FI85335B - Foerfarande foer framstaellning av lyofiliserad, farmaceutisk vaevnadsplasminogenaktivator(t-pa)-komposition. - Google Patents

Description

1 h 5 3 3 5

Menetelmä lyofilisoidun farmaseuttisesti käytettävän ku-dosplaminogeeniaktivaattori(t-PA)-valmisteen valmistamiseksi 5 Keksintö koskee menetelmää lyofilisoidun farma seuttisesti käytettävän kudosplasminogeeniaktivaattori-(t-PA)-valmisteen valmistamiseksi.

Uskotaan, että esiintyy dynaaminen tasapaino veri-hyytymiä muodostavan entsyymisysteemin - koagulaatiosys-10 teemin - ja verihyytymiä hajoittavan entsyymisysteemin -fibrinolyyttisen systeemin - välillä, joka ylläpitää pysyvän ehjän verisuonten ympäristön. Vahingoittuneeseen suoneen muodostuu verihyytymiä verenhukan rajoittamiseksi. Vaurion luonnollisen korjaantumisen jälkeen tarpeet-15 tomat verihyytymät hajoitetaan fibrinolyyttisen systeemin vaikutuksesta. Silloin tällöin muodostuu verihyytymiä ilman traumaattista vauriota, ja ne saattavat jäädä tärkeisiin suoniin aiheuttaen osittaisen tai jopa täydellisen verenkierron tukkeutumisen. Kun tämä tapahtuu sydämessä, 20 keuhkoissa tai aivoissa, tuloksena voi olla sydänlihaksen salpaus, keuhkotulppa tai halvaus. Nämä taudintilat ovat yhdessä teollistuneiden maiden johtavia sairautta ja kuolemaa aiheuttavia tekijöitä.

Verihyytymät muodostuvat säikeisestä verkostosta, 25 jota proteolyyttinen entsyymi, plasmiini, voi hajoittaa. Entsyymi muodostuu inaktiivisesta proentsyymistä, plas-minogeenista, joka on veren plasman osatekijä, plas-minogeeniaktivaattorin vaikutuksesta. On olemassa kaksi immunologisesti erilaista nisäkäsplasminogeeniaktivaatto-30 ria. Sisäinen plasminogeeniaktivaattori, joka myös tunnetaan urokinaasina, on munuaisissa tuotettu entsyymi, ja sitä voidaan eristää virtsasta. Sitä voidaan myös valmistaa useista kudosviljelmälähteistä. Ulkosyntyinen plasminogeeniaktivaattori, joka myös tunnetaan sekä vaskulaa-35 risena plasminogeeniaktivaattorina että kudosplas- 2 85335 minogeeniaktivaattorina (t-PA), voidaan eristää monista kudoshomogenaateista (varsinkin ihmisen kohdusta), verisuonten soluseinämistä ja joistakin soluviljelmistä. Näiden kahden plasminogeeniaktivaattorilajin lisäksi on 5 myös olemassa bakteerien avulla saatava tuote, strep- tokinaasi, jota valmistetaan beta-hemolyyttisistä streptokokeista. Sekä urokinaasin että streptokinaasin huomattavana haittana on, että ne ovat aktiivisia koko verenkierrossa eivätkä vain verihyytymien kohdalla. Ne voivat 10 esimerkiksi tuhota muita veren proteiineja, kuten fibri-nogeenia, protrombiinia, tekijää V ja tekijää VIII, vähentäen täten veren hyytymiskykyä ja lisäten verenvuodon riskiä. Tätä vastoin t-PA:n biologinen aktiivisuus on riippuvainen fibriinin läsnäolosta, johon se sitoutuu, ja 15 kohdasta, jossa se aktivoituu. Maksimaalinen aktiivisuus kehittyy siten vain verihyytymän kohdalla ko. liuotettavan fibriiniverkoston läsnäollessa, jolloin käytännöllisesti katsoen kokonaan vältetään verenvuodon riski.

t-PA:n pääasiallinen antomuoto on suonensisäisenä 20 tiputuksena, joten t-PA tulee valmistaa parenteraalisena liuoksena. Proteiinin ollessa kyseessä on parempi tarjota se lääkärille tai eläinlääkärille lyofilisoituna farmaseuttisena valmisteena johtuen sen merkittävistä eduista kuljetuksessa ja varastoinnissa nestemäiseen valmis-25 teeseen verrattuna. On kuitenkin tärkeätä, että mikä tahansa tällainen lyofilisoitu valmiste on helposti muutettavissa halutuksi parenteraaliseksi liuokseksi ilman hankaluuksia ja vaikeuksia ja että lääkäri tai eläinlääkäri missä tahansa tilanteessa voi saada lääkkeen halutussa 30 pitoisuudessa yksinkertaisesti liuottamalla valmiste sopivaan määrään liuotinta. Ei ole esimerkiksi suositeltavaa antaa potilaalle, jolla on sydämen tai munuaisten toiminnanhäiriö, suurta määrää nestettä, koska se entisestään rasittaisi sydäntä ja munuaisia. Siksi tällai-35 sessa tapauksessa lääkkeen tilavuus pitäisi pitää mahdol- li 3 85335 lisimman pienenä. On siten toivottavaa, että saatavilla on sekä parenteraalista liuosta, jolla on suhteellisen alhainen pitoisuus, että myös liuosta, jolla on korkea lääkeaineen pitoisuus.

5 Useita lyofilisoituja t-PA:n farmaseuttisia val misteita on aiemmin kuvattu, ks. esimerkiksi EP-julkaisut 113 319 ja 123 304. Nämä valmisteet ovat t-PA:n vesipohjaisia suolaliuoksia, jotka ovat lähes neutraalit, ja niillä on se haittapuoli, että t-PA:n liukoisuus tällai-10 sissa liuoksissa on alhainen ionipitoisuuslisän puuttuessa. Tästä seuraa, että näistä lyofilisoiduista valmisteista valmistetut parenteraaliset liuokset joko ovat t-PA:n suhteen kovin laimeat, mikä johtaa siihen, että potilaalle on annettava ei-toivotun suuria määriä liuos-15 ta, tai sitten ne ovat hypertonisia, jolloin niiden antaminen voi olla haitallinen veren punasoluille.

Nyt on todettu, että t-PA:n liukoisuutta vesipohjaiseen liuottimeen voidaan parantaa, mikäli liuoksen pH on happamalla alueella, että lyofilisoitu farmaseuttinen 20 valmiste voidaan valmistaa t-PA:n happamasta liuoksesta ja ettei tämän valmisteen antaminen parenteraalisesti aiheuta merkittäviä fysiologisia haittoja. Tämän mukaan keksinnön kohteena on menetelmä t-PA:n lyofilisoidun farmaseuttisesti käytettävän valmisteen valmistamiseksi, 25 jolle menetelmälle on tunnusomaista, että t-PA:n vesi-liuos, jonka pH on 2-5, lyofilisoidaan.

Parannetun t-PA:n liukoisuuden ansiosta keksinnön mukaisesti voidaan valmistaa lyofilisoitu farmaseuttinen valmiste, jonka avulla saadaan parenteraalinen liuos, 30 jossa on suuri t-PA-pitoisuus ilman merkittävää t-PA:n saostumisriskiä. Tätä lyofilisoitua valmistetta voidaan tarjota lääkäreille tai eläinlääkäreille, jotka voivat liuottaa valmisteen tarpeen mukaan haluttuun pitoisuuteen käyttämällä esimerkiksi neutraalia tai hapanta vettä.

35 Keksinnön mukaisesti voidaan siten valmistaa pysyvä lyö- 4 85335 filisoitu farmaseuttinen valmiste, joka suo lääkäreille ja eläinlääkäreille suuremman joustavuuden sen käsittelyssä ja käytössä, samoin kuin se mahdollistaa helpomman kuljetuksen ja varastoinnin.

5 t-PA, jota käytetään esillä olevassa keksinnössä voi olla mikä tahansa bioaktiivinen proteiini, joka olennaisesti vastaa nisäkäs-, ja erityisesti ihmisen t-PA:ta, mukaan luettuna glykosyloituja ja ei-glykosyloituja muotoja. Se voi olla yksi- tai kaksiketjuinen t-PA, tai 10 näiden seos, kuten on esitetty EP-julkaisussa 112 122, ja kuten täydellisesti glykosyloidun ihmisen t-PA:n tapauksessa, sen näennäinen molekyylipaino polyakryyliamidi-geeleissä on noin 70 000, ja sen isoelektrinen piste on 7,5-8,0. Edullisesti t-PA:n spesifinen aktiivisuus on 15 noin 500 000 IU/mg (kansainvälistä yksikköä/mg, kansainvälisen yksikön (IU) ollessa aktiivisuuden yksikkö (WHO; National Institute for Biological Standards and Control, Holly Hill, Hampstead, Lontoo, NW3 6RB, Englanti) .

20 t-PA:n aminohapposekvenssi vastaa edullisesti olennaisesti kuvion 1 esittämää. Sekvenssi on täten identtinen kuvion 1 esittämän sekvenssin kanssa tai se sisältää alleelista tai muuta alkuperää olevaa yhden tai useamman aminohapon deleetion, substituution, insertion, 25 inversion tai addition, jolloin tuloksena olevalla sekvenssillä on vähintään 80 %:n, ja edullisesti 90 %:n homologia kuvion 1 esittämään sekvenssiin nähden ja säilyttää pääosiltaan samoja proteiinin biologisia ja immunologisia ominaisuuksia. Erityisesti t-PA:n sekvenssi on ku-30 vion 1 esittämän sekvenssin kanssa identtinen, tai sillä on sama sekvenssi mutta aminohappo, joka on kohdassa 245 N-terminaalisesta seriinistä, on väliini metioniinin sijasta, jolloin kummastakin sekvenssistä vaihtoehtoisesti puuttuu jokin ensimmäisestä kolmesta aminohaposta tai 35 kummassakin on vaihtoehtoisesti ylimääräinen polypeptidi- li 5 85335 sekvenssi Gly-Ala-Arg ennen N-terminaalia.

Kuvion 1 esittämässä aminohapposekvenssissä on 35 kysteiinijäännöstä ja täten on olemassa mahdollisuus 17 disulfidisillan muodostumiselle. Analogiassa muihin pro-5 teiineihin, joiden rakenne on määritetty yksityiskohtaisemmin, sekvenssin oletettu rakenne (disulfidisidok-sien muodostumisen perusteella) kohdassa 90 olevan aminohapon ja C-terminaalisen proliinin välissä on esitetty kuviossa 2. N-terminaalin rakenne on vähemmän varma, 10 vaikka joitakin ehdotuksia on esitetty (Progress in Fibrinolysis, 1983, 6, 269-273; ja Proc. Natl. Acad. Sei., 1984, 81, 5355-5359). t-PA:n rakenteen tärkeimmät ominaisuudet ovat kaksi rinkelimäistä aluetta (92:n ja 173:n aminohapon sekä 180:n ja 261:n aminohapon välissä), jotka 15 vastaavat proteiinin sitoutumisesta fibriiniin, sekä se-riiniproteaasialue, joka muodostaa B-ketjun suurimman osan ja joka vastaa plasminogeenin aktivaatiota. Erityisen merkittäviä seriiniproteaasin aminohappoja ovat katalyyttinen triadi, His/Asp/Ser. t-PA:ssa nämä esiintyvät 20 kohdissa 322, 371 ja 463. Kohtien 264 ja 395 kysteiini-aminohapporyhmien välinen disulfidisilta on myös tärkeä, koska se pitää A- ja B-ketjut yhdessä t-PA:n kaksiket-juisessa muodossa.

Kuvioissa 1 ja 2 on käytetty tavanomaisia yksi- ja 25 kolmikirjainkoodeja aminohappojäännöksille seuraavasti:

Asp D Asparagiinihappo Ile I Isoleusiini

Thr T Treoniini Leu L Leusiini

Ser S Seriini Tyr Y Tyrosiini

Glu E Glutamiinihappo Phe F Fenyylialaniini 30 Pro P Proliini His H Histidiini

Gly G Glysiini Lys K Lysiini

Ala A Alaniini Arg R Arginiini

Cys C Kysteiini Trp W Tryptofaani

Vai V Väliini Gin Q Glutamiini 35 Met M Metioniini Asn N Asparagiini . _" 1 6 85335 t-PA voidaan tuottaa millä tahansa aikaisemmin kuvatulla tai sinänsä tunnetulla tavalla. Se voidaan tuottaa esimerkiksi julkaisuissa Biochimica et Biophysica Acta, 1979, 580, 140-153; EP-julkaisuissa A—41 766 tai 5 A-113 319 kuvatusta normaalista tai neoplastisesta solu- linjasta. On kuitenkin edullista tuottaa t-PA viljellystä transformoidusta tai transfektoidusta solulinjasta, joka on tuotettu yhdistelmä-DNA-tekniikkaa käyttäen, kuten esimerkiksi EP-julkaisuissa A-93 619, A-117 059 tai 10 A-117 060 on kuvattu. On erityisen edullista käyttää julkaisussa Molecular and Cellular Biology, 1985, 5(7), 1750-1759 kuvatulla tavalla tuotettuja kiinalaisen hamsterin munasarjasoluja (CHO) t-PA:n tuotantoon. Täten kloonattu geeni kotransfektoidaan yhdessä dihydrofolaat-15 tireduktaasia (dhfr) koodaavan geenin kanssa dhfr* CHO-soluihin. Transformantit, jotka ilmentävät dhfr valikoidaan nukleosidivapaalta alustalta ja altistetaan kasvaville metotreksaattipitoisuuksille. Tällöin dhfr ja t-PA-geenit amplifioituvat yhdessä, johtaen stabiiliin 20 solulinjaan, joka pystyy ilmentämään korkeita tPA-tasoja.

t-PA puhdistetaan edullisesti millä tahansa kuvatuilla tai sinänsä tunnetuilla menetelmillä, kuten julkaisuissa Biochimica et Biophysica Acta, 1979, 580, 140-153; J. Biol. Chem., 1979, 254(6), 1998-2003; ibid, 1981, 25 256(13), 7035-7041; Eur. J. Biochem., 1983, 132, 681-686; EP-A-41 766; EP-A-41 766; EP-A-113 319 tai GB-A-2 122 219 kuvatuilla menetelmillä.

Ei tunnu olevan ylärajaa t-PA:n liukoisuudelle vesipohjaisessa liuoksessa. Erittäin suurissa pitoisuuksissa 30 (yli 150 000 000 iu/ml) liuos vain muuttuu viskoosiksi ilman merkittävää t-PA:n saostumista. t-PA:n pitoisuus vesipohjaisessa liuoksessa voi siksi vaihdella laajasti, esimerkiksi 50 000-50 000 000 IU/ml. Esillä olevan keksinnön maksimaalisen edun varmistamiseksi on edullista, 35 että t-PA:n pitoisuus on suurempi kuin 100 000 IU/ml, 7 85335 erityisesti suurempi kuin 500 000 IU/ml, ja aivan erityisesti suuremmpi kuin 1 000 000 IU/ml. On erityisen edullista, että t-PA:n konsentraatio on noin 5 000 000 IU/ml.

Vesipohjaisen liuoksen pH:n yläraja on edullisesti 5 4,5. Itse asiassa pH on edullisesti 2,5-4,0, edullisemmin 2,8-3,5 ja edullisimmin noin 3,0. Vesipohjaisen liuoksen toivottu pH saavutetaan yksinkertaisesti käyttämällä fysiologisesti hyväksyttävää epäorgaanista tai orgaanista happoa. Esimerkkeinä tämänkaltaisista hapoista ovat suo-10 lahappo, rikkihappo ja typpihappo, sekä sitruunahappo, viinihappo ja bentseenisulfonihappo. Näistä edullisin on suolahappo.

Vaikka jotkut fysiologisesti hyväksyttävät liuottimet voivat vaihtoehtoisesti esiintyä veden lisäksi, on 15 edullista, että liuoksen väliaine on kokonaisuudessaan tai olennaisesti vesipohjainen.

Lyofilisoidusta farmaseuttisesta valmisteesta saatu parenteraalinen liuos voi olla hypertoninen, hypotoninen tai isotoninen potilaan veren seerumiin nähden. Ei-toi-20 vottujen sivuvaikutusten välttämiseksi parenteraalinen liuos on edullisesti isotoninen, vaikkakaan pienet poikkeamat siitä eivät aiheuta fysiologista haittaa. Olennaisesti isotoninen parenteraalinen liuos saadaan siten, että valmisteeseen sisällytetään fysiologisesti hyväksyttä-25 vä aine, joka pystyy nostamaan liuoksen toonisuuden halutulle tasolle. Tämä aine voidaan sisällyttää vesiliuokseen, joka kylmäkuivataan, niin että se on läsnä jo lyo-filisoidussa farmaseuttisessa valmisteessa tai se voidaan sisällyttää neutraaliin tai happamaan veteen, jota käyte-30 tään valmisteen liuotukseen halutun parenteraalisen liuoksen saamiseksi. Esimerkit tämänkaltaisista aineista ovat alalla hyvin tunnettuja; näitä ovat dekstroosi (an-hydridi- tai monohydraattimuodossa) ja natriumkloridi sekä näiden seokset. Aineen pitoisuus parenteraalisessa 35 liuoksessa vaihtelee luonnollisesti ainekohtaisesti. Nat- 8 65335 riumkloridin tapauksessa pitoisuus on edullisesti 7-10 mg/ml, ja erityisen edullisesti noin 8,5 mg/ml (fysiologinen suolaliuos). Anhydridin dekstroosin tapauksessa pitoisuus on edullisesti 30-70 mg/ml ja erityisen edulli-5 sesti noin 50 mg/ml.

Vesiliuos voi vaihtoehtoisesti sisältää tämän kaltaisissa lyofilisoiduissa farmaseuttisissa formulaatiois-sa tavallisesti käytettyjä lisäaineita. Esimerkkinä on ihmisen seerumialbumiini, erilaiset sideaineet ja täyte-10 aineet, kuten mannitoli, laktoosi ja glukoosi. Lisäksi t-PA:lla on taipumus tarttua lasi- ja muovipintoihin, ja siksi voi olla toivottavaa sisällyttää pinta-aktiivinen aine vesiliuokseen tämänkaltaisen adsorption estämiseksi tai minimoimiseksi. Esimerkkeinä tämänkaltaisesta ai-15 neesta ovat vedettömän sorbitolin osittaisten rasva- happoestereiden polyoksietyleenijohdannaiset, kuten kauppanimellä "Tween 80" markkinoitu aine.

Yksi esillä olevan keksinnön yllättävä etu, t-PA:n olennaisesti lisääntyneen liukoisuuden lisäksi on se, 20 että lyofilisoidun farmaseuttisen valmisteen liuottaminen happamaan parenteraaliseen liuokseen ei näytä aiheuttavan merkittäviä fysiologisia häiriöitä potilaalle lääkettä annettaessa. Vaikuttaa siltä, että verenkierto pystyy y-leensä nopeasti nostamaan liuoksen pH:ta noin 7:ään mel-25 kein välittömästi sen antamisen jälkeen, ja näin t-PA leviää nopeasti verenkiertoon. Kuitenkin suositellaan, että tätä prosessia ei vaikeutettaisi olennaisesti millään tavoin ja täten parenteraalisessa liuoksessa, samoinkuin vesiliuoksessa, joka halutaan lyofilisoida, ja rekonsti-30 tuutiovedessä ei saisi olla vahvoja puskuroivia aineita. Kuitenkin heikko puskuri voidaan lisätä, joka ei merkittävästi estä tätä prosessia, ja itse asiassa hiukan hap-pamessa pH:ssa t-PA itse toimii omana heikkona puskuroin-tiaineenaan. Lisäksi ihmisen seerumialbumiini pystyy 35 toimimaan heikkona puskurina.

li 9 85335

Johtuen t-PA:n kasvaneesta liukoisuudesta vesiliuoksessa, jonka pH on 2-5, ei lyofilisoidun materiaalin liuottamisen jälkeen saatuun parenteraaliseen liuokseen ole tarvetta lisätä lisäaineita, kuten lysiiniä tai ornitii-5 nia tai niiden suoloja, t-PA:n liukoisuuden parantamiseksi.

t-PA:n vesiliuos voidaan valmistaa vaihtamalla puhdistetussa t-PA-liuoksessa oleva alusta vesiliuoksella, jonka pH on 2-5, tai liuottamalla puhdistettua t-PA:ta 10 vesiliuokseen,jonka pH on 2-5.

t-PA:n puhdistuksen viimeinen vaihe saattaa sisältää proteiinin eluoimisen kromatografipylväästä liuoksena, jossa on vahva puskurointiaine. Kuten aiemmin mainittiin, suositellaan, että parenteraalisessa liuoksessa ja täten 15 myös lyofilisoidussa farmaseuttisessa valmisteessa ja vesiliuoksessa ei ole vahvoja puskureita; edullinen tapa puskurin poistamiseksi samalla kun alusta vaihdetaan on dialyysin käyttö. Tämä voidaan suorittaa käyttämällä dia-lyysiletkua tai keinomunuaista, jossa puhdistettu liuos 20 dialysoidaan vesipohjaista väliainetta vastaan, jonka pH on 2-5. Saattaa olla suositeltavaa, varsinkin silloin kun t-PA:n pitoisuus puhdistetussa liuoksessa on suuri, ensin säätää liuoksen pH arvoon 2-5. Toinen tapa vahvan puskurin poistamiseksi samalla kun vaihdetaan alusta on suo-25 rittaa puhdistetulle liuokselle geelisuodatus ja kehittää pylväs vesipohjaisella väliaineella, jonka pH on 2-5.

Saostetussa kiinteässä muodossa olevan t-PA:n eristämiseksi puhdistetusta liuoksesta suositellaan pH:n säätämistä noin 5,5:een, liuoksen jäähdyttämistä juuri jää-30 tymispisteen yläpuolelle ja proteiinin talteenotto esimerkiksi sentrifugoimalla. Saostettu kiinteä aine voidaan sitten liuottaa vesipohjaiseen väliaineeseen, jonka pH on 2-5, tavanomaisella tavalla.

Suositellaan, että näin saatu vesiliuos sterilisoi-35 daan tavanomaisin menetelmin, kuten esimerkiksi suodatus- ίο 8 5 5 35 steriloinnilla, ja että se sitten annostellaan steriilei-hin muovi- tai lasiastioihin, kuten ampulleihin tai pulloihin sellaisina tilavuuksina kuin esimerkiksi 0,5-20 ml.

5 t-PA:n vesiliuos jäädytetään mieluiten lämpötilas sa -10...-40° C. Jäätynyt vesiliuos pidetään mieluiten tämän lämpöisenä kunnes tyhjökuivaus alkaa.

Jäädytetyn veriliuoksen lyofilisointi voidaan suorittaa tavanomaisin menetelmin ja se käsittää kuivauksen 10 joko täydessä tai osittaisessa tyhjiössä, esimerkiksi 0,01-0,1 torrin alipaineessa, tarpeeksi pitkän ajan, jotta olennaisesti kaikki jäätynyt neste saadaan poistetuksi.

Tyhjökuivaus yleensä suoritetaan -30...-40° C:ssa 15 prosessin alussa, jotta vesiliuos voidaan pitää suurelta osin tai täysin jäätyneessä tilassa. Prosessin jatkuessa ja veden poistuessa lämpötilaa voidaan asteittain nostaa, kunnes päästään huoneenlämpötilaan. Suositellaan, että prosessin lopussa tyhjökuivaus suoritettaisiin huoneen-20 lämpötilassa tai hieman yli huomattavassa tyhjössä (noin 0,01 torria), jotta lopusta vedestä saataisiin pois niin paljon kuin mahdollista. Näin saatavan lyofilisoidun farmaseuttisen valmisteen suositeltava kosteuspitoisuus on 2,5 %. Kun tyhjökuivaus on saatu päätökseen steriili muo-25 vi- tai lasiastia, joka sisältää lyofilisoidun farmaseuttisen valmisteen, suljetaan tavanomaisilla menetelmillä.

Jäädytetyn vesiliuoksen tyhjökuivauksen aikana vesi poistuu ja saadaan t-PA fysiologisesti hyväksytyn suolan muodossa. Tämän mukaisesti tämän keksinnön mukaan voidaan 30 myös tuottaa fysiologisesti t-PA:n hyväksytty suola, erityisesti fysiologisesti hyväksytty happoadditiosuola, kuten hydrokloridisuola.

Esillä olevan keksinnön käyttö mahdollistaa ensimmäisen kerran sellaisen lyofilisoidun farmaseuttisen 35 valmisteen valmistuksen, jolla saadaan parenteraalinen 11 «5335 liuos, jossa on korkea t-PA:n pitoisuus. Tämän mukaisesti käsillä olevan keksinnön mukaan voidaan myös valmistaa lyofilisoitu farmaseuttinen t-PA-valmiste, joka veteen liuotettuna pystyy varmistamaan suuremman kuin 100 000 5 IU/ml, vielä tarkemmin suuremman kuin 500 000 IU/ml ja tarkimmin suuremman kuin l 000 000 IU/ml t-PA-pitoisuu-den.

Parenteraalisen t-PA-liuoksen valmistamiseksi lääke-käyttöön tämän keksinnön mukaisella prosessilla valmis-10 tettu lyofilisoitu farmaseuttinen valmiste liuotetaan neutraaliin tai happameen veteen. Jos vesiliuos, josta lyofilisoitu farmaseuttinen valmiste on peräisin, on olennaisesti isotoninen, suositellaan, että vesi johon valmiste liuotetaan myös olisi olennaisesti isotoninen.

15 t-PA:n biologinen aktiivisuus liuotettaessa verihyy- tymien fibriiniverkosto on johtanut sen käyttöön trom-boottisten tautien hoidossa [The Lancet, 7. marraskuuta 1981, 1018-1020; ibid., 13. huhtikuuta 1985, 842-847; The New England Journal of Medicine, 1984, 310(10), 609-613; 20 ja ibid., 1985, 312(14), 932-936].

Esillä olevaa keksintöä voidaan siten käyttää nisäkkäiden tromboottisen sairauden hoitoon. Erityiset esimerkit tromboottisesta sairaudesta ovat alalla tunnettuja ja käsittävät esim. sydänlihaksen salpauksen, sydänlaskimo-25 tromboosin, keuhkoembolian ja halvauksen.

t-PA:n pääantomuoto on suonensisäinen, erityisesti laskimonsisäinen tiputus, vaikkakin muitakin mahdollisia antomuotoja, kuten lihaksensisäinen antomuoto, voidaan käyttää. Suonensisäiset tiputukset normaalisti suorite-30 taan niin, että parenteraalinen liuos on tippapussissa tai -pullossa tai sähköisesti toimivalla ruiskeella. Pussissa tai pullossa oleva liuos annetaan potilaalle joko painovoiman avulla tai käyttämällä pumppua. Painovoima-syöttösysteemin käyttö aineen annostelussa ei mahdollista 35 riittävää parenteraaliliuoksen annostelunopeuden kontrol- 12 5 5 5 5 lia, ja siksi pumpun käyttöä suositellaan erityisesti sellaisten liuosten kanssa, joissa on suuri t-PA-pitoi-suus. Vielä suositeltavampi kuitenkin on sähköisesti toimivan ruiskeen käyttö, jonka avulla saadaan vieläkin pa-5 rempi annostelunopeuden säätö.

Tromboottisen häiriön hoitamiseksi tarvittavan t-PA:n määrä riippuu useista tekijöistä, kuten esimerkiksi potilaan painosta ja iästä, vamman laadusta ja vaikeusasteesta, ja annostelutavasta, ja jää lopulta hoita-10 van lääkärin tai eläinlääkärin harkintaan. On kuitenkin todennäköistä, että vaikuttava määrä esimerkiksi sepel-valtimotulpan liuottamiseen on yleisesti suuruusluokkaa 150 000-450 000 IU/kg potilaan painoa tunnissa. Täten vaikuttava määrä 1 tunnissa 70 kg painavalle ihmiselle on 15 yleisesti 10 000 000-30 000 000 IU, erityisesti noin 20 000 000 IU, ja tämä määrä voidaan antaa joko aloitus-annoksen jälkeen tai ilman aloitusannosta. On myös todennäköistä, että annos tulee olemaan pienempi joissakin tromboottisissa tiloissa, kuten laskimotromboosin ta-20 pauksessa ja akuutissa halvauksessa, tai yksinkertaisesti jo uudelleenavatun sepelvaltimon aukipitämiseen. Näissä tapauksissa vaikuttava määrä on yleensä 7 000-36 000 IU/kg potilaan painosta tunnissa.

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä, eikä niitä 25 pidä tulkita keksintöä rajoittavina.

Esimerkki 1

Kirkastettu t-PA:n näyte (eristetty transformoidun CHO-solulinjan viljelmästä, joka tuotettiin käyttämällä julkaisussa Molecular and Cellular Biology, 1985, 5(7), 30 1750-1759 kuvattua menetelmää) puhdistettiin kromatogra- fisesti ja t-PA kerättiin talteen vesipohjaisena liuoksena, joka sisälsi 0,17 mol/1 natriumsitraattia ja 0,01 % (p/t) Tween 80:a ja jonka pH oli 5,5. Liuoksen pH säädettiin arvoon 3,0 suolahapolla ja saatu liuos väkevöitiin 35 ultrasuodattamalla (H-10 Cartridge väkevöintilaite; li 13 ö 5 3 3 5

Aroicon Ltd., Upper Hill, Stonehouse, Gloucestershire, Englanti). Väkevöityä vesiliuosta puhdistettiin edelleen laittamalla se geelisuodatuspylvääseen (Sephadex G-150; Pharmacia Biotechnology, Uppsala, Ruotsi) ja eluoiroalla 5 0,85 % suolaliuoksella, joka sisälsi 0,01 % (p/t) Tween 80:a ja jonka pH oli 3,0. Tällä tavoin saatiin hyvin puhdasta t-PA:n vesiliuosta, joka väkevöitiin vielä kerran kertakäyttöisellä keinomunuaisella. t-PA saostettiin liuoksesta nostamalla pH-arvoa 5,5:een natriumhydrok-10 sidilla ja pitämällä suspensiota 4° C:ssa 2 tuntia. t-PA otettiin talteen sentrifugoimalla (4000 x g) 30 minuuttia 4° C:ssa. t-PA:n pelletti liuotettiin uudelleen vesi-liuokseen, joka sisälsi natriumkloridia (0,85 % (p/t) ja 0,01 % Tween 80:a ja jonka pH oli säädetty arvoon 3,0 15 suolahapolla. Suolaliuosta käytettiin sellainen määrä, että saatiin t-PA-konsentraatioksi 7 500 000 - 10 000 000 IU/ml. Tätä t-PA-liuosta laimennettiin edelleen natrium-kloridin [0,85 % (p/t)] vesiliuoksella, jossa oli 0,01 % (p/t) Tween 80:a ja jonka pH oli säädetty arvoon 3,0 suo-20 lahapolla ja johon happamaan suolaliuokseen oli lisätty 10-%:sta mannitoliliuosta niin, että lopullinen pitoisuus oli 5 000 000 IU/ml t-PA:ta ja 25 mg/ml mannitolia. Saatu liuos suodatus-steriloitiin ja annosteltiin 1 ml:n annoksina lasipulloihin, jotka jäädytettiin -35° C:ssa. Val-25 misteeseen kohdistettiin 0,05 torrin tyhjö. Noin 24 tunnin jälkeen lämpötilaa vähitellen nostettiin 5° C:een ja pidettiin tässä lämpötilassa 16 tuntia. Sen jälkeen lämpötilaa jälleen nostettiin 25° C:een ja alipaine säädettiin 0,02 torriin vielä 24 tunniksi, jonka jälkeen pullot 30 suljettiin kuivan typen osittaisessa tyhjössä (600 tor-ria) .

Esimerkki 2

Esimerkin 1 mukaisesta lyofilisoidusta t-PA-valmis-teesta saadun parenteraalisen liuoksen trombolyyttistä 35 tehokkuutta arvioitiin kaulalaskimon tromboosin in vivo- i4 8 5 35 5 mallissa.

(a) Menetelmä

Kokeessa käytetty menetelmä oli olennaisesti sama kuin Collen et ai.:n kuvaama (J. Clin. Invest., 1983, 71, 5 368-376).

Esimerkin 1 mukainen lyofilisoitu valmiste liuotettiin nopeasti ja täydellisesti steriiliin isotoniseen suolaliuokseen, jonka pH oli säädetty 3,0:ksi ja joka sisälsi 0,01 % Tween 80:a. Täten saatiin tarvittava määrä 10 parenteraalista liuosta kahden tunnin 500 000 IU/kg tiputusta varten. Tiputus tapahtui kanyylin kautta oikeanpuoleiseen reisilaskimoon. Kokeessa käytettiin neljää Uuden Seelannin valkoista kaniinia. Tiputuksen jälkeen trom-bolyysiaste arvioitiin.

15 (b) Tulokset

Trombolyysiprosentti oli 28,9 ± 4,1 täten osoittaen esimerkin 1 mukaisen parenteraalisen liuoksen trombolyyt-tisen vaikutuksen. Lisäksi mitään vastareaktioita ei todettu liuoksen käytön aikana.

20

Claims (6)

15 85335

1. Menetelmä lyofilisoidun farmaseuttisesti käytettävän t-PA-valmisteen valmistamiseksi, tunnet- 5. u siitä, että t-PA:n vesiliuos, jonka pH on 2 - 5, lyofilisoidaan.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesiliuoksen t-PA:n pitoisuus on noin 5 000 000 kansainvälistä yksikköä/ml.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesiliuoksen pH on noin 3,0.

4. Patenttivaatimusten 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesiliuos sisältää pinta-ak- 15 tiivisen aineen.

5. Patenttivaatimusten 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesiliuos on olennaisesti puskuroimaton.

6. Patenttivaatimusten 1-5 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että vesiliuos on olennaisesti sisältää sellaisen määrän natriumkloridia, että se on olennaisesti isotoninen ihmisen veren seerumin suhteen. ie S 5 3 3 5