CN103483452B

CN103483452B - 双信号独立的嵌合抗原受体及其用途

Info

Publication number: CN103483452B
Application number: CN201210191447.2A
Authority: CN
Inventors: 钱其军; 金华君; 丁娜; 俞德超; 李林芳; 吴孟超
Original assignee: Shanghai Cell Therapy Group Co Ltd
Current assignee: Shanghai Cell Therapy Group Co Ltd
Priority date: 2012-06-12
Filing date: 2012-06-12
Publication date: 2021-08-13
Anticipated expiration: 2032-06-12
Also published as: CN103483452A; WO2013185552A1

Abstract

本发明涉及一种嵌合抗原受体（CAR），特别是双信号独立的嵌合抗原受体，还涉及表达所述CAR的免疫反应细胞，以及所述免疫反应细胞用于制备治疗恶性肿瘤及病毒感染性疾病的药物中的用途。具体地，所述双信号独立的CAR分别识别肿瘤细胞两个不同家族的抗原，分别传递T细胞活化相关的两种信号。其中一种CAR通过结合肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的配体传递T细胞活化相关的第一信号，决定T细胞杀伤特异性；另一种CAR通过结合肿瘤细胞广泛表达的膜受体（如EGFR家族成员蛋白）的配体传递T细胞活化相关的第二信号，促进T细胞活化、增殖与存活。本发明能在保持第二代、第三代CAR疗效的基础上，避免其潜在的安全问题。

Description

双信号独立的嵌合抗原受体及其用途

技术领域

本发明涉及一种嵌合抗原受体，特别是双信号独立的嵌合抗原受体，本发明还涉及表达所述嵌合抗原受体的免疫反应细胞，以及所述免疫反应细胞用于制备治疗恶性肿瘤及病毒感染性疾病的药物中的用途。

背景技术

肿瘤过继细胞治疗（adoptive cell therapy,ACT）是将经处理的自体或异体免疫细胞（主要是自体细胞）回输给肿瘤患者，以增强患者免疫功能，达到治疗目的的方法。当前肿瘤ACT进展迅速，利用肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocyte,TIL）开展的过继免疫治疗方案针对黑色素瘤取得了非常好的临床效果（Science 2002;298:850-4）。然而，T细胞活化需要两个信号的刺激，即两种T细胞活化相关信号。其中，T细胞表面TCR-CD3复合体与抗原肽-MHC分子结合，提供T细胞活化的第一信号，决定T细胞的杀伤特异性；T细胞表面的共刺激分子（如CD28）与相应配体（如B7）结合，提供T细胞活化的第二信号，促进T细胞活化、增殖与存活。但肿瘤细胞第一信号刺激源（如MHC分子）与第二信号配体（如B7）等缺乏或表达下降，无法有效提供T细胞活化相关的信号，从而激活T细胞免疫反应。因而，需要对T细胞进行基因改造。目前主要通过转基因TCR（T cell receptor）及嵌合抗原受体CAR（chimeric antigen receptors,CAR）两种方式来实现这种T细胞的基因改造（Blood 2010;116:1035-44；Nat Rev Clin Oncol 2011;8:577-85）。

TCR改造具有比较大的限制性，①转基因TCR链可能与病人的内源性的TCR链发生错配，从而导致T细胞表面肿瘤反应性的TCR密度减少；②TCR识别MHC分子递呈的抗原，但不同的病人MHC分子是不同的，所以必须分离对所有MHC单体型特异的TCR，可操作性低；③大部分TCR不能识别糖类或糖脂类抗原，抗原选择范围较窄；④只提供T细胞活化相关的第一信号，没有提供第二信号，疗效不足。因而，嵌合抗原受体CAR受体受到更多的青睐。

嵌合抗原受体CAR由一个scFv单链抗体（由抗体VL区氨基酸序列和VH区氨基酸序列经Linker连接而成），通过铰链结构与源于TCR复合体或者IgE高亲和受体的跨膜和胞内信号结构连接构成。表达CAR的T细胞可通过非MHC限制性途径与抗原反应。此外，与常规的TCR只能针对的蛋白抗原相比，CAR并不局限于蛋白抗原，还包括糖类和糖脂类TAA，而这些抗原不像蛋白抗原那么容易突变（Curr Opin Immunol 2009;21:215-23；Blood 2010;116:1035-44；Cancer Res 2011;71:3175-81；J Cancer 2011;2:378-82）。自1989年，由Eshhar和其同事首次提出CAR的概念以来，其已经历了三个不同的发展阶段。第一代CAR受体，包含胞外特异识别肿瘤抗原的scFv片段，胞内激活信号由CD3ζ或FcεRIγ的ITAM（immunoreceptor tyrosine-based activation motifs）信号链来传递。但是第一代CAR受体缺乏T细胞的共刺激信号，导致T细胞只能发挥瞬间效应，在体内存在时间短、细胞因子分泌少。第二代CAR受体在第一代CAR的基础上增加了一个共刺激信号分子的胞内结构域，提供T细胞活化的两种信号，包括如CD28，CD134/OX40，CD137/4-1BB，lymphocyte-specificprotein tyrosine kinase(LCK)，inducible T-cell co-stimulator(ICOS)以及DNAX-activation protein 10(DAP10)等结构域，增强了T细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，IL-2、IFN-γ以及GM-CSF增加，从而突破肿瘤微环境的免疫抑制、延长AICD（activationinduced cell death,AICD）。第三代CAR受体，在第二代CAR的基础上，增加了另外一种共刺激信号分子的胞内结构域，如在共刺激结构CD28和ITAM信号链的之间再融合一个二级共刺激分子如4-1BB，产生一个三重信号的CAR受体，第三代CAR受体改造的T细胞具有更好的效应功能和体内存活时间。

目前，美国已有29项CAR修饰的T细胞过继治疗方案进入临床试验（Blood 2010;116:1035-44；Nat Rev Clin Oncol 2011;8:577-85）。可以看到，第一代CAR只提供T细胞活化的第一信号，第二代与第三代的CAR是将T细胞激活所需的两个信号进行了合并，将第二信号CD28或/和4-1BB细胞内信号区域直接连接到CD3z分子，从而绕过了肿瘤细胞通常第二信号如B7等缺乏所引起T细胞不能激活的障碍，第一信号与第二信号合并后，大大提高了对T细胞激活、增殖及杀伤能力，使之疗效大幅度增加。但随之给临床治疗带来了一定风险，因为第二代与第三代CAR修饰后T细胞会针对某些少量表达肿瘤相关抗原的正常组织产生超强的反应，呈“瀑布”式过量增加，造成对正常组织的过激免疫反应。目前已有两个注射CAR修饰后的T细胞而导致死亡的病例报道。其一例应用第三代CAR（针对Her2），患者由于急性肺水肿而死亡，其原因是CAR⁺的T细胞误攻击低表达Her2的肺上皮细胞（Mol Ther 2010;18:843-51）；另一例应用第二代CAR（针对CD19），死亡原因复杂，但伴随着血液中细胞因子水平的增高（Hum Gene Ther 2010;21:1039-42；Mol Ther 2010;18:666-8）。为解决这一安全性隐患，研究者将HSV-TK、△Fas、iCasp9、CD20-Rituximab等自杀系统引入T细胞的CAR修饰，发挥刹车作用，避免T细胞过量增殖（J Cancer 2011;2:378-82；N Engl J Med 2011;365:1673-83）。然而，CAR⁺的T细胞脱靶引发的“瀑布”效应速度非常快，这些自杀系统未必能及时发挥作用。另一种方法是减少CAR⁺的T细胞回输数量，这种方案随之使治疗疗效下降。所以，非常有必要对CAR自身的反应体系上进行改造，提高CAR介导的肿瘤ACT的临床安全性。

发明内容

本发明提供了一种双信号独立的嵌合抗原受体，表达所述嵌合抗原受体的免疫反应细胞，以及所述免疫反应细胞的用途。具体地，

本发明的第一方面涉及一种双信号独立的嵌合抗原受体（dual-signal chimericantigen receptors,dsCAR），其由两种独立的嵌合抗原受体组成，分别传递两种信号，其中嵌合抗原受体1由一个或数个（例如两个）包含能够结合肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的配体、跨膜区和胞内免疫受体酪氨酸活化基序的嵌合抗原受体组成，嵌合抗原受体2由一个或数个（例如两个）包含能够结合肿瘤细胞广泛表达的膜受体的配体、跨膜区和胞内共刺激信号分子胞内结构域的嵌合抗原受体组成。

在本发明中，所述两种信号是指T细胞活化的第一信号和第二信号。所述两种独立的嵌合抗原受体是指传递T细胞活化第一信号和第二信号的嵌合抗原受体之间相互独立，分别传递T细胞活化的第一信号和第二信号。

根据本发明第一方面的嵌合抗原受体，所述的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原选自CD19、CD20、CEA、GD2（又称B4GALNT1，beta-1,4-N-acetyl-galactosaminyl transferase1）、FR（Flavin reductase）、PSMA（Prostate-specific membrane antigen）、gp100（PMELpremelanosome protein）、CA9（carbonic anhydrase IX）、CD171/L1-CAM、IL-13Rα2、MART-1（又称melan-A）、ERBB2、NY-ESO-1（又称CTAG1B，cancer/testis antigen 1B）、MAGE（Melanoma-associated antigen E1）家族蛋白、BAGE（B melanoma antigen family）家族蛋白、GAGE（growth hormone releasing factor）家族蛋白、AFP（alpha-fetoprotein）、MUC1（mucin 1,cell surface associated）、CD22、CD23、CD30、CD33、CD44v7/8、CD70、VEGFR1、VEGFR2、IL-11Rα、EGP-2、EGP-40、FBP、GD₃（又称ST8SIA1，ST8alpha-N-acetyl-neuraminide alpha-2,8-sialyltransferase 1）、PSCA（prostate stem cell antigen）、FSA（又称KIAA1109）、PSA（又称KLK3，kallikrein-related peptidase 3）、HMGA2、fetalacetylcholine receptor、LeY（又称FUT3）、EpCAM、MSLN（mesothelin）、IGFR1、EGFR、EGFRvIII、ERBB3、ERBB4、CA125（又称MUC16,mucin 16,cell surface associated）、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、SCC（又称SERPINB3）、AFU（又称FUCA1）、EBV-VCA、POA（又称VDR，vitaminD(1,25-dihydroxyvitamin D3)receptor）、β2-MG（beta-2-microglobulin）和PROGRP（GRP gastrin-releasing peptide）中的一种或数种。在本发明的一个实施方案中，所述肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原为MUC1。

根据本发明第一方面的嵌合抗原受体，所述的肿瘤细胞广泛表达的膜受体选自CD19、CD20、MUC1、EGFR、EGFRvIII、ERBB2、ERBB3、ERBB4、VEGFR1、VEGFR2、EpCAM、CD44和IGFR中的一种或数种。

优选地，所述肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原与肿瘤细胞广泛表达的膜受体不同。

根据本发明第一方面的嵌合抗原受体，优选地，其中所述的能够结合肿瘤细胞广泛表达的膜受体的配体能够同时和两种或多种上述膜受体结合，使得本发明的嵌合抗原受体能够接受异质性肿瘤细胞群体的信号刺激，以延长免疫反应细胞的效应时间。

在本发明的一个实施方案中，所述能够结合肿瘤细胞广泛表达膜受体的配体是指能够结合EGFR家族蛋白（包括EGFR、ERBB2、和/或ERBB4）及EGFR突变体EGFRvIII的配体；优选地，所述配体为HERIN。

根据本发明第一方面的嵌合抗原受体，其中所述的胞内免疫受体酪氨酸活化基序包含选自CD3ζ和FcεRIγ的免疫受体酪氨酸活化基序信号链；其中所述的胞内共刺激信号分子胞内结构域包含选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、LCK、ICOS、DAP10胞内结构域，优选地，所述的胞内共刺激信号分子胞内结构域包含选自上述肽段中的两种或两种以上。

在本发明的一个实施方案中，所述的胞内免疫受体酪氨酸活化基序包含CD3ζ的免疫受体酪氨酸活化基序信号链。

在本发明的一个实施方案中，所述的胞内共刺激信号分子胞内结构域包含CD28和CD137/4-1BB的胞内结构域。

根据本发明第一方面的嵌合抗原受体，其中所述的跨膜区是指膜蛋白在细胞膜内的部分，例如可以为CD28、CD8、CD3ζ、CD134、CD137、ICOS、和DAP10跨膜区；优选地，所述的两种嵌合抗原受体的跨膜区不同，以防止错配。在本发明的一个实施方案中，所述嵌合抗原受体1的跨膜区为CD8跨膜区，所述嵌合抗原受体2的跨膜区为CD28跨膜区。

根据本发明第一方面的嵌合抗原受体，所述配体为可以和所述肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原、肿瘤细胞广泛表达的膜受体特异性结合的分子，例如可以为蛋白、多肽或抗体；所述抗体例如可以为单克隆抗体、单链抗体、Fab抗体等，在本发明的一个实施方案中，所述抗体为单链抗体（ScFv）；在本发明的另一个实施方案中，所述配体为多肽，在一个具体实施方案中，所述多肽为HERIN分子。

根据本发明第一方面的嵌合抗原受体，所述配体为单拷贝或多拷贝，所述多拷贝例如为双拷贝。

根据本发明第一方面的嵌合抗原受体，其由一个载体共同表达，或由两个相同或不同的载体分别表达。在本发明的一个实施方案中，其由一个载体共同表达。优选地，在两种嵌合抗原受体之间连接有蛋白质前体加工酶识别序列，例如Furin-2A，当两种嵌合抗原受体表达后，将被剪切成两个独立的蛋白，分别运输至细胞膜。

本发明所述的载体选自真核表达质粒、重组病毒；所述真核表达质粒例如可以为pSV2、pRSV、pcDNA3.1、pCI和pVAX1、转座子质粒；所述重组病毒例如可以为重组逆病毒、重组慢病毒，本发明的一个实施方案中，所述载体为pcDNA3.1(+)。

本发明通过将表达嵌合抗原受体的载体导入免疫反应细胞，使嵌合抗原受体得以表达，来对细胞进行遗传修饰。

其中将载体导入免疫反应细胞的方法可以为本领域常用的方法，例如为基因枪法、转染法、电转法、病毒转导法。

在本发明的一个实施方案中，构成嵌合抗原受体1为MUC1的ScFv、CD8跨膜区、CD3ζ信号链。构成嵌合抗原受体2的为人类Her2基因第8个内含子Herin编码的氨基酸序列HERIN、CD28跨膜区、CD28胞内区、4-1BB共刺激肽段。

本发明的第二方面涉及一种经过改造的免疫反应细胞，其表达本发明第一方面任一项所述的嵌合抗原受体。

根据本发明第二方面的免疫反应细胞，所述免疫反应细胞例如可以选自T细胞、单核细胞（monocyte）、自然杀伤细胞（NK细胞）、中性粒细胞；其中所述T细胞例如可以为细胞毒性T淋巴细胞、NKT细胞、辅助T细胞、或抑制/调节性T细胞。

本发明的第三方面涉及试剂盒，其包括本发明第二方面任一项所述的免疫反应细胞，以及任选的使用说明书。

本发明的第四方面涉及本发明第二方面任一项所述的免疫反应细胞用于制备预防和/或治疗恶性肿瘤及病毒感染性疾病的药物中的用途。

根据本发明第四方面的用途，其中所述的恶性肿瘤可以为任何恶性肿瘤，例如为肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌或前列腺癌。

根据本发明第四方面的用途，其中所述的病毒可以为侵染细胞的任何病毒，例如为艾滋病病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、EB病毒（Epstein-Barrvirus）、乳头瘤病毒（Papillomavirus）、疱疹病毒（Herpesvirus）或巨细胞病毒（cytomegalovirus）。

本发明的第五方面涉及一种改造免疫反应细胞的方法，其包括在免疫反应细胞上表达本发明第二方面任一项所述的嵌合抗原受体的步骤。

根据本发明第五方面的方法，所述免疫反应细胞选自T细胞、单核细胞（monocyte）、自然杀伤细胞、中性粒细胞；其中所述T细胞例如可以为细胞毒性T淋巴细胞、NKT细胞、辅助T细胞、或抑制/调节性T细胞。

发明详述

本发明中术语“嵌合抗原受体”是人工改造受体，能够将识别肿瘤抗原的特异性分子(如抗体)锚定在免疫细胞(如T细胞)上，使免疫细胞识别肿瘤抗原或病毒抗原和杀死肿瘤细胞或病毒感染的细胞。

本发明中术语“T细胞活化相关信号”是指与T细胞活化所需要两个信号，即T细胞表面TCR-CD3复合体与抗原肽-MHC分子结合，提供T细胞活化的第一信号，决定T细胞的杀伤特异性；T细胞表面的共刺激分子（如CD28）与相应配体（如B7）结合，提供T细胞活化的第二信号，促进T细胞活化、增殖与存活。

本发明中术语“免疫受体酪氨酸活化基序”（immunoreceptor tyrosine-basedactivation motifs，ITAM）是指免疫细胞活化相关受体(如BCR/Igα/Igβ，TCR/CD3、FcαR和FcRγ等)胞浆区所共有的以酪氨酸残基(tyrosine,Y)为基础的氨基酸序列基序，其特征为:两个酪氨酸残基被大约13外其它氨酸残基隔开(…YXX[L/V]X 7-11YXX[L/V]…)，其中酪氨酸是蛋白激酶磷酸化位点，被磷酸化后能够与信号转导途径下游的信号分子结合，导致细胞的活化。

本发明中术语“共刺激信号分子”（Co-stimulating molecule）是指免疫细胞表面的一些粘附分子，如CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、CD40等，通过与其配体结合，激活免疫细胞的第二信号，增强免疫细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，延长活化免疫细胞的存活时间。

发明中术语“肿瘤特异性抗原”（tumor specific antigen,TSA）是肿瘤细胞特有的或只存在于某种肿瘤细胞而不存在于正常细胞的新抗原。

发明中术语“肿瘤相关抗原”（tumor-associated antigen,TAA）是指非肿瘤细胞所特有的、正常细胞和其他组织上也存在的抗原，只是其含量在细胞癌变时明显增高的抗原。

发明中术语“单链抗体”（single-chain antibody variable region fragment,scFv）是指由抗体VL区氨基酸序列和VH区氨基酸序列经Linker连接而成，具有结合抗原能力的抗体片段。

本发明中术语“EGFR”是指人类表皮生长因子受体（epidermal growth factorreceptor），又简称为ERBB1或HER1，其家族成员包括EGFR、ERBB2（HER2）、ERBB3（HER3）、ERBB4（HER4）。

本发明中术语“Herin”是指人类Her2的第8个内含子中编码Herstatin的C末端79个氨基酸的DNA序列，所述HERIN是人类Her2的第8个内含子中编码Herstatin的C末端79个氨基酸序列，其可以和EGFR家族成员（包括EGFR、ERBB2、ERBB4）以及EGFR突变体EGFRvIII结合。

本发明中，所述双信号独立是指传递T细胞活化的第一信号和第二信号的嵌合抗原受体之间相互独立，分别与各自的配体结合，并分别将结合后产生的信号转导入细胞内。

本发明中，所述Linker是连接不同蛋白或多肽之间的多肽片段，其目的是使所连接的蛋白或多肽保持各自的空间构象，以维持蛋白或多肽的功能或活性。

本发明中，所述多肽通常是指长度在1－100个氨基酸的肽链分子；蛋白通常是指长度大于100个氨基酸的肽链分子。

在本发明中所述“选自”是指选自所列项目中的一种或数种。

发明的有益效果

本发明的实施方案中，以T细胞为例，在目前国际上最为流行的第二代、第三代CAR的基础上进行改造，将第一信号与第二信号从单一CAR中分开，构建双信号独立的嵌合抗原受体（dual-signal chimeric antigen receptors,dsCAR）。两种CAR分别识别肿瘤细胞两个不同家族的抗原，分别传递T细胞活化相关的两种信号。其中，一种CAR通过结合肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的单链抗体或肽段来传递T细胞活化相关的第一信号，决定T细胞杀伤特异性；另一种CAR通过结合肿瘤细胞广泛表达的膜受体（如EGFR家族成员蛋白）的单链抗体或肽段来传递T细胞活化相关的第二信号，促进T细胞活化、增殖与存活。保证经dsCAR修饰后的T细胞在第一信号与第二信号源同时存在的肿瘤环境中大量增殖，从而特异杀伤肿瘤细胞；而正常细胞不同时表达这两种刺激信号的受体，即使正常细胞低表达第一信号源，也只会出现轻度误伤，不会引起CAR⁺的T细胞呈“瀑布”式过量增加，导致严重的后果；而在只有第二信号源的一些正常组织环境中，T细胞不发挥杀伤作用，所以大大提高了安全性。本发明能在保持第二代、第三代CAR疗效的基础上，避免其潜在的安全问题。

除T细胞外，本发明同样适用于其它免疫反应细胞，例如单核细胞、NK细胞、中性粒细胞。

同时，本发明中的嵌合抗原受体2中包含有能够结合肿瘤细胞广泛表达的膜受体的配体，因而适用于各种恶性肿瘤、病毒感染性疾病以及同种类型的恶性肿瘤细胞或病毒感染细胞由于异质性而表达不同膜受体的情况，进而达到延长免疫反应细胞的效应时间的效果。

附图说明

图1：结合MUC1的CAR1（CAR1_MUC1）与结合EGFR家族蛋白的CAR2（CAR2_EGFR）、结合MUC1的第三代CAR（G3-CAR_MUC1）模式图。SP：信号肽；L1-L5：Linker 1-Linker 5;

图2：CAR1_MUC1CAR2_EGFR的表达载体结构图（简称pcDNA3.1-CAR1:2）。

图3：经不同处理的Jurkat细胞（Jurkat^CAR1、Jurkat^CAR2、Jurkat^CAR1CAR2及Jurkat^3G ^-CAR）接触A431、MCF7、U-2OS后的增殖情况。

图4：经不同处理的Jurkat细胞（Jurkat^CAR1、Jurkat^CAR2、Jurkat^CAR1CAR2及Jurkat^3G ^-CAR）与A431、MCF7、U-2OS细胞共培养后，INFrγ的分泌量。

图5：经不同处理的Jurkat细胞（Jurkat^CAR1、Jurkat^CAR2、Jurkat^CAR1CAR2及Jurkat^3G ^-CAR）对A431、MCF7、U-2OS的杀伤作用。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：CAR表达框的合成与表达载体的构建

根据构成CAR各组分的氨基酸序列与编码序列，拼接成整个融合的氨基酸序列与编码DNA表达框，其中:

HERIN的氨基酸残基序列为：

GTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEG(SEQ ID NO:1)

HERIN的编码序列为：

GGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCGCATGCAGCCTGGCCCAGCCCACCCTGTCCTATCCTTCCTCAGACCCTCTTGGGACCTAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACCCCTGGCCCCCCTCAGCCCTACAAGTGTCCCTATATCCCCTGTCAGTGTGGGGAGGGGCCCGGACCCTGATGCTCATGTGGCTGTTGACCTGTCCCGGTATGAAGGC (SEQ ID NO:2)

CD28跨膜区及胞内区（CD28）氨基酸残基序列为:

PFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:3)

CD28跨膜区及胞内区（CD28）的编码序列为:

CCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC (SEQ ID NO:4)

4-1BB共刺激信号域肽段（41BB）的氨基酸残基序列为:

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:5)

4-1BB共刺激信号域肽段（41BB）的编码序列为:

AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG (SEQ ID NO:6)

CD3ζ的氨基酸残基序列为：

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:7)

CD3ζ的编码序列为：

AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO:8)

MUC1 scFv-VH（VH_MUC1）的氨基酸残基序列为：EVQLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTFGNSFAYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:9)

MUC1 scFv-VH（VH_MUC1）的编码序列为：

GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCAGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGATTGAAATCTAATAATTATGCAACACATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCTTTGGTAACTCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO:10)

MUC1 scFv-VL（VL_MUC1）的氨基酸残基序列为：

DIVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGSE(SEQ ID NO:11)

MUC1 scFv-VL（VL_MUC1）的编码序列为：

GATATCGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTATGCCAACTGGGTCCAAGAAAAACCAGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTACCAACAACCGAGCACCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCATTGGGTGTTCGGTGGAGGAACCAAACTGACTGTCCTAGGATCCGAG (SEQ ID NO:12)

CD8跨膜区肽段（CD8TM）的氨基酸残基序列为:

YIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO:13)

CD8跨膜区肽段（CD8TM）的编码序列为:

TACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC(SEQ ID NO:14)

信号肽1的氨基酸残基序列为：

MEFWLSWVFLVAILKGVQC(SEQ ID NO:15)

信号肽1编码序列为：

ATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGT(SEQ ID NO:16)

信号肽2的氨基酸残基序列为：

MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO:17)

信号肽2编码序列为：

ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(SEQ IDNO:18)

Linker1的氨基酸残基序列为:

GGSGSGGSGSGGSGS(SEQ ID NO:19)

Linker1的编码序列为:

GGTGGTTCTGGTTCTGGCGGCTCCGGTTCCGGTGGATCCGGCTCT(SEQ ID NO:20)

Linker2的氨基酸残基序列为:

EPKSCDKTHTCPPCPAPE(SEQ ID NO:21)

Linker2的编码序列为:

GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAA(SEQ ID NO:22)

Linker3的氨基酸残基序列为:

PKLEEGEFSEARVDIVLTQSP(SEQ ID NO:23)

Linker3的编码序列为:

CCCAAGCTTGAAGAAGGTGAATTTTCAGAAGCACGCGTAGATATCGTTCTCACTCAATCTCCA(SEQID NO:24)

Linker 4的氨基酸残基序列为：

GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:25)

Linker 4编码序列为：

GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCG(SEQ ID NO:26)

Linker 5的氨基酸残基序列为:

GGGGGGGGG(SEQ ID NO:27)

Linker 5的编码序列为:

GGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGT (SEQ ID NO:28)

Furin-2A的氨基酸残基序列为:

RAKRAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:29)

Furin-2A的编码序列为:

CGTGCTAAACGAGCTCCTGTTAAACAGACTTTGAATTTTGACCTTCTCAAGTTGGCGGGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGGCCC(SEQ ID NO:30)

CAR1_MUC1依次由信号肽1-VH_MUC1-Linker1-VL_MUC1-Linker2-CD8TM-Linker3-CD3ζ融合构成（见图1），其氨基酸序列为：

MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEVQLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTFGNSFAYWGQGTTVTVSSGGSGSGGSGSGGSGSDIVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGSEEPKSCDKTHTCPPCPAPEYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCPKLEEGEFSEARVDIVLTQSPRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:31)

CAR1_MUC1的编码序列为:

ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGACAAGTTCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGATTGAAATCTAATAATTATGCAACACATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACGGGAGTGGGATTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCGGTGGTTCTGGTTCTGGCGGCTCCGGTTCCGGTGGATCCGGCTCTGATATCGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTATGCCAACTGGGTCCAAGAAAAACCAGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTACCAACAACCGAGCACCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCATTGGGTGTTCGGTGGAGGAACCAAACTGACTGTCCTAGGATCCGAGGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAATACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCCCCAAGCTTGAAGAAGGTGAATTTTCAGAAGCACGCGTAGATATCGTTCTCACTCAATCTCCAAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC (SEQ ID NO:32)

CAR2_EGFR依次由信号肽2-HERIN-Linker4-CD28-Linker5-41BB融合构成（见图1），其氨基酸序列为：

MEFWLSWVFLVAILKGVQCGTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEGGGGGSGGGGSGGGGSPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSGGGGGGGGGKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO:33)

CAR2_EGFR的编码序列为:

ATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCGCATGCAGCCTGGCCCAGCCCACCCTGTCCTATCCTTCCTCAGACCCTCTTGGGACCTAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACCCCTGGCCCCCCTCAGCCCTACAAGTGTCCCTATATCCCCTGTCAGTGTGGGGAGGGGCCCGGACCCTGATGCTCATGTGGCTGTTGACCTGTCCCGGTATGAAGGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG (SEQ ID NO:34)

CAR1_MUC1CAR2_EGFR由CAR1_MUC1与CAR2_EGFR经Furin-2A连接构成，其氨基酸序列为：

MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEVQLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTFGNSFAYWGQGTTVTVSSGGSGSGGSGSGGSGSDIVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGSEEPKSCDKTHTCPPCPAPEYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCPKLEEGEFSEARVDIVLTQSPRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRRAKRAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPEFWLSWVFLVAILKGVQCGTHSLPPRPAAVPVPLRMQPGPAHPVLSFLRPSWDLVSAFYSLPLAPLSPTSVPISPVSVGRGPDPDAHVAVDLSRYEGGGGGSGGGGSGGGGSPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS GGGGGGGGGKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO:35)

CAR1_MUC1CAR2_EGFR的编码序列为：

ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAGGTCCAGCTGCAGCAGTCAGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGATTGAAATCTAATAATTATGCAACACATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCTTTGGTAACTCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTTCTGGTTCTGGCGGCTCCGGTTCCGGTGGATCCGGCTCTGATATCGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTATGCCAACTGGGTCCAAGAAAAACCAGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTACCAACAACCGAGCACCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCATTGGGTGTTCGGTGGAGGAACCAAACTGACTGTCCTAGGATCCGAGGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAATACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCCCCAAGCTTGAAGAAGGTGAATTTTCAGAAGCACGCGTAGATATCGTTCTCACTCAATCTCCAAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCCGTGCTAAACGAGCTCCTGTTAAACAGACTTTGAATTTTGACCTTCTCAAGTTGGCGGGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGGCCCGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCGCATGCAGCCTGGCCCAGCCCACCCTGTCCTATCCTTCCTCAGACCCTCTTGGGACCTAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACCCCTGGCCCCCCTCAGCCCTACAAGTGTCCCTATATCCCCTGTCAGTGTGGGGAGGGGCCCGGACCCTGATGCTCATGTGGCTGTTGACCTGTCCCGGTATGAAGGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG (SEQ ID NO:36)

对照G3-CAR_MUC1依次由信号肽1-VH_MUC1-Linker1-VL_MUC1-Linker2-CD28-Linker4-41BB-Linker3-CD3ζ融合构成（见图2），其氨基酸序列为：

MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEVQLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTFGNSFAYWGQGTTVTVSSGGSGSGGSGSGGSGSDIVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGSEEPKSCDKTHTCPPCPAPEPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSGGGGGGGGGKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELPKLEEGEFSEARVDIVLTQSPRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:37)

G3-CAR_MUC1的编码序列为：

ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAGGTCCAGCTGCAGCAGTCAGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGATTGAAATCTAATAATTATGCAACACATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCTTTGGTAACTCCTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTTCTGGTTCTGGCGGCTCCGGTTCCGGTGGATCCGGCTCTGATATCGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTATGCCAACTGGGTCCAAGAAAAACCAGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTACCAACAACCGAGCACCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCATTGGGTGTTCGGTGGAGGAACCAAACTGACTGTCCTAGGATCCGAGGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGCCCAAGCTTGAAGAAGGTGAATTTTCAGAAGCACGCGTAGATATCGTTCTCACTCAATCTCCAAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC (SEQ ID NO:38)

分别按CAR1_MUC1的DNA编码序列(SEQ ID NO:32)、CAR2_EGFR的DNA编码序列(SEQ IDNO:34)、CAR1_MUC1CAR2_EGFR的DNA编码序列(SEQ ID NO:36)、G3-CAR_MUC1的DNA编码序列(SEQ IDNO:38)，委托生工

生物工程（上海）有限公司合成其整个表达框，插入pCDNA3.1（+）载体（Invitrogen）EcoRI-XbaI位点（见图2），转化到E.coli（DH5α），经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得各重组表达载体的高品质质粒。

实施例2：T细胞株的遗传修饰

将实施例1中构建并纯化获得的各重组表达载体的高品质质粒，利用Lipofectamine 2000（Invitrogen）分别转染至Jurkat E6.1（T淋巴细胞株，购自美国典型物保藏中心，ATCC）。2天后，将转染后的Jurkat E6.1细胞转移到具有新霉素的RPMI 1640培养基中，并通过有限稀释法将细胞克隆化。经21天的筛选，建立具有新霉素抗性、经CAR1_MUC1、CAR2_EGFR、CAR1_MUC1CAR2_EGFR、G3-CAR_MUC1遗传修饰的Jurkat E6.1细胞株Jurkat^CAR1、Jurkat^CAR2、Jurkat^CAR1CAR2及Jurkat^G3-CAR。

实施例3：遗传修饰后T细胞株增殖情况测定

将Jurkat^CAR1、Jurkat^CAR2、Jurkat^CAR1CAR2及Jurkat^G3-CAR以及未修饰的Jurkat E6.1细胞（5×10⁵/孔，RPMI 1640培养基，含20U/mlIL-2），分别加入预铺经放射处理的A431、MCF7、U-2OS的6孔板（均购自ATCC，5×10⁵/孔）中，分别在第3天、第7天，对悬浮的Jurkat细胞进行计数。结果表明，接触MUC1与EGFR双阳性的A431细胞后，Jurkat^CAR1CAR2能大量增殖，增殖倍数高于Jurkat^G3-CAR；接触MUC1高阳性而EGFR家族蛋白弱阳性的MCF7细胞后，Jurkat^CAR1CAR2的增殖倍数与Jurkat^CAR1相似，略低于Jurkat^G3-CAR；接触MUC1弱阳性、EGFR弱阳性的U-2OS细胞后，Jurkat^CAR1CAR2基本不增殖，而Jurkat^G3-CAR仍能少量增殖（见图4）。以上结果表明，当两种抗原同时存在（如MUC1与EGFR双阳性，代表一般肿瘤组织细胞），经dsCAR修饰的T细胞能大量增殖；当第一信号存在，第二信号较弱（如MUC1阳性、EGFR弱阳性，代表少数肿瘤细胞）,经dsCAR修饰的T细胞也能有效增殖；当第一信号较弱，第二信号存在（如MUC1弱阳、EGFR弱阳，代表正常组织细胞），经dsCAR修饰的T细胞基本不增殖。

实施例4：遗传修饰后T细胞株IFNγ分泌量测定

将Jurkat^CAR1、Jurkat^CAR2、Jurkat^CAR1CAR2及Jurkat^G3-CAR以及未修饰的Jurkat E6.1细胞（5×10⁵/孔）在24孔板中与A431、MCF7、U-2OS（均购自ATCC，1×10⁵/孔）共培养，72小时后收集上清，通过IFNγ的ELISA检测试剂盒（BD Biosciences）检测IFNγ的分泌量。结果表明，与MUC1与EGFR双阳性的A431细胞共培养后，Jurkat^CAR1CAR2能大量分泌IFNγ，分泌量高于Jurkat^G3-CAR；与MUC1高阳性而EGFR家族蛋白弱阳性的MCF7细胞共培养后，Jurkat^CAR1CAR2的IFNγ分泌量与Jurkat^CAR1相似，低于Jurkat^G3-CAR；与MUC1弱阳性、EGFR弱阳性的U-2OS细胞共培养后，Jurkat^CAR1CAR2基本不分泌IFNγ，而Jurkat^G3-CAR仍能分泌较多的IFNγ（见图4）。以上结果表明，当两种抗原同时存在（如MUC1与EGFR双阳性，代表一般肿瘤组织细胞），经dsCAR修饰的T细胞能大量分泌IFNγ；当第一信号存在，第二信号较弱（如MUC1阳性、EGFR弱阳性，代表少数肿瘤细胞）,经dsCAR修饰的T细胞也能有效分泌IFNγ；当第一信号较弱，第二信号存在（如MUC1弱阳、EGFR弱阳，代表正常组织细胞），经dsCAR修饰的T细胞基本不分泌IFNγ。

实施例5：遗传修饰后T细胞株的体外杀伤作用测定

按不同的效靶比（50:1，25:1，5:1，1:1），将Jurkat^CAR1、Jurkat^CAR2、Jurkat^CAR1CAR2及Jurkat^G3-CAR以及未修饰的Jurkat E6.1细胞与A431、MCF7、U-2OS共培养，应用LDH乳酸脱氢酶-细胞毒性检测分析试剂盒（LDH-Cytotoxicity Assay Kit，Biovision）检测不同方法遗传修饰后的Jurkat E6.1细胞对不同类型肿瘤细胞的体外杀伤能力。方法如下：靶细胞铺96孔板（5×10³/孔），设培养基背景、体积校正、靶细胞自发LDH释放、靶细胞最大LDH释放、效应细胞自发LDH释放对照孔，治疗组孔，每组重复3孔，每个孔的终体积相同且不少于100μL。250g离心4min，在37℃，5%CO2孵育至少4h。在离心前45min，向靶细胞最大释放孔加入10×裂解液，体积校正孔加入等量的裂解液。再次离心，从每孔转移50μL上清至新的96孔板中，再加入50μL底物溶液，室温避光孵育30min。每孔加入50μL终止液，1h内测定D490。细胞毒性（%）=[（D实验孔-D培养基背景孔）-（D效应细胞自发LDH释放孔-D培养基背景孔）-（D靶细胞自发LDH释放孔-D培养基背景孔）]/[（D靶细胞最大LDH释放孔-D体积校正孔）-（D靶细胞自发LDH释放孔-D培养基背景孔）]×100%。

结果表明，Jurkat^CAR1CAR2能有效杀伤MUC1与EGFR双阳性的A431肿瘤细胞；对MUC1高阳性而EGFR家族蛋白弱阳性的MCF7的杀伤作用与Jurkat^CAR1相似，低于Jurkat^G3-CAR；对MUC1弱阳性而EGFR阳性的U-2OS细胞基本不杀伤（见图5）。以上结果表明，当两种抗原同时存在（如MUC1与EGFR双阳性，代表一般肿瘤组织细胞），经dsCAR修饰的T细胞能有效杀伤；当第一信号存在，第二信号较弱（如MUC1阳性、EGFR弱阳性，代表少数肿瘤细胞）,经dsCAR修饰的T细胞也能有效发挥杀伤作用；当第一信号较弱，第二信号存在（如MUC1弱阳、EGFR弱阳，代表正常组织细胞），经dsCAR修饰的T细胞基本不杀伤。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

1.一种双信号独立的嵌合抗原受体，其由两种独立的嵌合抗原受体组成，分别传递两种信号，其中嵌合抗原受体1只发出T细胞活化的第一信号，并且由一个包含能够结合肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的配体、跨膜区和胞内免疫受体酪氨酸活化基序的嵌合抗原受体组成，嵌合抗原受体2只发出T细胞活化的第二信号，并且由一个包含能够结合肿瘤细胞广泛表达的膜受体的配体、跨膜区和胞内共刺激信号分子胞内结构域的嵌合抗原受体组成；其中：

所述的胞内免疫受体酪氨酸活化基序包含选自CD3ζ和FcεRIγ的免疫受体酪氨酸活化基序信号链；

所述的胞内共刺激信号分子胞内结构域包含选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、LCK、ICOS和DAP10的胞内结构域。

2.权利要求1的嵌合抗原受体，其中所述的肿瘤细胞广泛表达的膜受体选自CD19、CD20、MUC1、EGFR、EGFRvIII、ERBB2、ERBB3、ERBB4、VEGFR1、VEGFR2、EpCAM、CD44和IGFR中的一种或数种。

3.权利要求1的嵌合抗原受体，其中所述的能够结合肿瘤细胞广泛表达的膜受体的配体是指能够结合EGFR家族蛋白及EGFR突变体EGFRvIII的配体。

4.权利要求3所述的嵌合抗原受体，其中，所述EGFR家族蛋白包括EGFR、ERBB2、和/或ERBB4。

5.权利要求3所述的嵌合抗原受体，其中，所述配体为HERIN。

6.权利要求1的嵌合抗原受体，其中所述的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原选自CD19、CD20、CEA、GD₂、FR、PSMA、gp100、CA9、CD171/L1-CAM、IL-13Rα2、MART-1、ERBB2、NY-ESO-1、MAGE家族蛋白、BAGE家族蛋白、GAGE家族蛋白、AFP、MUC1、CD22、CD23、CD30、CD33、CD44v7/8、CD70、VEGFR1、VEGFR2、IL-11Rα、EGP-2、EGP-40、FBP、GD₃、PSCA、FSA、PSA、HMGA2、fetalacetylcholine receptor、LeY、EpCAM、MSLN、IGFR1、EGFR、EGFRvIII、ERBB3、ERBB4、CA125、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、SCC、AFU、EBV-VCA、TSGF、POA、β2-MG和PROGRP中的一种或数种。

7.权利要求1-6任一项所述的嵌合抗原受体，所述配体为多肽或蛋白；和/或所述配体为单拷贝或多拷贝。

8.权利要求7的嵌合抗原受体，其中，所述配体为抗体。

9.权利要求7的嵌合抗原受体，其中，所述多拷贝为双拷贝。

10.权利要求1的嵌合抗原受体，其由一个载体共同表达，或由两个相同或不同的载体分别表达。

11.一种经过改造的免疫反应细胞，其表达权利要求1-10任一项所述的嵌合抗原受体。

12.权利要求11的免疫反应细胞，所述免疫反应细胞选自T细胞、单核细胞(monocyte)、自然杀伤细胞、中性粒细胞。

13.权利要求12的免疫反应细胞，其中所述T细胞为细胞毒性T淋巴细胞、NKT细胞、辅助T细胞、或抑制/和调节性T细胞。

14.试剂盒，其包括权利要求11-13任一项所述的免疫反应细胞，以及任选的使用说明书。

15.权利要求11-13任一项所述的免疫反应细胞用于制备预防和/或治疗恶性肿瘤的药物中的用途。

16.权利要求15的用途，其中所述的恶性肿瘤为肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌或前列腺癌。

17.一种改造免疫反应细胞的方法，其包括在免疫反应细胞上表达权利要求1-10任一项所述的嵌合抗原受体的步骤。

18.权利要求17的方法，所述免疫反应细胞选自T细胞、单核细胞(monocyte)、自然杀伤细胞、中性粒细胞。

19.权利要求18的方法，其中所述T细胞为细胞毒性T淋巴细胞、NKT细胞、辅助T细胞、或抑制/调节性T细胞。