JP2001346598A - Ｈｄｌ亜画分の分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 高密度リポ蛋白亜画分（ＨＤＬ_２およびＨＤ
Ｌ_３）中の成分を、遠心操作等をせず分画し、簡便且つ
正確に測定する方法を提供すること。 【解決手段】 ＨＬＢ値が１７以上の非イオン性界面活
性剤の存在下でＨＤＬ_３中の成分、特にコレステロール
（ＨＤＬ_３−Ｃ）に選択的に酵素を作用をさせて、ＨＤ
Ｌ_３−Ｃ量を測定し、総ＨＤＬ−ＣからＨＤＬ_３−Ｃ量
を減算してＨＤＬ _２−Ｃ量を求める。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明が属する技術分野】本発明は、血中の高密度リポ
蛋白（ＨＤＬ）亜画分中の成分の測定法に関する。詳し
くは、ＨＤＬの亜画分であるＨＤＬ_２及びＨＤＬ_３に含
まれるコレステロール、ＨＤＬ_２−Ｃ、ＨＤＬ_３−Ｃを
測定する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】血清にはリポ蛋白として、大きく分類す
ると４種類のリポ蛋白、すなわち高密度リポ蛋白（ＨＤ
Ｌ）、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）、超低密度リポ蛋白
（ＶＬＤＬ）及びカイロミクロン（ＣＭ）が含まれてい
る。各種高脂血症等の疾病は、これらの１種類又は２種
類のリポ蛋白画分の増量に由来することが知られてお
り、各リポ蛋白を分画して定量する方法が報告されてい
る。この中で、ＨＤＬは特に冠動脈硬化症などの各種動
脈硬化症の診断又は病態の解析等のためのマーカーとし
て検査測定されている。ＨＤＬは更にＨＤＬ_２とＨＤＬ
_３の２つの亜画分（以下、ＨＤＬ亜画分という）に細分
される。

【０００３】ＨＤＬ亜画分の臨床的意義は、分画が困難
であるためほとんど研究されていない。従来、ＨＤＬの
分画は超遠心法で行われていた。この方法は熟練が必要
であり、かつ超遠心機を別途備え付けて遠心を数日にわ
たって行う。そのため、多検体を処理することは出来な
かった。これに代わりポリエチレングリコール及びデキ
ストラン硫酸等のポリアニオンにマグネシウムやカルシ
ウム等の２価カチオンを共存させたり、リンタングステ
ン酸に２価カチオンを共存させた分画剤なる溶液と血清
とを混和して、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、及びＣＭを沈澱せし
め、これらを遠心した後の上清に残るＨＤＬのみを分画
する方法が主流となっているが、ＨＤＬ亜画分は分別で
きない。

【０００４】また、この方法を応用して更に上清に残る
ＨＤＬを亜画分に分別する沈殿法がLewis I. Gidez, et
al [Journal of Lipid Research, 23, 1206-1223（198
2）]、Kurt Widhalm and Renate Pakosta[Clinical Che
mistry, 37 （2）, 238-241（1992）]らにより報告され
ているが、これらの方法はその正確度に疑問があり普及
していない。

【０００５】近年、電気泳動法によりＨＤＬ亜画分を分
画することでその研究が進められており、異常高ＨＤＬ
血症で遺伝的な欠損（ＣＥＴＰ欠損、肝性リパーゼ活性
低下など）が指摘されている。ＨＤＬコレステロール
（ＨＤＬ−Ｃ）が高いことは長寿症候群とも言われてい
るが、遺伝的な異常で高値となる場合は、やはり臨床的
な観察が必要である。ＨＤＬ−Ｃが低下すると動脈硬化
が亢進するので、ある程度の濃度を維持する必要がある
が、極端にＨＤＬ−Ｃが高値であると脳血管障害が引き
起こされる傾向にあるとういう報告もある。

【０００６】これらの現象についてＨＤＬ_２とＨＤＬ_３
を分析することで臨床的に重要な情報を早期に提供でき
る可能性がある。また、ＨＤＬ亜画分コレステロールの
臨床的意義についての報告も近年なされている。以下、
参考のために高ＨＤＬ血症やＨＤＬ亜画分に関する記述
のある文献を列挙する。

【０００７】1）松沢佑次、山下静也、垂井清一郎, Ｈ
ＤＬ異常症, 代謝, 25（4）, 351-358,1988. 2）Karl H. Weisgraber and Robert W. Mahley, Subfra
ction of human highdensity lipoproteins by heparin
-Sepharose affinity chromatography., J.Lipid Res.,
21, 316-325, 1980. 3）Lewis I. Gidez, et al, Separation and quantitat
ion of subclasses ofhuman plasma high density lipo
proteins by a simple precipitationprocedure., J. L
ipid Res., 23, 1206-1223, 1982. 4）Kurt Widhalm and Renate Pakosta, Precipitation
with polyethyleneglycol and density-gradient ultra
centrifugation compared fordetermining high-densit
y lipoprotein subclasses HDL₂ and HDL₃.,Clinical C
hemistry, 37 （2）, 238-241, 1992. 5）日高宏哉 その他, 正常ＣＥＴＰを持つ高ＨＤＬ血症
患者のＬＤＬ分画の検討, 臨床病理,42（11）, 1172-11
76, 1994. 6）青崎量二 その他, コレステリルエステル転送蛋白
（ＣＥＴＰ）の遺伝子型の簡便な測定法と高ＨＤＬ−Ｃ
血症患者における異常型ＣＥＴＰの頻度, 生物試料分
析, 20（2）, 119-125, 1997. 7）稲津明広 その他, ＣＥＴＰ欠損と高ＨＤＬコレステ
ロール血症, 臨床病理,44（4）, 322-326, 1996. 8）酒井尚彦 その他, ＨＤＬ異常症と動脈硬化, 臨床科
学, 27（4）, 416-424,1991. 9）星野忠 その他, リポ蛋白の電気泳動上特異なパター
ンを呈した高ＨＤＬ−Ｃ血症の一例, 臨床病理, 37
（7）, 835-839, 1989. 10）梅森祥央 その他, コレステロールエステル転送活
性の欠損に起因する高ＨＤＬ 血症の一症例, 臨床病
理, 40（9）, 999-1003, 1989. 11）山下静也 その他, Small Heterogeneous ＬＤＬと
巨大粒子ＨＤＬを特徴とし、Cholesteryl ester transf
er activity の完全欠損に起因する高ＨＤＬ血症２家系
の検討, 動脈硬化, １７（2）, 371-379, 1989. 12）山下静也 その他, 若年性角膜輪を伴う高ＨＤＬ_２
−Ｃ血漿の臨床的・生化学的検討, 動脈硬化, 13（4）,
981-990, 1985. 13）Ken-ischi Hirono, et al, Frequency of intron 1
4 splicing defect ofcholesterol ester transfer pro
tein gene in the Japanese generalpopulation-relati
on between the mutation and hyperalphalipoproteine
mia., Atherosclerosis, 100, 85-90, 1993.

【０００８】上記のように、ＨＤＬ亜画分を分別し、そ
れぞれに含まれるコレステロールを測定することは臨床
上の意義がある。しかし現在知られているＨＤＬ亜画分
の分別方法は、上記のように分画剤と血清とを混和し、
低速とは言え遠心操作を行う方法であり、分画剤と血清
とを混和させるときの人為的な定量誤差や検体の取り違
えなどが問題となっていた。その上、自動分析装置で他
の一般的な生化学項目と同時に測定することはできなか
った。臨床検査においては迅速に検査結果を得ることが
求められており、検査時間の短縮が課題である。

【０００９】近年、全自動のＨＤＬ中のコレステロール
を測定するキットが開発され普及しつつある。特許第２
６０００６５号（平６／１１／３０）、特開平８−２０
１３９３号公報（平７／１／３１）及び特開平８−１３
１１９５号公報（平６／１２／２１）にみられる技術
は、分画剤を併用するが、分画剤に含まれる二価カチオ
ンとして用いられる金属が自動分析装置で一般的に使用
される洗剤で不溶性の沈澱物を形成し、それが廃液機構
で蓄積することにより故障の原因となっている。

【００１０】更に、反応中に不溶性の凝集物を形成し測
定結果に影響を与える濁りが生じて測定誤差の原因とな
っているばかりか凝集物により反応セルが汚染されて同
時に測定している他の生化学項目の測定結果に少なから
ず影響を与えている。普及しているほとんどの自動分析
装置は、１０分で反応を完了する場合が多い。更に、既
知の方法である２ポイントエンド法、レート法、フィッ
クスタイム法などが選択できるようになっているので、
濁ったままの状態でも測定は可能である。

【００１１】しかし、この濁ったままの状態での測定
は、反応中に濁度変化があっては測定値に誤差が生じ、
正確性が問題となる。その他、反応液が濁ると再現性が
低下する。それ故、測定する試料に制限が加わり、幅広
い測定波長と多種多様な患者検体に対応することが出来
ない。例えば、３４０ｎｍ付近（ＵＶ領域）では凝集物
による濁りの現象で吸光度が２〜３以上となり分析機の
許容範囲をしばしば越えてしまう欠点がある。二価カチ
オンを用いることのない特開平９−９６６３７号公報
（平８／７／１９）の技術は、リポ蛋白と凝集する抗血
清を含ませる方法であるが、これも難溶性の抗原抗体凝
集物を形成するので、反応セルが汚染される。従って、
同時に測定している他の生化学項目の測定結果に少なか
らず影響を与える。また、反応液中の濁りが強度となる
ので、特にＵＶ領域によるＨＤＬ中のコレステロール測
定に対しても前述と同じ原因で正確な測定が不可能であ
る。

【００１２】これらの技術は、複合体や凝集体を形成す
ることで、酵素反応を阻害する共通の技術と測光法を工
夫することで成り立っているものであり、濁り本来が持
つ測定への悪影響は、完全には解消されていない。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、汎用
の自動分析装置を用いて、遠心操作による分離をせず
に、また、反応液中に複合体や凝集体による濁りを形成
することなく、生体試料中、特に血清中のＨＤＬ亜画分
（ＨＤＬ_２及びＨＤＬ_３）中の成分を定量する方法、詳
しくはＨＤＬ亜画分中のコレステロール（ＨＤＬ_２−Ｃ
及びＨＤＬ_３−Ｃ）を測定する方法を提供することであ
る。

【００１４】

【課題を解決する手段】本発明者らは、ＨＤＬに優先的
に直接作用するコレステロールエステル加水分解酵素で
あるリポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）又はコレステロ
ールエステラーゼ（ＣＥ）を、ＨＬＢ値が１７以上の非
イオン性界面活性剤の存在下で反応させ、分光光度計に
よる測定において誤差の原因となる複合体又は凝集体を
形成することなく、ＨＤＬ_３−コレステロール（ＨＤＬ
_３−Ｃ）を測定する方法を見出し、本発明を完成した。

【００１５】すなわち、本発明は、（１）ＨＤＬ亜画分
中の成分を酵素反応で測定する方法において、ＨＤＬ亜
画分から成分を遊離させるために、ＨＤＬに対して高い
特異性を示す酵素及びＨＬＢ値が１７以上である非イオ
ン性界面活性剤を用いることを特徴とするＨＤＬ亜画分
中の成分の測定法、（２）ＨＤＬに対して高い特異性を
示す酵素が、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）又はコ
レステロールエステラーゼ（ＣＥ）である前記（１）の
ＨＤＬ亜画分中の成分の測定法、（３）ＨＤＬ亜画分か
ら成分を遊離させるための酵素反応と該遊離された成分
を測定するための酵素反応をｐＨ６〜９の範囲で行うこ
とを特徴とする前記（１）又は（２）に記載のＨＤＬ亜
画分中の成分の測定法、（４）測定しようとするＨＤＬ
亜画分中の成分がコレステロールであり、コレステロー
ルを測定するための酵素反応がコレステロール脱水素酵
素及び酸化型補酵素による反応であり、該反応の生成物
である還元型補酵素を分光学的に検出する方法である前
記（１）〜（３）のいずれかのＨＤＬ亜画分中の成分の
測定法、（５）測定しようとするＨＤＬ亜画分中の成分
がコレステロールであり、コレステロールを測定するた
めの酵素反応がコレステロール酸化酵素による反応であ
り、該反応の生成物である過酸化水素をペルオキシダー
ゼを用いて測定する方法である前記（１）〜（３）のい
ずれかのＨＤＬ亜画分中の成分の測定法、（６）ＨＤＬ
亜画分がＨＤＬ_３であることを特徴とする前記（１）〜
（５）のいずれかのＨＤＬ亜画分中の成分の測定方法、
（７）総ＨＤＬ−コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）量から
ＨＤＬ_３−コレステロール（ＨＤＬ_３−Ｃ）量を減算す
ることによってＨＤＬ_２−コレステロール（ＨＤＬ_２−
Ｃ）量をも求めることを特徴とする前記（１）〜（６）
のいずれかのＨＤＬ亜画分中の成分の測定法、（８）前
記（１）〜（７）のいずれかのＨＤＬ亜画分中の成分の
測定法を実行するために必要な試薬を備えた試薬キッ
ト。

【００１６】

【発明の実施の態様】本発明のＨＤＬ亜画分中の成分の
測定法は、ＨＤＬ画分中の総ＨＤＬ−Ｃの測定に使用す
る方法を基本にしており、以下に示す手段を導入するこ
とでＨＤＬ亜画分中の成分、特にコレステロールの測定
を可能とするものである。ＨＤＬ画分中の成分、特にコ
レステロール（ＨＤＬ−Ｃ）の測定は、ＨＤＬ画分に酵
素を作用させ加水分解してＨＤＬが包含する成分を遊離
させる。その後遊離された成分を、その成分の測定に適
合する方法を用いて測定する。測定しようとする成分が
コレステロールである場合、コレステロール脱水素酵素
（ＣＤＨ）やコレステロール酸化酵素（ＣＯＤ）を作用
させて遊離されたコレステロールを測定する。

【００１７】ＨＤＬ亜画分中の成分、特にコレステロー
ルを測定する手段の１つは、ＨＤＬに優先的に反応する
酵素を選択することである。リポ蛋白に作用し加水分解
してリポ蛋白の包含する成分を遊離させる酵素としては
ＬＰＬ又はＣＥ等のコレステロールエステル加水分解酵
素がある。その中で例えばChromobacterium viscosum由
来のＬＰＬ又はＣＥが他のリポ蛋白と比較してＨＤＬに
優先的に反応するので好ましく用いられる。また、その
他の測定成分との適合性を考慮して、Pseudomonas属由
来の酵素も適宜選択できる。酵素の安定化などのために
修飾を行った酵素であっても、ＨＤＬに優先的に反応す
る酵素であり本発明の目的を達成しうるものであれば使
用できるので、修飾の有無は特に限定しない。

【００１８】ＨＤＬ亜画分中の成分、特にコレステロー
ルを測定する手段の別の１つは、ｐＨの選択であり、Ｈ
ＤＬ亜画分中の成分を遊離させる酵素反応及び該遊離さ
れた成分の測定のための反応をｐＨ６〜９で測定するこ
とが好ましい。ｐＨが６以下であるとリポ蛋白そのもの
が凝集体に関係なく、等電点効果で白濁してしまう。リ
ポ蛋白が比較的安定なｐＨ７付近を選択して測定条件を
整えれば良いが、ＬＰＬ又はＣＥはｐＨ８．０〜９．０
で非常に強くＨＤＬに反応する。

【００１９】更に、ＣＯＤ、ＣＤＨ、ＬＰＬ及びＣＥな
どの酵素が反応できるｐＨも考慮する。好適には、ＣＤ
Ｈ、ＬＰＬ及びＣＥの反応は、ｐＨ７〜９が好ましく、
ＣＯＤを用いるときはｐＨ６〜８が好ましい。

【００２０】ｐＨの調整は、緩衝液で行う。緩衝液は、
通常生化学反応に用いられる各種緩衝液が利用でき、Ｈ
ＥＰＥＳ緩衝液、ＴＡＰＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、
ＢＥＳ−ＢｉｓＴｒｉｓ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、Ｔｒ
ｉｓ−塩酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＡＤＡ緩衝液、ＡＣ
ＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳＯ緩衝液、ＢＥＳ緩衝液、ＴＥＳ
緩衝液、ＤＩＰＳＯ緩衝液、ＴＡＰＳＯ緩衝液、ＰＯＰ
ＳＯ緩衝液、ＨＥＰＰＳ緩衝液、ＨＥＰＰＳＯ緩衝液、
Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液、燐酸緩衝
液等が挙げられる。

【００２１】ＨＤＬ亜画分であるＨＤＬ_３中の成分、特
にコレステロール（ＨＤＬ_３−Ｃ）を測定する手段は、
ＨＬＢ値が１７以上、好ましくは１９以上、特に好まし
くは２０以上の非イオン性界面活性剤を使用することで
ある。その効果は、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ、及びＨＤ
Ｌ_２等のＨＤＬ_３以外のリポ蛋白に対するＬＰＬ及びＣ
Ｅの反応性を阻害するものである。従って、ＨＤＬ_３中
の成分、特にＨＤＬ_３−Ｃを測定できる。また、ＨＬＢ
値が高い非イオン性界面活性剤ほど、少ない添加量で選
択的にＨＤＬ_３中の成分の測定ができる。実際に使用で
きる界面活性剤を以下に例示するが、これらに限定され
ず、ＨＤＬ_３以外のリポ蛋白に対するＬＰＬ及びＣＥの
反応性を阻害するものであればよい。

【００２２】本法に用いる界面活性剤は、セチルエーテ
ル（Ｃ１６）（ヘキサデシルエーテル）（商品名：日光
ケミカル（株）：ＢＣ−２５ＴＸ、ＢＣ−３０ＴＸ、Ｂ
Ｃ−４０ＴＸ）、ラウリルエーテル（Ｃ１２）（ドデシ
ルエーテル）（商品名：日光ケミカル（株）：ＢＬ−２
１、ＢＬ−２５）、オレイルエーテル（商品名：日光ケ
ミカル（株）：ＢＯ−５０）、ベヘニルエーテル（Ｃ２
２）（商品名：日光ケミカル（株）：ＢＢ−３０）、ポ
リオキシエチレンラウリルエーテル（商品名：日本油脂
（株）：ノニオンＫ−２３０）、ポリオキシエチレンモ
ノラウレート（商品名：日本油脂（株）：ノニオンＳ−
４０）、ポリオキシエチレンエーテル類（商品名：シグ
マ：Ｂｒｉｊ９８、Ｂｒｉｊ７２１、Ｂｒｉｊ７８、Ｂ
ｒｉｊ９９）等が挙げられる。好適には、ＨＬＢ値が２
０付近のポリオキシエチレンエーテル類が選ばれる。こ
れらの界面活性剤は単独で使用してもよいし、適宜２種
以上を組み合わせて用いてもよい。添加量は、測定する
リポ蛋白量及び使用する界面活性剤のＨＬＢ値により変
化するが、簡単な実験的繰り返しにより、最適な添加量
を決定できる。例えば、ＨＬＢ値１７付近の界面活性剤
を使用する場合、ＬＤＬ及びＶＬＤＬに対するＬＰＬ及
びＣＥの反応性は阻害されるが、添加量によってはＨＤ
Ｌ_３に加えてＨＤＬ_２も測定されることがあるので、こ
のような場合、より高いＨＬＢ値の界面活性剤を使用す
る場合と比べ、添加量を多くすることが好ましい。具体
的には、０．００１ｗ／ｖ％〜１０ｗ／ｖ％の範囲で、
好適には１ｗ／ｖ％〜５ｗ／ｖ％の範囲で用いる。

【００２３】ＨＤＬ亜画分であるＨＤＬ_２中の成分量
は、ＨＤＬ中の成分量からＨＤＬ_３中の成分量を減算す
ることによって求められる。測定しようとするＨＤＬ_２
中の成分がコレステロールである場合、総ＨＤＬ−Ｃ量
からＨＤＬ_３−Ｃ量を減算すればＨＤＬ_２−Ｃ量が得ら
れる。

【００２４】本発明においては、上記３つの手段、ｐＨ
の選択、酵素の選択、界面活性剤の選択、を単独で又は
適宜選択し組合せて導入する。より好適にはこれら全て
の手段を同時に導入するが、必ずしも全てを同時に導入
する必要は無い。

【００２５】また、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びカイロミクロ
ン中の遊離型コレステロールが、ＨＤＬ−Ｃ測定時の反
応に関与して、しばしば誤差の原因となることがある
が、予めＣＯＤやＣＤＨでこれらの遊離型コレステロー
ルを反応させヒドラジン存在下でコレステノンヒドラゾ
ンに変換しておき、ＨＤＬ−Ｃの測定時に非基質化する
方法もある。非基質化する技術は公知の特開平５−１７
６７９７号公報（平３／１２／２７）を参考にすればよ
い。

【００２６】一方、ＣＥ又はＬＰＬのＬＤＬに対する反
応性を抑えるために、カリクスアレン類を用いることも
できる。カリクスアレン類にはカリクス［４］アレン、
カリクス［６］アレン、カリクス［８］アレン、硫酸カ
リクス［４］アレン、硫酸カリクス［６］アレン、硫酸
カリクス［８］アレン、酢酸カリクス［４］アレン、酢
酸カリクス［６］アレン、酢酸カリクス［８］アレン、
カルボキシカリクス［４］アレン、カルボキシカリクス
［６］アレン、カルボキシカリクス［８］アレン、カリ
クス［４］アレンアミン、カリクス［６］アレンアミ
ン、カリクス［８］アレンアミンが挙げられる。この中
から１種又は２種以上を適宜選択して用いる。使用濃度
は簡単な実験的繰り返しにより決めることができる。

【００２７】測定しようとするＨＤＬ亜画分中の成分が
コレステロールである場合、コレステロールを測定する
基本反応は、総コレステロールを測定する方法であり、
目的とする画分に合わせて成分を適宜調製すればよい。

【００２８】例えばコレステロールの測定は、コレステ
ロールとコレステロール脱水素酵素（ＣＤＨ）の反応を
酸化型補酵素存在下に行い、反応の結果還元された補酵
素を光学的に測定することによって行う。ＣＤＨを用い
る際の補酵素としては、β−ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド酸化型（ＮＡＤ）、Ｔｈｉｏ−ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド酸化型（ｔ−ＮＡＤ）、β
−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型
（ＮＡＤＰ）、Ｔｈｉｏ−ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドリン酸酸化型（ｔ−ＮＡＤＰ）等が挙げられ
る。

【００２９】また、コレステロール測定にはコレステロ
ール酸化酵素（ＣＯＤ）も使用できるが、この場合は、
ペルオキシダーゼと公知の過酸化水素定量法を組み合せ
て測定を行う。

【００３０】更に、コレステロール測定に必要となるコ
ール酸等の活性化剤や安定化剤などは既存の技術に従っ
てその条件を適宜選択し、簡単な実験的繰り返しにより
使用濃度を調整すればよい。

【００３１】本発明はまた、上記本発明のＨＤＬ亜画分
中の成分の測定法を実行するために必要な試薬を備えた
試薬キットを提供する。本発明の試薬キットは、少なく
ともＨＬＢ値が１７以上の非イオン性界面活性剤を含ん
でなるＨＤＬ亜画分中の成分の測定に使用する試薬キッ
トである。

【００３２】

【実施例】以下、ＨＤＬ_３中のコレステロールの測定例
について具体的に示す。

【実施例１】以下の試薬Ａ及びＢを調製した。検体は、
ボランティアによるヒト血清２２例を用いた。測定は、
日立７１７０型自動分析装置で実施した。先ず検体４μ
Ｌに試薬Ａ １８０μＬを加え３７℃で５分間恒温し、
この時点で主波長３４０ｎｍ及び副波長５７０ｎｍで吸
光度１を測定した。更に、試薬Ｂ ６０μＬを加え３７
℃で５分間恒温し、この時点で主波長３４０ｎｍ及び副
波長５７０ｎｍで吸光度２を測定した。吸光度１と吸光
度２の差を求めて既知ＨＤＬ_３−Ｃ濃度のコントロール
を標準液として検体の値を換算した。

【００３３】対照法としてポリエチレングリコールを用
いたKurt Widhalmらの方法を用いて測定を行った。この
方法を用いて遠心分画した上清のコレステロール濃度
は、国際試薬株式会社製Ｔ−ＣＨＯ試薬・Ｌ「コクサ
イ」を用いて求めた。また、自動分析装置を用いるホモ
ジニアスＨＤＬ−Ｃの測定は、国際試薬株式会社製ＨＤ
Ｌ−Ｃ試薬・ＫＬ「コクサイ」を用いて行った。対照法
のＨＤＬ_２−Ｃ値は、用手法によるＨＤＬ−Ｃから用手
法によるＨＤＬ_３−Ｃ値を差し引いて求めた。自動分析
法のＨＤＬ_２−Ｃ値は、ホモジニアスＨＤＬ−Ｃ値から
試薬Ａ及びＢを用いて求めたＨＤＬ_３−Ｃ値を差し引い
て求めた。

【００３４】図１に超遠心操作［Havel RJ, Eder HA, B
ragdon JH : The distribution andchemical compositi
on of ultracentrifugally separated lipoproteinsin
human serum., J. Clin. Invest., 34, 1345〜1353（19
55）］で得られたＶＬＤＬ、ＬＤＬ、（ＬＤＬ＋ＨＤＬ
_２）、ＨＤＬ_３及びＨＤＬを測定したときの３４０ｎｍ
における反応タイムコースを示した。

【００３５】図１に示したように、本法はＶＬＤＬ、Ｌ
ＤＬ、（ＬＤＬ＋ＨＤＬ_２）画分にはほとんど反応せ
ず、ＨＤＬ_３及びＨＤＬのみ反応していることが分か
る。各画分中の総コレステロール濃度は、ＶＬＤＬ＝９
９．９ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬ＝１９９．９ｍｇ／ｄＬ、
（ＬＤＬ＋ＨＤＬ_２）＝１７５．２＋３１．７ｍｇ／ｄ
Ｌ、ＨＤＬ_３＝２８．５ｍｇ／ｄＬ及びＨＤＬ＝８４．
２ｍｇ／ｄＬであった。

【００３６】本法による測定結果は、ＶＬＤＬ＝０．７
ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬ＝２．９ｍｇ／ｄＬ、（ＬＤＬ＋Ｈ
ＤＬ_２）＝４．０ｍｇ／ｄＬ、ＨＤＬ_３＝２８．０ｍｇ
／ｄＬ及びＨＤＬ＝６３．２ｍｇ／ｄＬであった。この
結果からもＨＤＬ_３に高い特異性を有することが分か
る。

【００３７】また、ヒト血清２２例を用いた測定結果を
表１に示した。本法のＨＤＬ_３−Ｃ値は、対照法との相
関係数が、０．９５７（ｐ＜０．０５）となり、よく一
致した結果となった。また、本法のＨＤＬ_２−Ｃ値は、
対照法との相関係数が、０．９３９（ｐ＜０．０５）と
なった。

【００３８】 試薬Ａ ＨＥＰＥＳ緩衝液 （ｐＨ７．０） １０ ｍｍｏｌ／Ｌ 二塩化ヒドラジニウム １００ ｍｍｏｌ／Ｌ β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型 ６．０ ｍｍｏｌ／Ｌ コール酸ナトリウム（活性化剤） ０．０６ ％ ノニオンＫ−２３０（ＨＬＢ値１７．３） ０．３ ｗ／ｖ％ ＢＣ−４０ＴＸ（ＨＬＢ値２０） １．０ ｗ／ｖ％ 硫酸カリクス［８］アレン ２．０ ｍｍｏｌ／Ｌ

【００３９】 試薬Ｂ ＴＡＰＳ緩衝液 （ｐＨ８．５） ５００ ｍｍｏｌ／Ｌ コレステロール脱水素酵素 ２０ Ｕ／ｍＬ ＬＰＬ ６ Ｕ／ｍＬ （Chromobacterium viscosum由来） コール酸ナトリウム（活性化剤） ０．１ ％

【００４０】

【表１】

【００４１】

【実施例２】以下の試薬Ｃ及びＤを調製した。検体は、
ボランティアによるヒト血清２２例を用いた。測定は、
日立７１７０型自動分析装置で実施した。操作法は、先
ず検体 ４μＬに試薬Ｃ １８０μＬを加え３７℃で５
分間恒温し、この時点で主波長３４０ｎｍ及び副波長５
７０ｎｍで吸光度１を測定した。更に、試薬Ｄ ６０μ
Ｌを加え３７℃で５分間恒温し、この時点で主波長３４
０ｎｍ及び副波長５７０ｎｍで吸光度２を測定した。吸
光度１と吸光度２の差を求めて既知ＨＤＬ_３−コレステ
ロール濃度のコントロールを標準液として検体の値を換
算した。対照法は、実施例１同様の操作を行った。自動
分析法のＨＤＬ_２−Ｃ値は、ホモジニアスＨＤＬ−Ｃ値
から試薬Ｃ及びＤを用いて求めたＨＤ_３−Ｃ値を差し引
いて求めた。

【００４２】図２に超遠心操作で得られたＶＬＤＬ、Ｌ
ＤＬ、（ＬＤＬ＋ＨＤＬ_２）、ＨＤＬ_３及びＨＤＬを測
定したときの３４０ｎｍにおける反応タイムコースを示
した。この図から、本法はＶＬＤＬ、ＬＤＬ、（ＬＤＬ
＋ＨＤＬ_２）画分にはほとんど反応せず、ＨＤＬ_３及び
ＨＤＬのみ反応していることが分かる。

【００４３】各画分中の総コレステロール濃度は、ＶＬ
ＤＬ＝９９．９ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬ＝１９９．９ｍｇ／
ｄＬ、（ＬＤＬ＋ＨＤＬ_２）＝１７５．２＋３１．７ｍ
ｇ／ｄＬ、ＨＤＬ_３＝２８．５ｍｇ／ｄＬ及びＨＤＬ＝
８４．２ｍｇ／ｄＬであった。

【００４４】本法による測定結果は、ＶＬＤＬ＝０．２
ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬ＝３．５ｍｇ／ｄＬ、（ＬＤＬ＋Ｈ
ＤＬ_２）＝０．２ｍｇ／ｄＬ、ＨＤＬ_３＝２７．８ｍｇ
／ｄＬ及びＨＤＬ＝５９．２ｍｇ／ｄＬであった。この
結果からもＨＤＬ_３に高い特異性を有することが分か
る。

【００４５】また、ヒト血清２２例を用いた測定結果を
表２に示した。本法のＨＤＬ_３−Ｃ値は、対照法との相
関係数が、０．９５２（ｐ＜０．０５）となり、よく一
致した結果となった。また、本法のＨＤＬ２−Ｃ値は、
対照法との相関係数が、０．９４２（ｐ＜０．０５）と
なった。

【００４６】 試薬Ｃ ＨＥＰＥＳ緩衝液 （ｐＨ７．０） １０ ｍｍｏｌ／Ｌ 二塩化ヒドラジニウム １００ ｍｍｏｌ／Ｌ β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型 ６．０ ｍｍｏｌ／Ｌ コール酸ナトリウム（活性化剤） ０．０６ ％ ノニオンＫ−２３０（ＨＬＢ値１７．３） ０．３ ｗ／ｖ％ Ｂｒｉｊ９８（ＨＬＢ値１９） １．６ ｗ／ｖ％ 硫酸カリクス［８］アレン ２．０ ｍｍｏｌ／Ｌ

【００４７】 試薬Ｄ ＴＡＰＳ緩衝液 （ｐＨ８．５） ５００ ｍｍｏｌ／Ｌ コレステロール脱水素酵素 ２０ Ｕ／ｍＬ ＬＰＬ ６ Ｕ／ｍＬ （Chromobacterium viscosum由来） コール酸ナトリウム（活性化剤） ０．１ ％

【００４８】

【表２】

【００４９】

【発明の効果】本発明の高密度リポ蛋白亜画分（ＨＤＬ
_２及びＨＤＬ_３）中の成分、特にコレステロールを測定
する方法は、ＨＬＢ値が１７以上の非イオン性界面活性
剤の存在下でＨＤＬ_３中の成分、特にコレステロール
（ＨＤＬ_３−Ｃ）に選択的に酵素を作用をさせて、ＨＤ
Ｌ_３−Ｃ量を測定し、総ＨＤＬ−ＣからＨＤＬ_３−Ｃ量
を減算してＨＤＬ_２−Ｃ量を求めることにより、極めて
容易にＨＤＬ亜画分のＨＤＬ−Ｃを測定する方法であ
る。本発明は、汎用の自動分析装置を用いて、遠心操作
による分離をせずに、また、反応液中に複合体や凝集体
による濁りを形成することなく、生体試料中、特に血清
中のＨＤＬ亜画分中の成分を定量することができるた
め、高脂血症等のリポ蛋白に関連する疾病の臨床検査や
研究等に有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】 超遠心操作で得た各リポ蛋白画分の反応タイ
ムコースを示す。測光ポイントは１７ポイントで５分、
３４ポイントで１０分を表す。

【図２】 超遠心操作で得た各リポ蛋白画分の反応タイ
ムコースを示す。測光ポイントは１７ポイントで５分、
３４ポイントで１０分を表す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/44 Ｃ１２Ｑ 1/44 Ｇ０１Ｎ 33/92 Ｇ０１Ｎ 33/92 Ｂ Ｚ (72)発明者 落合 浩二 兵庫県神戸市西区室谷１丁目１−２ 国際 試薬株式会社研究開発センター内 Ｆターム(参考） 2G045 AA13 BB29 BB60 CA25 CA26 DA63 DA69 FA26 FA27 FA29 FB01 GC10 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ76 QQ89 QR02 QR03 QR04 QR12 QR42 QR52 QS28 QS36 QX01

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＨＤＬ亜画分中の成分を酵素反応で測定
   する方法において、ＨＤＬ亜画分から成分を遊離させる
   ために、ＨＤＬに対して高い特異性を示す酵素及びＨＬ
   Ｂ値が１７以上である非イオン性界面活性剤を用いるこ
   とを特徴とするＨＤＬ亜画分中の成分の測定法。
2. 【請求項２】 ＨＤＬに対して高い特異性を示す酵素
   が、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）又はコレステロ
   ールエステラーゼ（ＣＥ）である請求項１に記載のＨＤ
   Ｌ亜画分中の成分の測定法。
3. 【請求項３】 ＨＤＬ亜画分から成分を遊離させるため
   の酵素反応と該遊離された成分を測定するための酵素反
   応をｐＨ６〜９の範囲で行うことを特徴とする請求項１
   又は２に記載のＨＤＬ亜画分中の成分の測定法。
4. 【請求項４】 測定しようとするＨＤＬ亜画分中の成分
   がコレステロールであり、コレステロールを測定するた
   めの酵素反応がコレステロール脱水素酵素及び酸化型補
   酵素による反応であり、該反応の生成物である還元型補
   酵素を分光学的に検出する方法である請求項１〜３のい
   ずれか１項に記載のＨＤＬ亜画分中の成分の測定法。
5. 【請求項５】 測定しようとするＨＤＬ亜画分中の成分
   がコレステロールであり、コレステロールを測定するた
   めの酵素反応がコレステロール酸化酵素による反応であ
   り、該反応の生成物である過酸化水素をペルオキシダー
   ゼを用いて測定する方法である請求項１〜３のいずれか
   １項に記載のＨＤＬ亜画分中の成分の測定法。
6. 【請求項６】 ＨＤＬ亜画分がＨＤＬ_３であることを特
   徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のＨＤＬ亜
   画分中の成分の測定方法。
7. 【請求項７】 総ＨＤＬ−コレステロール（ＨＤＬ−
   Ｃ）量からＨＤＬ_３−コレステロール（ＨＤＬ_３−Ｃ）
   量を減算することによってＨＤＬ_２−コレステロール
   （ＨＤＬ_２−Ｃ）量をも求めることを特徴とする請求項
   １〜６のいずれか１項に記載のＨＤＬ亜画分中の成分の
   測定法。
8. 【請求項８】 請求項１〜７のいずれか１項に記載のＨ
   ＤＬ亜画分中の成分の測定法を実行するために必要な試
   薬を備えた試薬キット。