DE3617752A1

DE3617752A1 - Gewebe-plasminogenaktivator, diesen enthaltende pharmazeutische formulierungen, ihre herstellung und ihre verwendung in der human- und veterinaermedizin

Info

Publication number: DE3617752A1
Application number: DE19863617752
Authority: DE
Inventors: Henry Cary N.C. Berger; Michael Denis Beckenham Kent Johnston
Original assignee: Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: Wellcome Foundation Ltd
Priority date: 1985-05-28
Filing date: 1986-05-27
Publication date: 1986-12-04
Also published as: ES8802439A1; FI85335C; GB8612780D0; CA1300008C; NL8601355A; DK163173B; BE904830A; GB2176702A; NZ216307A; FI862227A0; SE8602405L; HUT41638A; JPH0759517B2; IT1191926B; IT8648065A0; FR2583984A1; GB2176702B; NO171345B; ES555353A0; NO862096L

Description

Gewebe-Plasminogenaktivator, diesen enthaltende pharmazeutische Formulierungen, ihre Herstellung und ihre Verwendung in der Human- und Veterinärmedizin

Die vorliegende Erfindung betrifft den Gewebeplasminogenaktivator und insbesondere diesen enthaltende pharmazeutische Formulierungen, ihre Herstellung und ihre Verwendung in der Human- und Veterinärmedizin.

Man nimmt an, daß es ein dynamisches Gleichgewicht zwischen dem Enzymsystem, das in der Lage ist, Blutgerinnsel zu bilden - dem Coagulationssystem - und dem Enzymsystem, das in der Lage ist, Blutgerinnsel aufzulösen - dem fibrinolytischen System - das ein intaktes offenes Gefäßbett aufrecht erhält, gibt. Um den Blutverlust aufgrund von Verletzungen zu begrenzen, werden Blutgerinnsel in den verletzten Gefäßen gebildet. Nach einer natürlichen Wiederherstellung des verletzten Gefäßes werden die überflüssigen Blutgerinnsel durch das fibrinolytische System aufgelöst. Gelegentlich bilden sich Blutgerinnsel ohne traumatische Verletzung, die sich in den Hauptblutgefäßen ablagern können, wodurch es zu einer partiellen oder sogar totalen Verstopfung des Blutflusses kommt. Falls dies im Herz, in der Lunge oder im Gehirn eintritt, kann daraus ein Myokardinfarkt, eine Lungenembolie oder ein Schlaganfall resultieren. In kombinierter Form sind diese Umstände die Hauptursache von Krankheit und Tod in den industrialisierten Ländern.

Blutgerinnsel bestehen aus einem fibrösen Netzwerk, das durch das proteolytische Enzym Plasmin aufgelöst werden kann. Das Enzym wird aus dem inaktiven Proenzym, dem Plasminogen, eine Komponente des Blutplasmas, durch die Wirkung eines Plasminogenaktivators gebildet. Es gibt zwei immunologisch verschiedene Plasminogenaktivatoren in den Säugetieren. Einen intrinsischen Plasminogenaktivator, der auch als Urokinase bekannt ist, ein Enzym, das von der Niere produziert wird und das man aus Urin isolieren kann. Es kann gleichfalls aus

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einer Anzahl von Gewebekulturen isoliert werden. Einen extrinsischen Plasminogenaktivator, der auch als Gefäßplasminogenaktivator und als Gewebeplasminogenaktivator (tissue plasminogen activator, t-PA) bekannt ist und der aus vielen Gewebehomonogenaten (insbesondere Humanuterus), Gefäßzellwänden und aus einigen Zellkulturen isoliert werden kann. Zusätzlich zu diesen zwei Arten vom Plasminogenaktivatoren gibt es auch ein bakterielles Produkt, die Streptokinase, die man aus beta-hämolytischen Streptokokken isolieren kann. Ein wesentlicher Nachteil sowohl der Urokinase als auch der Streptokinase besteht darin, daß sie im gesamten Blutkreislauf und nicht nur an der Stelle des Blutgerinnsels aktiv sind. Sie können beispielsweise andere Blutproteine, wie z. B. Fibrinogen, Prothrombin, Faktor V und Faktor VIII zerstören und vermindern dadurch die Fähigkeit zur Blutgerinnung und erhöhen das Risiko einer Hämorrhagie. Im Gegensatz dazu ist die biologische Aktivität des t-PA von der Gegenwart von Fibrin, an das es sich bindet und wo es aktiviert wird, abhängig. Die maximale Aktivität bildet sich daher nur an der Stelle eines Blutgerinnsels, d. h. in Gegenwart des aufzulösenden Fibrinnetzwerkes, wodurch das Risiko einer Hämorrhagie größtenteils vermieden wird.

Der Hauptverabreichungsweg von t-PA ist die intravaskuläre Infusion, was die Formulierung des t-PA als parenterale Lösung erforderlich macht. Im Falle eines Proteins ist es vorzuziehen, das Mittel dem Arzt oder dem Veterinärmediziner in Form einer lyophilisierten pharmazeutischen Formulierung zur Verfugung zu stellen, weil diese wesentliche Vorteile für den Transport und die Lagerung im Vergleich zu einer flüssigen Formulierung aufweist. Es ist jedoch wichtig, daß jede lyophilisierte Formulierung einfach in die gewünschte parenterale Lösung ohne übermäßige Unannehmlichkeiten und Schwierigkeiten überführt werden kann und daß der Arzt oder der Veterinärmediziner in der Lage ist, die erforderliche Konzentration des Mittels in jeder gegebenen Situation einfach durch Rekonstitution der Formulierung mit der entsprechenden Menge des Lösungsmittels herzustellen. Es ist auch beispielsweise nicht zu empfehlen, eine große

Volumenmenge einer Lösung einem Patienten mit einer Herz- oder Nierenkrankheit zu verabreichen, weil dadurch das Herz oder die Nieren einer größeren Belastung ausgesetzt werden. Das Volumen sollte daher unter solchen Umständen so niedrig wie möglich gehalten werden. Es ist deshalb wünschenswert, daß man nicht nur eine parenterale Lösung, mit einer relativ niedrigen Konzentration, sondern auch eine mit einer relativ hohen Konzentration des Mittels herstellen kann.

s. ι Eine Anzahl von lyophilisierten pharmazeutischen Formulierungen von t-PA sind im Stand der Technik beschrieben, beispielsweise in der EP-A-113319 und EP-A-123304. Die Formulierungen werden aus einer wäßrigen Salzlösung des t-PA hergestellt, in der der pH-Wert etwa neutral ist und weisen den Nachteil auf, daß die Löslichkeit des t-PA in solchen Lösungen in Abwesenheit einer Erhöhung in der Ionenkonzentration gering ist. Folglich enthalten die parenteralen Lösungen, die man aus solchen lyophilisierten Formulierungen herstellen kann, entweder eine geringe t-PA-Konzentration, wodurch es in bestimmten Fällen notwendig ist, ein großes Volumen der Lösung dem Patienten zu verabreichen oder sie sind hypertonisch, was bei Verabreichung einen nachteiligen Effekt auf die roten Blutzellen haben kann.

Es wurde nun gefunden, daß die Löslichkeit des t-PA in einer wäßrigen Lösung verbessert werden kann, wenn der pH-Wert der Lösung im sauren Bereich liegt, und ferner, daß eine lyophilisierte pharmazeutische Formulierung aus einer sauren, wäßrigen t-PA-Lösung hergestellt werden kann und daß die Formulierung geeignet ist, eine parenterale Lösung zu ergeben, die bei Verabreichung keine wesentlichen physiologischen Probleme bereitet. Demgemäß wird durch die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer lyophilisierten pharmazeutischen t-PA-Formulierung zur Verfügung gestellt, wobei das Verfahren das Vakuumtrocknen einer gefrorenen t-PA-Lösung, in der der pH-Wert 2 bis 5 beträgt, enthält.

Als Ergebnis der verbesserten Löslichkeit des t-PA kann eine lyophilisierte pharmazeutische Formulierung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, die in der Lage ist, eine parenterale Lösung, die eine hohe Konzentration t-PA enthält, zu ergeben, ohne ein wesentliches Risiko, daß das t-PA aus der Lösung ausfällt. Die lyophilisierte Formulierung kann deshalb dem Arzt oder dem Veterinärmediziner zur Verfügung gestellt werden, der die Formulierung auflösen kann und, falls erforderlich, auf die gewünschte Konzentration unter Verwendung von beispielsweise Wasser mit neutralem oder saurem pH einstellen kann. Die vorliegende Erfindung stellt daher eine stabile lyophilisierte pharmazeutische Formulierung zur Verfügung, die eine größere Flexibilität in ihrer Handhabung und in der Verwendung durch den Arzt und Veterinärmediziner erlaubt und die auch einfacher zu transportieren und zu lagern ist.

Das in der vorliegenden Erfindung verwendete t-PA kann jedes bioaktive Protein sein, das im wesentlichen dem Säugetier t-PA und besonders dem humanen t-PA entspricht und umfaßt Formen mit und ohne Glycosilierung. Es kann ein- oder zwei-Ketten t-PA oder eine Mischung davon, wie in der EP-A 112 122 beschrieben, sein und im Fall des komplett glycosilierten humanen t-PA ein Molekulargewicht in Polyacrylamidgelen von etwa 70000 und einen isoelektrischen Punkt zwischen 7,5 und 8,0 aufweisen. Vorzugsweise besitzt das t-PA eine spezifische Aktivität von etwa 500000 IU/mg (International Units/mg, die Internationale Einheit ist eine Einheit der Aktivität, wie sie von der WHO, National Institute for Biological Standards and Control, Holly Hill, Hampstead, London NW3 6RB, U.K., definiert wurde).

Die Aminosäuresequenz des t-PA entspricht vorzugsweise im wesentlichen der in Figur 1 gezeigten Sequenz. Die Sequenz ist daher zu der in Figur 1 gezeigten identisch oder enthält eine oder mehrere Aminosäuredeletionen, Substitutionen, Insertionen, Inversionen oder Zusätze anderen allelischen Ursprungs oder andernfalls weist die

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erhaltene Sequenz zumindest 80 % und vorzugsweise 90 % Homologie mit der in Figur 1 gezeigten Sequenz auf und behält im wesentlichen die gleichen biologischen und immunologischen Eigenschaften des Proteins. Insbesondere ist die t-PA-Sequenz zu der in Figur 1 gezeigten identisch oder besitzt die gleiche Sequenz, jedoch mit der Aminosäure Valin in der Position 245 vom Serin N-terminalen Ende anstelle von Methionin oder beide Sequenzen enthalten gegebenenfalls keine der ersten drei Aminosäuren oder enthalten gegebenenfalls ein zusätzliches Polypeptid, wobei die Sequenz Gly-Ala-Arg als Presequenz dem N-terminalen Ende vorgeschaltet ist.

Die in Figur 1 gezeigte Aminosäuresequenz besitzt 35 Cysteinreste und folglich das Potential zur Bildung von 17 Disulfidbriicken. Aufgrund einer Analogie mit anderen Proteinen, deren Struktur detaillierter bestimmt worden ist, wird die postulierte Struktur für die Sequenz (aufgrund der Disulfidbrückenbildung) zwischen der Aminosäure in der Position 90 und dem Prolin C-terminalen Ende in der Figur 2 gezeigt. Die Struktur der N-terminalen Region ist unsicherer, obwohl einige Vorschläge gemacht wurden (Progress in Fibrinolysis, 1983, 6, 269-273; und Proc. Natl. Acad. Sei., 1984, 81, 5355-5359). Die wichtigsten Merkmale der t-PA-Struktur sind die beiden Schleifenregionen (zwischen den Aminosäuren in Position 92 und 173 und zwischen den Positionen 180 und 261), die für die Bindung des Proteins an Fibrin verantwortlich sind sowie die Serinproteaseregion, die den Hauptteil der B-Kette ausmacht und die für die Aktivierung des Plasminogens verantwortlich ist. Die Aminosäuren mit besonderer Wichtigkeit in Serinproteasen sind das katalytische Dreiergespann His/Asp/Ser. In dem t-PA findet man dieses an der Position 322, 371 und 463. Die Disulfidbrücke zwischen den Amincsäureresten an der Position 264 und 395 ist gleichfalls wichtig, da sie die A- und B-Ketten in der 2-Kettenform des t-PA zusammenhalt.

In den Figuren 1 und 2 wurde der übliche 3-Buchstaben-Code für die Aminosäurereste wie folgt verwendet:

Asp D Asparaginsäure He I Isoleucin

Thr T Threonin Leu L Leucin

Ser S Serin Tyr Y Tyrosin

GIu E Glutaminsäure Phe F Phenylalanin

Pro P Prolin His H Histidin

GIy G Glycin Lys K Lysin

Ala A Alanin Arg R Arginin

Cys C Cystein Trp W Tryptophan

VaI V Valin Gin Q Glutamin

Met M Methionin Asn N Asparagin

Das t-PA kann man durch jedes im Stand der Technik bekannte oder beschriebene Verfahren gewinnen. Beispielsweise kann man es aus einer normalen oder neoplastischen Zellinie derart, wie sie in Biochimica et Biophysica Acta, 1979, 580, 140-153; EP-A-41766 oder EP-A-113319 beschrieben, gewinnen. Vorzuziehen ist es jedoch, daß das t-PA aus einer kultivierten transformierten oder durch Transfektion der veränderten Zellinie, erhalten unter Verwendung der rekombinanten DNA-Technologie, wie beispielsweise in der EP-A-93619, EP-A-117059 oder EP-A-117060 beschrieben, gewonnen wird. Es ist besonders bevorzugt, das man Chinese Hamster Ovary (CHO)-ZeIlen für die Produktion des t-PA verwendet und diese auf die Art wie in Molecular and Cellular Biology, 1985, 5(7), 1750-1759 beschrieben, herstellt. In diesem Verfahren wird das geklonte Gen mit dem Gen, das für die Dihydrofolat-Reductase (dhfr) codiert in dhfr" CHO-Zellen übertragen. Die transformierten Zellen, die dhfr exprimieren, werden auf einem nukleosidfreien Medium selektiert und steigenden Konzentrationen Methotrexat ausgesetzt. Die auf diese Weise coamplifizierten dhfr und t-PA-Gene ergeben eine stabile Zellinie, die in der Lage ist, hohe Konzentrationen von t-PA zu exprimieren.

Das t-PA wird vorzugsweise unter Verwendung irgendeines im Stand der Technik bekannten oder beschriebenen Verfahrens, wie z. B. den Verfahren, die in Biochimica et Biophysica Acta, 1979, 580, 140-153; J. Biol. Chem., 1979, 254(6), 1998-2003; ibid, 1981, 256(13),

7035-7041; Eur. J. Biochem., 1983, 132, 681-686; EP-A-41766; EP-A-113319 oder GB-A-2122219 beschrieben sind, gereinigt.

Es gibt offensichtlich keine obere Grenze für die Löslichkeit des t-PA in der wäßrigen Lösung, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird. Bei sehr hohen Konzentrationen, beispielsweise größer als 150000000 IU/ml (International Units/ml) wurde die Lösung nur viskos, ohne daß wesentliche Mengen von t-PA auspräzipierten. Die Konzentration des t-PA in der wäßrigen Lösung kann deshalb innerhalb weiter Grenzen variieren, beispielsweise von 50000 bis 50000000 IU/ml. Um den maximalen Vorteil aus der vorliegenden Erfindung zu ziehen, ist es vorzuziehen, daß die Konzentration des t-PA größer als 100000 IU/ml, besser größer als 500000 IU/ml und am besten größer als 1000000 IU/ml ist. Am allerbesten beträgt die Konzentration des t-PA etwa 5000000 IU/ml.

Die Obergrenze des pH-Wertes der wäßrigen Lösung beträgt vorzugsweise 4,5. Tatsächlich liegt der pH-Wert daher vorzugsweise im Bereich von 2,5 bis 4,0 besser zwischen 2,8 bis 3,5 und am besten bei einem Wert von etwa 3,0. Der gewünschte pH-Wert der wäßrigen Lösung wird üblicherweise durch Verwendung einer physiologisch verträglichen anorganischen oder organischen Säure eingestellt. Beispiele für solche Säuren sind Salzsäure, Schwefelsäure und Salpetersäure, Zitronensäure, Weinsäure und Benzolsulfonsäure. Aus diesen Beispielen ist die Salzsäure bevorzugt.

Obwohl einige physiologisch verträglichen Cosolventien ggf. zusätzlich zu Wasser vorhanden sein können, ist es bevorzugt, daß das Medium für die wäßrige Lösung gänzlich oder im wesentlichen ein wäßriges Medium ist.

Die parenterale Lösung, die man aus der lyophilisierten pharmazeutischen Formulierung erhält, kann hypertonisch, hypotonisch oder isotonisch mit dem Blutserum des Patienten sein. Um unerwünschte Nebeneffekte zu vermeiden, ist die parenterale Lösung jedoch vor-

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zugsweise isotonisch, obwohl kleinere Abweichungen keine wesentlichen physiologischen Nachteile besitzen. Eine im wesentlichen isotonische parenterale Lösung kann man durch Zusatz eines physiologisch verträglichen Mittels, das in der Lage ist, die Tonizität der Lösung auf den erforderlichen Wert zu bringen, erhalten. Das Mittel kann zur Lösung, die gefriergetrocknet wird, zugegeben werden, so daß es bereits in der lyophilisierten pharmazeutischen Formulierung vorhanden ist oder man kann es in das Wasser mit neutralem oder saurem pH-Wert, das zur Auflösung der Formulierung, um die gewünschte parenterale Lösung zu erhalten, verwendet wird, zugegeben. Beispiele für solche Mittel sind im Stand der Technik bekannt und umfassen Dextrose (in der wasserfreien Form oder als Monohydrat) und Natriumchlorid und Mischungen davon. Die Konzentration des Mittels in der wäßrigen Lösung oder in dem Wasser zur Auflösung wird natürlich von Mittel zu Mittel variieren. Im Falle von Natriumchlorid beträgt die Konzentration vorzugsweise 7-10 mg/ml und am bevorzugtesten etwa 8,5 mg/ml, jene Konzentration, die man meistens als physiologische Salzlösung oder nur als physiologisches Salz bezeichnet. Im Fall der wasserfreien Dextrose beträgt die Konzentration vorzugsweise 30 bis 70 mg/ml und am bevorzugtesten etwa 50 mg/ml.

Die wäßrige Lösung kann ggf. Additive, die normalerweise mit den lyophilisierten pharmazeutischen Formulierungen dieser Art verbunden sind, enthalten. Beispiele umfassen humanes Serumalbumin, Bindemittel und Füllmittel, wie beispielsweise Mannitol, Lactose und Glucose. Zusätzlich besitzt das t-PA die Tendenz, an Glas- oder Plastikoberflächen zu adsorbieren und deshalb kann es erforderlich sein, ein oberflächenaktives Mittel in die wäßrige Lösung zuzusetzen, um diese Adsorption zu verhindern oder zu minimieren. Beispiele für ein Mittel dieser Art sind die Polyoxyethylenderivate der Fettsäurepartialester von Sorbitolanhydriden, wie sie beispielsweise

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unter dem Handelsnamen Tween 80 vertrieben werden.

Einer der überraschenden Vorteile der vorliegenden Erfindung, neben der wesentlich erhöhten Löslichkeit des t-PA, ist jener, daß die

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Verwendung einer sauren parenteralen Lösung, die man durch Rekonstitution der lyophilisierten pharmazeutischen Formulierung erhält, offensichtlich keine wesentlichen physiologischen nachteiligen Effekte bei Verabreichung an einem Patientem besitzt. Offensichtlich ist das Blut im allgemeinen in der Lage, den pH-Wert der Lösung sofort nach Kontakt auf einen neutralen pH-Wert einzustellen, wobei das t-PA innerhalb des Blutstroms rasch verteilt wird. Es ist jedoch vorzuziehen, daß dieser Vorgang nicht wesentlich auf irgendeine Weise behindert wird und daß die parenterale Lösung und folglich die wäßrige Lösung, die man gefriertrocknet und das Wasser für die Rekonstitution keine starke Puffersubstanz beinhaltet. Eine schwache Puffersubstanz, die nicht wesentlich diesen Prozeß behindert, kann in der Lösung enthalten sein und zusätzlich wirkt t-PA selbst bei einem sauren pH-Wert als seine eigene schwache Puffersubstanz. Zusätzlich besitzt das humane Serumalbumin die Fähigkeit, als schwache Puffersubstanz zu wirken.

Wegen der wesentlich erhöhten Löslichkeit des t-PA in einer wäßrigen Lösung, in der der pH-Wert von 2 bis 5 ist, gibt es keine Notwendigkeit, in die parenterale Lösung, die man durch Rekonstitution aus der lyophilisierten Formulierung erhält, irgendein zusätzliches Material, wie z. B. Lysin oder Ornithin oder ein Salz davon, zur Erhöhung der Löslichkeit des t-PA zuzusetzen.

Die wäßrige t-PA-Lösung kann man durch Herstellung einer Lösung von gereinigtem t-PA und Austausch des Mediums gegen ein wäßriges Medium mit einem pH-Wert von 2 bis 5 oder durch Auflösung von gereinigtem t-PA in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 2 bis 5 herstellen.

Die Reinigung des t-PA kann in der Endstufe die Eluierung des Proteins aus einer Chromatographiesäule in Form einer Lösung, die eine starke Puffersubstanz enthält, beinhalten. Wie vorhin angeführt, ist es vorzuziehen, daß die parenterale Lösung und daher die lyophilisierte pharmazeutische Formulierung und die wäßrige

Lösung keine starke Puffersubstanz enthalten und daher ist ein übliches Mittel zur Entfernung der starken Puffersubstanz bei gleichzeitigem Austausch des Mediums die Durchführung einer Dialyse. Diese kann unter Verwendung eines Dialyseschlauches oder einer künstlichen Niere durchgeführt werden, wobei die gereinigte Lösung gegen ein wäßriges Medium mit einem pH-Wert von 2 bis 5 ausgetauscht wird. Es kann insbesondere erforderlich sein, wenn die t-PA-Konzentration in der gereinigten Lösung hoch ist, zuerst den pH-Wert der Lösung auf 2 bis 5 einzustellen. Eine weitere Möglichkeit zur Entfernung einer starken Puffersubstanz bei gleichzeitigem Austausch des Mediums besteht darin, daß man die gereinigte Lösung einer Gelfiltration unterwirft und die Säule mit einem wäßrigen Medium, das einen pH-Wert von 2 bis 5 aufweist, äquilibriert.

Das t-PA in Form eines präzipitierten Feststoffes kann man, vorzugsweise aus einer gereinigten Lösung durch Einstellung des pH-Wertes auf 5,5, durch Abkühlen der Lösung bis gerade oberhalb des Gefrierpunktes und Sammeln des Proteins beispielsweise durch Zentrifugation gewinnen. Der präzipitierte Feststoff kann anschließend in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 2 bis 5 auf übliche Weise gelöst werden.

Bevorzugt ist, daß die erhaltene wäßrige Lösung auf übliche Weise sterilisiert wird, beispielsweise durch Filtersterilisation, und daß sie anschließend in sterile Plastik- oder Glasbehälter, wie z. B. Ampullen oder Fläschchen, in Volumina von beispielsweise 0,5 bis 20 ml, verteilt wird.

Die wäßrige Lösung des t-PA wird gefroren, vorzugsweise bei einer Temperatur von -10 bis -40 ⁰C. Die geforene wäßrige Lösung wird anschließend vorzugsweise bei dieser Temperatur bis zur Durchführung der Vakuumtrocknung gehalten.

Die Vakuumtrocknung der gefrorenen wäßrigen Lösung kann man auf übliche Weise durchführen,wobei diese das Trocknen unter einem

partiellen oder kompletten Vakuum, beispielsweise bei 0,01 bis 0,1 Torr für eine ausreichende Zeit, um die Entfernung von im wesentlichen der gesamten gefrorenen Flüssigkeit zu bewirken, enthält. Die Temperatur, bei welcher die Vakuumtrocknung durchgeführt wird, beträgt üblicherweise -30 bis -40 ⁰C am Anfang des Verfahrens, um die wäßrige Lösung in einer wesentlich oder komplett gefrorenen Form zu halten. Mit Fortdauer des Verfahrens und zunehmender Entfernung des Wassers kann man die Temperatur stufenweise, bis sie Raumtemperatur erreicht, erhöhen. Vorzuziehen ist, daß am Ende des Verfahrens das Vakuumtrocknen bei Raumtemperatur oder gerade oberhalb unter einem hohen Vakuum von etwa 0,01 Torr durchzuführen, um so viel wie möglich der letzten Spuren von Wasser zu entfernen. Der Feuchtigkeitsgehalt der erhaltenen lyophilisierten pharmazeutischen Formulierung beträgt vorzugsweise weniger als 2,5 %. Nach Beendigung des Vakuumtrocknens werden die sterilen Plastik- oder Glasbehälter, die die lyophilisierte pharmazeutische Formulierung enthalten, auf übliche Weise hermetisch verschlossen.

Während des Vakuumtrocknens der gefrorenen wäßrigen Lösung wird das Wasser unter Zurücklassung des t-PA in Form eines physiologisch verträglichen Salzes entfernt. Demzufolge wird durch die vorliegende Erfindung auch ein physiologisch verträgliches Salz, insbesondere ein physiologisch verträgliches Additionssalz, wie z. B. das Hydrochloridsalz des t-PA zur Verfügung gestellt.

Die Verwendung der vorliegenden Erfindung erlaubt erstmalig die Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung, die in der Lage ist, eine parenterale Lösung mit einer hohen t-PA-Konzentration zu ergeben. Demzufolge wird durch die vorliegende Erfindung auch eine lyophilisierte pharmazeutische Formulierung von t-PA, die bei Lösung in Wasser in der Lage ist, eine Konzentration von t-PA größer als 100000 IU/ml, besser mehr als 500000 IU/ml und am besten mehr als 1000000 IU/ml zu ergeben, zur Verfügung gestellt. Um eine parenterale t-PA-Lösung für die Verabreichung herzustellen, wird das lyophylisierte Material erhalten, das nach dem erfindungsgemäßen

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Verfahren erhalten wurde, in Wasser mit neutralem oder saurem pH-Wert rekonstituiert. Wenn die wäßrige Lösung, aus der man die lyophilisierte pharmazeutische Formulierung hergestellt hat, im wesentlichen isotonisch war, ist es vorzuziehen, daß das Wasser für die Rekonstitution auch im wesentlichen isotonisch ist.

Die biologische Aktivität des t-PA zur Auflösung des Fibrinnetzwerkes eines Blutgerinnsels führte zu seiner Verwendung in der Behandlung von thrombotisehen Erkrankungen (The Lancet, 7. November 1981, 1018-1020; ibid., 13 April 1985, 842-847; The New England Journal of Medicine, 1984, 310(10), 609-613; and ibid., 1985, 312(14), 932-936). Die vorliegende Erfindung stellt deshalb auch ein Verfahren zur Behandlung einer thrombotisehen Krankheit in einem Säugetier zur Verfügung, die die Verabreichung einer parenteralen Lösung von t-PA, erhalten aus einer lyophilisierten pharmazeutischen Formulierung, wie hier definiert, an ein Säugetier enthält. Als Alternative wird auch eine lyophilisierte pharmazeutische Formulierung von t-PA, wie hier definiert, zur Verwendung in der Human- oder Veterinärmedizin, besonders zur Verwendung in der Behandlung von thrombotisehen Krankheiten zur Verfugung gestellt.

Bestimmte Beispiele einer thrombotisehen Krankheit sind im Stand der Technik bekannt, umfassen jedoch allemal den Myokardinfarkt, die tiefe Venenthrombose, die Lungenembolie und den Schlaganfall.

Der Hauptweg der Verabreichung des t-PA ist die intravaskulare, insbesondere intravenöse Infusion, obwohl denkbare andere Verabreichungswege, wie z. B. die intramuskuläre Verabreichung, verwendet werden können. Intravaskulare Infusionen werden normalerweise mit der parenteralen Lösung, enthalten in einem Infusionsbeutel oder einer Flasche oder einer elektrisch betriebenen Infusionsnadel, durchgeführt. Die Lösung kann aus dem Infusionsbeutel oder der Flasche an den Patienten mittels der Schwerkraft oder durch die Verwendung einer Infusionspumpe verabreicht werden. Die Verwendung eines

Schwerkraftinfusionssystems erlaubt keine ausreichende Kontrolle über die Verabreichungsgeschwindigkeit der parenteralen Lösung und deshalb ist die Verwendung einer Infusionspumpe vorzuziehen, insbesondere im Falle von Lösungen, die relativ hohe Konzentrationen t-PA enthalten. Besser ist jedoch die Verwendung einer elektrisch betriebenen Infusionsnadel, die eine bessere Kontrolle über die Verabreichungsgeschwindigkeit erlaubt.

Eine wirksame Menge des t-PA zur Behandlung eines Säugetiers mit einer thrombotisehen Krankheit wird natürlich von einer Anzahl von Faktoren einschließlich beispielsweise dem Alter und dem Gewicht des Säugetiers, den genauen Umständen, die die Behandlung erforderlich machen, von der Schwere der Krankheit und dem Verabreichungsweg abhängen und wird letzlich im Ermessen des aufgesuchten Arztes oder Tierarztes liegen. Meistens jedoch wird eine wirksame Menge zur Lyse eines korronaren Artherienthrombus, beispielsweise im allgemeinen im Bereich von 150000 bis 450000 IU/kg Körpergewicht des Patienten/ Stunde betragen. Daher wird für einen 70 kg schweren erwachsenen Menschen die wirksame Menge/Stunde im allgemeinen von 10000000 bis 30000000 IU₅ insbesondere etwa 20000000 IU betragen. Diese Menge kann man mit oder ohne Vordosis verabreichen. Häufig wird auch die Dosis für bestimmte thrombotische Bedingungen, wie z. B. der tiefen Venenthrombose und dem akuten Schlaganfall oder um einfach eine bereits wieder durchströmte Koronarartherie offenzuhalten, geringer sein. In diesen Situationen wird eine wirksame Menge im allgemeinen von 7000 bis 36000 IU/kg Körpergewicht des Patienten betragen.

Die folgenden Beispiele sind zur Erläuterung der vorliegenden Ί1 Erfindung gedacht, sollten jedoch nicht als deren Begrenzung angesehen werden.

Beispiel 1

Ein geklärter t-PA überstand, erhalten aus einer kultivierten, transformierten CHO-ZeIlinie, die unter Verwendung des in Molecular

and Cellular Biology, 1985, 5(7), 1750-1759 beschriebenen Verfahrens erhalten wurde, wurde chromatographisch gereinigt und das t-PA als eine wäßrige Lösung, die 0,17 m Natriumeitrat und 0,01 % (w/v) Tweerr^80 mit einem pH-Wert von 5,5 enthält, gesammelt. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 3,0 mit Salzsäure eingestellt und die erhaltene Lösung wurde durch Ultrafiltration unter Verwendung einer H-10 Einheit (Amicon Ltd., Upper Hill, Stonehouse, Gloucestershire, England) konzentriert. Die konzentrierte wäßrige Lösung wurde weiter gereinigt durch Aufbringung auf eine Gelfiltrationssäule (Sephade >PG-150; Pharmacia Biotechnology, Uppsala, Schweden) und mit 0,85 %iger physiologischer Kochsalzlösung, enthaltend 0,01 % (w/v) Tweerr^eo mit einem pH-Wert von 3,0_;eluiert. Eine hoch gereinigte wäßrige t-PA-Lösung wurde auf diese Weise erhalten, die ein weiteres mal unter Verwendung einer wegwerfbaren künstlichen Nieren konzentriert wurde. Das t-PA wurde aus der Lösung durch Erhöhung des pH-Wertes auf 5,5 mit Natriumhydroxid und Stehenlassen der Suspension bei 4 ⁰C für 2 Stunden ausgefällt. Das t-PA wurde durch Zentrifugation bei 4000 χ g für 30 Minuten bei 4 ⁰C gesammelt. Das t-PA Pellet wurde in einer wäßrigen Natriumchloridlösung (0,85 % (w/v)), die 0,01 % (w/v) Tweeir^ 80 enthielt und deren pH-Wert auf 3,0 mit Salzsäure eingestellt worden war, gelöst. Das Volumen der verwendeten physiologischen Salzlösung war jenes, das erforderlich war, um eine Konzentration des t-PA zwischen 7500000 IU/ml und 10000000 IU/ml zu ergeben. Diese t-PA Lösung wurde weiter mit einer NaCl-Lösung (0,85 % (w/v)) enthaltend 0,01 % (w/v) Tween® 80 und einem pH-Wert, eingestellt auf 3,0 mit Salzsäure sowie mit einer genügenden Menge einer Lösung von 10 % (w/v) Mannitol in der selben sauren Salzlösung verdünnt, um eine Endkonzentration von 5000000 IU/ml t-PA und 25 mg/ml Mannitol zu ergeben. Die erhaltene Lösung wurde filtersterilisiert und in Volumina von 1 ml in Glasfläschchen verteilt, die bei -35 ⁰C eingefroeren wurden. Ein Vakuum von 0,05 Torr wurde angelegt. Nach etwa 24 Stunden wurde die Temperatur schrittweise auf +5 ⁰C erhöht und diese Temperatur für 16 Stunden gehalten. Anschließend wurde die Temperatur auf 25 ⁰C und das Vakuum auf 0,02 Torr für weitere 24 Stunden erhöht und die Fläschchen

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anschließend unter einem partiellen Vakuum von 600 Torr in trockenem Stickstoff hermetisch verschlossen.

Beispiel 2

Die thrombolytische Wirksamkeit einer parenteralen Lösung, die man aus der lyophylisierten Formulierung des t-PA gemäß Beispiel 1 erhielt, wurde in einem in vivo-Modell anhand einer jugularen Venenthrombose untersucht.

(a) Methode

Die experimentelle Methode folgt im wesentlichen der, die erstmalig von Collen et al (J. Clin. Invest., 1983, 71, 368-376) beschrieben wurde.

Die lyophilisierte Formulierung gemäß Beispiel 1 wurde schnell und vollständig in steriler isotonischerKochsalzlösung mit einem pH-Wert 3,0, enthaltend 0,01 % TweerV^80_; gelöst. Eine parenterale Lösung von t-PA wurde auf diese Weise hergestellt, die für eine zwei-Stunden-Infusion von 500000 IU/kg ausreicht. Die Infusion erfolgte durch eine Kanüle in die rechte Femoralvene. Vier weiße Neuseelandkaninchen wurden in dieser Studie benutzt. Nach der Infusion wurde der Grad der Thrombolyse bestimmt.

(b) Ergebnisse:

Der Prozentwert der Thrombolyse betrug 28,9 +4,1, wodurch die thrombolytische Wirksamkeit der parenteralen Lösung, die man aus der lyophilisierten Formulierung des Beispiels 1 erhält, gezeigt wurde. Zusätzlich wurden keine nachteiligen Reaktionen mit dieser Lösung beobachtet.

Claims

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1. Verfahren zur Herstellung einer lyophilisierten pharmazeutischen Formulierung von t-PA, wobei das Verfahren das Vakuumtrocknen einer gefrorenen wäßrigen t-PA Lösung, mit einem pH-Wert 2 bis 5 enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das t-PA entweder in der ein-Ketten-Form oder in der zwei-Ketten-Form vorliegt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das t-PA die in Figur 1 gezeigte Aminosäuresequenz besitzt oder die gleiche Aminosäuresequenz besitzt, wobei jedoch die Aminosäure in der Position 245 vom Serin-N-terminalen Ende Valin anstelle von Methionin ist, oder beide Sequenzen enthalten ggf. keine der ersten drei Aminosäuren oder beide Sequenzen enthalten ggf. ein zusätzliches Polypeptid mit der Sequenz Gly-Ala-Arg, wobei diese Sequenz dem N-terminalen Ende als Präsequenz vorgeschaltet ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, worin das t-PA aus einer kultivierten, transformierten oder durch Transfektion erhaltenen ZeIlinie gewonnen wird, die man unter Verwendung der rekombinanten DNA-Technologie hergestellt hat.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, worin die Konzentration des t-PA in der wäßrigen Lösung größer als 100000 IU/ml ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin die t-PA-Konzentration größer als 500000 IU/ml ist.

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7. Verfahren nach Anspruch 6, worin dia t-PA-Konzentration größer als 1000000 IU/ml ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin die t-PA-Konzentration etwa 5000000 IU/ml ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8_S worin der pH-Wert der wäßrigen Lösung 2 bis 4,5 beträgt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin der pH-Wert 2,5 bis 4,0 beträgt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin der pH-Wert 2,8 bis 3,5 beträgt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin der pH-Wert etwa 3,0 beträgt.

13. Verfahren nach Anspruch 1 bis 12, worin das Medium für die wäßrige Lösung gänzlich oder im wesentlichen wäßrig ist.

14. Verfahren nach Anspruch 1 bis 13, worin das Medium für die wäßrige Lösung ein physiologisch verträgliches Mittel, das die Lösung im wesentlichen isotonisch mit dem normalen Blutserum macht, enthält.

15. Verfahren nach Anspruch 14, worin das physiologisch verträgliche Mittel Natriumchlorid ist.

16. Verfahren nach Anspruch 14, worin das physiologisch verträgliche Mittel Dextrose ist.

17. Verfahren nach Anspruch 1 bis 16, worin die wäßrige Lösung ein oberflächenaktives Mittel enthält.

18. Verfahren nach Anspruch 1 bis 17, worin die wäßrige Lösung im wesentlichen ungepuffert ist.

19. Verfahren nach Anspruch 1 bis 18, worin die wäßrige Lösung im wesentlichen frei von Lysin oder Ornithin oder einem Salz davon ist.

20. Verfahren nach Anspruch 1 bis 19, worin die wäßrige Lösung sterilisiert ist.

21. Lyophilisierte pharmazeutische Formulierung, erhalten durch ein Verfahren nach Anspruch 1 bis 20.

22. Lyophilisierte pharmazeutische Formulierung von t-PA, die bei Auflösung in Wasser in der Lage ist, eine t-PA Konzentration von größer als 100000 IU/ml zu ergeben.

23. Lyophilisierte pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 22, worin die Konzentration größer als 500000 IU/ml ist.

24. Lyophilisierte pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 23, worin die Konzentration größer als 1000000 IU/ml ist.

25. Hermetisch verschlossener Behälter einer lyophilisierten pharmazeutischen Formulierung, wie in den Ansprüchen 21 bis 24 definiert.

26. Physiologisch verträgliches Salz von t-PA.

27. Physiologisch verträgliches Säureadditionssalz von t-PA.

28. Hydrochloridsalz von t-PA.

29. Verfahren zur Behandlung einer thrombotisehen Krankheit in einem Säugetier, wobei das Verfahren die Verabreichung einer parenteralen Lösung von t-PA, erhalten aus einer lyophilisierten pharmazeutischen Formulierung, wie in den Ansprüchen 21 bis 24, definiert, enthält.

30. Lyophilisierte pharmazeutische Formulierung, wie in den Ansprüchen 21 bis 24 definiert, zur Verwendung in der Human- oder Veterinärmedizin, insbesondere zur Verwendung in der Behandlung einer thrombotisehen Krankheit.