NL8601354A - Nieuwe samenstelling. - Google Patents

Description

* £ -1- VO 8202

Nieuwe samenstelling.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op weefselplasminogeenactivator en in het bijzonder op farmaceutische samenstellingen die weefselplasminogeenactivator bevatten, hun bereiding, en hun gebruik in de mens- en diergeneeskunde.

5 Men meent dat er een dynamisch evenwicht bestaat tussen het enzym- systeem dat bloedstolsels kan vormen - het coagulatiesysteem - en het enzymsysteem dat bloedstolsels kan oplossen - het fibrinolytische systeem - dat een intact voortreffelijk vaatbed in stand houdt. Om bloedverlies bij beschadigingen te beperken, worden in de beschadigde vaten 10 bloedstolsels gevormd. Na natuurlijke reparatie van de schade, worden de overbodige bloedstolsels opgelost door de werking van het fibrinolytische systeem. Soms vormen bloedstolsels zich zonder traumatische schade en blijven ze zitten in belangrijke bloedvaten, hetgeen resulteert in een gedeeltelijke of zelfs totale obstructie vein de bloedstroming. Wanneer 15 dit in het hart, de longen of hersenen gebeurt, kan het resultaat een myocardiaal infarct, longembolie of beroerte zijn. Deze condities zijn in combinatie de belangrijkste oorzaak voor ziekte en sterfte in de geïndustrialiseerde landen.

Bloedstolsels bestaan uit een vezelhoudend netwerk dat door het 20 proteolytische enzym piasmine kan worden opgelost. Het enzym is afgeleid van het inactieve pro-enzym, plasminogeen, een component van bloedplasma, door de werking van een plasminogeenactivator. Er zijn twee immunologisch verschillende plasminogeenactivatoren bij zoogdieren. Intrinsieke plasminogeenactivator, ook bekend als urokinase, is een enzym dat door 25 de nieren wordt geproduceerd en uit urine kan worden geïsoleerd. Het kan ook uit een aantal weefselkweekbronnen worden bereid. Extrinsieke plasminogeenactivator, ook bekend als vaatplasmïnogeenactivator en als weefselplasminogeenactivator (t-PA), kan uit vele weefselhomögenaten (met name humane uterus) , de vaatcelwand en uit enkele celkweken wor-30 den geïsoleerd. Behalve deze twee soorten plasminogeenactivator is er ook een bacterieel produkt, streptokinase, bereid uit S-haemolytische streptococcen. Een belangrijk nadeel van zowel urokinase als streptokinase is dat ze in de hele bloedsomloop actief zijn en niet alleen op de plaats van een bloedstolsel. Ze kunnen bijvoorbeeld andere bloed-35 eiwitten zoals fibrinogeen, prothrombine, factor V, en factor VIII ver- Λ .! — 2.

A\ | , ; -? tl hf C- i- r-J V'

* -T

-2- nietigen waardoor het vermogen van bloedstolling wordt verminderd en het risico van bloedingen wordt vergroot. Daarentegen is de biologische werkzaamheid vain t-PA afhankelijk van de aanwezigheid van fibrine waaraan het bindt en waar het wordt geactiveerd. Maximale activiteit wordt derhalve 5 alleen ontwikkeld op de plaats van een bloedstolsel, dat wil zeggen in tegenwoordigheid van het fibrine netwerk dat moet worden opgelost, en hierdoor wordt het risico van bloedingen in hoge mate vermeden.

De belangrijkste toedieningsroute van t-PA is door intravasadaire infusie,· hetgeen vereist dat de t-PA bevattende samenstelling een paren-10 terale oplossing is. In het algemeen is gewenst dat een parenterale oplossing een hoge concentratie geneesmiddel bevat. De reden hiervoor is dat de arts of diergeneeskundige dan de vereiste concentratie in elke gegeven situatie kan realiseren door eenvoudig de oplossing te verdunnen met extra oplosmiddel of medium. Bovendien is het niet raadzaam om een 15 grote volumehoeveelheid oplossing aan een patiënt met een hart- of nier-probleem toe te dienen omdat daardoor het hart of de nieren onder nog grotere spanning zouden komen te staan. De volumehoeveelheid moet daarom op een minimum worden gehouden door een geconcentreerdere samenstelling te gebruiken. Tegelijkertijd dient een dergelijke parenterale oplossing 20 stabiel te zijn in de zin dat er geen significante neiging voor het geneesmiddel bestaat om uit de oplossing neer te slaan tijdens opslag of tij dens verdunningsbewerkingen.

Een aantal parenterale oplossingen van t-PA zijn in algemene termen beschreven in ΞΡ-Α-41 766, EP-A-93 619, EP-A-112 122, EP-A-113 25 319, EP-A-123 304, Japanse octrooipublicatie 57-120523 (aanvrage 56- 6936) en Japanse octrooipublicatie 58-65218 (aanvrage 56-163145), De samenstellingen zijn waterige zoutoplossingen van t-PA, waarin de pH ongeveer neutraal is, en hebben het nadeel dat de oplosbaarheid van t-PA in dergelijke oplossingen laag is in afwezigheid van een toename in de 30 ionconcentratie. Daardoor bevatten de samenstellingen lage t-PA concentraties, zodat in sommige situaties de toediening van ongewenst grote volumehoeveelheden oplossing aan een patiënt nodig is, of zijn de samenstellingen hypertonisch, hetgeen bij toediening voor de rode bloedcellen schadelijk kan zijn.

35 Thans is gevonden, dat de oplosbaarheid van t-PA in een waterige parenterale oplossing kan worden verbeterd wanneer de pH van de oplossing binnen een zuur gebied is gelegen, en dat bij toediening de zuurte- 2II Λ t ii %’S ,)s! i .5 . } -2/ W £ 5? è -3- graad van een dergelijke oplossing geen significante fysiologische problemen geeft. De onderhavige uitvinding verschaft derhalve een waterige parenterale oplossing van t-PA, waarin de pH 2 - 5 bedraagt.

Als gevolg van de verbeterde oplosbaarheid van t-PA, kan de pa-5 renterale oplossing volgens de onderhavige uitvinding hoge t-PA concentraties realiseren zonder groot gevaar dat het t-PA uit de oplossing neerslaat. Bovendien is gevonden dat de concentratie van t-PA in een dergelijke oplossing gemakkelijk kan worden verlaagd door verdunning met water met een neutrale of zure pH, opnieuw zonder groot ge-10 vaar dat het t-PA neerslaat. De onderhavige uitvinding verschaft derhalve een stabiele parenterale oplossing die een grotere flexibiliteit creëert in zijn hantering en gebruik door artsen en diergeneeskundigen.

Het volgens de onderhavige uitvinding te gebruiken t-PA kan elk bioactief eiwit zijn.dat in essentie overeenstemt met t-PA van 15 zoogdieren, in het bijzonder de mens, en omvat vormen met en zonder glycosylering. Het kan uit één of uit twee ketens bestaand t-PA zijn, of een mengsel daarvan, zoals beschreven in EP-A-112 122 ,en heeft in het geval van volledig geglycosyleerd humaan t-PA een schijnbaar molecuul-gewicht op polyacrylamidegels van ongeveer 70.000 en een isoëlektrisch 20 punt tussen 7,5 en 8,0· Bij voorkeur heeft het t-PA een spe cifieke activiteit van ongeveer 500.000 Iü/mg (Internationale eenheden/ mg, waarbij de internationale eenheid een activiteitseenheid is zoals gedefinieerd door WHO, National Institute for Biological Standards and Control, Holly Hill,Hampstead, London, NW3 6 RB, U.K.) 25 De aminozuurvolgorde van t-PA correspondeert bij voorkeur in hoge mate met de in fig. 1 vermelde aminozuurvolgorde. De volgorde is derhalve identiek aan die in fig. 1 of bevat één of meerdere aminozuur-deleties, substituties, invoegingen, omkeringen of toevoegingen van allel oorsprong of anderszins, waarbij de resulterende volgorde ten 30 minste 80 % en bij voorkeur 90 % homologie heeft met de volgorde in fig. 1 en in essentie dezelfde biologische en immunologische eigenschappen van het eiwit behoudt. In het bijzonder is de t-PA volgorde identiek aan die in fig. 1 of heeft het dezelfde volgorde maar met dien verstande dat het aminozuur op de 245ste positie vanaf de serine 35 N-terminus valine is in plaats van methionine, waarbij elke volgorde desgewenst één of meer van de eerste drie aminozuren mist of desgewenst X £ £ ij -v fc V * ir Φ -4- een aditionele polypeptide N-terminale voorsequentie van Gly-Ala-Arg heeft.

De in fig. 1 getoonde aminozuurvolgorde heeft 35 cystelne-residuen en daardoor het potentieel om 17 disulfide bruggen te vormen.

5 Gebaseerd op analogie met andere eiwitten waarvan de structuur in groter detail is bepaald, is de gepostuleerde structuur voor de volgorde (volgend uit de vorming van disulfide banden) tussen het aminozuur op de 90ste positie en de proline C-terminus in fig. 2 getoond. De structuur van het N-terminale gebied is minder zeker hoewel daarvoor enkele voor-10 stellen zijn gedaan (Progress in Fibrinolysis, 1983, 6_, 269 - 273; and Proc. Natl. Acad. Sci., 1984, jU, 5355 - 5359). De belangrijkste kenmerken van de structuur van t-PA zijn de twee kringle-gebieden (tussen de 92ste en 173ste aminozuren en tussen de 180ste en 261ste aminozuren), die verantwoordelijk zijn voor de binding van het eiwit aan fibrine, en 15 het serine protease gebied, dat het belangrijkste deel van de B-keten omvat en verantwoordelijk is voor de activering van plasminogeen. De aminozuren van bijzonder belang in serine proteases zijn de katalytische triade His/Asp/Ser. In t-PA treden deze op op de 322ste, 371ste en de 463ste posities. De disulfide brug tussen de 264ste en 395ste 20 cysteine aminozuur residuen is ook belangrijk doordat deze de A en B-ketens bij elkaar houdt in de uit twee ketens bestaande vorm van t-PA.

In de figuren 1 en 2 zijn de conventionele één en drie letter-codes gebruikt voor de aminozuur residuen, welke code als volgt is:

Asp D Aspartinezuur lie I Isoleucine 25 Thr T Threonine Leu L Leucine

Ser S Serine Tyr Y Tyrosine

Glu E Glutaminezuur Phe F Phenylalanine

Pro P Proline His H Histidine

Gly G Glycine Lys K Lysine 30 Ala A Alanine Arg R Arginine

Cys C Cysteine Trp W Tryptofaan

Val V Valine Gin Q Glutamine

Met M Methionine Asn N Asparagine 35 Het t-PA kan worden verkregen volgens elk van de eerder beschre ven of bekende procedures. Het kan bijvoorbeeld worden verkregen uit p B 0 1 ^ o ά >ii· jy i v* - * -5- S' « een normale of neoplastische cellijn van de soort,beschreven in Biochi-mica et Biophysica Acta, 1979, 580, 140-153; ΞΡ-Α-41 766 of EP-A-113 319. De voorkeur heeft echter dat t-PA verkregen is van een gekweekte getransformeerde of getransfecteerde cellijn, afgeleid met behulp van 5 recombinant DNA technologie zoals beschreven in bijvoorbeeld EP-A 93 619; EP-A-117 059 of EP-A-117 060. Het heeft bijzondere voorkeur dat Chinese hamsterovarium (CHO) cellen gebruikt worden voor de produktie van t-PA en afgeleid zijn op de wijze, beschreven in Molecular and Cellular Biology,1985, 5(7), 1750-1759. Op deze wijze wordt het geclo-10 neerde gen samen met het gen dat codeert voor dihydrofolaat reductase (dhfr) getransfecteerd in dhfr CHO cellen. Transformanten waarin dhfr tot expressie komt, worden geselecteerd op media die nucleosiden missen en worden blootgesteld aan toenemende concentraties methotrexaat.

De dhfr en t-PA genen worden aldus samen geamplificeerd hetgeen leidt 15 tot een stabiele cellijn die in staat is tot een sterke expressie van t-PA.

Het t-PA wordt bij voorkeur gezuiverd onder toepassing van één van de eerder beschreven of bekende procedures, zoals de procedures beschreven in Biochimica et Biophysica Acta, 1979, 580, 140-153; J.Biol.

20 Chem., 1979, 254(6), 1998-2003; ibid, 1981, 256(13) , 7035-7041; Eur. J. Biochem., 1983, 132, 681-686; EP-A-41 766; EP-A-113 319 of GB-A-2 122 219.

Er lijkt geen bovengrens te bestaan voor de oplosbaarheid van t-PA in de parenterale oplossing. Bij zeer hoge concentraties, zoals 25 boven 150.000.000 IU/ml (Internationale eenheden/ml), wordt de oplossing alleen visceus zonder dat enige significante precipitatie van het t-PA optreedt. De concentratie van t-PA in de parenterale og.cSsing kan derhalve binnen ruime grenzen variëren, bijvoorbeeld van 50.000 tot 50.000. 000 IU/ml. Om een maximaal profijt van de onderhavige uitvinding 30 te verzekeren, heeft het de voorkeur dat de concentratie van t-PA groter is dan 100.000 IU/ml, meer in het bijzonder groter dan 500.000 IU/ml, en liefst groter dan 1.000.000 IU/ml. De grootste voorkeur heeft dat de t-PA concentratie ongeveer 5.000.000 IU/ml bedraagt.

De bovengrens voor de pH van de parenterale oplossing is bij 35 voorkeur 4,5. In feite ligt de pH bij voorkeur in een bereik van 2,5 tot 4.0, liever van 2,8 tot 3,5, en liefst ongeveer 3,0. De gewenste pH van Λ - ij? i h !. I Λ ^ 'jf ^ %* 'W - -6- de_ parenterale oplossing wordt op een geschikte wijze verkregen door een fysiologisch aanvaardbaar anorganisch of organisch zuur te gebruiken. Voorbeelden van een dergelijk zuur zijn zoutzuur, zwavelzuur en salpeterzuur, alsmede citroenzuur, wijnsteenzuur en benzeensulfonzuur. Van deze 5 voorbeelden heeft zoutzuur de voorkeur.

Hoewel behalve water desgewenst een fysiologisch aanvaardbaar co-solvent aanwezig kan zijn, heeft het de voorkeur dat het medium voor de parenterale oplossing geheel of nagenoeg volledig op waterbasis is.

De parenterale oplossing kan hypertonisch, hypotonisch of iso-10 tonisch zijn met het bloedserum van de patiënt. Om ongewenste neveneffecten te vermijden is de parenterale oplossing echter bij voorkeur isotonisch, hoewel ondergeschikte afwijkingen niet van grote fysiologische betekenis zijn. Een in hoge mate isotonische parenterale oplossing kan worden verkregen door een fysiologisch aanvaardbaar middel op 15 te nemen dat de toniciteit van de oplossing tot het vereiste niveau kan verhogen. Voorbeelden van een dergelijk middel zijn op zichzelf bekend en omvatten dextrose (in watervrije of monohydraatvorm) en natriumchlo-ride en mengsels daarvan. De concentratie van het middel in de parenterale oplossing zal natuurlijk van middel tot middel variëren. In het 20 geval van natriumchloride is de concentratie bij voorkeur 7 tot 10 mg/ml, en liefst ongeveer 8,5 mg/ml, welke concentratie vaak wordt aangeduid als een fysiologische zoutoplossing of alleen maar fysiologisch zout. In het geval van watervrije dextrose is de concentratie bij vocr-keur 30 tot 70 mg/ml, liefst ongeveer 50 mg/ml. In het geval dat de t-PA 25 concentratie in een in hoge mate isotonische parenterale oplossing moet worden verlaagd, heeft het de voorkeur dat de verdunning wordt uitgevoerd met een waterige oplossing van hetzelfde middel in dezelfde concentratie om een in hoge mate isotonische oplossing te behouden.

De parenterale oplossing kan desgewenst normaliter aan de samen-30 stellingen van dit type verbonden additieven bevatten. Voorbeelden omvatten humaan serum albumine.Bovendien heeft t-PA neiging om te adsorberen aan glazen en kunststoffen oppervlakken en het kan daarom gewenst zijn om een oppervlakte-actief middel in de parenterale oplossing op te nemen om een dergelijke adsorptie te verhinderen of tot een minimum te beper-35 ken. Voorbeelden van een dergelijk middel omvatten polyoxyëthyleen derivaten van partiële vetzuuresters van sorbitolanhydriden, zoals die welke in de handel zijn onder de naam "Tween 80".

g $ 1 τ s k ? 3 -7- Eén van de verrassende voordelen van de onderhavige uitvinding, afgezien nog van de aanzienlijk verhoogde oplosbaarheid van t-PA, is dat het gebruik van een zure parenterale oplossing met een pH binnen de hierboven gedefinieerde grenzen geen significante nadelige fysiolo-5 gische effecten blijkt te hebben op de toediening aan de patiënt. Men zou verwachten dat de bloedstroom in het algemeen in staat is om de pH van de oplossing bijna zodra contact wordt gemaakt tot de neutrale waarde te verhogen, waarbij het t-PA snel in de bloedstroom wordt verdeeld.

Het heeft echter de voorkeur dat dit proces niet wezenlijk op wat voor 10 manier dan ook wordt belemmerd en dat de parenterale oplossing geen sterk buffermiddel bevat. Evenwel kan een zwak buffermiddel dat dit proces niet in significante mate belemmert, worden opgenomen en bij zure pH. blijkt t-PA zelf als zijn eigen zwakke buffermiddel te werken. Bovendien kan humaan serum albumine .als een zwak buffermiddel fungeren.

15 Vanwege de sterk verhoogde oplosbaarheid van t-PA in de parente rale oplossing volgens de onderhavige uitvinding, is het niet nodig dat additionele materialen zoals lysine of ornithine of zouten daarvan worden opgenomen om de oplosbaarheid van t-PA te vergroten.

De parenterale oplossing kan worden bereid volgens conventionele 20 farmaceutische bereidingsprocedures en technieken waarbij t-PA wordt gebruikt in de vorm van een gezuiverde oplossing of vaste stof. De onderhavige uitvinding verschaft derhalve een werkwijze voor het bereiden van een waterige parenterale oplossing van t-PA, zoals hierin gedefinieerd, omvattende: 25 (i) het verkrijgen van een gezuiverde oplossing van t-PA en het uitwis selen van het medium voor een waterig medium met een pH van 2 - 5?of (ii)het oplossen van t-PA in een waterig medium met een pH van 2 - 5; en het steriliseren van de verkregen oplossing.

De zuivering van t-PA kan als laatste stap de elutie van het 30 eiwit uit een chromatografische kolom omvatten als een oplossing die een sterk buffermiddel bevat. Zoals eerder vermeld heeft het de voorkeur dat de parenterale oplossing geen sterk buffermiddel bevat en daarom is een geschikt middel om zijn verwijdering te realiseren onder uitwisseling van het medium, het gebruik van dialyse. Dit kan worden uitgevoerd door 35 dialyseslangen of een kunstnier te gebruiken waarin de gezuiverde oplossing wordt gedialyseerd tegen een waterig medium waarin de pH 2 - 5 is.

In het bijzonder wanneer de t-PA concentratie in de gezuiverde oplossing χ. 3 0 ' .) * '> -8-

V

hoog is, kan het gewenst zijn om eerst de pH van de oplossing zodanig in te stellen dat deze 2-5 bedraagt. Een ander middel om de verwijdering van een sterk buffermiddel te realiseren terwijl het medium wordt uitgewisseld, is het onderwerpen van de gezuiverde oplossing aan gelfiltra-5 tie en het ontwikkelen van de kolom met een waterig medium waarin de pH 2 - 5 is.

t-PA in de vorm van een neergeslagen vaste stof kan bij voorkeur worden verkregen uit een gezuiverde oplossing door de pH op ongeveer 5,5 in te stellen, de oplossing af te koelen tot net boven het vries-10 punt, en het eiwit te winnen door bijvoorbeeld centrifugeren. De neergeslagen vaste stof kan vervolgens worden opgelost in een waterig medium met een pH van 2 - 5 op een conventionele wijze.

De sterilisatie van de verkregen oplossing kan op conventionele wijze worden uitgevoerd, bijvoorbeeld door filtersterilisatie.

15 De parenterale oplossing wordt normaliter aangeboden in gesloten, steriele, kunststoffen of glazen houders. Hij kan ook worden aangeboden in de vorm van doseringseenheden, zoals ampullen, flesjes of wegwerp-injectie-instrumenten, of in multi-doseringsvormen, zoals in infusie-zakken of flessen. De volumehoeveelheid oplossing die in dergelijke 20 houders wordt aangeboden, kan sterk variëren maar bedraagt geschikt van 0,5 tot 20 ml.

Om het t-PA te stabiliseren wordt de parenterale oplossing bij voorkeur ingevroren en op een temperatuur van -10 - -30°C gehouden.

De biologische activiteit van t-PA in het oplossen van het fi-25 brine-netwerk van bloedstolsels heeft geleid tot zijn bruikbaarheid in de behandeling van trombosekwalen(The Lancet, 7 November 1981,1018-1020; ibid, 13 April 1985, 842-847; The New England Journal of Medicine, 1984 310(10), 609-613; en ibid., 1985, 312(14) , 932-936). De onderhavige uitvinding verschaft derhalve een methode voor het behandelen van een 30 trombosekwaal in een zoogdier, omvattende de toediening aan het zoogdier van een waterige parenterale oplossing van t-PA zoals hierin gedefinieerd. Verder wordt ook een waterige parenterale oplossing van t-PA verschaft, zoals hierin gedefinieerd,voor gebruik in de humane of diergeneeskunde, in het bijzonder voor gebruik in de behandeling van een trombosekwaal.

35 Bijzondere voorbeelden van trombosekwalen zijn op zichzelf bekend en omvatten myocardiaal infarct, diepe adertrombose, longembolie en beroerte.

8601354 -9-

De hoofdtoedieningsroute van de parenterale oplossing is door intravasculaire, in het bijzonder intraveneuze infusie hoewel mogelijk andere toedieningsrouten zoals intramusculaire toediening kunnen worden toegepast. Intravasculaire infusies worden normaliter uitgevoerd 5 met de parenterale oplossing in een infusiezak of fles of binnen een elektrisch béstuurde.üfusienaald. De oplossing kan uit de infusiezak of fles aan de patiënt worden afgegeven door zwaartekrachttoevoer of door gebruik te maken van een infusiepomp. Het gebruik van zwaartekrachttoevoer infusiesystemen geeft niet voldoende controle over de 10 toedieningssnelheid van de parenterale oplossing en daarom heeft het gebruik van een infusiepomp de voorkeur, in het bijzonder met oplossingen die betrekkelijk hoge concentraties t-PA bevatten. Grotere voorkeur heeft echter het gebruik van een elektrisch bestuurde infusienaald die een nog grotere controle over de toedieningssnelheid biedt.

15 De voor het behandelen van een zoogdier met een trombosekwaal effectieve hoeveelheid t-PA zal natuurlijk afhangen van een aantal factoren waaronder bijvoorbeeld de leeftijd en het gewicht van het zoogdier, de precieze conditie die behandeling vereist en de ernst daarvan, de toedieningsroute, en. zal uiteindelijk onder de verantwoordelijkheid 20 van de desbetreffende arts of diergeneeskundige vallen. Het is echter waarschijnlijk dat een effectieve hoeveelheid voor lyèpë van een coronaire slagadertrombus bijvoorbeeld in het algemeen in een bereik van 150.000 tot 450.000 IU/kg lichaamsgewicht van de patiënt per uur zal bedragen. Voor een volwassen mens van 70 kg zal derhalve een effectieve 25 hoeveelheid per uur in het algemeen 10.000.000 tot 30.000.000 IU, in het bijzonder ongeveer 20.000.000 Iü bedragen, en deze hoeveelheid kan met of zonder een voorbehandelingsdosis worden toegediend. Het is ook waarschijnlijk dat de dosering voor sommige trombosecondities geringer zal zijn, bijvoorbeeld voor diepe adertrombose en acute beroerte, of 30 voor het eenvoudig in puike conditie houden van een reeds opnieuw door-stroombaar gemaakte coronair slagader. In deze situaties zal een effectieve hoeveelheid in het algemeen 7.000 tot 36.000 IU/kg lichaamsgewicht van de patiënt per uur zijn.

De volgende voorbeelden worden gegeven, ter toelichting van de 35 onderhavige uitvinding en dienen niet zodanig te worden uitgelegd dat ze de uitvinding beperken.

hi J V ί 'J - =$* v -10-

Voorbeeld I.

Een geklaarde oogst van t-PA, verkregen uit een gekweekte getransformeerde CHO-cellijn die afgeleid was onder toepassing van de procedure volgens Molecular and Cellular Biology, 1985, 5(7), 1750-1759, 5 werd chromatografisch gezuiverd en het t-PA werd verzameld als een waterige oplossing die 0,1 M natriumcitraat en 0,01 % (w/v) Tween 80 bevatte, bij een pH van 5,5. De pH van de oplossing werd met zoutzuur ingesteld op 3,0 en de verkregen oplossing werd door ultrafiltratie geconcentreerd onder toepassing van een H-10 Cartridge (Amicon Ltd., Upper 10 Hill, Stonehouse, Gloucestershire, England). Een geconcentreerde, gezuiverde waterige oplossing van t-PA (2.500.000 IU/ml), die 0,1 M natriumcitraat, 0,23 M natriumchloride (afkomstig van de toevoeging van zoutzuur) en 0,01 % (w/v) Tween 80 bevatte en een pH van 3,0 had, werd aldus verkregen. Deze oplossing werd in dialyseslangen gebracht met 15 een molecuulgewichtsbegrenzing van ongeveer 14.000 en bij 4°C gedialy-seerd tegen 4 wisselingen van 50 volumehoeveelheden filter-gesterili-seerde, fysiologische zoutoplossing [0,85 % (w/v) natriumchloride] die 0,01 % (w/v) Tween 80 bevatte en met geconcentreerd zoutzuur werd ingesteld op een pH van 3,0. Elke dialysestap liet men gedurende 12 uur ver-20 lopen. Na winning van de waterige oplossing uit de dialysezak, werd deze aan een filtersterilisatie. onderworpen en verdund met een fysiologische zoutoplossing zodat hij 500.000 IU/ml t-PA bevatte. De verkeegen paren-terale oplossing werd daarna in glazen flesjes gebracht die afgedicht, ingevroren en bij -20°C bewaard werden.

25 Voorbeeld II.

Een geklaarde oogst van t-PA, verkregen uit een gekweekte getransformeerde CHO-cellijn die afgeleid was onder toepassing van de procedure volgens Molecular and Cellular Biology, 1985, 5(7), 1750-1759, werd chromatografisch gezuiverd en het t-PA werd verzameld als een wa-30 terige oplossing die 0,17 M natriumcitraat en 0,01 % (w/v) Tween 80 bevatte, bij een pH van 5,5. De pH van de oplossing werd met zoutzuur ingesteld op 3,0 en de verkregen oplossing werd door ultrafiltratie geconcentreerd onder toepassing van een H-10 Cartridge (Amicon Ltd., Upper 35 Hill, stonehouse, Gloucestershire, England). De geconcentreerde waterige oplossing werd verder gezuiverd door hem aan te brengen op een gelfil-tratiekolom (Sephadex G-150; Pharmacia Biotechnology, Uppsala, Sweden) en te elueren met 0,85 % zoutoplossing die 0,01 % (w/v) Tween 80 be-•rt r> Λ -3 ? > S 0 y * 3 3 -11- vatte,bij een pH van 3,0- Ben sterk gezuiverde waterige oplossing van t-PA werd aldus verkregen, welke oplossing nog één keer werd geconcentreerd onder toepassing van een wegwerp kunstnier. Het t-PA werd uit de oplossing neergeslagen door de pH tot 5,5 te verhogen met behulp van 5 natriumhydroxyde en de suspensie gedurende 2 uur op 4°C te houden. Het t-PA werd gewonnen door centrifugeren gedurende 30 minuten bij 4 eC bij 4000 x g. Het t-PA pellet werd opnieuw opgelost in een waterige oplossing van natriumchloride [0,85 % (w/v)] die 0,01 % (w/v) 'Tween 80 bevatte, en ingesteld met zoutzuur op een pH van 3,0. Er werd een volumehoe-10 veelheid zoutoplossing gebruikt die nodig was om een concentratie van t-PA te verkrijgen tussen 7.500.000 en 10.000.000 IU/ml. Deze t-PA oplossing werd verdund met een verdere waterige oplossing van natriumchloride [0,85 % (w/v)], die 0,01 % (w/v) Tween 80 bevatte en ingesteld op een pH van 3,0 met behulp van zoutzuur, en ook met een voldoende 15 hoeveelheid van een oplossing van 10 % (w/v) mannitol in dezelfde zure zoutoplossing om eindconcentraties van 5.000.000 IU/ml t-PA en 25 mg/ml mannitol te realiseren. De verkregen oplossing werd aan een filter-sterilisatie onderworpen en in volumehoeveelheden van 1 ml gebracht in glazen flesjes die ingevroren en bij -20°C bewaard werden.

20 Voorbeeld III.

De trombolytische werkzaamheid van de parenterale oplossing volgens voorbeeld I werd onderzocht in een in vivo model van halsader-trombose.

(a) Procedure: 25 De experimentele procedure volgde in essentie de procedure be schreven door Collen et al (J. Clin.Invest., 1983, 7_1, 368-376).

Men liet de parenterale oplossing van voorbeeld I ontdooien en verdunde hem met een steriele isotonische zoutoplossing, ingesteld op een pH van 3,0, die 0,01 % Tween 80 bevatte, om voldoende oplossing 30 te verkrijgen voor een twee uur durend infuus van 500.000 IU/kg t-PA.

De infusie geschiedde via een canule in de rechterdijader. Drie Nieuw Zeelandse witte konijnen werden in dit onderzoek gebruikt. Na infusie werd de trombolysegraad geschat.

(b) Resultaten: 35 Het percentage trombolyse bedroeg 22,3 +_ 4,2, hetgeen de trombo lytische werking van de parenterale oplossing volgens voorbeeld I aantoont . Bovendien werden geen nadelige reacties bij de infusie van deze oplossing waargenomen.

Μ Λ 1 “J *·, <3, S*· Si = V» »'

Claims (24)

1. Waterige parenterale oplossing van t-PA, waarin de pi 2 - 5 is.

2. Parenterale oplossing volgens conclusie 1, waarin het t-PA in de uit één-keten bestaande vorm of in de uit twee-ketens bestaande vorm verkeert.

3. Parenterale oplossing volgens conclusie 1 of 2, waarin het t-PA de aminozuurvolgorde heeft volgens fig. 1 of dezelfde aminozuurvolgorde heeft, met dien verstande dat het aminozuur op de 245ste positie vanaf de serine N-terminus valine is in plaats van methionine, waarbij elke volgorde desgewenst één of meer van de drie eerste aminozuren mist of 10 desgewenst een extra polypeptide N-terminale voor sequentie van Gly-Ala-Arg heeft.

4. Parenterale oplossing volgens één of meer van de voorgaande conclusies, waarin het t-PA verkregen is uit een gekweekte getransformeerde of getransfecteerde cellijn, afgeleid onder toepassing van recombinant

5. Parenterale oplossing volgens één of meer van de voorgaande conclusies, waarin de t-PA concentratie groter is dan 100.000 IU/ml.

6. Parenterale oplossing volgens conclusie 5, waarin de concentratie van t-PA groter is dan 500.000 IU/ml.

7. Parenterale oplossing volgens conclusie 6, waarin de concentratie van t-PA groter is dan 1.000.000 IU/ml.

8. Parenterale oplossing volgens conclusie 7, waarin de concentratie van t-PA ongeveer 5.000.000 IU/ml is.

9. Parenterale oplossing volgens één of meer van de voorgaande con-25 clusies, waarin de pH 2 - 4,5 is.

10. Parenterale oplossing volgens conclusie 9, waarin de pH 2,5 - 4,0 is.

11. Parenterale oplossing volgens conclusie 10, waarin de pH 2,8 - 3,5 bedraagt.

12. Parenterale oplossing volgens conclusie 11, waarin de pH ongeveer 3,0 is.

13. Parenterale oplossing volgens één of meer van de voorgaande conclusies, waarin het medium geheel of in hoofdzaak op waterbasis is. β 15 fï i S £ -13-

14. Parenterale oplossing volgens één of meer van de voorgaande conclusies, omvattende een fysiologisch aanvaardbaar middel dat de oplossing nagenoeg isotonisch met humaan bloedserum maakt.

15. Parenterale oplossing volgens conclusie 14, waarin het fysiolo-5 gisch aanvaardbare middel natriumchloride is.

15 DNA-technologie.

16. Parenterale- oplossing volgens conclusie 14, waarin het fysiologisch aanvaardbare middel dextrose is.

17. Parenterale oplossing volgens één of meer van de voorgaande conclusies, omvattende een oppervlakte-actief middel.

18. Parenterale oplossing volgens één of meer van de voorgaande con clusies, welke in hoofdzaak ongebufferd is.

19. Parenterale oplossing volgens één of meer van de voorgaande conclusies, die in hoofdzaak vrij is van lysine of ornithine of een zout daarvan.

20. Waterige parenterale zoutoplossing van t-PA, waarin de pH 2 - 5 is.

21. Werkwijze voor het bereiden van een parenterale oplossing volgens één of meer van de conclusies 1-20, omvattende: (i) het verkrijgen van een gezuiverde oplossing van t-PA en het uitwis- 20 selen van het medium voor een waterig medium met een pH van 2-5? of (ii) het oplossen van t-PA in een waterig medium met een pH van 2 - 5,en het steriliseren van de verkregen oplossing.

22. Werkwijze voor het behandelen van een trombose kwaal in een zoog-25 dier, omvattende de toediening aan het zoogdier van een parenterale oplossing volgens één of meer van de conclusies 1-20.

23. Parenterale oplossing volgens één of meer van de conclusies 1-20, voor gebruik in humane en diergeneeskunde, in het bijzonder voor gebruik in de behandeling van een trombose kwaal.

24. Gesloten houder met een parenterale oplossing volgens één of meer van de conclusies 1 - 20 en 23. Λ Λ ï? l v v v * 0 0 ·*?