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ES2842212T3 - Receptores de antígenos quiméricos monocatenarios específicos anti-CLL1 (scCAR) para inmunoterapia contra el cáncer - Google Patents

Receptores de antígenos quiméricos monocatenarios específicos anti-CLL1 (scCAR) para inmunoterapia contra el cáncer Download PDF

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ES2842212T3
ES2842212T3 ES16703450T ES16703450T ES2842212T3 ES 2842212 T3 ES2842212 T3 ES 2842212T3 ES 16703450 T ES16703450 T ES 16703450T ES 16703450 T ES16703450 T ES 16703450T ES 2842212 T3 ES2842212 T3 ES 2842212T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
seq
cll1
cells
domain
cell
Prior art date
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Active
Application number
ES16703450T
Other languages
English (en)
Inventor
Julianne Smith
Julien Valton
Alexandre Juillerat
Philippe Duchateau
Barbra Johnson Sasu
Arvind Rajpal
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cellectis SA
Original Assignee
Cellectis SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cellectis SA filed Critical Cellectis SA
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Abstract

Un receptor de antígeno quimérico específico de CLL1 (CAR anti-CLL1), que comprende al menos: - un dominio de unión a ligando extracelular anti-CLL1, que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv), que comprende los fragmentos variables pesado (VH) y ligero (VL) de los anticuerpos monoclonales anti-CLL1 M26 o M2, unidos por un enlazador flexible, en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, - un dominio transmembrana - un dominio de señalización citoplasmático, y - un dominio coestimulador.

Description

DESCRIPCIÓN
Receptores de antígenos quiméricos monocatenarios específicos anti-CLL1 (scCAR) para inmunoterapia contra el cáncer
Campo de la invención
Se ha identificado que la molécula 1 similar a lectina de tipo C (CLL1) se sobreexpresa con frecuencia en la mayoría de las células madre (LSC) de leucemia mieloide aguda (AML), en comparación con las células madre hematopoyéticas normales u otros tipos de células. La presente invención se refiere a receptores de antígenos quiméricos (CAR anti-CLL1), que son proteínas quiméricas recombinantes, capaces de redirigir la especificidad y la reactividad de las células inmunes hacia el antígeno de membrana seleccionado CLL1. Estos CAR anti-CLL1 comprenden una unión a ligando extracelular, que comprende un scFV, que comprende el fragmento variable pesado (VH) y ligero (VL) del anticuerpo monoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho v H comprende las CDR de SeQ. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, un dominio transmembrana, un dominio de señalización citoplasmático, y un dominio coestimulador. Las células inmunes genomanipuladas dotadas de dichos CAR confieren inmunidad adoptiva contra células positivas para CLL1 como parte de diversas terapias celulares para tratar el cáncer, en particular los cánceres hematológicos, con mayor eficacia.
Antecedentes de la invención
La inmunoterapia adoptiva, que implica la transferencia de linfocitos T específicos de antígeno generados ex vivo, es una estrategia prometedora para tratar infecciones víricas y cáncer. Los linfocitos T usados para inmunoterapia adoptiva pueden generarse mediante expansión de linfocitos T específicos de antígeno o redirección de linfocitos T mediante genomanipulación (Park, Rosenberg et al. 2011). La transferencia de linfocitos T específicos de antígeno vírico es un procedimiento bien establecido usado para el tratamiento de infecciones víricas asociadas con trasplante y tumores malignos relacionados con virus poco habituales. De forma similar, se ha mostrado que el aislamiento y transferencia de linfocitos T específicos de tumor tienen éxito en el tratamiento del melanoma.
Se han generado con éxito nuevas especificidades en los linfocitos T mediante la transferencia genética de receptores de linfocitos T transgénicos o receptores de antígenos quiméricos (scCAR) (Jena, Dotti et al. 2010). Los scCAR son receptores sintéticos que consisten en un resto de direccionamiento que está asociado con uno o más dominios de señalización en una única molécula de fusión. En general, el resto de unión de un scCAR consiste en un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo monocatenario (scFv), que comprende los fragmentos ligeros y variables de un anticuerpo monoclonal unidos por un enlazador flexible. También se han usado con éxito restos de unión basados en dominios de receptores o ligandos. Los dominios de señalización para scCAR de primera generación proceden de la región citoplasmática del CD3zeta o las cadenas gamma de receptores Fc. Se ha mostrado que los scCAR de primera generación redirigen con éxito la citotoxicidad de linfocitos T, sin embargo, no lograron proporcionar una expansión prolongada ni actividad antitumoral in vivo. Se han añadido dominios de señalización de moléculas coestimuladoras que incluyen CD28, OX-40 (CD134) y 4-1BB (CD137) en solitario (segunda generación) o en combinación (tercera generación) para mejorar la supervivencia y aumentar la proliferación de linfocitos T modificados con scCAR. Los scCAR han permitido con éxito que los linfocitos T se redirijan contra los antígenos expresados en la superficie de las células tumorales de diversas neoplasias, incluidos los linfomas y los tumores sólidos (Jena, Dotti et al. 2010).
Por otra parte, los tratamientos de inducción para la leucemia mieloide aguda (AML) se han mantenido prácticamente sin cambios durante casi 50 años y la AML sigue siendo una enfermedad de mal pronóstico. La AML es una enfermedad caracterizada por la rápida proliferación de células mieloides inmaduras en la médula ósea dando como resultado una hematopoyesis disfuncional. Aunque la quimioterapia de inducción estándar puede inducir remisiones completas, muchos pacientes eventualmente tienen recidivas y sucumben a la enfermedad, lo que exige el desarrollo de nuevas terapias para la AML. Los avances recientes en la inmunofenotipificación de las células de la AML han revelado varios antígenos de superficie celular asociados con la AML que pueden actuar como dianas para terapias futuras.
Entre otros, CLL1 (molécula 1 similar a lectina de tipo C) parece ser una diana de antígeno tumoral interesante, ya que se expresa mediante blastos leucémicos en el momento del diagnóstico del 85-92 % de los pacientes con a Ml analizados. Es un miembro de 75 kDa de la familia de moléculas de receptores similares a lectina de tipo C del grupo V. Las moléculas del grupo V tienen un dominio similar a lectina que se une a ligandos diferentes de azúcar. CLL1 es una glucoproteína transmembrana de 265 aminoácidos de tipo II (base de datos Uniprot: Q5QGZ9 para la proteína humana codificada por el gen n.° 160364 en la base de datos "Entrez Gene") que contiene un dominio extracelular de 200 AA. CLL1 también se conoce en la bibliografía y las bases de datos como MICL, CLEC12 y KLRL1.
Bakker et al., 2004 han demostrado que el antígeno CLL1 está asociado con células madre de AML. Al igual que algunos otros antígenos (tal como CD33), CLL1 es una proteína de superficie celular que se expresa específicamente en la mayoría de las células madre linfoides neoplásicas (AML LSC), mientras que no se expresa en HSC normales (Van Rhenen et al., 2007). Por otra parte, se reveló que CLL1 es un marcador de diagnóstico en la AML (Larsen et al., 2012). Los anticuerpos anti-CLL-1 permiten tanto la detección de células madre específicas de AML y posiblemente el direccionamiento de antígenos como distinguir las células neoplásicas de las células madre normales tanto en el momento del diagnóstico como en la remisión (van Rhenen et al., 2007). Sin embargo, hasta la fecha no se ha informado que ninguno de estos anticuerpos se haya probado en ensayos clínicos como anticuerpos terapéuticos.
Se han utilizado a menudo anticuerpos monoclonales para tratar linfomas, pero su uso en leucemias ha sido más limitado. Gemtuzumab ozogamicina (Mylotarg®) es un anticuerpo monoclonal con un veneno celular adherido. Anteriormente aprobado para tratar la AML en pacientes mayores, se retiró del mercado después de que los estudios encontraran cierta toxicidad asociada con el producto (comunicado de prensa del 10 de diciembre de 2010 en PMLIVE "ASH: Pfizer eyes re-launch of Mylotarg"). Otros anticuerpos terapéuticos monoclonales han mostrado efectos adversos durante la última década (Klastersky, J. (2006) "Adverse effects of the humanized antibodies used as cancer therapeutics" Current Opinion in Oncology. 18(4):316-320)
En la publicación de Zhang et al. (2011), se han descrito nanopartículas micelares decoradas covalentemente con péptidos dirigidos a CLL1 para la administración de fármacos dirigida (daunorrubicina); estas "nanomicelas dirigidas" transportan la carga de fármaco al interior de las células que expresan CLL1 y a las LSC aisladas de especímenes clínicos in vitro. Se demostró que las nanomicelas dirigidas a CLL1 tenían el potencial de utilizarse para la administración de fármacos dirigida a las células madre de la leucemia. Sin embargo, no se pudieron atribuir efectos terapéuticos al péptido dirigido a CCL-1 per se.
En vista de lo anterior, los inventores han seguido un nuevo enfoque para dirigirse a CCL1 usando células inmunes dotadas de receptores de antígenos quiméricos específicos basados en anticuerpos monoclonales anti-CLL1, que redirigen la especificidad de las células inmunes hacia células positivas para CLL1.
Las células inmunes genomanipuladas que obtuvieron mediante este enfoque han demostrado su eficacia para eliminar las células neoplásicas positivas para CLL1. En particular, han parecido ser particularmente útiles en el contexto de la producción de células inmunes genomanipuladas negativas para TCR alogénicas, lo que permite una reducción de los efectos secundarios, tal como GvHD.
Por lo tanto, la presente invención abre el camino al tratamiento de pacientes afectados con una afección caracterizada por una sobreabundancia de células que expresan CLL1 usando inmunoterapia adoptiva. Aún más, la presente invención proporciona células inmunes alogénicas genomanipuladas que pueden usarse como productos terapéuticos alogénicos "disponibles libremente". Como una ventaja adicional de la invención, las células genomanipuladas positivas para CAR pueden hacerse compatibles (es decir, resistentes) con quimioterapia o tratamientos de inmunodepleción, permitiendo de este modo efectos sinérgicos entre la quimioterapia y la inmunoterapia.
Sumario de la invención
Los inventores han generado un scCAR monocatenario específico de CLL1 que tiene un diseño diferente y que comprende diferentes scFV derivados de anticuerpos específicos anti-CLL1.
En particular, los inventores han desarrollado CAR monocatenario (scCAR) específico anti-CLL1 que comprende cadenas VL y VL derivadas de anticuerpos M26 y M2, con diferentes arquitecturas e identificaron construcciones de scCAR altamente específicas y muy selectivas que se unen a células que expresan CLL1 y destruyen selectivamente las células cancerosas que expresan CLL1.
Después de la activación no específica in vitro (por ejemplo, con perlas recubiertas con anti CD3/CD28 e IL2 recombinante), los linfocitos T primarios de los donantes se han transformado con polinucleótidos que expresan estos scCAR utilizando transducción viral. En determinados casos, los linfocitos T se genomanipularon adicionalmente para crear linfocitos T menos o no alorreactivos, más especialmente mediante la interrupción de un componente de TCR (receptores de linfocitos T ap) para prevenir la reacción de injerto contra huésped.
Los linfocitos T se genomanipularon además para crear linfocitos T resistentes a fármacos contra el cáncer, para usarse en combinación con dichos fármacos contra el cáncer convencionales.
Los linfocitos T genomanipulados resultantes mostraron reactividad in vitro contra células positivas para CLL1 en diversos grados, lo que demuestra que los scCAR de la presente invención contribuyen a la activación dependiente de antígeno, y también a la proliferación de los linfocitos T, haciéndolos útiles para la inmunoterapia.
Los linfocitos T genomanipulados resultantes mostraron reactividad in vivo contra células positivas para CLL1 y reducen significativamente el número de células cancerosas in vivo.
Los linfocitos T genomanipulados de la invención están diseñados para mostrar reactividad in vivo contra células positivas para CLL1, se pueden usar en concomitancia con fármacos contra el cáncer y se toleran bien. En una realización particular, los linfocitos T genomanipulados de la invención siguen siendo eficaces incluso después de varias administraciones, lo que hace que sean útiles para la inmunoterapia como primer tratamiento (inducción), como tratamiento de consolidación, como tratamiento en combinación con la quimioterapia contra el cáncer convencional. Los polipéptidos y secuencias de polinucleótidos que codifican los CAR de la presente invención se detallan en la presente memoria descriptiva.
Las células inmunes genomanipuladas de la presente invención son particularmente útiles para aplicaciones terapéuticas tales como tratamientos de la leucemia mieloide aguda (AML).
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Representación esquemática de una célula inmune genomanipulada de acuerdo con la invención. La célula inmune genomanipulada que se presenta en esta figura es un linfocito T transducido con un vector retroviral que codifica CLL1-scCAR. Este linfocito T se genomanipuló además para permitir un injerto mejor y más seguro en el paciente, que es opcional dentro del marco de la presente invención. El gen X puede ser, por ejemplo, un gen que expresa un componente de TCR (TCRalfa o TCRbeta), Y puede ser un gen involucrado en la sensibilidad de los linfocitos T a fármacos inmunosupresores como CD52 (con respecto a Campath) o HPRT (con respecto a 6-tioguanina).
Figura 2: Representación esquemática de las diferentes Arquitecturas de scCAR (V1 a V6) de la invención (scCAR anti-CLL1) con los componentes presentados en la Tabla 1 a continuación.
Figura 3A y figura 3B: Representación esquemática de CAR específicos de CLL1 ilustrativos de acuerdo con la invención que implican diferentes etiquetados de epítopo de mAb para el agotamiento de linfocitos T, especialmente mimótopo(s) CD20, que están diseñados para mitigar los posibles efectos secundarios asociados con la inyección de células positivas para CAR.
(A) Prototipo de CAR específico de CLL1 de acuerdo con la presente invención que no implica una secuencia de etiquetado de epítopo para clasificar o agotar células: V1 y v2 representan la cadena VH o VL respectivamente de un anticuerpo que se une a CLL1, TM: dominio transmembrana, L: enlazador, TM: Dominio transmembrana (preferentemente dominio transmembrana de CD8a), 4-1BB: dominio coestimulador intracelular, CD3 ITAM: dominio de activación.
(B) Arquitecturas de CAR específico de CLL1 de acuerdo con la invención que incluyen además al menos un epítopo insertado en el dominio de unión a ligando extracelular del CAR, en las que dicho epítopo se inserta entre las cadenas VH y VL; estando dicho epítopo bordeado por diferentes enlazadores;
(C) : Arquitecturas de CAR específico de CLL1 de acuerdo con la invención, donde se insertan dos epítopos en el dominio de unión a ligando extracelular del CAR, uno se inserta entre el extremo N-terminal del CAR y la cadena VH, estando dicho epítopo bordeado por al menos uno o dos enlazadores; el segundo epítopo se inserta entre las cadenas VH y VL, estando dicho 2° epítopo también delimitado por al menos uno o dos enlazadores. Las arquitecturas ilustradas en el presente documento difieren por los enlazadores usados que bordean el 2° epítopo.
(D) : Arquitecturas de CAR específico de CLL1 de acuerdo con la invención, donde se insertan dos epítopos en el dominio de unión a ligando extracelular del CAR, uno se inserta entre las cadenas VH y VL; el otro epítopo se inserta entre la cadena VL y la bisagra, estando cada uno de dichos epítopos también bordeado por al menos uno o dos enlazadores. Las arquitecturas ilustradas en el presente documento difieren por los enlazadores usados que bordean el 1er epítopo.
(E) : Arquitectura de CAR específico de CLL1 de acuerdo con la invención, donde se insertan dos epítopos en el dominio extracelular del CAR, uno se inserta entre el extremo N-terminal del CAR y la cadena VH, estando dicho epítopo bordeado por al menos uno o dos enlazadores; el segundo epítopo se inserta entre la cadena VL y la bisagra, estando dicho 2° epítopo también rodeado por dichos enlazadores.
(F) : Arquitecturas de CAR específico de CLL1 de acuerdo con la invención, donde se insertan tres epítopos en el dominio extracelular del CAR, uno se inserta entre el extremo N-terminal del CAR y la cadena VH, estando dicho epítopo bordeado por al menos uno o dos enlazadores; el segundo epítopo se inserta entre las cadenas VH y VL, estando dicho epítopo también bordeado por dichos enlazadores, y estando el tercer epítopo insertado entre la cadena VL y la bisagra. Estas dos arquitecturas se diferencian por los enlazadores utilizados que bordean el 2° epítopo.
(G) : Arquitecturas de CAR específico de CLL1 de acuerdo con la invención, donde se insertan al menos dos epítopos (preferentemente epítopos CD20) en el dominio de unión a ligando extracelular entre la bisagra y las cadenas Vh y VL anti-CLLÍ En la tercera arquitectura ilustrativa, se incluye un epítopo CD34 entre dos epítopos CD20. Se pueden considerar arquitecturas adicionales donde CD34 reemplaza cualquier otro epítopo CD20 anterior.
(H): Arquitecturas de CAR específico de CLL1 de acuerdo con la invención, donde se insertan al menos dos epítopos en el extremo del dominio de unión a ligando extracelular.
Tabla 1: Secuencia de los diferentes comonentes de scCAR con exceción de los scFv
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T l 2 ni r in ri l n H L ni- LL1 il r i r i DR
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(continuación)
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(continuación)
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(continuación)
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(continuación)
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Tabla 3: scCAR de estructura V-1
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Tabla 4: scCAR de estructura V-2
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continuación
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Tabla 5: scCAR de estructura V-3
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Tabla 6: scCAR de estructura V-4
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Tabla 7: scCAR de estructura V-5
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continuación
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Tabla 8: scCAR de estructura V-6
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Descripción detallada de la invención
Salvo que se defina específicamente en el presente documento, todos los términos técnicos y científicos utilizados tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto en la técnica en los campos de la terapia génica, bioquímica, genética y biología molecular.
Además, los materiales, métodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes, salvo que se indique lo contrario.
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otro modo, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de la experiencia en la técnica. Dichas técnicas se explican por completo en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, EE.UU.); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera edición, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. patente de EE.UU. N.° 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries y S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames y S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); la serie, Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson y M. Simon, eds.-in-chief, Academic Press, Inc., Nueva York), específicamente, vol.154 y 155 (Wu et al. eds.) y vol. 185, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller y M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer y Walker, eds., Academic Press, Londres, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds., 1986); y Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986). Receptores de antígenos quiméricos específicos monocatenarios de CLL1
La presente invención se refiere a un receptor de antígeno quimérico específico de CLL1 que comprende un dominio de unión a ligando extracelular dirigido específicamente contra una porción del antígeno CLL1, un dominio transmembrana y un dominio de transducción de señalización.
Por receptor de antígeno quimérico (CAR) se entienden moléculas que combinan un dominio de unión extracelular dirigido contra un componente presente en una célula diana, por ejemplo, una especificidad basada en anticuerpos para un antígeno deseado (por ejemplo, antígeno tumoral) con un componente receptor de células inmunes para generar una proteína quimérica que transducirá una señal de activación o inhibidora hacia la actividad inmunitaria celular.
La presente invención proporciona un receptor de antígeno quimérico específico de CLL1 (CAR anti-CLL1) que comprende al menos:
- un dominio de unión a ligando extracelular anti-CLL1 que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable pesado (Vh) y ligero ( Vl) del anticuerpo monoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, - un dominio transmembrana,
- un dominio de señalización citoplasmático, y
- un dominio coestimulador.
El dominio de transducción de señalización o "dominio de señalización citoplasmático" de un CAR de acuerdo con la presente invención es responsable de la señalización intracelular después de la unión del dominio de unión a ligando extracelular con la diana dando como resultado la activación o inhibición de la célula inmune y respuesta inmunitaria. En otras palabras, el dominio de transducción de señal es responsable de la activación o inactivación de al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmune, en donde se expresa el CAR. Por ejemplo, la función efectora de un linfocito T puede ser una actividad citolítica o actividad auxiliar que incluye la secreción de citocinas. Por lo tanto, la expresión "dominio de señalización citoplasmático" se refiere a la parte de una proteína que transduce la señal efectora a señal funcional y dirige la célula para realizar una función especializada.
El dominio de señalización citoplasmático, que es preferentemente de una proteína humana involucrada en la ruta o rutas de transducción de señal, determina si CAR anti-CLL1 es un CAR positivo (PCAR) o un CAR negativo (NCAR) dependiendo de la naturaleza de la señalización. Respectivamente, el CAR es un PCAR cuando el dominio de señalización, tal como CD3zeta del receptor TCR humano, tiene el efecto de estimular la actividad inmunitaria celular de la célula inmune cuando el dominio de unión a ligando extracelular se une a CLL1. Por el contrario, el CAR anti-CLL1 es un NCAR o CAR inhibidor (iCAR) cuando el dominio de señalización tiene el efecto de reducir la actividad inmunitaria celular, tal como los dominios de señalización de los receptores inmunoinhibidores humanos CTLA-4 y PD-1 (Federov et al., Sci Transl Med. 11 de diciembre de 2013; 5 (215): 215ra172). Los ejemplos preferidos de dominio de transducción de señal para su uso en un CAR anti-CLL1 pueden ser las secuencias citoplasmáticas del receptor y correceptores de linfocitos T que actúan en concierto para iniciar la transducción de señal después de interacción con el receptor de antígeno, así como cualquier derivado o variante de estas secuencias y cualquier secuencia sintética que tenga la misma capacidad funcional. El dominio de transducción de señal comprende dos clases distintas de secuencia de señalización citoplasmática, las que inician la activación primaria dependiente de antígeno y las que actúan de una manera dependiente de antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora. La secuencia de señalización citoplasmática primaria puede comprender motivos de señalización que se conocen como motivos de activación basados en tirosina inmunorreceptores de ITAM. Los ITAM son motivos de señalización bien definidos hallados en la cola intracitoplasmática de una diversidad de receptores que actúan como sitios de unión para tirosina cinasas de clase syk/zap70. Los ejemplos de ITAM usados en la invención pueden incluir como ejemplos no limitantes los procedentes de TCRzeta, FcRgamma, FcRbeta, FcRépsilon, CD3gamma, CD3delta, CD3épsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. En una realización preferida, el dominio transductor de señalización del CAR anti-CLL1 puede comprender el dominio de señalización de CD3zeta que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 70 %, preferentemente al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 90 %, 95 %, 97 %, o un 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 9.
Una molécula coestimuladora es una molécula de superficie celular distinta de un receptor de antígeno o sus ligandos que es necesaria para una respuesta inmunitaria eficaz. "Ligando coestimulador" se refiere a una molécula en una célula presentadora de antígeno que se une específicamente con una molécula coestimuladora afín en un linfocito T, proporcionando de este modo una señal que, además de la señal primaria proporcionada mediante, por ejemplo, la unión de un complejo de TCR/CD3 con una molécula del MHC cargada con péptido, media una respuesta de linfocitos T, incluyendo, pero sin limitación, activación de proliferación, diferenciación y similares. Un ligando coestimulador puede incluir, pero sin limitación, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, Pd -L2, 4-1BBL, OX40L, ligando coestimulador inducible (ICOS-L), molécula de adhesión intercelular (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, receptor de linfotoxina beta, 3/TR6, ILT3, ILT4, un agonista o anticuerpo que se une con el receptor de ligando Toll y un ligando que se une específicamente con B7-H3. Un ligando coestimulador también abarca, entre otras cosas, un anticuerpo que se une específicamente con una molécula coestimuladora presente en un linfocito T, tales como, pero sin limitación, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno 1 asociado a la función de linfocitos (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, un ligando que se une específicamente con CD83. Una "molécula coestimuladora" se refiere al compañero de unión afín en un linfocito T que se une específicamente con un ligando coestimulador, mediando de este modo en una respuesta coestimuladora por la célula, tal como, pero sin limitación, la proliferación. Las moléculas coestimuladoras incluyen, pero sin limitación, una molécula del MHC de clase I, BTLA y receptor de ligando Toll. Los ejemplos de moléculas coestimuladoras incluyen CD27, CD28, CD8, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno 1 asociado a la función de linfocitos (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 y un ligando que se une específicamente con CD83 y similares.
En una realización preferida, el dominio coestimulador del CAR anti-CLL1 de la presente invención comprende una parte de la molécula señal coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en un fragmento de 4-1BB (GenBank: AAA53133.) y CD28 (NP_006130.1). En particular, el dominio de transducción de señal del CAR anti-CLL1 de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 70 %, preferentemente al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 90 %, 95 % 97 % o un 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 8.
Un CAR anti-CLL1 de acuerdo con la presente invención generalmente comprende un dominio transmembrana (TM). Las características distintivas de los dominios transmembrana apropiados comprenden la capacidad de expresarse en la superficie de una célula, preferentemente en la presente invención una célula inmune, en particular, células linfocíticas o linfocitos citolíticos naturales (NK), y para interaccionar entre sí para dirigir la respuesta celular de células inmunes contra una célula diana predefinida. El dominio transmembrana puede proceder de una fuente natural o de una sintética. El dominio transmembrana puede proceder de cualquier proteína unida a membrana o transmembrana. Como ejemplos no limitantes, el polipéptido transmembrana puede ser una subunidad del receptor de linfocitos T tal como a, p, y o Z, polipéptido que constituye el complejo CD3, receptor de IL2 p55 (cadena a), p75 (cadena p) o cadena y, cadena subunitaria de receptores Fc, en particular receptor Fcy III o proteínas C D. Como alternativa, el dominio transmembrana puede ser sintético y puede comprender restos predominantemente hidrófobos tales como leucina y valina. En una realización preferida, dicho dominio transmembrana se obtiene a partir de la cadena alfa de CD8 humana (por ejemplo, Np_001139345.1). El dominio transmembrana puede comprender además una región bisagra entre dicho dominio de unión a ligando extracelular y dicho dominio transmembrana.
La expresión "región bisagra" usada en el presente documento se refiere generalmente a cualquier oligo o polipéptido que actúe para unir el dominio transmembrana con el dominio de unión a ligando extracelular. En particular, la región bisagra se usa para proporcionar más flexibilidad y accesibilidad para el dominio de unión a ligando extracelular. Una región bisagra puede comprender hasta 300 aminoácidos, preferentemente de 10 a 100 aminoácidos y mucho más preferentemente de 25 a 50 aminoácidos. La región bisagra puede proceder de todas o parte de las moléculas de origen natural, tal como de toda o parte de la región extracelular de CD8, CD4 o CD28, o de toda o parte de una región constante de anticuerpo. Como alternativa, la región bisagra puede ser una secuencia sintética que corresponde a una secuencia bisagra de origen natural, o puede ser una secuencia bisagra completamente sintética. En una realización preferida, dicho dominio bisagra comprende una parte de la cadena alfa de CD8 humana, el receptor FcYRIIIa o IgG1, respectivamente, a los que se hace referencia en esta memoria descriptiva como SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 y SEQ ID NO.5, o polipéptidos bisagra que presentan preferentemente al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 90 %, 95 %, 97 % o un 99 % de identidad de secuencia con estos polipéptidos. De acuerdo con una realización, la bisagra también puede ser una bisagra de Ig humana (inmunoglobulina), por ejemplo, una bisagra PD-1, una bisagra de IgG4.
Un CAR anti-CLL1 de acuerdo con la invención generalmente comprende un dominio transmembrana (TM), más particularmente un TM seleccionado de CD8a y 4-1BB, e incluso más particularmente que muestra identidad con los polipéptidos de SEQ ID NO. 6 o 7.
En una realización preferida, un CAR anti-CLL1 de acuerdo con la invención comprende un dominio TM de CD8a con la SEQ ID NO. 6 o que muestra al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 6
En células cancerosas se observa habitualmente regulación negativa o mutación de antígenos diana, creando variantes de escape de pérdida de antígeno. Por lo tanto, para compensar el escape tumoral y hacer a las células inmunes más específicas de la diana, el CAR anti-CLL1 específico de CLL1 de acuerdo con la invención puede comprender otros dominios de unión a ligando extracelulares, para unir simultáneamente diferentes elementos en diana aumentando de este modo la activación y función de células inmunes. En una realización, los dominios de unión a ligando extracelular pueden colocarse en tándem en el mismo polipéptido transmembrana y opcionalmente pueden separarse por un enlazador. En otra realización, dichos dominios de unión a ligando extracelulares diferentes pueden colocarse en diferentes polipéptidos transmembrana que componen el CAR anti-CLL1. En otra realización, la presente invención se refiere a una población de CAR anti-CLL1 que comprenden cada uno diferentes dominios de unión a ligando extracelular. Los diferentes dominios de unión a ligando extracelulares pueden unir simultáneamente de forma preferente diferentes elementos en la diana aumentando de este modo la activación y función de células inmunes. La presente invención también se refiere a una célula inmune linfoide genomanipulada aislada que comprende una población de CAR anti-CLL1 que comprenden cada uno diferentes dominios de unión a ligando extracelulares.
Los receptores de antígenos quiméricos específicos de CLL1 de acuerdo con la invención pueden tener diferentes arquitecturas, ya que pueden expresarse, por ejemplo, bajo una proteína quimérica monocatenaria (scCAR) o bajo la forma de varios polipéptidos (multicadena) incluyendo al menos una de dichas proteínas quiméricas. Dichas arquitecturas de CAR multicatenarias se divulgan en el documento WO2014/039523, especialmente en las figuras 2 a 4, y de la página 14 a 21.
En general, el CAR anti-CLL1 comprende un anticuerpo extracelular monocatenario (scFv Fc) fusionado al dominio de señalización intracelular de la cadena zeta del complejo del receptor de antígeno de linfocitos T (scFv Fc:Z), que tiene la capacidad, cuando se expresa en linfocitos T, de redirigir el reconocimiento de antígenos basándose en la especificidad del anticuerpo monoclonal.
Se divulgan varios CAR monocatenarios anti-CLL1 dirigidos contra el antígeno CLL1, que comprenden como ejemplo no limitante las secuencias de aminoácidos: SEQ ID NO: 35 a 112.
El CAR CLL1 de la presente invención también puede ser "CAR multicatenarios" como se ha mencionado anteriormente, lo que significa que el dominio de unión extracelular y los dominios de señalización se ubican preferentemente en diferentes cadenas polipeptídicas, mientras que los dominios coestimuladores pueden ubicarse en el mismo o un tercer polipéptido. Dichos CAR multicatenarios se pueden obtener a partir de FcsRI (Ravetch et al., 1989), reemplazando el dominio de unión a IgE de alta afinidad de la cadena alfa de FcsRI por un dominio de unión a ligando extracelular tal como scFv, mientras que las colas N y/o C-terminales de las cadenas beta y/o gamma de FcsRI se fusionan con dominios de transducción de señal y dominios coestimuladores, respectivamente. El dominio de unión a ligando extracelular tiene el papel de redirigir especificidad de linfocitos T hacia dianas celulares, mientras que los dominios de transducción de señal activan o reducen la respuesta de las células inmunes. El hecho de que los diferentes polipéptidos deriven de los polipéptidos alfa, beta y gamma de FcsRI que son polipéptidos transmembrana que se encuentran en posición de yuxtamembrana, proporciona una arquitectura más flexible a los CAR, mejorando la especificidad hacia la molécula diana y reduciendo la activación de fondo de las células inmunes como se describe en el documento WO2014/039523.
Dominio de unión a ligando extracelular
La expresión "dominio de unión a ligando extracelular", como se usa en el presente documento, se define como un oligo o polipéptido que es capaz de unirse con un ligando. Preferentemente, el dominio será capaz de interaccionar con una molécula de superficie celular. Por ejemplo, el dominio de unión a ligando extracelular puede elegirse para reconocer un ligando que actúa como un marcador de superficie celular en células diana con una patología particular. Pueden ser, por ejemplo, dominios de unión derivados de un ligando, un receptor, anticuerpos humanos o de ratón, o dominios de reconocimiento de antígenos derivados de camellos o peces cartilaginosos.
En general, el dominio de unión a ligando extracelular del CAR de la presente invención comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable ligero (Vl) y el pesado (Vh) del anticuerpo anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho VH comprende las CDR de s Eq . ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de Se Q ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente.
De acuerdo con realizaciones preferidas, dicho VH tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO. 15 y dicho VL tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO. 16; o dicho VH tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO. 25 y dicho VL tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia polipeptídica de SEQ ID No .26, respectivamente. El dominio extracelular y el dominio transmembrana se unen preferentemente entre sí mediante un enlazador flexible que comprende la secuencia SEQ ID NO.10.
Por la expresión "anticuerpo recombinante", como se usa en el presente documento, se entiende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se genera usando tecnología de ADN recombinante, tal como, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo expresado por un bacteriófago, un sistema de expresión de levadura o un sistema de expresión de células de mamífero. El término también debe interpretarse en el sentido de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se ha generado mediante la síntesis de una molécula de ADN que codifica el anticuerpo o fragmento de anticuerpo y cuya molécula de ADN expresa un anticuerpo o proteína de fragmento de anticuerpo, o una secuencia de aminoácidos que especifica el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, en donde la secuencia de aminoácidos o ADN se ha obtenido usando tecnología de secuencia de aminoácidos o ADN recombinante o sintético que está disponible y se conoce bien en la técnica.
La presente invención divulga un receptor de antígeno quimérico monocatenario específico de CLL1 (scCAR anti-CLL1) como se ha descrito anteriormente, en donde dicho dominio de unión a ligando extracelular comprende las cadenas VH y VL que están humanizadas.
Por la expresión "anticuerpo humanizado", como se usa en el presente documento, se entiende que los polipéptidos incluyen una región variable de cadena pesada humanizada y una región variable de cadena ligera humanizada. Por ejemplo, los polipéptidos pueden incluir las regiones marco (Fr ) de las regiones variables de cadena ligera y pesada de un anticuerpo humano, mientras que conservan sustancialmente la especificidad de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal parental. La región variable de cadena pesada humanizada y/o la región variable de cadena ligera humanizada están al menos aproximadamente un 87 % humanizadas, al menos aproximadamente un 90 % humanizadas, al menos aproximadamente un 95 % humanizadas, al menos aproximadamente un 98 % humanizado, o al menos aproximadamente un 100 % humanizado, excluyendo las regiones determinantes de complementariedad (CDR). Las moléculas de polipéptidos de unión a antígeno pueden derivarse de donantes de anticuerpos monoclonales (por ejemplo, donantes de anticuerpos monoclonales de ratón) y pueden incluir CDR de los anticuerpos monoclonales (por ejemplo, CDR monoclonales de ratón).
Por la expresión "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se entiende un anticuerpo producido por un clon de células cultivadas en laboratorio, ya sea de un hibridoma o de un linfocito transformado por virus que es más abundante y uniforme que el anticuerpo natural y es capaz de unirse específicamente a un único sitio en el antígeno CLL1. Son anticuerpos monoespecíficos que son producidos por células inmunes idénticas que son todos clones de una célula madre única, en contraste con los anticuerpos policlonales que están hechos de varias células inmunes diferentes. Los anticuerpos monoclonales tienen afinidad monovalente, ya que se unen al mismo epítopo. La metodología actual aplicada para la humanización es según Lefranc MP et al (Lefranc, MP, Ehrenmann F, Ginestoux C, Giudicelli V, Duroux P "Use of IMGT (®) databases and tools for antibody engineering and humanization", Methods Mol Biol. 2012; 907: 3-37). En estas cuatro alineaciones se indican.
Un anticuerpo humanizado puede ser producido usando diversas técnicas conocidas en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, injerto de CDR (véanse, por ejemplo, la Patente Europea N.° EP 239.400; la Publicación Internacional N.° WO 91/09967; y las Patentes de EE.UU. N.° 5.225.539, 5.530.101 y 5.585.089), modificación superficial o revestimiento (véanse, por ejemplo, las Patentes Europeas N.° EP 592.106 y EP 519.596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814; y Roguska et al., 1994, PNAS, PnAs , 91:969-973), barajado de cadenas (véase, por ejemplo, la Pat. de EE.u U. N.° 5.565.332), y las técnicas divulgadas en, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N.° US2005/0042664, la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N.° US2005/0048617, la Pat. de EE.UU. N.° 6.407.213, la Pat. de EE.UU. N.° 5.766.886, la Publicación Internacional N.° WO 9317105, Tan et al., J. Immunol., 169: 1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16): 10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8): 1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994), y Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994). Con frecuencia, los residuos marco de las regiones marco serán sustituidos por el residuo correspondiente del anticuerpo donante de CDR para alterar, por ejemplo, mejorar, la unión al antígeno. Estas sustituciones marco se identifican mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante la modelización de las interacciones de la CDR y residuos marco para identificar los residuos marco importantes para la unión a antígeno y la comparación de secuencias para identificar los residuos marco poco habituales en posiciones particulares. (Véanse, por ejemplo, Queen et al., Patente de Estados Unidos N.° 5.585.089; y Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323).
Las sustituciones de aminoácidos conservadoras son aquellas en las que el residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por lo tanto, uno o más residuos de aminoácidos dentro de un CAR anti-CLL1 de la invención se pueden reemplazar por otros residuos de aminoácidos de la misma familia de cadenas laterales y el CAR anti-CLL1 alterado se puede ensayar para determinar la capacidad de unirse a CLL1 usando los ensayos funcionales descritos en el presente documento.
Un CAR anti-CLL1 de la invención incluye opcionalmente un dominio suicida, que está destinado a agotar las células inmunes dotadas con el CAR en el caso de que estas posteriormente causen efectos adversos in vivo. Tal dominio suicida puede obtenerse, por ejemplo, incluyendo dos copias de un mimótopo CD20, preferentemente de la secuencia CPYSNPSLCS (SEQ ID NO. 113), en la secuencia polipeptídica de CAR. Dichas dos copias de un mimótopo CD20 se pueden unir entre sí y también al Vl mediante un enlazador. También se pueden insertar entre el scFv anti-CLL1 y la bisagra (tal como CD8alfa), utilizando un enlazador opcional. El mimótopo CD20 puede unirse mediante anticuerpos anti-CD20, tal como Rituximab (McLaughlin P, et al. 1998). Por lo tanto, el CAR anti-CLL1 de la presente invención puede comprender cadenas VH y VL que pueden unirse al antígeno de superficie celular CLL1, opcionalmente humanizado, un enlazador L, un dominio suicida, una bisagra o parte de esta, un dominio transmembrana, un dominio coestimulador y un dominio estimulador.
En una realización preferida, la presente invención divulga un receptor de antígeno quimérico monocatenario específico anti-CLL1 ("scCAR anti-CLL1" o "scCAR") que tiene una de las estructuras polipeptídicas seleccionadas de V1 a V6, como se ilustra en la figura 2 y las Tablas 3-8, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable pesado (Vh) y ligero (Vl) del anticuerpo monoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, una bisagra, un dominio transmembrana, un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización y un dominio coestimulador.
En una realización más preferida, la presente invención divulga un scCAR específico de CLL1 como se ha descrito anteriormente, en donde dicha estructura V1, V3 o V5 comprende una bisagra FcYRIIIa, CD8 alfa o IgG1 y un dominio transmembrana de CD8 alfa.
En otra realización más preferida, dicho scCAR específico de CLL1 comprende el dominio coestimulador de 4-1BB o el dominio coestimulador de CD28, o más preferentemente 4-1BB.
La presente invención divulga un scCAR específico de CLL1 como se ha descrito anteriormente, en donde dicha estructura V1, V3 o V5 comprende una bisagra FcYRIIIa, CD8 alfa o IgG1 y un dominio transmembrana 4-1BB.
La presente invención divulga un scCAR específico de CLL1 como se ha descrito anteriormente, en donde dicha estructura V1, V3 o V5 comprende un FcYRIIIa, CD8 alfa o IgG1, un dominio citoplasmático 4-1BB y un dominio transmembrana de CD8 alfa.
De acuerdo con una realización preferida, el scCAR anti-CLL1 de la invención tiene una de las estructuras polipeptídicas seleccionadas de V1 a V6, como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable pesado (Vh) y ligero (Vl) del anticuerpo monoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho
VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, una bisagra, un dominio transmembrana, un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización CD3 zeta y un dominio coestimulador, teniendo dicho dominio de señalización CD3 zeta preferentemente una secuencia SEQ ID NO.9.
De acuerdo con otra realización preferida, el scCAR anti-CLL1 de la invención tiene una de las estructuras polipeptídicas seleccionadas de V1 a V6, como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable pesado (Vh) y ligero (Vl) del anticuerpo monoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho
VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, una bisagra, un dominio transmembrana, un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización de CD3 zeta y un dominio coestimulador de 4-1BB, teniendo dicho dominio coestimulador de 4-1 BB preferentemente una secuencia SEQ ID NO.8.
La presente invención divulga un scCAR anti-CLL1 que tiene una de las estructuras polipeptídicas seleccionadas de
V1 a V6, como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable pesado ( Vh ) y ligero (Vl) del anticuerpo monoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, una bisagra FcYRIIIa, un dominio transmembrana de CD8a, que tiene preferentemente la SEQ ID NO.6, un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización CD3 zeta y un dominio coestimulador.
La presente invención divulga un scCAR anti-CLL1 que tiene una de las estructuras polipeptídicas seleccionadas de V1 a V6, como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable pesado ( Vh) y ligero ( Vl) del anticuerpo monoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho VH comprende las CDR de Se Q. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ iD NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, una bisagra CD8a, un dominio transmembrana de CD8a, que tiene preferentemente la SEQ ID NO.6, un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización CD3 zeta y un dominio coestimulador.
La presente invención divulga un scCAR anti-CLL1 que tiene una de las estructuras polipeptídicas seleccionadas de V1 a V6, como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable pesado ( Vh) y ligero ( Vl) del anticuerpo monoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho VH comprende las CDR de Se Q. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ iD NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, una bisagra IgG1, un dominio transmembrana de CD8a, que tiene preferentemente la SEQ ID NO.6, un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización CD3 zeta y un dominio coestimulador.
La presente invención divulga un scCAR anti-CLL1 que tiene una de las estructuras polipeptídicas seleccionadas de V1 a V6, como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable pesado ( Vh) y ligero ( Vl) del anticuerpo monoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho VH comprende las CDR de Se Q. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ iD NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, una bisagra FcYRIIIa, un dominio transmembrana de 4-1BB, que tiene preferentemente la SEQ ID NO.7, un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización CD3 zeta y un dominio coestimulador.
La presente invención divulga un scCAR anti-CLL1 que tiene una de las estructuras polipeptídicas seleccionadas de V1 a V6, como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable pesado (Vh) y ligero ( Vl) del anticuerpo monoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho VH comprende las CDR de Se Q. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ iD NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, una bisagra CD8a, un dominio transmembrana de 4-1BB, que tiene preferentemente la SEQ ID NO.7, un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización CD3 zeta y un dominio coestimulador.
La presente invención divulga un scCAR anti-CLL1 que tiene una de las estructuras polipeptídicas seleccionadas de V1 a V6, como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable pesado ( Vh ) y ligero ( Vl) del anticuerpo monoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho VH comprende las CDR de Se Q. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ iD NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, una bisagra IgG1, un dominio transmembrana de 4-1BB, que tiene preferentemente la SEQ iD NO.7, un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización CD3 zeta y un dominio coestimulador.
En un aspecto particular, la presente invención divulga un scCAR específico anti-CLL1 que tiene una estructura polipeptídica V1, como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable pesado ( Vh) y ligero ( Vl) del anticuerpo monoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, una bisagra FcYRIIIa preferentemente con la SEQ ID NO.3, un dominio transmembrana de CD8a, preferentemente con la SEQ ID NO.6, un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización CD3 zeta, preferentemente con la SEQ ID NO.9, y un dominio coestimulador de 4-1BB, preferentemente con la SEQ ID NO.8.
Más específicamente, la presente invención divulga un scCAR específico anti-CLL1 que tiene una estructura polipeptídica V1, como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable pesado (Vh) y ligero (Vl) del anticuerpo monoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho v H comprende las CDR de Se Q. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, una bisagra FcYRIIIa preferentemente con la SEQ ID NO.3, un dominio transmembrana de CD8a, preferentemente con la SEQ ID NO.6, un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización CD3 zeta, preferentemente con la SEQ ID NO.9, y un dominio coestimulador de 4-1BB, preferentemente con la SEQ ID NO.8, en donde dicha cadena VH tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO. 15 y dicha cadena VL tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO. 16, o en donde dicha cadena VH tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO. 25 y dicha cadena VL tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO. 26, respectivamente.
En otro aspecto particular, la presente invención divulga un scCAR específico anti-CLL1 que tiene una estructura polipeptídica V3, como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable pesado (Vh) y ligero (Vl) del anticuerpo monoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho v H comprende las CDR de Se Q. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, una bisagra CD8a preferentemente con la SEQ ID NO.4, un dominio transmembrana de CD8a, preferentemente con la SEQ ID NO.6, un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización CD3 zeta, preferentemente con la SEQ ID NO.9, y un dominio coestimulador de 4-1BB, preferentemente con la SEQ ID NO.8.
Más específicamente, la presente invención divulga un scCAR específico anti-CLL1 que tiene una estructura polipeptídica V3, como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable pesado (Vh) y ligero (Vl) del anticuerpo monoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho v H comprende las CDR de Se Q. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, una bisagra CD8a preferentemente con la SEQ ID NO.4, un dominio transmembrana de CD8a, preferentemente con la SEQ ID NO.6, un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización CD3 zeta, preferentemente con la SEQ ID NO.9, y un dominio coestimulador de 4-1BB, preferentemente con la SEQ ID NO.8, en donde dicha cadena VH tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO. 15, y dicha cadena VL tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO. 16, o en donde dicha cadena VH tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO. 25 y dicha cadena VL tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO. 26, respectivamente.
En aún otro aspecto particular, la presente invención divulga un scCAR específico anti-CLL1 que tiene una estructura polipeptídica V5, como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable pesado ( Vh) y ligero (Vl) del anticuerpo monoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, una bisagra IgG1 preferentemente con la SEQ ID NO.5, un dominio transmembrana de CD8a, preferentemente con la SEQ ID NO.6, un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización CD3 zeta, preferentemente con la SEQ ID NO.9, y un dominio coestimulador de 4-1BB, preferentemente con la SEQ ID NO.8.
Más específicamente, la presente invención divulga un scCAR específico anti-CLL1 que tiene una estructura polipeptídica V5, como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable pesado (Vh) y ligero (Vl) del anticuerpo monoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, una bisagra IgG1 preferentemente con la SEQ ID NO.5, un dominio transmembrana de CD8a, preferentemente con la SEQ ID NO.6, un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización CD3 zeta, preferentemente con la SEQ ID NO.9, y un dominio coestimulador de 4-1BB, preferentemente con la SEQ ID NO.8, en donde dicha cadena VH tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO. 15 y dicha cadena VL tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO. 16, o en donde dicha cadena VH tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO. 25 y dicha cadena VL tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO. 26, respectivamente.
Más específicamente, la presente invención divulga un scCAR específico anti-CLL1 que tiene una estructura polipeptídica V1, como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable pesado (Vh) y ligero (Vl) del anticuerpo monoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho v H comprende las CDR de Se Q. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, una bisagra FcYRIIIa preferentemente con la SEQ ID NO.3, un dominio transmembrana de CD8a, preferentemente con la SEQ ID NO.6, un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización CD3 zeta, preferentemente con la SEQ ID NO.9, y un dominio coestimulador de 4-1BB, preferentemente con la SEQ ID NO.8, en donde dicha cadena VH tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO. 15 y dicha cadena VL tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO 16 y en donde dicho polipéptido tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO. 53, o en donde dicha cadena VH tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO. 25 y dicha cadena VL tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO. 26, y en donde dicho polipéptido tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO. 83, respectivamente.
La presente invención divulga un scCAR específico anti-CLL1 de estructura V3, como se ilustra en la figura 2, teniendo dicho polipéptido al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO. 37, 43, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, 91, 97, 103 o 109.
Más específicamente, la presente invención divulga un scCAR específico anti-CLL1 que tiene una estructura polipeptídica V3, como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable pesado (Vh) y ligero (Vl) del anticuerpo monoclonal anti-CLL1 M26 o m 2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho v H comprende las CDR de Se Q. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, una bisagra CD8a preferentemente con la SEQ ID NO.4, un dominio transmembrana de CD8a, preferentemente con la SEQ ID NO.6, un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización CD3 zeta, preferentemente con la SEQ ID NO.9, y un dominio coestimulador de 4-1BB, preferentemente con la SEQ ID NO.8, en donde dicha cadena VH tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO. 15 y dicha cadena VL tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO. 16, y en donde dicho polipéptido tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO. 55, o en donde dicha cadena VH tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO. 25 y dicha cadena VL tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO. 26, y en donde dicho polipéptido tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO. 85, respectivamente.
Más específicamente, la presente invención divulga un scCAR específico anti-CLL1 que tiene una estructura polipeptídica V5, como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable pesado (Vh) y ligero (Vl) del anticuerpo monoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho v H comprende las CDR de SEQ. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, una bisagra IgG1 preferentemente con la SEQ ID NO.5, un dominio transmembrana de CD8a, preferentemente con la SEQ ID NO.6, un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización CD3 zeta, preferentemente con la SEQ ID NO.9, y un dominio coestimulador de 4-1BB, preferentemente con la SEQ ID NO.8, en donde dicha cadena VH tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO. 15 y dicha cadena VL tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO. 16, y en donde dicho 57, o en donde dicha cadena VH tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO. 25 y dicha cadena VL tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO. 26, y en donde dicho polipéptido tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO. 87, respectivamente.
La presente invención divulga un receptor de antígeno quimérico específico monocatenario anti-CLL1 (scCAR anti-CLL1) como anteriormente, en el que dicho dominio de unión a ligando extracelular VH y VL está humanizado.
La presente invención también divulga un scCAR específico de CLL1 como se ha definido previamente, que comprende además otro dominio de unión a ligando extracelular que no es específico para CLL1, tal como el antígeno CD33, antígeno CD44, antígeno CD47, antígeno CD123, antígeno CD96 e mucina-3 de inmunoglobulina de linfocitos T (TIM-3).
La presente invención divulga un scCAR específico de CLL1 como anteriormente, que comprende además un péptido señal, preferentemente de SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2, para ayudar al polipéptido CAR a alcanzar la membrana de la célula inmune.
La presente invención divulga un scCAR específico de CLL1 como anteriormente, en el que un enlazador de SEQ ID NO 10 se inserta entre VH y VL.
Polinucleótidos, vectores:
La presente divulgación también se refiere a polinucleótidos y vectores que permiten la expresión heteróloga en células del CAR anti-CLL1 de acuerdo con la invención, que codifican las secuencias polipeptídicas que se han detallado previamente.
Los polinucleótidos pueden incluirse en un casete de expresión o vector de expresión (por ejemplo, un plásmido para la introducción en una célula huésped bacteriana, o un vector viral tal como un vector de baculovirus para la transfección de una célula huésped de insecto, o un plásmido o vector viral tal como un lentivirus para la transfección de una célula huésped de mamífero).
En un caso particular, las diferentes secuencias de ácido nucleico se pueden incluir en un polinucleótido o vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de salto ribosómico, tal como una secuencia que codifica un péptido 2A. Los péptidos 2A, que se identificaron en el subgrupo Aphthovirus de picornavirus, provocan un "salto" ribosómico de un codón al siguiente sin la formación de un enlace peptídico entre los dos aminoácidos codificados por los codones (veánse (Donnelly y Elliott 2001; Atkins, Wills et al. 2007; Doronina, Wu et al. 2008)). Por "codón" se entiende tres nucleótidos en un ARNm (o en la hebra sentido de una molécula de ADN) que son traducidos por un ribosoma en un residuo de aminoácido. Por lo tanto, se pueden sintetizar dos polipéptidos a partir de un único marco de lectura abierto contiguo dentro de un ARNm cuando los polipéptidos están separados por una secuencia de oligopéptidos 2A que está en el marco. Dichos mecanismos de salto ribosómico se conocen bien en la técnica y se sabe que son utilizados por varios vectores para la expresión de varias proteínas codificadas por un único ARN mensajero.
Para dirigir el polipéptido transmembrana hacia la ruta secretora de una célula huésped, se proporciona una secuencia señal secretora (también conocida como secuencia líder, secuencia prepro o secuencia pre) en la secuencia de polinucleótidos o secuencia de vector. La secuencia señal secretora está unida operativamente a la secuencia de ácido nucleico transmembrana, es decir, las dos secuencias se unen en el marco de lectura correcto y se posicionan para dirigir el polipéptido recién sintetizado hacia la ruta secretora de la célula huésped. Las secuencias señal secretoras se posicionan comúnmente en 5' con respecto a la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés, aunque determinadas secuencias señal secretoras se pueden posicionar en otra parte de la secuencia de ácido nucleico de interés (véanse, por ejemplo, Welch et al., Patente de EE.UU. N.° 5.037.743; Holland et al., Patente de EE.UU. N.° 5.143.830). En una realización preferida, el péptido señal comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 y 2 o al menos un 90 %, 95 %, 97 % o un 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 y/o 2.
Los expertos en la técnica reconocerán que, en vista de la degeneración del código genético, es posible una variación de secuencia considerable entre estas moléculas de polinucleótidos. Preferentemente, las secuencias de ácido nucleico de la presente invención están optimizadas por codones para su expresión en células de mamífero, preferentemente para su expresión en células humanas. La optimización de codones se refiere al intercambio en una secuencia de interés de codones que son generalmente raros en genes altamente expresados de una especie dada por codones que son generalmente frecuentes en genes altamente expresados de dichas especies, codificando dichos codones los aminoácidos como los codones que están siendo intercambiados.
Métodos de administración
La presente divulgación incluye los diferentes medios para expresar el receptor de antígeno quimérico (CAR) anti-CLL1 descrito en el presente documento en células inmunes.
Los métodos para introducir una construcción polinucleotídica en células son conocidos en la técnica e incluyen como ejemplos no limitantes métodos de transformación estable en los que la construcción polinucleotídica que codifica dicho CAR se integra en el genoma de la célula, métodos de transformación transitoria en los que la construcción polinucleotídica no está integrada en el genoma de la célula y métodos mediados por virus.
Dichos polinucleótidos pueden introducirse en una célula mediante, por ejemplo, vectores virales recombinantes (por ejemplo, retrovirus, adenovirus), liposomas y similares. Por ejemplo, los métodos de transformación transitoria incluyen, por ejemplo, microinyección, electroporación o bombardeo de partículas, fusión celular. Dichos polinucleótidos pueden incluirse en vectores, más particularmente plásmidos o virus, con vistas a expresarse en células. Dicho vector plasmídico puede comprender un marcador de selección que permite la identificación y/o selección de células que recibieron dicho vector.
Se pueden incluir diferentes transgenes en un vector. Dicho vector puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de salto ribosómico tal como una secuencia que codifica un péptido 2A. Los péptidos 2A, que se identificaron en el subgrupo Aphthovirus de picornavirus, provocan un "salto" ribosómico de un codón al siguiente sin la formación de un enlace peptídico entre los dos aminoácidos codificados por los codones (véanse Donnelly et al., J. de General Virology 82: 1013-1025 (2001); Donnelly et al., J. de Gen. Virology 78: 13-21 (1997); Doronina et al., Mol. And. Cell. Biology 28(13): 4227-4239 (2008); Atkins et al., RNA 13: 803-810 (2007)).
Por "codón" se entiende tres nucleótidos en un ARNm (o en la hebra sentido de una molécula de ADN) que son traducidos por un ribosoma en un residuo de aminoácido. Por lo tanto, se pueden sintetizar dos polipéptidos a partir de un único marco de lectura abierto contiguo dentro de un ARNm cuando los polipéptidos están separados por una secuencia de oligopéptidos 2A que está en el marco. Dichos mecanismos de salto ribosómico se conocen bien en la técnica y se sabe que son utilizados por varios vectores para la expresión de varias proteínas codificadas por un único ARN mensajero.
En un caso más preferido, los polinucleótidos que codifican polipéptidos de acuerdo con la presente invención pueden ser ARNm que se introduce directamente en las células, por ejemplo, mediante electroporación. Los inventores determinaron las condiciones óptimas para la electroporación de ARNm en linfocitos T. El inventor utilizó la tecnología cytoPulse que permite, mediante el uso de campos eléctricos pulsados, permeabilizar transitoriamente las células vivas para la administración de material a las células. La tecnología, basada en el uso de formas de onda de electroporación PulseAgile (BTX Havard Apparatus, 84 October Hill Road, Holliston, MA 01746, EE.UU.), garantiza el control preciso de la duración del pulso, la intensidad, así como el intervalo entre pulsos (patente de EE.UU. 6.010.613 y solicitud PCT internacional WO2004083379). Todos estos parámetros pueden modificarse para alcanzar las mejores condiciones para una alta eficiencia de transfección con una mortalidad mínima. Básicamente, los primeros pulsos de alto campo eléctrico permiten la formación de poros, mientras que los pulsos posteriores de campo eléctrico inferior permiten mover el polinucleótido a la célula.
Los diferentes métodos descritos anteriormente implican la introducción de scCAR en una célula. Como ejemplo no limitante, dicho scCAR puede introducirse como transgenes codificados por un vector plasmídico. Dicho vector plasmídico también puede contener un marcador de selección que permite la identificación y/o selección de células que recibieron dicho vector.
Los polipéptidos se pueden sintetizar in situ en la célula como resultado de la introducción de polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos en la célula. Como alternativa, dichos polipéptidos podrían producirse fuera de la célula y a continuación introducirse en la misma. Se conocen en la técnica métodos para introducir una construcción polinucleotídica en células e incluyen como ejemplos no limitantes métodos de transformación estable en los que la construcción polinucleotídica se integra en el genoma de la célula, métodos de transformación transitoria en los que la construcción polinucleotídica no está integrada en el genoma de la célula y métodos mediados por virus. Dichos polinucleótidos pueden introducirse en una célula mediante, por ejemplo, vectores virales recombinantes (por ejemplo, retrovirus, adenovirus), liposomas y similares. Por ejemplo, los métodos de transformación transitoria incluyen, por ejemplo, microinyección, electroporación o bombardeo de partículas. Dichos polinucleótidos pueden incluirse en vectores, más particularmente plásmidos o virus, con vistas a expresarse en células.
Activación y expansión de linfocitos T
Ya sea antes o después de la modificación genética de los linfocitos T, incluso si las células inmunes modificadas genéticamente de la presente invención se activan y proliferan independientemente de los mecanismos de unión a antígeno, las células inmunes, particularmente los linfocitos T de la presente invención, pueden activarse adicionalmente y expandirse generalmente usando métodos como se describe, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. 6.352.694; 6.534.055; 6.905.680; 6.692.964; 5.858.358; 6.887.466; 6.905.681; 7.144.575; 7.067.318; 7.172.869; 7.232.566; 7.175.843; 5.883.223; 6.905.874; 6.797.514; 6.867.041; y la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 20060121005. Los linfocitos T pueden expandirse in vitro o in vivo.
Generalmente, los linfocitos T de la invención se expanden por contacto con un agente que estimula un complejo de CD3 TCR y una molécula coestimuladora en la superficie de los linfocitos T para crear una señal de activación para el linfocito T. Por ejemplo, se pueden utilizar productos químicos tal como ionóforo de calcio A23187, 12-miristato 13-acetato de forbol (PMA) o lectinas mitogénicas como fitohemaglutinina (PHA) para crear una señal de activación para el linfocito T.
Como ejemplos no limitantes, las poblaciones de linfocitos T pueden estimularse in vitro, tal como mediante contacto con un anticuerpo anti-CD3, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un anticuerpo anti-CD2 inmovilizado en una superficie, o por contacto con un activador de proteína cinasa C (por ejemplo, briostatina) junto con un ionóforo de calcio. Para la coestimulación de una molécula accesoria en la superficie de los linfocitos T, se utiliza un ligando que une la molécula accesoria. Por ejemplo, una población de linfocitos T puede ponerse en contacto con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, en condiciones apropiadas para estimular la proliferación de los linfocitos T. Las condiciones apropiadas para el cultivo de linfocitos T incluyen un medio apropiado (por ejemplo, medio esencial mínimo o medio RPMI 1640 o, X-vivo 5, (Lonza)) que pueden contener factores necesarios para la proliferación y la viabilidad, incluyendo suero (por ejemplo, suero bovino fetal o humano), interleucina-2 (IL-2), insulina, IFN-g, 1L-4, 1L-7, GM-CSF, -10, -2, 1L-15, TGFp y TNF- o cualquier otro aditivo para el crecimiento de células conocido por el experto en la técnica. Otros aditivos para el crecimiento de las células incluyen, pero sin limitación, tensioactivo, plasmanato y agentes reductores, tales como N-acetil-cisteína y 2-mercaptoetanol. Los medios pueden incluir Rp MI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1, y X-Vivo 20, Optimizer, con aminoácidos añadidos, piruvato de sodio y vitaminas, libre de suero o complementado con una cantidad apropiada de suero (o plasma) o un conjunto definido de hormonas, y/o una cantidad de citocina(s) suficiente para el crecimiento y la expansión de los linfocitos T. Los antibióticos, por ejemplo, penicilina y estreptomicina, se incluyen solo en cultivos experimentales, no en cultivos de células que se infunden en un sujeto. Las células diana se mantienen en condiciones necesarias para apoyar el crecimiento, por ejemplo, una temperatura (por ejemplo, 37 °C) y atmósfera apropiadas (por ejemplo, aire más 5 % de CO2). Los linfocitos T que han estado expuestos a tiempos de estimulación variados pueden presentar características diferentes. En otro caso particular, dichas células pueden expandirse mediante cocultivo con tejido o células. Dichas células también pueden expandirse in vivo, por ejemplo en la sangre del sujeto después de administrar dicha célula al sujeto.
Células inmunes genomanipuladas
Una "célula" de acuerdo con la presente invención generalmente se refiere a una célula de origen hematopoyético implicada funcionalmente en el inicio y/o ejecución de la respuesta inmunitaria innata y/o adaptativa. La célula de acuerdo con la presente invención es preferentemente una célula inmune aislada y más preferentemente un linfocito T obtenido de un donante. Dicha célula inmune de acuerdo con la presente invención también puede derivarse de una célula madre. Las células madre pueden ser células madre adultas, células madre embrionarias no humanas, más particularmente células madre no humanas, células madre de sangre de cordón umbilical, células progenitoras, células madre de la médula ósea, células madre pluripotentes inducidas, células madre totipotentes o células madre hematopoyéticas. Las células humanas representativas son células CD34+. Dicha célula aislada también puede ser una célula dendrítica, una célula dendrítica asesina, un mastocito, un linfocito NK, un linfocito B o un linfocito T seleccionado del grupo que consiste en linfocitos T inflamatorios, en linfocitos T citotóxicos, en linfocitos T reguladores o en linfocitos T auxiliares. En otra realización, dicha célula puede obtenerse del grupo que consiste en linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+. Antes de la expansión y modificación genética de las células de la invención, se puede obtener una fuente de células de un sujeto a través de diversos métodos no limitantes. Las células se pueden obtener de varias fuentes no limitantes, incluyendo células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, sangre de cordón umbilical, tejido de timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores. En determinadas realizaciones de la presente invención, se puede usar cualquier número de líneas de linfocitos T disponibles y conocidas por los expertos en la técnica.
En otra realización, dicha célula puede proceder de un donante sano, de un paciente diagnosticado con cáncer o de un paciente diagnosticado con una infección. En otra realización, dicha célula forma parte de una población mixta de células que presentan diferentes características fenotípicas. En el alcance de la presente invención también se incluye una línea celular obtenida de un linfocito T transformado de acuerdo con el método descrito previamente. Las células modificadas resistentes a un tratamiento inmunosupresor y susceptibles de obtenerse por el método anterior están incluidas en el alcance de la presente invención.
Como realización preferida, la presente invención proporciona linfocitos T o una población de linfocitos T primarios, dotados de un CAR CLL1 como se ha descrito anteriormente, que no expresan TCR funcional y que son reactivos hacia células positivas para CLL1, por su trasplante alogénico en pacientes.
Como una realización más preferida, la presente invención proporciona linfocitos T o una población de linfocitos T dotados de un scCAR c LL1 y que son reactivos hacia células positivas para CLL1 como se ha descrito anteriormente, que no expresan un TCR funcional y son resistentes a un fármaco seleccionado, para su trasplante alogénico en pacientes tratados con dicho fármaco seleccionado. La presente divulgación incluye el método de preparación de células inmunes genomanipuladas para inmunoterapia que comprende introducir ex vivo en dichas células inmunes los polinucleótidos o vectores que codifican el CAR CLL1 de acuerdo con métodos de transformación como se ha descrito previamente en los documentos WO2014/130635, WO2013176916, WO2013176915.
En un caso preferido, dichos polinucleótidos se introducen en las células inmunes por medio de vectores retrovirales con el fin de integrarse de forma estable en el genoma celular.
Métodos de genomanipulación de células inmunes dotadas de los CAR de acuerdo con la invención
La presente invención también tiene como objetivo producir células inmunes dotadas de CAR anti CLL1, que sean menos o no alorreactivas, que puedan usarse en tratamientos alogénicos (es decir, con riesgo reducido de inducir la reacción de injerto contra huésped) y/o hacerse resistentes a diversos tratamientos estándar de atención).
Como se describe adicionalmente en esta memoria descriptiva, dichos métodos pueden comprender además la etapa de modificar genéticamente dicha célula inmune utilizando al menos una endonucleasa.
- El término "endonucleasa" se refiere a cualquier enzima de tipo silvestre o variante capaz de catalizar la hidrólisis (escisión) de enlaces entre ácidos nucleicos dentro de una molécula de ADN o ARN, preferentemente, una molécula de ADN. Las endonucleasas no escinden la molécula de ADN o ARN independientemente de su secuencia, pero reconocen y escinden la molécula de ADN o ARN en secuencias polinucleotídicas específicas, denominadas además "secuencias diana" o "sitios diana". Las endonucleasas se pueden clasificar como endonucleasas de sitio de corte poco frecuente cuando tienen normalmente un sitio de reconocimiento de polinucleótidos de más de 12 pares de bases (pb) de longitud, más preferentemente de 14-55 pb.
Preferentemente, los métodos implican una endonucleasa de sitio de corte poco frecuente. Las endonucleasas de sitio de corte poco frecuente pueden ser, por ejemplo, una endonucleasa autodirigida (Paques y Duchateau 2007), una nucleasa quimérica de dedos de cinc (ZFN) resultante de la fusión de dominios de dedos de cinc genomanipulados con el dominio catalítico de una enzima de restricción tal como Fokl (Porteus y Carroll 2005), una nucleasa TALE, una endonucleasa Cas9 del sistema CRISPR como se describe a continuación (Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chylinski et al. 2012; Cong, Ran et al. 2013; Mali, Yang et al. 2013) o una endonucleasa química (Eisenschmidt, Lanio et al. 2005; Arimondo, Thomas et al. 2006). En las endonucleasas químicas, una escisión química o peptídica se conjuga con un polímero de ácidos nucleicos o con otro ADN que reconoce una secuencia diana específica, dirigiendo así la actividad de escisión a una secuencia específica. Las endonucleasas químicas también incluyen nucleasas sintéticas como conjugados de ortofenantrolina, una molécula de escisión del ADN, y oligonucleótidos formadores de tríplex (TFO), que se sabe que se unen a secuencias de ADN específicas (Kalish y Glazer 2005). Las endonucleasas de sitio de corte poco frecuente pueden usarse para inactivar genes un locus o para integrar transgenes mediante recombinación homóloga (HR), es decir, induciendo roturas bicatenarias de ADN (DSB) en un locus y la inserción de ADN exógeno en este locus mediante un mecanismo de reparación génica (Perrin, Buckle et al. 1993; Rouet, Smih et al. 1994; Choulika, Perrin et al. 1995; Pingoud y Silva 2007).
- Por "nucleasa TALE" (TALEN) se entiende una proteína de fusión que consiste en un dominio de unión a ácido nucleico derivado normalmente de un efector de tipo activador de la transcripción (TALE) y un dominio catalítico de nucleasa para escindir una secuencia diana de ácido nucleico. El dominio catalítico es preferentemente un dominio nucleasa y más preferentemente un dominio que tiene actividad endonucleasa, como, por ejemplo, I-Tevl, CoIE7, NucA y Fok-I. En una realización particular, el dominio TALE puede fusionarse con una meganucleasa como, por ejemplo, I-Crel e I-Onul o una variante funcional de las mismas. En una realización más preferida, dicha nucleasa es una nucleasa TALE monomérica. Una nucleasa TALE monomérica es una nucleasa TALE que no requiere dimerización para el reconocimiento y la escisión específicos, tal como las fusiones de repeticiones de TAL genomanipuladas con el dominio catalítico de I-Tevl descritas en el documento WO2012138927. El efector de tipo activador de la transcripción (TALE) son proteínas de la especie bacteriana Xanthomonas que comprenden una pluralidad de secuencias repetidas, comprendiendo cada repetición di­ residuos en la posición 12 y 13 (RVD) que son específicos para cada base nucleotídica de la secuencia diana de ácido nucleico. Los dominios de unión con propiedades modulares de unión a ácidos nucleicos base por base (MBBBD) similares también pueden derivarse de nuevas proteínas modulares descubiertas recientemente por el Solicitante en una especie bacteriana diferente. Las nuevas proteínas modulares tienen la ventaja de mostrar más variabilidad de secuencia que las repeticiones TAL. Preferentemente, los RVD asociados con el reconocimiento de los diferentes nucleótidos son HD para reconocer C, NG para reconocer T, NI para reconocer A, NN para reconocer G o A, NS para reconocer A, C, G o T, HG para reconocer T, IG para reconocer T, NK para reconocer G, HA para reconocer C, ND para reconocer C, HI para reconocer C, HN para reconocer G, NA para reconocer G, SN para reconocer G o A e YG para reconocer T, TL para reconocer A, Vt para reconocer A o G y SW para reconocer A. En otra realización, los aminoácidos críticos 12 y 13 pueden mutar hacia otros residuos de aminoácidos para modular su especificidad hacia los nucleótidos A, T, C y G, y en particular para mejorar esta especificidad. La nucleasa TALE ya se ha descrito y utilizado para estimular el direccionamiento génico y las modificaciones génicas (Boch, Scholze et al. 2009; Moscou y Bogdanove 2009; Christian, Cermak et al. 2010; Li, Huang et al. 2011). Están disponibles nucleasas TALE genomanipuladas con el nombre comercial TALEN™ (Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013 Paris, Francia) y pueden solicitarse a fabricantes, tales como Life Technologies (Carlsbad, California, e E.UU.).
Las nucleasas TALE preferidas que reconocen y escinden la secuencia diana se describen en el documento WO2015/075195. En particular, se puede introducir además un dominio catalítico adicional en la célula con dicha endonucleasa de sitio de corte poco frecuente para aumentar la mutagénesis con el fin de mejorar su capacidad para inactivar genes diana. Más particularmente, dicho dominio catalítico adicional es una enzima de procesamiento de extremos de ADN. Los ejemplos no limitantes de enzimas de procesamiento de extremos de ADN incluyen exonucleasas 5-3', exonucleasas 3-5', exonucleasas alcalinas 5-3', endonucleasas de aleta 5', helicasas, hosfatasa, hidrolasas y ADN polimerasas independientes de plantilla. Los ejemplos no limitantes de dicho dominio catalítico comprenden un dominio de proteína o un derivado catalíticamente activo del dominio de proteína seleccionado del grupo que consiste en hExol (EXO1_HUMAN), levadura Exol (EXO1_YEAST), Exol de E. coli, TREX2 humano, TREX1 de ratón, TREX1 humano, TREX1 bovino, TREX1 de rata, TdT (desoxinucleotidil transferasa terminal) DNA2 humano, DNA2 de levadura (DNA2_YEAST). En un caso preferido, dicho dominio catalítico adicional tiene una actividad exonucleasa 3'-5' y, en un caso más preferido, dicho dominio catalítico adicional es TREX, más preferentemente el dominio catalítico TREX2 (documento WO2012/058458). En otro caso preferido, dicho dominio catalítico está codificado por un polipéptido TREX2 monocatenario. Dicho dominio catalítico adicional puede fusionarse con una proteína de fusión de nucleasa o proteína quimérica descrita en el presente documento opcionalmente mediante un enlazador peptídico.
- Por "endonucleasa Cas9" se refiere a cualquier herramienta de ingeniería del genoma desarrollada basándose en la nucleasa Cas9 guiada por ARN (Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chylinski et al. 2012; Cong, Ran et al. 2013; Mali, Yang et al. 2013) del sistema inmunitario adaptativo CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas) procariótica de tipo II (véase para revisión (Sorek, Lawrence et al.
2013)). El sistema asociado a CRISPR (Cas) se descubrió primero en bacterias y actúa como defensa frente a ADN extraño, ya sea vírico o plasmídico. La ingeniería del genoma mediada por CRISPR procede en primer lugar mediante la selección de la secuencia diana a menudo flanqueada por un motivo de secuencia corta, denominado motivo adyacente al protoespaciador (PAM). Después de la selección de la secuencia diana, se genomanipula un ARNcr específico, complementario a esta secuencia diana. El ARNcr trans-activador (ARNtracr) requerido en los sistemas CRISPR de tipo II se empareja con el ARNcr y se une a la proteína Cas9 proporcionada. Cas9 actúa como un ancla molecular facilitando el emparejamiento de bases de ARNtrac con ARNc (Deltcheva, Chylinski et al. 2011). En este complejo ternario, la estructura doble de ARNtrac:ARNcr actúa como un ARN guía que dirige la endonucleasa Cas9 a la secuencia diana afín. El reconocimiento de la diana por el complejo Cas9-ARNtracr:ARNcr se inicia barriendo la secuencia diana para determinar la homología entre la secuencia diana y el ARNcr. Además de la complementariedad entre la secuencia diana y el ARNcr, el direccionamiento al ADN requiere la presencia de un motivo corto adyacente al protoespaciador (motivo adyacente al protoespaciador-PAM). Después del emparejamiento entre el ARN doble y la secuencia diana, Cas9 introduce posteriormente una rotura bicatenaria roma 3 bases cadena arriba del motivo PAM (Garneau, Dupuis et al., 2010). El uso de Cas9 en células inmunes, especialmente en linfocitos T, se ha descrito previamente en el documento WO2014191128.
Modificación de linfocitos T inactivando al menos un gen que codifica un componente del receptor de linfocitos T (TCR)
De acuerdo con un aspecto, los linfocitos T dotados de CAR anti-CLL1 de la presente invención se pueden hacer menos alorreactivos, por ejemplo, inactivando al menos un gen que expresa uno o más componentes del receptor de linfocitos T (TCR) como se describe en el documento WO 2013/176915. Esta inactivación puede combinarse con la de otro gen, tal como de un gen que codifica o regula la expresión de la proteína HLA o p2m. Por consiguiente, el riesgo del síndrome de injerto contra huésped y rechazo del injerto se reduce significativamente.
Los métodos para hacer que las células sean menos alogénicas pueden comprender la etapa de inactivar al menos un gen que codifica un componente del receptor de linfocitos T (TCR), en particular los genes TCRalfa y/o TCRbeta.
Métodos divulgados en el documento WO2013/176915 para preparar células inmunes que expresan CAR adecuadas para trasplante alogénico, inactivando uno o más componentes del receptor de linfocitos T (TCR).
La presente invención incluye una célula inmune que expresa CAR anti-CLL1, en donde al menos un gen que expresa uno o más componentes del receptor de linfocitos T (TCR) se ha inactivado. Por lo tanto, la presente invención proporciona un linfocito T que expresa CAR anti-CLL1, en donde al menos un gen que expresa uno o más componentes del receptor de linfocitos T (TCR) está inactivo.
Al inactivar un gen de TCR se pretende que el gen de interés no se exprese en forma de proteína funcional. En realizaciones particulares, la modificación genética del método se basa en la expresión, en células proporcionadas para genomanipulación, de una endonucleasa de sitio de corte poco frecuente de tal forma que dicha endonucleasa de sitio de corte poco frecuente cataliza específicamente la escisión en un gen diana, inactivando de ese modo dicho gen diana. Las roturas de la cadena de ácido nucleico causadas por la endonucleasa de sitio de corte poco frecuente se reparan habitualmente a través de los distintos mecanismos de recombinación homóloga o unión de extremos no homólogos (NHEJ). Sin embargo, la NHEJ es un proceso de reparación imperfecto que a menudo da como resultado cambios en la secuencia de ADN en el sitio de la escisión. Los mecanismos implican que se vuelvan a unir lo que queda de los dos extremos del ADN a través de la re-ligadura directa (Critchlow y Jackson 1998) o mediante la llamada unión de los extremos mediada por microhomología (Betts, Brenchley et al., 2003; Ma, Kim et al. 2003). La reparación a través de la unión de extremos no homólogos (NHEJ) a menudo da como resultado pequeñas inserciones o deleciones, y se puede utilizar para la creación de supresiones génicas específicas. Dicha modificación puede ser una sustitución, deleción o adición de al menos un nucleótido. Las células en las que se produce un evento de mutagénesis inducida por escisión, es decir, un evento de mutagénesis consecutivo a un evento de NHEJ, pueden identificarse y/o seleccionarse mediante un método bien conocido en la técnica. En un caso particular, la etapa de inactivar al menos un gen que codifica un componente del receptor de linfocitos T (TCR) en las células de cada muestra individual comprende introducir en la célula una endonucleasa de sitio de corte poco frecuente capaz de alterar al menos un gen que codifica un componente del receptor de linfocitos T (TCR). En un caso más particular, dichas células de cada muestra individual se transforman con ácido nucleico que codifica una endonucleasa de sitio de corte poco frecuente capaz de alterar al menos un gen que codifica un componente del receptor de linfocitos T (TCR), y dicha endonucleasa de sitio de corte poco frecuente se expresa en dichas células. En un caso preferido, dicho método de genomanipulación adicional de las células inmunes implica la introducción en dichos linfocitos T de polinucleótidos, en particular ARNm, que codifican la endonucleasa de sitio de corte poco frecuente específica para inactivar selectivamente los genes mencionados anteriormente mediante escisión del ADN. En un caso más preferido, dichas endonucleasas de sitio de corte poco frecuente son nucleasas TALE o endonucleasa Cas9. Las nucleasas TAL han demostrado hasta ahora una mayor especificidad y eficiencia de escisión sobre los otros tipos de endonucleasas de sitio de corte poco frecuente, lo que las convierte en las endonucleasas de elección para la producción de células inmunes genomanipuladas a gran escala con una rotación constante.
De acuerdo con la invención, las células inmunes de CAR anti-CLL1 con uno o más componentes del receptor de linfocitos T (TCR) inactivado están destinadas a utilizarse como medicamento.
Linfocitos T resistentes a fármacos
De acuerdo con otro aspecto, las células inmunes que expresan CAR anti-CLL1 de la invención pueden genomanipularse adicionalmente para hacerlas resistentes a fármacos inmunosupresores o tratamientos de quimioterapia, que se utilizan como cuidado estándar para tratar el cáncer asociado con células neoplásicas positivas para CLL1, especialmente AML.
Se han desarrollado varios agentes citotóxicos (fármacos contra el cáncer) tales como antimetabolitos, agentes alquilantes, antraciclinas, inhibidores de la ADN metiltransferasa, compuestos de platino y venenos del huso para destruir células cancerosas. Sin embargo, la introducción de estos agentes con terapias novedosas, tales como las inmunoterapias, es problemática. Por ejemplo, los agentes de quimioterapia pueden ser perjudiciales para el establecimiento de células inmunocompetentes antitumorales robustas debido a los perfiles de toxicidad no específicos de los agentes. Las terapias basadas en moléculas pequeñas que se dirigen a las rutas de proliferación celular también pueden obstaculizar el establecimiento de la inmunidad antitumoral. Si los regímenes de quimioterapia que son transitoriamente eficaces se pueden combinar con nuevas terapias celulares inmunocompetentes, entonces se podría lograr una mejora significativa en la terapia antineoplásica (para una revisión (Dasgupta, McCarty et al. 2011).
Para mejorar la terapia contra el cáncer y el injerto selectivo de células inmunes alogénicas, se confiere resistencia a fármacos a dichas células alogénicas para protegerlas de los efectos secundarios tóxicos de los agentes de quimioterapia. La resistencia a los fármacos de las células inmunes también permite su enriquecimiento in vivo o ex vivo, ya que los linfocitos T que expresan el gen de resistencia a fármacos sobrevivirán y se multiplicarán en relación con las células sensibles a los fármacos.
En el documento WO2015/075195 se divulgan métodos para genomanipular células inmunes resistentes a agentes quimioterapéuticos.
En particular, en el presente documento se describe un método de genomanipulación de células alogénicas adecuadas para inmunoterapia, en donde al menos un gen que codifica un componente del receptor de linfocitos T (TCR) se inactiva y un gen se modifica para conferir resistencia al fármaco que comprende:
- Proporcionar un linfocito T que expresa scCAR anti-CLL1; que expresa un linfocito T,
- Modificar dicho linfocito T que expresa scCAR anti-CLL1 inactivando al menos un gen que codifica un componente del receptor de linfocitos T (TCR);
- Modificar dicho linfocito T que expresa scCAR anti-CLL1, preferentemente scCAR CLL1 humanizado, para conferir resistencia a fármacos a dicho linfocito T que expresa scCAR anti-CLL1;
- Expandir dicho linfocito T que expresa scCAR anti-CLL1 genomanipulado en presencia de dicho fármaco.
Como alternativa, la presente divulgación se refiere a un método que comprende:
- Proporcionar un linfocito T que expresa scCAR anti-CLL1; preferentemente scCAR CLL1 humanizado;
- Modificar dicho linfocito T que expresa scCAR anti-CLL1 para conferir resistencia a fármacos a dicho linfocito T que expresa scCAR anti-CLL1;
- Modificar dicho linfocito T que expresa scCAR anti-CLL1 inactivando al menos un gen que codifica un componente del receptor de linfocitos T (TCR);
- Expandir dicho linfocito T que expresa scCAR anti-CLL1 genomanipulado en presencia de dicho fármaco.
En particular, la presente divulgación también se refiere a un método de genomanipulación de células alogénicas adecuadas para inmunoterapia, en donde al menos un gen que codifica un componente del receptor de linfocitos T (TCR) se inactiva y un gen se modifica para conferir resistencia al fármaco que comprende:
- Proporcionar un linfocito T que expresa scCAR anti-CLL1; preferentemente scCAR CLL1 humanizado;
- Modificar dicho linfocito T que expresa scCAR anti-CLL1 inactivando al menos un gen que codifica un componente del receptor de linfocitos T (TCR);
- Modificar dicho linfocito T que expresa scCAR anti-CLL1 para conferir resistencia a fármacos a dicho linfocito T que expresa scCAR anti-CLL1;
- Expandir dicho linfocito T que expresa scCAR anti-CLL1 genomanipulado en presencia de dicho fármaco.
Como alternativa, la presente divulgación se refiere a un método que comprende:
- Proporcionar un linfocito T que expresa scCAR anti-CLL1; preferentemente scCAR CLL1 humanizado;
- Modificar dicho linfocito T que expresa scCAR anti-CLL1 para conferir resistencia a fármacos a dicho linfocito T que expresa scCAR anti-CLL1;
- Modificar dicho linfocito T que expresa scCAR anti-CLL1 inactivando al menos un gen que codifica un componente del receptor de linfocitos T (TCR);
- Expandir dicho linfocito T que expresa scCAR anti-CLL1 genomanipulado en presencia de dicho fármaco.
Expresión de genes de resistencia a fármacos en células inmunes que expresan scCAR anti-CLL1
En una realización particular, dicha resistencia a fármacos se puede conferir al linfocito T mediante la expresión de al menos un gen de resistencia a fármacos. Dicho gen de resistencia a fármacos se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica la "resistencia" a un agente, tal como un agente quimioterapéutico (por ejemplo, metotrexato). En otras palabras, la expresión del gen de resistencia a fármacos en una célula permite la proliferación de las células en presencia del agente en mayor medida que la proliferación de una célula correspondiente sin el gen de resistencia a fármacos. La expresión del gen de resistencia a fármacos en una célula permite la proliferación de las células en presencia del agente y no afecta a su actividad. Un gen de resistencia a fármacos de la invención puede codificar resistencia a antimetabolito, metotrexato, vinblastina, cisplatino, agentes alquilantes, antraciclinas, antibióticos citotóxicos, antiinmunofilinas, sus análogos o derivados, y similares.
En una realización, un gen de resistencia a fármacos de la invención puede conferir resistencia a un fármaco (o un agente), en particular, un fármaco contra el cáncer seleccionado de aracitina, arabinósido de citosina, amsacrina, daunorrubicina, idarrubicina, novantrona, mitoxantrona, vepesid, etopósido (VP16), trioxido de arsénico, ácido transretinoico, combinación de trioxido de arsénico, ácido transretinoico, mecloretamina, procarbazina, clorambucilo, citarabina, antraciclinas, 6-tioguanina, hidroxiurea, prednisona, y una combinación de los mismos.
Se han identificado varios genes de resistencia a los fármacos que pueden usarse potencialmente para conferir resistencia a los fármacos a las células diana (Takebe, Zhao et al. 2001; Sugimoto, Tsukahara et al. 2003; Zielske, Reese et al. 2003; Nivens, Felder et al. 2004; Bardenheuer, Lehmberg et al. 2005; Kushman, Kabler et al. 2007). Un ejemplo de gen de resistencia a fármacos también puede ser una forma mutante o modificada de dihidrofolato reductasa (DHFR). La DHFR es una enzima involucrada en la regulación de la cantidad de tetrahidrofolato en la célula y es esencial para la síntesis de ADN. Los análogos de folato tal como metotrexato (MTX), inhiben la DHFR y, por lo tanto, se utilizan como agentes antineoplásicos en la clínica. Se han descrito diferentes formas mutantes de DHFR que tienen una mayor resistencia a la inhibición por anti-folatos usados en terapia. En una realización particular, el gen de resistencia a fármacos de acuerdo con la presente invención puede ser una secuencia de ácido nucleico que codifica una forma mutante de DHFR de tipo silvestre humana (GenBank: AAH71996.1) que comprende al menos una mutación que confiere resistencia a un tratamiento anti-folato, tal como metotrexato. En una realización particular, la forma mutante de DHFR comprende al menos un aminoácido mutado en la posición G15, L22, F31 o F34, preferentemente en las posiciones L22 o F31 (Schweitzer, Dicker et al. 1990); solicitud internacional WO94/24277; patente de EE.UU. US 6.642.043). En una realización particular, dicha forma mutante de DHFR comprende dos aminoácidos mutados en la posición L22 y F31. La correspondencia de las posiciones de los aminoácidos descritas en el presente documento se expresa con frecuencia en términos de las posiciones de los aminoácidos de la forma del polipéptido DHFR de tipo silvestre expuesta en GenBank: AAH71996.1. En una realización particular, el residuo de serina en la posición 15 se reemplaza preferentemente por un residuo de triptófano. En otra realización particular, el residuo de leucina en la posición 22 se reemplaza preferentemente por un aminoácido que alterará la unión de DHFR mutante a los antifolatos, preferentemente con residuos de aminoácidos no cargados tales como fenilalanina o tirosina. En otra realización particular, el residuo de fenilalanina en las posiciones 31 o 34 se reemplaza preferentemente por un pequeño aminoácido hidrófilo tal como alanina, serina o glicina.
Como se usan en el presente documento, "agente antifolato" o "análogos de folato" se refieren a una molécula dirigida para interferir con la ruta metabólica del folato en algún nivel. Ejemplos de agentes antifolato incluyen, por ejemplo, metotrexato (MTX); aminopterina; trimetrexato (Neutrexin™); edatrexato; ácido N10-propargil-5,8didesazafólico (CB3717); ZD1694 (Tumodex), ácido 5,8-didesazaisofólico (IAHQ); ácido 5,10-didesazatetrahidrofólico (DDATHF); ácido 5-desazafólico; PT523 (N alfa-(4-amino-4-desoxipteroil)-N deltahemiftaloil-L-ornitina); 10-etil-10-desazaaminopterina (DDATHF, lomatrexol); piritrexim; 10-EDAM; z D1694; GW1843; Pemetrexato y PDX (10-propargil-10-desazaaminopterina).
Otro ejemplo de gen de resistencia a fármacos también puede ser una forma mutante o modificada de ionisina-5'-monofosfato deshidrogenasa II (IMPDH2), una enzima limitante de la velocidad en la síntesis de novo de nucleótidos de guanosina. La forma mutante o modificada de IMPDH2 es un gen de resistencia al inhibidor de IMPDH. Los inhibidores de IMPDH pueden ser ácido micofenólico (MPA) o su profármaco micofenolato mofetilo (MMF). La IMPDH2 mutante puede comprender al menos una, preferentemente dos mutaciones en el sitio de unión a MAP de la IMPDH2 humana de tipo silvestre (NP_000875.2) que conduce a una resistencia significativamente aumentada al inhibidor de IMPDH. Las mutaciones se encuentran preferentemente en las posiciones T333 y/o S351 (Yam, Jensen et al. 2006; Sangiolo, Lesnikova et al. 2007; Jonnalagadda, Brown et al. 2013). En una realización particular, el residuo de treonina en la posición 333 se reemplaza por un residuo de isoleucina y el residuo de serina en la posición 351 se reemplaza por un residuo de tirosina. La correspondencia de las posiciones de los aminoácidos descritas en el presente documento se expresa con frecuencia en términos de las posiciones de los aminoácidos de la forma del polipéptido IMPDH2 humano de tipo silvestre expuesta en NP_000875.2.
Otro gen de resistencia a fármacos es la forma mutante de calcineurina. La calcineurina (PP2B), una proteína fosfatasa de serina/treonina expresada de manera ubicua que está involucrada en muchos procesos biológicos y que es fundamental para la activación de linfocitos T. La calcineurina es un heterodímero compuesto por una subunidad catalítica (CnA; tres isoformas) y una subunidad reguladora (CnB; dos isoformas). Después de la participación del receptor de linfocitos T, la calcineurina desfosforila el factor de transcripción NFAT, lo que le permite translocarse al núcleo y al gen diana clave activo, tal como IL2. FK506 en complejo con FKBP12, o ciclosporina A (CsA) en complejo con CyPA bloquean el acceso de NFAT al sitio activo de la calcineurina, evitando su desfosforilación e inhibiendo de este modo la activación de linfocitos T (Brewin, Mancao et al. 2009). El gen de resistencia a fármacos de la presente invención puede ser una secuencia de ácido nucleico que codifica una forma mutante de calcineurina resistente al inhibidor de calcineurina tal como FK506 y/o CsA. En una realización particular, dicha forma mutante puede comprender al menos un aminoácido mutado del heterodímero a de calcineurina de tipo silvestre en las posiciones: V314, Y341, M347, T351, W352, L354, K360, preferentemente mutaciones dobles en las posiciones T351 y L354 o V314 y Y341. En una realización particular, el residuo de valina en la posición 341 se puede reemplazar por un residuo de lisina o arginina, el residuo de tirosina en la posición 341 se puede reemplazar por un residuo de fenilalanina; la metionina en la posición 347 se puede reemplazar por el residuo de ácido glutámico, arginina o triptófano; la treonina en la posición 351 se puede reemplazar por el residuo de ácido glutámico; el residuo de triptófano en la posición 352 se puede reemplazar por un residuo de cisteína, ácido glutámico o alanina, la serina en la posición 353 se puede reemplazar por el residuo de histidina o asparagina, la leucina en la posición 354 se puede reemplazar por un residuo de alanina; la lisina en la posición 360 se puede reemplazar por un residuo de alanina o fenilalanina de una secuencia correspondiente a GenBank: ACX34092.1. La correspondencia de las posiciones de los aminoácidos descritas en el presente documento se expresa frecuentemente en términos de las posiciones de los aminoácidos de la forma de un polipéptido heterodímero a de calcineurina humana de tipo silvestre expuesta en (GenBank: ACX34092.1).
En otra realización particular, dicha forma mutante puede comprender al menos un aminoácido mutado del heterodímero b de calcineurina de tipo silvestre en las posiciones: V120, N123, L124 o K125, preferentemente mutaciones dobles en las posiciones L124 y K125. En una realización particular, la valina en la posición 120 se puede reemplazar por una serina, un ácido aspártico, residuo de fenilalanina o leucina; la asparagina en la posición 123 se puede reemplazar por un triptófano, lisina, fenilalanina, arginina, histidina o serina; la leucina en la posición 124 se puede reemplazar por un residuo de treonina; la lisina en la posición 125 se puede reemplazar por una alanina, un ácido glutámico, triptófano, o se pueden añadir dos residuos tales como leucina-arginina o isoleucinaácido glutámico después de la lisina en la posición 125 en la secuencia de aminoácidos correspondiente a GenBank: ACX34095.1. La correspondencia de las posiciones de los aminoácidos descritas en el presente documento se expresa frecuentemente en términos de las posiciones de los aminoácidos de la forma de un polipéptido heterodímero b de calcineurina humana de tipo silvestre expuesta en (GenBank: ACX34095.1).
Otro gen de resistencia a fármacos es la 0(6)-metilguanina metiltransferasa (MGMT) que codifica la alquil guanina transferasa humana (hAGT). La AGT es una proteína de reparación del ADN que confiere resistencia a los efectos citotóxicos de los agentes alquilantes, tales como las nitrosoureas y la temozolomida (TMZ). La 6-bencilguanina (6-BG) es un inhibidor de AGT que potencia la toxicidad de la nitrosourea y se administra conjuntamente con TMZ para potenciar los efectos citotóxicos de este agente. Varias formas mutantes de MGMT que codifican variantes de AGT son altamente resistentes a la inactivación por 6-BG, pero conservan su capacidad para reparar el daño del ADN (Maze, Kurpad et al. 1999). En una realización particular, la forma mutante de AGT puede comprender un aminoácido mutado de la posición P140 de AGT de tipo silvestre, en la secuencia de aminoácidos tal como se divulga en la base de datos Uniprot con la referencia P16455. En una realización preferida, dicha prolina en la posición 140 se reemplaza por un residuo de lisina.
Otro gen de resistencia a fármacos puede ser el gen de la proteína 1 de resistencia a múltiples fármacos (MDR1).
Este gen codifica una glucoproteína de membrana, conocida como glucoproteína P (P-GP), involucrada en el transporte de subproductos metabólicos a través de la membrana celular. La proteína P-Gp muestra una amplia especificidad hacia varios agentes de quimioterapia estructuralmente no relacionados.
Se ha descrito que la sobreexpresión de la proteína 1 de resistencia a múltiples fármacos confiere resistencia a fármacos tal como mitoxantrona (Charles S. Morrow, Christina Peklak-Scott, Bimjhana Bishwokarma, Timothy E. Kute, Pamela K. Smitherman, y Alan J. Townsend. Multidrug Resistance Protein 1 (MRP1, ABCC1) Mediates Resistance to Mitoxantrone via Glutathione-Dependent Drug Efflux Mol Pharmacol abril de 200669:1499-1505). Por lo tanto, se puede conferir resistencia a fármacos a las células mediante la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica MDR-1 (NP_000918).
Otra forma más de preparar células resistentes a fármacos es preparar células con una o más mutaciones específicas, tales como mutaciones en Arg486 y Glu571 en el gen de la topoisomerasa II humana, para conferir resistencia a amsacrina (S. PATEL, B. A. KELLER, y L. M. FISHER. 2000. MOLECULAR PHARMACOLOGY. Vol 57: pág. 784-791 (2000).
Otra forma más de preparar células resistentes a fármacos es preparar células que sobreexpresan microARN-21 para conferir resistencia a daunorrubicina (Involvement of miR-21 in resistance to daunorubicin by regulating PTEN expression in the leukaemia K562 cell line Bai, Haitao et al. FEBS Letters, Volumen 585, Edición 2, 402 - 408). En una realización preferida, las células que portan tal ARNm o proteína que confieren resistencia a fármacos también comprenden un ARNm inhibidor o un gen cuya expresión está condicionada, permitiendo la destrucción selectiva de dichas células resistentes a fármacos en presencia de dicho fármaco o tras la administración de dicho fármaco.
El gen de resistencia a fármacos también puede conferir resistencia a antibióticos citotóxicos y puede ser un gen ble o un gen mcrA. La expresión ectópica del gen ble o mcrA en una célula inmune proporciona una ventaja selectiva cuando se expone al agente quimioterapéutico, respectivamente, la bleomicina o la mitomicina C.
El enfoque más práctico para la terapia génica es la adición de un gen para genomanipular linfocitos T mediante el uso de administración de genes eficiente con vectores, preferentemente un vector viral. Por lo tanto, en una realización particular, dicho gen de resistencia a fármacos puede expresarse en la célula introduciendo un transgén codificado preferentemente por al menos un vector en una célula.
En una realización, las células que portan un gen de resistencia a fármacos o un gen modificado que confiere resistencia a un fármaco también comprenden un gen suicida inducible, cuya inducción provoca la muerte celular, lo que permite su destrucción selectiva.
La inserción aleatoria de genes en el genoma puede conducir a la expresión inapropiada del gen insertado o del gen cerca del sitio de inserción. La terapia génica específica que usa recombinación homóloga de ácido nucleico exógeno que comprende secuencias endógenas para dirigir genes a sitios específicos dentro del genoma puede permitir la genomanipulación de linfocitos T seguros. Como se ha descrito anteriormente, la etapa de modificación genética del método puede comprender una etapa de introducción en las células de un ácido nucleico exógeno que comprende al menos una secuencia que codifica el gen de resistencia a fármacos y una porción de un gen endógeno de manera que se produce una recombinación homóloga entre el gen endógeno y el ácido nucleico exógeno. En una realización particular, dicho gen endógeno puede ser el gen de "resistencia a fármacos" de tipo silvestre, de manera que, después de la recombinación homóloga, el gen de tipo silvestre se reemplaza por la forma mutante del gen que confiere resistencia a fármacos.
Se sabe que las roturas endonucleolíticas estimulan la velocidad de recombinación homóloga. Por lo tanto, en una realización particular, el método de la invención comprende además la etapa de expresar en la célula una endonucleasa de sitio de corte poco frecuente que sea capaz de escindir una secuencia diana dentro de un gen endógeno. Dicho gen endógeno puede codificar, por ejemplo, DHFR, IMPDH2, calcineurina o AGT. Dicha endonucleasa de sitio de corte poco frecuente puede ser una nucleasa TALE, una nucleasa de dedo de cinc, una endonucleasa CRISPR/Cas9, una nucleasa MBBBD o una meganucleasa.
Inactivación de genes de sensibilización a fármacos en células inmunes que expresan CAR anti-CLL1
En otra realización particular, dicha resistencia a fármacos se puede conferir a la célula de la invención (célula inmune que expresa CAR anti-CLL1) mediante la inactivación de un gen de sensibilización a fármaco.
El inventor buscó inactivar un gen potencial de sensibilización a fármacos para genomanipular linfocitos T para inmunoterapia, en particular para genomanipular células inmunes que expresan CAR anti-CLL1 que se pueden usar en combinación con un agente terapéutico (fármaco contra el cáncer).
Al inactivar un gen se pretende que el gen de interés no se exprese en forma de proteína funcional. En una realización particular, la modificación genética del método se basa en la expresión, en células proporcionadas para genomanipulación, de una endonucleasa de sitio de corte poco frecuente de tal forma que dicha endonucleasa de sitio de corte poco frecuente cataliza específicamente la escisión en un gen diana, inactivando de ese modo dicho gen diana. En una realización particular, la etapa de inactivar al menos un gen de sensibilización a fármacos comprende introducir en la célula una endonucleasa de sitio de corte poco frecuente capaz de alterar al menos un gen de sensibilización a fármacos. En una realización más particular, dichas células se transforman con ácido nucleico que codifica una endonucleasa de sitio de corte poco frecuente capaz de romper un gen de sensibilización a fármacos, y dicha endonucleasa de sitio de corte poco frecuente se expresa en dichas células. Dicha endonucleasa de sitio de corte poco frecuente puede ser una meganucleasa, una nucleasa de dedo de cinc, una nucleasa CRISPR/Cas9, una nucleasa MBBBd o una nucleasa TALE. En una realización preferida, dicha endonucleasa de sitio de corte poco frecuente es una nucleasa TALE.
En una realización preferida, el gen de sensibilización a fármacos que puede inactivarse para conferir resistencia a fármacos al linfocito T es el gen de desoxicitidina cinasa humana (dCK). Esta enzima es necesaria para la fosforilación de los desoxirribonucleósidos desoxicitidina (dC), desoxiguanosina (dG) y desoxiadenosina (dA). Los análogos de nucleótidos de purina (PNA) son metabolizados por dCK en PNA mono, di y trifosfato. Sus formas trifosfato y particularmente el trifosfato de clofarabina compiten con el ATP por la síntesis de ADN, actúan como agente proapoptótico y son potentes inhibidores de la ribonucleótido reductasa (RNR), que participa en la producción de trinucleótidos.
Preferentemente, la inactivación de dCK en linfocitos T está mediada por la nucleasa TALE. Para conseguir este objetivo, se han diseñado varios pares de nucleasa TALE de dCK, ensamblados a nivel de polinucleótidos y validados por secuenciación. En el documento WO2015/075195 se representan ejemplos de pares de nucleasa TALE que se pueden usar de acuerdo con la invención.
Esta inactivación de dCK en los linfocitos T confiere resistencia a análogos de nucleósidos de purina (PNA) tales como clofarabina, fludarabina o decitabina (Dacogen).
En otra realización preferida, la inactivación de dCK en los linfocitos T se combina con una inactivación de los genes TRAC que hacen que estos linfocitos T de doble desactivación (KO) sean tanto resistentes a fármacos como clofarabina, así como menos alogénicos. Esta doble característica es particularmente útil para un objetivo terapéutico, permitiendo células alogénicas "disponibles libremente" para inmunoterapia junto con quimioterapia para tratar pacientes con cáncer. Esta doble inactivación de KO dCK/TRAC se puede realizar de forma simultánea o secuencial. Un ejemplo de pares de nucleasa TALE dCK/TRAC que dieron éxito a la invención se describe en el documento WO2015/075195, en particular, las secuencias diana en los 2 loci (dCK y TRAC).
Otro ejemplo de enzima que puede inactivarse es el gen de la hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa humana (HPRT) (Genbank: M26434.1). En particular, HPRT puede inactivarse en linfocitos T genomanipulados para conferir resistencia a un metabolito citostático, la 6-tioguanina (6TG), que se convierte por HPRT en nucleótido de tioguanina citotóxico y que se usa actualmente para tratar pacientes con cáncer, en particular, leucemias (Hacke, Treger et al.
2013). Los análogos de guaninas son metabolizados por la HPRT transferasa que cataliza la adición de un resto fosforribosilo y permite la formación de análogos de TGMP guanina, incluyendo 6 mercaptopurina (6MP) y 6 tioguanina (6TG), y se utilizan normalmente como fármacos de depleción linfocítica para tratar las leucemias. Se metabolizan por HPRT (hipoxantina fosforribosil transferasa que cataliza la adición de la fracción fosforribosilo y permite la formación de TGMP. Sus fosforilaciones posteriores conducen a la formación de sus formas trifosforiladas que finalmente se integran en el ADN. Una vez incorporado en el ADN, el tio GTP afecta a la fidelidad de la replicación del ADN a través de su agrupación tiolato y genera mutaciones puntuales aleatorias que son altamente perjudiciales para la integridad celular.
Por lo tanto, la presente invención proporciona una célula que expresa scCAR anti-CLL1, en particular, un linfocito T que expresa scCAR anti-CLL1, en donde el scCAR tiene una secuencia polipeptídica de acuerdo con las SEQ ID No .53, 54, 55, 56, 57, 58, 83, 84, 85, 86, 87 u 88, y en donde el gen dCK está inactivado.
En otra realización, la inactivación del CD3 normalmente expresado en la superficie del linfocito T puede conferir resistencia a anticuerpos anti-CD3 tales como teplizumab.
Resistencia a múltiples fármacos de las células inmunes que expresan scCAR anti-CLL1
En otra realización particular, los inventores buscaron desarrollar una estrategia de inmunoterapia "disponible libremente", utilizando linfocitos T alogénicos, en particular, linfocitos T alogénicos anti-CLL1 que expresan scCAR resistentes a múltiples fármacos para mediar en la selección de linfocitos T genomanipulados cuando el paciente es tratado con diferentes fármacos. La eficacia terapéutica se puede mejorar significativamente mediante la ingeniería genética de linfocitos T alogénicos de resistencia a múltiples fármacos. Tal estrategia puede ser particularmente eficaz en el tratamiento de tumores que responden a combinaciones de fármacos que presentan efectos sinérgicos. Además, se pueden expandir y seleccionar múltiples linfocitos T genomanipulados resistentes mediante una dosis mínima de agentes farmacológicos.
Por lo tanto, el método de acuerdo con la presente divulgación puede comprender modificar el linfocito T para conferir resistencia a múltiples fármacos a dicho linfocito T. Dicha resistencia a múltiples fármacos se puede conferir expresando más de un gen de resistencia a fármacos o inactivando más de un gen de sensibilización a fármacos. En otro caso particular, la resistencia a múltiples fármacos se puede conferir a dicho linfocito T expresando al menos un gen de resistencia a fármacos e inactivando al menos un gen de sensibilización a fármacos. En particular, la resistencia a múltiples fármacos se puede conferir a dicho linfocito T expresando al menos un gen de resistencia a fármacos, tal como la forma mutante de DHFR, la forma mutante de IMPDH2, la forma mutante de calcineurina, la forma mutante de MGMT, el gen ble y el gen mcrA e inactivando al menos un gen de sensibilización a fármacos tal como el gen HPRT. En un caso preferido, se puede conferir resistencia a múltiples fármacos inactivando el gen HPRT y expresando una forma mutante de DHFR; o inactivando el gen HPRT y expresando una forma mutante de IMPDH2; o inactivando el gen HPRT y expresando una forma mutante de calcineurina; inactivando el gen HPRT y expresando una forma mutante de MGMT; inactivando el gen HPRT y expresando el gen ble; inactivando el gen HPRT y expresando el gen mcrA.
En una realización, la presente invención proporciona linfocitos T que expresan scCAR anti-CLL1 alogénicos que expresan más de un gen de resistencia a fármacos o en los que se inactiva más de un gen de sensibilización a fármacos.
Genes suicidas en células inmunes que expresan scCAR anti-CLL1
En algunos casos, dado que los linfocitos T genomanipulados pueden expandirse y persistir durante años después de la administración, puede ser deseable incluir un mecanismo de seguridad para permitir la deleción selectiva de los linfocitos T administrados. Por lo tanto, en algunos casos, el método de la divulgación puede comprender la transformación de dichos linfocitos T con un gen suicida recombinante. Dicho gen suicida recombinante se utiliza para reducir el riesgo de toxicidad directa y/o proliferación incontrolada de dichos linfocitos T una vez administrados a un sujeto (Quintarelli C, Vera F, blood 2007; Tey SK, Dotti G., Rooney C. M., boil blood marrow transplant 2007). Los genes suicidas permiten la deleción selectiva de células transformadas in vivo. En particular, el gen suicida tiene la capacidad de convertir un profármaco no tóxico en un fármaco citotóxico o de expresar el producto de expresión génica tóxico. En otras palabras, "gen suicida" es un ácido nucleico que codifica un producto, en donde el producto provoca la muerte celular por sí mismo o en presencia de otros compuestos.
Un ejemplo representativo de tal gen suicida es uno que codifica la timidina cinasa del virus del herpes simple. Ejemplos adicionales son la timidina cinasa del virus varicela zóster y el gen bacteriano citosina desaminasa que puede convertir la 5-fluorocitosina en el compuesto altamente tóxico 5-fluorouracilo. Los genes suicidas también incluyen como ejemplos no limitantes caspasa-9 o caspasa-8 o citosina desaminasa. La caspasa-9 se puede activar usando un inductor químico específico de dimerización (CID). Los genes suicidas también pueden ser polipéptidos que se expresan en la superficie de la célula y pueden hacer que las células sean sensibles a los anticuerpos monoclonales terapéuticos. Como se usa en el presente documento, "profármaco" significa cualquier compuesto útil en los métodos de la presente invención que puede convertirse en un producto tóxico. El profármaco se convierte en un producto tóxico mediante el producto génico del gen suicida en el método de la presente invención. Un ejemplo representativo de tal profármaco es el ganciclovir, que se convierte in vivo en un compuesto tóxico mediante la timidina cinasa del VHS. El derivado de ganciclovir posteriormente es tóxico para las células tumorales. Otros ejemplos representativos de profármacos incluyen aciclovir, FIAU [1-(2-desoxi-2-fluoro-p-D-arabinofuranosil)-5-yodouracilo], arabinósido de 6-metoxipurina para VZV-TK, y 5-fluorocitosina para citosina desaminasa.
Un sistema de genes suicidas preferido emplea un polipéptido antigénico recombinante que comprende un motivo antigénico reconocido por el mAb anti-CD20 Rituximab, especialmente QBen10, tal como en el llamado polipéptido RQR8 descrito en el documento WO2013153391, que se expresa independientemente del CAR anti-CLL1. Rituximab, un fármaco de anticuerpo autorizado, se puede utilizar posteriormente para la depleción celular cuando sea necesario.
En una realización, la presente invención proporciona linfocitos T que expresan scCAR anti-CLL1 alogénicos que expresan más de un gen de resistencia a fármacos o en los que se inactiva más de un gen de sensibilización a fármacos, y un gen suicida que permite destruir dichas células.
La resistencia de un fármaco puede conferirse mediante la inactivación de genes de sensibilización a fármacos o mediante la expresión de genes de resistencia a fármacos. Algunos ejemplos de fármacos que se adaptan a la invención son los análogos de nucleósidos de purina (PNA) tales como clofarabina o fludarabina, u otros fármacos tales como 6-mercaptopurina (6MP) y 6-tioguanina (6TG).
En un aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para genomanipular células inmunes para hacerlas resistentes a análogos de nucleótidos de purina (PNA), tales como clorofarabina o fludarabina, de modo que puedan usarse en tratamientos de inmunoterapia contra el cáncer en pacientes tratados previamente con estas quimioterapias convencionales.
La resistencia a los fármacos se puede conferir a los linfocitos T inactivando uno o más genes responsables de la sensibilidad de la célula al fármaco (gen o genes de sensibilización a fármacos), tales como los genes dcK y/o HPRT.
De acuerdo con otro aspecto, la resistencia a los fármacos se puede conferir a un linfocito T expresando un gen de resistencia a fármacos. Se han identificado alelos variantes de varios genes tales como dihidrofolato reductasa (DHFR), inosina monofosfato deshidrogenasa 2 (IMPDH2), calcineurina o metilguanina transferasa (MGMT), para conferir resistencia a fármacos a una célula de acuerdo con la invención.
Por ejemplo, CD52 y receptores de glucocorticoides (GR), que son dianas farmacológicas de Campath® (alemtuzumab) o tratamientos con rituximab y glucocorticoides, pueden inactivarse para hacer que las células sean resistentes a estos tratamientos y darles una ventaja competitiva sobre los linfocitos T del propio paciente no dotados de scCAR anti-CLL1 específicos. La expresión del gen CD3 también se puede suprimir o reducir para conferir resistencia al teplizumab, que es otro fármaco inmunosupresor. La expresión de HPRt también se puede suprimir o reducir para conferir resistencia a la 6-tioguanina, un agente citostático comúnmente utilizado en quimioterapia, especialmente para el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda.
Células genomanipuladas de puntos de control inmunes
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, las células inmunes pueden manipularse adicionalmente para hacerlas más activas o limitar el agotamiento, inactivando genes que codifican proteínas que actúan como "puntos de control inmunes" que actúan como reguladores de la activación de linfocitos T, tales como el siguiente gen seleccionado de CTLA4, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, LAG3, HAVCR2, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1 (orblimp1), BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3, preferentemente, dicho gen es PDCD1 o CTLA-4. En la Tabla 9 también se indican ejemplos de genes cuya expresión podría reducirse o suprimirse.
La presente invención también proporciona linfocitos T alogénicos que expresan un scCAR anti-CLL1, en particular un anti-CLL1, en donde al menos un gen que expresa uno o más componentes del receptor de linfocitos T (TCR) está inactivado y/o un gen seleccionado de los genes CTLA4, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, La G3, HAVCR2, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1 (orblimp1), BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3, está inactivado como se hace referencia en el documento WO2014/184741.
En una realización, dicho gen es un gen que actúa como regulador de la activación de linfocitos T que codifica la proteína de microglobulina beta 2.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, las células inmunes de scCAR anti-CLL1 de la invención pueden manipularse adicionalmente para hacerlas resistentes a un fármaco, en particular a un fármaco utilizado durante la quimioterapia contra el cáncer, en particular un cáncer mediado por células que expresan CLL1 tal como AML. Esto se puede conseguir introduciendo un gen que confiera resistencia a dicho fármaco. Este mismo gen puede activarse y desactivarse mediante el uso de un sistema de inhibición/expresión inducible por genes como se ha descrito previamente (Garcia EL, Mills AA (2002) Getting around lethality with inducible Cre-mediated excision. Semin Cell Dev Biol 13:151-8, Lewandoski M (2001) Conditional control of gene expression in the mouse. Nat Rev Genet 2:743-55; Scharfenberger L, Hennerici T, Kirly G et al. (2014) Transgenic mouse technology in skin biology: Generation of complete or tissue-specific knockout mice. J Invest Dermatol 134:e16; Schwenk F, Kuhn R, Angrand PO et al. (1998) Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice. Nucleic Acids Res 26:1427-32
Por lo tanto, una célula inmune resistente a fármacos que expresa scCAR anti-CLL1, en donde (i) al menos un gen que expresa uno o más componentes del receptor de linfocitos T (TCR) está inactivado, (ii) al menos un gen que confiere resistencia a un fármaco se incorpora o un gen que confiere sensibilidad a dicho fármaco se suprime o se muta para inactivarlo, (iii) opcionalmente se inactiva otro gen seleccionado del gen divulgado en la siguiente tabla 9 -es un objetivo de la presente invención.
Las células inmunes de la presente invención o las líneas celulares pueden comprender además polinucleótidos recombinantes exógenos, en particular, scCAR o genes suicidas, o pueden comprender genes alterados o eliminados que codifican proteínas de punto de control o ligandos de las mismas que contribuyen a su eficacia como producto terapéutico, idealmente como un producto "disponible libremente".
Tabla 9: Lista de genes que codifican proteínas de puntos de control inmunes.
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Células Daudi resistentes a fármacos CLL1 /luc+ para ensayar la citotoxicidad de linfocitos T scCAR alogénicos resistentes a fármacos
La presente divulgación también incluye un método para fabricar células diana que expresan tanto un receptor de superficie específico para los linfocitos T scCAR como un gen de resistencia. Estas células diana son particularmente útiles para probar la citotoxicidad de los linfocitos T scCAR. Estas células son fácilmente resistentes a dosis clínicamente relevantes de clofarabina y albergan actividad luciferasa. Esta combinación de características permite rastrearlos in vivo en un modelo de ratón o destruirlos cuando sea necesario.
Más particularmente, se pueden usar para evaluar las propiedades de citotoxicidad de los linfocitos T resistentes a fármacos en ratones en presencia de clofarabina u otros PNA. Las células Daudi resistentes a clofarabina imitan el estado fisiológico de los pacientes con leucemia mieloide aguda (AML) con recidiva en la terapia de inducción, que albergan neoplasias de linfocitos B resistentes a fármacos. Por lo tanto, estas células son de gran interés para evaluar la fiabilidad y la citotoxicidad de los linfocitos T scCAR resistentes a fármacos. Preferentemente, estas células diana son células Daudi CLL1+ Luciferasa+.
Inserción de al menos un epítopo en el dominio extracelular del CAR monocatenario anti-CLL1
Un CAR anti-CLL1 de la invención puede incluir al menos la inserción de al menos un epítopo en el dominio extracelular de dicho CAR. Esto está destinado a agotar de manera tentadora las células inmunes dotadas con el CAR en caso de efectos adversos in vivo, tal como una tormenta de citocinas. Además, dicha inserción de epítopo o "etiquetado de epítopo" puede ser útil para clasificar o purificar las células inmunes manipuladas in vitro durante su proceso de fabricación. Dicho al menos un epítopo puede ser cualquier péptido antigénico que sea suficientemente inmunogénico para unirse a un anticuerpo que reconoce dicho péptido. Por ejemplo, esto se puede obtener, por ejemplo, insertando al menos una, y preferentemente dos copias de un mimótopo CD20, preferentemente de la secuencia CPYSNPSLCS (SEQ ID NO. 113), en la secuencia polipeptídica de CAR. Con fines de simplificación en lo sucesivo, el orden de los scFv desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal se presenta de la siguiente manera: la cadena VH y a continuación la cadena VL. Sin embargo, se puede prever en el alcance de la presente invención que este orden sea inverso: la cadena VL y a continuación la cadena VL.
En la figura 3 se representan esquemáticamente diferentes posiciones del al menos un mimótopo CD20 dentro del CAR anti-CLL1 de la invención. Dichas dos copias de un mimótopo CD20 se pueden unir entre sí y también al Vl mediante un enlazador. También se pueden insertar entre el scFv anti-CLL1 y la bisagra (tal como CD8alfa), utilizando un enlazador opcional. Los mimótopos CD20 pueden unirse mediante anticuerpos anti-CD20, tal como Rituximab (McLaughlin P, et al. 1998).
De acuerdo con otra realización, el epítopo es un mimótopo. Como macromolécula, a menudo un péptido, que imita la estructura de un epítopo, el mimótopo tiene la ventaja de ser más pequeño que un epítopo convencional y, por lo tanto, puede ser beneficioso para una secuencia no conformacional y más fácil de reproducir en un polipéptido largo tal como un CAR. Los mimótopos son conocidos por varios mAb aprobados farmacéuticamente tales como dos péptidos de 10 aminoácidos para cetuximab (Riemer et al., 2005), o 24 aa para palivizumab (Arbiza et al., 1992). Dado que estos mimótopos pueden identificarse mediante presentación en fagos, es posible probar varios de ellos para obtener una secuencia que no perturbe el scFv para el mismo mAb. Adicionalmente, su uso puede potenciar una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).
En la siguiente Tabla 10 se presentan varios ejemplos de dichos epítopos y mimótopos con su correspondiente mAb de unión.
Tabla 10: Mimóto os e íto o con su mAb corres ondiente
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En una realización preferida, el epítopo introducido dentro del scFv quimérico es el mimótopo CD20 (SEQ ID NO. 113) y el mAb infundido que presenta afinidad por este mimótopo, con fines de clasificación y/o agotamiento, es rituximab.
En una realización, dicho al menos un epítopo se inserta entre las cadenas VH y VL del CAR anti-CLL1.1, opcionalmente unido a dichas cadenas VH y VL por un enlazador.
En alguna realización, el término "enlazador", como se usa en el contexto de un scFv, se refiere a un enlazador peptídico que consiste en aminoácidos tales como residuos de glicina y/o serina usados en solitario o en combinación, para unir regiones variables de cadena pesada y variables de cadena ligera entre sí. En una realización, el enlazador polipeptídico flexible es un enlazador de glicina/serina y comprende la secuencia de aminoácidos (Gly-Gly-Gly-Ser)n o (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n, donde n es un número entero positivo igual o superior a 1. Por ejemplo, n = 1, n = 2, n = 3, n = 4, n = 5, n = 6, n = 7, n = 8, n = 9 y n = 10. En una realización, los enlazadores polipeptídicos flexibles incluyen, pero sin limitación, (Gly4Ser)4 o (Gly4Ser)3. En otra realización, los enlazadores incluyen múltiples repeticiones de (GlyxSer)n, donde x = 1, 2, 3, 4 o 5 y n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, tales como una repetición múltiple de (GlySer), (Gly2Ser) o (Gly5Ser). También se incluyen dentro del alcance de la invención los enlazadores descritos en el documento WO2012/138475.
En una realización preferida, dicho receptor de antígeno quimérico específico de CLL1 (CAR anti-CLL1) tiene una de las estructuras polipeptídicas seleccionadas de V1, V3 o V5, como se ilustra en la figura 2, en las que un mimótopo CD20 se inserta entre las cadenas VH y VL del CAR anti-CLL1.1, opcionalmente unido a dichas cadenas VH y VL por un enlazador.
En una realización más preferida, dicho receptor de antígeno quim érico específico de CLL1 (CAR anti-C LL1) tiene una de las estructuras po lipeptíd icas de versión V3 com o se ilustra en la figura 2, com prendiendo dicha estructura al menos un dom inio de unión a ligando extrace lu lar anti-CLL1 que com prende un fragm ento de anticuerpo m onocatenario (scFv) que com prende el fragm ento variable pesado (VH) y ligero (VL) del anticuerpo m onoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho V h com prende las CDR de SEQ. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL com prende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH com prende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL com prende las CDR de S e Q ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivam ente, un dominio transm em brana de CD8a, un dom inio coestim ulador de 4-1BB, un dom inio de señalización de CD3 zeta, y en donde un m im ótopo CD20 se inserta entre las cadenas VH y VL del CAR anti-CLL1.1, opcionalm ente unido a dichas cadenas VH y VL por un enlazador.
En otra realización, dicho al m enos un epítopo se inserta en el extrem o N-term inal del CAR, o antes de los scFv, opcionalm ente unido a la cadena VH y al extrem o N-term inal del CAR por un enlazador.
En una realización preferida, dicho receptor de antígeno quim érico específico de CLL1 (CAR anti-C LL1) tiene una de las estructuras po lipeptíd icas seleccionadas de V1, V3 o V5, com o se ilustra en la figura 2, com prendiendo dicha estructura al m enos un dom inio de unión a ligando extracelu lar anti-CLL1 que com prende un fragm ento de anticuerpo m onocatenario (scFv) que com prende el fragm ento variable pesado ( V h ) y ligero ( V l ) del anticuerpo m onoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho VH com prende las CDR de SEQ. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL com prende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH com prende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL com prende las CDR de SEQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivam ente, un dom inio transm em brana de CD8a, un dom inio coestim ulador de 4-1BB, un dom inio de señalización de CD3 zeta, y en donde un ep ítopo se inserta en el extrem o N-term inal del CAR, o antes de los scFv, opcionalm ente unido a la cadena VH y al extrem o N-term inal del CAR por un enlazador.
En una realización más preferida, dicho receptor de antígeno quim érico específico de CLL1 (CAR anti-C LL1) tiene una de las estructuras po lipeptíd icas de versión V3 com o se ilustra en la figura 2, com prendiendo dicha estructura al menos un dom inio de unión a ligando extracelu lar anti-CLL1 que com prende un fragm ento de anticuerpo m onocatenario (scFv) que com prende el fragm ento variable pesado ( Vh) y ligero (Vl) del anticuerpo m onoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho VH com prende las CDR de S e Q. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL com prende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH com prende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL com prende las CDR de S e Q ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivam ente, un dominio transm em brana de CD8a, un dom inio coestim ulador de 4-1BB, un dom inio de señalización de CD3 zeta, y en donde un epítopo se inserta en el extrem o N-term inal del CAR, o antes de los scFv, opcionalm ente unido a la cadena VH y al extrem o N-term inal del CAR por un enlazador.
En otra realización, dicho al m enos un epítopo se inserta entre los scFv y la bisagra del CAR, opcionalm ente unido a la cadena VL y a la bisagra por un enlazador.
En una realización preferida, dicho receptor de antígeno quim érico específico de CLL1 (CAR anti-C LL1) tiene una de las estructuras po lipeptíd icas seleccionadas de V1, V3 o V5, com o se ilustra en la figura 2, com prendiendo dicha estructura al m enos un dom inio de unión a ligando extracelu lar anti-CLL1 que com prende un fragm ento de anticuerpo m onocatenario (scFv) que com prende el fragm ento variable pesado (V h) y ligero (V l) del anticuerpo m onoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho VH com prende las CDR de SEQ. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL com prende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH com prende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL com prende las CDR de SEQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivam ente, un dom inio transm em brana de CD8a, un dom inio coestim ulador de 4-1BB, un dom inio de señalización de CD3 zeta, y en donde un epítopo se inserta entre los scFv y la bisagra del CAR, opcionalm ente unido a la cadena VL y a la bisagra por un enlazador.
En una realización más preferida, dicho receptor de antígeno quim érico específico de CLL1 (CAR anti-CLL1) tiene una de las estructuras po lipeptíd icas de versión V3 com o se ilustra en la figura 2, com prendiendo dicha estructura al menos un dom inio de unión a ligando extrace lu lar anti-CLL1 que com prende un fragm ento de anticuerpo m onocatenario (scFv) que com prende el fragm ento variable pesado ( Vh) y ligero (Vl) del anticuerpo m onoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho VH com prende las CDR de S e Q. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL com prende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH com prende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL com prende las CDR de S e Q ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivam ente, un dom inio transm em brana de CD8a, un dom inio coestim ulador de 4-1BB, un dom inio de señalización de CD3 zeta, y en donde un epítopo se inserta entre los scFv y la bisagra del CAR, opcionalm ente unido a la cadena VL y a la bisagra por un enlazador.
En una realización preferida, al menos dos epítopos se insertan en el dominio extracelular del CAR anti-CLL1 de la presente invención.
En una realización, el receptor de antígeno quimérico específico de CLL1 (CAR anti-CLL1) tiene una de las estructuras polipeptídicas seleccionadas de V1, V3 o V5, como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura al menos un dominio de unión a ligando extracelular anti-CLL1 que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable pesado (V h ) y ligero ( Vl) del anticuerpo monoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, un dominio transmembrana de CD8a, un dominio coestimulador de 4-1BB, un dominio de señalización de CD3 zeta, y dos mimótopos CD20,
comprendiendo dicho dominio de unión extracelular las cadenas VH y VL dirigidas contra CLL1 y una bisagra FcYRIIIa o CD8a o IgG1; en donde dichos 2 epítopos se insertan en tándem entre los scFv y dicha bisagra, y opcionalmente
estando un enlazador (SEQ ID NO.10) interespaciado entre los 2 epítopos y/o entre el VH y los 2 epítopos.
En una realización, el receptor de antígeno quimérico específico de CLL1 (CAR anti-CLL1) tiene una de las estructuras polipeptídicas seleccionadas de V1, V3 o V5, como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura al menos un dominio de unión a ligando extracelular anti-CLL1 que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable pesado ( Vh) y ligero ( Vl) del anticuerpo monoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, un dominio transmembrana de CD8a, un dominio coestimulador de 4-1BB, un dominio de señalización de CD3 zeta, y dos mimótopos CD20,
comprendiendo dicho dominio de unión extracelular las cadenas VH y VL dirigidas contra CLL1 y una bisagra FcYRlIla o CD8a o IgG1;
en donde dichos 2 epítopos están insertados en tándem antes de los scFv, es decir, en el extremo N-terminal del CAR,
y opcionalmente, estando un enlazador (SEQ ID NO.10) interespaciado entre los 2 epítopos y/o en el extremo N-terminal del CAR.
De acuerdo con una realización, al menos dos epítopos se insertan en el dominio extracelular de tal manera que el VH se sitúe entre ellos, estando todos estos componentes opcionalmente interespaciados por al menos un enlazador.
En una realización preferida, dicho receptor de antígeno quimérico específico de CLL1 (CAR anti-CLL1) tiene una de las estructuras polipeptídicas seleccionadas de V1, V3 o V5, como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura al menos un dominio de unión a ligando extracelular anti-CLL1 que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable pesado (VH) y ligero (VL) del anticuerpo monoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, un dominio transmembrana de CD8a, un dominio coestimulador de 4-1BB, un dominio de señalización de CD3 zeta, y en donde dos epítopos se insertan en el dominio extracelular de tal manera que el VH se sitúe entre ellos, estando todos estos componentes opcionalmente interespaciados por al menos un enlazador.
En una realización más preferida, dicho receptor de antígeno quimérico específico de CLL1 (CAR anti-CLL1) tiene una de las estructuras polipeptídicas de versión V3 como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura al menos un dominio de unión a ligando extracelular anti-CLL1 que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable pesado ( Vh) y ligero (Vl) del anticuerpo monoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho VH comprende las CDR de Se Q. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de Se Q ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, un dominio transmembrana de CD8a, un dominio coestimulador de 4-1BB, un dominio de señalización de CD3 zeta, y en donde dos epítopos se insertan en el dominio extracelular de tal manera que el VL se sitúe entre ellos, estando todos estos componentes opcionalmente interespaciados por al menos un enlazador.
De acuerdo con otra realización, dos epítopos se insertan en el dominio extracelular de tal manera que el VL se sitúe entre ellos, estando todos estos componentes opcionalmente interespaciados por al menos un enlazador.
En una realización preferida, dicho receptor de antígeno quimérico específico de CLL1 (CAR anti-CLL1) tiene una de las estructuras polipeptídicas seleccionadas de V1, V3 o V5, como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura al menos un dominio de unión a ligando extracelular anti-CLL1 que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable pesado (Vh) y ligero (Vl) del anticuerpo monoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, un dominio transmembrana de CD8a, un dominio coestimulador de 4-1BB, un dominio de señalización de CD3 zeta, y en donde dos epítopos se insertan en el dominio extracelular de tal manera que el VL se sitúe entre ellos, estando todos estos componentes opcionalmente interespaciados por al menos un enlazador.
En una realización más preferida, dicho receptor de antígeno quimérico específico de CLL1 (CAR anti-CLL1) tiene una de las estructuras polipeptídicas de versión V3 como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura al menos un dominio de unión a ligando extracelular anti-CLL1 que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable pesado (V h ) y ligero (Vl) del anticuerpo monoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho VH comprende las CDR de SeQ. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de SeQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, un dominio transmembrana de CD8a, un dominio coestimulador de 4-1BB, un dominio de señalización de CD3 zeta, y en donde dos epítopos se insertan en el dominio extracelular de tal manera que el VL se sitúe entre ellos, estando todos estos componentes opcionalmente interespaciados por al menos un enlazador.
De acuerdo con otra realización, dicho receptor de antígeno quimérico específico de CLL1 (CAR anti-CLL1) comprende un dominio de unión extracelular que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable pesado (VH) y ligero (VL) del anticuerpo monoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho v H comprende las CDR de SEQ. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, en donde al menos dos epítopos se insertan en el dominio extracelular de tal manera que las cadenas VH y VL se sitúen entre ellos, estando todos estos componentes opcionalmente interespaciados por al menos un enlazador.
En una realización preferida, dicho receptor de antígeno quimérico específico de CLL1 (CAR anti-CLL1) tiene una de las estructuras polipeptídicas seleccionadas de V1, V3 o V5, como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura al menos un dominio de unión a ligando extracelular anti-CLL1 que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable pesado (Vh) y ligero (Vl) del anticuerpo monoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, un dominio transmembrana de CD8a, un dominio coestimulador de 4-1BB, un dominio de señalización de CD3 zeta, y en donde dos epítopos se insertan en el dominio extracelular de tal manera que las cadenas VH y VL se sitúen entre ellos, estando todos estos componentes opcionalmente interespaciados por al menos un enlazador.
En una realización más preferida, dicho receptor de antígeno quimérico específico de CLL1 (CAR anti-CLL1) tiene una de las estructuras polipeptídicas de versión V3 como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura al menos un dominio de unión a ligando extracelular anti-CLL1 que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable pesado ( Vh) y ligero (Vl) del anticuerpo monoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho VH comprende las CDR de SeQ. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de SeQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, un dominio transmembrana de CD8a, un dominio coestimulador de 4-1BB, un dominio de señalización de CD3 zeta, y en donde dos epítopos se insertan en el dominio extracelular de tal manera que las cadenas VH y VL se sitúen entre ellos, estando todos estos componentes opcionalmente interespaciados por al menos un enlazador.
En otra realización, tres epítopos se insertan en el dominio extracelular del CAR anti-CLL1 de la presente invención.
De acuerdo con una realización particular, dicho CAR específico de CLL1 de la invención contiene un dominio de unión extracelular que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable pesado ( Vh) y ligero (Vl) del anticuerpo monoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, en donde tres epítopos se insertan en el dominio extracelular de tal manera que las cadenas VH y VL se sitúen entre ellos, estando todos estos componentes opcionalmente interespaciados por al menos un enlazador.
En una realización preferida, dicho receptor de antígeno quimérico específico de CLL1 (CAR anti-CLL1) tiene una de las estructuras polipeptídicas seleccionadas de V1, V3 o V5, como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura al menos un dominio de unión a ligando extracelular anti-CLL1 que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable pesado ( Vh) y ligero ( Vl) del anticuerpo monoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, un dominio transmembrana de CD8a, un dominio coestimulador de 4-1BB, un dominio de señalización de CD3 zeta, y en donde tres epítopos se insertan en el dominio extracelular de tal manera que las cadenas VH y VL se sitúen entre ellos, estando todos estos componentes opcionalmente interespaciados por al menos un enlazador.
En una realización más preferida, dicho receptor de antígeno quimérico específico de CLL1 (CAR anti-CLL1) tiene una de las estructuras polipeptídicas de versión V3 como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura al menos un dominio de unión a ligando extracelular anti-CLL1 que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable pesado (V h ) y ligero (Vl) del anticuerpo monoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho VH comprende las CDR de Se Q. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de Se Q ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, un dominio transmembrana de CD8a, un dominio coestimulador de 4-1BB, un dominio de señalización de CD3 zeta, y en donde tres epítopos se insertan en el dominio extracelular de tal manera que las cadenas VH y VL se sitúen entre ellos, estando todos estos componentes opcionalmente interespaciados por al menos un enlazador.
En otra realización, el receptor de antígeno quimérico específico de CLL1 (CAR anti-CLL1) tiene una de las estructuras polipeptídicas seleccionadas de V1, V3 o V5, como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura al menos un dominio de unión a ligando extracelular anti-CLL1 que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable pesado ( Vh) y ligero ( Vl) del anticuerpo monoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, un dominio transmembrana de CD8a, un dominio coestimulador de 4-1BB, un dominio de señalización de CD3 zeta, y tres epítopos CD20,
comprendiendo dicho dominio de unión extracelular las cadenas VH y VL dirigidas contra CLL1 y una bisagra FcYRIIIa o CD8a o IgG1; en donde dichos 3 epítopos se insertan en tándem entre los scFv y dicha bisagra, y opcionalmente
estando un enlazador (SEQ ID NO.10) interespaciado entre los 3 epítopos y/o entre el VH y los 3 epítopos.
En otra realización, el receptor de antígeno quimérico específico de CLL1 (CAR anti-CLL1) tiene una de las estructuras polipeptídicas seleccionadas de V1, V3 o V5, como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura al menos un dominio de unión a ligando extracelular anti-CLL1 que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable pesado ( Vh) y ligero ( Vl) del anticuerpo monoclonal anti-CLL1 M26 o M2 unido por un enlazador flexible, en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente, un dominio transmembrana de CD8a, un dominio coestimulador de 4-1BB, un dominio de señalización CD3 zeta, dos epítopos CD20, y un epítopo CD34;
comprendiendo dicho dominio de unión extracelular las cadenas VH y VL dirigidas contra CLL1 y una bisagra FcYRlIla o CD8a o IgG1; estando dichos 2 epítopos insertados en tándem entre los scFv y dicha bisagra, y estando dicho epítopo CD34 insertado entre los dichos 2 epítopos CD20, estando todos los componentes interespaciados entre ellos por un enlazador (SEQ ID NO.10) y un enlazador entre el epítopo y entre el VH y los 3 epítopos.
En todas las realizaciones anteriores relacionadas con los CAR anti-CLL1 que contienen epítopo, las cadenas VH y VL que se usan como dominio de unión extracelular se unen preferentemente a CLL1-1 de membrana humano.
Más específicamente, los epítopos se pueden incluir en el CAR de la presente invención tal como sigue:
En algunas realizaciones, el dominio de unión extracelular comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 epítopos específicos de mAb.
En algunas realizaciones, el dominio de unión extracelular comprende al menos 1, 2 o 3 epítopos específicos de mAb.
En algunas realizaciones, cuando el dominio de unión extracelular comprende varios epítopos específicos de mAb, todos los epítopos específicos de mAb son idénticos.
En algunas realizaciones, cuando el dominio de unión extracelular comprende varios epítopos específicos de mAb, los epítopos específicos de mAb no son idénticos. Por ejemplo, el dominio de unión extracelular puede comprender tres epítopos específicos de mAb, siendo dos de ellos idénticos y el tercero diferente.
En algunas realizaciones, el dominio de unión extracelular comprende un VH, un VL, uno o más epítopos específicos de mAb, preferentemente 1, 2 o 3, más preferentemente 2 o 3 epítopos específicos de mAb.
En algunas realizaciones, el dominio de unión extracelular comprende la siguiente secuencia (Nterm se encuentra en el lado izquierdo):
V1-L1-V2-(L)x-Epítopo1-(L)x;
V1-L1-V2-(L)x-Epítopo1-(L)x-Epítopo2-(L)x;
V1-L1-V2-(L)x-Epítopo1-(L)x-Epítopo2-(L)x-Epítopo3-(L)x;
(L)x-Epítopo1-(L)x-V1-L1-V2;
(L)x-Epítopo1-(L)x-Epítopo2-(L)x-V1-L1-V2;
Epítopo1-(L)x-Epítopo2-(L)x-Epítopo3-(L)x-V1-L1-V2;
(L)x-Epítopo1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-Epítopo2-(L)x;
(L)x-Epítopo1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-Epítopo2-(L)x-Epítopo3-(L)x;
(L)x-Epítopo1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-Epítopo2-(L)x-Epítopo3-(L)x-Epítopo4-(L)x;
(L)x-Epítopo1-(L)x-Epítopo2-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-Epítopo3-(L)x;
(L)x-Epítopo1-(L)x-Epítopo2-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-Epítopo3-(L)x-Epítopo4-(L)x;
V1-(L)x-Epítopo1-(L)x-V2;
V1-(L)x-Epítopo1-(L)x-V2-(L)x-Epítopo2-(L)x;
V1-(L)x-Epítopo1-(L)x-V2-(L)x-Epítopo2-(L)x-Epítopo3-(L)x;
V1-(L)x-Epítopo1-(L)x-V2-(L)x-Epítopo2-(L)x-Epítopo3-(L)x-Epítopo4-(L)x;
(L)x-Epítopo1-(L)x-V1-(L)x-Epítopo2-(L)x-V2;
(L)x-Epítopo1-(L)x-V1-(L)x-Epítopo2-(L)x-V2-(L)x-Epítopo3-(L)x;
V1-L1-V2-L-Epítopo1;
V1-L1-V2-L-Epítopo1-L;
V1-L1-V2-L-Epítopo1 -L-Epítopo2;
V 1-L1-V2-L-Epítopo1-L-Epítopo2-L;
V1-L1-V2-L-Epítopo1-L-Epítopo2-L-Epítopo3;
V1-L1-V2-L-Epítopo1-L-Epítopo2-L-Epítopo3-L;
V1-L1-V2-Epítopo1;
V1-L1-V2-Epítopo1-L;
V1-L1-V2-Epítopo1-L-Epítopo2;
V1-L1-V2-Epítopo1-L-Epítopo2-L;
V1-L1-V2-Epítopo1-L-Epítopo2-L-Epítopo3;
V1-L1-V2-Epítopo1-L-Epítopo2-L-Epítopo3-L;
Epítopo1-V1-L1-V2;
Epítopo1-L-V1-L1-V2;
L-Epítopo1 -V1-L1-V2;
L-Epítopo1 -L-V1-L1-V2;
Epítopo1-L-Epítopo2-V1-L1-V2;
Epítopo1-L-Epítopo2-L-V1-L1-V2;
L-Epítopo1 -L-Epítopo2-V1-L1-V2;
L-Epítopo1-L-Epítopo2-L-V1-L1-V2;
Epítopo1-L-Epítopo2-L-Epítopo3-V1-L1-V2;
Epítopo1-L-Epítopo2-L-Epítopo3-L-V1-Li-V2;
L-Epítopo1-L-Epítopo2-L-Epítopo3-V1-L1-V2;
L-Epítopo1-L-Epítopo2-L-Epítopo3-L-V1-L1-V2;
V1-L-Epítopo1-L-V2;
L-Epítopo1-L-V1-L-Epítopo2-L-V2;
V1-L-Epítopo1-L-V2-L-Epítopo2-L;
V1-L-Epítopo1-L-V2-L-Epítopo2-L-Epítopo3;
V1-L-Epítopo1-L-V2-L-Epítopo2-Epítopo3;
V1-L-Epítopo1-L-V2-L-Epítopo2-L-Epítopo3-Epítopo4;
L-Epítopo1-L-Vi-L-Epítopo2-L-V2-L-Epítopo3-L;
Epítopo1-L-Vi-L-Epítopo2-L-V2-L-Epítopo3-L;
L-Epítopo1-L-Vi-L-Epítopo2-L-V2-L-Epítopo3;
L-Epítopo1-L-V1-L1-V2-L-Epítopo2-L;
L-Epítopo1-L-V1-L1-V2-L-Epítopo2-L-Epítopo3;
L-Epítopo1 -L-V1-L1-V2-L-Epítopo2-Epítopo3, o,
Epítopo1-L-V1-L1-V2-L-Epítopo2-L-Epítopo3-Epítopo 4;
en las que,
V1 y V2 son Vh y Vl de un ScFv (es decir, V1 es Vl y V2 es Vh o V1 es Vh y V2 es Vl);
L1 es cualquier enlazador adecuado para unir la cadena VH a la cadena Vl en un ScFv;
L es un enlazador, que comprende preferentemente residuos de glicina y de serina, y cada aparición de L en el dominio de unión extracelular puede ser idéntica o ser diferente a otra aparición de L en el mismo dominio de unión extracelular, y
x es 0 o 1 y cada aparición de x es independiente de las demás; y,
el epítopo 1, el epítopo 2, el epítopo 3 y el epítopo 4 se seleccionan independientemente de epítopos específicos de mAb que comprenden una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 191, SeQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198 o SEQ ID NO: 199.
En algunas realizaciones, el dominio de unión extracelular comprende la siguiente secuencia (Nterm se encuentra en el lado izquierdo):
VH-L1-VL-L-Epítopo1-L-Epítopo2-L;
L-Epítopo1-L-VH-L-Epítopo2-L-VL-L-Epítopo3-L;
VL-L1-VH-L-Epítopo1-L-Epítopo2-L; o
L-Epítopo1-L-VL-L-Epítopo2-L-VH-L-Epítopo3-L.
en las que L, L1, el epítopo 1, el epítopo 2 y el epítopo 3 son como se han definido anteriormente.
En algunas realizaciones, L1 es un enlazador que comprende glicina y/o serina. En alguna realización, L1 es un enlazador que comprende la secuencia de aminoácidos (Gly-Gly-Gly-Ser)n o (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n, donde n es 1, 2, 3, 4 o 5. En algunas realizaciones, L1 es (Gly4Ser)4 o (Gly4Ser)3.
En alguna realización, L es un enlazador flexible, que comprende preferentemente glicina y/o serina. En algunas realizaciones, L tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SGG, GGS, SGGS, SSGGS, GGGG, SGGGG, GGGGS, SGGGGS, GGGGGS, SGGGGGS, SGGGGG, GSGGGGS, GGGGGGGS, SGGGGGGG, SGGGGGGGS, o SGGGGSGGGGS, preferentemente SGG, SGGS, SSGGS, GGGG, SGGGGS, SGGGGGS, SGGGGG, GSGGGGS o SGGGGSg Gg GS. En alguna realización, cuando el dominio de unión extracelular comprende varias apariciones de L, todas las L son idénticas. En algunas realizaciones, cuando el dominio de unión extracelular comprende varias apariciones de L, las L no son todas idénticas. En algunas realizaciones, L es SGGGGS. En algunas realizaciones, el dominio de unión extracelular comprende varias apariciones de L y todas las L son SGGGGS.
En algunas realizaciones, el Epítopo 1, el Epítopo 2 y el Epítopo 3 son idénticos o diferentes y se seleccionan de epítopos específicos de mAb reconocidos específicamente por ibritumomab, tiuxetán, muromonab-CD3, tositumomab, abciximab, basiliximab, brentuximab vedotina, cetuximab, infliximab, rituximab, alemtuzumab, bevacizumab, certolizumab pegol, daclizumab, eculizumab, efalizumab, gemtuzumab, natalizumab, omalizumab, palivizumab, ranibizumab, tocilizumab, trastuzumab, vedolizumab, adalimumab, belimumab, canakinumab, denosumab, golimumab, ipilimumab, ofatumumab, panitumumab, QBEND-10, alemtuzumab o ustekinumab.
En alguna realización, uno del Epítopo 1, el Epítopo 2, el Epítopo 3 y el Epítopo 4 es un epítopo CD34, preferentemente un epítopo de SEQ ID 198 o 199. En alguna realización, uno del Epítopo1, el Epítopo 2, el Epítopo 3 y el Epítopo 4 es un epítopo CD34, preferentemente un epítopo de SEQ ID 198 o 199, y los demás epítopos específicos de mAb son mimótopos CD20, preferentemente un mimótopo de SEQ ID NO 113.
Método para agotar las células inmunes que expresan CAR
Las células inmunes que expresan el CAR específico de CLL1 de acuerdo con la presente invención pueden comprender uno o más epítopos en su dominio extracelular, tal como se ha descrito anteriormente, de modo que puedan agotarse en un paciente en caso de una respuesta inmune adversa o demasiado aguda (por ejemplo, tormenta de citocinas) administrando a dicho paciente un anticuerpo, preferentemente monoclonal, específico para dicho uno o más epítopos.
Por "agotamiento in vivo" se entiende en la presente invención la administración de un tratamiento a un organismo mamífero con el objetivo de detener la proliferación de células inmunes que expresan CAR mediante inhibición o eliminación.
Un aspecto de la divulgación se refiere a un método para agotar in vivo una célula inmune genomanipulada que expresa un CAR que comprende un epítopo específico de m-Ab como se ha descrito previamente, que comprende poner en contacto dicha célula inmune genomanipulada o dicha célula inmune que expresa CAR con un al menos un mAb específico de epítopo. Otro aspecto de la divulgación se refiere a un método para agotar in vivo una célula inmune que expresa CAR inmune que comprende el scFv quimérico anterior (formado por inserción de un epítopo específico de mAb) poniendo en contacto dicha célula inmune genomanipulada con anticuerpos específicos de epítopo.
Preferentemente, Preferiblemente, dichas células inmunes son linfocitos T y/o los anticuerpos son monoclonales. De acuerdo con un caso, el agotamiento in vivo de la célula inmune genomanipulada se realiza en una célula inmune genomanipulada que se ha clasificado previamente usando el método in vitro de la presente divulgación. En este caso, será el mismo mAb infundido utilizado.
De acuerdo con un caso preferido, el antígeno específico de mAb es el antígeno CD20 y el mAb específico de epítopo es rituximab.
En algunos casos, la invención se refiere a un método para agotar in vivo una célula inmune genomanipulada que expresa un CAR que comprende un epítopo específico de mAb (célula inmune que expresa CAR) como se ha descrito previamente, en un paciente que comprende poner en contacto dicho CAR que expresa célula inmune con al menos un mAb específico de epítopo.
En algunos casos, dicho epítopo específico de mAb es un epítopo o mimótopo CD20, preferentemente la SEQ ID NO 35, y el mAb específico de epítopo es rituximab.
En algunos casos, la etapa de poner en contacto dicha célula inmune genomanipulada o dicha célula inmune que expresa CAR con al menos un mAb específico de epítopo comprende infundir al paciente con mAb específico de epítopo, preferentemente rituximab.
En algunos casos, cuando las células inmunes que expresan un CAR que comprende un epítopo específico de mAb (células inmunes que expresan CAR) se agotan en un ensayo CDC usando mAb específico de epítopo, la cantidad de células inmunes viables que expresan CAR disminuye, preferentemente en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o un 90 %. Preferiblemente, el ensayo CDC es el ensayo divulgado en el Ejemplo 3, Ejemplo 4 o Ejemplo 7.4. En algunos casos, dicho epítopo específico de mAb es un epítopo o mimótopo CD20, preferentemente la SEQ ID NO 35, y el mAb específico de epítopo es rituximab.
Además de la posibilidad de agotar in vivo las células inmunes de acuerdo con la invención, los epítopos insertados en el dominio extracelular de los CAR pueden ser útiles para las etapas de clasificación o purificación de las células inmunes que expresan dichos CAR, como parte del método para producirlos.
Células aisladas
Las células resultantes son células inmunes linfoides genomanipuladas que expresan en la membrana de superficie celular un receptor de antígeno quimérico específico de CLL1 como se ha descrito previamente, en particular, células inmunes genomanipuladas derivadas de linfocitos T primarios, opcionalmente resistentes a un fármaco contra el cáncer, y que llevan una deleción en un gen que codifica un TCR alfa o un TCR beta.
La presente invención divulga una célula inmune genomanipulada como anteriormente, en la que se suprime la expresión de TCR.
La presente invención describe una célula inmune linfoide genomanipulada como anteriormente, en donde la expresión de al menos una proteína del MHC, preferentemente p2m o HLA, se reduce o se suprime en dicha célul a inmune genomanipulada. p2m representa microglobulina beta 2 y HLA para antígeno leucocitario humano. La proteína del MHC es una proteína del MHC de clase I o de clase II.
La presente invención describe una célula inmune linfoide genomanipulada como anteriormente, en la que dicha célula inmune genomanipulada está mutada para conferir resistencia al menos a un fármaco inmunosupresor, fármaco de quimioterapia, o fármaco contra el cáncer.
La presente invención divulga una célula inmune linfoide genomanipulada como anteriormente para su uso en terapia.
La presente invención divulga una célula inmune linfoide genomanipulada para su uso en terapia como anteriormente, en la que el paciente es un ser humano.
La presente invención divulga una célula inmune linfoide genomanipulada para su uso en terapia como anteriormente, en la que la afección es una afección de cáncer preneoplásica o neoplásica caracterizada por células que expresan CLL1.
La presente invención divulga una célula inmune linfoide genomanipulada para su uso en terapia como anteriormente, en la que la afección es una afección que se caracteriza por una sobreabundancia de células que expresan CLL1.
La presente invención divulga una célula inmune linfoide genomanipulada para su uso en terapia como anteriormente, en la que la afección de cáncer neoplásica es una afección de cáncer hematológico.
La presente invención divulga una célula inmune linfoide genomanipulada para su uso en terapia como anteriormente, en la que la afección de cáncer hematológico es leucemia o trastornos linfoproliferativos neoplásicos. La presente invención divulga una célula inmune linfoide genomanipulada para su uso en terapia como anteriormente, en la que dicha leucemia se selecciona del grupo que consiste en leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, síndrome mielodisplásico, leucemia linfoide aguda, leucemia linfoide crónica, y síndrome mielodisplásico.
La presente invención divulga una célula inmune linfoide genomanipulada para su uso en terapia como anteriormente, en la que la leucemia es leucemia mielógena aguda (AML).
La presente invención divulga una célula inmune linfoide genomanipulada para su uso en terapia como anteriormente, en la que dicho cáncer hematológico es un trastorno linfoproliferativo neoplásico.
La presente invención divulga una célula inmune linfoide genomanipulada para su uso en terapia como anteriormente, en la que dicho trastorno linfoproliferativo neoplásico es linfoma.
La presente invención divulga una célula inmune linfoide genomanipulada para su uso en terapia como anteriormente, en la que dicho linfoma se selecciona del grupo que consiste en mieloma múltiple, linfoma no Hodgkin, linfoma de Burkitt y linfoma folicular (células pequeñas y células grandes).
La presente divulgación proporciona un método para genomanipular una célula inmune que comprende:
(a) Proporcionar una célula inmune,
(b) expresar en la superficie de dicha célula al menos un receptor de antígeno quimérico específico monocatenario de CLL1 tal como el expuesto previamente.
La presente divulgación proporciona un método para genomanipular una célula inmune como anteriormente que comprende:
(a) Proporcionar una célula inmune,
(b) introducir en dicha célula al menos un polinucleótido que codifica dicho receptor de antígeno quimérico específico monocatenario de CLL1,
(c) expresar dicho polinucleótido en dicha célula.
La presente divulgación proporciona un método para genomanipular una célula inmune como anteriormente que comprende:
(a) Proporcionar una célula inmune,
(b) introducir en dicha célula al menos un polinucleótido que codifica dicho receptor de antígeno quimérico específico monocatenario de CLL1,
(c) introducir al menos otro receptor de antígeno quimérico que no sea específico para CLL1.
La presente divulgación proporciona un método para tratar a un sujeto que lo necesita que comprende:
(a) Proporcionar una célula inmune que exprese en la superficie un receptor de antígeno quimérico específico monocatenario de CLL1 tal como el expuesto anteriormente.
(b) Administrar dichas células inmunes a dicho paciente.
La presente divulgación proporciona un método para tratar a un sujeto que lo necesita como anteriormente, en el que dicha célula inmune se proporciona a partir de un donante.
La presente divulgación proporciona un método para tratar a un sujeto que lo necesita como anteriormente, en el que dicha célula inmune la proporciona el propio paciente.
Aplicaciones terapéuticas
La célula aislada obtenida por los diferentes métodos o la línea celular derivada de dicha célula aislada como se ha descrito previamente puede usarse como medicamento.
En una realización, dicho medicamento puede usarse para tratar el cáncer, particularmente para el tratamiento de la leucemia en un paciente que lo necesite.
En otra realización, dicha célula inmune linfoide aislada de acuerdo con la invención o la línea celular derivada de dicha célula aislada puede usarse en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer en un paciente que lo necesite.
En una realización particular, se proporciona un linfocito T que expresa CAR anti-CLL1 como medicamento para el tratamiento de AML, de un subtipo de AML, de una complicación relacionada con la AML, de una afección relacionada con la AML.
En otra realización, dicho medicamento puede usarse en el tratamiento de una afección patológica mediada por células que expresan CLL1 o una afección caracterizada por la actividad directa o indirecta de una célula que expresa CLL1.
Dicho tratamiento puede ser de mejora, curativo o profiláctico. Puede formar parte de una inmunoterapia autóloga o parte de un tratamiento de inmunoterapia alogénica. Por autólogo, se entiende que las células, la línea celular o la población de células utilizadas para tratar pacientes se originan a partir de dicho paciente o de un donante compatible con el antígeno leucocitario humano (HLA). Por alogénico se entiende que las células o la población de células utilizadas para tratar pacientes no son originarias de dicho paciente sino de un donante.
Las células que se pueden usar con los métodos divulgados se describen en la sección anterior. Dicho tratamiento se puede usar para tratar pacientes diagnosticados en los que una afección de cáncer preneoplásica o neoplásica está caracterizada por células que expresan CLL1, especialmente por una sobreabundancia de células que expresan CLL1. Dichas condiciones se encuentran en cánceres hematológicos, tal como leucemia.
Se divulga una composición para su uso en el tratamiento de una enfermedad mediada por células que expresan CLL1, en particular un cáncer hematológico mediado por células que expresan CLL1, comprendiendo dicha composición dicho linfocito T que expresa scCAR anti-CLL1 de la invención.
Cualquier otro trastorno linfoproliferativo neoplásico que media el CLL1 o que implica CLL1 divulgado en el presente documento puede mejorarse con las células que expresan CAR anti-CLL1 de la presente invención.
En una realización preferida, el cáncer que puede tratarse usando las células que expresan CAR anti-CLL1 de la presente invención es la leucemia, una enfermedad asociada a la leucemia, o una complicación de la misma.
Las leucemias que se pueden tratar usando las células que expresan CAR anti-CLL1 de la presente invención pueden ser leucemia mielógena aguda (AML). La AML o subtipos de AML que se pueden tratar usando las células que expresan scCAR anti-CLL1 de la presente invención pueden ser en particular, leucemia mieloblástica aguda, leucemia mieloblástica aguda mínimamente diferenciada, leucemia mieloblástica aguda sin maduración, leucemia mieloblástica aguda con maduración granulocítica, leucemia promielocítica o promielocítica aguda (APL), leucemia mielomonocítica aguda, mielomonocítica junto con eosinofilia de la médula ósea, leucemia monoblástica aguda (M5a) o leucemia monocítica aguda (M5b), leucemias eritroides agudas, incluyendo eritroleucemia (M6a) y leucemia eritroide pura poco frecuente (M6b), leucemia megacarioblástica aguda, leucemia basófila aguda, panmielosis aguda con mielofibrosis, ya sea que impliquen células positivas para CLL1.
Los subtipos de AML también incluyen leucemia de células pilosas, leucemia linfoblástica aguda con cromosoma Filadelfia positivo. La AML puede clasificarse como AML con anomalías genéticas específicas. La clasificación se basa en la capacidad del cariotipo para predecir la respuesta a la terapia de inducción, el riesgo de recidiva y la supervivencia.
Por consiguiente, la AML que se puede tratar usando las células que expresan CAR anti-CLL1 de la presente invención puede ser AML con una translocación entre los cromosomas 8 y 21, AML con una translocación o inversión en el cromosoma 16, AML con una translocación entre los cromosomas 9 y 11, APL (M3) con translocación entre los cromosomas 15 y 17, AML con una translocación entre los cromosomas 6 y 9, AML con una translocación o inversión en el cromosoma 3, AML (megacarioblástica) con una translocación entre los cromosomas 1 y 22.
La presente invención es particularmente útil para el tratamiento de la AML asociada con estos marcadores citogenéticos particulares.
La presente invención también proporciona un linfocito T que expresa CAR anti-CLL1 para su uso en el tratamiento de pacientes con subconjuntos citogenéticos específicos de AML, tales como pacientes con t(15;17)(q22;q21) identificados usando ácido todo-trans retinoico (ATRA) 16-19 y para el tratamiento de pacientes con t(8;21)(q22;q22) o inv(16)(p13q22)/t(16;16)(p13;q22) identificados mediante dosis repetidas de citarabina en dosis altas.
Preferentemente, la presente invención proporciona un linfocito T que expresa CAR anti-CLL1 para su uso en el tratamiento de pacientes con aberraciones, tales como -5/del(5q), -7, anomalías de 3q, o un cariotipo complejo, que se ha demostrado que tienen tasas de remisión completa y una supervivencia inferiores.
La expresión "agente terapéutico", "agente quimioterapéutico" o "fármaco" o "fármaco contra el cáncer", como se usa en el presente documento, se refieren a un medicamento, preferentemente un compuesto o un derivado del mismo que puede interactuar con una célula cancerosa, reduciendo de este modo el estado proliferativo de la célula y/o destruyendo la célula. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos o "fármaco contra el cáncer" incluyen, pero sin limitación, agentes alquilantes (por ejemplo, busulfano, carboplatino, clorambucilo, cisplatino, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalán, mecloretamina, oxaliplatino, uramustina, temozolomid, fotemustina), antagonistas metabólicos (por ejemplo, antimetabolito de nucleósido de purina tales clofarabina, fludarabina o 2'-desoxiadenosina, metotrexato (MTX), 5-fluorouracilo o derivados de los mismos, azatioprina, capecitabina, citarabina, floxuridina, fluorouracilo, gemcitabina, metotrexato, pemetrexed), antibióticos antitumorales (por ejemplo, mitomicina, adriamicina, bleomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, hidroxiurea, idarrubicina, mitomicina C, mitoxantrona), agentes antitumorales derivados de plantas (por ejemplo, vincristina, vindesina, taxol, vinblastina, vinorelbina, docetaxel o paclitaxel), inhibidor de topoisomerasa (irinotecán, topotecán, etoposido).
En una realización preferida, un agente terapéutico, un fármaco de quimioterapia como se usa en el presente documento se refiere a un compuesto o un derivado del mismo que se puede usar para tratar el cáncer, en particular para tratar una célula cancerosa hematopoyética y más particularmente AML, reduciendo de este modo el estado proliferativo de la célula cancerosa y/o la destrucción de la célula cancerosa. Ejemplos de agentes quimioterápicos incluyen, pero sin limitación, aracitina, arabinósido de citosina, amsacrina, daunorrubicina, idarrubicina, novantrona, mitoxantrona, vepesid, etopósido (VP16), trioxido de arsénico, ácido transretinoico, mecloretamina, procarbazina, clorambucilo, y una combinación de los mismos.
En otras realizaciones de la presente invención, las células de la invención son para la administración a un paciente junto con un fármaco (o un agente) seleccionado de aracitina, arabinósido de citosina, amsacrina, daunorrubicina, idarrubicina, novantrona, mitoxantrona, vepesid, etopósido (VP16), trioxido de arsénico, ácido transretinoico, citarabina, antraciclinas, 6-tioguanina, hidroxiurea, prednisona, y una combinación de los mismos.
Dichos agentes pueden incluir además, pero sin limitación, los agentes anticancerosos TRIMETHOTRIXATE™ (TMTX), TEMOZOLOMIDE™, RALTRITREXED™, S-(4-Nitrobencil)-6-tioinosina (NBMPR), 6-benciguanidina (6-BG), bis-cloronitrosourea (BCNU) y CAMPTOTHECIN™, o un derivado terapéutico de cualquiera de los mismos.
En una realización más preferida, un linfocito T que expresa scCAR anti-CLL1 es para la administración a un paciente, en combinación con al menos un agente terapéutico seleccionado de aracitina, arabinósido de citosina, amsacrina, daunorrubicina, idarrubicina, novantrona, mitoxantrona, vepesid, etopósido (VP16), trioxido de arsénico, ácido transretinoico y una combinación de los mismos.
Como se usa en el presente documento, una célula que es "resistente o tolerante" a un agente significa una célula que ha sido modificada genéticamente para que la célula prolifere en presencia de una cantidad de un agente que inhiba o prevenga la proliferación de una célula sin la modificación.
Grupo de pacientes
En una realización preferida, la célula inmune linfoide genomanipulada de la invención es para su uso en un tratamiento para la AML en pacientes mayores de 60 años o en pacientes menores de 20 años.
En una realización más preferida, la célula inmune linfoide genomanipulada de la presente invención es para su uso en un tratamiento pediátrico, en particular, un tratamiento pediátrico contra la AML, o enfermedades o complicaciones relacionadas con la AML.
En aún otra realización preferida, la célula inmune linfoide genomanipulada de la presente invención es para su uso en un tratamiento en pacientes con AML con un estado bajo, malo o desfavorable, es decir, con una tasa de supervivencia prevista de menos de 5 años. En este grupo, los pacientes padecen AML con las siguientes características citogenéticas: -5; 5q; -7; 7q-;11q23; non t(9;11); inv(3); t(3;3); t(6;9); t(9;22) está asociado con un estado de bajo riesgo (Byrd J.C. et al., 15 de diciembre de 2002; Blood: 100 (13) y se contempla especialmente para tratarse con un objeto de la presente invención.
En una realización, el linfocito T que expresa CAR anti-CLL1 de la presente invención pueden usarse como terapia de inducción, como terapia posterior a la remisión de AML o como terapia de consolidación en pacientes con AML. En una realización, el linfocito T que expresa CAR anti-CLL1 de la presente invención puede usarse en caso de recidiva de la AML, o en caso de AML refractaria o resistente, y más preferentemente, en combinación con al menos otro fármaco contra el cáncer
En otra realización preferida, al menos una célula inmune linfoide genomanipulada que expresa CAR anti-CLL1 de la invención es para su uso en la prevención del desarrollo de células cancerosas que se produce en particular después del tratamiento contra el cáncer, durante el agotamiento de la médula ósea, o antes del trasplante de médula ósea, después de la destrucción de la médula ósea.
Complicaciones de la AML
En una realización particular, la invención proporciona un linfocito T que expresa CAR anti-CLL1 de la invención para su uso como un medicamento que mejora el estado de salud de un paciente, en particular un paciente que sufre una complicación relacionada con la a Ml . Más preferentemente, dicho linfocito T que expresa CAR anti-CLL1 genomanipulado de la invención expresa al menos un CAR anti-CLL1 de la invención y se usa como un medicamento para el tratamiento de una complicación relacionada con la AML.
Una complicación o enfermedad relacionada con la AML puede incluir una fase de mielodisplasia previa, leucemia secundaria, en particular AML secundaria, recuento alto de glóbulos blancos, y ausencia de bacilos de Auer. Entre otras, la leucostasis y la afectación del sistema nervioso central (SNC), la hiperleucocitosis, la enfermedad residual, también se consideran una complicación o enfermedad relacionada con la AML.
Enfermedades asociadas a la AML
En una realización, la presente invención también proporciona un linfocito T que expresa CAR anti-CLL1 de la invención para el tratamiento de una afección patológica relacionada con la AML.
La presente invención proporciona un linfocito T que expresa CAR anti-CLL1 de la invención para su uso en terapia para neoplasias mieloides relacionadas con la a Ml , para leucemia mieloide aguda y síndrome mielodisplásico, un tratamiento de la leucemia mieloide aguda recidivante o refractaria, un tratamiento de la leucemia promielocítica aguda recidivante o refractaria en adultos, un tratamiento para la leucemia promieloide aguda, un tratamiento de la leucemia mieloide aguda en adultos mayores de 60 años.
La neoplasia hematológica relacionada con afecciones de la AML incluye síndromes mielodisplásicos (MDS, anteriormente conocido como "preleucemia") que son un conjunto diverso de afecciones hematológicas unidas por la producción ineficaz (o displasia) de células sanguíneas mieloides y el riesgo de transformación a AML.
Otras afecciones patológicas o síndromes genéticos asociados con el riesgo de AML pueden mejorarse con el uso adecuado de la presente invención, dichos síndromes genéticos incluyen síndrome de Down, trisomía, anemia de Fanconi, síndrome de Bloom, ataxia-telangiectasia, anemia de Diamond-Blackfan, síndrome de Schwachman-Diamond, síndrome de Li-Fraumeni, neurofibromatosis tipo 1, neutropenia congénita grave (también denominada síndrome de Kostmann).
Otras afecciones patológicas mediadas por CLL1
De acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona una célula inmune linfoide genomanipulada de la invención para su uso en el tratamiento de enfermedades mediadas por células CLL1+. Estas enfermedades mediadas por células CLL1+ incluyen inflamación, tal como artritis reumatoide.
En particular, la célula inmune linfoide genomanipulada de la presente invención puede usarse en el tratamiento de enfermedades mediadas por células CLL1+ tales como inflamación, y más particularmente artritis reumatoide.
Composiciones
Se divulga una composición que comprende linfocitos T genomanipulados de acuerdo con la invención para su uso o un método para tratar una enfermedad.
En un aspecto, la enfermedad es un cáncer hematológico, en particular un cáncer de células madre que incluye, pero sin limitación, leucemia (tal como leucemia mielógena aguda (AML) o una complicación de la misma.
También se divulga una composición para su uso o un método para inhibir la proliferación o reducir una población de células que expresan CLL1 o actividad en un paciente. Un método ilustrativo incluye poner en contacto una población de células que comprenden una célula que expresa CLL1 con una célula CART anti-CLL1, y en particular scCART, de la invención que se une a la célula que expresa CLL1.
En un aspecto más específico, se divulga una composición para su uso o un método para inhibir la proliferación o reducir la población de células cancerosas que expresan CLL1 en un paciente, comprendiendo los métodos poner en contacto la población de células cancerosas que expresan CLL1 con un célula CART anti-CLL1, y en particular scCART, de la invención que se une a la célula que expresa CLL1, la unión de una célula CAR anti-CLL1, y en particular scCART, de la invención a la célula cancerosa que expresa CLL1 dando como resultado la destrucción de las células cancerosas que expresan CLL1
En determinados aspectos, la célula CART anti-CLL1, y en particular scCART, de la invención reduce la cantidad, número, cantidad o porcentaje de células y/o células cancerosas en al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 65 %, al menos un 75 %, al menos un 85 %, al menos un 95 %, o al menos un 99 % (a un nivel indetectable) en un sujeto con o modelo animal para leucemia mieloide u otro cáncer asociado con células que expresan CLL1, en relación con un control negativo.
También se divulga una composición para su uso o un método para prevenir, tratar y/o gestionar un trastorno o afección asociada con células que expresan CLL1 (por ejemplo, asociadas con un cáncer hematológico), comprendiendo los métodos administrar a un sujeto que lo necesita una célula CART anti-CLL1, y en particular scCART, de la invención que se une a la célula que expresa CLL1. En un aspecto, el sujeto es un ser humano. Los ejemplos no limitantes de trastornos asociados con células que expresan CLL1 incluyen trastornos inflamatorios (tal como artritis reumatoide) y cánceres (tales como cánceres hematológicos, en particular AML o complicaciones de la AML).
También se divulga una composición para su uso o un método para prevenir, tratar y/o gestionar una enfermedad asociada con las células que expresan CLL1, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita una célula CART anti-CLL1, y en particular scCART, de la invención que se une a la célula que expresa CLL1. En un aspecto, el sujeto es un ser humano. Los ejemplos no limitantes de enfermedades asociadas con células que expresan CLL1 incluyen, en particular, leucemia mieloide aguda (AML).
Se divulga una composición para su uso o un método para tratar o prevenir la recidiva del cáncer asociado con células que expresan CLL1, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesite una célula CART anti-CLL1, y en particular scCART, de la invención que se une a la célula que expresa CLL1. En otro aspecto, los métodos comprenden administrar al sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de una célula CART anti-CLL1, y en particular scCART, de la invención que se une a la célula que expresa CLL1 en combinación con una cantidad eficaz de otra terapia.
En un aspecto, se considera que CLL1 es un marcador de "células madre cancerosas" en la AML. Por lo tanto, una célula CART anti-CLL1, y en particular scCART, de la invención puede prevenir la recidiva de la AML, o incluso tratar la AML que es mayoritariamente negativa para CLL1 pero con una población "madre" de células CLL1+ (células que expresan CLL1).
En un aspecto, se divulgan composiciones y métodos para tratar sujetos que se han sometido a tratamiento para una enfermedad o trastorno asociado con niveles de expresión elevados de CD 19, y exhiben una enfermedad o trastorno asociado con niveles elevados de CLL1.
El tratamiento con las células inmunes genomanipuladas de acuerdo con la invención puede combinarse con una o más terapias contra el cáncer seleccionadas del grupo de terapia con anticuerpos, quimioterapia, terapia de citocinas, terapia de células dendríticas, terapia génica, terapia hormonal, terapia con luz láser y radioterapia.
Preferentemente, el tratamiento con las células inmunes genomanipuladas de acuerdo con la invención se puede administrar en combinación (por ejemplo, antes, simultáneamente o después de) con una o más terapias contra el cáncer seleccionadas de aracitina, arabinósido de citosina, amsacrina, daunorrubicina, idarrubicina, novantrona, mitoxantrona, vepesid, etopósido (VP16), trióxido de arsénico, ácido transretinoico, combinación de trióxido de arsénico, ácido transretinoico, mecloretamina, procarbazina, clorambucilo, y una combinación de los mismos.
De acuerdo con un caso preferido, dicho tratamiento puede administrarse a pacientes que se someten a un tratamiento inmunosupresor. De hecho, la presente invención se basa preferentemente en células o poblaciones de células, que se han hecho resistentes al menos a un agente inmunosupresor debido a la inactivación de un gen que codifica un receptor para dicho agente inmunosupresor. En este aspecto, el tratamiento inmunosupresor debería ayudar a la selección y expansión de los linfocitos T de acuerdo con la invención en el paciente.
La administración de las células o la población de células de acuerdo con la presente invención puede realizarse de cualquier manera conveniente, incluso por inhalación de aerosol, inyección, ingestión, transfusión, implante o trasplante. Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse a un paciente por vía subcutánea, intradérmica, intratumoral, intraganglionar, intramedular, intramuscular, por inyección intravenosa o intralinfática, o por vía intraperitoneal. En una realización, las composiciones celulares de la presente invención se administran preferentemente mediante inyección intravenosa.
La administración de las células o la población de células puede consistir en la administración de 104-109 células por kg de peso corporal, preferentemente de 105 a 106 células/kg de peso corporal incluyendo todos los valores enteros de números de células dentro de estos intervalos. Las células o la población de células pueden administrarse en una o más dosis. En otra realización, dicha cantidad eficaz de células se administran como una dosis única. En otra realización, dicha cantidad eficaz de células se administra como más de una dosis durante un periodo de tiempo. El momento de la administración está a criterio del médico responsable y depende de la condición clínica del paciente. Las células o la población de células pueden obtenerse de cualquier fuente, tal como un banco de sangre o un donante. Si bien las necesidades individuales varían, la determinación de intervalos óptimos de cantidades eficaces de un tipo celular dado para una enfermedad o afecciones particulares dentro de la habilidad de la técnica. Una cantidad eficaz significa una cantidad que proporciona un beneficio terapéutico o profiláctico. La dosis administrada dependerá de la edad, la salud y el peso del receptor, tipo de tratamiento concomitante, en caso de que lo hubiera, la frecuencia del tratamiento y la naturaleza del efecto deseado.
En otro caso, dicha cantidad eficaz de células o composición que comprende estas células puede administrarse por vía parenteral. Dicha administración puede ser una administración intravenosa. Dicha administración puede realizarse directamente mediante inyección dentro de un tumor.
En determinados casos, las células se administran a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después de) cualquier número de modalidades de tratamiento relevantes, incluyendo, pero sin limitación, el tratamiento con agentes tales como terapia antiviral, cidofovir e interleucina-2, El tratamiento con citarabina (también conocido como ARA-C) o natalizimab para pacientes con EM o el tratamiento con efaliztimab para pacientes con psoriasis u otros tratamientos para pacientes con PML. En casos adicionales, los linfocitos T de la invención pueden usarse en combinación con quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, tal como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos tal como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias de anticuerpos, citoxina, fludaribina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micoplienólico, esteroides, FR901228, citocinas e irradiación. Estos fármacos inhiben la calcineurina fosfatasa dependiente de calcio (ciclosporina y FK506) o inhiben la cinasa p70S6 que es importante para la señalización inducida por el factor de crecimiento (rapamicina) (Henderson, Naya et al. 1991; Liu, Albers et al. 1992; Bierer, Hollander et al. 1993).
En un caso adicional, las composiciones celulares de la presente invención se administran a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después de) un trasplante de médula ósea, terapia ablativa de linfocitos T que utiliza agentes de quimioterapia, tales como, fludarabina, radioterapia de haz externo (XRT), ciclofosfamida o anticuerpos, tales como OKT3 o CAMPATH.
En otro caso, las composiciones celulares de la presente invención se administran después de la terapia ablativa de linfocitos B, tales como agentes que reaccionan con CD20, por ejemplo, Rituxan. Por ejemplo, en una realización, los sujetos pueden someterse a un tratamiento estándar con dosis altas de quimioterapia seguida de trasplante de células madre de sangre periférica. En determinados casos, después del trasplante, los sujetos reciben una infusión de las células inmunes expandidas de la presente invención. En un caso adicional, las células expandidas se administran antes o después de la cirugía.
En determinados casos, las células que expresan scCAR anti-CLL1 se administran a un paciente junto (por ejemplo, antes, simultáneamente o después) con un fármaco seleccionado de aracitina, arabinósido de citosina, amsacrina, daunorrubicina, idarrubicina, novantrona, mitoxantrona, vepesid, etopósido (VP16), trióxido de arsénico, ácido transretinoico, combinación de trióxido de arsénico, ácido transretinoico, mecloretamina, procarbazina, clorambucilo, y una combinación de los mismos. En estos casos, las células que expresan scCAR anti-CLL1 pueden ser resistentes al fármaco particular o combinación de fármacos que se administran junto con células que expresan scCAR anti-CLL1.
En otros casos, las células que expresan scCAR anti-CLL1 se administran a un paciente junto con un fármaco seleccionado de citarabina, antraciclinas, 6-tioguanina, hidroxiurea, prednisona, y una combinación de los mismos. Otras definiciones
- A menos que se especifique de otro modo, "un", "una", "el", "la", y "al menos uno/a" se usan indistintamente y significan uno o más de uno.- Los residuos de aminoácidos en una secuencia polipeptídica se designan en el presente documento de acuerdo con el código de una letra, en donde, por ejemplo, Q significa Gln o residuo de glutamina, R significa Arg o residuo de arginina y D significa Asp o residuo de ácido aspártico.
- Sustitución de aminoácido significa el reemplazo de un residuo de aminoácido por otro, por ejemplo, el reemplazo de un residuo de arginina con un residuo de glutamina en una secuencia peptídica es una sustitución de aminoácidos.
- Los nucleótidos se designan del siguiente modo: se usa un código de una letra para designar la base de un nucleósido: A es adenina, T es timina, C es citosina, y G es guanina. Para los nucleótidos degenerados, r representa g o a (nucleótidos de purina), k representa g o t, s representa g o c, w representa a o t, m representa a o c, y representa t o c (nucleótidos de pirimidina), d representa g, a o t, v representa g, a o c, b representa g, t o c, h representa a, t o c, y n representa g, a, t o c.
- "Como se usan en el presente documento, "ácido nucleico" o "polinucleótidos" se refieren a nucleótidos y/o polinucleótidos, tal como ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos, fragmentos generados por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fragmentos generados por cualquiera de ligadura, escisión, acción de endonucleasa y acción de exonucleasa. Las moléculas de ácido nucleico pueden estar compuestas por monómeros que son nucleótidos de origen natural (tales como ADN y ARN) o análogos de nucleótidos de origen natural (por ejemplo, formas enantioméricas de nucleótidos de origen natural) o una combinación de ambos. Los nucleótidos modificados pueden tener alteraciones en restos de azúcar y/o en restos de bases de pirimidina o purina. Las modificaciones de azúcar incluyen, por ejemplo, reemplazo de uno o más grupos hidroxilo con halógenos, grupos alquilo, aminas y grupos azido, o los azúcares pueden funcionalizarse como éteres o ésteres. Además, todo el resto de azúcar puede ser reemplazado por estructuras similares estérica y electrónicamente, tales como azúcares aza y análogos de azúcar carbocíclico. Los ejemplos de modificaciones en un resto base incluyen purinas y pirimidinas alquiladas, purinas o pirimidinas aciladas, u otros sustitutos heterocíclicos bien conocidos. Los monómeros de ácido nucleico pueden estar unidos mediante enlaces fosfodiéster o análogos de dichos enlaces. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios.
- Por "vector de liberación" o "vectores de liberación" se entiende cualquier vector de liberación que se puede usar en la presente invención para poner en contacto celular (es decir, "contactar") o liberar dentro de células o compartimentos subcelulares (es decir, "introducir") agentes/sustancias químicas y moléculas (proteínas o ácidos nucleicos) necesarios en la presente invención. Incluye, pero sin limitación, vectores de liberación liposómicos, vectores de liberación víricos, vectores de liberación de fármacos, vehículos químicos, vehículos poliméricos, lipoplexos, poliplexos, dendrímeros, microburbujas (medios de contraste de ultrasonidos), nanopartículas, emulsiones u otros vectores de transferencia apropiados. Estos vectores de liberación permiten la liberación de moléculas, sustancias químicas, macromoléculas (genes, proteínas) u otros vectores, tales como plásmidos, péptidos desarrollados por Diatos. En estos casos, los vectores de liberación son vehículos de moléculas. Por "vector de liberación" o "vectores de liberación" también se entienden métodos de administración para realizar la transfección.
- Los términos "vector' o "vectores" se refieren a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un "vector" en la presente invención incluye, pero sin limitación, un vector viral, un plásmido, un vector de ARN o una molécula de ARN o ADN lineal o circular que puede consistir en ácidos nucleicos cromosómicos, no cromosómicos, semisintéticos o sintéticos. Los vectores preferidos son aquellos capaces de replicación autónoma (vector episomal) y/o expresión de ácidos nucleicos a los que están unidos (vectores de expresión). Los expertos en la técnica conocen un gran número de vectores adecuados y están disponibles comercialmente.
Los vectores virales incluyen retrovirus, adenovirus, parvovirus (por ejemplo, virus adenoasociados), coronavirus, virus de ARN de cadena negativa, tales como ortomixovirus (por ejemplo, virus de la gripe), rabdovirus (por ejemplo, virus de la rabia y virus de la estomatitis vesicular), paramixovirus (por ejemplo, sarampión y Sendai), virus de ARN de cadena positiva, tales como picornavirus y alfavirus, y virus de ADN de doble cadena, incluyendo adenovirus, virus del herpes (por ejemplo, virus del herpes simple tipos 1 y 2, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus) y poxvirus (por ejemplo, vaccinia, viruela aviar y viruela del canario). Otros virus incluyen el virus Norwalk, togavirus, flavivirus, reovirus, papovavirus, hepadnavirus y virus de la hepatitis, por ejemplo. Los ejemplos de retrovirus incluyen: leucosis-sarcoma aviar, tipo C de mamífero, virus de tipo B, virus de tipo D, grupo HTLV-BLV, lentivirus, espumavirus (Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, En Fundamental Virology, Tercera edición, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Filadelfia, 1996).
- Por "vector lentiviral" se entiende vectores lentivirales basados en el VIH que son muy prometedores para la liberación de genes debido a su capacidad de empaquetamiento relativamente grande, inmunogenicidad reducida y su capacidad para transducir de manera estable con alta eficiencia una amplia gama de diferentes tipos de células. Los vectores lentivirales generalmente se generan después de la transfección transitoria de tres (empaquetamiento, envoltura y transferencia) o más plásmidos en las células productoras. Como el VIH, los vectores lentivirales entran en la célula diana a través de la interacción de las glucoproteínas de la superficie viral con los receptores en la superficie celular. Al entrar, el ARN del virus sufre transcripción inversa, que está mediada por el complejo de transcriptasa inversa del virus. El producto de la transcripción inversa es un ADN viral lineal bicatenario, que es el sustrato para la integración viral en el ADN de las células infectadas. Por "vectores lentivirales integrativos (o LV)", se entienden dichos vectores como ejemplo no limitante, que son capaces de integrarse en el genoma de una célula diana. Por el contrario, por "vectores lentivirales no integrativos (o NILV)" se entiende vectores de liberación de genes eficientes que no se integran el genoma de una célula diana a través de la acción de la integrasa del virus.
- Los vectores y vectores de liberación pueden asociarse o combinarse con cualquier técnica de permeabilización celular, tales como sonoporación o electroporación o derivados de estas técnicas.
- Por célula o células se entiende cualquier célula viva eucariota, células primarias y líneas celulares derivadas de estos organismos para cultivos in vitro.
- Por "célula primaria" o "células primarias" se entiende células tomadas directamente de tejido vivo (es decir, material de biopsia) y establecidas para el crecimiento in vitro, que han sufrido muy pocas duplicaciones de población y, por lo tanto, son más representativos de los principales componentes funcionales y características de los tejidos de los que derivan, en comparación con líneas celulares tumorigénicas continuas o inmortalizadas artificialmente.
Como ejemplos no limitantes, las líneas celulares pueden seleccionarse del grupo que consiste en células CHO-K1; células HEK293; células Caco2; células U2-OS; células NIH 3T3; células NSO; células SP2; células CHO-S; células DG44; células K-562, células U-937; células MRC5; células IMR90; células Jurkat; células HepG2; células HeLa; células HT-1080; células HCT-116; células Hu-h7; células Huvec; células Molt 4.
Todas estas líneas celulares pueden modificarse mediante el método de la presente invención para proporcionar modelos de líneas celulares para producir, expresar, cuantificar, detectar, estudiar un gen o una proteína de interés; estos modelos también se pueden utilizar para detectar moléculas biológicamente activas de interés en investigación y producción, y en varios campos tales como el químico, biocombustibles, productos terapéuticos y agronomía como ejemplos no limitantes.
- por "mutación" se entiende la sustitución, eliminación, inserción de hasta uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, veinte, veinticinco, treinta, cuarenta, cincuenta o más nucleótidos/aminoácidos en un polinucleótido (ADNc, gen) o una secuencia polipeptídica. La mutación puede afectar a la secuencia codificante de un gen o a su secuencia reguladora. También puede afectar a la estructura de la secuencia genómica o a la estructura/estabilidad del ARNm codificado.
- por "variante(s)", se entiende una variante repetida, una variante, una variante de unión a ADN, una variante de una nucleasa TALE, una variante de polipéptido obtenida por mutación o reemplazo de al menos un residuo en la secuencia de aminoácidos de la molécula precursora.
- por "variante funcional" se entiende un mutante catalíticamente activo de una proteína o un dominio de proteína; dicho mutante puede tener la misma actividad en comparación con su proteína precursora o dominio de proteína o propiedades adicionales, o actividad más alta o más baja.
- "Identidad", se refiere a la identidad de secuencia entre dos moléculas de ácido nucleico o polipéptidos. La identidad se puede determinar comparando una posición en cada secuencia que se puede alinear a efectos de comparación. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por la misma base, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. Un grado de similitud o identidad entre las secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos va en función del número de nucleótidos idénticos o coincidentes en las posiciones compartidas por las secuencias de ácido nucleico. Se pueden usar diversos algoritmos y/o programas de alineación para calcular la identidad entre dos secuencias, incluyendo FASTA o BLAST, que están disponibles como parte del paquete de análisis de secuencia GCG (Universidad de Wisconsin, Madison, Wis.), y se pueden usar con, por ejemplo, una configuración predeterminada. Por ejemplo, se contemplan polipéptidos que tienen al menos un 70 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o un 99 % de identidad con polipéptidos específicos descritos en el presente documento y que preferentemente exhiben sustancialmente las mismas funciones, así como polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos.
- "similitud" describe la relación entre las secuencias de aminoácidos de dos o más polipéptidos. BLASTP también se puede usar para identificar una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 87,5 %, 90 %, 92,5 %, 95 %, 97,5 %, 98 %, 99 % de similitud de secuencia con una secuencia de aminoácidos de referencia usando una matriz de similitud tal como BLOSUM45, BLOSUM62 o BLOSUM80. A menos que se indique de otro modo, una puntuación de similitud se basará en el uso de BLOSUM62. Cuando se usa BLASTP, el porcentaje de similitud se basa en la puntuación de positivos de BLASTP y el porcentaje de identidad de secuencia se basa en la puntuación de identidades de BLASTP. Las "identidades" de BLASTP muestran el número y la fracción de residuos totales en los pares de secuencias de alta puntuación que son idénticos; y "Positivos" de BLASTP muestran el número y la fracción de residuos para los que las puntuaciones de alineación tienen valores positivos y que son similares entre sí. Las secuencias de aminoácidos que tienen estos grados de identidad o similitud o cualquier grado intermedio de identidad de similitud con las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento se contemplan y se incluyen en esta divulgación. Las secuencias de polinucleótidos de polipéptidos similares se deducen usando el código genético y se pueden obtener por medios convencionales. Por ejemplo, una variante funcional de pTalfa puede tener un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 87,5 %, 90 %, 92,5 %, 95 %, 97,5 %, 98 %, 99 % de similitud de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107 tal como se divulga en el documento WO2013176916. Un polinucleótido que codifica una variante funcional de este tipo se produciría mediante la traducción inversa de su secuencia de aminoácidos utilizando el código genético.
El término "sujeto" o "paciente", como se usa en el presente documento, incluye todos los miembros del reino animal, incluidos los primates no humanos y los seres humanos.
El término "recidiva" se refiere a una situación, en la que un sujeto o un mamífero, que ha tenido una remisión del cáncer después de la terapia, tiene un retorno de las células cancerosas.
El término "refractario o resistente" se refiere a una circunstancia, en la que un sujeto o un mamífero, incluso después de un tratamiento intensivo, tiene células cancerosas residuales en su cuerpo.
La expresión "resistencia a fármacos" se refiere a la condición cuando una enfermedad no responde al tratamiento de un fármaco o fármacos. La resistencia a fármacos puede ser intrínseca (o resistencia primaria), lo que significa que la enfermedad nunca ha respondido al fármaco o fármacos, o puede ser adquirida, lo que significa que la enfermedad deja de responder a un fármaco o fármacos a los que la enfermedad había respondido anteriormente (resistencia secundaria). En determinadas realizaciones, la resistencia a fármacos es intrínseca. En determinadas realizaciones, la resistencia a fármacos es adquirida.
El término "neoplasia hematológica" o "cáncer hematológico" se refiere a un cáncer de la médula ósea y/o tejido linfático del cuerpo. Ejemplos de neoplasias hematológicas incluyen, en particular, leucemia mieloide aguda (a Ml ), AML con mielodisplasia de tres linajes (AML/TMDS), leucemia de linaje mixto (MLL), y otras patologías relacionadas con AM.
El término "leucemia" se refiere a neoplasias malignas de los tejidos que forman la sangre, incluyendo, en particular, leucemia mieloide aguda o leucemia mielógena aguda (AML).
La descripción escrita anteriormente de la invención proporciona una manera y proceso de hacerla y usarla de tal manera que cualquier experto en esta técnica esté habilitado para hacerla y usarla, estando esta habilitación proporcionada en particular para la materia objeto de las reivindicaciones adjuntas, que forman parte de la descripción original.
Cuando se indique un límite numérico o un intervalo en el presente documento, se incluyen los puntos extremos. Además, todos los valores y subintervalos dentro de un límite o intervalo numérico se incluyen específicamente como si se hubieran escrito explícitamente.
Habiendo descrito generalmente la presente invención, se puede obtener una mayor comprensión haciendo referencia a determinados ejemplos específicos, que se proporcionan en el presente documento solo con fines ilustrativos y no se pretende que sean limitantes, a menos que se especifique lo contrario.
Ejemplos
MÉTODOS GENERALES
Cultivos de linfocitos T primarios
Se purificaron linfocitos T a partir de muestras de capa leucocitaria proporcionadas por EFS (Etablissement Frangais du Sang, París, Francia) usando medio de densidad en gradiente Ficoll. Se recuperó la capa de PBMC y los linfocitos T se purificaron usando un kit de enriquecimiento de linfocitos T disponible comercialmente. Los linfocitos T purificados se activaron en medio X-Vivo™-15 (Lonza) complementado con 20 ng/ml de IL-2 humana, humana al 5 % y activador de linfocitos T humanos Dynabeads CD3/CD28 en una relación 1:1 de perlas:células (Life Technologies).
Transfección de ARNm de scCAR
Las transfecciones se realizaron el Día 4 o el Día 11 después de la purificación y la activación de los linfocitos T. Se transfectaron 5 millones de células con 15 pg de ARNm que codificaba las diferentes construcciones de scCAR. Los ARNm de scCAR se produjeron utilizando transfecciones de ARNm polimerasa T7 realizadas con tecnología Cytopulse, aplicando dos pulsos de 0,1 mS a 3000 V/cm seguidos de cuatro pulsos de 0,2 mS a 325 V/cm en cubetas con huecos de 0,4 cm en un volumen final de 200 pl de "tampón de citoporación T" (BTX Harvard Apparatus). Las células se diluyeron inmediatamente en medio X-Vivo™-15 y se incubaron a 37 °C con CO2 al 5 %.
Se añadió IL-22 h después de la electroporación a 20 ng/ml.
Ensayo de desgranulación (movilización de CD107a)
Se incubaron linfocitos T en placas de 96 pocillos (40.000 células/pocillo), junto con una cantidad igual de células que expresaban diversos niveles de la proteína CLL1. Los cocultivos se mantuvieron en un volumen final de 100 pl de medio X-Vivo™-15 (Lonza) durante 6 horas a 37 °C con CO2 al 5 %. La tinción de CD107a se realizó durante la estimulación celular, mediante la adición de un anticuerpo anti-CD107a fluorescente al comienzo del cocultivo, junto con 1 pg/ml de anti-CD49d, 1 pg/ml de anti-CD28, y una solución de monensina 1x. Después del periodo de incubación de 6 h, las células se tiñeron con un colorante de viabilidad fijable y anti-CD8 conjugado con fluorocromo y se analizaron mediante citometría de flujo. La actividad de desgranulación se determinó como el % de células CD8+/CD107a+, y determinando la señal de intensidad de fluorescencia media (MFI) para la tinción de CD107a entre células CD8+. Los ensayos de desgranulación se realizaron 24 h después de la transfección del ARNm.
Ensayo de liberación de IFN gamma
Se incubaron linfocitos T en placas de 96 pocillos (40.000 células/pocillo), junto con líneas celulares que expresan diversos niveles de la proteína CLL1. Los cocultivos se mantuvieron en un volumen final de 100 pl de medio X-Vivo™-15 (Lonza) durante 24 horas a 37 °C con CO2 al 5 %. Después de este periodo de incubación, las placas se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos y los sobrenadantes se recuperaron en una nueva placa. La detección de IFN gamma en los sobrenadantes del cultivo celular se realizó mediante un ensayo ELISA. Los ensayos de liberación de IFN gamma se realizaron iniciando los cocultivos celulares 24 h después de la transfección del ARNm. Ensayo de citotoxicidad
Se incubaron linfocitos T en placas de 96 pocillos (100.000 células/pocillo), junto con 10.000 células diana (que expresan CLL1) y 10.000 células de control (CLL1neg) en el mismo pocillo. Las células diana y de control se marcaron con colorantes intracelulares fluorescentes (CFSE o Cell Trace Violet) antes de cocultivarlas con linfocitos T scCAR+. Los cocultivos se incubaron durante 4 horas a 37 °C con CO2 al 5 %. Después de este periodo de incubación, las células se marcaron con un colorante de viabilidad fijable y se analizaron mediante citometría de flujo. Se determinó la viabilidad de cada población celular (células diana o células de control CLL1neg) y se calculó el % de lisis celular específica. Los ensayos de citotoxicidad se realizaron 48 h después de la transfección del ARNm.
Transducción de linfocitos T
La transducción de linfocitos T con vectores lentivirales recombinantes de expresión de scCAR se realizó tres días después de la purificación/activación de linfocitos T. La detección de scCAR en la superficie de los linfocitos T se realizó usando una proteína recombinante que consistía en la fusión del dominio extracelular de la proteína CLL1 humana, junto con un fragmento Fc de IgG1 murina. La unión de esta proteína a la molécula scCAR se detectó con un anticuerpo secundario conjugado con fluorocromo dirigido a la porción Fc de ratón de la proteína, y se analizó por citometría de flujo.
Modelo de ratón antitumoral
A ratones NOG inmunodeficientes se les inyectó por vía intravenosa (iv) células MOLM13-luciferasa que expresaban CLL1 como un modelo de ratón de xenoinjerto de AML. Opcionalmente, los ratones recibieron un tratamiento contra el cáncer. A continuación, a los ratones se les inyectó iv (2 o 7 días después de la inyección de la línea de células tumorales) diferentes dosis de linfocitos T scCAR+ a ensayar, o linfocitos T que no se transdujeron con el vector lentiviral de scCAR. Las señales bioluminiscentes se determinaron el día de la inyección de linfocitos T (D0), en D7, 14, 21, 28 y 40 después de la inyección de linfocitos T para seguir la progresión tumoral en los diferentes animales. Ejemplo 1: Proliferación de células inactivadas con TCRalfa que expresan un scCAR CLL1
Se diseñaron y se produjeron nucleasas TALE heterodimérica dirigidas a dos secuencias de 17 pb de longitud (denominadas semidianas) separadas por un espaciador de 15 pb dentro del gen de la región de cadena constante alfa del receptor de linfocitos T (TRAC). Cada semidiana es reconocida por repeticiones de las seminucleasas TALE enumeradas en la Tabla 10.
Tabla 10: Nucleasas TAL diri idas al en TCRalfa
Figure imgf000051_0001
Cada construcción de nucleasa TALE se subclonó usando digestión con enzimas de restricción en un vector de expresión de mamífero bajo el control del promotor T7. El ARNm que codifica la secuencia genómica TRAC que escinde la nucleasa TALE se sintetizó a partir del plásmido que llevaba la secuencia codificante cadena abajo del promotor T7.
Se transfectaron linfocitos T purificados preactivados durante 72 horas con perlas recubiertas con antiCD3/CD28 con cada uno de los 2 ARNm que codificaban ambas seminucleasas TALE TRAC_T01. 48 horas después de la transfección, diferentes grupos de linfocitos T del mismo donante se transdujeron respectivamente con un vector lentiviral que codificaba uno de los scCAR anti-CLL1 descritos anteriormente (SEQ ID NO: 35 a 112). 2 días después de la transducción, las células CD3NEG se purificaron usando perlas magnéticas anti-CD3 y 5 días después de la transducción se reactivaron las células con anti-CD28 soluble (5 pg/ml).
Se siguió la proliferación celular durante hasta 30 días después de la reactivación contando las células 2 veces por semana. Se observó un aumento de la proliferación en células inactivadas con TCR alfa que expresaban los scCAR de CLL1, especialmente cuando se reactivaron con anti-CD28, en comparación con las células no transducidas. Para investigar si los linfocitos T humanos que expresan scCAR CLL1 muestran un estado activado, la expresión del marcador de activación CD25 se analiza mediante FACS 7 días después de la transducción. Las células purificadas transducidas con el vector lentiviral que codifica scCAR CLL1 ensayaron la expresión de CD25 en su superficie con el fin de evaluar su activación en comparación con las células no transducidas. Se espera un aumento de la expresión de CD25 tanto en condiciones de reactivación de CD28 como en condiciones de no reactivación.
Ejemplo 2: Construcción de scCAR CLL1 usando diversos fragmentos de anticuerpo anti-CLL1
Cultivos de linfocitos T primarios
Se purificaron linfocitos T a partir de muestras de capa leucocitaria proporcionadas por EFS (Etablissement Franpais du Sang, París, Francia) utilizando medio de densidad en gradiente Ficoll (Ficoll Paque PLUS/GE Healthcare Life Sciences). Se recuperó la capa de PBMC y los linfocitos T se purificaron usando un kit de enriquecimiento de linfocitos T disponible comercialmente (Stem Cell Technologies). Los linfocitos T purificados se activaron en medio X-Vivo™-15 (Lonza) complementado con 20 ng/ml de IL-2 humana (Miltenyi Biotech), suero humano al 5 % (Sera Laboratories) y activador de linfocitos T humanos Dynabeads CD3/CD28 en una relación 1:1 de perlas:células (Life Technologies). Después de la activación, las células se cultivaron y se mantuvieron en medio X-Vivo™-15 (Lonza) complementado con 20 ng/ml de IL-2 humana (Miltenyi Biotec) y suero humano al 5 % (Sera Laboratories) Transfección de ARNm de scCAR
Las transfecciones se realizaron el Día 4 o el Día 11 después de la purificación y la activación de los linfocitos T. Se transfectaron 5 millones de células con 15 pg de ARNm que codifica las diferentes construcciones de scCAR. Los ARNm de scCAR se produjeron usando el kit mMESSAGE mMACHINE T7 (Life Technologies) y se purificaron usando columnas RNeasy Mini Spin (Qiagen). Las transfecciones se realizaron usando tecnología Cytopulse, aplicando dos pulsos de 0,1 mS a 3000 V/cm seguidos de cuatro pulsos de 0,2 mS a 325 V/cm en cubetas con huecos de 0,4 cm en un volumen final de 200 pl de "tampón de citoporación T" (BTX Harvard Apparatus). Las células se diluyeron inmediatamente en medio X-Vivo™-15 (Lonza) y se incubaron a 37 °C con CO2 al 5 %. Se añadió IL-2 (de Miltenyi Biotec 2 h después de la electroporación a 20 ng/ml.
Ensayo de desgranulación (movilización de CD107a)
Se incubaron linfocitos T en placas de 96 pocillos (40.000 células/pocillo), junto con una cantidad igual de células que expresaban o no la proteína CLL1. Los cocultivos se mantuvieron en un volumen final de 100 pl de medio X-Vivo™-15 (Lonza) durante 6 horas a 37 °C con CO2 al 5 %. La tinción de CD107a se realizó durante la estimulación celular, mediante la adición de un anticuerpo anti-CD107a fluorescente (conjugado con APC, de Miltenyi Biotec) al comienzo del cocultivo, junto con 1 pg/ml de anti-CD49d (BD Pharmingen), 1 pg/ml de anti-CD28 (Miltenyi Biotec), y una solución de monensina 1x (eBioscience). Después del periodo de incubación de 6 h, las células se tiñeron con un colorante de viabilidad fijable (eFluor 780, de eBioscience) y anti-CD8 conjugado con fluorocromo (Miltenyi Biotec conjugado con PE) y se analizaron mediante citometría de flujo. La actividad de desgranulación se determinó como el % de células CD8+/CD107a+, y determinando la señal de intensidad de fluorescencia media (MFI) para la tinción de CD107a entre células CD8+. Los ensayos de desgranulación se realizaron 24 h después de la transfección del ARNm.
Ensayo de liberación de IFNgamma
Se incubaron linfocitos T en placas de 96 pocillos (40.000 células/pocillo), junto con líneas celulares que expresaban o no la proteína CLL1. Los cocultivos se mantuvieron en un volumen final de 100 pl de medio X-Vivo™-15 (Lonza) durante 24 horas a 37 °C con CO2 al 5 %. Después de este periodo de incubación, las placas se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos y los sobrenadantes se recuperaron en una nueva placa. La detección de IFN gamma en los sobrenadantes de cultivos celulares se realizó mediante un ensayo ELISA (kit de ELISA de IFN gamma humano Quantikine, de R&D Systems). Los ensayos de liberación de IFN gamma se realizaron iniciando los cocultivos celulares 24 h después de la transfección del ARNm.
Ensayo de citotoxicidad
Se incubaron linfocitos T en placas de 96 pocillos (100.000 células/pocillo), junto con 10.000 células diana (que expresan CLL1) y 10.000 células de control (CLL1neg) en el mismo pocillo. Las células diana y de control se marcaron con colorantes intracelulares fluorescentes (CFSE o Cell Trace Violet, de Life Technologies) antes de cocultivarlas con linfocitos T scCAR+. Los cocultivos se incubaron durante 4 horas a 37 °C con CO2 al 5 %. Después de este periodo de incubación, las células se marcaron con un colorante de viabilidad fijable (eFluor 780, de eBioscience) y se analizaron mediante citometría de flujo. Se determinó la viabilidad de cada población celular (células diana o células de control CLL1neg) y se calculó el % de lisis celular específica. Los ensayos de citotoxicidad se realizaron 48 h después de la transfección del ARNm.
Receptores de antígeno quimérico monocatenario anti-CLL1 ilustrativos
sc SC02-357-CAR-v1 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.35)
MALPVTALLLPLALLLHAARP QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCWSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHS GSPNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSSSGGFFDYWGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGG GGS DIQ.MTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQ5ISSYLNWYQQKPG KAPKLLIYAAS5LQ.SGVP5RFSGSG5GTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQSYSTPPTFGQGTKVEIK GLAVSTISSFFPPGYQIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYI FKQ.PFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQ.LYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDP EMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
sc SC02-357-CAR-v2 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.36)
Figure imgf000053_0001
sc SC02-357-CAR-v3 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.37)
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCWSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHS GSPNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSSSGGFFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGG GGS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQSYSTPPTFGQGTKVEIKrrTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYI WAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQ.TTQ.EEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQ.Q GQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQ.KDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDG LYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
sc SC02-357-CAR-v4 (S E Q ID NO.1 S E Q ID NO. 38)
MALPVTALLLPLALLLHAARP QVQ.LQESGPGLVKPSETLSLTCVVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHS GSPNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSSSGGFFDYWGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGG GGS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTUCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPED FATYYCQQSYSTP PTFGQGTKVEIK TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIIS FFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQ. QGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQ.KDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHD GLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
sc SC02-357-CAR-v5 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.39)
Figure imgf000054_0001
sc SC02-378 CAR-v2 (S E Q ID NO.1 S E Q ID N O .42 )
Figure imgf000055_0001
sc SC02-378 CAR-v3 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.43)
MALPVTALLLPLALLLHAARPlQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCVVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHS GSPNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSSSGGFFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGG GGS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQSYSTPPTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYI WAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQ GQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRG KGHDG LYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
sc SC02-378 CAR-v4 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO. 44)
MALPVTALLLPLALLLHAARP QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCVVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHS GSPNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSSSGGFFDYWGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGG GGS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPED FATYYCQQSYSTP PTFGQGTKVEIK TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIIS FFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQ QGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHD G LYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
sc SC02-378 CAR-v5 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.45)
KGQ.PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ.PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQT TQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNP QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
sc SC02-161 CAR-v1 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.47)
Figure imgf000056_0001
sc SC02-161 CAR-v3 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.49)
MALPVTALLLPLALLLHAARPbVQLQESGPGLVKPSETLSLTCVVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHS GSPNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARQTTAGSFDYWGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGG GGS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQ.QKPGKAPKLUYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQ.PEDFATYYCQQ.SYSTPPTFGQ.GTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQ.PLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYI WAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQ.EEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQ GQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGFIDG LYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
sc SC02-161 CAR-v4 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.50)
MALPVTALLLPLAiLLLHAARP QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCVVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHS GSPNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARQ.TTAGSFDYWGQGTLVTVSS GGGGSGGGGSGG GGS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPED FATYYCQQSYSTP PTFGQGTKVEIK TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIIS FFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQ QGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHD G LYQG LSTATKDTYDALH MQALPPR
sc SC02-161 CAR-v5 (S E Q ID NO.1 S E Q ID N O .51 )
Figure imgf000057_0001
sc M26 CAR-v1 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.53 )
MALPVTALLLPLALLLHAARP EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYFIHWVKQKPGQGLEWIGFINPYN DGS KYN E KF KG KATLTS D KSSSTAYM E LSSLTS EDSAVYYCTR D DG YYG YAM DY W G QGTSVTVSS GGGGSGGGGS GGGGS DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRATQELSGYLSWLQQKPDGTIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGNRSGSDYSL TISSLESEDFADYYCLQYAIYPYTFGGGTKLEIKRGLAVSTISSFFPPGYQIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKL LYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGR DPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR sc M26 CAR-v2 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.54)
Figure imgf000057_0002
s c M 26 C A R -v 3 (S E Q ID NO.1 S E Q ID N O .55)
MAFPVTAFLFPFAFFFHAARP EVQFQQSGPEFVKPGASVKMSCKASGYTFTSYFIHWVKQKPGQGFEWIGFINPYN DGSKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCTRDDGYYGYAMDYWGQGTSVTVSS GGGGSGGGGS GGGGSDIQMTQSPSSFSASFGERVSFTCRATQEFSGYFSWFQQKPDGTIKRFIYAASTLDSGVPKRFSGNRSGSDYSL TISSLESEDFADYYCLgYAIYPYTFGGGTKLEIKRrTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQ.PFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAY QQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGH DGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
sc M26 CAR-v4 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.56)
MAFPVTAFLLPFAFLFHAARPEVQFQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYFIHWVKQKPGQGFEWIGFINPYN DGSKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCTRDDGYYGYAMDYWGQGTSVTVSS GGGGSGGGGS GGGGS DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRATQELSGYLSWLQQKPDGTIKRUYAASTLDSGVPKRFSGNRSGSDYSL TISSLESEDFADYYCLQYAIYPYTFGGGTKLEIKR TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD IISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQ.TTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPA YQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKG HDGLYQGFSTATKDTYDALHMQALPPR
sc M26 CAR-v5 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.57)
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYFIHWVKQKPGQGLEWIGFINPYN DGSKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCTRDDGYYGYAMDYWGQGTSVTVSS GGGGSGGGGS
GGGGS DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRATQELSGYLSWLQQKPDGTIKRUYAASTLDSGVPKRFSGNRSGSDYSL TISSLESEDFADYYCLQYAIYPYTFGGGTKLEIKR^ EPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTC VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ.KSLSLSPGKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQ TTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKN PQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
sc M26 CAR-v6 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.58)
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYFIHWVKQKPGQGLEWIGFINPYN DGSKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCTRDDGYYGYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGS GGGGS DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRATQELSGYLSWLQQKPDGTIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGNRSGSDYSL TISSLESEDFADYYCLQYAIYPYTFGGGTKLEIKR EPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTC VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPV QTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRK NPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
sc M31 CAR-v1 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.59)
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPY NDGTKYNEKFKGKATLTSDTSSSTAYMELNSLTSEDSAVYFCARPIYFDNDYFDYWGQGTTLKVSS GGGGSGGGGS GGGGSTIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLUYLASNLESGVPARFSGSGSR TDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNNYDPWTFGGGTKLEIKiGLAVSTISSFFPPGYQIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDV LDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ ALPPR
sc M31 CAR-v2 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.60)
MALPVTALLLPLALLLHAARP EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPY NDGTKYNEKFKGKATLTSDTSSSTAYMELNSLTSEDSAVYFCARPIYFDNDYFDYWGQGTTLKVSS GGGGSGGGGS GGGGSTIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLUYLASNLESGVPARFSGSGSR TDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNNYDPWTFGGGTKLEIKGLAVSTI5SFFPPGYQII5FFLALT5TALLFLLFFLTLRF5V VKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYD
VLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHM QALPPR
sc M31 CAR-v3 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO. 61)
MALPVTALLLPLALLLHAARP EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPY NDGTKYNEKFKGKATLTSDTSSSTAYMELNSLTSEDSAVYFCARPIYFDNDYFDYWGQGTTLKVSSGGGGSGGGGS GGGGSTIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLUYLASNLESGVPARFSGSGSR TDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNNYDPWTFGGGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTR GLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSR SADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQ.KDKMAEAYSEIGMKGE RRRGKGHDG LYQG LSTATKDTYDALH MQALPPR
sc M31 CAR-v4 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.62)
MALPVTALLLPLALLLHAARP EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPY NDGTKYNEKFKGKATLTSDTSSSTAYMELNSLTSEDSAVYFCARPIYFDNDYFDYWGQGTTLKVSS GGGGSGGGGS GGGGSTIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLUYLASNLESGVPARFSGSGSR TDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNNYDPWTFGGGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTR GLDFACDIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFS RSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKG ERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALH MQALPPR
sc M31 CAR-v5 (S E Q ID NO.1 S E Q ID NO. 63 )
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPY NDGTKYNEKFKGKATLTSDTSSSTAYMELNSLTSEDSAVYFCARPIYFDNDYFDYWGQGTTLKVSS GGGGSGGGGS GGGGSTIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSR TDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNNYDPWTFGGGTKLEIK EPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIA RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQP FMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMG GKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGFIDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
sc M31 CAR-v6 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.64)
MALPVTALLLPLALLLHAARP EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPY NDGTKYNEKFKGKATLTSDTSSSTAYMELNSLTSEDSAVYFCARPIYFDNDYFDYWGQGTTLKVSS GGGGSGGGGS GGGGSTIVLTQ.SPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNSFMHWYQ.QKPGQPPKLUYLASNLESGVPARFSGSGSR TDFTLTIDPVEADDAATYYCQ.QNNYDPWTFGGGTKLEIK EPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIA RTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKIMQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQ PFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEM GGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
sc G4 CAR-v1 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.65)
Figure imgf000060_0001
sc G4 CAR-v3 (S E Q ID NO.1 S E Q ID NO. 67 )
MALPVTALLLPLALLLHAARP EVQLQQ.SGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQ.SHEKNLEWIGPINPYN DGTIYNPNFKGKATLTVDKASSTAYMELLSLTSDDPAVYYCARTDDYDDYTMDYWGQGTSVTVSS GGGGSGGGG SGGGGS EIQMTQTPSSLSASLGDRVTISCRASHDISNYLNWYQQKPDGTLKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYS LTISNLEQEDIATYFCQQGKTLLWTFGGGTKLEIKjrTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA CDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAP AYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGK G H DG LYQG LST ATKDTY DALEIM QALPP R
sc G4 CAR-v4 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO. 68)
MALPVTALLLPLALLLHAARP EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQ.SHEKNLEWIGPINPYN DGTIYNPNFKGKATLTVDKASSTAYMELLSLTSDDPAVYYCARTDDYDDYTMDYWGQGTSVTVSS GGGGSGGGG SGGGGS EIQMTQTPSSLSASLGDRVTISCRASHDISNYLNWYQQKPDGTLKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYS LTISNLEQEDIATYFCQQGKTLLWTFGGGTKLEIK<[mPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA CDIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADA PAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRG KGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
sc G4 CAR-v5 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO. 69)
Figure imgf000061_0001
sc M22 CAR-v1 (S E Q ID NO.1 S E Q ID N O .71)
Figure imgf000062_0001
sc M22 CAR-v4 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.74)
MALPVTALLLPLALLLHAARP QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTRYWMHWVKQRPGQGLEWIGNIDP SDTETHYNQQFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAIYYGNPSYYAMDYWGQGTSVTVSS GGGGSGG GGSGGGGS DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQNLLNSGNQKKYLNWYQAKPGQPPKLUYWASTRESGVPD RFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYFCQNDYSYPFTFGAGTKLELKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAG GAVHTRGLDFACDIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGC ELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYS EIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
sc M22 CAR-v5 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.75)
Figure imgf000063_0001
sc M29 CAR-v3 (S E Q ID NO.1 S E Q ID N O .79)
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYIFTSYVMYWVKQKPGQGLEWIGYINPY NDGTKYNEKFKG KATLTS DKSSSTAYM ELSS LTS E DSAVYYCA RYYD YDYYF DYWGQGTTLTVSS GGGGSGGGGSG GGGSDIQMTQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDINKYIAWYQHKPGKGPRLLIEIYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSI SNLEPEDIATYYCLQYDYLWTFGGGTKLEIK TTTPAPRPPTPAPTIA5QPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYI WAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQ GQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQ.KDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDG LYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
sc M29 CAR-v4 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.80)
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYIFTSYVMYWVKQKPGQGLEWIGYINPY NDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARYYDYDYYFDYWGQGTTLTVSS GGGGSGGGGSG GGGSDIQMTQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDINKYIAWYQHKPGKGPRLUHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSI SNLEPEDIATYYCLQYDYLWTFGGGTKLEIKfmPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIIS FFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQ.EEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQ. QGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHD GLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
sc M29 CAR-v5 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.81)
Figure imgf000064_0001
sc M2 CAR-v1 (S E Q ID NO.1 S E Q ID N O .83 )
Figure imgf000065_0001
sc M2 CAR-v3 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO. 85)
MALPVTALLLPLALLLHAARP EVQ.LRQ.SGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYFMHWVKQ.KPGQGLEWIGFINPY NDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELNSLTSEDSAVYYCTRDDGYYDYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGG GSGGGGS DIQMTQ.SPS5LSA5LGERV5LTCRASQ.EISVYLSWLQQKPDGTIKRLIYAASTLDSGVPERFSGSRSGSDY i_ S_L_T_I_S_S_L_E__S_E_D__F_A_D_Y__Y_C_L_Q__Y_A_S__Y_P_Y_T__F_G_G__G_T_K__L_E_IK_R pTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA CDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAP AYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGK GHDGLYQ.GLSTATKDTYDALHMQ.ALPPR
sc M2 CAR-v4 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.86)
MALPVTALLLPLALLLHAARP EVQLRQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYFMHWVKQKPGQGLEWIGFINPY NDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELNSLTSEDSAVYYCTRDDGYYDYAMDYWGQGTSVTVSS GGGGSGGG GSGGGGS DIQ.MTQSPSSLSASLGERVSLTCRA5QEISVYLSWLQQKPDGTIKRLIYAASTLDSGVPERFSGSRSGSDY SLTISSLESEDFADYYCLQYASYPYTFGGGTKLEIKRfFTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA CDIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADA PAYQQGQNQ.LYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRG KGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
sc M2 CAR-v5 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO. 87)
MALPVTALLLPLALLLHAARP EVQLRQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYFMHWVKQKPGQGLEWIGFINPY NDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELNSLTSEDSAVYYCTRDDGYYDYAMDYWGQGTSVTVSS GGGGSGGG GSGGGGS DIQMTQSPS5LSASLGERV5LTCRA5QEISVYLSWLQQKPDGTIKRLIYAASTLDSGVPERFSGSRSG5DY SLTISSLESEDFADYYCLQYASYPYTFGGGTKLEIKR EPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEV TCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ.YNSTYRVVSVLTVLHQ.DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRP VQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPR RKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
sc M2 CAR-v6 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.88)
MALPVTALLLPLALLLHAARP|EVQLRQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYFMHWVKQKPGQGLEWIGFINPY| NDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELNSLTSEDSAVYYCTRDDGYYDYAMDYWGQGTSVTVSS GGGGSGGG GSGGGGS DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQEISVYLSWLQQKPDGTIKRLIYAASTLDSGVPERFSGSRSGSDY SLTISSLESEDFADYYCLQYASYPYTFGGGTKLEIKR EPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEV TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK
TISKAKGQ.PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ.PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMR PVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPR RKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
sc M5 CAR-v1 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.89)
MALPVTALLLPLALLLHAARP|EVQLQQ5GAELVRPGASVKLSCTA5GFNIKDDYIHWVKQRPEQGLEWIGWIDPEI^ GDTAYASKFQDKATITSDTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCTLTGRFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGS^ |lVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLY5SNQKNNLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDF| TLTISSVQAEDLAVYYCQQYYSYRTFGGGTKLEIKGLAVSTISSFFPPGYQIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKK LLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRG RDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
sc M5 CAR-v2 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.90)
m a l p v t a l l l p l a l l l h a a r p |e v q l q q s g a e l v r p g a s v k l s c t a s g f n ik d d y ih w v k q r p e q g l e w ig w id p e k | |GDTAYA5KFQ.DKATITSDTSSNTAYLQLS5LTSEDTAVYYCTLTGRFDYWGQGTTLTV55|GGGG5GGGG5GGGGS[D| |lVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLY5SNQKNNLAWYQQKPGQ5PKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDF| TLTISSVQAEDLAVYYCQQYYSYRTFGGGTKLEIKGLAVSTI5SFFPPGYQIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRF5VVKRGRK KLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRR GRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
sc M5 CAR-v3 (S E Q ID NO.1 S E Q ID NO .91 )
MALPVTALLLPLALLLHAARP EVQLQQ.SGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDDYIHWVKQRPEQGLEWIGWIDPEI^ GDTAYASKFQDKATITSDTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCTLTGRFDYWGQGTTLTVSS g g g g s g g g g s g g g g s [d IVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNNLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDF| TLTISSVQAEDLAVYYCQQYYSYRTFGGGTKLEIK TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFAC DIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQ.EEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPA YQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKG HDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
sc M5 CAR-v4 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.92)
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDDYIHWVKqRPEQGLEWIGWIDPEI^ |g d t a y a s k f q d k a t it s d t s s n t a y l q l s s l t s e d t a v y y c t l t g r f d y w g q g t t l t v s s |g g g g s g g g g s g g g g s [d |
Figure imgf000067_0001
d iis f f l a l t s t a l l f l l f f l t l r f s w k r g r k k l l y if k q p f m r p v q t t q e e d g c s c r f p e e e e g g c e l r v k f s r s a d a p AYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGK GHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
sc M5 CAR-v5 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.93)
MALPVTALLLPLALLLHAARP|EVQLQQ5GAELVRPGASVKLSCTA5GFNIKDDYIHWVKQRPEQGLEWIGWIDPEI^ |GDTAYASKFQDKATITSDTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCTLTGRFDYWGQGTTLTVSS|GGGGSGGGGSGGGGS|^ Iiv m s q s p s s l a v s v g e k v t m s c k s s q s l l y s s n q k n n l a w y q q k p g q s p k l u y w a s t r e s g v p d r f t g s g s g t d f I TLTISSVQAEDLAVYYCQQYYSYRTFGGGTKLEIK EPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ.PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPV
Q.TTQ.EEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQ.QGQ.NQ.LYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRK NPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
sc M5 CAR-v6 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.94)
MALPVTALLLPLALLLFIAARP|EVQ.LQQ5GAELVRPGASVKL5CTA5GFNIKDDYIFIWVKQRPEQGLEWIGWIDPEK| g d t a y a s k f q d k a t it s d t s s n t a y l q l s s l t s e d t a v y y c t l t g r f d y w g q g t t l t v s s g g g g s g g g g s g g g g s [d ||VM5Q5PS5LAVSVGEKVTMSCK5SQSLLY55NQKNNLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDF|
t l t is s v q a e d l a v y y c q q y y s y r t f g g g t k l e ik e p k s p d k t h t c p p c p a p p v a g p s v f l f p p k p k d t l m ia r t p e v t c v v v d v s h e d p e v k f n w y v d g v e v h n a k t k p r e e q y n s t y r v v s v l t v l h q d w l n g k e y k c k v s n k a l p a p ie k t is k a k g q p r e p q v y t l p p s r d e l t k n q v s l t c l v k g f y p s d ia v e w e s n g q p e n n y k t t p p v l d s d g s f f l y s k l t v d k s r w q q g n v f s c s v m h e a l h n h y t q k s l s l s p g k iis f f l a l t s t a l l f l l f f l t l r f s v v k r g r k k l l y if k q p f m r p v q t t q e e d g c s c r f p e e e e g g c e l r v k f s r s a d a p a y q q g q n q l y n e l n l g r r e e y d v l d k r r g r d p e m g g k p r r k n p q e g l y n e l q k d k m a e a y s e ig m k g e r r r g k g h d g l y q g l s t a t k d t y d a l h m q a l p p r
sc G12 CAR-v1 (S E Q ID NO.1 S E Q ID N O .95 )
MALPVTALLLPLALLLHAARP QVQLQQPGAELVKPGASMKMSCKASGYTFPSSNIHWLKQTPGQGLEWIGVIYPG NGDT5YNQKFKDKATLTTDK5SSTAYMQLSSLTSEDSAIYFCARVYNWHFDVWGAGTTVTVSS GGGGSGGGGSG GGGS NIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDGYGDIFMLWYQQKPGQPPKLLIYFASNLESGVPARFSGSGSRT DFTLTIDPVEADDAATYYCQQNNEDPYTFGGGTKLEIKRGLAVSTISSFFPPGYQIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCK RGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVL
DKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQA LPPR
sc G12 CAR-v2 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.96)
MALPVTALLLPLALLLHAARPlQVQLQQPGAELVKPGASMKMSCKASGYTFPSSNIHWLKQTPGQGLEWIGVIYPG NGDTSYNQ.KFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAIYFCARVYNWHFDVWGAGTTVTVSS GGGGSGGGGSG GGGSNIVLTQ.SPASLAVSLGQRATISCRASESVDGYGDIFMLWYQQKPGQ.PPKLUYFASNLESGVPARFSGSGSRT DFTLTIDPVEADDAATYYCQQNNEDPYTFGGGTKLEIKRGLAVSTISSFFPPGYQIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVV KRGRKKLLYIFKQ.PFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDV LDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ ALPPR
sc G12 CAR-v3 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.97)
MALPVTALLLPLALLLHAARP QVQLQQPGAELVKPGASMKMSCKASGYTFPSSNIHWLKQ.TPGQGLEWIGVIYPG NGDTSYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAIYFCARVYNWHFDVWGAGTTVTVSS GGGGSGGGGSG GGGSNIVLTQ.SPASLAVSLGQRATISCRASESVDGYGDIFMLWYQQKPGQPPKLLIYFASNLESGVPARFSGSGSRT DFTLTIDPVEADDAATYYCQQNNEDPYTFGGGTKLEIKRTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTR GLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSR SADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGE RRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
sc G12 CAR-v4 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.98)
MALPVTALLLPLALLLHAARP QVQLQQPGAELVKPGASMKMSCKASGYTFPSSNIHWLKQTPGQGLEWIGVIYPG NGDTSYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAIYFCARVYNWHFDVWGAGTTVTVSS GGGGSGGGGSG GGGSNIVLT SPASLAVSLG RATISCRASESVDGYGDIFMLWYQQKPGQPPKLUYFASNLESGVPARFSGSGSRT
Figure imgf000068_0002
RPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTR
GLDFACDIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFS RSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKG ERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
sc G12 CAR-v5 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.99)
Figure imgf000068_0001
GGGS NIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDGYGDIFMLWYQQ.KPGQPPKLLIYFASNLESGVPARFSGSGSRT DFTLTID PV E AD D AATYYCQQN NEDPYTFGGGTKLEIKR EPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIA RTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQP FMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMG GKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
sc G12 CAR-v6 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.100)
Figure imgf000069_0001
sc 21.26 CAR-v1 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.101)
MALPVTALLLPLALLLHAARP QVQLQQPGAELVKPGTSVKLSCKASGYTFTRYWMHWVKQRPGQGLEWIGMIHP SSGSTSYNEKVKNKATLTVDRSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARDGDYYYGTGDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGG GSGGGGSQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSIIMYMHWYQQKPGSSPKPWIFATSNLASGVPSRFSGSGSGTS
Y5LTISRVEAEDAATYYCQQWRSDRALTFGAGTKLELGLAVSTI5SFFPPGYQIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRG RKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDK RRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALP PR
sc 21.26 CAR-v2 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.102)
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQ.QPGAELVKPGTSVKLSCKASGYTFTRYWMHWVKQ.RPGQGLEWIGMIHP SSGSTSYNEKVKNKATLTVDRSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARDGDYYYGTGDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGG GSGGGGSQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSINYMHWYQQKPGSSPKPWIFATSNLASGVPSRFSGSGSGTS YSLTISRVEAEDAATYYCQQWRSDRALTFGAGTKLELGLAVSTIS5FFPPGYQIISFFLALT5TALLFLLFFLTLRF5VVKR GRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLD
KRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQAL PPR
sc 21.26 CAR-v3 (S E Q ID NO.1 S E Q ID N O .103)
MALPVTALLLPLALLLHAARP|QVQLQQPGAELVKPGTSVKLSCKASGYTFTRYWMHWVKQRPGQGLEWIGMIHP SSGSTSYNEKVKNKATLTVDRSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARDGDYYYGTGDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGG GSGGGGSQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSINYMHWYQQKPGSSPKPWIFATSNLASGVPSRFSGSGSGTS YSLTISRVEAEDAATYYCQQWRSDRALTFGAGTKLELTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGL DFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQ.TTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSA DAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERR RGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
sc 21.26 CAR-v4 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO. 104)
MALPVTALLLPLALLLHAARP Q.VQLQQ.PGAELVKPGTSVKLSCKASGYTFTRYWMHWVKQRPGQGLEWIGMIHP SSGSTSYNEKVKNKATLTVDRSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARDGDYYYGTGDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGG GSGGGGS Q.IVLSQ.SPAILSASPGEKVTMTCRASSSINYMHWYQQKPGSSPKPWIFATSNLASGVPSRFSGSGSGTS YSLTISRVEAEDAATYYCQQWRSDRALTFGAGTKLELTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGL DFACDIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRS ADAPAYQQ.GQ.NQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQ.EGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGER RRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
sc 21.26 CAR-v5 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.105)
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQ.PGAELVKPGTSVKLSCKASGYTFTRYWMHWVKQ.RPGQ.GLEWIGMIHP SSGSTSYNEKVKNKATLTVDRSSTTAYMQ.LSSLTSEDSAVYYCARDGDYYYGTGDYWGQGTTLTVS5GGGGSGGG GSGGGGS QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSINYMHWYQQKPGSSPKPWIFATSNLASGVPSRFSGSGSGTS YSLTISRVEAEDAATYYCQQWRSDRALTFGAGTKLELEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTP EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFM RPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKP RRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
sc 21.26 CAR-v6 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO. 106)
MALPVTALLLPLALLLHAARP QVQLQQPG AE LV KPGTS V KLSCKASG YTFTR YW M H WVKQR PGQG LE W l G M IH P SSGSTSYNEKVKNKATLTVDRSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARDGDYYYGTGDYWGQ.GTTLTVSS GGGGSGGG GSGGGGS QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSINYMHWYQQKPGSSPKPWIFATSNLASGVPSRFSGSGSGTS YSLTISRVEAEDAATYYCQQWRSDRALTFGAGTKLELEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTP EVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQ.GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPF MRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGG KPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
sc 1075.7 CAR-v1 (S E Q ID NO.1 S E Q ID N O .107 )
MALPVTALLLPLALLLHAARP DIQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSAYYWNWIRQFPGNKLEWMGYISYDG RNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCAKEGDYDVGNYYAMDYWGQGTSVTVSS GGGGSGGG GSGGGGS ENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSNVISSYVHWYQQRSGASPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGS GTSYSLTISSVEAEDAATYYCQQYSGYPLTFGAGTKLELGLAVSTI55FFPPGYQIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKR GRKKLLYIFKQPFMRPVQ.TTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQ.QGQ.NQ.LYNELNLGRREEYDVLD KRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQAL PPR
sc 1075.7 CAR-v2 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.108)
MALPVTALLLPLALLLHAARP DIQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSAYYWNWIRQFPGNKLEWMGYISYDG RNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCAKEGDYDVGNYYAMDYWGQGTSVTVSS GGGGSGGG GSGGGGS ENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSNVISSYVHWYQQRSGASPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGS GTSYSLTISSVEAEDAATYYCQQYSGYPLTFGAGTKLELGLAVSTISSFFPPGYQIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVK RGRKKLLYIFKQ.PFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVL DKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQA LPPR
sc 1075.7 CAR-v3 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.109)
MALPVTALLLPLALLLHAARP DIQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSAYYWNWIRQFPGNKLEWMGYISYDG RNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCAKEGDYDVGNYYAMDYWGQGTSVTVSS GGGGSGGG GSGGGGS ENVLTQ.SPAIMSASPGEKVTMTCRASSNVISSYVHWYQQRSGASPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGS GTSYSLTISSVEAEDAATYYCQ.QYSGYPLTFGAGTKLELTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGL
DFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGC5CRFPEEEEGGCELRVKFSRSA DAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAY5EIGMKGERR RGKGHDGLYQG LSTATKDTYDALHMQ.ALPPR
sc 1075.7 CAR-v4 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.110)
MALPVTALLLPLALLLHAARP DIQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSAYYWNWIRQFPGNKLEWMGYISYDG RNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCAKEGDYDVGNYYAMDYWGQGTSVTVSS GGGGSGGG GSGGGGS ENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSNVISSYVHWYQQRSGASPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGS GTSYSLTISSVEAEDAATYYCQQYSGYPLTFGAGTKLELTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGL DFACDIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRS ADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGER RRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
sc 1075.7 CAR-v5 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.111)
MALPVTALLLPLALLLHAARP DIQLQESGPGLVKPSQ.SLSLTCSVTGYSITSAYYWNWIRQ.FPGNKLEWMGYISYDG
RNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCAKEGDYDVGNYYAMDYWGQGTSVTVSS GGGGSGGG
GSGGGG5 ENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRA5SNVISSYVHWYQQRSGASPKLWIY5TSNLASGVPARFSGSGS GTSYSLTISSVEAEDAATYYCQQYSGYPLTFGAGTKLELEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIART PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV5VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ.KSLSLSPGKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFM RPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKP RRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
sc 1075.7 CAR-v6 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.112)
MALPVTALLLPLALLLHAARP DIQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSAYYWNWIRQFPGNKLEWMGYISYDG RNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCAKEGDYDVGNYYAMDYWGQGTSVTVSS GGGGSGGG GSGGGGS ENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSNVISSYVHWYQQRSGASPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGS GTSYSLTISSVEAEDAATYYCQQYSGYPLTFGAGTKLELEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIART PEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQ.DWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQ.QGNVFSCSVMHEALHNHYTQ.KSLSLSPGKIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPF MRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGG KPRRKNPQ.EGLYNELQ.KDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR REFERENCIAS:
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Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Un receptor de antígeno quimérico específico de CLL1 (CAR anti-CLL1), que comprende al menos:
- un dominio de unión a ligando extracelular anti-CLL1, que comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv), que comprende los fragmentos variables pesado (Vh) y ligero (Vl) de los anticuerpos monoclonales anti-CLL1 M26 o M2, unidos por un enlazador flexible, en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ. ID NO. 131, SEQ ID NO. 132 y SEQ ID NO. 133, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 134, SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136, o en donde dicho VH comprende las CDR de SEQ ID NO. 161, SEQ ID NO. 162 y SEQ ID NO. 163, y dicho VL comprende las CDR de SEQ ID NO. 164, SEQ ID NO. 165 y SEQ ID NO. 166, respectivamente,
- un dominio transmembrana
- un dominio de señalización citoplasmático, y
- un dominio coestimulador.
2. El receptor de antígeno quimérico específico de CLL1 de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el dominio coestimulador es un dominio coestimulador de CD28 o un dominio coestimulador de 4-1BB.
3. El receptor de antígeno quimérico específico de CLL1 de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicho dominio transmembrana es un dominio transmembrana de CD8a.
4. El receptor de antígeno quimérico específico de CLL1 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además una bisagra.
5. Receptor de antígeno quimérico específico de CLL1 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho VH tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO. 15 y dicho VL tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia polipeptídica de SEQ ID No . 16; o en donde dicho Vh tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO. 25, y dicho VL tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO. 26, respectivamente.
6. El receptor de antígeno quimérico específico de CLL1 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el dominio de unión extracelular incluye al menos un mimótopo específico de mAb que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194 o SEQ ID NO: 195.
7. El receptor de antígeno quimérico específico de CLL1 de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el dominio de unión extracelular comprende 1,2, 3 o 4 de dichos mimótopos específicos de mAb.
8. El receptor de antígeno quimérico específico de CLL1 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el dominio de unión extracelular incluye al menos un mimótopo CD20.
9. El receptor de antígeno quimérico específico de CLL1 de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el mimótopo CD20 es reconocido específicamente por rituximab.
10. El receptor de antígeno quimérico específico de CLL1 de acuerdo con las reivindicaciones 8 o 9, en el que dicho mimótopo CD20 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113.
11. El receptor de antígeno quimérico específico de CLL1 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el dominio de unión extracelular comprende la siguiente secuencia:
V1-L1-V2-(L)x-Epítopo1-(L)x-;
V1-L1-V2-(L)x-Epítopo1-(L)x-Epítopo2-(L)x-;
V1-L1-V2-(L)x-Epítopo1-(L)x-Epítopo2-(L)x-Epítopo3-(L)x-;
(L)x-Epítopo1-(L)x-V1-L1-V2;
(L)x-Epítopo1-(L)x-Epítopo2-(L)x-V1-L1-V2;
Epítopo1-(L)x-Epítopo2-(L)x-Epítopo3-(L)x-V1-L1-V2;
(L)x-Epítopo1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-Epítopo2-(L)x;
(L)x-Epítopo1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-Epítopo2-(L)x-Epítopo3-(L)x-;
(L)x-Epítopo1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-Epítopo2-(L)x-Epítopo3-(L)x-Epítopo4-(L)x-(L)x-Epítopo1-(L)x-Epítopo2-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-Epítopo3-(L)x-;
(L)x-Epítopo1-(L)x-Epítopo2-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-Epítopo3-(L)x-Epítopo4-(L)x-V1-(L)x-Epítopo1-(L)x-V2;
V1-(L)x-Epítopo1-(L)x-V2-(L)x-Epítopo2-(L)x;
V1-(L)x-Epítopo1-(L)x-V2-(L)x-Epítopo2-(L)x-Epítopo3-(L)x;
V1-(L)x-Epítopo1-(L)x-V2-(L)x-Epítopo2-(L)x-Epítopo3-(L)x-Epítopo4-(L)x;
(L)x-Epítopo1-(L)x-V1-(L)x-Epítopo2-(L)x-V2; o
(L)x-Epítopo1-(L)x-Vi-(L)x-Epítopo2-(L)x-V2-(L)x-Epítopo3-(L)x;
en donde,
Vi es Vl y V2 es Vh o V1 es Vh y V2 es Vl;
L1 es un enlazador adecuado para unir la cadena Vh a la cadena Vl;
L es un enlazador, que comprende preferentemente residuos de glicina y de serina, y cada aparición de L en el dominio de unión extracelular puede ser idéntica o ser diferente a otra aparición de L en el mismo dominio de unión extracelular, y
x es 0 o 1, y cada aparición de x se selecciona independientemente de las demás; y,
el Epítopo 1, el Epítopo 2, el Epítopo 3 y el Epítopo 4 se seleccionan independientemente de epítopos específicos de mAb, que comprenden una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198 o SEQ ID NO: 199.
12. El receptor de antígeno quimérico específico de CLL1 de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el Epítopo 1, el Epítopo 2, el Epítopo 3 y/o el Epítopo 4 es un mimótopo específico de mAb, que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No : 113.
13. Una célula inmune linfoide genomanipulada, que expresa en la membrana de superficie celular un CAR anti-CLL1 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
14. La célula inmune linfoide genomanipulada de acuerdo con la reivindicación 13, derivada de linfocitos T inflamatorios, de linfocitos T citotóxicos, de linfocitos T reguladores o de linfocitos T auxiliares.
15. La célula inmune linfoide genomanipulada de acuerdo con las reivindicaciones 13 o 14, en la que la expresión de TCR se suprime en dicha célula inmune, y/o en donde la expresión de al menos una proteína del MHC, preferentemente p2m o HLA, se reprime o se suprime en dicha célula inmune.
16. La célula inmune linfoide genomanipulada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, para su uso en terapia.
17. La célula inmune linfoide genomanipulada para su uso en terapia de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la afección es una afección de cáncer hematológico.
18. La célula inmune linfoide genomanipulada para su uso de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la afección de cáncer hematológico es leucemia mielógena aguda (AML).
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