JPS5951220A - 新規なプラスミノ−ゲン・アクチベ−タ−およびその製法ならびにこれを含有する薬剤 - Google Patents
新規なプラスミノ−ゲン・アクチベ−タ−およびその製法ならびにこれを含有する薬剤Info
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- JPS5951220A JPS5951220A JP57133633A JP13363382A JPS5951220A JP S5951220 A JPS5951220 A JP S5951220A JP 57133633 A JP57133633 A JP 57133633A JP 13363382 A JP13363382 A JP 13363382A JP S5951220 A JPS5951220 A JP S5951220A
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
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- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明け、新規なプラスミノーゲン・アクチベーターお
よびその製法ならひにこれを有効成分として含有する血
栓溶解剤に関する、さらに詳しくは、人の正常組織由来
細胞の組織培養液より採取したプラスミノーゲン・アク
チペーターおよびこれを分離精製して得る方法ならびに
これを有効成分として含有する血栓溶解剤としての医薬
用途に関する。
よびその製法ならひにこれを有効成分として含有する血
栓溶解剤に関する、さらに詳しくは、人の正常組織由来
細胞の組織培養液より採取したプラスミノーゲン・アク
チペーターおよびこれを分離精製して得る方法ならびに
これを有効成分として含有する血栓溶解剤としての医薬
用途に関する。
プラスミノーゲン・アクチペーターとしては今日、尿ま
たは培養腎細胞から分離精製されたウロキナーゼ、およ
びストレプトコッキより採取されるストレプトキナーゼ
が血栓溶解剤として実用に供されている、 しかし、これらはフィブリンに対する親和性の点で劣る
ので、治療に際し必要な効果を得るには大量に投与する
場合が多く、内出血等の副作用が発現することが知られ
ている。かかる実情から、少歇でかつ血栓溶解活性が高
く、副作用の少ない血栓溶解剤が望まれている。
たは培養腎細胞から分離精製されたウロキナーゼ、およ
びストレプトコッキより採取されるストレプトキナーゼ
が血栓溶解剤として実用に供されている、 しかし、これらはフィブリンに対する親和性の点で劣る
ので、治療に際し必要な効果を得るには大量に投与する
場合が多く、内出血等の副作用が発現することが知られ
ている。かかる実情から、少歇でかつ血栓溶解活性が高
く、副作用の少ない血栓溶解剤が望まれている。
したがって、本発明の目的は、フィブリン親和性が高く
、少Ｊｉ；でりｌＪ果を有する新規なプラスミノーゲン
・アクチベーターを提供することにある２他の目的は、
該プラスミノーゲン・アクチベーターを分ｌｌ！ｔ！精
製して製造する方法、および得られたブラスミノーグン
アクチベーターを有効成分とする新規な血栓溶解剤を提
供することである。
、少Ｊｉ；でりｌＪ果を有する新規なプラスミノーゲン
・アクチベーターを提供することにある２他の目的は、
該プラスミノーゲン・アクチベーターを分ｌｌ！ｔ！精
製して製造する方法、および得られたブラスミノーグン
アクチベーターを有効成分とする新規な血栓溶解剤を提
供することである。
かかる目的で、本発明者らは、種々の人の正常組織由来
細胞の組織培養液について検索したところ、ウロキナー
ゼとは異なるプラスミノーゲン・アクチベーター活性を
有する物質が含まｔｌていることを見い出し、これを分
離精製することに成功し、本発明を完成した。
細胞の組織培養液について検索したところ、ウロキナー
ゼとは異なるプラスミノーゲン・アクチベーター活性を
有する物質が含まｔｌていることを見い出し、これを分
離精製することに成功し、本発明を完成した。
近年、同様な目的で、プラスミノーゲン・アクチベータ
ーを人の黒色ｎＵ＋ ａｌ胞の組織培養液から分離精製
したものがある（特開昭５７−２８００９号公報参照）
。しかしながら、これは１ｌｉｌｉ瘍１１１１胞を原料
とするものであるから、抗原性発癌性に問題があり、実
用に供し得ないものである、一方、本発明のプラスミノ
ーゲン・アクチペーターは正常組織由来細胞の組織培養
物より分離したものであるから、かかる欠点を有しない
ものである。
ーを人の黒色ｎＵ＋ ａｌ胞の組織培養液から分離精製
したものがある（特開昭５７−２８００９号公報参照）
。しかしながら、これは１ｌｉｌｉ瘍１１１１胞を原料
とするものであるから、抗原性発癌性に問題があり、実
用に供し得ないものである、一方、本発明のプラスミノ
ーゲン・アクチペーターは正常組織由来細胞の組織培養
物より分離したものであるから、かかる欠点を有しない
ものである。
本発明のプラスミノーゲン・アクチベーターｔＬ１適当
な生育培体中で人の正常組織由来細胞、たとえば、人胎
児の腎、腸、肺、心臓、輸尿管、皮膚、包皮および全胎
児由来の細胞、人の胎盤由来の卸１胞あるいは人の腎、
腸、肺、甲状腺、心臓、輸尿管、皮膚由来の細胞等を用
いた組織培養液から分１ＩｉＩＦ精製することによシ製
造することができる。
な生育培体中で人の正常組織由来細胞、たとえば、人胎
児の腎、腸、肺、心臓、輸尿管、皮膚、包皮および全胎
児由来の細胞、人の胎盤由来の卸１胞あるいは人の腎、
腸、肺、甲状腺、心臓、輸尿管、皮膚由来の細胞等を用
いた組織培養液から分１ＩｉＩＦ精製することによシ製
造することができる。
培養液からの分離精製方法としては、蛋白質化学におい
て通常使用される方法、たとえば、担体による吸着法、
イオン交換法、分別沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、
各種アフイニテイクロマトグラフイー特に特異抗体を用
いた方法が望ましく、これらを単独−または紹み合わせ
て使用できる。かくして得られたプラスミノーゲ／・ア
クチペーターの用途としては、血栓溶解剤としての医薬
用途以外に、たとえば、人工血管、人工臓器等の材料に
結合させ、血栓の形成を防止する薬剤として、あるいは
血栓症等の診断薬としての用途があげられる、 本発明で用いる人の正常に［１織由来Ｉ、（１１胞の組
織培養液は、プラスミノーゲンΦアクチペーター産生能
を有する細胞を種々の培養飲中で培養したものを用いる
ことができ、たとえば、特開昭５４＝１０７５１０号公
報、特開昭５４−１０７５１１号公報、特開昭５５−１
９００１号公報、特ｌｉｊ昭５５−１５９５２ｓ号公報
、特公昭５７−５１５９号公報記載の培養液等があけら
れる。代表的な培養方法については、参考例１，２に例
示するい本発明のプラスミノーゲン・アクチベーターの
具体的な分離精製方法の一例な上ければ、組織培養液あ
るいは濃縮した培養沿に値酸アンモニウムを加えて生ず
る沈澱を分取し、塩化す） ＩＪウムを加えたロダンア
ンモニウム溶液に溶解させ、抗つロキナーゼＩｇ−Ｇセ
ファロースカラムに通し、フィブリンセファロースカラ
ムに吸着させる。これをアルギニンを溶出溶媒として用
いて得らノする溶出液を、さらに抗つロキナーゼＩｇ−
Ｇセファロースカラムに通した後、凍結乾燥処理し濃縮
する。
て通常使用される方法、たとえば、担体による吸着法、
イオン交換法、分別沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、
各種アフイニテイクロマトグラフイー特に特異抗体を用
いた方法が望ましく、これらを単独−または紹み合わせ
て使用できる。かくして得られたプラスミノーゲ／・ア
クチペーターの用途としては、血栓溶解剤としての医薬
用途以外に、たとえば、人工血管、人工臓器等の材料に
結合させ、血栓の形成を防止する薬剤として、あるいは
血栓症等の診断薬としての用途があげられる、 本発明で用いる人の正常に［１織由来Ｉ、（１１胞の組
織培養液は、プラスミノーゲンΦアクチペーター産生能
を有する細胞を種々の培養飲中で培養したものを用いる
ことができ、たとえば、特開昭５４＝１０７５１０号公
報、特開昭５４−１０７５１１号公報、特開昭５５−１
９００１号公報、特ｌｉｊ昭５５−１５９５２ｓ号公報
、特公昭５７−５１５９号公報記載の培養液等があけら
れる。代表的な培養方法については、参考例１，２に例
示するい本発明のプラスミノーゲン・アクチベーターの
具体的な分離精製方法の一例な上ければ、組織培養液あ
るいは濃縮した培養沿に値酸アンモニウムを加えて生ず
る沈澱を分取し、塩化す） ＩＪウムを加えたロダンア
ンモニウム溶液に溶解させ、抗つロキナーゼＩｇ−Ｇセ
ファロースカラムに通し、フィブリンセファロースカラ
ムに吸着させる。これをアルギニンを溶出溶媒として用
いて得らノする溶出液を、さらに抗つロキナーゼＩｇ−
Ｇセファロースカラムに通した後、凍結乾燥処理し濃縮
する。
ｔ４ ＩＩＩ ｆｆｉ ヲセファデツクスＧ−１５０（
ファルマシア社登録商柳）を用いゲル濾過することにょ
シ、目的のプラスミノーゲン・アクチベーターが得られ
る。本物質はプラスミノーゲンを含まないフィブリンは
溶解せず、プラスミノーゲンを含むフィブリンを８解す
ることからプラスミノーゲンΦアクチベーターであるこ
とは明らかである、かくして得られる本発明のプラスミ
ノーゲン働アクチベーターの物理化学的性質について、
以下に説明する。なお、力価測定は次の方法で行なった
（以下の実験についても同じ）。
ファルマシア社登録商柳）を用いゲル濾過することにょ
シ、目的のプラスミノーゲン・アクチベーターが得られ
る。本物質はプラスミノーゲンを含まないフィブリンは
溶解せず、プラスミノーゲンを含むフィブリンを８解す
ることからプラスミノーゲンΦアクチベーターであるこ
とは明らかである、かくして得られる本発明のプラスミ
ノーゲン働アクチベーターの物理化学的性質について、
以下に説明する。なお、力価測定は次の方法で行なった
（以下の実験についても同じ）。
９５−凝固フィブリノーゲン（プラスミノーゲン含量約
５０カゼイン単位／を凝固蛋白）を原料として作製した
寒天加フィブリン平板を用い、ウロキナーゼを標準品と
するプレート法で測定した。
５０カゼイン単位／を凝固蛋白）を原料として作製した
寒天加フィブリン平板を用い、ウロキナーゼを標準品と
するプレート法で測定した。
本発明物質溶液を、１％ゼラチン、０，１Ｍ塩化ナトリ
ウムおよび０．１チ窒化ナトリウムを含む０．０６７
Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）で希釈し、フィブ
リン平板上で１０ ＩＵ／＋＋＋ｔのウロキナーゼと同
じ溶解窓を示す本発明物質溶液の濃度を１０ Ｕ／ｎｒ
ｌとした、 ａ）分子基：５００００〜Ｂ Ｏ００ｎ１．５Ｍ堪什、
す ト リ ラム、 ０．Ｉ Ｍ ＥＤＴＡ、０．１
Ｍアルギニンおよび０．１％ツイン８０（化工アト
ラス登録商標）を含む０．０１ Ｍ 、ｌＪン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）で平衡化したセファデックスＧ−１５０
を用いるグル濾過法にて測定した。
ウムおよび０．１チ窒化ナトリウムを含む０．０６７
Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）で希釈し、フィブ
リン平板上で１０ ＩＵ／＋＋＋ｔのウロキナーゼと同
じ溶解窓を示す本発明物質溶液の濃度を１０ Ｕ／ｎｒ
ｌとした、 ａ）分子基：５００００〜Ｂ Ｏ００ｎ１．５Ｍ堪什、
す ト リ ラム、 ０．Ｉ Ｍ ＥＤＴＡ、０．１
Ｍアルギニンおよび０．１％ツイン８０（化工アト
ラス登録商標）を含む０．０１ Ｍ 、ｌＪン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）で平衡化したセファデックスＧ−１５０
を用いるグル濾過法にて測定した。
ｂ）等電点ニア、０〜８．５
アンフオライトを用いた等電点電気泳動法にて等電点分
画し測定した。
画し測定した。
Ｃ）フィブリンに対する親和性：
本発明物質に、プラスミノーゲンを含有しないフィブリ
ノーゲン溶液を加え、次いでト四ンピレ溶液を加えてフ
ィブリンを形成させｆｃとζろ、本発明物質は約７０チ
がフィブリンに取シ込まれた、一方、組織培養ウロキナ
ーゼは全く取シ込まれなかった。
ノーゲン溶液を加え、次いでト四ンピレ溶液を加えてフ
ィブリンを形成させｆｃとζろ、本発明物質は約７０チ
がフィブリンに取シ込まれた、一方、組織培養ウロキナ
ーゼは全く取シ込まれなかった。
ｄ）コンカナバリンＡに対する親和性：本発明物質（５
０Ｕ／ｍｌ’） ２−を生理食塩水に溶解シテコンカナ
バリンＡ−セファロース（ファルマシア社製）のカラム
（０，５ｘ４ｍ）に吸着させ、１Ｍ塩化す） ＩＪウム
溶液で洗浄したところ、はぼ１００％が吸着した。
０Ｕ／ｍｌ’） ２−を生理食塩水に溶解シテコンカナ
バリンＡ−セファロース（ファルマシア社製）のカラム
（０，５ｘ４ｍ）に吸着させ、１Ｍ塩化す） ＩＪウム
溶液で洗浄したところ、はぼ１００％が吸着した。
ｅ）至適ｐＨニア 〜９．５
生理食塩水に溶解した本発明物質５０μｔに、１０チグ
リセリンを含む生理食塩水に溶解したプラスミノーゲン
（ＢＣＵ／ｎｔ）５０ ＡＬ、および０．１０Ｍ塩化ナ
トリウムを含むＱ、０ ５Ｍクエン酸緩衝液（ｐ Ｈｓ
、０ 、６．０ ）、リン酸緩衝液（ｐ Ｈ６，０゜７
．０．８．０ ）またねグリシン−水酸化ナトリウム緩
衝液（ｐ Ｈ８，０、９，０、１０，０、１１，０）
（ｐＨ５，０，、６，０、７，０、８，０、９，ｔｌ
、 １０．０ 、１１．０の７種）を１００μｔずつ混
合し、５７Ｃで５０分間ブレインキュベートする。次い
で、０．１５Ｍ）リス塩酸緩衝液（ｐ ＩＩ Ｂ、０）
で溶解したＢｏＣ−Ｇｌｕ −Ｌｙｓ −Ｌｙｅ −Ｍ
ＣＡを５００μを加え、さらに５７Ｕで１５分間インキ
ュベートした後、酢酸１−を加え反応を停止させて、生
成するアミノメチルクマリンを螢光法にて測定し、至適
ｐ■を求めた、測定結果を第１図に示す。
リセリンを含む生理食塩水に溶解したプラスミノーゲン
（ＢＣＵ／ｎｔ）５０ ＡＬ、および０．１０Ｍ塩化ナ
トリウムを含むＱ、０ ５Ｍクエン酸緩衝液（ｐ Ｈｓ
、０ 、６．０ ）、リン酸緩衝液（ｐ Ｈ６，０゜７
．０．８．０ ）またねグリシン−水酸化ナトリウム緩
衝液（ｐ Ｈ８，０、９，０、１０，０、１１，０）
（ｐＨ５，０，、６，０、７，０、８，０、９，ｔｌ
、 １０．０ 、１１．０の７種）を１００μｔずつ混
合し、５７Ｃで５０分間ブレインキュベートする。次い
で、０．１５Ｍ）リス塩酸緩衝液（ｐ ＩＩ Ｂ、０）
で溶解したＢｏＣ−Ｇｌｕ −Ｌｙｓ −Ｌｙｅ −Ｍ
ＣＡを５００μを加え、さらに５７Ｕで１５分間インキ
ュベートした後、酢酸１−を加え反応を停止させて、生
成するアミノメチルクマリンを螢光法にて測定し、至適
ｐ■を求めた、測定結果を第１図に示す。
ｆ）安定性：
■生理食塩水に溶解した本発明物質（１００Ｕ／πｅ）
に、ヒト血清アルブミンを１ｍ９／−の割合で添加し、
６０Ｃ１０時間の脱ウィルス処理を施したが、活性の低
下は認められない。
に、ヒト血清アルブミンを１ｍ９／−の割合で添加し、
６０Ｃ１０時間の脱ウィルス処理を施したが、活性の低
下は認められない。
■グリシン塩酸緩衝液１を用へｐ Ｈを２〜３に調製し
、９８Ｃ，１、分間の脱ウィルス処理を施したところ、
約５１Ｉ６の失活が認めらｔｌた、ｇ）各種合成基質に
対する氷解活性： 本発明物質（１００Ｕ ７ｍｇ）またはウロキナーゼ（
１２０ＩＵ／ｍ（り各々５０１ｓｔに、０．１ Ｍ ＋
２１． 什ナトＩＪウムを含む０．０５ Ｍ ）リス塩
酸緩衝液（ｐ ｎ ａ、ｏ ）４５０μｔで溶解した各
種基質０．１ｍＭを加え、５７ｔｌ：”１？１５分間反
応させる。２０チ酢［０，５ｙａｇを加え反応を停止さ
せ、これを励起波長３７０ ｎｍ、スリット幅ｓ ｎｍ
、螢光波長４６０ ｎｍｓスリット幅５ｎｍで生ずるア
ミノメチルクマリンを測定し、氷解活性を求めた。
、９８Ｃ，１、分間の脱ウィルス処理を施したところ、
約５１Ｉ６の失活が認めらｔｌた、ｇ）各種合成基質に
対する氷解活性： 本発明物質（１００Ｕ ７ｍｇ）またはウロキナーゼ（
１２０ＩＵ／ｍ（り各々５０１ｓｔに、０．１ Ｍ ＋
２１． 什ナトＩＪウムを含む０．０５ Ｍ ）リス塩
酸緩衝液（ｐ ｎ ａ、ｏ ）４５０μｔで溶解した各
種基質０．１ｍＭを加え、５７ｔｌ：”１？１５分間反
応させる。２０チ酢［０，５ｙａｇを加え反応を停止さ
せ、これを励起波長３７０ ｎｍ、スリット幅ｓ ｎｍ
、螢光波長４６０ ｎｍｓスリット幅５ｎｍで生ずるア
ミノメチルクマリンを測定し、氷解活性を求めた。
結果を第１表に示す、
第 １ 表
※
氷解活性 （％ｌ
※
１μＭアミンメチルウマリンー１００％ｈ）各種蛋白分
解酵素阻害ｈＩＩの影響本発明物質（１ｏ ｔ＋Ｕ／ｍ
ｇ ） ｉ！たはウロキナーゼ（１００ＩＵ／ｍ／ ）
’？ｂ々５０ ｌｉｔに、各種蛋白分解酵素１慣害剤
の溶液５０μｔと０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０
５Ｍ）リス墳酸緩衝液（、Ｈ８，０）３００μｔを加え
、３７Ｃで５分間反応を行う。次に、本発明物質に対し
ては０．１ｍＭのＢｏｃ７Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｍ
ＣＡ（ペプチド研究所）を、ウロキナーゼに対してｄｏ
、１ｍＭのＧｌ ｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ −ＭＣＡ （ペ
プチド研究所）をそれぞれ１００１ｔｌ−加え、３７ｃ
で６ｃ分間反応させる、ついで２０％酢酸０．５−を加
え、反応を停Ｊ′Ｆさせ、これを励起波長！＋７０ｎｍ
、スリット幅２０ｍ１螢光波長４６０ｎｒｒ＋、スリッ
ト幅２ ｎ’ｍで生ずるアミノメチルクマリンを測定し
、氷解活性を求めた、 本発明物質およびウロキナーゼの活性を５０襲明害する
蛋白分解酵素１慣害剤の儂度（１ｃ、。）ｆＬ求め、そ
の結果を第２表に示す。
解酵素阻害ｈＩＩの影響本発明物質（１ｏ ｔ＋Ｕ／ｍ
ｇ ） ｉ！たはウロキナーゼ（１００ＩＵ／ｍ／ ）
’？ｂ々５０ ｌｉｔに、各種蛋白分解酵素１慣害剤
の溶液５０μｔと０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０
５Ｍ）リス墳酸緩衝液（、Ｈ８，０）３００μｔを加え
、３７Ｃで５分間反応を行う。次に、本発明物質に対し
ては０．１ｍＭのＢｏｃ７Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｍ
ＣＡ（ペプチド研究所）を、ウロキナーゼに対してｄｏ
、１ｍＭのＧｌ ｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ −ＭＣＡ （ペ
プチド研究所）をそれぞれ１００１ｔｌ−加え、３７ｃ
で６ｃ分間反応させる、ついで２０％酢酸０．５−を加
え、反応を停Ｊ′Ｆさせ、これを励起波長！＋７０ｎｍ
、スリット幅２０ｍ１螢光波長４６０ｎｒｒ＋、スリッ
ト幅２ ｎ’ｍで生ずるアミノメチルクマリンを測定し
、氷解活性を求めた、 本発明物質およびウロキナーゼの活性を５０襲明害する
蛋白分解酵素１慣害剤の儂度（１ｃ、。）ｆＬ求め、そ
の結果を第２表に示す。
また、セリングロテアーゼの阻害Ｉｌｌであるジイソプ
ロピルフルオルリン？（ＤＦＰ ）によす、本発明物り
ｆおよびウロキナーゼは完全に阻害されｌｔ。
ロピルフルオルリン？（ＤＦＰ ）によす、本発明物り
ｆおよびウロキナーゼは完全に阻害されｌｔ。
第２表
１１ＫＩＵ
（２１小野薬品工業（株）
以上の各神性質から、本発明のグラスミノーグンアクチ
ペーターは、人尿あるいは腎卸ｊ胞の組織培養物由来の
ウロキナーゼとは興なる新規な物質である。
ペーターは、人尿あるいは腎卸ｊ胞の組織培養物由来の
ウロキナーゼとは興なる新規な物質である。
次に、本発明プラスミノーゲンアクチペーターの血栓溶
解活性をチャンドラ−・ルーフ法（Ｑｕａｒｔ、 Ｊ、
Ｅｘｐ、 Ｐｈｙｓｉｏｌ、 ４６，１（１９６１）
）により測定した。つｐキナーゼと比較し九ＪＩ′１１
栓溶解率を第２図に示す。なお、血液はヒト新鮮血を用
い血栓形成時間は５０９、血栓溶解時間は４時間で行な
った。また、第２図において、１は本発明物質、２はウ
ロキナーゼを示す。
解活性をチャンドラ−・ルーフ法（Ｑｕａｒｔ、 Ｊ、
Ｅｘｐ、 Ｐｈｙｓｉｏｌ、 ４６，１（１９６１）
）により測定した。つｐキナーゼと比較し九ＪＩ′１１
栓溶解率を第２図に示す。なお、血液はヒト新鮮血を用
い血栓形成時間は５０９、血栓溶解時間は４時間で行な
った。また、第２図において、１は本発明物質、２はウ
ロキナーゼを示す。
この結果、本発明プラスミノーゲンアクチペーターの血
栓溶解活性は、ウロキナーゼに比べて３０倍強力である
ことが碑認された。
栓溶解活性は、ウロキナーゼに比べて３０倍強力である
ことが碑認された。
したがって、本発明プラスミノーゲンアクチベーターは
、少量の投与で強力な血栓溶解効果が得られるＪｊｌ栓
溶解剤表して極めて有用である。
、少量の投与で強力な血栓溶解効果が得られるＪｊｌ栓
溶解剤表して極めて有用である。
本発明物質は、静脈内投与するのが好ましく、投与ｉは
１１者の状態によ−シ異なるが、１日当り２００〜１０
００．０００単位の範囲で投与できる。
１１者の状態によ−シ異なるが、１日当り２００〜１０
００．０００単位の範囲で投与できる。
静脈内投与の方法としては、注射にょる投−りが好まし
く、輸液等に溶解して投与することもできる。
く、輸液等に溶解して投与することもできる。
参考例１
ヒト胎児腎細胞を１ｏｏＩＩＩｉプラスチックディッ江
に７ ｘ １０’ ｃｅｌｌａ／−の密度で植え込み、
６７ｃ。
に７ ｘ １０’ ｃｅｌｌａ／−の密度で植え込み、
６７ｃ。
５チ炭酸ガスを含む空気中で、成育培地として１０チウ
シ胎児血清を含むメジウムＭＥＭを１０ｔｎｌ添加し、
光分増殖させた後、生理食塩水で洗浄し、血清を含まな
い０．５チラクトアルプミン氷解物および０．８係フマ
ール酸を含むメジウム１９９かも成る生産培地２０ ｍ
ｌにおきかえる。７日間保持した後、新鮮な生産培地と
交換し、本発明物質を含む培養液を回収する、 参考例２ ヒト胎児肺にＩ１１胞を５００ｍｅ容スピナーフラスコ
に１０ ’ ｃ ｅ １１ ａ ／ｍｌの密度で２ 、
５ ｒｎ９１ｍｅ １８度のサイトテックスＩ （ｉ（
Ｉ＋胞培養用ビーズ川用、ファルマシア社登録商標）と
共に植え込み、５７Ｃ，５チ炭酸ガスを含む空気中で、
成育培地として１０％ウシ胎児而隋を含むメジウムＩＶ
ｆＥＭを３００ｍ添加し、６０−ｒｐｍの回転数で撹拌
しながら懸濁培養する。
シ胎児血清を含むメジウムＭＥＭを１０ｔｎｌ添加し、
光分増殖させた後、生理食塩水で洗浄し、血清を含まな
い０．５チラクトアルプミン氷解物および０．８係フマ
ール酸を含むメジウム１９９かも成る生産培地２０ ｍ
ｌにおきかえる。７日間保持した後、新鮮な生産培地と
交換し、本発明物質を含む培養液を回収する、 参考例２ ヒト胎児肺にＩ１１胞を５００ｍｅ容スピナーフラスコ
に１０ ’ ｃ ｅ １１ ａ ／ｍｌの密度で２ 、
５ ｒｎ９１ｍｅ １８度のサイトテックスＩ （ｉ（
Ｉ＋胞培養用ビーズ川用、ファルマシア社登録商標）と
共に植え込み、５７Ｃ，５チ炭酸ガスを含む空気中で、
成育培地として１０％ウシ胎児而隋を含むメジウムＩＶ
ｆＥＭを３００ｍ添加し、６０−ｒｐｍの回転数で撹拌
しながら懸濁培養する。
８日間培養し、ｄｌｉｌ胞を充分増殖させた後、生理食
塩水で細胞が接着したビーズ相体を洗浄し、血清を含ま
ない０．５％ラクトアルブミン氷解物を含むメジウム１
９９ ３００−におきかえ、６０ ｒｐｍの回転数で攪
拌しながら培養する。５日目毎に、この培地を交換しな
がら、本発明物質を含む培養液を回収する。
塩水で細胞が接着したビーズ相体を洗浄し、血清を含ま
ない０．５％ラクトアルブミン氷解物を含むメジウム１
９９ ３００−におきかえ、６０ ｒｐｍの回転数で攪
拌しながら培養する。５日目毎に、この培地を交換しな
がら、本発明物質を含む培養液を回収する。
実施例１
人胎児腎組織培養液４１／Ｃ硫安を３００り／ｌの割合
で加え、４Ｃ下−晩装置する。生じた沈６を濾過で集め
、１Ｍ塩化ナトリウムを含む１Ｍロダンア／モニウム溶
液で溶解する。 ａＩられた溶カイ液は液１４００ｄ、
本発明物質の活性は２１ Ｕ／ｒ＋へ比活性は１０Ｕ／
Ａ２８０であった。こゎをフェニールセファロースカラ
ム（１ｘ１０ｏル）に吸Ａ′ｆさせた後、エチレングリ
コールを５０％ｆ、！ ＩＢ−まで１１３度勾配法で増
加させ、本発明物刊を溶出する。ｉ？′ｉ出数は液量１
５０ ｍｌ、本発明物ｇの活性ｒｊ： ５２１１／ｌｎ
ｌ、比活性は２５０ Ｕ／Ａ２８０であった。
で加え、４Ｃ下−晩装置する。生じた沈６を濾過で集め
、１Ｍ塩化ナトリウムを含む１Ｍロダンア／モニウム溶
液で溶解する。 ａＩられた溶カイ液は液１４００ｄ、
本発明物質の活性は２１ Ｕ／ｒ＋へ比活性は１０Ｕ／
Ａ２８０であった。こゎをフェニールセファロースカラ
ム（１ｘ１０ｏル）に吸Ａ′ｆさせた後、エチレングリ
コールを５０％ｆ、！ ＩＢ−まで１１３度勾配法で増
加させ、本発明物刊を溶出する。ｉ？′ｉ出数は液量１
５０ ｍｌ、本発明物ｇの活性ｒｊ： ５２１１／ｌｎ
ｌ、比活性は２５０ Ｕ／Ａ２８０であった。
この溶出＃：ヲま０．１チツイン８ｏを含む４１坤食塩
水で透析し、抗ウロキナーゼＩｇ −Ｇセファｌｒ −
Ｘカラムを通過させた後、アルギニンセファロースカラ
ム（１，５Ｘ１０（Ｉｎ）に連続的に吸着さゼる。
水で透析し、抗ウロキナーゼＩｇ −Ｇセファｌｒ −
Ｘカラムを通過させた後、アルギニンセファロースカラ
ム（１，５Ｘ１０（Ｉｎ）に連続的に吸着さゼる。
０．１チツイン８０を含む０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液
で充分洗浄後、０．１チツイン８０を含む０．５Ｍアル
ギニン溶液で本発明物質を溶出する。この溶ｉｌＬ液量
５２ｍ１．本発明物質の活性は９８Ｕ／ぺ比活性は５２
００ Ｕ／Ａ２ＢＧであった、これを凍結転傾で儂縮後
、１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍフルギニン、ｏ、
１ＭＥＤＴＡおよび０．１％ツイン８０を含む０．０１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したセファデ
ックスＧ−１５０のカラム（１，５ｘ １００山）でゲ
ル濾過して活性のある部分を集める。イ：１ら才ｌた溶
液は液量１５−１本発明物質の活性ｉｊ ２７０ Ｕ１
ｍｅｓ比活性け１２５００Ｕ／Ａ２８０であった。
で充分洗浄後、０．１チツイン８０を含む０．５Ｍアル
ギニン溶液で本発明物質を溶出する。この溶ｉｌＬ液量
５２ｍ１．本発明物質の活性は９８Ｕ／ぺ比活性は５２
００ Ｕ／Ａ２ＢＧであった、これを凍結転傾で儂縮後
、１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍフルギニン、ｏ、
１ＭＥＤＴＡおよび０．１％ツイン８０を含む０．０１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したセファデ
ックスＧ−１５０のカラム（１，５ｘ １００山）でゲ
ル濾過して活性のある部分を集める。イ：１ら才ｌた溶
液は液量１５−１本発明物質の活性ｉｊ ２７０ Ｕ１
ｍｅｓ比活性け１２５００Ｕ／Ａ２８０であった。
実施例２
人胎児肺組織培養Ｑ１ｔを抗つロキナーゼＩｇ−Ｇセフ
ァロースカラム連過後、フィブリンセファロースカラム
（１，ｓ ｘ １ｏｃｍ）に吸着させる、０．１チツイ
ン８０を含む０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液で充分洗浄後
、０．１％ツイン８０を含む０．５ Ｍアルギニン溶液
で浴出し、本発明物質活性を有する部分の溶ｆｉ５０ｍ
を集める。この溶液の本発明物質の活性は６２ Ｕ／ｄ
、比活性は９５０ Ｕ／Ａ２８０であった。この溶液を
０．１チツイン８ｏを含む生理食塩水に透析後、コンカ
ナバリンＡセファロースカラム（ＩＸ２０ｆｆＭ）に吸
着させ、１Ｍ塩化ナトリウム、０．１％ツイン８ｏを含
むロ、０１Ｍリン酸緩術液（ｐＨ７，０）で洗浄後、当
該溶液から０．４Ｍメチルマンノシド、２Ｍロダンアン
モニウムおよび０．１％ツイン８ｏを含むＯ’、０１
Ｍリン酸緩＠５液（ｐＨ，７，０）まで直線的にね度を
変え、本発明物質を溶出する。得られた溶液は＄Ｑ ２
５ ｍｅ。
ァロースカラム連過後、フィブリンセファロースカラム
（１，ｓ ｘ １ｏｃｍ）に吸着させる、０．１チツイ
ン８０を含む０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液で充分洗浄後
、０．１％ツイン８０を含む０．５ Ｍアルギニン溶液
で浴出し、本発明物質活性を有する部分の溶ｆｉ５０ｍ
を集める。この溶液の本発明物質の活性は６２ Ｕ／ｄ
、比活性は９５０ Ｕ／Ａ２８０であった。この溶液を
０．１チツイン８ｏを含む生理食塩水に透析後、コンカ
ナバリンＡセファロースカラム（ＩＸ２０ｆｆＭ）に吸
着させ、１Ｍ塩化ナトリウム、０．１％ツイン８ｏを含
むロ、０１Ｍリン酸緩術液（ｐＨ７，０）で洗浄後、当
該溶液から０．４Ｍメチルマンノシド、２Ｍロダンアン
モニウムおよび０．１％ツイン８ｏを含むＯ’、０１
Ｍリン酸緩＠５液（ｐＨ，７，０）まで直線的にね度を
変え、本発明物質を溶出する。得られた溶液は＄Ｑ ２
５ ｍｅ。
本発明物ηの活性は９８ Ｕ／ｄ、比活性ｔま５５００
Ｕ／Ａ ２８０であった。透析後、限外濾過で濃縮し、
セファテックスＧ−１５０でゲル濾過して活性を有する
部分を１５−回収した。活性は１５５ Ｕ／＋＋＋／。
Ｕ／Ａ ２８０であった。透析後、限外濾過で濃縮し、
セファテックスＧ−１５０でゲル濾過して活性を有する
部分を１５−回収した。活性は１５５ Ｕ／＋＋＋／。
比活性は１２５００Ｕ／Ａ２８Ｇであった、実施例５
人胎児腎、人胎児肺絹織以外の糾絖山米の細胞を培養し
て得られた培養液名１ｔを、実施例２に示した方法と同
じ方法で精製を行なった結果を第３表に示す、 第 ６ 表 実施例４ 和製した木兄り］物質（１ｍ９）を７０インドのコンフ
リートアジュバントに混ぜ、家兎に注射して（１４らｔ
する本発明物質に対する特異抗血清をプロティンＡセフ
ァロースＣＬ４ＢカラムでＩｈ’Ｊ Ｍ’ＬＩして、抗
水発明物質のＩｇ−Ｇを分取する、このＩｇ−ＧをＣＮ
Ｂ ｒ−活性化セファロース４Ｂにゲル１−当９１ｍ９
の割合で結合し、Ｉｇ−Ｇセファロースを作製す机 腎組織培養液６ｔを抗水発明物質のＩｇ −Ｇセファロ
ースカラム（２×５薗）に吸着させ、生理食塩水で充分
洗浄後、０．２Ｍグリシン塩酸絆衡液（ｐ Ｈ２，５）
で溶出する、溶出液は直ちにｐ Ｈを中性伺近に上げた
後、活性を測定し、液量２００ｍｅ、活性５０ Ｕ ／
ｍｅ、比活性５００ Ｕ／Ａ２８０の溶液を得る。この
液をフィブリンセファロースカラム（１×５閤）に吸着
後、０．５Ｍ塩化す） ＩＪウム溶液で充分洗浄し、１
．５．Ｍ ＫＳＣＮで浴出する、溶出沿は２０ ｍ７
！、活性１３０ Ｕ／ｍｅ、比活性６０００Ｕ／Ａ ２
８０であった。
て得られた培養液名１ｔを、実施例２に示した方法と同
じ方法で精製を行なった結果を第３表に示す、 第 ６ 表 実施例４ 和製した木兄り］物質（１ｍ９）を７０インドのコンフ
リートアジュバントに混ぜ、家兎に注射して（１４らｔ
する本発明物質に対する特異抗血清をプロティンＡセフ
ァロースＣＬ４ＢカラムでＩｈ’Ｊ Ｍ’ＬＩして、抗
水発明物質のＩｇ−Ｇを分取する、このＩｇ−ＧをＣＮ
Ｂ ｒ−活性化セファロース４Ｂにゲル１−当９１ｍ９
の割合で結合し、Ｉｇ−Ｇセファロースを作製す机 腎組織培養液６ｔを抗水発明物質のＩｇ −Ｇセファロ
ースカラム（２×５薗）に吸着させ、生理食塩水で充分
洗浄後、０．２Ｍグリシン塩酸絆衡液（ｐ Ｈ２，５）
で溶出する、溶出液は直ちにｐ Ｈを中性伺近に上げた
後、活性を測定し、液量２００ｍｅ、活性５０ Ｕ ／
ｍｅ、比活性５００ Ｕ／Ａ２８０の溶液を得る。この
液をフィブリンセファロースカラム（１×５閤）に吸着
後、０．５Ｍ塩化す） ＩＪウム溶液で充分洗浄し、１
．５．Ｍ ＫＳＣＮで浴出する、溶出沿は２０ ｍ７
！、活性１３０ Ｕ／ｍｅ、比活性６０００Ｕ／Ａ ２
８０であった。
製剤例１
本発明物質 ２４，０００単位硝製ゼラチン
２０ｍＬ？マンニトール
１００ ｍ９塩化ナトリウム
７．８ ｍ９リン酸ナトリウム
１５．４ ｍｇ上記成分を注射用蒸留
水２ ｒｕｇ Ｋ溶解し、無菌バイアルに入れ、−５０
ｃ〜−４０ｃで２時間予備凍に＋’ｉ Ｉｙ、−３０Ｃ
〜＋２０ ’Ｃ％Ｎ’２度０．０５〜０．１ Ｔｏｒｒ
で３５１１４間、−次乾燥し、次いで３０７”：。
２０ｍＬ？マンニトール
１００ ｍ９塩化ナトリウム
７．８ ｍ９リン酸ナトリウム
１５．４ ｍｇ上記成分を注射用蒸留
水２ ｒｕｇ Ｋ溶解し、無菌バイアルに入れ、−５０
ｃ〜−４０ｃで２時間予備凍に＋’ｉ Ｉｙ、−３０Ｃ
〜＋２０ ’Ｃ％Ｎ’２度０．０５〜０．１ Ｔｏｒｒ
で３５１１４間、−次乾燥し、次いで３０７”：。
Ａ−９Ｗ ０．０１〜０．０５ Ｔｏｒｒで５時間、二
次乾り、パ叫、７て、注射用バイアルを製造した、 このものｌ：Ｌ 、用時生理食堝水もしくねブドウ犯１
（注射液５００ ｆｆＩｅに溶解して点滴静注する、製
剤例２ 本発明物質 ６０００ 単位 アルブミン ５〃１９ マンニトール ２５ ＃＋＋）Ｕに化ナトリ
ウム １．９５ｍ９リン酸プ斗リウム
３゜８５ ｍｇ上記成分にて、製剤例１と
同様にして注０１用バイアルを製造した、
次乾り、パ叫、７て、注射用バイアルを製造した、 このものｌ：Ｌ 、用時生理食堝水もしくねブドウ犯１
（注射液５００ ｆｆＩｅに溶解して点滴静注する、製
剤例２ 本発明物質 ６０００ 単位 アルブミン ５〃１９ マンニトール ２５ ＃＋＋）Ｕに化ナトリ
ウム １．９５ｍ９リン酸プ斗リウム
３゜８５ ｍｇ上記成分にて、製剤例１と
同様にして注０１用バイアルを製造した、
第１図は本発明物質の至適ｐ Ｈ域を示すグラフであり
、第２図はウロキナーゼおよび本発明物ｌ°［の自度と
血栓溶解率の関係を示すグラフである、２１３１図 コ ７９１１ Ｈ 第２図 ０．６０．８１ ２ ４ ６８１０ ２０
４０６０８０＋００ウロキたビあＪひ′本発明物質
ｍｌ震度 （Ｕ／ｍｌ血液）手続補正書 昭和５８年１０月１４日 特許庁長官 若杉和夫 殿 １ 事件の表示 特層目１ｒＪ ５ ７−１ ３ ５ ６ ３ ５ 号２
発明の名４１＋ζ 新規なフィブリノーゲン・アクチペーターおよびその製
法ならびにこれを含有する薬剤５ 補正をする者 事件との関係・ｌＦ’ｊ ｉｔ’Ｆ出願人４代理人 郵便番号１０５ 東京都港区虎ノ門−丁目２番２９号虎ノ門産業ビル５階
明細書の発明の詳細な説明の欄 ６ 補正の内容 明細４Ｊ：の記載を下記のとおシ補正する。 （Ｉ１ｍ３Ｆ７１４行の「かかる実情から、」全下記の
とおり補正する。 ［すなわち、これらＫよって循環血液中で生成されるプ
ラスミンは、血中のプラスミンインヒビタ−と結合して
速やかに失活するため、治療効果をあげるためＫけ、こ
れらを大ポ・に投与して、血中のプラスミンインヒビタ
−のｆｆｌ： ’ｔ−Ｊ：回るプラスミンを生成する必
要がある。しかし、大Ｒｆのプラスミンが生成されると
フィブリノ−ケンを分解して、出血傾向という副作用を
引き起すことになる。これに対しフィブリンに親５１１
１件がＡ ＜ 、フィブリン上でプラスミンを生成する
ことができれば、循環血液中のプラスミンインヒビタ−
の影響を受けることなく、少量でフィブリンを分解する
ことができ、循環血液中のフィブリノーゲンを分解する
作用も弱くなる。かかる実情からフィブリン親和性が高
く、」（２）第５頁５行の「由来のＩｔＩＩＩＩＫｌ等
を」の後にＦ記の記載を挿入する。 、より好ましいｎ１１胞としては、ヒト胎児胃、ヒト胎
児肺あるいし１ヒト胎児包皮由来の細胞を」（３）第５
頁６行の「ことにより製造することができる。」の７１
Ｋ下記の記載を追加する。 「すなわち、これらの細胞は通常の動物細胞の培養に用
いられる培養方７Ｉ！−，、たとえば［Ｔｉ５ｓｕｅＣ
ｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｌｔｏｄｓ ａｎｄ Ａｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｊ （Ｐ 、Ｋ。 １（ｒｌｌｓｅ ａｎｄ Ｍ 、 Ｋ 、
Ｐａｔ ｔｅｒｓｏｎ Ａｃａｄｅｍｔｃ Ｐｒ
ｅｓｓＮｅｗ Ｙｏｒｋ Ｓａｎ Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ
Ｌｏｎｄｏｎ １９７３ ）記載の方法で増殖させ７
１ｃ後、炭素源、窒素源および必要な場合は無機小知ま
たは／およびその他の紛加物を含む溶液と接触させるこ
とによって、本発明物質を生産せしめることができる。 共存させる絵加物とし□てｔ：１、アミノ酸類、ビタミ
ン類、ベプタイドに’ｌ’！ 、糖類、有機酸類などを
挙げることができる。本発明物質の生産は、通常細））
：Ｍ １°０万個あたり０．２１上の培養液を用いて２
５Ｃ〜ａ ｏ ｃ ％”’ Ｍましく１ｊ５Ｃ，５８Ｃ
の温度範囲で、６．０〜８．０、好ましく ｉｊ ７．
０〜７．４のｐＴＩの範囲で行なわれる。生産の１１数
１１通常４日ないし３０日であるが、５０日を、［４ｙ
えることもＴ＝Ｊ能である。本発明物質の牛ｐ１．速度
ｔｉｔ 。 生産の後半では次第に遅くなるので、工柴的生産の場合
は、最も効率の、ｌ：いｌ」数がズ１骨」“れる。」（
４）第５自１１行の［を用いた方θ；が一イＪ′±Ｌ＜
、Ｊの後に下記のＲ＋Ｅ載を挿入する。 ［その、１：うな例どして、フィブリンを結合させたセ
ファロース玄・用いるフィブリンセファ［］−スヌカラ
ムクロマトグラフィーカルボキシメチルノ、（全結合さ
せたセファロースを用いるＣＭセファロ−ヌカラムクロ
マトグラフィー、リジンを結合させたセファロースを月
１いるリジンセファ「Ｉ−スカラムクロマトグラフイー
、曲鉛キレートセファロースを用いる配位子交換り１Ｊ
７トグラフイー、コンカナバリンＡ ＊ ＃、’を合さ
せたセファロースを用いるレクチンカラムクロマドグシ
フイー、本発明物ｊｌｑと相異的に結合する抗体を結合
しｌこ抗体アフィニティークロマトグラフィー、架橋し
たデキストラン粒イに′用いるゲｉ＋４７ｉ（５）第８
頁４行の「測定した。」の次に下記の記載な・追加する
。 「５Ｉ）Ｓ（ドデシル硫酸す） ＩＪウム）電気泳動法
による非還元状Ｍｌの分子１１１測定結果し１約７０，
０００であった。」 （（３）第８貞９〜１１行の［゛本発明物質に・・・・
川・・形成させたところ」を下ＨＬのとおり補正する。 ［生理食塩水に溶１１＋’ｆシたプラスミノーゲン全含
有しないフィブリノーゲン溶液（０，２％）９５８μｌ
１本発明物ｆ′ｊ （５００Ｕ ／ｍｌ ） ２０ ｚ
＋ｔｋ７Ｊ１１え、室ｊｌ、Ａで１時間放置する。生じ
たフィブリン金分取し、脱水後、生理共塩水で洗浄する
。２へ１０ダンアンモニウムｍ ｒｌ支１ ｍｅでフィ
ブリン中の本発明物質全抽出したところ」 （力 第１０頁１行の ［脱ウィルス処理−１を・ 「脱つィノ１ス処理［Ｇｃｌｌｉｏ Ｓ、Ｓ、ｅｔ ａ
ｌ、 Ｊ、Ｃｌ１ｎ。 Ｉｎｖｅｓｔ、、２７，２３９（１９４３）参１！（ｔ
） 、Ｊ 、！：袖抽圧る。 （８）第１０頁２行の 「認められない。」を ［昭められなかった。」と補正する。 （９）第１０頁４行の 「脱ウィルス処理」を ［脱つイ／Ｌ、、Ｘ処理（Ｋｒｕｇｍａｎ Ｓ、ｅｔ
ａｌ、 Ｊｊｎｆ。 １）ｉｓ、、 １７ノー、４３２（１９７０）参ＩＫｉ
） Ｊと補正する。 （１０）εｌ’（１１頁の第１表中、基りの欄の第４段
１− Ｂｏｂ −Ｐｂｅ・・・・・・・・・」を「ｌ３
ｏｃ−ｐｈｃ・・・・・・・・・」と補正する。 （１１）第１１頁の第１表 の脚注 「アミンメチルウマリン」ヲ ［アミンメチルクマリン」と補正する。 （１り 第１３頁の第２表の脚注と下から５行の間に下
１ｉＩＬの記載を挿入する。 ［ｉ）フィブリンによる活性増強 プラスミ／−ゲｙ （１０ＣＵ／ｍｅ ） ｆｉ４１ｉ
５０ μｌ。 ４灸 イ本 ５ ０ １ｔＬ、 ０．１
ｍＭ ｌ１ｏｃ−Ｖａｌ −Ｌｅｕ−Ｌｙｓ −
ＭＣＡ１００ μ、ｌ−およびトロンビン（，２［Ｊ／
ｒｎｅ ）溶７１（１００μｔＷ順次、０．０５％フィ
ブリノーゲンを溶解した０、１Ｍ塩化ナトリウムを含む
０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ）ｉ７．５ ） ２０
０μｔ ＭＣ加え、２５Ｃで１時間反応させる。２０チ
酢酸５００μｔで反応を停止させ、試験ｇ）と同様にし
て氷解活性を求めた。なお、フィブリノーゲン無添加の
場合と比較した。結果を第３表に示す。 第３表 ※１０μＭアミノメチルクマリン＝１００％Ｑ３）
第１８頁２０行〜第１９負１行の「第５表」を 「第４表」と補正する。 （１４ｊ 第１９貞２行の 「第３表」を 「第４表」と補正する。 （１最 第２図の横軸単位ｒＵ／ｍ／！血液」を別紙
添伺の第２図で赤字で示したようＫ ｒ ｒｔ＋ −４
７−、は１）／ｍｅ血液」と補正午る。
、第２図はウロキナーゼおよび本発明物ｌ°［の自度と
血栓溶解率の関係を示すグラフである、２１３１図 コ ７９１１ Ｈ 第２図 ０．６０．８１ ２ ４ ６８１０ ２０
４０６０８０＋００ウロキたビあＪひ′本発明物質
ｍｌ震度 （Ｕ／ｍｌ血液）手続補正書 昭和５８年１０月１４日 特許庁長官 若杉和夫 殿 １ 事件の表示 特層目１ｒＪ ５ ７−１ ３ ５ ６ ３ ５ 号２
発明の名４１＋ζ 新規なフィブリノーゲン・アクチペーターおよびその製
法ならびにこれを含有する薬剤５ 補正をする者 事件との関係・ｌＦ’ｊ ｉｔ’Ｆ出願人４代理人 郵便番号１０５ 東京都港区虎ノ門−丁目２番２９号虎ノ門産業ビル５階
明細書の発明の詳細な説明の欄 ６ 補正の内容 明細４Ｊ：の記載を下記のとおシ補正する。 （Ｉ１ｍ３Ｆ７１４行の「かかる実情から、」全下記の
とおり補正する。 ［すなわち、これらＫよって循環血液中で生成されるプ
ラスミンは、血中のプラスミンインヒビタ−と結合して
速やかに失活するため、治療効果をあげるためＫけ、こ
れらを大ポ・に投与して、血中のプラスミンインヒビタ
−のｆｆｌ： ’ｔ−Ｊ：回るプラスミンを生成する必
要がある。しかし、大Ｒｆのプラスミンが生成されると
フィブリノ−ケンを分解して、出血傾向という副作用を
引き起すことになる。これに対しフィブリンに親５１１
１件がＡ ＜ 、フィブリン上でプラスミンを生成する
ことができれば、循環血液中のプラスミンインヒビタ−
の影響を受けることなく、少量でフィブリンを分解する
ことができ、循環血液中のフィブリノーゲンを分解する
作用も弱くなる。かかる実情からフィブリン親和性が高
く、」（２）第５頁５行の「由来のＩｔＩＩＩＩＫｌ等
を」の後にＦ記の記載を挿入する。 、より好ましいｎ１１胞としては、ヒト胎児胃、ヒト胎
児肺あるいし１ヒト胎児包皮由来の細胞を」（３）第５
頁６行の「ことにより製造することができる。」の７１
Ｋ下記の記載を追加する。 「すなわち、これらの細胞は通常の動物細胞の培養に用
いられる培養方７Ｉ！−，、たとえば［Ｔｉ５ｓｕｅＣ
ｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｌｔｏｄｓ ａｎｄ Ａｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｊ （Ｐ 、Ｋ。 １（ｒｌｌｓｅ ａｎｄ Ｍ 、 Ｋ 、
Ｐａｔ ｔｅｒｓｏｎ Ａｃａｄｅｍｔｃ Ｐｒ
ｅｓｓＮｅｗ Ｙｏｒｋ Ｓａｎ Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ
Ｌｏｎｄｏｎ １９７３ ）記載の方法で増殖させ７
１ｃ後、炭素源、窒素源および必要な場合は無機小知ま
たは／およびその他の紛加物を含む溶液と接触させるこ
とによって、本発明物質を生産せしめることができる。 共存させる絵加物とし□てｔ：１、アミノ酸類、ビタミ
ン類、ベプタイドに’ｌ’！ 、糖類、有機酸類などを
挙げることができる。本発明物質の生産は、通常細））
：Ｍ １°０万個あたり０．２１上の培養液を用いて２
５Ｃ〜ａ ｏ ｃ ％”’ Ｍましく１ｊ５Ｃ，５８Ｃ
の温度範囲で、６．０〜８．０、好ましく ｉｊ ７．
０〜７．４のｐＴＩの範囲で行なわれる。生産の１１数
１１通常４日ないし３０日であるが、５０日を、［４ｙ
えることもＴ＝Ｊ能である。本発明物質の牛ｐ１．速度
ｔｉｔ 。 生産の後半では次第に遅くなるので、工柴的生産の場合
は、最も効率の、ｌ：いｌ」数がズ１骨」“れる。」（
４）第５自１１行の［を用いた方θ；が一イＪ′±Ｌ＜
、Ｊの後に下記のＲ＋Ｅ載を挿入する。 ［その、１：うな例どして、フィブリンを結合させたセ
ファロース玄・用いるフィブリンセファ［］−スヌカラ
ムクロマトグラフィーカルボキシメチルノ、（全結合さ
せたセファロースを用いるＣＭセファロ−ヌカラムクロ
マトグラフィー、リジンを結合させたセファロースを月
１いるリジンセファ「Ｉ−スカラムクロマトグラフイー
、曲鉛キレートセファロースを用いる配位子交換り１Ｊ
７トグラフイー、コンカナバリンＡ ＊ ＃、’を合さ
せたセファロースを用いるレクチンカラムクロマドグシ
フイー、本発明物ｊｌｑと相異的に結合する抗体を結合
しｌこ抗体アフィニティークロマトグラフィー、架橋し
たデキストラン粒イに′用いるゲｉ＋４７ｉ（５）第８
頁４行の「測定した。」の次に下記の記載な・追加する
。 「５Ｉ）Ｓ（ドデシル硫酸す） ＩＪウム）電気泳動法
による非還元状Ｍｌの分子１１１測定結果し１約７０，
０００であった。」 （（３）第８貞９〜１１行の［゛本発明物質に・・・・
川・・形成させたところ」を下ＨＬのとおり補正する。 ［生理食塩水に溶１１＋’ｆシたプラスミノーゲン全含
有しないフィブリノーゲン溶液（０，２％）９５８μｌ
１本発明物ｆ′ｊ （５００Ｕ ／ｍｌ ） ２０ ｚ
＋ｔｋ７Ｊ１１え、室ｊｌ、Ａで１時間放置する。生じ
たフィブリン金分取し、脱水後、生理共塩水で洗浄する
。２へ１０ダンアンモニウムｍ ｒｌ支１ ｍｅでフィ
ブリン中の本発明物質全抽出したところ」 （力 第１０頁１行の ［脱ウィルス処理−１を・ 「脱つィノ１ス処理［Ｇｃｌｌｉｏ Ｓ、Ｓ、ｅｔ ａ
ｌ、 Ｊ、Ｃｌ１ｎ。 Ｉｎｖｅｓｔ、、２７，２３９（１９４３）参１！（ｔ
） 、Ｊ 、！：袖抽圧る。 （８）第１０頁２行の 「認められない。」を ［昭められなかった。」と補正する。 （９）第１０頁４行の 「脱ウィルス処理」を ［脱つイ／Ｌ、、Ｘ処理（Ｋｒｕｇｍａｎ Ｓ、ｅｔ
ａｌ、 Ｊｊｎｆ。 １）ｉｓ、、 １７ノー、４３２（１９７０）参ＩＫｉ
） Ｊと補正する。 （１０）εｌ’（１１頁の第１表中、基りの欄の第４段
１− Ｂｏｂ −Ｐｂｅ・・・・・・・・・」を「ｌ３
ｏｃ−ｐｈｃ・・・・・・・・・」と補正する。 （１１）第１１頁の第１表 の脚注 「アミンメチルウマリン」ヲ ［アミンメチルクマリン」と補正する。 （１り 第１３頁の第２表の脚注と下から５行の間に下
１ｉＩＬの記載を挿入する。 ［ｉ）フィブリンによる活性増強 プラスミ／−ゲｙ （１０ＣＵ／ｍｅ ） ｆｉ４１ｉ
５０ μｌ。 ４灸 イ本 ５ ０ １ｔＬ、 ０．１
ｍＭ ｌ１ｏｃ−Ｖａｌ −Ｌｅｕ−Ｌｙｓ −
ＭＣＡ１００ μ、ｌ−およびトロンビン（，２［Ｊ／
ｒｎｅ ）溶７１（１００μｔＷ順次、０．０５％フィ
ブリノーゲンを溶解した０、１Ｍ塩化ナトリウムを含む
０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ）ｉ７．５ ） ２０
０μｔ ＭＣ加え、２５Ｃで１時間反応させる。２０チ
酢酸５００μｔで反応を停止させ、試験ｇ）と同様にし
て氷解活性を求めた。なお、フィブリノーゲン無添加の
場合と比較した。結果を第３表に示す。 第３表 ※１０μＭアミノメチルクマリン＝１００％Ｑ３）
第１８頁２０行〜第１９負１行の「第５表」を 「第４表」と補正する。 （１４ｊ 第１９貞２行の 「第３表」を 「第４表」と補正する。 （１最 第２図の横軸単位ｒＵ／ｍ／！血液」を別紙
添伺の第２図で赤字で示したようＫ ｒ ｒｔ＋ −４
７−、は１）／ｍｅ血液」と補正午る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１１人の正常組織由来細胞の組織培養液門り採取した
、下記の性質ｆｒ［するプラスミノーゲン・アクチペー
ター。 ａ）分子量： ５ｏｏｏｏ〜ａｏｏｏ。 ｂ）等電点ニア、０〜８．５ Ｃ）フィブリンに対する親和性：あり ｄ）コンカナバリンＡに対する親和性：ありｅ）至適Ｐ
Ｈニア〜９．５ ｆ）安定性：６０Ｃ，１０時間で失活せず、ｐＨ２〜５
．９８Ｃ，１分間で約５チ失活 （２１人の正常組織由来細胞の組織培養液よりプラース
ミノーゲンｅアクチベーターを含む両分を分取し、これ
を精製することを特徴とする下記の性質を有するプラス
ミノーゲン・アクチペーターの製法、 ａ）分子量： ５００００〜５ｏｏｏ。 ｂ）等隼１点ニア、０〜８．５ Ｃ）フィブリンに対する親ツ１１性：あシｄ）コンカナ
バリンＡ、Ｇ’ｌ＝Ｊする親和性：ありｅ）至適ｐＨニ
ア Ｔ−９，５ ｆ）安定性＝６０Ｃ，１０時間で失活せず１．ｐＨ２〜
５．９８Ｃ，１分で約５チ失活 （３１，下記の性質を有するプラスミノーゲン・アクチ
ベーターを有効成分として含有する血栓溶解剤。 ａ）分子量：５０００．０〜８００００ 。 ｂ）等重点ニア、０〜８．５ Ｃ）フィブリンに対する親和性：あり ｄ）コンカナバリンＡに対する親、相性：ありｅ）至適
ｐＨ： ７〜９．５ ｆ）安定性：６０Ｃ，１０時間で失活せず、ｐＨ２〜５
．９８Ｆ、１盆で約５チ失活
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