NO171345B - Fremgangsmaate for fremstilling av farmasoeytiske preparater inneholdende vevsplasminogenaktivator - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for fremstilling lyofiliserte farmasøytiske preparater inneholdende vevsplasminogenaktivator for anvendelse i human- og veteri-nærmedisinen.

Det antas at det er en dynamisk likevekt mellom enzymsystemet som kan danne levret eller størknet blod - koagulerings-systemet - og enzymsystemet som kan oppløse levret blod - det fibrinolytiske system - hvilket opprettholder et intakt patent vaskulært sjikt. For å begrense tap av blod fra skade dannes levret blod i skadede blodkar. Etter naturlig reparasjon av skaden, blir overflødige klumper av levret blod oppløst gjennom innvirkning av det fibrinolytiske system. Av og til dannes klumper av levret blod uten sår skade og kan sette seg fast i større blodkar hvilket resultererer i en delvis eller endog total obstruksjon av blodstrømmen. Når dette oppstår i hjertet, lungen eller hjernen kan resultatet være et myokardialt infarkt, pulmonal embolisme eller slag. Disse tilstander er kombinert den største årsaken til sykelighet og dødelighet i de industrialiserte nasjoner.

Levret blod består av et fibrøst nettverk som kan oppløses av det proteolytiske enzymet plasmin. Enzymet avledes fra det inaktive proenzym, plasminogen, en komponent i blodplasma, ved innvirkning av en plasminogenaktivator. Det forekommer to immunologisk forskjellige pattedyr-plasminogenaktivatorer. Intrinsik plasminogenaktivator, også kjent som urokinase, er et enzym produsert av nyren og kan isoleres fra urin. Den kan også fremstilles fra en rekke vevskulturkilder. Ekstrinsik plasminogenaktivator, også kjent som vaskulær plasminogenaktivator og som vevsplasminogenaktivator (t-PA), kan isoleres fra mange vevshomogenater (spesielt livmor hos mennesker), den vaskulære celleveggen og fra noen celle-kulturer. I tillegg til disse to typer av plasminogenaktivator finnes det også et bakterieprodukt, streptokinase, fremstilt fra p<->hemolytiske streptokokker. En hovedulempe med både urokinase og streptokinase er at de er aktive i hele kretsløpet og ikke bare på stedet for blodlevring. De kan f.eks. ødelegge andre blodproteiner slik som fibrinogen, protrombin, faktor V og faktor VIII og dermed redusere blodlevrende evne og øke risikoen for blødning. I motsetning til dette er den biologiske aktiviteten til t-PÅ avhengig av tilstedeværelsen av fibrin hvortil den bindes og hvor den aktiveres. Maksimum aktivitet utvikles dermed bare på stedet for en blodlevring, dvs. i nærvær av fibrinnettverket som skal oppløses og dette unngår i stor grad risikoen for blødning.

Hovedveien for administrasjon av t-PA er ved intravaskulær administrasjon av t-PA er ved intravaskulær infusjon, hvilket således nødvendiggjør formuleringen av t-PA som en parenteral oppløsning. I tilfellet for et protein er det foretrukket å presentere legemidlet for legen eller veterinæren som et lyofilisert farmasøytisk preparat på grunn av dets betydelige transport- og lagringsfordeler i forhold til et flytende preparat. Det er imidlertid viktig at ethvert slikt lyofilisert preparat lett kan omdannes til den ønskede parenterale oppløsning uten urimelig ulempe og vanskelighet og at legen eller veterinæren kan oppnå den nødvendige konsentrasjon av legemidlet i enhver gitt situasjon ganske enkelt ved rekonstituering av preparatet i den hensiktsmessige mengde oppløsningsmiddel. Det er f.eks. ikke tilrådelig å admini-strere et stort volum oppløsning til en pasient med hjerte-eller nyreforstyrrelser fordi dette ville sette hjertet eller nyrene under enda større belastning. Volumet bør derfor holdes til et minimum under slike forhold. Det er således ønskelig at det kan oppnås en parenteral oppløsning ikke bare med en relativt lav konsentrasjon, men også med en høy konsentrasjon av legemidlet.

En rekke lyofiliserte farmasøytiske preparater av t-PA har vært beskrevet i den tidligere teknikk, f.eks. i EP-A-113.319 og EP-A-123.304. Preparatene fremstilles fra vandige saltoppløsninger av t-PA, hvori pH-verdien er omtrent nøytral, og er forbundet med den ulempe at oppløseligheten av t-PA i slike oppløsninger er lav i fravær av en økning i den ioniske konsentrasjon. Følgelig inneholder de parenterale oppløsningene oppnådd fra slike lyofiliserte preparater enten lave konsentrasjoner av t-PA, hvilket i noen situasjoner nødvendiggjør administrasjon av uønsket store volumer oppløsning til en pasient, eller de er hypertoniske, hvilket ved administrasjon kan være skadelig for røde blodceller.

Det er nå funnet at oppløseligheten for t-PA i en vandig oppløsning kan forbedres dersom oppløsningens pH-verdi er i et surt område, at et lyofilisert farmasøytisk preparat kan fremstilles fra en sur oppløsning av t-PA, og at preparatet kan gi en parenteral oppløsning som ved administrasjon ikke er forbundet med noen betydelige fysiologiske problemer.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av et lyofilisert farma-søytisk preparat av t-PA, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved at en frosset, vandig, vesentlig ubufret og sterilisert oppløs-ning av t-PA, hvori pH-verdien er fra 2 til 5, vakuumtørkes, idet mediet for den vandige oppløsning innbefatter et fysiologisk akseptabelt middel som gjør opp-løsningen vesent-lig isotonisk med blodserum fra mennesker.

Som et resultat av den forbedrede oppløseligheten av t-PA, kan det ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles et lyofilisert farmasøytisk preparat som kan gi en parenteral oppløsning inneholdende en høy konsentrasjon av t-PA uten noen vesentlig risiko for at t-PA-materialet blir utfelt av oppløsningen. Det lyofiliserte preparatet kan derfor presenteres til leger eller veterinærer som kan oppløse preparatet og etter behov til den ønskede konsentrasjon ved bruk f.eks. av vann med nøytral eller sur pH. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer derfor et stabilt lyofilisert farmasøytisk preparat som gir større fleksibilitet ved dets behandling og bruk av leger og veterinærer, samt sørger for en mer hensiktsmessig transport- og lagringsmåte.

t-PA-materialet som anvendes i foreliggende oppfinnelse kan være ethvert bioaktivt protein vesentlig tilsvarende t-PA fra pattedyr, spesielt menneske, og innbefatter former med og uten glykosylering. Det kan være en- eller to-kjedet t-PA eller en blanding derav, som beskrevet i EP-A-112.122 og har, i tilfellet for fullstendig glykosylert human t-PA, en tilsynelatende molekylvekt på polyakrylamidgeler på ca. 70.000 og et isoelektrisk punkt mellom 7,5 og 8,0. t-PA-materialet har fortrinnsvis en spesifikk aktivitet på ca. 500.000 IU/mg (internasjonale enheter/mg, hvor den internasjonale enheten er en aktivitetsenhet som definert av WHO, National Institute for Biological Standards and Control, Holly Hill, Hampstead, London, NW3 6RB, U.K.).

Aminosyresekvensen i t-PA tilsvarer fortrinnsvis vesentlig den som er angitt på fig. 1. Sekvensen er således identisk med den på fig. 1 eller inneholder en eller flere aminosyre-utelatelser, -substitusjoner, -innskudd, -inversjoner eller-addisjoner av allelisk opprinnelse, idet den resulterende sekvens ellers har minst 80$ og fortrinnsvis 90$ homologi med sekvensen på fig. 1 og bibeholder vesentlig de samme biologiske og immunologiske egenskaper til proteinet. Spesielt er t-PA-sekvensen identisk med den på fig. 1 eller har den samme sekvensen, men hvor aminosyren i stilling 245 fra serin-N-terminusen er valin istedenfor metionin, idet hver sekvens eventuelt er uten noen av de første tre aminosyrene eller eventuelt har en ytterligere polypeptid N-terminal-presekvens av Gly-Ala-Arg.

Aminosyresekvensen angitt på fig. 1 har 35 cysteinrester og således potensiale for dannelse av 17 disulfid-broer. Basert på analogi med andre proteiner hvis struktur har blitt bestemt mer detaljert, er den postulerte strukturen for sekvensen (som skriver seg fra disulfid-bindingsdannelse) mellom aminosyren i 90-stillingen og prolin-C-terminusen angitt på fig. 2. Strukturen til N-terminalområdet er mindre sikker skjønt noen forslag har blitt fremsatt (Progress in Fibrinolysis, 1983, 6, 269-273; og Proe. Nati. Åcad. Sei., 1984, 81, 5355-5359). De viktigste trekkene i strukturen til t-PA er de to kringleområdene (mellom den 92. og 173. aminosyren og mellom den 180. og 261. aminosyren), som er ansvarlige for bindingen av proteinet til fibrin, og serin-proteaseområdet som omfatter størstedelen av B-kjeden og som er ansvarlig for aktiveringen av plasminogen. Aminosyrene med spesiell signifikans i serin-proteaser er den katalytiske triaden, His/Asp/Ser. I t-PA forekommer disse ved stillingene 322, 371 og 463. Disulfid-broen mellom 264. og 395. cystein-aminosyrerestene er også viktig siden den holder sammen A- og B-kjedene i den to-kjedede formen av t-PA.

På fig. 1 og 2 har de konvensjonelle kodene med en og tre bokstaver blitt benyttet for aminosyrerestene som følger:

t-PA kan oppnås ved en hvilken som helst av de metoder som er beskrevet eller kjente innen teknikken. Den kan f.eks. oppnås fra en normal eller neoplastisk cellelinje av den typen som er beskrevet i Biochimica et Biophysica Acta, 1979, 580, 140-153; EP-A-41.766 eller

EP-A-113.319. Det er imidlertid foretrukket at t-PA oppnås fra en dyrket transformert eller transfisert cellelinje oppnådd ved bruk av rekombinant DNA-teknologi som beskrevet i f.eks. EP-A-93.619; EP-A-117.059 eller EP-A-117.060. Det er særlig foretrukket at eggstokkceller fra kinesisk hamster (CHO) anvendes for fremstilling av t-PA og oppnås på den måte som er beskrevet i Molecular and Cellular Biology, 1985, 5( 7). 1750-1759. På denne måten blir det klonede gen kotransfisert med genet som koder dihydrofolat-reduktase (dhfr) til dhfr~CHO-celler. Transformanter som uttrykker dhfr velges på media som mangler nukleosider og eksponeres overfor økende konsentrasjoner av metrotreksat. dhfr- og t-PA-genene blir således koamplifisert hvilket leder til en stabil cellelinje som kan uttrykke høye nivåer av t-PA.

t-PA-materialet blir fortrinnsvis renset under anvendelse av en hvilken som helst av de metoder som er beskrevet eller kjent innen teknikken, slik som metodene beskrevet i Biochimica et Biophysica Acta, 1979, 580, 140.153; J. Biol. Chem., 1979, 254( 6). 1998-2003; ibid, 1981, 256( 13). 7035-7041; Eur. J. Biochem., 1983, 132, 681-686; EP-A.41.766; EP-A-113.319 eller GB-A-2.122.219.

Det synes ikke å være noen øvre grense for oppløseligheten av t-PA i den vandige oppløsning for bruk i foreliggende fremgangsmåte. Ved meget høye konsentrasjoner, slik som over 150.000.000 IU/ml (internasjonale enheter/ml), blir bare oppløsningen viskøs uten noen betydelig utfelling av t-PA. Konsentrasjonen av t-PA i den vandige oppløsningen kan derfor variere innen vide grenser, f.eks. fra 50.000 til 50.000.000 IU/ml. For å sikre den maksimale fordel fra foreliggende oppfinnelse, er det foretrukket at konsentrasjonen av t-PA er større enn 100.000 IU/ml, mer spesielt større enn 500.000 IU/ml, og mest spesielt større enn 1.000.000 IU/ml. Det er særlig foretrukket at konsentrasjonen av t-PA er ca. 5.000.000 IU/ml.

Den øvre grensen for pH i den vandige oppløsning er fortrinnsvis 4,5. pH-verdien er fortrinnsvis i området fra 4,5 til 4,0, mer foretrukket fra 2,8 til 3,5, og helst ca. 3,0. Den ønskede pH-verdi til den vandige oppløsningen oppnås hensiktsmessig ved bruk av en fysiologisk akseptabel uorganisk eller organisk syre. Eksempler på en slik syre innbefatter saltsyre, svovelsyre og salpetersyre, og sitronsyre, vinsyre og benzensulfonsyre. Av disse eksemplene er saltsyre foretrukket.

Selv om et fysiologisk akseptabelt ko-oppløsningsmiddel eventuelt kan være tilstede i tillegg til vann, er det foretrukket at mediet for den vandige oppløsning fullstendig eller vesentlig er vandig.

Den parenterale oppløsning som oppnås fra det lyofiliserte farmasøytiske preparatet kan være hypertonisk, hypotonisk eller isotonisk med pasientens blodserum. For å unngå uønskede bivirkninger, er imidlertid den parenterale oppløsning fortrinnsvis isotonisk selv om mindre avvik ikke er av større fysiologisk betydning. En vesentlig isotonisk parenteral oppløsning kan oppnås ved tilføyelse av et fysiologisk akseptabelt middel som kan heve oppløsningens tonisitet til det nødvendige nivå. Midlet kan innbefattes i den vandige oppløsning som skal frysetørkes slik at det allerede er tilstede i det lyofiliserte farmasøytiske preparatet eller det kan inkluderes i vannet av nøytral eller sur pH-verdi som anvendes for å oppløse preparatet for oppnåelse av den ønskede parenterale oppløsning. Eksempler på et slikt middel er velkjent innen teknikken og innbefatter dekstrose (i vannfri eller monohydratform) og natriumklorid og blandinger derav. Konsentrasjonen av midlet i den vandige oppløsning eller i vannet for oppløsning vil naturligvis variere fra middel til middel. I tilfellet for natriumklorid er konsentrasjonen fortrinnsvis 7-10 mg/ml, og helst ca. 8,5 mg/ml, idet konsentrasjonen ofte betegnes som fysiologisk saltoppløsning. I tilfellet for vannfri dekstrose er konsentrasjonen fortrinnsvis 30-70 mg/ml og helst ca. 50 mg/ml.

Den vandige oppløsningen kan eventuelt inneholde additiver som normalt er forbundet med lyofiliserte farmasøytiske preparater av denne typen. Eksempler innbefatter human serumalbumin, og bindemidler og fyllstoffer slik som mannitol, laktose og glukose. I tillegg har t-PA tendens til å adsorberes til glass- og plastoverflater og det kan derfor være ønskelig å innbefatte et overflateaktivt middel i den vandige oppløsningen for å hindre eller minimalisere slik adsorpsjon. Eksempler på et slikt middel innbefatter polyoksyetylenderivater av fettsyre-partialestere av sorbitolanhydrider, slik som markedsføres under vare-betegnelsen "Tween 80".

En av de overraskende fordelene ved foreliggende oppfinnelse bortsett fra den vesentlig forøkede oppløseligheten av t-PA, er at bruken av en sur parenteral oppløsning oppnådd fra rekonstituering av det lyofiliserte farmasøytiske preparatet ikke synes å gi noen betydelige uheldige fysiologiske effekter på administrasjonen til pasienten. Det synes som om blodstrømmen generelt er i stand til å heve oppløsningens pH-verdi til nøytral nesten så snart som kontakt foreligger, idet t-PA-materialet hurtig fordeles i blodstrømmen. Det er imidlertid foretrukket at denne prosessen ikke vesentlig hindres på noen måte og at den parenterale oppløsningen og således den vandige oppløsningen som skal frysetørkes, og vannet for rekonstituering ikke inneholder et sterkt buffermiddel. Et svakt buffermiddel derimot, som ikke betydelig inhiberer denne prosessen, kan innbefattes og ved sur pH virker virkelig t-PA i seg selv som sitt eget svake buffermiddel. I tillegg er human serumalbumin i stand til å virke som et svakt buffermiddel.

På grunn av den vesentlige forøkede oppløselighet av t-PA i en vandig oppløsning, hvori pH-verdien er fra 2 til 5, er det intet behov for at det i den parenterale oppløsningen, oppnådd fra rekonstituering av det lyofiliserte preparat, innbefattes noe ytterligere materiale slik som lysin eller ornitin eller et salt derav, for å forøke oppløseligheten av t-PA.

Den vandige oppløsningen av t-PA kan fremstilles ved oppnåelse av en oppløsning av renset t-PA og utveksle mediet med et vandig medium som har en pH fra 2 til 5, eller ved å oppløse renset t-PA i et vandig medium med en pH-verdi fra 2 til 5.

Rensingen av t-PA kan som et sluttrinn innebære eluering av proteinet fra en kromatografisk kolonne som en oppløsning inneholdende et sterkt buffermiddel. Som nevnt tidligere, er det foretrukket at den parenterale oppløsningen, og således det lyofiliserte farmasøytiske preparat og vandig oppløsning, ikke inneholder et sterkt buffermiddel og en hensiktsmessig metode for å bevirke dets fjerning, mens mediet utveksles, er derfor å benytte dialyse. Dette kan foretas ved bruk av dialyserør eller en kunstig nyre hvori den rensede oppløsning dialyseres mot et vandig medium hvori pH-verdien er fra 2 til 5. Det kan være ønskelig, spesielt dersom konsentrasjonen av t-PA i den rensede oppløsning er høy, først å justere oppløsningens pH-verdi slik at den er fra 2 til 5. En annen metode for å bevirke fjerning av et sterkt buffermiddel, mens mediet utveksles, er å underkaste den rensede oppløsning for gelfiltrering og å utvikle kolonnen med et vandig medium hvis pH-verdi er fra 2 til 5.

t-PA i form av et utfelt fast stoff kan fortrinnsvis oppnås fra en renset oppløsning ved å justere pH-verdien til ca. 5,5, avkjøle oppløsningen til like over dens frysepunkt, og utvinne proteinet ved f.eks. sentrifugering. Det utfelte faste stoffet kan deretter oppløses i et vandig medium som har en pH-verdi fra 2 til 5 på en konvensjonell måte.

Det er foretrukket at den resulterende vandige oppløsning steriliseres på konvensjonell måte f.eks. ved filter-sterilisering og at den deretter fordeles i sterile beholdere av plast eller glass, slik som ampuller eller små glass, i volumer på f.eks. fra 0,5 til 20 ml.

Den vandige oppløsningen av t-PA fryses, fortrinnsvis ved en temperatur fra -10 til -40°C. Den frossede vandige oppløsning holdes deretter fortrinnsvis ved denne temperaturen inntil vakuumtørkingen begynnes.

Vakuumtørking av den frossede vandige oppløsningen kan utføres på konvensjonell måte og innbefatter tørking under et partielt eller fullstendig vakuum, f.eks. ved 0,01-0,1 torr, i en tilstrekkelig tid til å bevirke fjerning av vesentlig all den frosne væsken.

Den temperatur ved hvilken vakuumtørking utføres er vanligvis fra -30 til -40°C ved begynnelsen av prosessen for derved å holde den vandige oppløsningen i en vesentlig eller fullstendig frosset form. Etter hvert som prosessen forløper og vannet fjernes, kan temperaturen gradvis økes inntil den når romtemperatur. Ved slutten av prosessen er det foretrukket å utføre vakuumtørkingen ved romtemperatur eller like over under et vesentlig vakuum på ca. 0,01 torr for å fjerne så mye som mulig av de siste spor av vann. Fuktighetsinnholdet i det resulterende lyofiliserte farmasøytiske preparat er fortrinnsvis mindre enn 2, 5%. Når først vakuumtørkingen er fullført, blir den sterile beholderen av plast eller glass, inneholdende det lyofiliserte farmasøytiske preparat, deretter forseglet på hensiktsmessig måte.

Under vakuumtørkingen av den frosne vandige oppløsningen, fjernes vannet og etterlater t-PA-materialet i form av et fysiologisk akseptabelt salt. Følgelig tilveiebringer også foreliggende oppfinnelse et fysiologisk akseptabelt salt, spesielt et fysiologisk akseptabelt syresalt, slik som hydrokloridsaltet, av t-PA.

Anvendelsen av foreliggende oppfinnelse muliggjør for første gang oppnåelse av et lyofilisert farmasøytisk preparat som kan gi en parenteral oppløsning inneholdende en høy konsentrasjon av t-PA. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer følgelig også et lyofilisert farmasøytisk preparat av t-PA som, ved oppløsning i vann, kan gi en konsentrasjon av t-PA over 100.000 ITJ/ml, mer spesielt over 500.000 IU/ml og mest spesielt over 1.000.000 IU/ml.

For å fremstille en parenteral oppløsning av t-PA for administrasjon, blir det ifølge oppfinnelsen fremstilte lyofiliserte farmasøytiske preparat rekonstituert i vann av nøytral eller sur pH. Dersom den vandige oppløsningen hvorfra det lyofiliserte farmasøytiske preparat ble oppnådd er vesentlig isotonisk, så er det foretrukket at vannet for rekonstituering også er vesentlig isotonisk.

Den biologiske aktiviteten til t-PA med henblikk på oppløs-ning av fibrin-nettverket i levret blod har ledet til dets nyttevirkning i behandlingen av trombotiske forstyrrelser (The Lancet, 7. november 1981, 1018-1020; ibid., 13. april 1985, 842-847; The New England Journal of Medicine, 1984, 310( 10), 609-613; ibid., 1985, 312( 14 ). 932-936). Behandling av en trombotisk forstyrrelse hos pattedyr foretas administrasjon til pattedyret av en parenteral oppløsning av t-PA oppnådd fra et lyofilisert farmasøytisk preparat som fremstilt.

Spesielle eksempler på en trombotisk forstyrrelse er kjent i teknikken, men inkluderer mycokardialt infarkt, dypåre-trombose, pulmonar embolisme og slag.

Hovedveien for administrasjon av t-PA er ved intravaskulær, spesielt intravenøs, infusjon selv om andre administrasjons-veier slik som intramuskulær administrasjon, kan benyttes. Intravaskulære infusjoner utføres normalt med den parenterale oppløsningen inneholdt i en infusjonspose eller -flaske eller i en elektrisk operert infusjonssprøyte. Oppløsningen kan leveres fra infusjonsposen eller -flasken til pasienten ved gravitasjonstilførsel eller ved bruk av en infusjonspumpe. Bruken av infusjonssystemer med gravitasjonstilførsel sørger ikke for tilstrekkelig kontroll over administrasjonshastigheten av den parenterale oppløsningen og derfor foretrekkes bruken av en infusjonspumpe spesielt med oppløsninger inneholdende relativt høye konsentrasjoner av t-PA. Mer foretrukket er imidlertid anvendelsen av en elektrisk drevet infusjonssprøyte som bidrar til enda større kontroll over administrasjonshastigheten.

En effektiv mengde t-PA for behandling av et pattedyr som har en trombotisk forstyrrelse vil naturligvis avhenge av flere faktorer inkludert f.eks. alderen og vekten på pattedyret, den nøyaktige tilstand som krever behandling og dennes alvorlighetsgrad, administrasjonsveien, og vil til syvende og sist bli bedømt av legen eller veterinæren. Det er imidlertid sannsynlig at en effektiv mengde for lysering av f.eks. en kranspulsåre-blodpropp generelt vil være i området 150.000-450.000 IU/kg legemsvekt av pasienten pr. time. For et voksent menneske på 70 kg vil således en effektiv mengde pr. time generelt være 10.000.000-30.000.000 IU, spesielt ca. 20.000.000 IU, og denne mengden kan administreres med eller uten en primingdose. Det er også sannsynlig at doseringen vil være mindre for noen trombotiske tilstander, slik som dypåre-trombose og akutt slag, eller for ganske enkelt å opprett-holde åpenhet av en allerede reperfusert kranspulsåre. I disse situasjoner vil en effektiv mengde generelt være 7.000-36.000 IU/kg legemsvekt av pasienten pr. time.

Følgende eksempler illustrerer foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 1

En klaret, innhøstet prøve av t-PA, oppnådd fra en dyrket transformert CHO-cellelinje som var oppnådd ved bruk av metoden ifølge Molecular and Cellular Biology, 1985, 5( 71.

1750-1759, ble renset kromatografisk og t-PA-materialet oppsamlet som en vandig oppløsning inneholdende 0,17 M natriumcitrat og 0,0156 (vekt/vol) "Tween 80" ved en pH på 5,5. Oppløsningens pH-verdi ble justert til 3,0 med saltsyre og den resulterende oppløsning konsentrert ved ultra-filtrering ved bruk av en H-10-patron (Amicon Ltd., Upper Hill, Stonehouse, Gloucestershire, England). Den konsentrerte vandige oppløsningen ble ytterligere renset ved å anbringe den på en gelfiltreringskolonne (Sephadex G-150; Pharmacia Biotechnology, Uppsala, Sverige) og eluering med 0,85$ saltoppløsning inneholdende 0,01$ (vekt/vol) "Tween 80" ved en pH-verdi på 3,0. En høyt renset vandig oppløsning av t-PA ble således oppnådd og denne ble konsentrert en gang til ved bruk av en kunstig engangsnyre. t-PA-materialet ble utfelt fra oppløsning ved å øke pH-verdien til 5,5 med natrium-hydroksyd og opprettholdelse av suspensjonen ved 4°C i 2 timer. t-PA-materialet ble utvunnet ved sentrifugering ved 4000 x g i 30 minutter ved 4°C. Pelleten av t-PA ble gjenoppløst i en vandig oppløsning av natriumklorid (0,85$

(vekt/vol)) inneholdende 0,01$ (vekt/vol) "Tween 80" og justert til pH 3,0 med saltsyre. Volumet av saltoppløsning benyttet var det som var nødvendig for å gi en konsentrasjon av t-PA mellom 7.500.000 IU/ml og 10.000.000 IU/ml. Denne oppløsning av t-PA ble fortynnet med ytterligere vandig oppløsning av natriumklorid (0,85$ (vekt/vol)) inneholdende 0,0156 (vekt/vol) "Tween 80" og justert til pH 3,0 med saltsyre og også med tilstrekkelig av en oppløsning av 1056 (vekt/vol) mannitol i den samme sure saltoppløsning for oppnåelse av sluttlige konsentrasjoner på 5.000.000 IU/ml av t-PA og 25 mg/ml mannitol. Den resulterende oppløsning ble filtersterilisert og fordelt i volumer av 1 ml i små glassflasker som ble frosset ved -35°C. Et vakuum ble påsatt ved 0,05 torr. Etter ca. 24 timer ble temperaturen gradvis øket til 5°C og holdt ved denne temperatur i 16 timer. Den ble deretter øket igjen til 25° C og vakuumet ble øket til 0,02 torr i ytterligere 24 timer, hvoretter glassflaskene ble

forseglet under et partielt vakuum på 600 torr av tørr nitrogen.

Eksempel 2

Den trombolytiske effektiviteten for en parenteral oppløsning oppnådd fra det lyofiliserte preparatet av t-PA i eksempel 1 ble bedømt i en in vivo-modell av halsåre-trombose.

(a) Metode:

Forsøksmetoden som i alt vesentlig ble fulgt, er den som først ble beskrevet av Coilen et al. (J. Clin. Invest., 1983, 71, 368-376).

Det lyofiliserte preparatet i eksempel 1 oppløste seg hurtig og fullstendig i steril isotonisk saltoppløsning justert til pH 3,0 inneholdende 0,0156 "Tween 80". En parenteral oppløsning ble således tilveiebragt for en 2 timers infusjon av 500.000 IU/kg av t-PA. Infusjon ble foretatt via en kanyle i høyre lårblodåre. Fire hvite New Zealand kaniner ble benyttet i studiet. Etter infusjon ble graden av trombolyse bestemt.

(b) Resultater:

Den prosentvise trombolyse var 28,9 ± 4,1, hvilket således demonstrerer den trombolytiske effekten til den parenterale oppløsning oppnådd fra det lyofiliserte preparatet i eksempel 1. I tillegg ble det ikke observert noen uheldige reaksjoner med denne oppløsningen.

Claims (8)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et lyofilisert farmasøytisk preparat av t-PA, karakterisert ved at en frosset, vandig, vesentlig ubufret og sterilisert oppløs-ning av t-PA, hvori pH-verdien er fra 2 til 5, vakuumtørkes, idet mediet for den vandige oppløsning innbefatter et fysiologisk akseptabelt middel som gjør oppløsningen vesent-lig isotonisk med blodserum fra mennesker.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at konsentrasjonen av t-PA som benyttes er større enn 500.000 IU/ml.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at konsentrasjonen av t-PA som benyttes, er større enn 1.000.000 IU/ml.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at konsentrasjonen av t-PA som benyttes, er ca.

5.000.000 IU/ml.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at pH-verdien justeres til fra 2,5 til 4,0.

6. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at mediet for den vandige oppløsning er fullstendig eller vesentlig vandig.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det fysiologisk akseptable midlet som benyttes, er natriumklorid.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det fysiologisk akseptable midlet som anvendes, er dekstrose.