PT1572744E

PT1572744E - Variantes de imunoglobulina e utilizações destas

Info

Publication number: PT1572744E
Application number: PT03813759T
Authority: PT
Inventors: Camellia W Adams; Henry B Lowman; Leonard G Presta; Craig W Crowley; Andrew C Chan; Gerald R Nakamura
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2002-12-16
Filing date: 2003-12-16
Publication date: 2010-09-07
Also published as: BRPI0316779B1; MA27704A1; CL2008003323A1; NO338402B1; ATE470675T1; JP2012044997A; AU2003301079C1; CA2507898A1; SI1572744T1; RS51318B; SG2013036975A; JP2006517399A; HUP0500954A2; HUE035898T2; EP1572744B1; IL214083A0; DK1572744T3; CN103833854A; US7799900B2; CY1110759T1

Description

ΕΡ 1 572 744/PT

DESCRIÇÃO "Variantes de imunoglobulina e utilizações destas"

CAMPO DO INVENTO 0 presente invento refere-se a anticorpos anti-CD20 e sua utilização no tratamento de doenças relacionadas com células B.

ANTECEDENTES DO INVENTO

Os linfócitos são uma das várias populações de glóbulos brancos; eles reconhecem especificamente e respondem a antigénios estranhos. As três principais classes de linfócitos são os linfócitos B (células B), os linfócitos T (células T) e as células assassinas naturais (NK) . Os linfócitos B são as células responsáveis pela produção de anticorpos e proporcionam imunidade humoral. As células B maturam dentro da medula óssea e deixam a medula expressando um anticorpo de ligação ao antigénio na sua superfície celular. Quando uma célula B ingénua encontra pela primeira vez o antigénio para o qual o seu anticorpo ligado à membrana é específico, a célula começa a dividir-se rapidamente e a sua descendência diferencia-se em células B de memória e células efectoras designadas "células plasmáticas". As células B de memória têm uma maior duração de vida e continuam a expressar o anticorpo ligado à membrana com a mesma especificidade que a célula parental original. As células plasmáticas não produzem anticorpo ligado à membrana mas em vez disso produzem a forma segregada do anticorpo. Os anticorpos segregados são as principais moléculas efectoras da imunidade humoral. 0 antigénio CD20 (também designado antigénio de diferenciação restrito a linfócitos B humanos, Bp35) é uma proteína transmembranar hidrófoba com um peso molecular de aproximadamente 35 kDa localizada em linfócitos pré-B e B maduros (Valentine et ai. , J. Biol. Chem. 264 (19): 11282-11287, 1989; e Einfeld et ai., EMBO J. 7(3): 711-717, 1988). 0 antigénio é também expresso em mais de 90% dos linfomas não-Hodgkin (LNH) de células B (Anderson et ai., Blood 63(6): 2

ΕΡ 1 572 744/PT 1424-1433, 1984), mas não se verifica em células estaminais hematopoiéticas, células pro-B, células plasmáticas normais ou outros tecidos normais (Tedder et al., J. Immunol. 135(2): 973-979, 1985) . Pensa-se que CD20 regula um ou mais passos iniciais no processo de activação para o início do ciclo celular e diferenciação (Tedder et al., supra) e possivelmente funciona como um canal do ião de cálcio (Tedder et al., J. Cell. Biochem. 14D: 195, 1990).

Dada a expressão de CD20 em linfomas de células B, este antigénio tem sido um alvo terapêutico útil para tratar tais linfomas. Existem mais de 300000 pessoas nos Estados Unidos com LNH de células B e mais de 56000 novos casos são diagnosticados cada ano. Por exemplo, o anticorpo rituximab (RITUXAN®) que é um anticorpo monoclonal quimérico murídeo/humano geneticamente concebido dirigido contra o antigénio CD20 humano (comercialmente disponível em Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia, U.S.) é utilizado para o tratamento de pacientes com linfoma não-Hodgkin de células B positivo para CD20 de baixo grau ou folicular, de relapso ou refractário. 0 Rituximab é o anticorpo referido como "C2B8" na Patente U.S. 5736137 concedida a 7 de Abril de 1998 (Anderson et al.) e na Patente U.S. 5776456. Estudos do mecanismo de acção in vitro demonstraram que RITUXAN® se liga ao complemento humano e lisa linhas de células B linfóides através de citotoxicidade dependente do complemento (CDC) (Reff et al., Blood 83(2): 435-445, 1994). Adicionalmente, tem actividade significativa em ensaios de citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). Estudos pré-clínicos in vivo mostraram que RITUXAN® elimina células B do sangue periférico, nódulos linfáticos, e medula óssea de Macaca fascicularis, presumivelmente através do complemento e de processos mediados por células (Reff et al., Blood 83 (2): 435-445, 1994). Outros anticorpos anti-CD20 indicados para o tratamento de LNH incluem o anticorpo de murídeo Zovalin™ que é ligado ao radioisótopo ítrio-90 (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA), tm ^ ,

Bexxar que e outro anticorpo totalmente de murídeo conjugado com 1-131 (Corixa, WA).

Uma das principais limitações na utilização de anticorpos de murídeo em terapia humana é a resposta de anticorpos humanos anti-ratinho (HAMA) (ver, p.ex., Miller, R.A. et al., 3 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ "Monoclonal antibody therapeutic trials in seven patients with T-cell lymphoma" Blood 62: 988-995, 1983; e Schroff, R.W., et al., "Human anti-murine immunoglobulin response in patients receiving monoclonal antibody therapy" Câncer Res. 45: 879- 885, 1985). US 5576195 descreve um anticorpo quimérico anti- CD20 com CDR representadas como SEQ ID NO: 4, 5, 6 e 10, 11 e 12 tal como aqui descrito. Até moléculas quiméricas, onde os domínios variáveis (V) de anticorpos de roedor são fundidos com regiões constantes humanas (C) , são ainda capazes de desencadear uma resposta imunitária significativa (HACA, anticorpo humano anti-quimérico) (Neuberger et al.r Nature (Lond.) 314: 268-270, 1985). Uma abordagem poderosa para superar estas limitações na utilização clínica de anticorpos monoclonais é a "humanização" do anticorpo de murídeo ou anticorpo de uma espécie não humana (Jones et al., Nature (Lond) 321: 522-525, 1986; Riechman et al., Nature (Lond) 332: 323-327, 1988).

Assim, é benéfico produzir anticorpos terapêuticos para o antigénio CD20 que criem uma antigenicidade mínima ou nenhuma antigenicidade quando administrados a pacientes, especialmente para tratamento crónico. O presente invento satisfaz estas e outras necessidades. O presente invento proporciona anticorpos anti-CD20 que superam as limitações das actuais composições terapêuticas bem como oferecem vantagens adicionais que serão aparentes a partir da descrição detalhada abaixo.

SUMÁRIO DO INVENTO O presente invento proporciona anticorpos de ligação anti-CD20 humanos ou fragmentos funcionais destes tal como expostos na reivindicação 1, e refere-se à sua utilização no tratamento de doenças associadas a células B. Estes anticorpos são anticorpos monoclonais. Os anticorpos anti-CD20 aqui descritos podem ainda compreender mudanças de resíduos de aminoácidos na região Fc que conduzem a uma melhor função efectora incluindo maior função de CDC e/ou ADCC e morte de células B (também aqui referida como eliminação de células B) . Os anticorpos anti-CD20 do presente invento incluem aqueles possuindo mudanças específicas que melhoram a estabilidade. Variantes humanizadas de 2H7 com maior estabilidade são 4

ΕΡ 1 572 744/PT descritas no exemplo 6 abaixo. Variantes deficientes em fucose possuindo melhor função de ADCC in vivo são aqui descritas.

Numa concretização preferida de todas as composições de anticorpos e métodos de utilização deste invento, o anticorpo de ligação a CD20 humanizado é 2H7.vl6 possuindo a sequência de aminoácidos da cadeia leve e pesada de SEQ ID NO: 21 e 22, respectivamente, tal como mostrado na FIG. 6 e FIG. 7. Quando nos referimos às sequências polipeptidicas das Figuras 6, 7 e 8, deve ser entendido que os primeiros 19 aminoácidos ou à volta disso que formam a sequência sinal secretora não estão presentes no polipéptido maduro. A região V de todas as outras variantes com base numa versão 16 terá as sequências de aminoácidos de vl6 excepto nas posições das substituições de aminoácidos que estão indicadas na divulgação. A menos que indicado em contrário, as variantes de 2H7 terão a mesma cadeia L que vl6. 0 presente invento proporciona um anticorpo humanizado que se liga ao CD20 humano, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio tal como exposto nas reivindicações, em que o anticorpo é eficaz a eliminar células B de primata in vivo. Numa concretização, as células B de primata são de humano e de Macaca fascicularis. 0 anticorpo do presente invento compreende a sequência de VH de SEQ ID NO: 8 de vl6, tal como mostrada na FIG. 1B e a sequência de VL de SEQ ID NO: 2 de vl6, tal como mostrado na FIG. IA.

Noutras concretizações, o anticorpo humanizado é 2H7.v31 possuindo a sequência de aminoácidos da cadeia leve e pesada de SEQ ID NO: 21 e 23, respectivamente, tal como mostradas na FIG. 6 e FIG. 8; possuindo 2H7.v31 a sequência de aminoácidos da cadeia pesada de SEQ ID NO:23 tal como mostrada na FIG. 8.

Em concretizações separadas, o anticorpo de qualquer uma das concretizações anteriores compreende ainda pelo menos uma substituição de aminoácidos na Região Fc que melhora a actividade de ADCC e/ou CDC em relação ao anticorpo original ou parental a partir do qual foi derivado, sendo v.16 o anticorpo parental comparado na maioria dos casos, e Rituxan 5 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ noutros casos. Um tal anticorpo com actividade melhorada compreende a tripla substituição de Alanina de S298A/E333A/K334A na região Fc. Um anticorpo possuindo a substituição S298A/E333A/K334A é 2H7.v31 possuindo a sequência de aminoácidos da cadeia pesada de SEQ ID NO:23.

Noutra concretização, o anticorpo compreende ainda pelo menos uma substituição de aminoácidos na região Fc que diminui a actividade de CDC em comparação com o anticorpo parental do qual foi derivado que é vl6 na maioria dos casos. Um tal anticorpo com menor actividade de CDC em comparação com vl6 compreende pelo menos a substituição K322A na cadeia Η. A comparação da actividade de ADCC e CDC pode ser ensaiada tal como descrito nos exemplos.

Numa concretização preferida, os anticorpos do presente invento são anticorpos inteiros em que a região VH é unida a uma região constante de cadeia pesada de IgG humana. Em concretizações preferidas, a IgG é IgGl ou IgG3 humana.

Numa concretização, o anticorpo de ligação a CD20 é conjugado com um agente citotóxico. Em concretizações preferidas o agente citotóxico é uma toxina ou um isótopo radioactivo.

Numa concretização, os anticorpos do presente invento para utilizar em fins terapêuticos ou de diagnóstico são produzidos em células CHO. E também proporcionada uma composição compreendendo um anticorpo de qualquer uma das concretizações anteriores e um transportador. Numa concretização, o transportador é um transportador farmaceuticamente aceitável. Estas composições podem ser proporcionadas num artigo de fabrico ou num estojo. 0 presente invento proporcionou também uma formulação liquida compreendendo um anticorpo 2H7 humanizado a 20 mg/ml de anticorpo, sulfato de histidina 10 mM pH 5,8, 60 mg/ml de sacarose (6%), 0,2 mg/ml de polissorbato 20 (0,02%). 0 presente invento proporciona também um ácido nucleico isolado que codifica qualquer um dos anticorpos aqui 6 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ divulgados, incluindo um vector de expressão para expressar o anticorpo.

Outro aspecto do presente invento é células hospedeiras compreendendo os ácidos nucleicos anteriores e células hospedeiras que produzem o anticorpo. Numa concretização preferida da última, a célula hospedeira é uma célula CHO. É proporcionado um método de produção destes anticorpos, compreendendo o método a cultura da célula hospedeira que produz o anticorpo e a recuperação do anticorpo a partir da cultura celular.

Ainda outro aspecto do presente invento é um artigo de fabrico compreendendo um recipiente e uma composição contida nele, em que a composição compreende um anticorpo de qualquer uma das concretizações anteriores. Para utilização em tratamento de LNH, o artigo de fabrico compreende ainda um folheto informativo indicando que a composição é utilizada para tratar linfoma não-Hodgkin.

Outro aspecto do presente invento refere-se a um método de indução de apoptose em células B in vivo, compreendendo o contacto de células B com o anticorpo de qualquer uma das anteriores, matando deste modo as células B. 0 presente invento refere-se também a métodos de tratamento das doenças aqui divulgadas através da administração de um anticorpo de ligação a CD20 ou seu fragmento funcional, a um mamífero tal como um paciente humano sofrendo da doença. Num método para tratamento de uma doença auto-imune ou um de um cancro positivo para CD20, o anticorpo pode ser 2H7.vl6 possuindo a sequência de aminoácidos da cadeia leve e pesada de SEQ ID NO: 21 e 22, respectivamente, tal como mostrado na FIG. 6 e FIG. 7. Assim, um método de tratamento de um cancro positivo para CD20 pode compreender a administração a um paciente sofrendo do cancro, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo de ligação a CD20 humanizado do presente invento. 0 cancro positivo para CD20 pode ser um linfoma ou leucemia de células B incluindo linfoma não-Hodgkin (LNH) ou doença de Hodgkin com predominância linfocitária (DHPL), leucemia linfocítica crónica (LLC) ou LLP. Num método de tratamento de um linfoma 7 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ ou leucemia de células B, o anticorpo pode ser administrado numa gama de dosagem de cerca de 2 75-3 75 mg/m2. 0 método de tratamento pode ainda compreender a administração ao paciente de pelo menos um agente quimioterapêutico, em que para linfoma não-Hodgkin (LNH), o agente quimioterapêutico é seleccionado de entre o grupo que consiste em doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina e prednisolona.

Um método de tratamento de uma doença auto-imune pode compreender a administração a um paciente sofrendo da doença auto-imune, de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo de ligação a CD20 humanizado de qualquer uma das reivindicações anteriores. A doença auto-imune é seleccionada de entre o grupo que consiste em artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, lúpus eritematoso sistémico (LES), doença de Wegener, doença inflamatória dos intestinos, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), púrpura trombocitopénica trombótica (PTT), trobocitopenia auto-imune, esclerose múltipla, psoríase, nefropatia de IgA, polineuropatias de IgM, miastenia grave, vasculite, diabetes mellitus, síndroma de Reynaud, síndroma de Sjorgen e glomerulonefrite. Quando a doença auto-imune é artrite reumatóide, o anticorpo pode ser administrado em conjunto com um segundo agente terapêutico que é de preferência metotrexato.

Nestes métodos de tratamento, os anticorpos de ligação a CD20 podem ser administrados sozinhos ou em conjunto com um segundo agente terapêutico tal como um segundo anticorpo, ou um agente quimioterapêutico ou agente imunossupressor. 0 segundo anticorpo pode ser um que se liga a CD20 ou a um antigénio diferente de células B, ou a um antigénio de células NK ou T. Numa concretização, o segundo anticorpo é um anticorpo anti-CD20 radiomarcado. Noutras concretizações, o anticorpo de ligação a CD20 é conjugado com um agente citotóxico incluindo uma toxina ou um isótopo radioactivo.

Noutro aspecto, o presente invento refere-se a um método de tratamento de uma doença auto-imune seleccionada de entre o grupo que consiste em Dermatomiosite, granulomatose de Wegener, ANCA, Anemia aplásica, anemia hemolítica auto-imune (AHAI), deficiência de factor VIII, hemofilia A, neutropenia auto-imune, síndroma de Castleman, síndroma de Goodpasture, 8 ΕΡ 1 572 744/PT rejeição de transplantes de órgãos sólidos, doença de enxerto versus hospedeiro (DEVH), púrpura trombocitopénica trombótica (PTT) mediada por IgM, Tiroidite de Hashimoto, hepatite auto-imune, pneumonite intersticial linfóide (VIH), bronquiolite obliterante (não transplante) vs. NSIP, Síndroma de Guillain-Barre, vasculite do vasos grandes, arterite da células gigantes (de Takayasu), vasculite do vasos médios, Doença de Kawasaki, poliarterite nodosa, compreendendo a administração a um paciente sofrendo da doença, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo de ligação a CD20. Numa concretização deste método, o anticorpo de ligação a CD20 é Rituxan®. É aqui descrito um ácido nucleico isolado compreendendo a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 24 de CD20 de Macaca fascicularis (mostrada na FIG. 19).

Um ácido nucleico isolado pode compreender uma sequência que codifica um polipéptido com as substituições de aminoácidos conservativas mostradas na FIG. 20. Um vector pode compreender o ácido nucleico anterior, incluindo um vector de expressão para expressão numa célula hospedeira. Uma célula hospedeira pode compreender o vector. É também descrito um polipéptido isolado compreendendo a sequência de aminoácidos [SEQ ID NO:25; FIG. 20] do CD20 de Macaca fascicularis.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A FIG. IA é um alinhamento de sequências comparando as sequências de aminoácidos do domínio variável da cadeia leve (VL) de cada 2H7 de murídeo (SEQ ID NO:l), variante 2H7.vl6 humanizada (SEQ ID NO:2), e cadeia leve capa humana subgrupo I (SEQ ID NO:3) . As CDR de VL de 2H7 e hu2H7.vl6 são como se segue: CDR1 (SEQ ID NO: 4), CDR2 (SEQ ID NO:5), e CDR3 (SEQ ID NO:6). A FIG. 1B é um alinhamento de sequências que compara as sequências de VH de 2H7 de murídeo (SEQ ID NO: 7), variante 2H7.vl6 humanizada (SEQ ID NO:8), e sequência de consenso humana da cadeia pesada subgrupo III (SEQ ID NO:9). As CDR de VH de 2H7 e hu2H7.vl6 são como se segue: CDR1 (SEQ ID NO:10), CDR2 (SEQ ID NO:ll), e CDR3 (SEQ ID NO:12). 9 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ

Na FIG. ΙΑ e FIG. 1B, a CDR1, CDR2 e CDR3 em cada cadeia estão dentro de parênteses, flanqueadas pelas regiões estruturais, FR1-FR4, tal como indicado. 2H7 refere-se ao anticorpo 2H7 de murideo. Os asteriscos entre duas filas de sequências indicam as posições que são diferentes entre as duas sequências. A numeração dos resíduos está de acordo com Kabat et al., "Sequences of Immunological Interest". 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health,

Bethesda, Md., 1991, com as inserções mostradas como a, b, c, d, e e.

A FIG. 2 mostra a sequência do fagemídeo pVX4 (SEQ ID NO:13) utilizado para construção dos plasmídeos do Fab 2H7 (ver Exemplo 1) bem como as sequências de aminoácidos da cadeia L (SEQ ID NO: 14) e da cadeia H (SEQ ID NO: 15) do Fab para o anticorpo humanizado anti-IFN-α enxertado com CDR. A FIG. 3 mostra a sequência do plasmídeo de expressão que codifica o Fab quimérico 2H7.v6.8 (SEQ ID N0:16). São mostradas as sequências de aminoácidos da cadeia L (SEQ ID NO:17) e da cadeia H (SEQ ID N0:18). A FIG. 4 mostra a sequência do plasmídeo pDRl (SEQ ID NO:19; 5391 pb) para expressão das cadeias leves de imunoglobulina tal como descrito no Exemplo 1. pDRl contém sequências codificando um anticorpo irrelevante, a cadeia leve de um anticorpo humanizado anti-CD3 (Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225, 1992), os codões de início e de terminação para a qual estão indicados a cheio e sublinhados. A FIG. 5 mostra a sequência do plasmídeo pDR2 (SEQ ID NO:20; 6135 pb) para expressão das cadeias pesadas de imunoglobulina tal como descrito no Exemplo 1. pDR2 contém sequências codificando um anticorpo irrelevante, a cadeia pesada de um anticorpo humanizado anti-CD3 (Shalaby et al., supra) , os codões de início e terminação para a qual estão indicados a cheio e sublinhados. A FIG. 6 mostra a sequência de aminoácidos da cadeia L completa de 2H7.vl6 (SEQ ID NO:21). Os primeiros 10 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ 19 aminoácidos antes de DIQ são a sequência sinal secretora não presente na cadeia polipeptídica madura.

A FIG. 7 mostra a sequência de aminoácidos da cadeia H completa de 2H7.vl6 (SEQ ID NO:22). Os primeiros 19 aminoácidos antes de EVQ são a sequência sinal secretora não presente na cadeia polipeptídica madura. No alinhamento da sequência de VH na FIG. 1B (SEQ ID NO: 8) com a sequência da cadeia H completa, a região constante γΐ humana é da posição de aminoácido 114-471 em SEQ ID NO:22. A FIG. 8 mostra a sequência de aminoácidos da cadeia H completa de 2H7.v31 (SEQ ID NO:23). Os primeiros 19 aminoácidos antes de EVQ são a sequência sinal secretora não presente na cadeia polipeptídica madura. A cadeia L é a mesma que para 2H7.vl6 (ver FIG. 6). A FIG. 9 mostra a estabilidade relativa das variantes de IgG 2H7.vl6 e 2H7.v73. Os resultados do ensaio foram normalizados para os valores antes da incubação e relatados como percentagem restante após incubação. A FIG. 10 é um fluxograma resumindo as mudanças de aminoácidos do 2H7 de murídeo num subconjunto de versões humanizadas até v75. A FIG. 11 é um resumo da média absoluta da contagem de células B [CD3-/CD40+] em todos os grupos (estudo de 2H7 e estudo de Rituxan combinados), tal como descrito no Exemplo 10. A FIG. 12 mostra os resultados de um ensaio representativo de ADCC em variantes de 2H7 deficientes em fucose tal como descrito no Exemplo 11. A FIG. 13 mostra os resultados da coloração de Anexina V num gráfico em função da concentração de anticorpo. Células de Ramos foram tratadas com um anticorpo de controlo IgGl irrelevante (Herceptin®; círculos), Rituximab (quadrados), ou rhuMAb 2H7.vl6 (triângulos) na presença de um anticorpo secundário de ligação cruzada e foram analisados através de FACS. As Figuras 13-15 são descritas no Exemplo 13. 11 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ A FIG. 14 mostra os resultados da dupla coloração de Anexina V e iodeto de propídio num gráfico em função da concentração de anticorpo. Células de Ramos foram tratadas com um anticorpo de controlo IgGl irrelevante (Herceptin®; círculos), Rituximab (quadrados), ou rhuMAb 2H7.vl6 (triângulos) na presença de um anticorpo secundário de ligação cruzada e foram analisados através de FACS. A FIG. 15 mostra as contagens (por 10 s) de células vivas, não coradas num gráfico em função da concentração de anticorpo. Células de Ramos foram tratadas com um anticorpo de controlo IgGl irrelevante (Herceptin®; círculos), Rituximab (quadrados), ou rhuMAb 2H7.vl6 (triângulos) na presença de um anticorpo secundário de ligação cruzada e foram analisados através de FACS.

As FIGs. 16, 17, 18 mostram a inibição do crescimento tumoral de células de Raji em ratinhos nus, tal como descrito no Exemplo 14. Os animais foram tratados semanalmente (tal como indicado através de setas verticais; n=8 ratinhos por grupo) durante 6 semanas com PBS (controlo) ou com Rituxan® ou rhuMAb 2H7.vl6 a 5 mg/kg (FIG. 16), 0,5 mg/kg (FIG. 17), ou 0,05 mg/kg (FIG. 18). A FIG. 19 mostra as sequências nucleotídica (SEQ ID NO: 24) e de aminoácidos (SEQ ID NO: 25) de CD20 de Macaca fascicularis, tal como descrito no Exemplo 15. A FIG. 20 mostra a sequência de aminoácidos para CD20 de Macaca fascicularis. Os resíduos que diferem do CD20 humano estão sublinhados e os resíduos humanos estão indicados directamente abaixo dos resíduos de macaco. O putativo domínio extracelular do CD20 de macaco está a cheio. A FIG. 21 mostra os resultados de células de Macaca fascicularis expressando CD20 que se ligam a hu2H7.vl6, .v31, e Rituxan, tal como descrito no Exemplo 15. Os anticorpos foram ensaiados quanto à capacidade para se ligarem e deslocarem a ligação de 2H7 de murídeo conjugado com FITC a CD20 de Macaca fascicularis. 12 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ A FIG. 22 mostra ο esquema de escalonamento da dose para o ensaio clínico de fase I/II de artrite reumatóide. A FIG. 23 mostra o vector para expressão de 2H7.vl6 em células CHO.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS 0 antigénio "CD20" é uma fosfoproteína transmembranar, não glicosilada com um peso molecular de aproximadamente 35 kDa que se encontra na superfície de mais de 90% das células B do sangue periférico ou órgãos linfóides. CD20 é expresso durante o desenvolvimento inicial de pré-células B e permanece até à diferenciação das células plasmáticas; não se encontra em células estaminais humanas, células progenitoras linfóides ou células plasmáticas normais. CD20 está presente tanto em células B normais como em células B malignas. Outros nomes para CD20 na literatura incluem "antigénio de diferenciação restrito a linfócitos B" e "Bp35". O antigénio CD20 é descrito, por exemplo, em Clark e Ledbetter, Adv. Can. Res. 52: 81-149, 1989 e Valentine et al., J. Biol. Chem. 264(19): 11282-11287, 1989. O termo "anticorpo" é utilizado no sentido mais amplo e cobre especificamente anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais inteiros), anticorpos multiespecíficos (p.ex., anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpo desde que exibam a actividade ou função biológica desejada. A actividade biológica da ligação de CD20 e dos anticorpos de ligação a CD20 humanizados do presente invento incluirá pelo menos a ligação do anticorpo ao CD20 humano, de preferência a ligação ao CD20 humano e de outro primata (incluindo Macaca fascicularis, macaco Rhesus, chimpanzés). Os anticorpos ligar-se-iam a CD20 com um valor de Kd não superior a lxlCT8, de preferência um valor de Kd não superior a cerca de lxlCT9 e serão capazes de matar ou eliminar células B in vivo, de preferência em pelo menos 20% quando comparados com o controlo negativo apropriado que não é tratado com um tal anticorpo. A eliminação de células B pode ser um resultado de um ou mais de ADCC, CDC, apoptose ou outro mecanismo. Nalgumas concretizações de tratamento de doença aqui, funções efectoras 13 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ específicas ou mecanismos podem ser desejados em detrimento de outros e certas variantes do 2H7 humanizado são preferidas para alcançar essas funções biológicas, tais como ADCC. "Fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de um anticorpo inteiro, geralmente a ligação ao antigénio ou uma sua região variável. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia simples; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo. "Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um local de reconhecimento e ligação ao antigénio completo. Este fragmento consiste num dímero de um domínio da região variável da cadeia pesada e um da cadeia leve em íntima associação não covalente. Da dobragem destes dois domínios emanam seis voltas hipervariáveis (3 voltas cada da cadeia H e L) que contribuem com os resíduos de aminoácidos para a ligação ao antigénio e conferem especificidade de ligação ao antigénio ao anticorpo. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três CDR específicas para um antigénio) tem a capacidade para reconhecer e ligar-se ao antigénio, embora a uma menor afinidade que o local de ligação inteiro. 0 termo "anticorpo monoclonal" tal como aqui se utiliza refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, i.e., os anticorpos individuais constituindo a população são idênticos excepto quanto a possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único local antigénico. Para além disso, em contraste com preparações convencionais de anticorpos (policlonais) que incluem tipicamente diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante do antigénio. 0 adjectivo "monoclonal" indica o carácter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogénea de anticorpos, e não deve ser entendido como requerendo a produção do anticorpo através de qualquer método 14

ΕΡ 1 572 744/PT particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a utilizar de acordo com o presente invento podem ser produzidos através do método de hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et al. , Nature 256 : 495, 1975, ou podem ser produzidos através de métodos de ADN recombinante (ver, p.ex., Patente U.S. 4816567). Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados a partir de bibliotecas fágicas de anticorpos utilizando as técnicas descritas em Clackson et al., Nature 352: 624-628, 1991 e Marks et al., J. Mol. Blol. 222: 581-597, 1991, por exemplo. "Fragmentos funcionais" dos anticorpos de ligação a CD20 do presente invento são os fragmentos que mantêm a ligação a CD20 com substancialmente a mesma afinidade que a molécula inteira intacta da qual são derivados e mostram actividade biológica incluindo eliminação de células B tal como medida através de ensaios in vitro ou in vivo tais como os aqui descritos. 0 termo "variável" refere-se ao facto de certos segmentos dos domínios variáveis diferirem extensivamente na sequência entre anticorpos. 0 domínio V medeia a ligação ao antigénio e define a especificidade de um determinado anticorpo para o seu antigénio particular. No entanto, a variabilidade não é igualmente distribuída ao longo do troço de 110 aminoácidos dos domínios variáveis. Em vez disso, as regiões V consistem em trechos relativamente invariantes designados regiões estruturais (FR) de 15-30 aminoácidos separadas por regiões mais curtas de extrema variabilidade designadas "regiões hipervariáveis" que têm cada uma 9-12 aminoácidos de comprimento. Os domínios variáveis das cadeias pesadas e leves nativas compreendem cada um quatro FR, adoptando grandemente uma configuração de folha β, ligadas através de três regiões hipervariáveis, que formam voltas ligando-se a, e nalguns casos fazendo parte, da estrutura em folha β. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em íntima proximidade através das FR e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação ao antigénio dos anticorpos (ver Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD., 1991). Os domínios constantes não estão envolvidos directamente na 15 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ ligação de um anticorpo a um antigénio, mas exibem várias funções efectoras, tais como participação do anticorpo em citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). 0 termo "região hipervariável" quando aqui utilizado refere-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antigénio. A região hipervariável compreende geralmente resíduos de aminoácidos de uma "região determinante de complementaridade" ou "CDR" (p.ex. em torno de cerca dos resíduos 24-34 (L1) , 50-56 (L2) e 89-97 (L3) na VL, e em torno de cerca dos resíduos 31-35B (Hl), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) na VH (Kabat et al. , "Sequences of Proteins of

Immunological Interest", 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD., 1991) e/ou os resíduos de uma "volta hipervariável" (p.ex. resíduos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) na VL, e 26-32 (Hl), 52A-55 (H2) e 96-101 (H3) na VH (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901- 917, 1987).

Tal como aqui referido, a "sequência de consenso" ou a sequência de consenso do domínio V é uma sequência artificial derivada de uma comparação das sequências de aminoácidos de sequências da região variável de imunoglobulina humana conhecidas. Com base nestas comparações, foram preparadas sequências de ácido nucleico recombinantes codificando os aminoácidos do domínio V que são um consenso das sequências derivadas dos domínios V das cadeias κ e H subgrupo III humanas. A sequência de consenso de V não tem qualquer especificidade ou afinidade de ligação do anticorpo conhecidas.

Os anticorpos (imunoglobulinas) "quiméricos" têm uma porção da cadeia pesada e/ou leve idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma determinada espécie ou pertencentes a uma determinada classe ou subclasse de anticorpos, ao mesmo tempo que o restante da cadeia ou cadeias é idêntico ou homólogo a sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam a actividade biológica desejada (Patente U.S. 4816567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 6851-6855, 16 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ 1984) . Ο anticorpo humanizado tal como aqui utilizado é um subconjunto de anticorpos quiméricos.

Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (p.ex., de murídeo) são anticorpos quiméricos que contêm a sequência minima derivada de imunoglobulina não humana. Na maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor ou aceitador) nas quais residuos da região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos da região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como ratinho, rato, coelho ou primata não humano possuindo a especificidade, afinidade, e capacidade desejadas. Nalguns casos, os resíduos da região estrutural Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Para além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não se encontram no anticorpo receptor nem no anticorpo dador. Estas modificações são feitas para refinar mais o desempenho do anticorpo tal como a afinidade de ligação. Geralmente, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as voltas hipervariáveis correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as de uma sequência de imunoglobulina humana embora as regiões FR possam incluir uma ou mais substituições de aminoácidos que melhorem a afinidade de ligação. 0 número destas substituições de aminoácidos na FR é tipicamente de não mais de 6 na cadeia H e, na cadeia L, não mais de 3. 0 anticorpo humanizado compreenderá opcionalmente também pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, ver Jones et al., Nature 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature 332: 323- 329, 1988; e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596, 1992.

As "funções efectoras" do anticorpo referem-se às actividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de sequência nativa ou uma região Fc de uma variante da sequência de aminoácidos) de um anticorpo e variam com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efectoras do anticorpo incluem: ligação Clq e citotoxicidade dependente do complemento; ligação ao receptor de Fc; citotoxicidade mediada 17

ΕΡ 1 572 744/PT por células dependente de anticorpos (ADCC); fagocitose; infra-regulação de receptores da superfície celular (p.ex. receptor de células B); e activação de células B. "Citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos" ou "ADCC" refere-se a uma forma de citotoxicidade em que Ig segregadas ligadas a receptores de Fc (FcR) presentes em certas células citotóxicas (p.ex. células Assassinas Naturais (NK), neutrófilos, e macrófagos) permitem que estas células citotóxicas efectoras se liguem especificamente a uma célula alvo possuindo o antigénio e subsequentemente matem a célula alvo com citotoxinas. Os anticorpos "armam" as células citotóxicas e são absolutamente necessários para tal matança. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam apenas FcyRIII, enquanto os monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92, 1991. Para avaliar a actividade de ADCC de uma molécula de interesse, pode ser efectuado um ensaio de ADCC in vitro, tal como o descrito na Patente U.S. 5500362 ou 5821337. Células efectoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células Assassinas Naturais (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, a actividade de ADCC da molécula de interesse pode ser ensaiada in vivo, p.ex., num modelo animal tal como o divulgado em Clynes et al., PNAS (USA) 95: 652-656, 1998. 0 "receptor de Fc" ou "FcR" descreve um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR humano de sequência nativa. Para além disso, um FcR preferido é um que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRI, FcyRII, e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e formas de processamento alternativo destes receptores. Os receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptor activador") e FcyRIIB (um "receptor inibidor") , que possuem sequências de aminoácidos semelhantes que diferem principalmente nos domínios citoplasmáticos destes. O receptor activador FcyRIIA contém um motivo imuno-receptor de activação baseado em tirosina (ITAM) no seu domínio citoplasmático. O receptor inibidor FcyRIIB contém um motivo imuno-receptor de inibição baseado em tirosina (ITIM) 18 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ no seu domínio citoplasmático (ver revisão em Daêron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234, 1997). Os FcR são revistos em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92, 1991; Capei et al., Immunomethods 4: 25-34, 1994; e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41, 1995). Outros FcR, incluindo aqueles a identificar no futuro, são aqui englobados pelo termo "FcR". O termo inclui também o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência das IgG maternas para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587, 1976; e Kim et al., J. Immunol. 24: 249, 1994).

Em WO 00/42072 (Presta) descrevem-se variantes de anticorpo com ligação melhorada ou diminuída aos FcR. Ver, também, Shields et al., J. Blol. Chem. 9(2): 6591-6604, 2001. "Células efectoras humanas" são leucócitos que expressam um ou mais FcR e efectuam funções efectoras. De preferência, as células expressam pelo menos FcyRIII e efectuam a função efectora de ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que medeiam ADCC incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC), células assassinas naturais (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; sendo preferidos os PBMC e as células NK. As células efectoras podem ser isoladas a partir de uma fonte nativa, p.ex. do sangue. "Citotoxicidade dependente do complemento" ou "CDC" refere-se à lise de uma célula alvo na presença do complemento. A activação da via clássica do complemento é iniciada através da ligação do primeiro componente do sistema do complemento (Clq) a anticorpos (da subclasse apropriada) que estão ligados ao seu antigénio cognato. Para avaliar a activação do complemento, pode ser efectuado um ensaio de CDC, p.ex., tal como descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163, 1996.

Variantes de polipéptidos com sequências de aminoácidos da região Fc alteradas e maior ou menor capacidade de ligação a Clq são descritos na Patente U.S. 6194551B1 e W099/51642. Ver, também, Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184, 2000 . 19 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ Ο local de N-glicosilação em IgG é em Asn297 no domínio CH2. 0 presente invento proporciona também composições de um anticorpo humanizado que se liga a CD20 possuindo uma região Fc, em que cerca de 80-100% (e de preferência cerca de 90-99%) do anticorpo na composição compreende uma estrutura central de hidrato de carbono madura sem fucose, ligada à região Fc da glicoproteína. Foi aqui demonstrado que tais composições exibem uma melhoria surpreendente na ligação a FcyRIIIA(F158), que não é tão eficaz como FcyRIIIA (V158) na interacção com a IgG humana. Assim, antecipa-se que as composições daqui sejam superiores às composições de anticorpos anti-CD20 anteriormente descritas, especialmente para terapia de pacientes humanos que expressem FcyRMA (F158). FcyRIIIA (F158) é mais comum que FcyRIIIA (V158) em afro-americanos e Caucasianos saudáveis normais. Ver Lehrnbecher et al., Blood 94: 4220, 1999. O presente pedido demonstra ainda o aumento sinérgico na ligação a FcyRIII e/ou na função de ADCC que resulta da combinação das variações de glicosilação aqui com uma ou mais modificações na sequência de aminoácidos na região Fc da glicoproteína.

Um anticorpo "isolado" é um que foi identificado e separado e/ou recuperado a partir de um componente do seu ambiente natural. Componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interfeririam com utilizações de diagnóstico ou terapêuticas para o anticorpo, e podem incluir enzimas, hormonas, e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em concretizações preferidas, o anticorpo será purificado (1) até mais de 95% em peso do anticorpo tal como determinado através do método de Lowry, e de preferência mais de 99% em peso, (2) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos N-terminal ou interna através da utilização de um sequenciador de copo giratório, ou (3) até à homogeneidade através de SDS-PAGE sob condições redutoras ou não redutoras utilizando coloração Azul de Coomassie ou, de preferência, de prata. Um anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Vulgarmente, no entanto, o anticorpo isolado será preparado através de pelo menos um passo de purificação. 20 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ

Uma molécula de ácido nucleico "isolada" é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada pelo menos de uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual está vulgarmente associada na fonte natural do ácido nucleico do anticorpo. Uma molécula de ácido nucleico isolada está numa forma ou disposição que não aquela em que se encontra na natureza. Moléculas de ácido nucleico isoladas são portanto distintas da molécula de ácido nucleico tal como existe em células naturais. No entanto, uma molécula de ácido nucleico isolada inclui uma molécula de ácido nucleico contida em células que expressam vulgarmente o anticorpo onde, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está numa localização cromossómica diferente da das células naturais. "Sequências de controlo" da expressão referem-se a sequências de ADN necessárias para a expressão de uma sequência de codificação operativamente ligada num determinado organismo hospedeiro. As sequências de controlo que são adequadas para procariotas incluem, por exemplo, um promotor, opcionalmente uma sequência operadora e um local de ligação ao ribossoma. Sabe-se que as células eucarióticas utilizam promotores, sinais de poliadenilação e estimuladores. O ácido nucleico está "operativamente ligado" quando é colocado numa relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o ADN para uma pré-sequência ou comando de secreção está operativamente ligado ao ADN para um polipéptido se for expresso como uma pré-proteina que participa na secreção do polipéptido; um promotor ou estimulador está operativamente ligado a uma sequência de codificação se afectar a transcrição da sequência; ou um local de ligação ao ribossoma está operativamente ligado a uma sequência de codificação se estiver posicionado de modo a facilitar a tradução. Geralmente, "operativamente ligado" significa que as sequências de ADN a ligar são contíguas e, no caso de um comando de secreção, contíguas e em fase de leitura. No entanto, os estimuladores não têm de ser contíguos. A ligação é alcançada através de ligação em locais de restrição convenientes. Se tais locais não existirem, são utilizados os adaptadores ou ligantes oligonucleotídicos sintéticos de acordo com a prática convencional. 21 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ "Vector" inclui vectores vaivém e vectores de expressão. Tipicamente, a construção plasmídica incluirá também uma origem de replicação (p.ex., a origem de replicação ColEl) e um marcador seleccionável (p.ex., resistência a ampicilina ou tetraciclina), para replicação e selecção, respectivamente, dos plasmideos em bactérias. Um "vector de expressão" refere-se a um vector que contém as sequências de controlo ou elementos reguladores necessários para expressão dos anticorpos incluindo o fragmento de anticorpo do presente invento, em células Bacterianas ou eucarióticas. Os vectores adequados são divulgados abaixo. A célula que produz um anticorpo de ligação a CD20 humanizado do presente invento incluirá as células hospedeiras bacterianas e eucarióticas nas quais o ácido nucleico codificando os anticorpos foi introduzido. As células hospedeiras adequadas são divulgadas abaixo. A palavra "marcador" quando aqui utilizada refere-se a um composto ou uma composição detectável que é conjugado directamente ou indirectamente com o anticorpo. 0 marcador pode ele mesmo ser detectável por si próprio (p.ex., marcadores radioisótopos ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimático, pode catalisar a alteração química de um composto ou uma composição substrato que seja detectável.

Uma "doença auto-imune" aqui é uma doença ou distúrbio não maligno surgindo de, e dirigido contra, antigénios e/ou tecidos do próprio indivíduo (auto). Tal como aqui utilizada, "eliminação de células B" refere-se a uma redução nos níveis de células B num animal ou humano após tratamento com fármacos ou anticorpos, em comparação com o nível de células B antes do tratamento. Os níveis de células B são mensuráveis utilizando ensaios bem conhecidos tais como os descritos nos Exemplos Experimentais. A eliminação de células B pode ser completa ou parcial. Numa concretização, a eliminação de células B que expressam CD20 é de pelo menos 25%. Para não estar limitado a nenhum mecanismo, possíveis mecanismos de eliminação de células B incluem ADCC, CDC, apoptose, modulação do fluxo de cálcio ou uma combinação de dois ou mais dos anteriores. 22 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ Ο termo "agente citotóxico" tal como aqui utilizado refere-se a uma substância que inibe ou impede a função das células e/ou causa a destruição das células. Pretende-se que o termo inclua isótopos radioactivos (p.ex., I131, I124, Y90 e

Re186) , agentes quimioterapêuticos, e toxinas tais como toxinas enzimaticamente activas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos destes.

Um "agente quimioterapêutico" é um composto químico útil no tratamento de cancro. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem alcalinizantes ou alquilantes tais como tiotepa e ciclofosfamida (CYTOXAN™); sulfonatos de alquilo tais como bussulfano, improsulfano e piposulfano; aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa, e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotio-fosforamida e trimetilolmelamina; mostardas de azoto tais como clorambucilo, clomafazina, clofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracilo; nitrosureias tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tais como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (Adriamicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos tais como metotrexato e 5-fluorouracilo (5-FU); análogos do ácido fólico tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purinas tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; androgénios tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenérgicos tais como aminoglutetimida, mitotano, 23 ΕΡ 1 572 7 4 4/PT trilostano; substitutos do ácido fólico tais como ácido frolínico; aceglatona; glicósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; etoglúcido; nitrato de gálio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilinico; 2-etil-hidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofirano; espirogermânio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2', 2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); tiotepa; taxóides, p.ex., paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Miers Squibb Oncology, Princeton, NJ) e docetaxel (TAXOTERE®. Rhône-Poulenc Rorer, Antony, França); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; platina; etoposido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinblastina; vinorrelbina; navelbina; novantrona; teniposido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inibidor da topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinóico; espiramicinas; capecitabina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos de cima. Também incluídos nesta definição estão agentes anti-hormonais que actuem regulando ou inibindo a acção hormonal em tumores tais como anti-estrogénios incluindo por exemplo tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles que inibem a aromatase, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno (Fareston); anti-androgénios tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida e goserelina; outros agentes quimioterapêuticos tais como prednisolona. Estão incluídos sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos de cima. "Tratar" ou "tratamento" ou "alívio" refere-se tanto a medidas de tratamento terapêuticas como profilácticas ou preventivas, em que o objectivo é impedir ou atrasar (diminuir) a condição ou distúrbio patológico alvo. Um sujeito é "tratado" com sucesso a um cancro positivo para CD20 ou uma doença auto-imune se, após receber uma quantidade terapêutica de um anticorpo de ligação a CD20 do presente invento de 24 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ acordo com os métodos do presente invento, o sujeito mostrar uma redução observável e/ou mensurável ou ausência de um ou mais sinais e sintomas da doença particular. Por exemplo, para cancro, redução do número de células de cancro ou ausência das células de cancro; redução do tamanho do tumor; inibição (i.e., atrasar até certo ponto e preferência parar) de metástase tumoral; inibição, até certo ponto, do crescimento tumoral; aumento da duração da remissão e/ou alivio até certo ponto, de um ou mais dos sintomas associados ao cancro especifico; morbidez e mortalidade reduzidas, e melhoria de questões de qualidade de vida. Pode também ser sentida pelo paciente uma redução dos sinais ou sintomas de uma doença. 0 tratamento pode alcançar uma resposta completa, definida como desaparecimento de todos os sinais de cancro, ou uma resposta parcial, em que o tamanho do tumor é diminuído, de preferência em mais de 50 porcento, de maior preferência em 75%. Um paciente é também considerado tratado se tiver uma doença estável. Numa concretização preferida, os pacientes de cancro estão ainda livres de progressão do cancro após um ano, de preferência após 15 meses. Estes parâmetros para avaliação do tratamento com sucesso e melhoria da doença são facilmente mensuráveis através de procedimentos de rotina familiares a um médico de apropriada perícia na especialidade.

Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade de um anticorpo ou de um fármaco eficaz para "tratar" uma doença ou um distúrbio num sujeito. No caso de cancro, a quantidade terapeuticamente eficaz do fármaco pode reduzir o número de células de cancro; reduzir o tamanho do tumor; inibir (i.e., atrasar até certo ponto e de preferência parar) a infiltração de células de cancro em órgãos periféricos; inibir (i.e., atrasar até certo ponto e preferência parar) metástase tumoral; inibir, até certo ponto, o crescimento tumoral; e/ou aliviar até certo ponto um ou mais dos sintomas associados ao cancro. Ver definição anterior de "tratar".

Administração "crónica" refere-se à administração do agente ou agentes de um modo contínuo em oposição a um modo agudo, de forma a manter o efeito terapêutico inicial (actividade) durante um período de tempo prolongado.

Administração "intermitente" é tratamento que não é feito 25 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ consecutivamente sem interrupção, mas em vez disso é de natureza cíclica.

Composições e Métodos do Invento 0 presente invento proporciona anticorpos humanizados tal como exposto nas reivindicações.

Num anticorpo inteiro, o anticorpo de ligação a CD20 humanizado do presente invento compreenderá um domínio V humanizado unido a um domínio C de uma imunoglobulina humana. Numa concretização preferida, a região C da cadeia H é de IgG humana, de preferência IgGl ou IgG3. 0 domínio C da cadeia L é de preferência de cadeia κ humana. A menos que indicado de outro modo, uma versão humanizada do anticorpo 2H7 daqui terá as sequências dos domínios V e C da cadeia L (FIG. 6, SEQ ID N0:21) e da cadeia H (FIG. 7., SEQ ID NO:22) de 2H7.vl6 excepto nas posições de substituições ou mudanças de aminoácidos indicadas nos exemplos experimentais abaixo.

Os anticorpos de ligação a CD20 humanizados ligar-se-ão pelo menos a CD20 humano e de preferência ligar-se-ão a outro CD20 de primata tal como o de macacos incluindo Macaca fascicularis e macaco Rhesus, e chimpanzés. A sequência do CD20 de Macaca fascicularis é divulgada no Exemplo 15 e na Figura 19. A actividade biológica dos anticorpos de ligação a CD20 humanizados do presente invento incluirá pelo menos a ligação do anticorpo a CD20 humano, de preferência a ligação a CD20 humano e de primata (incluindo Macaca fascicularis, macaco Rhesus, chimpanzés) , com um valor de Kd não superior a lxlCT8, de preferência um valor de Kd não superior a cerca de lxlCT9, ainda de maior preferência um valor de Kd não superior a cerca de lxlCT10, e serem capazes de matar ou eliminar células B in vitro ou in vivo, de preferência em pelo menos 20% quando comparado com o nível limiar ou o controlo negativo apropriado que não é tratado com um tal anticorpo. 26 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ Ο nível desejado de eliminação de células B dependerá da doença. Para o tratamento de um cancro positivo para CD20, pode ser desejável maximizar a eliminação das células B que são o alvo dos anticorpos anti-CD20 do presente invento. Assim, para o tratamento de um neoplasma de células B positivo para CD20, é desejável que a eliminação de células B seja suficiente para pelo menos impedir a progressão da doença o que pode ser avaliado pelo médico perito na especialidade, p.ex., através de monitorização do crescimento tumoral (tamanho) , proliferação do tipo de célula cancerosa, metástase, outros sinais e sintomas do cancro particular. De preferência, a eliminação de células B é suficiente para impedir a progressão da doença durante pelo menos 2 meses, preferência 3 meses, ainda de preferência 4 meses, de maior preferência 5 meses, ainda de maior preferência 6 ou mais meses. Em concretizações ainda mais preferidas, a eliminação de células B é suficiente para aumentar o tempo em remissão em pelo menos 6 meses, de preferência 9 meses, de maior preferência um ano, ainda de preferência 2 anos, ainda de maior preferência 3 anos, ainda de maior preferência 5 ou mais anos. Numa concretização mais preferida, a eliminação de células B é suficiente para curar a doença. Em concretizações preferidas, a eliminação de células B num paciente de cancro é pelo menos cerca de 75% e de preferência, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% e mesmo 100% do nível limiar antes do tratamento.

Para tratamento de uma doença auto-imune, pode ser desejável modular a extensão da eliminação de células B dependendo da doença e/ou da gravidade da condição em cada paciente, através do ajuste da dosagem de anticorpo de ligação a CD20. Assim, a eliminação de células B pode, mas não tem de, ser completa. Ou, a eliminação de células B total pode ser desejada no tratamento inicial mas em tratamentos subsequentes a dosagem pode ser ajustada para alcançar apenas eliminação parcial. Numa concretização, a eliminação de células B é pelo menos de 20%, i.e., 80% ou menos de células B positivas para CD20 em comparação com o nível limiar antes do tratamento. Noutras concretizações, a eliminação de células B é de 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ou mais. De preferência, a eliminação de células B é suficiente para parar a progressão da doença, de maior preferência para aliviar os sinais e sintomas da 27 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ doença particular em tratamento, de maior preferência ainda para curar a doença.

Os anticorpos de ligação a CD20 biespecíficos são anticorpos em que um braço do anticorpo tem uma cadeia H e L humanizada do anticorpo de ligação a CD20 humanizado do presente invento, e o outro braço tem especificidade de ligação da região V para um segundo antigénio. 0 segundo antigénio pode ser seleccionado de entre o grupo que consiste em CD3, CD64, CD32A, CD16, NKG2D ou outros ligandos de activação de NK.

Em comparação com Rituxan (rituximab), vl6 exibe uma potência de ADCC cerca de 2 a 5 vezes maior, uma CDC ~3- 4 vezes menor que Rituxan.

Produção de anticorpos

Anticorpos monoclonais

Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos utilizando o método de hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et ai., Nature 256: 495, 1975, ou podem ser produzidos através de métodos de ADN recombinante (Patente U.S. 4816567).

No método de hibridoma, um ratinho ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como um hamster, é imunizado tal como descrito acima para desencadear linfócitos que produzam ou sejam capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente à proteína utilizada para imunização.

Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Após imunização, os linfócitos são isolados e depois fundidos com uma linha celular de mieloma utilizando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Coding, "Monoclonal antibodies: Principies and Practice", págs. 59-103 (Academic Press, 1986)).

As células de hibridoma assim preparadas são semeadas e criadas num meio de cultura adequado, meio esse que contém de preferência uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células de mieloma não fundidas, parentais (também referidas como parceiros de fusão). Por exemplo, se as células de mieloma parentais não tiverem a 28 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ enzima hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura selectivo para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT) , substâncias essas que impedem o crescimento de células deficientes em HGPRT.

As células de mieloma parceiras de fusão preferidas são as que se fundem eficientemente, suportam uma produção estável de elevado nível de anticorpo pelas células produtoras de anticorpo seleccionadas e são sensíveis a um meio selectivo que selecciona contra as células parentais não fundidas. Linhas celulares de mieloma preferidas são linhas de mieloma de murídeo, tais como as derivadas de tumores de ratinho MOPC-21 e MPC-11 disponíveis em Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia USA, e células SP-2 e derivadas, p.ex., células X63-Ag8-653 disponíveis em American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Foram também descritas linhas celulares de mieloma humano e de heteromieloma ratinho-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol. 133: 3001, 1984; e Brodeur et al. , "Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications", págs. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., New York, 1987)) . O meio de cultura no qual as células de hibridoma crescem é ensaiado quanto à produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra o antigénio. De preferência, a especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada através de imunoprecipitação ou através de um ensaio de ligação in vitro, tal como um radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunossorvente enzimático (ELISA). A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada através de análise Scatchard descrita em Munson et al., Anal. Biochem. 107: 220, 1980.

Uma vez identificadas as células de hibridoma que produzem anticorpos com a especificidade, afinidade e/ou actividade desejadas, os clones podem ser subclonados através de procedimentos de diluição limitante e criados através de métodos padrão (Goding, "Monoclonal Antibodies: Principies and 29 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ

Practice", págs. 59-103 (Academic Press, 1986)). Meios de cultura adequados para este fim incluem, por exemplo, D-MEM ou RPMI-1640. Adicionalmente, as células de hibridoma podem ser criadas in vivo como tumores de ascites num animal não humano, p.ex. através de injecção i.p. das células em ratinhos.

Os anticorpos monoclonais segregados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, do fluido de ascites ou do soro através de procedimentos convencionais de purificação de anticorpos tais como, por exemplo, cromatografia de afinidade (p.ex., utilizando proteína A ou proteína G-Sepharose) ou cromatografia de permuta iónica, cromatografia de hidroxilapatite, electroforese em gel, diálise, etc. O ADN codificando os anticorpos monoclonais é facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (p.ex., através da utilização de sondas oligonucleotídicas que sejam capazes de se ligar especificamente a genes codificando as cadeias pesadas e leves de anticorpos de murídeo). As células de hibridoma servem como fonte preferida de tal ADN. Uma vez isolado, o ADN pode ser colocado em vectores de expressão, que são então transfectados para células hospedeiras tais como células de E. coli, células COS de símio, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou células de mieloma que não produzam de outro modo proteína de anticorpo, para obter a síntese de anticorpos monoclonais em células hospedeiras recombinantes. Artigos de revisão sobre expressão recombinante em bactérias de ADN codificando o anticorpo incluem Skerra et al. , Curr. Opinion in Immunol. 5: 256-262, 1993 e Pluckthun, Immunol. Revs. 130: 151-188, 1992.

Noutra concretização, os anticorpos monoclonais ou fragmentos de anticorpo podem ser isolados a partir de bibliotecas fágicas de anticorpos geradas utilizando as técnicas descritas em McCafferty et al., Nature 348: 552-554, 1990. Clackson et al., Nature 352: 624-628, 1991 e Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597, 1991 descrevem o isolamento de anticorpos de murídeo e humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas fágicas. Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de elevada afinidade (intervalo nM) através de baralhação de cadeias 30 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ (Marks et al., Bio/Technology 10 : 779-783, 1992), bem como infecção combinatória e recombinação in vivo como estratégia para a construção de bibliotecas fágicas muito grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21: 2265-2266, 1993).

Assim, estas técnicas são alternativas viáveis às técnicas tradicionais de hibridoma de anticorpos monoclonais para isolamento de anticorpos monoclonais. O ADN que codifica o anticorpo pode ser modificado para produzir polipéptidos de anticorpo quiméricos ou de fusão, por exemplo, através da substituição de sequências do domínio constante da cadeia pesada e da cadeia leve (CH e Cl) de murídeo pelas sequências humanas homólogas (Patente U.S. 4816567; e Morrison, et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 6851, 1984) ou através de fusão da sequência de codificação de imunoglobulina com toda ou parte da sequência de codificação para um polipéptido não imunoglobulina (polipéptido heterólogo). As sequências polipeptídicas não imunoglobulina podem substituir os domínios constantes de um anticorpo ou substituem os domínios variáveis de um local de combinação com o antigénio de um anticorpo para criar um anticorpo quimérico bivalente compreendendo um local de combinação com o antigénio possuindo especificidade para um antigénio e outro local de combinação com o antigénio possuindo especificidade para um antigénio diferente.

Anticorpos humanizados Métodos para humanização de anticorpos não humanos foram descritos na especialidade. De preferência, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos nele de uma fonte que é não humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são frequentemente referidos como resíduos de "importação", que são tipicamente tomados de um domínio variável de "importação". A humanização pode ser essencialmente efectuada seguindo o método de Winter e colegas (Jones et al., Nature 321: 522-525, 1986; Riechmann et al.,

Nature 332: 323-327, 1988; Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536, 1988), através da substituição de sequências de regiões hipervariáveis de um anticorpo humano por sequências correspondentes. Assim, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Patente U.S. 4816567) em que 31 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ substancialmente menos de um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos da região hipervariável e possivelmente alguns resíduos FR são substituídos por resíduos de locais análogos de anticorpos de roedor. A escolha dos domínios variáveis humanos, tanto leves como pesados, a utilizar na produção de anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade e a resposta HAMA (anticorpo humano anti-ratinho) quando se pretende o anticorpo para utilização terapêutica humana. De acordo com o método designado de "melhor ajuste", a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é pesquisada contra a biblioteca inteira de sequências conhecidas do domínio variável humano. A sequência do domínio V humano que estiver mais próxima da do roedor é identificada e a região estrutural humana (FR) dentro desta é aceite para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol. 151: 2296, 1993; Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901, 1987). Outro método utiliza uma determinada região estrutural derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um determinado subgrupo de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser utilizada para vários anticorpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 4285, 1992; Presta et al., J. Immnol. 151: 2623, 1993). É ainda importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção de elevada afinidade de ligação para o antigénio e outras propriedades biológicas favoráveis. Para alcançar este objectivo, de acordo com um método preferido, os anticorpos humanizados são preparados através de um processo de análise das sequências parentais e de vários produtos humanizados conceptuais utilizando modelos tridimensionais das sequências parentais e humanizadas. Modelos tridimensionais de imunoglobulinas estão vulgarmente disponíveis e são familiares aos peritos na especialidade. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e apresentam estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulinas candidatas seleccionadas. A inspecção destas apresentações permite a análise do papel provável dos resíduos 32 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, i.e., a análise dos resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata para se ligar ao seu antigénio. Deste modo, resíduos FR podem ser seleccionados e combinados a partir das sequências aceitadora e de importação para que seja alcançada a característica desejada do anticorpo, tal como maior afinidade para o antigénio ou antigénios alvo. Em geral, resíduos das regiões hipervariáveis estão directamente e muito substancialmente envolvidos na influência na ligação ao antigénio. 0 anticorpo humanizado pode ser um fragmento de anticorpo, tal como Fab, que é opcionalmente conjugado com um ou mais agentes citotóxicos para gerar um imunoconjugado. Alternativamente, o anticorpo humanizado pode ser um anticorpo inteiro, tal como um anticorpo IgGl inteiro.

Anticorpos humanos e metodologia de apresentação fágica

Como alternativa à humanização, podem ser gerados anticorpos humanos. Por exemplo, é agora possível produzir animais transgénicos não humanos (p.ex., ratinhos) que são capazes, após imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulinas endógenas. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica do gene da região de união das cadeias pesadas de anticorpos (JH) em ratinhos quiméricos e mutantes na linha germinativa resulta na completa inibição da produção de anticorpos endógenos. A transferência da série génica de imunoglobulina da linha germinativa humana para tais ratinhos mutantes na linha germinativa resultará na produção de anticorpos humanos após confronto com o antigénio. Ver, p.ex., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 2551, 1993; Jakobovits et al., Nature 362: 255-258, 1993; Bruggermann et al., Year in Immuno. 7: 33, 1993, Patentes U.S. 5545806, 5569825, 5591669 (todas de GenPharm); 5545807; e WO 97/17852.

Alternativamente, pode ser utilizada tecnologia de apresentação fágica (McCafferty et al., Nature 348: 552-553, 1990) para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpo in vitro, a partir de repertórios de genes do domínio variável (V) de imunoglobulina de dadores não 33 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ imunizados. De acordo com esta técnica, genes do domínio V de anticorpo são clonados enquadrados num gene da proteína principal ou menor de revestimento de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd, e apresentados como fragmentos de anticorpo funcionais à superfície da partícula fágica. Como a partícula filamentosa contém uma cópia de ADN de cadeia simples do genoma do fago, selecções com base nas propriedades funcionais do anticorpo resultam também na selecção do gene codificando o anticorpo exibindo essas propriedades. Assim, o fago imita algumas das propriedades das células B. A apresentação fágica pode ser efectuada numa variedade de formatos, revistos em, p.ex., Johnson, Kevin S. e Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571, 1993. Podem ser utilizadas várias fontes de segmentos de genes de V para apresentação fágica. Clackson et al., Nature 352: 624-628, 1991 isolaram uma série diversa de anticorpos anti-oxazolona a partir de uma pequena biblioteca combinatória aleatória de genes de V derivada dos baços de ratinhos imunizados. Um repertório de genes de V de dadores humanos não imunizados pode ser construído e anticorpos para uma série diversa de antigénios (incluindo auto-antigénios) podem ser isolados essencialmente seguindo as técnicas descritas por Marks et al. , J. Mol. Biol. 222: 581-597, 1991, ou Griffith et al. , EMBO J. 12: 725-734, 1993. Ver, também,

Patentes U.S. 5565332 e 5573905.

Tal como discutido acima, anticorpos humanos podem também ser gerados através de células B activadas in vitro (ver Patentes U.S. 5567610 e 5229275).

Fragmentos de anticorpo

Em certas circunstâncias há vantagens na utilização de fragmentos de anticorpo, em vez de anticorpos inteiros. O menor tamanho dos fragmentos permite uma rápida eliminação e pode conduzir a um melhor acesso a tumores sólidos. Várias técnicas foram desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, estes fragmentos eram derivados através de digestão proteolítica de anticorpos intactos (ver, p.ex., Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117, 1992; e Brennan et al.,

Science 229: 81, 1985). No entanto, estes fragmentos podem 34

ΕΡ 1 572 7 4 4/PT agora ser produzidos directamente por células hospedeiras recombinantes. Fragmentos de anticorpo Fab, Fv e ScFv podem todos ser expressos em, e segregados a partir de, E. coli, permitindo assim a fácil produção de grandes quantidades destes fragmentos. Fragmentos de anticorpo podem ser isolados a partir das bibliotecas fágicas de anticorpo discutidas acima. Alternativamente, fragmentos Fab'-SH podem ser directamente recuperados a partir de E. coli e ligados quimicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et ai., Bio/Technology 10: 163-167, 1992). De acordo com outra abordagem, fragmentos F(ab')2 podem ser isolados directamente a partir de cultura de células hospedeiras recombinantes. Os fragmentos Fab e F(ab')2 com maior semivida in vivo compreendendo resíduos de epítopo de ligação ao receptor de recuperação são descritos na Patente U.S. 5869046. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo serão aparentes ao perito executante. Noutras concretizações, o anticorpo de escolha é um fragmento Fv de cadeia simples (scFv). Ver WO 93/16185; Patente U.S. 5571894; e Patente U.S. 5587458. Fv e sFv são as únicas espécies com locais de combinação intactos que são desprovidos de regiões constantes; assim, são adequados para reduzida ligação não específica durante utilização in vivo. Proteínas de fusão sFv podem ser construídas, para produzir a fusão de uma proteína efectora num dos terminais amino ou carboxilo de um sFv. Ver "Antibody Engineering", ed. Borrebaeck supra. O fragmento de anticorpo pode também ser um "anticorpo linear", p.ex., tal como descrito, por exemplo, na Patente U.S. 5641870. Tais fragmentos de anticorpo linear podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.

Anticorpos biespecíficos

Anticorpos biespecíficos são anticorpos que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes. Anticorpos biespecíficos exemplares podem ligar-se a dois epítopos diferentes da proteína CD20. Outros desses anticorpos podem combinar um local de ligação a CD20 com um ou mais locais de ligação a outra proteína. Alternativamente, um braço anti-CD20 pode ser combinado com um braço que se liga a uma molécula desencadeadora num leucócito tal como uma molécula receptora de células T (p.ex. CD3), ou receptores de Fc para IgG (FcyR) , tais como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e 35

ΕΡ 1 572 744/PT

FcyRIII (CD16), ou NKG2D ou outro ligando activador de células NK, de modo a focar e localizar mecanismos de defesa celular em células que expressem CD20. Os anticorpos biespecíficos podem também ser utilizados para localizar agentes citotóxicos em células que expressem CD20. Estes anticorpos possuem um braço de ligação a CD20 e um braço que se liga ao agente citotóxico (p.ex., saporina, anti-interferão-α, alcaloide vinca, cadeia A de rícino, metotrexato ou um isótopo radioactivo de hapteno). Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos inteiros ou fragmentos de anticorpo (p.ex., anticorpos biespecíficos F(ab')2) .

Em WO 96/16673 descreve-se um anticorpo biespecífico anti-ErbB2/anti-FcYRIII e a Patente U.S. 5837234 divulga um anticorpo biespecífico anti-BrbB2/anti-FcYRI. Um anticorpo biespecífico anti-ErbB2/Fccx é mostrado em WO98/02463. A Patente U.S. 5821337 ensina um anticorpo biespecífico anti-ErbB2/anti-CD3.

Os métodos para produção de anticorpos biespecíficos são conhecidos na especialidade. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos inteiros baseia-se na co-expressão de dois pares cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina, onde as duas cadeias têm especificidades diferentes (Millstein et al. , Nature 305: 537-539, 1983). Devido à distribuição aleatória das cadeias pesadas e leves de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma potencial mistura de 10 moléculas de anticorpo diferentes, das quais apenas uma tem a estrutura biespecífica correcta. A purificação da molécula correcta, que é habitualmente feita através de passos de cromatografia de afinidade, é bastante trabalhosa e os rendimentos do produto são baixos. Procedimentos semelhantes são divulgados em WO 93/08829 e em Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655-3659, 1991.

De acordo com uma abordagem diferente, domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (locais de combinação anticorpo-antigénio) são fundidos com sequências de domínios constantes de imunoglobulina. De preferência, a fusão é com um domínio constante da cadeia pesada de Ig, compreendendo pelo menos parte das regiões de 36 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ charneira CH2 e CH3. É preferível ter a primeira região constante da cadeia pesada (CH1), contendo o local necessário para união com a cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. Os ADN que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vectores de expressão separados e são co-transfectados numa célula hospedeira adequada. Isto proporciona maior flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos polipeptídicos em concretizações onde razões desiguais das três cadeias polipeptídicas utilizadas na construção proporcionam o rendimento óptimo do anticorpo biespecífico desejado. E, no entanto, possível inserir as sequências de codificação para duas ou todas as três cadeias polipeptídicas num único vector de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias polipeptídicas em razões iguais resulta em rendimentos elevados ou quando as razões não têm um efeito significativo no rendimento da combinação de cadeias desejada.

Numa concretização preferida desta abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos por uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação num braço e um par híbrido de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina (proporcionando uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Verificou-se que esta estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado de combinações de cadeias de imunoglobulina indesejadas, uma vez que a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas metade da molécula biespecífica proporciona um modo fácil de separação. Esta abordagem é divulgada em WO 94/04690. Para mais detalhes de criação de anticorpos biespecíficos ver, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121: 210, 1986.

De acordo com outra abordagem descrita na Patente U.S. 5731168, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser desenhada para maximizar a percentagem de heterodímeros que são recuperados a partir da cultura de células recombinantes. A interface preferida compreende pelo menos uma parte do domínio CH3. Neste método, uma ou mais cadeias laterais de aminoácidos pequenas da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas por cadeias 37

ΕΡ 1 572 744/PT laterais maiores (p.ex., tirosina ou triptofano). São criadas na interface da segunda molécula de anticorpo "cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou semelhante ao da cadeia ou cadeias laterais grandes através da substituição das cadeias laterais de aminoácidos grandes por pequenas (p.ex., alanina ou treonina). Isto proporciona um mecanismo para aumentar o rendimento do heterodimero em relação a outros produtos finais indesejados tais como homodimeros.

Anticorpos biespecíficos incluem anticorpos ligados de forma cruzada ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser ligado a avidina e o outro a biotina. Tais anticorpos têm sido propostos, por exemplo, para direccionar células do sistema imunitário para células indesejadas (Patente U.S. 4676980) e para tratamento de infecção por VIH (WO 91/00360, WO 92/200373 e EP 03089) . Anticorpos heteroconjugados podem ser produzidos utilizando quaisquer métodos de ligação cruzada convenientes. Agentes de ligação cruzada adequados são bem conhecidos na especialidade e são divulgados na Patente U.S. 4676980, juntamente com várias técnicas de ligação cruzada.

Na literatura foram também descritas técnicas para criação de anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpo. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem ser preparados utilizando ligação química. Brennan et al., Science 229: 81, 1985 descrevem um procedimento em que anticorpos intactos são proteoliticamente clivados para gerar fragmentos F(ab,)2. Estes fragmentos são reduzidos na presença de um agente de complexação de ditiol, arsenito de sódio, para estabilizar ditióis vicinais e prevenir a formação de dissulfuretos intermoleculares. Os fragmentos Fab' gerados são então convertidos em derivados tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados Fab'-TNB é então reconvertido no Fab'-tiol através de redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado Fab'-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser utilizados como agentes para a imobilização selectiva de enzimas. O progresso recente facilitou a recuperação directa de fragmentos Fab'-SH a partir de E. coli, que podem ser 38 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ quimicamente ligados para formar anticorpos biespecificos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225, 1992 descrevem a produção de uma molécula F(ab')2 de anticorpo biespecifico completamente humanizada. Cada fragmento Fab' foi separadamente segregado de E. coli e sujeito a ligação quimica directa in vitro para formar o anticorpo biespecifico. 0 anticorpo biespecifico assim formado foi capaz de se ligar a células que sobre-expressam o receptor ErbB2 e células T humanas normais, bem como desencadear a actividade litica de linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumores da mama humanos.

Foram também descritas várias técnicas para produzir e isolar fragmentos de anticorpo biespecificos directamente a partir de cultura de células recombinantes. Por exemplo, foram produzidos anticorpos biespecificos utilizando fechos de leucina. Kostelny et ai., J. Immunol. 148(5): 1547-1553, 1992. Os péptidos com fechos de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes através de fusão génica. Os homodímeros do anticorpo foram reduzidos na região charneira para formar monómeros e depois re-oxidados para formar os heterodímeros do anticorpo. Este método pode também ser utilizado para a produção de homodímeros do anticorpo. A tecnologia de "diacorpos" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6444- 6448, 1993 proporcionou um mecanismo alternativo para produção de fragmentos de anticorpo biespecificos. Os fragmentos compreendem um VH ligado a um VL através de um ligante que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Assim, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a emparelhar com os domínios VL e VH complementares de outro fragmento, formando deste modo dois locais de ligação ao antigénio. Foi também relatada outra estratégia para produzir fragmentos de anticorpo biespecificos através da utilização de dímeros de Fv de cadeia simples (sFv). Ver Gruber et al., J. Immunol. 152: 5368, 1994.

Estão contemplados anticorpos com mais de duas valências. Por exemplo, podem ser preparados anticorpos triespecíficos. Tutt et ai., J. Immunol. 147: 60, 1991. 39 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ

Anticorpos multivalentes

Um anticorpo multivalente pode ser internalizado (e/ou catabolizado) mais depressa que um anticorpo bivalente por uma célula expressando um antigénio ao qual os anticorpos se ligam. Os anticorpos do presente invento podem ser anticorpos multivalentes (que não são da classe IgM) com três ou mais locais de ligação ao antigénio (p.ex., anticorpos tetravalentes), que podem ser facilmente produzidos através de expressão recombinante de ácido nucleico codificando as cadeias polipeptidicas do anticorpo. 0 anticorpo multivalente pode compreender um domínio de dimerização e três ou mais locais de ligação ao antigénio. 0 domínio de dimerização preferido compreende (ou consiste em) uma região Fc ou uma região charneira. Neste cenário, o anticorpo compreenderá uma região Fc e três ou mais locais de ligação ao antigénio amino-terminais à região Fc. 0 anticorpo multivalente preferido daqui compreende (ou consiste em) três a cerca de oito, mas de preferência quatro, locais de ligação ao antigénio. 0 anticorpo multivalente compreende pelo menos uma cadeia polipeptídica (e de preferência duas cadeias polipeptidicas) , em que a cadeia ou cadeias polipeptídicas compreendem dois ou mais domínios variáveis. Por exemplo, a cadeia ou cadeias polipeptídicas podem compreender VD1-(XI)n-VD2-(X2)n-Fc, em que VD1 é um primeiro domínio variável, VD2 é um segundo domínio variável, Fc é uma cadeia polipeptídica de uma região Fc, XI e X2 representam um aminoácido ou polipéptido, e n é 0 ou 1. Por exemplo, a cadeia ou cadeias polipeptídicas podem compreender: VH-CHl-ligante flexível-VH-CHl-cadeia da região Fc; ou VH-CHl-VH-CHl-cadeia da região Fc. 0 anticorpo multivalente daqui compreende ainda de preferência pelo menos dois (e de preferência quatro) polipéptidos do domínio variável da cadeia leve. 0 anticorpo multivalente daqui pode, por exemplo, compreender de cerca de dois a cerca de oito polipéptidos do domínio variável da cadeia leve. Os polipéptidos do domínio variável da cadeia leve aqui contemplados compreendem um domínio variável da cadeia leve e, opcionalmente, compreendem ainda um domínio CL.

Outras modificações da sequência de aminoácidos

Está contemplada a modificação ou modificações da sequência de aminoácidos dos anticorpos de ligação a CD20 aqui descritos. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do 40 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ anticorpo. Variantes da sequência de aminoácidos do anticorpo anti-CD20 são preparadas através da introdução de mudanças de nucleótidos apropriadas no ácido nucleico do anticorpo anti-CD20, ou através de síntese peptídica. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções de, e/ou inserções em e/ou substituições de, resíduos dentro das sequências de aminoácidos do anticorpo anti-CD20. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição é feita para chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas. As mudanças de aminoácidos podem também alterar processos pós-tradução do anticorpo anti-CD20, tais como mudança do número ou da posição de locais de glicosilação.

Um método útil para identificação de certos resíduos ou regiões do anticorpo anti-CD20 que são localizações preferidas para mutagénese é designado "mutagénese por varrimento de alaninas" tal como descrito por Cunningham e Wells em Science 244: 1081-1085, 1989. Aqui, é identificado um resíduo ou grupo de resíduos alvo (p.ex., resíduos com carga tais como arg, asp, his, lys, e glu) que é substituído por um aminoácido neutro ou com carga negativa (de preferência alanina ou polialanina) para afectar a interacção dos aminoácidos com o antigénio CD20. Os locais de aminoácidos demonstrando sensibilidade funcional às substituições são então refinados através da introdução de mais ou de outras variantes em, ou para, os locais de substituição. Assim, embora o local para introdução de uma variação da sequência de aminoácidos seja predeterminado, a natureza da mutação per se não necessita de ser predeterminada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação num dado local, é conduzida mutagénese por varrimento de ala ou aleatória no codão ou região alvo e as variantes do anticorpo anti-CD20 expressas são pesquisadas quanto à actividade desejada.

Inserções na sequência de aminoácidos incluem fusões amino-terminais e/ou carboxi-terminais variando no comprimento de um resíduo a polipéptidos contendo cem ou mais resíduos, bem como inserções intra-sequência de um ou múltiplos resíduos de aminoácidos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo anti-CD20 com um resíduo metionilo N-terminal ou o anticorpo fundido com um polipéptido citotóxico. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo anti-CD20 41 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ incluem a fusão com o terminal N ou C do anticorpo anti-CD20 de uma enzima (p.ex. para ADEPT) ou um polipéptido que aumente a semivida sérica do anticorpo.

Outro tipo de variante é uma variante de substituição de aminoácidos. Estas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de anticorpo anti-CD20 substituído por um resíduo diferente. Os locais de maior interesse para mutagénese de substituição incluem as regiões hipervariáveis, mas estão também contempladas alterações em FR. Substituições conservativas são mostradas na Tabela abaixo sob o cabeçalho de "substituições preferidas". Se tais substituições resultarem numa mudança na actividade biológica, então mais mudanças substanciais, denominadas "substituições exemplares" na Tabela, ou tal como melhor descrito abaixo em referência às classes de aminoácidos, podem ser introduzidas e os produtos pesquisados. TABELA de Substituições de Aminoácidos

Resíduo Original Substituições Exemplificativas Substituições Preferidas Ala (A) vai; leu; ile vai Arg (R) lys; gin; asn lys Asn (N) gin; his; asp, lys; arg gin Asp (D) glu; asn glu Cys (C) ser; ala ser Gin (Q) asn; glu asn Glu (E) asp; gin asp Gly (G) ala ala His (H) asn; gin; lys; arg arg He (I) leu; vai; met; ala; phe; norleucina leu Leu (L) norleucina; ile; vai; met; ala; phe ile Lys (K) arg; gin; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; vai; ile; ala; tyr tyr Pro (P) ala ala Ser (S) thr thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe Vai (V) ile; leu; met; phe; ala; norleucina leu 42

ΕΡ 1 572 7 4 4/PT

Modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo são alcançadas através de selecção de substituições que difiram significativamente no seu efeito na manutenção (а) da estrutura do esqueleto polipeptidico na área da substituição, por exemplo, como conformação em folha ou helicoidal, (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no local alvo, ou (c) do volume da cadeia lateral. Os resíduos de ocorrência natural são divididos em grupos com base em propriedades comuns das cadeias laterais: (1) hidrófobos: norleucina, met, ala, vai, leu, ile; (2) neutros hidrófilos: cys, ser, thr; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: asn, gin, his, lys, arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: gly, pro; e (б) aromáticos: trp, tyr, phe.

Substituições não conservativas implicarão a permuta de um membro de uma destas classes por outro de outra classe.

Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação correcta do anticorpo anti-CD20 pode também ser substituído, geralmente com serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e prevenir ligação cruzada aberrante. Inversamente, pode ser adicionada uma ligação ou ligações de cisteína ao anticorpo para melhorar a sua estabilidade (particularmente quando o anticorpo é um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fv).

Um tipo particularmente preferido de variante de substituição envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo parental (p.ex. um anticorpo humanizado ou humano). Geralmente, a variante ou variantes resultantes seleccionadas para mais desenvolvimento terão melhores propriedades biológicas relativamente ao anticorpo parental a partir do qual são geradas. Um modo conveniente para gerar tais variantes de substituição envolve a maturação da afinidade utilizando apresentação fágica. Resumidamente, vários locais da região hipervariável (p.ex., 6-7 locais) são mutados para gerar todas as possíveis 43 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ substituições de aminoácidos em cada local. As variantes de anticorpo assim geradas são apresentadas de um modo monovalente a partir de partículas fágicas filamentosas como fusões com o produto do gene III de M13 empacotadas dentro de cada partícula. As variantes apresentadas por fagos são então pesquisadas quanto à sua actividade biológica (p.ex., afinidade de ligação) tal como aqui divulgado. Para identificar locais da região hipervariável candidatos para modificação, pode ser efectuada mutagénese por varrimento de alanina para identificar resíduos da região hipervariável contribuindo significativamente para a ligação ao antigénio. Alternativamente, ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura cristalina do complexo antigénio-anticorpo para identificar pontos de contacto entre o anticorpo e o CD20 humano. Tais resíduos de contacto e resíduos vizinhos são candidatos para substituição de acordo com as técnicas aqui descritas. Uma vez geradas tais variantes, o painel de variantes é sujeito a pesquisa tal como aqui descrito e os anticorpos com propriedades superiores num ou mais ensaios relevantes podem ser seleccionados para mais desenvolvimento.

Outro tipo de variante de aminoácidos do anticorpo altera o padrão de glicosilação original do anticorpo. Por alteração entenda-se a deleção de uma ou mais porções hidrato de carbono verificadas no anticorpo e/ou adição de um ou mais locais de glicosilação que não estão presentes no anticorpo. A glicosilação dos anticorpos é tipicamente ligada em N ou em 0. Ligada em N refere-se à união da porção hidrato de carbono à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências tripeptídicas asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido excepto prolina, são as sequências de reconhecimento para união enzimática da porção hidrato de carbono à cadeia lateral da asparagina. Assim, a presença de uma destas sequências tripeptídicas num polipéptido cria um potencial local de glicosilação. A glicosilação ligada em 0 refere-se à união de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um hidroxiaminoácido, mais vulgarmente serina ou treonina, embora possa também ser utilizada 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina. 44 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ A adição de locais de glicosilação ao anticorpo é convenientemente alcançada através da alteração da sequência de aminoácidos para que contenha uma ou mais das sequências tripeptidicas descritas acima (para locais de glicosilação ligados em N) . A alteração pode também ser feita através da adição de, ou da substituição por, um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência do anticorpo original (para locais de glicosilação ligados em 0).

As moléculas de ácido nucleico codificando variantes da sequência de aminoácidos do anticorpo anti-CD20 são preparadas através de uma variedade de métodos conhecidos na especialidade. Estes métodos incluem, mas não se limitam a, isolamento a partir de uma fonte natural (no caso de variantes da sequência de aminoácidos de ocorrência natural) ou preparação através de mutagénese mediada por oligonucleótidos (ou dirigida ao local), mutagénese por PCR e mutagénese de cassete de uma variante preparada anteriormente ou de uma versão não variante do anticorpo anti-CD20.

Pode ser desejável modificar o anticorpo do presente invento em relação à função efectora, p.ex. para aumentar a citotoxicidade mediada por células dependente do antigénio (ADCC) e/ou a citotoxicidade dependente do complemento (CDC) do anticorpo. Isto pode ser alcançado através da introdução de uma ou mais substituições de aminoácidos numa região Fc do anticorpo. Alternativamente ou adicionalmente, o resíduo ou resíduos de cisteína podem ser introduzidos na região Fc, permitindo deste modo a formação de ligações dissulfureto intercadeias nesta região. 0 anticorpo homodimérico assim gerado pode ter uma melhor capacidade de internalização e/ou maior matança celular mediada pelo complemento e citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). Ver Caron et al., J. Exp Med. 176: 1191-1195, 1992 e Shopes, B., J. Immunol. 148: 2918-2922, 1992. Anticorpos homodiméricos com maior actividade antitumoral podem também ser preparados utilizando ligantes cruzados heterobifuncionais tal como descrito em Wolff et al., Câncer Research 53: 2560-2565, 1993. Alternativamente, pode ser desenhado um anticorpo que tenha regiões Fc duplas e que possa deste modo ter maiores 45 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ capacidades de lise mediada pelo complemento e de ADCC. Ver Stevenson et ai., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230, 1989.

Para aumentar a semivida sérica do anticorpo, pode-se incorporar um epitopo de ligação ao receptor de recuperação no anticorpo (especialmente um fragmento de anticorpo) tal como descrito, por exemplo, na Patente U.S. 5739277. Tal como aqui se utiliza, o termo "epitopo de ligação ao receptor de recuperação" refere-se a um epitopo da região Fc de uma molécula IgG (p.ex., IgGi, IgG2, IgG3 ou IgG4) que seja responsável por aumentar a semivida sérica in vivo da molécula IgG.

Outras modificações do anticorpo

Outras modificações do anticorpo estão aqui contempladas. Por exemplo, o anticorpo pode ser ligado a um de uma variedade de polímeros não proteináceos, p.ex., polietilenoglicol, polipropilenoglicol, polioxialquilenos ou copolímeros de polietilenoglicol e polipropilenoglicol. O anticorpo pode também estar aprisionado em microcápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas de coacervação ou através de polimerização interfacial (por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente), em sistemas de distribuição de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartícuias e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16a edição, Oslo, A., Ed., 1980.

Pesquisa de anticorpos com as propriedades desejadas

Anticorpos com certas características biológicas podem ser seleccionados tal como descrito nos Exemplos Experimentais.

Os efeitos inibidores do crescimento de um anticorpo anti-CD20 do presente invento podem ser avaliados através de método bem conhecidos na especialidade, p.ex., utilizando células que expressam CD20 endogenamente ou após transfecção com o gene CD20. Por exemplo, linhas celulares tumorais e células transfectadas com CD20 podem ser tratadas com um ΕΡ 1 572 744/ΡΤ 4 6 anticorpo monoclonal anti-CD20 do presente invento a várias concentrações durante alguns dias (p.ex., 2-7) e coradas com violeta cristal ou MTT ou analisadas através de algum outro ensaio colorimétrico. Outro método de medição da proliferação seria através de comparação da tomada de 3H-timidina pelas células tratadas na presença ou ausência de um anticorpo anti-CD20 do presente invento. Após tratamento com anticorpo, as células são colhidas e a quantidade de radioactividade incorporada no ADN é quantificada num contador de cintilações. Controlos positivos apropriados incluem tratamento de uma linha celular seleccionada com um anticorpo inibidor do crescimento que se saiba inibir o crescimento dessa linha celular.

Para seleccionar anticorpos que induzam morte celular, a perda de integridade membranar tal como indicada por, p.ex., tomada de iodeto de propídio (PI), azul tripano ou 7AAD pode ser avaliada relativamente ao controlo. 0 ensaio de tomada de PI pode ser efectuado na ausência de complemento e células imunitárias efectoras. Células tumorais expressando CD-20 são incubadas apenas com meio ou com meio contendo o anticorpo monoclonal apropriado a, p.ex., cerca de 10 pg/ml. As células são incubadas durante um período de 3 dias. Após cada tratamento, as células são lavadas e divididas em alíquotas em 12 x 75 tubos de 35 mm com tampa de filtro (1 ml por tubo, 3 tubos por grupo de tratamento) para remoção de grumos celulares. Os tubos recebem então PI (10 pg/ml). As amostras podem ser analisadas utilizando um citómetro de fluxo FACSCAN™ e suporte lógico FACSCONVERT™ CellQuest (Becton Dickinson). Os anticorpos que induzem níveis estatisticamente significativos de morte celular tal como determinado através de tomada de PI podem ser seleccionados como anticorpos indutores de morte celular.

Para pesquisar anticorpos que se liguem a um epítopo em CD20 ligado por um anticorpo de interesse, pode ser efectuado um ensaio de bloqueio cruzado de rotina tal como o descrito em "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane, 1988. Este ensaio pode ser utilizado para determinar se um anticorpo de teste se liga ao mesmo local ou epítopo que um anticorpo anti-CD20 do presente invento. Alternativamente, ou adicionalmente, pode 47 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ ser efectuado ο mapeamento do epítopo através de métodos conhecidos na especialidade. Por exemplo, a sequência do anticorpo pode ser submetida a mutagénese tal como através de varrimento de alanina, para identificar residuos de contacto. 0 anticorpo mutante é inicialmente testado quanto à ligação com anticorpo policlonal para assegurar uma dobragem correcta. Num método diferente, péptidos correspondendo a diferentes regiões de CD20 podem ser utilizados em ensaios de competição com os anticorpos de teste ou com um anticorpo de teste e um anticorpo com um epítopo caracterizado ou conhecido.

Vectores, Células Hospedeiras e Métodos Recombinantes 0 presente invento proporciona também um ácido nucleico isolado codificando um anticorpo de ligação a CD20 humanizado, vectores e células hospedeiras compreendendo o ácido nucleico, e técnicas recombinantes para a produção do anticorpo.

Para produção recombinante do anticorpo, o ácido nucleico codificando-o é isolado e inserido num vector replicável para mais clonagem (amplificação do ADN) ou para expressão. 0 ADN codificando o anticorpo monoclonal é facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (p.ex., através da utilização de sondas oligonucleotídicas que sejam capazes de se ligar especificamente a genes codificando as cadeias pesada e leve do anticorpo). Estão disponíveis muitos vectores. Os componentes do vector incluem geralmente, mas não se limitam a, um ou mais dos seguintes: uma sequência sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento estimulador, um promotor e uma sequência de terminação da transcrição. (i) Componente sequência sinal 0 anticorpo de ligação a CD20 deste invento pode ser produzido de forma recombinante não apenas directamente, mas também como um polipéptido de fusão com um polipéptido heterólogo, que é de preferência uma sequência sinal ou outro polipéptido possuindo um local de clivagem específico no terminal N da proteína ou polipéptido maduro. A sequência sinal heteróloga seleccionada é de preferência uma que seja reconhecida e processada (i.e., clivada através de uma peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Para células 48 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ hospedeiras procarióticas que não reconhecem nem processam a sequência sinal do anticorpo de ligação a CD20 nativo, a sequência sinal é substituída por uma sequência sinal procariótica seleccionada, por exemplo, de entre o grupo dos comandos da fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp, ou enterotoxina II termoestável. Para secreção em levedura a sequência sinal nativa pode ser substituída, p.ex., pelo comando da invertase de levedura, comando do factor α (incluindo os comandos do factor α de Saccharomyces e Kluyveromyces) , ou o comando da fosfatase ácida, o comando da glucoamilase de C. albicans, ou o sinal descrito em WO 90/13646. Na expressão em células de mamífero, estão disponíveis sequências sinal de mamífero bem como comandos de secreção virais, por exemplo, o sinal da gD de herpes simplex. O ADN para tal região precursora é ligado enquadrado ao ADN codificando o anticorpo de ligação a CD20. (ii) Origem de replicação

Ambos os vectores de expressão e de clonagem contêm geralmente uma sequência de ácido nucleico que permite que o vector se replique numa ou mais células hospedeiras seleccionadas. Geralmente, em vectores de clonagem, esta sequência é uma que permite que o vector se replique independentemente do ADN cromossómico do hospedeiro e inclui origens de replicação ou sequências de replicação autónomas. Tais sequências são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, leveduras e vírus. A origem de replicação do plasmídeo pBR322 é adequada para a maioria das bactérias Gram-negativas, a origem do plasmídeo 2μ é adequada para leveduras e várias origens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para vectores de clonagem em células de mamífero. Geralmente, o componente origem de replicação não é necessário para vectores de expressão de mamífero (a origem de SV40 pode ser tipicamente utilizada apenas por conter o promotor inicial). (iii) Componente gene de selecção

Os vectores de expressão e clonagem podem conter um gene de selecção, também designado marcador seleccionável. Genes de selecção típicos codificam proteínas que (a) conferem 49 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ resistência a antibióticos ou outras toxinas, p.ex., ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis em meios complexos, p.ex., o gene codificando a D-alanina-racemase para Bacilli.

Um exemplo de um esquema de selecção utiliza um fármaco para parar o crescimento de uma célula hospedeira. As células que são transformadas com sucesso com um gene heterólogo produzem uma proteína conferindo resistência a fármacos e sobrevivem assim ao regime de selecção. Exemplos de tal selecção dominante utilizam os fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Outro exemplo de marcadores seleccionáveis adequados para células de mamífero são os que permitem a identificação de células competentes para tomar o ácido nucleico do anticorpo de ligação a CD20, tal como DHFR, timidina-quinase, metalotioneína I e II, de preferência genes de metalotioneína de primata, adenosina-desaminase, ornitina-descarboxilase, etc.

Por exemplo, células transformadas com o gene de selecção de DHFR são primeiro identificadas através de cultura de todos os transformantes num meio de cultura que contém metotrexato (Mtx), um antagonista competitivo de DHFR. Uma célula hospedeira apropriada quando é empregue DHFR de tipo selvagem é a linha celular de ovário de hamster chinês (CHO) deficiente na actividade de DHFR (p.ex., ATCC CRL-9096).

Alternativamente, células hospedeiras (particularmente hospedeiros de tipo selvagem que contêm DHFR endógena) transformadas ou co-transformadas com sequências de ADN codificando um anticorpo de ligação a CD20, a proteína DHFR de tipo selvagem, e outro marcador seleccionável tal como a aminoglicósido-3'-fosfotransferase (APH) podem ser seleccionadas através de crescimento celular em meio contendo um agente de selecção para o marcador seleccionável tal como um antibiótico aminoglicosídico, p.ex., canamicina, neomicina ou G418. Ver Patente U.S. 4965199. 50 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ

Um gene de selecção adequado para utilização em levedura é o gene trpl presente no plasmídeo de levedura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature 282: 39, 1979). O gene trpl proporciona um marcador de selecção para uma estirpe mutante de levedura sem a capacidade para crescer em triptofano, por exemplo, ATCC N.° 44076 ou PEP4-1. Jones, Genetics 85: 12, 1977. A presença da lesão de trpl no genoma da célula hospedeira de levedura proporciona então um ambiente eficaz para detecção de transformação através de crescimento na ausência de triptofano. Semelhantemente, estirpes de levedura deficientes em Leu2 (ATCC 20622 ou 38626) são complementadas por plasmídeos conhecidos possuindo o gene Leu2.

Adicionalmente, vectores derivados do plasmídeo circular de 1,6 ym pKDl podem ser utilizados para transformação de leveduras Kluyveromyces. Alternativamente, foi relatado para K. lactis um sistema de expressão para produção em larga escala de quimosina de vitelo recombinante. Van den Berg, Bio/Technology 8: 135, 1990. Foram também divulgados vectores de expressão estável de múltiplas cópias para secreção de albumina do soro humana recombinante por estirpes industriais de Kluyveromyces. Fleer et al., Bio/Technology 9: 968-975, 1991. (iv) Componente promotor

Os vectores de expressão e clonagem contêm habitualmente um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e está operativamente ligado ao ácido nucleico codificando o anticorpo de ligação a CD20. Promotores adequados para utilizar com hospedeiros procarióticos incluem o promotor de phoA, sistemas promotores da β-lactamase e lactose, promotor da fosfatase alcalina, um sistema promotor de triptofano (trp), e promotores híbridos tais como o promotor tac. No entanto, são adequados outros promotores bacterianos conhecidos. Os promotores para utilização em sistemas bacterianos conterão também uma sequência de Shine-Dalgarno (S.D.) operativamente ligada ao ADN codificando o anticorpo de ligação a CD20. São conhecidas sequências promotoras para eucariotas. Virtualmente todos os genes eucarióticos têm uma região rica em AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases a montante do 51 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ local onde a transcrição é iniciada. Outra sequência verificada 70 a 80 bases a montante do inicio da transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT onde N pode ser qualquer nucleótido. Na extremidade 3' da maioria dos genes eucarióticos está uma sequência AATAAA que pode ser o sinal para a adição de uma cauda poli-A na extremidade 3' da sequência de codificação. Todas estas sequências estão adequadamente inseridas em vectores de expressão eucarióticos.

Exemplos de sequências promotoras adequadas para utilizar com hospedeiros de levedura incluem os promotores para 3-fosfoglicerato-quinase ou outras enzimas glicoliticas, tais como enolase, gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase, hexoquinase, piruvato-descarboxilase, fosfofrutoquinase, glucose-6-fosfato-isomerase, 3-fosfoglicerato-mutase, piruvato-quinase, triosefosfato-isomerase, fosfoglucose-isomerase e glucoquinase.

Outros promotores de levedura, que são promotores indutiveis possuindo a vantagem adicional de transcrição controlada através das condições de crescimento, são as regiões promotoras para a álcool-desidrogenase 2, isocitocromo C, fosfatase ácida, enzimas degradativas associadas ao metabolismo do azoto, metalotioneina, gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase, e enzimas responsáveis pela utilização da maltose e galactose. Vectores e promotores adequados para utilização em expressão em levedura são ainda descritos em EP 73657. Estimuladores de levedura são também vantajosamente utilizados com promotores de levedura. A transcrição do anticorpo de ligação a CD20 a partir de vectores em células hospedeiras de mamífero é controlada, por exemplo, por promotores obtidos a partir dos genomas de vírus tais como o vírus do polioma, vírus da varíola aviária, adenovírus (tais como o Adenovírus 2), vírus do papiloma bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite B e de preferência Vírus Símio 40 (SV40), de promotores de mamífero heterólogos, p.ex., o promotor da actina ou um promotor de imunoglobulina, de promotores de choque térmico, desde que tais promotores sejam compatíveis com os sistemas celulares hospedeiros. 52 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ

Os promotores inicial e tardio do vírus SV40 são convenientemente obtidos como um fragmento de restrição de SV40 que contém também a origem de replicação virai de SV40. 0 promotor inicial imediato do citomegalovírus humano é convenientemente obtido como um fragmento de restrição HindiII E. Um sistema para expressar ADN em hospedeiros mamíferos utilizando o vírus de papiloma bovino como vector é divulgado na Patente U.S. 4419446. Uma modificação deste sistema é descrita na Patente U.S. 4601978. Ver também Reyes et ai., Nature 297: 598-601, 1982 sobre expressão de ADNc de interferão β humano em células de ratinho sob o controlo de um promotor da timidina-quinase do vírus herpes simplex. Alternativamente, pode ser utilizada como promotor a repetição terminal longa do Vírus do Sarcoma de Rous. (v) Componente elemento estimulador A transcrição de um ADN codificando o anticorpo de ligação a CD20 deste invento por eucariotas superiores é frequentemente aumentada através da inserção de uma sequência estimuladora no vector. Muitas sequências estimuladoras são agora conhecidas provenientes de genes de mamífero (globina, elastase, albumina, α-fetoproteína e insulina). Tipicamente, no entanto, utilizar-se-á um estimulador de um vírus de células eucarióticas. Exemplos incluem o estimulador de SV40 no lado tardio da origem de replicação (pb 100-270), o estimulador do promotor inicial de citomegalovírus, o estimulador de polioma no lado tardio da origem de replicação e estimuladores adenovirais. Ver também Yaniv, Nature 291: 17-18, 1982 sobre elementos estimuladores para activação de promotores eucarióticos. O estimulador pode ser unido no vector numa posição a 5' ou 3' da sequência codificando o anticorpo de ligação a CD20, mas é de preferência localizado num local a 5' do promotor. (vi) Componente terminação da transcrição

Os vectores de expressão utilizados em células hospedeiras eucarióticas (células de levedura, fungos, insecto, vegetais, animais, humanas ou nucleadas de outros organismos multicelulares) conterão também sequências necessárias para a terminação da transcrição e para estabilização do ARNm. Tais sequências estão vulgarmente 53

ΕΡ 1 572 7 4 4/PT disponíveis nas regiões não traduzidas a 5', e ocasionalmente a 3', dos ADN ou ADNc eucarióticos ou virais. Estas regiões contêm segmentos nucleotídicos transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do ARNm codificando o anticorpo de ligação a CD20. Um componente terminação da transcrição útil é a região de poliadenilação da hormona de crescimento bovina. Ver WO 94/11026 e o vector de expressão aqui divulgado. (vii) Selecção e transformação de células hospedeiras Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão do ADN nos vectores daqui são as células de procariotas, leveduras ou eucariotas superiores descritas acima. Procariotas adequados para este fim incluem eubactérias, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae tais como Escherichia, p.ex., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, p.ex., Salmonella typhimurium, Serratia, p.ex., Serratia marcescans, e Shigella, bem como Bacilli tais como B. subtilis e B. licheniformis (p.ex., B. licheniformis 41P divulgado em DD 266710 publicada a 12 de Abril de 1989), Pseudomonas tais como P. aeruginosa, e Streptomyces. Um hospedeiro de clonagem E. coli preferido é E. coli 294 (ATCC 31446), embora sejam adequadas outras estirpes tais como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31537), e E. coli W3110 (ATCC 27325). Estes exemplos são ilustrativos e não limitantes. O anticorpo inteiro, fragmentos do anticorpo e proteínas de fusão do anticorpo podem ser produzidos em bactérias, em particular quando a glicosilação e a função efectora de Fc não são necessárias, tal como quando o anticorpo terapêutico é conjugado a um agente citotóxico (p.ex., uma toxina) e o imunoconjugado mostra por si mesmo eficácia na destruição de células tumorais. Os anticorpos inteiros têm maior semivida em circulação. A produção em E. coli é mais rápida e mais rentável. Para expressão de fragmentos e polipéptidos de anticorpos em bactérias, ver, p.ex., U.S. 5648237 (Cárter et al. ) , U.S. 5789199 (Joly et al.)r e U.S. 5840523 (Simmons et al.) que descrevem a região de início da tradução (TIR) e sequências sinal para optimização da expressão e secreção. Após expressão, o anticorpo é isolado da pasta de células de E. coli numa fracção solúvel e pode ser purificado através, 54 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ p.ex., de uma coluna de proteína A ou G dependendo do isotipo. A purificação final pode ser realizada de modo semelhante ao processo para purificação do anticorpo expresso p.ex., em células CHO.

Para além dos procariotas, micróbios eucarióticos tais como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vectores codificando o anticorpo de ligação a CD20. Saccharomyces cerevisiae, ou levedura de padeiro, é o mais vulgarmente utilizado entre os microrganismos hospedeiros eucarióticos inferiores. No entanto, vários outros géneros, espécies e estirpes estão vulgarmente disponíveis e são úteis aqui, tais como hospedeiros Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces tais como, p.ex., K. lactis, K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906), K. thermotolerans e K. marxianus; Yarrowia (EP 402226); Pichia pastoris (EP 183070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244234); Neurospora crassa·, Schwanniomyces tais como Schwanniomyces occidentalis; e fungos filamentosos tais como, p.ex., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium e hospedeiros Aspergillus tais como A. nidulans e A. niger. Células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpo de ligação a CD20 glicosilado são derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrado incluem células vegetais e de insecto. Foram identificadas numerosas estirpes e variantes de baculovírus e correspondentes células hospedeiras de insecto permissivas de hospedeiros tais como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca da fruta) e Bombyx mori. Uma variedade de estirpes virais para transfecção está publicamente disponível, p.ex., a variante L-l de NPV de Autographa californica e a estirpe Bm-5 de NPV de Bombyx mori, e tais vírus podem ser utilizados como o vírus daqui de acordo com o presente invento, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda. 55 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ

Podem também ser utilizadas como hospedeiros culturas de células vegetais de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate e tabaco.

No entanto, o interesse tem sido maior em células de vertebrado e a propagação de células de vertebrado em cultura (cultura de tecidos) tornou-se um procedimento de rotina. Exemplos de linhas celulares hospedeiras de mamífero úteis são a linha de rim de macaco CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); a linha de rim embrionário humano (293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59, 1977); células de rim de hamster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 4216, 1980); células de Sertoli de ratinho (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251, 1980); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células hepáticas de rato-búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de ratinho (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al. , Annals N.Y. Acad. Sei. 383: 44-68, 1982); células MRC 5; células FS4; e uma linha de hepatoma humano (Hep G2).

As células hospedeiras são transformadas com os vectores de expressão ou de clonagem acima descritos para produção do anticorpo de ligação a CD20 e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conforme apropriado para indução de promotores, selecção de transformantes ou amplificação dos genes codificando as sequências desejadas. (viii) Cultura das células hospedeiras

As células hospedeiras utilizadas para produzir o anticorpo de ligação a CD20 deste invento podem ser cultivadas numa variedade de meios. Meios comercialmente disponíveis tais como F10 de Ham (Sigma), Meio Essencial Mínimo ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) e Meio de Eagle Modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) são adequados para cultura das células hospedeiras. Adicionalmente, qualquer um dos meios descritos 56 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ em Ham et al., Meth. Enz. 58: 44, 1979, Barnes et al., Anal.

Biochem. 102: 255, 1980, Pat. U.S. 4767704; 4657866; 4927762; 4560655; ou 5122469; WO 90/03430; WO 87/00195; ou Patente U.S. Re. 30985 pode ser utilizado como meio de cultura para as células hospedeiras. Qualquer um destes meios pode ser suplementado conforme necessário com hormonas e/ou outros factores de crescimento (tais como insulina, transferrina ou factor de crescimento epidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tais como HEPES), nucleótidos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tais como o fármaco GENTAMYCIN™) , elementos vestigiais (definidos como compostos inorgânicos habitualmente presentes em concentrações finais na gama micromolar) e glicose ou uma fonte energética equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários podem também ser incluídos a concentrações apropriadas que serão conhecidas dos peritos na especialidade. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e semelhantes, são as anteriormente utilizadas com a célula hospedeira seleccionada para expressão e serão aparentes aos vulgares peritos na especialidade. (ix) Purificação do anticorpo

Quando se utilizam técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido intracelularmente, no espaço periplasmático ou segregado directamente para o meio. Se o anticorpo for produzido intracelularmente, como primeiro passo, são removidos os restos particulados, sejam células hospedeiras ou fragmentos lisados, por exemplo através de centrifugação ou ultrafiltração. Cárter et al., Bio/Technology 10: 163-167, 1992 descrevem um procedimento para isolamento de anticorpos que são segregados para o espaço periplasmático de E. coli. Resumidamente, a pasta celular é descongelada na presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA e fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF) durante cerca de 30 minutos. Os restos celulares podem ser removidos através de centrifugação. Quando o anticorpo é segregado para o meio, os sobrenadantes de tais sistemas de expressão são geralmente primeiro concentrados utilizando um filtro de concentração de proteínas comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de proteases tal como PMSF pode ser incluído em qualquer um dos passos anteriores para inibir a 57 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ proteólise e podem ser incluídos antibióticos para prevenir o crescimento de contaminantes acidentais.

A composição de anticorpo preparada a partir das células pode ser purificada utilizando, por exemplo, cromatografia de hidroxilapatite, electroforese em gel, diálise e cromatografia de afinidade, sendo a cromatografia de afinidade a técnica de purificação preferida. A adequabilidade da proteína A como ligando de afinidade depende da espécie e do isotipo de qualquer domínio Fc de imunoglobulina que esteja presente no anticorpo. A proteína A pode ser utilizada para purificar anticorpos que se baseiem nas cadeias pesadas humanas γΐ, γ2 ou γ4 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13, 1983) . A proteína G é recomendada para todos os isotipos de ratinho e para a γ3 humana (Guss et al., EMBO J. 5: 1567-1575, 1986). A matriz à qual o ligando de afinidade é ligado é muito frequentemente agarose, mas estão disponíveis outras matrizes. Matrizes mecanicamente estáveis tais como vidro de poro controlado ou poli(estirenodivinil)benzeno permitem caudais mais rápidos e tempos de processamento mais curtos dos que podem ser alcançados com agarose. Quando o anticorpo compreende um domínio CH3, é útil para purificação a resina Bakerbond ABX™ (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ). Outras técnicas para purificação de proteínas tais como fraccionamento numa coluna de permuta iónica, precipitação em etanol, HPLC de Fase Inversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina, cromatografia de SEPHAROSE™ numa resina de permuta aniónica ou catiónica (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocagem, SDS-PAGE e precipitação em sulfato de amónio estão também disponíveis, dependendo do anticorpo a recuperar.

Após qualquer passo ou passos de purificação preliminares, a mistura compreendendo o anticorpo de interesse e contaminantes pode ser sujeita a cromatografia de interacção hidrófoba de baixo pH utilizando um tampão de eluição a um pH entre cerca de 2,5-4,5, de preferência efectuada a baixas concentrações salinas (p.ex., de cerca de 0-0,25 M de sal).

Conjugados de anticorpo O anticorpo pode ser conjugado a um agente citotóxico tal como uma toxina ou um isótopo radioactivo. Em certas concretizações, é preferido que a toxina seja caliqueamicina, 58 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ um maitansinóide, uma dolastatina, auristatina E e análogos ou derivados destas. Fármacos/toxinas preferidos incluem agentes de danificação do ADN, inibidores da polimerização ou despolimerização dos microtúbulos e antimetabolitos. Classes preferidas de agentes citotóxicos incluem, por exemplo, os inibidores enzimáticos tais como inibidores da di-hidrofolato-redutase e inibidores da timidilato-sintetase, intercaladores de ADN, clivadores de ADN, inibidores da topoisomerase, a família de fármacos antraciclinas, os fármacos vinca, as mitomicinas, as bleomicinas, os nucleósidos citotóxicos, a família de fármacos pteridinas, diinenos, as podofilotoxinas e indutores de diferenciação. Membros particularmente úteis destas classes incluem, por exemplo, metotrexato, metopterina, diclorometotrexato, 5-fluorouracilo, 6-mercaptopurina, arabinósido de citosina, melfalano, leurosina, leurosideina, actinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, N-(5,5- diacetoxipentil)doxorrubicina, morfolinodoxorrubicina, 1—(2 — cloroetil)-1,2-dimetanossulfonil-hidrazida, N8-acetilespermidina, aminopterina metopterina, esperamicina, mitomicina C, mitomicina A, actinomicina, bleomicina, carminomicina, aminopterina, talissomicina, podofilotoxina e derivados de podofilotoxina tais como etoposido ou fosfato de etoposido, vinblastina, vincristina, vindesina, taxol, taxotere, ácido retinóico, ácido butírico, N8-acetilespermidina, camptotecina, caliqueamicina, briostatinas, cefalostatinas, ansamitocina, actosina, maitansinóides tais como DM-1, maitansina, maitansinol, N-desmetil-4,5-desepoximaitansinol, C-19-decloro-maitansinol, C-2O-hidroximaitansinol, C-20-emetoximaitansinol, C-9-SH-maitensinol, C-l4-alcoximetilmaitansinol, C-14-hidroxi ou acetiloximetilmaitansinol, C-15-hidroxi/acetiloximaitansinol, C-15-metoximaitansinol, C-l8-N-demetilmaitansinol e 4,5-desoximaitansinol, auristatinas tais como auristatina E, M, PHE e PE; dolostatinas tais como dolostatina A, dolostatina B, dolostatina C, dolostatina D, dolostatina E (20-epi e 11-epi), dolostatina G, dolostatina H, dolostatina I, dolostatina 1, dolostatina 2, dolostatina 3, dolostatina 4, dolostatina 5, dolostatina 6, dolostatina 7, dolostatina 8, dolostatina 9, dolostatina 10, deo-dolostatina 10, dolostatina 11, dolostatina 12, dolostatina 13, dolostatina 14, dolostatina 15, dolostatina 16, dolostatina 17, e dolostatina 18; cefalostatinas tais como 59 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ cefalostatina 1, cefalostatina 2, cefalostatina 3, cefalostatina 4, cefalostatina 5, cefalostatina 6, cefalostatina 7, 25'-epi-cefalostatina 7, 20-epi-cefalostatina 7, cefalostatina 8, cefalostatina 9, cefalostatina 10, cefalostatina 11, cefalostatina 12 , cefalostatina 13, cefalostatina 14, cefalostatina 15 , cefalostatina 16, cefalostatina 17, cefalostatina 18 e cefalostatina 19.

Os maitansinóides são inibidores mitóticos que actuam através da inibição da polimerização da tubulina. A maitansina foi isolada pela primeira vez a partir do arbusto da África oriental Maytenus serrata (Patente U.S. 3896111). Subsequentemente, foi descoberto que certos micróbios também produzem maitansinóides, tais como maitansinol e ésteres C-3 de maitansinol (Patente U.S. 4151042). O maitansinol sintético e seus derivados e análogos são divulgados, por exemplo, nas Patentes U.S. 4137230; 4248870; 4256746; 4260608; 4265814; 4294757; 4307016; 4308268; 4308269; 4309428; 4313946; 4315929; 4317821; 4322348; 4331598; 4361650; 4364866; 4424219; 4450254; 4362663; e 4371533.

Maitansina e maitansinóides foram conjugados com anticorpos que se ligam especificamente a antigénios de células tumorais. Imunoconjugados contendo maitansinóides e sua utilização terapêutica são divulgados, por exemplo, nas Patentes U.S. 5208020, 5416064 e Patente Europeia ΕΡ 0425235B1. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 8618-8623, 1996 descrevem imunoconjugados compreendendo um maitansinóide designado DM1 ligado ao anticorpo monoclonal C242 dirigido contra cancro colorrectal humano. Verificou-se que o conjugado era altamente citotóxico contra células de cancro do cólon em cultura, e mostrava actividade antitumoral num ensaio de crescimento tumoral in vivo. Chari et al., Câncer Research 52: 127-131, 1992 descrevem imunoconjugados nos quais um maitansinóide foi conjugado através de um ligante dissulfureto com o anticorpo de murideo A7 que se liga a um antigénio em linhas celulares de cancro do cólon humano, ou com outro anticorpo monoclonal de murideo TA.l que se liga ao oncogene HER-2/neu.

Existem muitos grupos de ligação conhecidos na especialidade para produzir conjugados anticorpo- 60 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ maitansinóide, incluindo, por exemplo, os divulgados na Patente U.S. 5208020 ou Patente ΕΡ 0425235B1, e Chari et al., Câncer Research 52: 127-131, 1992. Os grupos de ligação incluem grupos dissulfureto, grupos tioéter, grupos sensíveis a ácido, grupos fotossensíveis, grupos sensíveis a peptidases, ou grupos sensíveis a esterases, tal como divulgado nas patentes acima identificadas, sendo preferíveis os grupos dissulfureto e tioéter.

Os conjugados do anticorpo e maitansinóide podem ser produzidos utilizando uma variedade de agentes de ligação de proteínas bifuncionais tais como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclo-hexano-l-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como dimetiladipimidato-HC1), ésteres activos (tais como dissuccinimidilsuberato), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis(p-azidobenzoí1)-hexanodiamina) , derivados bis- diazónio (tais como bis-(p-diazónio-benzoí1)etilenodiamina), diisocianatos (tais como tolueno-2,6-diisocianato) , e compostos de flúor bis-activos (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Agentes de ligação particularmente preferidos incluem N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) (Carlsson et ai., Biochem. J. 173: 723-737, 1978) e N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP) para proporcionar uma ligação dissulfureto. O ligante pode ser ligado à molécula de maitansinóide em várias posições, dependendo do tipo de ligação. Por exemplo, uma ligação éster pode ser formada através de reacção com um grupo hidroxilo utilizando técnicas de ligação convencionais. A reacção pode ocorrer na posição C-3 possuindo um grupo hidroxilo, a posição C-14 modificada com hidroximetilo, a posição C-15 modificada com um grupo hidroxilo, e a posição C-20 possuindo um grupo hidroxilo. Numa concretização preferida, a ligação é formada na posição C-3 do maitansinol ou de um análogo de maitansinol.

Caliqueamicina

Outro imunoconjugado de interesse compreende um anticorpo de ligação a CD20 conjugado com uma ou mais moléculas de caliqueamicina. Os antibióticos da família caliqueamicina são 61 ΕΡ 1 572 744/PT capazes de produzir quebras no ADN de cadeia dupla a concentrações sub-picomolares. Para a preparação de conjugados da família caliqueamicina, ver patentes U.S. 5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001, 5877296 (todas para American Cyanamid Company). Análogos estruturais da caliqueamicina que podem ser utilizados incluem, mas não se limitam a γι1, OÍ21, OÍ31, N-acetil-γι1, PSAG e θΣι (Hinman et al., Câncer Research 53: 3336-3342, 1993, Lode et al., Câncer Research 58: 2925-2928, 1998 e as patentes U.S. acima mencionadas para American Cyanamid). Outro fármaco antitumoral com que o anticorpo pode ser conjugado é QFA que é um antifolato. Tanto caliqueamicina como QFA têm locais de acção intracelulares e não atravessam facilmente a membrana plasmática. Por essa razão, a tomada celular destes agentes através de internalização mediada por anticorpos aumenta grandemente os seus efeitos citotóxicos.

Isótopos radioactivos

Para destruição selectiva do tumor, o anticorpo pode compreender um átomo altamente radioactivo. Está disponível uma variedade de isótopos radioactivos para a produção de anticorpos anti-CD20 radioconjugados. Exemplos incluem At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Quando o conjugado é utilizado para diagnóstico, pode compreender um átomo radioactivo para estudos cintigráficos, por exemplo tc99m ou I123, ou um marcador de spin para imagiologia de ressonância magnética nuclear (RMN) (também conhecida como imagiologia de ressonância magnética, irm), tal como novamente iodo-123, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, azoto-15, oxigénio-17, gadolínio, manganésio ou ferro.

Os radiomarcadores ou outros marcadores podem ser incorporados no conjugado de modos conhecidos. Por exemplo, o péptido pode ser biossintetizado ou pode ser sintetizado através de síntese química de aminoácidos utilizando precursores de aminoácidos adequados envolvendo, por exemplo, flúor-19 em vez de hidrogénio. Marcadores tais como Tc99m ou I123, Re186, Re188 e In111 podem ser ligados através de um resíduo de cisteína no péptido. O ítrio-90 pode ser ligado através de um resíduo de lisina. O método IODOGEN (Fraker et al. Blochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57, 1978) pode ser utilizado para 62 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ incorporar iodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) descreve outros métodos em detalhe.

Os conjugados do anticorpo e agente citotóxico podem ser feitos utilizando uma variedade de agentes de ligação de proteínas bifuncionais tais como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-l-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como dimetiladipimidato-HCL), ésteres activos (tais como di-succinimidilsuberato), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis-(p-azidobenzoí1)-hexanodiamina), derivados bis-diazónio (tais como bis-(p-diazónio-benzoí1)etilenodiamina), diisocianatos (tais como tolueno-2,6-diisocianato), e compostos de flúor bis-activos (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno) . Por exemplo, uma imunotoxina de rícino pode ser preparada tal como descrito em Vitetta et al., Science 238: 1098, 1987. O ácido 1-isotiocianatobenzi1-3-metildietilenotriaminopenta-acético (MX-DTPA) marcado com carbono 14 é um agente quelante exemplar para conjugação de radionucleótidos com o anticorpo. Ver WO 94/11026. O ligante pode ser um "ligante clivável" facilitando a libertação do fármaco citotóxico na célula. Por exemplo, pode ser utilizado um ligante sensível a ácido, um ligante sensível a peptidases, um ligante fotossensível, um ligante de dimetilo ou ligante contendo dissulfureto (Chari et al., Câncer Research 52: 127-131, 1992; Patente U.S. 5208020).

Utilizações Terapêuticas dos Anticorpos de Ligação a CD20

Os anticorpos de ligação a CD20 do presente invento são úteis para tratar várias doenças malignas e não malignas incluindo doenças anti-imunes e condições relacionadas, e cancros positivos para CD20 incluindo linfomas e leucemias de células B. As células estaminais (progenitoras das células B) na medula óssea não possuem o antigénio CD20, permitindo gue células B saudáveis se regenerem após tratamento e regressem aos níveis normais em alguns meses.

Doenças auto-imunes ou condições relacionadas com auto-imunidade incluem artrite (artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, osteoartrite, artrite psoriática), 63 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ psoríase, dermatite incluindo dermatite atópica; urticária auto-imune crónica, polimiosite/dermatomiosite, necrólise epidérmica tóxica, esclerodermia e esclerose sistémicas, respostas associadas a doença inflamatória dos intestinos (DlI) (doença de Crohn, colite ulcerosa), síndroma de dificuldade respiratória, síndroma de dificuldade respiratória do adulto (SDRA), meningite, rinite alérgica, encefalite, uveíte, colite, glomerulonefrite, condições alérgicas, eczema, asma, condições envolvendo infiltração de células T e respostas inflamatórias crónicas, aterosclerose, miocardite auto-imune, deficiência de adesão leucocitária, lúpus eritematoso sistémico (LES), lúpus (incluindo nefrite, não renal, discóide, alopecia), diabetes de surgimento juvenil, esclerose múltipla, encefalomielite alérgica, respostas imunitárias associadas a hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citoquinas e linfócitos T, tuberculose, sarcoidose, granulomatose incluindo granulomatose de Wegener, agranulocitose, vasculite (incluindo ANCA), anemia aplásica, anemia positiva de Coombs, anemia de Diamond Blackfan, anemia imunitária hemolítica incluindo anemia auto-imune hemolítica (AAIH), anemia perniciosa, aplasia pura de glóbulos vermelhos (APGV), deficiência de Factor VIII, hemofilia A, neutropenia auto-imune, pancitopenia, leucopenia, doenças envolvendo diapedese leucocitária, distúrbios inflamatórios do SNC, síndroma de lesão de múltiplos órgãos, miastenia grave, doenças mediadas pelo complexo antigénio-anticorpo, doenças da membrana basal anti-glomerular, síndroma de anticorpos anti-fosfolípidos, neurite alérgica, doença de Bechet, síndroma de Castleman, Síndroma de Goodpasture, Síndroma Miasténico de Lambert-Eaton, síndroma de Reynaud, síndroma de Sjorgen, síndroma de Stevens-Johnson, rejeição de transplantes de órgãos sólidos (incluindo pré-tratamento para títulos elevados de anticorpos reactivos com um painel, depósito de IgA nos tecidos, etc.), doença de enxerto versus hospedeiro (GVHD), penfigóide bolhoso, pênfigo (todos incluindo vulgaris, foliatis), poliendocrinopatias auto-imunes, doença de Reiter, síndroma da pessoa rígida ("stiff-man", arterite de células gigantes, nefrite de complexo imunitário, nefropatia de IgA, polineuropatias de IgM ou neuropatia mediada por IgM, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), púrpura trombocitopénica trombótica (PTT), trombocitopenia auto-imune, doença auto-imune do testículo e ovário incluindo orquite e ooforite auto- 64 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ imune, hipotiroidismo primário; doenças endócrinas auto-imunes incluindo tiroidite auto-imune, tiroidite crónica (Tiroidite de Hashimoto), tiroidite subaguda, hipotiroidismo idiopático, doença de Addison, doença de Grave, síndromas poliglandulares auto-imunes (ou síndromas de endocrinopatia poliglandular), diabetes Tipo I também referido como diabetes mellitus dependente de insulina (DMDI) e síndroma de Sheehan; hepatite auto-imune, Pneumonite intersticial linfóide (VIH) , bronquiolite obliterante (sem transplante) vs NSIP, Síndroma de Guillain-Barre, Vasculite dos Grandes Vasos (incluindo Polimialgia Reumática e Arterite de Células Gigantes (de Takayasu)), Vasculite dos Vasos Médios (incluindo Doença de Kawasaki e Poliarterite Nodosa), espondilite anquilosante, Doença de Berger (nefropatia de IgA), Glomerulonefrite Rapidamente Progressiva, Cirrose biliar primária, Doença celíaca (enteropatia do glúten), Crioglobulinemia, ELA, doença das artérias coronárias.

Cancros positivos para CD20 são os que compreendem proliferação anormal de células que expressam CD20 à superfície celular. Os neoplasmas de células B positivos para CD20 incluem doença de Hodgkin positiva para CD20 incluindo doença de Hodgkin de predominância linfocitária (DHPL); linfoma não-Hodgkin (LNH); linfomas de células centrais foliculares (CCF); leucemia linfocítica aguda (LLA); leucemia linfocítica crónica (LLC); tricoleucemia. 0 linfomas não-

Hodgkin inclui linfoma não-Hodgkin (LNH) de baixo grau/folicular, linfoma linfocítico pequeno (LLP), LNH de grau intermédio/folicular, LNH difuso de grau intermédio, LNH imunoblástico de grau elevado, LNH linfoblástico de grau elevado, LNH de células não clivadas pequenas de grau elevado, LNH de doença volumosa, linfoma linfocítico plasmacitóide, linfoma de células do manto, linfoma relacionado com SIDA e macroglobulinemia de Waldenstrom. 0 tratamento de relapsos destes cancros está também contemplado. A LPHD é um tipo de doença de Hodgkin que tende a recidivar frequentemente apesar do tratamento de radiação ou quimioterapia e é caracterizada por células malignas positivas para CD20. A CLL é um dos quatro principais tipos de leucemia. Um cancro de células B maduras designadas linfócitos, CLL manifesta-se através de acumulação progressiva de células no sangue, na medula óssea e nos tecidos linfáticos. 65 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ

Em concretizações específicas, os anticorpos de ligação a CD20 humanizados e fragmentos funcionais destes são para utilização no tratamento de linfoma não-Hodgkin (LNH), doença de Hodgkin de predominância linfocitária (LHPL), linfoma linfocítico pequeno (LLP), leucemia linfocítica crónica, artrite reumatóide e artrite reumatóide juvenil, lúpus eritematoso sistémico (LES) incluindo nefrite de lúpus, doença de Wegener, doença inflamatória dos intestinos, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), púrpura trombocitopénica trombótica (PTT), trombocitopenia auto-imune, esclerose múltipla, Psoríase, nefropatia de IgA, polineuropatias de IgM, miastenia grave, vasculite, diabetes mellitus, síndroma de Reynaud, síndroma de Sjorgen e glomerulonefrite.

Os anticorpos de ligação a CD20 humanizados ou fragmentos funcionais destes são úteis como único agente de tratamento, p.ex., para LNH de células B positivo para CD20 de baixo grau ou folicular recidivado ou refractário, ou podem ser administrados a pacientes em conjunto com outros fármacos num regime de múltiplos fármacos. 0 linfoma indolente é uma doença incurável de crescimento lento na qual o paciente médio sobrevive entre seis e 10 anos após numerosos períodos de remissão e relapso. Numa concretização, os anticorpos de ligação a CD20 humanizados ou fragmentos funcionais destes são utilizados para tratar LNH indolente.

Os parâmetros para avaliar a eficácia ou o sucesso do tratamento do neoplasma serão conhecidos do médico perito na doença apropriada. Geralmente, o médico perito procurará uma redução dos sinais e sintomas da doença específica. Os parâmetros podem incluir o tempo médio para a progressão da doença, tempo em remissão, doença estável.

As seguintes referências descrevem linfomas e CLL, seus diagnósticos, tratamento e procedimentos médicos padrão para medição da eficácia do tratamento. Canellos, G.P., Lister, T.A., Sklar J.L.: "The Lymphomas", W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1998; van Besien, K. e Cabanillas, F.: "Clinicai Manifestations, Staging and Treatment of Lymphoma non- 66

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Hodgkin", Cap. 70, págs. 1293-1338, em: "Hematology, Basic Principies and Practice", 3a ed. Hoffman et al., (editores), Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000; e Rai, K. e Patel, D.: "Chronic Lymphocytic Leukemia, Cap. 72, págs. 1350-1362, em: "Hematology, Basic Principies and Practice", 3a ed. Hoffman et al., (editores). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000.

Os parâmetros para avaliação da eficácia ou do sucesso do tratamento de uma doença auto-imune ou relacionada com auto-imunidade serão conhecidos do médico perito na doença apropriada. Geralmente, o médico perito procurará uma redução dos sinais e sintomas da doença especifica. Os seguintes são para fins de exemplo.

Numa concretização, os anticorpos do presente invento são úteis para tratar artrite reumatóide. A AR é caracterizada por inflamação de múltiplas articulações, perda de cartilagem e erosão óssea que conduz à destruição das articulações e finalmente a reduzida função das articulações. Adicionalmente, uma vez que AR é uma doença sistémica, pode ter efeitos noutros tecidos tais como pulmões, olhos e medula óssea. Menos de 50 porcento dos pacientes que tiveram AR durante mais de 10 anos podem continuar a trabalhar ou funcionar normalmente na base do dia a dia.

Os anticorpos podem ser utilizados como terapia de primeira linha em pacientes com AR precoce (i.e., inocentes face a metotrexato (MTX)) e como monoterapia, ou em combinação com, p.ex., MTX ou ciclofosfamida. Ou, os anticorpos podem ser utilizados em tratamento como terapia de segunda linha para pacientes que foram refractários a DMARD e/ou MTX, e como monoterapia ou em combinação com, p.ex., MTX. Os anticorpos de ligação a CD20 humanizados são úteis para prevenir e controlar danos nas articulações, atrasar danos estruturais, diminuir a dor associada a inflamação em AR, e geralmente reduzir os sinais e sintomas em AR moderada a grave. O paciente de AR pode ser tratado com o anticorpo de CD20 humanizado antes, após ou juntamente com tratamento com outros fármacos utilizados em tratamento de AR (ver terapia de combinação abaixo). Numa concretização, pacientes que tinham falhado inicialmente fármacos anti-reumáticos modificadores da doença 67 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ e/ou tinham tido uma resposta inadequada ao metotrexato sozinho são tratados com um anticorpo de ligação a CD20 humanizado do presente invento. Numa concretização deste tratamento, os pacientes estão num regime de tratamento de 17 dias recebendo apenas anticorpo de ligação a CD20 humanizado (infusões iv de 1 g nos dias 1 e 15); o anticorpo de ligação a CD20 mais ciclofosfamida (infusão iv de 750 mg nos dias 3 e 17) ; ou anticorpo de ligação a CD20 mais metotrexato.

Um método de avaliação da eficácia do tratamento em AR baseia-se nos critérios do American College of Rheumatology (ACR), que mede a percentagem de melhoria em articulações fracas e inchadas, entre outras coisas. O paciente de AR pode ser registado, por exemplo, como ACR 20 (melhoria de 20 porcento) em comparação com tratamento sem anticorpo (p.ex., limiar antes do tratamento) ou tratamento com placebo. Outros modos de avaliação da eficácia do tratamento de anticorpo incluem registo de raios X tal como o registo de raios X de Sharp utilizado para classificar danos estruturais tais como erosão óssea e estreitamento do espaço das articulações. Os pacientes podem também ser avaliados quanto à prevenção ou melhoria na incapacidade com base no registo do Questionário de Avaliação da Saúde [HAQ], registo AIMS, SF-36 a períodos de tempo durante ou após o tratamento. Os critérios de ACR 20 podem incluir melhoria de 20% tanto na contagem das articulações fracas (doridas) como na contagem das articulações inchadas mais uma melhoria de 20% em pelo menos 3 das 5 medidas adicionais: 1. avaliação da dor do paciente através da escala visual análoga (VAS), 2. avaliação global do paciente da actividade de doença (VAS), 3. avaliação global do médico da actividade de doença (VAS), 4. incapacidade auto-avaliada do paciente medida através do Questionário de Avaliação da Saúde, e 5. reagentes da fase aguda, CRP ou ESR. O ACR 50 e 70 são definidos de modo análogo. De preferência, é administrado ao paciente uma quantidade de um anticorpo de ligação a CD20 do presente invento eficaz para alcançar pelo menos um registo de ACR 20, de preferência pelo 68 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ menos ACR 30, de maior preferência pelo menos ACR 50, ainda de preferência pelo menos ACR 70, ainda de maior preferência pelo menos ACR 75 e superior. A artrite psoriática tem características radiográficas únicas e distintas. Para a artrite psoriática, a erosão das articulações e o estreitamento do espaço das articulações podem também ser avaliados através do registo de Sharp. Os anticorpos de ligação a CD20 humanizados do presente invento podem ser utilizados para prevenir os danos nas articulações bem como reduzir sinais e sintomas de doença do distúrbio.

Ainda outro aspecto do presente invento refere-se a um método de tratamento de Lúpus ou LES através da administração ao paciente sofrendo de LES, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo de ligação a CD20 humanizado do presente invento. Os registos SLEDAI proporcionam uma quantificação numérica da actividade da doença. O SLEDAI é um índice ponderado de 24 parâmetros clínicos e laboratoriais que se sabe correlacionarem-se com a actividade de doença, com uma variação numérica de 0-103. Ver Bryan Gescuk & John Davis, "Novel therapeutic agent for systemic lupus erythematosus" em Current Opinion in Rheumatology 2002, 14: 515-521. Crê-se que anticorpos para ADN de cadeia dupla causem inflamações renais e outras manifestações de lúpus. Os pacientes sujeitos a tratamento de anticorpos podem ser monitorizados durante um tempo quanto a inflamação renal, que é definida como um aumento significativo, reprodutível na creatinina sérica, proteína na urina ou sangue na urina. Alternativamente ou adicionalmente, os pacientes podem ser monitorizados quanto a níveis de anticorpos antinucleares e anticorpos para ADN de cadeia dupla. Tratamentos para LES incluem elevadas doses de corticosteróides e/ou ciclofosfamida (HDCC).

As espondiloartropatias são um grupo de distúrbios das articulações, incluindo espondilite anquilosante, artrite psoriática e doença de Crohn. O tratamento com sucesso pode ser determinado através de ferramentas de medição da avaliação global pelo paciente e pelo médico validadas. 69 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ

Para tratar psoríase são utilizadas várias medicações; o tratamento difere directamente em relação à gravidade da doença. Os pacientes com uma forma mais suave de psoríase utilizam tipicamente tratamentos tópicos, tais como esteróides tópicos, antralina, calcipotrieno, clobetasol e tazaroteno, para gerir a doença enquanto que em pacientes com psoríase moderada e grave é mais provável o emprego de terapias sistémicas (metotrexato, retinóides, ciclosporina, PUVA e UVB) . São também utilizados alcatrões. Estas terapias têm uma combinação de preocupações de segurança, regimes demorados ou processos de tratamento inconvenientes. Para além disso, alguns requerem equipamento dispendioso e espaço dedicado na disposição da sala. As medicações sistémicas podem produzir efeitos secundários graves, incluindo hipertensão, hiperlipidemia, supressão da medula óssea, doença hepática, doença renal e perturbação gastrointestinal. Também, a utilização de fototerapia pode aumentar a incidência de cancros da pele. Para além da inconveniência e desconforto associados à utilização de terapias tópicas, a fototerapia e os tratamentos sistémicos requerem ciclos de entrada e saída dos pacientes na terapia e monitorização da exposição ao longo da vida devido aos seus efeitos secundários. A eficácia do tratamento para a psoríase é avaliada através da monitorização de mudanças em sinais e sintomas clínicos da doença incluindo mudanças na Avaliação Global do Médico (PGA) e registos do índice da Área e Gravidade da Psoríase (PASI), Avaliação dos Sintomas da Psoríase (PSA), em comparação com a condição limiar. 0 paciente pode ser medido periodicamente ao longo do tratamento na escala Visual análoga utilizada para indicar o grau de comichão sentida a momentos específicos.

Os pacientes podem sentir uma reacção de infusão ou sintomas relacionados com infusão com a sua primeira infusão de um anticorpo terapêutico. Estes sintomas variam na gravidade e são geralmente reversíveis com intervenção médica. Estes sintomas incluem mas não se limitam a, febre semelhante a gripe, arrepios/tremuras, náusea, urticária, dor de cabeça, broncospasmos, angioedema. Seria desejável para os métodos de tratamento de doença do presente invento que minimizassem as reacções de infusão. Assim, outro aspecto do presente invento 70 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ refere-se a um método de tratamento das doenças divulgadas através da administração de um anticorpo de ligação a CD20 humanizado em que o anticorpo tem reduzida ou nenhuma citotoxicidade dependente do complemento e resulta em reduzidos sintomas relacionados com infusão em comparação com o tratamento com Rituxan®. Numa concretização, o anticorpo de ligação a CD20 humanizado é 2H7.vll6.

Dosagem

Dependendo da indicação a tratar e dos factores relevantes para a dosagem com que um médico perito no campo estará familiarizado, os anticorpos do presente invento serão para administração a uma dosagem que seja eficaz para o tratamento dessa indicação ao mesmo tempo que minimiza a toxicidade e os efeitos secundários. Para o tratamento de um cancro positivo para CD20 ou uma doença auto-imune, a dosagem terapeuticamente eficaz estará na gama de cerca de 250 mg/m2 a cerca de 400 mg/m2 ou 500 mg/m2, de preferência cerca de 250- 3 75 mg/m2. Numa concretização, a gama de dosagem é 2 75- 375 mg/m2. Numa concretização do tratamento de um neoplasma de células B positivo para CD20, o anticorpo é administrado numa gama de 300-375 mg/m2. Para o tratamento de pacientes sofrendo de linfoma de células B tais como linfoma não-Hodgkin, os anticorpos anti-CD20 e os anticorpos anti-CD20 humanizados do presente invento podem ser para um paciente humano a uma dosagem de 10 mg/kg ou 375 mg/m2. Para tratamento de LNH, um regime de dosagem seria administrar uma dose da composição de anticorpo a uma dosagem de 10 mg/kg na primeira semana de tratamento, seguido de um intervalo de 2 semanas, depois é administrada uma segunda dose da mesma quantidade de anticorpo. Geralmente, os pacientes de LNH recebem tal tratamento uma vez durante um ano mas, após recorrência do linfoma, tal tratamento pode ser repetido. Noutro regime de dosagem, os pacientes tratados com LNH de baixo grau recebem quatro semanas de uma versão de 2H7 humanizado, de preferência vl6 (375 mg/m2 semanalmente) seguido na semana cinco de três cursos adicionais do anticorpo mais quimioterapia padrão CHOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisona) ou CVP (ciclofosfamida, vincristina, prednisona), que foi dada de três em três semanas durante três ciclos. 71 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ

Para tratamento de artrite reumatóide, numa concretização, a gama de dosagem para o anticorpo humanizado é de 125 mg/m2 (equivalente a cerca de 200 mg/dose) a 600 mg/m2, dado em duas doses, p.ex., a primeira dose de 200 mg é administrada no dia um seguida de uma segunda dose de 200 mg no dia 15. Em concretizações diferentes, a dosagem é 250 mg/dose, 275 mg, 300 mg, 325 mg, 350 mg, 375 mg, 400 mg, 425 mg, 450 mg, 475 mg, 500 mg, 525 mg, 550 mg, 575 mg, 600 mg.

No tratamento da doença, os anticorpos de ligação a CD20 do presente invento podem ser administrados ao paciente cronicamente ou intermitentemente, tal como descrito pelo médico perito na doença.

Um paciente ao qual foi administrado um fármaco através de infusão intravenosa ou subcutaneamente pode sentir eventos adversos tais como febre, arrepios, sensação de queimadura, astenia e dores de cabeça. Para aliviar ou minimizar tais eventos adversos, o paciente pode receber uma dose ou doses iniciais de condicionamento do anticorpo seguidas de uma dose terapêutica. A dose ou doses de condicionamento serão inferiores à dose terapêutica para condicionar o paciente a tolerar doses mais elevadas.

Via de administração

Os anticorpos de ligação a CD20 são para administração a um paciente humano de acordo com métodos conhecidos, tais como através de administração intravenosa, p.ex., como um bolo ou através de infusão continua ao longo de um período de tempo, através da via subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intracerebrospinal, intra-articular, intra-sinovial, intratecal, ou por inalação, geralmente através de administração intravenosa ou subcutânea.

Um anticorpo humanizado pode ser para administração através de infusão intravenosa com cloreto de sódio a 0,9% como veículo de infusão.

Terapia de Combinação

No tratamento dos neoplasmas de células B descritos acima, o paciente pode ser tratado com anticorpos de ligação a 72 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ CD20 do presente invento em conjunto com um ou mais agentes terapêuticos tais como um agente quimioterapêutico num regime de múltiplos fármacos. 0 anticorpo de ligação a CD20 pode ser administrado concorrente, sequencial ou alternadamente com o agente quimioterapêutico, ou após não haver resposta com outra terapia. A quimioterapia padrão para tratamento de linfoma pode incluir ciclofosfamida, citarabina, melfalano e mitoxantrona mais melfalano. CHOP é um dos regimes de quimioterapia mais comuns para tratamento de linfoma não-Hodgkin. Os seguintes são os fármacos utilizados no regime CHOP: ciclofosfamida (nomes comerciais: citoxano, neosar); adriamicina (doxorrubicina/hidroxidoxorrubicina) ; vincristina (Oncovin); e prednisolona (por vezes designado Deltasone ou Orasone). Um anticorpo de ligação a CD20 pode ser para administração a um paciente a necessitar deste em combinação com um ou mais dos seguintes agentes quimioterapêuticos de doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina e prednisolona. Um paciente sofrendo de um linfoma (tal como um linfoma não-Hodgkin) pode ser tratado com um anticorpo anti-CD20 do presente invento em conjunto com terapia CHOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisona). Um paciente de cancro pode ser tratado com um anticorpo de ligação a CD20 humanizado do presente invento em combinação com quimioterapia CVP (ciclofosfamida, vincristina e prednisona). Um paciente sofrendo de LNH positivo para CD20 pode ser tratado com 2H7.vl6 humanizado em conjunto com CVP. No tratamento de CLL, um anticorpo de ligação a CD20 pode ser administrado em conjunto com quimioterapia com um ou ambos de fludarabina e citoxano.

No tratamento das doenças auto-imunes ou condições relacionadas com auto-imunidade descritas acima, o paciente pode ser tratado com os anticorpos de ligação a CD20 do presente invento em conjunto com um segundo agente terapêutico, tal como um agente imunossupressor, tal como num regime de múltiplos fármacos. 0 anticorpo de ligação a CD20 pode ser administrado concorrente, sequencial ou alternadamente com o agente imunossupressor ou após não haver resposta com outra terapia. 0 agente imunossupressor pode ser administrado à mesma dosagem ou menor que o exposto na especialidade. 0 agente imunossupressor auxiliar preferido 73 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ dependerá de muitos factores, incluindo o tipo de distúrbio a tratar bem como a história do paciente. "Agente imunossupressor" tal como aqui utilizado para terapia auxiliar refere-se a substâncias que actuam para suprimir ou mascarar o sistema imunitário de um paciente. Tais agentes incluirão substâncias que suprimem a produção de citoquinas, infra-regulam ou suprimem a expressão de auto-antigénios ou mascaram os antigénios de MHC. Exemplos de tais agentes incluem esteróides tais como glucocorticosteróides, p.ex., prednisona, metilprednisolona, e dexametasona; pirimidinas 2-amino-6-aril-5-substituidas (ver Pat. U.S. 4665077), azatioprina (ou ciclofosfamida, se houver uma reacção adversa à azatioprina); bromocriptina; glutaraldeido (que mascara os antigénios de MHC, tal como descrito na Pat. U.S. 4120649); anticorpos anti-idiotipicos para antigénios do MHC e fragmentos do MHC; ciclosporina A; antagonistas de citoquinas ou receptores de citoquinas incluindo anticorpos anti-interferão-γ, β ou a; anticorpos anti-factor de necrose tumoral-α; anticorpos anti-factor de necrose tumoral-β; anticorpos anti-interleucina-2 e anticorpos anti-receptor de IL - 2; anticorpos anti-L3T4; globulina heteróloga anti-linfócitos; anticorpos pan-T, de preferência anticorpos anti-CD3 ou anti-CD4/CD4a; péptido solúvel contendo um domínio de ligação LFA-3 (WO 90/08187 publicado a 7/26/90); estreptoquinase; TGF-β; estreptodornase; ARN ou ADN do hospedeiro; FK506; RS-61443; desoxispergualina; rapamicina; receptor de células T (Pat. U.S. 5114721); fragmentos do receptor de células T (Offner et al., Science 251: 430-432, 1991); WO 90/11294; e WO 91/01133); e anticorpos do receptor de células T (EP 340109) tais como T10B9.

Para o tratamento de artrite reumatóide, o paciente pode ser tratado com um anticorpo de CD20 do presente invento em conjunto com qualquer um ou mais dos seguintes fármacos: FARMD (fármacos anti-reumáticos modificadores da doença (p.ex., metotrexato)), ΑΙΝΕ ou FAINE (fármacos anti-inflamatórios não esteróides), HUMIRA™ (adalimumab; Abbott Laboratories), ARAVA® (leflunomida), REMICADE® (infliximab; Centocor Inc., de Malvern, Pa), ENBREL (etanercept; Immunex, WA) , inibidores de COX-2. FARMD vulgarmente utilizados em AR são hidroxicloroquina, sulfassalazina, metotrexato, leflunomida, 74 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ etanercept, infliximab, azatioprina, D-penicilamina, Ouro (oral), Ouro (intramuscular), minociclina, ciclosporina, imunoadsorpção de proteína A de Estafilococos. Adalimumab é um anticorpo monoclonal humano que se liga a TNFa. Infliximab é um anticorpo monoclonal quimérico que se liga a TNFa. Etanercept é uma proteína de fusão "imunoadesina" consistindo na porção extracelular de ligação ao ligando do receptor do factor de necrose tumoral (TNFR) humano de 75 kDa (p75) ligado à porção Fc de uma IgGl humana. Para tratamento convencional de AR, ver, p.ex., "Guidelines for the management of arthritis rheumatoid" Arthritis & Rheuinatism 46(2): 328-346 (Fevereiro, 2002). Numa concretização específica, o paciente de AR é tratado com um anticorpo de CD20 do presente invento em conjunto com metotrexato (MTX). Uma dosagem exemplar de MTX é de cerca de 7,5-25 mg/kg/sem. MTX pode ser administrado oralmente e subcutaneamente.

Para o tratamento de espondilite anquilosante, artrite psiriática e doença de Crohn, o paciente pode ser tratado com um anticorpo de ligação a CD20 do presente invento em conjunto, por exemplo, com Remicade® (infliximab; de Centocor Inc., de Malvern, Pa.), ENBREL (etanercept; Immunex, WA).

Os tratamentos para LES incluem elevadas doses de corticosteróides e/ou ciclofosfamida (HDCC).

Para o tratamento de psoríase, pode ser administrado aos pacientes um anticorpo de ligação a CD20 em conjunto com tratamentos tópicos, tais como esteróides tópicos, antralina, calcipotrieno, clobetasol e tazaroteno, ou com terapias de metotrexato, retinóides, ciclosporina, PUVA e UVB. Um paciente de psoríase pode ser tratado com o anticorpo de ligação a CD20 sequencialmente ou concorrentemente com ciclosporina.

Formulações Farmacêuticas

As formulações terapêuticas dos anticorpos de ligação a CD20 de acordo com o presente invento são preparadas para armazenamento através de mistura de um anticorpo possuindo o grau desejado de pureza com transportadores, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais, ("Remington's Pharmaceutical Sciences", 16a edição, Osol, A. Ed., 1980), na forma de formulações liofilizadas ou soluções 75

ΕΡ 1 572 7 4 4/PT aquosas. Os transportadores, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis são não tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregues e incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzilamónio; cloreto de hexametónio; cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio; fenol, álcool butilico ou benzílico; alquilparabenos tais como metilparabeno ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipéptidos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos), proteínas, tais como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-iões formadores de sais tais como sódio; complexos metálicos (p.ex. complexos Zn-proteína); e/ou tensioactivos não iónicos tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietilenoglicol (PEG).

Formulações exemplares de anticorpo anti-CD20 são descritas em W098/56418. Outra formulação é uma formulação líquida multi-doses compreendendo o anticorpo anti-CD20 a 40 mg/ml, acetato 25 mM, trealose 150 mM, álcool benzílico a 0,9%, polissorbato 20 a 0,02% a pH 5,0 que tem uma vida em armazém mínima de dois anos de armazenamento a 2-8°C. Outra formulação de anti-CD20 de interesse compreende 10 mg/ml de anticorpo em 9,0 mg/ml de cloreto de sódio, 7,35 mg/ml de citrato de sódio di-hidratado, 0,7 mg/ml de polissorbato 80, e Água Estéril para Injecção, pH 6,5. Ainda outra formulação farmacêutica aquosa compreende acetato de sódio 10-30 mM de cerca de pH 4,8 a cerca de pH 5,5, de preferência a pH 5,5, polissorbato como tensioactivo numa quantidade de cerca de 0,01-0,1% v/v, trealose a uma quantidade de cerca de 2-10% p/v, e álcool benzílico como conservante (U.S. 6171586).

Formulações liofilizadas adaptadas para administração subcutânea são descritas em WO 97/04801. Tais formulações liofilizadas podem ser reconstituídas com um diluente adequado numa concentração proteica elevada e a formulação 76 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ reconstituída pode ser administrada subcutaneamente ao mamífero a tratar aqui.

Uma formulação para o anticorpo humanizado é anticorpo a 12-14 mg/ml em histidina 10 mM, sacarose a 6%, polissorbato 20 a 0,02%, pH 5,8.

Um anticorpo do presente invento e em particular 2H7.vl6 pode ser formulado como anticorpo a 20 mg/ml em sulfato de histidina 10 mM, 60 mg/ml de sacarose, 0,2 mg/ml de polissorbato 20 e Água Estéril para Injecção, a pH 5,8. A formulação aqui pode também conter mais de um composto activo conforme necessário para a indicação particular a tratar, de preferência aqueles com actividades complementares que não se afectam adversamente uns aos outros. Por exemplo, pode ser desejável proporcionar ainda um agente citotóxico, agente quimioterapêutico, citoquina ou agente imunossupressor (p.ex. um que actue em células T, tal como ciclosporina ou um anticorpo que se ligue a células T, p.ex. um que se ligue a LFA-1). A quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de anticorpo presente na formulação, do tipo de doença ou distúrbio ou tratamento, e outros factores discutidos acima. Estes são geralmente utilizados nas mesmas dosagens e com vias de administração tal como aqui descrito ou cerca de 1 a 99% das dosagens empregues até aqui.

Os ingredientes activos podem também ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas de coacervação ou através de polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de distribuição de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartícuias e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em "Remington's Pharmaceutical

Sciences", 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).

Podem preparar-se preparações de libertação sustida. Exemplos adequados de preparações de libertação sustida incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrófobos sólidos contendo o antagonista, matrizes essas que estão sob a forma de artigos moldados, p.ex., películas ou microcápsulas. 77

ΕΡ 1 572 7 4 4/PT

Exemplos de matrizes de libertação sustida incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato) ou poli(álcool vinílico)), polilactidas (Pat. U.S. 3773919), copolímeros de ácido L-glutâmico e etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo não degradáveis, copolímeros degradáveis de ácido láctico-ácido glicólico tais como LUPRON DEPOT™ (microesferas injectáveis compostas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida), e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

As formulações a utilizar para administração in vivo têm de ser estéreis. Isto é facilmente alcançado por filtração através de membranas de esterilização por filtração.

Artigos de Fabrico e Estojos

Outra concretização do presente invento é um artigo de fabrico tal como exposto nas reivindicações, que contém materiais úteis para o tratamento de doença auto-imunes e condições relacionadas e cancros positivos para CD20 tais como linfoma não-Hodgkin. 0 artigo de fabrico compreende um recipiente e uma etiqueta ou folheto informativo associados ao recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, etc. Os recipientes podem ser formados por uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. 0 recipiente guarda uma composição que é eficaz para tratamento da condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo o recipiente pode estar num saco de solução intravenosa ou num frasco possuindo uma tampa perfurável por uma agulha de injecção hipodérmica). Pelo menos um agente activo na composição é um anticorpo de ligação a CD20 do presente invento. A etiqueta ou folheto informativo indica que a composição é utilizada para tratamento da condição particular. A etiqueta ou folheto informativo incluirá ainda instruções para administração da composição do anticorpo ao paciente. 0 folheto informativo refere instruções vulgarmente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informação acerca das indicações, utilização, dosagem, administração, contra-indicações e/ou avisos em relação à utilização de tais produtos terapêuticos. Numa concretização, o folheto informativo indica que a composição é utilizada para tratamento de linfoma não-Hodgkin. 78 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ

Adicionalmente, ο artigo de fabrico pode compreender ainda um segundo recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injecção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode ainda incluir outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial ou do utilizador, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

Os estojos são úteis para vários fins, p.ex., para ensaios de matança de células B, como controlo positivo para ensaios de apoptose, para purificação ou imunoprecipitação de CD20 a partir de células. Para isolamento e purificação de CD20, o estojo pode conter um anticorpo anti-CD20 ligado a contas (p.ex., contas de Sepharose). Podem ser proporcionados estojos gue contenham os anticorpos para detecção e quantificação de CD20 in vitro, p.ex. num ELISA ou num Western blot. Tal como com o artigo de fabrico, o estojo compreende um recipiente e uma etiqueta ou folheto informativo associado ao recipiente. 0 recipiente guarda uma composição compreendendo pelo menos um anticorpo anti-CD20 do presente invento. Podem ser incluídos recipientes adicionais que contenham, p.ex., diluentes e tampões, anticorpos de controlo. A etiqueta ou folheto informativo pode proporcionar uma descrição da composição bem como instruções para a utilização in vitro ou de diagnóstico pretendida. CD20 de Macaca fascicularis

Um ácido nucleico isolado compreendendo a sequência nucleotídica de SEQ ID NO:24 do CD20 de Macaca fascicularis é mostrado na FIG. 19. 0 ácido nucleico pode ser ADNc. Um ácido nucleico codificando o CD20 de macaco pode estar num vector de expressão para expressão numa célula hospedeira. A sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 24 no vector de expressão pode ser operativamente ligada a uma sequência de controlo da expressão tal como um promotor ou promotor e estimulador. A sequência de controlo da expressão pode ser a sequência nativa normalmente associada ao gene de CD20 de Macaca fascicularis, ou heteróloga ao gene. É também descrito um polipéptido isolado compreendendo a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:25; FIG. 19 & 20) do CD20 de Macaca fascicularis, bem como células hospedeiras contendo o ácido nucleico de CD20 de Macaca 79 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ fascicularis. As células hospedeiras podem ser células eucarióticas, p.ex., células CHO. Proteínas de fusão compreendendo a sequência de aminoácidos de CD20 de Macaca fascicularis ou fraqmentos da sequência estão também contemplados. EXEMPLOS EXPERIMENTAIS Exemplo 1

Humanização do anticorpo monoclonal de murideo anti-CD20 2H7 A humanização do anticorpo de murideo anti-CD20 humano, 2H7 (também aqui referido como m2H7, m de murideo), foi realizada numa série de passos de mutaqénese dirigida ao local. Foram descritas as sequências da região variável do anticorpo de murideo 2H7 e de 2H7 quimérico com a V de ratinho e a C humana, ver, p.ex., patentes U.S. 5846818 e 6204023. Os resíduos de CDR de 2H7 foram identificados através de comparação da sequência de aminoácidos dos domínios variáveis de 2H7 de murideo (divulgada em U.S. 5846818) com as sequências de anticorpos conhecidos (Kabat et al., "Sequences of proteins of immunological interest", Ed. 5. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991)). As regiões CDR para as cadeias leve e pesada foram definidas com base na hipervariabilidade das sequências (Kabat et al., supra) e são mostradas na Fig. IA e Fig. 1B, respectivamente. Utilizando oligonucleótidos sintéticos (Tabela 1), foi utilizada mutagénese dirigida ao local (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sei. 82: 488-492, 1985) para introduzir todas as seis regiões CDR do 2H7 de murideo numa estrutura Fab humana completa correspondendo a uma sequência de consenso VKI,VHIII (VL capa subgrupo I, VH subgrupo III) contida no plasmídeo pVX4 (Fig. 2). O fagemideo pVX4 (Fig. 2) foi utilizado para mutagénese bem como para expressão de F(ab)s em E. coli. Com base no fagemideo pb0720, um derivado de pB0475 (Cunningham et al., Science 243: 1330-1336, 1989), pVX4 contém um fragmento de ADN codificando um anticorpo anti-IFN-α (interferão a) de cadeia leve κ-subgrupo I de consenso humanizada (VlkI-Cl) e cadeia pesada subgrupo III de consenso humanizada (VhIH-Ch1). pVX4 tem também um promotor da fosfatase alcalina e uma sequência de Shine-Dalgarno ambos derivados de outro plasmídeo baseado 80 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ em pUC119 anteriormente descrito, pAK2 (Cárter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 4285, 1992) . Foi introduzido um local de restrição SpeI único entre o ADN codificando para as cadeias leve e pesada de F(ab). Os primeiros 23 aminoácidos em ambas as cadeias pesada e leve do anti-IFN-α são a sequência sinal de secreção Stll (Chang et al., Gene 55: 189-196, 1987).

Para construir a versão troca-de-CDR de 2H7 (2H7.v2), foi efectuada mutagénese dirigida ao local num molde contendo desoxiuridina de pVX4; todas as seis CDR do anti-IFN-α foram mudadas para as CDR de 2H7 de murídeo. A molécula resultante é referida como versão 2 de 2H7 humanizado (2H7.v2), ou "versão troca-de-CDR" de 2H7 ("CDR-swap version"); possui os resíduos da CDR de m2H7 com os resíduos da FR humana de consenso mostrados nas Figuras IA e 1B. O 2H7.v2 humanizado foi utilizado para mais humanização. A Tabela 1 mostra a sequência oligonucleotídica utilizada para criar cada uma das CDR de 2H7 de murídeo (m2H7) na cadeia H e L. Por exemplo, o oligonucleótido de CDR-H1 foi utilizado para recriar a CDR1 da cadeia H de m2H7. CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 refere-se à CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia H, respectivamente; semelhantemente, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 refere-se a cada uma das CDR da cadeia L. As substituições em CDR-H2 foram feitas em dois passos com dois oligonucleótidos, CDR-H2A e CDR-H2B.

Tabela 1. Sequências oligonucleotídicas utilizadas para construção da troca-de-CDR de CDR de 2H7 de murídeo numa

Estrutura humana em pVX4. Os resíduos mudados por cada oligonucleótido estão sublinhados.

Substituição Sequência oligonucleotídica CDR-H1 C TAC AOC TTC ACG AGC TAT AAC ATG CSC TQG CTC OG (SEQ ID NO. ) CDR-H2A G ATT AAT CCT GAC AAC GGC GAC ACG AGC TAT AAC CAG A AG TTC AAG GGC CG (SEQ ID NO. ) CDR-H2B GAA TGG GTT GCA GCG ATC TAT CCT GGC AAC GGC GAC AC (SEQ ID NO. ) CDR-H3 AT TAT TGT GCT CG A GTG GTC TAC TAT AGC AAC AGC TAC TGG TAC TTC GAC GTC TGG GGT CAA GGA (SEP ID NO. ) CDR-L1 C TQC ACA GCC AGC TCT TCT GTC AGC TAT ATG CAT TG (SEQ ID NO. ) CDR-L2 AA CTA CTG ATT TAC GCT OCA TCG AAC CTC GCG TCT GGA CTC C (SEQ ID NO. ) CDR-L3 TAT TAC TGT CAA CAG TGG AGC TTC AAT CCG CCC ACA TTT GGA CAG (SEQIDNO. ) 81 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ

Para comparação com construções humanizadas, foi construído um plasmídeo expressando um Fab quimérico de 2H7 (contendo os domínios VL e VH de murídeo, e os domínios CL e CHi humanos) através de mutagénese dirigida ao local (Kunkel, supra) utilizando oligonucleótidos sintéticos para introduzir os resíduos estruturais de murídeo em 2H7.v2. A sequência da construção plasmídica resultante para expressão do Fab quimérico conhecido como 2H7.v6.8, é mostrada na Fig. 3. Cada cadeia codificada do Fab tem uma sequência sinal de secreção Stll de 23 aminoácidos tal como descrito para pVX4 (Fig. 2) acima.

Com base numa comparação de sequências dos resíduos estruturais de 2H7 de murídeo com a estrutura de consenso humana de VKI,VHIII (Figuras IA e 1B) e anticorpos previamente humanizados (Cárter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 4285-4289, 1992), foram introduzidas várias mutações estruturais na construção do Fab 2H7.v2 através de mutagénese dirigida ao local. Estas mutações resultam numa mudança de certos resíduos estruturais de consenso humanos para os verificados na estrutura de 2H7 de murídeo, em locais que podem afectar as conformações das CDR ou os contactos com o antigénio. A versão 3 continha VH(R71V, N73K), a versão 4 continha VH(R71V), a versão 5 continha VH(R71V, N73K) e Vl(L46P), e a versão 6 continha VH(R71V, N73K) e Vl(L46P, L47W).

As versões humanizada e quimérica do Fab do anticorpo m2H7 foram expressas em E. coli e purificadas como se segue. Os plasmídeos foram transformados na estirpe XL-1 Blue de E. coli (Stratagene, San Diego, CA) para preparação de ADN de cadeia dupla e simples. Para cada variante, foram completamente sequenciadas ambas as cadeias leve e pesada, utilizando o método de didesoxinucleótidos (Sequenase, U.S. Biochemical Corp.). Os plasmídeos foram transformados na estirpe 16C9 de E. coli, um derivado de MM294, plaqueadas em placas de LB contendo 5 pg/ml de carbenicilina, e foi seleccionada uma única colónia para expressão proteica. A colónia única foi criada em 5 ml de LB-carbenicilina a 100 pg/ml durante 5-8 h a 37°C. A cultura de 5 ml foi adicionada a 500 ml de AP5-carbenicilina a 100 yg/ml e deixada crescer durante 16 h num balão de agitação abafado de 4 1 a 82

ΕΡ 1 572 7 4 4/PT 37°C. 0 meio AP5 consiste em: 1,5 g de glicose, 11,0 de Hycase SF, 0,6 g de extracto de levedura (certificado), 0,19 g de MgS04 anidrido, 1,07 g de NH4C1, 3,73 g de KC1, 1,2 g de NaCl, 120 ml de trietanolamina 1 M, pH 7,4, para 1 1 de água e depois esterilizou-se por filtração através de um filtro de Sealkeen de 0,1 pm.

As células foram colhidas por centrifugação numa garrafa de centrífuga de 1 1 (Nalgene) a 3000 xg e o sobrenadante foi removido. Após congelação durante 1 h, o sedimento foi ressuspenso em 25 ml de MES 10 mM-EDTA 10 mM frio, pH 5,0 (tampão A) . Foram adicionados 250 μΐ de PMSF 0,1 M (Sigma) para inibir a proteólise e foram adicionados 3,5 ml de reserva de lisozima da clara do ovo de galinha a 10 mg/ml (Sigma) para ajudar na lise da parede celular bacteriana. Após agitação suave em gelo durante 1 h, a amostra foi centrifugada a 40 000 xg durante 15 min. O sobrenadante foi perfeito a 50 ml com tampão A e carregado numa coluna de DEAE de 2 ml equilibrada com tampão A. O fluído corrido foi então aplicado numa coluna de proteína G-Sepharose CL-4B (Pharmacia) (volume do leito de 0,5 ml) equilibrada com tampão A. A coluna foi lavada com 10 ml de tampão A e eluída com 3 ml de glicina 0,3 M, pH 3,0, em 1,25 ml de Tris 1 M, pH 8,0. Foi então mudado o tampão do F(ab) para PBS utilizando Centricon-30 (Amicon) e concentrou-se até um volume final de 0,5 ml. Foram corridos géis de SDS-PAGE de todos os F(ab)s para avaliar a pureza e o peso molecular de cada variante foi verificado através de espectrometria de massa por electrovaporização.

Em ensaios de ligação ELISA baseados em células (descritos abaixo) , a ligação dos Fab, incluindo Fab 2H7 quimérico, a CD20 foi difícil de detectar. Por essa razão, as versões do Fab 2H7 foram reformatadas como anticorpos IgGl inteiros para os ensaios e posterior mutagénese.

Plasmideos para expressão de IgG inteiras foram construídos através de subclonagem dos domínios VL e VH do Fab 2H7 quimérico (v6.8) bem como das versões humanizadas do Fab 2 a 6 nos vectores pRK anteriormente descritos para expressão em células de mamífero (Gorman et ai., DNA Prot. Eng. Tech. 2: 3-10, 1990)). Resumidamente, cada construção de Fab foi digerida com EcoKV e BlpI para excisar uma fragmento VL, que foi 83

ΕΡ 1 572 7 4 4/PT clonado nos locais EcoRV/BlpI do plasmídeo pDRl (Fig. 4) para expressão da cadeia leve completa (domínios VL-CL) · Adicionalmente, cada construção de Fab foi digerida com PvuII e Apa I para excisar um fragmento VH, que foi clonado nos locais PvuII/Apal do plasmídeo pDR2 (Fig. 5) para expressão da cadeia pesada completa (domínios VH-CHi-charneira-CH2-CH3) . Para cada variante de IgG, foram efectuadas transfecções transientes através de co-transfecção de um plasmídeo expressando a cadeia leve e um plasmídeo expressando a cadeia pesada numa linha celular de rim embrionário humano transfectada com adenovírus, 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59-74, 1977). Resumidamente, as células 293 foram divididas no dia anterior à transfecção, e plaqueadas em meio contendo soro. No dia seguinte, foi adicionado ADN de cadeia dupla preparado como um precipitado de fosfato de cálcio, seguido de ADN de pAdVAntage™ (Promega, Madison, WI), e as células foram incubadas de um dia para o outro a 37°C. As células foram cultivadas em meio sem soro e colhidas após 4 dias. Os anticorpos foram purificados a partir dos sobrenadantes da cultura utilizando proteína A-Sepharose CL-4B, depois o tampão foi mudado para succinato de sódio 10 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0, e concentrado utilizando um Centricon-10 (Amicon). As concentrações proteicas foram determinadas através de análise quantitativa dos aminoácidos.

Para medir as afinidades de ligação relativas ao antigénio CD20, foi desenvolvido um ensaio ELISA baseado em células. Células B linfoblastóides humanas WIL2-S (ATCC CRL 8885, American Type Culture Collection, Rockville, MD) foram criadas em RPMI 1640 suplementado com L-glutamina 2 mM, HEPES 20 mM, pH 7,2 e soro fetal bovino inactivado com calor a 10% numa incubadora humidificada com C02 a 5%. As células foram lavadas com PBS contendo FBS a 1% (tampão de ensaio) e semeadas a 250-300 000 células/poço em placas de fundo redondo de 96 poços (Nunc, Roskilde, Dinamarca). Foi adicionado às placas, padrão diluído em série duas vezes (15,6-1000 ng/ml de IgG quimérica 2H7 v6.8) e amostras diluídas em série três vezes (2,7-2000 ng/ml) em tampão de ensaio. As placas foram enterradas em gelo e incubadas durante 45 min. Para remover o anticorpo não ligado, foi adicionado aos poços 0,1 ml de tampão de ensaio. As placas foram centrifugadas e os sobrenadantes foram removidos. As células foram lavadas duas 84 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ vezes ou mais com 2,0 ml de tampão de ensaio. O anticorpo ligado às placas foi detectado através de adição às placas de anticorpo de cabra anti-Fc humano conjugado com peroxidase (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) . Após uma incubação de 45 min, as células foram lavadas tal como descrito anteriormente. Substrato TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina; Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) foi adicionado às placas. A reacção foi parada através da adição de ácido fosfórico 1 M. As curvas de titulação foram ajustadas com um programa de ajuste de curvas de regressão não linear de quatro parâmetros (KaleidaGraph, Synergy software, Reading, PA) . Foi determinada a absorvância no ponto médio da curva de titulação (mid-OD) e a correspondente concentração do padrão. Depois foi determinada a concentração de cada variante nesta mid-OD, e a concentração do padrão foi dividida pela de cada variante. Deste modo os valores são uma razão da ligação de cada variante relativamente ao padrão. Os desvios padrão na afinidade relativa (concentração equivalente) foram geralmente de +/-10% entre as experiências.

Tal como mostrado na Tabela 2, a ligação da variante troca-de-CDR (v.2) foi extremamente reduzida em comparação com ο 2H7 quimérico (v.6.8). No entanto, as versões 3 a 6 mostraram uma ligação melhorada. Para determinar o número mínimo de mutações que podiam ser requeridas para restaurar a afinidade de ligação para a do 2H7 quimérico, foram construídas mutações e combinações de mutações adicionais através de mutagénese dirigida ao local para produzir as variantes 7 a 17 tal como indicadas na Tabela 2. Em particular, estas incluíram as mutações de VH, A49G, F67A, I69L, N73K e L78A; e as mutações de VL, M4L, M33I e F71Y. As versões 16 e 17 mostraram as melhores afinidades de ligação relativas, dentro de duas vezes a da versão quimérica, sem diferença significativa (d.p. = +/-10%) entre as duas. Para minimizar o número de mutações, a versão 16, possuindo apenas 4 mutações dos resíduos estruturais humanos para resíduos estruturais de murídeo (Tabela 2), foi portanto escolhida como a forma humanizada para caracterização adicional. 85 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ

Tabela 2. Afinidade de ligação relativa das variantes de IgG de 2H7 humanizadas a CD20 em comparação com ο 2H7 quimérico utilizando ELISA baseado em células. A ligação relativa é expressa como a concentração do 2H7 quimérico sobre a concentração da variante requerida para ligação equivalente; assim uma razão <1 indica uma afinidade mais fraca para a variante. 0 desvio padrão na determinação da afinidade relativa foi em média de +/-10%. As substituições estruturais nos domínios variáveis são relativas à versão troca-de-CDR de acordo com o sistema de numeração de Kabat (Kabat et al., supra).

Versão de 2H7 Substituições da cadeia pesada (VH) Substituições da cadeia leve (VL) Ligaçao relativa 6.8 (Quimera) (Quimera) -1- 2 (troca-de-CDR) (troca-de-CDR) 0, 01 3 R71V, N73K (troca-de-CDR) 0,21 4 R71V (troca-de-CDR) 0,21 5 R71V, N73K I46P 0,50 6 R71V, N73K L46P, L47W 0,58 7 R71V L46P 0,33 8 R71V, L78A L46P 0,19 9 R71V, F67A L46P 0,07 10 R71V, F67A, I69L L46P 0,12 11 R71V, P67A, L78A L46P 0,19 12 R71V L46P, M4L 0,32 13 R71V L46P, M33I 0,31 14 R71V L46P, F 71Y 0,25 15 R71V L46P, M4L, M33I 0,26 16 R71V, N73K, A49G L46P 0,65 17 R71V, N73K, A49G L46P, L47W 0,67 86

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Tabela 3. Sequências oligonucleotídicas utilizadas para construção das mutações VH(A49G, R71V, N73K) e VL(L46P) na versão 16 do 2H7 humanizado (2H7.vl6). Os codões sublinhados codificam as substituições de aminoácidos indicadas. Para VH (R71V, N73K) e VL (L46P) , os oligos são mostrados como a cadeia com sentido uma vez que estes foram utilizados para mutagénese no molde Fab, enquanto que para VH (A49G) , o oligo é mostrado como a cadeia anti-sentido, uma vez que este foi utilizado com o molde pRK (cadeia pesada de IgG) . A sequência proteica da versão 16 é mostrada na Fig. 6 e Fig. 7.

Substituição Sequência oligonucleotídica VH (R71V, N73K) CT TTC ACT ATA ACT CTC GAC MG TOC AAA ABC ACA. TT (SEQ ID NO._) VH (A49G) GOCMSATAGATGQQXCASaXATTOCfiGQOC (SEQ ID NO._) VL (LA6P) AMCTXX3MAXaCT0OTTO03CT (SEQ ID NO._)

Exemplo 2

Determinantes da ligação ao antigénio (parátopo) de 2H7

Foram feitas substituições de alanina (Cunningham & Wells, Science 244: 1081-1085, 1989) em 2H7.vl6 ou 2H7.vl7 para testar as contribuições de cada cadeia lateral do anticorpo na ligação a CD20. As variantes de IgG foram expressas em células 293 a partir dos vectores pDRl e pDR2, purificadas, e ensaiadas quanto à afinidade de ligação relativa tal como descrito acima. Várias substituições de alanina resultaram em diminuições significativas na ligação relativa a CD20 em células WIL-2S (Tabela 4). 87 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ

Tabela 4. Efeitos das substituições de alanina nas regiões CDR do 2H7.vl6 humanizado medidos utilizando ELISA baseado em células (células WIL2-S). A ligação relativa é expressa como a concentração do 2H7.vl6 parental sobre a concentração da variante requerida para ligação equivalente; assim uma razão <1 indica uma afinidade mais fraca para a variante; uma razão >1 indica uma afinidade mais elevada para a variante. 0 desvio padrão na determinação da afinidade relativa foi em média de +/-10%. As substituições estruturais nos domínios variáveis são relativas a 2H7.vl6 de acordo com o sistema de numeração de Kabat (Kabat et al., supra) . NBD significa ligação não detectável. Os dois números para a versão 45 são de experiências separadas.

Versão de 2H7 Localizaçao da CDR Substituições da cadeia pesada Substituições da cadeia leve Ligação relativa 16 - - - -1- 140 Hl G26A - 0,63 141 Hl Y2 7A - 0,47 34 Hl T28A - 0,86 35 Hl F29A - 0, 07 36 Hl T30A - 0, 81 37 Hl S31A - 0, 97 142 Hl Y32A - 0,63 143 Hl N33A - NDB 144 Hl M3 4A - 1,2 145 Hl H35A - <0,25 146 H2 A50G - 0,31 147 H2 I51A - 0,65 38 H2 Y52A - 0,01 148 H2 P52aA - 0,66 39 H2 G53A - 0,89 67 H2 N54A - 1,4 40 H2 G55A - 0, 79 41 H2 D56A - 2,0 89 H2 T57A - 0,61 88

ΕΡ 1 572 7 4 4/PT

Versão de 2H7 Localizaçao da CDR Substituições da cadeia pesada Substituições da cadeia leve Ligaçao relativa 90 H2 S58A - 0,92 91 H2 Y59A - 0, 74 92 H2 N60A - 0,80 93 H2 Q61A - 0,83 94 H2 K62A - 0, 44 95 H2 F63A - 0,51 83 H2 V71A - 3,96 149 H2 K64A - 0,82 150 H2 G65A - 1,2 153 H3 V95A - 0,89 42 H3 V96A - 0,98 43 H3 Y97A - 0,63 44 H3 Y98A - 0,40 45 H3 S99A - 0,84; 0,92 46 H3 NI 0 0A - 0,81 47 H3 SlOOaA - 0, 85 48 H3 YlOObA - 0, 78 49 H3 WlOOcA - 0,02 59 H3 YlOOdA - 0,98 60 H3 FlOOeA - NDB 61 H3 Dl 0 IA - 0,31 151 H3 V102A - 1,1 117 LI - R2 4A 0, 85 118 LI - A25G 0,86 119 LI - S26A 0,98 120 LI - S27A 0,98 121 LI - S28A 1,0 122 LI - V29A 0, 41 89 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ

Versão de 2H7 Localização da CDR Substituições da cadeia pesada Substituições da cadeia leve Ligação relativa 50 LI - S30A 0,96 51 LI - Y32A 1,0 123 LI - M33A 1,0 124 LI - H34A 0,21 125 L2 - A50G 0,92 126 L2 - P51A 0,88 52 L2 - S52A 0,80 53 L2 - N53A 0, 76 54 L2 - L54A 0,60 127 L2 - A55G 1,1 128 L2 - S56A 1,1 129 L3 - Q89A 0,46 130 L3 - Q90A <0,22 55 L2 - W91A 3,88 56 L3 - S92A 1,1 57 L3 - F93A 0,36 58 L3 - N94A 0, 61 131 L3 - P95A NDB 132 L3 - P96A 0,18 133 L3 - T97A <0,22

Exemplo 3

Mutações adicionais dentro das regiões CDR de 2H7

Substituições de resíduos adicionais e combinações de substituições em posições de CDR que foram identificadas como importantes através do varrimento de Ala foram também testadas. Várias variantes de combinação, particularmente v.96 pareceram ligar-se mais fortemente que v.16. 90

ΕΡ 1 572 7 4 4/PT

Tabela 5. Efeitos de combinações de mutações e substituições não alanina nas regiões CDR do 2H7.vl6 humanizado medidos utilizando ELISA baseado em células (células WIL2-S). A ligação relativa a CD20 é expressa como a concentração do 2H7.vl6 parental sobre a concentração da variante requerida para ligação equivalente; assim uma razão <1 indica uma afinidade mais fraca para a variante; uma razão >1 indica uma afinidade mais elevada para a variante. O desvio padrão na determinação da afinidade relativa foi em média de +/-10%. As substituições estruturais nos domínios variáveis são relativas a 2H7.vl6 de acordo com o sistema de numeração de Kabat (Kabat et al., supra).

Versão de 2H7 Substituições da cadeia pesada Substituições da cadeia leve Ligação relativa 16 - - -1- 96 D56A, NI 0 0A S92A 3,5 97 S99T, N100G, YlOObl - 0,99 98 S99G, N100S, YlOObl - 1,6 99 N100G, YlOObl - 0,80 101 N54S, D56A - 1,7 102 N54K,D56A - 0,48 103 D56A, N100A - 2,1 104 S99T, N100G - 0,81 105 S99G, N100S - 1,1 106 N100G - ~1 167 SlOOaG, YlOObS - 136 D56A, N100A S56A, S92A 2,6 137 D56A, N100A ASSG, S92A 2,1 156 D56A, N100A S26A, S56A, S92A 2,1 107 D56A, N100A, YlOObl S92A não expresso 182 Y2 7W 183 Y2 7F - 184 F29Y - 185 F29W - 186 Y32F - 187 Y32W - 91

ΕΡ 1 572 7 4 4/PT

Versão de 2H7 Substituições da cadeia pesada Substituições da cadeia leve Ligaçao relativa 188 N33Q - 189 N33D - 190 N33Y - 191 N33S - 208 H35S - 209 A5 0S - 210 A50R - 211 A50V - 212 ASOL - 168 Y52W - 169 Y52F - 0, 75 170 N54D - 0,25 171 N54S - 1,2 172 D56K - 1 173 D56R - 174 D56H - 1,5 175 D56E - 1,2 213 D56S - 214 D56G - 215 D56N - 216 D56Y - 176 Y59W - 177 Y59F - 180 K62R - 181 K62D - 178 F63W - 179 F63Y - 157 Y97W - 0,64 158 Y97F - 1,2 159 Y98W - 0,64 160 Y98F - 0,88 92

ΕΡ 1 572 7 4 4/PT

Versão de 2H7 Substituições da cadeia pesada Substituições da cadeia leve Ligaçao relativa 106 N100G - 161 WlOOcY - 0,05 162 WlOOcF - 3,27 163 FlOOeY - 0,59 164 FlOOeW - 0, 71 165 Dl 0 IN - 0,64 16 6 S99G, N100G, S100aD,Y100b eliminado — 0,99 217 VI0 2 Y - 1,0 207 - H34Y 192 - Q89E 193 - Q89N 194 - Q90E 195 - Q90N 196 - W91Y 197 - W91F 205 - S92N 206 - S92G 198 - F93Y 199 - F93W 204 - F93S, N94Y 200 - P96L 201 - P96Y 202 - P96W 203 - P96R 93 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ

Exemplo 4

Mutações em locais de substituições estruturais de humanização

As substituições de resíduos adicionais em posições estruturais que foram mudadas durante a humanização foram também testadas no fundo 2H7.vl6. Em particular, substituições estruturais alternativas que não foram verificadas no 2H7 de murídeo parental nem na estrutura de consenso humana foram feitas em VL(P46) e VH(G49, V71, e K73).

Estas substituições conduziram qeralmente a pouca alteração na ligação relativa (Tabela 6), indicando que existe alguma flexibilidade em resíduos estruturais nestas posições.

Tabela 6. Ligação relativa num ensaio baseado em células (WIL2-S) de substituições estruturais. As variantes de IgG são mostradas com mutações em relação ao fundo 2H7.vl6. A ligação relativa é expressa como a concentração da quimera 2H7.v6.8 sobre a concentração da variante requerida para ligação equivalente; assim uma razão <1 indica uma afinidade mais fraca para a variante; uma razão >1 indica uma afinidade mais elevada para a variante. 0 desvio padrão na determinação da afinidade relativa foi em média de +/-10%. As substituições estruturais nos domínios variáveis são relativas a 2H7.vl6 de acordo com o sistema de numeração de Kabat (Kabat et al., supra). (*) Variantes que foram ensaiadas com 2H7.vl6 como comparador padrão; os valores relativos são normalizados para os da quimera.

Versão de 2H7 Substituições da cadeia pesada Substituições da cadeia leve Ligaçao relativa 6.8 (quimera) (quimera) -1- 16 - - 0,64 78 K73R - 0, 72 79 K73H - 3,49 80 K73Q - 0,58 81 V71I - 0,42 82 V71T - 0,58 83 V71A 84 G49S - 0,32 85 G49L - 94 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ

Versão de 2H7 Substituições da cadeia pesada Substituições da cadeia leve Ligação relativa 86 - P46E 0,22 87 - P46V 0,51 88 - P46T 108 G49A, V71T, K73R S92A, M32L, P46T 0,026* 109 G49A, A49G, V71T, K73R S92A, M32L, P46T 0,026* 110 K73P, D56A, NI0 0A S92A, M32L Não expresso 111 G49A, V71T, K73R - 0,46* 112 G49A, A50G, V71T, K73R - 0,12* (*) Variantes que foram ensaiadas com 2H7.vl6 como comparador padrão; os valores relativos são normalizados para os da quimera.

Exemplo 5

Variantes humanizadas de 2H7 com funções efectoras melhoradas

Como 2H7 pode mediar a lise de células B através de citotoxicidade dependente do complemento (CDC) e citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), pensámos produzir variantes de 2H7.vl6 humanizado com actividade de CDC e ADCC melhorada. Foram descritas mutações de certos resíduos dentro das regiões Fc de outros anticorpos (Idusogie et al., J. Immunol. 166: 2571-2575, 2001) para melhorar a CDC através de maior ligação ao componente Clq do complemento. Foram também descritas mutações (Shields et al., J. Biol. Chem. 276: 6591-6604, 2001; Presta et ai., Biochem. Soc. Trans. 30: 487-490, 2002) para melhorar a ADCC através de maior ligação de IgG a receptores de Fcy activadores e ligação reduzida de IgG a receptores de Fcy inibidores. Em particular, foram identificadas três mutações para melhorar a actividade de CDC e ADCC: S298A/E333A/K334A (também aqui referido como triplo mutante ou variante de Ala; a numeração na região Fc é de acordo com o sistema de numeração de EU; Kabat et ai., supra) tal como descrito (Idusogie et al., supra, 2001;

Shields et al., supra).

Para aumentar a actividade de CDC e ADCC de 2H7, foi construído um triplo mutante de Ala do Fc de 2H7. Uma variante 95 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ humanizada do anticorpo anti-HER2 4d5 foi produzida com as mutações S298A/E333A/K334A e é conhecida como 4D5FcllO (i.e., IgGl anti-p185HER2 (S298A/E333A/K334A); Shields et ai., supra). Um plasmideo, p4D5FcllO codificando o anticorpo 4D5FcllO (Shields et ai., supra) foi digerido com ApaI e HindIII, e o fragmento Fc (contendo as mutações S298A/E333A/K334A) foi ligado nos locais Apal/HindIII do vector da cadeia pesada de 2H7, pDR2-vl6, para produzir pDR2-v31. A sequência de aminoácidos da versão 31 da cadeia H completa é mostrada na Fig. 8. A cadeia L é a mesma que a de vl6.

Embora os domínios constantes da região Fc dos anticorpos IgGl sejam relativamente conservados com uma dada espécie, existem variações alélicas (revistas por Lefranc e Lefranc, em "The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function, and "regulation, págs. 43-78, F. Shakib (ed.), Pergammon Press, Oxford, 1990).

Tabela 7. Efeitos de substituições na região Fc na ligação a CD20. A ligação relativa a CD20 foi medida num ensaio baseado em células (WIL2-S) das substituições estruturais. As mutações de Fc (*) estão indicadas através da numeração de EU (Kabat, supra) e são relativas ao 2H7.vl6 parental. A combinação de três mudanças de Ala na região Fc de v.31 é descrita como "FcllO". As variantes de IgG são mostradas com mutações em relação ao fundo 2H7.vl6. A ligação relativa é expressa como a concentração da quimera 2H7.v6.8 sobre a concentração da variante requerida para ligação equivalente; assim uma razão <1 indica uma afinidade mais fraca para a variante. O desvio padrão na determinação da afinidade relativa foi em média de +/-10%.

Versão de 2H7 Substituições de Fc* Ligaçao relativa OO - -1- 16 - 0,65 31 S298A, E333A, K334A 0,62

Exemplo 6

Variantes humanizadas de 2H7 com maior estabilidade

Para desenvolvimento como proteínas terapêuticas, é desejável escolher variantes que permaneçam estáveis em 96 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ relação à oxidação, desamidação, ou outros processos que podem afectar a qualidade do produto, num tampão de formulação adequado. Em 2H7.vl6, foram identificados vários resíduos como possíveis fontes de instabilidade: VL (M32) e VH (M34, N100). Portanto, foram introduzidas mutações nestes locais para comparação com νίβ.

Tabela 8. Ligação relativa de variantes de 2H7 concebidas para maior estabilidade e/ou função efectora, a CD20 num ensaio baseado em células (WIL2-S). As variantes de IgG são mostradas com mutações em relação ao fundo 2H7.vl6. A ligação relativa é expressa como a concentração da quimera 2H7.v6.8 sobre a concentração da variante requerida para ligação equivalente; assim uma razão <1 indica uma afinidade mais fraca para a variante. 0 desvio padrão na determinação da afinidade relativa foi em média de +/-10%. As substituições estruturais nos domínios variáveis são relativas a 2H7.vl6 de acordo com o sistema de numeração de Kabat e as mutações de Fc (*) estão indicadas através da numeração de EU (Kabat et ai., supra). (**) Variantes que foram medidas com 2H7.vl6 como comparador padrão, os valores relativos são normalizados para os da quimera.

As mutações adicionais de Fc foram combinadas com mutações que aumentam a estabilidade ou afinidade para alterar ou aumentar as funções efectoras com base nas mutações anteriormente relatadas (Idusogie et al., 2000; Idusogie et al., 2001; Shields et al., 2001). Estas mudanças incluem S298, E333A, K334A tal como descrito no Exemplo 5; K322A para reduzir a actividade de CDC; D265A para reduzir a actividade de ADCC; K3 2 6A ou K32 6W para aumentar a actividade de CDC; e E356D/M358L para testar os efeitos de mudanças alotípicas na região Fc. Nenhuma destas mutações causou diferenças significativas na afinidade de ligação a CD20. Versão de 2H7 Mudanças da cadeia pesada (VH) Mudanças da cadeia leve (VL) Mudanças de Fc* Ligaçao relativa CTi CO (quimera) (quimera) - -1- 16 - - - 0,65 62 - M32I - 0,46 63 M3 4I - - 3,49 6 4 N100A - - 97

ΕΡ 1 572 744/PT 65 NI 0 0A L47W - 0, 74 6 6 S 9 9 A L47W - 0,62 67 N54A - - 68 - M32I - 0,48 69 - M32L - 0,52 70 NI 0 0A - S298A, E333A, K334A 0, 80 71 N100D - S298A, E333A, K334A 0, 44 72 NI 0 0A M32I - 0,58 73 NI 0 0A M32L - 0,53 74 NI 0 0A M3 2I S298A, E333A, K334A 0,61 75 NI 0 0A M32L S298A, E333A, K334A 0,60 113 - - E356D, M358L 0,60** 114 D56A, NI 0 0A M32L, S92A S298A, E333A, K334A 1,2** 115 D56A, N100A M32L, S92A S298A, E333A, K334A, E356D, M358L 1, 4** 116 6 D56A, NI 0 0A M32L, S92A S298A, K334A, K322A 1,2** 134 D56A, N100A M32L, S92A E356D, M358L, D265A 1,5** 135 D56A, NI 0 0A M32L, S92A E356D, M358L, D265A, K326W 0,95** 138 D56A, N100A M32L, S92A S298A, E333A, K334A, K326A 1, 2** 139 D56A, N100A M32L, S92A S298A, E333A, K334A, K326A, E356N, M358L 1, 1** 154 - - D265A 0,70** 155 - - S298A, K322A, K334A 0,70** (**) Variantes que foram medidas com 2H7.vl6 como comparador, os valores relativos da ligação são normalizados para os da quimera.

Para testar os efeitos das mutações de estabilidade na taxa de degradação proteica, 2H7.vl6 e 2H7.v73 foram formulados a 12-14 mg/ml em histidina 10 mM, sacarose a 6%, polissorbato 20 a 0,02%, pH 5,8 e incubados a 40°C durante 16 dias. As amostras incubadas foram então ensaiadas quanto a mudanças em variantes de carga através de cromatografia de permuta iónica, agregação e segmentação através de 98 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ cromatografia de exclusão de tamanho, e ligação relativa através de testes num ensaio baseado em células (WIL2-S).

Os resultados (Fig. 9) mostram que v.73 de 2H7 tem maior estabilidade em comparação com v.16 de 2H7 em relação a perdas na fracção do pico principal através de cromatografia de permuta iónica sob condições de estabilidade acelerada. Não foram observadas diferenças significativas em relação à agregação, segmentação ou afinidade de ligação.

Exemplo 7

Análise de Scatchard da ligação do anticorpo a CD20 em células WIL2-S

As constantes de dissociação em equilíbrio (Kd) foram determinadas para as variantes de IgG 2H7 que se ligam a células WIL2-S utilizando IgG 2H7 radiomarcado. As variantes de IgG foram produzidas em células CHO. Rituxan® (a fonte para todas as experiências é Genentech, S. San Francisco, CA) e 2H7 de murídeo (BD PharMingen, San Diego, CA) foram utilizados para comparação com variantes humanizadas. 0 anticorpo 2H7 de murídeo está também disponível noutras fontes, p.ex., eBioscience, e Calbiochem (ambos de San Diego, CA) , Accurate Chemical & Scientific Corp., (Westbury, NY), Ancell (Bayport, MN), e Vinci-Biochem (Vinci, Itália). Todas as diluições foram efectuadas em tampão de ensaio de ligação (meio DMEM contendo albumina de soro bovino a 1%, HEPES 25 mM pH 7,2, e azida de sódio a 0,01%). Alíquotas (0,025 ml) de 125I-2H7. vl6 (iodado com lactoperoxidase) a uma concentração de 0,8 nM foram dispensadas para poços de uma placa de microensaio de 96 poços de fundo em V, e foram adicionadas e misturadas diluições em série (0,05 ml) de anticorpo frio. As células WIL2-S (60000 células em 0,025 ml) foram então adicionadas. A placa foi selada e incubada à temperatura ambiente durante 24 h, depois centrifugada durante 15 min a 3500 rpm. O sobrenadante foi então aspirado e o sedimento celular foi lavado e centrifugado. O sobrenadante foi novamente aspirado, e os sedimentos foram dissolvidos em NaOH 1 N e transferidos para tubos para contagem gama. Os dados foram utilizados para análise de Scatchard (Munson e Rodbard, Anal. Biochem. 107: 220-239, 1980) utilizando o programa Ligand (McPherson,

Comput. Programs Biomed. 17: 107-114, 1983). Os resultados, 99 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ mostrados na Tabela 9, indicam que as variantes humanizadas de 2H7 tinham afinidade de ligação a CD20 semelhante em comparação com 2H7 de murídeo, e uma afinidade de ligação a Rituxan® semelhante. Espera-se que 2H7.v31 tenha uma Kd muito semelhante à de v.16 com base na ligação mostrada na Tabela 7 cima.

Tabela 9. Afinidade de ligação no equilíbrio de variantes de 2H7 a partir da análise de Scatchard

Variante de anticorpo Kd (nM) n Rituxan 0,9 9±0,49 3 2H7 (murino) 1,23±0,29 3 2H7.vl6 0,84±0,37 4 2H7.v73 1,22±0,39 4 2H7.v75 1,09±0, 17 4

Exemplo 8

Ensaios de Citotoxicidade Dependente do Complemento (CDC)

As variantes de IgG 2H7 foram ensaiadas quanto à sua capacidade para mediar a lise dependente do complemento de células WIL2-S, uma linha de células B linfoblastóides expressando CD20, essencialmente tal como descrito (Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184, 2000; Idusogie et al., J. Immunol. 166: 2571-2575, 2001). Os anticorpos foram diluídos em série 1:3 a partir de uma solução de reserva a 0,1 mg/ml. Foi adicionada uma alíquota de 0,05 ml de cada diluição a uma placa de cultura de tecidos de 96 poços que continha 0,05 ml de uma solução de complemento humano normal (Quidel, San Diego, CA) . A esta mistura, foram adicionadas 50000 células WIL2-S num volume de 0,05 ml. Após incubação durante 2h a 37°C, foram adicionados 0,05 ml de uma solução de azul de Alamar (Accumed International, Westlake, OH) , e a incubação foi continuada durante mais 18 h a 37°C. As tampas foram então removidas das placas, e foram agitadas durante 15 min à temperatura ambiente num agitador orbital. As unidades fluorescentes relativas (RFU) foram lidas utilizando um filtro de excitação de 530 nm e um filtro de emissão de 590 nm. Foi calculada uma CE50 através de ajuste das RFU em função da 100 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ concentração para cada anticorpo utilizando o suporte lógico KaleidaGraph.

Os resultados (Tabela 10) mostram uma melhoria surpreendente na CDC por anticorpos 2H7 humanizados, com uma potência relativa semelhante a Rituxan® para v.73, 3 vezes mais potente que Rituxan® para v.75, e 3 vezes mais fraca que Rituxan® para v.16.

Tabela 10. Actividade de CDC de anticorpos 2H7 em comparação com Rituxan. Números >1 indicam uma actividade de CDC menos potente que Rituxan® e números <1 indicam uma actividade mais potente que Rituxan®. Os anticorpos foram produzidos a partir de linhas CHO estáveis, excepto os indicados por (*) que foram produzidos transientemente.

Variante de anticorpo n CE50 (variante) /CE50 (Rituxan) Rituxan® 4 -1- 2H7.vl6 4 3,72; 4,08 2H7.V31* 4 2, 21 2H7.v73 4 1, 05 2H7.v75 4 0,33 2H7.v96* 4 0, 956 2H7.V114* 4 0,378 2H7.vll5* 4 0, 475 2H7.V116* 1 >100 2H7.V135* 2 0, 42

Exemplo 9

Ensaios de Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos (ADCC)

As variantes de IgG 2H7 foram ensaiadas quando à sua capacidade para mediar lise por células Assassinas Naturais (células NK) de células WIL2-S, uma linha de células B linfoblastóides expressando CD20, essencialmente tal como descrito (Shields et al., J. Biol. Chem. 276: 6591-6604, 2001) 101 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ utilizando uma leitura de lactato-desidrogenase (LDH). Células NK foram preparadas a partir de 100 ml de sangue heparinizado, diluído com 100 ml de PBS (solução salina tamponada com fosfato), obtido de dadores humanos normais gue tinham sido isotipados para FcyRIII, também conhecido como CD16 (Koene et al., Blood 90 : 1109-1114, 1997). Nesta experiência, as células NK foram de dadores humanos heterozigóticos para CD16 (F158/V158). O sangue diluído foi vertido sobre 15 ml de meio de separação de linfócitos (ICN Biochemical, Aurora, Ohio) e centrifugado durante 20 min a 2000 RPM. Os glóbulos brancos na interface entre as camadas foram dispensados para 4 tubos limpos de 50 ml, gue foram enchidos com meio RPMI contendo soro fetal de vitelo a 15%. Os tubos foram centrif ugados durante 5 min a 1400 RPM e o sobrenadante descartado. Os sedimentos foram ressuspensos em tampão MACS (BSA a 0,5%, EDTA 2 mM) , e as células NK foram purificadas utilizando contas (Estojo de Isolamento de Células NK, 130-046-502) de acordo com o protocolo do fabricante (Miltenyi Biotech,). As células NK foram diluídas em tampão MACS até 2χ106 células/ml.

Diluições em série de anticorpo (0,05 ml) em meio de ensaio (F12/DMEM 50:50 sem glicina, tampão HEPES 1 mM, pH 7,2, Penicilina/Estreptomicina (100 unidades/ml; Gibco), glutamina, e soro fetal bovino inactivado com calor a 1%) foram adicionadas a uma placa de cultura de tecidos de 96 poços de fundo redondo. As células WIL2-S foram diluídas em tampão de ensaio até uma concentração de 4xl05/ml. As células WIL2-S (0,05 ml por poço) foram misturadas com anticorpo diluído na placa de 96 poços e incubadas durante 30 min à temperatura ambiente para permitir a ligação do anticorpo a CD20 (opsonização). A reacção de ADCC foi iniciada através da adição de 0,1 ml de células NK a cada poço. Nos poços de controlo, foi adicionado Triton X-100 a 2%. A placa foi então incubada durante 4h a 37°C. Os níveis de LDH libertada foram medidos utilizando um estojo de detecção da citotoxicidade (LDH) (Estojo #1644793, Roche Diagnostics, Indianapolis, Indiana) seguindo as instruções do fabricante. Foram adicionados a cada poço 0,1 ml de revelador de LDH, seguido de mistura durante 10 s. A placa foi então coberta com folha de alumínio e 102 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ incubada no escuro à temperatura ambiente durante 15 min. A densidade óptica a 490 nm foi então lida e utilizada para calcular a % de lise dividindo pela LDH total medida nos poços de controlo. A lise foi representada num gráfico em função da concentração de anticorpo e foi utilizado um ajuste à curva de 4 parâmetros (KaleidaGraph) para determinar as concentrações EC50.

Os resultados mostraram que os anticorpos 2H7 humanizados eram activos em ADCC, com uma potência relativa 20 vezes superior à de Rituxan® para v.31 e v.75, 5 vezes mais potente que Rituxan® para v.16, e quase 4 vezes superior à de Rituxan® para v.73.

Tabela 11. Actividade de ADCC dos anticorpos 2H7 em células WIL2-S em comparação com 2H7.vl6, com base em n experiências. (Valores >1 indicam uma menor potência que 2H7.vl6, e valores <1 indicam maior potência).

Variante de anticorpo n CE só (variante) /CE50(2H7.vl6) Rituxan® 4 5, 3 2H7.vl6 5 1 2H7.v31 1 0,24 2H7.v73 5 1,4 2H7.v75 4 0,25

Foram realizados ensaios adicionais de ADCC para comparar variantes de combinação de 2H7 com Rituxan®. Os resultados destes ensaios indicaram que 2H7.vll4 e 2H7.vll5 tinham uma potência de ADCC >10 vezes melhorada em comparação com Rituxan® (Tabela 12). 103 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ

Tabela 12. Actividade de ADCC de anticorpos 2H7 em células WIL2-S em comparação com Rituxan®, com base em n experiências (valores >1 indicam uma potência inferior a Rituxan®, e valores <1 indicam uma potência superior).

Variante de anticorpo CE5o (variante) /CE50 (Rituxan) Ritwcan® 2 -1- 2H7 v.16 2 0,52 2H7 v.96 2 0,58 2H7.vl14 2 0,093 2H7.vll5 2 0,083 2H7.vll6 2 0,30

Exemplo 10

Efeitos in vivo de variantes de 2H7 num estudo piloto em Macaca fascicularis

As variantes de 2H7, produzidas através de transfecção transiente de células CHO, foram testadas em macacos machos normais (Macaca fascicularis) para avaliar as suas actividades in vivo. Outros anticorpos anti-CD20, tais como C2B8 (Rituxan®) demonstraram uma capacidade para eliminar células B em primatas normais (Reff et ai., Blood 83: 435-445, 1994).

Num estudo, foram comparadas variantes de 2H7 humanizadas. Num estudo paralelo, foi também testado Rituxan® em Macaca fascicularis. Foram utilizados quatro macacos em cada um dos cinco grupos de dose: (1) veiculo, (2) 0,05 mg/kg de hu2H7.vl6, (3) 10 mg/kg de hu2H7.vl6, (4) 0,05 mg/kg de hu2H7.v31, e (5) 10 mg/kg de hu2H7.v31. Os anticorpos foram administrados intravenosamente a uma concentração de 0, 0,2, ou 20 mg/ml, para um total de duas doses, uma no dia 1 do estudo, e outra no dia 8. 0 primeiro dia de dosagem é designado dia 1 e o dia anterior é designado dia 1; o primeiro dia de recuperação (para 2 animais em cada grupo) é designado como dia 11. As amostras de sangue foram colhidas nos dias -19, -12, 1 (antes da dosagem), e às 6h, 24h, e 72h após a primeira dose. Foram tomadas amostras adicionais no dia 8 104 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ (antes da dosagem), dia 10 (antes do sacrifício de 2 animais/grupo) , e nos dias 36 e 67 (para os animais de recuperação).

As concentrações de células B periféricas foram determinadas através do método de FACS que contou células CD3~ /CD40+. A percentagem de células B CD3~CD40+ dos linfócitos totais em amostras de macacos foram obtidas através da seguinte estratégia de separação. A população de linfócitos foi marcada no diagrama de dispersão dispersão directa/dispersão lateral para definir a Região 1 (Rl).

Utilizando eventos em Rl, gráficos de pontos de intensidade de fluorescência foram apresentados para os marcadores CD40 e CD3. Controlos do isotipo marcados com fluorescência foram utilizados para determinar os respectivos pontos de separação para positividade para CD40 e CD3.

Os resultados indicaram que ambos 2H7.vl6 e 2H7.v31 eram capazes de produzir eliminação total de células B periféricas à dose de 10 mg/kg e eliminação parcial de células B periféricas à dose de 0,05 mg/kg (Fig. 11). O curso de tempo e a extensão da eliminação de células B medidos durante as primeiras 72 h de doseamento foram semelhantes para os dois anticorpos. A subsequente análise dos animais de recuperação indicou que os animais tratados com 2H7.v31 apresentaram uma eliminação prolongada de células B em comparação com os doseados com 2H7.vl6. Em particular, em animais de recuperação tratados com 10 mg/kg de 2H7.vl6, as células B mostraram substancial recuperação de células B nalgum momento entre a amostragem no Dia 10 e no Dia 36. No entanto, para os animais de recuperação tratados com 10 mg/kg de 2H7.v31, as células B não mostraram recuperação até algum momento entre o Dia 36 e o Dia 67 (Fig. 11). Isto sugere uma maior duração da eliminação total em cerca de um mês para 2H7.v31 em comparação com 2H7.vl6. Não se observou toxicidade no estudo de macacos a dose baixa ou elevada e a patologia grosseira foi normal. Noutros estudos, vl6 foi bem tolerado até à dose mais elevada avaliada de (100 mg/kg x2 = 1200 mg/m2 x2) após administração i.v. de 2 doses dadas separadas 2 semanas nestes macacos. 105 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ

Os dados em Macaca fascicularis com 2H7.vl6 versus Rituxan® sugerem que uma redução de 5 vezes na actividade de CDC não afecta adversamente a potência. Um anticorpo com potente actividade de ADCC mas reduzida actividade de CDC pode ter um perfil de segurança mais favorável em relação às primeiras reacções de infusão que um com maior actividade de CDC.

Exemplo 11

Anticorpos 2H7 variantes deficientes em fucose com maior função efectora Células CHO e HEK293 normais adicionam fucose ao oligossacárido de IgG até um elevado grau (97-98%). As IgG dos soros são também altamente fucosiladas. DP 12, uma linha celular CHO di-hidrofolato-redutase menos (DHFR”) que é competente na fucosilação, e Lecl3, uma linha celular que é deficiente na fucosilação proteica foram utilizadas para produzir anticorpos para este estudo. A linha celular CHO Pro-Lecl3.6a (Lecl3), foi obtida da Professora Pamela Stanley de Albert Einstein College of Medicine de Yeshiva University. As linhas parentais são Pro- (auxotrofo para prolina) e Gat- (auxotrofo para glicina, adenosina e timidina). A linha celular CHO-DP12 é um derivado da linha celular CHO-K1 (ATCC #CCL-61), que é deficiente na di-hidrof olato-redutase, e tem uma necessidade reduzida de insulina. As linhas celulares foram transfectadas com ADNc utilizando o método Superfect (Qiagen, Valência, CA). A selecção das células Lecl3 expressando anticorpos transfectados foi efectuada utilizando di-cloridrato de puromicina (Calbiochem, San Diego, CA) a 10 yg/ml em meio de crescimento contendo: Meio MEM Alfa com L-glutamina, ribonucleósidos e desoxirribonucleósidos (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD), suplementado com FBS inactivado a 10% (GIBCO), HEPES 10 mM, e penicilina/estreptomicina lx (GIBCO). As células CHO foram semelhantemente seleccionadas em meio de cultura contendo F12 de Ham sem GHT: DMEM Pobre em Glicose sem Glicina com NaHC03 suplementado com FBS a 5% (GIBCO) , HEPES 10 mM, L-glutamina 2 mM, GHT lx (glicina, hipoxantina, timidina), e penicilina/estreptomicina lx. 106 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ

Formaram-se colónias em duas a três semanas e foram reunidas para expansão e expressão proteica. Os bancos celulares foram semeados inicialmente a 3xl06 células/placa de 10 cm para expressão proteica de pequenas fornadas. As células foram convertidas em meio sem soro após crescerem até 90-95% de confluência e após 3-5 dias os sobrenadantes celulares foram colhidos e testados num ELISA de Fc de IgG e de IgG intacto para estimar os níveis de expressão proteica. As células Lecl3 e CHO foram semeadas a aproximadamente 8χ106 células/placa de 15 cm um dia antes da conversão para meio de produção PS24, suplementado com 10 mg/1 de insulina humana recombinante e 1 mg/1 de elementos vestigiais.

As células Lecl3 e células DP12 permaneceram em meio de produção sem soro durante 3-5 dias. Os sobrenadantes foram colhidos e clarificados através de centrifugação em tubos cónicos de 150 ml para remover as células e os restos. Foram adicionados os inibidores de proteases PMSF e aprotinina (Sigma, St Louis, MO) e os sobrenadantes foram concentrados 5 vezes em células agitadas utilizando filtros MWC030 (Amicon, Beverly, MA) antes de purificação imediata utilizando cromatografia de proteína G (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) ) . O tampão de todas as proteínas foi mudado para solução salina tamponada com fosfato (PBS) utilizado concentradores Centripriep-30 (Amicon) e foram analisadas através de electroforese em gel de SDS-poliacrilamida. As concentrações proteicas foram determinadas utilizando A280 e verificadas utilizando análise da composição de aminoácidos.

As células CHO foram transfectadas com vectores expressando 2H7vl6, 2H7v.31 humanizados e seleccionadas tal como descrito. O anticorpo 2H7v.l6 mantém a região Fc de tipo selvagem enquanto v.31 (ver Exemplo 5, Tabela 7 acima) tem uma região Fc em que foram feitas 3 mudanças de aminoácidos (S298A, E333A, K334A) que resultam em maior afinidade para o receptor FcYRIIIa (Shields et al., J. Biol. Chem. 276 (9): 6591-6604, 2001). Após transfecção e selecção, colónias individuais de células foram isoladas e avaliadas quanto ao nível de expressão proteica e as maiores produtoras foram sujeitas a selecção de metotrexato para seleccionar células que tinham amplificado o número de cópias do plasmídeo e que portanto produziam níveis superiores do anticorpo. As células 107 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ foram criadas, transferidas para meio sem soro durante um período de 7 dias, depois o meio foi colhido, carregado numa coluna de proteína A e o anticorpo foi eluído utilizando técnicas padrão. A concentração final do anticorpo foi determinada utilizando um Elisa que mede o anticorpo intacto. O tampão de todas as proteínas foi mudado para solução salina tamponada com fosfato (PBS) utilizando concentradores Centripriep-30 (Amicon) e foram analisadas através de electroforese em gel de SDS-poliacrilamida.

Análise de Espectro de Massa de Dessorção/Ionização Laser Assistida por Matriz Tempo-de-vôo (MALDI-TOF) de Oligossacáridos Ligados a Asparagina: oligossacáridos ligados em N foram libertados de glicoproteínas recombinantes utilizando o procedimento de Papac et ai., Glycobiology 8: 445-454, 1998. Resumidamente, os poços de uma placa de microtitulação de 96 poços forrada com PVDF (Millipore, Bedford, MA) foram condicionados com 100 μΐ de metanol que foram retirados através das membranas de PDVF aplicando vácuo na torneira de vácuo de Millipore Multiscreen. As membranas de PVDF condicionadas foram lavadas com 3χ250 μΐ de água. Entre todos os passos de lavagem os poços foram drenados completamente através de aplicação de vácuo suave à torneira. As membranas foram lavadas com tampão de redução e carboximetilação (RCM) consistindo em cloridrato de guanidina 6 M, Tris 360 mM, EDTA 2 mM, pH 8,6. As amostras de glicoproteínas (50 pg) foram aplicadas a poços individuais, novamente retiradas através das membranas de PVDF através de vácuo suave e os poços foram lavados com 2x50 μΐ de tampão RCM. As amostras imobilizadas foram reduzidas através da adição de 50 μΐ de uma solução de ditiotreitol (DTT) 0,1 M a cada poço e incubação da placa de microt itulação a 37°C durante 1 h. O DTT foi removido através de vácuo e os poços foram lavados em 4x250 μΐ de água. Os resíduos de cisteína foram carboxilmet ilados através da adição de 50 μΐ de uma solução de ácido iodoacético (LAA) 0,1 M que foi preparada de fresco em NaOH 1 M e diluído até 0,1 M com tampão RCM. A carboximetilação foi alcançada através de incubação durante 30 min no escuro à temperatura ambiente. Foi aplicado vácuo à placa para remover a solução de IAA e os poços foram lavados com 4x250 μΐ de água purificada. As membranas de PVDF foram bloqueadas através da adição de 100 μΐ de solução de PVP360 a 108

ΕΡ 1 572 7 4 4/PT 1% (polivinilpirrolidina 360000 PM) (Sigma) e incubação durante 1 h à temperatura ambiente. A solução de PVP-360 foi removida através de vácuo suave e os poços foram lavados 4x250 μΐ de água. A solução de digerido de PNGase F (New England Biolabs, Beverly, MA) , 25 μΐ de uma solução a 25

Unidades/ml em Tris-acetato 10 MM, pH 8,4, foi adicionada a cada poço e a digestão prosseguiu durante 3 h a 37°C. Após digestão, as amostras foram transferidas para tubos Eppendorf de 500 μΐ e foram adicionados a cada amostra 2,5 μΐ de uma solução de ácido acético 1,5 M. As amostras acidificadas foram incubadas durante 3 h à temperatura ambiente para converter os oligossacáridos de glicosilaminas na forma hidroxilo. Antes da análise do espectro de massa MALDI-TOF, os oligossacáridos libertados foram dessalinizados utilizando um leito de 0,7 ml de resina de permuta catiónica (resina AG50W-X8 na forma hidrogenada) (Bio-Rad, Hercules, CA) empacotada em pasta em tubos de reacção compactos (US Biochemical, Cleveland, OH).

Para análise de espectro de massa MALDI-TOF das amostras no modo positivo, os oligossacáridos dessalinizados (aliguotas de 0,5 μΐ) foram aplicados ao alvo inoxidável com 0,5 μΐ da matriz de ácido 2,5-di-hidroxibenzóico (sDHB) que foram preparados através de dissolução de 2 mg de ácido 2,5-di-hidroxibenzóico com 0,1 mg de ácido 5-metoxisilicílico em 1 ml de etanol/cloreto de sódio 10 mM 1:1 (v/v). A mistura amostra/matriz foi seca através de vácuo. Para análise no modo negativo, os oligossacáridos ligados em N dessalinizados (aliquotas de 0,5 μΐ) foram aplicados ao alvo inoxidável juntamente com 0,5 μΐ de matriz de 2',4',6'-tri-hidroxiacetofenona (THAP) preparada em acetonitrilo/tampão citrato de amónio 13,3 mM 1:3 (v/v). A mistura amostra/matriz foi seca em vácuo e depois deixada a absorver a humidade atmosférica antes da análise. Os oligossacáridos libertados foram analisados através de MALDI-TOF num espectrómetro de massa PerSeptive BioSystems Voyager-DE. O espectrómetro de massa foi operado a 20 kV no modo positivo ou negativo com a configuração linear e utilizando extracção retardada. Os dados foram adquiridos utilizando uma potência de laser de 1300 e no modo de soma de dados (240 varrimentos) para melhorar o sinal para ruido. O instrumento foi calibrado com uma mistura de oligossacáridos padrão e os dados foram alisados utilizando um algoritmo de Savitsky-Golay de 19 pontos antes das massas 109 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ serem atribuídas. A integração dos dados do espectro de massa foram alcançados utilizando o pacote de suporte lógico de análise de dados Caesar 7.0 (SciBridge Software).

Ensaios de citotoxicidade dependente de anticorpos de células assassinas naturais (NK)

Os ensaios de ADCC foram efectuados tal como descrito no Exemplo 9. A razão de células NK para alvo (WIL2-S) foi de 4 para 1, os ensaios foram corridos durante 4 horas, e a toxicidade foi medida tal como anteriormente utilizando um ensaio de lactose-desidrogenase. As células alvo foram opsonizadas com as concentrações de anticorpo indicadas durante 30 min antes da adição de células NK. O anticorpo Rituxan® utilizado foi de Genentech (S. San Francisco, CA). A Figura 12 mostra os resultados de um ensaio de ADCC representativo.

Os resultados mostram que anticorpos subfucosilados medeiam a matança de células alvo por células NK mais eficientemente que anticorpos com um complemento total de fucose. 0 anticorpo subfucosilado, 2H7v.31, é muito eficiente a mediar a matança de células alvo. Este anticorpo é eficaz a concentrações inferiores e é capaz de mediar a matança de uma maior percentagem de células alvo a concentrações mais elevadas que as dos outros anticorpos. A actividade dos anticorpos é como se segue: 2H7 v31 derivado de Lecl3> 2H7vl6 derivado de Lecl3> 2H7v31 derivado de Dpl2> 2H7vl6 derivado de Dpl2> ou = a Rituxan. A proteína e as alterações dos hidratos de carbono são aditivas. A comparação dos hidratos de carbono verificados na IgG nativa com os da IgG produzida por lecl3 e produzida por CHO não mostrou diferenças apreciáveis na extensão de galactosilação e assim os resultados podem ser atribuídos meramente à presença/ausência de fucose.

Exemplo 12

Anticorpos variantes 2H7 deficientes em fucose com maior ADCC in vivo

Este exemplo descreve actividade de ADCC in vivo das variantes de 2H7 humanizadas deficientes em fucose incluindo v.16 e v.31 produzidas em Lecl3 em comparação com os 110 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ equivalentes fucosilados normais produzidos em DP12, em ratinhos expressando CD16 humano [FcRyIII] e CD20 humano.

Geração de ratinhos huCD20Tg+ huCDl6Tg+ mCD!6~/~

Ratinhos transgénicos de CD20 humano foram gerados a partir de ADN BAC de CD20 (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Os ratinhos foram pesquisados com base na análise FACS da expressão de CD20 humano. Ratinhos Tg HuCD20 foram então cruzados com ratinhos huCD16Tg+mCD16_/“ para gerar ratinhos huCD20Tg+huCD16Tg+mCD16~^.

Tratamento in vivo 10 a 100 pg de cada uma das variantes de 2H7 ou Rituxan® são administrados a ratinhos huCD20Tg+huCD16Tg+mCD16_/” através de injecções intraperitoneais. Uma quantidade igual de anticorpos do mesmo isotipo será aplicada de forma semelhante ao grupo de animais de controlo negativo.

Preparação de linfócitos de ratinho

Linfócitos de ratinho de sangue completo, baço, nódulos linfáticos e medula óssea são preparados de acordo com o protocolo padrão descrito em "Current Protocols in Immunology", editado por John Coligan, Ada Kruisbeek, David Margulies, Ethan Shevach e Warren Strober, 1994.

Análise FACS

Meio milhão de células são lavadas e ressuspensas em 100 μΐ de tampão FACS, que é solução salina tamponada com fosfato com BSA a 1%, contendo 5 μΐ de anticorpo de coloração ou de controlo. Todos os anticorpos de coloração, incluindo controlos de isotipo, são obtidos em PharMingen, San Diego, CA. A expressão de CD20 humano é avaliada através de coloração com Rituxan® juntamente com anticorpo secundário anti-IgGl humana conjugado com FITC. A análise FACS é conduzida utilizando FACScan e Cell Quest (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA) . Todos os linfócitos são definidos nas dispersões de luz directa e lateral, enquanto todos os linfócitos B são definidos com a expressão de B220 à superfície celular. 111 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ A eliminação e recuperação de células B são avaliados através da análise das contagens de células B periféricas e da análise das células B hCD20+ através de FACS no baço, nódulos linfáticos e medula óssea numa base diária durante a primeira semana após a injecção e a partir dai numa base semanal. Os níveis séricos do anticorpo variante 2H7 injectado são monitorizados.

Os resultados deste ensaio in vivo confirmam as descobertas in vitro sobre a maior actividade de ADCC e maior eliminação de células B das variantes de 2H7 deficientes em fucose em relação aos equivalentes de glicosilação de tipo selvagem (em relação à fucosilação).

Exemplo 13

Actividade de Apoptose

Foi mostrado que anticorpos anti-CD20 incluindo Rituxan® induzem apoptose in vitro quando ligados de forma cruzada por um anticorpo secundário ou através de meios químicos (Shan et al., Blood 9: 1644-1652, 1998; Byrd et al., Blood 99: 1038-43, 2002; Pederson et al., Blood 99: 1314-19, 2002). Quando ligados quimicamente de forma cruzada, dímeros de 2H7 de murídeo induziram apoptose de células Daudi (Ghetie et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94: 7509-14, 1997). A ligação cruzada com um anticorpo secundário induziu também apoptose com o anticorpo 2H7 de murídeo (Shan et al., 1998) . Crê-se que estas actividades sejam fisiologicamente relevantes porque uma variedade de mecanismos poderia conduzir a ligação cruzada de anticorpos anti-CD20 ligados a CD20 da superfície celular in vi vo.

RhuMAb 2H7.vl6 (vl6 de 2H7 humanizada; RhuMAb significa anticorpo monoclonal humano recombinante) e Rituxan® foram comparados em ensaios de apoptose in vitro utilizando um anticorpo secundário de ligação cruzada. Células de Ramos (CRL-1596, ATCC, Manassas, VA), uma linha celular de linfócitos B humanos que expressa CD20, foram utilizadas para medir a capacidade dos anticorpos monoclonais anti-CD20 rhuMAb 2H7.vl6 e Rituximab versus um anticorpo de controlo negativo, Trastuzumab (Herceptin®, Genentech, South San Francisco, CA) , para induzir apoptose medida através de coloração de Anexina V 112 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ e exclusão do corante iodeto de propídio (Vybrant® Apoptosis Assay Kit, Molecular Probes, Seattle, WA) . Células de Ramos foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Gibco, Rockville, MD) contendo soro fetal bovino a 10% (Biosource International, Camarillo, CA) e L-glutamina 2 mM (Gibco) . Antes de serem ensaiadas, as células foram lavadas duas vezes em meio fresco e depois ajustadas a uma concentração celular de 2xl06 por ml. As células (150 μΐ) foram adicionadas a placas de ensaio de 96 poços (Becton Dickinson, Paio Alto, CA) que continham 150 μΐ de uma quantidade predeterminada de IgGl de controlo, rhuMAb 2H7.vl6, ou Rituximab, juntamente com F(ab)'2 de cabra anti-Fc humano (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) . As concentrações finais de IgG foram de 100, 10, 1,0, 0,1, 0,01 e 0,001 nM, e a concentração do anticorpo F(ab)'2 de cabra anti-Fc humano foi estabelecida a duas vezes a respectiva concentração do anticorpo da amostra. Cada diluição foi estabelecida em triplicado. Após uma incubação de 24 horas a 37°C, as células foram lavadas duas vezes com PBS e depois coradas com Anexina V e iodeto de propídio de acordo com as recomendações do fabricante. Os padrões de coloração das células de Ramos foram analisados através de citometria de fluxo utilizando um Citómetro de Fluxo FACscan (Becton Dickinson, San Jose, CA) , e os dados foram recolhidos durante períodos de 10 s. Os dados foram reduzidos utilizando o suporte lógico Cellquest Pro (Becton Dickinson). As células de Ramos que eram positivas para (1) coloração de Anexina V, (2) dupla coloração de Anexina V e iodeto de propídio, e (3) o número de células vivas não coradas, foram contados e representados num gráfico utilizando suporte lógico KaleidaGraph (Synergy Software, Reading, PA).

Tanto rhuMAb 2H7.vl6 como Rituximab induziram apoptose de células de Ramos quando ligados de forma cruzada com anti-Fc humano e em comparação com um anticorpo irrelevante IgGl de controlo (Figuras 13-15) . A actividade apoptótica de (rhuMAb 2H7) foi ligeiramente inferior à de Rituximab. A concentrações de 10 nM de rhuMAb 2H7, Rituximab e IgGl de controlo ligados de forma cruzada, as fracções de células coradas com Anexina V foram de 18,5, 16,5, 2,5%, respectivamente, as fracções de células duplamente coradas foram de 29, 38 e 16%, e os números de células vivas contadas por 10 s foram de 5200, 3100 e 8600. 113 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ

Estes dados in vitro demonstram que a apoptose é um potencial mecanismo para eliminação de células B in vivo. A ligação cruzada in vivo de rhuMAb 2H7 ou Rituximab ligado a CD20 da superfície celular pode ocorrer através de FcyR nas superfícies de células imunitárias efectoras.

Exemplo 14

Supressão in vivo de Crescimento Tumoral A capacidade de rhuMAb 2H7.vl6 para inibir o crescimento das células B humanas de Raji, uma linha celular de linfoma (ATCC CCL 86), foi avaliada em ratinhos nus (atímicos) Balb/c. As células de Raji expressam CD20 e foi relatado que cresciam em ratinhos nus, produzindo doença metastática; o crescimento tumoral é inibido por Rituxan® (Clynes et al., Nature Medicine 6. 443-446, 2000). Cinquenta e seis ratinhos Balb/c nus com 8-10 semanas de idade foram divididos em 7 grupos (A-G) consistindo cada grupo em 8 ratinhos. No dia 0, cada ratinho recebeu uma injecção subcutânea de 5xl06 células de linfoma B de Raji no flanco. Começando no dia 0, cada ratinho recebeu 100 μΐ da solução de controlo negativo (PBS; solução tamponada com fosfato), Rituxan® ou 2H7.vl6. A dosagem foi dependente do peso e a distribuição do fármaco foi intravenosamente através da veia da cauda. O grupo A recebeu PBS. Os grupos B-D receberam Rituxan® a 5,0, mg/kg, 0,5 mg/kg, e 0,05 mg/kg, respectivamente. Os ratinhos dos grupos E-G receberam 2H7 v.16 a 5,0 mg/kg, 0,5 mg/kg e 0,05 mg/kg, respectivamente. As injecções foram repetidas todas as semanas durante 6 semanas. A intervalos semanais durante o tratamento, cada ratinho foi inspeccionado quanto à presença de tumores palpáveis no local da injecção, e o volume dos tumores se presentes foi medido e registado. Uma inspecção final foi feita na semana 8 (após um intervalo de duas semanas sem tratamentos).

Os resultados deste estudo mostraram que tanto rhuMAb 2H7.vl6 como Rituxan® foram eficazes na inibição do crescimento de células tumorais de Raji subcutâneas em ratinhos nus (FIGs. 16-18). O crescimento tumoral foi observado no grupo de controlo de PBS começando às 4 semanas. No entanto, não foi observado crescimento tumoral em grupos tratados com Rituxan® ou 2H7.vl6 a 5 mg/kg ou 0,5 mg/kg durante a duração de 8 semanas do estudo. Nos grupos de 114 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ tratamento de dose baixa de 0,05 mg/kg, tumores foram observados num animal no grupo de 2H7 e num animal no grupo de Rituxan® (FIG. 18).

Exemplo 15

Clonagem de CD20 de Macaca fascicularis e ligação do anticorpo A sequência de ADN de CD20 para macaco (Macaca fascicularis) foi determinada após o isolamento de ADNc codificando CD20 a partir de uma biblioteca de ADNc de baço de Macaca fascicularis. Um Sistema de Plasmideos SUPERSCRIPT™ para Síntese de ADNc e Clonagem de Plasmideos (Cat#18248-013, Invitrogen, Carlsbad, CA) foi utilizado com ligeiras modificações para construir a biblioteca. A biblioteca de ADNc foi ligada num vector pRK5E utilizando locais de restrição Xhol e Not I. ARNm foi isolado a partir de tecido do baço (Califórnia Regional Research Primate Center, Davis, CA) . Os iniciadores para amplificar ADNc codificando CD20 foram desenhados com base em sequências não codificadoras do CD20 humano. 0 iniciador da região N-terminal 5' -AGTTTTGAGAGCAAAATG-3' e o iniciador da região C-terminal 5'-AAGCTATGAACACTAATG-3' foram utilizados para clonar através de reacção em cadeia da polimerase (PCR) o ADNc codificando CD20 de Macaca fascicularis. A reacção de PCR foi realizada utilizando Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity de acordo com as recomendações do fabricante (Gibco, Rockville, MD). O produto de PCR foi subclonado em pCR® 2.1-TOPO® Vector (Invitrogen) e transformado em E. coli XL-1 blue (Stratagene. La Jolla, CA). O ADN plasmídico contendo os produtos de PCR ligados foi isolado a partir de clones individuais e sequenciado. A sequência de aminoácidos para CD20 de Macaca fascicularis é mostrada na Figura 19. A Figura 20 mostra uma comparação de CD20 de Macaca fascicularis e humano. O CD20 de Macaca fascicularis é 97,3% semelhante ao CD20 humano com 8 diferenças. O domínio extracelular contém uma mudança em V157A, enquanto os restantes 7 resíduos podem ser encontrados nas regiões citoplasmáticas ou transmembranares.

Anticorpos dirigidos contra CD20 humano foram ensaiados quanto à capacidade para se ligarem e deslocarem a ligação do 2H7 de murídeo conjugado com FITC a células de Macaca 115

ΕΡ 1 572 7 4 4/PT fascicularis expressando CD20. Vinte mililitros de sangue foram tirados de 2 macacos Macaca fascicularis (Califórnia Regional Research Primate Center, Davis, CA) para heparina de sódio e enviados directamente para Genentech Inc. No mesmo dia, as amostras de sangue foram reunidas e diluídas 1:1 através da adição de 40 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS). 20 ml de sangue diluído foram vertidos em 4x20 ml de Ficoll-Paque™ Plus (Amersham Biosciences, Uppsala, Suécia) em tubos cónicos de 50 ml (Cat#352098, Falcon, Franklin Lakes, NJ) e centrifugados a 1300 rpm durante 30 minutos à TA numa centrífuga Sorvai 7 (Dupont, Newtown, CT) . A camada de PBMC foi isolada e lavada em PBS. Os glóbulos vermelhos foram lisados numa solução de NaCl a 0,2%, restaurada para isotonicidade com um volume equivalente de uma solução de NaCl a 1,6%, e centrifugados durante 10 minutos a 1000 RPM. O sedimento de PBMC foi ressuspenso em RPMI 1640 (Gibco, Rockville, MD) contendo soro fetal bovino (FBS) a 5% e dispensado para uma caixa de cultura de tecidos de 10 cm durante 1 hora a 37°C. As populações de células B e T não aderentes não aderentes foram removidas através de aspiração, centrifugadas e contadas. Foi recuperado um total de 2,4xl07 células. Os PBMC ressuspensos foram distribuídos por vinte tubos de cultura de 12x75 mm (Cat#352053, Falcon), com cada tubo contendo lxlO6 células num volume de 0,25 ml. Os tubos foram divididos em quatro conjuntos de cinco tubos. A cada conjunto foi adicionado meio (RPMI 1640, FBS a 5%), quantidades tituladas de anticorpo IgGi humano de controlo, Rituxan®, 2H7.vl6, ou 2H7.v31. A concentração final de cada anticorpo foi de 30, 10, 3,3 e 1,1 nM. Adicionalmente, cada tubo recebeu também 20 μΐ de anti-CD20 humano conjugado com Isotiocianato de Fluoresceína (FITC) (Cat#555622, BD Biosciences, San Diego, CA) . As células foram gentilmente misturadas, incubadas durante 1 hora em gelo e depois lavadas duas vezes em PBS frio. A coloração da superfície celular foi analisada num Epic XL-MCL (Coulter, Miami, FL), a média geométrica derivada, representada graficamente (KaleidaGraph™, Synergy Software Reading, PA) versus as concentrações de anticorpo.

Os dados na Figura 21 mostraram que v.16 de 2H7 e v.31 de 2H7 deslocaram competitivamente a ligação de FITC-2H7 de murídeo a células de Macaca fascicularis. Para além disso, 116 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ

Rituxan® também deslocou a ligação de FITC-2H7 de murídeo demonstrando assim que tanto 2H7 como Rituxan® se ligam a um epítopo sobreponivel em CD20. Adicionalmente, os dados mostram que o valor de CI50 para v.16 de 2H7, v.31 de 2H7 e Rituxan são semelhantes e recaem na gama de 4-6 nM.

Exemplo 16

Estudo de Fase I/II de rhuMAb 2H7 (2H7.vl6) em artrite reumatóide moderada a grave

Sinopse do Protocolo

Um estudo de fase I/II aleatório, controlado com placebo, multicentro, cego sobre a segurança do aumento de doses de PRO70769 (rhuMAb 2H7) em sujeitos com artrite reumatóide moderada a grave recebendo doses estáveis de metotrexato concomitante.

Objectivos 0 objectivo primário deste estudo é o de avaliar a segurança e tolerabilidade do aumento de doses intravenosas (IV) de PR070769 (rhuMAb 2H7) em sujeitos com artrite reumatóide (A.R.) moderada a grave.

Desenho do Estudo

Este é um estudo aleatório, controlado com placebo, multicentro, de fase I/II, cego para o investigador e para o sujeito sobre a segurança do aumento de doses de PRO70769 em combinação com MTX em sujeitos com AR moderada a grave. 0 estudo consiste numa fase de aumento da dose e uma segunda fase com recrutamento de um maior número de sujeitos. 0

Patrocinador permanecerá afastado da atribuição do tratamento.

Serão recrutados sujeitos com AR moderada a grave que falharam um a cinco fármacos ou produtos biológicos anti- reumáticos modificadores da doença que têm actualmente respostas clínicas insatisfatórias ao tratamento com MTX.

Será necessário os sujeitos receberem MTX na gama de 10-25 mg semanalmente durante pelo menos 12 semanas antes da entrada no estudo e estarem a uma dose estável durante pelo 117 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ menos 4 semanas antes de receberem a sua dose inicial do fármaco do estudo (PRO70769 ou placebo). Os sujeitos podem também receber doses estáveis de corticosteróides orais (até 10 mg diários ou o equivalente em prednisona) e doses estáveis de fármacos anti-inflamatórios não esteróides (FAINE). Os sujeitos receberão duas infusões IV de PRO70769 ou o equivalente em placebo na dose indicada nos Dias 1 e 15 de acordo com o seguinte plano de aumento da dose (ver

Figura 22) . O aumento da dose ocorrerá de acordo com critérios específicos (ver Regras de Aumento da Dose) e após revisão dos dados de segurança por um comité interno de revisão de dados de segurança e avaliação da toxicidade aguda 72 horas após a segunda infusão no último sujeito tratado em cada coorte. Após a fase de aumento da dose, 40 sujeitos adicionais (32 activos e 8 placebos) serão distribuídos aleatoriamente por cada um dos níveis de dose seguintes: 2x50 mg, 2x200 mg, 2x500 mg e 2x1000 mg, se tivesse sido demonstrado que os níveis de dose eram toleráveis durante a fase de aumento da dose. Serão recrutados neste estudo aproximadamente 205 sujeitos.

Contagens de células B serão obtidas e registadas (para as avaliações do estudo, ver Secção 4.5 e Apêndice A-l) . As contagens de células B serão avaliadas utilizando citometria de fluxo num período de acompanhamento de 48 semanas para além da avaliação de eficácia de 6 meses. A eliminação de células B não será considerada uma toxicidade limitante da dose (DLC), mas sim o resultado farmacodinâmico esperado do tratamento de PRO70769.

Num sub-estudo opcional, será obtido sangue para análises séricas e de ARN, bem como amostras de urina a partir de sujeitos a vários momentos (ver Secção 3.3.3). Estas amostras podem ser utilizadas para identificar biomarcadores que possam ser preditivos da resposta ao tratamento com PRO70769 em sujeitos com AR moderada a grave.

Medidas do Resultado A medida do resultado primário para este estudo é a segurança e a tolerabilidade de PRO70769 em sujeitos com AR moderada a grave. 118

ΕΡ 1 572 7 4 4/PT

Tratamento do Estudo

Coortes de sujeitos receberão duas infusões IV de PR070769 ou equivalente em placebo à dose indicada nos Dias 1 e 15 de acordo com o seguinte plano de aumento da dose: - 10 mg de PRO70769 ou equivalente em placebo: 4 sujeitos de fármaco activo, 1 de controlo - 50 mg de PRO70769 ou equivalente em placebo: 8 sujeitos de fármaco activo, 2 de controlo - 200 mg de PRO70769 ou equivalente em placebo: 8 sujeitos de fármaco activo, 2 de controlo - 500 mg de PRO70769 ou equivalente em placebo: 8 sujeitos de fármaco activo, 2 de controlo - 1000 mg de PRO70769 ou equivalente em placebo: 8 sujeitos de fármaco activo, 2 de controlo

Eficácia A eficácia de PRO70769 será medida através de respostas de ACR. A percentagem de sujeitos que alcançam uma resposta de ACR20, ACR50, e ACR70 será resumida pelo grupo de tratamento e serão gerados intervalos de confiança de 95% para cada grupo. Os componentes desta resposta e a sua mudança em relação ao limiar serão resumidos pelo tratamento e visita.

Conclusão

Os dados acima demonstraram o sucesso na produção de anticorpos de ligação a CD20 humanizados, em particular variantes de anticorpos 2H7 humanizados, que mantinham e até aumentaram as suas propriedades biológicas. Os anticorpos 2H7 humanizados do presente invento ligaram-se a CD20 a afinidades semelhantes às dos anticorpos de murideo dador e 2H7 quimérico e foram eficazes na morte de células B num primata, conduzindo a eliminação de células B. Certas variantes mostraram ADCC aumentada em relação a um anticorpo anti-CD20 quimérico actualmente utilizado para tratar LNH, favorecendo a utilização de doses menores do anticorpo terapêutico em pacientes. Adicionalmente, embora possa ser necessário que um anticorpo quimérico que possua resíduos FR de murideo seja administrado a uma dose eficaz para se alcançar a completa 119 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ eliminação de células B para evitar uma resposta de anticorpos contra estes, os presentes anticorpos humanizados podem ser administrados a dosagens que alcançam eliminação parcial ou completa de células B, e durante diferentes durações de tempo, conforme desejado para a doença e paciente particulares. Adicionalmente, estes anticorpos demonstraram estabilidade em solução. Estas propriedades dos anticorpos 2H7 humanizados tornam-nos ideais para utilizar como agentes imunoterapêuticos no tratamento de cancros positivos para CD20 e doenças auto-imunes; não se espera que estes anticorpos sejam imunogénicos ou pelo menos serão menos imunogénicos que os anticorpos anti-CD20 completamente de murídeo ou quiméricos em pacientes humanos.

Referências A prática do presente invento empregará, a menos que indicado em contrário, técnicas convencionais de biologia molecular e semelhantes, que estão dentro da perícia na especialidade. Tais técnicas são completamente explicadas na literatura. Ver p.ex., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.,1989); Current Protocols in Molecular Biology (F. Ausubel et al., eds., 1987 updated); Essential Molecular Biology (T. Brown ed., IRL Press 1991); Gene Expression Technology (Goeddel ed., Academic Press 1991); Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes (A. Bothwell et al. eds., Bartlett PubL 1990); Gene Transfer and Expression (M. Kriegler, Stockton Press 1990); Recombinant DNA Methodology II (R. Wu et al. eds., Academic Press 1995); PCR: A Practical Approach (M. McPherson et al., IRL Press at Oxford University Press 1991); Oligonucleotide Synthesis (M. Gait ed., 1984); Cell Culture for Biochemists (R. Adams ed., Elsevier Science Publishers 1990); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. Miller & M. Calos eds., 1987); Mammalian Cell Biotschnology (M. Butler ed., 1991); Animal Cell Culture (J. Pollard et al. eds., Humana Press 1990); Culture of Animal Cells, 2nd Ed. (R. Freshney et al. eds., Alan R. Liss 1987); Flow Cytometry and Sorting (M. Melamed et al. eds., Wiley-Liss 1990); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Wirth M. and Hauser H. (1993); Immunochemistry in Practice, 3rd edition, A. Johnstone & R. Thorpe, Blackwell Science, Cambridge, MA, 1996; Techniques in 120 ΕΡ 1 572 744/ΡΤ

Immunocytochemistry, (G. Bullock & Ρ. Petrusz eds., Academic Press 1982,1983, 1985, 1989); Handbook of Experimental Immunology, (D. Weir & C. Blackwell, eds.); Current Protocols in Immunology (J. Coligan et al. eds. 1991); Immunoassay (E. P. Diamandis & T.K. Christopoulos, eds., Academic Press, Inc., 1996); Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principies and Practice (2d ed) Academic Press, New York; Ed Harlow and David Lane, Antibodies A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988; Antibody Engineering 2nd edition (C. Borrebaeck, ed., Oxford University Press, 1995); and the series Annual Review of Immunology; the series Advances in Immunology.

Lisboa, 2010-08-31

Claims

ΕΡ 1 572 744/ΡΤ 1/9 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo anti-CD20 humano ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, em que o anticorpo compreende a sequência de VH de SEQ ID NO:8 tal como mostrada na Figura 1B (2H7.vl6) e a sequência de VL de SEQ ID NO:2 tal como mostrada na Figura IA (2H7.vl6).
2. Anticorpo da reivindicação 1, em que a região VH é unida a uma região constante da cadeia de IgG humana.
3. Anticorpo da reivindicação 2, em que a IgG humana é IgGl ou IgG3.
4. Anticorpo da reivindicação 1, em que o anticorpo compreende a sequência de aminoácidos da cadeia leve e pesada de SEQ ID NO: 21 tal como mostrada na Figura 6 e 22 tal como mostrada na Figura 7, respectivamente.
5. Anticorpo da reivindicação 1, em que o anticorpo compreende a sequência de aminoácidos da cadeia leve e pesada de SEQ ID NO: 21 tal como mostrada na Figura 6 e 23 tal como mostrada na Figura 8, respectivamente.
6. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio da reivindicação 1 em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo é eficaz a eliminar células B de primata in vivo e as células B de primata são de ser humano e de Macaca fascicularis.
7. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio de qualquer uma das reivindicações anteriores conjugado com um agente citotóxico.
8. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio da reivindicação 7 em que o agente citotóxico é um isótopo radioactivo ou uma toxina.
9. Anticorpo anti-CD20 humano ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, cujo anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio é produzido através de um método de expressão de um ácido nucleico que codifica um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antigénio de acordo com qualquer uma das ΕΡ 1 572 744/ΡΤ 2/9 reivindicações 1-5 numa célula hospedeira e recuperação do anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio produzido a partir da cultura de células hospedeiras.
10. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio da reivindicação 9, em que a célula hospedeira é uma célula CHO.
11. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio da reivindicação 9 ou da reivindicação 10, em que o ácido nucleico codifica o anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos da cadeia leve e pesada de SEQ ID NO: 21 tal como mostrada na Figura 6 e 22 tal como mostrada na Figura 7, respectivamente.
12. Composição compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio de qualquer uma das reivindicações anteriores, e um transportador.
13. Composição da reivindicação 12 em que o anticorpo compreende a sequência de aminoácidos da cadeia leve e pesada de SEQ ID NO: 21 tal como mostrado na Figura 6 e 22 tal como mostrado na Figura 7, respectivamente, e o transportador é um transportador farmaceuticamente aceitável.
14. Artigo de fabrico compreendendo um recipiente e uma composição nele contida, em que a composição compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio de qualquer uma das reivindicações 1-11.
15. Artigo de fabrico da reivindicação 14, compreendendo ainda um folheto informativo indicando que a composição pode ser utilizada para tratar linfoma não-Hodgkin ou artrite reumatóide.
16. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, para utilização num método de indução de apoptose em células B in vivo, um método de tratamento de um cancro positivo para CD20 num paciente, ou um método de tratamento de uma doença auto-imune num paciente. ΕΡ 1 572 744/ΡΤ 3/9
17. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio para utilizar de acordo com a reivindicação 16 em gue o cancro positivo para CD20 é um linfoma ou uma leucemia de células B.
18. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio para utilizar de acordo com a reivindicação 17 em que o cancro positivo para CD20 é linfoma não-Hodgkin (LNH) ou doença de Hodgkin de predominância linfocitária (DHPL).
19. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio para utilizar de acordo com a reivindicação 16 em que o cancro é leucemia linfocitica crónica ou linfoma linfocitico pequeno.
20. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio para utilizar de acordo com uma das reivindicações 16 a 19, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio é para administração para tratar um cancro positivo para CD20 num paciente numa gama de dosagem de cerca de 275-375 mg/m2.
21. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio para utilizar de acordo com uma das reivindicações 16 a 19, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio é para administração para tratar um cancro positivo para CD20 num paciente numa gama de dosagem de cerca de 250 mg/m2 a cerca de 500 mg/m2.
22. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio para utilizar de acordo com uma das reivindicações 16 a 21 em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio é para administração ao paciente para tratar cancro positivo para CD20 com pelo menos um agente quimioterapêutico.
23. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio para utilizar de acordo com a reivindicação 22, em que o cancro é linfoma não-Hodgkin (LNH) e o agente quimioterapêutico é seleccionado de entre o grupo que consiste em doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, prednisolona e CHOP.
24. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio para utilizar de acordo com a reivindicação 20, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio é para administração para ΕΡ 1 572 744/ΡΤ 4/9 tratar cancro positivo para CD20 num paciente em pelo menos duas doses a 375 mg/m2 por dose.
25. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio para utilizar de acordo com a reivindicação 24, em que as duas doses são separadas por duas semanas.
26. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio para utilizar de acordo com a reivindicação 16, em que a doença auto-imune é seleccionada de entre o grupo que consiste em artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, lúpus eritematoso sistémico (LES), nefrite de lúpus, colite ulcerosa, doença de Wegener, doença inflamatória dos intestinos, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), púrpura trombocitopénica trombótica (PTT), trobocitopenia auto-imune, esclerose múltipla, psoríase, nefropatia de IgA, polineuropatias de IgM, miastenia grave, vasculite, vasculite ANCA, rejeição de transplante de órgãos sólidos, doença de enxerto versus hospedeiro, diabetes mellitus, síndroma de Reynaud, síndroma de Sjorgen e glomerulonefrite.
27. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio para utilizar de acordo com a reivindicação 26, em que a doença auto-imune é artrite reumatóide.
28. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio para utilizar de acordo com a reivindicação 27 em que o paciente sofre de artrite reumatóide moderada a grave e em quem falhou o tratamento com pelo menos um fármaco anti-reumático modificador da doença.
29. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio para utilizar de acordo com a reivindicação 27, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio é para administração ao paciente para tratar a doença auto-imune com um segundo agente terapêutico.
30. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio para utilizar de acordo com a reivindicação 29, em que o segundo agente terapêutico é um agente imunossupressor. ΕΡ 1 572 744/ΡΤ 5/9
31. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio para utilizar de acordo com a reivindicação 30, em que o agente imunossupressor é metotrexato.
32. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio para utilizar de acordo com a reivindicação 27, em que o anticorpo de ligação a CD20 ou fragmento de ligação ao antigénio compreendem a sequência de aminoácidos da cadeia leve e pesada de SEQ ID NO: 21 tal como mostrada na Figura 6 e 22 tal como mostrada na Figura 7, respectivamente, e em que o anticorpo é para administração para tratar uma doença auto-imune numa dosagem seleccionada de 2x50 mg, 2x200 mg e 2x500 mg.
33. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio para utilizar de acordo com a reivindicação 32, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio é para administração através de infusão intravenosa.
34. Anticorpo para utilizar de acordo com a reivindicação 32 em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio é para administração através de administração subcutânea.
35. Ácido nucleico isolado que codifica o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio de qualquer uma das reivindicações 1-5.
36. Vector de expressão que codifica o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio de qualquer uma das reivindicações 1-5.
37. Célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico da reivindicação 35.
38. Célula hospedeira da reivindicação 37 que produz um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigénio, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio se liga a CD20 humano.
39. Célula hospedeira da reivindicação 38 que é uma célula CHO. ΕΡ 1 572 744/ΡΤ 6/9
40. Método de produção de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigénio, em gue o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antigénio se liga a CD20 humano, compreendendo a cultura da célula hospedeira de acordo com a reivindicação 38 ou a reivindicação 39 e a recuperação do anticorpo a partir da cultura celular.
41. Formulação líquida compreendendo um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antigénio a 20 mg/ml, sulfato de histidina 10 mM a pH 5,8, 60 mg/ml de sacarose, e 0,2 mg/ml de polissorbato 20, em que o anticorpo tem a sequência de aminoácidos da cadeia leve e pesada de SEQ ID NO: 21 tal como mostrado na Figura 6 e 22 tal como mostrado na Figura 7, respectivamente.
42. Anticorpo para utilizar de acordo com a reivindicação 26, em que o anticorpo de ligação a CD20 compreende a sequência de aminoácidos da cadeia leve e pesada de SEQ ID NO: 21 tal como mostrada na Figura 6 e 22 tal como mostrada na Figura 7, respectivamente.
43. Anticorpo para utilizar de acordo com a reivindicação 42, em que a doença auto-imune é lúpus eritematoso sistémico (LES) ou nefrite de lúpus. de acordo com a auto-imune é colite
44. Anticorpo para utilizar reivindicação 42, em que a doença ulcerosa. acordo com a é vasculite ANCA.
45. Anticorpo para utilizar de reivindicação 42, em que a doença auto-imune
46. Anticorpo para utilizar de acordo com a reivindicação 42, em que a doença auto-imune é rejeição de transplante de órgãos sólidos ou doença de enxerto versus hospedeiro.
47. Anticorpo para utilizar de acordo com a reivindicação 42, em que o anticorpo é para administração através de infusão intravenosa. ΕΡ 1 572 7 4 4/PT 7/9
48. Anticorpo para utilizar de acordo com a reivindicação 42 em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio é para administração através de administração subcutânea.
49. Utilização do anticorpo de ligação a CD20 ou fragmento de qualquer uma das reivindicações 1 a 11 no fabrico de um medicamento para tratamento de um cancro positivo para CD20 num paciente.
50. Utilização de acordo com a reivindicação 49 em que o cancro positivo para CD20 é um linfoma ou uma leucemia de células B.
51. Utilização de acordo com a reivindicação 49 em que o cancro positivo para CD20 é linfoma não-Hodgkin (LNH) ou doença de Hodgkin de predominância linfocitária (DHPL).
52. Utilização de acordo com a reivindicação 50 em que o cancro é leucemia linfocitica crónica ou linfoma linfocítico pequeno.
53. Utilização de acordo com a reivindicação 49, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio é para administração para tratar um cancro positivo para CD20 num paciente numa gama de dosagem de cerca de 275-375 mg/m2.
54. Utilização de acordo com a reivindicação 49, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio é para administração para tratar um cancro positivo para CD20 num paciente numa gama de dosagem de cerca de 250 mg/m2 a cerca de 500 mg/m2.
55. Utilização de acordo com a reivindicação 53, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio é para administração para tratar cancro positivo para CD20 num paciente em pelo menos duas doses a 375 mg/m2 por dose.
56. Utilização de acordo com a reivindicação 55, em que as duas doses são separadas por duas semanas. ΕΡ 1 572 744/PT 8/9
57. Utilização de acordo com a reivindicação 49 em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio é para administração ao paciente para tratar cancro positivo para CD20 com pelo menos um agente quimioterapêutico.
58. Utilização de acordo com a reivindicação 57, em que o cancro é linfoma não-Hodgkin (LNH) e o agente quimioterapêutico é seleccionado de entre o grupo que consiste em doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, prednisolona, e CHOP.
59. Utilização do anticorpo de ligação a CD20 ou fragmento de ligação ao antigénio de qualquer uma das reivindicações 1 a 11 no fabrico de um medicamento para tratamento de uma doença auto-imune num paciente.
60. Utilização de acordo com a reivindicação 59, em que a doença auto-imune é seleccionada de entre o grupo que consiste em artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, lúpus eritematoso sistémico (LES), nefrite de lúpus, colite ulcerosa, doença de Wegener, doença inflamatória dos intestinos, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), púrpura trombocitopénica trombótica (PTT), trobocitopenia auto-imune, esclerose múltipla, psoríase, nefropatia de IgA, polineuropatias de IgM, miastenia grave, vasculite, vasculite ANCA, rejeição de transplante de órgãos sólidos, doença de enxerto versus hospedeiro, diabetes mellitus, síndroma de Reynaud, síndroma de Sjorgen e glomerulonefrite.
61. Utilização de acordo com a reivindicação 60, em que a doença auto-imune é artrite reumatóide.
62. Utilização de acordo com a reivindicação 61 em que o paciente sofre de artrite reumatóide moderada a grave e falhou o tratamento com pelo menos um fármaco anti-reumático modificador da doença.
63. Utilização de acordo com a reivindicação 61, em que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antigénio é para administração ao paciente para tratar a doença auto-imune com um segundo agente terapêutico. ΕΡ 1 572 744/ΡΤ 9/9
64. Utilização de acordo com a reivindicação 63, em que o segundo agente terapêutico é um agente imunossupressor.
65. Utilização de acordo com a reivindicação 64, em que o agente imunossupressor é metotrexato.
66. Utilização de acordo com a reivindicação 61, em que o anticorpo de ligação a CD20 ou fragmento de ligação ao antigénio compreende a sequência de aminoácidos da cadeia leve e pesada de SEQ ID NO: 21 tal como mostrada na Figura 6 e 22 tal como mostrada na Figura 7, respectivamente, e em que o anticorpo é para administração para tratar uma doença auto-imune a uma dosagem seleccionada de 2x50 mg, 2x200 mg e 2x500 mg.
67. Utilização de acordo com a reivindicação 66, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio é para administração através de infusão intravenosa.
68. Utilização de acordo com a reivindicação 66 em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio é para administração através de injecção subcutânea. Lisboa, 2010-08-31