１遺伝子が２．３倍増加していた。１８Ｓ ｒＲＮＡプライマーで標準化すると、ＣＳ１は、それぞれのｃＤＮＡ試料において１．８倍増加していた。
（活性化Ｂ細胞および活性化Ｔ細胞における新規マウスＬｙ９の上方制御）
新規マウスＬｙ９は、ヒトＣＳ１の相同分子種であると提唱されている（Ｔｏｖａｒら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５４：３９４−４０２（２００２））。活性化Ｂ細胞および活性化Ｔ細胞におけるマウスの新規Ｌｙ９の発現を、リアルタイムＰＣＲを用いて調べた。それらのデータは、新規マウスＬｙ９が活性化Ｂ細胞および活性化Ｔ細胞中で上方制御されることを示した。
新規マウスＬｙ９の発現をＡＢＩ ＧｅｎｅＡｍｐ ５７００配列検出システム（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて解析した（実施例２参照）。１８Ｓ ｒＲＮＡプライマー用いて標準化すると、Ｌｙ９遺伝子は、非刺激脾臓ｃＤＮＡと比較して、ｃｏｎＡで刺激したｃＤＮＡ中では３倍に増加し、ＬＰＳで刺激したｃＤＮＡ中では６倍に上方制御された。
（炎症性腸疾患組織におけるＣＳ１の上方制御）
正常な組織と対比した、ＩＢＤ組織（クローン病および潰瘍性大腸炎）におけるＩＢＤモジュレータータンパク質の発現を、上記のようにマイクロチップアレイ上で測定した。複数の組織に由来するｃＲＮＡを用いて、オリゴヌクレオチドマイクロアレイを検索した。より具体的には、インビトロ転写アッセイ（ＩＶＴ）によって、９つのＩＢＤおよび９つの適合する隣接する正常な腸の検体、ならびに２４個の結腸上皮試料から、ｃＲＮＡを作製した。オリゴヌクレオチドマイクロアレイに対するｃＲＮＡのハイブリダイゼーションを、遺伝子の発現レベルに直接比例する平均蛍光強度法（ＡＩ）によって測定した。
ＩＢＤにおける遺伝子発現レベルを成人の非病原性組織および器官と比較して、データを解析した。正常な組織と比較して、炎症性腸疾患組織における遺伝子発現の顕著な増加によって同定された遺伝子の１つがＣＳ１であった。マイクロアレイ解析によって、ＣＳ１遺伝子の発現が、健康な成人の結腸上皮細胞と比較して、潰瘍性大腸炎およびクローン病で増加することが示された。
炎症性腸疾患患者におけるＣＳ１発現を、健常個体と比較してさらに評価するために、３人の健康な成人に由来する正常な大腸の試料と比べて、２人のクローン病患者および３人の潰瘍性大腸炎患者の大腸患部に由来する試料を脱凝集、洗浄して、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）に入れた。製造業者のプロトコールに従って、全ＲＮＡを単離した。全ＲＮＡはＲｎａｓｅフリーＤｎａｓｅ（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ）で処理した。Ｄｎａｓｅで消化したＲＮＡを、フェノール／クロロホルムで抽出して、エタノールで一晩沈殿させた。７５％エタノールでＲＮＡを洗浄し、ヌクレアーゼフリー水に溶解させた。ＲＮＡを定量して、ＲＮＡの完全性をアガロースゲル上で分析した。リアルタイムＰＣＲのデータは、ＣＳ１が、健常個体（ｎ＝３）由来の正常な大腸のプールと比較して、クローン病患者（ｎ＝２）に由来する病変部大腸では７倍および６倍に上方制御され、潰瘍性大腸炎患者（ｎ＝３）に由来する病変部大腸では１３倍、１４倍および４６倍に上方制御されることを示した。
（実施例７ 癌細胞におけるＣＳ１の発現）
（ＣＳ１タンパク質の発現パターン：）
ＣＳ１タンパク質の発現を、ＦＡＣＳ解析により産生したＬｕｃ抗体を用いて調べた。細胞株を、抗ＣＳ１ Ｌｕｃ９０．Ｈ１抗体またはマウスＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照抗体とともに、氷上で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄してから、フィコエリトリン（ＰＥ）を結合した抗マウスＩｇを細胞に添加して、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄して、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上でフローサイトメトリーによって解析した。これらのデータは、ＣＳ１がＡＲＨ−７７白血病系列細胞、ＣＥＳＳ Ｂリンパ芽細胞株およびＩＭ９ Ｂリンパ芽細胞株、ならびに骨髄腫細胞株であるＬ３６３、ＬＰ１、およびＯＰＭ２の中で発現することを示している。
多発性骨髄腫患者（ｎ＝２１骨髄試料）、ＭＧＵＳ患者（意味不明の単クローン性免疫グロブリン血症；ｎ＝１）、形質細胞性白血病患者（ｎ＝１）、骨髄から動員したＣＤ３４＋幹細胞（ｎ＝５）、正常な骨髄細胞（ｎ＝３）、正常なリンパ節組織（ｎ＝１）、慢性リンパ芽球性白血病患者（ＣＬＬ；ｎ＝１５）、急性骨髄性白血病患者（ＡＭＬ；ｎ＝１１）、非ホジキンリンパ腫患者（ＮＨＬ；ｎ＝１）、およびホジキンリンパ腫患者（ｎ＝１）に由来する試料を、ＦＩＴＣを結合体化した、ＣＳ１（Ｌｕｃ９０またはＬｕｃ６３）、ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ、ＣＤ３８−ＰＥ、および／またはＣＤ１３８−ＰＥに対する抗体とともにインキュベートして、骨髄細胞をＦＡＣＳ解析について上記に詳述したように処理した。本明細書で用いられるマウス抗ＣＳ１抗体は、Ｌｕｃ９０（ＩｇＧ２ｂ）、Ｌｕｃ６３（ＩｇＧ２ａ）、Ｌｕｃ３８（ＩｇＧ２ｂ）および他の産生された抗ＣＳ１ Ｌｕｃ抗体である。アイソタイプ対照抗体はアイソタイプ適合マウスＩｇＧ抗体であった。
骨髄吸引物をＣｌｅｖｅｌａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃの多発性骨髄腫患者から採取した。骨髄腫細胞株（ＬＰ１、Ｌ３６３、ＯＰＭ２、ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＲＰＭＩ８２２６、およびＵ２６６Ｂ１）、白血病細胞株ＡＲＨ−７７、Ｂリンパ芽球株（ＩＭ９、ＣＥＳＳ）、および骨髄細胞を、標準的な染色プロトコールに従って、アイソタイプ対照抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）と対比して、抗ＣＳ１モノクローナル抗体で染色した。細胞を洗浄し、染色用緩衝液（ＲＰＭＩ、ヒト細胞については１０％ＦＢＳ、またはＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ）に入れ、抗ＣＳ１対アイソタイプ対照抗体を、細胞１００万個当り抗体０．５〜１μｇ添加して最終容量を０．１ｍｌとした。患者の試料については、赤血球を溶解し、細胞を遠心分離によって沈殿させてから、染色用緩衝液に再懸濁した。ＦＩＴＣに直接結合体化していない抗体については、第２段階の抗体を細胞１００万個当り抗体０．５〜１μｇ添加して、最終容量を０．１ｍｌとした。Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒ上でＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてＦＡＣＳ解析を行うため、細胞を洗浄して染色用緩衝液に再懸濁した。形質漿細胞と区別するため、多発性骨髄腫細胞を抗ＣＤ４５、抗ｓｙｎｄｅｃａｎ−１（ＣＤ１３８）、および抗ＣＤ３８モノクローナル抗体で染色した。抗ｓｙｎｄｅｃａｎ−１（ＣＤ１３８）は、形質細胞を特異的に染色し、その他の白血球は染色しない。
結果は、ＣＳ１が１０人の多発性骨髄腫患者に由来する形質細胞（例えばＣＤ１３８＋細胞）、および形質細胞性白血病患者に由来する形質細胞、ならびにいくつかの骨髄腫細胞株（Ｌ３６３、ＬＰ１、およびＯＰＭ２）で高発現することを示している。多発性骨髄腫患者に由来する全部で２１の異なった骨髄試料をフロー法（ｆｌｏｗ）によって測定し、２１試料中の２１すべてで、事実上すべての骨髄形質細胞がＣＳ１を発現する。ＣＳ１は、ＡＲＨ−７７白血病細胞およびＢリンパ芽球腫細胞株（ＩＭ９およびＣＥＳＳ）でも発現される。
（実施例８ 骨髄腫患者に由来する形質細胞におけるＣＳ１発現）
多発性骨髄腫患者に由来する骨髄試料をＣＤ１３８−ＰＥ、ＣＤ４５ＰｅｒＣＰ、Ｌｕｃ９０−ＦＩＴＣ、および／またはＩｇＧ２ｂ−ＦＩＴＣ（アイソタイプ対照抗体）で染色し、上記したようにＦＡＣＳによって解析した（実施例５参照）。リンパ球、単球、顆粒球、赤血球系細胞、形質細胞、および芽細胞を含むよう、細胞をゲートした。データは、ＣＳ１が多発性骨髄腫患者に由来する形質細胞（例えばＣＤ１３８＋細胞）上で発現することを示した。
（実施例９：抗ＣＳ１モノクローナル抗体は、活性化末梢血Ｂ細胞によるＩｇＭの分泌を減少させる）
正常な成人に由来する末梢血単核細胞を、標準的なフィコール勾配遠心法によって単離し、１０μｇ／ｍｌのヤマゴボウマイトジェン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，Ｅｎｇｌａｎｄ，ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）とともにインキュベートしてから、総容量１ｍｌの２４ウェルプレートで平板培養した。１００μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌモノクローナル抗体（マウス抗ヒトＣＳ１（Ｌｕｃ６３）またはマウスＩｇＧアイソタイプ対照）を試料ウエルに添加した。細胞および抗体を、７％ＣＯ２中３７℃で８日間インキュベートした。培養液から上清を単離し、上記したように、ＥＬＩＳＡ法によってＩｇＭをアッセイした。結果は、１００μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌのアイソタイプ対照とともに、または抗体なしでインキュベートした細胞によるＩｇＭ分泌と比較すると、１００μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌのＬｕｃ６３抗体は、末梢血単核細胞のＩｇＭ分泌を減少させることを示した。
（抗ＣＳ１モノクローナル抗体は、自己免疫疾患患者の活性化末梢血Ｂ細胞によるＩｇＭ分泌を減少させる：）
末梢血単核細胞の細胞培養液の上清を上記したように単離し、ＥＬＩＳＡ法によってアッセイした。Ｉｍｍｕｌｏｎ−１プレートを、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトＩｇＭモノクローナル抗体（カタログ番号０５−４９００、Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）１００μｌで被覆した。プレートをＥＬＩＳＡ緩衝液（‘ＥＢ’＝ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）によって１時間ブロックした。培養上清を、さまざまな希釈度（ＥＢ中）で１ウエル当たり１００μｌにして添加した。上清および標準的なヒトＩｇＭ（カタログ番号００９−０００−０１２，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）を室温で１〜２時間インキュベートした。捕捉したヒトＩｇＭを、製造業者のプロトコールに従って、ヤギ抗ヒトＩｇＭ−ＨＲＰポリクローナル抗体（カタログ番号２０２０−０５，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａｂａｍａ）、およびＨＲＰ基質によって発色させた。結合したＩｇＭを、分光測定法（４０５ｎｍ ＯＤ）によって、標準的なＥＬＩＳＡプレート読み取り装置上で可視化した。データは、狼瘡患者のＰＢＭＣのＩｇＭ分泌量が、アイソタイプ対照抗体で処理した場合の０．１８μｇ／ｍｌから、抗ＣＳ１抗体（Ｌｕｃ９０Ｈ１）で処理した場合の０．１０μｇ／ｍｌに減少したことを示した。ＩｇＭを０．１２μｇ／ｍｌで分泌した陽性対照抗ＣＤ２抗体は、抗ＣＳ１が、ＩｇＭ産生を減少させる点では、抗ＣＤ２抗体よりもさらに強力であることを示した。
（抗ＣＳ１モノクローナル抗体は、健康な成人および自己免疫疾患患者に由来する末梢血Ｂ細胞によるＩｇＧ産生を減少させる）
健康な成人および自己免疫疾患（狼瘡）患者に由来する末梢血Ｂ細胞によるＩｇＧ産生を、ＩｇＭ産生と同様に解析した。結果は、抗ＣＳ１抗体（Ｌｕｃ９０Ｈ．１）で処理してから９日後の健康な成人の末梢血単核細胞による全産生量が、ＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照と比較すると、約２３％減少したことを示した。抗ＣＳ１抗体（Ｌｕｃ９０Ｈ．１）で処理してから９日後の狼瘡患者の末梢血単核細胞によるＩｇＧ全産生量は、ＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照と比較すると、約５６％減少した。表３Ａおよび３Ｂは、多数の作製した抗ＣＳ１抗体によるＩｇＧ産生の阻害をまとめている。表３Ａに示されているように、Ｌｕｃ９０．Ｈ１は、リポ多糖およびヤマゴボウマイトジェンで活性化したＰＢＭＣによるＩｇＧ産生を、約４０％減少させた。Ｌｕｃ３４．１は、ヤマゴボウマイトジェンで活性化したＰＢＭＣによるＩｇＧ産生を約３８％減少させた。表３Ｂに示されているように、Ｌｕｃ９０．Ｈ１は、健康な成人のＰＢＭＣおよび成熟型Ｂ細胞株（ＩＭ９細胞）によるＩｇＧ産生を約４８％減少させた。Ｌｕｃ３４．１は、健康な成人のＰＢＭＣによるＩｇＧ産生を約５３％減少させた。Ｌｕｃ６３．２は、ＰＢＭＣおよびＩＭ９細胞のＩｇＧ産生を約４７％減少させた。これらの実験から、Ｌｕｃ９０Ｈ．１、Ｌｕｃ３４．１、およびＬｕｃ６３．２が最も優れた機能的抗体であることが明らかである。エピトープマッピングから、Ｌｕｃ９０およびＬｕｃ６３は、重複型エピトープをもたない。
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 実験結果は、抗ＣＳ１抗体が、インビトロにおいて末梢血Ｂ細胞によるＩｇＧおよびＩｇＭの産生を減少させることを示した。
（実施例１０：ＳＣＩＤ−ＨｕＰＢＭＣマウスモデルにおけるＣＳ１モノクローナル抗体によるインビボでのＩｇＧの減少）
（ＳＣＩＤ−ＨｕＰＢＭＣマウスモデル）
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、標準的なフィコール−パーク（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）密度勾配法によって単離し、１ｍｌ当たり２×１０７個のＰＢＭＣになるようリン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ）に再懸濁した。再懸濁したＰＢＭＣ（１ｍｌ）を、Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤマウスの腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射した。ＰＢＭＣ注射の２〜３週間後、血清試料をマウスから採取し、ＥＬＩＳＡによってヒトＩｇＧを測定した。移植したマウス（血清中に＞１μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧを産生）を無作為に処理群に分けてから、マウス抗ヒトＣＳ１モノクローナル抗体（Ｌｕｃ９０．Ｈ１またはＬｕｃ６３．２．２２）、マウスアイソタイプ対照抗体（それぞれＩｇＧ２ｂまたはＩｇＧ２ａ）、またはＰＢＳで処置した。マウスに、ＰＢＳ５００μｌ中の２００μｇの抗体を、３〜４日毎に３または４回用量投与した。マウス血清を、標準的なプロトコールを用いＥＬＩＳＡによって、ヒトＩｇＧについて解析した。
各マウスについて、抗体の初回投与前（０日目）のヒトＩｇＧ濃度を、投与後（ｘ日目）のヒトＩｇＧ濃度から引き算し、初回投与前（０日目）のヒトＩｇＧ濃度で割り算して、１００倍して、例えば［（ｘ日目−０日目）／０日目］×１００によって、血清ヒトＩｇＧのパーセント変化率を計算した。データを、各マウス群について平均パーセント変化として、標準誤差とともに表示する。ヒトＩｇＧ濃度は、各マウス群について標準誤差とともに平均濃度として示されている。ウェルチ（Ｗｅｌｃｈ）２標本ｔ検定を用いて、処理群横断的にヒトＩｇＧのパーセント変化率を比較した。
（抗ＣＳ１抗体は、インビボにおけるヒトＩｇＧ産生を減少させた）
これらのデータは、本発明の抗ＣＳ１抗体が、ＳＣＩＤ−ＨｕＰＢＭＣ転移モデルにおいて、実質的にヒト免疫グロブリンの産生を減少させることを示している。図１Ａに示されているように、Ｌｕｃ９０．Ｈ１は、早くも４日目（抗体の初回投与による処理を行った４日後）に、ＰＢＳ対照およびアイソタイプ対照においてＩｇＧ産生の増加を抑制した。このような減少が、７週間（３２日）の試験期間にわたって継続した。例えば、１８日目には、ＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照では、ヒトＩｇＧ産生が２２５％増加し、ＰＢＳ対照では１８１％増加したが、Ｌｕｃ９０Ｈ．１処理によって、ヒトＩｇＧ産生は１４％減少した。Ｌｕｃ９０Ｈ．１は、対照群におけるヒトＩｇＧ産生の１８１〜２２５％の増加を打ち消したばかりでなく、ヒトＩｇＧ産生をさらに１４％減少させた。２５日目には、Ｌｕｃ９０Ｈ．１は、対照群におけるヒトＩｇＧ産生の３倍の増加を打ち消したばかりでなく、ヒトＩｇＧ産生をさらに２４％減少させた。
Ｌｕｃ６３．２も、インビボにおいてＩｇＧ産生を効率的に減少させた。図１Ｂに示されているように、Ｌｕｃ６３．２は、対照群（ＰＢＳおよびＩｇＧ２ａアイソタイプ対照）におけるＩｇＧ産生の３７〜４６％の増加を打ち消し、ＩｇＧ産生をさらに５９％減少させた。この同じ研究において、Ｌｕｃ９０．Ｈ１をＬｕｃ６３．２と比較すると、Ｌｕｃ９０．Ｈ１は対照群（ＰＢＳおよびＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照）における３７〜１１４％の増加を打ち消して、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）による移植を受けたマウスによるＩｇＧ産生をさらに１４％減少させた。
図１Ｃでは、ＳＣＩＤＨｕＰＢＭＣモデルにおけるＬｕｃ９０およびＬｕｃ６３による処理によってＩｇ産生が減少することがさらにまとめられている。アイソタイプ対照およびＰＢＳ対照によって処理したマウスにおけるＩｇＧ産生の増加を打ち消す一方で、Ｌｕｃ９０は、ＩｇＧ産生をさらに１４％、２２％、２４％、および３９％減少させ、Ｌｕｃ６３はさらに４０％および５９％減少させた。したがって、ヒトＰＢＭＣを移植したＳＣＩＤマウス（ＳＣＩＤ−ＨｕＰＢＭＣ）を抗Ｌｕｃで処置すると、これらの動物の血清中に通常では観察されるヒト免疫グロブリンの増加が完全に打ち消されるばかりでなく、処理前のレベルと比較して、さらなる減少がもたらされると結論することができる。
（実施例１１：抗ＣＳ１抗体のＡＤＣＣ活性）
（エフェクター細胞の調製：）
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（エフェクター細胞）を、標準的なフィコール−パーク密度勾配法（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、全血から単離した。細胞を洗浄して、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加したＲＰＭＩ培地に再懸濁した。
（標的細胞の調製）
細胞表面ＣＳ−１を発現する安定的形質転換体細胞（標的細胞）を洗浄して、１％ＢＳＡを添加したＲＰＭＩ培地に再懸濁した。細胞を、全容量５０μｌにウエル当たり１００，０００個の細胞をプレートした。マウス抗ヒトＣＳ−１モノクローナル抗体（Ｌｕｃ９０．Ｈ１またはＬｕｃ６３．２．２２）またはアイソタイプ対照抗体（それぞれマウスＩｇＧ２ｂまたはマウスＩｇＧ２ａ）を、さまざまな濃度で標的細胞に添加し、最終容量を１００μｌとし、室温で３０分間インキュベートした。
インキュベーション後、１００μｌのエフェクターＰＢＭＣを、最終容量２００μｌとなるように、２０：１の比率で標的細胞に添加した。標的細胞およびエフェクター細胞を３７℃で５時間または一晩インキュベートした。細胞を３５０×ｇで５分間遠心してから、ウエル当たり１００μｌの上清を採取して、光学的に透明な９６ウエル平底マイクロタイタープレートに移した。
（乳酸脱水素酵素アッセイ：）
上清に含まれる乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性を測定するために、細胞傷害性検出キット（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の反応混合物１００μｌを各ウエルに添加し、試料を１５〜２５℃で最大３０分間インキュベートした。このインキュベーションの間、マイクロタイタープレートを光から保護した。試料の吸光度がＥＬＩＳＡ読み取り装置を用いて４９０ｎｍで測定した。
細胞媒介性細胞傷害の割合を判定するために、次の等式を用いて、試料の平均吸光度を計算し、バックグラウンド対照を引き算した：
細胞傷害性（％）＝（試料のＬＤＨ放出試料−ＳＲエフェクター−ＳＲ標的）×１００／（ＭＲ標的−ＳＲ標的）
ＳＲ：自発的放出
ＭＲ：最大放出
実験対照は、標的細胞のみの自発的放出またはエフェクター細胞のみの自発的放出であった。標的細胞は、２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００（１：１）溶液中でアッセイした。
（抗ＣＳ１抗体は抗体に由来する細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘導する）
この実験は、抗ＣＳ１抗体Ｌｕｃ６３．２およびＬｕｃ９０が、ＰＢＭＣ（エフェクター細胞）存在下でＣＳ１を発現する細胞の抗体由来細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘導することを示した。その結果、Ｌｕｃ９０が用量依存的に細胞傷害性を誘導することが示された。５０μｇ／ｍｌの量のＬｕｃ９０は、標的細胞の細胞傷害性をほぼ５０％誘導した。Ｌｕｃ６３．２は、一般に、１０〜５０μｇ／ｍｌの用量範囲で、標的細胞の６０〜８０％の細胞傷害性を誘導した。同様の結果が、さらに２つのドナーを用いて行われた実験から得られた。
（実施例１２：低フコースＣＳ１抗体によるＡＤＣＣ活性）
（Ｌｕｃ９０の可変領域のｃＤＮＡのクローニング）
マウス可変領域（配列番号３および４）を、標準的な方法によって，Ｌｕｃ９０ハイブリドーマ細胞株からクローニングした。簡単に言うと、全ＲＮＡを抽出し、供給業者のプロトコールに従って、ＳＭＡＲＴ５’−ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて、２本鎖ｃＤＮＡを合成した。可変領域ｃＤＮＡのＰＣＲフラグメントを、配列決定のために、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。重鎖および軽鎖のそれぞれについて、いくつかのプラスミドクローンの配列を決定した。典型的なマウス重鎖および軽鎖の可変領域に相同性をもつ独自の配列を同定した。
（キメラＬｕｃ９０のＶＨおよびＶＬの発現ベクターの構築）
Ｌｕｃ９０のＶＨおよびＶＬのそれぞれをコードする遺伝子を、シグナルペプチド、スプライス供与体シグナル、Ｋｏｚａｋ開始配列、およびその後、哺乳動物発現ベクターにクロンーニングするのに適した制限酵素部位を含むミニエクソンとして設計した。プライマーは、適当な制限部位、およびＶＨ遺伝子またはＶＬ遺伝子のいずれかを含有するＴＯＰＯベクターからのＰＣＲに対して相補性を含むように設計した。ＰＣＲ増幅したフラグメントを、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ増幅キット（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製し、ＭｌｕＩおよびＸｂａＩで消化した。Ｌｕｃ９０のＶＨ遺伝子をｐＨｕＨＣｇ１．Ｄ（野生型）またはｐＨｕＨＣｇ１．Ｄ．ＡＡ（ＢＳ変異体）にサブクローニングして、それぞれプラスミドｐＣｈｉＨｕＨＣｇ１．Ｄ−ＭｕＬｕｃ９０ＶＨおよびｐＣｈｉＨｕＨＣｇ１．Ｄ．ＡＡ−ＭｕＬｕｃ９０ＶＨを作製した。ＢＳ変異体は、Ｆｃ受容体との結合が打ち消されるように、ＩｇＧ１のＣＨ２領域に２つのアミノ酸変異（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）を含んでいる（Ｘｕら，（２０００）Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００：１６−２６）。Ｌｕｃ９０のＶＬ遺伝子を、ｐＶｋにサブクローニングして、プラスミドｐＣｈｉＶｋ−ＭｕＬｕｃ９０ＶＬを作製した。単独プラスミド発現ベクターを、重鎖および軽鎖の遺伝子が単独プラスミドから発現され得るように作製した。重鎖ベクターをＥｃｏＲＩで消化して全重鎖領域を除去してから、軽鎖ベクター中の単一のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした。ＢＳ変異体の重鎖をｐＣｈｉＶｋ−ＭｕＬｕｃ９０ＶＬベクターフラグメントと結合して、プラスミドｐＣｈｉＬｕｃ９０−ＢＳＫを作製したが、野生型重鎖をｐＣｈｉＶｋ−ＭｕＬｕｃ９０ＶＬにサブクローニングして、プラスミドｐＣｈｉＬｕｃ９０−ｇ１Ｋを作製した。
（キメラＬｕｃ９０の発現）
キメラＬｕｃ９０ ＩｇＧ１／κ野生型抗体およびＢＳ抗体は、Ｓｐ２／０細胞にｐＣｈｉＬｕｃ９０−ｇ１ＫおよびｐＣｈｉＬｕｃ９０−ＢＳＫベクターをそれぞれ安定的にトランスフェクションして作製した。低フコース抗体は、ＹＢ２／０細胞にｐＣｈｉＬｕｃ９０−ｇ１Ｋベクターを安定的にトランスフェクションして作製した。陽性クローンを、ミコフェノール酸培地を用いて選択し、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。野生型クローンＡＨ４、ＢＳ変異体ＨＧ１２および低フコースクローン５Ｅ４を、高発現により選択し、２％低Ｉｇウシ胎児血清を含むＧｉｂｃｏ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ無血清培地に適応させた。精製するために、２リットルの培養液をローラーボトル中で増殖させた。抗体を標準的なプロテイン−Ｇアフィニティーカラムクロマトグラフィーによって精製した。
その結果、抗ＣＳ１ Ｌｕｃ９０キメラ抗体は、ヒトＣＳ１を発現する安定した細胞株においてＣＳ１を発現する細胞、および２種のヒト骨髄腫細胞株であるＯＰＭ２およびＬ３６３の抗体依存的な細胞の細胞傷害性を刺激することが示された。それぞれの場合において、細胞傷害性は、低レベルのフコースをもつ抗体によって（上記に詳しく説明されているようにＹＢ２／０細胞における増殖を介して）顕著に高められる。
（実施例１３：抗ＣＳ１抗体による骨髄腫の処置）
試験被験体の腹腔内に抗体を注射して、骨髄腫マウス腫瘍モデルに対するインビボでの抗ＣＳ１抗体による処置を行った。図２に示されているように、抗ＣＳ１抗体による処置（Ｌｕｃ６３およびＬｕｃ９０）は、アイソタイプ対照による処置を受けた動物と比較して、腫瘍の大きさを縮小させた。この研究では、１×１０７個の骨髄腫細胞（Ｌ３６３骨髄腫細胞株）をＣＢ．１７ ＳＣＩＤマウスの腹腔内に注射した。２週間後、腫瘍サイズが約８０ｍｍ３に達したら、マウスを、群当たり８マウスの４群に無作為に分けた。マウスを、抗ＣＳ１抗体（Ｌｕｃ６３またはＬｕｃ９０）またはアイソタイプ対照抗体（マウスＩｇＧ２ａまたはマウスＩｇＧ２ｂ）によって処置した。マウスには、マウス当たり２００μｇの抗体を、週当たり３用量で８用量投与した。その結果は、抗ＣＳ１抗体で処置したマウスでは、アイソタイプ対照抗体で処置したマウスと比較して、腫瘍体積が顕著に減少したことを示している。実験の２５日目（用量５回投与後）までに、Ｌｕｃ６３で処置したマウスでは、ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照抗体で処置したマウス（平均腫瘍サイズ約８００ｍｍ３）と比較して、平均腫瘍サイズが約１００ｍｍ３であることが示される。Ｌｕｃ９０で処置したマウスでは、ＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照抗体で処置したマウス（平均腫瘍サイズ約９５０ｍｍ３）と比較して、平均腫瘍サイズが約４００ｍｍ３であることが示されている。抗ＣＳ１ Ｌｕｃ６３抗体で処置されたマウスは、処理後２．５週間まで、測定可能な腫瘍がなく、この抗体の、腫瘍形成性細胞を消失させることにおける驚くべき効果を示している。
骨髄腫についてのさらに別のモデル系には、蛍光標識されたか、非標識の骨髄腫細胞株または成熟型Ｂ細胞株、例えばＡＲＨ７７、ＣＥＳＳ、ＩＭ９、Ｌ３６３、ＬＰ１およびＯＰＭ２を、静脈内（ｉ．ｖ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）に移植されたか、または直接（同所的に）骨に注射されたＳＣＩＤマウスが含まれる。これらの細胞株は、骨髄腫動物モデル系におけるアンタゴニスト処置の効果を試験するために用いられる。これらの細胞株は、抗ヒトＣＳ１抗体によって認識される抗原を発現する。動物を無作為に群に分け、抗ヒトＣＳ１抗体または対照抗体（例えば、アイソタイプ対照抗体）による治療計画を行う。抗体は、例えば、１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量を全部で９〜１０回、３〜４日ごとに腹腔内に投与するなどして、いくつかの用量レベルで投与する。腫瘍サイズを、各処理群について３５〜４０日間、週２回測定する。骨髄腫の臨床症状を記録する。死亡日時を、各マウスについて記録する。
抗ＣＳ１抗体処置と化学療法との間で相乗効果が起こる可能性を判定するために動物試験を開始する。異種移植した腫瘍を、おおよそのサイズが５０〜１００ｍｍ３に達するまで増殖させてから、静脈内、腹腔内、または同所的に注射されたマウスについて、癌細胞を動物に移植することができる。その際、動物を無作為に群に分け、抗ヒトＣＳ１抗体または対照抗体（例えば、アイソタイプ対照抗体）による処置計画を行う。あるいは、動物に対し、抗ヒトＣＳ１抗体または対照抗体（例えば、アイソタイプ対照抗体）を用いる処置計画を、プレドニゾンおよびメルファランまたはその他のアルキル化剤（例えばシクロフォスファミドまたはクロラムブシル）の併用を含む標準的な化学療法剤、またはビンクリスチン、ドキソルビシンおよび高用量のデキサメタゾン（ＶＡＤ）による処置、または当業者に公知の他の化学療法計画などと併用して行うことができる。抗体は、例えば、１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量を全部で９〜１０回、３〜４日ごとに腹腔内に投与するなどして、いくつかの用量レベルで投与する。化学療法は、例えば１ｍｇ／ｋｇ、または当業者に公知のその他の有効用量など、効果的な濃度で、３〜４日ごとに腹腔内に投与される。腫瘍サイズ（ｓ．ｃ．注射された動物）を、各処置群について３５〜４０日間、週２回測定する。ヒト免疫グロブリンを分泌する細胞株（ＩＭ９、ＣＥＳＳ、ＡＲＨ−７７、およびＬＰ−１）を注射されたマウスにおける血清免疫グロブリンを含む、骨髄腫の臨床症状を記録する。死亡日時を、各マウスについて記録する。化学療法の有無による抗体処置の有効性が評価される。
（実施例１４：ヒト化抗ＣＳ１抗体による多発性骨髄腫の処置）
実施例１３記載の例と同様、試験被験体の腹腔内に抗体を注射して、多発性骨髄腫瘍マウス腫瘍モデルに対するインビボでのヒト化抗ＣＳ１抗体による治療を行った。雌のＩＣＲ／ＳＣＩＤマウスに、（側腹部の）皮下に多発性骨髄腫株ＯＰＭ−２を移植した（１０００万細胞／動物）。腫瘍を確立させ、腫瘍が平均１００ｍｍ３に達したところで、マウスを無作為に８群に分けた（それぞれマウス８匹からなる８群、平均腫瘍体積１００ｍｍ３）。
次に、マウスに、以下の抗体を週３回腹腔内に投与して処理した。
第１群 リン酸緩衝食塩水対照（ＰＢＳ）
第２群 １０ｍｇ／ｋｇのマウスＬｕｃ６３抗体（ＭＵＬｕｃ６３）
第３群 対照として、１０ｍｇ／ｋｇの無関連ヒト化ＩｇＧ１抗体（ｃＨＵＩｇＧ１）
第４群 １０ｍｇ／ｋｇのヒト化Ｌｕｃ６３（ＨＵＬｕｃ６３）
第５群 ３ｍｇ／ｋｇのヒト化Ｌｕｃ６３（ＨＵＬｕｃ６３）
第６群 ２３４位および２３５位の残基にアラニン変異を有するヒト化Ｌｕｃ６３、１０ｍｇ／ｋｇ（ＨｕＬｕｃ６３ａ，ａ）-この変異はＩｇＧ１ ＦｃのＦｃＲｓへの結合に影響を与えるため、抗体依存性の細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）などのＦｃ依存型機能を付与する抗体の能力に影響を与える。
この実験の結果を図３に示す。以前観察したように、１０ｍｇ／ｋｇのＭＵＬｕｃ６３抗体はインビボで腫瘍増殖を低下させるのに有効であった。４６日目に（９回の抗体投与の最後から５日後）、８匹中５匹には、測定可能な腫瘍が存在しなかった。ＨＵＬｕｃ６３は、３ｍｇ／ｋｇでも１０ｍｇ／ｋｇでも、腫瘍増殖を低下させるのに効果的であったが、ヒト化抗体は、マウスにおいてはマウス抗体として効率的に作用しない。興味深いことに、２３４位および２３５位の残基を変異させたヒト化Ｌｕｃ６３抗体は、このモデルにおいてはまったく有効性を示すことができなかった。実際、２つの対照群、ＰＢＳおよびヒト化ＩｇＧ１（ｃＨＵＩｇＧ１）と同様に、腫瘍が大きくなりすぎたため（また、ＩＡＣＵＣ規則により、動物を殺処理する必要があったため）、ＨＵＬｕｃ６３ａ，ａ変異体で処理した動物を、３９日目（８回目の抗体投与の日）に殺処理しなければならなかった。ＨＵＬｕｃ６３ａ，ａ変異体によって作成されたデータは、このモデルにおいて、抗体のＦｃ部分が重要であることを示しており、Ｌｕｃ６３抗体（およびそのヒト化型）が作用するメカニズムの１つは、ＡＤＣＣ（または恐らく受容体架橋結合）など、移入されたＦｃ媒介型エフェクター機能を介していることを示唆している。
これらの結果は、この抗体のＡＤＣＣ活性を増大させることによって、人間の治療におけるＣＳ１抗体の有効性を向上させることができることを示唆している。ＡＤＣＣ活性を増大させる方法は、実施例１２の低フコース抗体を提供すること、およびＣＳ１抗体のＦｃ部分に突然変異を生じさせること、特に、各々が参考とため本明細書において援用される、米国特許第６，７３７，０５６Ｂ１号および米国特許出願第２００４／０１３２１０１Ａ１号に記載されているようなＦｃγＲ受容体に対する抗体親和性を増大させる変異を生じさせることを含む。
患者も、プレドニゾンおよびメルファランもしくは他のアルキル化剤（例えばシクロフォスファミドまたはクロラムブシル）の併用を含む標準的な化学療法剤、またはビンクリスチン、ドキソルビシン、および高用量デキサメタゾン（ＶＡＤ）による処置、当業者に公知のサリドマイド、ベルケードまたはその他の化学療法計画などと組み合わせて抗ヒトＣＳ１抗体による治療を受けることができる。
（実施例１５：ＳＣＩＤ−ＨｕＰＢＭＣマウスモデルにおけるヒト化抗ＣＳ１抗体によるＩｇＧのインビボにおける減少）
（ＳＣＩＤ−ＨｕＰＢＭＣマウスモデル）
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を標準的なフィコール−パーク（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）密度勾配法により単離し、リン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ）に２×１０７ＰＢＭＣ／ｍｌで再懸濁した。再懸濁されたＰＢＭＣ（１ｍｌ）をＣ．Ｂ−１７ ＳＣＩＤマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ＰＢＭＣ注射の２〜３週間後、血清試料をマウスから採取し、ＥＬＩＳＡ法によってヒトＩｇλについて測定した。移植を受けたマウス（血清中でヒトＩｇλを＞１μｇ／ｍｌ産生する）を無作為に処置群に分けてから、ヒト化Ｌｕｃ６３（ＨｕＬｕｃ６３）またはヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体で処理した。マウスに、５００μｌのＰＢＳ中２００μｇの抗体を３〜４日ごとに４用量の抗体を投与した。マウス血清を、標準的なプロトコールを用いたＥＬＩＳＡによって、ヒトＩｇλについて解析した。ヒト化抗体は、カッパ軽鎖は持っているが、ラムダ軽鎖を持っていないため、ヒトＩｇλを検出することによって、マウスを処置するために用いられるヒト化抗体および対照ヒト抗体ではなく、注射したヒトＢ細胞によって産生される免疫グロブリンを測定する。
各マウスについて、抗体の初回投与前（０日目）のヒトＩｇλ濃度を、投与後（ｘ日目）のヒトＩｇλ濃度から引き算し、初回投与前（０日目）のヒトＩｇλ濃度で割り算して、１００倍して、例えば［（ｘ日目−０日目）／０日目］×１００によって、血清ヒトＩｇλのパーセント変化率を計算した。データを、実験の０日目と１４日目を比較して、各マウス群について、標準誤差とともに平均パーセント変化として表示する。
（ヒト化抗ＣＳ１抗体は、インビボにおいてヒト免疫グロブリンの産生を低下させた）
これらのデータは、本発明の抗ＣＳ１抗体が、ＳＣＩＤ−ＨｕＰＢＭＣ転移モデルにおいて、ヒト免疫グロブリンの産生を実質的に減少させることを示している。このモデルでは、アイソタイプ対照で処置されたマウスで見られるように、このモデルに内在する免疫グロブリン産生が約３００％増加する。ＨｕＬｕｃ６３は、免疫グロブリン産生の約３００％の増加を無効にして、さらに免疫グロブリンの２％の減少をもたらした。したがって、マウス抗ヒトＣＳ１による処置と同様、ヒトＰＢＭＣを移植されたＳＣＩＤマウス（ＳＣＩＤ−ＨｕＰＢＭＣ）をヒト化抗ＣＳ１ Ｌｕｃ６３抗体によって処置すると、これらの動物の血清で正常には観察されるヒト免疫グロブリンの増加が完全に無効になるだけでなく、処理前のレベルに比較して、さらなる減少を生じさせるということが、結論付けられ得る。したがって、ヒト化抗ＣＳ１抗体は、ヒト免疫グロブリンの産生に関連する病気のヒト患者における有用な治療剤を提供する。
（実施例１６：さらなる抗ＣＳ１モノクローナル抗体およびヒト化抗ＣＳ１モノクローナル抗体）
抗体の重鎖および軽鎖の可変領域を、標準的な技術を用いてクローニングした。簡単に述べると、１〜５×１０６個の細胞から得た全ＲＮＡを用い、ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてｃＤＮＡを調製し、マウスの重鎖および軽鎖の定常領域に相補的な遺伝子特異的プライマーを用いて、可変領域をＰＣＲ増幅した。
抗体（Ｌｕｃ６９、ＬｕｃＸ．１およびＬｕｃＸ．２）の成熟型重鎖および成熟型軽鎖のアミノ酸を表９に示すが、そこには、Ｌｕｃ６９の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号５１）および軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号５２）；ＬｕｃＸ．１の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号５９）および軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号６０）；ＬｕｃＸ．２の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号６７）および軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号６８）が記載されている。配列番号５３、５４、および５５は、それぞれ、Ｌｕｃ６９の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。配列番号５６、５７、および５８は、それぞれ、Ｌｕｃ６９の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。配列番号６１、６２、および６３は、それぞれ、ＬｕｃＸ．１の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。配列番号６４、６５、および６６は、それぞれ、ＬｕｃＸ．１の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。配列番号６９、７０、および７１は、それぞれ、ＬｕｃＸ．２の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。配列番号７２、７３、および７４は、それぞれ、ＬｕｃＸ．２の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
Figure 0004758984
Figure 0004758984
 表９の抗体Ｌｕｃ６９、ＬｕｃＸ．１およびＬｕｃＸ．２、ならびに表４のＬｕｃ９０およびＬｕｃ３４は、Ｑｕｅｅｎらの米国特許第５，５３０１，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、および同第６，１８０，３７０号に教示されている方法に従ってヒト化される。
簡単に述べると、この方法は，ドナー（マウス）免疫グロブリンに由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）を１つ以上、およびヒト免疫グロブリンに由来するフレームワーク領域を提供することを包含する。好適な方法は、まずドナー免疫グロブリンのフレームワークまたは可変領域のアミノ酸配列を、ヒト免疫グロブリン鎖のコレクションの中の対応する配列と比較すること、およびコレクションから、より相同性の高い配列の１つをヒト免疫グロブリンとして選択することを包含する。ヒト免疫グロブリン、すなわちアクセプターである免疫グロブリンの配列は、典型的には、少なくとも１０〜２０以上の免疫グロブリンの可変領域配列のコレクションから選択され、通常、コレクション中の任意の配列のドナー免疫グロブリン配列に最も高い相同性をもつ。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列は、典型的には、ドナー免疫グロブリンのフレームワーク配列に約６５〜７０％以上の相同性をもつ。ドナー免疫グロブリンは重鎖または軽鎖のいずれかであり得、ヒトのコレクションは同種の鎖を含む。ヒト化軽鎖または重鎖を用いて、部分長または完全長のヒト定常領域の有無に関わらず、２つの軽鎖／重鎖対を有する完全なヒト化免疫グロブリンまたは抗体を形成させることができる。
ヒト化可変領域を形成するため、以下のカテゴリにある場合、ヒトの受容体配列中のアミノ酸を、ドナー配列の対応するアミノ酸と置換する：（１）アミノ酸がＣＤＲにある。上記比較工程と併用するか、またはそれとは別個に、アクセプター免疫グロブリン鎖の中の付加的アミノ酸を、ＣＤＲ−ドナー免疫グロブリン鎖からのアミノ酸で置換することができる。より具体的には、ドナー免疫グロブリンの対応するアミノ酸による、アクセプター免疫グロブリンのヒトフレームワークアミノ酸のさらなる必要に応じての置換を、以下のカテゴリの１つ以上に該当する位置で行う：（２）アクセプター免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域におけるアミノ酸は、その位置ではまれであり、ドナー免疫グロブリンにおける対応アミノ酸は、ヒト免疫グロブリン配列のその位置では一般的である、または（３）アミノ酸は、ＣＤＲの１つに直ぐ隣接している、または（４）アミノ酸が、抗原、またはドナー免疫グロブリンもしくはヒト化免疫グロブリンのＣＤＲと相互作用することができると推定されている。さらに、（５）アクセプター免疫グロブリンにおけるアミノ酸が、その位置ではまれであり、ドナー免疫グロブリンにおける対応アミノ酸も、他のヒト配列と比較するとまれである場合、アクセプター配列中のアミノ酸を、必要に応じて、その位置でヒト配列にとっては一般的なアミノ酸で置換することができる。
インタクトな抗体に組み込まれると、ヒト化軽鎖および重鎖は、ヒトにおいて実質的に非免疫原性となって、ＣＳ１に対してドナー免疫グロブリンと実質的に同じ親和性を維持する。
いったん設計されると、結合フラグメントおよびその他の免疫グロブリン型を含む免疫グロブリンを、さまざまな組換えＤＮＡ技術、またはその他の技術によって簡単に作製することができる。好ましくは、合成によって、および適当な核酸配列を連結させることによって、究極的にはトランスフェクションされた細胞の中で発現する、所望のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを作出する。ヒト化抗ＣＳ１モノクローナル抗体は、本明細書に詳述されているように、モノクローナル抗体療法に感受性があるヒトの疾患を処置する上で特に有用であろう。
（実施例１７：他の霊長類のＣＳ１配列）
カニクイザル（ｃｙｎｏｓ）、チンパンジーおよびアカゲザルなど、いくつかの非ヒト霊長類に由来するＣＳ１細胞外ドメインのアミノ酸配列が決定されており、ヒト配列と比較された。アカゲザル由来の活性化ＰＢＭＣの試料からアカゲザルの配列を決定した。あらかじめＯＫＴ３で刺激されていたＰＢＭＣの試料からチンパンジー配列を決定した。カニクイザル由来の活性化ＰＢＭＣの試料からカニクイの配列を決定した。
Ｔｒｉｚｏｌ ＬＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）／クロロホルム抽出を利用して、組織試料からＲＮＡを調製した後、ＲＮＡｅａｓｙマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ）クリーンアップを行った。ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、第１鎖ｃＤＮＡを調製した。各種について公開された配列に対して設計されたか、または、特異的な種の配列が利用できない場合にはヒトの配列を用いて設計されたプライマーを用いてＰＣＲを行い、目的の領域をカバーするフラグメントを単離した。これらのフラグメントを、ＡＢ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ上で配列決定するために、ＴＯＰＯクローニング系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。
種特異的配列が決定された場合、必要とされるフラグメントを、発現ベクターに必要な制限部位を含むクローニングプライマーを用いて、ＰＣＲした。それぞれの種の細胞外ドメインを、ＮＥＦ３９ ＨＡＰＰＦｃベクター、ＮＥＦ３９ Ｆｃベクター、またはＮＩＦ Ｆｃベクターにサブクローニングし、完全長ＯＲＦは、ＮＥＦ３９ ＨＡ ＩＣＤ４ベクターにサブクローニングした。核酸配列の翻訳からアミノ酸配列を決定した。表１０（配列番号７５、７６、７７および７８）は、それぞれ、カニクイザル、アカゲザル、ヒトおよびチンパンジーに由来する各配列のアラインメントを示している。配列は、まずメチオニンから整列され、各シグナルペプチドを含んでいる。全種間で相同なアミノ酸残基を、＊記号で示した。
Figure 0004758984
 。
（実施例１８：ＣＳ１抗体のエピトープマッピング）
ヒト、マウス、またはヒト−マウスのキメラＣＳ１−Ｆｃタンパク質を構築して、サンドウィッチＥＬＩＳＡ法を用いて、さまざまな抗ＣＳ１抗体に結合する能力を評価した。抗ＣＳ１抗体のパネルは、ヒトＣＳ１タンパク質には結合するが、マウスＣＳ１タンパク質には結合しないことが示されている。
（ＣＳ１発現ベクター）
ヒトＣＳ１の細胞外ドメイン（アミノ酸１−２２７）をＮＩＦ Ｆｃベクターにサブクローニングして、マウスＣＳ１の細胞外ドメイン（アミノ酸１−２２４）をＮＥＦ３９Ｆｃベクターにサブクローニングした。これらのベクターは、上流にクローニングされたＣＳ１の細胞外ドメインと、ヒトガンマ１免疫グロブリン重鎖遺伝子とがインレームになった融合タンパク質を生成する。これによって、Ｃ末端にＣＳ１細胞外ドメインおよびヒトＦｃ“タグ”を含む分泌タンパク質を生成する。
（ＰＣＲおよび配列決定）
ＣＳ１細胞外ドメインのヒト／マウスキメラを、以前クローニングしたｃＤＮＡを供給源にもつヒトおよびマウスの配列の必要な結合部にまたがるキメラプライマーを用いてＰＣＲによって生成した。これらのフラグメントを、ソーイング（ｓｅｗｉｎｇ）ＰＣＲに用いて、発現ベクターに必要とされる制限部位とともにフラグメントを縫合した。これらのキメラフラグメントを、ＡＢ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒで配列決定するために、ＴＯＰＯクローニング系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングするか、またはＮＩＦ Ｆｃ発現ベクターに直接クローニングした。配列決定したフラグメントを、発現ベクターＮＩＦ Ｆｃにサブクローニングした。
キメラ構築物は、以下のように、表示されたヒトおよびマウスＣＳ１由来のアミノ酸を含む。これらの配列は表１１に示されている。
ｈｕ２５／ｍｕ７５：ヒトＣＳ１の１位〜６７位のアミノ酸を、マウスＣＳ１の６８位〜２２４位のアミノ酸に融合したもの（配列番号７９）。
ｍｕ２５／ｈｕ７５：マウスＣＳ１の１位〜６７位のアミノ酸を、ヒトＣＳ１の６８位〜２２７位のアミノ酸に融合したもの（配列番号８０）。
ｈｕ５０／ｍｕ５０：ヒトＣＳ１の１位〜１５１位のアミノ酸を、マウスＣＳ１の１４９位〜２２４位のアミノ酸と融合したもの（配列番号８１）。
ｍｕ５０／ｈｕ５０：マウスＣＳ１の１位〜１３１位のアミノ酸を、ヒトＣＳ１の１３５位〜２２７位のアミノ酸に融合したもの（配列番号８２）。
ｈｕ７５／ｍｕ２５：ヒトＣＳ１の１位〜１６９位のアミノ酸を、マウスＣＳ１の１６７位〜２２４位のアミノ酸に融合した（配列番号８３）。
ｍｕ７５／ｈｕ２５：マウスＣＳ１の１位〜１６６位のアミノ酸をヒトＣＳ１の１７０位〜２２７位のアミノ酸と融合したもの（配列番号８４）。
Figure 0004758984
 。
（一時的形質転換）
６ウェルプレートにウエル当たり２×１０５個の２９３／Ｔ細胞をプレートした。２４時間後、０．１５ｐｍｏｌのＤＮＡを、製造業者の指示に従って、ＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）と混合して、細胞に加えた。２４時間後、その細胞は、Ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ ＩｇＧ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに１２ｍｌの培地を含むＴ７５フラスコに移した。３日後、上清を回収して、ＥＬＩＳＡによってＦｃタグを検出することにより、ＣＳ１−Ｆｃ融合タンパク質が存在していることを確認し定量化した。
（エピトープマッピングＥＬＩＳＡ）
ヒト、マウス、またはヒト−マウスのキメラＣＳ１−Ｆｃタンパク質を、さまざまな抗ＣＳ１抗体を結合する能力について、サンドウィッチＥＬＩＳＡ法を用いて評価した。捕捉抗体である抗ヒトガンマ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ）を、１．８μｇ／ｍｌの炭酸緩衝液中でＥＬＩＳＡプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ ４ ＨＢＸ−ＴｈｅｒｍｏＬａｂＳｙｓｔｅｍｓ）に一晩結合させた。ブロッキングした後、ＣＳ１構築物でトランスフェクションされた２９３／Ｔ細胞から１００μｌの上清を３７℃で１時間インキュベートし、次いで、２μｇ／ｍｌの抗ＣＳ１抗体とともにインキュベートした。そして、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合体化した抗マウス抗体を、０．５μｇ／ｍｌでインキュベートし、その後、３，３’，５，５’ テトラメチルベンジジン（Ｓｉｇｍａ）で検出した。各アッセイは、少なくとも２回、２つの異なったトランスフェクションを用いて行った。
ＣＳ１抗体が、ヒトＣＳ１には結合するが、マウスＣＳ１には結合しないことは、以前から測定されている。しかし、この２つの種に由来するＣＳ１の細胞外ドメインは、ヒトＣＳ１とマウスＣＳ１との間のキメラを作製して、抗体が結合するタンパク質の領域を局在化することが可能にするのに十分に類似している。ヒトおよびマウスのＣＳ１の細胞外ドメインのキメラを含む発現構築物を２９３／Ｔ細胞にトランスフェクションして、それらのＣＳ１抗体への結合能力について評価した。予想通り、ＣＳ１抗体は、ヒトＣＳ１に結合したが、マウスＣＳ１には結合せず、３つの異なるエピトープ群に該当することが判明した（表１２）。
Figure 0004758984
 ＣＳ１抗体Ｌｕｃ３４、ＬｕｃＸ、Ｌｕｃ６９、およびＬｕｃ９０は、ヒトＣＳ１の最初の１５１アミノ酸、およびマウスＣＳ１の後半部を含むｈｕ５０／ｍｕ５０に結合する。したがって、これらの抗体は、ヒトＣＳ１細胞外ドメインの前半部に結合する。しかし、これらの抗体のいずれも、ヒトＣＳ１の最初の６７アミノ酸を含むｈｕ２５／ｍｕ７５や、ヒトＣＳ１の６８位〜２２７位のアミノ酸を含むｍｕ２５／ｈｕ７５のいずれにも結合しない。したがって、これらの抗体に対するエピトープは、これらの領域の両方で重複し、これらの構造体の接合部（６７位〜６８位のアミノ酸）に位置し得る。ＣＳ１抗体のＬｕｃ５およびＬｕｃ３８は、ヒトＣＳ１の最初の１５１アミノ酸を含むｈｕ５０／ｍｕ５０、およびヒトＣＳ１の６８位〜２２７位のアミノ酸を含むｍｕ２５／ｈｕ７５の両方に結合する。すなわち、これらの抗体はヒトＣＳ１の６８位〜１５１位のアミノ酸の間に結合する。調べたヒトＣＳ１で、Ｌｕｃ４、Ｌｕｃ１２、Ｌｕｃ２３、Ｌｕｃ２９、Ｌｕｃ３２、Ｌｕｃ３７、およびＬｕｃ６３が結合する最小の領域はｍｕ７５／ｈｕ２５である。すなわち、これらの抗体は、ヒトＣＳ１細胞外ドメインのＣ末端の５８アミノ酸に結合する。
本研究によって、ＣＳ１抗体結合部位が、以下の３つのエピトープクラスターに分類された。
（１）Ｌｕｃ９０によって規定されるエピトープ。ｈｕ５０／ｍｕ５０（配列番号８１）に結合する。このエピトープは、ヒトＣＳ１の約２３位のアミノ酸残基から約１５１位のアミノ酸残基までをカバーする。このエピトープは、細胞外ドメインのドメイン１（Ｖドメイン）の内部に存在する。このエピトープも、Ｌｕｃ３４、ＬｕｃＸ（ＬｕｃＸ．１およびＬｕｃＸ．２を含む）、およびＬｕｃ６９によって認識される。
（２）Ｌｕｃ３８によって規定されるエピトープ。ｍｕ２５／ｈｕ７５（配列番号８０）およびｈｕ５０／ｍｕ５０（配列番号８１）に結合する。このエピトープは、ヒトＣＳ１の約６８位のアミノ酸残基から約１５１位のアミノ酸残基までをカバーしている可能性がある。このエピトープはまた、Ｌｕｃ５によって認識される。
（３）Ｌｕｃ６３によって規定されるエピトープ。ｍｕ７５／ｈｕ２５（配列番号８４）に結合する。このエピトープは、ヒトＣＳ１の約１７０位のアミノ酸残基から約２２７位のアミノ酸残基までをカバーする。このエピトープは、ヒトＣＳ１のドメイン２（Ｃ２ドメイン）の内部に存在する。このエピトープはまた、Ｌｕｃ４、Ｌｕｃ１２、Ｌｕｃ２３、Ｌｕｃ２９、Ｌｕｃ３２、およびＬｕｃ３７によって認識される。
上記の実施例が決して本発明の真の範囲を制限するものではなく、むしろ例示的目的で提示されていると理解される。本明細書で引用した全ての刊行物、一連の登録番号、および特許出願は、個別の刊行物、登録番号、または特許出願が具体的かつ個別に示され参考として援用される場合と同様に、本明細書において参考として援用される。
図１Ａは、抗ＣＳ１モノクローナル抗体による、ＳＣＩＤ−ＨｕＰＢＭＣマウスモデルにおけるヒトＩｇＧのインビボ産生の阻害を示している。 図１Ｂは、抗ＣＳ１モノクローナル抗体Ｌｕｃ９０および６３による、ＳＣＩＤ−ＨｕＰＢＭＣマウスモデルにおけるヒトＩｇＧのインビボ産生の阻害の比較を示す。 図１Ｃは、抗ＣＳ１モノクローナル抗体による、ＳＣＩＤ−ＨｕＰＢＭＣマウスモデルにおけるヒトＩｇＧのインビボ産生の阻害をまとめたものを示している。 図２は、アイソタイプの対照用抗体と比較すると、抗ＣＳ１抗体のＬｕｃ９０およびＬｕｃ６３によって処置されたマウス異種移植多発性骨髄腫モデルにおける腫瘍容積の減少を示している。 図３は、インビボにおけるＯＰＭ−２腫瘍増殖に対する抗ＣＳ１抗体Ｌｕｃ６３およびヒト化Ｌｕｃ６３の効果を示している。

Claims (18)

  1. 配列番号１によりコードされるタンパク質に結合する、モノクローナル抗ＣＳ１抗体または抗ＣＳ１抗原結合フラグメントであって、
    配列番号６９、７０および７１に対応する重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列、および配列番号７２、７３および７４に対応する軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む、抗体または抗原結合フラグメント。
  2. ヒト化された請求項１に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  3. ＩｇＧ１である請求項１または２に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  4. 配列番号６７に対応するアミノ酸配列および配列番号６８に対応するアミノ酸配列を含む請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
  5. エフェクター部分および／または検出可能な部分に連結された、請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメントを含む、結合体化化合物。
  6. 前記抗体または抗原結合フラグメントが、検出可能な標識に結合体化された、請求項５に記載の結合体化化合物。
  7. 前記検出可能な標識が、放射性化合物、蛍光化合物、酵素、基質、エピトープタグ、または毒素である、請求項６に記載の結合体化化合物。
  8. 前記エフェクター部分が、毒素、化学療法剤、免疫調節物質、または放射性同位体である、請求項５に記載の結合体化化合物。
  9. 請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメントを含むか、あるいは請求項５〜８のうちのいずれか１項に記載の結合体化化合物を含む、薬学的組成物。
  10. 治療において使用するための組成物であって、請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント、あるいは請求項５〜８のうちのいずれか１項に記載の結合体化化合物を含む組成物。
  11. 癌を処置するための組成物であって、請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント、あるいは請求項５〜８のうちのいずれか１項に記載の結合体化化合物を含む組成物。
  12. 請求項１１に記載の組成物であって、前記癌が形質細胞癌である、組成物。
  13. 請求項１２に記載の組成物であって、前記形質細胞癌が、多発性骨髄腫、骨の骨髄腫、髄外性形質細胞腫、マクログロブリン血症、重鎖病、原発性アミロイドーシス、または意味不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症である組成物。
  14. 請求項１１に記載の組成物であって、前記癌が非形質細胞癌である組成物。
  15. 請求項１４に記載の組成物であって、前記非形質細胞癌が慢性リンパ球性白血病である組成物。
  16. 過粘稠血症候群を処置するための組成物であって、請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント、あるいは請求項５〜８のうちのいずれか１項に記載の結合体化化合物を含む組成物。
  17. 自己免疫疾患を処置するための組成物であって、請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント、あるいは請求項５〜８のうちのいずれか１項に記載の結合体化化合物を含む組成物。
  18. 請求項１７に記載の組成物であって、前記自己免疫疾患が、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、血小板減少症、関節リウマチ（ＲＡ）、溶血性貧血、または重症筋無力症である組成物。
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WO2001046260A2 (en) * 1999-12-23 2001-06-28 Bristol-Myers Squibb Company Novel immunoglobulin superfamily members apex-1, apex-2 and apex-3 and uses thereof

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