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JP2022522786A - 構成的に活性なキメラサイトカイン受容体 - Google Patents

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Abstract

構成的に活性なキメラサイトカイン受容体(CACCR)が本明細書で提供される。キメラ抗原受容体(CAR)を担持する免疫細胞上に存在する場合、そのようなCACCRは、免疫細胞の活性化、増殖、持続性、および/または効力の増加を可能にする。本明細書に記載のCACCRを作製および使用する方法も提供される。【選択図】図3B

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2019年3月1日に出願された米国仮出願第62/812,911号、および2020年2月24日に出願された米国仮出願第62/980,823号に対する優先権の権益を主張するものであり、これら両方の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ASCII形式で電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、配列表を含む。2020年2月21日に作成された上記のASCIIコピーは、AT-023_03WO_SL.txtという名称であり、251,652バイトのサイズである。
悪性腫瘍関連抗原を認識するように遺伝子改変された免疫細胞(例えば、T細胞)の養子移入は、がん治療への新しいアプローチとして有望であることが示されている。T細胞は、抗原認識部分とT細胞活性化ドメインで構成される融合タンパク質であるキメラ抗原受容体(CAR)を発現するように遺伝子改変することができる。
T細胞の増殖、細胞毒性の効力、および持続性は、シグナル伝達経路によって促進される。従来のCAR設計は、CD3zeta活性化(シグナル1)と共刺激(シグナル2、例えば4-1BB、OX40、および/またはCD28発現)の2つのシグナルを提供する。いくつかの状況では、第3のシグナル(シグナル3)である、サイトカイン誘導性サイトカイン受容体シグナル伝達(例えば、免疫増強のためのサイトカインサポート)が望ましくあり得る。しかしながら、シグナル3を提供するアプローチには、重大な制限がある。
サイトカインサポートを提供するための1つのアプローチは、CAR-T細胞療法を組換えサイトカイン(複数)/サイトカイン模倣体の全身注入と組み合わせること、およびサイトカインを細胞外に分泌/発現するようにCAR-T細胞を操作することを含む。サイトカインには多面的な効果があり、他の細胞タイプの機能にも影響を与え得るため、CAR-T細胞による免疫増強サイトカインの全身投与または産生には少なくとも2つの大きな欠点がある:(i)これらのアプローチはヒトに全身毒性を引き起こす可能性がある、および(ii)同種異系CAR-T細胞療法の文脈では、これらのアプローチは、同種異系CAR-T細胞の拒絶反応を加速し、それによって治療効果を損なう可能性のあるバイスタンダー宿主免疫活性化を引き起こす可能性がある。サイトカインサポートを提供する別のアプローチは、構成的に活性化された二量体化サイトカイン受容体、IL-7Raの導入に基づく-これは、シグナル伝達出力の性質(IL-7シグナル伝達のみ)と規模を制限する。サイトカインサポートを提供するためのさらに別のアプローチは、シグナル3をCAR分子に直接組み込むことを含んだ(Nat Med.2018 Mar;24(3):352-359)。このアプローチの制限は、シグナル3の強度がCAR活性化の強度に依存することである。標的(およびCARの活性化)がない場合、シグナル3は伝達されない。
サイトカインシグナルを調整可能な方法でCAR-T細胞に特異的に標的化することによりこれらの欠点を回避し、安全性プロファイルと治療効果を改善するための解決策が必要である。この必要性に対処する組成物および方法が本明細書で提供される。
本開示は、構成的に活性なキメラサイトカイン受容体(CACCR)を提供する。キメラ抗原受容体(CAR)を担持する免疫細胞(CAR-I細胞、例えばCAR-T細胞)上に存在する場合、そのようなCACCRは、免疫細胞の活性化、増殖、持続性、および/または効力の増加を可能にする。本明細書に記載のCACCRを作製および使用する方法も提供される。
したがって、一態様では、2つのモノマーから構成されるCACCRであって、各モノマーは、(a)膜貫通ドメイン、(b)ヤヌスキナーゼ(JAK)結合ドメイン、および(c)動員ドメインを含み、モノマーは構成的に二量体化されている、CACCRが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、CACCRは、細胞外ドメインリガンド結合ドメインを含まない。
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインおよび/またはJAK結合ドメインは、TPOR/MPLR受容体に由来する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインおよび/またはJAK結合ドメインは、配列番号6の天然に存在するTPOR/MPLR受容体のアミノ酸478~582に由来する。いくつかの実施形態では、TPOR/MPLR受容体は、H499L、S505N、W515K、およびG509Nから選択されるアミノ酸置換のうちの1つ以上を含む。いくつかの実施形態では、TPOR/MPLR受容体は、H499L、S505N、およびW515K置換、またはS505NおよびW515K置換を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、STAT動員ドメインである。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL7Ra由来のSTAT動員ドメイン、例えば、IL7Ra(316~459)を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL2Rb由来のSTAT動員ドメイン、例えば、IL2Rb(333~551)、IL2Rb(393~433、518~551)、IL2Rb(339~379、393~433、518~551)、IL2Rb(333~551、Y381S、Y384S、Y387S)、IL2Rb(333~551、Y364S、Y381S、Y384S、Y387S)を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL12Rb1由来のSTAT動員ドメイン、例えば、IL12Rb1(622~662)を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL12Rb2からのSTAT動員ドメイン、例えば、IL12Rb2(714~862)またはIL12Rb2(775~825)を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL21R由来のSTAT動員ドメイン、例えば、IL21R(322~538)を含む。
本明細書で提供される関連する態様は、本開示のCACCRのいずれか1つをコードするポリヌクレオチド、およびそのようなポリヌクレオチドを含む発現ベクターである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、キメラ抗原受容体(CAR)をさらにコードし、CARは、BCMA、EGFRvIII、Flt-3、WT-1、CD20、CD23、CD30、CD38、CD70、CD33、CD133、LeY、NKG2D、CS1、CD44v6、ROR1、CD19、クローディン18.2(クローディン18A2、またはクローディン18アイソフォーム2)、DLL3(デルタ様タンパク質3、Drosophilaデルタホモログ3、Delta3)、Muc17(ムチン17、Muc3、Muc3)、FAPアルファ(線維芽細胞活性化タンパク質アルファ)、Ly6G6D(リンパ球抗原6複合遺伝子座タンパク質G6d、c6orf23、G6D、MEGT1、NG25)、および/またはRNF43(E3ユビキチンタンパク質リガーゼRNF43、RINGフィンガータンパク質43)に結合する。
別の態様では、本開示の少なくとも1つのキメラ抗原受容体(CAR)と少なくとも1つのCACCRとを含む操作された免疫細胞が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、T細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、同種異系免疫細胞である。他の実施形態では、免疫細胞は自己免疫細胞である。免疫細胞は、T細胞、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、NK細胞、マクロファージ、単球、B細胞、および幹細胞に由来する免疫細胞からなる群から選択され得る。関連する態様では、本開示の操作された免疫細胞のいずれかを含む医薬組成物、およびそのような医薬組成物を含むキットが本明細書で提供される。
別の態様では、治療有効量の本明細書に記載の操作された免疫細胞のうちのいずれかを対象に投与することを含む、対象のがんを治療する方法が本明細書で提供される。
本開示の操作されたCACCRの概略図を示す。 本開示のCACCRとCARを共発現させるために使用できる本開示のベクターの概略図を示す。1つ以上のサイトテールをタンデムに結合して、1つ以上のサイトカインからのシグナル伝達を模倣することができる。対照BFP(青色蛍光タンパク質)CARを発現するベクターの概略図も示される。 サイトカイン受容体シグナル伝達を構成的に活性化するTpoR膜貫通(TM)変異体の同定を示す。 構成的に活性なキメラサイトカイン受容体を共発現するCAR-T細胞の拡大の結果を示す。 異なるIL-2条件下でのCAR-T細胞産物における分化とメモリーT細胞サブセットの分布を示す。 各TpoR TMバリアントによって媒介される構成的サイトカインシグナル伝達の程度を示す。 TpoR TM変異体の細胞傷害活性を示しており、構成的サイトカイン受容体シグナル伝達がCAR-T細胞の効力を増強することを示している。 TpoR TM変異体の細胞毒性活性と耐久性を示す。 増殖因子非依存性アッセイにおけるCAR-T細胞の経時的な濃縮を示す。 増殖因子非依存性アッセイにおけるCAR-T細胞の経時的な拡大倍率を示す。 増殖因子非依存性アッセイにおける、CAR+T細胞間のメモリーT細胞サブセットの経時的な分布を示す。 示されたCACCRを共発現するCAR-T細胞によるSTATシグナル伝達経路の活性化を示す。 全長または短縮型サイトテールを発現するHEK293 T細胞におけるレポーターアッセイで示されるCACCRシグナル伝達強度の最適化を示す。 全長または短縮型サイトテールを発現するHEK293 T細胞におけるレポーターアッセイで示されるCACCRシグナル伝達強度の最適化を示す。 全長または短縮型サイトテールを共発現する初代CAR-T細胞で示されるCACCRシグナル伝達強度の最適化を示す。 短縮型IL2Rbサイトテールを担持するCACCR CAR-T細胞が、IL-2ではなくIL-15のシグナル伝達をより厳密に模倣することを示す。 タンデムに融合した異なるサイトテールのコンビナトリアルシグナル出力を示す。 CAR-T細胞のメモリー分化に対するCACCRの効果を示す。 増殖因子非依存性条件下でのCAR-T細胞の生存およびメモリー分化に対するCACCRの影響を示す。 様々なCACCRを共発現するCAR-T細胞の細胞傷害活性を示す。 CACCRが、液性腫瘍標的BCMAに向けられたCAR-T細胞の細胞傷害活性を改善したことを示す。 CACCRが同所性多発性骨髄腫に対するインビボ抗腫瘍活性およびBCMA CAR-T細胞の持続性を改善したことを示す。 CACCRが確立された固形腫瘍に対するCAR-T細胞の抗腫瘍活性を改善したことを示す。
本開示は、構成的に活性なキメラサイトカイン受容体(CACCR)を提供する。構成的に活性で調整可能なキメラサイトカイン受容体の存在は、シグナル3の免疫増強が免疫増強の必要性を満たすことを可能にする。したがって、キメラ抗原受容体(CAR)を担持する免疫細胞(CAR-I細胞、例えばCAR-T細胞)上に存在する場合、そのようなCACCRは、免疫細胞の活性化、増殖、持続性、および/または効力の増加を可能にする。本明細書に記載のCACCRを作製および使用する方法も本明細書で提供される。
本開示のCACCRは調整可能であり、CAR-T細胞活性、持続性などの増強のための柔軟なサイトカインシグナル伝達出力を有する。コンポーネント、作成方法、および使用方法を以下に順番に説明する。
I.構成的に活性なキメラサイトカイン受容体(CACCR)
本開示のCACCRは、2つのモノマーから構成され、各モノマーは、(a)膜貫通ドメイン、(b)ヤヌスキナーゼ(JAK)結合ドメイン、および(c)動員ドメインを含み、モノマーは構成的に二量体化されている。いくつかの実施形態では、本開示のCACCRは、細胞外リガンド結合ドメインを含まない。
いくつかの実施形態では、モノマーは同一であり、構成的に活性なホモダイマーを生じさせる。そのような実施形態では、ベクターで発現される必要があるタンパク質の数が減少する。いくつかの実施形態では、モノマーは同一ではなく、構成的に活性なヘテロダイマーを生じさせ、これは特定の状況下で望ましくあり得る。
本開示のCACCRのモノマーは、自発的に二量体化することができ、外因性刺激またはリガンドの非存在下でシグナル伝達を活性化することができる(リガンド非依存性二量体化)。活性のレベルは、CACCRの膜貫通ドメインに導入された変異によって制御することができる。当業者は、CACCRのモノマーが100%の時間において二量体化されておらず、モノマーとして存在し得ることを理解するであろう。
A.膜貫通ドメイン
本開示のCACCRは、膜貫通ドメインを含む。本開示の膜貫通ドメインは、それらがモノマー対との構成的二量体化を可能にし、したがって細胞内部分での構成的JAK活性化、ならびに例えば受容体の細胞質領域でのSTATの構成的動員およびリン酸化を可能にするような配列を含む。
膜貫通ドメインはN末端にあり、C末端の細胞内/細胞質ドメインに結合している。いくつかの実施形態では、結合は、任意選択でリンカーを介して達成される。
本明細書で使用される場合、膜貫通ドメインは、それが発現される細胞の膜に挿入することができる。いくつかの実施形態では、本開示の膜貫通ドメインは、細胞膜にまたがり、細胞外部分、および/または細胞内部分を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の膜貫通ドメインは操作されており(合成であり)、天然に存在する膜貫通ドメインのいずれにも類似しておらず、例えば、それらは天然に存在していない。
他の実施形態では、本開示の膜貫通ドメインは、天然に存在する受容体に由来する。
いくつかの実施形態では、本開示の膜貫通ドメインおよび/またはJAK活性化ドメインは、例えば、以下の受容体のうちの1つ以上に由来する:エリスロポエチン受容体(EpoR)、インターロイキン6シグナルトランスデューサー(GP130またはIL6ST)、プロラクチン受容体(PrlR)、成長ホルモン受容体(GHR)、顆粒球コロニー刺激因子受容体(GCSFR)、およびトロンボポエチン受容体/骨髄増殖性白血病タンパク質受容体(TPOR/MPLR)。天然に存在する受容体に由来する場合、受容体全体、または受容体の膜貫通配列全体は、細胞内部分で構成的活性化および構成的JAK結合/活性化を達成するために必ずしも必要ではない可能性がある。したがって、天然に存在する受容体の断片を利用することができる。さらに、特定の変異は、下流のシグナル伝達をさらに調整するために、天然に存在する受容体に由来する膜貫通ドメインに導入されてもよい。
いくつかの実施形態では、本開示の膜貫通ドメインおよび/またはJAK活性化ドメインは、天然に存在するEpoR受容体に由来する。
いくつかの実施形態では、本開示の膜貫通ドメインおよび/またはJAK活性化ドメインは、天然に存在するGP130受容体に由来する。
いくつかの実施形態では、本開示の膜貫通ドメインおよび/またはJAK活性化ドメインは、天然に存在するPrlR受容体に由来する。
いくつかの実施形態では、本開示の膜貫通ドメインおよび/またはJAK活性化ドメインは、天然に存在するGHR受容体に由来する。
いくつかの実施形態では、本開示の膜貫通ドメインおよび/またはJAK活性化ドメインは、天然に存在するGCSF受容体に由来する。
いくつかの実施形態では、本開示の膜貫通ドメインおよび/またはJAK活性化ドメインは、天然に存在するTPOR受容体に由来する。
表1aは、膜貫通タンパク質が由来する、本開示に提供される天然に存在する受容体の例示的な全長配列を提示する。表1aに提供される配列は、例えば、表1bおよび1cにおいてどのより後期の突然変異が発現されるかに関する、参照配列である。
Figure 2022522786000002
Figure 2022522786000003
Figure 2022522786000004
Figure 2022522786000005
Figure 2022522786000006
Figure 2022522786000007
いくつかの実施形態では、本開示の膜貫通ドメインは、表1aに示される天然に存在するTPOR/MPLR(骨髄増殖性白血病タンパク質)受容体の短縮バージョンに由来する。
いくつかの実施形態では、CACCRの膜貫通ドメインは、表1aのTPOR受容体のアミノ酸478~582を含む。
表1bは、本開示の例示的な膜貫通ドメインアミノ酸配列を提供し、膜貫通ドメインは、天然に存在するTPOR受容体に由来する。
Figure 2022522786000008
いくつかの実施形態では、CACCRの膜貫通ドメインは、TPOR受容体のアミノ酸478~582、および少なくともH499でのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、CACCRの膜貫通ドメインは、TPOR受容体のアミノ酸478~582、およびアミノ酸置換H499Lを含む。
いくつかの実施形態では、CACCRの膜貫通ドメインは、TPOR受容体のアミノ酸478~582、および少なくともS505でのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、CACCRの膜貫通ドメインは、TPOR受容体のアミノ酸478~582、およびアミノ酸置換S505Nを含む。
いくつかの実施形態では、CACCRの膜貫通ドメインは、TPOR受容体のアミノ酸478~582、および少なくともG509でのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、CACCRの膜貫通ドメインは、TPOR受容体のアミノ酸478~582、およびアミノ酸置換G509Nを含む。
いくつかの実施形態では、CACCRの膜貫通ドメインは、TPOR受容体のアミノ酸478~582、および少なくともW515でのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、CACCRの膜貫通ドメインは、TPOR受容体のアミノ酸478~582、およびアミノ酸置換W515Kを含む。
いくつかの実施形態では、CACCRの膜貫通ドメインは、TPOR受容体のアミノ酸478~582、ならびにH499およびS505でのアミノ酸置換を含む(表1bに提供される配列)。
いくつかの実施形態では、CACCRの膜貫通ドメインは、TPOR受容体のアミノ酸478~582、ならびにH499およびW515でのアミノ酸置換を含む(表1bに提供される配列)。
いくつかの実施形態では、CACCRの膜貫通ドメインは、TPOR受容体のアミノ酸478~582、ならびにH499、S505、およびW515でのアミノ酸置換を含む(表1bに提供される配列)。
いくつかの実施形態では、CACCRの膜貫通ドメインは、TPOR受容体のアミノ酸478~582、ならびにS505およびW515におけるアミノ酸置換を含む(表1bに提供される配列)。
いくつかの実施形態では、CACCRの膜貫通ドメインは、TPOR受容体のアミノ酸478~582、ならびにH499およびG509でのアミノ酸置換を含む(表1bに提供される配列)。
いくつかの実施形態では、CACCRの膜貫通ドメインは、TPOR受容体のアミノ酸478~582、ならびにアミノ酸置換H499LおよびS505Nを含む(表1bに提供される配列)。
いくつかの実施形態では、CACCRの膜貫通ドメインは、TPOR受容体のアミノ酸478~582、ならびにアミノ酸置換H499LおよびW515Kを含む(表1bに提供される配列)。
いくつかの実施形態では、CACCRの膜貫通ドメインは、TPOR受容体のアミノ酸478~582、ならびにアミノ酸置換H499LおよびG509Nを含む(表1bに提供される配列)。
いくつかの実施形態では、CACCRの膜貫通ドメインは、TPOR受容体のアミノ酸478~582、ならびにアミノ酸置換S505NおよびW515Kを含む(表1bに提供される配列)。
いくつかの実施形態では、CACCRの膜貫通ドメインは、TPOR受容体のアミノ酸478~582、ならびにアミノ酸置換H499L、S505N、およびW515Kを含む(表1bに提供される配列)。
いくつかの実施形態では、CACCRの膜貫通ドメインは、TPOR受容体のアミノ酸478~582、ならびにH499およびS505でのアミノ酸置換を含む(表1bに提供される配列)。
本開示のCACCRは、CAR担持免疫細胞(例えば、CAR-T細胞)において必要とされ、特定の状況または条件において望まれるシグナル3/免疫増強のレベルを達成するために調整可能である。
いくつかの実施形態では、低レベルのSTAT5活性化は、CAR担持免疫細胞(例えば、CAR-T細胞)において望ましい。例として、そのような実施形態では、TPOR受容体のアミノ酸478~582、およびアミノ酸置換S505N、W515K、またはH499L/G509Nを含むCACCRの膜貫通ドメインを導入することができる。
いくつかの実施形態では、STAT5活性化のレベルの増加は、CAR担持免疫細胞(例えば、CAR-T細胞)において望まれる。例として、そのような実施形態では、TPOR受容体のアミノ酸478~582、ならびにアミノ酸置換H499L、S505N、およびW515Kを含むCACCRの膜貫通ドメインを導入することができる。別の例として、そのような実施形態では、TPOR受容体のアミノ酸478~582、ならびにアミノ酸置換S505NおよびW515Kを含むCACCRの膜貫通ドメインを導入することができる。
いくつかの実施形態では、メモリーT細胞への分化の増加は、CAR担持免疫細胞(例えば、CAR-T細胞)において望まれる。例として、そのような実施形態では、TPOR受容体のアミノ酸478~582、およびアミノ酸置換W515K、またはH499L/G509Nを含むCACCRの膜貫通ドメインを導入することができる。
いくつかの実施形態では、メモリーT細胞への分化の増加は、CAR担持免疫細胞(例えば、CAR-T細胞)において望まれる。例として、そのような実施形態では、TPOR受容体のアミノ酸478~582、ならびにアミノ酸置換S505N/W515KおよびH499L/S505N/W515Kを含むCACCRの膜貫通ドメインを導入することができる。
また、細胞傷害性効力、応答の持続性、および持続性の増加を増加させるための置換、例えば、S505N/W515KおよびH499L/S505N/W515K置換が本明細書で提供される。
Figure 2022522786000009
Figure 2022522786000010
Figure 2022522786000011
B.ヤヌスキナーゼ(JAK)結合ドメイン
本開示のCACCRは、細胞内JAK結合ドメインを含む。JAK結合ドメインは、直接またはリンカーを介して、膜貫通ドメインのC末端に結合する。JAK結合ドメインは、キメラサイトカイン受容体の細胞側の膜貫通ドメインに結合している。
いくつかの実施形態では、JAK結合ドメインは、JAK-1結合ドメイン、JAK-2結合ドメイン、JAK-3結合ドメイン、またはTYK2結合ドメインである。
いくつかの実施形態では、本開示のCACCRのJAK結合ドメインは、天然に存在し、および天然に存在する受容体に由来する。
いくつかの実施形態では、本開示のCACCRのJAK結合ドメインは合成である。
表1bおよび表1cは、本開示の膜貫通ドメインおよびJAK2結合ドメインの例示的なアミノ酸配列を提示する。いくつかの実施形態では、本開示のCACCRは、表1bおよび1cの配列から選択されるアミノ酸配列を含む膜貫通およびJAK2結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示のCACCRは、表1bおよび1cの配列のいずれか1つと少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む膜貫通およびJAK2結合ドメインを含む。
C.動員ドメイン
本開示のCACCRは、細胞質動員ドメインを含む。動員ドメインは、STAT動員ドメイン、AP1動員ドメイン、Myc/Max動員ドメイン、またはNFkB動員ドメインであり得る。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、例えば、受容体尾部(サイトテール(cytotail))またはサイトカイン受容体尾部に由来するシグナル伝達性転写因子(STAT)動員(Stat活性化)ドメインである。本開示のCACCRのこれらの細胞内動員ドメインは、CARおよびキメラサイトカイン受容体(例えば、本開示のキメラサイトカイン受容体を有するCAR-T細胞)を含む免疫細胞におけるシグナル3の伝播を可能にする。Stat動員ドメインを介して伝播されるサイトカインシグナル伝達は、細胞のサイトカインベースの免疫増強を可能にする。いくつかの実施形態では、免疫増強は恒常性であり、例えば、シグナル伝達は、CARを担持する免疫細胞の増加を引き起こす。いくつかの実施形態では、免疫増強は炎症性であり、例えば、シグナル伝達は、CARを担持する免疫細胞の効力の増加を引き起こす。いくつかの実施形態では、免疫増強は、疲弊を防ぎ、例えば、シグナル伝達は、CARを担持する免疫細胞の長期機能を維持する。
いくつかの実施形態では、本開示の動員ドメインは合成であり、天然に存在する受容体断片に類似していない。いくつかの実施形態では、免疫増強は、疲弊を防ぎ、例えば、シグナル伝達は、CARを担持する免疫細胞の長期機能を維持する。
いくつかの実施形態では、本開示のStat動員ドメインは合成であり、天然に存在する受容体断片に類似していない。
他の実施形態では、本開示のStat動員ドメインは、例えば、天然に存在するサイトカイン受容体に由来する、天然に存在する受容体の細胞質尾部に由来する。天然に存在する受容体のこれらの細胞質尾部は、受容体の膜貫通ドメインのJAK活性化ドメインの下流の領域であってよい。キメラサイトカイン受容体のStat動員ドメインは、少なくとも1つの受容体由来の少なくとも1つのSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Stat動員ドメインは、少なくとも1つのSTAT1動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Stat動員ドメインは、少なくとも1つのSTAT2動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Stat動員ドメインは、少なくとも1つのSTAT3動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Stat動員ドメインは、少なくとも1つのSTAT4動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Stat動員ドメインは、少なくとも1つのSTAT5動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Stat動員ドメインは、少なくとも1つのSTAT6動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Stat動員ドメインは、少なくとも1つのSTAT7動員ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、Stat動員ドメインが由来する天然に存在する受容体は、サイトカイン受容体ではない。
いくつかの実施形態では、Stat動員ドメインが由来する天然に存在する受容体は、サイトカイン受容体である。T細胞免疫増強サイトカインがシグナル伝達する例示的なサイトカイン受容体には、IL-2受容体、IL-7受容体、IL-15受容体、およびIL-21受容体が含まれるが、これらに限定されない。代替の実施形態では、Stat動員ドメインが由来する受容体は、サイトカイン受容体ではない。CACCRのStat動員ドメインを選択することにより、選択したシグナル伝達に受容体を向け直すことができる。
いくつかの実施形態では、本開示のCACCRは、リンカーを伴って、または伴わずに、膜貫通/JAK2結合ドメインのC末端に接続された動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、1つ以上のアミノ酸残基を含む。
表2aは、本開示のCACCRの動員ドメインが由来する例示的な受容体を提示する。表2bは、本開示の動員ドメインの例示的なアミノ酸配列を提示する。いくつかの実施形態では、本開示のCACCRは、表2bの受容体配列のうちの1つ以上から選択されるアミノ酸配列を含む動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示のCACCRは、表2bの配列のいずれか1つと少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む動員ドメインを含む。
Figure 2022522786000012
Figure 2022522786000013
Figure 2022522786000014
Figure 2022522786000015
Figure 2022522786000016
Figure 2022522786000017
いくつかの実施形態では、本開示のCACCRのStat動員ドメインは、1つの受容体由来のSTAT動員ドメインを含む。
複数の出力を生成するために、2つ以上のSTAT動員ドメインをタンデムに結合して、1つ以上のサイトカインからのシグナル伝達を模倣することができる。
いくつかの実施形態では、2つ以上のSTAT動員ドメインは、リンカーを伴って、または伴わずに、タンデムに結合され得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、1つ以上のアミノ酸残基を含む。
いくつかの実施形態では、STAT動員ドメインは、例えば、1つを超えるSTAT動員ドメインを含む、1つを超える受容体の部分を含む。そのような実施形態では、タンデムサイトカインシグナル伝達ドメインが提供され、シグナル伝達の増強を可能にする。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のCACCRのモノマーのSTAT動員ドメインは、1つを超える受容体由来のSTAT動員ドメインを含み、例えば、2、3、4、5、または6つもの受容体由来のSTAT動員ドメインを含む。例えば、いくつかの実施形態では、STAT動員ドメインは、複数の経路を刺激するためにタンデムに連結され得る(例えば、持続性増強STAT5および炎症促進性STAT4のためのIL7R(316~459)-IL12Rb2(775~825)断片融合、持続性増強のためのIL7R(316~459)-IL2Rbsmall(393~433、518~551)、持続性増強と抗疲弊のためのIL7R(316~459)-EGFR(1122~1165)、持続性増強と抗疲弊のためのIL2Rbsmall(393~433、518~551)-EGFR(1122~1165))。
複数の出力を生成する際に、個々のSTAT動員ドメインの細胞膜への近接性は、それらのそれぞれのシグナル伝達出力の強度に影響を及ぼし得る。表2cは、各出力を細胞膜の近位または遠位のいずれかに配置することのできる、二重出力を有するCACCRの例を示す。いくつかの実施形態では、本開示のCACCRは、表2cから選択された二重出力を有する動員ドメインを含む。
Figure 2022522786000018
Figure 2022522786000019
Figure 2022522786000020
理論またはメカニズムに拘束されることなく、いくつかの実施形態では、JAKタンパク質(JAK1、JAK2、JAK3、またはTYK2)は、本開示の二量体化されたCACCRに結合される。2つの結合したJAKタンパク質が活性化され、CACCRの動員ドメイン上のチロシン残基をリン酸化することができる。次いで、リン酸化された動員ドメインは、動員されたタンパク質に結合することができ(例えば、リン酸化されたSTAT動員ドメインはSTATタンパク質に結合する)、これは転じて核内の転写イベントをもたらす。
D.例示的なCACCR
表3は、本開示の例示的なCACCR配列を示す。受容体は、シグナル配列、例えば、配列MALPVTALLLPLALLLHAARP(配列番号89)のCD8SSとともに発現され得る。
いくつかの実施形態では、本開示のCACCRは、表3の配列のうちのいずれか1つを含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、配列番号90~98および107~139のアミノ酸配列のうちのいずれか1つと少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、TPOR/MPLR受容体は、配列番号90~98および107~139のアミノ酸配列のうちのいずれか1つを含む。
いくつかの実施形態では、CACCRは、TPOR/MPLR受容体に由来する膜貫通ドメインおよび/またはJAK結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本開示のCACCRは、配列番号6の天然に存在するTPOR/MPLR受容体のアミノ酸478~582を含む。いくつかの実施形態では、本開示のCACCRは、配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のCACCRは、配列番号17のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、表2bに示される受容体配列のうちの1つ以上のアミノ酸配列を含む動員ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、IL7Ra、IL2Rb、IL12Rb1、IL12Rb2、およびIL21R由来のSTAT動員ドメインからなる群から選択される1つ以上の動員ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL7Ra由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、IL7Ra由来のSTAT動員ドメインは、配列番号46、68、69、70、71、または72のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、IL7Ra由来のSTAT動員ドメインは、配列番号46、68、69、70、71、または72のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL2Rb由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、IL2Rb由来のSTAT動員ドメインは、配列番号47、73、74、75、76、77、78、106、または143のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、IL2Rb由来のSTAT動員ドメインは、配列番号47、73、74、75、76、77、78、106、または143のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL12Rb1またはIL12Rb2由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、IL12Rb1またはIL12Rb2由来のSTAT動員ドメインは、配列番号67、86、または87のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、IL12Rb1またはIL12Rb2由来のSTAT動員ドメインは、配列番号67、86、または87のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL21R由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、IL21R由来のSTAT動員ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、IL21R由来のSTAT動員ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、表2cに示される1つ以上の動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL7RaおよびIL2Rb由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL7RaおよびIL12Rb1由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL7RaおよびIL12Rb2由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、シグナル配列を伴って、または伴わずに、配列番号90または119のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、シグナル配列を伴って、または伴わずに、配列番号90または119のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のCACCRは、H499、S505、G509、またはW515での1つ以上のアミノ酸置換を含む、TPOR/MPLR受容体由来の膜貫通ドメインおよび/またはJAK結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、TPOR/MPLR受容体は、H499L置換を含む。いくつかの実施形態では、TPOR/MPLR受容体は、S505N置換を含む。いくつかの実施形態では、TPOR/MPLR受容体は、G509N置換を含む。いくつかの実施形態では、TPOR/MPLR受容体は、W515K置換を含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、表2bに示される受容体配列のうちの1つ以上のアミノ酸配列を含む動員ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、IL7Ra、IL2Rb、IL12Rb1、IL12Rb2、およびIL21R由来のSTAT動員ドメインからなる群から選択される1つ以上の動員ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL7Ra由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、IL7Ra由来のSTAT動員ドメインは、配列番号46、68、69、70、71、または72のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、IL7Ra由来のSTAT動員ドメインは、配列番号46、68、69、70、71、または72のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL2Rb由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、IL2Rb由来のSTAT動員ドメインは、配列番号47、73、74、75、76、77、78、106、または143のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、IL2Rb由来のSTAT動員ドメインは、配列番号47、73、74、75、76、77、78、106、または143のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL12Rb1またはIL12Rb2由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、IL12Rb1またはIL12Rb2由来のSTAT動員ドメインは、配列番号67、86、または87のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、IL12Rb1またはIL12Rb2由来のSTAT動員ドメインは、配列番号67、86、または87のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL21R由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、IL21R由来のSTAT動員ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、IL21R由来のSTAT動員ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、表2cに示される1つ以上の動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL7RaおよびIL2Rb由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL7RaおよびIL12Rb1由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL7RaおよびIL12Rb2由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、シグナル配列を伴って、または伴わずに、配列番号92、94、121、または123のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、シグナル配列を伴って、または伴わずに、配列番号92、94、121、または123のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のCACCRは、H499LおよびS505N置換を含む、TPOR/MPLR受容体由来の膜貫通ドメインおよび/またはJAK結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、表2bに示される受容体配列のうちの1つ以上のアミノ酸配列を含む動員ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、IL7Ra、IL2Rb、IL12Rb1、IL12Rb2、およびIL21R由来のSTAT動員ドメインからなる群から選択される1つ以上の動員ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL7Ra由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、IL7Ra由来のSTAT動員ドメインは、配列番号46、68、69、70、71、または72のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、IL7Ra由来のSTAT動員ドメインは、配列番号46、68、69、70、71、または72のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL2Rb由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、IL2Rb由来のSTAT動員ドメインは、配列番号47、73、74、75、76、77、78、106、または143のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、IL2Rb由来のSTAT動員ドメインは、配列番号47、73、74、75、76、77、78、106、または143のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL12Rb1またはIL12Rb2由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、IL12Rb1またはIL12Rb2由来のSTAT動員ドメインは、配列番号67、86、または87のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、IL12Rb1またはIL12Rb2由来のSTAT動員ドメインは、配列番号67、86、または87のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL21R由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、IL21R由来のSTAT動員ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、IL21R由来のSTAT動員ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、表2cに示される1つ以上の動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL7RaおよびIL2Rb由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL7RaおよびIL12Rb1由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL7RaおよびIL12Rb2由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、シグナル配列を伴って、または伴わずに、配列番号91、98、120、または127のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、シグナル配列を伴って、または伴わずに、配列番号91、98、120、または127のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のCACCRは、H499LおよびW515K置換またはH499LおよびG509N置換を含む、TPOR/MPLR受容体由来の膜貫通ドメインおよび/またはJAK結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、表2bに示される受容体配列のうちの1つ以上のアミノ酸配列を含む動員ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、IL7Ra、IL2Rb、IL12Rb1、IL12Rb2、およびIL21R由来のSTAT動員ドメインからなる群から選択される1つ以上の動員ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL7Ra由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、IL7Ra由来のSTAT動員ドメインは、配列番号46、68、69、70、71、または72のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、IL7Ra由来のSTAT動員ドメインは、配列番号46、68、69、70、71、または72のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL2Rb由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、IL2Rb由来のSTAT動員ドメインは、配列番号47、73、74、75、76、77、78、106、または143のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、IL2Rb由来のSTAT動員ドメインは、配列番号47、73、74、75、76、77、78、106、または143のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL12Rb1またはIL12Rb2由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、IL12Rb1またはIL12Rb2由来のSTAT動員ドメインは、配列番号67、86、または87のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、IL12Rb1またはIL12Rb2由来のSTAT動員ドメインは、配列番号67、86、または87のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL21R由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、IL21R由来のSTAT動員ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、IL21R由来のSTAT動員ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、表2cに示される1つ以上の動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL7RaおよびIL2Rb由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL7RaおよびIL12Rb1由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL7RaおよびIL12Rb2由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、シグナル配列を伴って、または伴わずに、配列番号97または126のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、シグナル配列を伴って、または伴わずに、配列番号97または126のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のCACCRは、S505NおよびW515K置換を含む、TPOR/MPLR受容体由来の膜貫通ドメインおよび/またはJAK結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、表2bに示される受容体配列のうちの1つ以上のアミノ酸配列を含む動員ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、IL7Ra、IL2Rb、IL12Rb1、IL12Rb2、およびIL21R由来のSTAT動員ドメインからなる群から選択される1つ以上の動員ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL7Ra由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、IL7Ra由来のSTAT動員ドメインは、配列番号46、68、69、70、71、または72のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、IL7Ra由来のSTAT動員ドメインは、配列番号46、68、69、70、71、または72のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL2Rb由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、IL2Rb由来のSTAT動員ドメインは、配列番号47、73、74、75、76、77、78、106、または143のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、IL2Rb由来のSTAT動員ドメインは、配列番号47、73、74、75、76、77、78、106、または143のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL12Rb1またはIL12Rb2由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、IL12Rb1またはIL12Rb2由来のSTAT動員ドメインは、配列番号67、86、または87のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、IL12Rb1またはIL12Rb2由来のSTAT動員ドメインは、配列番号67、86、または87のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL21R由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、IL21R由来のSTAT動員ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、IL21R由来のSTAT動員ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、表2cに示される1つ以上の動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL7RaおよびIL2Rb由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL7RaおよびIL12Rb1由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL7RaおよびIL12Rb2由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、シグナル配列を伴って、または伴わずに、配列番号96、107、109、111、113、115、117、125、128、129、132、134、136、または138のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、シグナル配列を伴って、または伴わずに、配列番号96、107、109、111、113、115、117、125、128、129、132、134、136、または138のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のCACCRは、H499LおよびW515K置換を含む、TPOR/MPLR受容体由来の膜貫通ドメインおよび/またはJAK結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、表2bに示される受容体配列のうちの1つ以上のアミノ酸配列を含む動員ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、IL7Ra、IL2Rb、IL12Rb1、IL12Rb2、およびIL21R由来のSTAT動員ドメインからなる群から選択される1つ以上の動員ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL7Ra由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、IL7Ra由来のSTAT動員ドメインは、配列番号46、68、69、70、71、または72のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、IL7Ra由来のSTAT動員ドメインは、配列番号46、68、69、70、71、または72のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL2Rb由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、IL2Rb由来のSTAT動員ドメインは、配列番号47、73、74、75、76、77、78、106、または143のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、IL2Rb由来のSTAT動員ドメインは、配列番号47、73、74、75、76、77、78、106、または143のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL12Rb1またはIL12Rb2由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、IL12Rb1またはIL12Rb2由来のSTAT動員ドメインは、配列番号67、86、または87のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、IL12Rb1またはIL12Rb2由来のSTAT動員ドメインは、配列番号67、86、または87のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL21R由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、IL21R由来のSTAT動員ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、IL21R由来のSTAT動員ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、表2cに示される1つ以上の動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL7RaおよびIL2Rb由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL7RaおよびIL12Rb1由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL7RaおよびIL12Rb2由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、シグナル配列を伴って、または伴わずに、配列番号93のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、シグナル配列を伴って、または伴わずに、配列番号93のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のCACCRは、H499L、S505N、およびW515K置換を含む、TPOR/MPLR受容体由来の膜貫通ドメインおよび/またはJAK結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、表2bに示される受容体配列のうちの1つ以上のアミノ酸配列を含む動員ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、IL7Ra、IL2Rb、IL12Rb1、IL12Rb2、およびIL21R由来のSTAT動員ドメインからなる群から選択される1つ以上の動員ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL7Ra由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、IL7Ra由来のSTAT動員ドメインは、配列番号46、68、69、70、71、または72のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、IL7Ra由来のSTAT動員ドメインは、配列番号46、68、69、70、71、または72のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL2Rb由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、IL2Rb由来のSTAT動員ドメインは、配列番号47、73、74、75、76、77、78、106、または143のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、IL2Rb由来のSTAT動員ドメインは、配列番号47、73、74、75、76、77、78、106、または143のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL12Rb1またはIL12Rb2由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、IL12Rb1またはIL12Rb2由来のSTAT動員ドメインは、配列番号67、86、または87のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、IL12Rb1またはIL12Rb2由来のSTAT動員ドメインは、配列番号67、86、または87のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL21R由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、IL21R由来のSTAT動員ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、IL21R由来のSTAT動員ドメインは、配列番号54のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、表2cに示される1つ以上の動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL7RaおよびIL2Rb由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL7RaおよびIL12Rb1由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、動員ドメインは、IL7RaおよびIL12Rb2由来のSTAT動員ドメインを含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、シグナル配列を伴って、または伴わずに、配列番号95、108、110、112、114、116、118、124、130、131、133、135、137、または139のアミノ酸配列と少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、シグナル配列を伴って、または伴わずに、配列番号95、108、110、112、114、116、118、124、130、131、133、135、137、または139のアミノ酸配列を含む。
Figure 2022522786000021
Figure 2022522786000022
Figure 2022522786000023
Figure 2022522786000024
Figure 2022522786000025
Figure 2022522786000026
Figure 2022522786000027
Figure 2022522786000028
Figure 2022522786000029
Figure 2022522786000030
E.CACCRの発現
本明細書で提供されるCACCRのうちのいずれか1つをコードするポリヌクレオチドが本明細書で提供される。同様に、そのようなポリヌクレオチドを含む発現ベクターが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターはウイルスベクターではない。
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、CACCRおよびキメラ抗原受容体(CAR)を発現するポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、CACCRとCARの発現は、リンカーによって分離された単一のポリペプチド鎖として発現される。図2は、本開示のCACCRとCARを共発現させるために使用できるベクターの概略図を示す。1つ以上の動員ドメインをタンデムに結合して、1つ以上のサイトカインからのシグナル伝達を模倣することができる。
II.CARを担持する免疫細胞
本開示のキメラ抗原受容体(CAR)とCACCRをコードするポリヌクレオチドを含む操作された免疫細胞が本明細書で提供される。本開示のキメラ抗原受容体(CAR-I細胞)とCACCRを発現する操作された免疫細胞が本明細書で提供される。免疫細胞の例は、T細胞、例えば、アルファ/ベータT細胞およびガンマ/デルタT細胞、B細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、ナチュラルキラーT(NKT)細胞、インバリアントNKT細胞、マスト細胞、骨髄由来食細胞、樹状細胞、キラー樹状細胞、マクロファージ、ならびに単球を含む。免疫細胞は、例えば、非限定的に、幹細胞に由来する細胞も指す。幹細胞は、成人幹細胞、非ヒト胚性幹細胞、より具体的には非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞または造血幹細胞であり得る。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示のCACCRを含むCAR-T細胞が本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、CARは、細胞外リガンド結合ドメイン(例えば、単鎖可変断片(scFv))と、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインと、を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインは、1つのポリペプチド、すなわち、一本鎖にある。多重鎖(multichain)CARおよびポリペプチドも、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、多重鎖CARは、膜貫通ドメインおよび少なくとも1つの細胞外リガンド結合ドメインを含む第1のポリペプチドと、膜貫通ドメインおよび少なくとも1つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む第2のポリペプチドと、を含み、ポリペプチドは一緒に構築して多重鎖CARを形成する。
CARの細胞外リガンド結合ドメインは、目的の標的に特異的に結合する。目的の標的は、例えば、非限定的に、BCMA、EGFRvIII、Flt-3、WT-1、CD20、CD23、CD30、CD38、CD70、CD33、CD133、LeY、NKG2D、CS1、CD44v6、ROR1、CD19、クローディン18.2(クローディン18A2、またはクローディン18アイソフォーム2)、DLL3(デルタ様タンパク質3、Drosophilaデルタホモログ3、Delta3)、Muc17(ムチン17、Muc3、Muc3)、FAPアルファ(線維芽細胞活性化タンパク質アルファ)、Ly6G6D(リンパ球抗原6複合遺伝子座タンパク質G6d、c6orf23、G6D、MEGT1、NG25)、および/またはRNF43(E3ユビキチンタンパク質リガーゼRNF43、RINGフィンガータンパク質43)を含む任意の目的の分子であってよい。
いくつかの実施形態では、CARの細胞外リガンド結合ドメインは、可動性リンカーによって結合された標的抗原特異的モノクローナル抗体の軽鎖可変(VL)領域および重鎖可変(VH)領域を含むscFvを含む。単鎖可変領域断片は、短い連結ペプチド(例えば、グリシン-セリン含有リンカー)を使用することによって軽鎖および/または重鎖の可変領域を連結することにより作製される(Bird et al.,Science 242:423-426,1988)。一般に、リンカーは、短い、可撓性ポリペプチドであり、一般的に約20以下のアミノ酸残基から構成され得る。次に、リンカーは、薬物の付着または固体支持物への付着のような、追加的機能のために修飾され得る。一本鎖バリアントは、組換えまたは合成的のいずれかで生み出され得る。scFvの合成産生のために、自動合成装置が使用され得る。ScFvの組換え産生のために、scFvをコードするポリヌクレオチドを含む好適なプラスミドは、酵母、植物、昆虫もしくは哺乳動物細胞のような真核生物、またはE.coliのような原核生物のいずれかの好適な宿主細胞中に導入され得る。目的のscFvをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーションのような日常的な操作によって作製され得る。生じたscFvは、当該技術分野で既知の標準的なタンパク質精製技法を使用して単離され得る。
本発明によるCARの細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインの標的への結合に続く細胞内シグナル伝達を担い、免疫細胞の活性化および免疫応答(シグナル1および/または2)をもたらす。細胞内シグナル伝達ドメインは、CARが発現する免疫細胞の通常のエフェクター機能のうちの少なくとも1つを活性化する能力を有する。例えば、T細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。
いくつかの実施形態では、CARにおける使用のための細胞内シグナル伝達ドメインは、これらの配列の任意の類似体またはバリアント、および同じ機能的能力を有する任意の合成配列と同様に、例えば、限定なく、抗原受容体の会合に続くシグナル形質導入を開始することと協調して作用するT細胞受容体および共受容体の細胞質配列であり得る。細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞質シグナル伝達配列の2つの異なるクラス、抗原依存性の一次活性化を開始するものと、抗原独立様式で作用して二次的または共刺激シグナルを提供するものと、を含む。一次細胞質シグナル伝達配列は、ITAMの免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフとして知られているシグナル伝達モチーフを含み得る。ITAMは、syk/zap70クラスのチロシンキナーゼに対する結合部位として機能するさまざまな受容体の細胞質内尾部において見出される明確に定義されたシグナル伝達モチーフである。本発明において使用されるITAMの例は、非限定的な例として、TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79bおよびCD66dに由来するものを含み得る。いくつかの実施形態では、CARの細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζシグナル伝達ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、本発明のCARの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子のドメインを含む。
いくつかの実施形態では、本発明のCARの細胞内シグナル伝達ドメインは、41BB(GenBank:AAA53133.)およびCD28(NP_006130.1)の断片からなる群から選択される共刺激分子の一部を含む。
CARは、細胞の表面膜上に発現される。したがって、CARは、膜貫通ドメインを含み得る。本明細書に開示されるCARに好適な膜貫通ドメインは、(a)細胞、好ましくは、例えば、限定なく、リンパ球細胞またはナチュラルキラー(NK)細胞のような免疫細胞の表面上で発現される能力と、(b)事前定義された標的細胞に対して免疫細胞の細胞応答を方向付けるために、リガンド結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインと相互作用する能力と、を有する。膜貫通ドメインは、天然または合成供給源のいずれかに由来し得る。膜貫通ドメインは、任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来し得る。非限定的な例として、膜貫通ポリペプチドは、CD3複合体、IL-2受容体p55(鎖)、p75(β鎖)もしくはγ鎖、Fc受容体のサブユニット鎖、特にFcγ受容体IIIもしくはCDタンパク質を構成するα、β、γまたはδポリペプチドのようなT細胞受容体のサブユニットであり得る。代替的には、膜貫通ドメインは、合成的であり得、ロイシンおよびバリンのような主に疎水性残基を含み得る。いくつかの実施形態では、該膜貫通ドメインは、ヒトCD8α鎖(例えば、NP_001139345.1)に由来する。膜貫通ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインと該膜貫通ドメインとの間にストークドメインをさらに含み得る。ストークドメインは、最大300アミノ酸、好ましくは10~100アミノ酸、最も好ましくは25~50アミノ酸を含み得る。ストーク領域は、CD8、CD4、またはCD28の細胞外領域の全てもしくは一部から、または抗体定常領域の全てもしくは一部からのような、天然に発生する分子の全てまたは一部に由来し得る。代替的には、ストークドメインは、天然に発生するストーク配列に対応する合成配列であり得るか、または完全に合成ストーク配列であり得る。いくつかの実施形態では、該ストークドメインは、ヒトCD8α鎖(例えば、NP_001139345.1)の一部である。別の特定の実施形態では、該膜貫通ドメインおよびヒンジドメインは、ヒトCD8α鎖の一部を含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζシグナル伝達ドメインと、さらに第2のシグナル伝達ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζシグナル伝達ドメインと、4-1BBシグナル伝達ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるCARは、BCMAまたはEGFRvIII、CD8αヒトヒンジおよび膜貫通ドメイン、CD3ζシグナル伝達ドメイン、ならびに4-1BBシグナル伝達ドメインに特異的に結合する細胞外リガンド結合ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、EGFRvIII特異的CARは、配列番号140のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、BCMA特異的CARは、シグナル配列を伴って、または伴わずに、配列番号141または142のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、CAR免疫細胞は、本開示のCACCRを含むBCMA CAR-T細胞である。いくつかの実施形態では、BCMA CAR-T細胞のCACCRは、H499L、S505N、およびW515Kの三重置換、またはS505NおよびW515Kの二重置換(例えば、配列番号12または13)を有する、配列番号6の天然に存在するTPOR/MPLR受容体のアミノ酸478~582の膜貫通/JAK結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、CACCRは、IL2Rb由来の動員ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、BCMA CAR-T細胞のCACCRは、IL2Rb(393~433、518~551)またはIL2Rb(339~379、393~433、518~551)由来の動員ドメイン(例えば、配列番号77または78)をさらに含む。いくつかの実施形態では、BCMA特異的CARは、シグナル配列を伴って、または伴わずに、配列番号141または142のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、BCMA CAR-T細胞は、シグナル配列を伴って、または伴わずに、配列番号113、114、または116のアミノ酸配列を含むCACCRを含む。
いくつかの実施形態では、CARは、プラスミドベクターを介して導入遺伝子として免疫細胞中に導入され得る。いくつかの実施形態では、プラスミドベクターはまた、例えば、ベクターを受けた細胞の同定および/または選択を提供する選択マーカーを含むことができる。
表4は、本明細書に開示されるCARにおいて使用され得るCAR構成成分の例示的な配列、ならびに本明細書で例示される抗体および/またはCAR配列を提供する。
Figure 2022522786000031
Figure 2022522786000032
いくつかの実施形態では、本開示のCAR免疫細胞(例えば、CAR-T細胞)は、例えば、RQR8のような自殺ポリペプチド(suicide polypeptide)をコードするポリヌクレオチドを含む。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるWO2013153391Aを参照されたい。いくつかの実施形態では、自殺ポリペプチドは、細胞の表面上で発現される。いくつかの実施形態では、自殺ポリペプチドは、CAR構築物に含まれる。いくつかの実施形態では、自殺ポリペプチドは、CAR構築物の部分でない。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるCARのうちのいずれか1つの細胞外ドメインは、モノクローナル抗体に対して特異的な(モノクローナル抗体に特異的に認識される)1つ以上のエピトープを含み得る。これらのエピトープは、本明細書ではmAb特異的エピトープとも称される。例示的なmAb特異的エピトープは、その全体が本明細書に組み込まれる国際特許公開第WO2016/120216号に開示される。これらの実施形態では、CARの細胞外ドメインは、目的の標的に特異的に結合する抗原結合ドメインと、1つ以上のモノクローナル抗体(mAb)に結合する1つ以上のエピトープと、を含む。mAb特異的エピトープを含むCARは、単鎖または多鎖であり得る。
本明細書に記載されるCARの細胞外ドメインにおけるモノクローナル抗体に対して特異的なエピトープの包含は、CARを発現する操作された免疫細胞の選別および枯渇を可能にする。いくつかの実施形態では、枯渇を可能にすることは、例えば対象への投与時の有害な影響の場合に、安全スイッチを提供する。
免疫療法での使用のための操作された免疫細胞を調製する方法も、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、方法は、CACCRおよびCARを免疫細胞中に導入することと、細胞を拡大することと、を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、細胞を提供することと、CACCRを発現させることと、少なくとも1つのCARを細胞の表面で発現させることと、を含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、方法は、CACCRをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、およびCARをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドによって細胞をトランスフェクトすることと、細胞においてポリヌクレオチドを発現させることと、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、CACCRをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、およびCARをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドによって細胞をトランスフェクトすることと、細胞においてポリヌクレオチドを発現させることと、を含む。
いくつかの実施形態では、CACCRおよびCARをコードするポリヌクレオチドは、細胞における安定的な発現のために1つ以上の発現ベクターに存在する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞における安定的な発現のためにウイルスベクターに存在する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、例えば、レンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターであり得る。
いくつかの実施形態では、本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、エレクトロポレーションによって細胞中に直接導入されるmRNAであり得る。いくつかの実施形態では、PulseAgileのようなCytoPulseエレクトロポレーション技術は、細胞中への材料の送達のために生細胞を一過的に透過処理するために使用され得る(例えば、US 6,078,490、PCT/US2011/000827、およびPCT/US2004/005237)。パラメータは、最小の死亡率を伴う高トランスフェクション効率のための条件を決定するために変更され得る。
免疫細胞、例えばT細胞をトランスフェクトする方法も本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、この方法は、T細胞をRNAと接触させることと、T細胞にアジャイルパルスシーケンスを適用することと、を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞(例えば、T細胞)をトランスフェクトする方法は、免疫細胞をRNAと接触させることと、細胞にアジャイルパルスシーケンスを適用することと、を含む。
いくつかの実施形態では、方法は、例えば、限定なく、TCRの構成成分、免疫抑制剤の標的、HLA遺伝子、および/またはPDCD1もしくはCTLA-4のような免疫チェックポイントタンパク質を発現する少なくとも1つの遺伝子を不活性化することによる、細胞を遺伝子改変するステップをさらに含み得る。遺伝子を不活性化することにより、目的の遺伝子は機能的なタンパク質形態で発現されないことが、意図される。いくつかの実施形態では、不活性化される遺伝子は、例えば、限定なく、TCRα、TCRβ、CD52、GR、デオキシシチジンキナーゼ(DCK)、PD-1、およびCTLA-4からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、方法は、選択的DNA切断によって遺伝子を選択的に不活性化することができるレアカット(rare-cutting)エンドヌクレアーゼを細胞中に導入することによって1つ以上の遺伝子を不活性化することを含む。いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼは、例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEヌクレアーゼ)、またはCRISPRベースのエンドヌクレアーゼ(例えば、Cas-9もしくはCas12a)であり得る。
別の態様では、細胞を遺伝子改変するステップは、免疫抑制剤の標的を発現する少なくとも1つの遺伝子を不活性化することによって免疫細胞を改変することと、任意選択で、免疫抑制剤の存在下で細胞を拡大することと、を含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される操作された免疫細胞(例えば、T細胞)は、CACCRを発現しない操作された免疫細胞と比較して、改善された細胞傷害性、増加した拡大、および/または増加したレベルのメモリー表現型マーカーを示す。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される操作された免疫細胞(例えば、T細胞)は、CACCRを発現しない操作された免疫細胞と比較して、(i)インビボ持続性の増加、(ii)STAT活性化の増加、(iii)細胞傷害性の増加、(iv)メモリー表現型マーカーのレベルの増加、(v)拡大(増殖)の増加、またはこれらの機能的特徴の組み合わせを示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される1つ以上の機能的特徴の改善は、CACCRに導入された変異/改変に依存して、調整可能である。いくつかの実施形態では、開示される1つ以上のCACCRを含む操作された免疫細胞によって活性化されるSTATは、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5、STAT6、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、CACCRを含む免疫細胞によって増加または維持されるメモリー表現型マーカーは、幹細胞メモリー(Tscm)マーカーおよびセントラルメモリー(Tcm)マーカーを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるCACCRを含む免疫細胞によって示される1つ以上の機能的特徴の改善は、CACCRを発現しない免疫細胞と比較して、それらの間の値および範囲を含む、少なくとも約2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、125倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、または約10500倍までもである。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるCACCRを含む免疫細胞によって示される1つ以上の機能的特徴の改善は、CACCRを発現しない免疫細胞と比較して、それらの間の値および範囲を含む、少なくとも約10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、70%、75%、80%、90%、100%、125%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、または約500%までもである。
III.治療法
本開示のCACCRおよびCARを担持する細胞を含む医薬組成物が本明細書で提供される。
上述の方法によって得られた操作されたCACCR担持およびCAR担持免疫細胞(例えばT細胞)、またはそのような操作された免疫細胞に由来する細胞株は、医薬として使用することができる。いくつかの実施形態では、かかる医薬品は、例えばウイルス性疾患、細菌性疾患、がん、炎症性疾患、免疫疾患、または加齢関連疾患のような障害を治療するために使用され得る。いくつかの実施形態では、がんは固形がんである。いくつかの実施形態では、がんは液体がんである。がんは、胃がん、肉腫、リンパ腫、白血病、頭頸部がん、胸腺がん、上皮がん、唾液がん、肝臓がん、胃がん、甲状腺がん、肺がん、卵巣がん、乳がん、前立腺がん、食道がん、膵臓がん、神経膠腫、白血病、多発性骨髄腫、腎細胞がん、膀胱がん、子宮頸がん、絨毛がん、結腸がん、口腔がん、皮膚がん、および黒色腫からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、対象は、局所進行性もしくは転移性黒色腫、扁平上皮性頭頸部がん(SCHNC)、卵巣がん、肉腫、または再発性もしくは難治性の古典的ホジキンリンパ腫(cHL)を有する以前に治療された成人対象である。
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞、または操作された免疫細胞に由来する細胞株は、それを必要とする対象における障害の治療のための医薬の製造に使用され得る。いくつかの実施形態では、障害は、例えば、がん、自己免疫障害、または感染症であり得る。
また、本明細書では、そのような治療を必要とする対象を治療する方法も、提供される。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、非限定的に、ヒトおよび他の霊長類(例えば、チンパンジー、カニクイザル、ならびに他の類人猿およびサル種)、家畜(例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマ)、飼育哺乳動物(例えば、イヌおよびネコ)、実験動物(例えば、ウサギ、マウス、ラット、およびモルモットなどのげっ歯類)、ならびに鳥類(例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、および他の家禽鳥類、アヒル、ガチョウなどのような飼育、野生、およびゲーム用鳥類)を含む任意の脊椎動物を指す。いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物である。例示的な実施形態では、対象は、ヒトである。
いくつかの実施形態では、この方法は、本明細書に記載のCACCRおよびCARを担持する、本開示の免疫細胞を、それを必要とする対象に提供することを含む。
いくつかの実施形態では、本発明のCACCRおよびCARを担持するT細胞は、頑健なインビボ細胞拡大を経ることができ、長期間残存することができる。
本発明の治療方法は、改善すること、治癒的または予防的であり得る。本発明の方法は、自己免疫療法の一部または同種免疫療法治療の一部のいずれかであり得る。
別の態様では、本発明は、腫瘍を有する対象における腫瘍の増殖または進行を阻害する方法であって、有効量の、本明細書に記載のCACCRを発現およびCARを発現する免疫細胞を対象に投与することを含む、方法を提供する。別の態様では、本発明は、対象におけるがん細胞の転移を阻害または防止する方法であって、有効量の本明細書に記載の操作された免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。別の態様では、本発明は、腫瘍を有する対象において腫瘍退縮を誘導する方法であって、有効量の本明細書に記載の操作された免疫細胞を対象に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書における操作されたT細胞は、対象において非経口的に投与され得る。
本明細書ではさらに、それを必要とする対象における、がんの治療のための、または腫瘍の増殖もしくは進行を阻害するための医薬の製造における、本明細書に提供される操作されたT細胞うちのいずれかの使用が提供される。
いくつかの実施形態では、治療は、免疫抑制治療を受けている対象中に投与され得る。実際、本発明は、好ましくは、かかる免疫抑制剤の受容体をコードする遺伝子の不活性化に起因して、少なくとも1つの免疫抑制剤に対して耐性を持たせられている細胞または細胞の集団に依存する。この態様では、免疫抑制治療は、対象内での本発明による免疫細胞の選択および拡大を助けるはずである。本発明に従う細胞または細胞の集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、移植(implantation)または移植(transplantation)によるものを含む、任意の簡便な様式で実施され得る。本明細書に記載される組成物は、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内もしくはリンパ内注射、または腹腔内で対象に投与され得る。本開示のCACCRおよびCARを担持する細胞またはその医薬組成物は、以下の投与経路のうちの1つ以上を介して投与され得る:静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、皮下、局所、経口、経皮、腹腔内、眼窩内、移植により、吸入により、髄腔内、脳室内、耳経由、または鼻腔内。
いくつかの実施形態では、(本開示のCACCRとCARを担持する)細胞または細胞集団の投与は、それらの範囲内の細胞数の全ての整数値を含む、例えば、体重1kgあたり約104~約109細胞の投与を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞または細胞集団の投与は、体重1kgあたり約104~105細胞、体重1kgあたり105~106細胞、体重1kgあたり106~107細胞、体重1kgあたり107~108細胞、または体重1kgあたり108~109細胞の投与を含み得る。細胞または細胞の集団は、1回以上の用量で投与され得る。いくつかの実施形態では、該有効量の細胞は、単回用量として投与され得る。いくつかの実施形態では、該有効量の細胞は、期間にわたって2回以上の用量として投与され得る。投与のタイミングは、主治医の判断の範囲内であり、対象の臨床状態に依存する。細胞または細胞の集団は、血液バンクまたはドナーのような任意の供給源から得られることができる。個々の必要性は変化するが、一方で、当該分野の範囲内の特定の疾患または状態に対する所与の細胞型の有効量の最適範囲の決定。有効量は、治療的または予防的利益を提供する量を意味する。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康状態および体重、同時治療の種類、もしあるなら、治療の頻度ならびに所望の効果の性質に依存するであろう。いくつかの実施形態では、有効量の細胞またはそれらの細胞を含む組成物は、非経口投与される。いくつかの実施形態では、投与は、静脈内投与であり得る。いくつかの実施形態では、投与は、腫瘍内の注射によって直接行われ得る。
方法は、本明細書に提供されるCARおよびCACCRを担持する操作された免疫細胞を投与する前に、1つ以上の治療薬を対象に投与することをさらに含み得る。ある特定の実施形態では、薬剤は、リンパ枯渇(lymphodepleting)(プレコンディショニング)レジメンである。例えば、かかる療法を必要とする対象をリンパ枯渇させる方法は、対象に特定の有効用量のシクロホスファミド(200mg/m2/日~2000mg/m2/日、約100mg/m2/日~約2000mg/m2/日、例えば、約100mg/m2/日、約200mg/m2/日、約300mg/m2/日、約400mg/m2/日、約500mg/m2/日、約600mg/m2/日、約700mg/m2/日、約800mg/m2/日、約900mg/m2/日、約1000mg/m2/日、約1500mg/m2/日または約2000mg/m2/日)および特定の用量のフルダラビン(20mg/m2/日~900mg/m2/日、約10mg/m2/日~約900mg/m2/日、例えば、約10mg/m2/日、約20mg/m2/日、約30mg/m2/日、約40mg/m2/日、約40mg/m2/日、約50mg/m2/日、約60mg/m2/日、約70mg/m2/日、約80mg/m2/日、約90mg/m2/日、約100mg/m2/日、約500mg/m2/日または約900mg/m2/日)を投与することを含む。例示的な投薬レジメンは、治療有効量の操作された免疫細胞の患者への投与の前3日間に約30mg/m2/日のフルダラビンを投与することと組み合わせて、またはその前、またはその後に、約300mg/m2/日のシクロホスファミドを患者に毎日投与することを含む、対象を治療することを伴う。
いくつかの実施形態では、特に、本明細書に提供される操作された細胞がCD52の表面発現を除去または最小化するように遺伝子編集されている場合に、リンパ枯渇は、アレムツズマブのような抗CD52抗体の投与をさらに含む。いくつかの実施形態では、CD52抗体は、約1~20mg/日のIV、例えば、約13mg/日のIVの用量で、1、2、3日以上投与される。抗体は、リンパ枯渇レジメンの他の要素(例えば、シクロホスファミドおよび/またはフルダラビン)の投与と組み合わせて、その前に、またはその後に、投与され得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるCACCRおよびCAR発現免疫エフェクター細胞を含む組成物は、任意の数の化学療法剤と組み合わされて投与され得る。
IV.キットおよび製品
本開示は、本明細書に記載のCACCRおよびCARを担持する細胞のいずれか1つ以上、ならびにそれらの医薬組成物を含むキットを提供する。本開示はまた、本明細書に記載のCACCRおよびCARを担持するCAR-1細胞のいずれか1つ以上、それらの医薬組成物、および本明細書に記載のキットを含む製品を提供する。
以下の実施例は、例示目的のみのために提供され、決して本発明の範囲を限定するように意図されるものではない。
本開示を通して参照される全ての特許および非特許文献は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
実施例1:サイトカインシグナル伝達を構成的に活性化するTpoR TM変異体の同定
トロンボポエチン受容体(TpoR)の配列を使用して、プロトタイプの構成的に活性なキメラサイトカイン受容体(CACCR)を設計した。TpoRは、JAK-Statシグナル伝達経路を活性化することができ、ホモ二量体受容体としてシグナルを伝達する。TpoR活性における単一点変異(アミノ酸置換)は、受容体活性を調節することが示されている(Proc Natl Acad Sci U S A.2013 Feb 12;110(7):2540-5.;FASEB J.2011 Jul;25(7):2234-44.;J Biol Chem.2016 Feb 5;291(6):2974-87)。この例では、構成的に活性なキメラサイトカイン受容体が天然に存在するTpoR受容体から操作された。天然のTpoR受容体の細胞外ドメインが除去されたため、リガンド結合能を失った。1~3個の変異がその膜貫通ドメインに導入された。TpoRサイトテールは、所望の/記載されたサイトカイン受容体のもので置換された。図1は、操作された構成的に活性なキメラサイトカイン受容体の概略図を示す。
CAR-T細胞との関連で構成的に活性なキメラサイトカイン受容体の有用性を実証するために、各TpoR膜貫通(TM)バリアントを、第2世代EGFRvIII特異的CAR(2173scFv;Sci Transl Med.2015 Feb 18;7(275):275ra22.に記載)をコードするレンチウイルスベクターにクローニングした。サイトカイン受容体とCARの化学量論的共発現を可能にするために、両方の遺伝子はP2Aペプチドを介して連結された。形質導入された細胞の検出を容易にするために、v5エピトープタグ(KPIPNPLLGLDST(配列番号144))を、scFvとCD8ヒンジドメインの間に挿入した。
図2は、構成的に活性なキメラサイトカイン受容体およびCARを共発現するために使用されるレンチウイルスベクターの概略図を示す。
表4は、使用したコンストラクトに関連する配列を示す。
HEK293T細胞レポーターアッセイを使用して、構成的サイトカインシグナル伝達が可能なTpoR TMバリアントをスクリーニングした。簡潔に述べると、20,000のHEK293T細胞を、ポリ-L-リジンでコーティングされた96ウェルの平底プレートの各ウェル中に播種し、一晩接着させた。サイトカイン受容体-CARコンストラクト(2.5ng)、ホタルルシフェラーゼ(100ng、Promega)を駆動するStat応答エレメント、およびRenillaルシフェラーゼ対照レポーターベクター(1ng、Promega)を、Opti-MEM(Gibco)中に5uLの最終体積で混合した(「DNA混合物」)。陰性対照として、全てのサイトカインシグナル伝達ドメインを欠くBFP CARコンストラクトを細胞にトランスフェクトした。陽性対照として、細胞に全長ヒトEpoR(サイトカイン受容体-CARコンストラクトの代わりのエリスロポエチン受容体)をコードするベクターをトランスフェクトし、外因性組換えヒトEpoの添加によりStat5シグナル伝達を誘導できるようにした。5uLのOpti-MEMにおいて0.3uLのLipofectamine 2000(Invitrogen)を、室温で5分間インキュベートし、次いで、DNA混合物に添加した。混合物を室温で20分間インキュベートし、10uLの総量をHEK-293Tを含む各ウェルに添加した。トランスフェクションの48時間後、Stat5レポーター活性を、Dual-Gloルシフェラーゼアッセイシステム(Promega)を使用して評価した。Stat5レポーター活性の誘導倍率を、サイトカイン受容体を除く全てのベクターでトランスフェクトされ、未処理のままにされたHEK293T細胞のものに対して正規化した。
図3aおよび3bは、サイトカイン受容体シグナル伝達を構成的に活性化するTpoR TM変異体の同定を示す。図3aは、使用されたレンチウイルスベクターの概略図を示す。それは、CAR-T細胞におけるIL7シグナル伝達を模倣するIL7R(316~459)サイトテールを担持する。図3bは、Dual-Gloルシフェラーゼアッセイによって決定されるときの、Stat5レポーター活性を示す。野生型TpoR TMドメイン(TpoR(478~582))を担持するサイトカイン受容体はStat5を自発的に活性化しなかった。TpoR(478~582、S505N)、TpoR(478~582、W515K)、およびTpoR(478~582、H499L、G509N)変異体は、弱いStat5活性化をもたらした。TpoR(478~582、H499L、S505N、W515K)は中程度のStat5アクティビティを可能にし、TpoR(478~582、S505N、W515K)は最も強いStat5シグナルを生成した。
実施例2:構成的に活性なキメラサイトカイン受容体を発現するCAR-T細胞の生成
次に、これらのサイトカイン受容体が初代ヒトCAR-T細胞との関連でシグナルを伝達するかどうかを試験した。サイトカイン受容体CARをコードするレンチウイルスを作製するために、HEK293T細胞を、トランスフェクションの前日に、6ウェルプレートのウェルあたり10%FBS(Hyclone)を補充した2mLのDMEM(Gibco)中にmLあたり45万細胞で播種した。トランスフェクションの日に、レンチウイルスを、6ウェルプレートのウェルあたり250uLのOpti-MEM(Gibco)においてレンチウイルスパッケージングベクター1.5ugのpsPAX2、0.5ugのpMD2G、0.5ugの適切なCARベクターを一緒に混合することによって調製した(「DNA混合物」)。250uLのOpti-MEMにおいて10uLのLipofectamine 2000(Invitrogen)を、室温で5分間インキュベートし、次いで、DNA混合物に添加した。混合物を室温で20分間インキュベートし、500uLの総量をHEK293Tを含むウェルの側面にゆっくりと添加した。トランスフェクションの1日後に、6ウェルプレートにおけるHEK293T細胞の各ウェルからの培地を、ウェルあたり2mLのT細胞形質導入培地、すなわち、10%FBSを補充したX-Vivo-15で置き換えた。トランスフェクションの2日後に、HEK293T細胞からのレンチウイルス上清を回収し、0.45ミクロンフィルター(EMD Millipore)に通して細胞残屑を除去し、Lenti-Xコンセントレーター(Takara Bio)を製造者の使用説明書に従って使用して25倍に濃縮し、アリコートで瞬間冷凍した。レンチウイルス力価は、凍結レンチウイルスのアリコートを解凍し、4倍段階希釈を行い、JurkaT細胞(クローンE6-1;ATCC)で限界希釈滴定を行うことによって決定した。0日目に、精製されたT細胞を、100IU/mLのヒトIL-2(Miltenyi Biotec)で補充されたX-vivo-15培地(Lonza)において、Grex-24プレート(Wilson Wolf、カタログ番号80192M)を補充したX-Vivo-15培地(Lonza)において、10%FBS(Hyclone)、およびヒトT TransAct(Miltenyi Biotec、カタログ番号130-111-160、1:100希釈)で活性化した。2日目に、T細胞をT細胞形質導入培地に50万細胞/mLで再懸濁し、Grex-24プレートで100IU/mLのヒトIL-2とともにMOI=5のそれぞれのレンチウイルスストックで形質導入した。形質導入が完了した5日目に、細胞を回収して洗浄し、残留IL-2を除去した。次いで、それらをT細胞拡大培地、すなわち5%ヒトAB血清(Gemini Bio)を補充したX-Vivo-15に再懸濁し、各サンプルを2つの部分に均等に分割し、1つの部分に標準プロトコールに従う100IU/mLのヒトIL-2を入れ、もう1つは低濃度の25IU/mLのヒトIL-2を入れた。細胞を、T細胞拡大培地とそれぞれの濃度のヒトIL-2を使用して、必要に応じてより大きなG-Rex容器(Wilson Wolf)中で拡大した。5、9、および14日目に、各サンプルのT細胞の絶対数を数え、形質導入効率を、フローサイトメトリーを使用してFITCコンジュゲートv5タグモノクローナル抗体(Thermo Fisher)に結合したT細胞のパーセンテージを検出することにより、決定した。14日目または15日目に、CAR-T細胞産物を、凍結保存し、さらなるアッセイのために必要に応じて解凍した。
図4a~4cは、構成的に活性なキメラサイトカイン受容体を共発現するCAR-T細胞の生成の結果を示す。野生型TpoR TMサイトカイン受容体(TpoR(478~582))を有するCAR-T細胞培養と比較して、TpoR TM変異体を担持するCAR-T細胞培養は、総T細胞数(図4a)とCAR-T細胞数(図4b)の両方に関してより強力な拡大を受けた。図4a~4cは、TpoR TM変異体の形質導入効率が、野生型TpoR(478~582)の対応物と同等かそれ以上であることを示す。TpoR TM変異体は、CAR-T細胞産物のより高い収量を可能にする。さらに、より低いIL-2濃度でTpoR TM変異体を拡大させることは、CAR-T細胞の拡大または収量に影響を及ぼさなかった(図4c)。
CAR-T細胞生成の14日目に、CAR-T細胞のメモリー表現型が決定された。簡潔に述べると、サンプルを、PBSで洗浄し、Fcでブロックし、次いで、PBS+1%BSAで希釈した以下の抗体カクテルで染色した:BUV395コンジュゲート抗ヒトCD3、BV510コンジュゲート抗ヒトCD8、BV605コンジュゲートヒトCD4およびFITCコンジュゲートv5タグ(CAR検出用)、PE/Cy7コンジュゲート抗ヒトCD62L(Biolegend)、およびBV785コンジュゲート抗ヒトCD45RO(Biolegend)。最後に、サンプルをPBSで洗浄し、細胞ペレットをFACS分析のために130uLのPBS+1%BSAに再懸濁させた。
図5は、CAR-T細胞産物におけるメモリーT細胞サブセットの分布を示す。野生型TpoR(478~582)の対応物と比較して、TpoR(478~582、W515K)およびTpoR(478~582、H499L、G509N)変異体は、標準の100IU/mLのIL-2条件で拡大した場合により大きな分化を示した。低IL-2条件での増殖は分化を改善した。標準濃度のIL-2と協調して、TpoR(478~582、W515K)およびTpoR(478~582、H499L、G509N)変異体によって誘導されるより強いStat5シグナル伝達は、CAR-T細胞分化の加速をもたらし得、低IL-2条件での拡大は、構成的サイトカイン受容体を発現するCAR-T細胞との関連でより有利であり得る。
実施例3:TpoR TM変異体は、ヒトCAR-T細胞におけるサイトカインシグナル伝達を構成的に活性化する
TpoR TM変異体によって媒介されるサイトカインシグナル伝達の強度を決定するために、TpoR TMサイトカイン受容体バリアントを担持するCAR-T細胞を、100uLの無血清RPMI(Corning)で、37℃、5%CO2の加湿インキュベーターで4時間血清飢餓状態にした。陽性対照として、外因性組換えヒトIL-7(10ng/mL;Miltenyi)を4時間の血清飢餓の最後の30分間に添加した。4時間後、BUV395コンジュゲート抗ヒトCD3(Biolegend)およびFITCコンジュゲートv5タグモノクローナル抗体(Thermo Fisher)を含む抗体カクテルを、細胞に添加し、最後の20分間インキュベートした。次いで、各100uLサンプルに35uLの16%パラホルムアルデヒドを添加し、37℃で15分間インキュベートして細胞を固定した。次いで、細胞を、PBSで3回洗浄し、-20%で1または2晩100%冷メタノールで透過処理した。FACS分析の日に、細胞を、PBSで3回洗浄し、Fcでブロッキングし、PBS+1%BSAにおいて希釈されたAlexaFluor647複合体化抗マウス/ヒトStat5(pY694)(BD Biosciences)で染色した。暗所における室温での1時間のインキュベーション後、細胞を、FACS分析前に3回洗浄した。
図6a~6bは、pStat5+細胞のパーセンテージ(図6a)およびpStat5染色の幾何平均蛍光強度(gMFI)(図6b)によって反映される、各TpoR TMバリアントによって媒介される構成的サイトカインシグナル伝達の程度を示す。TpoR TM単一変異体(TpoR(478~582、S505N)およびTpoR(478~582、W515K))は、感知できるほどのStat5活性化を誘導しなかったが、TpoR TM二重変異体(TpoR(478~582、S505N、W515K)および三重変異体(TpoR(478~582、H499L、S505N、W515K))は、比較的強力な構成的Stat5活性化を誘導した。低IL-2および標準IL-2濃度で拡大したCAR-T細胞は、同等のStat活性化プロファイルを生成した。Stat5が活性化されたのは、同じ培養における、CARを担持するT細胞(CAR+)と、CARを担持しないT細胞(CAR-)のみであり、サイトカインシグナル伝達がCAR-T細胞特異的であることを示している。
実施例4:構成的サイトカイン受容体は、CAR-T細胞の細胞傷害性効力および応答の長期持続性を増強した
構成的サイトカイン受容体シグナル伝達がCAR-T細胞の細胞傷害活性を増強するかどうかを試験するために、標的細胞としてU87KO-EGFRvIII-nucGFPを使用した。U87KO-EGFRvIIIは、Cellectis SA(Paris,France)からの好意による寄贈品である。U87KO-EGFRvIIIは、まず転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)を使用して内因性野生型EGFRをノックアウトし、次いで、レンチウイルス形質導入を介して完全長ヒトEGFRvIIIを安定的に過剰発現させることによって、親細胞株U87MG(ATCC)に由来した。IncuCyte生細胞解析イメージングシステムを介した標的細胞イメージングを促進するために、U87KO-EGFRvIII-nucGFP標的細胞は、IncuCyte NucLight Greenレンチウイルス試薬(Sartorius)を用いた第2のレンチウイルス形質導入によってU87KO-EGFRvIIIに由来した。5,000のU87KO-EGFRvIII-nucGFP標的細胞を、播種し、10%FBS(Hyclone)、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、および20~25mMのHEPESを含有する50uLのRPMIにおいて黒色の壁および平坦で透明な底を有する96ウェルプレートにおいて付着することを可能にした。TpoR TMバリアントサイトカイン受容体を担持するEGFRvIII CAR(2173 scFv)T細胞を解凍し、1:8および1:2のエフェクター:標的(E:T)比で播種した標的細胞に添加した。比較のために、外因性組換えヒトIL-7を添加した場合と添加しない場合の野生型TpoR(478-582)CAR-T細胞をアッセイに含めた。該当する場合、CAR-T細胞は、浮遊細胞を元のプレートから標的細胞の新しいプレートに移すことにより、示された時点で再チャレンジされた。重複したウェルを、各条件について設定した。細胞傷害性は、IncuCyte生細胞解析イメージングシステムを使用して、各時点での生標的細胞の数を列挙することによって決定された。
図7a~7dは、1:8のE:T比でのTpoR TM変異体の細胞傷害活性を示している。Stat5(図6a~6b)を効果的に活性化できないことと一致して、単一のTpoR TM変異体TpoR(478~582、S505N)(図7a)およびTpoR(478~582、W515KN)(図7b)は、野生型TpoR(478~582)対照を担持する対応物と比較した機能強化を示さなかった。図7cは、標準的なIL-2濃度で拡大したTpoR二重変異体CAR-T細胞が増強されなかったことを示し、一方、低IL-2条件で拡大したTpoR二重変異体CAR-T細胞は、標的細胞の溶解においてより強力であった。図7dは、CAR-T細胞生成中のIL-2濃度に関係なく、TpoR三重変異体CAR-T細胞が標的細胞溶解においてより強力であったことを示す。これは、構成的サイトカイン受容体シグナル伝達がCAR-T細胞の効力を増強することを示す。
図8a~8bは、1:2のE:T比でのTpoR TM二重(図8a)および三重変異体(図8b)の細胞傷害活性を示す。一次応答の間、CAR-T細胞は、サイトカイン受容体の活性に関係なく、標的の細胞を同等に効果的に排除した。しかしながら、新しいターゲットで再チャレンジした場合、構成的に活性なキメラサイトカイン受容体を発現するCAR-T細胞のみが機能を維持し、構成的サイトカイン受容体シグナル伝達がCAR-T細胞応答の持続性を増強することを示す。
実施例5:構成的サイトカイン受容体は、CAR-T細胞の持続性を増強し、CAR+Tscmの拡大を促進した。
標的または外因性サイトカインの非存在下でのCAR-T細胞の持続性に対する構成的サイトカイン受容体シグナル伝達の増強効果を確認するために、増殖因子非依存性アッセイを実施した。簡潔に述べると、全てのサンプルにわたるCAR-T細胞のパーセンテージは、非形質導入(NTD)T細胞の添加により、最も低い形質導入効率(35.7%)のサンプルに対して正規化された。10%FBS(Hyclone社)、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、および20~25mMのHEPESを含む4mLのRPMI中に0.25×106/mLのCAR担持T細胞の細胞。次に、細胞をT25組織培養フラスコに播種した。陽性対照として、外因性ヒトIL-7(10ng/mL;Miltenyi)を、構成的サイトカイン受容体シグナル伝達を欠くCAR-T細胞(野生型TpoR(478~582))に添加した。各条件から200uLの2重のサンプルを回収し、Zombie NIR Fixable Viability Kit(Biolegend)を使用して染色した。サンプルを、PBSで洗浄し、Fcでブロックし、次いで、PBS+1%BSAで希釈した以下の抗体カクテルで染色した:BUV395複合体化抗ヒトCD3、BV510複合体化抗ヒトCD8、BV605複合体化ヒトCD4およびFITC複合体化v5タグ(CAR検出用)、PE/Cy7複合体化抗ヒトCD62L(Biolegend)およびBV785複合体化抗ヒトCD45RO(Biolegend)。最後に、サンプルをPBSにおいて洗浄し、細胞ペレットをFACS分析の前に、123count eBeads(Thermo Fisher)(120uLのPBS+1%BSAにおける10uLの計数ビーズ)を含有する130uLのPBS+1%BSAに再懸濁させた。
図9は、増殖因子非依存性アッセイにおけるCAR-T細胞の経時的な濃縮を示す。野生型TpoR TM(TpoR(478~582)ならびにTpoR TM単一変異体(TpoR(478~582、S505N)およびTpoR(478~582、W515KN))を担持するCAR-T細胞は濃縮されなかったが、TpoR TM二重変異体および三重変異体を担持するCAR-T細胞は経時的に濃縮され、構成的サイトカイン受容体シグナル伝達を受けたCAR担持T細胞が優先的に生存したことを示す。
図10a~10bは、増殖因子非依存性アッセイにおけるCAR-T細胞の経時的な拡大倍率を示す。拡大倍率は、各時点でのCAR-T細胞の絶対数をアッセイの0日目のCAR-T細胞の数に正規化することによって決定された。図10aは、サイトカイン受容体シグナル伝達を生産的に活性化できなかったTpoR TM単一変異体が、野生型TpoR TM(TpoR(478~582))を担持するCAR-T細胞と同じ速度で減少したことを示す。対照的に、図10bは、TpoR TM二重変異体または三重変異体を担持するCAR-T細胞が、標的および外因性サイトカインの非存在下で延長された生存を有したことを示す。低IL-2条件で拡大したTpoR TM二重変異体CAR-T細胞は、標準的なIL-2条件で増殖した対応物と比較して、持続性の増加を示した。低および標準のIL-2条件で製造されたTpoR TM三重変異体CAR-T細胞は、持続性において同等の中間的な増強を示した。特に、TpoRの二重および三重変異体CAR-T細胞はより長く持続したが、最終的には減少し、構成的サイトカイン受容体シグナル伝達がCAR-T細胞の不死化または形質転換をもたらす可能性は低いことを示している。
図11は、増殖因子非依存性アッセイにおけるCAR+T細胞間のメモリーT細胞サブセットの経時的な分布を示す。野生型TpoR TM(TpoR(478~582))と比較して、構成的に活性なサイトカイン受容体を担持するCAR-T細胞(この場合、低IL-2条件で拡大したTpoR TM三重変異体である)は、長寿命の抗腫瘍免疫を媒介するサブセットである幹細胞メモリーT細胞(Tscm)の絶対数の拡大を示す。特に、TpoR TM三重変異体からの構成的シグナル伝達は、Tscm CAR-T細胞の拡大において、外因性のヒトIL-7補充よりも効果的であった。
実施例6:構成的サイトテールは、目的のシグナル伝達経路を活性化するように調整することができる
CAR-T細胞の運命と機能を調節するサイトカインの能力は、さまざまな下流のシグナル伝達経路を誘発する能力に由来する。例えば、IL-7/IL-2/IL-15を介したSTAT5の活性化は、T細胞の生存と拡大を促進するが、IL-12を介したSTAT4の活性化は、短命のエフェクターへの最終分化を促進する。より広範囲のサイトカインシグナルを模倣できる動員ドメイン(すなわち、サイトテール)を設計することは、ユーザーがプログラム可能なシグナル伝達結果に柔軟性を提供し、それによってCAR-T細胞の運命と機能の制御をもたらす。
CACCRが追加のサイトカイン受容体を介して媒介されるシグナルを伝達できるかどうかを調べるために、図3のIL7Ra(316~459)サイトテールをIL2RbまたはIL12Rb2の細胞内シグナル伝達ドメインに由来する代替サイトテールに置き換えた。次いで、HEK293T細胞レポーターアッセイを使用して、これらのキメラのシグナル伝達能力を評価した。簡単に説明すると、20,000のHEK293T細胞を、ポリ-L-リジン被覆された96ウェルの平底プレートの各ウェル中に播種し、一晩接着させた。サイトカイン受容体-CARコンストラクト(2.5ng)、ホタルルシフェラーゼ(100ng、Promega)を駆動するStat応答エレメント、およびRenillaルシフェラーゼ対照レポーターベクター(1ng、Promega)を、Opti-MEM(Gibco)中に5uLの最終体積で混合した(「DNA混合物」)。陰性対照として、全てのサイトカインシグナル伝達ドメインを欠くBFP-CARコンストラクト、または膜貫通型変異を欠くため構成的にシグナル伝達できないTpoR(478~582).IL7Ra(316~459)コンストラクトのいずれかを細胞にトランスフェクトした。5uLのOpti-MEMにおいて0.3uLのLipofectamine 2000(Invitrogen)を、室温で5分間インキュベートし、次いで、DNA混合物に添加した。混合物を室温で20分間インキュベートし、10uLの総量をHEK-293Tを含む各ウェルに添加した。トランスフェクションの48時間後、それぞれのStatレポーターの活性を、Dual-Gloルシフェラーゼアッセイシステム(Promega)を使用して評価した。Stat5レポーター活性の誘導倍率は、対照BFP-CARコンストラクトでトランスフェクトされたHEK293T細胞の誘導倍率に正規化された。
図12は、異なるシグナル伝達ドメインを担持するコンストラクトが、異なるSTAT経路を優先的に活性化することを示す。具体的には、IL2Rb(333~551)とIL7Ra(316~459)はSTAT5を活性化し、IL12Rb2(714~862)はSTAT4を活性化し、それぞれの親受容体に期待されるシグナル伝達を反映している。これは、CACCRをプログラムして、目的のシグナル伝達ドメインと融合することにより、所望のシグナル伝達経路を活性化できることを示している。さらに、図3と一致して、TpoR(478~582、S505N、W515K)二量体化ドメインを担持するCACCRは、それらのTpoR(478~582、H499L、S505N、W515K)対応物よりも強いシグナル伝達をもたらした。したがって、CACCRシグナル伝達出力の強度は、これらの二量体化ドメインのいずれかとの融合によってさらに調整することができる。
実施例7:CACCRシグナリングドメインを最適化して、ベクターカーゴサイズを縮小しながらシグナル強度を調節できる
現在、ウイルスベースの遺伝子送達法(例えば、レンチウイルスおよびレトロウイルスを介した遺伝子導入)がCAR-T細胞の製造に日常的に使用されている。カーゴサイズが大きくなると、形質導入効率とCAR-T細胞の収量が減少する。したがって、カーゴのサイズを縮小することは、製造の成功を確実にするために有益である。CACCRの動員/シグナリングドメインの最適化は、2つの理由でこの目的を達成するための手段を提供する。第1に、IL2Rb(333~551)の場合と同様に、サイトカイン受容体由来のシグナル伝達ドメインは、長さが200アミノ酸超に達し、トランスファーベクターで650塩基対を超える可能性がある。第2に、シグナル伝達ドメイン内のチロシン残基は、下流のシグナル伝達を開始および伝播するために重要であるが、それらのいくつかは、シグナル伝達の持続時間と強度を制限する負のフィードバックループに参加することもできる。したがって、サイトテールシグナル伝達ドメインをトリミングすることにより、ベクターカーゴのサイズを縮小できるだけでなく、サイトテールシグナル伝達を調節する機会も提供される。この目的のために、全長IL12Rb2(714~862)およびIL2Rb(331~551)尾部内のチロシン残基を特定し、バリアントを生成して、サイトテールシグナル伝達を媒介できる短縮型コンストラクトを同定した。
全長IL12Rb2(714~862)には、2つのリン酸化可能なチロシン残基、Y767およびY800が含まれており、これらは下流のシグナル伝達に関与し得る。Y800のみを含む短縮型IL12Rb2(775-825)尾部を生成し、HEK293T細胞レポーターアッセイを使用してSTAT4を活性化する能力を評価した。簡単に説明すると、20,000のHEK293T細胞を、ポリ-L-リジン被覆された96ウェルの平底プレートの各ウェル中に播種し、一晩接着させた。CACCR-CARコンストラクト(2.5ng)、ホタルルシフェラーゼ(100ng、Promega)を駆動するStat応答エレメント、およびRenillaルシフェラーゼ対照レポーターベクター(1ng、Promega)を、Opti-MEM(Gibco)中に5uLの最終体積で混合した(「DNA混合物」)。陰性対照として、全てのサイトカインシグナル伝達ドメインを欠くBFP CARコンストラクトを細胞にトランスフェクトした。5uLのOpti-MEMにおいて0.3uLのLipofectamine 2000(Invitrogen)を、室温で5分間インキュベートし、次いで、DNA混合物に添加した。混合物を室温で20分間インキュベートし、10uLの総量をHEK-293Tを含む各ウェルに添加した。トランスフェクションの48時間後、Stat4レポーターの活性を、Dual-Gloルシフェラーゼアッセイシステム(Promega)を使用して評価した。Stat4レポーター活性の誘導倍率は、対照BFP-CARコンストラクトでトランスフェクトされたHEK293T細胞の誘導倍率に正規化された。
図13A~Bは、全長IL12Rb2(714-862)サイトテールに匹敵するSTAT4活性化が可能な短縮型IL12Rb2(775~825)サイトテールの同定を示す。図13Aは、全長IL12Rb(714~862)尾部および短縮型IL12Rb(775~825)サイトテールの概略図を示す。各尾部に含まれるチロシン残基(Y)の位置は示されている通りである。図13Bは、より強力なTpoR(478~582、S505N、W515K)二量体化ドメインに融合すると、短縮型IL12Rb2(775~825)サイトテールが全長IL12Rb2(714~862)サイトテールのSTAT4シグナル伝達強度を完全に再現したことを示す。より弱いTpoR(478~582、H499L、S505N、W515K)二量体化ドメインに融合すると、短縮型IL12Rb2(775~825)サイトテールは、全長IL12Rb2(714~862)サイトテールのSTAT4シグナル伝達強度を部分的に再現した。
全長IL2Rb(333~551)サイトテールには、下流のシグナル伝達に関与し得る6つのチロシン残基が含まれている。これらのうち、Y364(受容体の膜貫通ドメインに最も近いチロシン残基)は、PI3Kを活性化してT細胞の分化と増殖を促進し、細胞骨格の再編成を促進して受容体の内在化を誘導することが報告されている。したがって、Y364はT細胞エフェクター機能を促進することが可能であり、IL2Rbシグナル伝達の強度と持続時間を制限することも可能である。6つのチロシン残基から3つ(Y364、Y418、およびY436)、または6つのチロシン残基から2つ(Y418およびY436)を含む短縮型IL2Rbサイトテールを生成し、HEK293T細胞レポーターアッセイを使用してSTAT5を活性化する能力を評価した。簡単に説明すると、20,000のHEK293T細胞を、ポリ-L-リジン被覆された96ウェルの平底プレートの各ウェル中に播種し、一晩接着させた。CACCR-CARコンストラクト(2.5ng)、ホタルルシフェラーゼ(100ng、Promega)を駆動するStat応答エレメント、およびRenillaルシフェラーゼ対照レポーターベクター(1ng、Promega)を、Opti-MEM(Gibco)中に5uLの最終体積で混合した(「DNA混合物」)。陰性対照として、全てのサイトカインシグナル伝達ドメインを欠くBFP CARコンストラクトを細胞にトランスフェクトした。5uLのOpti-MEMにおいて0.3uLのLipofectamine 2000(Invitrogen)を、室温で5分間インキュベートし、次いで、DNA混合物に添加した。混合物を室温で20分間インキュベートし、10uLの総量をHEK-293Tを含む各ウェルに添加した。トランスフェクションの48時間後、Stat5レポーターの活性を、Dual-Gloルシフェラーゼアッセイシステム(Promega)を使用して評価した。Stat5レポーター活性の誘導倍率は、対照BFP-CARコンストラクトでトランスフェクトされたHEK293T細胞の誘導倍率に正規化された。
図14A~Bは、全長IL2Rb(333~551)尾部と比較して同等またはそれ以上のSTAT5活性化が可能な短縮型IL2Rb尾部の同定を示す。図14Aは、全長IL2Rb(333~551)尾部および2つの短縮型IL2Rb尾部の概略図を示す。各尾部に含まれるチロシン残基(Y)の位置は示されている通りである。点線は、短縮型尾部から削除された全長IL2Rb(333~551)尾部の相互結合領域を表す。図14Bは、HEK293T細胞レポーターアッセイの結果を示し、ここでは、全長IL2Rb(333~551)のSTAT5シグナル伝達が、Y364、Y418、およびY536を含むTpoR(478~582、H499L、S505N、W515K)IL2Rb(339~379、393~433、518~551)サイトテールによって完全に再現される。TpoR(478~582、S505N、W515K).IL2Rb(393~433、518~551)サイトテールでは、受容体の内部移行を仲介するY364をさらに除去すると、STAT5のシグナル伝達強度が劇的に向上した。
HEK293T細胞アッセイは、サイトテールトランスフェクションから48時間以内に読み取り値が測定される短期アッセイである。それはサイトテール活性の効率的なスクリーニングプラットフォームを提供するが、このアッセイの限られた期間は、長期の構成的サイトカインおよびサイトテールシグナル伝達に続いて引き起こされる負のフィードバックループの複雑さを反映していない。減少型IL2Rb尾部バリアントの長期シグナル伝達活性をより正確に評価するために、2週間の生産プロセスを使用してCACCR CAR-T細胞を生成し、細胞内フローサイトメトリーによってSTAT5の活性化を評価した。この目的のために、CACCR CAR-T細胞を、5%CO2で37℃で加湿インキュベーター中で4時間、100uLの無血清RPMI(Corning)で血清飢餓した。陽性対照として、外因性組換えヒトIL-2(10ng/mL;Miltenyi)を4時間の血清飢餓の最後の30分間に添加した。4時間後、BUV395コンジュゲート抗ヒトCD3(Biolegend)およびFITCコンジュゲートv5タグモノクローナル抗体(Thermo Fisher)を含む抗体カクテルを、細胞に添加し、最後の20分間インキュベートした。次いで、各100uLサンプルに35uLの16%パラホルムアルデヒドを添加し、37℃で15分間インキュベートして細胞を固定した。次いで、細胞を、PBSで3回洗浄し、-20%で1または2晩100%冷メタノールで透過処理した。FACS分析の日に、細胞を、PBSで3回洗浄し、Fcでブロッキングし、PBS+1%BSAにおいて希釈されたAlexaFluor647複合体化抗マウス/ヒトStat5(pY694)(BD Biosciences)で染色した。暗所における室温での1時間のインキュベーション後、細胞を、FACS分析前に3回洗浄した。
図15は、全長または短縮型IL2Rbサイトテールを担持する初代CACCR CAR-T細胞におけるSTAT5活性化を示す。最大のSTAT5活性化は、Y364内在化モチーフを欠いた短縮型IL2Rb(393~433、518~551)サイトテールを担持するCACCR CAR-T細胞によって誘発された。中間のSTAT5活性化は、短縮型IL2Rb(339~379、393~433、518~551)サイトテールを担持するCACCR CAR-T細胞で観察された。同じ培養内のCAR陰性集団ではSTAT5の活性化は観察されず、サイトテールシグナル伝達のCAR-T細胞特異的性質を示している。特に、全長IL2Rb(333~551)サイトテールを担持するCACCR CAR-T細胞では、STAT5活性はほとんどまたはまったく検出されなかった。これは、全長IL2Rb(333~551)サイトテールに存在する他の3つのチロシン残基が原因である可能性があり、長期的な負の調節を誘発する可能性がある。したがって、そのような負の調節モチーフを排除するためのサイトテールシグナル伝達ドメインの最適化は、構成的かつ生産的なシグナル伝達が長期的に維持されることを確実にするために有益である。強いサイトテールは強い負のフィードバック応答を誘発する可能性があるため、長期的な刺激には弱いサイトテールが好ましくあり得る。
実施例7:最適化されたIL2Rb由来のサイトテールは、IL-2ではなくIL-15のシグナル伝達をより厳密に模倣する
IL-2とIL-15は、共通ガンマ鎖とIL2Rbで構成されるヘテロ二量体サイトカイン受容体を介して天然でシグナルを伝達する2つのサイトカインである。同じ天然の受容体を共有しているにもかかわらず、IL-2とIL-15はT細胞の分化と持続性に異なる影響を及ぼす。IL-2は短命のエフェクター分化を誘導するが、IL-15は長命のメモリーT細胞の生成を促進する。さらに、IL-15の血清濃度の上昇は、CAR-T細胞療法に対する患者の応答と正の相関があることが示されている。したがって、IL-2ではなくIL-15のシグナル伝達と効果を模倣するサイトテールが好ましい。本発明者らは、減少型IL2RbサイトテールがIL-2またはIL-15シグナル伝達をより厳密に模倣しているかどうかを判断しようとした。
この目的のために、本発明者らは、リツキシマブミモトープ、4-1BBおよびCD3zシグナル伝達ドメインに結合された、BCMAに向けられたP5A2 scFvを担持する例示的なCARを含むCAR-T細胞を利用した(参照により本明細書に組み込まれるUS10,294,304を参照されたい)。短縮型IL2Rb尾部を共発現するBCMA特異的CAR-T細胞が生成され、それらの遺伝子発現プロファイルは、外因性組換えヒトIL-2またはIL-15に曝露された対照CAR-T細胞と比較された。CACCRおよびCARをコードするレンチウイルスを作製するために、HEK293T細胞を、トランスフェクションの前日に、6ウェルプレートのウェルあたり10%FBS(Hyclone)を補充した2mLのDMEM(Gibco)中にmLあたり45万細胞で播種した。トランスフェクションの日に、レンチウイルスを、6ウェルプレートのウェルあたり250uLのOpti-MEM(Gibco)においてレンチウイルスパッケージングベクター1.5ugのpsPAX2、0.5ugのpMD2G、0.5ugの適切なCARベクターを一緒に混合することによって調製した(「DNA混合物」)。250uLのOpti-MEMにおいて10uLのLipofectamine 2000(Invitrogen)を、室温で5分間インキュベートし、次いで、DNA混合物に添加した。混合物を室温で20分間インキュベートし、500uLの総量をHEK293Tを含むウェルの側面にゆっくりと添加した。トランスフェクションの1日後に、6ウェルプレートにおけるHEK293T細胞の各ウェルからの培地を、ウェルあたり2mLのT細胞形質導入培地、すなわち、10%FBSを補充したX-Vivo-15で置き換えた。トランスフェクションの2日後、HEK293T細胞からレンチウイルス上清を回収し、0.45ミクロンフィルター(EMD Millipore)に通して細胞残屑を除去し、粗レンチウイルス上清をT細胞形質導入に直接使用した。0日目に、精製されたT細胞を、100IU/mLのヒトIL-2(Miltenyi Biotec)で補充されたX-vivo-15培地(Lonza)において、Grex-24プレート(Wilson Wolf、カタログ番号80192M)を補充したX-Vivo-15培地(Lonza)において、10%FBS(Hyclone)、およびヒトT TransAct(Miltenyi Biotec、カタログ番号130-111-160、1:100希釈)で活性化した。2日目に、T細胞をT細胞形質導入培地に50万細胞/mLで再懸濁し、Grex-24プレートに100IU/mLのヒトIL-2とともに等量の粗レンチウイルス上清で形質導入した。5日目に、使用済み培地をT細胞拡大培地、すなわち5%ヒトAB血清(Gemini Bio)と100IU/mLヒトIL-2を補充したX-Vivo-15に置き換えることにより、サイトテール発現CAR-T細胞を培養した。このとき、サイトテールを欠く対照CAR-T細胞は、100U/mLヒトIL-2のみ、または100U/mLヒトIL-2と10ng/mLヒトIL-15(Miltenyi Biotec)のいずれかで拡大した。細胞を、T細胞拡大培地とそれぞれの濃度の組換えサイトカインを使用して、必要に応じてより大きなG-Rex容器(Wilson Wolf)中で拡大した。13日目に、細胞をZombie NIR Fixable Viability Kit(Biolegend)で染色し、BUV395コンジュゲートCD3抗体(Biolegend)およびP5A2 scFvに特異的な抗イディオタイプ抗体で標識し、次いで、FACSで選別してCAR+T細胞を濃縮した。次いで、選別されたCAR+T細胞をGrex-24プレートでT細胞拡大培地でさらに2日間培養し、CACCR CAR+T細胞を外因性サイトカインの非存在下に残し、選別された対照CAR+T細胞を、外因性の非存在下サイトカイン、100U/mLヒトIL-2で処理、または10ng/mLヒトIL-15で処理のいずれかに残した。15日目に、Easy Sep Dead Cell Removal Kit(StemCell Technologies)を使用して生きているCAR+T細胞を濃縮し、その後のRNA抽出とNanoString遺伝子発現分析(Human CAR-T Panel;NanoString Technologies)のために細胞ペレットを急速凍結した。
データは、短縮型IL2Rb尾部を担持するCACCR CAR-T細胞が、IL-2ではなくIL-15のシグナル伝達をより厳密に模倣することを示す。例として、サイトテールTpoR(478~582、S505N、W515K).IL2Rb(393~433、518~551)、およびTpoR(478~582、H499L、S505N、W515K)を試験した。IL2Rb(339~379、393~433、518~551).図16Aは、サンプル調製のための実験計画およびワークフローの概略図である。図16Bは、13~15日目からIL-2で処理された対照CAR-T細胞の遺伝子発現プロファイルと比較した、CACCR CAR-T細胞の遺伝子発現プロファイルを示す。図16Cは、13~15日目からIL-15で処理された対照CAR-T細胞の遺伝子発現プロファイルと比較した、CACCR CAR-T細胞の遺伝子発現プロファイルを示す。各サンプルのLog2変化倍率(FC)は、13~15日目からの未処理のままにされた対照CAR-T細胞に対する正規化によって計算された。線形回帰分析によって決定されるR2値と最良適合線(実線)は、各グラフに示される。示されているデータは、2人のドナーの代表的なものである。CACCR CAR-T細胞の遺伝子発現プロファイルはIL-2処理サンプルとの相関を示さなかったが(図16B)、IL-15処理サンプルとは正の相関を示した(図16C)。これらは、短縮型IL2Rb尾部を担持するサイトテールが、IL-2ではなくIL-15の下流のシグナル伝達および転写応答をより厳密に模倣していることを示唆する。
実施例9:構成的サイトテールはコンビナトリアルシグナル伝達出力用にプログラムできる
図12に示されるように、様々なサイトカイン受容体に由来するシグナル伝達ドメインを担持するCACCRは、親受容体を連想させるシグナル伝達を活性化することができる。サイトテールは、1つを超えるサイトテールをタンデムで融合することにより、複数の親受容体からの同時シグナル伝達を模倣するように設計でき、コンビナトリアルシグナル伝達の結果を達成できると仮定した。タンデムサイトテールからのコンビナトリアルシグナル伝達出力を試験するために、IL7Ra(316~459)サイトテールを短縮型IL12Rb2(775~825)サイトテールと融合することにより、構成的7.12tailを生成し、HEK293T細胞レポーターアッセイを使用してシグナル伝達を評価した。
図17A~Dは、7.12tailによって例示されるような、構成的タンデムサイトテールの設計およびシグナル伝達能力を示す。図17Aは、構成的7.12tailの概略図を示す。図17Bは、7.12tailバリアントおよびCARを共発現するために使用される、それらのTpoR(478~582)二量体化/JAK結合ドメインのみが異なるレンチウイルスベクターの概略図を示す。図17C~Dは、それぞれ、示されたサイトテールに融合された、TpoR(478~582;S505N;W515K)およびTpoR(478~582;H499L;S505NW515K)二量体化/JAK結合ドメインをそれぞれ担持するコンストラクトのSTATレポーター活性を示す。IL7Ra(316~459)サイトテールはSTAT5を強力に活性化したが、IL12Rb2(775~825)サイトテールはSTAT4を強力に活性化した。しかしながら、IL7Ra(316~459)で観察されたように、両方のサイトテールをタンデムで融合させたIL12Rb2(775~825)サイトテールは、STAT5とSTAT4の両方を同時にコンビナトリアルに活性化した。これは、通常2つ以上の異なる負のサイトカイン受容体を必要とする複数のシグナル伝達経路が単一のサイトテールで達成できることを示す。
実施例10:構成的サイトテールは、CAR-T細胞の表現型と機能を指示するために単一または複数の出力で調整することができる
次に、異なるシグナル伝達出力を担持する構成的サイトテールが、初代ヒトCAR-T細胞の表現型と機能に異なる影響を及ぼし得るかあるかどうかを判断した。T細胞の生存とメモリーの維持を促進するIL-7とは異なり、IL12はT細胞の分化を促進する炎症性サイトカインである。したがって、IL7RaまたはIL12Rb由来のサイトテールを介したシグナル伝達がこれらの異なる表現型を差次的に指示できるかどうかを調べ、両方の尾部をタンデムで融合することの正味のコンビナトリアル効果を評価しようとした。
この目的のために、7tail(すなわちIL7Ra(316~459))または12tailのバリアント(すなわちIL12Rb2(775~825)もしくはIL12Rb2(714~862))のいずれかを共発現するヒト初代CAR-T細胞を生成した。図13Aを参照されたい。CACCRおよびCARをコードするレンチウイルスを作製するために、HEK293T細胞を、トランスフェクションの前日に、6ウェルプレートのウェルあたり10%FBS(Hyclone)を補充した2mLのDMEM(Gibco)中にmLあたり45万細胞で播種した。トランスフェクションの日に、レンチウイルスを、6ウェルプレートのウェルあたり250uLのOpti-MEM(Gibco)においてレンチウイルスパッケージングベクター1.5ugのpsPAX2、0.5ugのpMD2G、0.5ugの適切なCARベクターを一緒に混合することによって調製した(「DNA混合物」)。250uLのOpti-MEMにおいて10uLのLipofectamine 2000(Invitrogen)を、室温で5分間インキュベートし、次いで、DNA混合物に添加した。混合物を室温で20分間インキュベートし、500uLの総量をHEK293Tを含むウェルの側面にゆっくりと添加した。トランスフェクションの1日後に、6ウェルプレートにおけるHEK293T細胞の各ウェルからの培地を、ウェルあたり2mLのT細胞形質導入培地、すなわち、10%FBSを補充したX-Vivo-15で置き換えた。トランスフェクションの2日後、HEK293T細胞からレンチウイルス上清を回収し、0.45ミクロンフィルター(EMD Millipore)に通して細胞残屑を除去し、粗レンチウイルス上清をT細胞形質導入に直接使用した。0日目に、精製されたT細胞を、100IU/mLのヒトIL-2(Miltenyi Biotec)で補充されたX-vivo-15培地(Lonza)において、Grex-24プレート(Wilson Wolf、カタログ番号80192M)を補充したX-Vivo-15培地(Lonza)において、10%FBS(Hyclone)、およびヒトT TransAct(Miltenyi Biotec、カタログ番号130-111-160、1:100希釈)で活性化した。2日目に、T細胞をT細胞形質導入培地に50万細胞/mLで再懸濁し、Grex-24プレートに100IU/mLのヒトIL-2とともに等量の粗レンチウイルス上清で形質導入した。5日目に、使用済み培地をT細胞拡大培地、すなわち5%ヒトAB血清(Gemini Bio)と100IU/mLヒトIL-2を補充したX-Vivo-15に置き換えることにより、細胞を培養した。細胞を、T細胞拡大培地とそれぞれの濃度のヒトIL-2を使用して、必要に応じてより大きなG-Rex容器(Wilson Wolf)中で拡大した。14日目に、CAR-T細胞産物のメモリー表現型解析は、フローサイトメトリーによって、PE/Cy7コンジュゲートCD62L抗体(Biolegend)およびBV785コンジュゲートCD45RO抗体(Biolegend)との共染色とともに、FITCコンジュゲートv5タグモノクローナル抗体(Thermo Fisher)を使用してCAR形質導入細胞を検出することによって実施された。CACCRシグナル伝達を欠いた陰性対照として、BFPまたは7tailに結合した野生型TpoR(478~582)膜貫通ドメインを共発現するCAR-T細胞を並行して生成した。
図18は、CAR-T細胞産物のメモリー分化に対するサイトテールの影響を示す。2人の健康なドナーから生成された14日目のCACCR CAR-T細胞産物のメモリー表現型が示されている。IL7Ra(316~459)サイトテールを共発現するCAR-T細胞は幹細胞メモリー(Tscm)集団を保持したが、IL12Rb2由来のサイトテールを担持するCAR-T細胞は、中央メモリー(Tcm)集団の増加を伴うTscm集団の顕著な減少を示した。これらは、CARの関与がない場合、IL12Rb2由来のサイトテールを介した構成的IL12様シグナル伝達が、TscmからTcmへの進行性の分化を促進することを示唆した。さらに、タンデムIL7Ra(316~459)を共発現するCAR-T細胞。IL12Rb2(775~825)サイトテールは、Tscm集団の回復を示し、単一のIL7Ra(316~459)サイトテールを担持するCAR-T細胞の表現型を模倣した。これは、単一のサイトテールの負の影響が、タンデムサイトテールのコンビナトリアルシグナル伝達によって軽減できることを示している。
さらに、CACCRシグナル伝達が、生存および細胞傷害性を含む、CAR-T細胞の機能的結果を導くことができるかどうかを調査した。長期のT細胞生存を促進するIL-7シグナル伝達と比較して、IL-12シグナル伝達は代わりに短命の最終分化エフェクターへの分化を促進する。これをサポートするために、長期生存が可能であり、長期のCAR-T細胞の持続性を媒介すると考えられているTscm集団は、IL12Rb2由来の尾部を担持するCAR-T細胞ではほとんどなかった。異なるサイトテールを介したシグナル伝達がCAR-T細胞の生存と分化をプログラムできるかどうかを調べるために、CACCRを共発現するCAR-T細胞を標的細胞または外因的に補充されたサイトカインの非存在下で培養する増殖因子非依存性アッセイを実施した。これらの条件下で、CAR-T細胞数とメモリー分化を経時的にモニターした。
簡潔に述べると、凍結保存されたCAR-T細胞を解凍して数え、全てのサンプルにわたるCAR-T細胞のパーセンテージは、非形質導入(NTD)T細胞の添加により、最も低い形質導入効率のサンプルに対して正規化された。対照として、サイトテールの代わりにBFPを共発現するCAR-T細胞(BFP CAR)を使用した。10%FBS(Hyclone社)、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、および20~25mMのHEPES conを含む1.5mLのRPMI中に0.25×106のCAR+T細胞/mLを、24ウェル組織培養プレートに播種した。示された日に、各条件から100uLの複製サンプルを採取し、Zombie NIR Fixable Viability Kit(Biolegend)を使用して染色した。サンプルを、PBSで洗浄し、Fcでブロックし、次いで、PBS+1%BSAで希釈した以下の抗体カクテルで染色した:BUV395複合体化抗ヒトCD3、BV510複合体化抗ヒトCD8、BV605複合体化ヒトCD4およびFITC複合体化v5タグ(CAR検出用)、PE/Cy7複合体化抗ヒトCD62L(Biolegend)およびBV785複合体化抗ヒトCD45RO(Biolegend)。最後に、サンプルをPBSにおいて洗浄し、細胞ペレットをFACS分析の前に、123count eBeads(Thermo Fisher)(120uLのPBS+1%BSAにおける10uLの計数ビーズ)を含有する130uLのPBS+1%BSAに再懸濁させた。
図19A~Bは、2人のドナー由来の細胞の代表的なデータを示す。図19Aおよび図19Bは、それぞれ、示されたサイトテールに融合されたTpoR(478~582、S505N、W515K)およびTpoR(478~582、H499L、S505N、W515K)二量体化/JAK結合ドメインを担持するコンストラクトについて、アッセイの開始時(0日目)の入力と比較した、CAR-T細胞の拡大倍率を示す。対照BFP CAR-T細胞と比較して、IL7Ra(316~459)サイトテールを担持するCAR-T細胞はより遅い速度で減少し、IL7Ra(316~459)サイトテールを介した構成的シグナル伝達がCAR-T細胞の生存を改善したことを示している。対照的に、IL12Rb2由来のサイトテールを担持するCAR-T細胞は、BFP CAR-T細胞により匹敵する速度で減少し、延命効果を欠くことを示唆している。特に、タンデムIL7Ra(316~459)を担持するCAR-T細胞。IL12Rb2(775~825)サイトテールは、IL7Ra(316~459)サイトテールにより匹敵する延命効果をもたらした。図19C~Dは、それぞれ、示されたサイトテールに融合された、TpoR(478~582、S505N、W515K)およびTpoR(478~582、H499L、S505N、W515K)二量体化/JAK結合ドメインを担持するコンストラクトの増殖因子非依存性アッセイの7日目のCAR-T細胞分化を示す。対照BFP CAR-T細胞およびIL12Rb2由来サイトテールを担持するCAR-T細胞と比較して、IL7Ra(316~459)サイトテールを担持するCAR-T細胞は、より豊富であるだけでなく、Tscm集団においてより豊富であった。図19C~Dを参照されたい。タンデムIL7Ra(316~459)IL12Rb2(775~825)サイトテールを担持するCAR-T細胞は、Tscm濃縮を改善した。特定のメカニズムに限定されることなく、結果は、IL7Ra(316~459)サイトテールとの融合が単一のIL12Rb2(775~825)サイトテールの表現型を無効にしたことを示唆している。まとめると、これらのデータは、タンデムサイトテールシグナル伝達のコンビナトリアル機能効果を繰り返し、異なるサイトテールコンストラクトの調整可能性を示している。
Tscm集団が豊富なCAR-T細胞産物は、拡大、持続性、および活性の改善に関連している。しかしながら、最終分化したCAR-T細胞は短命であり、増殖の可能性が限られているため、有効性が低下する。これらの特性がIL7Ra(316~459)およびIL12Rb2由来のサイトテールによって異なった影響を受けたことを考慮し、CAR-T細胞の細胞傷害性に影響を及ぼすこれらのサイトテールの能力を評価した。
この目的のために、5,000のU87KO-EGFRvIII-nucGFP標的細胞を、播種し、10%FBS(Hyclone)、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、および20~25mMのHEPESを含有する50uLのRPMIにおいて黒色の壁および平坦で透明な底を有する96ウェルプレートにおいて付着することを可能にした。IL7Ra(316~459)またはIL12Rb由来のサイトテールを担持するEGFRvIII CAR(2173 scFv)T細胞を解凍し、1:3のE:T比で播種された標的細胞に添加した。標的細胞はCAR-T細胞よりも多いため、標的細胞の増殖を制御するには、CAR-T細胞を繰り返しまたは連続して殺傷する必要がある。対照として、サイトテールの代わりにBFP CARを共発現するCAR-T細胞を使用した。経時的な生きている標的細胞の数は、IncuCyte生細胞解析イメージングシステムを介してモニターされた。
図20A~20Bは、様々なCACCRを共発現するCAR-T細胞の細胞傷害活性を示す。図20A~Bは、それぞれ、示されたサイトテールに融合された、TpoR(478~582、S505N、W515K)およびTpoR(478~582、H499L、S505N、W515K)二量体化/JAK結合ドメインを担持するCACCR CAR-T細胞による標的細胞クリアランスを示す。BFP CAR-T細胞と比較して、IL12Rb2由来のサイトテールを担持するCAR-T細胞は、おそらく増殖能が限られており寿命が短いため、インビトロでの連続殺傷活性にいくらかの活性が見られるか、またはまったく改善が見られなかった。対照的に、IL7Ra(316~459)サイトテールを担持するCAR-T細胞は、おそらく増殖と持続性の強化により、改善された連続殺傷活性を示した。特に、タンデムIL7Ra(316~459).IL12Rb2(775~825)サイトテールを担持するCAR-T細胞は、IL7Ra(316~459)サイトテールと同等またはそれ以上の連続殺傷活性を示し、単一のサイトテール内の持続性促進のIL7Ra(316~459)シグナル伝達ドメインとエフェクター促進のIL12Rb2(775~825)シグナル伝達ドメインの組み合わせは、CAR-T細胞の寿命、拡大、および即時エフェクター機能を同時に増強できることを示唆する。
実施例11:構成的サイトカイン受容体は、液性腫瘍標的に向けられたCARのインビトロ細胞傷害性を増強する
我々は、CACCRが、膠芽腫などの固形腫瘍の標的であるEGFRvIIIに向けられたCARの活性を増強できることを実証した。CACCRが血液腫瘍標的の異なるscFv全体に広く適用可能かどうかを判断するために、血液悪性腫瘍のマーカー(すなわち、BCMA)に向けられたCARコンストラクトにCACCRをさらにクローン化し、BCMA陽性標的細胞株に対する長期細胞傷害性を評価した。
ホタルルシフェラーゼとGFPレポーターを安定して発現する標的細胞は、レンチウイルス形質導入によって生成された。10,000個のLuc-GFP標識標的細胞を、白色の平底96ウェル組織培養プレートにウェルあたり100uLで播種した。凍結保存されたCAR-T細胞を解凍して数え、全てのサンプルにわたるCAR-T細胞のパーセンテージは、非形質導入(NTD)T細胞の添加により、最も低い形質導入効率のサンプルに対して正規化された。次いで、100uLの容量のCAR-T細胞を、示されたエフェクター:ターゲット(E:T)比で3重で標的細胞の各ウェルに添加した。「標的のみ」の陰性対照として、T細胞の代わりに100μLの培地を標的細胞に添加した。2~3日後、ウェルを穏やかにピペッティングして混合し、100uLの各T細胞含有ウェルを10,000個の新たにプレーティングした100μLのLuc-GFP標識標的細胞を含む新しい白色の平底96ウェル組織培養プレートに移した。「標的のみ」のウェルは、T細胞の代わりに新鮮な培地を入れた。新しいプレートを37℃でインキュベートし、古い96ウェルプレートに残っている生きている標的細胞の数を、ONE-Gloルシフェラーゼアッセイシステム(Promega)を製造者の使用説明書に従って使用して決定した。生きている標的細胞のパーセンテージは、ルシフェラーゼシグナルを「標的のみ」のウェルのシグナルに正規化することによって計算され、細胞傷害性のパーセンテージは、100%-生きている標的細胞%として計算された。全ての細胞傷害活性が停止するまで、2日または3日ごとに新鮮な標的細胞への連続転送とルシフェラーゼの読み出しを行った。
図21は、CACCRが、液性腫瘍標的であるBCMAに向けられたCAR-T細胞の細胞傷害活性を改善したことを示す。図21は、E:T=10:1でのMM1.S多発性骨髄腫細胞株に対するBCMA CAR(P5A2 scFv)の細胞傷害性を示しており、CACCRの共発現がCAR-T細胞の長期細胞傷害性を増加させたことを示している。
実施例12:CACCRはCAR-T細胞のインビボ活性を増強する
CD19およびBCMAを標的とするようなCAR-T細胞療法は、血液悪性腫瘍の治療において前例のない臨床的成功を収めている。高率の完全奏効が達成されているが、ほとんどの患者が最終的に再発するため、これは一時的なものである。さらに、CAR-T細胞は固形腫瘍の治療においてより限定的な成功を収めている。再発と応答の欠如の理由の中には、不十分なCAR-T細胞の拡大と持続性、ならびに免疫抑制微小環境によるCAR-T細胞の機能的阻害が含まれる。CACCR CAR-T細胞のインビトロ特性評価により、標的駆動型の増殖、持続性、効力、および疲弊プロファイルの改善が明らかになったため、次に、これらの機能強化がインビボでの抗腫瘍活性の改善につながるかどうかを調べた。
血液悪性腫瘍との関連でCACCR CAR-T細胞のインビボ活性を調べるために、多発性骨髄腫の同所性異種移植モデルにおいて、4-1BBおよびCD3ζシグナル伝達ドメインに結合したBCMA特異的P5A2 scFvを担持するCAR-T細胞を利用した。T細胞受容体(TCR)欠損BCMA CAR-T細胞は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)を介したノックアウトによって生成され、TCR駆動型の異種反応性による潜在的な混乱を回避した。8~10週齢のメスのNSGマウスを前5×106のMM1.S-Luc-GFPの静脈内接種の前日に1Gyで照射した。腫瘍移植の14日後、マウスを、腫瘍量に基づいて無作為化し、そして指示されたCAR-T細胞の1×106個、または3×106個のいずれかを静脈内投与した(1群当たりn=10)。腫瘍の進行は生物発光イメージングによってモニターされた。T細胞投与の30日後に、3×106個のCAR-T細胞を投与されたマウスは、末梢におけるBCMA CAR-T細胞の数え上げのために採血された。具体的には、各マウスからの50uLの全血を、ACK Lysing Buffer(Gibco)を使用して赤血球溶解にかけ、Fcでブロックし、PBS+1%BSAで希釈した次の抗体カクテルで染色した:FITCコンジュゲート抗マウスCD45(Biolegend)、BV421コンジュゲート抗ヒトCD45(Biolegend)、およびP5A2 scFvに特異的な抗イディオタイプ抗体。最後に、サンプルをPBSにおいて洗浄し、細胞ペレットをFACS分析の前に、123count eBeads(Thermo Fisher)(120uLのPBS+1%BSAにおける10uLの計数ビーズ)を含有する130uLのPBS+1%BSAに再懸濁させた。
図22A~Cは、CACCRが同所性多発性骨髄腫に対するインビボ抗腫瘍活性およびBCMA CAR-T細胞の持続性を改善したことを示す。図24A~Bは、それぞれ、示されたCAR-T細胞の1×106個または3×106個のいずれかでの処置に応答した腫瘍の進行を示す。対照のBCMA CAR-T細胞は最初の腫瘍退縮を仲介することができたが、細胞注入の22日後に腫瘍が再発したため、この反応は短命であった。しかしながら、CACCRを共発現するCAR-T細胞は、腫瘍の再発を大幅に遅らせ、応答の持続性を改善した。図24A~Bの統計は、図22Aの6~34日目と図22Bの6~44日目からのテューキーの多重比較による反復測定一元配置分散分析に基づく**p<0.01および***p<0.001を表す。図22Cは、T細胞注入の30日後に3×106個のCAR-T細胞で処置されたマウスの末梢血に存在するBCMA CAR-T細胞の数を示す。対照BCMA CAR-T細胞で処置されたマウスで観察された腫瘍再発と一致して、対照BCMA CAR-T細胞はもはや末梢で検出できなかった。対照的に、腫瘍再発の予防に優れたCACCR BCMA CAR-T細胞は、インビボでもより有意に豊富であった。図24Cの統計は、テューキーの多重比較による通常の一元配置分散分析に基づいて、*p<0.05および****p<0.0001を表す。これらは、改善されたCACCR CAR-T細胞の持続性が、部分的に、強化された長期腫瘍制御を媒介し、応答の持続性を延長したことを示唆している。
さらに、膠芽腫などのCAR-T細胞療法に抵抗することが知られている固形腫瘍との関連で、CAR-T細胞活性に対するCACCRへの影響を評価した。この目的のために、4-1BBおよびCD3ζシグナル伝達ドメインに結合した2173 scFvを担持するEGFRvIII特異的CAR、およびEGFRvIIIを安定して過剰発現するLN229ヒト神経膠芽腫細胞株(LN229-EGFRvIII)を利用した。8~10週齢のメスNSGマウスに3×106個のLN229-EGFRvIIIを皮下移植した。腫瘍が確立した25日後、マウスを、腫瘍量に基づいて無作為化し、そして指示されたCAR-T細胞の1.5×106個、または3×106個のいずれかを静脈内投与した(1群当たりn=8~10)。腫瘍の進行は、キャリパー測定によって週に2回モニターされた。
図23は、CACCRが確立された固形腫瘍に対するCAR-T細胞の抗腫瘍活性を改善したことを示す。コントロールEGFRvIII CAR-T細胞による治療は、LN229-EGFRvIII腫瘍の増殖を遅らせることができましたが、腫瘍が最終的に進行するにつれて、反応は一過性で最適ではなかった。対照的に、CACCR CAR-T細胞による処置は、完全な腫瘍退縮をもたらした。特に、1.5×106個のCACCR CAR-T細胞の低用量でさえ腫瘍除去に十分であった。統計は、3~38日のテューキーの多重比較による反復測定一元配置分散分析に基づく3×106個の対照CAR-T細胞による処置と比較して、**p<0.01を表す。これらの結果は、CAR-T細胞のシグナル伝達ドメインと非冗長的に相乗作用して改善された活性を与えるCACCRの能力を繰り返す。

Claims (57)

  1. 2つのモノマーで構成される構成的に活性なキメラサイトカイン受容体(CACCR)であって、各モノマーが、
    a.膜貫通ドメインと、
    b.ヤヌスキナーゼ(JAK)結合ドメインと、
    c.動員ドメインと、を含み、
    前記モノマーが構成的に二量体化されている、構成的に活性なキメラサイトカイン受容体(CACCR)。
  2. 前記JAK結合ドメインが、JAK1結合ドメインを含む、請求項1に記載のCACCR。
  3. 前記JAK結合ドメインが、JAK2結合ドメインを含む、請求項1に記載のCACCR。
  4. 前記JAK結合ドメインが、JAK3結合ドメインを含む、請求項1に記載のCACCR。
  5. 前記JAK結合ドメインが、TYK2結合ドメインを含む、請求項1に記載のCACCR。
  6. 前記JAK結合ドメインが、表1bに示されている膜貫通アミノ酸配列のうちの1つを含む、請求項1~5のいずれか1項に記載のCACCR。
  7. 前記動員ドメインが、少なくとも1つの受容体由来の、STAT-1、STAT-2、STAT-3、STAT-4、STAT-5、STAT-6、またはSTAT-7の動員ドメインから選択されるSTAT動員ドメインを含む、請求項1~6のいずれか1項に記載のCACCR。
  8. 前記膜貫通ドメインおよび/または前記JAK結合ドメインが、EpoR、GP130、PrlR、GHR、GCSFR、またはTPOR/MPLR受容体に由来する、請求項1~7のいずれか1項に記載のCACCR。
  9. 前記膜貫通ドメインおよび/または前記JAK結合ドメインが、前記TPOR/MPLR受容体に由来する、請求項1~7のいずれか1項に記載のCACCR。
  10. 前記膜貫通ドメインおよび/または前記JAK結合ドメインが、前記TPOR/MPLR受容体に由来し、前記TPOR/MPLR受容体が、配列番号6の天然に存在するTPOR/MPLR受容体のアミノ酸478~582を含む、請求項9に記載のCACCR。
  11. 前記TPOR/MPLR受容体が、配列番号6のH499、S505、W515、およびG509において1つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項10に記載のCACCR。
  12. 前記TPOR/MPLR受容体が、H499L、S505N、W515K、およびG509Nから選択されるアミノ酸置換のうちの1つ以上を含む、請求項11に記載のCACCR。
  13. 前記TPOR/MPLR受容体がアミノ酸置換H499Lを含む、請求項11に記載のCACCR。
  14. 前記TPOR/MPLR受容体がアミノ酸置換S505Nを含む、請求項11に記載のCACCR。
  15. 前記TPOR/MPLR受容体がアミノ酸置換W515Kを含む、請求項11に記載のCACCR。
  16. 前記TPOR/MPLR受容体がアミノ酸置換G509Nを含む、請求項11に記載のCACCR。
  17. 前記TPOR/MPLR受容体がアミノ酸置換H499LおよびS505Nを含む、請求項11に記載のCACCR。
  18. 前記TPOR/MPLR受容体がアミノ酸置換H499LおよびW515Kを含む、請求項11に記載のCACCR。
  19. 前記TPOR/MPLR受容体がアミノ酸置換S505NおよびW515Kを含む、請求項11に記載のCACCR。
  20. 前記TPOR/MPLR受容体がアミノ酸置換H499LおよびG509Nを含む、請求項11に記載のCACCR。
  21. 前記TPOR/MPLR受容体がアミノ酸置換H499LおよびS505Nを含む、請求項11に記載のCACCR。
  22. 前記TPOR/MPLR受容体がアミノ酸置換H499L、S505N、およびW515Kを含む、請求項11に記載のCACCR。
  23. 前記モノマーが同一である、請求項1~22のいずれか1項に記載のCACCR。
  24. 前記モノマーが異なる、請求項1~22のいずれか1項に記載のCACCR。
  25. 前記動員ドメインが、サイトカイン受容体由来のSTAT動員ドメインを含む、請求項1~24のいずれか1項に記載のCACCR。
  26. 前記動員ドメインが、表2aに示されている受容体から選択される受容体由来のSTAT動員ドメインを含む、請求項1~24のいずれか1項に記載のCACCR。
  27. 前記動員ドメインが、表2bに示される受容体配列のうちの1つ以上のアミノ酸配列を含む、請求項1~24のいずれか1項に記載のCACCR。
  28. 前記動員ドメインがIL7Ra由来のSTAT動員ドメインを含む、請求項1~27のいずれか1項に記載のCACCR。
  29. 前記IL7RaがIL7Ra(316~459)である、請求項28に記載のCACCR。
  30. 前記動員ドメインがIL2Rb由来のSTAT動員ドメインを含む、請求項1~27のいずれか1項に記載のCACCR。
  31. 前記IL2Rbが含む前記動員ドメインがIL7Ra由来のSTAT動員ドメインを含む、請求項30に記載のCACCR。
  32. 前記動員ドメインがIL12Rb2由来のSTAT動員ドメインを含む、請求項1~27のいずれか1項に記載のCACCR。
  33. 前記IL12Rb2がIL12Rb2(714~862)またはIL12Rb2(775~825)を含む、請求項32に記載のCACCR。
  34. 前記動員ドメインが2つの受容体由来のSTAT動員ドメインを含む、請求項1~33のいずれか1項に記載のCACCR。
  35. 前記動員ドメインが2つのサイトカイン受容体由来のSTAT動員ドメインを含む、請求項1~34のいずれか1項に記載のCACCR。
  36. 前記2つのサイトカイン受容体が、IL7Ra、IL2Rb、およびIL12Rb2からなる群から選択される、請求項35に記載のCACCR。
  37. 請求項1~36のいずれか1項に記載のCACCRのうちのいずれか1つをコードするポリヌクレオチド。
  38. 請求項37に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  39. 請求項37に記載のポリヌクレオチドとキメラ抗原受容体(CAR)を発現するポリヌクレオチドと、を含む、請求項37に記載の発現ベクター。
  40. 前記CARが、BCMA、EGFRvIII、Flt-3、WT-1、CD20、CD23、CD30、CD38、CD70、CD33、CD133、LeY、NKG2D、CS1、CD44v6、ROR1、CD19、クローディン18.2(クローディン18A2、またはクローディン18アイソフォーム2)、DLL3(デルタ様タンパク質3、Drosophilaデルタホモログ3、Delta3)、Muc17(ムチン17、Muc3、Muc3)、FAPアルファ(線維芽細胞活性化タンパク質アルファ)、Ly6G6D(リンパ球抗原6複合遺伝子座タンパク質G6d、c6orf23、G6D、MEGT1、NG25)、および/またはRNF43(E3ユビキチンタンパク質リガーゼRNF43、RINGフィンガータンパク質43)に結合する、請求項39に記載の発現ベクター。
  41. 前記ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項38~40のいずれか1項に記載の発現ベクター。
  42. 請求項38~41のいずれか1項に記載の発現ベクターを含む操作された免疫細胞。
  43. 前記免疫細胞がT細胞である、請求項42に記載の操作された免疫細胞。
  44. キメラ抗原受容体(CAR)と、請求項1~36のいずれか1項に記載の少なくとも1つのCACCRと、を含む操作された免疫細胞。
  45. 前記CARおよび前記CACCRが化学量論的に等しい量で発現される、請求項44に記載の操作された免疫細胞。
  46. 前記免疫細胞がT細胞である、請求項42~45のいずれか1項に記載の操作された免疫細胞。
  47. 前記CARが、BCMA、EGFRvIII、Flt-3、WT-1、CD20、CD23、CD30、CD38、CD70、CD33、CD133、LeY、NKG2D、CS1、CD44v6、ROR1、CD19、クローディン18.2(クローディン18A2、またはクローディン18アイソフォーム2)、DLL3(デルタ様タンパク質3、Drosophilaデルタホモログ3、Delta3)、Muc17(ムチン17、Muc3、Muc3)、FAPアルファ(線維芽細胞活性化タンパク質アルファ)、Ly6G6D(リンパ球抗原6複合遺伝子座タンパク質G6d、c6orf23、G6D、MEGT1、NG25)、および/またはRNF43(E3ユビキチンタンパク質リガーゼRNF43、RINGフィンガータンパク質43)に結合する、請求項42~46のいずれか1項に記載の操作された免疫細胞。
  48. 前記細胞が同種異系免疫細胞である、請求項42~47のいずれか1項に記載の操作された免疫細胞。
  49. 前記細胞が自己免疫細胞である、請求項42~47のいずれか1項に記載の操作された免疫細胞。
  50. 前記免疫細胞が、T細胞、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、NK細胞、マクロファージ、単球、B細胞、および幹細胞に由来する免疫細胞からなる群から選択される、請求項42~49のいずれか1項に記載の操作された免疫細胞。
  51. 操作された免疫細胞を調製する方法であって、請求項37に記載のポリヌクレオチドまたは請求項38~41のいずれか1項に記載の発現ベクターを免疫細胞に導入することを含む、方法。
  52. 前記免疫細胞が、T細胞、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、NK細胞、マクロファージ、単球、B細胞、および幹細胞に由来する免疫細胞からなる群から選択される、請求項51に記載の方法。
  53. 請求項42~50のいずれか1項に記載の操作された免疫細胞を含む、医薬組成物。
  54. 請求項42~50のいずれか1項に記載の操作された免疫細胞または請求項53に記載の医薬組成物を含むキット。
  55. 対象のがんを治療する方法であって、治療有効量の請求項42~50のいずれか1項に記載の操作された免疫細胞または請求項53に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  56. 前記がんが固形腫瘍を含む、請求項55に記載の方法。
  57. 前記がんが液性腫瘍を含む、請求項55に記載の方法。
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