<Desc/Clms Page number 1>
Utilisation de l'activateur tissulaire du plasminogen, son association avec une superoxyde-dismutase et formulation pharmaceutique contenant cette association.
La présente invention concerne l'activateur tissulaire du plasminogbne, son association avec une superoxydedismutase, des formulations pharmaceutiques les contenant et leur emploi en médecine humaine et veterinaire.
11 existe un équilibre dynamique entre le Systeme enzymatique capable de former des caillots sanguins (lesys- tème coagulateur) et le système enzymatique capable de dissoudre les caillots sanguins (le système fibrinolytique) qui maintient à l'état dégagé un lit vasculaire intact.
Pour limiter la perte de sang par une blessure, des caillots sanguins sont formés dans le vaisseau lésé. Après la réparation naturelle de la blessure, les caillots sanguins superflus sont dissous par l'action du système fibrinolytique.
Des caillots sanguins peuvent occasionnellement se former en l'absence de blessure traumatique et peuvent se loger dans des vaisseaux sanguins importants en faisant ainsi partiellement ou même totalement obstacle à l'écoulement du sang. Si cela se produit dans le coeur, le poumon ou le cerveau, il peut s'ensuivre un infarctus du myocarde, une embolie pulmonaire ou un ictus cerebral. Ces affections constituent ensemble la principale cause de morbidité et de mortalité dans les nations industrialisées.
Les caillots sanguins sont constitués d'unreseau fibreux qui est susceptible d'être dissous par une enzyme protéolytique, la plasmine. Cette enzyme est dérivée d'une pro-enzyme inactive, le plasminogène, un composantdu plasma sanguin, sous l'action d'un activateur de plasminogène. 11 existe chez les mammifères deux activateurs de plasminogen immunologiquement distincts. L'activateur intrinsèque du plasrninogènet éga1ement connu en tant qu'urokinase, est une enzyme produite par le rein qui peut être isolée de l'urine.
On peut également le préparer ä partir d'un certain nombre de cultures tissulaires qui en sont des sources. L'activateur extrinsèque du plasminogène, également connu en tant qu'acti- vateur vasculaire du plasminogène et en tant qu'activateur tissulaire du plasminogbne (AP-t), peut être isole de nom-
<Desc/Clms Page number 2>
EMI2.1
breux homogénats tissulaires (notamment d'uterus humain), de la paroi des cellules vasculaires et de certaines cul- tures tissulaires. En plus de ces deux types d'activateurs du plasminogène, il existe également un produit bactérien, la streptokinase, préparé ä partir de streptocoques betahémolytiques.
Un inconvénient majeur affectant ä la fois l'urokinase et la streptokinase est qu'elles sont actives dans toute la circulation et non juste à l'emplacement d'un caillot sanguin. Elles peuvent, par exemple, détruire d'autres protéines du sang, telles que le fibrinogène, la prothrombine, le facteur V et le facteur VIII, en réduisant ainsi le pouvoir de coagulation du sang et en augmentant le risque d'hémorragie. Par contre, l'activité biologique de AP-t dépend de la présence de fibrine ä laquelle il se lie et où il est activé. L'activité maximale ne se développe ainsi qu'au seul emplacement d'un caillot sanguin, c'est-à- dire en présence du réseau fibrineux ä dissoudre, et le risque d'hémorragie s'en trouve écarté dans une large mesure.
L'interruption du courant sanguin dans un vaisseau mène généralement ä la survenue d'une ischémie. Dans cette Situation, le tissu est privé d'oxygène et se trouve menacé, un état dans lequel le tissu est altéré mais encore potentiellement viable. Cependant, si cette situation se prolonge pendant une periode de, par exemple trois heures ou plus, le tissu se nécrose et, une fois dans cet état, ne peut être récupéré. 11 est donc important qu'une réirrigation, c'est- à-dire le rétablissement du courant sanguin, ait lieu aussi tot que possible pour sauver le tissu avant qu'il ne soit définitivement endommagé.
Ironiquement, même si elle est réalisée avant que le tissu ne devienne nécrotique, la réirrigation elle-même engendre un ensemble complexe de phénomènes, y compris la formation présumée du radical superoxyde, qui exercent un effet délétère sur le tissu hypoxique. Par conséquent, la réirrigation ne peut conduire qu'à une récupération partielle du tissu menacé, le reste gtantdafiniti- vement endommage par la survenue d'un ou plusieurs de ces phénomènes. -
<Desc/Clms Page number 3>
On a maintenant découvert que AP-t inhibe l'encom- magement d'un tissu menacé pendant la réirrigation en protégeant ce tissu ä l'encontre d'un ou plusieurs des phénomènes susmentionnés.
Le mécanisme d'action par lequel AP-t apporte cette protection n'a pas été explicite mais il n'est pas lié à son activité d'agent thrombolytique. Cette propriété nouvellement découverte donne ainsi la possibilité d'utiliser AP-t, ou une formulation pharmaceutique le contenant, comme inhibiteur d'endommagement de tissu menace dans les girconstances globalement exposées ici.
En consequence, la présente invention propose : (a) un procédé pour inhiber l'endommagement d'un tissu menacd pendant une réirrigation chez un mammifère, qui consiste ä administrer au mammifère une quantité efficace de AP-t (b) l'utilisation de AP-t pour inhiber l'endommagement d'un tissu menacé pendant une réirrigation chez un mammifère ; (c) l'utilisation de AP-t pour la fabrication d'un media- ment destine ä l'inhibition de l'endommagement d'un tissu menacé pendant une réirrigation chez un mammifère : et (d) une formulation pharmaceutique ä utiliser pour inhiber l'endommagement d'un tissu menace pendant une réirriga- tion chez un mammifère, qui comprend AP-t et un support pharmaceutiquement acceptable.
Bien que la présente inventionpuisse être mise en oeuvre pour protéger un quelconque tissu menacé, elle est particulièrement utile pour inhiber l'endommagement d'un tissu myocardique menacé.
Le AP-t ä utiliser dans la présente invention peut etre n'importe quelle protéine biologiquement active correspondant sensiblement au AP-t des mammifères, et en particulier des etres humains, et il englobe les formes avec et sans glycosylation. 11 peut s'agir de AP-t à une ou deux chaines, ou d'un mélange de tels AP-t, comme décrit dans le document EP-A-112 122,-et, dans le cas de AP-t humain totalement glycosylé, son poids moleculaire apparent sur gel de polyacrylamide est d'environ 70 000 et son point
<Desc/Clms Page number 4>
isoélectrique est compris entre 7, 5 et 8, 0. De préférence, l'activité spécifique du AP-t est d'environ 500 000 UI/mg (Unités Internationales/mg,
l'Unité Internationale étant une unité d'activité définie par le National Institute for Biological Standards and Control, Holly Hill, Hampstead Londres, NW3 6RB, Royaume-Uni, dans le cadre de l'Organisation Mondiale de la Santé).
La séquence d'amino-acides de AP-t correspond de préférence sensiblement ä celle qui est exposée sur la figure 1 des dessins annexés. 11 s'agit donc d'une séquence identique à celle de la figure l ou comportant une ou plusieurs délétions, substitutions, insertions, inversions ou additions d'amino-acides, d'origine allélomorphe ou autre, la séquence résultante présentant au moins 80 %, et de préférence 90 %, d'homologie avec la séquence de la figure 1 et conservant essentiellement les memes propriétés biologiques et immunologiques que cette protéine.
En particulier, la séquence est identique ä celle de la figure 1 ou bien est la même à la différence que l'amino-acide de la 245ème position ä partir de la sérine N-terminale est la valine au lieu de la méthionine, l'une ou l'autre séquence contenant éventuellement une préséquence polypeptidique N-terminale additionnelle consistant en Gly-Ala-Arg.
La sequence -d'amino-acides représentée-sur la figure l contient trente-cinq résidus de cystéine et a donc la capacité de former dix-sept ponts disulfure. Sur la base d'une analogie faite avec d'autres protéines dont la structure a été déterminée plus en détail, la figure 2 montre la structure proposée pour la séquence (résultant de la formation de ponts disulfure) comprise entre l'amino-acide de la 90ème position et la proline C-terminale. on est moins sur de la structure de la région N-terminale, bien que quelques propositions aient été avancées (Progress in Fibrinolysis, 1983, /=269-273 : et Proc. Natl. Acad. Sei., 1984., 81, 5355-5359).
Les caractéristiques les plus importantes de la structure de AP-t sont les deux régions en anneau (comprises
<Desc/Clms Page number 5>
entre les 92ème et 173ème amino-acides et entre les 180ème et 261ème amino-acides), qui sont responsables de la liaison de la protéine à la fibrine, et la région des sérine-protéases qui constitue la majeure partie de la chaîne B et qui est responsable de l'activation du plasminogène. Les amino-acides particulièrement importants des sérine-protéases sont ceux de la triade catalytique His/Asp/Ser. Dans AP-t, ceux-ci apparaissent aux 322ème, 371ème et 463ème positions.
Le pont
EMI5.1
'-me et disulfure reliant les résidus de cystéine des 264ème et 395ème positions est légalement important en ce sens qu'il maintient ensemble les chaînes A et B dans la forme bicaté- naire de AP-t.
Sur les figures 1 et 2, les résidus d'amino-acides sont désignés par les codes conventionnels ä une et trois lettres suivants : Asp D Acide aspartique Cys C Cystéine His H Histidine Thr T Thréonine Val V Valine Arg R Arginine Ser S Sérine Ile I Isoleucine Lye K Lysine Glu E Acide glutamique Leu L Leucine Trp KTryptophanne Pro P Proline Tyr Y Tyrosine Gln Q Glutamine Gly G Glycine Phe F Phénylalanine Met M Methionine Ala A Alanine Asn N Asparagine Sur la figure 2, l'astérisque désigne le site de clivagede AP-t monocatenaire en AP-t bicaténairedans lequel la chaine A contient les deux régions en anneau et la chaine B contient
EMI5.2
la région des sérine-protéases.
Le AP-t peut être obtenu par l'une quelconquedes techniques décrites ou connues dans l'art antérieur. Par exemple, on peut 1 t obtenir à partir d'une lignée cellulaire normale ou néoplasique du type décrit dans Biochemica et Biophysica Acta, 1979, 580, 140-153 ; et les documents EP-A- 41 766 et EP-A-113 319. On préfère cependant que AP-t soit tir d'une lignée cellulaire cultivée transformée et transfectée, dérivée en utilisant une technique d'ADN recombinant comme décrit par exemple dans les documents EP-A-93 619, EP-A-117 059, EP-A-117 060, EP-A-173 552, EP-A-174 835, EP-A-178 105, WO 86/01538, WO 86/05514 et WO 86/05807.
<Desc/Clms Page number 6>
On préfère en particulier l'utilisation de cellules d'ovaire de hamster chinois (OHC) pour la production de AP-t, et que ces cellules soient dérivées de la manière décrite dans Molecular and Cellular Biology, 1985, 5 (7), 1750-1759. Selon cette methode, le gène cloné est co-transfecté avec le gène codant la dihydrofolate-réductase (dhfr) dans des cellules dhfr- de OHC. Les transformants exprimant dhfr sont selec- tionnés sur des milieux manquant de nucléosides et sont exposés ä des concentrations croissantes de méthotrexate.
Les gènes de dhfr et de AP-t sont ainsi amplifiés conjointement en conduisant ä une lignée cellulaire stable capable d'exprimer des taux élevés de AP-t.
De préférence, on purifie le AP-t en utilisant n'importe laquelle des techniques décrites ou connues dans l'art antérieur, par exemple les techniques décrites dans Biochemica et Biophysica Acta, 1979,580, 140-153 : J. Biol.
Chem., 1979, 254 (6), 1998-2003 : ibid., 1981, 256 (13), 7035- 7041 ; Eur. J. Biochem., 1983, 132, 681-686 ; et les documents EP-A-41 766, EP-A-113 319 et GB-A-2 122 219.
Le AP-t peut être utilisé ä la manière de la présente invention soit seul, soit en association avec un autre agent thérapeutique qui inhibe également l'endommagement d'un tissu menacé pendant une reirrigation. Un exemple particu- lièrement utile-dLme telle association est celle faite avec la superoxyde-dismutase (SOD), une enzyme dont on sait qu'elle entraine et détruit les radicaux superoxyde qui sont l'agent d'un des phénomènes capables de provoquer l'endommagement du tissu. En fait, on a également constaté que le degré d'inhibition offert par l'association de AP-t et SOD est fortement potentialisé comparativement à ceux que procurent AP-t et SOD par eux-mêmes. En conséquence, la présente invention propose également une association de AP-t et de SOD.
L'association de AP-t et SOD fournit un moyen particulièrement commode pour réaliser à la fois l'élimination des caillots sanguins et l'inhibition de l'endommagement d'un tissu menacé pendant une réirrigation subséquente.
<Desc/Clms Page number 7>
EMI7.1
Ainsi, de l'administration de AP-t et SOD résulte tout d'abord l'Elimination du caillot sanguin sousl'action thrombolytique connue de AP-t, puis l'inhibition del'endommagement du tissu sous les actions conjuguées de AP-t et de SOD.
La SOD a utiliser en association avec AP-t peut etre n'importe quelle protéine biologiquement active correspondant sensiblement ä l'une ou plusieurs quelconques d'un groupe d'enzymes globalement désignées par ce nom. Elle est de préférence d'origine mammifère et en particulier bovine ou humaine, et se trouve généralement combinée à un cation métallique dont on se sert normalement pour la classer. Des exemples de cations métalliques comprennent ceux de fer, manganèse et cuivre et, de préférence, des associations de cuivre avec d'autres métaux tels que le zinc, le cadmium, le cobalt ou le mercure, parmi lesquelles on préfère l'association cuivre/zinc. Les formes combinées au manganèse et au cuivre/zinc de SOD se rencontrent naturellement chez les êtres humains.
Les formes combinées au fer et au manganèse de SOD d'origine bactérienne ont toute deux un poids molécu- laire d'environ 40 000 et sont des dimères. D'autre part, la forme combinée au manganèse de SOD d'origine eucaryotique est un tétramère dont le poids moléculaire est d'environ
EMI7.2
80 000. La forme combinée au cuivre/zinc de SOD d'origine eucaryotique est un dimère qui contient un cation cuivre et un cation zinc par sous-unité et dont le poids moleculaire est d'environ 32 000.
Le cation cuivre est lié par coordination à quatre résidus d'histidine par sous-unité et le cation zinc est lié par coordination entre un residu d'histidine et un résidu d'acide aspartique. 11 existe également une forme combinée au cuivre/zinc de SOD d'origine eucaryotique qui se compose de quatre sous-unités et dont le poids moléculaire est d'environ 130 000. Les poids moléculaires des diverses formes de SOD ont été estimés par équilibre de sédimentation, tamisage moleculaire ou en utilisant des gels de polyacrylamide.
Les points isoélectriques des diverses formes de SOD s'échelonnent de 4 à 6,5, selon le degré de
<Desc/Clms Page number 8>
sulfatation et/ou de désamidation. De preference, 1'activité spécifique de la forme combinée au cuivre/zinc de SOD d'origine bovine ou humaine est d'au moins 3000 U/mg (l'unité d'activité étant comme définie dans J. Biol. Chem., 1969,
EMI8.1
244, 6049-6055).
La séquence d'amino-acides de la forme combinée au cuivre/zinc de SOD d'origine bovine ou humaine correspond de préférence sensiblement ä celle exposée dans J. Biol. Chem., 1974, 249 (22), 7326-7338, dans le cas de l'origine bovine, et dans Biochemistry, 1980, 19, 2310-2316 et FEBS Letters, 1980,120, 53-55, dans le cas de l'origine humaine. Cette sequence est donc identique à l'une de celles exposées dans ces articles ou comporte une ou plusieurs délétions, substi-
EMI8.2
tutions, insertions, inversions ou additions d'amino-acides, d'origine allélomorphe ou autre, la sequence résultante étant suffisamment homologue ä la séquence publiée choisie pour conserver essentiellement les mêmes propriétés biologiques et immunologiques.
La sequence d'amino-acides de la forme combinée au cuivre/zinc de SOD d'origine bovine contient trois résidus de cystéine par sous-unité (J. Biol. Chem., 1974, 249 (22), 7326- 7338). Le pont disulfure intracaténaire se trouve entre les résidus Cys 55 et Cys 144, tandis que le pont disulfure intercaténaire se trouve entre les résidus Cys 6. La séquence d'amino-acides de la forme combinée au cuivre/zinc de SOD d'origine humaine contient quatre résidus de cystéine par sous-unité (Biochemistry, 1980,19, 2310-2316, et FEBS Letters, 1980, 120,53-55). Le pont disulfure intracaténaire se trouve entre les résidus Cys 57 et Cys 146, tandis que le pont disulfure intercaténaire se trouve entre les résidus Cys 6.
Le résidu Cys 111 reste libre.
La SOD peut être obtenue par n'importe quelle technique décrite ou connue dans l'art antérieur. Par exemple, on peut-la tirer des érythrocytes ou du foie par un procédé d'extraction du type décrit dans les documents GB-A-1 407 807 et GB-A-1 529 890. En variante, la SOD peut etre tirée d'une
<Desc/Clms Page number 9>
1ignée cellulaire cultivée transformée ou transfectée, dérivée en utilisant une technique d'ADN recombinant comme décrit, par exemple, dans la demande de brevet australien
Na 27461/84 et les documents WO 85/01503, EP-A-138 111,
EP-A-164 566, EP-A-173 280 etEP-A-180 964.
La SOD est de préférence purifiée par une quel- conque technique appropriée décrite ou connue dans l'art antérieur, par exemple la technique décrite dans le document
EP-A-112 299.
Pour utiliser AP-t, ou une association de AP-t et SOD, ä la manière de la présente invention, il est pree- rable d'employer le ou les ingrédients actifs sous forme d'une formulation pharmaceutique. Dans le cas de l'associa- tion, les ingrédients actifs peuvent se trouver dans des formulations séparées qui sont administrées simultanément ou successivement. Si on les administre successivement, il est preferable d'administrer d'abord la formulation contenant
AP-t et ensuite la formulation contenant SOD. Dans l'un ou l'autre cas, le dé1ai d'administration de la seconde des deux formulations ne doit pas être tel que l'on perde le bénéfice de l'effet potentialisé d'inhibition de l'endomma- gement des tissus qui résulte de l'association in vivo des ingrédients actifs.
Toutefois, plutôt que d'employer des formulations séparées, il est bien plus commode de présenter les deux ingrédients actifs ensemble dans une seule formu- lation mixte. En conséquence, la présente invention propose également une formulation pharmaceutique qui comprend AP-t et SOD et un support pharmaceutiquement acceptable.
EMI9.1
En général, le AP-t ou l'association de AP-t et SOD seront administres par voie intravasculaire, que ce soit par perfusion ou par injection d'un embol, et une formulation ä usage parenteral est donc nécessaire. 11 est préférable de présenter une formulation lyophilisée au médecin ou au vete- rinaire en raison des importants avantages qu'offre une telle formulation sur le plan du transport et de la conservation.
Le médecin ou le vétérinaire peut ensuite reconstituer la
<Desc/Clms Page number 10>
formulation lyophilisée dans une quantité appropriée de solvant, comme il le taut et au moment voulu.
Des formulations pharmaceutiques contenant AP-t, lyophilisées et ä usage parenteral, sont connues dans l'art antérieur- Des exemples en sont fournis par les documents EP-A-41 766, EP-A-93 619, EP-A-112 122, EP-A-113 319, EP-A- 123 304, EP-A-143 081, EP-A-156 169, WO 86/01104, le brevet japonais publié NO 57-120523 (demande NO 56-6936) et lebrevet japonais publié N 58-65218 (demande NO 56-163145).
D'autres exemples préférés sont fournis par les documents GB-A-2 176 702 et GB-A-2 176 703. Toutes ces formulations conviennent également pour SOD et pour l'associationde AP-t et SOD.
Les perfusions intravasculaires sont normalement effectuées en utilisant la solution à usage parentéral contenue dans un sachet ou un flacon de perfusion ou encore dans une seringue de perfusion actionnée électriquement.
La solution peut être délivrée au malade ä partir du sachet ou du flacon sous l'effet d'un écoulement par gravité ou en utilisant une pompe de perfusion. L'utilisation de systemes de perfusion ä écroulement par gravité ne permet pas de maitriser suffisamment la vitesse d'administration de la solution ä usage parentéral et on préfère donc l'utilisation d'une pompe de perfusion, notamment avec les solutions dont la concentration en ingrédients actifs est relativement élevée. On préfère cependant encore plus l'utilisation d'une seringue de perfusion actionnee electriquement quipermetde maitriser mieux encore la vitesse d'administration.
La quantité de AP-t, et d'une association deAP-t et SOD, qui est efficace pour inhiber l'endommagement d'un tissu menacé pendant une réirrigation est évidemment fonction d'un certain nombre de facteurs comprenant, par exemple l'âge et le poids du mammifère, l'affection exacte necessi- tant le traitement et sa gravité, la voie d'administration, et cette quantité sera en fin de compte laissee a l'appre- ciation du médecin ou vétérinaire traitant.
Toutefois, dans
<Desc/Clms Page number 11>
le cas de AP-t, une dose efficace est généralement comprise dans l'intervalle de 0, 2 ä 4 mg/kg (c'est-à-dire de 100 000 ä 2 000 000 UI/kg en admettant une valeur de 500 000 UI/mg pour l'activité spécifique de AP-t), de preference de 0, 3 ä
EMI11.1
2 mg/kg (c'est-à-dire 150 000 ä 1 000 000 UI/kg), de poids corporel du malade et par heure. Ainsi, pour un être humain adulte pesant 70 kg, une quantité efficace par heure est de préférence comprise entre 20 et 140 mg (c'est-à-dire entre 10 000 000 et 70 000 000 UI), et en particulier d'environ 70 mg (c'est-à-dire 35 000 000 UI).
Dans le cas où AP-t est associé ä SOD, une dose efficace de SOD est alors généralement comprise dans l'intervalle de 1000 ä 50 000 U/kg, de préférence de 7000 ä 20 000 U/kg, de poids corporel du malade et par heure. Ainsi, pour un etre humain adulte pesant 70 kg, une quantité efficace de SOD, par heure, est de préférence comprise entre 500 000 et 1 500 000 U.
Les exemples non limitatifs suivants illustrent la présente invention.
Exemple 1 : préparation d'une Formulation de AP-t ä Usage
Parentéral
On prépare une formulation de AP-t à usage parentéral en procédant sensiblement comme décrit dans le document GB-A-2 176 703 ; l'activité spécifique du AP-t utilisé est d'environ 300 000 UI/mg.
Exemple 2 : préparation d'une Formulation de SOD ä Usage
Parenteral
On dissout dans du sérum physiologique sensiblement neutre de la SOD bovine, forme combinée au cuivre/zinc, fournie sous forme d'une poudre par Sigma Chemical Co., St Louis, Missouri, U. S. A., 63178.
Exemple 3 : Preparation d'une Formulation de AP-t et SOD a Usage Parenteral
On mélange les formulations des Exemples 1 et 2 et on dilue encore le melange obtenu pour atteindre le dosage requis.
<Desc/Clms Page number 12>
Exemple 4 : Protection de tissu menace en utilisant AP-t et en utilisant AP-t et SOD (a) Méthodologie
On anesthesie des chiens de race bigle mâles (10-12 kg1 avec du pentobarbital sodique, les intube et les ventile ä l'air ambiant au moyen d'un respirateur de Harvard. On implante des cathéters pour perfusion et mesures de pression arterielle dans la veine jugulaire gauche et l'artère carotide gauche. On pratique une thoracotomie au niveau du quatrième espace intercostal, on suspend le coeur dans un arceau péricardique et on isole l'artère interventriculaire antérieure (AIA) juste au-dessous de la première branche diagonale principale.
On place une sonde de débit électromagnétique sur l'AIA. On provoque une occlusion de l'AIA pendant 90 minutes en plaçant une anse de fil de soie 1/0 en aval de la sonde de débit. On commence le traitement par voie intraveineuse quinze minutes avant la levée de l'anse d'occlusion et le poursuit pendant 45 minutes après la levée. On referme la thoracotomie et on laisse les animaux se remettre des actes chirurgicaux. On anesthésie de nouveau les animaux 24 heures après l'occlusion et on redetermine le débit dans l'AIA. On retire ensuite le coeur pour une quantification post-mortem de la taille de l'infarctus.
On soumet quatre groupes de chiens ä l'évaluation.
Le Groupe 1 se compose de témoins recevant une solution saline. Les animaux du Groupe II reçoivent 2, 5 mg/kg (750 000 Ul/kg) de AP-t, ceux du Groupe II reçoivent 16 500 U/kg de SOD bovine et ceux du Groupe IV reçoivent 2,5 mg/kg (750 000 UI/kg) de AP-t ainsi que 16 500 U/kg de SOD bovine. Les formulations utilisées sont celles décrites dans les Exemples 1 ä 3.
On détermine quantitativement la taille des infarctus du myocarde par une technique de double- perfusion extra vivo. On introduit des canules dans l'AIA immédiatement en aval du si te d'occlusion et dans l'aorte au-dessus
<Desc/Clms Page number 13>
des orifices coronaires. On perfuse dans le lit coronaire de AIA du chlorhydrate de triphényl-tétrazolium (CTT) à
1, 5 % dans du phosphate de potassium tampon 0, 02M, pH 7, 4.
On perfuse du bleu Evans ä 0, 5 % en mode rétrograde dans l'aorte. On met les deux régions sous perfusion avec leurs colorants respectifs ä une pression constante de 100 mm de mercure pendant cinq minutes. On découpe le coeur en tran- ches de 8 mm perpendiculaires ä l'axe pointe-base. On iden- tifie par l'absence de bleu Evans la zone du ventricule gauche qui est soumise au risque d'infarctus en raison de sa dépendance anatomique ä l'égard de l'AIA en ce qui con- cerne le courant sanguin. A 1'intérieur de la zone à risque, la region de myocarde infarci se démarque par l'absence de coloration du tissu une fois qu'il a été soumis ä la perfu- sion de CTT, et ce en raison d'une perte de déshydrogénases.
On dessine soigneusement les coupes ventriculaires transversales sur des calques acryliques transparents pour disposer dlun enregistrement permanent de la morphologie de l'infarctus et permettre la confirmation planimétrique de la taille de l'infarctus. On débarrasse ensuite les coupes ventriculaires du muscle ventriculaire droit, des valvules et du tissu adipeux. On sépare par une dissection soignée la zone ä risque totale du ventricule gauche et l'infarctus, et on les pèse. La taille de l'infarctus est exprimée en pourcentage par rapport ä la zone anatomique à risque. On procède ä une comparaison statistique de chaque groupe traité par un medicament avec le groupe témoin en effectuant une analyse univoque de variance par la méthode de Bonferroni pour comparaison multiple (Circulation Research, 1980,47,
1-9).
On prend une valeur p inférieure à 0, 05 comme critère de significativité.
<Desc/Clms Page number 14>
(b) Résultats
TABLEAU
EMI14.1
<tb>
<tb> NOMBRE <SEP> ZONE <SEP> A <SEP> % <SEP> DE <SEP> VENTRIGROUPE <SEP> DE <SEP> RISQUE <SEP> CULE <SEP> SOUMIS
<tb> CHIENS <SEP> INFARCIE <SEP> AU-RISQUE-*
<tb> I. <SEP> Solution <SEP> 5 <SEP> 36,0¯8,9 <SEP> 37,3¯7,6
<tb> saline
<tb> II. <SEP> AP-5 <SEP> 6 <SEP> 14,3¯11,7 <SEP> 35,7¯5,4
<tb> III. <SEP> SOD <SEP> 4 <SEP> 13, <SEP> 0 <SEP> 4, <SEP> 6 <SEP> 30, <SEP> 6+2, <SEP> 6
<tb> IV. <SEP> AP-t <SEP> + <SEP> SOD <SEP> 3 <SEP> 2,3¯1,3 <SEP> 37,2¯9,1
<tb>
* Les résultats sont exprimés en moyenne t écart-type.
Selon l'analyse de variance, la proportion de ventricule gauche rendue ischémique par occlusion mécanique de l'AIA ne diffère pas significativement entre aucun des groupes traités et le groupe témoin (c) Conclusions
L'utilisation de AP-t inhibe significativement la taille de l'infarctus du myocarde, ce qui démontre son aptitude ä protéger le tissu menacé pendant la réirrigation. De plus, par l'utilisation conjointe de AP-t et SOD, on parvient à cet égard ä produire un effet inhibiteur synergique, l'association procurant un taux d'inhibition superieur ä celui fourni par chacun de AP-t et SOD indépendamment.