DE2630757A1

DE2630757A1 - L-pyroglutamyl-l-prolinamid, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung

Info

Publication number: DE2630757A1
Application number: DE19762630757
Authority: DE
Inventors: Albert Dr Loffet
Original assignee: UCB SA
Current assignee: UCB SA
Priority date: 1975-07-08
Filing date: 1976-07-08
Publication date: 1977-01-27
Also published as: NO762352L; ES449624A1; AU1565576A; JPS6131118B2; FI761970A; DK305876A; SU624572A3; US4077951A; CA1058186A; PT65324B; NL7607446A; FR2316944B1; AT351689B; SE7607717L; AU500396B2; GR60849B; RO69885A; IL49991A0; FR2316944A1; CS194241B2

Description

DR. A. VAN DERWERTH DR. FRANZ LEDERER REINER F. MEYER

DlPL-ING. (1934-1974) DIPL.-CHEM. DIPL.-ING.

8000 MÜNCHEN 80 LUCILE-G RAH N-STRASSE 22

TELEFON: (089) 472947 TELEX: 524624 LEDER D TELEGR.: LEDERERPATENT

8. Juli 1976 16.07.06

UCB, S.A.

4·, Chaussee de Charleroi, Saint-Gilles-lez-Bruxelles, Belgien

L-Fyroglutamyl-L— prolinamid, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung

Die Erfindung "betrifft eine neue Verbindung, nätnlich L-Pyroglutamyl-L-prolinamid, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als Arzneimittel bei der Behandlung des Alterns im Hinblick auf eine Verbesserung von Altersausfällen.

Gemäß der Erfindung stellt man das L-Pyroglutamyl-L-prolinamid in an sich bekannter Weise durch Reaktion von L-Pyroglutaminsäure mit L-Prolinamid in Anwesenheit eines Kupplungsmittels in einem organischen Medium nach folgender Reaktionsgleichung her:

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a) Kupplungsmittel

Die beiden zur Herstellung von L-Fyroglutamyl-L-prolinamid verwendeten Ausgangsmaterialien sind bekannt und im Handel erhältlich. So wird beispielsweise !!-Pyroglutaminsäure von der US-Firma Aldrich Chemical Co., Inc. vertrieben, während L-Frolinamid von der US-Firma Cyclo Chemical erhältlich ist. Die letztgenannte Substanz kann ebenfalls durch Ammonolyse des entsprechenden Äthylesters nach der Methode von R.W.Chambers und F.H. Carpenter, J. Am. Chem. Soc., £Z (1955), S.1522-26 hergestellt werden.

Als Kupplungsmittel für diese Reaktion kann man klassische Kupplungsmittel verwenden, insbesondere Dicyclohexylcarbodiimid und 1-Äthoxy-carbonyl-2-äthoxy-1,2-dihydrochinolein. Hinsichtlich anderer Verbindungen, die zu diesem Zweck anwendbar sind, sei auf die in der Übersichtsarbeit von X.S. Klausner und M. Bodansky, Synthesis (1972), S.4-53-4-63 genannten Verbindungen verwiesen.

Als Reaktionsmedium für das erfindungsgemäße Verfahren kann man organische Lösungsmittel wie Tetrahydrofuran, Dimethylformamid, Dioxan, Äthylacetat, Dichlormethan usw. verwenden.

Die Herstellung von L-Pyroglutamyl-L-prolinamid kann entsprechend der Arbeitsweise des folgenden Beispiels durchgeführt werden:

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_ 3 —

Beispiel

In einen lO-l-Dreihalskolben, der mit einem Rührer und einem Schütttrichter ausgerüstet ist, werden 283,3 g = 1,2 Hol L-Pyroglutaminsäure und 193>·Ί B = 1»7 WoI P-Prolinamid eingeführt.

Man gi"bt 4 1 Dimethylformamid hinzu, kühlt die so erhaltene Lösung auf 0 ⁰C und gibt immer unter Rühren im Verlauf von einer Stunde 488 g = 2,37 Mol Dicyclohexylcarbodiimid, aufgelöst in 2 1 Bichlormethan, hinzu. Die Temperatur wird zwischen 0 und 5 C während der Zugabe gehalten;. Das Rühren wird für 48 Stunden fortgeführt, wobei das Gemisch nach und nach auf Umgebungstemperatur kommen gelassen wird. Man gibt dann 3 1 Wasser hinzu, um den Dicyclohexy !harnstoff (gebildet aus dem Dicyclohexylcarbodiimid) auszufällen. Der Niederschlag wird abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Das Filtrat wird zur Trockene eingedampft und der Rückstand wird in 1 1 V/asser aufgenommen. Es bildet sich ein Niederschlag, dieser wird durch Filtrieren entfernt. Nach dem Abdampfen des Wassers wird das als Rückstand erhaltene Öl in 1 1 warmem Acetonitril aufgelöst, und die auf diese Weise erhaltene, klare Flüssigkeit wird zur Kristallisation in einen Eisschrank eingestellt. Die auf diese Weise erhaltenen Kristalle werden filtriert, mit 100 ml Acetonitril gewaschen und getrocknet.

Auf diese Weise erhält man eine erste Menge von 262,6 g L-Pyroglutamyl-L-prolinamid mit einer Ausbeute von 63,5 %·> bezogen auf das Ausgangsprolinamid. Man kann auch noch die erfindungsgemäße Verbindung aus den Mutterlaugen gewinnen, wodurch die Ausbeute bis auf 70 % der Theorie gesteigert werden kann.

Das L-Pyroglutamyl-L-prolinamid kristallisiert in Form des Monohydrates.

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P. = 98 ⁰C α²²= -100°

Elementaranalyse:

berechnet (%): C = 49,4; H = 7,0; Ή = 17,28; HpO = 7,40 gefunden (%): C = 50,0; E = 7,1; Ii = 17,10; H₂O = 6,74

Das Spektrum der kernmagnetischen Resonanz (in einer Ferkins-Elmer-Apparatur) bei 60 MHz mit DoO/TMS ergibt folgende Werte:

Il

CO

im \

4 CH₂ CH- 5	— C — It 0	— IT α ^CH	2 ^CH2
υρηα	Multiplizität	integr.	Zuordnung
2,1	M	4H	2H⁴
2,5	H	4H	2H^ß
3,7	M	2H	2H*
4,5	M	2H	H^

Die Protonen der Amidgruppe von L-Pyroglutaminsäure und von -Frolinamid = 4,65 ppm.

L-Frolinamid tauschen mit D^O aus und erscheinen daher bei

Die Resonanzen wurden durch Vergleich mit den Resonanzspektren der Fyroglutamyl- und Prolinamidreste im Molekül von TRH (Tyrosin freisetzendem Hormon) zugeordnet, siehe S. Fermand^iian et al-, FEBS Letters, 28 (1972), S. 1^6 und J-C. Boilot et al-, C.S.Acad.Sci. Paris, Serie C 276 (1973), S- 217·

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Die Analyse des sauren Hydrolysates des Moleküls zeigt die genaue Stöchiometrie für die verschiedenen Bestandteile, nämlich Glu/Fro/HH,: 1/1/1.

Im folgenden werden die pharmakologischen Eigenschaften näher erläutert:

Es ist bekannt, daß als Folge der Alterung des Organismus beim Greis, der offensichtlich an keiner gut definierten Krankheit leidet, ein mehr oder weniger rasches, fortschreitendes Auftreten einer Reihe von Zellenrückbildungen vorkommt, welche sich in Störungen des Allgemeinenbefindens zeigen.

Diese Veränderungen sind häufig und sie treten hauptsächlich im Bereich der folgenden drei Endokrinachsen auf: der Insulinachse, der Thyroidalachse und der gonalen Achse.

Es ist beispielsweise wohlbekannt, daß das Insulinansprechen auf eine durch Nahrungszufuhr bedingte oder hervorgerufene Hyperglykämie beim alten Menschen unterschiedlich und stark vermindert ist, im Vergleich zu den Erscheinungen beim gesunden Erwachsenen (Prädiabetes). Dasselbe gilt für die Fähigkeit der Fixierung vc-n Jod durch die Schilddrüse, siehe Handbook of Endocrinology, Ed. R. D. Dillon, Lea und Febiger, Philadelphia (1973), USA.

Es gibt tatsächlich kein Therapeutikum, das die wirksame Bekämpfung dieser Arten von Veränderungen ermöglichen würde.

überraschenderweise wurde nun gefunden, daß die erfindungsgemäße, neue Verbindung, nämlich L.Pyroglutamyl-L-prolinamid, geeignet ist, die metabolischen oder endokrinologischen, mit dem Altern verbundenen Schwierigkeiten zu beheben. Die erfindungsgemäße Verbindung, stellt insbesondere die Fähigkeit zur Adaption des Organismus und sein Wiederansprechen auf bestimmte Stimuli , wie beispielsweise eine hervorgerufene Hyperglykämie, wieder her, wobei sie selbst geaoch kein Mittel ist, welches öie Freisetzung von Insulin stimuliert.

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Fharmakologisches Tests

gegenüber Glukose
Dillon et al., loc. cit.

Der Test auf Toleranz gegenüber Glukose besteht darin, bei Ratten auf oralem Weg eine Dosis von 1 g/kg an Glukose in Lösung in 1 ml Wasser ζυ applizieren und anschließend im Ilasma die Menge an freigesetztem Insulin (IHI) zu den Zeitpunkten 0, 15, 30, 60 und 120 Minuten zu messen. Das normale Ansprechen auf diesen Test ist eine Dreieckkurve, bei welcher das Maximum an freigesetztem Insulin bei ungefähr 15 Minuten liegt.

Zehn Ratten mit einem Alter von 12 Monaten wurden während einer Woche mit physiologischem Serum behandelt. Am letzten Tag erhielten sie eine Überdosis an Glukose entsprechend dem beschriebenen Test. Das Insulinansprechen war nur schwach.

Die gleichen Tiere wurden anschließend auf oralem Weg während fünf Tagen mit L-Pyroglutamyl-L-prolinamid mit einer Dosis von 40 mg/kg in Lösung in 1 ml Wasser behandelt. Der Toleranztest gegenüber Glukose wurde anschließend wie zuvor durchgeführt.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt.

	vor der Behandlung	Tabelle	I	nach der Behandlung	Extrem werte+	9
	11		10,1 '	9,1-10,
gemessen zum Zeitpunkt(min)	17	Insulinämie (iiU/ml)	34	33,8-35
0	10,3	Extrem werte+	23	20,5-24	5
15	9	10,5-12	5	3,4- 6,	6
30	4,2	15,5-19		6-8,
60	9,5-11
120	8,2-10.
	2,8- 5-




,1
.7

^11Og 0 9 8 §l⁸nff 0 ¹⁵'⁴¹ '² ^ 3⁶9,5-1697,25

g 0 9 8

+ = Extremwerte:

Diese Werte stellen die an ein und derselben Probe gemessenen Extremwerte dar (Variationen als Folge der angewandten Meßtechnik). Sie stellen nicht die Varianz der Tiere selbst dar, da das analysierte Serum aus den bei zehn Tieren gesammelten Seren stammte.

Als Beispiel wurde ein Toleranztest gegenüber Glukose an einer Gruppe von nicht-behandelten, jungen Tieren durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IT zusammengestellt:

	O	Tabelle II	Extremwerte	5
	15	/uU/ml	7,5 -	5
Zeit	30	8,5	20
t	160	21	29 -
t	31
t	15	- 9,
t		- 22,
	- 33
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Es sei darauf hingewiesen, daß der Insulingrundwert vor der Überbelastung mit Glukose (Zeit 0) durch die Behandlung nicht modifiziert wird. Dies beweist, daß das Produkt selbst kein freisetzendes Mittel für Insulin ist.

Der gleiche Test wurde ebenfalls an Kunden durchgeführt. Bei einer Dosis von 5 mg/kg wurde der intensivste Effekt von L-Pyroglutamyl-L-prolinamid bei den Tieren beobachtet, welche die höchsten Grundglykämien und Insulinämien aufwiesen. Die Tiere, welche niedrige Insulinwerte jedoch eine normale Glykämie zeigten, sprechen praktisch auf diese Behandlung nicht an. Bei geringeren Dosen (1 mg/kg) hat die Behandlung praktisch keinen Einfluß auf den Wert von Glukose und Insulin, mit Ausnahme des Falles von einer behandelten Hündin, die trächtig war und die erhöhte Insulinwerte und eine normale Glykämie zeigte. Als

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Folge der Behandlung vmrden die Glykäiriie und Insulinämie auf Werte rückgeführt, Vielehe exakt mit denjenigen der anderen Tiere vergleichbar waren.

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Y^on Glukose-C

Im Verlauf des Alterns findet man eine allgemeine Verlangsamung des Zellmetabolismus, und zwar sowohl hinsichtlich der Energie produzierenden Systeme (Glykolyse, mitochondriale Oxidation, usw.) wie auch der Systeme der makromolekularen Biosynthesen (Synthese von EKi, Proteinen, usw.).

Das Ziel dieses Tests war es, den Einbau von Glukose- C in makromolekulare Fraktionen von gealterten Tieren zu verfolgen. Der Test wurde an zehn weiblichen Hausen (Stamm NiIRI) mit einem Alter von 20 Monaten durchgeführt, welche im Mittel 38 g - 5 g wogen.

Nach einer Behandlung von 10 Tagen mit 0,1 mM/kg an L-Pyroglut-

14 amyl-L-prolinamid und der Applikation einer Dosis von Glukose- C wurden die Tiere 5 Stunden später getötet, um die Menge an in unterschiedlichen Organen (Leber, Herz, Hirn) eingebauter

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Glukose- C zu bestimmen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, daß der Einbau des radioaktiven Vorläufers in unterschiedlichen Ausmaßen in den organischen und proteinartigen Extrakten wie auch in an EKA und DNA angereicherten Fraktionen stimuliert wird. Das Organ, in welchem die Effekte am ausgeprägtesten zu sein schienen, war das Hirn unter den angewandten, experimentellen Bedingungen,(Messung 5 Stunden nach der Applikation von Glukose- ¹^C).

3· Verhalten der Tiere

Im Verlauf der an den Mäusen durchgeführten Untersuchungen wurde festgestellt, daß die mit L-Fyroglutamyl-L-prolinamid behandelten,

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alten Tiere eine größere Lebhaftigkeit als die Ecntrolltiere aufwiesen. Diese Erhöhung der Lebhaftigkeit kann in Zahlenwerten ausgedrückt werden, wozu eine praktisch gleiche Anzahl an behandelten Mäusen und Eontrollmäusen im Käfig gefangen wird und die Reihenfolge aufgezeichnet wird, in welcher die Tiere gefangen werden, wobei die statistische Analyse nach dem Mittelwerttest durchgeführt wird, siehe V/.J. Conover, Practical non parametric Statistics, Ed. Wiley & Sons (197Oi S. 167.

Es wurde festgestellt, daß der Unterschied der Lebhaftigkeit zwischen den behandelten Tieren und den Vergleichstieren sich nur zu dem Zeitpunkt zeigte, wo sie gefangen wurden, während ihr Verhalten im !Ruhezustand gleich war.

Pharmazeutische Präparationen oder Arzneimittel, welche die erfindungsgemäße Verbindung enthalten, können auf intravenösem, intraperitonealem, intramuskulärem, subkutanem Weg oder per os appliziert werden, wobei die !Dosismengenzwischen 1 und 200 mg/kg pro Tag variieren.

Als Beispiel für eine pharmazeutische Präparation gemäß der Erfindung sei die folgende genannt:

für eine Kapsel Nr. 1: 25 mg L-Pyroglutamyl-L-prolinamid

400 mg Lactose 10 mg Magnesiumεtearat.

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Claims

- ίο -

Patentansprüche

,1i l-Pyroglutamyl-L-prolinamid der folgenden Formel
2. Verfahren zur Herstellung von L-Pyroglutamyl-L-prolinamid, dadurch gekennzeichnet, daß man L-Pyroglutaminsäure mit L-Frolinam'id in Anwesenheit eines Kupplungsmittels in einem organischen Medium umsetzt.
3- Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kupplungsmittel Dicyclohexylcarbodiimid oder 1-Äthoxycarbonyl-2-äthoxy-1,2-dihydrochinolein verwendet.
4·. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Medium Tetrahydrofuran, Dimethylformamid, Dioxan, Äthylacetat oder Dichlormethan verwendet.
5. Feste oder flüssige Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß sie L-Pyroglutamyl-L-prolinamid und gegebenenfalls einen üblichen, pharmazeutischen Trägerstoff oder Verdünnungsstoff enthalten.

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