JP4708531B2 - Ｈｄｌ亜画分中のコレステロールの測定法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、血中の高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）亜画分中の成分の測定法に関する。詳しくは、ＨＤＬの亜画分であるＨＤＬ２及びＨＤＬ３に含まれるコレステロール、ＨＤＬ２−Ｃ、ＨＤＬ３−Ｃを測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血清にはリポ蛋白として、大きく分類すると４種類のリポ蛋白、すなわち高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）、超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）及びカイロミクロン（ＣＭ）が含まれている。各種高脂血症等の疾病は、これらの１種類又は２種類のリポ蛋白画分の増量に由来することが知られており、各リポ蛋白を分画して定量する方法が報告されている。この中で、ＨＤＬは特に冠動脈硬化症などの各種動脈硬化症の診断又は病態の解析等のためのマーカーとして検査測定されている。ＨＤＬは更にＨＤＬ２とＨＤＬ３の２つの亜画分（以下、ＨＤＬ亜画分という）に細分される。
【０００３】
ＨＤＬ亜画分の臨床的意義は、分画が困難であるためほとんど研究されていない。従来、ＨＤＬの分画は超遠心法で行われていた。この方法は熟練が必要であり、かつ超遠心機を別途備え付けて遠心を数日にわたって行う。そのため、多検体を処理することは出来なかった。これに代わりポリエチレングリコール及びデキストラン硫酸等のポリアニオンにマグネシウムやカルシウム等の２価カチオンを共存させたり、リンタングステン酸に２価カチオンを共存させた分画剤なる溶液と血清とを混和して、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、及びＣＭを沈澱せしめ、これらを遠心した後の上清に残るＨＤＬのみを分画する方法が主流となっているが、ＨＤＬ亜画分は分別できない。
【０００４】
また、この方法を応用して更に上清に残るＨＤＬを亜画分に分別する沈殿法がLewis I. Gidez, et al [Journal of Lipid Research, 23, 1206-1223（1982）]、Kurt Widhalm and Renate Pakosta[Clinical Chemistry, 37 （2）, 238-241（1992）]らにより報告されているが、これらの方法はその正確度に疑問があり普及していない。
【０００５】
近年、電気泳動法によりＨＤＬ亜画分を分画することでその研究が進められており、異常高ＨＤＬ血症で遺伝的な欠損（ＣＥＴＰ欠損、肝性リパーゼ活性低下など）が指摘されている。ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）が高いことは長寿症候群とも言われているが、遺伝的な異常で高値となる場合は、やはり臨床的な観察が必要である。ＨＤＬ−Ｃが低下すると動脈硬化が亢進するので、ある程度の濃度を維持する必要があるが、極端にＨＤＬ−Ｃが高値であると脳血管障害が引き起こされる傾向にあるとういう報告もある。
【０００６】
これらの現象についてＨＤＬ２とＨＤＬ３を分析することで臨床的に重要な情報を早期に提供できる可能性がある。また、ＨＤＬ亜画分コレステロールの臨床的意義についての報告も近年なされている。以下、参考のために高ＨＤＬ血症やＨＤＬ亜画分に関する記述のある文献を列挙する。
【０００７】
1）松沢佑次、山下静也、垂井清一郎, ＨＤＬ異常症, 代謝, 25（4）, 351-358, 1988.
2）Karl H. Weisgraber and Robert W. Mahley, Subfraction of human high
density lipoproteins by heparin-Sepharose affinity chromatography., J. Lipid Res., 21, 316-325, 1980.
3）Lewis I. Gidez, et al, Separation and quantitation of subclasses of human plasma high density lipoproteins by a simple precipitation
procedure., J. Lipid Res., 23, 1206-1223, 1982.
4）Kurt Widhalm and Renate Pakosta, Precipitation with polyethylene
glycol and density-gradient ultracentrifugation compared for
determining high-density lipoprotein subclasses HDL2 and HDL3.,
Clinical Chemistry, 37 （2）, 238-241, 1992.
5）日高宏哉 その他, 正常ＣＥＴＰを持つ高ＨＤＬ血症患者のＬＤＬ分画の検討, 臨床病理,42（11）, 1172-1176, 1994.
6）青崎量二 その他, コレステリルエステル転送蛋白（ＣＥＴＰ）の遺伝子型の簡便な測定法と高ＨＤＬ−Ｃ血症患者における異常型ＣＥＴＰの頻度, 生物試料分析, 20（2）, 119-125, 1997.
7）稲津明広 その他, ＣＥＴＰ欠損と高ＨＤＬコレステロール血症, 臨床病理, 44（4）, 322-326, 1996.
8）酒井尚彦 その他, ＨＤＬ異常症と動脈硬化, 臨床科学, 27（4）, 416-424, 1991.
9）星野忠 その他, リポ蛋白の電気泳動上特異なパターンを呈した高ＨＤＬ−Ｃ血症の一例, 臨床病理, 37（7）, 835-839, 1989.
10）梅森祥央 その他, コレステロールエステル転送活性の欠損に起因する高ＨＤＬ 血症の一症例, 臨床病理, 40（9）, 999-1003, 1989.
11）山下静也 その他, Small Heterogeneous ＬＤＬと巨大粒子ＨＤＬを特徴とし、Cholesteryl ester transfer activity の完全欠損に起因する高ＨＤＬ血症２家系の検討, 動脈硬化, １７（2）, 371-379, 1989.
12）山下静也 その他, 若年性角膜輪を伴う高ＨＤＬ２−Ｃ血漿の臨床的・生化学的検討, 動脈硬化, 13（4）, 981-990, 1985.
13）Ken-ischi Hirono, et al, Frequency of intron 14 splicing defect of cholesterol ester transfer protein gene in the Japanese general
population-relation between the mutation and hyperalphalipoproteinemia., Atherosclerosis, 100, 85-90, 1993.
【０００８】
上記のように、ＨＤＬ亜画分を分別し、それぞれに含まれるコレステロールを測定することは臨床上の意義がある。しかし現在知られているＨＤＬ亜画分の分別方法は、上記のように分画剤と血清とを混和し、低速とは言え遠心操作を行う方法であり、分画剤と血清とを混和させるときの人為的な定量誤差や検体の取り違えなどが問題となっていた。その上、自動分析装置で他の一般的な生化学項目と同時に測定することはできなかった。臨床検査においては迅速に検査結果を得ることが求められており、検査時間の短縮が課題である。
【０００９】
近年、全自動のＨＤＬ中のコレステロールを測定するキットが開発され普及しつつある。特許第２６０００６５号（平６／１１／３０）、特開平８−２０１３９３号公報（平７／１／３１）及び特開平８−１３１１９５号公報（平６／１２／２１）にみられる技術は、分画剤を併用するが、分画剤に含まれる二価カチオンとして用いられる金属が自動分析装置で一般的に使用される洗剤で不溶性の沈澱物を形成し、それが廃液機構で蓄積することにより故障の原因となっている。
【００１０】
更に、反応中に不溶性の凝集物を形成し測定結果に影響を与える濁りが生じて測定誤差の原因となっているばかりか凝集物により反応セルが汚染されて同時に測定している他の生化学項目の測定結果に少なからず影響を与えている。普及しているほとんどの自動分析装置は、１０分で反応を完了する場合が多い。更に、既知の方法である２ポイントエンド法、レート法、フィックスタイム法などが選択できるようになっているので、濁ったままの状態でも測定は可能である。
【００１１】
しかし、この濁ったままの状態での測定は、反応中に濁度変化があっては測定値に誤差が生じ、正確性が問題となる。その他、反応液が濁ると再現性が低下する。それ故、測定する試料に制限が加わり、幅広い測定波長と多種多様な患者検体に対応することが出来ない。例えば、３４０ｎｍ付近（ＵＶ領域）では凝集物による濁りの現象で吸光度が２〜３以上となり分析機の許容範囲をしばしば越えてしまう欠点がある。二価カチオンを用いることのない特開平９−９６６３７号公報（平８／７／１９）の技術は、リポ蛋白と凝集する抗血清を含ませる方法であるが、これも難溶性の抗原抗体凝集物を形成するので、反応セルが汚染される。従って、同時に測定している他の生化学項目の測定結果に少なからず影響を与える。また、反応液中の濁りが強度となるので、特にＵＶ領域によるＨＤＬ中のコレステロール測定に対しても前述と同じ原因で正確な測定が不可能である。
【００１２】
これらの技術は、複合体や凝集体を形成することで、酵素反応を阻害する共通の技術と測光法を工夫することで成り立っているものであり、濁り本来が持つ測定への悪影響は、完全には解消されていない。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、汎用の自動分析装置を用いて、遠心操作による分離をせずに、また、反応液中に複合体や凝集体による濁りを形成することなく、生体試料中、特に血清中のＨＤＬ亜画分（ＨＤＬ２及びＨＤＬ３）中の成分を定量する方法、詳しくはＨＤＬ亜画分中のコレステロール（ＨＤＬ２−Ｃ及びＨＤＬ３−Ｃ）を測定する方法を提供することである。
【００１４】
【課題を解決する手段】
本発明者らは、ＨＤＬに優先的に直接作用するコレステロールエステル加水分解酵素であるリポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）又はコレステロールエステラーゼ（ＣＥ）を、ＨＬＢ値が１７以上の非イオン性界面活性剤の存在下で反応させ、分光光度計による測定において誤差の原因となる複合体又は凝集体を形成することなく、ＨＤＬ３−コレステロール（ＨＤＬ３−Ｃ）を測定する方法を見出し、本発明を完成した。
【００１５】
すなわち、本発明は以下からなる。
１．リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）及びコレステロールエステラーゼ（ＣＥ）から選択されるコレステロールエステル加水分解酵素、ＨＬＢ値が１７以上２０以下である異なる２種類の非イオン性界面活性剤、ヒドラジン塩、及びカリクスアレンを用いてＨＤＬ３画分からコレステロールを遊離させ、遊離されたコレステロールをコレステロール脱水素酵素又はコレステロール酸化酵素による酵素反応で測定することを特徴とするＨＤＬ３‐コレステロールの測定法。
２．異なる２種類の非イオン性界面活性剤、ヒドラジン塩、及びカリクスアレンを含む試薬と血清試料を混合した後に、コレステロールエステル加水分解酵素を含む試薬を添加することによりＨＤＬ３画分からコレステロールを遊離させる前項１に記載のＨＤＬ３‐コレステロールの測定法。
３．ＨＤＬ３画分からコレステロールを遊離させるための酵素反応と該遊離されたコレステロールを測定するための酵素反応をｐＨ６〜９の範囲で行うことを特徴とする前項１または２に記載のＨＤＬ３‐コレステロールの測定法。
４．遊離されたコレステロールを測定するための酵素反応がコレステロール脱水素酵素及び酸化型補酵素による反応であり、該反応の生成物である還元型補酵素を分光学的に検出する前項１〜３のいずれか１項に記載のＨＤＬ３‐コレステロールの測定法。
５．遊離されたコレステロールを測定するための酵素反応がコレステロール酸化酵素による反応であり、該反応の生成物である過酸化水素をペルオキシダーゼを用いて測定する前項１〜３のいずれか１項に記載のＨＤＬ３‐コレステロールの測定法。
６．前項１〜４のいずれか１項に記載の測定法によりＨＤＬ３‐コレステロール量を測定し、総ＨＤＬ−コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）量からＨＤＬ３‐コレステロール（ＨＤＬ３‐Ｃ）量を減算することによって求めることを特徴とするＨＤＬ２‐コレステロールの測定法。
【００１６】
【発明の実施の態様】
本発明のＨＤＬ亜画分中の成分の測定法は、ＨＤＬ画分中の総ＨＤＬ−Ｃの測定に使用する方法を基本にしており、以下に示す手段を導入することでＨＤＬ亜画分中の成分、特にコレステロールの測定を可能とするものである。ＨＤＬ画分中の成分、特にコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）の測定は、ＨＤＬ画分に酵素を作用させ加水分解してＨＤＬが包含する成分を遊離させる。その後遊離された成分を、その成分の測定に適合する方法を用いて測定する。測定しようとする成分がコレステロールである場合、コレステロール脱水素酵素（ＣＤＨ）やコレステロール酸化酵素（ＣＯＤ）を作用させて遊離されたコレステロールを測定する。
【００１７】
ＨＤＬ亜画分中の成分、特にコレステロールを測定する手段の１つは、ＨＤＬに優先的に反応する酵素を選択することである。リポ蛋白に作用し加水分解してリポ蛋白の包含する成分を遊離させる酵素としてはＬＰＬ又はＣＥ等のコレステロールエステル加水分解酵素がある。その中で例えばChromobacterium viscosum由来のＬＰＬ又はＣＥが他のリポ蛋白と比較してＨＤＬに優先的に反応するので好ましく用いられる。また、その他の測定成分との適合性を考慮して、Pseudomonas属由来の酵素も適宜選択できる。酵素の安定化などのために修飾を行った酵素であっても、ＨＤＬに優先的に反応する酵素であり本発明の目的を達成しうるものであれば使用できるので、修飾の有無は特に限定しない。
【００１８】
ＨＤＬ亜画分中の成分、特にコレステロールを測定する手段の別の１つは、ｐＨの選択であり、ＨＤＬ亜画分中の成分を遊離させる酵素反応及び該遊離された成分の測定のための反応をｐＨ６〜９で測定することが好ましい。ｐＨが６以下であるとリポ蛋白そのものが凝集体に関係なく、等電点効果で白濁してしまう。リポ蛋白が比較的安定なｐＨ７付近を選択して測定条件を整えれば良いが、ＬＰＬ又はＣＥはｐＨ８．０〜９．０で非常に強くＨＤＬに反応する。
【００１９】
更に、ＣＯＤ、ＣＤＨ、ＬＰＬ及びＣＥなどの酵素が反応できるｐＨも考慮する。好適には、ＣＤＨ、ＬＰＬ及びＣＥの反応は、ｐＨ７〜９が好ましく、ＣＯＤを用いるときはｐＨ６〜８が好ましい。
【００２０】
ｐＨの調整は、緩衝液で行う。緩衝液は、通常生化学反応に用いられる各種緩衝液が利用でき、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＴＡＰＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、ＢＥＳ−ＢｉｓＴｒｉｓ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＡＤＡ緩衝液、ＡＣＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳＯ緩衝液、ＢＥＳ緩衝液、ＴＥＳ緩衝液、ＤＩＰＳＯ緩衝液、ＴＡＰＳＯ緩衝液、ＰＯＰＳＯ緩衝液、ＨＥＰＰＳ緩衝液、ＨＥＰＰＳＯ緩衝液、Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液、燐酸緩衝液等が挙げられる。
【００２１】
ＨＤＬ亜画分であるＨＤＬ３中の成分、特にコレステロール（ＨＤＬ３−Ｃ）を測定する手段は、ＨＬＢ値が１７以上、好ましくは１９以上、特に好ましくは２０以上の非イオン性界面活性剤を使用することである。その効果は、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ、及びＨＤＬ２等のＨＤＬ３以外のリポ蛋白に対するＬＰＬ及びＣＥの反応性を阻害するものである。従って、ＨＤＬ３中の成分、特にＨＤＬ３−Ｃを測定できる。また、ＨＬＢ値が高い非イオン性界面活性剤ほど、少ない添加量で選択的にＨＤＬ３中の成分の測定ができる。実際に使用できる界面活性剤を以下に例示するが、これらに限定されず、ＨＤＬ３以外のリポ蛋白に対するＬＰＬ及びＣＥの反応性を阻害するものであればよい。
【００２２】
本法に用いる界面活性剤は、セチルエーテル（Ｃ１６）（ヘキサデシルエーテル）（商品名：日光ケミカル（株）：ＢＣ−２５ＴＸ、ＢＣ−３０ＴＸ、ＢＣ−４０ＴＸ）、ラウリルエーテル（Ｃ１２）（ドデシルエーテル）（商品名：日光ケミカル（株）：ＢＬ−２１、ＢＬ−２５）、オレイルエーテル（商品名：日光ケミカル（株）：ＢＯ−５０）、ベヘニルエーテル（Ｃ２２）（商品名：日光ケミカル（株）：ＢＢ−３０）、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（商品名：日本油脂（株）：ノニオンＫ−２３０）、ポリオキシエチレンモノラウレート（商品名：日本油脂（株）：ノニオンＳ−４０）、ポリオキシエチレンエーテル類（商品名：シグマ：Ｂｒｉｊ９８、Ｂｒｉｊ７２１、Ｂｒｉｊ７８、Ｂｒｉｊ９９）等が挙げられる。好適には、ＨＬＢ値が２０付近のポリオキシエチレンエーテル類が選ばれる。これらの界面活性剤は単独で使用してもよいし、適宜２種以上を組み合わせて用いてもよい。添加量は、測定するリポ蛋白量及び使用する界面活性剤のＨＬＢ値により変化するが、簡単な実験的繰り返しにより、最適な添加量を決定できる。例えば、ＨＬＢ値１７付近の界面活性剤を使用する場合、ＬＤＬ及びＶＬＤＬに対するＬＰＬ及びＣＥの反応性は阻害されるが、添加量によってはＨＤＬ３に加えてＨＤＬ２も測定されることがあるので、このような場合、より高いＨＬＢ値の界面活性剤を使用する場合と比べ、添加量を多くすることが好ましい。具体的には、０．００１ｗ／ｖ％〜１０ｗ／ｖ％の範囲で、好適には１ｗ／ｖ％〜５ｗ／ｖ％の範囲で用いる。
【００２３】
ＨＤＬ亜画分であるＨＤＬ２中の成分量は、ＨＤＬ中の成分量からＨＤＬ３中の成分量を減算することによって求められる。測定しようとするＨＤＬ２中の成分がコレステロールである場合、総ＨＤＬ−Ｃ量からＨＤＬ３−Ｃ量を減算すればＨＤＬ２−Ｃ量が得られる。
【００２４】
本発明においては、上記３つの手段、ｐＨの選択、酵素の選択、界面活性剤の選択、を単独で又は適宜選択し組合せて導入する。より好適にはこれら全ての手段を同時に導入するが、必ずしも全てを同時に導入する必要は無い。
【００２５】
また、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びカイロミクロン中の遊離型コレステロールが、ＨＤＬ−Ｃ測定時の反応に関与して、しばしば誤差の原因となることがあるが、予めＣＯＤやＣＤＨでこれらの遊離型コレステロールを反応させヒドラジン存在下でコレステノンヒドラゾンに変換しておき、ＨＤＬ−Ｃの測定時に非基質化する方法もある。非基質化する技術は公知の特開平５−１７６７９７号公報（平３／１２／２７）を参考にすればよい。
【００２６】
一方、ＣＥ又はＬＰＬのＬＤＬに対する反応性を抑えるために、カリクスアレン類を用いることもできる。カリクスアレン類にはカリクス［４］アレン、カリクス［６］アレン、カリクス［８］アレン、硫酸カリクス［４］アレン、硫酸カリクス［６］アレン、硫酸カリクス［８］アレン、酢酸カリクス［４］アレン、酢酸カリクス［６］アレン、酢酸カリクス［８］アレン、カルボキシカリクス［４］アレン、カルボキシカリクス［６］アレン、カルボキシカリクス［８］アレン、カリクス［４］アレンアミン、カリクス［６］アレンアミン、カリクス［８］アレンアミンが挙げられる。この中から１種又は２種以上を適宜選択して用いる。使用濃度は簡単な実験的繰り返しにより決めることができる。
【００２７】
測定しようとするＨＤＬ亜画分中の成分がコレステロールである場合、コレステロールを測定する基本反応は、総コレステロールを測定する方法であり、目的とする画分に合わせて成分を適宜調製すればよい。
【００２８】
例えばコレステロールの測定は、コレステロールとコレステロール脱水素酵素（ＣＤＨ）の反応を酸化型補酵素存在下に行い、反応の結果還元された補酵素を光学的に測定することによって行う。ＣＤＨを用いる際の補酵素としては、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（ＮＡＤ）、Ｔｈｉｏ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（ｔ−ＮＡＤ）、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型（ＮＡＤＰ）、Ｔｈｉｏ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型（ｔ−ＮＡＤＰ）等が挙げられる。
【００２９】
また、コレステロール測定にはコレステロール酸化酵素（ＣＯＤ）も使用できるが、この場合は、ペルオキシダーゼと公知の過酸化水素定量法を組み合せて測定を行う。
【００３０】
更に、コレステロール測定に必要となるコール酸等の活性化剤や安定化剤などは既存の技術に従ってその条件を適宜選択し、簡単な実験的繰り返しにより使用濃度を調整すればよい。
【００３１】
本発明はまた、上記本発明のＨＤＬ亜画分中の成分の測定法を実行するために必要な試薬を備えた試薬キットを提供する。本発明の試薬キットは、少なくともＨＬＢ値が１７以上の非イオン性界面活性剤を含んでなるＨＤＬ亜画分中の成分の測定に使用する試薬キットである。
【００３２】
【実施例】
以下、ＨＤＬ３中のコレステロールの測定例について具体的に示す。
【実施例１】
以下の試薬Ａ及びＢを調製した。検体は、ボランティアによるヒト血清２２例を用いた。測定は、日立７１７０型自動分析装置で実施した。先ず検体４μＬに試薬Ａ １８０μＬを加え３７℃で５分間恒温し、この時点で主波長３４０ｎｍ及び副波長５７０ｎｍで吸光度１を測定した。更に、試薬Ｂ ６０μＬを加え３７℃で５分間恒温し、この時点で主波長３４０ｎｍ及び副波長５７０ｎｍで吸光度２を測定した。吸光度１と吸光度２の差を求めて既知ＨＤＬ３−Ｃ濃度のコントロールを標準液として検体の値を換算した。
【００３３】
対照法としてポリエチレングリコールを用いたKurt Widhalmらの方法を用いて測定を行った。この方法を用いて遠心分画した上清のコレステロール濃度は、国際試薬株式会社製Ｔ−ＣＨＯ試薬・Ｌ「コクサイ」を用いて求めた。また、自動分析装置を用いるホモジニアスＨＤＬ−Ｃの測定は、国際試薬株式会社製ＨＤＬ−Ｃ試薬・ＫＬ「コクサイ」を用いて行った。対照法のＨＤＬ２−Ｃ値は、用手法によるＨＤＬ−Ｃから用手法によるＨＤＬ３−Ｃ値を差し引いて求めた。自動分析法のＨＤＬ２−Ｃ値は、ホモジニアスＨＤＬ−Ｃ値から試薬Ａ及びＢを用いて求めたＨＤＬ３−Ｃ値を差し引いて求めた。
【００３４】
図１に超遠心操作［Havel RJ, Eder HA, Bragdon JH : The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteinsin human serum., J. Clin. Invest., 34, 1345〜1353（1955）］で得られたＶＬＤＬ、ＬＤＬ、（ＬＤＬ＋ＨＤＬ２）、ＨＤＬ３及びＨＤＬを測定したときの３４０ｎｍにおける反応タイムコースを示した。
【００３５】
図１に示したように、本法はＶＬＤＬ、ＬＤＬ、（ＬＤＬ＋ＨＤＬ２）画分にはほとんど反応せず、ＨＤＬ３及びＨＤＬのみ反応していることが分かる。各画分中の総コレステロール濃度は、ＶＬＤＬ＝９９．９ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬ＝１９９．９ｍｇ／ｄＬ、（ＬＤＬ＋ＨＤＬ２）＝１７５．２＋３１．７ｍｇ／ｄＬ、ＨＤＬ３＝２８．５ｍｇ／ｄＬ及びＨＤＬ＝８４．２ｍｇ／ｄＬであった。
【００３６】
本法による測定結果は、ＶＬＤＬ＝０．７ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬ＝２．９ｍｇ／ｄＬ、（ＬＤＬ＋ＨＤＬ２）＝４．０ｍｇ／ｄＬ、ＨＤＬ３＝２８．０ｍｇ／ｄＬ及びＨＤＬ＝６３．２ｍｇ／ｄＬであった。この結果からもＨＤＬ３に高い特異性を有することが分かる。
【００３７】
また、ヒト血清２２例を用いた測定結果を表１に示した。本法のＨＤＬ３−Ｃ値は、対照法との相関係数が、０．９５７（ｐ＜０．０５）となり、よく一致した結果となった。また、本法のＨＤＬ２−Ｃ値は、対照法との相関係数が、０．９３９（ｐ＜０．０５）となった。
【００３８】
試薬Ａ
ＨＥＰＥＳ緩衝液 （ｐＨ７．０） １０ ｍｍｏｌ／Ｌ
二塩化ヒドラジニウム １００ ｍｍｏｌ／Ｌ
β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型 ６．０ ｍｍｏｌ／Ｌ
コール酸ナトリウム（活性化剤） ０．０６ ％
ノニオンＫ−２３０（ＨＬＢ値１７．３） ０．３ ｗ／ｖ％
ＢＣ−４０ＴＸ（ＨＬＢ値２０） １．０ ｗ／ｖ％
硫酸カリクス［８］アレン ２．０ ｍｍｏｌ／Ｌ
【００３９】
試薬Ｂ
ＴＡＰＳ緩衝液 （ｐＨ８．５） ５００ ｍｍｏｌ／Ｌ
コレステロール脱水素酵素 ２０ Ｕ／ｍＬ
ＬＰＬ ６ Ｕ／ｍＬ
（Chromobacterium viscosum由来）
コール酸ナトリウム（活性化剤） ０．１ ％
【００４０】
【表１】
【００４１】
【実施例２】
以下の試薬Ｃ及びＤを調製した。検体は、ボランティアによるヒト血清２２例を用いた。測定は、日立７１７０型自動分析装置で実施した。操作法は、先ず検体 ４μＬに試薬Ｃ １８０μＬを加え３７℃で５分間恒温し、この時点で主波長３４０ｎｍ及び副波長５７０ｎｍで吸光度１を測定した。更に、試薬Ｄ ６０μＬを加え３７℃で５分間恒温し、この時点で主波長３４０ｎｍ及び副波長５７０ｎｍで吸光度２を測定した。吸光度１と吸光度２の差を求めて既知ＨＤＬ３−コレステロール濃度のコントロールを標準液として検体の値を換算した。対照法は、実施例１同様の操作を行った。自動分析法のＨＤＬ２−Ｃ値は、ホモジニアスＨＤＬ−Ｃ値から試薬Ｃ及びＤを用いて求めたＨＤ３−Ｃ値を差し引いて求めた。
【００４２】
図２に超遠心操作で得られたＶＬＤＬ、ＬＤＬ、（ＬＤＬ＋ＨＤＬ２）、ＨＤＬ３及びＨＤＬを測定したときの３４０ｎｍにおける反応タイムコースを示した。この図から、本法はＶＬＤＬ、ＬＤＬ、（ＬＤＬ＋ＨＤＬ２）画分にはほとんど反応せず、ＨＤＬ３及びＨＤＬのみ反応していることが分かる。
【００４３】
各画分中の総コレステロール濃度は、ＶＬＤＬ＝９９．９ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬ＝１９９．９ｍｇ／ｄＬ、（ＬＤＬ＋ＨＤＬ２）＝１７５．２＋３１．７ｍｇ／ｄＬ、ＨＤＬ３＝２８．５ｍｇ／ｄＬ及びＨＤＬ＝８４．２ｍｇ／ｄＬであった。
【００４４】
本法による測定結果は、ＶＬＤＬ＝０．２ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬ＝３．５ｍｇ／ｄＬ、（ＬＤＬ＋ＨＤＬ２）＝０．２ｍｇ／ｄＬ、ＨＤＬ３＝２７．８ｍｇ／ｄＬ及びＨＤＬ＝５９．２ｍｇ／ｄＬであった。この結果からもＨＤＬ３に高い特異性を有することが分かる。
【００４５】
また、ヒト血清２２例を用いた測定結果を表２に示した。本法のＨＤＬ３−Ｃ値は、対照法との相関係数が、０．９５２（ｐ＜０．０５）となり、よく一致した結果となった。また、本法のＨＤＬ２−Ｃ値は、対照法との相関係数が、０．９４２（ｐ＜０．０５）となった。
【００４６】
試薬Ｃ
ＨＥＰＥＳ緩衝液 （ｐＨ７．０） １０ ｍｍｏｌ／Ｌ
二塩化ヒドラジニウム １００ ｍｍｏｌ／Ｌ
β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型 ６．０ ｍｍｏｌ／Ｌ
コール酸ナトリウム（活性化剤） ０．０６ ％
ノニオンＫ−２３０（ＨＬＢ値１７．３） ０．３ ｗ／ｖ％
Ｂｒｉｊ９８（ＨＬＢ値１９） １．６ ｗ／ｖ％
硫酸カリクス［８］アレン ２．０ ｍｍｏｌ／Ｌ
【００４７】
試薬Ｄ
ＴＡＰＳ緩衝液 （ｐＨ８．５） ５００ ｍｍｏｌ／Ｌ
コレステロール脱水素酵素 ２０ Ｕ／ｍＬ
ＬＰＬ ６ Ｕ／ｍＬ
（Chromobacterium viscosum由来）
コール酸ナトリウム（活性化剤） ０．１ ％
【００４８】
【表２】
【００４９】
【発明の効果】
本発明の高密度リポ蛋白亜画分（ＨＤＬ２及びＨＤＬ３）中の成分、特にコレステロールを測定する方法は、ＨＬＢ値が１７以上の非イオン性界面活性剤の存在下でＨＤＬ３中の成分、特にコレステロール（ＨＤＬ３−Ｃ）に選択的に酵素を作用をさせて、ＨＤＬ３−Ｃ量を測定し、総ＨＤＬ−ＣからＨＤＬ３−Ｃ量を減算してＨＤＬ２−Ｃ量を求めることにより、極めて容易にＨＤＬ亜画分のＨＤＬ−Ｃを測定する方法である。本発明は、汎用の自動分析装置を用いて、遠心操作による分離をせずに、また、反応液中に複合体や凝集体による濁りを形成することなく、生体試料中、特に血清中のＨＤＬ亜画分中の成分を定量することができるため、高脂血症等のリポ蛋白に関連する疾病の臨床検査や研究等に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 超遠心操作で得た各リポ蛋白画分の反応タイムコースを示す。測光ポイントは１７ポイントで５分、３４ポイントで１０分を表す。
【図２】 超遠心操作で得た各リポ蛋白画分の反応タイムコースを示す。測光ポイントは１７ポイントで５分、３４ポイントで１０分を表す。
【発明が属する技術分野】
本発明は、血中の高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）亜画分中の成分の測定法に関する。詳しくは、ＨＤＬの亜画分であるＨＤＬ２及びＨＤＬ３に含まれるコレステロール、ＨＤＬ２−Ｃ、ＨＤＬ３−Ｃを測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血清にはリポ蛋白として、大きく分類すると４種類のリポ蛋白、すなわち高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）、超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）及びカイロミクロン（ＣＭ）が含まれている。各種高脂血症等の疾病は、これらの１種類又は２種類のリポ蛋白画分の増量に由来することが知られており、各リポ蛋白を分画して定量する方法が報告されている。この中で、ＨＤＬは特に冠動脈硬化症などの各種動脈硬化症の診断又は病態の解析等のためのマーカーとして検査測定されている。ＨＤＬは更にＨＤＬ２とＨＤＬ３の２つの亜画分（以下、ＨＤＬ亜画分という）に細分される。
【０００３】
ＨＤＬ亜画分の臨床的意義は、分画が困難であるためほとんど研究されていない。従来、ＨＤＬの分画は超遠心法で行われていた。この方法は熟練が必要であり、かつ超遠心機を別途備え付けて遠心を数日にわたって行う。そのため、多検体を処理することは出来なかった。これに代わりポリエチレングリコール及びデキストラン硫酸等のポリアニオンにマグネシウムやカルシウム等の２価カチオンを共存させたり、リンタングステン酸に２価カチオンを共存させた分画剤なる溶液と血清とを混和して、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、及びＣＭを沈澱せしめ、これらを遠心した後の上清に残るＨＤＬのみを分画する方法が主流となっているが、ＨＤＬ亜画分は分別できない。
【０００４】
また、この方法を応用して更に上清に残るＨＤＬを亜画分に分別する沈殿法がLewis I. Gidez, et al [Journal of Lipid Research, 23, 1206-1223（1982）]、Kurt Widhalm and Renate Pakosta[Clinical Chemistry, 37 （2）, 238-241（1992）]らにより報告されているが、これらの方法はその正確度に疑問があり普及していない。
【０００５】
近年、電気泳動法によりＨＤＬ亜画分を分画することでその研究が進められており、異常高ＨＤＬ血症で遺伝的な欠損（ＣＥＴＰ欠損、肝性リパーゼ活性低下など）が指摘されている。ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）が高いことは長寿症候群とも言われているが、遺伝的な異常で高値となる場合は、やはり臨床的な観察が必要である。ＨＤＬ−Ｃが低下すると動脈硬化が亢進するので、ある程度の濃度を維持する必要があるが、極端にＨＤＬ−Ｃが高値であると脳血管障害が引き起こされる傾向にあるとういう報告もある。
【０００６】
これらの現象についてＨＤＬ２とＨＤＬ３を分析することで臨床的に重要な情報を早期に提供できる可能性がある。また、ＨＤＬ亜画分コレステロールの臨床的意義についての報告も近年なされている。以下、参考のために高ＨＤＬ血症やＨＤＬ亜画分に関する記述のある文献を列挙する。
【０００７】
1）松沢佑次、山下静也、垂井清一郎, ＨＤＬ異常症, 代謝, 25（4）, 351-358, 1988.
2）Karl H. Weisgraber and Robert W. Mahley, Subfraction of human high
density lipoproteins by heparin-Sepharose affinity chromatography., J. Lipid Res., 21, 316-325, 1980.
3）Lewis I. Gidez, et al, Separation and quantitation of subclasses of human plasma high density lipoproteins by a simple precipitation
procedure., J. Lipid Res., 23, 1206-1223, 1982.
4）Kurt Widhalm and Renate Pakosta, Precipitation with polyethylene
glycol and density-gradient ultracentrifugation compared for
determining high-density lipoprotein subclasses HDL2 and HDL3.,
Clinical Chemistry, 37 （2）, 238-241, 1992.
5）日高宏哉 その他, 正常ＣＥＴＰを持つ高ＨＤＬ血症患者のＬＤＬ分画の検討, 臨床病理,42（11）, 1172-1176, 1994.
6）青崎量二 その他, コレステリルエステル転送蛋白（ＣＥＴＰ）の遺伝子型の簡便な測定法と高ＨＤＬ−Ｃ血症患者における異常型ＣＥＴＰの頻度, 生物試料分析, 20（2）, 119-125, 1997.
7）稲津明広 その他, ＣＥＴＰ欠損と高ＨＤＬコレステロール血症, 臨床病理, 44（4）, 322-326, 1996.
8）酒井尚彦 その他, ＨＤＬ異常症と動脈硬化, 臨床科学, 27（4）, 416-424, 1991.
9）星野忠 その他, リポ蛋白の電気泳動上特異なパターンを呈した高ＨＤＬ−Ｃ血症の一例, 臨床病理, 37（7）, 835-839, 1989.
10）梅森祥央 その他, コレステロールエステル転送活性の欠損に起因する高ＨＤＬ 血症の一症例, 臨床病理, 40（9）, 999-1003, 1989.
11）山下静也 その他, Small Heterogeneous ＬＤＬと巨大粒子ＨＤＬを特徴とし、Cholesteryl ester transfer activity の完全欠損に起因する高ＨＤＬ血症２家系の検討, 動脈硬化, １７（2）, 371-379, 1989.
12）山下静也 その他, 若年性角膜輪を伴う高ＨＤＬ２−Ｃ血漿の臨床的・生化学的検討, 動脈硬化, 13（4）, 981-990, 1985.
13）Ken-ischi Hirono, et al, Frequency of intron 14 splicing defect of cholesterol ester transfer protein gene in the Japanese general
population-relation between the mutation and hyperalphalipoproteinemia., Atherosclerosis, 100, 85-90, 1993.
【０００８】
上記のように、ＨＤＬ亜画分を分別し、それぞれに含まれるコレステロールを測定することは臨床上の意義がある。しかし現在知られているＨＤＬ亜画分の分別方法は、上記のように分画剤と血清とを混和し、低速とは言え遠心操作を行う方法であり、分画剤と血清とを混和させるときの人為的な定量誤差や検体の取り違えなどが問題となっていた。その上、自動分析装置で他の一般的な生化学項目と同時に測定することはできなかった。臨床検査においては迅速に検査結果を得ることが求められており、検査時間の短縮が課題である。
【０００９】
近年、全自動のＨＤＬ中のコレステロールを測定するキットが開発され普及しつつある。特許第２６０００６５号（平６／１１／３０）、特開平８−２０１３９３号公報（平７／１／３１）及び特開平８−１３１１９５号公報（平６／１２／２１）にみられる技術は、分画剤を併用するが、分画剤に含まれる二価カチオンとして用いられる金属が自動分析装置で一般的に使用される洗剤で不溶性の沈澱物を形成し、それが廃液機構で蓄積することにより故障の原因となっている。
【００１０】
更に、反応中に不溶性の凝集物を形成し測定結果に影響を与える濁りが生じて測定誤差の原因となっているばかりか凝集物により反応セルが汚染されて同時に測定している他の生化学項目の測定結果に少なからず影響を与えている。普及しているほとんどの自動分析装置は、１０分で反応を完了する場合が多い。更に、既知の方法である２ポイントエンド法、レート法、フィックスタイム法などが選択できるようになっているので、濁ったままの状態でも測定は可能である。
【００１１】
しかし、この濁ったままの状態での測定は、反応中に濁度変化があっては測定値に誤差が生じ、正確性が問題となる。その他、反応液が濁ると再現性が低下する。それ故、測定する試料に制限が加わり、幅広い測定波長と多種多様な患者検体に対応することが出来ない。例えば、３４０ｎｍ付近（ＵＶ領域）では凝集物による濁りの現象で吸光度が２〜３以上となり分析機の許容範囲をしばしば越えてしまう欠点がある。二価カチオンを用いることのない特開平９−９６６３７号公報（平８／７／１９）の技術は、リポ蛋白と凝集する抗血清を含ませる方法であるが、これも難溶性の抗原抗体凝集物を形成するので、反応セルが汚染される。従って、同時に測定している他の生化学項目の測定結果に少なからず影響を与える。また、反応液中の濁りが強度となるので、特にＵＶ領域によるＨＤＬ中のコレステロール測定に対しても前述と同じ原因で正確な測定が不可能である。
【００１２】
これらの技術は、複合体や凝集体を形成することで、酵素反応を阻害する共通の技術と測光法を工夫することで成り立っているものであり、濁り本来が持つ測定への悪影響は、完全には解消されていない。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、汎用の自動分析装置を用いて、遠心操作による分離をせずに、また、反応液中に複合体や凝集体による濁りを形成することなく、生体試料中、特に血清中のＨＤＬ亜画分（ＨＤＬ２及びＨＤＬ３）中の成分を定量する方法、詳しくはＨＤＬ亜画分中のコレステロール（ＨＤＬ２−Ｃ及びＨＤＬ３−Ｃ）を測定する方法を提供することである。
【００１４】
【課題を解決する手段】
本発明者らは、ＨＤＬに優先的に直接作用するコレステロールエステル加水分解酵素であるリポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）又はコレステロールエステラーゼ（ＣＥ）を、ＨＬＢ値が１７以上の非イオン性界面活性剤の存在下で反応させ、分光光度計による測定において誤差の原因となる複合体又は凝集体を形成することなく、ＨＤＬ３−コレステロール（ＨＤＬ３−Ｃ）を測定する方法を見出し、本発明を完成した。
【００１５】
すなわち、本発明は以下からなる。
１．リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）及びコレステロールエステラーゼ（ＣＥ）から選択されるコレステロールエステル加水分解酵素、ＨＬＢ値が１７以上２０以下である異なる２種類の非イオン性界面活性剤、ヒドラジン塩、及びカリクスアレンを用いてＨＤＬ３画分からコレステロールを遊離させ、遊離されたコレステロールをコレステロール脱水素酵素又はコレステロール酸化酵素による酵素反応で測定することを特徴とするＨＤＬ３‐コレステロールの測定法。
２．異なる２種類の非イオン性界面活性剤、ヒドラジン塩、及びカリクスアレンを含む試薬と血清試料を混合した後に、コレステロールエステル加水分解酵素を含む試薬を添加することによりＨＤＬ３画分からコレステロールを遊離させる前項１に記載のＨＤＬ３‐コレステロールの測定法。
３．ＨＤＬ３画分からコレステロールを遊離させるための酵素反応と該遊離されたコレステロールを測定するための酵素反応をｐＨ６〜９の範囲で行うことを特徴とする前項１または２に記載のＨＤＬ３‐コレステロールの測定法。
４．遊離されたコレステロールを測定するための酵素反応がコレステロール脱水素酵素及び酸化型補酵素による反応であり、該反応の生成物である還元型補酵素を分光学的に検出する前項１〜３のいずれか１項に記載のＨＤＬ３‐コレステロールの測定法。
５．遊離されたコレステロールを測定するための酵素反応がコレステロール酸化酵素による反応であり、該反応の生成物である過酸化水素をペルオキシダーゼを用いて測定する前項１〜３のいずれか１項に記載のＨＤＬ３‐コレステロールの測定法。
６．前項１〜４のいずれか１項に記載の測定法によりＨＤＬ３‐コレステロール量を測定し、総ＨＤＬ−コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）量からＨＤＬ３‐コレステロール（ＨＤＬ３‐Ｃ）量を減算することによって求めることを特徴とするＨＤＬ２‐コレステロールの測定法。
【００１６】
【発明の実施の態様】
本発明のＨＤＬ亜画分中の成分の測定法は、ＨＤＬ画分中の総ＨＤＬ−Ｃの測定に使用する方法を基本にしており、以下に示す手段を導入することでＨＤＬ亜画分中の成分、特にコレステロールの測定を可能とするものである。ＨＤＬ画分中の成分、特にコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）の測定は、ＨＤＬ画分に酵素を作用させ加水分解してＨＤＬが包含する成分を遊離させる。その後遊離された成分を、その成分の測定に適合する方法を用いて測定する。測定しようとする成分がコレステロールである場合、コレステロール脱水素酵素（ＣＤＨ）やコレステロール酸化酵素（ＣＯＤ）を作用させて遊離されたコレステロールを測定する。
【００１７】
ＨＤＬ亜画分中の成分、特にコレステロールを測定する手段の１つは、ＨＤＬに優先的に反応する酵素を選択することである。リポ蛋白に作用し加水分解してリポ蛋白の包含する成分を遊離させる酵素としてはＬＰＬ又はＣＥ等のコレステロールエステル加水分解酵素がある。その中で例えばChromobacterium viscosum由来のＬＰＬ又はＣＥが他のリポ蛋白と比較してＨＤＬに優先的に反応するので好ましく用いられる。また、その他の測定成分との適合性を考慮して、Pseudomonas属由来の酵素も適宜選択できる。酵素の安定化などのために修飾を行った酵素であっても、ＨＤＬに優先的に反応する酵素であり本発明の目的を達成しうるものであれば使用できるので、修飾の有無は特に限定しない。
【００１８】
ＨＤＬ亜画分中の成分、特にコレステロールを測定する手段の別の１つは、ｐＨの選択であり、ＨＤＬ亜画分中の成分を遊離させる酵素反応及び該遊離された成分の測定のための反応をｐＨ６〜９で測定することが好ましい。ｐＨが６以下であるとリポ蛋白そのものが凝集体に関係なく、等電点効果で白濁してしまう。リポ蛋白が比較的安定なｐＨ７付近を選択して測定条件を整えれば良いが、ＬＰＬ又はＣＥはｐＨ８．０〜９．０で非常に強くＨＤＬに反応する。
【００１９】
更に、ＣＯＤ、ＣＤＨ、ＬＰＬ及びＣＥなどの酵素が反応できるｐＨも考慮する。好適には、ＣＤＨ、ＬＰＬ及びＣＥの反応は、ｐＨ７〜９が好ましく、ＣＯＤを用いるときはｐＨ６〜８が好ましい。
【００２０】
ｐＨの調整は、緩衝液で行う。緩衝液は、通常生化学反応に用いられる各種緩衝液が利用でき、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＴＡＰＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、ＢＥＳ−ＢｉｓＴｒｉｓ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＡＤＡ緩衝液、ＡＣＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳＯ緩衝液、ＢＥＳ緩衝液、ＴＥＳ緩衝液、ＤＩＰＳＯ緩衝液、ＴＡＰＳＯ緩衝液、ＰＯＰＳＯ緩衝液、ＨＥＰＰＳ緩衝液、ＨＥＰＰＳＯ緩衝液、Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液、燐酸緩衝液等が挙げられる。
【００２１】
ＨＤＬ亜画分であるＨＤＬ３中の成分、特にコレステロール（ＨＤＬ３−Ｃ）を測定する手段は、ＨＬＢ値が１７以上、好ましくは１９以上、特に好ましくは２０以上の非イオン性界面活性剤を使用することである。その効果は、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ、及びＨＤＬ２等のＨＤＬ３以外のリポ蛋白に対するＬＰＬ及びＣＥの反応性を阻害するものである。従って、ＨＤＬ３中の成分、特にＨＤＬ３−Ｃを測定できる。また、ＨＬＢ値が高い非イオン性界面活性剤ほど、少ない添加量で選択的にＨＤＬ３中の成分の測定ができる。実際に使用できる界面活性剤を以下に例示するが、これらに限定されず、ＨＤＬ３以外のリポ蛋白に対するＬＰＬ及びＣＥの反応性を阻害するものであればよい。
【００２２】
本法に用いる界面活性剤は、セチルエーテル（Ｃ１６）（ヘキサデシルエーテル）（商品名：日光ケミカル（株）：ＢＣ−２５ＴＸ、ＢＣ−３０ＴＸ、ＢＣ−４０ＴＸ）、ラウリルエーテル（Ｃ１２）（ドデシルエーテル）（商品名：日光ケミカル（株）：ＢＬ−２１、ＢＬ−２５）、オレイルエーテル（商品名：日光ケミカル（株）：ＢＯ−５０）、ベヘニルエーテル（Ｃ２２）（商品名：日光ケミカル（株）：ＢＢ−３０）、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（商品名：日本油脂（株）：ノニオンＫ−２３０）、ポリオキシエチレンモノラウレート（商品名：日本油脂（株）：ノニオンＳ−４０）、ポリオキシエチレンエーテル類（商品名：シグマ：Ｂｒｉｊ９８、Ｂｒｉｊ７２１、Ｂｒｉｊ７８、Ｂｒｉｊ９９）等が挙げられる。好適には、ＨＬＢ値が２０付近のポリオキシエチレンエーテル類が選ばれる。これらの界面活性剤は単独で使用してもよいし、適宜２種以上を組み合わせて用いてもよい。添加量は、測定するリポ蛋白量及び使用する界面活性剤のＨＬＢ値により変化するが、簡単な実験的繰り返しにより、最適な添加量を決定できる。例えば、ＨＬＢ値１７付近の界面活性剤を使用する場合、ＬＤＬ及びＶＬＤＬに対するＬＰＬ及びＣＥの反応性は阻害されるが、添加量によってはＨＤＬ３に加えてＨＤＬ２も測定されることがあるので、このような場合、より高いＨＬＢ値の界面活性剤を使用する場合と比べ、添加量を多くすることが好ましい。具体的には、０．００１ｗ／ｖ％〜１０ｗ／ｖ％の範囲で、好適には１ｗ／ｖ％〜５ｗ／ｖ％の範囲で用いる。
【００２３】
ＨＤＬ亜画分であるＨＤＬ２中の成分量は、ＨＤＬ中の成分量からＨＤＬ３中の成分量を減算することによって求められる。測定しようとするＨＤＬ２中の成分がコレステロールである場合、総ＨＤＬ−Ｃ量からＨＤＬ３−Ｃ量を減算すればＨＤＬ２−Ｃ量が得られる。
【００２４】
本発明においては、上記３つの手段、ｐＨの選択、酵素の選択、界面活性剤の選択、を単独で又は適宜選択し組合せて導入する。より好適にはこれら全ての手段を同時に導入するが、必ずしも全てを同時に導入する必要は無い。
【００２５】
また、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びカイロミクロン中の遊離型コレステロールが、ＨＤＬ−Ｃ測定時の反応に関与して、しばしば誤差の原因となることがあるが、予めＣＯＤやＣＤＨでこれらの遊離型コレステロールを反応させヒドラジン存在下でコレステノンヒドラゾンに変換しておき、ＨＤＬ−Ｃの測定時に非基質化する方法もある。非基質化する技術は公知の特開平５−１７６７９７号公報（平３／１２／２７）を参考にすればよい。
【００２６】
一方、ＣＥ又はＬＰＬのＬＤＬに対する反応性を抑えるために、カリクスアレン類を用いることもできる。カリクスアレン類にはカリクス［４］アレン、カリクス［６］アレン、カリクス［８］アレン、硫酸カリクス［４］アレン、硫酸カリクス［６］アレン、硫酸カリクス［８］アレン、酢酸カリクス［４］アレン、酢酸カリクス［６］アレン、酢酸カリクス［８］アレン、カルボキシカリクス［４］アレン、カルボキシカリクス［６］アレン、カルボキシカリクス［８］アレン、カリクス［４］アレンアミン、カリクス［６］アレンアミン、カリクス［８］アレンアミンが挙げられる。この中から１種又は２種以上を適宜選択して用いる。使用濃度は簡単な実験的繰り返しにより決めることができる。
【００２７】
測定しようとするＨＤＬ亜画分中の成分がコレステロールである場合、コレステロールを測定する基本反応は、総コレステロールを測定する方法であり、目的とする画分に合わせて成分を適宜調製すればよい。
【００２８】
例えばコレステロールの測定は、コレステロールとコレステロール脱水素酵素（ＣＤＨ）の反応を酸化型補酵素存在下に行い、反応の結果還元された補酵素を光学的に測定することによって行う。ＣＤＨを用いる際の補酵素としては、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（ＮＡＤ）、Ｔｈｉｏ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（ｔ−ＮＡＤ）、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型（ＮＡＤＰ）、Ｔｈｉｏ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型（ｔ−ＮＡＤＰ）等が挙げられる。
【００２９】
また、コレステロール測定にはコレステロール酸化酵素（ＣＯＤ）も使用できるが、この場合は、ペルオキシダーゼと公知の過酸化水素定量法を組み合せて測定を行う。
【００３０】
更に、コレステロール測定に必要となるコール酸等の活性化剤や安定化剤などは既存の技術に従ってその条件を適宜選択し、簡単な実験的繰り返しにより使用濃度を調整すればよい。
【００３１】
本発明はまた、上記本発明のＨＤＬ亜画分中の成分の測定法を実行するために必要な試薬を備えた試薬キットを提供する。本発明の試薬キットは、少なくともＨＬＢ値が１７以上の非イオン性界面活性剤を含んでなるＨＤＬ亜画分中の成分の測定に使用する試薬キットである。
【００３２】
【実施例】
以下、ＨＤＬ３中のコレステロールの測定例について具体的に示す。
【実施例１】
以下の試薬Ａ及びＢを調製した。検体は、ボランティアによるヒト血清２２例を用いた。測定は、日立７１７０型自動分析装置で実施した。先ず検体４μＬに試薬Ａ １８０μＬを加え３７℃で５分間恒温し、この時点で主波長３４０ｎｍ及び副波長５７０ｎｍで吸光度１を測定した。更に、試薬Ｂ ６０μＬを加え３７℃で５分間恒温し、この時点で主波長３４０ｎｍ及び副波長５７０ｎｍで吸光度２を測定した。吸光度１と吸光度２の差を求めて既知ＨＤＬ３−Ｃ濃度のコントロールを標準液として検体の値を換算した。
【００３３】
対照法としてポリエチレングリコールを用いたKurt Widhalmらの方法を用いて測定を行った。この方法を用いて遠心分画した上清のコレステロール濃度は、国際試薬株式会社製Ｔ−ＣＨＯ試薬・Ｌ「コクサイ」を用いて求めた。また、自動分析装置を用いるホモジニアスＨＤＬ−Ｃの測定は、国際試薬株式会社製ＨＤＬ−Ｃ試薬・ＫＬ「コクサイ」を用いて行った。対照法のＨＤＬ２−Ｃ値は、用手法によるＨＤＬ−Ｃから用手法によるＨＤＬ３−Ｃ値を差し引いて求めた。自動分析法のＨＤＬ２−Ｃ値は、ホモジニアスＨＤＬ−Ｃ値から試薬Ａ及びＢを用いて求めたＨＤＬ３−Ｃ値を差し引いて求めた。
【００３４】
図１に超遠心操作［Havel RJ, Eder HA, Bragdon JH : The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteinsin human serum., J. Clin. Invest., 34, 1345〜1353（1955）］で得られたＶＬＤＬ、ＬＤＬ、（ＬＤＬ＋ＨＤＬ２）、ＨＤＬ３及びＨＤＬを測定したときの３４０ｎｍにおける反応タイムコースを示した。
【００３５】
図１に示したように、本法はＶＬＤＬ、ＬＤＬ、（ＬＤＬ＋ＨＤＬ２）画分にはほとんど反応せず、ＨＤＬ３及びＨＤＬのみ反応していることが分かる。各画分中の総コレステロール濃度は、ＶＬＤＬ＝９９．９ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬ＝１９９．９ｍｇ／ｄＬ、（ＬＤＬ＋ＨＤＬ２）＝１７５．２＋３１．７ｍｇ／ｄＬ、ＨＤＬ３＝２８．５ｍｇ／ｄＬ及びＨＤＬ＝８４．２ｍｇ／ｄＬであった。
【００３６】
本法による測定結果は、ＶＬＤＬ＝０．７ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬ＝２．９ｍｇ／ｄＬ、（ＬＤＬ＋ＨＤＬ２）＝４．０ｍｇ／ｄＬ、ＨＤＬ３＝２８．０ｍｇ／ｄＬ及びＨＤＬ＝６３．２ｍｇ／ｄＬであった。この結果からもＨＤＬ３に高い特異性を有することが分かる。
【００３７】
また、ヒト血清２２例を用いた測定結果を表１に示した。本法のＨＤＬ３−Ｃ値は、対照法との相関係数が、０．９５７（ｐ＜０．０５）となり、よく一致した結果となった。また、本法のＨＤＬ２−Ｃ値は、対照法との相関係数が、０．９３９（ｐ＜０．０５）となった。
【００３８】
試薬Ａ
ＨＥＰＥＳ緩衝液 （ｐＨ７．０） １０ ｍｍｏｌ／Ｌ
二塩化ヒドラジニウム １００ ｍｍｏｌ／Ｌ
β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型 ６．０ ｍｍｏｌ／Ｌ
コール酸ナトリウム（活性化剤） ０．０６ ％
ノニオンＫ−２３０（ＨＬＢ値１７．３） ０．３ ｗ／ｖ％
ＢＣ−４０ＴＸ（ＨＬＢ値２０） １．０ ｗ／ｖ％
硫酸カリクス［８］アレン ２．０ ｍｍｏｌ／Ｌ
【００３９】
試薬Ｂ
ＴＡＰＳ緩衝液 （ｐＨ８．５） ５００ ｍｍｏｌ／Ｌ
コレステロール脱水素酵素 ２０ Ｕ／ｍＬ
ＬＰＬ ６ Ｕ／ｍＬ
（Chromobacterium viscosum由来）
コール酸ナトリウム（活性化剤） ０．１ ％
【００４０】
【表１】
【実施例２】
以下の試薬Ｃ及びＤを調製した。検体は、ボランティアによるヒト血清２２例を用いた。測定は、日立７１７０型自動分析装置で実施した。操作法は、先ず検体 ４μＬに試薬Ｃ １８０μＬを加え３７℃で５分間恒温し、この時点で主波長３４０ｎｍ及び副波長５７０ｎｍで吸光度１を測定した。更に、試薬Ｄ ６０μＬを加え３７℃で５分間恒温し、この時点で主波長３４０ｎｍ及び副波長５７０ｎｍで吸光度２を測定した。吸光度１と吸光度２の差を求めて既知ＨＤＬ３−コレステロール濃度のコントロールを標準液として検体の値を換算した。対照法は、実施例１同様の操作を行った。自動分析法のＨＤＬ２−Ｃ値は、ホモジニアスＨＤＬ−Ｃ値から試薬Ｃ及びＤを用いて求めたＨＤ３−Ｃ値を差し引いて求めた。
【００４２】
図２に超遠心操作で得られたＶＬＤＬ、ＬＤＬ、（ＬＤＬ＋ＨＤＬ２）、ＨＤＬ３及びＨＤＬを測定したときの３４０ｎｍにおける反応タイムコースを示した。この図から、本法はＶＬＤＬ、ＬＤＬ、（ＬＤＬ＋ＨＤＬ２）画分にはほとんど反応せず、ＨＤＬ３及びＨＤＬのみ反応していることが分かる。
【００４３】
各画分中の総コレステロール濃度は、ＶＬＤＬ＝９９．９ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬ＝１９９．９ｍｇ／ｄＬ、（ＬＤＬ＋ＨＤＬ２）＝１７５．２＋３１．７ｍｇ／ｄＬ、ＨＤＬ３＝２８．５ｍｇ／ｄＬ及びＨＤＬ＝８４．２ｍｇ／ｄＬであった。
【００４４】
本法による測定結果は、ＶＬＤＬ＝０．２ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬ＝３．５ｍｇ／ｄＬ、（ＬＤＬ＋ＨＤＬ２）＝０．２ｍｇ／ｄＬ、ＨＤＬ３＝２７．８ｍｇ／ｄＬ及びＨＤＬ＝５９．２ｍｇ／ｄＬであった。この結果からもＨＤＬ３に高い特異性を有することが分かる。
【００４５】
また、ヒト血清２２例を用いた測定結果を表２に示した。本法のＨＤＬ３−Ｃ値は、対照法との相関係数が、０．９５２（ｐ＜０．０５）となり、よく一致した結果となった。また、本法のＨＤＬ２−Ｃ値は、対照法との相関係数が、０．９４２（ｐ＜０．０５）となった。
【００４６】
試薬Ｃ
ＨＥＰＥＳ緩衝液 （ｐＨ７．０） １０ ｍｍｏｌ／Ｌ
二塩化ヒドラジニウム １００ ｍｍｏｌ／Ｌ
β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型 ６．０ ｍｍｏｌ／Ｌ
コール酸ナトリウム（活性化剤） ０．０６ ％
ノニオンＫ−２３０（ＨＬＢ値１７．３） ０．３ ｗ／ｖ％
Ｂｒｉｊ９８（ＨＬＢ値１９） １．６ ｗ／ｖ％
硫酸カリクス［８］アレン ２．０ ｍｍｏｌ／Ｌ
【００４７】
試薬Ｄ
ＴＡＰＳ緩衝液 （ｐＨ８．５） ５００ ｍｍｏｌ／Ｌ
コレステロール脱水素酵素 ２０ Ｕ／ｍＬ
ＬＰＬ ６ Ｕ／ｍＬ
（Chromobacterium viscosum由来）
コール酸ナトリウム（活性化剤） ０．１ ％
【００４８】
【表２】
【発明の効果】
本発明の高密度リポ蛋白亜画分（ＨＤＬ２及びＨＤＬ３）中の成分、特にコレステロールを測定する方法は、ＨＬＢ値が１７以上の非イオン性界面活性剤の存在下でＨＤＬ３中の成分、特にコレステロール（ＨＤＬ３−Ｃ）に選択的に酵素を作用をさせて、ＨＤＬ３−Ｃ量を測定し、総ＨＤＬ−ＣからＨＤＬ３−Ｃ量を減算してＨＤＬ２−Ｃ量を求めることにより、極めて容易にＨＤＬ亜画分のＨＤＬ−Ｃを測定する方法である。本発明は、汎用の自動分析装置を用いて、遠心操作による分離をせずに、また、反応液中に複合体や凝集体による濁りを形成することなく、生体試料中、特に血清中のＨＤＬ亜画分中の成分を定量することができるため、高脂血症等のリポ蛋白に関連する疾病の臨床検査や研究等に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 超遠心操作で得た各リポ蛋白画分の反応タイムコースを示す。測光ポイントは１７ポイントで５分、３４ポイントで１０分を表す。
【図２】 超遠心操作で得た各リポ蛋白画分の反応タイムコースを示す。測光ポイントは１７ポイントで５分、３４ポイントで１０分を表す。
Claims (6)
- リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）及びコレステロールエステラーゼ（ＣＥ）から選択されるコレステロールエステル加水分解酵素、ＨＬＢ値が１７以上２０以下である異なる２種類の非イオン性界面活性剤、ヒドラジン塩、及びカリクスアレンを用いてＨＤＬ３画分からコレステロールを遊離させ、遊離されたコレステロールをコレステロール脱水素酵素又はコレステロール酸化酵素による酵素反応で測定することを特徴とするＨＤＬ３‐コレステロールの測定法。
- 異なる２種類の非イオン性界面活性剤、ヒドラジン塩、及びカリクスアレンを含む試薬と血清試料を混合した後に、コレステロールエステル加水分解酵素を含む試薬を添加することによりＨＤＬ３画分からコレステロールを遊離させる請求項１に記載のＨＤＬ３‐コレステロールの測定法。
- ＨＤＬ３画分からコレステロールを遊離させるための酵素反応と該遊離されたコレステロールを測定するための酵素反応をｐＨ６〜９の範囲で行うことを特徴とする請求項１または２に記載のＨＤＬ３‐コレステロールの測定法。
- 遊離されたコレステロールを測定するための酵素反応がコレステロール脱水素酵素及び酸化型補酵素による反応であり、該反応の生成物である還元型補酵素を分光学的に検出する請求項１〜３のいずれか１項に記載のＨＤＬ３‐コレステロールの測定法。
- 遊離されたコレステロールを測定するための酵素反応がコレステロール酸化酵素による反応であり、該反応の生成物である過酸化水素をペルオキシダーゼを用いて測定する請求項１〜３のいずれか１項に記載のＨＤＬ３‐コレステロールの測定法。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載の測定法によりＨＤＬ３‐コレステロール量を測定し、総ＨＤＬ−コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）量からＨＤＬ３‐コレステロール（ＨＤＬ３‐Ｃ）量を減算することによって求めることを特徴とするＨＤＬ２‐コレステロールの測定法。
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