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WO2013051718A1 - キメラ抗原受容体 - Google Patents

キメラ抗原受容体 Download PDF

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Publication number
WO2013051718A1
WO2013051718A1 PCT/JP2012/076034 JP2012076034W WO2013051718A1 WO 2013051718 A1 WO2013051718 A1 WO 2013051718A1 JP 2012076034 W JP2012076034 W JP 2012076034W WO 2013051718 A1 WO2013051718 A1 WO 2013051718A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
car
cea
cell
cells
domain
Prior art date
Application number
PCT/JP2012/076034
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
洋 珠玖
織戸　由貴
峰野　純一
幸子 岡本
泰典 天石
Original Assignee
国立大学法人三重大学
タカラバイオ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人三重大学, タカラバイオ株式会社 filed Critical 国立大学法人三重大学
Priority to JP2013537578A priority Critical patent/JP6053688B2/ja
Priority to EP12838701.6A priority patent/EP2765193B1/en
Priority to US14/349,763 priority patent/US9175308B2/en
Priority to KR1020147010498A priority patent/KR101956751B1/ko
Priority to CN201280060330.9A priority patent/CN104126009B/zh
Publication of WO2013051718A1 publication Critical patent/WO2013051718A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
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    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
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    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid encoding a chimeric antigen receptor and a cell expressing the chimeric antigen receptor, which are useful in the field of adoptive gene therapy for tumors.
  • TCR T cell receptor
  • a nucleic acid encoding a chimeric antigen receptor (CAR) having specificity for tumor cell surface antigen and T cell activation ability is introduced into T cells, and the resulting transgenic T.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • a typical CAR structure is composed of a single chain antibody (scFv) that recognizes the surface antigen of tumor cells, a transmembrane domain, and an intracellular domain of TCR complex CD3 ⁇ that activates T cells. .
  • the CAR having such a configuration is called a first generation CAR.
  • the gene of the single chain antibody part is isolated from, for example, a hybridoma that produces a monoclonal antibody that recognizes the target antigen.
  • CAR-expressing T cells directly recognize tumor cell surface antigens regardless of the expression of major histocompatibility antigen class I on tumor cells and simultaneously activate T cells to efficiently kill tumor cells. Is possible.
  • a second generation CAR in which the intracellular domain of CD28, which is a T cell costimulatory molecule, is linked has been developed.
  • a third-generation CAR in which intracellular domains derived from the tumor necrosis factor (TNF) receptor superfamily CD137 (4-1BB) or CD1 34 (OX40) are linked in tandem has also been developed.
  • TNF tumor necrosis factor
  • 4-1BB tumor necrosis factor receptor superfamily CD137
  • OF40 CD1 34
  • Non-Patent Document 2 Accordingly, there has been a need to find new costimulatory molecules that are effective when linked to CAR.
  • GITR Glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor
  • GITRL GITR ligand
  • An object of the present invention is to provide a nucleic acid encoding CAR that specifically binds to a target antigen and imparts high cytotoxic activity to the target cell to the cell, and a cell that expresses the CAR.
  • the inventors of the present invention expresses that cells expressing CAR having the intracellular domain of GITR specifically bind to the target antigen and are higher than the target cell.
  • the present invention has been completed by finding that it has a damaging activity.
  • a nucleic acid encoding CAR including an extracellular domain that binds to an antigen, a transmembrane domain, and at least one intracellular domain, wherein the CAR includes the intracellular domain of GITR as the intracellular domain.
  • the present invention provides a chimeric antigen receptor useful in the field of adoptive immunity gene therapy targeting an antigen such as a tumor antigen, a nucleic acid encoding the chimeric antigen receptor, and a cell expressing the chimeric antigen receptor.
  • the chimeric antigen receptor of the present invention has a high expression level in the introduced cells, and the introduced cells show high cytotoxic activity.
  • the anti-CEA (carcinoembryonic antigen) monoclonal antibody scFv is “CEA-scFv”
  • the hinge domain is “CD8 hinge”
  • the transmembrane domain of CD28 is “CD28 TM”
  • the intracellular domain of CD28 is “CD28 ICD (IntraCellular Domain)”
  • the CD3 ⁇ intracellular domain is represented as “CD3 ⁇ ”, the terminal repeat sequence as “LTR”, the splice donor sequence as “SD”, the splice acceptor sequence as “SA”, and the packaging signal sequence as “ ⁇ ”.
  • LTR terminal repeat sequence
  • SD the splice donor sequence
  • SA the splice acceptor sequence
  • packaging signal sequence as “ ⁇ ”.
  • the scFv of the antibody that binds to the antigen is “scFv”, the spacer domain is “Spacer domain”, the transmembrane domain of CD28 is “CD28 TM”, the intracellular domain of CD28 is “CD28 ICD”, and the transmembrane domain of GITR is “GITR” TM ”, the GITR intracellular domain is indicated as“ GITR ICD ”, and the CD3 ⁇ intracellular domain is indicated as“ CD3 ⁇ ”.
  • each CDR is (1) z, (2) 28z, (3) z28, (4) Gz, (5) zG, (6) 28Gz, (7) G28z, (8) zG28, (9) 28zG and (10) z28G are abbreviated.
  • chimeric antigen receptor refers to a fusion protein comprising an extracellular domain that binds to an antigen, a transmembrane domain derived from a polypeptide different from the extracellular domain, and at least one intracellular domain. Indicates. “Chimeric antigen receptor (CAR)” is sometimes called “chimeric receptor”, “T-body”, “chimeric immune receptor (CIR)”.
  • An “extracellular domain that binds to an antigen” refers to any oligo or polypeptide that can bind to an antigen
  • an “intracellular domain” refers to a signal that results in the activation or inhibition of a biological process in the cell. By any oligo or polypeptide known to function as a transducing domain.
  • tumor antigen means a biomolecule having antigenicity that is newly expressed as cells become cancerous. Detection of tumor antigens, such as immunological detection, is useful for distinguishing cancerous cells from their mother cells.
  • the tumor antigen in the present invention is a tumor-specific antigen (antigen present only in tumor cells and not found in other normal cells), or a tumor-associated antigen (other organs / tissues or heterologous normal cells) Antigens, and antigens expressed during development and differentiation).
  • GITR glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor
  • single chain antibody means a single chain polypeptide derived from an antibody that retains the ability to bind to an antigen.
  • an antibody polypeptide formed by recombinant DNA technology and linking the Fv regions of immunoglobulin heavy chain (H chain) and light chain (L chain) fragments via a spacer sequence is exemplified.
  • Various methods for producing scFv are known, US Pat. No. 4,694,778, Science, 242 and 423-442 (1988), Nature, 334, 54454 (1989). Science, Vol. 242, pages 1038-1041 (1988).
  • domain refers to a region in a polypeptide that is folded (folded) into a specific structure independently of other regions.
  • the CAR of the present invention includes an extracellular domain that binds to an antigen in order from the N-terminal side, a transmembrane domain, and at least one intracellular domain, and includes an intracellular domain of GITR as the intracellular domain.
  • the CAR of the present invention has a high expression level in cells, the cell expressing the CAR of the present invention has a high cell growth rate and a high production amount of cytokines, and a high cytotoxicity to cells having antigens to which the CAR binds on the surface. Has activity.
  • Extracellular domain The “extracellular domain that binds to an antigen” used in the CAR of the present invention is a domain containing an oligo or polypeptide that can bind to a target antigen.
  • the binding domain, the ligand binding domain of the receptor is included. This domain confers specificity to cells that express CAR by binding to and interacting with antigens, such as those present on the cell surface.
  • Extracellular domains particularly useful in the present invention include antibodies (H and L chains), TCR variable regions (TCR ⁇ , TCR ⁇ , TCR ⁇ , TCR ⁇ ), CD8 ⁇ , CD8 ⁇ , CD11A, CD11B, CD11C, CD18, CD29, CD49A , CD49B, CD49D, CD49E, CD49F, CD61, CD41, or CD51. It may be effective to use the whole of these proteins, but in particular, domains that bind to antigens and ligands, such as antibody Fab fragments, antibody variable regions [H chain V region (VH) and L chain V region ( VL)] or the extracellular domain of the receptor can be used. In particular, scFv can be preferably used.
  • the extracellular domain of the CAR of the present invention may bind only to one type of antigen or ligand, or may be an extracellular domain that binds to two or more types of antigens or ligands.
  • the present invention includes both a CAR including one extracellular domain and a CAR including two or more extracellular domains.
  • the extracellular domain can be selected from an antibody that recognizes a target antigen or a molecule that interacts with the antigen.
  • antigens include, for example, viral antigens, bacterial (especially infectious bacterial) antigens, parasitic antigens, cell surface markers on target cells (eg, tumor antigens) and surface molecules of immune-related cells associated with a particular disease state.
  • retroviridae human immunodeficiency virus such as retroviridae, eg, HIV-1 and HIV-LP
  • picornaviridae eg, poliovirus, eg, poliovirus, hepatitis A virus
  • hepatitis C virus CAR Enterovirus, human coxsackie virus, rhinovirus, echovirus), rubella virus, coronavirus, vesicular stomatitis virus, rabies virus, ebola virus, parainfluenza virus, mumps virus, measles virus, respiratory syncytial virus, influenza virus, B Hepatitis B virus, parvovirus, adenoviridae, herpesviridae [Herpesviridae, eg type 1 and type 2 herpes simplex Binds to antigens derived from viruses (HSV), varicella-zoster virus, cytomegalovirus (CMV), herpes virus], Poxviridae (for example, variola virus, vaccinia virus, poxvirus), hepatitis C virus CAR is provided.
  • HSV herpesviridae
  • Herpesviridae eg type 1 and type 2 herpes simplex Binds to antigens
  • Staphylococcus species Streptococcus species, Escherichia coli species, Pseudomonas species and Salmonella species CAR
  • infectious bacteria such as Helicobacter pylori, Legionella pneumophilia, Mycobacterium sp.
  • infectious bacteria such as Helicobacter pylori, Legionella pneumophilia, Mycobacterium sp.
  • M. tuberculosis M. aviv.
  • M. kansaii, M. gordonea Staphylococcus aureus
  • Neisseria gonorhoea Neisseria meningitidis
  • Listeria genocide Listeria genocide.
  • Group streptococci B streptococci (Streptococcus agalactiae), Streptococcus pneumoniae (Streptococcus pneumoniae), CAR is provided that binds to antigens from tetanus (Clostridium tetani).
  • 5T4 alpha5 ⁇ 1-integrin, 707-AP, AFP, ART-4, B7H4, BAGE, ⁇ -catenin / m, Bcr-abl, MN / C IX antigen, CA125, CAMEL, CAP -1, CASP-8, CD4, CD19, CD20, CD22, CD25, CDC27 / m, CD30, CD33, CD52, CD56, CD80, CDK4 / m, CEA, CT, Cyp-B, DAM, EGFR, ErbB3, ELF2M , EMMPRIN, EpCam, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2 / new, HLA-A * 0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT (or hTRT), iCE, IGF-1R, L-2R, IL-5, KI
  • Intracellular domain used in the present invention is a molecule capable of transmitting a signal into a cell when an extracellular domain existing in the same molecule binds (interacts) with an antigen. It is.
  • the CAR of the present invention is characterized by including the intracellular domain of GITR as the intracellular domain.
  • the intracellular domain of GITR includes its variants that have the same function.
  • the term “mutant” means any variant containing one or several to several amino acid substitutions, deletions or additions, provided that the variant retains the original sequence. It retains substantially the same function.
  • the intracellular domain of GITR used in the present invention is exemplified by an intracellular domain containing amino acid numbers 193 to 241 (SEQ ID NO: 28) of GITR (NCBI RefSeq: NP_004186.1).
  • the CAR of the present invention can use an intracellular domain derived from another polypeptide in addition to the intracellular domain of GITR.
  • intracellular domains include cytoplasmic sequences derived from TCR complexes and costimulatory molecules, as well as any variants having the same function of those sequences.
  • the CAR of the present invention contains the primary cytoplasmic signaling sequence and / or the secondary cytoplasmic signaling sequence as an intracellular domain.
  • the primary cytoplasmic signaling sequence regulates the primary activation of the TCR complex.
  • Primary cytoplasmic signaling sequences that stimulate activation may include a signaling motif known as the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) [Nature, 338, 383-384 ( 1989)].
  • ITAM immunoreceptor tyrosine-based activation motif
  • primary cytoplasmic signaling sequences that act in a suppressive manner include a signaling motif known as an immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif (ITIM) [Journal of Immunology (J Immunol.), Vol. 162, No. 2, 897-902 (1999)].
  • ITAM immunoreceptor tyrosine-based activation motif
  • ITIM immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif
  • an intracellular domain having ITAM or ITIM can be used.
  • Intracellular domains having ITAM that can be used in the present invention include, for example, ITAM derived from CD3 ⁇ , FcR ⁇ , FcR ⁇ , CD3 ⁇ , CD3 ⁇ , CD3 ⁇ , CD5, CD22, CD79a, CD79b, and CD66d.
  • amino acid numbers 51 to 164 (SEQ ID NO: 26) of CD3 ⁇ (NCBI RefSeq: NP_932170.1), amino acid numbers 45 to 86 of Fc ⁇ RI ⁇ (NCBI RefSeq: NP_004097.1), Fc ⁇ RI ⁇ (NCBI RefSeq: NP_000130.1) )
  • Amino acid numbers 201 to 244 amino acid numbers 139 to 182 of CD3 ⁇ (NCBI RefSeq: NP — 0000643.1), amino acid numbers 128 to 171 of CD3 ⁇ (NCBI RefSeq: NP — 000723.1), and CD3 ⁇ (NCBI RefSeq: NP — 000724.1).
  • the amino acid number based on the amino acid sequence information of NCBI RefSeq ID and GenBank described in the present specification is a number to which the precursor of each protein (including the signal peptide sequence and the like) is added as a full length.
  • the intracellular domain containing the secondary cytoplasmic signaling sequence that can be used in the present invention includes, for example, sequences derived from CD2, CD4, CD5, CD8 ⁇ , CD8 ⁇ , CD28, CD134, CD137, ICOS, and CD154.
  • amino acid numbers 236 to 351 of CD2 (NCBI RefSeq: NP_001758.2), amino acid numbers 421 to 458 of CD4 (NCBI RefSeq: NP_000000607.1), amino acid numbers 402 of CD5 (NCBI RefSeq: NP_055022.2) -495, amino acid number 207-235 of CD8 ⁇ (NCBI RefSeq: NP_001759.3), amino acid number 196-210 of CD8 ⁇ (GenBank: AAA356641), amino acid number 181-220 of CD28 (NCBI RefSeq: NP_006130.1) SEQ ID NO: 25), amino acid numbers 214 to 255 of CD137 (4-1BB, NCBI RefSeq: NP_001552.2), CD134 (OX40, NC) BI RefSeq: NP_003318.1) amino acid numbers 241 to 277, ICOS (NCBI RefSeq: NP_036224.1)
  • the present invention includes a CAR including only the intracellular domain of GITR as an intracellular domain, and a CAR including one or a plurality of, for example, two or three intracellular domains in addition to the intracellular domain of GITR.
  • a CAR including the intracellular domain of GITR and the intracellular domain of CD3 ⁇ the intracellular domain of GITR, the intracellular domain of CD3 ⁇ and the CAR including the intracellular domain of CD28 are exemplified.
  • a CAR in which a plurality of intracellular domains of the same type are linked in tandem is also included in the present invention.
  • One embodiment of the present invention is a CAR in which the intracellular domain of GITR is arranged on the C-terminal side of the intracellular domain of CD3 ⁇ . That is, it is a CAR comprising an intracellular domain linked in the order of the intracellular domain of CD3 ⁇ and the intracellular domain of GITR from the N-terminal side. In addition to this CAR, an intracellular domain of CD28 is added.
  • a CAR containing an intracellular domain linked in the order of the intracellular domain of CD28, the intracellular domain of CD3 ⁇ , and the intracellular domain of GITR, N-terminal side A CAR comprising an intracellular domain linked in the order of the intracellular domain of CD3 ⁇ , the intracellular domain of GITR, and the intracellular domain of CD28 in this order is also included in the present invention.
  • a CAR in which the intracellular domain of GITR is arranged on the C-terminal side is also included in the present invention.
  • a CAR containing a plurality of intracellular domains can be linked by inserting an oligopeptide linker or a polypeptide linker between these intracellular domains.
  • a linker consisting of 2 to 10 amino acids in length can be used.
  • a linker having a glycine-serine continuous sequence can be used.
  • the CAR of the present invention includes a transmembrane domain.
  • the transmembrane domain may be derived from a natural polypeptide or may be artificially designed.
  • a transmembrane domain derived from a natural polypeptide can be obtained from any membrane-bound or transmembrane protein.
  • T cell receptor ⁇ , ⁇ chain, CD3 ⁇ chain, CD28, CD3 ⁇ , CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154 The transmembrane domain of GITR can be used.
  • transmembrane domains are polypeptides that mainly contain hydrophobic residues such as leucine and valine.
  • phenylalanine, tryptophan and valine triplets are preferably found at each end of the synthetic transmembrane domain.
  • a short oligopeptide linker or polypeptide linker for example a linker consisting of 2 to 10 amino acid sequences in length, can be placed between the transmembrane domain and the intracellular domain of (b) above.
  • a linker sequence having a glycine-serine continuous sequence can be used.
  • a transmembrane domain having a sequence of amino acid numbers 153 to 180 (SEQ ID NO: 24) of CD28 (NCBI RefSeq: NP_006130.1) can be used.
  • a transmembrane domain having a sequence of amino acid numbers 162 to 183 (SEQ ID NO: 27) of GITR (NCBI RefSeq: NP_004186.1) can be used.
  • the CAR of the present invention can arrange a spacer domain between the extracellular domain and the transmembrane domain, or between the intracellular domain and the transmembrane domain.
  • the spacer domain means any oligopeptide or polypeptide that serves to link the transmembrane domain and extracellular domain and / or the transmembrane domain and intracellular domain.
  • the spacer domain comprises up to 300 amino acids, preferably 10-100 amino acids, most preferably 25-50 amino acids.
  • the spacer domain is preferably a sequence that promotes the binding of CAR to an antigen and enhances signal transduction into the cell.
  • Amino acids that are expected to promote binding are exemplified by cysteine, charged amino acids or amino acids such as serine or threonine within potential glycosylation sites and can be used as amino acids that constitute the spacer domain.
  • the spacer domains are amino acid numbers 118 to 178 (SEQ ID NO: 23) which are hinge regions of CD8 ⁇ (NCBI RefSeq: NP_001759.3), amino acid numbers 135 to 195 of CD8 ⁇ (GenBank: AAA3565641), CD4 (NCBI RefSeq: NP — 000607). .1) amino acid numbers 315 to 396 or CD28 (NCBI RefSeq: NP — 006130.1) amino acid numbers 137 to 152 may be used in whole or in part.
  • a part of the constant region of the antibody H chain or L chain (CH1 region or CL region, for example, a peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 34) can also be used as the spacer domain. Furthermore, it may be an artificially synthesized sequence.
  • the CAR of the present invention can be designed to be a multimer, particularly a dimer.
  • CAR is multimerized (dimerized) by inserting cysteine into the spacer domain and / or transmembrane domain.
  • the CAR of the present invention can link a signal peptide sequence to the N-terminus.
  • the signal peptide sequence is present at the N-terminus of many secreted proteins and membrane proteins and has a length of 15 to 30 amino acids. Since many of the protein molecules exemplified above as intracellular domains have a signal peptide sequence, these signal peptides can be used as the signal peptide of the CAR of the present invention.
  • nucleic acid encoding CAR The present invention provides a nucleic acid encoding CAR described in (1) above.
  • the nucleic acid encoding CAR can be easily prepared from the identified CAR amino acid sequence by a conventional method. It is possible to obtain a base sequence encoding an amino acid sequence from NCBI RefSeq ID indicating the amino acid sequence of each domain described above or an Access number of GenBank, and perform standard molecular biological and / or chemical procedures. Can be used to produce the nucleic acids of the present invention. For example, a nucleic acid can be synthesized based on these base sequences, and a nucleic acid of the present invention can be prepared by combining DNA fragments obtained from a cDNA library using the polymerase chain reaction (PCR). Can do.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the nucleic acid of the present invention can be linked to another nucleic acid so that it can be expressed under the control of an appropriate promoter.
  • an appropriate promoter any of those that constitutively promote expression and those that are induced by drugs or the like (for example, tetracycline or doxorubicin) can be used.
  • a promoter or other regulatory element cooperating with the transcription start site for example, a nucleic acid containing an enhancer sequence or terminator sequence may be linked.
  • a gene that can serve as a marker for confirming the expression of the nucleic acid may be incorporated. .
  • the present invention provides a composition comprising the nucleic acid of the present invention as an active ingredient together with a pharmaceutically acceptable excipient.
  • suitable pharmaceutically acceptable excipients include, for example, phosphate buffered saline (eg, 0.01 M phosphate, 0.138 M NaCl, 0.0027 M KCl). PH 7.4), aqueous solutions containing mineral salts such as hydrochloride, hydrobromide, phosphate, sulfate, physiological saline, solutions such as glycol or ethanol, and acetate, propionate, malon Salts of organic acids such as acid salts and benzoates.
  • mineral salts such as hydrochloride, hydrobromide, phosphate, sulfate, physiological saline, solutions such as glycol or ethanol, and acetate, propionate, malon Salts of organic acids such as acid salts and benzoates.
  • Adjuvants such as wetting or emulsifying agents and pH buffering agents can also be used.
  • pharmaceutically acceptable excipients those described in Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., NJ 1991) (part of which is incorporated herein by reference) are used as appropriate. it can.
  • the composition can be in a known form suitable for parenteral administration, eg, injection or infusion.
  • formulation adjuvants such as suspending agents, preservatives, stabilizers and / or dispersants, preservatives can be used to extend the shelf life during storage.
  • the composition may be in dry form for reconstitution with a suitable sterile liquid prior to use.
  • DNA can be coated on particles such as microscopic gold particles.
  • the nucleic acid of the present invention is a substance that promotes the transfer of the nucleic acid to the cell in addition to the above-mentioned excipients, for example, a nucleic acid such as a liposome or cationic lipid You may combine with the reagent for introduction.
  • a vector carrying the nucleic acid of the present invention is also useful.
  • a composition in a form suitable for administration to a living body, which contains the nucleic acid of the present invention held in an appropriate vector is suitable for in vivo gene therapy.
  • composition containing the nucleic acid of the present invention as an active ingredient depends on the antigen to which the CAR encoded by the nucleic acid binds.
  • cancer blood cancer (leukemia), solid tumor, etc.] inflammatory disease / self Administered to treat immune diseases (asthma, eczema), infectious diseases caused by hepatitis, viruses such as influenza and HIV, bacteria, and fungi, such as tuberculosis, MRSA, VRE, and deep mycosis can do.
  • a composition comprising the nucleic acid of the present invention as an active ingredient is not limited, but can be administered parenterally, for example, by injection or infusion, intradermal, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intraarterial, intravenous. Intratumoral, imported lymphatic vessels, etc.
  • Method for producing CAR-expressing cell comprises the step of introducing the nucleic acid encoding CAR described in (2) into a cell. .
  • This step is performed ex vivo.
  • it can be produced by transforming cells in vitro using a viral vector or non-viral vector containing the nucleic acid of the present invention.
  • mammals such as cells derived from humans or cells derived from non-human mammals such as monkeys, mice, rats, pigs, cows, and dogs can be used.
  • non-human mammals such as monkeys, mice, rats, pigs, cows, and dogs
  • Arbitrary cells can be used.
  • cells collected, isolated, purified and derived from blood peripheral blood, umbilical cord blood, etc.
  • body fluids such as bone marrow, tissues or organs can be used.
  • PBMC Peripheral blood mononuclear cells
  • immune cells dendritic cells, B cells, hematopoietic stem cells, macrophages, monocytes, NK cells or blood cells (neutrophils, basophils)]
  • cord blood mononuclear cells Fibroblasts, preadipocytes, hepatocytes, skin keratinocytes, mesenchymal stem cells, adipose stem cells, various cancer cell lines or neural stem cells
  • Fibroblasts preadipocytes
  • hepatocytes hepatocytes
  • skin keratinocytes mesenchymal stem cells
  • adipose stem cells various cancer cell lines or neural stem cells
  • T cells T cell progenitor cells (hematopoietic stem cells, lymphocyte progenitor cells, etc.) or cell populations containing these.
  • T cells include CD8 positive T cells, CD4 positive T cells, regulatory T cells, cytotoxic T cells, or tumor infiltrating lymphocytes.
  • Cell populations containing T cells and T cell progenitor cells include PBMC.
  • the cells may be collected from a living body, expanded and cultured, or established as a cell line. When it is desired to transplant a cell expressing the produced CAR or a cell differentiated from the cell into a living body, it is preferable to introduce a nucleic acid into the cell itself or a cell collected from the same kind of living body.
  • the nucleic acid encoding the CAR of the present invention can be inserted into a vector, and this vector can be introduced into cells.
  • retrovirus vectors including oncoretrovirus vectors, lentivirus vectors, pseudotype vectors
  • adenovirus vectors including oncoretrovirus vectors, lentivirus vectors, pseudotype vectors
  • AAV adeno-associated virus
  • simian virus vectors vaccinia virus vectors or Sendai virus vectors
  • Epstein-Bar Viral vectors such as viral (EBV) vectors and HSV vectors
  • ESV Epstein-Bar Viral vectors
  • those lacking replication ability are preferable so that they cannot self-replicate in infected cells.
  • liposomes and WO 96/10038 pamphlet, WO 97/18185 pamphlet, WO 97/25329 pamphlet, WO 97/30170 pamphlet and WO 97/31934 pamphlet (whichever In addition, non-viral vectors can also be used in the present invention in combination with condensing agents such as cationic lipids described in the specification by reference).
  • the nucleic acid of the present invention can be introduced into cells by calcium phosphate transfection, DEAE-dextran, electroporation, or particle bombardment.
  • retroviral particles when a retroviral vector is used, an appropriate packaging cell can be selected based on the LTR sequence and the packaging signal sequence possessed by the vector, and retroviral particles can be prepared and used. It can.
  • PG13 ATCC CRL-10686
  • PA317 ATCC CRL-9078
  • GP + E-86 and GP + envAm-12 US Pat. No. 5,278,056
  • Psi-Crip [American Academy of Sciences, Vol. 85, No. 6460-6464 (1988)] is exemplified.
  • Retroviral particles can also be produced using 293 cells or 293T cells with high transfection efficiency. Retrovirus vectors produced based on many types of retroviruses and packaging cells that can be used for packaging the vectors are widely available from various companies.
  • a functional substance that improves the introduction efficiency can also be used [for example, WO 95/26200 pamphlet, WO 00/01836 pamphlet (both of which are incorporated herein by reference) As part of the book)].
  • substances that improve the introduction efficiency include substances having an activity of binding to a viral vector, such as fibronectin or fibronectin fragments.
  • a fibronectin fragment having a heparin binding site for example, a fragment commercially available as RetroNectin (registered trademark, CH-296, manufactured by Takara Bio Inc.) can be used.
  • RetroNectin registered trademark, CH-296, manufactured by Takara Bio Inc.
  • polybrene, fibroblast growth factor, type V collagen, polylysine, or DEAE-dextran which is a synthetic polycation having an effect of improving the infection efficiency of retrovirus cells, can be used.
  • the functional substance is immobilized on a suitable solid phase, for example, a container (plate, petri dish, flask, bag or the like) used for cell culture or a carrier (microbeads or the like).
  • a suitable solid phase for example, a container (plate, petri dish, flask, bag or the like) used for cell culture or a carrier (microbeads or the like).
  • a container plate, petri dish, flask, bag or the like
  • a carrier microbeads or the like
  • the cell expressing the CAR of the present invention is a cell into which the nucleic acid encoding the CAR of (2) has been introduced and expressed by the production method of (3).
  • the cell of the present invention is activated by transmitting a signal into the cell by binding to a specific antigen via CAR.
  • the activation of cells that express CAR varies depending on the type of host cell and the intracellular domain of CAR. For example, release of cytokines, improvement of cell proliferation rate, changes in cell surface molecules, etc. can be confirmed as indicators. . For example, the release of cytotoxic cytokines (tumor necrosis factor, lymphotoxin, etc.) from activated cells results in the destruction of target cells that express the antigen.
  • cytotoxic cytokines tumor necrosis factor, lymphotoxin, etc.
  • other immune cells such as B cells, dendritic cells, NK cells, macrophages and the like are stimulated by cytokine release and changes in cell surface molecules.
  • Cells expressing CAR can be used as a therapeutic agent for diseases.
  • the therapeutic agent contains a cell expressing CAR as an active ingredient, and may further contain an appropriate excipient.
  • the excipient include the above-described pharmaceutically acceptable excipients, various cell culture media, isotonic saline and the like described for the composition containing the nucleic acid of the present invention as an active ingredient.
  • the disease to which a cell expressing CAR is administered is not particularly limited as long as it is a disease sensitive to the cell.
  • cancer blood cancer (leukemia), solid tumor etc.
  • Antigens possessed by cells that are desired to be reduced or eliminated in the above diseases, that is, cells expressing the CAR of the present invention that bind to tumor antigens, viral antigens, bacterial antigens, etc. are administered for the treatment of these diseases .
  • the cell of the present invention can also be used for donor lymphocyte infusion for the purpose of bone marrow transplantation, prevention of infection after irradiation, and remission of relapsed leukemia.
  • a therapeutic agent containing CAR-expressing cells as an active ingredient is not limited, but is administered parenterally, for example, by injection or infusion, intradermal, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intraarterial, intravenous It can be administered into the body, into a tumor, or into an imported lymphatic vessel.
  • Example 1 Preparation of Anti-CEA-CAR Expression Vector First, PCR was performed using pMSCVneo (Clontech) as a template with the 3MSCV5 primer described in SEQ ID NO: 1 and the 3MSCV3 primer described in SEQ ID NO: 2 to amplify the MSCV3 ′ LTR site. The obtained amplified fragment was cleaved with restriction enzymes XhoI and EcoRI, and the pM vector [pM vector described in Gene Therapy Vol. 7, pages 797-804 (2000)] on the XhoI-EcoRI site. Cloning to prepare pMS-MC.
  • pMS3-MC is a 5 ′ LTR derived from MMLV in order from the 5 ′ end, SD derived from MMLV, ⁇ derived from MMLV, SA derived from human EF1 ⁇ gene, U3 region is derived from MSCV, and the remaining region is 3 ′ LTR derived from MMLV. including.
  • an artificially synthesized gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 (indicated as anti-CEA-28z-CAR in FIG. 1A) and an artificially synthesized gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 (FIG. In 1B, anti-CEA-z28-CAR) was prepared.
  • These artificially synthesized genes include the anti-CEA monoclonal antibody scFv (amino acid sequence is described in SEQ ID NO: 22) that binds to the cancer antigen CEA (CD8 ⁇ chain hinge domain).
  • CD28 transmembrane domain having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24, a CD28 intracellular domain having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25, and a CD3 ⁇ intracellular domain having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26 Encodes a chimeric protein.
  • the scFv of the anti-CEA monoclonal antibody is “CEA-scFv”
  • the hinge domain is “CD8 hinge”
  • the transmembrane domain is “CD28 TM”
  • intracellular domain of CD28 is “CD28 ICD (IntraCellular Domain)”, CD3 ⁇ .
  • the intracellular domain is represented as “CD3 ⁇ ”, the terminal repeat sequence as “LTR”, the splice donor sequence as “SD”, the splice acceptor sequence as “SA”, and the packaging signal sequence as “ ⁇ ”.
  • a nucleic acid fragment containing these artificially synthesized genes was cloned into a pMS3-MC vector digested with BglII-BamHI, and pMS3 expressing a CAR in which the CD28 intracellular domain is located N-terminal to the CD3 ⁇ intracellular domain
  • a CEA-28z-CAR vector was prepared.
  • a pMS3-CEA-z28-CAR vector expressing a CAR in which the CD3 ⁇ intracellular domain is located N-terminal to the CD28 intracellular domain was prepared.
  • Example 2 Preparation of CAR expression vector carrying GITR gene An artificially synthesized gene shown in SEQ ID NO: 5 was prepared. This artificially synthesized gene encodes a GITR transmembrane domain having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 27 and a GITR intracellular domain having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 28. Using this artificially synthesized gene as a template, PCR was performed using the 28TM-GF primer shown in SEQ ID NO: 6 and the Gz-R primer shown in SEQ ID NO: 7, and the amplified DNA fragment A was obtained as z PCR was performed using the GF primer and the G-MC-R primer shown in SEQ ID NO: 9 to obtain the amplified DNA fragment B.
  • the 28SD-GF primer shown in SEQ ID NO: 10 and the Gz shown in SEQ ID NO: 7 Amplification DNA fragment C was obtained by PCR using -R primer, and amplified DNA fragment D was obtained by performing PCR using hinge-GF primer shown in SEQ ID NO: 11 and G-28SD-R primer shown in SEQ ID NO: 12.
  • PCR was performed using the 28TM-R primer shown in SEQ ID NO: 14 and the z-F primer shown in SEQ ID NO: 15 using the pMS3-CEA-28z-CAR vector prepared in Example 1 as a template.
  • the amplified DNA fragment A was cloned into the amplification product thus obtained using In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit (Clontech) to prepare a pMS3-CEA-Gz-CAR vector.
  • PCR was performed using the pMS3-CEA-z28-CAR vector prepared in Example 1 as a template and the z-R primer shown in SEQ ID NO: 16 and the END-MC-F primer shown in SEQ ID NO: 17. .
  • the amplified DNA fragment B was cloned into the amplification product thus obtained to prepare a pMS3-CEA-zG-CAR vector.
  • the amino acid sequence of CEA-zG-CAR expressed by this vector is shown in SEQ ID NO: 29.
  • PCR was performed using the pSD3-CEA-28z-CAR vector as a template and the 28SD-R primer shown in SEQ ID NO: 18 and the z-F primer shown in SEQ ID NO: 15.
  • the amplified DNA fragment C was cloned into the amplification product thus obtained to prepare a pMS3-CEA-28Gz-CAR vector.
  • PCR was performed using the pMS3-CEA-28z-CAR vector as a template and the hinge-R primer shown in SEQ ID NO: 19 and the 28SD-F primer shown in SEQ ID NO: 20.
  • the amplified DNA fragment D was cloned into the amplification product thus obtained to prepare a pMS3-CEA-G28z-CAR vector.
  • PCR was performed using the pMS3-CEA-z28-CAR vector as a template and the z-R primer shown in SEQ ID NO: 16 and the 28SD-F2 primer shown in SEQ ID NO: 21.
  • the amplified DNA fragment E was cloned into the amplification product thus obtained to prepare a pMS3-CEA-zG28-CAR vector.
  • the amino acid sequence of CEA-zG28-CAR expressed by this vector is shown in SEQ ID NO: 30.
  • PCR was performed using the pMS3-CEA-28z-CAR vector as a template and the z-R primer shown in SEQ ID NO: 16 and the END-MC-F primer shown in SEQ ID NO: 17.
  • the amplified DNA fragment B was cloned into the amplification product thus obtained to prepare a pMS3-CEA-28zG-CAR vector.
  • the structure of CAR expressed by each prepared vector corresponds to structures (2) to (9) shown in FIG.
  • the pMS3-CEA-28z-CAR vector is (2) 28z
  • the pMS3-CEA-z28-CAR vector is (3) z28
  • the pMS3-CEA-Gz-CAR vector is (4) Gz
  • the CAR vector is (5) zG
  • the pMS3-CEA-28Gz-CAR vector is (6) 28Gz
  • the pMS3-CEA-G28z-CAR vector is (7) G28z
  • the pMS3-CEA-zG28-CAR vector is (8) zG28
  • the pMS3-CEA-28zG-CAR vector (9) expresses a CAR having the structure of 28zG.
  • Example 3 Preparation of Retrovirus Solution Escherichia coli JM109 was transformed with the plasmid vectors prepared in Examples 1 and 2 to obtain transformants. Plasmid DNAs retained by these transformants were purified using QIAGEN Plasmid Midi Kit (manufactured by Qiagen) and subjected to the following operations as transfection DNA. Each of the prepared DNAs for transfection and the pGP vector and pEeco vector contained in Retrovirus Packaging Kit Eco (manufactured by Takara Bio Inc.) were each transfected into 293T cells. This operation was performed according to the product protocol of the kit.
  • Retrovirus Packaging Kit Eco manufactured by Takara Bio Inc.
  • a supernatant containing ecotropic virus was obtained from each of the transduced cells obtained, and filtered through a 0.45 ⁇ m filter (Milex HV, manufactured by Millipore). Using this supernatant, ecotropic virus was infected to PG13 cells (ATCC CRL-10686) by a method using polybrene. The culture supernatant of the obtained cells was collected and filtered through a 0.45 ⁇ m filter to obtain an anti-CEA-CAR expression retrovirus solution.
  • Example 4 Infection of anti-CEA-CAR retrovirus to human PBMC 1
  • retronectin registered trademark, Takara Bio
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells isolated from human peripheral blood collected with informed consent.
  • anti-CEA-CAR-expressing PBMCs were prepared respectively by a standard method using the same method.
  • Three groups of PBMCs were prepared for each retrovirus solution, and infection was carried out using retrovirus solutions diluted in three stages of 2-fold, 4-fold and 8-fold.
  • Genomic DNA was extracted from cells 5 days after the second virus infection using FastPure DNA Kit (Takara Bio Inc.), Provide Copy Number Detection Prime Set, Human (Takara Bio Inc.) and Cycle PCR Core Kit (Takara Bio Inc.). was used to measure the number of retrovirus copies integrated into the genome.
  • CEA protein labeled with biotin-labeling kit-NH 2 was added to cells 3 days after the second virus infection, and then streptavidin-PE (phycoerythrin: manufactured by Becton Dickinson) ) And FITC-labeled anti-Human CD8 antibody (Becton Dickinson).
  • streptavidin-PE phycoerythrin: manufactured by Becton Dickinson
  • FITC-labeled anti-Human CD8 antibody Becton Dickinson
  • the average fluorescence intensity reflects the expression level of anti-CEA-CAR in anti-CEA-CAR positive cells. As a result, it was confirmed that the cell surface CAR was positive in any cell. In particular, (5) CEA-zG-infected cells had higher anti-CEA-CAR positive rates and average fluorescence intensity than (4) CEA-Gz-infected cells. For cells infected with (2) CEA-28z, (3) CEA-z28, and (5) CEA-zG, the anti-CEA-CAR positive rate (vertical axis) and the number of retroviral copies integrated into the genome are shown in FIG. Fig.
  • FIG. 4 shows the relationship between the horizontal axis and the average fluorescence intensity of PE derived from cells positive for biotin-labeled CEA protein (vertical axis) and the number of retrovirus copies incorporated into the genome (horizontal axis). Indicates.
  • PBMC introduced with anti-CEA-zG-CAR [(5) CEA-zG] is compared with other anti-CEA-CAR-introduced PBMC having no GITR intracellular domain. It was found that a high anti-CEA-CAR positive rate was obtained and that the expression level of anti-CEA-CAR was also high.
  • Example 5 Infection of anti-CEA-CAR retrovirus to human PBMC 2 Among the anti-CEA-CAR expression retrovirus solution prepared in Example 3, (2) CEA-28z was diluted 4-fold, 6-fold or 8-fold into human PBMC collected with informed consent. (5 ) CEA-zG diluted into stock solution, 2-fold, 4-fold dilution, (9) CEA-28zG or (8) CEA-zG28 diluted 2-fold, 4-fold, 8-fold, and RetroNectin (registered trademark, manufactured by Takara Bio Inc.) Anti-CEA-CAR-expressing PBMCs were each prepared by infection twice using the standard method used.
  • FIG. 5 shows the positive rate of anti-CEA-CAR
  • FIG. 6 shows the PE average fluorescence intensity of the positive cells.
  • the cells infected with (5) CEA-zG, (9) CEA-28zG and (8) zG28 are compared to (2) cells infected with CEA-28z, It was found that the proportion of cells expressing anti-CEA-CAR was high and the expression level of anti-CEA-CAR was also high.
  • CEA-positive cell line MKN-45 and CEA-negative cell line MKN-1 both available from RIKEN BioResource Center
  • Calsein-AM manufactured by Dojindo
  • Cytotoxic activity (%) 100 ⁇ (measured value of each well ⁇ measured value of low control) / (measured value of high control ⁇ measured value of low control)
  • CEA positive cell line MKN-45 cytotoxic activity by PBMC introduced with anti-CEA-CAR was observed in CEA positive cell line MKN-45.
  • CEA-zG-introduced PBMC (5) CEA-zG-introduced PBMC, (9) CEA-28zG-introduced PBMC, and (8) CEA-zG28-introduced PBMC have strong cytotoxic activity, and CAR having the intracellular domain of GITR treats cancer. Have been shown to be useful.
  • Example 6 Reconstruction of CEA-zG28 and preparation of retrovirus solution Since a frameshift was found in the coding region of the CD28 intracellular domain of CEA-zG28 used in Example 5, plasmid DNA with this frameshift repaired was used. It produced and refine
  • Example 7 Infection of anti-CEA-CAR retroviral vector to human PBMC 3
  • Human PBMC collected with informed consent were diluted with (8) CEA-zG28_r and (9) CEA-28zG prepared in Example 6 as stock solutions, diluted 2-fold, 4-fold, and 8-fold.
  • the number of virus copies integrated in the genome after infection with human PBMC, the number of virus copies integrated in the genome, the proportion of cells positive for anti-CEA-CAR in CD8-positive cells, and the average fluorescence intensity of PE were measured.
  • FIG. 8 shows the positive rate of anti-CEA-CAR with respect to the copy number
  • FIG. 9 shows the PE average fluorescence intensity with respect to the copy number.
  • (8) cells infected with CEA-zG28_r were confirmed to express anti-CEA-CAR.
  • each anti-CEA-CAR expressing cell having a relatively close retrovirus copy number 6 days after the second virus infection [(9) CEA-28zG: 2.22 copies, (8) CEA-zG28_r: 2.12 copies)
  • the cells were collected, and the cytotoxic activity against CEA positive cell line MKN-45 and CEA negative cell line MKN-1 was measured in the same manner as in Example 5. The result is shown in FIG. As shown in FIG. 10, in the CEA positive cell line MKN-45, the same cytotoxic activity was observed in any PBMC into which any anti-CEA-CAR was introduced.
  • Example 8 Infection of anti-CEA-CAR retroviral vector to human PBMC 4 (5) CEA-zG and (9) CEA-28zG prepared in Example 3 were diluted in stock solution, 2-fold, 4-fold dilution, 8-fold dilution, and (2) CEA-28z was diluted in stock solution, 2-fold, 4-fold. Diluted solutions diluted 8 times and 16 times were prepared. Human PBMCs collected with informed consent were infected twice by a standard method using these retroviral vector dilutions and RetroNectin (registered trademark) to prepare anti-CEA-CAR-expressing PBMCs, respectively. .
  • FIG. 11 shows the anti-CEA-CAR positive rate with respect to the copy number
  • FIG. 12 shows the PE average fluorescence intensity with respect to the copy number.
  • the ratio of cells expressing anti-CEA-CAR to the copy number is the same, and the average fluorescence intensity of PE relative to the copy number, ie, the expression level is (5) CEA-zG It was the highest.
  • cells were collected 6 days after the second virus infection, and intracellular cytokines were stained on a 96-well plate as follows.
  • a suspension obtained by suspending the anti-CEA-CAR-introduced PBMC in a medium containing the intracellular transport inhibitor Brefeldin A (manufactured by Sigma) to 1.0 ⁇ 10 6 cells / mL was added to each well of the plate. 100 ⁇ L was added. Further, 100 ⁇ L of a 1.0 ⁇ 10 6 cells / mL suspension of CEA positive cell line MKN-45 was added and co-cultured for 5 hours.
  • FIG. 13 shows the relationship of the IFN ⁇ -producing cell rate (vertical axis) to the retrovirus copy number (horizontal axis)
  • FIG. 14 shows the relationship of the PE average fluorescence intensity (vertical axis) to the retrovirus copy number (horizontal axis). Indicates.
  • the IFN ⁇ production rate is lower in (9) CEA-28zG than in (2) CEA-28z, but as shown in FIG. 14, (9) the amount of IFN ⁇ produced by CEA-28zG is (2) It was confirmed to be equivalent to CEA-28z. That is, the amount of IFN ⁇ produced in IFN ⁇ -producing cells was higher in (9) CEA-28zG-introduced cells.
  • FIG. 15 shows the relationship of the TNF ⁇ -producing cell rate (vertical axis) to the retrovirus copy number (horizontal axis)
  • FIG. 16 shows the APC average fluorescence intensity (vertical axis) against the retrovirus copy number (horizontal axis). (Axis) relationship.
  • the TNF ⁇ production rate is lower than (9) CEA-28zG than (2) CEA-28z
  • the amount of TNF ⁇ produced is (9) CEA-28zG Exceeded. That is, similar to IFN ⁇ , the amount of IFN ⁇ produced in TNF ⁇ -producing cells was high in (9) CEA-28zG-introduced cells. From the above, it was shown that cells with enhanced cytokine production ability can be produced by further mounting the intracellular domain of GITR on CAR having the intracellular domain of CD28.
  • Example 9 Production of Anti-EGFR-CAR Expression Retroviral Vector An artificially synthesized gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 31 was produced.
  • This artificially synthesized gene is EGFR-z, which is anti-EGFR-CAR, that is, a human IgG leader sequence having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 32, a cancer antigen EGFR (Epidmal Growth Factor having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 33) ScFv of anti-EGFR monoclonal antibody that binds to (Receptor), human IgG-LC (light chain constant region) domain having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 34, CD28 transmembrane domain having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24, sequence It encodes one molecule of a chimeric protein consisting of the CD3 ⁇ intracellular domain having the amino acid sequence set forth in No.
  • a nucleic acid fragment containing this artificially synthesized gene was cloned into a pMS3-MC vector digested with NotI-XhoI, and had only a CD3 ⁇ intracellular domain as an intracellular domain.
  • pMS3-EGFR-LC expressing EGFR-z -Z-CAR was prepared.
  • the CAR structure corresponds to (1) in FIG.
  • Example 10 Production of Anti-EGFR-CAR Expression Vector Equipped with GITR Gene Based on pMS3-EGFR-LC-z-CAR produced in Example 9, it has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 35 (2) EGFR- PMS3-EGFR-LC-28z-CAR expressing 28z was generated. Similarly, (5) pMS3-EGFR-LC-zG-CAR expressing EGFR-zG having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 36, and (9) EGFR-28zG having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 37.
  • Example 11 Preparation of Retrovirus Solution A virus solution was prepared from the plasmid vectors prepared in Examples 9 and 10 in the same manner as in Example 3. (1) EGFR-z, (2) EGFR-28z, (5) EGFR-zG, (9) EGFR-28zG, (10) EGFR-z28G, (7) EGFR- It was named G28z.
  • Example 12 Infection of Anti-EGFR-CAR Retroviral Vector to Human PBMC
  • Each virus solution prepared in Example 11 was added to human PBMC collected with informed consent, and the stock solution, 2 times, 4 times, 8 times After dilution, infection was carried out twice by a standard method using RetroNectin (registered trademark) to produce anti-EGFR-CAR-expressing PBMC.
  • RetroNectin registered trademark
  • Recombinant Human EGFR manufactured by Sino Biological
  • a biotin-labeled anti-His-tag antibody manufactured by Miltenyi Biotech
  • FIG. 17 shows the positive cell ratio of anti-EGFR-CAR with respect to the retrovirus copy number
  • FIG. 18 shows the average PE fluorescence intensity with respect to the retrovirus copy number. As shown in FIGS. 17 and 18, the expression of all anti-EGFR-CARs was confirmed.
  • Example 8 cells were collected 6 days after the second virus infection, and intracellular cytokines were stained in the same manner as in Example 8 except that the EGFR positive cell line Hela was used. Furthermore, in addition to IFN ⁇ and TNF ⁇ , staining of IL-2 with FITC-labeled anti-Human IL-2 (Becton Dickinson) was performed. Using a flow cytometer, the proportion of each cytokine-producing cell and the average fluorescence intensity of the fluorescent dye were measured for the stained cells. Average fluorescence intensity reflects the amount of IL-2, IFN ⁇ and TNF ⁇ intracellular cytokines in anti-CEA-CAR positive cells.
  • FIG. 19 shows the relationship of each cytokine-producing cell rate (vertical axis) to the retrovirus copy number (horizontal axis), and FIG. 20 shows the average fluorescence intensity (respective cytokine production amount) with respect to the retrovirus copy number (horizontal axis).
  • the (vertical axis) relationship is shown. As shown in FIGS. 19 and 20, it was confirmed that CAR loaded with the intracellular domain of GITR tends to have a high cytokine production amount relative to the CAR expression amount.
  • a CAR that specifically binds to a target antigen and imparts high cytotoxic activity to the target cell to the cell, a nucleic acid encoding the CAR, and a cell that expresses the CAR are provided.
  • These CARs, nucleic acids, and cells are useful in the field of adoptive immunity gene therapy targeting antigens such as tumor antigens.
  • SEQ ID NO: 1 3MSCV5 primer SEQ ID NO: 2: 3MSCV3 primer SEQ ID NO: 3: Anti CEA-28z-CAR fragment sequence SEQ ID NO: 4: Anti CEA-z28-CAR fragment sequence SEQ ID NO: 5: GITR transmembrane region and cytoplasmic domain coding sequence SEQ ID NO: 6: 28TM-GF primer SEQ ID NO: 7: GzR primer SEQ ID NO: 8: zGF primer SEQ ID NO: 9: G-MC-R primer SEQ ID NO: 10: 28SD-GF primer SEQ ID NO: 11: hinge-GF primer SEQ ID NO: 12: G-28SD-R primer SEQ ID NO: 13: G-28SD-R2 primer SEQ ID NO: 14: 28TM-R primer SEQ ID NO: 15: zF primer SEQ ID NO: 16: zR primer SEQ ID NO: 17: END-MC-F primer SEQ ID NO: 18: 28SD-R primer SEQ ID NO: 19: hinge-R primer

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Abstract

　抗原に結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び少なくとも１つの細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体であって、細胞内ドメインとしてグルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）の細胞内ドメインを含むことを特徴とするキメラ抗原受容体、当該キメラ抗原受容体をコードする核酸、当該キメラ抗原受容体を発現する細胞及び当該細胞を製造する方法が提供される。

Description

キメラ抗原受容体
　本発明は腫瘍に対する養子免疫遺伝子治療の分野において有用な、キメラ抗原受容体をコードする核酸及びキメラ抗原受容体を発現する細胞に関する。
　腫瘍に対する治療戦略として、特定の抗原に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子を任意のＴ細胞に導入することにより、目的の抗原を標的とするＴ細胞を作製することが期待できる。これに基づき、多くの腫瘍抗原、例えばＷＴ１、ＭＡＲＴ１、ｇｐ１００、ＣＥＡ、ＣＤ１９及びｍＨＡＧ　ＨＡ－２抗原を標的としたＴＣＲ遺伝子による養子免疫遺伝子治療が試みられている。
　腫瘍に対する新たな養子免疫遺伝子治療として、遺伝子改変Ｔ細胞療法が注目されている。この治療法は腫瘍細胞の表面抗原への特異性とＴ細胞の活性化能を有するキメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ　Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＣＡＲ）をコードする核酸をＴ細胞に導入し、得られた遺伝子導入Ｔ細胞を体外で増殖させて輸注する方法である。この方法は抗体医薬に比べて抗腫瘍効果がより強力で、効果もより長期間持続すると考えられており、その臨床効果に大いに期待がもたれている。
　代表的なＣＡＲの構造は、腫瘍細胞の表面抗原を認識する単鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　ｖａｒｉａｂｌｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ：ｓｃＦｖ）、膜貫通ドメインとＴ細胞を活性化させるＴＣＲ複合体ＣＤ３ζの細胞内ドメインから構成される。このような構成のＣＡＲは第一世代ＣＡＲと呼ばれている。単鎖抗体部分の遺伝子は、例えば標的とする抗原を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから単離される。ＣＡＲを発現するＴ細胞は、腫瘍細胞上の主要組織適合抗原クラスＩの発現とは無関係に腫瘍細胞の表面抗原を直接認識し、同時にＴ細胞を活性化することで、効率よく腫瘍細胞を殺傷することが可能である。
　第一世代ＣＡＲのＴ細胞活性化能を増強する目的で、Ｔ細胞の共刺激分子であるＣＤ２８の細胞内ドメインを連結した第二世代ＣＡＲが開発されている。さらなる改良型として、更に腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーであるＣＤ１３７（４－１ＢＢ）又はＣＤ１3４（ＯＸ４０）由来の細胞内ドメインをタンデムに連結した第三世代ＣＡＲも開発され、様々な腫瘍抗原を標的とした多くのＣＡＲ分子が報告されている（非特許文献１）。しかしながら、現在報告されている第二世代及び第三世代ＣＡＲで細胞内ドメインとして使用されている共刺激分子は限られている。ＣＡＲに連結した際に、Ｔ細胞の共刺激分子由来の細胞内ドメインが一様に強くＴ細胞を刺激して標的とする腫瘍細胞を傷害するわけではないことが知られている。例えばＣＤ１３７由来の細胞内ドメインを連結した第二世代ＣＡＲは第一世代ＣＡＲと同程度の細胞傷害活性しか示さない、すなわち当該細胞内ドメインはＣＡＲの機能向上に効果が認められないことが報告されている（非特許文献２）。したがって、ＣＡＲに連結した時に有効な新たな共刺激分子を見出すことが求められていた。
　Ｔ細胞のサブセットである制御性Ｔ細胞において発現している遺伝子として見出されたグルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）は、細胞表面の膜貫通タンパク質受容体であり、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの一員である（非特許文献３）。ＧＩＴＲは、非活性化Ｔ細胞上に構成的に存在することが示されている。ＧＩＴＲは、ＧＩＴＲリガンド（以下ＧＩＴＲＬと記載する）と称される別の膜貫通タンパク質に結合する。ＧＩＴＲに対する作動性抗体は、制御性Ｔ細胞の免疫抑制活性を解除することが示されていることから、ＧＩＴＲＬはＧＩＴＲを介して制御性Ｔ細胞の活性を制御するという機能的な役割を果たしていることが示唆されている（非特許文献４参照）。
カレント　オピニオン　イン　イムノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第２１巻、第２１５－２２３頁（２００９） ザ　ジャーナル　オブ　イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第１７２巻、第１０４－１１３頁（２００４） イムノロジカル　レビューズ（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．）、第１８２巻、第１８－３２頁（２００１） イムニティ（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）、第１６巻、第３１１－３２３頁（２００２）
　本発明の目的は、標的とする抗原に特異的に結合し、標的とする細胞に対する高い細胞傷害活性を細胞に付与するＣＡＲをコードする核酸及び当該ＣＡＲを発現する細胞を提供することにある。
　本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、ＧＩＴＲの細胞内ドメインを有するＣＡＲを発現する細胞は標的とする抗原に特異的に結合し、標的とする細胞に対して高い細胞傷害活性を有することを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち本発明を概説すれば、
［１］　抗原に結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び少なくとも１つの細胞内ドメインを含むＣＡＲをコードする核酸であって、細胞内ドメインとしてＧＩＴＲの細胞内ドメインを含むことを特徴とするＣＡＲをコードする核酸、
［２］　抗原が腫瘍抗原である［１］記載のＣＡＲをコードする核酸、
［３］　抗原に結合する細胞外ドメインが抗原に結合する抗体の単鎖抗体である［１］記載のＣＡＲをコードする核酸、
［４］　細胞内ドメインとして更にＣＤ３ζ細胞内ドメインを含む［１］記載のＣＡＲをコードする核酸、
［５］　ＧＩＴＲの細胞内ドメインがＣＤ３ζ細胞内ドメインよりＣ末端側に配置される［４］記載のＣＡＲをコードする核酸、
［６］　抗原に結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び少なくとも１つの細胞内ドメインを含むＣＡＲであって、細胞内ドメインとしてＧＩＴＲの細胞内ドメインを含むことを特徴とするＣＡＲ、
［７］　抗原が腫瘍抗原である［６］記載のＣＡＲ、
［８］　抗原に結合する細胞外ドメインが抗原に結合する抗体の単鎖抗体である［６］記載のＣＡＲ、
［９］　細胞内ドメインとして更にＣＤ３ζ細胞内ドメインを含む［６］記載のＣＡＲ、
［１０］　ＧＩＴＲの細胞内ドメインがＣＤ３ζ細胞内ドメインよりＣ末端側に配置される［９］記載のＣＡＲ、
［１１］　［１］～［５］のいずれかに記載の核酸を細胞に導入する工程を含むＣＡＲ発現細胞の製造方法、
［１２］　細胞がＴ細胞又はＴ細胞を含有する細胞集団である［１１］記載のＣＡＲ発現細胞の製造方法、
［１３］　［１］～［５］のいずれかに記載の核酸が導入されたＣＡＲ発現細胞、
［１４］　細胞がＴ細胞又はＴ細胞を含有する細胞集団である［１３］記載のＣＡＲ発現細胞、に関する。
　本発明により、腫瘍抗原等の抗原を標的にした養子免疫遺伝子治療の分野において有用なキメラ抗原受容体、キメラ抗原受容体をコードする核酸及びキメラ抗原受容体を発現する細胞が提供される。本発明のキメラ抗原受容体は導入された細胞での発現量が高く、導入された細胞は高い細胞傷害活性を示す。
実施例で使用するＣＡＲの作製手順を示す図である。抗ＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ）モノクローナル抗体のｓｃＦｖを「ＣＥＡ－ｓｃＦｖ」、ヒンジドメインを「ＣＤ８　ｈｉｎｇｅ」、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを「ＣＤ２８　ＴＭ」、ＣＤ２８の細胞内ドメインを「ＣＤ２８　ＩＣＤ（ＩｎｔｒａＣｅｌｌｕｌａｒ　Ｄｏｍａｉｎ）」、ＣＤ３ζ細胞内ドメインを「ＣＤ３ζ」、末端反復配列を「ＬＴＲ」、スプライスドナー配列を「ＳＤ」、スプライスアクセプター配列を「ＳＡ」、パッケージングシグナル配列を「ψ」と表示する。 実施例で使用するＣＡＲの構造を示す図である。抗原に結合する抗体のｓｃＦｖを「ｓｃＦｖ」、スペーサードメインを「Ｓｐａｃｅｒ　ｄｏｍａｉｎ」、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを「ＣＤ２８　ＴＭ」、ＣＤ２８の細胞内ドメインを「ＣＤ２８　ＩＣＤ」、ＧＩＴＲの膜貫通ドメインを「ＧＩＴＲ　ＴＭ」、ＧＩＴＲ細胞内ドメインを「ＧＩＴＲ　ＩＣＤ」、ＣＤ３ζ細胞内ドメインを「ＣＤ３ζ」と示す。本明細書中、各ＣＤＲの構造を（１）ｚ、（２）２８ｚ、（３）ｚ２８、（４）Ｇｚ、（５）ｚＧ、（６）２８Ｇｚ、（７）Ｇ２８ｚ、（８）ｚＧ２８、（９）２８ｚＧ、および（１０）ｚ２８Ｇと略して表示する。 レトロウイルスコピー数に対する、ＣＡＲが導入された細胞にＣＥＡが結合する割合を示す図である。 レトロウイルスコピー数に対する、ＣＡＲが導入された細胞に結合する標識したＣＥＡの蛍光強度を示す図である。 ＣＡＲが導入された細胞にＣＥＡが結合する割合を示す図である。 ＣＡＲが導入された細胞に結合する標識したＣＥＡの蛍光強度を示す図である。 ＣＡＲが導入された細胞の細胞傷害活性を示す図である。 レトロウイルスコピー数に対する、ＣＡＲが導入された細胞にＣＥＡが結合する割合を示す図である。 レトロウイルスコピー数に対する、ＣＡＲが導入された細胞に結合する標識したＣＥＡの蛍光強度を示す図である。 ＣＡＲが導入された細胞の細胞傷害活性を示す図である。 レトロウイルスコピー数に対する、ＣＡＲが導入された細胞にＣＥＡが結合する割合を示す図である。 レトロウイルスコピー数に対する、ＣＡＲが導入された細胞に結合する標識したＣＥＡの蛍光強度を示す図である。 レトロウイルスコピー数に対する、サイトカインＩＦＮγを産生する細胞の割合を示す図である。 レトロウイルスコピー数に対する、サイトカインＩＦＮγの産生量を示す図である。 レトロウイルスコピー数に対する、サイトカインＴＮＦαを産生する細胞の割合を示す図である。 レトロウイルスコピー数に対する、サイトカインＴＮＦαの産生量を示す図である。 レトロウイルスコピー数に対する、ＣＡＲが導入された細胞にＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）が結合する割合を示す図である。 レトロウイルスコピー数に対する、ＣＡＲが導入された細胞に結合する標識したＥＧＦＲの蛍光強度を示す図である。 レトロウイルスコピー数に対する、サイトカインを産生する細胞の割合を示す図である。 レトロウイルスコピー数に対する、サイトカインの産生量を示す図である。
　本明細書において「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」とは、抗原に結合する細胞外ドメイン、前記細胞外ドメインとは異なるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン及び少なくとも１つの細胞内ドメインを含む融合タンパク質を示す。「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、「キメラ受容体」、「Ｔ－ｂｏｄｙ」、「キメラ免疫受容体（ＣＩＲ）」と呼ばれることがある。「抗原に結合する細胞外ドメイン」は、ある抗原に結合することができる任意のオリゴ又はポリペプチドを示し、「細胞内ドメイン」は細胞内で生物学的プロセスの活性化又は阻害をもたらすシグナルを伝達するドメインとして機能することが知られている任意のオリゴ又はポリペプチドを意味する。
　本明細書において「腫瘍抗原」とは、細胞のがん化に伴って新たに発現が認められるようになる、抗原性を有する生体分子を意味する。腫瘍抗原の検出、例えば免疫学的な検出は、がん化した細胞とその母細胞の区別に有用である。本発明における腫瘍抗原は、腫瘍特異抗原（腫瘍細胞のみに存在し、他の正常細胞には見られない抗原）、又は腫瘍関連抗原（他の臓器・組織又は異種異系の正常細胞にも存在する抗原、発生・分化の途上において発現する抗原）を含む。
　本明細書において「グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）」とは、グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体ファミリー関連遺伝子（Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ＴＮＦ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｆａｍｉｌｙ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｇｅｎｅ）の産物であるタンパク質を示す。ＧＩＴＲは、細胞表面の膜貫通タンパク質受容体であり、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーの一員である。ＧＩＴＲは、非活性化Ｔ細胞上に構築的に存在することが示されており、ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）と称する別の膜貫通タンパク質に結合する。ＧＩＴＲのアミノ酸配列はＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ）：ＮＰ＿００４１８６．１、カレント　バイオロジー（Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．）、第９巻、第４号、第２１５－２１８頁（１９９９）に記載される。
　本明細書において「単鎖抗体（ｓｃＦｖ）」とは、抗原との結合能力を保持した、抗体由来の一本鎖ポリペプチドを意味する。例えば組換えＤＮＡ技術により形成され、スペーサー配列を介して免疫グロブリン重鎖（Ｈ鎖）及び軽鎖（Ｌ鎖）フラグメントのＦｖ領域を連結した抗体ポリペプチドが例示される。ｓｃＦｖの各種作製方法が公知であり、米国特許第４６９４７７８号公報、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２４２巻、第４２３－４４２頁（１９８８）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３３４巻、第５４４５４頁（１９８９）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２４２巻、第１０３８－１０４１頁（１９８８）に記載されている方法が挙げられる。
　本明細書において「ドメイン」とは、ポリペプチド内の一領域であって、他の領域とは独立して特定の構造に折りたたまれる（フォールディングされる）領域を意味する。
（１）本発明のＣＡＲ
　本発明のＣＡＲは、Ｎ末端側から順に抗原に結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び少なくとも１つの細胞内ドメインを含み、細胞内ドメインとしてＧＩＴＲの細胞内ドメインを含むことを特徴とする。本発明のＣＡＲは細胞での発現量が高く、本発明のＣＡＲを発現する細胞は細胞の増殖率、サイトカインの産生量が高く、ＣＡＲが結合する抗原を表面に有する細胞に対して高い細胞傷害活性を有する。
（ａ）細胞外ドメイン
　本発明のＣＡＲに使用される「抗原に結合する細胞外ドメイン」は、標的とする抗原に結合することができるオリゴ又はポリペプチドを含むドメインであり、例えば、抗体の抗原結合ドメイン、受容体のリガンド結合ドメインが含まれる。このドメインは、抗原、例えば細胞表面に存在する抗原と結合し、相互作用することによりＣＡＲを発現する細胞に特異性を付与する。本発明において特に有用な細胞外ドメインとしては、抗体（Ｈ鎖及びＬ鎖）、ＴＣＲの可変領域（ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ）、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ１１Ｃ、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ４９Ａ、ＣＤ４９Ｂ、ＣＤ４９Ｄ、ＣＤ４９Ｅ、ＣＤ４９Ｆ、ＣＤ６１、ＣＤ４１、又はＣＤ５１に由来するものが例示される。これらのタンパク質全体を使用するのが有効なこともあるが、特に抗原やリガンドに結合するドメイン、例えば、抗体Ｆａｂフラグメント、抗体可変領域［Ｈ鎖のＶ領域（ＶＨ）及びＬ鎖のＶ領域（ＶＬ）］又は受容体の細胞外ドメインを使用することができる。特にｓｃＦｖが好適に使用できる。
　本発明のＣＡＲの細胞外ドメインは、１種類の抗原又はリガンドにのみ結合するものでもよく、２種以上の抗原又はリガンドに結合する細胞外ドメインでもよい。また、本発明には、１つの細胞外ドメインを含むＣＡＲ及び２つ以上の細胞外ドメインを含むＣＡＲのいずれもが含まれる。
　細胞外ドメインは、標的とする抗原を認識する抗体又は前記抗原と相互作用する分子から選択することができる。この抗原は例えば、ウイルス抗原、細菌（特に感染性細菌）抗原、寄生虫抗原、特定の病状に関係した標的細胞上の細胞表面マーカー（例えば腫瘍抗原）や免疫関連細胞の表面分子を包含する。
　本発明の一つの態様として、例えばレトロウイルス科（ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、例えば、ＨＩＶ－１及びＨＩＶ－ＬＰのような、ヒト免疫不全ウイルス）、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）、風疹ウイルス、コロナウイルス、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、ヘルペスウイルス科［Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、例えば、１型及び２型の単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス］、ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、例えば、痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）、Ｃ型肝炎ウイルスに由来する抗原に結合するＣＡＲが提供される。
　本発明の別の態様として、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）の菌種、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）の菌種、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の菌種及びサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の菌種に由来する抗原に結合するＣＡＲが含まれる。特に、感染性細菌、例えば、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉｓ）、レジオネラ・ニューモフィリア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ　ｓｐｓ）の菌種（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎｅａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ａ群連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｅｔａｎｉ）に由来する抗原に結合するＣＡＲが提供される。
　本発明の別の態様として、５Ｔ４、アルファ５β１－インテグリン、７０７－ＡＰ、ＡＦＰ、ＡＲＴ－４、Ｂ７Ｈ４、ＢＡＧＥ、β－カテニン／ｍ、Ｂｃｒ－ａｂｌ、ＭＮ／Ｃ ＩＸ抗原、ＣＡ１２５、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ－１、ＣＡＳＰ－８、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、ＣＴ、Ｃｙｐ－Ｂ、ＤＡＭ、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＥｐＣａｍ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ－Ｖ、Ｇｐ１００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ－２／ｎｅｗ、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１－Ｒ１７０Ｉ、ＨＰＶ－Ｅ７、ＨＳＰ７０－２Ｍ、ＨＳＴ－２、ｈＴＥＲＴ（又はｈＴＲＴ）、ｉＣＥ、ＩＧＦ－１Ｒ、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－５、ＫＩＡＡ０２０５、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ－１／ｍｅｌａｎ－Ａ、ＭＡＲＴ－２／Ｓｋｉ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ－１、ＭＵＭ－２、ＭＵＭ－３、ＮＡ８８－Ａ、ＰＡＰ、プロテイナーゼ－３、ｐ１９０マイナーｂｃｒ－ａｂｌ、Ｐｍｌ／ＲＡＲα、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１又はＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ－１又はＳＡＲＴ－３、サバイビン、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＧＦβ、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、ＶＥＧＦ、ＷＴ１、ＮＹ－Ｅｓｏ－１又はＮＹ－Ｅｓｏ－Ｂなどの腫瘍抗原に結合するＣＡＲが提供される。また、細胞表面接着分子、自己免疫疾患において出現する炎症細胞の表面分子、及び自己免疫を起こすＴＣＲに結合するＣＡＲも提供される。
（ｂ）細胞内ドメイン
　本発明に使用される細胞内ドメインは、同一分子内に存在する細胞外ドメインが抗原と結合（相互作用）した際に、細胞内にシグナルを伝達することが可能な分子である。
　本発明のＣＡＲは、細胞内ドメインとしてＧＩＴＲの細胞内ドメインを含むことを特徴とする。ＧＩＴＲの細胞内ドメインは、同一の機能を有するその変異体を含む。用語「変異体」は、１個又は数個～複数個のアミノ酸置換、欠失又は付加を含む任意の変異体を意味するが、ただし、当該変異体は元の配列が保持していたものと同一の機能を実質的に保持する。例えば、本発明に使用するＧＩＴＲの細胞内ドメインは、ＧＩＴＲ（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００４１８６．１）のアミノ酸番号１９３～２４１（配列番号２８）を含む細胞内ドメインが例示される。
　本発明のＣＡＲはＧＩＴＲの細胞内ドメインに加えて他のポリペプチドに由来する細胞内ドメインを使用することができる。このような細胞内ドメインは、ＴＣＲ複合体及び共刺激分子に由来する細胞質配列、並びにそれらの配列の同一の機能を有する任意の変異体が含まれる。
　ＴＣＲ複合体のみを介して発生されたシグナルはＴ細胞の活性化に不十分であること、及び二次又は共刺激シグナルも必要であることが知られている。天然のＴ細胞活性化は、２つの異なる種類の細胞質シグナル伝達配列、すなわちＴＣＲ複合体を介して抗原依存的一次活性化を開始させる配列（一次細胞質シグナル伝達配列）及び抗原非依存的に作用して二次又は共刺激シグナルを提供する配列（二次細胞質シグナル伝達配列）によって伝達されている。好適な態様において、本発明のＣＡＲは、細胞内ドメインとして、前記一次細胞質シグナル伝達配列及び／又は二次細胞質シグナル伝達配列を含む。
　一次細胞質シグナル伝達配列は、ＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。活性化を刺激する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）として知られるシグナル伝達モチーフを含むことがある［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３３８巻、第３８３－３８４頁（１９８９）］。一方、抑制的に作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）として知られるシグナル伝達モチーフを含む［ジャーナル　オブ　イムノロジー（Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第１６２巻、第２号、第８９７－９０２頁（１９９９）］。本発明には、ＩＴＡＭ又はＩＴＩＭを有する細胞内ドメインが使用できる。
　本発明で使用できるＩＴＡＭを有する細胞内ドメインは、例えば、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するＩＴＡＭを包含する。具体的には、ＣＤ３ζ（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿９３２１７０．１）のアミノ酸番号５１～１６４（配列番号２６）、ＦｃεＲＩγ（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００４０９７．１）のアミノ酸番号４５～８６、ＦｃεＲＩβ（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００１３０．１）のアミノ酸番号２０１～２４４、ＣＤ３γ（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００００６４．１）のアミノ酸番号１３９～１８２、ＣＤ３δ（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００７２３．１）のアミノ酸番号１２８～１７１、ＣＤ３ε（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００７２４．１）のアミノ酸番号１５３～２０７、ＣＤ５（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０５５０２２．２）のアミノ酸番号４０２～４９５、ＣＤ２２（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７６２．２）のアミノ酸番号７０７～８４７、ＣＤ７９ａ（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７７４．１）のアミノ酸番号１６６～２２６、ＣＤ７９ｂ（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００６１７．１）のアミノ酸番号１８２～２２９、ＣＤ６６ｄ（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１８０６．２）のアミノ酸番号１７７～２５２の配列を有するペプチド及びこれらと同一の機能を有するその変異体が挙げられる。なお、本明細書に記載するＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤやＧｅｎＢａｎｋのアミノ酸配列情報に基づくアミノ酸番号は、各タンパク質の前駆体（シグナルペプチド配列などを含む）を全長として付された番号である。
　本発明で使用できる二次細胞質シグナル伝達配列を含む細胞内ドメインには、例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、及びＣＤ１５４に由来する配列が含まれる。具体的には、ＣＤ２（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７５８．２）のアミノ酸番号２３６～３５１、ＣＤ４（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００６０７．１）のアミノ酸番号４２１～４５８、ＣＤ５（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０５５０２２．２）のアミノ酸番号４０２～４９５、ＣＤ８α（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７５９．３）のアミノ酸番号２０７～２３５、ＣＤ８β（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ３５６６４．１）のアミノ酸番号１９６～２１０、ＣＤ２８（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００６１３０．１）のアミノ酸番号１８１～２２０（配列番号２５）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ、ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１５５２．２）のアミノ酸番号２１４～２５５、ＣＤ１３４（ＯＸ４０、ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００３３１８．１）のアミノ酸番号２４１～２７７、ＩＣＯＳ（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０３６２２４．１）のアミノ酸番号１６６～１９９の配列を有するペプチド及びこれらと同一の機能を有するその変異体が挙げられる。
　本発明は、細胞内ドメインとしてＧＩＴＲの細胞内ドメインのみを含むＣＡＲ、ＧＩＴＲの細胞内ドメインの他に１つ又は複数、例えば２つ又は３つの細胞内ドメインを含むＣＡＲを含む。特に好適には、細胞内ドメインとして、ＧＩＴＲの細胞内ドメイン及びＣＤ３ζの細胞内ドメインを含むＣＡＲ、ＧＩＴＲの細胞内ドメイン、ＣＤ３ζの細胞内ドメイン及びＣＤ２８の細胞内ドメインを含むＣＡＲが例示される。同じ種類の細胞内ドメインを複数個タンデムに連結したＣＡＲも本発明に含まれる。本発明の一態様は、ＧＩＴＲの細胞内ドメインがＣＤ３ζの細胞内ドメインよりＣ末端側に配置されるＣＡＲである。すなわち、Ｎ末端側からＣＤ３ζの細胞内ドメイン、ＧＩＴＲの細胞内ドメインの順に連結された細胞内ドメインを含むＣＡＲである。このＣＡＲに更にＣＤ２８の細胞内ドメインを追加して、Ｎ末端側からＣＤ２８の細胞内ドメイン、ＣＤ３ζの細胞内ドメイン、ＧＩＴＲの細胞内ドメインの順に連結された細胞内ドメインを含むＣＡＲ、Ｎ末端側から順にＣＤ３ζの細胞内ドメイン、ＧＩＴＲの細胞内ドメイン、ＣＤ２８の細胞内ドメインの順に連結された細胞内ドメインを含むＣＡＲも本発明に含まれる。本発明の別の態様として、ＧＩＴＲの細胞内ドメインがＣ末端側に配置されるＣＡＲも本発明に含まれる。
　複数の細胞内ドメインを含むＣＡＲは、それらの細胞内ドメインの間にオリゴペプチドリンカー又はポリペプチドリンカーを挿入して連結することができる。好ましくは長さが２～１０個のアミノ酸からなるリンカーが使用できる。特にグリシン－セリン連続配列を有するリンカーを使用することができる。
（ｃ）膜貫通ドメイン及びスペーサードメイン
　本発明のＣＡＲは、膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは天然のポリペプチドに由来するものでもよく、人為的に設計したものでもよい。天然のポリペプチド由来の膜貫通ドメインは、任意の膜結合又は膜貫通タンパク質から取得することができる。例えば、Ｔ細胞受容体のα、β鎖、ＣＤ３ζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、ＧＩＴＲの膜貫通ドメインを使用することができる。また、人為的に設計された膜貫通ドメインは、ロイシン及びバリンなどの疎水性残基を主に含むポリペプチドである。また、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各末端に見出されることが好ましい。場合により、短いオリゴペプチドリンカー又はポリペプチドリンカー、例えば長さが２～１０個のアミノ酸配列からなるリンカーを、膜貫通ドメインと前記（ｂ）の細胞内ドメインとの間に配置することができる。特にグリシン－セリン連続配列を有するリンカー配列を使用することができる。
　本発明の一態様として、膜貫通ドメインはＣＤ２８（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００６１３０．１）のアミノ酸番号１５３～１８０（配列番号２４）の配列を有する膜貫通ドメインが使用できる。更に別の態様として、ＧＩＴＲ（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００４１８６．１）のアミノ酸番号１６２～１８３（配列番号２７）の配列を有する膜貫通ドメインが使用できる。
　本発明のＣＡＲは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間、又は細胞内ドメインと膜貫通ドメインの間に、スペーサードメインを配置することができる。スペーサードメインは、膜貫通ドメインと細胞外ドメイン及び／又は膜貫通ドメインと細胞内ドメインとを連結する働きをする任意のオリゴペプチド又はポリペプチドを意味する。スペーサードメインは、３００個までのアミノ酸、好ましくは１０～１００個のアミノ酸、最も好ましくは２５～５０個のアミノ酸を含む。
　スペーサードメインは、ＣＡＲと抗原の結合を促進し、細胞内へのシグナル伝達を亢進する配列であることが好ましい。結合を促進すると予想されるアミノ酸は、システイン、荷電アミノ酸又は潜在的なグリコシル化部位内のセリン又はスレオニンなどのアミノ酸が例示され、スペーサードメインを構成するアミノ酸として使用することができる。
　スペーサードメインは、ＣＤ８α（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７５９．３）のヒンジ領域であるアミノ酸番号１１８～１７８（配列番号２３）、ＣＤ８β（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ３５６６４．１）のアミノ酸番号１３５～１９５、ＣＤ４（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００６０７．１）のアミノ酸番号３１５～３９６、又はＣＤ２８（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００６１３０．１）のアミノ酸番号１３７～１５２の全部又は一部分を使用することができる。また、スペーサードメインは、抗体Ｈ鎖又はＬ鎖の定常領域の一部（ＣＨ１領域又はＣＬ領域、例えば配列番号３４に記載されるアミノ酸配列を有するペプチド）も使用することができる。さらに、人工的に合成した配列であってもよい。
　本発明のＣＡＲは、多量体、特に二量体となるよう設計することができる。例えば、スペーサードメイン及び／又は膜貫通ドメインにシステインを挿入することにより、ＣＡＲが多量体化（二量体化）される。
　更に、本発明のＣＡＲは、Ｎ末端にシグナルペプチド配列を連結することができる。シグナルペプチド配列は多くの分泌タンパク質、膜タンパク質のＮ末端に存在し、１５～３０アミノ酸の長さを有する。細胞内ドメインとして前記に例示したタンパク質分子の多くはシグナルペプチド配列を有していることから、これらのシグナルペプチドを本発明のＣＡＲのシグナルペプチドとして使用することができる。
（２）ＣＡＲをコードする核酸
　本発明は、前記（１）に記載するＣＡＲをコードする核酸を提供する。ＣＡＲをコードする核酸は、特定されたＣＡＲのアミノ酸配列から常法により容易に作製することができる。前記に記載した各ドメインのアミノ酸配列を示すＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤやＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号からアミノ酸配列をコードする塩基配列を取得することが可能であり、標準的な分子生物学的及び／又は化学的手順を用いて本発明の核酸を作製できる。例えば、これらの塩基配列をもとに、核酸を合成することができ、また、ｃＤＮＡライブラリーよりポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して得られるＤＮＡ断片を組み合わせて本発明の核酸を作製することができる。
　本発明の核酸は、適当なプロモーターの制御下に発現されるように別の核酸と連結することができる。プロモーターとしては構成的に発現を促進するもの、薬剤等（例えば、テトラサイクリン又はドキソルビシン）により誘導されるもの等のいずれも用いることができる。また、核酸の効率のよい転写を達成するために、プロモーター又は転写開始部位と協同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列又はターミネーター配列を含む核酸を連結してもよい。また、更に本発明の核酸に加えて、当該核酸の発現を確認するためのマーカーとなりうる遺伝子（例えば薬剤耐性遺伝子、レポーター酵素をコードする遺伝子、又は蛍光タンパク質をコードする遺伝子等）を組み込んでもよい。
　本発明は、本発明の核酸を活性成分として、薬学的に許容できる賦形剤と共に含む組成物を提供する。適している薬学的に許容できる賦形剤は、当業者にはよく知られており、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（例えば、０．０１Ｍリン酸塩、０．１３８Ｍ　ＮａＣｌ、０．００２７Ｍ　ＫＣｌ、ｐＨ７．４）、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩を含有する水溶液、生理食塩液、グリコール又はエタノールなどの溶液及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩を含む。湿潤剤又は乳化剤などの補助剤、及びｐＨ緩衝剤も使用することができる。薬学的に許容できる賦形剤としては、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ　Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．１９９１）（出典明示により本明細書の一部とする）に記載されるものを適宜使用できる。組成物は、非経口投与、例えば、注射又は注入に適した公知の形態とすることができる。更に、懸濁化剤、保存剤、安定化剤及び／又は分散剤などの製剤補助剤、保存中の有効期限を延ばすために保存剤を使用することができる。組成物は、使用前に適切な無菌の液体により再構成するための乾燥形態であってもよい。微粒子仲介投与用には、顕微鏡サイズの金粒子などの粒子上にＤＮＡをコーティングすることができる。
　本発明の核酸を生体外で細胞に導入する場合には、本発明の核酸は上記の賦形剤に加えて細胞への核酸の移行を促進する物質、例えばリポソーム、カチオニックリピドのような核酸導入用試薬と組み合わせてもよい。また、後述のように本発明の核酸を保持するベクターも有用である。特に、適切なベクターに保持された本発明の核酸を含有する、生体への投与に適した形態の組成物は、ｉｎ　ｖｉｖｏ遺伝子治療に好適である。
　本発明の核酸を活性成分として含む組成物は、該核酸がコードするＣＡＲが結合する抗原にもよるが、例えば、がん［血液がん（白血病）、固形腫瘍など］、炎症性疾患／自己免疫疾患（喘息、湿疹）、肝炎や、インフルエンザ、ＨＩＶなどのウイルス、細菌、真菌が原因となる感染性疾患、例えば結核、ＭＲＳＡ、ＶＲＥ、深在性真菌症等の疾患の治療のために投与することができる。本発明の核酸を活性成分として含む組成物は、限定するものではないが、非経口投与、例えば、注射又は注入により、皮内、筋肉内、皮下、腹腔内、鼻腔内、動脈内、静脈内、腫瘍内、又は輸入リンパ管内などに投与することができる。
（３）ＣＡＲを発現する細胞の製造方法
　本発明のＣＡＲを発現する細胞の製造方法は、前記（２）に記載するＣＡＲをコードする核酸を細胞に導入する工程を包含することを特徴とする。当該工程は生体外（ｅｘ　ｖｉｖｏ）で実施される。例えば、本発明の核酸を含むウイルスベクター又は非ウイルスベクターを利用して、細胞を生体外で形質転換することにより製造することができる。
　本発明の方法は、哺乳動物、例えばヒト由来の細胞又はサル、マウス、ラット、ブタ、ウシ、イヌ等の非ヒト哺乳動物由来の細胞が使用できる。本発明の方法に使用される細胞に特に限定はなく、任意の細胞を使用することができる。例えば、血液（末梢血、臍帯血など）、骨髄などの体液、組織又は器官より採取、単離、精製、誘導された細胞を使用することができる。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、免疫細胞［樹状細胞、Ｂ細胞、造血幹細胞、マクロファージ、単球、ＮＫ細胞又は血球系細胞（好中球、好塩基球）］、臍帯血単核球、線維芽細胞、前駆脂肪細胞、肝細胞、皮膚角化細胞、間葉系幹細胞、脂肪幹細胞、各種がん細胞株又は神経幹細胞を使用することができる。本発明においては、特にＴ細胞、Ｔ細胞の前駆細胞（造血幹細胞、リンパ球前駆細胞等）又はこれらを含有する細胞集団の使用が好ましい。Ｔ細胞には、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、又は腫瘍浸潤リンパ球が含まれる。Ｔ細胞及びＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団には、ＰＢＭＣが含まれる。前記の細胞は生体より採取されたもの、それを拡大培養したもの又は細胞株として樹立されたもののいずれでもよい。製造されたＣＡＲを発現する細胞又は当該細胞より分化させた細胞を生体に移植することが望まれる場合には、その生体自身又は同種の生体から採取された細胞に核酸を導入することが好ましい。
　本発明のＣＡＲをコードする核酸をベクターに挿入して、このベクターを細胞に導入することができる。例えば、レトロウイルスベクター（オンコレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、シュードタイプベクターを包含する）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はセンダイウイルスベクター、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）ベクター、ＨＳＶベクターなどのウイルスベクターが使用できる。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。
　また、リポソーム及び国際公開第９６／１００３８号パンフレット、国際公開第９７／１８１８５号パンフレット、国際公開第９７／２５３２９号パンフレット、国際公開第９７／３０１７０号パンフレット及び国際公開第９７／３１９３４号パンフレット（いずれも、出典明示により本明細書の一部とする）に記載されている陽イオン脂質などの縮合剤との併用により、非ウイルスベクターも本発明に使用することができる。更に、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥ－デキストラン、エレクトロポレーション、パーティクルボンバードメントにより細胞に本発明の核酸を導入することができる。
　例えばレトロウイルスベクターを使用する場合、ベクターが有しているＬＴＲ配列及びパッケージングシグナル配列に基づいて適切なパッケージング細胞を選択し、これを使用してレトロウイルス粒子を調製して実施することができる。例えばＰＧ１３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１０６８６）、ＰＡ３１７（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－９０７８）、ＧＰ＋Ｅ－８６やＧＰ＋ｅｎｖＡｍ－１２（米国特許第５，２７８，０５６号公報）、Ｐｓｉ－Ｃｒｉｐ［米国科学アカデミー紀要、第８５巻、第６４６０－６４６４頁（１９８８）］のパッケージング細胞が例示される。また、トランスフェクション効率の高い２９３細胞や２９３Ｔ細胞を用いてレトロウイルス粒子を作製することもできる。多くの種類のレトロウイルスを基に製造されたレトロウイルスベクター及び当該ベクターのパッケージングに使用可能なパッケージング細胞は、各社より広く市販されている。
　核酸を細胞に導入する工程で、導入効率を向上させる機能性物質を用いることもできる［例えば、国際公開第９５／２６２００号パンフレット、国際公開第００／０１８３６号パンフレット（いずれも出典明示により本明細書の一部とする）］。導入効率を向上させる物質としては、ウイルスベクターに結合する活性を有する物質、例えばフィブロネクチン又はフィブロネクチンフラグメントなどの物質が挙げられる。好適には、ヘパリン結合部位を有するフィブロネクチンフラグメント、例えばレトロネクチン（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ、登録商標、ＣＨ－２９６、タカラバイオ社製）として市販されているフラグメントを用いることができる。また、レトロウイルスの細胞への感染効率を向上させる作用を有する合成ポリカチオンであるポリブレン、線維芽細胞増殖因子、Ｖ型コラーゲン、ポリリジン又はＤＥＡＥ－デキストランを使用することができる。
　本発明の好適な態様において、前記の機能性物質は適切な固相、例えば細胞培養に使用される容器（プレート、シャーレ、フラスコ又はバッグ等）又は担体（マイクロビーズ等）に固定化された状態で使用することができる。
（４）ＣＡＲを発現する細胞
　本発明のＣＡＲを発現する細胞は、前記（３）の製造方法により、前記（２）のＣＡＲをコードする核酸が導入・発現した細胞である。
　本発明の細胞は、ＣＡＲを介して特定の抗原との結合により細胞内にシグナルが伝達され、活性化される。ＣＡＲを発現する細胞の活性化は、宿主細胞の種類やＣＡＲの細胞内ドメインにより異なるが、例えば、サイトカインの放出、細胞増殖率の向上、細胞表面分子の変化等を指標として確認することができる。例えば、活性化された細胞からの細胞傷害性のサイトカイン（腫瘍壊死因子、リンホトキシンなど）の放出は、抗原を発現する標的細胞の破壊をもたらす。また、サイトカイン放出や細胞表面分子の変化により、他の免疫細胞、例えば、Ｂ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ等を刺激する。
　ＣＡＲを発現する細胞は疾患の治療剤として使用することができる。該治療剤は、ＣＡＲを発現する細胞を活性成分として含み、さらに、適当な賦形剤を含んでいてもよい。該賦形剤としては、例えば、本発明の核酸を活性成分として含む組成物に関して記載された上述の薬学的に許容できる賦形剤、種々の細胞培養培地、等張食塩水などが挙げられる。ＣＡＲを発現する細胞が投与される疾患としては、当該細胞に感受性を示す疾患であればよく特に限定はないが、例えば、がん［血液がん（白血病）、固形腫瘍など］、炎症性疾患／自己免疫疾患（喘息、湿疹）、肝炎や、インフルエンザ、ＨＩＶなどのウイルス、細菌、真菌が原因となる感染性疾患、例えば結核、ＭＲＳＡ、ＶＲＥ、深在性真菌症が例示される。前記の疾患において減少もしくは消失が望まれる細胞が有している抗原、すなわち腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原等に結合する本発明のＣＡＲを発現する細胞がこれら疾患の治療のために投与される。また、本発明の細胞は、骨髄移植や放射線照射後の感染症予防、再発白血病の寛解を目的としたドナーリンパ球輸注などにも利用できる。ＣＡＲを発現する細胞を活性成分として含む治療剤は、限定するものではないが、非経口投与、例えば、注射又は注入により、皮内、筋肉内、皮下、腹腔内、鼻腔内、動脈内、静脈内、腫瘍内、又は輸入リンパ管内などに投与することができる。
　以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
　また、本明細書に記載の操作のうち、基本的な操作については２００１年、コールド　スプリング　ハーバー　ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー　クローニング：ア　ラボラトリー　マニュアル第３版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　３ｒｄ　ｅｄ．）（出典明示により本明細書の一部とする）に記載の方法によった。
実施例１　抗ＣＥＡ－ＣＡＲ発現ベクターの作製
　まず、ｐＭＳＣＶｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型に配列番号１記載の３ＭＳＣＶ５プライマー及び配列番号２記載の３ＭＳＣＶ３プライマーでＰＣＲを行い、ＭＳＣＶ３’ＬＴＲ部位を増幅した。得られた増幅断片を制限酵素ＸｈｏＩとＥｃｏＲＩで切断し、ｐＭベクター［ジーン　セラピー（Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ）　第７巻、第７９７－８０４頁（２０００）に記載されているｐＭベクター］のＸｈｏＩ－ＥｃｏＲＩサイトにクローニングし、ｐＭＳ－ＭＣを作製した。更に、ｐＭＥＩ－５ベクター（タカラバイオ社製）を制限酵素ＭｌｕＩとＸｈｏＩにて切断し、ｐＭＳ－ＭＣのＭｌｕＩ－ＸｈｏＩサイトへ挿入し、ｐＭＳ３－ＭＣを作製した。ｐＭＳ３－ＭＣは、５’末端から順にＭＭＬＶ由来の５’ＬＴＲ、ＭＭＬＶ由来のＳＤ、ＭＭＬＶ由来のψ、ヒトＥＦ１α遺伝子由来のＳＡ、Ｕ３領域はＭＳＣＶ由来で残りの領域はＭＭＬＶ由来の３’ＬＴＲを含む。
　図１Ａ、Ｂに示すように、配列番号３に示す塩基配列の人工合成遺伝子（図１Ａ中、抗ＣＥＡ－２８ｚ－ＣＡＲと表記する）及び、配列番号４に示す塩基配列の人工合成遺伝子（図１Ｂ中、抗ＣＥＡ－ｚ２８－ＣＡＲと表記する）を作製した。これらの人工合成遺伝子は、がん抗原ＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ）と結合する抗ＣＥＡモノクローナル抗体のｓｃＦｖ（アミノ酸配列を配列番号２２に記載する）、配列番号２３に記載するアミノ酸配列を有するＣＤ８α鎖ヒンジドメイン、配列番号２４に記載するアミノ酸配列を有するＣＤ２８膜貫通ドメイン、配列番号２５に記載するアミノ酸配列を有するＣＤ２８細胞内ドメイン、配列番号２６に記載するアミノ酸配列を有するＣＤ３ζ細胞内ドメインから成る１分子のキメラタンパク質をコードする。図１において、抗ＣＥＡモノクローナル抗体のｓｃＦｖを「ＣＥＡ－ｓｃＦｖ」、ヒンジドメインを「ＣＤ８　ｈｉｎｇｅ」、膜貫通ドメインを「ＣＤ２８　ＴＭ」、ＣＤ２８の細胞内ドメインを「ＣＤ２８　ＩＣＤ（ＩｎｔｒａＣｅｌｌｕｌａｒ　Ｄｏｍａｉｎ）」、ＣＤ３ζ細胞内ドメインを「ＣＤ３ζ」、末端反復配列を「ＬＴＲ」、スプライスドナー配列を「ＳＤ」、スプライスアクセプター配列を「ＳＡ」、パッケージングシグナル配列を「ψ」と表示する。これらの人工合成遺伝子を含む核酸断片を、ＢｇｌＩＩ－ＢａｍＨＩにて消化したｐＭＳ３－ＭＣベクターにクローニングし、ＣＤ２８細胞内ドメインがＣＤ３ζ細胞内ドメインに対してＮ末端側に配置されるＣＡＲを発現するｐＭＳ３－ＣＥＡ－２８ｚ－ＣＡＲベクターを作製した。逆に、ＣＤ３ζ細胞内ドメインがＣＤ２８細胞内ドメインに対してＮ末端側に配置されるＣＡＲを発現するｐＭＳ３－ＣＥＡ－ｚ２８－ＣＡＲベクターを作製した。
実施例２　ＧＩＴＲ遺伝子を搭載したＣＡＲ発現ベクターの作製
　配列番号５に示す人工合成遺伝子を作製した。この人工合成遺伝子は配列番号２７に記載するアミノ酸配列を有するＧＩＴＲ膜貫通ドメイン及び配列番号２８に記載するアミノ酸配列を有するＧＩＴＲ細胞内ドメインをコードする。この人工合成遺伝子を鋳型とし、配列番号６に示す２８ＴＭ－Ｇ－Ｆプライマーと配列番号７に示すＧ－ｚ－Ｒプライマーを用いたＰＣＲを行って増幅ＤＮＡ断片Ａを、配列番号８に示すｚ－Ｇ－Ｆプライマーと配列番号９に示すＧ－ＭＣ－Ｒプライマーを用いたＰＣＲを行って増幅ＤＮＡ断片Ｂを、配列番号１０に示す２８ＳＤ－Ｇ－Ｆプライマーと配列番号７に示すＧ－ｚ－Ｒプライマーを用いたＰＣＲを行って増幅ＤＮＡ断片Ｃを、配列番号１１に示すｈｉｎｇｅ－Ｇ－Ｆプライマーと配列番号１２に示すＧ－２８ＳＤ－Ｒプライマーを用いたＰＣＲを行って増幅ＤＮＡ断片Ｄを、配列番号８に示すｚ－Ｇ－Ｆプライマーと配列番号１３に示すＧ－２８ＳＤ－Ｒ２プライマーを用いたＰＣＲを行って増幅ＤＮＡ断片Ｅをそれぞれ得た。
　実施例１で作製したｐＭＳ３－ＣＥＡ－２８ｚ－ＣＡＲベクターを鋳型とし、配列番号１４に示す２８ＴＭ－Ｒプライマーと配列番号１５に示すｚ－Ｆプライマーを用いたＰＣＲを行った。こうして得られた増幅産物に、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（クロンテック社製）を使用して増幅ＤＮＡ断片Ａをクローニングし、ｐＭＳ３－ＣＥＡ－Ｇｚ－ＣＡＲベクターを作製した。
　以下同様に、実施例１で作製したｐＭＳ３－ＣＥＡ－ｚ２８－ＣＡＲベクターを鋳型とし、配列番号１６に示すｚ－Ｒプライマーと配列番号１７に示すＥＮＤ－ＭＣ－Ｆプライマーを用いたＰＣＲを行った。こうして得られた増幅産物に増幅ＤＮＡ断片Ｂをクローニングし、ｐＭＳ３－ＣＥＡ－ｚＧ－ＣＡＲベクターを作製した。このベクターが発現するＣＥＡ－ｚＧ－ＣＡＲのアミノ酸配列を配列番号２９に示す。
　ｐＭＳ３－ＣＥＡ－２８ｚ－ＣＡＲベクターを鋳型とし、配列番号１８に示す２８ＳＤ－Ｒプライマーと配列番号１５に示すｚ－Ｆプライマーを用いたＰＣＲを行った。こうして得られた増幅産物に増幅ＤＮＡ断片Ｃをクローニングし、ｐＭＳ３－ＣＥＡ－２８Ｇｚ－ＣＡＲベクターを作製した。
　ｐＭＳ３－ＣＥＡ－２８ｚ－ＣＡＲベクターを鋳型とし、配列番号１９に示すｈｉｎｇｅ－Ｒプライマーと配列番号２０に示す２８ＳＤ－Ｆプライマーを用いたＰＣＲを行った。こうして得られた増幅産物に増幅ＤＮＡ断片Ｄをクローニングし、ｐＭＳ３－ＣＥＡ－Ｇ２８ｚ－ＣＡＲベクターを作製した。
　ｐＭＳ３－ＣＥＡ－ｚ２８－ＣＡＲベクターを鋳型とし、配列番号１６に示すｚ－Ｒプライマーと配列番号２１に示す２８ＳＤ－Ｆ２プライマーを用いたＰＣＲを行った。こうして得られた増幅産物に増幅ＤＮＡ断片Ｅをクローニングし、ｐＭＳ３－ＣＥＡ－ｚＧ２８－ＣＡＲベクターを作製した。このベクターが発現するＣＥＡ－ｚＧ２８－ＣＡＲのアミノ酸配列を配列番号３０に示す。
　ｐＭＳ３－ＣＥＡ－２８ｚ－ＣＡＲベクターを鋳型とし、配列番号１６に示すｚ－Ｒプライマーと配列番号１７に示すＥＮＤ－ＭＣ－Ｆプライマーを用いたＰＣＲを行った。こうして得られた増幅産物に増幅ＤＮＡ断片Ｂをクローニングし、ｐＭＳ３－ＣＥＡ－２８ｚＧ－ＣＡＲベクターを作製した。
　作製した各ベクターが発現するＣＡＲの構造は、図２に示される構造（２）～（９）に対応する。すなわち、ｐＭＳ３－ＣＥＡ－２８ｚ－ＣＡＲベクターは（２）２８ｚ、ｐＭＳ３－ＣＥＡ－ｚ２８－ＣＡＲベクターは（３）ｚ２８、ｐＭＳ３－ＣＥＡ－Ｇｚ－ＣＡＲベクターは（４）Ｇｚ、ｐＭＳ３－ＣＥＡ－ｚＧ－ＣＡＲベクターは（５）ｚＧ、ｐＭＳ３－ＣＥＡ－２８Ｇｚ－ＣＡＲベクターは（６）２８Ｇｚ、ｐＭＳ３－ＣＥＡ－Ｇ２８ｚ－ＣＡＲベクターは（７）Ｇ２８ｚ、ｐＭＳ３－ＣＥＡ－ｚＧ２８－ＣＡＲベクターは（８）ｚＧ２８、ｐＭＳ３－ＣＥＡ－２８ｚＧ－ＣＡＲベクターは（９）２８ｚＧの構造を有するＣＡＲを発現する。
実施例３　レトロウイルス溶液の作製
　実施例１及び２で作製したプラスミドベクターにより大腸菌ＪＭ１０９をそれぞれ形質転換し、形質転換体を得た。これら形質転換体の保持するプラスミドＤＮＡをＱＩＡＧＥＮ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｄｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてそれぞれ精製し、トランスフェクション用ＤＮＡとして以下の操作に供した。
　調製したトランスフェクション用ＤＮＡのそれぞれとＲｅｔｏｒｏｖｉｒｕｓ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　Ｋｉｔ　Ｅｃｏ（タカラバイオ社製）に含有されるｐＧＰベクター、ｐＥｅｃｏベクターを２９３Ｔ細胞にそれぞれトランスフェクトした。この操作は前記キットの製品プロトコールに従って行った。得られた形質導入細胞のそれぞれよりエコトロピックウイルスを含有する上清液を獲得し、０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｅｘ　ＨＶ、ミリポア社製）にてろ過した。この上清を用いて、ポリブレンを使用する方法によりＰＧ１３細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１０６８６）にエコトロピックウイルスを感染させた。得られた細胞の培養上清を回収し、０．４５μｍフィルターによりろ過し、抗ＣＥＡ－ＣＡＲ発現用レトロウイルス溶液とした。各ウイルスは発現するＣＡＲの構造からそれぞれ（２）ＣＥＡ－２８ｚ、（３）ＣＥＡ－ｚ２８、（４）ＣＥＡ－Ｇｚ、（５）ＣＥＡ－ｚＧ、（６）ＣＥＡ－２８Ｇｚ、（７）ＣＥＡ－Ｇ２８ｚ、（８）ＣＥＡ－ｚＧ２８、（９）ＣＥＡ－２８ｚＧと命名した。
実施例４　ヒトＰＢＭＣへの抗ＣＥＡ－ＣＡＲレトロウイルスの感染１
　インフォームドコンセントを得て採取されたヒト末梢血より分離した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に、実施例３で作製した各抗ＣＥＡ－ＣＡＲ発現用レトロウイルス溶液を、レトロネクチン（登録商標、タカラバイオ社製）を用いた標準的な方法で２回感染させ、抗ＣＥＡ－ＣＡＲ発現ＰＢＭＣをそれぞれ作製した。各レトロウイルス溶液について３群のＰＢＭＣを準備し、２倍、４倍、８倍の３段階に希釈したレトロウイルス溶液を用いて感染を実施した。２回目のウイルス感染から５日後の細胞よりＦａｓｔＰｕｒｅ　ＤＮＡ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、Ｐｒｏｖｉｒｕｓ　Ｃｏｐｙ　Ｎｕｍｂｅｒ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｓｅｔ，Ｈｕｍａｎ（タカラバイオ社製）とＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ　Ｃｏｒｅ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、ゲノムに組み込まれたレトロウイルスコピー数の測定を行った。
　また、２回目のウイルス感染から３日後の細胞にＢｉｏｔｉｎ－Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＮＨ２（同仁化学社製）によりビオチン標識したＣＥＡタンパク質を添加した後、ストレプトアビジン－ＰＥ（フィコエリスリン：ベクトンディッキンソン社製）及びＦＩＴＣ標識抗Ｈｕｍａｎ　ＣＤ８　抗体（ベクトンディッキンソン社製）により染色した。フローサイトメーターを使用し、染色後の細胞について、ＦＩＴＣ陽性細胞中のＰＥ陽性である細胞の割合、すなわちＣＤ８陽性細胞中のＣＥＡに結合するＣＡＲが陽性である細胞の割合を測定した。また、蛍光色素ＰＥの平均蛍光強度を測定した。平均蛍光強度は抗ＣＥＡ－ＣＡＲ陽性細胞における、抗ＣＥＡ－ＣＡＲの発現量を反映している。その結果、いずれの細胞においても細胞表面のＣＡＲが陽性であることを確認した。特に、（５）ＣＥＡ－ｚＧを感染させた細胞は（４）ＣＥＡ－Ｇｚを感染させた細胞に比べて抗ＣＥＡ－ＣＡＲの陽性率及び平均蛍光強度が高かった。（２）ＣＥＡ－２８ｚ、（３）ＣＥＡ－ｚ２８、（５）ＣＥＡ－ｚＧを感染させた細胞について、図３に抗ＣＥＡ－ＣＡＲ陽性率（縦軸）とゲノムに組み込まれたレトロウイルスコピー数（横軸）の関係を示し、図４にビオチン標識したＣＥＡタンパク質が陽性である細胞に由来するＰＥの平均蛍光強度（縦軸）とゲノムに組み込まれたレトロウイルスコピー数（横軸）の関係を示す。図３及び図４に示すように、抗ＣＥＡ－ｚＧ－ＣＡＲを導入したＰＢＭＣ［（５）ＣＥＡ－ｚＧ］は、ＧＩＴＲ細胞内ドメインを有していない他の抗ＣＥＡ－ＣＡＲ導入ＰＢＭＣと比べて、高い抗ＣＥＡ－ＣＡＲ陽性率が得られ、また、抗ＣＥＡ－ＣＡＲの発現量も高いことが分かった。
実施例５　ヒトＰＢＭＣへの抗ＣＥＡ－ＣＡＲレトロウイルスの感染２
　インフォームドコンセントを得て採取されたヒトＰＢＭＣに、実施例３で作製した抗ＣＥＡ－ＣＡＲ発現用レトロウイルス溶液のうち、（２）ＣＥＡ－２８ｚを４倍、６倍、８倍希釈、（５）ＣＥＡ－ｚＧを原液、２倍、４倍希釈、（９）ＣＥＡ－２８ｚＧ又は（８）ＣＥＡ－ｚＧ２８を２倍、４倍、８倍希釈し、レトロネクチン（登録商標、タカラバイオ社製）を用いた標準的な方法で２回感染を行い、抗ＣＥＡ－ＣＡＲ発現ＰＢＭＣをそれぞれ作製した。２回目のウイルス感染６日後に細胞を回収し、実施例４と同様にしてゲノムに組み込まれたウイルスコピー数の測定を行った。比較的レトロウイルスコピー数の近い各抗ＣＥＡ－ＣＡＲ発現細胞［（２）ＣＥＡ－２８ｚ：０．２７コピー、（５）ＣＥＡ－ｚＧ：１．３コピー、（９）ＣＥＡ－２８ｚＧ：０．８１コピー、（８）ＣＥＡ－ｚＧ２８：０．６５コピー）を選び、実施例４と同様に染色した細胞について、ＣＤ８陽性細胞中の抗ＣＥＡ－ＣＡＲが陽性である細胞の割合及びＰＥの平均蛍光強度を測定した。図５に抗ＣＥＡ－ＣＡＲの陽性率を示し、図６に当該陽性細胞のＰＥ平均蛍光強度を示す。図５及び図６に示すように、（５）ＣＥＡ－ｚＧ、（９）ＣＥＡ－２８ｚＧ及び（８）ｚＧ２８を感染させた細胞は、（２）ＣＥＡ－２８ｚを感染させた細胞と比べて、抗ＣＥＡ－ＣＡＲを発現する細胞の割合が高く、また、抗ＣＥＡ－ＣＡＲの発現量も高いことが分かった。
　また、２回目のウイルス感染１１日後に細胞を回収し、９６－ｗｅｌｌプレートにてＣａｌｓｅｉｎ　ｒｅｌｅａｓｅ　ａｓｓａｙによって細胞傷害活性を測定した。Ｃａｌｓｅｉｎ－ＡＭ（同仁化学社製）を取り込ませたＣＥＡ陽性細胞株ＭＫＮ－４５及びＣＥＡ陰性細胞株ＭＫＮ－１（いずれも理研バイオリソースセンターから入手可能）を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した後、１ウェルあたり１００μＬ添加した。また、上記抗ＣＥＡ－ＣＡＲ導入ＰＢＭＣ及びコントロールとしてベクターを導入しなかったＰＢＭＣ（ＮＧＭＣ）を懸濁し、ＥＴ比が３０、１０、３、１となるように１００μＬ添加した。ＰＢＭＣの代わりに、Ｌｏｗ　ｃｏｎｔｒｏｌとして培地を、Ｈｉｇｈ　ｃｏｎｔｒｏｌとして０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を１００μＬ添加するウェルを用意した。細胞及びコントロールを調製した後、９６－ｗｅｌｌプレートを５．０％ＣＯ２ガスで平衡化した３７℃　ＣＯ２インキュベーター中で４時間保温した。次いで、上清１００μＬについてλｅｘ＝４９０ｎｍ、λｅｍ＝５１５ｎｍにて蛍光強度を測定し、放出Ｃａｌｓｅｉｎ量を測定した。細胞傷害活性（Ｌｙｓｉｓ）を下式によって算出した結果を図７に示す。
　細胞傷害活性（％）＝１００×（各ウェルの測定値－Ｌｏｗ　ｃｏｎｔｒｏｌの測定値）／（Ｈｉｇｈ　ｃｏｎｔｒｏｌの測定値－Ｌｏｗ　ｃｏｎｔｒｏｌの測定値）
　図７に示すように、ＣＥＡ陽性細胞株ＭＫＮ－４５において抗ＣＥＡ－ＣＡＲを導入したＰＢＭＣによる細胞傷害活性が見られた。特に、（５）ＣＥＡ－ｚＧ導入ＰＢＭＣ、（９）ＣＥＡ－２８ｚＧ導入ＰＢＭＣ及び（８）ＣＥＡ－ｚＧ２８導入ＰＢＭＣで強い細胞傷害活性が得られ、ＧＩＴＲの細胞内ドメインを有するＣＡＲががんの処置において有用であることが示された。
実施例６　ＣＥＡ－ｚＧ２８の再作製、及び、レトロウイルス溶液の作製
　実施例５で使用したＣＥＡ－ｚＧ２８のＣＤ２８細胞内ドメインのコード領域にフレームシフトが見つかったため、このフレームシフトを修復したプラスミドＤＮＡを作製し、ＱＩＡＧＥＮ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｄｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。この精製プラスミドＤＮＡをトランスフェクション用ＤＮＡとして実施例３と同様の方法でウイルス溶液を調製した。得られたレトロウイルス溶液を（８）ＣＥＡ－ｚＧ２８＿ｒと命名した。
実施例７　ヒトＰＢＭＣへの抗ＣＥＡ－ＣＡＲレトロウイルスベクターの感染３
　インフォームドコンセントを得て採取されたヒトＰＢＭＣに、実施例６で作製した（８）ＣＥＡ－ｚＧ２８＿ｒ及び（９）ＣＥＡ－２８ｚＧを原液、２倍、４倍希釈、８倍希釈し、実施例４と同様にしてヒトＰＢＭＣに感染させた後、ゲノムに組み込まれたウイルスコピー数の測定と、ＣＤ８陽性細胞中の抗ＣＥＡ－ＣＡＲが陽性である細胞の割合及びＰＥの平均蛍光強度を測定した。図８にコピー数に対する抗ＣＥＡ－ＣＡＲの陽性率を示し、図９にコピー数に対するＰＥ平均蛍光強度を示す。図８及び図９に示すように、（８）ＣＥＡ－ｚＧ２８＿ｒを感染させた細胞は、抗ＣＥＡ－ＣＡＲを発現することを確認した。
　また、２回目のウイルス感染６日後に比較的レトロウイルスコピー数の近い各抗ＣＥＡ－ＣＡＲ発現細胞［（９）ＣＥＡ－２８ｚＧ：２．２２コピー、（８）ＣＥＡ－ｚＧ２８＿ｒ：２．１２コピー）を選び、細胞を回収し、実施例５と同様に、ＣＥＡ陽性細胞株ＭＫＮ－４５及びＣＥＡ陰性細胞株ＭＫＮ－１に対する細胞傷害活性を測定した。その結果を図１０に示す。図１０に示すように、ＣＥＡ陽性細胞株ＭＫＮ－４５において、いずれの抗ＣＥＡ－ＣＡＲを導入したＰＢＭＣでも同等の細胞傷害活性が見られた。
実施例８　ヒトＰＢＭＣへの抗ＣＥＡ－ＣＡＲレトロウイルスベクターの感染４
　実施例３で作製した（５）ＣＥＡ－ｚＧ及び（９）ＣＥＡ－２８ｚＧを原液、２倍、４倍希釈、８倍希釈した希釈液、（２）ＣＥＡ－２８ｚを原液、２倍、４倍、８倍、１６倍希釈した希釈液をそれぞれ調製した。インフォームドコンセントを得て採取されたヒトＰＢＭＣについて、これらのレトロウイルスベクター希釈液とレトロネクチン（登録商標）を用いた標準的な方法で２回感染を行い、抗ＣＥＡ－ＣＡＲ発現ＰＢＭＣをそれぞれ作製した。２回目のウイルス感染５日後に細胞を回収し、実施例４記載の方法によりゲノムに組み込まれたウイルスコピー数を測定するとともに、ＣＤ８陽性細胞中の抗ＣＥＡ－ＣＡＲが陽性である細胞の割合及びＰＥの平均蛍光強度を測定した。図１１にコピー数に対する抗ＣＥＡ－ＣＡＲの陽性率を示し、図１２にコピー数に対するＰＥ平均蛍光強度を示す。図１１及び図１２に示すように、コピー数に対する抗ＣＥＡ－ＣＡＲを発現する細胞の割合はいずれも同等であり、コピー数に対するＰＥの平均蛍光強度、すなわち発現量は（５）ＣＥＡ－ｚＧが最も高かった。
　また、２回目のウイルス感染６日後に細胞を回収し、９６－ｗｅｌｌプレートにて細胞内サイトカインの染色を以下の通り行った。細胞内輸送阻害剤ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ（シグマ社製）を含む培地で上記抗ＣＥＡ－ＣＡＲ導入ＰＢＭＣを１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した懸濁液を、前記プレートの１ウェルあたり１００μＬ添加した。さらに、ＣＥＡ陽性細胞株ＭＫＮ－４５の１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ懸濁液を１００μＬ添加し、５時間共培養させた。共培養させた細胞をＡＰＣｃｙ７標識抗Ｈｕｍａｎ　ＣＤ８　抗体（ベクトンディッキンソン社製）により染色した後、ＩｎｔｒａＰｒｅｐ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ベックマンコールター社製）処理を行い、ＰＥ標識抗Ｈｕｍａｎ　ＩＦＮγ　抗体（ベックマンコールター社製）及びＡＰＣ標識抗Ｈｕｍａｎ　ＴＮＦα　抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）により染色を行った。フローサイトメーターを使用し、染色後の細胞について、ＣＤ８陽性細胞中のＩＦＮγ産生細胞の割合と蛍光色素ＰＥの平均蛍光強度を測定し、また、ＣＤ８陽性細胞中のＴＮＦα産生細胞の割合と蛍光色素ＡＰＣの平均蛍光強度を測定した。平均蛍光強度は抗ＣＥＡ－ＣＡＲ陽性細胞におけるＩＦＮγ及びＴＮＦαの細胞内サイトカイン量を反映している。
　図１３にレトロウイルスのコピー数（横軸）に対する、ＩＦＮγ産生細胞率（縦軸）の関係を示し、図１４にレトロウイルスのコピー数（横軸）に対するＰＥ平均蛍光強度（縦軸）の関係を示す。図１３に示すように、ＩＦＮγ産生率は（２）ＣＥＡ－２８ｚに比べ（９）ＣＥＡ－２８ｚＧが低いにも関わらず、図１４に示すように、（９）ＣＥＡ－２８ｚＧのＩＦＮγ産生量は（２）ＣＥＡ－２８ｚと同等であることが確認された。すなわち、ＩＦＮγ産生細胞におけるＩＦＮγ産生量は（９）ＣＥＡ－２８ｚＧ導入細胞が高くなった。
　また、同様に図１５にレトロウイルスのコピー数（横軸）に対する、ＴＮＦα産生細胞率（縦軸）の関係を示し、図１６にレトロウイルスのコピー数（横軸）に対するＡＰＣ平均蛍光強度（縦軸）の関係を示す。図１５に示すように、ＴＮＦα産生率は（９）ＣＥＡ－２８ｚＧは（２）ＣＥＡ－２８ｚよりも下回るにも関わらず、図１６に示すように、ＴＮＦα産生量は（９）ＣＥＡ－２８ｚＧが上回った。すなわち、ＩＦＮγと同様に、ＴＮＦα産生細胞におけるＩＦＮγ産生量は（９）ＣＥＡ－２８ｚＧ導入細胞が高いという結果になった。
　以上より、ＣＤ２８の細胞内ドメインを有するＣＡＲにさらにＧＩＴＲの細胞内ドメインを搭載させることにより、サイトカイン産生能が増強された細胞を製造することが可能となることが示された。
実施例９　抗ＥＧＦＲ－ＣＡＲ発現レトロウイルスベクターの作製
　配列番号３１に示す塩基配列の人工合成遺伝子を作製した。この人工合成遺伝子は抗ＥＧＦＲ－ＣＡＲであるＥＧＦＲ－ｚ、すなわち、配列番号３２に記載するアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧリーダー配列、配列番号３３に記載するアミノ酸配列を有するがん抗原ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と結合する抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体のｓｃＦｖ、配列番号３４に記載するアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ－ＬＣ（軽鎖定常領域）ドメイン、配列番号２４に記載するアミノ酸配列を有するＣＤ２８膜貫通ドメイン、配列番号２６に記載するアミノ酸配列を有するＣＤ３ζ細胞内ドメインからなる１分子のキメラタンパク質をコードする。この人工合成遺伝子を含む核酸断片を、ＮｏｔＩ－ＸｈｏＩにて消化したｐＭＳ３－ＭＣベクターにクローニングし、細胞内ドメインとしてＣＤ３ζ細胞内ドメインのみを有する（１）ＥＧＦＲ－ｚを発現するｐＭＳ３－ＥＧＦＲ－ＬＣ－ｚ－ＣＡＲを作製した。なお、該ＣＡＲの構造は、図２中の（１）に対応する。
実施例１０　ＧＩＴＲ遺伝子を搭載した抗ＥＧＦＲ－ＣＡＲ発現ベクターの作製
　実施例９で作製したｐＭＳ３－ＥＧＦＲ－ＬＣ－ｚ－ＣＡＲを基に、配列番号３５に記載するアミノ酸配列を有する（２）ＥＧＦＲ－２８ｚを発現するｐＭＳ３－ＥＧＦＲ－ＬＣ－２８ｚ－ＣＡＲを作製した。以下同様に、配列番号３６に記載するアミノ酸配列を有する（５）ＥＧＦＲ－ｚＧを発現するｐＭＳ３－ＥＧＦＲ－ＬＣ－ｚＧ－ＣＡＲ、配列番号３７に記載するアミノ酸配列を有する（９）ＥＧＦＲ－２８ｚＧを発現するｐＭＳ３－ＥＧＦＲ－ＬＣ－２８ｚＧ－ＣＡＲ、配列番号３８に記載するアミノ酸配列を有する（１０）ＥＧＦＲ－ｚ２８Ｇを発現するｐＭＳ３－ＥＧＦＲ－ＬＣ－ｚ２８Ｇ－ＣＡＲ、配列番号３９に記載するアミノ酸配列を有する（７）ＥＧＦＲ－Ｇ２８ｚを発現するｐＭＳ３－ＥＧＦＲ－ＬＣ－Ｇ２８ｚ－ＣＡＲを作製した。なお、これらのＣＡＲの構造は、各々、図２中の（２）、（５）、（９）、（７）および（１０）に対応する。
実施例１１　レトロウイルス溶液の作製
　実施例９及び１０で作製したプラスミドベクターから、実施例３と同様の方法でウイルス溶液を調製した。各ウイルスは発現するＣＡＲの構造からそれぞれ（１）ＥＧＦＲ－ｚ、（２）ＥＧＦＲ－２８ｚ、（５）ＥＧＦＲ－ｚＧ、（９）ＥＧＦＲ－２８ｚＧ、（１０）ＥＧＦＲ－ｚ２８Ｇ、（７）ＥＧＦＲ－Ｇ２８ｚと命名した。
実施例１２　ヒトＰＢＭＣへの抗ＥＧＦＲ－ＣＡＲレトロウイルスベクターの感染
　インフォームドコンセントを得て採取されたヒトＰＢＭＣに、実施例１１で作製した各ウイルス溶液を、原液、２倍、４倍、８倍希釈し、レトロネクチン（登録商標）を用いた標準的な方法で２回感染を行い、抗ＥＧＦＲ－ＣＡＲ発現ＰＢＭＣをそれぞれ作製した。
　２回目のウイルス感染５日後の細胞に、Ｃ末端がＨｉｓ－ｔａｇ修飾されたＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＥＧＦＲ（Ｓｉｎｏ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製）を添加した後、ビオチン標識抗Ｈｉｓ－ｔａｇ抗体（ミルテニーバイオテク社製）を添加した。その後、ストレプトアビジン－ＰＥ（フィコエリスリン：ベクトンディッキンソン社製）及びＦＩＴＣ標識抗Ｈｕｍａｎ　ＣＤ８　抗体（ベクトンディッキンソン社製）により染色した。フローサイトメーターを使用し、染色後の細胞について、ＦＩＴＣ陽性細胞中のＰＥ陽性である細胞の割合、すなわちＣＤ８陽性細胞中のＥＧＦＲに結合するＣＡＲが陽性である細胞の割合を測定した。また、蛍光色素ＰＥの平均蛍光強度を測定した。さらに、２回目のウイルス感染５日後に細胞を回収し、実施例４と同様にしてゲノムに組み込まれたウイルスコピー数を測定した。図１７にレトロウイルスのコピー数に対する抗ＥＧＦＲ－ＣＡＲの陽性細胞率を示し、図１８にレトロウイルスのコピー数に対するＰＥ平均蛍光強度を示す。図１７及び図１８に示すように、全ての抗ＥＧＦＲ－ＣＡＲの発現が確認された。
　また、２回目のウイルス感染６日後に細胞を回収し、ＥＧＦＲ陽性細胞株Ｈｅｌａを使用する以外は実施例８と同様にして細胞内サイトカインの染色を行った。さらに、ＩＦＮγ及びＴＮＦαに加えて、ＦＩＴＣ標識抗Ｈｕｍａｎ　ＩＬ－２（べクトンディッキンソン社製）によるＩＬ－２の染色を行った。フローサイトメーターを使用し、染色後の細胞について、各サイトカインの産生細胞の割合と蛍光色素の平均蛍光強度を測定した。平均蛍光強度は抗ＣＥＡ－ＣＡＲ陽性細胞におけるＩＬ－２、ＩＦＮγ及びＴＮＦαの細胞内サイトカイン量を反映している。
　図１９にレトロウイルスのコピー数（横軸）に対する、各サイトカイン産生細胞率（縦軸）の関係を示し、図２０にレトロウイルスのコピー数（横軸）に対する平均蛍光強度（各サイトカイン産生量）（縦軸）の関係を示す。図１９、図２０に示すように、ＧＩＴＲの細胞内ドメインを搭載したＣＡＲは、ＣＡＲの発現量に対するサイトカイン産生量が高い傾向が確認された。
　本発明により、標的とする抗原に特異的に結合し、標的とする細胞に対する高い細胞傷害活性を細胞に付与するＣＡＲ、当該ＣＡＲをコードする核酸及び当該ＣＡＲを発現する細胞が提供される。これらのＣＡＲ、核酸、細胞は、腫瘍抗原等の抗原を標的にした養子免疫遺伝子治療の分野において有用である。
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Claims (14)

  1. 　抗原に結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び少なくとも１つの細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードする核酸であって、細胞内ドメインとしてグルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）の細胞内ドメインを含むことを特徴とするキメラ抗原受容体をコードする核酸。
  2. 　抗原が腫瘍抗原である請求項１記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸。
  3. 　抗原に結合する細胞外ドメインが抗原に結合する抗体の単鎖抗体である請求項１記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸。
  4. 　細胞内ドメインとして更にＣＤ３ζ細胞内ドメインを含む請求項１記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸。
  5. 　ＧＩＴＲの細胞内ドメインがＣＤ３ζ細胞内ドメインよりＣ末端側に配置される請求項４記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸。
  6. 　抗原に結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び少なくとも１つの細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体であって、細胞内ドメインとしてＧＩＴＲの細胞内ドメインを含むことを特徴とするキメラ抗原受容体。
  7. 　抗原が腫瘍抗原である請求項６記載のキメラ抗原受容体。
  8. 　抗原に結合する細胞外ドメインが抗原に結合する抗体の単鎖抗体である請求項６記載のキメラ抗原受容体。
  9. 　細胞内ドメインとして更にＣＤ３ζ細胞内ドメインを含む請求項６記載のキメラ抗原受容体。
  10. 　ＧＩＴＲの細胞内ドメインがＣＤ３ζ細胞内ドメインよりＣ末端側に配置される請求項９記載のキメラ抗原受容体。
  11. 　請求項１～５のいずれか１項記載の核酸を細胞に導入する工程を含むキメラ抗原受容体発現細胞の製造方法。
  12. 　細胞がＴ細胞又はＴ細胞を含有する細胞集団である請求項１１記載のキメラ抗原受容体発現細胞の製造方法。
  13. 　請求項１～５のいずれか１項記載の核酸が導入されたキメラ抗原受容体発現細胞。
  14. 　細胞がＴ細胞又はＴ細胞を含有する細胞集団である請求項１３記載のキメラ抗原受容体発現細胞。
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