JP5111389B2 - 小粒子低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法 - Google Patents
小粒子低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5111389B2 JP5111389B2 JP2008540946A JP2008540946A JP5111389B2 JP 5111389 B2 JP5111389 B2 JP 5111389B2 JP 2008540946 A JP2008540946 A JP 2008540946A JP 2008540946 A JP2008540946 A JP 2008540946A JP 5111389 B2 JP5111389 B2 JP 5111389B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cholesterol
- polyoxyethylene
- surfactant
- sdldl
- reagent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 title claims abstract description 216
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 title claims abstract description 108
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 61
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 title claims description 25
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 title claims description 25
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims description 17
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 192
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims abstract description 177
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 174
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 claims abstract description 120
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 117
- 102000000019 Sterol Esterase Human genes 0.000 claims abstract description 109
- 108010055297 Sterol Esterase Proteins 0.000 claims abstract description 109
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims abstract description 35
- 108010023302 HDL Cholesterol Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 claims description 171
- -1 polyoxyethylene Polymers 0.000 claims description 151
- 108010089254 Cholesterol oxidase Proteins 0.000 claims description 66
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 44
- 108010023417 cholesterol dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 44
- 108010085346 steroid delta-isomerase Proteins 0.000 claims description 44
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 43
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 claims description 40
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 claims description 40
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 35
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 35
- 125000003367 polycyclic group Chemical group 0.000 claims description 33
- 125000005037 alkyl phenyl group Chemical group 0.000 claims description 28
- 150000005215 alkyl ethers Chemical class 0.000 claims description 25
- USIUVYZYUHIAEV-UHFFFAOYSA-N diphenyl ether Chemical compound C=1C=CC=CC=1OC1=CC=CC=C1 USIUVYZYUHIAEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 229920002503 polyoxyethylene-polyoxypropylene Polymers 0.000 claims description 23
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 22
- 108010010234 HDL Lipoproteins Proteins 0.000 claims description 21
- 102000015779 HDL Lipoproteins Human genes 0.000 claims description 21
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 claims description 21
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 18
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 18
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 18
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 18
- 108010062497 VLDL Lipoproteins Proteins 0.000 claims description 17
- 150000003973 alkyl amines Chemical class 0.000 claims description 16
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 14
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 14
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 13
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 12
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 10
- 108010004103 Chylomicrons Proteins 0.000 claims description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 8
- FURYAADUZGZUGQ-UHFFFAOYSA-N phenoxybenzene;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.C=1C=CC=CC=1OC1=CC=CC=C1 FURYAADUZGZUGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 claims description 7
- XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N Taurine Natural products NCCS(O)(=O)=O XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229960003080 taurine Drugs 0.000 claims description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- HWMGJMKHOJKGLQ-VPHNIEJBSA-N oxidized coenzyme a Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@@](O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 HWMGJMKHOJKGLQ-VPHNIEJBSA-N 0.000 claims description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 32
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 32
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 abstract description 22
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 abstract description 9
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 39
- 238000005691 oxidative coupling reaction Methods 0.000 description 32
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 32
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 24
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 23
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 21
- RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 4-aminoantipyrine Chemical compound CN1C(C)=C(N)C(=O)N1C1=CC=CC=C1 RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 19
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 18
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 18
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 14
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 14
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 13
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 13
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 12
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 12
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 12
- 125000001421 myristyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 12
- 125000000913 palmityl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 12
- 125000004079 stearyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 12
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N Aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 125000003438 dodecyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 10
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 10
- 229940123748 Catalase inhibitor Drugs 0.000 description 9
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 9
- 125000002511 behenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 8
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 8
- 239000003245 coal Substances 0.000 description 8
- 101150117702 lpl3 gene Proteins 0.000 description 8
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 8
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 8
- 241001662443 Phemeranthus parviflorus Species 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 7
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 7
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 7
- PYHRZPFZZDCOPH-QXGOIDDHSA-N (S)-amphetamine sulfate Chemical compound [H+].[H+].[O-]S([O-])(=O)=O.C[C@H](N)CC1=CC=CC=C1.C[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 PYHRZPFZZDCOPH-QXGOIDDHSA-N 0.000 description 6
- 108010013563 Lipoprotein Lipase Proteins 0.000 description 6
- 102000043296 Lipoprotein lipases Human genes 0.000 description 6
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 125000001204 arachidyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 6
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 6
- 125000002704 decyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 6
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 6
- 125000003187 heptyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 6
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 6
- 125000002960 margaryl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 6
- 125000001196 nonadecyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 6
- 125000001400 nonyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 6
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 6
- 125000002958 pentadecyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 6
- 125000001147 pentyl group Chemical group C(CCCC)* 0.000 description 6
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 6
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 6
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 6
- 125000002889 tridecyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 6
- 125000002948 undecyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 6
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 5
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 4
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 4
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 4
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710171243 Peroxidase 10 Proteins 0.000 description 4
- 101710171264 Peroxidase 20 Proteins 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100040423 Transcobalamin-2 Human genes 0.000 description 4
- 101710124862 Transcobalamin-2 Proteins 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 125000003901 ceryl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 125000000755 henicosyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- 125000002818 heptacosyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- 125000002463 lignoceryl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 4
- 125000002460 pentacosyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- 238000005502 peroxidation Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 229940071089 sarcosinate Drugs 0.000 description 4
- 125000002469 tricosyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 150000008065 acid anhydrides Chemical class 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 3
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 125000002819 montanyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 3
- 125000002465 nonacosyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- CXONXVMMINSQBV-NNYOXOHSSA-N (2r,3r,4s,5r)-5-[[[[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-hydroxyphosphoryl]oxymethyl]-2-(3-carbamothioylpyridin-1-ium-1-yl)-4-hydroxyoxolan-3-olate Chemical compound NC(=S)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)[O-])=C1 CXONXVMMINSQBV-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- QZTKDVCDBIDYMD-UHFFFAOYSA-N 2,2'-[(2-amino-2-oxoethyl)imino]diacetic acid Chemical compound NC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O QZTKDVCDBIDYMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-n-[3-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-(dimethylamino)phenyl]-1-n,1-n-dimethylbenzene-1,4-diamine Chemical compound C1=C(C(C=2C=CC(Cl)=CC=2)C=2C=CC(Cl)=CC=2)C(N(C)C)=CC=C1NC(C=1)=CC=C(N(C)C)C=1C(C=1C=CC(Cl)=CC=1)C1=CC=C(Cl)C=C1 BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LVQFQZZGTZFUNF-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3-[4-(2-hydroxy-3-sulfonatopropyl)piperazine-1,4-diium-1-yl]propane-1-sulfonate Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CN1CCN(CC(O)CS(O)(=O)=O)CC1 LVQFQZZGTZFUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NUFBIAUZAMHTSP-UHFFFAOYSA-N 3-(n-morpholino)-2-hydroxypropanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CN1CCOCC1 NUFBIAUZAMHTSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RZQXOGQSPBYUKH-UHFFFAOYSA-N 3-[[1,3-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)propan-2-yl]azaniumyl]-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound OCC(CO)(CO)NCC(O)CS(O)(=O)=O RZQXOGQSPBYUKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XCBLFURAFHFFJF-UHFFFAOYSA-N 3-[bis(2-hydroxyethyl)azaniumyl]-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)CS(O)(=O)=O XCBLFURAFHFFJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WKALLSVICJPZTM-UHFFFAOYSA-N 3-[decyl(dimethyl)azaniumyl]propane-1-sulfonate Chemical compound CCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O WKALLSVICJPZTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GIAVHGFPMPSIFI-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-2,4,6-triiodobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=C(I)C=C(I)C(O)=C1I GIAVHGFPMPSIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- OWXMKDGYPWMGEB-UHFFFAOYSA-N HEPPS Chemical compound OCCN1CCN(CCCS(O)(=O)=O)CC1 OWXMKDGYPWMGEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000620894 Homo sapiens Lysophosphatidic acid phosphatase type 6 Proteins 0.000 description 2
- 101001135804 Homo sapiens Protein tyrosine phosphatase receptor type C-associated protein Proteins 0.000 description 2
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 108010046315 IDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBXNUXBLKRLWFA-UHFFFAOYSA-N N-(2-acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound NC(=O)CNCCS(O)(=O)=O DBXNUXBLKRLWFA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical group ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YNLCVAQJIKOXER-UHFFFAOYSA-N N-[tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCCS(O)(=O)=O YNLCVAQJIKOXER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCNC1CCCCC1 MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010007843 NADH oxidase Proteins 0.000 description 2
- 241000047703 Nonion Species 0.000 description 2
- 102100036937 Protein tyrosine phosphatase receptor type C-associated protein Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 150000001840 cholesterol esters Chemical class 0.000 description 2
- 150000001841 cholesterols Chemical class 0.000 description 2
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical group 0.000 description 2
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000040 m-tolyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C([H])C(=C1[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- DVEKCXOJTLDBFE-UHFFFAOYSA-N n-dodecyl-n,n-dimethylglycinate Chemical compound CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC([O-])=O DVEKCXOJTLDBFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002924 oxiranes Chemical group 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FSSPGSAQUIYDCN-UHFFFAOYSA-N 1,3-Propane sultone Chemical compound O=S1(=O)CCCO1 FSSPGSAQUIYDCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPGZNKGKCSYBGK-UHFFFAOYSA-N 1-n-[4-(dimethylamino)phenyl]-4-n,4-n-dimethylbenzene-1,4-diamine Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1NC1=CC=C(N(C)C)C=C1 ZPGZNKGKCSYBGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001917 2,4-dinitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C(=C1*)[N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- HYSZWUPCSXTPSX-UHFFFAOYSA-N 2-(4-ethylpiperazin-1-yl)ethanol Chemical class CCN1CCN(CCO)CC1 HYSZWUPCSXTPSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUJZNKFIBZHDKL-UHFFFAOYSA-N 2-[[3,7-bis(dimethylamino)phenothiazine-10-carbonyl]amino]acetic acid Chemical compound C1=C(N(C)C)C=C2SC3=CC(N(C)C)=CC=C3N(C(=O)NCC(O)=O)C2=C1 XUJZNKFIBZHDKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AJTVSSFTXWNIRG-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(2-hydroxyethyl)amino]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+](CCO)CCS([O-])(=O)=O AJTVSSFTXWNIRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RAZLJUXJEOEYAM-UHFFFAOYSA-N 2-[bis[2-(2,6-dioxomorpholin-4-yl)ethyl]azaniumyl]acetate Chemical compound C1C(=O)OC(=O)CN1CCN(CC(=O)O)CCN1CC(=O)OC(=O)C1 RAZLJUXJEOEYAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- XEZFKMUDMLXWAW-UHFFFAOYSA-N 3,7-bis(dimethylamino)-n-methylphenothiazine-10-carboxamide Chemical compound CN(C)C1=CC=C2N(C(=O)NC)C3=CC=C(N(C)C)C=C3SC2=C1 XEZFKMUDMLXWAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AOTXQRRUWFSXCN-UHFFFAOYSA-N 3-(3,5-dimethoxyanilino)-2-hydroxypropane-1-sulfonic acid Chemical compound COC1=CC(NCC(O)CS(O)(=O)=O)=CC(OC)=C1 AOTXQRRUWFSXCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MENXRDLDYNLDHE-UHFFFAOYSA-N 3-(3,5-dimethoxyanilino)propane-1-sulfonic acid Chemical compound COC1=CC(NCCCS(O)(=O)=O)=CC(OC)=C1 MENXRDLDYNLDHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- INEWUCPYEUEQTN-UHFFFAOYSA-N 3-(cyclohexylamino)-2-hydroxy-1-propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CNC1CCCCC1 INEWUCPYEUEQTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTIDJAQNJLWPTI-UHFFFAOYSA-N 3-(n-ethyl-3,5-dimethoxyanilino)-2-hydroxypropane-1-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CN(CC)C1=CC(OC)=CC(OC)=C1 BTIDJAQNJLWPTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NZAVBNVWEPQSBL-UHFFFAOYSA-N 3-(n-ethyl-3,5-dimethoxyanilino)propane-1-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN(CC)C1=CC(OC)=CC(OC)=C1 NZAVBNVWEPQSBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NPROGRQJOGOVDS-UHFFFAOYSA-N 3-(n-ethyl-3,5-dimethylanilino)propane-1-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN(CC)C1=CC(C)=CC(C)=C1 NPROGRQJOGOVDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLQNJZKBJSMXCJ-UHFFFAOYSA-N 3-(n-ethyl-3-methoxyanilino)-2-hydroxypropane-1-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CN(CC)C1=CC=CC(OC)=C1 ZLQNJZKBJSMXCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- STBWJPWQQLXSCK-UHFFFAOYSA-N 3-(n-ethyl-3-methoxyanilino)propane-1-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN(CC)C1=CC=CC(OC)=C1 STBWJPWQQLXSCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IBSUMVZKDLDAEK-UHFFFAOYSA-N 3-(n-ethyl-3-methylanilino)propane-1-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN(CC)C1=CC=CC(C)=C1 IBSUMVZKDLDAEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DHOHNBDXAQUXGS-UHFFFAOYSA-N 3-(n-ethyl-4-fluoro-3,5-dimethoxyanilino)-2-hydroxypropane-1-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CN(CC)C1=CC(OC)=C(F)C(OC)=C1 DHOHNBDXAQUXGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HXITYOAFXWBMLL-UHFFFAOYSA-N 3-(n-ethylanilino)propane-1-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN(CC)C1=CC=CC=C1 HXITYOAFXWBMLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NYLUYMWPXIIXDX-UHFFFAOYSA-N 3-(phenylazaniumyl)propane-1-sulfonate Chemical compound OS(=O)(=O)CCCNC1=CC=CC=C1 NYLUYMWPXIIXDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KYYHRMMRLHFQEU-UHFFFAOYSA-N 3-[3,5-dimethoxy-n-(3-sulfopropyl)anilino]propane-1-sulfonic acid Chemical compound COC1=CC(OC)=CC(N(CCCS(O)(=O)=O)CCCS(O)(=O)=O)=C1 KYYHRMMRLHFQEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HUDPLKWXRLNSPC-UHFFFAOYSA-N 4-aminophthalhydrazide Chemical compound O=C1NNC(=O)C=2C1=CC(N)=CC=2 HUDPLKWXRLNSPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WXNZTHHGJRFXKQ-UHFFFAOYSA-N 4-chlorophenol Chemical compound OC1=CC=C(Cl)C=C1 WXNZTHHGJRFXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006306 4-iodophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C([H])C([H])=C1I 0.000 description 1
- 239000007991 ACES buffer Substances 0.000 description 1
- KLSJWNVTNUYHDU-UHFFFAOYSA-N Amitrole Chemical compound NC1=NC=NN1 KLSJWNVTNUYHDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005666 Apolipoprotein A-I Human genes 0.000 description 1
- 108010059886 Apolipoprotein A-I Proteins 0.000 description 1
- 101710095342 Apolipoprotein B Proteins 0.000 description 1
- 102100040202 Apolipoprotein B-100 Human genes 0.000 description 1
- 102000006410 Apoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010083590 Apoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108700016232 Arg(2)-Sar(4)- dermorphin (1-4) Proteins 0.000 description 1
- 206010003211 Arteriosclerosis coronary artery Diseases 0.000 description 1
- 108010024957 Ascorbate Oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000006942 B-Cell Maturation Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010008014 B-Cell Maturation Antigen Proteins 0.000 description 1
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Betaine Natural products C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101100388509 Caenorhabditis elegans che-3 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101710184216 Cardioactive peptide Proteins 0.000 description 1
- 102100032404 Cholinesterase Human genes 0.000 description 1
- 235000005956 Cosmos caudatus Nutrition 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SDKQRNRRDYRQKY-UHFFFAOYSA-N Dioxacarb Chemical compound CNC(=O)OC1=CC=CC=C1C1OCCO1 SDKQRNRRDYRQKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 239000006173 Good's buffer Substances 0.000 description 1
- 241001191009 Gymnomyza Species 0.000 description 1
- GIZQLVPDAOBAFN-UHFFFAOYSA-N HEPPSO Chemical compound OCCN1CCN(CC(O)CS(O)(=O)=O)CC1 GIZQLVPDAOBAFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000943274 Homo sapiens Cholinesterase Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108010028554 LDL Cholesterol Proteins 0.000 description 1
- YXOLAZRVSSWPPT-UHFFFAOYSA-N Morin Chemical compound OC1=CC(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=C(O)C=C(O)C=C2O1 YXOLAZRVSSWPPT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O N,N,N-trimethylglycinium Chemical compound C[N+](C)(C)CC(O)=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 108010002998 NADPH Oxidases Proteins 0.000 description 1
- 102000004722 NADPH Oxidases Human genes 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229920002057 Pluronic® P 103 Polymers 0.000 description 1
- 229920002070 Pluronic® P 84 Polymers 0.000 description 1
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 229920001218 Pullulan Polymers 0.000 description 1
- 239000004373 Pullulan Substances 0.000 description 1
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QYKIQEUNHZKYBP-UHFFFAOYSA-N Vinyl ether Chemical compound C=COC=C QYKIQEUNHZKYBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004018 acid anhydride group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-M alaninate Chemical compound CC(N)C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 150000001448 anilines Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 1
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- DHNRXBZYEKSXIM-UHFFFAOYSA-N chloromethylisothiazolinone Chemical compound CN1SC(Cl)=CC1=O DHNRXBZYEKSXIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005311 colipase Human genes 0.000 description 1
- 108020002632 colipase Proteins 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006356 dehydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- SYELZBGXAIXKHU-UHFFFAOYSA-N dodecyldimethylamine N-oxide Chemical compound CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)[O-] SYELZBGXAIXKHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- HBSYJULDYOVADU-UHFFFAOYSA-N hydrazine;3-methyl-1,3-benzothiazol-2-one Chemical compound NN.C1=CC=C2SC(=O)N(C)C2=C1 HBSYJULDYOVADU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 1
- IZWSFJTYBVKZNK-UHFFFAOYSA-N lauryl sulfobetaine Chemical compound CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O IZWSFJTYBVKZNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- KNJDBYZZKAZQNG-UHFFFAOYSA-N lucigenin Chemical compound [O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.C12=CC=CC=C2[N+](C)=C(C=CC=C2)C2=C1C1=C(C=CC=C2)C2=[N+](C)C2=CC=CC=C12 KNJDBYZZKAZQNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 1
- 108010077372 mast cell degranulating peptide Proteins 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- UXOUKMQIEVGVLY-UHFFFAOYSA-N morin Natural products OC1=CC(O)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UXOUKMQIEVGVLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000007708 morin Nutrition 0.000 description 1
- 229930187048 morinol Natural products 0.000 description 1
- CWOMTHDOJCARBY-UHFFFAOYSA-N n,n,3-trimethylaniline Chemical compound CN(C)C1=CC=CC(C)=C1 CWOMTHDOJCARBY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPEDSBOBSNNATM-UHFFFAOYSA-N n-[2-(n-ethyl-3-methylanilino)ethyl]acetamide Chemical compound CC(=O)NCCN(CC)C1=CC=CC(C)=C1 ZPEDSBOBSNNATM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JSABTPDNEXHNOQ-UHFFFAOYSA-N n-phenylaniline;sodium Chemical compound [Na].C=1C=CC=CC=1NC1=CC=CC=C1 JSABTPDNEXHNOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHYFEEDKONKGEB-UHFFFAOYSA-N oxathiane 2,2-dioxide Chemical compound O=S1(=O)CCCCO1 MHYFEEDKONKGEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001819 pancreatic juice Anatomy 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N phenyl 10-methylacridin-10-ium-9-carboxylate Chemical compound C12=CC=CC=C2[N+](C)=C2C=CC=CC2=C1C(=O)OC1=CC=CC=C1 RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002635 polyurethane Chemical group 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Chemical group 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N propane-1-sulfonic acid Chemical compound CCCS(O)(=O)=O KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 235000019423 pullulan Nutrition 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- SMBKJPHMYWYRDF-UHFFFAOYSA-M sodium 4-[2-(2,4-dinitrophenyl)-3-(4-iodophenyl)-1,3-dihydrotetrazol-3-ium-5-yl]benzene-1,3-disulfonate Chemical compound [Na+].[O-][N+](=O)C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1N1[NH+](C=2C=CC(I)=CC=2)N=C(C=2C(=CC(=CC=2)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)N1 SMBKJPHMYWYRDF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- SVLRFMQGKVFRTB-UHFFFAOYSA-M sodium;3-(3,5-dimethoxyanilino)-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].COC1=CC(NCC(O)CS([O-])(=O)=O)=CC(OC)=C1 SVLRFMQGKVFRTB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- HDARHUHTZKLJET-UHFFFAOYSA-M sodium;3-(n-ethyl-3,5-dimethoxyanilino)-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)CC(O)CN(CC)C1=CC(OC)=CC(OC)=C1 HDARHUHTZKLJET-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- HLXGRHNZZSMNRX-UHFFFAOYSA-M sodium;3-(n-ethyl-3,5-dimethylanilino)-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)CC(O)CN(CC)C1=CC(C)=CC(C)=C1 HLXGRHNZZSMNRX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- IRQRBVOQGUPTLG-UHFFFAOYSA-M sodium;3-(n-ethyl-3-methylanilino)-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)CC(O)CN(CC)C1=CC=CC(C)=C1 IRQRBVOQGUPTLG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ZPCAZHPYLUKSMY-UHFFFAOYSA-M sodium;3-(n-ethyl-3-methylanilino)-2-hydroxypropane-1-sulfonate;dihydrate Chemical compound O.O.[Na+].[O-]S(=O)(=O)CC(O)CN(CC)C1=CC=CC(C)=C1 ZPCAZHPYLUKSMY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- JUJBNYBVVQSIOU-UHFFFAOYSA-M sodium;4-[2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)tetrazol-2-ium-5-yl]benzene-1,3-disulfonate Chemical compound [Na+].C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1N1[N+](C=2C=CC(I)=CC=2)=NC(C=2C(=CC(=CC=2)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=N1 JUJBNYBVVQSIOU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- VHYHKZFQXUYNSG-UHFFFAOYSA-M sodium;4-[3-(4-iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-1,3-dihydrotetrazol-3-ium-5-yl]benzene-1,3-disulfonate Chemical compound [Na+].C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1N1[NH+](C=2C=CC(I)=CC=2)N=C(C=2C(=CC(=CC=2)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)N1 VHYHKZFQXUYNSG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明は、検体中の小粒子低密度リポ蛋白（以下、ｓｄＬＤＬと略記する）中のコレステロール（以下、ｓｄＬＤＬ−Ｃと略記する）の定量方法及び定量用キットに関する。
血液中に存在するリポ蛋白は、その比重により高密度リポ蛋白（以下、ＨＤＬと略記する）、低密度リポ蛋白（以下、ＬＤＬと略記する）、超低密度リポ蛋白（以下、ＶＬＤＬと略記する）、及びカイロミクロン（以下、ＣＭと略記する）の４つに大きく分類されている。各リポ蛋白は構成する脂質組成も異なり、また各リポ蛋白を構成するアポ蛋白の種類の違いによって生体中での働きが大きく異なっている。また、ＶＬＤＬからＬＤＬへ代謝される過程において生成するリポ蛋白として、ＶＬＤＬとＬＤＬの中間の密度を有する中間密度リポ蛋白（以下、ＩＤＬと略記する）が存在するが、これも広義にはＬＤＬとして分類されている。
臨床検査において、動脈硬化診断のスクリーニングマーカーとして、総コレステロール、総トリグリセリド、ＨＤＬ中コレステロール、ＬＤＬ中コレステロール、アポリポ蛋白ＡＩ、アポリポ蛋白Ｂなどが用いられている。なかでも、動脈硬化形成に強く関与するといわれているＬＤＬ中のコレステロールが頻繁に測定されるようになってきた。一方、ＬＤＬ中のコレステロールが高くないにも関わらず冠動脈硬化病変を有する者も多く認められる。この病態においては小型で高密度のＬＤＬ（当該ＬＤＬが、ｓｄＬＤＬと呼ばれている）が増加しており、ｓｄＬＤＬ−ＣはＬＤＬ−Ｃ以上に冠動脈疾患と関係するという報告もある［「アーテリオスクレローシス トロンボシス アンド ヴァスキュラー バイオロジー(Arteriosclerosis Thrombosis, and Vascular Biology)」，２００４年，第２４巻，ｐ．５５８−５６３参照］。
ｓｄＬＤＬを測定する方法としては、電気泳動法、超遠心法、分画法などが知られている。電気泳動法は２〜１６％の非変性グラジエントゲルを用いて電気泳動、染色を行いＬＤＬの粒子サイズを測定する方法であるが、操作が煩雑であり汎用性に劣る。またこの方法ではＬＤＬの粒子サイズは測定できるが、ｓｄＬＤＬの定量はできない。また、イオン強度の差によりｓｄＬＤＬを混濁または溶解させ吸光度の差によりｓｄＬＤＬを測定する方法（特許文献１参照）がある。しかし、この方法では濁度を測定しているため、特異性や精度が不十分であり、更にこの方法ではｓｄＬＤＬ量を測定できるが、ｓｄＬＤＬ−Ｃを測定することは出来ない。
ｓｄＬＤＬ−Ｃを定量する方法には、超遠心法、分画法などがある。超遠心法は超遠心分離機を用いて検体中のｓｄＬＤＬにあたる比重領域を分取し、該比重領域中のコレステロールを測定する方法であり、ｓｄＬＤＬ−Ｃ定量の標準法となり得る方法である。しかしながらこの方法は、高価な設備を必要とし、測定に非常に長時間を要し、手技に熟練を要する。
分画法としては、第一工程でポリアニオンと２価の陽イオン又は１価の陽イオンとの組み合わせ、或いはポリエチレングリコールを用いて検体中のＨＤＬ及びｓｄＬＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させ、遠心分離やフィルターろ過により凝集物を除去し、ＨＤＬ及びｓｄＬＤＬを分離し、第二工程で分離したＨＤＬ及びｓｄＬＤＬを含む試料からｓｄＬＤＬ−Ｃを定量する方法である（特許文献２参照）。この方法は、超遠心法と比較して操作が簡便化したものの、分画操作が必要であるため測定に時間を要する。
界面活性剤の存在下で、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素を、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭからなる群より選ばれる一つ又は複数の特定のリポ蛋白に特異的に作用させ、測定すべきリポ蛋白中のコレステロールを測定する方法は多数報告されている。最近、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体の存在下に、検体にコレステロール測定用酵素を添加し、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体をｓｄＬＤＬに選択的に作用させ、生成したコレステロール量を測定することを特徴とするｓｄＬＤＬ−Ｃの定量法が報告された（特許文献３）。
特開２００３−２８８８２号公報
国際公開第２００４／０５３５００号パンフレット
国際公開第２００７／０２６８２９号パンフレット
本発明の目的は、簡便で、かつ、正確に、検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃを定量できる方法及びキットを提供することにある。
本発明は以下の［１］〜［６］に関する。
［１］（i）コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による高密度リポ蛋白中のコレステロール（以下、ＨＤＬ−Ｃと略記する）、超低密度リポ蛋白中のコレステロール（以下、ＶＬＤＬ−Ｃと略記する）、カイロミクロン中のコレステロール（以下、ＣＭ−Ｃと略記する）及び大粒子低密度リポ蛋白中のコレステロール（以下、ＬｇＬＤＬ−Ｃと略記する）の反応に比較して、該コレステロールエステル加水分解酵素及び該コレステロール酸化酵素若しくは該コレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による小粒子低密度リポ蛋白中のコレステロール（以下、ｓｄＬＤＬ−Ｃと略記する）の反応を優先的に抑制する界面活性剤（以下、該界面活性剤を界面活性剤Ａと略記する）を含有する反応液中で、検体に該コレステロールエステル加水分解酵素及び該コレステロール酸化酵素、又は、該コレステロールエステル加水分解酵素、該コレステロール脱水素酵素及び酸化型補酵素を作用させ、該検体中のＨＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ、ＣＭ−Ｃ及びＬｇＬＤＬ−Ｃを除去する工程；
（ii）前記工程（i）の界面活性剤Ａを含有する反応液に残存するｓｄＬＤＬ−Ｃの、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による反応の抑制を解除する界面活性剤（以下、該界面活性剤を界面活性剤Ｂと略記する）を添加し、過酸化水素または還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素又は還元型補酵素を測定する工程；
(iii)既知濃度のｓｄＬＤＬ−Ｃを含有する標準検体を用いて、前記(i)及び(ii)の工程を行い過酸化水素または還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素又は還元型補酵素を測定し、ｓｄＬＤＬ−Ｃ濃度と過酸化水素又は還元型補酵素に係る測定値とを関連づけ、該検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃ濃度を決定する工程；
の各工程を含み、
上記界面活性剤Ａが、ポリオキシエチレンアルキルアミン、アミンオキシド類、アルキルベタイン、アルキルアンモニオ−１−プロパンスルホン酸塩、酸アミドアルキルベタイン、ポリオキシエチレンベンジル−アルキル４級アンモニウム塩、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルアミン硫酸エステル塩、Ｎ−アシルタウリン塩、Ｎ−アシルアミノ酸塩、エチレンジアミン−ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリエチレングリコールを含まないポリプロピレングリコール誘導体、一般式（Ｉ）
（式中、ａ、ｂ及びｃは同一又は異なって、１〜２００の整数を表す）で表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、及び、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル（該アルキルは炭素数９以下のアルキル）からなる群より選ばれる１種又は２種以上の界面活性剤であり、
上記界面活性剤Ｂが、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル（該アルキルは炭素数１０以上のアルキル）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル、一般式（II）
（式中、ｄ、ｅ及びｆは同一又は異なって、１〜２００の整数を表す）で表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、及び、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアミンからなる群より選ばれる１種又は２種以上の界面活性剤である、
ことを特徴とする検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量方法。
［２］工程(i)をアルブミン存在下で行う［１］に記載の方法。
［１］（i）コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による高密度リポ蛋白中のコレステロール（以下、ＨＤＬ−Ｃと略記する）、超低密度リポ蛋白中のコレステロール（以下、ＶＬＤＬ−Ｃと略記する）、カイロミクロン中のコレステロール（以下、ＣＭ−Ｃと略記する）及び大粒子低密度リポ蛋白中のコレステロール（以下、ＬｇＬＤＬ−Ｃと略記する）の反応に比較して、該コレステロールエステル加水分解酵素及び該コレステロール酸化酵素若しくは該コレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による小粒子低密度リポ蛋白中のコレステロール（以下、ｓｄＬＤＬ−Ｃと略記する）の反応を優先的に抑制する界面活性剤（以下、該界面活性剤を界面活性剤Ａと略記する）を含有する反応液中で、検体に該コレステロールエステル加水分解酵素及び該コレステロール酸化酵素、又は、該コレステロールエステル加水分解酵素、該コレステロール脱水素酵素及び酸化型補酵素を作用させ、該検体中のＨＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ、ＣＭ−Ｃ及びＬｇＬＤＬ−Ｃを除去する工程；
（ii）前記工程（i）の界面活性剤Ａを含有する反応液に残存するｓｄＬＤＬ−Ｃの、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による反応の抑制を解除する界面活性剤（以下、該界面活性剤を界面活性剤Ｂと略記する）を添加し、過酸化水素または還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素又は還元型補酵素を測定する工程；
(iii)既知濃度のｓｄＬＤＬ−Ｃを含有する標準検体を用いて、前記(i)及び(ii)の工程を行い過酸化水素または還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素又は還元型補酵素を測定し、ｓｄＬＤＬ−Ｃ濃度と過酸化水素又は還元型補酵素に係る測定値とを関連づけ、該検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃ濃度を決定する工程；
の各工程を含み、
上記界面活性剤Ａが、ポリオキシエチレンアルキルアミン、アミンオキシド類、アルキルベタイン、アルキルアンモニオ−１−プロパンスルホン酸塩、酸アミドアルキルベタイン、ポリオキシエチレンベンジル−アルキル４級アンモニウム塩、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルアミン硫酸エステル塩、Ｎ−アシルタウリン塩、Ｎ−アシルアミノ酸塩、エチレンジアミン−ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリエチレングリコールを含まないポリプロピレングリコール誘導体、一般式（Ｉ）
（式中、ａ、ｂ及びｃは同一又は異なって、１〜２００の整数を表す）で表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、及び、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル（該アルキルは炭素数９以下のアルキル）からなる群より選ばれる１種又は２種以上の界面活性剤であり、
上記界面活性剤Ｂが、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル（該アルキルは炭素数１０以上のアルキル）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル、一般式（II）
（式中、ｄ、ｅ及びｆは同一又は異なって、１〜２００の整数を表す）で表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、及び、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアミンからなる群より選ばれる１種又は２種以上の界面活性剤である、
ことを特徴とする検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量方法。
［２］工程(i)をアルブミン存在下で行う［１］に記載の方法。
［３］（ａ）コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による高密度リポ蛋白中のコレステロール、超低密度リポ蛋白中のコレステロール、カイロミクロン中のコレステロール及び大粒子低密度リポ蛋白中のコレステロールの反応に比較して、該コレステロールエステル加水分解酵素及び該コレステロール酸化酵素若しくは該コレステロール脱水素酵素−該酸化型補酵素による小粒子低密度リポ蛋白中のコレステロール（以下、ｓｄＬＤＬ−Ｃと略記する）の反応を優先的に抑制する界面活性剤（以下、該界面活性剤を界面活性剤Ａと略記する）、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素及び過酸化水素除去試薬を含有する第一試薬と、（ｂ）界面活性剤Ａ共存下でｓｄＬＤＬ−Ｃの、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による反応の抑制を解除する界面活性剤（以下、該界面活性剤を界面活性剤Ｂと略記する）、及び、過酸化水素測定試薬を含有する第二試薬とを含有し、
上記界面活性剤Ａが、ポリオキシエチレンアルキルアミン、アミンオキシド類、アルキルベタイン、アルキルアンモニオ−１−プロパンスルホン酸塩、酸アミドアルキルベタイン、ポリオキシエチレンベンジル−アルキル４級アンモニウム塩、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルアミン硫酸エステル塩、Ｎ−アシルタウリン塩、Ｎ−アシルアミノ酸塩、エチレンジアミン−ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリエチレングリコールを含まないポリプロピレングリコール誘導体、一般式（Ｉ）
（式中、ａ、ｂ及びｃは同一又は異なって、１〜２００の整数を表す）で表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、及び、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル（該アルキルは炭素数９以下のアルキル）からなる群より選ばれる１種又は２種以上の界面活性剤であり、
上記界面活性剤Ｂが、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル（該アルキルは炭素数１０以上のアルキル）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル、一般式（II）
（式中、ｄ、ｅ及びｆは同一又は異なって、１〜２００の整数を表す）で表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、及び、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアミンからなる群より選ばれる１種又は２種以上の界面活性剤である、
ことを特徴とする検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キット。
［４］（ａ）コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による高密度リポ蛋白中のコレステロール、超低密度リポ蛋白中のコレステロール、カイロミクロン中のコレステロール及び大粒子低密度リポ蛋白中のコレステロールの反応に比較して、該コレステロールエステル加水分解酵素及び該コレステロール酸化酵素若しくは該コレステロール脱水素酵素−該酸化型補酵素による小粒子低密度リポ蛋白中のコレステロール（以下、ｓｄＬＤＬ−Ｃと略記する）の反応を優先的に抑制する界面活性剤（以下、該界面活性剤を界面活性剤Ａと略記する）、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素を含有する第一試薬と、（ｂ）界面活性剤Ａ共存下でｓｄＬＤＬ−Ｃの、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による反応の抑制を解除する界面活性剤（以下、該界面活性剤を界面活性剤Ｂと略記する）を含有する第二試薬とを含有し、
上記界面活性剤Ａが、ポリオキシエチレンアルキルアミン、アミンオキシド類、アルキルベタイン、アルキルアンモニオ−１−プロパンスルホン酸塩、酸アミドアルキルベタイン、ポリオキシエチレンベンジル−アルキル４級アンモニウム塩、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルアミン硫酸エステル塩、Ｎ−アシルタウリン塩、Ｎ−アシルアミノ酸塩、エチレンジアミン−ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリエチレングリコールを含まないポリプロピレングリコール誘導体、一般式（Ｉ）
（式中、ａ、ｂ及びｃは同一又は異なって、１〜２００の整数を表す）で表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、及び、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル（該アルキルは炭素数９以下のアルキル）からなる群より選ばれる１種又は２種以上の界面活性剤であり、
上記界面活性剤Ｂが、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル（該アルキルは炭素数１０以上のアルキル）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル、一般式（II）
（式中、ｄ、ｅ及びｆは同一又は異なって、１〜２００の整数を表す）で表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、及び、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアミンからなる群より選ばれる１種又は２種以上の界面活性剤である、
ことを特徴とする検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キット。
［５］少なくとも第一試薬にアルブミンを含有する［３］又は［４］に記載のキット。
［６］第三試薬として、既知濃度のｓｄＬＤＬを含有する標準品を含有する［３］〜［５］のいずれかに記載のキット。
上記界面活性剤Ａが、ポリオキシエチレンアルキルアミン、アミンオキシド類、アルキルベタイン、アルキルアンモニオ−１−プロパンスルホン酸塩、酸アミドアルキルベタイン、ポリオキシエチレンベンジル−アルキル４級アンモニウム塩、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルアミン硫酸エステル塩、Ｎ−アシルタウリン塩、Ｎ−アシルアミノ酸塩、エチレンジアミン−ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリエチレングリコールを含まないポリプロピレングリコール誘導体、一般式（Ｉ）
（式中、ａ、ｂ及びｃは同一又は異なって、１〜２００の整数を表す）で表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、及び、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル（該アルキルは炭素数９以下のアルキル）からなる群より選ばれる１種又は２種以上の界面活性剤であり、
上記界面活性剤Ｂが、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル（該アルキルは炭素数１０以上のアルキル）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル、一般式（II）
（式中、ｄ、ｅ及びｆは同一又は異なって、１〜２００の整数を表す）で表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、及び、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアミンからなる群より選ばれる１種又は２種以上の界面活性剤である、
ことを特徴とする検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キット。
［４］（ａ）コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による高密度リポ蛋白中のコレステロール、超低密度リポ蛋白中のコレステロール、カイロミクロン中のコレステロール及び大粒子低密度リポ蛋白中のコレステロールの反応に比較して、該コレステロールエステル加水分解酵素及び該コレステロール酸化酵素若しくは該コレステロール脱水素酵素−該酸化型補酵素による小粒子低密度リポ蛋白中のコレステロール（以下、ｓｄＬＤＬ−Ｃと略記する）の反応を優先的に抑制する界面活性剤（以下、該界面活性剤を界面活性剤Ａと略記する）、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素を含有する第一試薬と、（ｂ）界面活性剤Ａ共存下でｓｄＬＤＬ−Ｃの、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による反応の抑制を解除する界面活性剤（以下、該界面活性剤を界面活性剤Ｂと略記する）を含有する第二試薬とを含有し、
上記界面活性剤Ａが、ポリオキシエチレンアルキルアミン、アミンオキシド類、アルキルベタイン、アルキルアンモニオ−１−プロパンスルホン酸塩、酸アミドアルキルベタイン、ポリオキシエチレンベンジル−アルキル４級アンモニウム塩、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルアミン硫酸エステル塩、Ｎ−アシルタウリン塩、Ｎ−アシルアミノ酸塩、エチレンジアミン−ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリエチレングリコールを含まないポリプロピレングリコール誘導体、一般式（Ｉ）
（式中、ａ、ｂ及びｃは同一又は異なって、１〜２００の整数を表す）で表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、及び、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル（該アルキルは炭素数９以下のアルキル）からなる群より選ばれる１種又は２種以上の界面活性剤であり、
上記界面活性剤Ｂが、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル（該アルキルは炭素数１０以上のアルキル）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル、一般式（II）
（式中、ｄ、ｅ及びｆは同一又は異なって、１〜２００の整数を表す）で表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、及び、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアミンからなる群より選ばれる１種又は２種以上の界面活性剤である、
ことを特徴とする検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キット。
［５］少なくとも第一試薬にアルブミンを含有する［３］又は［４］に記載のキット。
［６］第三試薬として、既知濃度のｓｄＬＤＬを含有する標準品を含有する［３］〜［５］のいずれかに記載のキット。
本発明により、簡便で、かつ、正確に、検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃを定量できる方法及びキットが提供される。
ＨＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ及びＣＭ−Ｃとは、それぞれＨＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ中の遊離型コレステロールとエステル型コレステロールを合わせたものを意味する。
本発明の測定方法において用いられる検体としては、例えば全血、血漿、血清、髄液、唾液、羊水、尿、汗、膵液等が挙げられるが、血漿及び血清が好ましい。
本発明におけるコレステロールエステル加水分解酵素としては、コレステロールエステルを加水分解する能力を有する酵素であれば特に限定はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼ等も用いることができる。
本発明の測定方法において用いられる検体としては、例えば全血、血漿、血清、髄液、唾液、羊水、尿、汗、膵液等が挙げられるが、血漿及び血清が好ましい。
本発明におけるコレステロールエステル加水分解酵素としては、コレステロールエステルを加水分解する能力を有する酵素であれば特に限定はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼ等も用いることができる。
コレステロールエステル加水分解酵素としては、無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素も、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素も使用することができる。また、コレステロールエステル加水分解酵素としては市販品を使用することもできる。
市販されているコレステロールエステル加水分解酵素としては、コレステロールエステラーゼ“Amano”２（ＣＨＥ２；天野エンザイム社製）、コレステロールエステラーゼ“Amano”３（ＣＨＥ３；天野エンザイム社製）、リポプロテインリパーゼ“Amano”３（ＬＰＬ３；天野エンザイム社製）、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ−３１１；東洋紡績社製）、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ−３１２；東洋紡績社製）、コレテロールエステラーゼ（ＣＯＥ−３０１；東洋紡績社製）、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＢＰ；旭化成社製）、コレステロールエステラーゼ（ＣＥＢＰ−Ｍ；旭化成社製）、コレステロールエステラーゼ（ＣＥＮ；旭化成社製）、リパーゼ（ＬＰ；旭化成社製）、リパーゼ（ＬＰＭ；旭化成社製）、リパーゼ（ＬＰＡＰ；旭化成社製）、リパーゼ（ＬＩＰＳ；旭化成社製）、コレステロールエステラーゼ（ＣＨＥ−ＢＥ；キッコーマン社製）等が挙げられる。また、本発明においては、２種類以上のコレステロールエステル加水分解酵素を組み合わせて用いることもできる。
市販されているコレステロールエステル加水分解酵素としては、コレステロールエステラーゼ“Amano”２（ＣＨＥ２；天野エンザイム社製）、コレステロールエステラーゼ“Amano”３（ＣＨＥ３；天野エンザイム社製）、リポプロテインリパーゼ“Amano”３（ＬＰＬ３；天野エンザイム社製）、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ−３１１；東洋紡績社製）、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ−３１２；東洋紡績社製）、コレテロールエステラーゼ（ＣＯＥ−３０１；東洋紡績社製）、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＢＰ；旭化成社製）、コレステロールエステラーゼ（ＣＥＢＰ−Ｍ；旭化成社製）、コレステロールエステラーゼ（ＣＥＮ；旭化成社製）、リパーゼ（ＬＰ；旭化成社製）、リパーゼ（ＬＰＭ；旭化成社製）、リパーゼ（ＬＰＡＰ；旭化成社製）、リパーゼ（ＬＩＰＳ；旭化成社製）、コレステロールエステラーゼ（ＣＨＥ−ＢＥ；キッコーマン社製）等が挙げられる。また、本発明においては、２種類以上のコレステロールエステル加水分解酵素を組み合わせて用いることもできる。
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素において、コレステロールエステル加水分解酵素を修飾する基（化学修飾基）としては、例えばポリエチレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、水溶性多糖類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリウレタン基、キレート機能を有する基等が挙げられるが、ポリエチレングリコールを主成分とする基が好ましい。水溶性多糖類としては、例えばデキストラン、プルラン、可溶性デンプン等が挙げられる。
コレステロールエステル加水分解酵素を化学的に修飾するための試薬（化学修飾剤）としては、上記の化学修飾基と、酵素のアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基等と反応し得る官能基又は構造とを併せ持つ化合物等が挙げられる。酵素中のアミノ基と反応し得る官能基又は構造としては、例えばカルボキシル基、活性エステル基（Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド基等）、酸無水物、酸塩化物、アルデヒド、エポキシド基、１，３−プロパンスルトン、１，４−ブタンスルトン等が挙げられる。酵素中のカルボキシル基と反応し得る官能基又は構造としては、例えばアミノ基等が挙げられる。酵素中のスルフヒドリル基と反応し得る基又は構造としては、例えばマレイミド基、ジスルフィド、α−ハロエステル（α−ヨードエステル等）等が挙げられる。
化学修飾剤として、市販品を使用することもできる。市販されている化学修飾剤としては、ポリエチレングリコールを主成分とする基とＮ−ヒドロキシサクシンイミド基とを有するサンブライトＶＦＭ−４１０１、サンブライトＭＥ−０５０ＡＳ、サンブライトＤＥ−０３０ＡＳ（いずれも日本油脂社製）、ポリエチレングリコールやポリプロピレングリコール等のポリアルキレングリコールを主成分とする基と酸無水物構造とを有するサンブライトＡＫＭシリーズ（例えば、サンブライトＡＫＭ−１５１０等）、サンブライトＡＤＭシリーズ、サンブライトＡＣＭシリーズ（いずれも日本油脂社製）、ポリエチレングリコールを主成分とする基とエポキシド基とを有するＥＰＯＸ−３４００、Ｍ−ＥＰＯＸ−５０００（いずれもＳｈｅａｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社製）、キレート機能を有する基と酸無水物構造とを有するジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ペンタ無水二酢酸（ＤＴＰＡ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ；同仁化学研究所社製）等が挙げられる。
コレステロールエステル加水分解酵素の化学修飾は、例えば以下の方法で行うことができるが、本方法に限定されるものではない。まず、コレステロールエステル加水分解酵素をｐＨ８．０以上の緩衝液｛例えば２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液｝に溶解し、０〜５５℃で０．０１〜５００倍モル量の化学修飾剤を添加し、５分間〜５時間攪拌する。実際の酵素反応においては、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素として、この反応液そのもののみならず、必要に応じて限外濾過膜等により未反応の化学修飾剤等を除去したものも、使用することもできる。
本反応の方法に用いられるコレステロールエステル加水分解酵素の濃度としては、本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で０．００１〜２０００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、０．００５〜１０００Ｕ／ｍＬであることがより好ましい。
本発明におけるコレステロール酸化酵素としては、コレステロールを酸化して過酸化水素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のコレステロールオキシダーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールオキシダーゼ等も用いることができ、コレステロールオキシダーゼ“Amano”１（ＣＨＯＤ１；天野エンザイム社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯ−ＰＥＬ；キッコーマン社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯ−ＰＥＷＬ；キッコーマン社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯ−ＣＥ；キッコーマン社製）コレステロールオキシダーゼ（ＣＯＯ３２１；東洋紡績社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＯＯ−３２２；東洋紡績社製）等の市販品を用いることもできる。また、本発明においては、２種類以上のコレステロール酸化酵素を組み合わせて用いることもできる。
本発明におけるコレステロール酸化酵素としては、コレステロールを酸化して過酸化水素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のコレステロールオキシダーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールオキシダーゼ等も用いることができ、コレステロールオキシダーゼ“Amano”１（ＣＨＯＤ１；天野エンザイム社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯ−ＰＥＬ；キッコーマン社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯ−ＰＥＷＬ；キッコーマン社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯ−ＣＥ；キッコーマン社製）コレステロールオキシダーゼ（ＣＯＯ３２１；東洋紡績社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＯＯ−３２２；東洋紡績社製）等の市販品を用いることもできる。また、本発明においては、２種類以上のコレステロール酸化酵素を組み合わせて用いることもできる。
コレステロール酸化酵素は、無修飾の酵素であっても、化学的に修飾された酵素であってもよい。化学的に修飾されたコレステロール酸化酵素は、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。
本反応の方法に用いられるコレステロール酸化酵素の濃度としては、本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で０．００１〜２０００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、０．００５〜１０００Ｕ／ｍＬの濃度であることがより好ましい。
本反応の方法に用いられるコレステロール酸化酵素の濃度としては、本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で０．００１〜２０００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、０．００５〜１０００Ｕ／ｍＬの濃度であることがより好ましい。
本発明におけるコレステロール脱水素酵素としては、酸化型補酵素の存在下にコレステロールを酸化して還元型補酵素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のコレステロールデヒドロゲナーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールデヒドロゲナーゼ等も用いることができる。コレステロールデヒドロゲナーゼ“Amano”５（ＣＨＤＨ５；天野エンザイム社製）等の市販品を用いることもできる。また、本発明においては、２種類以上のコレステロール脱水素酵素を組み合わせて用いることもできる。
コレステロール脱水素酵素は、無修飾の酵素であっても、化学的に修飾された酵素であってもよい。化学的に修飾されたコレステロール脱水素酵素は、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。
本反応の方法に用いられるコレステロール脱水素酵素の濃度としては、本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で０．００１〜２０００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、０．００５〜１０００Ｕ／ｍＬの濃度であることがより好ましい。
本反応の方法に用いられるコレステロール脱水素酵素の濃度としては、本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で０．００１〜２０００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、０．００５〜１０００Ｕ／ｍＬの濃度であることがより好ましい。
コレステロール脱水素酵素を用いた定量において使用される酸化型補酵素としては、例えばＮＡＤ（Ｐ）＋、ｔｈｉｏ−ＮＡＤ（Ｐ）＋等が挙げられる。酸化型補酵素共存下でのコレステロール脱水素酵素とリポ蛋白中のコレステロールとの反応により生成する還元型補酵素としては、例えばＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、ｔｈｉｏ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ等が挙げられる。
本発明の方法に用いられる酸化型補酵素の濃度としては、本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で０．０１〜４００ｍｍｏｌ／Ｌの濃度であることが好ましく、０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの濃度であることがより好ましい。
本発明の方法に用いられる酸化型補酵素の濃度としては、本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で０．０１〜４００ｍｍｏｌ／Ｌの濃度であることが好ましく、０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの濃度であることがより好ましい。
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量方法においては、還元型補酵素酸化酵素も用いることができる。ここで、還元型補酵素酸化酵素は、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素と共に用いられ、酸化型補酵素共存下でのコレステロール脱水素酵素とリポ蛋白中のコレステロールとの反応により生成した還元型補酵素を過酸化水素に変換する。還元型補酵素酸化酵素としては、例えばＮＡＤ（Ｐ）Ｈ酸化酵素等が挙げられる。還元型補酵素酸化酵素としては、市販品を使用することもできる。市販の還元型補酵素酸化酵素としては、ＮＡＤＨ Ｏｘｉｄａｓｅ（コスモ・バイオ社製）等が挙げられる。
本発明の方法に用いられる還元型補酵素酸化酵素の濃度としては、本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で０．０１〜４００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、０．０２〜２００Ｕ／ｍＬの濃度であることがより好ましい。
本発明において使用されるアルブミンとしては、本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とするアルブミンであれば特に限定はなく、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヒト由来のアルブミン等が挙げられるが、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が好ましい。また、遺伝子工学的な手法により製造されたアルブミンも用いることができる。本発明においては、２種類以上のアルブミンを組み合わせて使用することもできる。本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量におけるアルブミンの濃度としては、本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が０．００１〜１０％であることが好ましく、０．０１〜５％がより好ましい。
本発明において使用されるアルブミンとしては、本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とするアルブミンであれば特に限定はなく、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヒト由来のアルブミン等が挙げられるが、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が好ましい。また、遺伝子工学的な手法により製造されたアルブミンも用いることができる。本発明においては、２種類以上のアルブミンを組み合わせて使用することもできる。本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量におけるアルブミンの濃度としては、本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が０．００１〜１０％であることが好ましく、０．０１〜５％がより好ましい。
本発明における界面活性剤Ａは、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素によるｓｄＬＤＬ−Ｃの反応を抑制し、ＬｇＬＤＬ−Ｃの反応を行わせる性質を有する。具体的には、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素によるＨＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ、ＣＭ−Ｃ及びＬｇＬＤＬ−Ｃの反応に比較して、該コレステロールエステル加水分解酵素及び該コレステロール酸化酵素若しくは該コレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素によるｓｄＬＤＬ−Ｃの反応を優先的に抑制する界面活性剤であり、工程(i)において、ｓｄＬＤＬ−Ｃ以外の、すなわちＨＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ、ＣＭ−Ｃ及びＬｇＬＤＬ−Ｃの除去に使用される界面活性剤である。以下、ＨＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ、ＣＭ−Ｃ及びＬｇＬＤＬ−Ｃを総称して、ｓｄＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールと表記する場合がある。
界面活性剤Ａとしては、例えばポリオキシエチレンアルキルアミン（以下、ＰＯＥアルキルアミンと略記する）、アミンオキシド類、アルキルベタイン、アルキルアンモニオ−１−プロパンスルホン酸塩、酸アミドアルキルベタイン、ポリオキシエチレンベンジル−アルキル４級アンモニウム塩（以下、ＰＯＥベンジル−アルキル４級アンモニウム塩と略記する）、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド（以下、ＰＯＥ脂肪酸アミドと略記する）、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩（以下、ＰＯＥ多環フェニルエーテル硫酸エステル塩と略記する）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩（以下、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩と略記する）、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド硫酸エステル塩（以下、ＰＯＥ脂肪酸アミド硫酸エステル塩と略記する）、ポリオキシエチレンアルキルアミン硫酸エステル塩（以下、ＰＯＥアルキルアミン硫酸エステル塩と略記する）、Ｎ−アシルタウリン塩、Ｎ−アシルアミノ酸塩、エチレンジアミン−ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物（以下、エチレンジアミン−ＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物と略記する）、ポリエチレングリコールを含まないポリプロピレングリコール誘導体（以下、ＰＰＧ誘導体と略記する）、一般式（Ｉ）
（式中、ａ、ｂ及びｃは同一又は異なって、１〜２００の整数を表す）で表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物（以下、ＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物と略記する）、及び、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル（該アルキルは炭素数９以下のアルキル）（以下、Ｃ９以下のＰＯＥ・ＰＯＡアルキルエーテルと略記する）等が挙げられる。
ＰＯＥアルキルアミン、アルキルベタイン、アルキルアンモニオ−１−プロパンスルホン酸塩、酸アミドアルキルベタイン、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ＰＯＥアルキルアミン硫酸エステル塩におけるアルキルとしては、炭素数１〜３０の、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル（ベヘニル）、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、トリアコンシル等が挙げられる。
ＰＯＥアルキルアミンの市販品としては、パイオニンＤ−３１０４、パイオニンＤ−３１１０、パイオニンＤ−３１２０（以上、竹本油脂社製）、ナイミーンＬ−２０７（以上、日本油脂社製）、ＢＬＡＵＮＯＮ Ｌ−２０５（以上、青木油脂社製）等が挙げられる。
アミンオキシド類としては、例えばアルキルアミンオキシド、ポリオキシエチレンアルキルアミンオキシド（以下、ＰＯＥアルキルアミンオキシドと略記する）等が挙げられる。アルキルアミンオキシド、ＰＯＥアルキルアミンオキシドにおけるアルキルとしては、例えば置換若しくは非置換の炭素数１〜３０のアルキル等が挙げられる。該アルキルとしては前記のアルキル等が挙げられる。該置換基としては、例えば水酸基等が挙げられる。アミンオキシド類の市販品としては、ユニセーフＡ−ＬＥ、ユニセーフＡ−ＬＭ、ユニセーフＡ−ＬＹ（以上、日本油脂社製）等が挙げられる。
アミンオキシド類としては、例えばアルキルアミンオキシド、ポリオキシエチレンアルキルアミンオキシド（以下、ＰＯＥアルキルアミンオキシドと略記する）等が挙げられる。アルキルアミンオキシド、ＰＯＥアルキルアミンオキシドにおけるアルキルとしては、例えば置換若しくは非置換の炭素数１〜３０のアルキル等が挙げられる。該アルキルとしては前記のアルキル等が挙げられる。該置換基としては、例えば水酸基等が挙げられる。アミンオキシド類の市販品としては、ユニセーフＡ−ＬＥ、ユニセーフＡ−ＬＭ、ユニセーフＡ−ＬＹ（以上、日本油脂社製）等が挙げられる。
アルキルベタインの市販品としては、ニッサンアノンＢＬ、ニッサンアノンＢＦ（以上、日本油脂社製）、アンヒトール２４Ｂ、アンヒトール８６Ｂ（以上、花王社製）等が挙げられる。
アルキルアンモニオ−１−プロパンスルホン酸塩の市販品としては、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−１０、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−１２（以上、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）等が挙げられる。
アルキルアンモニオ−１−プロパンスルホン酸塩の市販品としては、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−１０、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−１２（以上、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）等が挙げられる。
酸アミドアルキルベタインの市販品としては、アノンＢＤＦ−ＳＦ（日本油脂社製）等が挙げられる。
ＰＯＥベンジル−アルキル４級アンモニウム塩の市販品としては、ビスノールＳＫ（一方社社製）等が挙げられる。
ＰＯＥ脂肪酸アミドの市販品としては、ナイミッドＭＴ−２１５（日本油脂社製）、ニッコールＴＡＭＤＳ１５（日光ケミカルズ社製）等が挙げられる。
ＰＯＥベンジル−アルキル４級アンモニウム塩の市販品としては、ビスノールＳＫ（一方社社製）等が挙げられる。
ＰＯＥ脂肪酸アミドの市販品としては、ナイミッドＭＴ−２１５（日本油脂社製）、ニッコールＴＡＭＤＳ１５（日光ケミカルズ社製）等が挙げられる。
ＰＯＥ多環フェニルエーテル硫酸エステル塩における多環フェニルとしては、基内に１つの芳香環を有する基（置換基）が２つ以上置換したフェニル基、基内に２つ以上の芳香環を有する基（置換基）が１つまたは複数置換したフェニル基等が挙げられる。基内に１つの芳香環を有する基としては、例えばベンジル、１−（フェニル）エチル等が挙げられる。基内に２つ以上の芳香環を有する基としては、例えばナフチル等が挙げられる。ＰＯＥ多環フェニルエーテル硫酸エステル塩の市販品としては、ニューコール７０７−ＳＦ、ニューコール７０７−ＳＦＣ、ニューコール７０７−ＳＮ、ニューコール７２３−ＳＦ（以上、日本乳化剤社製）等が挙げられる。
ＰＯＥアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩の市販品としては、ハイテノールＮ−０７、ハイテノールＮ−０８、ハイテノールＮ−１７（以上、第一工業薬品社製）等が挙げられる。
ＰＯＥ脂肪酸アミド硫酸エステル塩の市販品としては、サンアミドＣＦ−３、サンアミドＣＦ−１０（以上、日本油脂社製）等が挙げられる。
ＰＯＥ脂肪酸アミド硫酸エステル塩の市販品としては、サンアミドＣＦ−３、サンアミドＣＦ−１０（以上、日本油脂社製）等が挙げられる。
ＰＯＥアルキルアミン硫酸エステル塩の市販品としては、ミグノールＰＡ−３０（一方社社製）等が挙げられる。
Ｎ−アシルタウリン塩の市販品としては、ニッコールＣＭＴ−３０、ニッコールＰＭＴ（以上、日光ケミカルズ社製）、ダイヤポンＴペースト、ダイヤポンＴパウダー、ダイヤポンＫ、ダイヤポンＬＭ、ダイヤポンＫ−ＭＧ（以上、日本油脂社製）等が挙げられる。
Ｎ−アシルタウリン塩の市販品としては、ニッコールＣＭＴ−３０、ニッコールＰＭＴ（以上、日光ケミカルズ社製）、ダイヤポンＴペースト、ダイヤポンＴパウダー、ダイヤポンＫ、ダイヤポンＬＭ、ダイヤポンＫ−ＭＧ（以上、日本油脂社製）等が挙げられる。
Ｎ−アシルアミノ酸塩におけるアミノ酸としてはサルコシン、アラニン等が挙げられる。Ｎ−アシルアミノ酸塩の市販品としては、サルコシネートＬＮ−３０、サルコシネートＣＮ−３０、サルコシネートＬＫ−３０、アラニネートＬＮ−３０（以上、日光ケミカルズ社製）、フィレットＬ（日本油脂社製）等が挙げられる。
エチレンジアミン−ＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物の市販品としては、アデカプルロニックＴＲ−７０１、アデカプルロニックＴＲ−７０２、アデカプルロニックＴＲ−７０４、アデカプルロニックＴＲ−９１３Ｒ（以上、旭電化社製）、ユニルーブ３２ＴＹ−６５ＢＩ（日本油脂社製）等が挙げられる。
エチレンジアミン−ＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物の市販品としては、アデカプルロニックＴＲ−７０１、アデカプルロニックＴＲ−７０２、アデカプルロニックＴＲ−７０４、アデカプルロニックＴＲ−９１３Ｒ（以上、旭電化社製）、ユニルーブ３２ＴＹ−６５ＢＩ（日本油脂社製）等が挙げられる。
ポリエチレングリコールを含まないＰＰＧ誘導体としては、ポリプロピレングリコール（以下、ＰＰＧと略記する）、ポリオキシプロピレンアルキルエーテル（以下、ＰＯＰアルキルエーテルと略記する）等が挙げられる。ＰＰＧとしては、例えば分子量１２００以下のＰＰＧが好ましい。分子量１２００以下のＰＰＧの市販品としては、ユニオールＤ−７００（日本油脂社製）、ニューポールＰＰ−４００（三洋化成社製）等が挙げられる。ＰＯＰアルキルエーテルの市販品としては、ユニルーブＭＢ−２（日本油脂社製）等が挙げられる。
一般式（Ｉ）
（式中、ａ、ｂ及びｃは同一又は異なって、１〜２００の整数を表す）で表されるＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物の市販品としては、プルロニック２５Ｒ−１、プルロニック２５Ｒ−２（以上、旭電化社製）、ＢＬＡＵＮＯＮ ＥＰ−０４８０、ＢＬＡＵＮＯＮ ＥＰ−０６７０、ＢＬＡＵＮＯＮ ＥＰ−１４６１（以上、青木油脂社製）等が挙げられる。
Ｃ９以下のＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテルにおけるアルキルとしては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル等が挙げられる。Ｃ９以下のＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテルの市販品としては、ユニルーブ５０ＭＢ−２６、ユニルーブ５０ＭＢ−７２（以上、日本油脂社製）等が挙げられる。
本発明においては、界面活性剤Ａは１種のみならず、２種以上を組み合わせて用いても良い。
本発明においては、界面活性剤Ａは１種のみならず、２種以上を組み合わせて用いても良い。
本出願により、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素によるｓｄＬＤＬ中のコレステロールの反応を抑制し、ＬｇＬＤＬ中のコレステロールの反応を行わせる作用を示す界面活性剤が存在することを開示された当業者は、上記に例示したもの以外でも、下記の判定により容易に本発明の界面活性剤Ａの具体例を把握し、選択することができる。該方法により選択される界面活性剤も本願発明の界面活性剤Ａに包含される。
界面活性剤Ａの判定は、例えば以下に記載の方法で行うことができる。
１）リポ蛋白分画の分離
血清中のＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ、ＬｇＬＤＬ、ｓｄＬＤＬの各分画を比重により分離精製する。具体的には、「新生化学実験講座４」（東京化学同人）に記載の超遠心法に従い、ヒト血清よりＨＤＬ（比重１．０６３以上）、ｓｄＬＤＬ（比重１．０４４〜１．０６３）、ＬｇＬＤＬ（比重１．００６〜１．０４４）、ＶＬＤＬ及びＣＭ（比重１．００６以下）の４つのリポ蛋白分画を分取する。
２）界面活性剤Ａの判定用試薬
例１
緩衝液、例えばＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）
コレステロールエステル加水分解酵素、例えばＬＰＬ３
コレステロール酸化酵素、例えばＣＨＯ−ＰＥＬ
過酸化水素測定試薬、例えばパーオキシダーゼ、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）及び４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）
検討すべき界面活性剤
例２
緩衝液、例えばＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）
コレステロールエステル加水分解酵素、例えばＬＰＬ３
コレステロール脱水素酵素、例えばＣＨＤＨ５
酸化型補酵素、例えばＮＡＤ
［必要に応じて、還元型補酵素測定試薬、例えば２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム モノナトリウム塩（ＷＳＴ−３）］
検討すべき界面活性剤
例３
緩衝液、例えばＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）
コレステロールエステル加水分解酵素、例えばＬＰＬ３
コレステロール脱水素酵素、例えばＣＨＤＨ５
酸化型補酵素、例えばＮＡＤ
還元型補酵素酸化酵素、例えばＮＡＤＨ ｏｘｉｄａｓｅ
過酸化水素測定試薬、例えばパーオキシダーゼ、ＥＭＳＥ及び４−ＡＡ
検討すべき界面活性剤
なお、上記各試薬には、必要に応じて、後述の水性媒体、安定化剤、防腐剤、影響物質消去剤、反応促進剤等を含有させることもできる。
３）界面活性剤Ａ判定方法
各リポ蛋白分画を検体とし反応セルへ（２μＬ）添加し、次いで上記２）に記載した試薬（０．１５ｍＬ）を添加し反応を開始させ、３７℃で５分間加温し、反応液の吸光度が直線的に増加する時間、例えば反応５分後の反応液の吸光度変化（ΔＥリポ蛋白分画）を測定する。
１）リポ蛋白分画の分離
血清中のＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ、ＬｇＬＤＬ、ｓｄＬＤＬの各分画を比重により分離精製する。具体的には、「新生化学実験講座４」（東京化学同人）に記載の超遠心法に従い、ヒト血清よりＨＤＬ（比重１．０６３以上）、ｓｄＬＤＬ（比重１．０４４〜１．０６３）、ＬｇＬＤＬ（比重１．００６〜１．０４４）、ＶＬＤＬ及びＣＭ（比重１．００６以下）の４つのリポ蛋白分画を分取する。
２）界面活性剤Ａの判定用試薬
例１
緩衝液、例えばＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）
コレステロールエステル加水分解酵素、例えばＬＰＬ３
コレステロール酸化酵素、例えばＣＨＯ−ＰＥＬ
過酸化水素測定試薬、例えばパーオキシダーゼ、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）及び４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）
検討すべき界面活性剤
例２
緩衝液、例えばＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）
コレステロールエステル加水分解酵素、例えばＬＰＬ３
コレステロール脱水素酵素、例えばＣＨＤＨ５
酸化型補酵素、例えばＮＡＤ
［必要に応じて、還元型補酵素測定試薬、例えば２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム モノナトリウム塩（ＷＳＴ−３）］
検討すべき界面活性剤
例３
緩衝液、例えばＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）
コレステロールエステル加水分解酵素、例えばＬＰＬ３
コレステロール脱水素酵素、例えばＣＨＤＨ５
酸化型補酵素、例えばＮＡＤ
還元型補酵素酸化酵素、例えばＮＡＤＨ ｏｘｉｄａｓｅ
過酸化水素測定試薬、例えばパーオキシダーゼ、ＥＭＳＥ及び４−ＡＡ
検討すべき界面活性剤
なお、上記各試薬には、必要に応じて、後述の水性媒体、安定化剤、防腐剤、影響物質消去剤、反応促進剤等を含有させることもできる。
３）界面活性剤Ａ判定方法
各リポ蛋白分画を検体とし反応セルへ（２μＬ）添加し、次いで上記２）に記載した試薬（０．１５ｍＬ）を添加し反応を開始させ、３７℃で５分間加温し、反応液の吸光度が直線的に増加する時間、例えば反応５分後の反応液の吸光度変化（ΔＥリポ蛋白分画）を測定する。
各リポ蛋白分画の代わりに生理食塩水を検体として用いて、同様の測定を行い、吸光度変化（ΔＥブランク）を算出し、各リポ蛋白分画における「反応吸光度１」を下記（式１）により算出する。
各リポ蛋白分画について、日立７１７０Ｓ形自動分析装置を用いて、総コレステロール定量用キットであるデタミナーＣ ＴＣ（協和メデックス社製）を用いて、同様にして、「反応吸光度２」を算出する。
ついで、各リポ蛋白分画の反応率を下記（式２）より算出する。
ｓｄＬＤＬ分画における反応率が低く、ＬｇＬＤＬ分画における反応率が高い界面活性剤を選択し、好ましくは、ｓｄＬＤＬ分画における反応率が低く、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ及びＬｇＬＤＬ分画における反応率が高い界面活性剤を、界面活性剤Ａとして選択する。
コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素によるＨＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ、ＣＭ−Ｃ及びＬｇＬＤＬ−Ｃの反応に比較して、該コレステロールエステル加水分解酵素及び該コレステロール酸化酵素若しくは該コレステロール脱水素酵素−該酸化型補酵素によるｓｄＬＤＬ−Ｃの反応を優先的に抑制するとは、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ及びＬｇＬＤＬの各分画中のコレステロールの反応率に対するｓｄＬＤＬ分画中のコレステロールの反応率が小さいことをいい、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ及びＬｇＬＤＬの各分画中のコレステロールの反応率に対するｓｄＬＤＬ分画中のコレステロールの反応率の割合が好ましくは５０％以下であり、より好ましくは２０％以下であり、特に好ましくは１０％以下である。
なお、使用する酵素の種類及び濃度等の反応条件が異なると界面活性剤の反応性が異なる場合もあるが、設定した条件で検討対象の界面活性剤が本発明に界面活性剤Ａとして使用できるか否か判断できる。
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量方法における界面活性剤Ａの濃度は、好ましくはｓｄＬＤＬ以外のリポ蛋白、即ち、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ及びＬｇＬＤＬ中のコレステロールを優先的に除去し得る濃度であり、反応液中での濃度が０．０００１〜１％であることが好ましく、０．０００５〜０．５％であることがより好ましい。
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量方法における界面活性剤Ａの濃度は、好ましくはｓｄＬＤＬ以外のリポ蛋白、即ち、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ及びＬｇＬＤＬ中のコレステロールを優先的に除去し得る濃度であり、反応液中での濃度が０．０００１〜１％であることが好ましく、０．０００５〜０．５％であることがより好ましい。
本発明におけるｓｄＬＤＬ−Ｃの反応を引き起こす試薬は、検体とコレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素とを界面活性剤Ａの存在下に反応させて、ｓｄＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを除去した後の反応液中に残存するｓｄＬＤＬ−Ｃの、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による反応を可能とする試薬である。具体的には、界面活性剤Ａの存在下での、ｓｄＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを除去するのに使用したコレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素によるｓｄＬＤＬ−Ｃの反応抑制を解除する界面活性剤（以下、該界面活性剤を界面活性剤Ｂと略記する）及び界面活性剤Ａの存在下にｓｄＬＤＬ−Ｃとの反応を可能とする酵素などが挙げられる。
本発明における界面活性剤Ｂとしては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル（以下、ＰＯＥアルキルエーテルと略記する）、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル（該アルキルは炭素数１０以上のアルキル）（以下、Ｃ１０以上のＰＯＥ・ＰＯＡアルキルエーテルと略記する）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（以下、ＰＯＥアルキルフェニルエーテルと略記する）、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル（以下、ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルフェニルエーテルと略記する）、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル（以下、ＰＯＥ多環フェニルエーテルと略記する）、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル（以下、ＰＯＥ・ＰＯＡ多環フェニルエーテルと略記する）、一般式（ＩＩ）
（式中、ｄ、ｅ及びｆは同一又は異なって、１〜２００の整数を表す）で表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物（以下、ＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物と略記する）、及び、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアミン（以下ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアミンと略記する）等が挙げられる。
ＰＯＥアルキルエーテルとしては、ＨＬＢが１５．０未満のＰＯＥアルキルエーテル（該アルキルは炭素数２０以下のアルキル）が好ましい。ＨＬＢが１５．０未満のＰＯＥアルキルエーテル（該アルキルは炭素数２０以下のアルキル）におけるアルキルとしては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、イソデシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘキシデシル、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル、オクチルドデシル等が挙げられる。ＨＬＢが１５．０未満のＰＯＥアルキルエーテル（該アルキルは炭素数２０以下のアルキル）の市販品としてはモリノールＬ−８０（ＨＬＢ１３．１；炭素数１２）（モーリン化学社製）、エマルミンＮＬ−８０（ＨＬＢ１３．１；炭素数１２）、エマルミンＮＬ−９０（ＨＬＢ１３．６；炭素数１２）、エマルミンＮＬ−１００（ＨＬＢ１４．０；炭素数１２）、エマルミンＮＬ−１１０（ＨＬＢ１４．４；炭素数１２）（以上、三洋化成社製）、ノイゲンＴＤＳ−８０（ＨＬＢ１３．３；炭素数１３）、ノイゲンＴＤＳ−１２０（ＨＬＢ１４．８；炭素数１３）（以上、第一工業製薬社製）、ＥＭＡＬＥＸ１６１５（ＨＬＢ１３．０；炭素数１６）、ＥＭＡＬＥＸ１８２０（ＨＬＢ１４．０；炭素数１８）、ＥＭＡＬＥＸ ＯＤ−１６（ＨＬＢ１２．０；炭素数２０）（以上、日本エマルジョン社製）等があげられる。
Ｃ１０以上のＰＯＥ・ＰＯＡアルキルエーテルとしては、ＨＬＢが１５．０未満かつアルキルの炭素数が１０以上２０以下であるＰＯＥ・ＰＯＡアルキルエーテルが好ましい。ＨＬＢが１５．０未満かつアルキルの炭素数が１０以上２０以下であるＰＯＥ・ＰＯＡアルキルエーテルにおけるアルキルとしては、例えばデシル、イソデシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘキシデシル、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル、オクチルドデシル等が挙げられる。ＨＬＢが１５．０未満かつアルキルの炭素数が１０以上２０以下であるＰＯＥ・ＰＯＡアルキルエーテルにおけるポリオキシアルキレンとしては、ポリオキシエチレン以外の例えば、ポリオキシプロピレン、ポリオキシブチレン等が挙げられる。ＨＬＢが１５．０未満かつアルキルの炭素数が１０以上２０以下であるＰＯＥ・ＰＯＡアルキルエーテルの市販品としては、例えばワンダサーフＩＤ−５０（ＨＬＢ１０．５；炭素数１０）、ワンダサーフＩＤ−７０（ＨＬＢ１２．１；炭素数１０）、ワンダサーフＩＤ−９０（ＨＬＢ１３．３；炭素数１０）、ワンダサーフＳ−８００（ＨＬＢ１２．３；炭素数１３）、ワンダサーフＳ−１０００（ＨＬＢ１３．２；炭素数１３）、ワンダサーフＳ−１４００（ＨＬＢ１４．４；炭素数１３）（以上、青木油脂社製）等が挙げられる。
ＰＯＥアルキルフェニルエーテルとしては、ＨＬＢが１６．０未満であるＰＯＥアルキルフェニルエーテルが好ましい。ＨＬＢが１６．０未満のＰＯＥアルキルフェニルエーテルにおけるアルキルとしては、炭素数１〜３０の、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル（ベヘニル）、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、トリアコンシル等が挙げられる。ＨＬＢが１６．０未満のＰＯＥアルキルフェニルエーテルの市販品としてはノニオンＮＳ−２１０（ＨＬＢ１３．３）、ノニオンＮＳ−２１２（ＨＬＢ１４．１）、ノニオンＮＳ−２１５（ＨＬＢ１５．０）、ノニオンＨＳ−２１０（ＨＬＢ１３．６）（以上、日本油脂社製）、エマルゲン９１１（ＨＬＢ１３．７）、エマルゲン９１３（ＨＬＢ１４．５）（以上、花王社製）等が挙げられる。
ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルフェニルエーテルとしては、ＨＬＢが１６．０未満であるＰＯＥ・ＰＯＡアルキルフェニルエーテルが好ましい。ＨＬＢが１６．０未満のＰＯＥ・ＰＯＡアルキルフェニルエーテルにおけるアルキルとしては、炭素数１〜３０の、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル（ベヘニル）、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、トリアコンシル等が挙げられる。ＨＬＢが１６．０未満のＰＯＥ・ＰＯＡアルキルフェニルエーテルにおけるポリオキシアルキレンとしては、ポリオキシエチレン以外の例えば、ポリオキシプロピレン、ポリオキシブチレン等が挙げられる。ＨＬＢが１６．０未満のＰＯＥ・ＰＯＡアルキルフェニルエーテルの市販品としては、アクロネセスＫＰ−１８９Ｒ、ディスパノールＬＳ−１００（以上、日本油脂社製）、エマルゲンＬ−４０（花王社製）等が挙げられる。
ＰＯＥ多環フェニルエーテルとしては、ＨＬＢが１３．０未満であるＰＯＥ多環フェニルエーテルが好ましい。ＨＬＢが１３．０未満であるＰＯＥ多環フェニルエーテルにおける多環フェニルとしては、基内に１つの芳香環を有する基（置換基）が２つ以上置換したフェニル基、基内に２つ以上の芳香環を有する基（置換基）が１つまたは複数置換したフェニル基等が挙げられる。基内に１つの芳香環を有する基としては、例えばベンジル、１−（フェニル）エチル等が挙げられる。基内に２つ以上の芳香環を有する基としては、例えばナフチル等が挙げられる。ＨＬＢが１３．０未満であるＰＯＥ多環フェニルエーテルの市販品としては、エマルゲンＡ−６０（ＨＬＢ１２．８）（花王社製）、ＢＬＡＵＮＯＮ ＤＳＰ−９（ＨＬＢ１１．４）、ＢＬＡＵＮＯＮ ＤＳＰ−１２．５（ＨＬＢ１２．８）（以上、青木油脂社製）、ニューコール２６０７（ＨＬＢ１１．８）（日本乳化剤社製）等が挙げられる。
ＰＯＥ・ＰＯＡ多環フェニルエーテルとしては、ＨＬＢが１３．０未満であるＰＯＥ・ＰＯＡ多環フェニルエーテルが好ましい。ＨＬＢが１３．０未満であるＰＯＥ・ＰＯＡ多環フェニルエーテルにおける多環フェニルとしては、基内に１つの芳香環を有する基（置換基）が２つ以上置換したフェニル基、基内に２つ以上の芳香環を有する基（置換基）が１つまたは複数置換したフェニル基等が挙げられる。基内に１つの芳香環を有する基としては、例えばベンジル、１−（フェニル）エチル等が挙げられる。基内に２つ以上の芳香環を有する基としては、例えばナフチル等が挙げられる。ＨＬＢが１３．０未満であるＰＯＥ・ＰＯＡ多環フェニルエーテルにおけるポリオキシアルキレンとしては、ポリオキシエチレン以外の例えば、ポリオキシプロピレン、ポリオキシブチレン等が挙げられる。ＨＬＢが１３．０未満であるＰＯＥ・ＰＯＡ多環フェニルエーテルの市販品としてはニューコール７０７Ｆ（ＨＬＢ１２．４）（以上、日本乳化剤社製）等が挙げられる。
一般式（ＩＩ）
（式中、ｄ、ｅ及びｆは同一又は異なって、１〜２００の整数を表す）で表されるＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物としては、ＰＯＰの分子量が１２００以上かつＰＯＥ含量が６０％以下であるＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物が好ましい。ＰＯＰの分子量が１２００以上かつＰＯＥ含量が６０％以下であるＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物の市販品としてはプロノン２０４（ＰＯＰの分子量：２０００；ＰＯＥ含量：４０％）（日本油脂社製）、ニューポールＰＥ−６２（ＰＯＰの分子量：１７５０；ＰＯＥ含量：２０％）、ニューポールＰＥ−６４（ＰＯＰの分子量：１７５０；ＰＯＥ含量：４０％）、ニューポールＰＥ−７１（ＰＯＰの分子量：２０５０；ＰＯＥ含量：１０％）、ニューポールＰＥ−７５（ＰＯＰの分子量：２０５０；ＰＯＥ含量：５０％）（以上、三洋化成社製）、プルロニックＰ−８４（ＰＯＰの分子量：２２５０；ＰＯＥ含量：４０％）、プルロニックＰ−８５（ＰＯＰの分子量：２２５０；ＰＯＥ含量：５０％）、プルロニックＰ−１０３（ＰＯＰの分子量：３２５０；ＰＯＥ含量：３０％）（以上、旭電化社製）等が挙げられる。
ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアミンにおけるアルキルとしては、炭素数１〜３０の、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル（ベヘニル）、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、トリアコンシル等が挙げられる。ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアミンにおけるポリオキシアルキレンとしては、ポリオキシエチレン以外の例えば、ポリオキシプロピレン、ポリオキシブチレン等が挙げられる。ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアミンの市販品としてはＢＬＡＵＮＯＮ ＬＰＥ１００７（青木油脂社製）、アルキル（Ｃ１６）アミンＥＯ２０ＰＯ１０（日本油脂社製）等が挙げられる。
本発明においては、界面活性剤Ｂを１種のみならず、２種以上を組み合わせて用いても良い。
なお、当業者は、本発明の実施例２に示した方法等により、ｓｄＬＤＬ分画の反応率を高める界面活性剤を、界面活性剤Ｂとして適宜把握・選択することができる。使用する酵素の種類及び濃度等の反応条件が異なると界面活性剤の反応性が異なる場合もあるが、設定した条件で検討対象の界面活性剤が本発明に界面活性剤Ｂとして使用できるか否か判断することができる。
なお、当業者は、本発明の実施例２に示した方法等により、ｓｄＬＤＬ分画の反応率を高める界面活性剤を、界面活性剤Ｂとして適宜把握・選択することができる。使用する酵素の種類及び濃度等の反応条件が異なると界面活性剤の反応性が異なる場合もあるが、設定した条件で検討対象の界面活性剤が本発明に界面活性剤Ｂとして使用できるか否か判断することができる。
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量方法における界面活性剤Ｂの濃度は、ｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とする濃度であり、反応液中での濃度が０．００１〜５％であることが好ましく、０．０１〜０．５％であることがより好ましい。
界面活性剤Ａの存在下にｓｄＬＤＬ−Ｃとの反応を可能とする酵素としては、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素又はコレステロール脱水素酵素等が挙げられるが、コレステロールエステル加水分解酵素が好ましい。コレステロールエステル加水分解酵素を界面活性剤Ｂの代わりに用いる場合、該コレステロールエステル加水分解酵素としては、工程(i)で使用されるコレステロールエステル加水分解酵素と同種のコレステロールエステル加水分解酵素であっても異種のコレステロールエステル加水分解酵素であってもよい。同種のコレステロールエステル加水分解酵素を用いる場合には、工程（ii）において、残存するｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とする量のコレステロールエステル加水分解酵素を添加すればよい。また、異種のコレステロールエステル加水分解酵素を用いる場合には、残存するｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とするコレステロールエステル加水分解酵素であれば特に制限はない。
界面活性剤Ａの存在下にｓｄＬＤＬ−Ｃとの反応を可能とする酵素としては、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素又はコレステロール脱水素酵素等が挙げられるが、コレステロールエステル加水分解酵素が好ましい。コレステロールエステル加水分解酵素を界面活性剤Ｂの代わりに用いる場合、該コレステロールエステル加水分解酵素としては、工程(i)で使用されるコレステロールエステル加水分解酵素と同種のコレステロールエステル加水分解酵素であっても異種のコレステロールエステル加水分解酵素であってもよい。同種のコレステロールエステル加水分解酵素を用いる場合には、工程（ii）において、残存するｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とする量のコレステロールエステル加水分解酵素を添加すればよい。また、異種のコレステロールエステル加水分解酵素を用いる場合には、残存するｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とするコレステロールエステル加水分解酵素であれば特に制限はない。
また、工程（ii）において、ｓｄＬＤＬ−Ｃの反応を引き起こす試薬としては、酵素と界面活性剤の組み合わせを用いることもできる。該組み合わせは、ｓｄＬＤＬ以外のリポ蛋白を除去した後の反応液に残存するｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とする組み合わせであれば特に制限はない。該組み合わせを構成する酵素及び界面活性剤は、単独で、残存するｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とする必要はなく、組み合わされて使用されることにより、残存するｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とすればよい。
ＨＬＢとは、親水性−親油性均衡値を意味する。本発明に用いられる界面活性剤、例えばＰＯＥ多環フェニルエーテルのＨＬＢは、界面活性剤ハンドブック（吉田 時行ら著 工業図書株式会社）や新界面活性剤（堀口 博著 三共出版株式会社）に記載の方法で算出することが可能である。また、該ＨＬＢとしては、各種界面活性剤の製造メーカーのカタログやパンフレットに記載されているＨＬＢ値を利用することも可能である。
（ｓｄＬＤＬ−Ｃ定量方法）
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量方法は、下記工程(i)〜(iii)を含む方法である。
（i）界面活性剤Ａを含有する反応液中で、検体にコレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素、或いは、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素及び酸化型補酵素を作用させ、該検体中のｓｄＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを除去する工程
（ii）前記工程（i）後の反応液に残存するｓｄＬＤＬ−Ｃの反応を引き起こす試薬を添加し、過酸化水素または還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素又は還元型補酵素を測定する工程
（iii）既知濃度のｓｄＬＤＬ−Ｃを含有する標準検体を用いて、前記（i）及び（ii）の工程を行い過酸化水素または還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素又は還元型補酵素を測定し、ｓｄＬＤＬ−Ｃ濃度と過酸化水素又は還元型補酵素濃度に係る測定値とを関連づけ、該検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃ濃度を決定する工程
また、工程(iii)を行うことなく、工程(i)及び工程(ii)を行うことにより、検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃの検出方法とすることもできる。
（ｓｄＬＤＬ−Ｃ定量方法）
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量方法は、下記工程(i)〜(iii)を含む方法である。
（i）界面活性剤Ａを含有する反応液中で、検体にコレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素、或いは、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素及び酸化型補酵素を作用させ、該検体中のｓｄＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを除去する工程
（ii）前記工程（i）後の反応液に残存するｓｄＬＤＬ−Ｃの反応を引き起こす試薬を添加し、過酸化水素または還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素又は還元型補酵素を測定する工程
（iii）既知濃度のｓｄＬＤＬ−Ｃを含有する標準検体を用いて、前記（i）及び（ii）の工程を行い過酸化水素または還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素又は還元型補酵素を測定し、ｓｄＬＤＬ−Ｃ濃度と過酸化水素又は還元型補酵素濃度に係る測定値とを関連づけ、該検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃ濃度を決定する工程
また、工程(iii)を行うことなく、工程(i)及び工程(ii)を行うことにより、検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃの検出方法とすることもできる。
工程(i)における検体中のｓｄＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールの除去方法としては、例えば、該コレステロールから変換された過酸化水素、又は、該コレステロールより生成させた還元型補酵素を除去する方法が挙げられる。該除去方法としては、該コレステロールより過酸化水素を生成させ、次いで該過酸化水素を除去する方法が好ましい。
過酸化水素の除去は、例えば過酸化水素除去試薬を用いることにより行うことができる。過酸化水素除去方法としては、過酸化水素にカタラーゼを作用させるか、又は、過酸化水素に、過酸化活性物質と、酸化カップリング発色反応に使用される２つの酸化カップリング色原体の一方との組み合わせを作用させる方法が好ましい。
還元型補酵素の除去は、例えば還元型補酵素に還元型補酵素酸化酵素を作用させ、生成する過酸化水素を過酸化水素除去試薬を用いることにより除去することにより行うことができる。
還元型補酵素の除去は、例えば還元型補酵素に還元型補酵素酸化酵素を作用させ、生成する過酸化水素を過酸化水素除去試薬を用いることにより除去することにより行うことができる。
過酸化水素除去試薬としては、ｓｄＬＤＬ−Ｃ以外のリポ蛋白のコレステロールから生成する過酸化水素を、ｓｄＬＤＬ−Ｃから生成する過酸化水素の測定に影響を及ぼさない物質に変換する試薬であれば特に制限はないが、例えばカタラーゼを含有する試薬、過酸化活性物質と酸化カップリング型発色反応に使用される２つの酸化カップリング型色原体の一方とを含有する試薬等が挙げられる。過酸化活性物質としては、例えばパーオキシダーゼ等が挙げられる。酸化カップリング型発色反応に使用される２つの酸化カップリング型色原体の一方とは、具体的には、後述の「酸化カップリング発色型色原体」におけるカプラー、又は、アニリン類若しくはフェノール類が例示される。本明細書において、「もう片方の酸化カップリング型色原体」なる用語は、「酸化カップリング型発色反応に使用される２つの酸化カップリング型色原体の一方」なる用語と対で使用され、例えば、前者がカップラーを意味する場合は、後者はフェノール類又はアニリン類を示し、前者がフェノール類又はアニリン類を意味する場合は、後者は、カップラーを示す。
過酸化水素除試薬として、カタラ−ゼを含有する試薬を用いる場合、カタラーゼの濃度としては、０．００１〜５０００ｋＵ/Ｌが好ましく、０．０１〜１０００ｋＵ/Ｌがより好ましい。また、本発明の工程(i)において、過酸化水素除去試薬としてカタラーゼを用いる場合は、工程（ii）においてカタラーゼ阻害剤を共存させることが好ましい。カタラーゼ阻害剤としては、アジ化ナトリウム、Ｈ2Ｓ、ＨＣＮ、ＮＨ2ＯＨ、３−アミノ−１，２，４−トリアゾール等が挙げられ、使用する濃度としてはカタラーゼ活性を阻害し、工程（ii）で生成する過酸化水素の測定に影響を及ぼさない濃度であれば特に限定はされないが、好ましくは０．５〜６０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１〜３０ｍｍｏｌ／Ｌである。
過酸化水素除去試薬として、過酸化活性物質と酸化カップリング型発色反応に使用される２つの酸化カップリング型色原体の一方とを用いる場合、過酸化活性物質としてはパーオキシダーゼ等が挙げられる。パーオキシダ−ゼの濃度は０．０１〜５００ｋＵ／Ｌが好ましく、１〜１００ｋＵ／Ｌがより好ましい。酸化カップリング型発色反応に使用される２つの酸化カップリング型色原体の一方の濃度としては、０．０１〜１０ｇ／Ｌが好ましい。
尚、本発明において、工程(i)におけるｓｄＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールの除去とは、該コレステロールから生成した過酸化水素又は還元型補酵素を、他の物質に変換して消去することにとどまらない。例えば、過酸化水素と還元型補酵素の分別測定が可能な場合、該コレステロールから生成した過酸化水素又は還元型補酵素を他の物質に変換する必要はない。例えば工程(i)でｓｄＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールから還元型補酵素を生成させ、工程(ii)でｓｄＬＤＬ中のコレステロールから過酸化水素を生成させる場合、工程(i)で生成した還元型補酵素を他の物質に変換する必要はない。更に、本発明は、工程(i)で生成した過酸化水素又は還元型補酵素を測定し、得られた測定値を基に、工程（ii）で生成した過酸化水素又は還元型補酵素を算出することにより、検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃを定量することも包含する。
ここで、過酸化水素の測定は、例えば過酸化水素電極や後述の過酸化水素測定試薬を用いて行うことができるが、過酸化水素に過酸化活性物質と酸化発色型色原体とを作用させて色素を生成させ、該色素の吸光度を測定することにより行われる方法が好ましい。
還元型補酵素の測定は、例えば還元型補酵素の吸収極大付近の波長での吸光度測定や、後述の還元型補酵素測定試薬を用いた測定により行うことができる。
還元型補酵素の測定は、例えば還元型補酵素の吸収極大付近の波長での吸光度測定や、後述の還元型補酵素測定試薬を用いた測定により行うことができる。
過酸化水素測定用試薬は、生成した過酸化水素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素、光等が挙げられるが、色素が好ましい。検出可能な物質が色素の場合には、過酸化水素測定用試薬は、酸化発色型色原体及びパーオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含有する。酸化発色型色原体としては、例えば後述の酸化発色型色原体が挙げられる。検出可能な物質が光の場合には、過酸化水素測定用試薬は、化学発光物質を含有する。化学発光物質としては、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル等が挙げられる。
過酸化水素測定用試薬として、酸化発色型色原体及び過酸化活性物質を含有する試薬を用いる場合には、過酸化水素は、過酸化活性物質の存在下に酸化発色型色原体と反応して色素を生成し、生成した色素を測定することにより、過酸化水素を測定することができる。また、化学発光物質を含有する過酸化水素測定用試薬を用いる場合には、過酸化水素は、化学発光物質と反応して光を生じ、生じた光を測定することにより、過酸化水素を測定することができる。
酸化発色型色原体としては、例えばロイコ型色原体、酸化カップリング発色型色原体等が挙げられる。
ロイコ型色原体は、過酸化水素及び過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。具体的には、１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩（ＤＡ−６４）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）等が挙げられる。
ロイコ型色原体は、過酸化水素及び過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。具体的には、１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩（ＤＡ−６４）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）等が挙げられる。
酸化カップリング発色型色原体は、過酸化水素及び過酸化活性物質の存在下、２つの化合物が酸化的カップリングして色素を生成する物質である。
２つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせ等が挙げられる。
カプラーとしては、例えば４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラジン等が挙げられる。
２つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせ等が挙げられる。
カプラーとしては、例えば４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラジン等が挙げられる。
アニリン類としては、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ビス（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４−フルオロ−３，５−ジメトキシアニリン（Ｆ−ＤＡＯＳ）等が挙げられる。
フェノール類としては、フェノール、４−クロロフェノール、３−メチルフェノール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等が挙げられる。
還元型補酵素測定試薬は、生成した還元型補酵素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素等が挙げられる。検出可能な物質が色素の場合には、還元型補酵素測定試薬は、還元発色型色原体を含有する。還元発色型色原体としては、例えば３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム ブロミド（ＭＴＴ）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム モノナトリウム塩（ＷＳＴ−１）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム モノナトリウム塩（ＷＳＴ−３）等が挙げられる。
還元型補酵素測定試薬は、生成した還元型補酵素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素等が挙げられる。検出可能な物質が色素の場合には、還元型補酵素測定試薬は、還元発色型色原体を含有する。還元発色型色原体としては、例えば３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム ブロミド（ＭＴＴ）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム モノナトリウム塩（ＷＳＴ−１）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム モノナトリウム塩（ＷＳＴ−３）等が挙げられる。
過酸化水素の測定において、過酸化活性物質としては、例えばパーオキシダーゼ等が挙げられる。過酸化活性物質の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、過酸化活性物質としてパーオキシダーゼを用いる場合は、１〜１００ｋＵ／Ｌが好ましい。また、酸化発色型色原体の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、０．０１〜１０ｇ／Ｌが好ましい。
本発明において、ｓｄＬＤＬ−Ｃの測定は水性媒体中で行われることが好ましい。水性媒体としては、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられるが、緩衝液が好ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。
グッドの緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔（Ｈ）ＥＰＰＳ〕、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等が挙げられる。緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、０．００１〜２．０ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．００５〜１．０ｍｏｌ／Ｌがより好ましい。
グッドの緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔（Ｈ）ＥＰＰＳ〕、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等が挙げられる。緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、０．００１〜２．０ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．００５〜１．０ｍｏｌ／Ｌがより好ましい。
試料中のｓｄＬＤＬ−Ｃ濃度を決定するために使用する検量線は、例えば、既知濃度のｓｄＬＤＬ−Ｃを含有する標準検体を用いて、本発明の工程(i)及び工程(ii)を行い過酸化水素または還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素又は還元型補酵素を測定し、その測定値と使用したｓｄＬＤＬ−Ｃ濃度から作成することができる。
本発明の工程(i)及び工程(ii)は、例えば、１０〜５０℃で、好ましくは、２０〜４０℃で、１〜３０分間、好ましくは２〜１５分間行う。
（ｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キット）
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットは、本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量方法に使用され得る。ｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットの形態としては、本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量方法を可能とする形態であれば特に制限はなく、２試薬系、３試薬系等のいずれの形態であってもよいが、２試薬系が好ましい。
本発明の工程(i)及び工程(ii)は、例えば、１０〜５０℃で、好ましくは、２０〜４０℃で、１〜３０分間、好ましくは２〜１５分間行う。
（ｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キット）
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットは、本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量方法に使用され得る。ｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットの形態としては、本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量方法を可能とする形態であれば特に制限はなく、２試薬系、３試薬系等のいずれの形態であってもよいが、２試薬系が好ましい。
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットとしては、例えば以下のキットが挙げられる。
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素及び過酸化水素除去試薬を含有する第一試薬と、ｓｄＬＤＬ−Ｃの反応を引き起こす試薬及び過酸化水素測定試薬を含有する第二試薬とを含有することを特徴とする、検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キット。
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素及び過酸化水素除去試薬を含有する第一試薬と、ｓｄＬＤＬ−Ｃの反応を引き起こす試薬及び過酸化水素測定試薬を含有する第二試薬とを含有することを特徴とする、検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キット。
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素を含有する第一試薬と、ｓｄＬＤＬ−Ｃの反応を引き起こす試薬を含有する第二試薬とを含有することを特徴とする、検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キット。
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素及び還元型補酵素測定試薬を含有する第一試薬と、ｓｄＬＤＬ−Ｃの反応を引き起こす試薬を含有する第二試薬とを含有することを特徴とする、ｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キット。
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素及び還元型補酵素測定試薬を含有する第一試薬と、ｓｄＬＤＬ−Ｃの反応を引き起こす試薬を含有する第二試薬とを含有することを特徴とする、ｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キット。
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素酸化酵素及び過酸化水素除去試薬素を含有する第一試薬と、ｓｄＬＤＬ−Ｃの反応を引き起こす試薬及び過酸化水素測定試薬を含有する第二試薬とを含有することを特徴とする、検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キット。
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素及び過酸化水素除去試薬を含有する第一試薬と、界面活性剤Ｂ及び過酸化水素測定試薬を含有する第二試薬とを含有することを特徴とする、ｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キット。
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素及び過酸化水素除去試薬を含有する第一試薬と、界面活性剤Ｂ及び過酸化水素測定試薬を含有する第二試薬とを含有することを特徴とする、ｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キット。
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素を含有する第一試薬と、界面活性剤Ｂを含有する第二試薬とを含有することを特徴とする、ｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キット。
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素及び還元型補酵素測定試薬を含有する第一試薬と、界面活性剤Ｂを含有する第二試薬とを含有することを特徴とする、ｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キット。
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素及び還元型補酵素測定試薬を含有する第一試薬と、界面活性剤Ｂを含有する第二試薬とを含有することを特徴とする、ｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キット。
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素酸化酵素及び過酸化水素除去試薬を含有する第一試薬と、界面活性剤Ｂ及び過酸化水素測定試薬を含有する第二試薬とを含有することを特徴とする、ｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キット。
第一試薬及び第二試薬からなる２試薬系のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットにおいては、コレステロールエステル加水分解酵素は第一試薬に含有されるが、第一及び第二試薬両方に含有されてもよい。コレステロール酸化酵素は、第一試薬に含有されるが、第一及び第二試薬両方に含有されてもよい。コレステロール脱水素酵素は、第一試薬に含有されるが、第一及び第二試薬両方に含有されてもよい。
第一試薬及び第二試薬からなる２試薬系のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットにおいては、コレステロールエステル加水分解酵素は第一試薬に含有されるが、第一及び第二試薬両方に含有されてもよい。コレステロール酸化酵素は、第一試薬に含有されるが、第一及び第二試薬両方に含有されてもよい。コレステロール脱水素酵素は、第一試薬に含有されるが、第一及び第二試薬両方に含有されてもよい。
界面活性剤Ａは、第一試薬に含有されることが好ましい。
酸化型補酵素は、第一試薬に含有されるが、第一及び第二試薬両方に含有されてもよい。還元型補酵素酸化酵素は、第一試薬に含有されるが、第一及び第二試薬両方に含有されてもよい。
過酸化水素除去試薬は、第一試薬に含有されることが好ましい。過酸化水素除去試薬としてカタラーゼを用いる場合、カタラーゼは第一試薬に含有されることが好ましく、カタラーゼ阻害剤は、第二試薬に含有されることが好ましい。過酸化水素除去試薬としてパーオキシダーゼと酸化カップリング型発色反応に使用される２つの酸化カップリング型色原体の一方との組み合わせを用いる場合、該組み合わせは第一試薬に含有されることが好ましい。
酸化型補酵素は、第一試薬に含有されるが、第一及び第二試薬両方に含有されてもよい。還元型補酵素酸化酵素は、第一試薬に含有されるが、第一及び第二試薬両方に含有されてもよい。
過酸化水素除去試薬は、第一試薬に含有されることが好ましい。過酸化水素除去試薬としてカタラーゼを用いる場合、カタラーゼは第一試薬に含有されることが好ましく、カタラーゼ阻害剤は、第二試薬に含有されることが好ましい。過酸化水素除去試薬としてパーオキシダーゼと酸化カップリング型発色反応に使用される２つの酸化カップリング型色原体の一方との組み合わせを用いる場合、該組み合わせは第一試薬に含有されることが好ましい。
界面活性剤Ｂは、第二試薬に含有されることが好ましい。前述のように、界面活性剤Ｂの代わりに、ｓｄＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを除去した後の反応液に残存するｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とする酵素や、酵素と界面活性剤の組み合わせを用いることもできる。
過酸化水素測定試薬として、パーオキシダーゼと２つの酸化カップリング型色原体とを含有する試薬を用いる場合には、２つの酸化カップリング型色原体はそれぞれ別々の試薬に含有されることが好ましい。パーオキシダーゼは、第一、第二試薬のいずれか一方又は両方に含有される。尚、過酸化水素除去試薬として、パーオキシダーゼと酸化カップリング型発色反応に使用される２つの酸化カップリング型色原体の一方との組み合わせを用いる場合、当該組み合わせと共に、もう一方のカップリング型色原体とを組み合わせて過酸化水素測定試薬とすることができる。尚、該もう一方のカップリング型色原体は第二試薬に含有される。
過酸化水素測定試薬として、パーオキシダーゼと２つの酸化カップリング型色原体とを含有する試薬を用いる場合には、２つの酸化カップリング型色原体はそれぞれ別々の試薬に含有されることが好ましい。パーオキシダーゼは、第一、第二試薬のいずれか一方又は両方に含有される。尚、過酸化水素除去試薬として、パーオキシダーゼと酸化カップリング型発色反応に使用される２つの酸化カップリング型色原体の一方との組み合わせを用いる場合、当該組み合わせと共に、もう一方のカップリング型色原体とを組み合わせて過酸化水素測定試薬とすることができる。尚、該もう一方のカップリング型色原体は第二試薬に含有される。
アルブミンは、第一試薬に含有されることが好ましいが、第一及び第二試薬両方に含有されてもよい。
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットとしては、例えば以下の態様のキットが挙げられるがこれらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
キット１
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、カタラーゼ
第二試薬
界面活性剤Ｂ、カタラーゼ阻害剤、過酸化水素測定試薬
キット２
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、パーオキシダーゼ、酸化カップリング型色原体の一方
第二試薬
界面活性剤Ｂ、もう一方の酸化カップリング型色原体
キット３
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、パーオキシダーゼ、酸化カップリング型色原体
第二試薬
界面活性剤Ｂ
キット４
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素
第二試薬
界面活性剤Ｂ
キット５
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素測定試薬
第二試薬
界面活性剤Ｂ
キット６
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素酸化酵素、カタラーゼ
第二試薬
界面活性剤Ｂ、カタラーゼ阻害剤、過酸化水素測定試薬
キット７
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素酸化酵素、パーオキシダーゼ、酸化カップリング型色原体の一方
第二試薬
界面活性剤Ｂ、もう一方の酸化カップリング型色原体
キット８
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、カタラーゼ、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ、カタラーゼ阻害剤、過酸化水素測定試薬
キット９
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、パーオキシダーゼ、酸化カップリング型色原体の一方、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ、もう一方の酸化カップリング型色原体
キット１０
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、パーオキシダーゼ、酸化カップリング型色原体、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ
キット１１
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ
キット１２
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素測定試薬、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ
キット１３
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素酸化酵素、カタラーゼ、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ、カタラーゼ阻害剤、過酸化水素測定試薬
キット１４
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素酸化酵素、パーオキシダーゼ、酸化カップリング型色原体の一方、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ、もう一方の酸化カップリング型色原体
キット１５
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、カタラーゼ、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ、カタラーゼ阻害剤、過酸化水素測定試薬、アルブミン
キット１６
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、パーオキシダーゼ、酸化カップリング型色原体の一方、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ、アルブミン、もう一方の酸化カップリング型色原体
キット１７
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、パーオキシダーゼ、酸化カップリング型色原体、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ、アルブミン
キット１８
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ、アルブミン
キット１９
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素測定試薬、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ、アルブミン
キット２０
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素酸化酵素、カタラーゼ、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ、カタラーゼ阻害剤、過酸化水素測定試薬、アルブミン
キット２１
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素酸化酵素、パーオキシダーゼ、酸化カップリング型色原体の一方、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ、アルブミン、もう一方の酸化カップリング型色原体
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットに用いられる、界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素酸化酵素、過酸化水素除去試薬、界面活性剤Ｂ、アルブミン、過酸化水素測定試薬としては、それぞれ、前述のものが挙げられる。
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットとしては、例えば以下の態様のキットが挙げられるがこれらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
キット１
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、カタラーゼ
第二試薬
界面活性剤Ｂ、カタラーゼ阻害剤、過酸化水素測定試薬
キット２
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、パーオキシダーゼ、酸化カップリング型色原体の一方
第二試薬
界面活性剤Ｂ、もう一方の酸化カップリング型色原体
キット３
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、パーオキシダーゼ、酸化カップリング型色原体
第二試薬
界面活性剤Ｂ
キット４
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素
第二試薬
界面活性剤Ｂ
キット５
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素測定試薬
第二試薬
界面活性剤Ｂ
キット６
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素酸化酵素、カタラーゼ
第二試薬
界面活性剤Ｂ、カタラーゼ阻害剤、過酸化水素測定試薬
キット７
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素酸化酵素、パーオキシダーゼ、酸化カップリング型色原体の一方
第二試薬
界面活性剤Ｂ、もう一方の酸化カップリング型色原体
キット８
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、カタラーゼ、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ、カタラーゼ阻害剤、過酸化水素測定試薬
キット９
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、パーオキシダーゼ、酸化カップリング型色原体の一方、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ、もう一方の酸化カップリング型色原体
キット１０
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、パーオキシダーゼ、酸化カップリング型色原体、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ
キット１１
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ
キット１２
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素測定試薬、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ
キット１３
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素酸化酵素、カタラーゼ、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ、カタラーゼ阻害剤、過酸化水素測定試薬
キット１４
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素酸化酵素、パーオキシダーゼ、酸化カップリング型色原体の一方、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ、もう一方の酸化カップリング型色原体
キット１５
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、カタラーゼ、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ、カタラーゼ阻害剤、過酸化水素測定試薬、アルブミン
キット１６
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、パーオキシダーゼ、酸化カップリング型色原体の一方、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ、アルブミン、もう一方の酸化カップリング型色原体
キット１７
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、パーオキシダーゼ、酸化カップリング型色原体、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ、アルブミン
キット１８
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ、アルブミン
キット１９
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素測定試薬、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ、アルブミン
キット２０
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素酸化酵素、カタラーゼ、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ、カタラーゼ阻害剤、過酸化水素測定試薬、アルブミン
キット２１
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素酸化酵素、パーオキシダーゼ、酸化カップリング型色原体の一方、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ、アルブミン、もう一方の酸化カップリング型色原体
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットに用いられる、界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素酸化酵素、過酸化水素除去試薬、界面活性剤Ｂ、アルブミン、過酸化水素測定試薬としては、それぞれ、前述のものが挙げられる。
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットには、必要に応じて、水性媒体、安定化剤、防腐剤、影響物質消去剤、反応促進剤等が含有されてもよい。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。安定化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シュークロース、塩化カルシウム等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、バイオエ−ス、抗生物質等が挙げられる。影響物質消去剤としては、例えばアスコルビン酸の影響を消去するためのアスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。反応促進剤としては、例えばコリパーゼ等の酵素、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム等の塩類等が挙げられる。
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットは、凍結乾燥された状態でも、水性媒体に溶解された状態でもよい。凍結乾燥された状態の試薬を用いて検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃを定量する場合には、当該試薬は水性媒体に溶解して使用される。
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットにおけるコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．００１〜２０００Ｕ／ｍＬとなる含量が好ましく、０．００５〜１０００Ｕ／ｍＬとなる含量がより好ましい。
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットにおけるコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．００１〜２０００Ｕ／ｍＬとなる含量が好ましく、０．００５〜１０００Ｕ／ｍＬとなる含量がより好ましい。
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットにおけるコレステロール脱水素酵素、還元型補酵素酸化酵素の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．００１〜２０００Ｕ／ｍＬとなる含量が好ましく、０．００５〜１０００Ｕ／ｍＬとなる含量がより好ましい。
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットにおける酸化型補酵素の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．０１〜５００ｍｍｏｌ／Ｌとなる含量が好ましく、０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌとなる含量がより好ましい。
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットにおける酸化型補酵素の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．０１〜５００ｍｍｏｌ／Ｌとなる含量が好ましく、０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌとなる含量がより好ましい。
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットにおける界面活性剤Ａの含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．０００１〜１％となる含量が好ましく、０．０００５〜０．５％となる含量がより好ましい。
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットにおける界面活性剤Ｂの含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．００１〜５％となる含量が好ましく、０．０１〜０．５％となる含量がより好ましい。
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットにおける界面活性剤Ｂの含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．００１〜５％となる含量が好ましく、０．０１〜０．５％となる含量がより好ましい。
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットにおけるアルブミン含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．０００１〜１０％であることが好ましく、０．００１〜５％がより好ましい。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。尚、本実施例および参考例においては、下記メーカーの試薬及び酵素を使用した。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。尚、本実施例および参考例においては、下記メーカーの試薬及び酵素を使用した。
ＭＯＰＳ（同仁化学研究所社製）、ＥＭＳＥ（ダイトーケミックス社製）、硫酸ナトリウム（関東化学社製）、４−アミノアンチピリン（埼京化成社製）、パーオキシダーゼ（東洋紡績社製）、ＣＨＯ−ＰＥＬ（コレステロール酸化酵素；キッコーマン社製）、ＣＨＯ−ＣＥ（コレステロール酸化酵素；キッコーマン社製）、ＣＯＯ−３２２（コレステロール酸化酵素；東洋紡績社製）、ＬＰＬ３（コレステロールエステル加水分解酵素；天野エンザイム社製）、ＬＰ（コレステロールエステル加水分解酵素；旭化成社製）、ＬＩＰＳ（コレステロールエステル加水分解酵素；旭化成社製）、ＬＰＡＰ（コレステロールエステル加水分解酵素；旭化成社製）、パーオキシダーゼ（東洋紡績社製）、ＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ社製）。
パイオニンＤ−３１１０（竹本油脂社製）、パイオニンＤ−３１２０（竹本油脂社製）、ナイミーンＬ−２０７（日本油脂社製）、ユニセーフＡＬ−Ｅ（日本油脂社製）、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ ３−１０（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）、ニッサンアノンＢＬ（日本油脂社製）、アノンＢＤＦ−ＳＦ（日本油脂社製）、ビスノールＳＫ（一方社社製）、ナイミッドＭＴ−２１５（日本油脂社製）、ニューコール７０７−ＳＦ（日本乳化剤社製）、ニューコール７２３−ＳＦ（日本乳化剤社製）、ハイテノールＮ−１７（第一工業薬品社製）、サンアミドＣＦ−１０（日本油脂社製）、ミグノールＰＡ−３０（一方社社製）、ニッコールＣＭＴ−３０（日光ケミカルズ社製）、サルコシネートＬＮ−３０（日光ケミカルズ社製）、アデカプルロニックＴＲ−７０４（旭電化社製）、ユニオールＤ−７００（日本油脂社製）、プルロニック２５Ｒ−２（旭電化社製）、ユニルーブ５０ＭＢ−２６（日本油脂社製）。
ノイゲンＴＤＳ−８０（第一工業薬品社製）、ノイゲンＴＤＳ−１２０（第一工業薬品社製）、ＥＭＡＬＥＸ ＯＤ−１６（日本エマルジョン社製）、ワンダサーフＳ−８００（青木油脂社製）、ワンダサーフＳ−１４００（青木油脂社製）、ノニオンＮＳ−２１０（日本油脂社製）、ノニオンＮＳ−２１５（日本油脂社製）、ニューコール２６０７（日本乳化剤社製）、エマルゲンＡ−６０（花王社製）、ＢＬＡＵＮＯＮＤＳＰ−１２．５（青木油脂社製）、ニューポールＰＥ−６４（三洋化成社製）、ＢＬＡＵＮＯＮＬＰＥ１００７（青木油脂社製）。
以下の第一試薬及び第二試薬からなるｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットを調製した。第１表に示す界面活性剤Ａ及び界面活性剤Ｂを用いたキットを実施例１(1)〜１(34)のキットとした。
第一試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０．３ ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ２ ｇ／Ｌ
界面活性剤Ａ（以下、「界Ａ」と略記する）
ＬＰＬ３ １００ ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯ−ＰＥＬ １ ｋＵ／Ｌ
パーオキシダーゼ １０ ｋＵ／Ｌ
第二試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ ２０ ｋＵ／Ｌ
界面活性剤Ｂ（以下、「界Ｂ」と略記する）
第一試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０．３ ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ２ ｇ／Ｌ
界面活性剤Ａ（以下、「界Ａ」と略記する）
ＬＰＬ３ １００ ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯ−ＰＥＬ １ ｋＵ／Ｌ
パーオキシダーゼ １０ ｋＵ／Ｌ
第二試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ ２０ ｋＵ／Ｌ
界面活性剤Ｂ（以下、「界Ｂ」と略記する）
「新生化学実験講座４」（東京化学同人）に記載の超遠心法に従い、ヒト血清よりＨＤＬ（比重 １．０６３以上）、ｓｄＬＤＬ（比重１．０４４〜１．０６３）、ＬｇＬＤＬ（比重 １．００６〜１．０４４）、ＶＬＤＬ及びＣＭ（比重 １．００６以下）の４つのリポ蛋白分画をそれぞれ分取し、実施例１のキットを用いて、各リポ蛋白分画中コレステロールの反応率を算出した。
（１）各リポ蛋白分画中コレステロールと実施例１のキットとの反応による各リポ蛋白分画における「反応吸光度」の算出
日立７１７０Ｓ形自動分析装置を用いて、以下の操作により「反応吸光度」を算出した。
（１）各リポ蛋白分画中コレステロールと実施例１のキットとの反応による各リポ蛋白分画における「反応吸光度」の算出
日立７１７０Ｓ形自動分析装置を用いて、以下の操作により「反応吸光度」を算出した。
各リポ蛋白分画を検体とし反応セルへ（２μＬ）添加し、次いでそれぞれ実施例１のキットの第一試薬（０．１５ｍＬ）を添加し反応（第一反応）を開始させ、３７℃で５分間加温し、反応５分後の反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定した。次いで、この反応液にそれぞれ実施例１(1)〜１(34)のキットの第二試薬（０．０５ｍＬ）を添加しさらに３７℃で５分間加温して反応（第二反応）を行い、第二反応５分後の反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定し、Ｅ２からＥ１を差し引いて、吸光度変化（ΔＥ’リポ蛋白分画）を算出した。また、各リポ蛋白分画の代わりに生理食塩水を検体として用いて、同様の測定を行い、吸光度変化（ΔＥ’ブランク）を算出した。最後に、下記（式３）により、各リポ蛋白分画における「反応吸光度３」を算出した。
日立７１７０Ｓ形自動分析装置を用いて、総コレステロール定量用キットであるデタミナーＣ ＴＣ（協和メデックス社製）を実施例１のキットの代わりに用いる以外は（１）の場合と同様の方法で、「反応吸光度４」を算出し、以下の（式４）にて、実施例１(1)〜１(34)のそれぞれのキットにおける各リポ蛋白分画中コレステロールの反応率（％）を算出した。尚、デタミナーＣ ＴＣを用いた測定において算出した「反応吸光度４」は、対象とするリポ蛋白中のコレステロールが全て反応した際の「反応吸光度」を意味する。
以下の第一試薬及び第二試薬からなるｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットを調製した。第３表に示す界面活性剤Ａ及び界面活性剤Ｂを用いたキットを実施例３(35)〜３(44)のキットとした。
第一試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０．３ ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ２ ｇ／Ｌ
界面活性剤Ａ（以下、「界Ａ」と略記する）
ＬＰＬ３ １００ ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯ−ＰＥＬ １ ｋＵ／Ｌ
パーオキシダーゼ １０ ｋＵ／Ｌ
ＢＳＡ
第二試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ ２０ ｋＵ／Ｌ
界面活性剤Ｂ（以下、「界Ｂ」と略記する）
第一試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０．３ ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ２ ｇ／Ｌ
界面活性剤Ａ（以下、「界Ａ」と略記する）
ＬＰＬ３ １００ ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯ−ＰＥＬ １ ｋＵ／Ｌ
パーオキシダーゼ １０ ｋＵ／Ｌ
ＢＳＡ
第二試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ ２０ ｋＵ／Ｌ
界面活性剤Ｂ（以下、「界Ｂ」と略記する）
実施例３(35)〜３(47)のキットを用いて、実施例２の（１）記載の測定方法と同様にして日立７１７０Ｓ自動分析装置により、ヒト血清２４検体それぞれにおける反応吸光度を測定した。
次に、該血清を用いてJournal of Lipid Research vol.44, p.2193-2201(2003) 記載の超遠心法にて該検体中のｓｄＬＤＬを遠心分離し、得られたｓｄＬＤＬ分画中のコレステロール量をデタミナーＬ ＴＣＩＩ（協和メデックス社製）を用いて測定した。実施例３(35)〜３(47)のキットを用いた測定における測定値と、超遠心法による測定値との相関係数を第４表に記す。
次に、該血清を用いてJournal of Lipid Research vol.44, p.2193-2201(2003) 記載の超遠心法にて該検体中のｓｄＬＤＬを遠心分離し、得られたｓｄＬＤＬ分画中のコレステロール量をデタミナーＬ ＴＣＩＩ（協和メデックス社製）を用いて測定した。実施例３(35)〜３(47)のキットを用いた測定における測定値と、超遠心法による測定値との相関係数を第４表に記す。
また、第一試薬にＢＳＡを含有する実施例３(42)と３(43)のキットを用いた測定と、実施例３(35)と３(37)のキットを用いた測定との比較から、第一試薬にＢＳＡを含有するキットを用いることにより、第一試薬にＢＳＡを含有しないキットを用いた場合に比較して、超遠心法との間の相関がより良好となることが判った。
以下の第一試薬及び第二試薬からなるｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットを調製した。第５表に示す界面活性剤Ａ及び界面活性剤Ｂを用いたキットを実施例５(48)〜５(57)のキットとした。
第一試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０．３ ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ２ ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ １０ ｋＵ／Ｌ
ＢＳＡ ３ ｇ／Ｌ
界面活性剤Ａ（以下、「界Ａ」と略記する）
コレステロールエステル加水分解酵素（以下、「ＣＨＥＲ」と略記する）
コレステロール酸化酵素（以下、「ＣＨＯＤ」と略記する）
第二試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ ２０ ｋＵ／Ｌ
ＢＬＡＵＮＯＮ ＬＰＥ−１００７ １ ｇ／Ｌ
ワンダサーフＳ−８００ ０．３ ｇ／Ｌ
第一試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０．３ ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ２ ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ １０ ｋＵ／Ｌ
ＢＳＡ ３ ｇ／Ｌ
界面活性剤Ａ（以下、「界Ａ」と略記する）
コレステロールエステル加水分解酵素（以下、「ＣＨＥＲ」と略記する）
コレステロール酸化酵素（以下、「ＣＨＯＤ」と略記する）
第二試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ ２０ ｋＵ／Ｌ
ＢＬＡＵＮＯＮ ＬＰＥ−１００７ １ ｇ／Ｌ
ワンダサーフＳ−８００ ０．３ ｇ／Ｌ
実施例３(43)、及び、実施例５(48)〜５(57)のキットを用いて、実施例２の（１）記載の方法と同様にして日立７１７０Ｓ自動分析装置により、ヒト血清２５検体それぞれにおける反応吸光度を測定した。
次に、該血清を用いてJournal of Lipid Research vol.44, p.2193-2201(2003) 記載の超遠心法にて該検体中のｓｄＬＤＬを遠心分離し、得られたｓｄＬＤＬ分画中のコレステロール量をデタミナーＬ ＴＣＩＩ（協和メデックス社製）を用いて測定した。実施例３(43)、及び、実施例５(48)〜５(57)のキットを用いた測定における測定値と、超遠心法による測定値との相関係数を第６表に記す。
次に、該血清を用いてJournal of Lipid Research vol.44, p.2193-2201(2003) 記載の超遠心法にて該検体中のｓｄＬＤＬを遠心分離し、得られたｓｄＬＤＬ分画中のコレステロール量をデタミナーＬ ＴＣＩＩ（協和メデックス社製）を用いて測定した。実施例３(43)、及び、実施例５(48)〜５(57)のキットを用いた測定における測定値と、超遠心法による測定値との相関係数を第６表に記す。
以下の第一試薬及び第二試薬からなるｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットを調製した。第７表に示す界面活性剤Ａ及び界面活性剤Ｂを用いたキットを実施例７(58)〜７(67)のキットとした。
第一試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０．３ ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ２ ｇ／Ｌ
界面活性剤Ａ（以下、「界Ａ」と略記する）
ＬＰＬ３ １００ ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯ−ＰＥＬ １ ｋＵ／Ｌ
パーオキシダーゼ １０ ｋＵ／Ｌ
ＢＳＡ
第二試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ ２０ ｋＵ／Ｌ
界面活性剤Ｂ（以下、「界Ｂ」と略記する）
第一試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０．３ ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ２ ｇ／Ｌ
界面活性剤Ａ（以下、「界Ａ」と略記する）
ＬＰＬ３ １００ ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯ−ＰＥＬ １ ｋＵ／Ｌ
パーオキシダーゼ １０ ｋＵ／Ｌ
ＢＳＡ
第二試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０） ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ ２０ ｋＵ／Ｌ
界面活性剤Ｂ（以下、「界Ｂ」と略記する）
実施例３(36)及び実施例７(58)〜７(67)のキットを用いて、実施例２の（１）記載の方法と同様にしてヒト血清２１検体それぞれにおける反応吸光度を測定した。
次に、該血清を用いてJournal of Lipid Research vol.44, p.2193-2201(2003) 記載の超遠心法にて該血清中のｓｄＬＤＬを遠心分離し、得られたｓｄＬＤＬ分画中のコレステロール量をデタミナーＬ ＴＣＩＩ（協和メデックス社製）を用いて測定した。各実施例及び比較例のキットを用いた測定における測定値と、超遠心法による測定値との相関係数を第８表に記す。
次に、該血清を用いてJournal of Lipid Research vol.44, p.2193-2201(2003) 記載の超遠心法にて該血清中のｓｄＬＤＬを遠心分離し、得られたｓｄＬＤＬ分画中のコレステロール量をデタミナーＬ ＴＣＩＩ（協和メデックス社製）を用いて測定した。各実施例及び比較例のキットを用いた測定における測定値と、超遠心法による測定値との相関係数を第８表に記す。
検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量
超遠心法並びに本発明の実施例３(36)及び実施例３(44)のキットを用いて、ヒト新鮮血清２検体について、各検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃを以下の方法により定量した。
（１）超遠心法を用いたヒト血清検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量
該ヒト血清２検体を用いてJournal of Lipid Research vol.44, p.2193-2201(2003) 記載の超遠心法にて該血清中のｓｄＬＤＬを遠心分離し、得られたｓｄＬＤＬ分画中のコレステロール量をデタミナーＬ ＴＣＩＩ（協和メデックス社製）を用いて測定した。
（２）検量線の作成
超遠心法による測定より、ｓｄＬＤＬ−Ｃ濃度が４３．１ｍｇ／ｄＬであることが判明している血清標準液を検量線作成用サンプルとした。実施例２の（１）記載の測定方法と同様にして日立７１７０Ｓ自動分析装置により、実施例３(36)及び実施例３(44)のキットにより、検量線作成用サンプル検体の反応吸光度を測定し、該反応吸光度と検量線作成用サンプル中のｓｄＬＤＬ−Ｃ濃度との関係からそれぞれのキットの検量線を作成した。
（３）ヒト血清２検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量
検量線作成用サンプルの代わりにヒト血清２検体を用いて、上記（２）と同様の方法により、該２検体各々について反応を行い、反応後の反応液の吸光度と上記（２）で作成した検量線とから、それぞれのキットについて各検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃ濃度を決定した。
超遠心法並びに本発明の実施例３(36)及び実施例３(44)のキットを用いて、ヒト新鮮血清２検体について、各検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃを以下の方法により定量した。
（１）超遠心法を用いたヒト血清検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量
該ヒト血清２検体を用いてJournal of Lipid Research vol.44, p.2193-2201(2003) 記載の超遠心法にて該血清中のｓｄＬＤＬを遠心分離し、得られたｓｄＬＤＬ分画中のコレステロール量をデタミナーＬ ＴＣＩＩ（協和メデックス社製）を用いて測定した。
（２）検量線の作成
超遠心法による測定より、ｓｄＬＤＬ−Ｃ濃度が４３．１ｍｇ／ｄＬであることが判明している血清標準液を検量線作成用サンプルとした。実施例２の（１）記載の測定方法と同様にして日立７１７０Ｓ自動分析装置により、実施例３(36)及び実施例３(44)のキットにより、検量線作成用サンプル検体の反応吸光度を測定し、該反応吸光度と検量線作成用サンプル中のｓｄＬＤＬ−Ｃ濃度との関係からそれぞれのキットの検量線を作成した。
（３）ヒト血清２検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量
検量線作成用サンプルの代わりにヒト血清２検体を用いて、上記（２）と同様の方法により、該２検体各々について反応を行い、反応後の反応液の吸光度と上記（２）で作成した検量線とから、それぞれのキットについて各検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃ濃度を決定した。
該２検体について、上記（１）における超遠心法により決定した該検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃ濃度と、上記（３）における実施例３(36)及び実施例３(44)のキットを用いた測定により決定した該検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃ濃度を第９表に示す。
本発明により、動脈硬化などの冠動脈疾患の診断に有用な小粒子低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法及び定量用キットが提供される。
Claims (6)
- （i）コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による高密度リポ蛋白中のコレステロール（以下、ＨＤＬ−Ｃと略記する）、超低密度リポ蛋白中のコレステロール（以下、ＶＬＤＬ−Ｃと略記する）、カイロミクロン中のコレステロール（以下、ＣＭ−Ｃと略記する）及び大粒子低密度リポ蛋白中のコレステロール（以下、ＬｇＬＤＬ−Ｃと略記する）の反応に比較して、該コレステロールエステル加水分解酵素及び該コレステロール酸化酵素若しくは該コレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による小粒子低密度リポ蛋白中のコレステロール（以下、ｓｄＬＤＬ−Ｃと略記する）の反応を優先的に抑制する界面活性剤（以下、該界面活性剤を界面活性剤Ａと略記する）を含有する反応液中で、検体に該コレステロールエステル加水分解酵素及び該コレステロール酸化酵素、又は、該コレステロールエステル加水分解酵素、該コレステロール脱水素酵素及び酸化型補酵素を作用させ、該検体中のＨＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ、ＣＭ−Ｃ及びＬｇＬＤＬ−Ｃを除去する工程；
（ii）前記工程（i）の界面活性剤Ａを含有する反応液に残存するｓｄＬＤＬ−Ｃの、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による反応の抑制を解除する界面活性剤（以下、該界面活性剤を界面活性剤Ｂと略記する）を添加し、過酸化水素または還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素又は還元型補酵素を測定する工程；
(iii)既知濃度のｓｄＬＤＬ−Ｃを含有する標準検体を用いて、前記(i)及び(ii)の工程を行い過酸化水素または還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素又は還元型補酵素を測定し、ｓｄＬＤＬ−Ｃ濃度と過酸化水素又は還元型補酵素に係る測定値とを関連づけ、該検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃ濃度を決定する工程；
の各工程を含み、
上記界面活性剤Ａが、ポリオキシエチレンアルキルアミン、アミンオキシド類、アルキルベタイン、アルキルアンモニオ−１−プロパンスルホン酸塩、酸アミドアルキルベタイン、ポリオキシエチレンベンジル−アルキル４級アンモニウム塩、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルアミン硫酸エステル塩、Ｎ−アシルタウリン塩、Ｎ−アシルアミノ酸塩、エチレンジアミン−ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリエチレングリコールを含まないポリプロピレングリコール誘導体、一般式（Ｉ）
上記界面活性剤Ｂが、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル（該アルキルは炭素数１０以上のアルキル）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル、一般式（II）
ことを特徴とする検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量方法。 - 工程(i)をアルブミン存在下で行う請求項１に記載の方法。
- （ａ）コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による高密度リポ蛋白中のコレステロール、超低密度リポ蛋白中のコレステロール、カイロミクロン中のコレステロール及び大粒子低密度リポ蛋白中のコレステロールの反応に比較して、該コレステロールエステル加水分解酵素及び該コレステロール酸化酵素若しくは該コレステロール脱水素酵素−該酸化型補酵素による小粒子低密度リポ蛋白中のコレステロール（以下、ｓｄＬＤＬ−Ｃと略記する）の反応を優先的に抑制する界面活性剤（以下、該界面活性剤を界面活性剤Ａと略記する）、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素及び過酸化水素除去試薬を含有する第一試薬と、（ｂ）界面活性剤Ａ共存下でｓｄＬＤＬ−Ｃの、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による反応の抑制を解除する界面活性剤（以下、該界面活性剤を界面活性剤Ｂと略記する）、及び、過酸化水素測定試薬を含有する第二試薬とを含有し、
上記界面活性剤Ａが、ポリオキシエチレンアルキルアミン、アミンオキシド類、アルキルベタイン、アルキルアンモニオ−１−プロパンスルホン酸塩、酸アミドアルキルベタイン、ポリオキシエチレンベンジル−アルキル４級アンモニウム塩、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルアミン硫酸エステル塩、Ｎ−アシルタウリン塩、Ｎ−アシルアミノ酸塩、エチレンジアミン−ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリエチレングリコールを含まないポリプロピレングリコール誘導体、一般式（Ｉ）
上記界面活性剤Ｂが、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル（該アルキルは炭素数１０以上のアルキル）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル、一般式（II）
ことを特徴とする検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キット。 - （ａ）コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による高密度リポ蛋白中のコレステロール、超低密度リポ蛋白中のコレステロール、カイロミクロン中のコレステロール及び大粒子低密度リポ蛋白中のコレステロールの反応に比較して、該コレステロールエステル加水分解酵素及び該コレステロール酸化酵素若しくは該コレステロール脱水素酵素−該酸化型補酵素による小粒子低密度リポ蛋白中のコレステロール（以下、ｓｄＬＤＬ−Ｃと略記する）の反応を優先的に抑制する界面活性剤（以下、該界面活性剤を界面活性剤Ａと略記する）、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素を含有する第一試薬と、（ｂ）界面活性剤Ａ共存下でｓｄＬＤＬ−Ｃの、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による反応の抑制を解除する界面活性剤（以下、該界面活性剤を界面活性剤Ｂと略記する）を含有する第二試薬とを含有し、
上記界面活性剤Ａが、ポリオキシエチレンアルキルアミン、アミンオキシド類、アルキルベタイン、アルキルアンモニオ−１−プロパンスルホン酸塩、酸アミドアルキルベタイン、ポリオキシエチレンベンジル−アルキル４級アンモニウム塩、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルアミン硫酸エステル塩、Ｎ−アシルタウリン塩、Ｎ−アシルアミノ酸塩、エチレンジアミン−ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリエチレングリコールを含まないポリプロピレングリコール誘導体、一般式（Ｉ）
上記界面活性剤Ｂが、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル（該アルキルは炭素数１０以上のアルキル）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル、一般式（II）
ことを特徴とする検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キット。 - 少なくとも第一試薬にアルブミンを含有する請求項３又は４に記載のキット。
- 第三試薬として、既知濃度のｓｄＬＤＬを含有する標準品を含有する請求項３〜５のいずれかに記載のキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2008540946A JP5111389B2 (ja) | 2006-10-18 | 2007-10-16 | 小粒子低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006283418 | 2006-10-18 | ||
| JP2006283418 | 2006-10-18 | ||
| PCT/JP2007/070172 WO2008050636A1 (fr) | 2006-10-18 | 2007-10-16 | Procédé de quantification du cholestérol dans une lipoprotéine de faible densité |
| JP2008540946A JP5111389B2 (ja) | 2006-10-18 | 2007-10-16 | 小粒子低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2008050636A1 JPWO2008050636A1 (ja) | 2010-02-25 |
| JP5111389B2 true JP5111389B2 (ja) | 2013-01-09 |
Family
ID=39324435
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2008540946A Active JP5111389B2 (ja) | 2006-10-18 | 2007-10-16 | 小粒子低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8163512B2 (ja) |
| EP (1) | EP2077333B1 (ja) |
| JP (1) | JP5111389B2 (ja) |
| KR (1) | KR101467926B1 (ja) |
| CN (2) | CN101512012B (ja) |
| AT (1) | ATE498019T1 (ja) |
| DE (1) | DE602007012455D1 (ja) |
| TW (1) | TWI421058B (ja) |
| WO (1) | WO2008050636A1 (ja) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2015077B1 (en) * | 2006-05-01 | 2012-10-31 | DENKA SEIKEN Co., Ltd. | Method for detection of familial combined hyperlipidemia |
| CA2679309C (en) * | 2007-02-28 | 2015-05-26 | Denka Seiken Co., Ltd. | Reagent for quantitative determination of small, dense ldls |
| CN103952462B (zh) * | 2007-10-10 | 2017-10-24 | 电化生研株式会社 | 定量测定小而密ldl胆固醇的方法和试剂盒 |
| JP5285000B2 (ja) * | 2010-02-23 | 2013-09-11 | 富士フイルム株式会社 | 低密度リポ蛋白コレステロールの測定方法 |
| WO2011136316A1 (ja) * | 2010-04-30 | 2011-11-03 | 協和メデックス株式会社 | 低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法、測定用試薬及び測定用キット |
| US20140147869A1 (en) * | 2010-10-29 | 2014-05-29 | Arkray, Inc. | Method and Kit for Measuring Cholesterol in Low-Density Lipoproteins |
| JP6047778B2 (ja) * | 2012-01-12 | 2016-12-21 | 株式会社シノテスト | 測定対象物質の測定方法及び測定試薬、並びにビリルビンに由来する影響の回避方法 |
| CN104673879A (zh) * | 2015-03-07 | 2015-06-03 | 王贤俊 | 一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒及其制备 |
| CN105385751B (zh) * | 2015-12-24 | 2019-10-15 | 山东博科生物产业有限公司 | 一种准确度高、抗干扰能力强的总胆固醇检测试剂 |
| CN105652021B (zh) * | 2016-03-11 | 2018-01-02 | 上海练佰生物技术中心 | 一种测定小而密脂蛋白的试剂、方法和试剂盒 |
| JP6829009B2 (ja) * | 2016-05-24 | 2021-02-10 | デンカ株式会社 | トリグリセリドリッチリポ蛋白中のコレステロールの定量方法及び定量試薬 |
| CN107446989B (zh) * | 2017-06-23 | 2020-07-14 | 美康生物科技股份有限公司 | 测定样本中的小而密低密度脂蛋白胆固醇的方法及试剂 |
| CN107505272B (zh) * | 2017-08-10 | 2020-09-25 | 东软威特曼生物科技(南京)有限公司 | 低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒及其使用方法 |
| EP3677688B1 (en) * | 2017-09-01 | 2024-08-07 | Hitachi Chemical Diagnostics Systems Co., Ltd. | Method for measuring cholesterol in low-density lipoprotein, use of a measurement reagent, and of a measurement kit |
| CN110736846B (zh) * | 2018-07-20 | 2023-07-14 | 上海微鸿企业管理有限公司 | 一种小而密脂蛋白的测定试剂、方法和试剂盒 |
| JP6426873B1 (ja) * | 2018-08-06 | 2018-11-21 | 積水メディカル株式会社 | マイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的検出方法 |
| CN111690715A (zh) * | 2019-03-12 | 2020-09-22 | 程明 | 一种小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒及其测定方法 |
| JP6703175B1 (ja) * | 2019-09-10 | 2020-06-03 | デンカ生研株式会社 | キットおよび方法 |
| CN110564810A (zh) * | 2019-09-19 | 2019-12-13 | 武汉瀚海新酶生物科技有限公司 | 一种高性能小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒 |
| CN110791549B (zh) * | 2019-12-03 | 2023-09-26 | 宁波普瑞柏生物技术股份有限公司 | 定量测定小而密低密度脂蛋白胆固醇的方法和试剂盒 |
| CN111269962B (zh) * | 2020-03-18 | 2021-03-23 | 浙江夸克生物科技有限公司 | 一种小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒及其应用 |
| CN113495069B (zh) * | 2021-04-19 | 2024-04-26 | 深圳市锦瑞生物科技股份有限公司 | 一种总胆固醇检测试剂及检测芯片 |
| WO2023049473A1 (en) * | 2021-09-27 | 2023-03-30 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | System and method to determine the concentration of lipoprotein (a) cholesterol |
| CN114350744B (zh) * | 2022-01-21 | 2023-03-24 | 广西康柏莱科技有限公司 | 一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000017388A1 (fr) * | 1998-09-18 | 2000-03-30 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Dosage du cholesterol dans les lipoproteines et reactifs de quantification |
| JP2000325097A (ja) * | 1999-05-21 | 2000-11-28 | Showa Denko Kk | リポ蛋白質コレステロールの測定方法及び測定試薬 |
| WO2004053500A1 (ja) * | 2002-12-06 | 2004-06-24 | Denka Seiken Co., Ltd. | 小粒子低比重リポ蛋白の定量法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003028881A (ja) * | 2001-07-10 | 2003-01-29 | Orient Cancer Therary:Kk | 難治性自己免疫疾患の測定方法 |
| JP4593026B2 (ja) * | 2001-07-18 | 2010-12-08 | 栄研化学株式会社 | ＳｍａｌｌｄｅｎｓｅＬＤＬの測定方法 |
| JP4606901B2 (ja) | 2005-02-18 | 2011-01-05 | デンカ生研株式会社 | 動脈硬化の診断方法 |
| WO2007001011A1 (ja) | 2005-06-28 | 2007-01-04 | Denka Seiken Co., Ltd. | 食後高脂血症診断のための測定試薬 |
| DE602006018035D1 (de) * | 2005-08-31 | 2010-12-16 | Denka Seiken Kk | Verfahren und kit zur quantitativen bestimmung von small, dense ldl cholesterol |
| WO2007066760A1 (ja) | 2005-12-09 | 2007-06-14 | Kyowa Medex Co., Ltd. | レムナント様リポ蛋白中のコレステロール測定方法、試薬及びキット |
| US8785146B2 (en) * | 2008-04-01 | 2014-07-22 | Beijing Strong Biotechnologies, Inc. | Method for quantitative measurements of HDL-C and LDL-C |
-
2007
- 2007-10-16 EP EP07829906A patent/EP2077333B1/en not_active Not-in-force
- 2007-10-16 KR KR1020097007184A patent/KR101467926B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2007-10-16 CN CN2007800334706A patent/CN101512012B/zh active Active
- 2007-10-16 AT AT07829906T patent/ATE498019T1/de not_active IP Right Cessation
- 2007-10-16 WO PCT/JP2007/070172 patent/WO2008050636A1/ja active Application Filing
- 2007-10-16 US US12/377,318 patent/US8163512B2/en active Active
- 2007-10-16 CN CN2013101864355A patent/CN103305592A/zh active Pending
- 2007-10-16 DE DE602007012455T patent/DE602007012455D1/de active Active
- 2007-10-16 JP JP2008540946A patent/JP5111389B2/ja active Active
- 2007-10-17 TW TW096138822A patent/TWI421058B/zh not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000017388A1 (fr) * | 1998-09-18 | 2000-03-30 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Dosage du cholesterol dans les lipoproteines et reactifs de quantification |
| JP2000325097A (ja) * | 1999-05-21 | 2000-11-28 | Showa Denko Kk | リポ蛋白質コレステロールの測定方法及び測定試薬 |
| WO2004053500A1 (ja) * | 2002-12-06 | 2004-06-24 | Denka Seiken Co., Ltd. | 小粒子低比重リポ蛋白の定量法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101512012A (zh) | 2009-08-19 |
| KR20090079887A (ko) | 2009-07-22 |
| US20100041080A1 (en) | 2010-02-18 |
| CN103305592A (zh) | 2013-09-18 |
| EP2077333A1 (en) | 2009-07-08 |
| WO2008050636A1 (fr) | 2008-05-02 |
| ATE498019T1 (de) | 2011-02-15 |
| US8163512B2 (en) | 2012-04-24 |
| EP2077333A4 (en) | 2009-10-28 |
| EP2077333B1 (en) | 2011-02-09 |
| TWI421058B (zh) | 2014-01-01 |
| JPWO2008050636A1 (ja) | 2010-02-25 |
| TW200826903A (en) | 2008-07-01 |
| CN101512012B (zh) | 2013-12-04 |
| KR101467926B1 (ko) | 2014-12-03 |
| DE602007012455D1 (de) | 2011-03-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5111389B2 (ja) | 小粒子低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法 | |
| JP5548733B2 (ja) | 小粒子低比重リポ蛋白の定量方法および定量キット | |
| JP4498143B2 (ja) | 高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および試薬 | |
| EP1849876B1 (en) | Method, reagent and kit for determination of cholesterol in remnant-like particles (rlp) | |
| JP5191236B2 (ja) | 低密度リポ蛋白中トリグリセリドの測定方法及び測定用キット | |
| CA2605329C (en) | Method for determination of cholesterol in high-density lipoprotein | |
| JP5534644B2 (ja) | レムナント様リポ蛋白中のコレステロール測定方法、試薬及びキット | |
| KR102524702B1 (ko) | 저밀도 리포단백 중의 콜레스테롤의 측정 방법, 측정용 시약 및 측정용 키트 | |
| JP5864858B2 (ja) | 低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法、測定用試薬及び測定用キット | |
| JP5832995B2 (ja) | 低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法、測定用試薬及び測定用キット | |
| JP4796489B2 (ja) | 高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法 | |
| JP6372921B2 (ja) | 高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100826 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20100826 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120712 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120910 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20121004 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20121009 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20151019 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5111389 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |