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JP2004500095A - 細胞の同時の刺激および濃縮 - Google Patents

細胞の同時の刺激および濃縮 Download PDF

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JP2004500095A
JP2004500095A JP2001562670A JP2001562670A JP2004500095A JP 2004500095 A JP2004500095 A JP 2004500095A JP 2001562670 A JP2001562670 A JP 2001562670A JP 2001562670 A JP2001562670 A JP 2001562670A JP 2004500095 A JP2004500095 A JP 2004500095A
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Japan
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cells
cell
antibody
population
ligand
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Application number
JP2001562670A
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ベレンソン，　ロン
ロウ，　チェ
ボニーハディ，　マーク
サウンド，　ナリンダー
クレイグ，　スチュワート
カラマス，　デイル
ハードウィック，　アラン
マックミレン，　デイビッド
Original Assignee
エクサイト　セラピーズ，　インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

本発明は、細胞を刺激する方法に関し、詳細には、このような細胞の刺激および／または増殖を最大化する細胞を濃縮し、そして刺激する新規の方法に関する。細胞は、増強された増殖、細胞シグナル伝達、および／または細胞表面部分の凝集を生じる表面を用いて刺激され、濃縮される。同時の濃縮および細胞表面部分の連結によってＴ細胞のような細胞集団を刺激する方法は、細胞集団を表面に接触させることによって、そして細胞の濃縮および細胞表面部分の連結を優勢に駆動する力を適用して、細胞刺激、細胞表面部分の凝集、および／またはレセプターシグナル伝達の増強を誘導することによって提供される。表現型的に変更された細胞を生成するための方法を提供する。これらのプロセスによって生成される細胞の組成物が、提供される。

Description

【０００１】
（技術分野）
本発明は、一般的には細胞を刺激するための方法、より詳細にはこのような細胞の刺激を最大化するよう細胞を濃縮および刺激する方法に関する。本発明はまた、特異的な表現型の特性を有する刺激されたＴ細胞を含む、細胞の組成物に関する。
【０００２】
（発明の背景）
多くの細胞は、細胞表層膜に見出される脂質のいかだに組込まれたレセプターを介して活性化または調節される。例えば、Ｋ．Ｓｉｍｏｎｓ　ａｎｄ　Ｄ．Ｔｏｏｍｒｅ，Ｎａｔｕｒｅ　Ｒｅｖ．１：３１，２０００を参照のこと。脂質のいかだは、リガンドの結合により活性化される個々のレセプターのための濃縮プラットホーム（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｎｇ　ｐｌａｔｆｏｒｍ）を形成する。脂質のいかだは、アレルギー性免疫応答時の免疫グロブリンＥのシグナリング、神経系の発達および維持に重要なグリア細胞由来の神経栄養因子のシグナリング、多くのシグナル伝達プロセスの中心であるＲａｓシグナリング、およびＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）のシグナリングを含む、細胞のシグナリングプロセスに関与される。
【０００３】
Ｔ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）は、ＣＤ３複合体と会合し、そして抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびクラスＩＩタンパク質により提示されるペプチドに結合する、多サブユニット免疫認識レセプターである。ＡＰＣ上の抗原ペプチドへのＴＣＲの結合は、Ｔ細胞活性化の中心的な現象であり、Ｔ細胞とＡＰＣとの接触点で免疫学的な接合（ｓｙｎａｐｓｅ）を生じる。さらにデータは、脂質のいかだのクラスター化が、この免疫学的な接合の形成に必須であることを示唆する。Ｋｒａｗｃｚｙｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　１３（４）：４６３−７３，２０００。
【０００４】
Ｔ細胞の活性化を維持するために、代表的にＴリンパ球は、第２の同時刺激シグナルを必要とする。代表的に同時刺激は、Ｔヘルパー細胞がクローンの増殖を誘導する十分なサイトカインレベルを産生するために必要である。Ｂｒｅｔｓｃｈｅｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ　１３：７４，１９９２；Ｊｕｎｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ　１５：３２１，１９９４。主要な同時刺激シグナルは、活性化された抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＢ７ファミリーリガンドのメンバー（ＣＤ８０（Ｂ７．１）またはＣＤ８６（Ｂ７．２））が、Ｔ細胞上のＣＤ２８に結合する場合に生じる。
【０００５】
Ｔ細胞の特定のサブセットの増殖を刺激する方法は、免疫療法において有用な種々のＴ細胞組成物を生じる可能性を有する。成功した免疫療法は、効果的な刺激によるＴ細胞の反応性および量の増大により補助され得る。
【０００６】
ヒトＴ細胞を増殖するために利用可能な種々の技術は、アクセサリー細胞および／または外因性の増殖因子（例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２））の使用に主に依存する。ＩＬ−２は、抗ＣＤ３抗体と共に使用されて、Ｔ細胞増殖を刺激し、Ｔ細胞のＣＤ８＋亜集団を優勢に増殖させる。両方のＡＰＣシグナルは、最適なＴ細胞の活性化、増殖、および再注入の際のＴ細胞の長期の生存のために必要であると考えられる。ＡＰＣは比較的単命なので、アクセサリー細胞としてのＭＨＣ適合性ＡＰＣに対する要求は、長期の培養系に重要な問題を示す。従って、長期の培養系において、ＡＰＣは、耐えず供給源から獲得され、補充されなければならない。アクセサリー細胞の継続的な供給の必要性は、アクセサリー細胞が影響される免疫不全の処置にとって問題となる。さらに、ウイルス感染の処置の際、アクセサリー細胞がウイルスを保有する場合、この細胞は、長期の培養中に全体的なＴ細胞集団に混入し得る。
【０００７】
外因性の増殖因子またはアクセサリー細胞の非存在下で、同時刺激シグナルは、例えば、固体相表面（例えば、ビーズ）に取り付けられたＣＤ３リガンドおよびＣＤ２８リガンドに細胞を曝すことによりＴ細胞集団に送達され得る（Ｃ．Ｊｕｎｅ，ｅｔ　ａｌ．（米国特許第５，８５８，３５８号）；Ｃ．Ｊｕｎｅ　ｅｔ　ａｌ．ＷＯ９９／９５３８２３を参照のこと）。これらの方法は、治療的に有用なＴ細胞集団を達成し得るが、Ｔ細胞調製の増加した粗暴さおよび容易さは、理想よりも低いままである。
【０００８】
さらに、当該分野で現在利用可能な方法は、Ｔ細胞の短期の増殖またはより粗暴なＴ細胞集団の獲得およびそれらの有益な結果ならびに／もしくは特定のＴ細胞亜集団／表現型の増殖に焦点を合わされていない。さらに、増殖されたＴ細胞の適用性は、いくつかの疾患状態のみに限定される。インビボでの最大の有効性にとって、理論的に、エキソビボまたはインビボで生成された、活性化されたＴ細胞集団は、癌、感染疾患、または他の疾患状態に対する免疫応答と最大限に組合わせ得る状態にあるべきである。本発明は、他の増殖方法よりも健常的で天然であると思われる表面レセプターおよびサイトカイン産生特性を有する、増加した数の、より高度に活性化され、より純粋なＴ細胞を生成する方法を提供する。
【０００９】
さらに、本発明は、Ｔ細胞集団および同一物を産生するため、および他の関連する利点を提供するためのパラメータを含む、任意の標的細胞の表現型が変更された細胞集団の組成物を提供する。
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、一般的には細胞を刺激するための方法を提供し、より詳細にはこのような細胞の刺激を最大化するよう細胞を濃縮および刺激する新規の方法に関する。１つの局面において、本発明は、同時のＴ細胞濃縮および細胞表面部分の連結により、Ｔ細胞の集団を刺激するための方法を提供する。この方法は、細胞集団を提供する工程を包含し、ここで、少なくともその一部がＴ細胞を含み、細胞の集団と表面を接触させ、ここで、この表面が、少なくともＴ細胞の表面部分の一部と連結される１つ以上の因子に取付けられており、そして少なくとも一部のＴ細胞またはその亜集団のその部分を刺激し、そして優勢にＴ細胞の濃縮およびＴ細胞表面部分の連結を駆動する力を適用し、それによってＴ細胞の刺激を誘導する。
【００１１】
本発明の１つの実施形態において、この表面は、Ｔ細胞の第１の細胞表面部分に連結する第１の因子に取り付けられており；そして同一およ第２の表面は、上記Ｔ細胞の第２の部分に連結する第２の因子に取り付けられており、ここで、第１および第２の因子による上記連結は、上記Ｔ細胞の増殖を誘導する。関連する実施形態において、この表面は、生物適合性、天然または合成であり得、ポリマーを含み、コラーゲン、精製されたタンパク質、精製されたペプチド、多糖類、グリコサミノグリカン、または細胞外マトリクス組成物を含む。特定の実施形態において、この多糖類は、キトサン、アルギネート、デキストラン、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）、およびセルロースから選択され、そしてこのポリマーは、ポリスチレン、ポリエステル、ポリエーテル、ポリ無水物、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ）、ポリビニルアセテート、ブロックコポリマー、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、またはポリウレタンから選択される。さらに他の実施形態において、このポリマーは、乳酸またはコポリマーを含み得る。なおさらに他の実施形態において、このポリマーはコポリマーであり得る。このようなコポリマーは、種々の公知のコポリマーであり得、そして乳酸および／またはグリコール酸（ＰＬＧＡ）を含み得る。
【００１２】
生物適合性の表面に関して、このような表面は、生物分解性または非生物分解性であり得る。関連の実施形態において、限定されないが、非生物分解性の表面は、ポリ（ジメチジルオキサン）および／またはポリ（エチレン−ビニルアセテート）を含み得る。さらに生物適合性の表面は、限定されないが、コラーゲン、金属、ヒドロキシアパタイト、ガラス、アルミネート、バイオセラミック物質、ヒアルロン酸ポリマー、アルギネート、アクリルエステルポリマー、乳酸ポリマー、グリコール酸ポリマー、乳酸／グリコール酸ポリマー、精製されたタンパク質、精製されたペプチド、および／または細胞外マトリクス組成物を含み得る。
【００１３】
なおさらにさらなる実施形態において、この生物適合性表面は、移殖可能なデバイスと連結される。この移殖可能なデバイスは、用いられることが所望されるいずれかであり得、そしてステント、カテーテル、繊維、中空繊維、パッチ、または縫合糸を含み得る。関連する実施形態において、この表面は、ガラス、シリカ、ケイ素、コラーゲン、ヒドロキシアパタイト、ヒドロゲル、ＰＴＦＥ、ポリプロピレン、ポリスチレン、ナイロン、またはポリアクリルアミドであり得る。なおさらなる実施形態において、この表面は、脂質、メッキ、バッグ、ロッド、ペレット、繊維またはメッシュを含む。他の実施形態において、この表面が、粒子であり、そしてさらにこの粒子がビーズ、微粒子、ナノ粒子、またはコロイド粒子を含む。粒子およびビーズの大きさはまた選択され得、そしてこのビーズが直径約５ナノメートルから約５００ミクロンである、種々の大きさを有し得る。
【００１４】
他の実施形態において、この方法で使用される因子は、タンパク質リガンド、天然リガンド、または合成リガンドから独立して選択され得る。さらに、この因子としてはまた、抗体、抗体フラグメント、ペプチド、ポリペプチド、糖ペプチド、可溶性レセプター、ステロイド、ホルモン、分裂促進因子、抗原、スーパー抗原、増殖因子、サイトカイン、レクチン、ウイルスタンパク質、接着分子、またはケモカインを含む。特定の実施形態において、少なくとも１つの因子が、抗体または抗体フラグメントである。これに対して、なお他の実施形態において、第１の因子は、抗体およびそのフラグメントであり、そして、第２の因子は、抗体またはそのフラグメントである。第１の因子および第２の因子は、同じまたは異なる抗体のいずれかであり得ることがもちろん理解される。
【００１５】
選択された実施形態において、第１の因子は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２抗体、または抗ＣＤ３抗体もしくは抗ＣＤ２抗体の抗体フラグメントである。さらに選択された実施形態は、第２の因子が、抗ＣＤ２８抗体またはその抗体フラグメントである実施形態を含む。さらなる実施形態は、第２の因子が、ＣＤ２８（例えば、Ｂ７−１またはＢ７−２のような）についての天然リガンドを含む実施形態を含む。さらに、他の刺激性因子が使用され得る。
【００１６】
特定の実施形態において、細胞を駆動するために使用される力は、類似して機能する種々の力を含み得、そして、重力、水力、膜貫通圧力によって生成されるろ過力、遠心力、または磁力より大きい力を含み得る。磁力が使用される場合、いくつかの実施形態は、磁石の表面において、約２００ガウスから約１２，０００の間で変化する磁場強度を有する磁石によって生成される磁力を利用する。
【００１７】
別の実施形態は、その表面が、常磁性粒子の表面である表面を含む。これに対して、常磁性粒子の表面を含む表面を利用する実施形態において、表面への因子の接着は、共有結合性、非共有結合性、静電気的、分子間接着、または疎水性結合であり得る。
【００１８】
さらになお別の実施形態は、リガンドであるＴ細胞は、結合されていないＴ細胞から分離された。これに対して、他の実施形態において、Ｔ細胞は、免疫応答障害を改善する。
【００１９】
上記の実施形態と組み合わせられ得る他の局面は、例えば、同時の細胞表面部分の結合およびＴ細胞凝集によって、Ｔ細胞を刺激するための方法を含み、この方法は、以下の工程を包含する：Ｔ細胞を含む細胞集団を提供する工程、この細胞集団を表面と接触させる工程であって、この表面が、そこへ細胞表面部分について特異的な１つ以上のリガンドを接着する工程、Ｔ細胞および表面の濃縮を駆動する力を適用する工程、ならびに所望の刺激を達成するために十分な期間、この細胞をインキュベートする工程。関連した実施形態において、所望の刺激を達成するために十分な時間は、１分から１０日まで、そしてその間の全ての整数値で変化し得る。特定の実施形態において、この時間範囲は、約１日から約８日まで変化し得るが、なお他の実施形態において、時間範囲は、約３日から５日まで、または約１日から５日までであり得る。関連した実施形態において、インキュベーション温度は、約２から３８℃まで変化し得る。
【００２０】
全ての記載された方法を用いて使用され得るさらなる実施形態は、表面が、ガラス、シリカ、シリコン、コラーゲン、ヒドロキシアパタイト、ヒドロゲル、ＰＴＦＥ、ポリプロピレン、ポリスチレン、ナイロン、デキストラン、またはポリアクリルアミド、またはこれらの任意の混合物から選択される場合を含む。さらに、実施形態は、上記に示される任意の工程を用いる前または同時に、非濃縮細胞から表面を有するＴ細胞濃縮物を分離する工程を包含する。
【００２１】
他の局面において、インビボでＴ細胞活性化を誘導する方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：動物に常磁性粒子を提供する工程であって、この粒子が、そこへＴ細胞活性化を誘導するＴ細胞表面部分に特異的なリガンドを接着する工程；動物の別々の領域に磁場を適用する工程；ならびにそれにより、この別々の領域でこの粒子に結合されたＴ細胞の局在化および活性化を誘導する工程。
【００２２】
同時の標的細胞濃縮および標的細胞部分の連結によって、標的細胞の集団を刺激するための方法を含む、さらなる局面が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：細胞の集団を提供する工程であって、その少なくとも一部が標的細胞を含む工程、この細胞の集団を表面と接触させる工程であって、この表面が、そこへこの標的細胞少なくとも一部の細胞表面部分を連結し、そして標的細胞の少なくともこの一部を刺激する１つ以上の因子を接着させる工程、標的細胞の濃縮および標的細胞の表面部分の連結を主に駆動する力を適用し、それにより標的細胞の刺激を誘導する工程。
【００２３】
特定の実施形態において、本明細書中に記載される方法は、そこへ標的細胞の第１の細胞表面部分と結合する第１の因子が接着された表面を利用する；そして、同じまたは第２の表面が、この標的細胞の第２の部分と結合する第２の因子に結合され、ここで、第１の因子および第２の因子によるこの結合が、この標的細胞においてシグナル伝達を誘導する。
【００２４】
以前に述べられたように、表面は、コラーゲン、精製タンパク質、精製ペプチド、多糖類、グリコサミノグリカン、および／または細胞外マトリクス組成物を含む、種々の成分を含む。特定の実施形態において利用されるいくつかの多糖類としては、キトサン、アルギナート、デキストラン、ヒアルロン酸、および／またはセルロースが挙げられ得る。さらに、上記および全ての方法に適用可能であるポリマーは、ポリエステル、ポリエーテル、ポリ無水物、ポリアルキルシアノアシレート、ポリアクリルアミド、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリビニルアセテート、ブロックコポリマー、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、および／またはポリウレタンならびにそれらの混合物から選択され得る。
【００２５】
他の局面において、細胞表面部分の結合および標的細胞の濃縮によって、標的細胞を刺激するための方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：標的細胞を含む細胞集団を提供する工程、この細胞集団を表面と接触させる工程であって、この表面が、そこへ細胞表面部分についての１つ以上のリガンドを接着する工程、標的細胞の濃縮およびこの表面のこの細胞の濃縮を駆動する力を適用する工程、ならびに所望の刺激を達成するのに十分な期間、この細胞をインキュベートする工程。
【００２６】
関連した実施形態において、標的細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、または幹細胞であり得る。
【００２７】
他の局面は、インビボで標的細胞刺激を誘導する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：常磁性粒子を動物に提供する工程であって、この粒子が、そこへ標的細胞刺激を誘導する標的細胞表面部分について特異的なリガンドを接着する工程；動物の別々の領域に磁場を適用する工程；ならびにそれにより、この別々の領域でこの粒子に結合された標的細胞の局在化および刺激を誘導する工程。
【００２８】
レセプター保有細胞におけるレセプター分極を誘導する方法を含む、なお他の局面が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：細胞集団を提供する工程、この細胞集団を固体表面と接触させる工程であって、この固体表面が、そこへこの細胞集団の少なくとも一部に存在する細胞表面レセプターに特異的な１つ以上のリガンドを接着する工程、ならびに細胞濃縮および細胞表面レセプター結合を駆動する力を適用する工程。
【００２９】
他の局面は、細胞表面分子の凝集を誘導するための方法を含み、この工程は、以下の工程を包含する：標的細胞表面分子を有する細胞の集団を提供する工程、この細胞の集団と固体表面を接触させる工程であって、この固体表面が、そこへ少なくとも１つの標的細胞表面分子についてのリガンドを接着する工程、ならびに標的化された細胞表面分子の凝集を駆動する力を適用する工程。
【００３０】
特定の実施形態において、細胞集団は、リンパ球を含む。
【００３１】
なお他の特定の実施形態において、レセプターまたは細胞表面部分の結合は、細胞性事象のダウンレギュレーションまたは抑制を導く。関連した実施形態は、レセプター結合が、細胞性事象のアップレギュレーションまたは活性化を導く実施形態を含み、これは、例えば、レセプター媒介性シグナル伝達を含み得る。
【００３２】
本発明の別の実施形態は、細胞表面部分の濃縮または配向を駆動する力の使用を想定する。
【００３３】
本発明のなおさらなる実施形態は、テイラード標的細胞集団および／またはＴ細胞組成物を含む組成物を表現型的に提供する。さらに、細胞表面部分と結合することによって、このような細胞を活性化するための方法が提供される。Ｔ細胞集団が増殖するのを誘導するための方法がさらに提供され、この方法は、約２時間と約９日の間の期間、Ｔ細胞を固体表面と接触させる工程であって、固体表面が、その上に第１の因子および第２の因子を固定化し、第１の因子が、活性化シグナルを提供し、そして第２の因子がこのＴ細胞に同時刺激性シグナルを提供する工程を包含する。
【００３４】
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照する際に明らかとなる。
【００３５】
（発明の詳細な説明）
本発明を述べる前に、本明細書中以下で使用される特定の用語の定義を示すことは、本発明の理解の一助となり得る。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、用語「生物適合性」は生存細胞に対して主に無毒である特性を言う。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「刺激」は、細胞表面部分の連結によって誘導される一次応答を言う。例えば、レセプターの状況において、このような刺激は、レセプターの連結および引続くシグナル伝達事象を伴う。Ｔ細胞の刺激に関して、このような刺激は、Ｔ細胞表面部分の連結を言い、このことは１つの実施形態において次のシグナル伝達事象（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合）を誘導する。さらに、刺激事象は細胞を活性化し得、そして分子の発現もしくは分泌をアップレギュレーションまたはダウンレギュレーション（例えば、ＴＧＦ−βのダウンレギュレーション）し得る。従って、細胞表面部分の連結は、直接的なシグナル伝達事象がない場合においてさえも、細胞骨格構造または細胞表面部分の付着（そのそれぞれは、引続く細胞応答を増強、改変、または変化するために役立ち得る）の再構築を生じ得る。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、用語「活性化」は、顕著な形態学的変化を誘導するために十分な細胞表面部分の連結に続く細胞の状態を言う。Ｔ細胞表面の状況において、このような活性化は細胞増殖を誘導するために十分に刺激されたＴ細胞の状態を言う。Ｔ細胞の活性化はまた、サイトカイン産生および調節性または細胞溶解性エフェクター機能の実施を誘導し得る。他の細胞の状況において、この用語は、特定の物理的−化学的プロセスのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかを推論する。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、用語「力」は刺激されるべき細胞に適用される人工的な力または外部の力を言い、これは細胞濃縮および細胞表面部分に結合する因子を有する細胞の濃縮を誘導する。例えば、用語「力」として、細胞濃縮および／または細胞表面部分の連結を誘導する重力よりも大きな任意の力（すなわち、重力に加えて、および重力の力のみではない）が挙げられる。このような力として、濾過のような細胞内外圧、水力、電気的力、音の力、遠心力、または磁力が挙げられる。理想的には、使用される力は、細胞表面部分に連結する因子での目的の標的細胞の濃縮を誘導する。種々の状況において、この力はパルスされ得る（すなわち、適用、再適用（例えば、磁力を消し、そして磁力をかけ得、それを常磁性粒子と組合せて細胞集団をパルスする）。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、用語「同時に」は、細胞表面部分に付着される因子を結合する細胞表面部分を有する表面で細胞を固有に濃縮するという事実が、お互いにおよび細胞表面（従って、リガンド）に濃縮を生じることを言う。しかし、用語「同時に」の使用は、濃縮および濃縮表面で同時に生じるさらなるリガンドの結合のように、細胞表面に付着される因子を結合する細胞表面部分を有する表面と標的細胞の前もっての結合を防止しない。例えば、Ｔ細胞活性化の状況において、Ｔ細胞は、細胞表面に付着される抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を有する常磁性ビーズのような表面に曝露され得、そして磁性領域によって同時に濃縮される。従って、この状況において、細胞およびビーズが前もっての接触および連結を有するにも関わらず、細胞濃縮の間にさらなる連結が生じる。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、用語「標的細胞」は、細胞表面部分の連結によって刺激されることを意図される任意の細胞を言う。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、「抗体」として以下が挙げられる：ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方；霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）（例えば、ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ））；マウス；マウス−ヒト；マウス−霊長類；およびキメラ；ならびにインタクトな分子、それらのフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ）’２フラグメント）、もしくはインタクトな分子および／またはフラグメントのマルチマーまたは凝集物であり得；そして天然に存在し得るか、または例えば、免疫化、合成または遺伝的操作によって生成され得；本明細書中で使用される場合、「抗体フラグメント」は、抗体に由来するか、または抗体に関連するフラグメントを言い、これらは抗原に結合し、そしていくつかの実施形態において、クリアランスおよび取り込みを容易にする構造的な特徴を示すために誘導化され得る（例えば、ガラクトース残基の組込みによって）。これは、例えば、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）’２、ｓｃＦｖ、軽鎖可変領域（ＶＬ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、およびこれらの組合せを含む。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、用語「タンパク質」として、タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドが挙げられ；インタクトな分子、それらのフラグメント、もしくはインタクトな分子および／またはフラグメントのマルチマーあるいは凝集物であり得；そして天然に存在し得るか、もしくは例えば、合成（化学的および／または酵素的を含む）または遺伝的操作によって産生され得る。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、用語「因子」、「リガンド」、または「細胞表面部分に結合する因子」は、規定された細胞集団に結合する分子を言う。この因子は、レセプター、抗原性決定基、または標的細胞集団上に存在する他の結合部位のような任意の細胞部分に結合し得る。この因子は、タンパク質、ペプチド、抗体およびそれら抗体のフラグメント、融合タンパク質、合成分子、有機分子（例えば、低分子）などであり得る。本明細書中およびＴ細胞刺激の状況において、抗体は、このような因子のプロトタイプの例として使用される。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、用語「細胞表面部分に結合する因子」および「細胞表面部分」は、リガンド／抗リガンド対の状況において使用される。従って、これらの分子は、一般的に相対的に高い親和性の特異的結合を示す相補性分子／抗相補性分子セットとして考えられるべきである。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、「同時刺激性シグナル」は、一次シグナルとの組合せ（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３の連結）のシグナルを言い、Ｔ細胞増殖を引き起こす。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、「リガンド／抗リガンド対」は、一般的に相対的に高い親和性の特異的結合を示す相補性分子／抗相補性分子のセットを言う。例示的に、リガンド／抗リガンド対、酵素／インヒビター、ハプテン／抗体、レクチン／炭水化物、リガンド／レセプター、およびビオチン／アビジンまたはストレプトアビジン。本発明の状況において、特定のレセプターおよび他の細胞表面部分は、抗リガンドであるが、細胞表面と反応性の因子（例えば、抗体および抗体フラグメント）は、リガンドと考えられる。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、「分離」は、１つの成分を別の成分から（例えば、濾過または磁性誘引によって）実質的に精製する任意の手段を含む。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、「静止状態の」は、細胞が活動的に増殖していない細胞状態を言う。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、「表面」は、細胞表面に付着される因子を有し得る任意の表面を言い、限定ではないが、金属、ガラス、プラスチック、コポリマー、コロイド、脂質、細胞表面などが挙げられる。基本的に任意の表面は、差異病表面に結合されるか、または付着される因子を残し得る。
【００５１】
本発明の１つの局面は、細胞の濃縮を誘導する力と細胞表面部分の連結との組合せが、これらの細胞の刺激の顕著な増大を生じるという驚くべき発見に関する。本明細書中に示されるプロトタイプの例では、Ｔ細胞が用いられる。しかし、当業者は、本発明が、細胞表面部分の連結または凝集が所望されるか、またはこのような結合が引き続いての細胞シグナル伝達事象を引き起こす任意の細胞型（例えば、レセプター）に対する広範な適用性を有することを容易に推論する。理論に捕らわれることなく、本発明は、脂質ラフティング（ｒａｆｔｉｎｇ）および／またはレセプター分極化を伴う現象の利点を得ることにより、機能し得る。これらの現象は、細胞表面部分を含む脂質ラフト（ｒａｆｔ）の凝集によるシグナル伝達の開始／増大か、あるいは細胞の１つまたは数個所の領域でのレセプターの局在化（すなわち、分極化）に起因する増大したシグナル伝達のいずれかを示唆することで類似している。従って、このような細胞表面部分の連結は、Ｔ細胞における強い細胞活性化および増殖を予想外に引き起こすのみならず、多くの細胞型のシグナル伝達事象を拡大するために適用され得る。従って、本発明は、身体内の特定の位置におけるシグナル伝達事象を誘導するために、移植可能なデバイスと組合せて用いられ得、患者への引き続いての注入のために細胞をエキソビボで刺激するために用いられ得、そしてシグナル伝達のシグナルを増幅することにより細胞内のシグナル伝達事象の研究を実質的に向上させるために用いられ得、それにより、このような伝達事象に影響を与える薬物（例えば、精神分裂病、睡眠、および他の神経学的兆候に関するＧ共役型タンパク質レセプター；アレルギー応答に関する肥満細胞および好塩基球上のＦｃフラグメントレセプター）をスクリーニングする際に補助をする。従って、Ｔ細胞に関して、本発明は、以下の種々の予想外の利点を提供する：初めに、本発明は、「非コーティング」粒子を用いる別個の単球除去工程の必要性を排除し、より少ない細胞移入およびより少ない試薬、活性化工程の間のＴ細胞活性化の増加したレベル、細胞のプロセシングに関る時間および労力の減少を必要とすることにより、Ｔ細胞の増殖を単純化し、製造の費用を削減し、そして患者の処置および注入を計画する際の自由度を増す。
【００５２】
本発明のさらなる局面では、第１および第２以上の表面は、表面に結合したリガンド／因子を伴ってか、または伴わずに利用される。この実施形態では、種々の表面は、標的細胞の細胞表面部分を結合するために、表面に付着させた、同じまたは異なる因子を有し得る。例えば、常磁性ビーズは、これらに付着され得、標的細胞上のレセプターに対する抗体およびこのようなビーズは、標的細胞を含む細胞の集団と共に混合され得る。さらに、細胞集団は、表面に付着した薬剤を結合する同じまたは異なる細胞部分を有する第２以上のビーズと混合され得る。力が濃縮を誘導した際に、ビーズおよび細胞は、類似した容量で合わせられ、シグナル伝達が増幅される。別の例では、糖質または表面に付着した他の非レセプター細胞表面部分を有する常磁性ビーズは、標的細胞を含む細胞の集団と混合される。次いで、磁場を用いて、細胞に付着したビーズを、別の表面に付着したレセプター連結因子を有する別の表面へと引き付ける。従って、シグナル伝達を誘導する因子は、第２の表面上にある。なおさらなる別の例では、標的細胞の細胞表面部分を結合する薬剤は、メッシュまたはフィルター（これらは、それ自体がこれらに結合したリガンドを有し得る）に保持されるために十分に大きい粒子に付着され得る。
【００５３】
上記のように、本発明は、細胞集団中の細胞の表面上の部分を、同時に濃縮および連結することにより、細胞集団を刺激するための方法を提供する。細胞集団を、細胞表面部分に結合するある因子（例えば、リガンド）と接触させることにより、細胞集団を刺激し得る。このリガンドは、溶液であってもよいが、また表面に付着させてもよい。レセプターのような細胞表面部分の連結は、一般に、特定のシグナル伝達経路を誘導し得る。最近の研究は、生じるシグナル伝達について、必要なレセプターを含む脂質ラフトの臨海濃縮物が凝集するはずであることを示唆する。例として、ラフトの凝集は、特定の細胞表面部分に対するリガンドを常磁性粒子へと付着させ、リガンド保有粒子を細胞に曝露させ、そして直後かまたは同時に力（例えば、連結した部分（例えば、レセプター）を分極化し、そして小さな容積に細胞を濃縮することを補助するための磁場）を加えることにより、インビボまたはインビトロで促進され得る。磁力の適用は、細胞を濃縮し、そして細胞表面部分を連結する、表面に付着した因子を有する表面を有する細胞を濃縮し、それにより細胞のリガンドとのより強い接触をもたらし、加速した活性化およびより強力な活性化を生じる。本発明の多くの適用が可能である（例えば、細胞が、少ない数のレセプターおよび／または機能不全のレセプターを有する場合、この方法は、脂質ラフトにおけるこのようなレセプターを十分に濃縮して、このような欠陥を克服し得、そして適切なシグナル伝達活性を可能にする）。このような細胞表面レパートリーの収集物の１つの例は、白血病の特定の型を有する患者にあり、ここで、因子（例えば、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体）を用いる細胞表面刺激の前では、いくつかの正常な細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体）は、通常低い。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体のような因子を用いるこれらの細胞表面の刺激により、これらの細胞の細胞表面マーカーは、正常に見えるレベルに戻り、そして患者に戻される場合、癌治療のためのより強い産物を提供し得る。本発明のさらに他の適用では、細胞は、有効に濃縮および活性化（レセプター分極化を誘導することを含む）され得、それにより、レセプターシグナル伝達事象を最大にする。このような適用は、広範な有用性（レセプターで、または活性化を誘導する（例えば、Ｆａｓまたは腫瘍細胞における分子のようなものを連結することによりアポトーシスを誘導する）ために細胞の表面上の細胞ラフトを収集することによる、指向されるスクリーニングアッセイにおける用途を含む）を有する。
【００５４】
このようなスクリーニングアッセイの１つの例では、Ｇ共役型タンパク質レセプター保有細胞を使用し得、そしてこれらの細胞を、細胞に結合する因子（これらの因子は、力が濃縮を誘導することを可能にする表面に結合している）と接触し得る。従って、レセプターが一緒にラフトする場合、シグナル伝達事象は増幅される。このことは、代表的な実験、従って、このようなシグナル伝達事象を阻害するかまたはいくらか改変するための薬物化合物についてのスクリーニングにおいて、非常に低いレベルである、シグナル伝達事象の研究に重要であり得る。
【００５５】
（Ａ．細胞集団の刺激）
本発明の方法は、細胞事象を誘導する、細胞部分に結合するリガンドまたは因子を導入することによる標的細胞の刺激に関する。細胞に対するリガンドまたは因子の結合は、シグナル伝達経路を開始し得る。これは、次いで、細胞における特定の表現型変化または生物学的変化を活性化する。細胞の活性化は、正常な細胞機能を増強し得るか、または異常な細胞における正常な細胞機能を惹起し得る。本明細書中に記載される方法は、細胞表面部分を連結するリガンドまたは因子と共に細胞の濃縮を強制することによる刺激を提供する。細胞の刺激は、増強され得るか、または特定の細胞事象は、第２の細胞表面部分を連結する第２の因子またはリガンドを導入することにより刺激され得る。本発明は、細胞表面部分の連結がシグナル伝達事象を導く任意の細胞に適用され得る。本発明は、刺激した細胞を選択または培養するための手段をさらに提供する。記載されるプロトタイプの例は、Ｔ細胞の刺激であるが、当業者は、この方法が、他の細胞型に適用され得ることを容易に理解する。例として、刺激および選択され得る細胞型としては、線維芽細胞、神経芽細胞、造血幹細胞および造血前駆体細胞（ＣＤ３４＋細胞）、間葉幹細胞、樹状細胞、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、他の白血球集団、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞、多能性（ｍｕｌｔｉ−ｐｏｔｅｎｔ）幹細胞、島細胞などが挙げられる。従って、本発明はまた、この方法論から生じる細胞の集団、ならびに特定の表現型特性を有するＴ細胞を含む別々の表現型特性を有する細胞集団を提供する。
【００５６】
上記のように、種々の細胞型が、本発明の状況下において利用され得る。例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、他の血球、ニューロン細胞、腺（内分泌）細胞、骨形成細胞（破骨細胞など）、生殖細胞（例えば、卵母細胞）、生殖器官内面の上皮細胞などのような細胞型が利用され得る。細胞表面部分−リガンド対としては、（排他的ではないが）以下が挙げられ得る：Ｔ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）および抗ＣＤ３　ｍＡｂ、ＴＣＲおよび主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）＋抗原、ＴＣＲおよびスーパー抗原（例えば、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）、トキシックショック症候群毒素（ＴＳＳＴ）など）、Ｂ細胞抗原レセプター（ＢＣＲ）および抗Ｉｇ、ＢＣＲおよびＬＰＳ、ＢＣＲおよび特異的抗原（一価または多価）、ＮＫレセプターおよび抗ＮＫレセプター抗体、ＦＡＳ（ＣＤ９５）レセプターおよびＦＡＳリガンド、ＦＡＳレセプターおよび抗ＦＡＳ抗体、ＣＤ５４および抗ＣＤ５４抗体、ＣＤ２および抗ＣＤ２抗体、ＣＤ２およびＬＦＡ−３（リンパ球機能関連抗原−３）、サイトカインレセプターおよびその個々のサイトカイン、サイトカインレセプターおよび抗サイトカインレセプター抗体、ＴＮＦ−Ｒ（腫瘍壊死因子レセプター）ファミリーメンバーおよびそれに対して指向された抗体、ＴＮＦ−Ｒファミリーメンバーおよびその個々のリガンド、接着／ホーミングレセプターおよびそのリガンド、接着／ホーミングレセプターおよびそれに対する抗体、卵母細胞または受精卵母細胞のレセプターおよびそのリガンド、卵母細胞または受精卵母細胞のレセプターおよびそれに対する抗体、子宮の子宮内膜内面上のレセプターおよびそのリガンド、ホルモンレセプターおよびその個々のホルモン、ホルモンレセプターおよびそれに対して指向された抗体など。
【００５７】
リガンドによるレセプターの結合の性質は、レセプターの多量体化、またはレセプターの凝集／配向付けのいずれかを引き起こし、その結果、シグナル伝達または細胞応答が加速されるか、改善されるか、さもなくば改変されて特定の利点（例えば、細胞分裂、サイトカイン分泌、細胞移動、細胞−細胞相互作用の増加など）を付与する。
【００５８】
２つの例を、以下に示す。これらの例は、このような細胞表面部分の多量体化、凝集または制御された再配向付けが、いかに実用的に有益であり得るかを示す。
【００５９】
１つの例では、抗原および抗原提示細胞による正常なＴ細胞活性化が、通常、ＴＣＲラフト（ＴＣＲ　ｒａｆｔ）の凝集、細胞骨格再構築、「活性化」シグナルの分極、および細胞分裂などを生じる。本明細書中に記載されるような人為的アプローチを使用することにより、「正常な」インビボＴ細胞活性化の非存在下において、特にＴＣＲおよびＣＤ２８の加速され、制御され、かつ空間的に配向付けられた連結を通して、上記の機能を加速し得るか、上記の機能を改善し得るか、さもなくば上記の機能に影響を及ぼし得る。利点は、治療的適用のための多数の注入可能でありかつより頑強な細胞を生じる、インビトロでの細胞増殖の改善であり得る。他の利点は、細胞表面上における正常未満のＴＣＲ密度のような欠損を有する細胞についてのレセプター「凝集」の改善であり得る。同様に、インビボ適用は、特定のＴ細胞集団（例えば、腫瘍部位での腫瘍特異的Ｔ細胞）が活性化される必要のある場合に有益であり得る。レセプターの凝集および配向付けの改善は、さもなくば機能的に寛容化されたＴ細胞を得ることが困難な活性化シグナルを提供し得る。さらに、このような活性化は、抗原特異的なＴ細胞の状況下において使用され得る。これに関して、腫瘍由来のＴ細胞が単離され得、そして増殖され得、そして患者に注入され得る。同様に、インビボまたはインビトロのいずれかで抗原に曝露されたＴ細胞が、本発明の方法論によって増殖され得る。
【００６０】
別の例では、細胞死の誘導の改善が、ＦＡＳ経路を介して生じる：ＦＡＳの多量体化を加速する能力、標的細胞表面上において「活性化された」ＦＡＳを空間的に配向付ける能力、または、さもなくば達成不可能である累積的なＦＡＳ連結を促進する能力は、特に、癌、自己免疫応答、または対宿主性移植片病を処置するために、インビボで顕著な利点を提供し得る。例えば、腫瘍細胞は、インビボで低レベルのＦＡＳを発現し得、そして宿主は、腫瘍部位で低レベルのＦＡＳ−Ｌを発現し得る（抑制性サイトカインなどに起因する）。これらの低いレベルに起因して、十分なＦＡＳシグナルは生成され得ず、腫瘍の生存および増殖が許容される。このＦＡＳ／ＦＡＳリガンド欠損を克服するために可能な１つの方法は、常磁性粒子に結合したＦＡＳに対する一価リガンドまたは多価リガンド（ＦＡＳ−Ｌ、抗体など）を用いて、腫瘍／腫瘍部位を標的化することであり得る。腫瘍部位（例えば、黒色腫、カポージ肉腫、扁平上皮頸部癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ　ｃｅｌｌ　ｎｅｃｋ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）など）で本発明を使用する強力な磁場の適用は、腫瘍部位で常磁性粒子の空間的配向付けを提供し得る。なぜなら、腫瘍細胞においてＦＡＳに結合した粒子は、レセプターの活性化および／またはＴ細胞の活性化および増殖に適合されるからである。シグナル分極によって達成されるＦＡＳ凝集の増加は、ここで、腫瘍細胞において細胞死を誘導するために十分なシグナルを提供し得る。
【００６１】
本発明の１つの特定の実施形態では、Ｔ細胞集団を、Ｔ細胞表面を同時に濃縮しかつ連結することによって刺激し得る。本発明の１つの局面では、ＣＤ３およびＣＤ２８に対する抗体は、表面上に同時固定される。このような固定化のために好ましい表面としては、粒子が挙げられ、そして特定の局面では、ビーズ（例えば、常磁性ビーズ）が挙げられる。本発明の別の局面では、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を結合し、そして一次刺激シグナルを開始する任意のリガンドが、表面上に固定された一次活性化因子として利用され得る。ＣＤ２８を結合し、そしてＣＤ２８シグナル伝達経路を開始し、それによってＣＤ３リガンドを有する細胞の同時刺激を引き起こし、かつＴ細胞集団の活性化を増強するリガンドはいずれもＣＤ２８リガンドであり、従って、本発明の状況下における同時刺激因子である。本発明のさらなる局面では、Ｔ細胞ならびに抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８コーティング表面の混合物に力を適用して、Ｔ細胞を濃縮し、それによってＴ細胞の表面連結を最大化する。１つの特定の実施形態では、この濃縮力は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８コーティング表面が常磁性ビーズである場合に適用される磁気力であるが、細胞とリガンドとを一緒に濃縮様式にするための他の手段が、当該分野で利用可能である。Ｔ細胞集団を刺激するこのような方法は、Ｔ細胞の驚くほど高い活性化および／または増殖を誘導する、顕著なビーズ−細胞接触および／または細胞−細胞接触を与える。さらに、本発明の方法は、細胞表面マーカープロフィールを改変する。ここでは、活性化Ｔ細胞は、より正常な表現型および疾患を有する被験体から最初に単離された場合のＴ細胞のプロフィールと比較して変動の少ない最終産物を示す、細胞表面マーカーを発現する。
【００６２】
（１．一次シグナル）
エキソビボでのＴ細胞刺激を担う生化学的事象を、以下に簡潔に示す。抗原提示細胞において、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子のいずれかと共に提示される抗原とＴＣＲ／ＣＤ３複合体との間の相互作用は、抗原特異的Ｔ細胞活性化と称される一連の生化学的事象を開始する。従って、Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を刺激することによってか、またはＣＤ２表面タンパク質を刺激することによって、達成され得る。抗ＣＤ３モノクローナル抗体を使用し、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介してＴ細胞集団を活性化し得る。多数の抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体が市販されており、例は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手されるハイブリドーマ細胞から調製されるＯＫＴ３、およびモノクローナル抗体Ｇ１９−４である。同様に、抗ＣＤ２抗体の刺激性形態が公知であり、そして入手可能である。抗ＣＤ２抗体を用いるＣＤ２を介した刺激は、代表的に、少なくとも２つの異なる抗ＣＤ２抗体の組み合わせを使用して達成される。記載されている抗ＣＤ２抗体の刺激性の組み合わせとしては、以下が挙げられる：Ｔ１１．１またはＴ１１．２抗体（Ｍｅｕｅｒら、Ｃｅｌｌ　３６：８９７−９０６、１９８４）との組み合わせにおけるＴ１１．３抗体、および９−１抗体（Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１０９７−１１００、１９８６）との組み合わせにおける９．６抗体（これは、Ｔ１１．１と同じエピトープを認識する）。上記のいずれかの抗体と同じエピトープに結合する他の抗体もまた使用され得る。さらなる抗体、または抗体の組み合わせが、標準的な技術によって調製され得、そして同定され得る。
【００６３】
一次活性化シグナルはまた、他の機構を介してＴ細胞に送達され得る。例えば、使用され得る組み合わせとしては、ホルボールエステル（例えば、ホルボールミリステートアセテート）のようなプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）アクチベーター、およびカルシウムイオノフォア（例えば、イオノマイシン（これは、細胞質カルシウム濃度を上昇させる）など、が挙げられる。このような因子の使用は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を迂回するが、Ｔ細胞に刺激シグナルを送達する。一次シグナルとして作用する他の因子には、天然のリガンドおよび合成リガンドを含まれ得る。天然のリガンドには、ＭＨＣ（提示されたペプチドを有するかまたは有さない）を含まれ得る。他のリガンドには、ペプチド、ポリペプチド、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、糖ペプチド、可溶性レセプター、ステロイド、ホルモン、マイトジェン（例えば、ＰＨＡ）または他のスーパー抗原が含まれ得るが、これらに限定されない。本発明の状況下で、濃縮および刺激の使用は、二次シグナルがＴ細胞の増殖を誘導するために必要とされないような、高いレセプター偏向（ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を生じ得る。
【００６４】
他の実施形態において、任意の種のシグナル伝達事象は、本発明を利用することによって拡大または分析され得る。例えば、Ｇタンパク質結合レセプターは、本発明の濃縮方法を使用して刺激および測定され得る。
【００６５】
（２．二次シグナル）
ＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＤ２分子の刺激は、Ｔ細胞における一次活性化シグナルの送達に必要とされるようであるが、Ｔ細胞の表面上の多くの分子（補助分子または同時刺激分子といわれる）は、休止Ｔ細胞から芽球転換への移行、ならびに引き続く増殖および分化の調節に関係している。従って、一次活性化シグナルに加えて、Ｔ細胞応答の誘発は、第２の同時刺激シグナルを必要とする。１つのこのような同時刺激分子または補助分子であるＣＤ２８は、ＴＣＲ複合体によって刺激されるシグナル伝達経路とは異なるシグナル伝達経路を開始または調節すると考えられる。
【００６６】
従って、外因性増殖因子またはアクセサリー細胞の非存在下でＴ細胞の集団の活性化および増殖を増強するために、Ｔ細胞の表面上の補助分子（例えば、ＣＤ２８）を、その補助分子を結合するリガンドで刺激する。１つの実施形態では、補助分子ＣＤ２８の刺激およびＴ細胞の活性化は、Ｔ細胞の集団に、ＣＤ３を結合するリガンドおよびＣＤ２８を結合するリガンドが結合する表面を接触させることにより同時に生じる。Ｔ細胞の活性化（例えば、抗ＣＤ３抗体での）およびＣＤ２８補助分子の刺激は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の選択的な増殖を生じる。
【００６７】
従って、当業者は、任意の因子（抗ＣＤ２８抗体、またはＣＤ２８分子と交差結合し得るそのフラグメント、あるいはＣＤ２８に対する天然リガンドを含む）を使用して、Ｔ細胞を刺激し得ることを認識する。本発明の状況において有用な、例示的な抗ＣＤ２８抗体またはそのフラグメントとしては、モノクローナル抗体９．３（ＩｇＧ２ａ）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ　Ｓｑｕｉｂｂ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、モノクローナル抗体ＫＯＬＴ−２（ＩｇＧ１）、１５Ｅ８（ＩｇＧ１）、２４８．２３．２（ＩｇＭ）およびＥＸ５．３Ｄ１０（ＩｇＧ２ａ）（ＡＴＣＣ　ＨＢ１１３７３）が挙げられる。例示的な天然リガンドとしては、Ｂ７ファミリーのタンパク質（例えば、Ｂ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）（Ｆｒｅｅｄｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３２６０−３２６７，１９８７；Ｆｒｅｅｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：２７１４−２７２２，１９８９；Ｆｒｅｅｍａｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：６２５−６３１，１９９１；Ｆｒｅｅｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６２：９０９−９１１，１９９３；Ａｚｕｍａら、Ｎａｔｕｒｅ　３６６：７６−７９，１９９３；Ｆｒｅｅｍａｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：２１８５−２１９２，１９９３））が挙げられる。さらに、天然リガンドの結合ホモログもまた、ネイティブであるかまたは化学技術もしくは組換え技術によって合成されたかに関わらず、本発明に従って使用され得る。二次シグナルとして作用する他の因子には、天然のリガンドおよび合成リガンドが含まれ得る。因子としては、他の抗体またはそのフラグメント、ペプチド、ポリペプチド、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、糖ペプチド、可溶性レセプター、ステロイド、ホルモン、マイトジェン（例えば、ＰＨＡ）または他のスーパー抗体が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００６８】
本発明のさらなる実施形態において、Ｔ細胞集団の活性化は、他のＴ細胞膜内在タンパク質の同時刺激によって増強され得る。例えば、Ｔ細胞インテグリンＬＦＡ−１のその天然のリガンドＩＣＡＭ−１への結合は、細胞の活性化を増強し得る。Ｔ細胞についての同時刺激因子として作用し得る別の細胞表面分子は、ＶＣＡＭ−１（ＣＤ１０６）であり、これは、Ｔ細胞上の最後期抗原−４（ｖｅｒｙ−ｌａｔｅ−Ａｎｔｉｇｅｎ−４）（ＶＬＡ−４）を結合する。
【００６９】
当業者は、Ｔ細胞以外の細胞が、細胞表面部分を連結しそしてその部分の凝集を誘導する因子の結合によって刺激され得、これが、次いで、シグナル伝達経路の活性化を生じることを認識する。他のこのような細胞表面部分としては、ＧＰＩアンカー型葉酸レセプター（ＣＤ５９）、ヒトＩｇＥレセプター（ＦｃεＲｉレセプター）、ＢＣＲ、ＥＧＦレセプター、インスリンレセプター、エフィリン（ｅｐｈｒｉｎ）Ｂ１レセプター、ニューロトロフィン、グリア細胞由来神経栄養（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｃ）因子（ＧＮＤＦ）、ヘッジホッグおよび他のコレステロール連結タンパク質およびパラミリストイル化タンパク質、Ｈ−Ｒａｓ、インテグリン、内皮一酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）、ＦＡＳ、ＴＮＦレセプターファミリーのメンバー、ＧＰＩアンカー型タンパク質、二重アシル化タンパク質（例えば、Ｓｒｃファミリーキナーゼ）、ヘテロ三量体Ｇタンパク質のαサブユニット、および細胞骨格タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
（Ｂ．Ｔ細胞集団の拡大）
本発明の１つの局面において、エキソビボでのＴ細胞拡大が、Ｔ細胞の単離およびその後の刺激によって行われ得る。本発明の１つの実施形態において、Ｔ細胞は、単一の因子によって刺激され得る。別の実施形態において、Ｔ細胞は、２つの因子によって刺激され、一方は、一次シグナルを誘導し、そして２つ目は、同時刺激シグナルである。単一のシグナルの刺激または一次シグナルの刺激に有用なリガンド、および二次シグナルを刺激する補助分子は、可溶性形態で使用され得るか、細胞の表面に結合され得るか、または本明細書中に記載のように表面に固定化され得る。表面に結合されるリガンドまたは因子は、「代理」抗原提示細胞（ＡＰＣ）として作用する。好ましい実施形態において、一次因子および二次因子の両方が、表面上に共に固定化される。１つの実施形態において、一次活性化シグナルを提供する分子（例えば、ＣＤ３リガンド）および同時刺激分子（例えば、ＣＤ２８リガンド）が、同じ表面（例えば、粒子）に結合される。さらに、先に記載したように、１個、２個またはそれ以上の刺激分子が、同じ表面上または異なる表面上で使用され得る。
【００７１】
拡大前に、Ｔ細胞の供給源を、被験体から得る。用語「被験体」は、免疫応答が誘発され得る、生きた生物体（例えば、哺乳動物）を含むことが意図される。被験体の例としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種が挙げられる。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、脾臓組織および腫瘍を含む、多くの供給源から得られ得る。好ましくは、個体の循環中の血液由来の細胞は、アフェレーシスまたは白血球搬出法によって得られる。アフェレーシス生成物は、代表的に、リンパ球（Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球を含む）、赤血球および血小板を含む。１つの実施形態において、アフェレーシスによって収集された細胞は、血漿画分を除去するため、およびその後の処理工程のための適切な緩衝液または培地中に置くために、洗浄され得る。本発明の１つの実施形態において、細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。代替的な実施形態において、洗浄溶液は、カルシウムを欠き、そしてマグネシウムを欠き得るかまたは多くの（全てではなくとも）二価カチオンを欠き得る。再度、驚くことに、カルシウムの非存在下での最初の活性化工程は、活性化の拡大を導く。当業者が容易に認識するように、洗浄工程は、当該分野で公知の方法によって（例えば、半自動化「フロースルー」遠心分離（例えば、Ｃｏｂｅ　２９９１細胞プロセッサー、Ｂａｘｔｅｒ）をその製造業者の説明書に従って使用することによって）達成され得る。洗浄後、細胞を、種々の生体適合性の緩衝液（例えば、無Ｃａ、無ＭｇのＰＢＳ）中に再懸濁し得る。あるいは、アフェレーシスサンプルの所望でない成分は、除去され得、そして細胞を、培養培地中に直接再懸濁し得る。
別の実施形態において、Ｔ細胞が、赤血球を溶解しそして例えば、ＰＥＲＣＯＬＬＴＭ勾配を介する遠心分離によって、単球を除去することによって、末梢血白血球が単球から単離される。ＣＤ２８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞のような、Ｔ細胞の特定の部分集団が、ポジティブ選択技術またはネガティブ選択技術によってさらに単離され得る。例えば、ネガティブ選択によるＴ細胞集団の濃縮は、ネガティブに選択される細胞に特有の表面マーカーに対する抗体の組合わせを用いて達成され得る。好ましい方法は、ネガティブな磁気免疫接着（ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｒｅｎｃｅ）またはフローサイトメトリーを介する細胞選別および／または細胞選択であり、それはネガティブに選択される細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体混合物を利用する。例えば、ネガティブ選択によってＣＤ４＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体混合物は、代表的に、ＣＤ１４に対する抗体、ＣＤ２０に対する抗体、ＣＤ１１ｂに対する抗体、ＣＤ１６に対する抗体、ＨＬＡ−ＤＲに対する抗体、およびＣＤ８に対する抗体を含む。
【００７２】
上記の単球除去に関して、単球集団（すなわち、ＣＤ１４＋細胞）が、エキソビボ増殖の前に、種々の方法（抗ＣＤ１４コードビーズまたは抗ＣＤ１４コートカラム、または除去を容易にするためのこれらの細胞の食作用活性の利用を含む）によって、血液調製物から除去され得る。従って、１つの実施形態において、本発明は、食細胞単球により飲み込まれるに十分なサイズの常磁性粒子を使用する。特定の実施形態において、この常磁性粒子は、市販のビーズ、例えば、ＤｙｎａｂｅａｄＴＭの商標名の下でＤｙｎａｌ　ＡＳによって作製されたものである。これに関する例示的ＤｙｎａｂｅａｄＴＭは、Ｍ−２８０、Ｍ−４５０、およびＭ−５００である。１つの局面において、他の非特異的細胞が、「無関係の」タンパク質（例えば、血清タンパク質または抗体）でその常磁性粒子をコーティングすることによって、除去される。無関係のタンパク質および無関係の抗体としては、増殖されるべきＴ細胞を特異的には標的としない、タンパク質および抗体またはそれらのフラグメントが挙げられる。特定の実施形態において、無関係のビーズとしては、ヒツジ抗マウス抗体でコーティングしたビーズ、ヤギ抗マウス抗体でコーティングしたビーズ、およびヒト血清アルブミンでコーティングした抗体が挙げられる。
【００７３】
簡潔には、このような単球除去は、フィコール処理した全血またはアフェレーシスした末梢血を、１つ以上の種類の無関係な抗体もしくは非抗体に結合した常磁性粒子（１バッチの細胞（代表的には約５×１０８細胞〜約２×１０１０細胞）に対して約１バイアルのビーズまたは４×１０９ビーズ）とともに、２２℃〜３７℃で約３０分〜２時間プレインキュベートし、その後、その常磁性粒子に結合したかまたは包まれた細胞を磁気的に除去することによって、実施される。このような分離は、当該分野で利用可能な標準的方法を使用して実施され得る。例えば、市販されている種々のもの（例えば、ＤＹＮＡＬ（登録商標）Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（ＤＹＮＡＬ　ＭＰＣ（登録商標））を含む、任意の磁気分離方法が使用され得る。必要な除去の確かさが、その除去の前および後に、当業者に公知の種々の方法（ＣＤ１４陽性細胞のフローサイトメトリー分析を含む）によってモニターされ得る。
【００７４】
刺激のためにＴ細胞を調製するための別の方法は、洗浄工程後にその細胞を凍結することであり、これは、単球除去工程を必要としない。理論に拘束されることを望まないが、凍結工程およびその後の融解工程は、その細胞集団の顆粒球を除去しそしてある程度単球を除去することによって、より均一な生成物を提供する。血漿および血小板を除去するこの洗浄工程の後、この細胞は、凍結溶液中に懸濁され得る。多くの凍結溶液およびパラメーターが、当該分野において公知であり、そしてこの状況において有用であるが、１つの方法は、２０％　ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミンを含むＰＢＳかまたは他の適切な細胞凍結媒体を使用する工程を包含し、その後、その細胞は、１分あたり１℃の速度で−８０℃まで凍結され、そして液体窒素貯蔵タンクの気相において貯蔵される。
【００７５】
その細胞集団は、本明細書中に記載されるように、例えば、表面上に固定された抗ＣＤ３抗体または抗ＣＤ２抗体との接触によってか、またはカルシウムイオノフォアと組み合わせたプロテインキナーゼＣアクチベーター（例えば、ブリオスタチン）との接触によって、刺激され得る。そのＴ細胞の表面上の補助分子の同時刺激のために、その補助分子を結合するリガンドが使用される。例えば、ＣＤ４＋細胞の集団が、そのＴ細胞の増殖を刺激するために適切な条件下で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触され得る。同様に、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体およびモノクローナル抗体ＥＳ５．２Ｄ８（ＡＴＣＣ）が、当該分野で一般的に公知である他の方法（Ｂｅｒｇら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ　Ｐｒｏｃ．３０（８）：３９７５〜３９７７，１９９８；Ｈａａｎｅｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（９）：１３１９〜１３２８，１９９９；Ｇａｒｌａｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２２７（１〜２）：５３〜６３，１９９９）が使用され得るのと同様に、使用され得る。
【００７６】
そのＴ細胞についての第一刺激シグナルおよび同時刺激シグナルは、種々のプロトコルによって提供され得る。例えば、各シグナルを提供する因子が、溶液中に存在し得るか、または表面に結合され得る。表面に結合された場合、その因子は、同じ表面（すなわち、「シス」構成）にかまたは別々の表面（すなわち、「トランス」構成）に結合され得る。あるいは、１つの因子が表面に結合され得、もう一方の因子が溶液中に存在し得る。１つの実施形態において、同時刺激シグナルを提供する因子が細胞表面に結合され、そして一次活性化シグナルを提供する因子が、溶液中に存在するかまたは表面に結合される。好ましい実施形態において、この２つの因子は、ビーズ上（同じビーズ上（すなわち、「シス」）または別個のビーズ上（すなわち、「トランス」）のいずれか）に固定される。例として、一次活性化シグナルを提供する因子は抗ＣＤ３抗体であり、そして同時刺激シグナルを提供する因子は抗ＣＤ２８抗体であり、そして両方の因子が、等分子量で同じビーズにともに固定されている。１つの実施形態において、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖およびＴ細胞増殖のために、ビーズに結合した１：１の比の各抗体が使用される。しかし、１：５００〜５００：１およびその中間の任意の整数値の粒子：細胞比が、Ｔ細胞または他の標的細胞を刺激するために使用され得る。当業者が容易に認識し得るように、粒子：細胞比は、標的細胞に対する粒子サイズに依存し得る。例えば、小さいサイズのビーズは、２〜３個の細胞しか結合し得ないが、もっと大きなビーズは、多くの細胞を結合し得る。特定の実施形態において、細胞：粒子比は、１００：１〜１００：１およびその中間の任意の整数値の範囲であり、そしてさらなる実施形態において、その比は、１：９〜９：１およびその間の任意の整数値を含み、そしてまた、Ｔ細胞を刺激するために使用され得る。Ｔ細胞刺激を生じる抗ＣＤ３結合ビーズおよび抗ＣＤ２８結合ビーズ：Ｔ細胞の比は、上記のように変動し得るが、特定の好ましい値としては、少なくとも１：４、１：３、１：２、２：１、３：１、４：１〜６：１が挙げられ、１つの好ましい比は、少なくとも２：１のビーズ：Ｔ細胞である。
【００７７】
特定の方法を使用すると、最初の活性化および刺激の後、そのＴ細胞を約１２〜約１４日後に刺激から分離することによって、Ｔ細胞集団の長期刺激を維持することが有利であり得る。Ｔ細胞増殖の速度は、例えば、クールター計数器を用いて、Ｔ細胞のサイズを調べることまたはＴ細胞の体積を測定することによって、周期的に（例えば、毎日）モニターされる。これに関し、休止Ｔ細胞は、最初の活性化および刺激の際に、刺激リガンドの存在下で、平均直径約６．８ミクロンを有し、そのＴ細胞平均直径は、４日目までに１２ミクロンを超えるまで増大し、そしておよそ６日目までに減少し始める。この平均Ｔ細胞直径が約８ミクロンまで減少した場合、そのＴ細胞は、そのＴ細胞のさらなる増殖を誘導するように再活性化および再刺激される。あるいは、Ｔ細胞増殖の速度およびＴ細胞再刺激のための時間は、活性化Ｔ細胞上に誘導される細胞表面分子（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２）の存在についてアッセイすることによって、モニターされ得る。
【００７８】
ＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の集団の長期刺激を誘導するために、そのＴ細胞を、刺激因子（例えば、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体またはモノクローナル抗体ＥＳ５．２Ｄ８）で数回再活性化および再刺激して、もとのＴ細胞集団の約１０倍〜約１，０００倍数が増加したＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を生じることが必要であり得る。本発明の方法を使用すると、約１００倍〜約１００，０００倍のＴ細胞数を達成することが可能である。さらに、実施例ＸＩＩに記載されるように、本発明の方法によって増殖されたＴ細胞は、培養上清中に高レベルのサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−α）を分泌する。例えば、ＩＬ−２による刺激と比較して、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８同時刺激の使用により増殖されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、高レベルのＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αを培養培地中に分泌する。これらのサイトカインは培養上清から精製され得るか、またはこの上清が、培養中の細胞を維持するために直接使用され得る。同様に、本発明の方法によって増殖されたＴ細胞が、培養上清およびサイトカインとともに、インビボで細胞の増殖を支持するために投与され得る。
【００７９】
１つの実施形態において、ビーズ（３×２８ビーズ）上で同時固定した抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を用いて、細胞を静止状態（低増殖または増殖なし）に戻すのに十分な時間（初回刺激後、約８〜１４日）、Ｔ細胞刺激を実施する。次いで、刺激シグナルを細胞から除き、そしてこの細胞を洗浄して、患者に注入して戻す。刺激相の最後の時点で細胞を、実施例によって証明されるように、本発明の方法によって、これらの細胞が抗原に応答する能力、およびこれらの細胞が記憶様表現型を示す能力によって実証されるように、「超誘導性（ｓｕｐｅｒ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）」にする。従って、外因的にまたは注入後インビボで抗原のいずれかによっての再刺激の際、活性化Ｔ細胞は、持続性ＣＤ１５４発現、サイトカイン産生増大などのような特有の表現型特性によって特徴付けられた強力な反応を実証する。
【００８０】
本発明のさらなる実施形態において、Ｔ細胞のような細胞を薬剤コーティングビーズと合わせて、このビーズおよび細胞を引き続いて分離し、次いでこの細胞を培養する。別の実施形態において、培養前に、薬剤コーティングビーズおよび細胞は、分離されないが一緒に培養される。さらなる実施形態において、ビーズおよび細胞は、力の付与によってまず濃縮され、細胞表面部分連結（ｃｅｌｌ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｍｏｉｅｔｙ　ｌｉｇａｔｉｏｎ）を生じ、それにより細胞刺激を誘導する。
【００８１】
例えば、Ｔ細胞が標的細胞集団である場合、細胞表面部分は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８が付着される常磁性ビーズ（ＣＤ３×ＣＤ２８ビーズ）が、Ｔ細胞調製物と接触することを可能にすることによって連結され得る。１つの実施形態において、細胞（例えば、１０４〜１０９／ｍＬのＴ細胞）およびビーズ（例えば、１．５×１０９　ＣＤ３×ＣＤ２８常磁性ビーズ）を緩衝液、好ましくはＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムのような二価陽イオンを含まない）中であわせる。ここでも、当業者は、任意の細胞濃度が用いられ得ることを容易に理解し得る。例えば、標的細胞は、このサンプル中で非常にまれであり、そしてわずか０．０１％のサンプルしか標的細胞を含まなくてもよいし、またはサンプル全体（すなわち、１００％）が目的の標的細胞を含んでもよい。従って、本発明の文脈には任意の細胞数が含まれる。
【００８２】
細胞を中に懸濁している緩衝液は、特定の細胞型に適切な任意の緩衝液であり得る。特定の細胞型を利用する場合、緩衝液は、他の成分、例えば１〜５％の血清を含み得、処理の間に細胞の完全性を維持する必要がある。別の実施形態では、この細胞およびビーズは、細胞培養培地中に合わせられ得る。細胞およびビーズは、例えば、回転、攪拌、または混合のための任意の手段で、１分〜数時間の範囲の時間で、混合され得る。次いで、ビーズおよび細胞の容器に力（例えば、磁場に配置する）をかけて濃縮する。培地および未結合の細胞を取り出し、そしてビーズに結合した細胞を、例えば、蠕動ポンプによるポンピングによって洗浄し、次いで細胞培養に適切な培地中に再懸濁する。
【００８３】
本発明の１つの実施形態において、この混合物を数時間（約３時間）〜１４日間、またはこの間の任意の整数時間数、培養し得る。本発明の１つの実施形態において、ビーズおよびＴ細胞を約８日間一緒に培養する。別の実施形態において、ビーズおよびＴ細胞を２〜３日間一緒に培養する。Ｔ細胞培養のために適切な条件は、適切な培地（例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ　Ｍｅｄｉａ　１６４０　または、Ｘ−ｖｉｖｏ　１５（Ｂｉｏ　Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ））を含む。この培地は、増殖および生存に必須の因子を含み得る。この因子としては、血清（例えば、ウシ胎仔血清またはヒト血清）またはインターロイキン−２（ＩＬ−２）が挙げられる。抗生物質（例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシン）は、被験体に注入されるはずの細胞の培養中ではなく、実験的培養にしか含まれない。標的細胞を、増殖を支持するのに必要な条件（例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気＋５％ＣＯ２））下で維持する。
【００８４】
濃縮力として磁場を使用する場合、細胞培養の前に細胞に供された電場強度は、磁気表面上で２００ガウス〜１２，０００ガウスの範囲内であり得る。磁石の形状およびサイズは、混合もしくは細胞培養容器のサイズおよび形状に、または任意の他のパラメーター（細胞間接触および細胞の濃縮を容易にするかまたは増大する）に適合され得る。磁力は、細胞との混合物内に含まれる、磁石と常磁性ビーズとの間に、緩衝液またはスペーサーとして働く物質を配置することによって拡散され得る。強力な磁力とは、一般に、表面で少なくとも７５００ガウスであると考えられるが、弱い磁力とは、表面で２０００〜２５００の範囲であるとみなされる。常磁性ビーズ上の磁石によって付与されるおよその磁力は、以下の式によって、常磁性ビーズの容積および電場強度に依存する。
Ｆｍａｇ＝（ｖ）（Ψ）（Ｂ）（ｄＢ／ｄｘ）
ここで、Ｆｍａｇは、磁力であり、ｖは、常磁性ビーズの容積であり、Ψは、常磁性ビーズの磁気感受性（製造業者によって与えられる値）であり、Ｂは磁場強度であり、そして（ｄＢ／ｄｘ）は、磁場強度勾配である。当業者は、式の右側の因数が得られるかまたは測定できて、付与される磁力を算出することが可能になることを理解する。
【００８５】
本発明の方法によって刺激された細胞は、シグナル伝達の誘導、細胞表面マーカーの発現および／または増殖によって示されるように活性化される。Ｔ細胞に適切なこのようなマーカーの１つは、ＣＤ１５４である。これは、重要な免疫調節分子であり、ＣＤ１５４の発現は、免疫応答を増幅するのに非常に有利である。ＣＤ１５４は、多くのＢ細胞、樹状細胞、単球およびいくつかの上皮細胞の上で発現されたＣＤ４０分子と相互作用する。従って、ＣＤ１５４発現における、この予期されないそして驚くべき増大は、より有効なＴ細胞組成をもたらすようである。本明細書に記載されるようなＣＤ３＋細胞の刺激は、刺激後１、２、３、または４日後に、特定の細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ１５４）発現のレベルの１．１〜２０倍の増大を示すＴ細胞を提供する。（実施例５、表２、および図４を参照のこと）。別の細胞表面マーカー（ＣＤ２５）の発現はまた、培養前の細胞、または他の方法によって刺激された細胞上の発現よりも、濃縮および刺激後のＴ細胞上で、より大きかった（表２を参照のこと）。
【００８６】
当業者は、細胞表面部分連結によって刺激され得る任意の標的細胞が、薬剤コーティング表面（例えば、ビーズ）と合わせられ得ることを理解する。さらに、薬剤コーティング表面（例えば、ビーズ）は、培養前の細胞から、培養中の任意の時点で、または培養の終了時に、分離され得る。さらに、標的細胞に連結された薬剤コーティング表面は、培養の前に非結合細胞から分離され得るか、または他の細胞が、同様に培養中に残り得る。１つの実施形態において、培養前に、薬剤コーティングビーズおよび標的細胞は、分離されないが一緒に培養される。さらなる実施形態において、ビーズおよび標的細胞は、力の適用によって最初に濃縮され、細胞表面部分連結を生じ、これによって刺激および引き続く活性化を誘導する。
【００８７】
また、本発明によって、標的細胞（例えば、一次刺激分子および二次刺激分子でコーティングされた表面に結合した、Ｔ細胞画分）の濃度を上昇させるための他の手段が意図される。磁力の適用に加えて、重力より大きな他の力（例えば、遠心力、膜透過圧力、および水力であるが、これらに限定されない）が、適用され得る。濃縮はまた、濾過によって達成され得る。
【００８８】
当業者は、因子でコーティングされたビーズと刺激されるべき細胞との間の接触が、他の力を使用する濃縮によって増加し得ることを、容易に理解する。従って、濃縮が、重力または拡散を超える様式で細胞と因子とを一緒にする限り、細胞表面部分がリガンドを結合している細胞を濃縮するための任意の手段で十分である。
【００８９】
種々の実施形態において、因子でコーティングされた表面が、粒子（例えば、ビーズ）であり、これが細胞と混合され、そして磁場において少量に濃縮され、従って、全ての粒子および粒子に結合した細胞を規定された濃縮領域に引くことが、理解されるべきである。特定の実施形態において、因子でコーティングされた表面は、標的細胞に曝露されている３０秒間〜４時間以内に、力によって一緒に引かれ得る。他の実施形態において、この時間は、１分間〜２時間、またはこの間の全ての整数の範囲であり得る。少なくとも１つの細胞表面リガンドが付着する表面と混合された、レセプター保有細胞を有する細胞集団への、力の適用は、細胞レセプター分極を引き起こし得、細胞表面分子を凝集させる。このことは、細胞表面分極が、脂質ラフト（ｒａｆｔ）を含む細胞表面分子を凝集させることによって、細胞内のシグナル伝達を増強し得ることを意味する。このような凝集は、細胞事象のダウンレギュレーションまたは抑制を導き得る、シグナル伝達経路を誘導し得る。あるいは、細胞表面分子の凝集は、細胞事象のアップレギュレーションまたは活性化を導き得る。
【００９０】
細胞事象としては、例えば、特定の経路（アポトーシス経路を含む）を誘導または抑制するか、あるいはタンパク質のリン酸化を誘導するか、あるいは増殖シグナルを刺激または抑制する、レセプター媒介シグナル伝達が挙げられ得る。１つの実施形態において、細胞は、リンパ球（特に、Ｔ細胞）であり得、そして細胞表面リガンドは、表面（例えば、粒子）に付着した抗ＣＤ３抗体であり得る。この粒子は、常磁性ビーズであり得、そして適用される力は、磁力であり得る。リンパ球と、抗ＣＤ３で被覆した常磁性ビーズの表面との混合物への磁力の適用は、Ｔ細胞のＣＤ３レセプターの分極を、外力の非存在下で起こるよりずっと速く引き起こし得る。Ｔ細胞を刺激するこの方法は、Ｔ細胞免疫応答経路のより迅速な活性化および細胞の増殖を促進する。
【００９１】
別の実施形態において、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（すなわち、ＣＤ３×ＣＤ２８）で被覆したビーズのような刺激因子への曝露時間は、所望のＴ細胞表現型を得るために、改変するかまたはあつらえ得る。ヘルパーＴ細胞（ＴＨ）（代表的には、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞またはサプレッサＴ細胞（ＴＣ）と対照的に、ＣＤ４＋））のより大きな集団が所望であり得る。なぜなら、ＴＨ細胞の増殖は、全体の免疫応答性を改善または回復し得るからである。多くの特異的免疫応答が、ＣＤ８＋抗原特異的Ｔ細胞（これは、標的細胞を直接溶解または殺傷し得る）によって媒介されるが、大部分の免疫応答は、ＣＤ４＋Ｔ細胞（これは、例えばＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ−２のような、重要な免疫調節分子を発現する）の補助を必要とする。ＣＤ４媒介性補助が好ましい場合には、ＣＤ４：ＣＤ８の比を保存または増強する、本明細書中に記載される方法のような方法は、非常に有利であり得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞の増加した数は、患者に導入される細胞発現されたＣＤ４０Ｌの量を増加させて、標的細胞の可視性を潜在的に改善し得る（改善されたＡＰＣ機能）。類似の効果が、ＧＭ−ＣＬＦまたはＩＬ−２（これらの全てが、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって優勢に発現される）を発現する注入される細胞の数を増加させることによって、見られ得る。あるいは、ＣＤ４による補助がさほど必要ではなく、そして増加した数のＣＤ８＋Ｔ細胞が所望である状況においては、本明細書中に記載のＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥアプローチがまた、例えば刺激および／または培養の前にＣＤ８＋細胞を予め選択することによって、利用され得る。このような状況は、増加したレベルのＩＦＮまたは標的細胞の増加した細胞溶解が好ましい場合に、存在し得る。
【００９２】
異なるＴ細胞集団の単離を果たすために、濃縮力への曝露時間は、変化され得るかまたはパルス化され得る。例えば、このような力が磁力である場合には、目的の特定の表現型を得るために、磁石への曝露または磁場の強度が変化し得、そして／あるいは増殖時間が変化され得る。種々の表現型マーカーの発現は、経時的に変化する；従って、Ｔ細胞の特定の集団を得るために、特定の時点が選択され得る。従って、刺激される細胞型に依存して、刺激および／または曝露の時間は、４週間以下、２週間以下、１０日間以下、または８日間以下であり得る（４週間以下とは、４週間から１日間（２４時間）までの全ての時間範囲を含む）。いくつかの実施形態において、刺激および増殖は、６日間以下、４日間以下、２日間以下行われ得、そして他の実施形態においては、２４時間以下程度に短時間、そして好ましくは、４〜６時間以下で行われ得る（これらの範囲は、この間の任意の整数値を含む）。Ｔ細胞の刺激がより短い時間にわたって行われる場合には、Ｔ細胞の集団は、その数が劇的には増加しないかもしれず、この集団は、より強くかつより健常に活性化されるＴ細胞を提供し、これらは、インビボで増殖し続け得、そして天然のエフェクターＴ細胞プールにより近く類似し得る。Ｔ細胞による補助のアベイラビリティーは、しばしば、タンパク質抗原に対する抗体応答における制限因子であるので、Ｔ細胞のＣＤ４＋富化集団を選択的に増殖するかまたは被験体に選択的に注入する能力は、非常に有利である。このような富化された集団のさらなる利点は、Ｂリンパ球によって提示される抗原を認識する活性化ヘルパーＴ細胞が２つの型の刺激（物理的接触およびサイトカイン産生であり、これらは、Ｂ細胞の増殖および分化を生じる）を送達する点で、容易に明らかである。
【００９３】
種々の刺激時間に供されたＴ細胞は、異なる特性を示し得る。例えば、代表的な血液またはアフェレーシスされた末梢血液の単核細胞産物は、細胞傷害性Ｔ細胞集団またはサプレッサＴ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８＋）より大きなヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する。ＣＤ３レセプターおよびＣＤ２８レセプターを刺激することによる、Ｔ細胞のエキソビボ増殖は、約８〜９日目より前には優勢的にＴＨ細胞からなるが約８〜９日目より後にはＴ細胞の集団がＴＣ細胞の次第に大きくなる集団を含む、Ｔ細胞の集団を産生する。従って、処置の目的に依存して、優勢的にＴＨ細胞からなるＴ細胞集団を被験体に注入することが、有利であり得る。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットが単離されている場合には、このサブセットをより大きな程度まで増殖することが、有利であり得る。
【００９４】
さらに、ＣＤ４マーカーおよびＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーは、有意に、しかし、大部分において再現可能に細胞増殖プロセスの過程の間、再現可能に変化する。このように、再現可能性によって、特定の目的のための活性化Ｔ細胞産物を作り変える能力が可能になる。
【００９５】
１つのこのような例において、時間とともに再現可能に変化する重要な表現型マーカーには、高い親和性のＩＬ−２レセプター（ＣＤ２５）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４）、およびＣＤ４５ＲＯ（ＴＣＲと優先的に会合することによって、抗原結合に対するＴＣＲの感度を増加し得る分子）がある。当業者が容易に理解するように、このような分子は、種々の理由のために重要である。例えば、ＣＤ２５は、迅速なＴ細胞分裂を可能にするオートクラインループの重要な部分を構成する。ＣＤ１５４は、抗原提示樹状細胞の変異の刺激；抗体産生のためのＢ細胞活性化；ＴＨ細胞増殖の調節；ＴＣ細胞の分化の増強；ＴＨ細胞と抗原提示細胞との両方のサイトカイン分泌の調節；および同時刺激性リガンド（ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ１５４を含む）の発現の刺激において重要な役割を演じることが示されている。
【００９６】
サイトカイン産生は、エキソビボ増殖プロセスの最初の数日においてピークがある。従って、サイトカインがＴ細胞の活性化および機能ならびに免疫応答調節を媒介するのに重要であることが公知であるので、このようなサイトカインは、多分、治療的Ｔ細胞産物（さらなる抗原チャレンジと接触した際に再活性化を受け得る）の発生において重要である。この点において重要なサイトカインとしては、限定しないが、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＴＮＦ−およびＩＦＮ−が挙げられる。従って、最初の数日の増殖の間、Ｔ細胞の集団を得ることおよびこれらの細胞を被験体に注入することによって、さらなる活性化およびＴ細胞の増殖がインビボで生じる治療的利益が生じ得る。
【００９７】
先に議論されるサイトカインおよびマーカーに加えて、Ｔ細胞活性化および免疫応答調節の媒介に重要であることが公知の接着分子の発現はまた、エキソビボ発現プロセスの過程にわたって劇的ではあるが再現可能に変化する。例えば、ＣＤ６２Ｌは、リンパ球組織に対するＴ細胞のホーミングおよび炎症部位へＴ細胞を行き来させる（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）ことに重要である。疾患および損傷についての特定の状況下において、これらの部位における活性化Ｔ細胞の存在は、不利であり得る。ＣＤ６２Ｌの下方調節が活性化に続いて初期に生じるので、Ｔ細胞は、短い期間で増殖され得る。逆に、培養におけるより長い期間は、より高いレベルのＣＤ６２Ｌを有するＴ細胞集団を生成し、従って、他の好ましい条件下において、これらの部位に活性下されたＴ細胞を標的化させるより高い能力を生成する。発現が経時にわたって変化するポリペプチドの別の例は、ＣＤ４９ｄ（炎症の部位の組織空間に血液からリンパ球を行き来させることに関係する接着分子）である。ＣＤ４９ｄに対するＣＤ４９ｄリガンドの結合によってまた、Ｔ細胞がＶＣＡＭ−１またはフィブロネクチンリガンドによる結合を介する活性化および増殖のための同時刺激シグナルを受容し得る。接着分子ＣＤ５４の発現（Ｔ細胞−ＡＰＣ相互作用およびＴ細胞−Ｔ細胞相互作用ならびに炎症部位へのホーミングに関与する）はまた、発現の過程にわたって変化する。従って、Ｔ細胞は、目的のマーカープロフィールと同時である選択された期間の間、刺激され得、引き続いて、収集され、そして注入される。従って、Ｔ細胞集団は、処置される適応症について最大の治療的利益を提供すると考えられるマーカーを発現するように作り変えられ得る。
【００９８】
種々の実施形態において、当業者は、細胞から刺激シグナルを除去することは使用される表面の型に依存するということを理解している。例えば、常磁性のビーズが利用される場合、磁気分離が適した選択肢である。分離技術は、常磁性ビーズ製造説明書（例えば、ＤＹＮＡＬ　Ｉｎｃ．Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）を参照のこと）によって詳細に記載される。さらに、表面が細胞から分離されるのに十分大きいビーズである場合、濾過はまた、用いられ得る。さらに、２０ミクロンおよび８０ミクロンの注入フィルター（Ｂａｘｔｅｒ）を含む、種々の注入フィルターが市販されている。従って、ビーズがフィルターのメッシュサイズより大きい限り、このような濾過は大いに有効である。関連の実施形態において、ビーズは、フィルターを通るが、細胞は残ったままであり、従って、分離を可能にする。
【００９９】
本明細書中で記載される方法において使用される抗体は、ＡＴＣＣのような公的供給源から容易に入手され得るが、Ｔ細胞補助分子に対する抗体およびＣＤ３複合体は標準的技術によって産生され得る。本発明の方法で使用するための抗体を生産する方法論は当該分野で周知であり、以下にさらに詳細に考察される。
【０１００】
（Ｃ．表面上へのリガンドの固定化）
上記のように、本発明の方法は、好ましくは、表面に結合したリガンドを使用する。表面は、そこに結合するかまたはそこに組み込まれるリガンドを有し得、そして生体適合性であり、すなわち、刺激される標的細胞に対して実質的に非毒性である、任意の表面であり得る。生体適合性表面は、生分解性であっても非生分解性であってもよい。表面は、天然であっても合成であってもよく、合成表面はポリマーであり得る。表面は、コラーゲン、精製されたタンパク質、精製されたペプチド、多糖類、グリコサミノグリカン、または細胞外マトリクス組成物を含み得る。多糖類としては、例えば、セルロース、アガロース、デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸、またはアルギネートが挙げられ得る。他のポリマーとしては、ポリエステル、ポリエーテル、ポリ無水物、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリビニルアセテート、ブロックコポリマー、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、またはポリウレタンが挙げられ得る。ポリマーは、乳酸またはコポリマーであり得る。コポリマーは、乳酸およびグリコール酸（ＰＬＧＡ）を含み得る。非生分解性表面としては、ポリ（ジメチルシロキサン）およびポリ（エチレン−ビニルアセテート）のポリマーが挙げられ得る。生体適合性表面としては、例えば、ガラス（例えば、バイオガラス）、コラーゲン、金属、ヒドロキシアパタイト、アルミネート、バイオセラミック材料、ヒアルロン酸ポリマー、アルギネート、アクリルエステルポリマー、乳酸ポリマー、グリコール酸ポリマー、乳酸／グリコール酸ポリマー、精製タンパク質、精製ペプチド、または細胞外マトリクス組成物が挙げられ得る。表面を含む他のポリマーとしては、ガラス、シリカ、シリコン、ヒドロキシアパタイト、ヒドロゲル、コラーゲン、アクロレイン、ポリアクリルアミド、ポリプロピレン、ポリスチレン、ナイロン、あるいは多数のプラスチックまたは合成有機ポリマーなどが挙げられ得る。表面は、生物学的構造（例えば、リポソーム）を含み得る。表面は、脂質、プレート、バック、ペレット、繊維、メッシュ、または粒子の形態であり得る。粒子は、コロイド状粒子、ミクロスフェア、ナノ粒子、ビーズなどを含み得る。種々の実施形態において、ビーズまたは他の粒子のような市販の表面（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｗｅｄｅｎ；ＤＹＮＡＢＥＡＤＳＴＭ、Ｄｙｎａｌ　Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ；ＰＵＲＡＢＥＡＤＳＴＭ、Ｐｒｏｍｅｔｉｃ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が有用である。
【０１０１】
ビーズが使用される場合、このビーズは標的細胞の刺激を達成する任意のサイズであり得る。ある実施形態において、ビーズは好ましくは約５ｎｍ〜５００μｍのサイズである。従って、ビーズサイズの選択はビーズが役立つ特定の使用に依存する。例えば、ビーズが単球欠乏のために使用される場合、単球摂取を容易にするために小さなサイズが選択され（例えば、２．８μｍおよび４．５μｍの直径または吸い込まれ得る任意のサイズ（例えば、ナノメータサイズ））、しかし、濾過によるビーズの分離が所望される場合、５０μｍ以上のビーズサイズが、代表的に使用される。さらに、常磁性ビーズを使用する場合、ビーズは代表的に、約２．８μｍ〜約５００μｍのサイズに及び、より好ましくは約２．８μｍ〜約５０μｍのサイズに及ぶ。最後に、ビーズは、約１０ｎｍ程度の小ささであり得る、超常磁性ナノ粒子を使用するために選択し得る。従って、上記の議論から、実質的に、任意の粒径が、利用され得ることは、容易に明らかとなる。
【０１０２】
薬剤は、当該分野で公知であり、そして利用可能な種々の方法によって、表面に付着もしくは結合、または一体化され得る。この薬剤は、天然のリガンド、タンパク質リガンド、または合成リガンドであり得る。この付着は、共有的もしくは非共有的、電気的、または疎水的であり得、そして例えば、化学的、機械的、酵素的手段、もしくは他の手段を含む種々の付着手段によって達成され得、これにより、リガンドは、細胞を刺激し得る。例えば、第１に、リガンドに対する抗体は、表面に付着され得るか、またはアビジンもしくはストレプトアビジンは、ビオチニル化リガンドに結合するために、表面に付着され得る。このリガンドに対する抗体は、抗イディオタイプ抗体を介して表面に付着され得る。別の実施例は、抗体と結合する表面に付着する、タンパク質Ａもしくはタンパク質Ｇまたは他の非特異的抗体結合分子の使用を含む。あるいは、市販の架橋試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ　ＩＬ）もしくは他の手段を用いた表面への架橋のような化学的方法によって、リガンドが表面に固定され得る。特定の実施形態において、リガンドは表面に共有結合的に結合している。さらに、１つの実施形態において、製造業者の指示に従って、市販のトシル活性化した（ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ）ＤＹＮＡＢＥＡＤＳＴＭまたはエポキシ表面反応基を有するＤＹＮＡＢＥＡＤＳＴＭが目的のポリペプチドリガンドと共にインキュベートされる。簡潔に言うと、このような条件は、代表的に、ｐＨ４〜ｐＨ９．５のリン酸緩衝液中での、４〜３７℃の範囲の温度でのインキュベーションである。
【０１０３】
１つの局面において、特定のリガンドのような試薬は、単一の起点または複数の起点であり得、そして別の局面において、抗体またはそのフラグメントであり得、Ｔ細胞を利用する場合、同時刺激性リガンドは、Ｂ７分子（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２）である。これらのリガンドは、上記の異なる任意の結合手段によって表面に結合される。この表面に結合したＢ７分子は、同時刺激分子を発現する細胞から単離されるか、または標準的な組換えＤＮＡ技術および発現システムを使用して得られ得、これにより、本明細書中に記載されるような同時刺激分子の生成および単離を可能にする。細胞の表面に結合される場合に、Ｔ細胞中の同時刺激シグナルを誘発するための能力を保持するＢ７分子の、フラグメント、変異体または改変体がまた、使用され得る。さらに、当業者は、Ｔ細胞のサブセットの増殖の活性化および誘導に有用な任意のリガンドがまた、ビーズまたは培養容器の表面または任意の表面上で免疫化され得ることを理解する。さらに、リガンドの表面に対する共有結合は、一つの好ましい方法論であるが、第２のモノクローナル抗体による吸着または捕捉がまた、使用され得る。表面に付着する特定のリガンドの量は、この表面がビーズである場合に、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析によって容易に決定され得るか、または例えば、この表面が組織培養ディッシュ、メッシュ、ファイバー、バッグである場合に、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＺＡ）によって決定され得る。
【０１０４】
特定の実施形態において、刺激性の形態のＢ７分子もしくは抗ＣＤ２８抗体またはそれらのフラグメントは、抗ＣＤ３抗体のようなＴＣＲ／ＣＤ３複合体を刺激する薬剤と同じ固相表面に付着される。抗ＣＤ３に加えて、抗原シグナルを模倣するレセプターに結合する他の抗体が使用され得る。例えば、ビーズまたは他の表面は、抗ＣＤ２抗体とＢ７分子との組み合わせで、特に抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８との組み合わせで、コーティングされ得る。
【０１０５】
（Ｄ．試薬）
本発明によって意図される試薬としては、タンパク質リガンド、天然のリガンド、および合成リガンドが挙げられる。細胞表面分子に結合し得る抗原は、特定の条件下で、ライゲーションおよび凝集させシグナル化に導き、これには、レクチン（例えば、ＰＨＡ、レンチルレクチン、コンカナバリンＡ）、抗体、抗体フラグメント、ペプチド、ポリペプチド、グリコペプチド、レセプター、Ｂ細胞レセプター、およびＴ細胞レセプターリガンド、細胞外マトリクス成分、ステロイド、ホルモン（例えば、成長ホルモン、コルチコステロイド、プロスタグランジン、テトラヨードチロシン）、細菌部分（例えば、リポポリサッカリド）、マイトジェン、抗原、スーパー抗原およびその誘導体、成長因子、サイトカイン、ウイルスタンパク質（例えば、ＨＩＶ　ｇｐ−１２０）、接着分子（例えば、Ｌ−セレクチン、ＬＦＡ−３、ＣＤ５４、ＬＦＡ−１）、ケモカイン、および晶分子が挙げられるが、これらに限定されない。この試薬は、細胞、血液産物、および組織のような天然供給源から単離するか、またはインビトロで増殖した細胞から単離するか、または組換え的、もしくは当業者に公知の他の方法によって調製され得る。
【０１０６】
本発明の一つの局面において、Ｔ細胞を刺激することが所望される場合、有用な試薬としては、ＣＤ／ＴＣＲ複合体、ＣＤ２、および／またはＣＤ２８と結合し得るリガンドが挙げられ、それぞれ、活性化または増殖を開始する。従って、用語リガンドは、細胞表面タンパク質にとって「天然の」リガンド（例えば、ＣＤ２８にとってのＢ７分子）であるタンパク質、ならびに細胞表面タンパク質に対する抗体のような人工的なリガンドを含む。このような抗体およびそのフラグメントは、ハイブリドーマ合成、組換えＤＮＡ技術およびタンパク質合成のような従来の技術に従って産生され得る。有用な抗体およびフラグメントは、（ヒトを含む）任意の種から誘導され得るか、または１種よりも多くの種に由来する配列を用いるキメラタンパク質として形成され得る。
【０１０７】
当該分野で公知の方法は、抗体、ポリクローナル抗血清、またはリガンドに対して特異的であるモノクローナル抗体を産生するために使用され得る。抗体はまた、所望の特性を有するように設計された、遺伝子操作された免疫グロブリン（Ｉｇ）またはＩｇフラグメントとして産生され得る。例えば、例示によって、抗体としては、第１哺乳動物種由来の少なくとも１つの可変（Ｖ）領域および第２の明確な哺乳動物種由来の少なくとも１つの定常領域を有する、キメラ融合タンパク質である、組換えＩｇＧが挙げられるが、これに限定されない。ほとんど一般的に、キメラ抗体は、マウス可変領域配列およびヒト定常領域配列を有する。このようなマウス／ヒトキメラ免疫グロブリンは、相補的決定領域（ＣＤＲ）を移植することによって「ヒト化」され得、これにより、マウス抗体からヒト誘導化Ｖ領域フレームワーク領域およびヒト誘導化定常領域に誘導される、抗原に対して特異的な結合を与える。これらの分子のフラグメントは、タンパク質分解性消化によって、または必要に応じて、ジスルフィド結合およびアルキル化の穏やかな還元後のタンパク質分解性消化によって、または組換え遺伝子操作技術によって産生され得る。
【０１０８】
抗体は、約１０４Ｍ−１以上、好ましくは約１０５Ｍ−１以上、より好ましくは１０６Ｍ−１以上、そしてさらにより好ましくは約１０７Ｍ−１以上の親和性定数Ｋａを有するリガンドに特異的に結合する場合に、「免疫特異的」であると定義される。結合パートナーまたは抗体の親和性は、従来の技術（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｔら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　５１：６６０，１９４９）により記載される技術、または表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＬ）により記載される技術）を使用して容易に決定され得る。例えば、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，５３：２５６０−２５６５，１９９３を参照のこと。
【０１０９】
抗体は、一般に、当業者公知の様々な技術のいずれかによって調製され得る（例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１９８８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照のこと）。１つのこのような技術において、動物は、抗原としてのリガンドで免疫されて、ポリクローナル抗血清を生成する。適切な動物としては、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシが挙げられ、そして小哺乳動物種（例えば、マウス、ラットおよびハムスター）が挙げられ得る。
【０１１０】
免疫原は、リガンドを発現する細胞、精製されたかまたは部分的に精製されたリガンドポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメント、あるいはリガンドペプチドからなり得る。リガンドペプチドは、タンパク質分解切断によって生成されるか、または化学的に合成され得る。免疫のためのペプチドは、宿主動物における抗原応答を生成しそうなアミノ酸配列を決定するために、当業者に公知の方法に従って、リガンドの一次構造、二次構造または三次構造を分析することによって選択され得る（例えば、Ｎｏｖｏｔｎｙ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２０１−２０７，１９９１；Ｂｅｒｚｏｋｓｋｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：９３２−４０，１９８５を参照のこと）。
【０１１１】
免疫源の調製は、リガンドポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメント、あるいはペプチドを、別の免疫原性タンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニンまたはウシ血清アルブミン）に共有結合する工程を包含し得る。さらに、このペプチド、ポリペプチドまたは細胞は、アジュバンド中に乳化され得る（Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１９８８ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照のこと）。一般的に、最初の注射の後、動物は、その動物種に好ましいスケジュールに従って、１回以上のブースター免疫を受ける。この免疫応答は、この動物を定期的に出血させ、血清を分離し、そしてこの血清をイムノアッセイ（例えば、オークターロニーアッセイ）で分析して、比抗体価を評価することによってモニタリングされ得る。一旦、抗体価が確立されると、この動物はポリクローナル抗血清を蓄積するために周期的に出血され得る。リガンドポリペプチドまたはペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体は、例えば、タンパク質Ａを使用するか、または適切な固体支持体に結合したリガンドポリペプチドまたはペプチドを使用するアフィニティクロマトグラフィーによって、このような抗血清から精製され得る。
【０１１２】
リガンドポリペプチドまたはそれらのフラグメントもしくは改変体に特異的に結合するモノクローナル抗体は、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの技術（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７，１９７５；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９，１９７６）、およびその改良型を使用して、調製され得る。リガンドポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントに対する所望の特異性を有する抗体を産生する、不死化真核生物細胞株であるハイブリドーマが生成され得る。動物（例えば、ラット、ハムスター、または好ましくは、マウス）は、上記のように調製されたリガンド免疫源で免疫される。免役した動物から得られるリンパ球細胞、最も一般的には、脾臓細胞は、薬物感受性骨髄腫細胞融合パートナーとの融合によって、好ましくは免役した動物と同系のパートナーとの融合によって不死化され得る。脾臓細胞および骨髄腫細胞は、数分間、膜融合促進剤（例えば、ポリエチレングリコールまたは非イオン性界面活性剤）と合わせられ、次いで、骨髄腫細胞ではなく、ハイブリドーマ細胞の増殖を支持する選択培地上に、低密度でプレートされる。好ましい選択培地は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）である。十分な時間（通常は、約１〜２週間）の後、細胞のコロニーを観察する。単一のコロニーを単離し、そしてこの細胞により産生される抗体を、リガンドポリオペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントに対する結合活性について試験し得る。このリガンド抗原に対して高い親和性および特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマが好ましい。リガンドポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、本発明によって企図される。
【０１１３】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培地の上清から単離され得る。マウスモノクローナル抗体の産生のための代替の方法は、ハイブリドーマ細胞を同系マウスの腹腔に注射することである。このマウスは、モノクローナル抗体を含有する腹水を産生する。不純物を従来の技術（例えば、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈殿または抽出）によって、この抗体から除去し得る。
【０１１４】
ヒトモノクローナル抗体は、多数の技術によって生成され得る。方法には、ヒト血液細胞のエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）形質転換（例えば、米国特許第４，４６４，４５６号）、ヒトＢ細胞のインビトロ免疫（例えば、Ｂｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６−９５，１９９１）、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有する免役したトランスジェニックマウス由来の脾臓細胞の融合、および酵母人工染色体（ＹＡＣ）により挿入された免疫グロブリン遺伝子を保有する免役したトランスジェニックマウス由来の脾臓細胞の融合（例えば、米国特許第５，８７７，３９７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：４５５−５８，１９９７；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５２５−３５，１９９５を参照のこと）、またはヒト免疫グロブリンＶ領域ファージライブラリからの単離が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１５】
本発明で使用するためのキメラ抗体およびヒト化抗体が生成され得る。キメラ抗体は、第１の哺乳動物種由来の少なくとも１つの不変領域ドメインおよび第２の異なる哺乳動物種由来の少なくとも１つの可変領域ドメインを有する（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−５５，１９８４を参照のこと）。最も一般的には、キメラ抗体は、非ヒトモノクローナル抗体由来の少なくとも１つの可変領域ドメイン（例えば、マウス、ラット、またはハムスターモノクローナル抗体由来の可変領域）をコードするポリヌクレオチド配列を、少なくとも１つのヒト不変領域をコードする配列を含むベクターにクローン化することによって構築され得る（例えば、Ｓｈｉｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４５９−７６，１９８９；Ｗａｌｌｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２９２１−２９，１９９３を参照のこと）。選択されたヒト不変領域は、特定の抗体に所望されるエフェクター機能に依存し得る。キメラ抗体を生成するための当該分野で公知の別の方法は、相同組換えである（米国特許第５，４８２，８５６号）。好ましくは、ベクターは、キメラ抗体の安定な発現のために、真核生物細胞にトランスフェクトされる。
【０１１６】
非ヒト／ヒトキメラ抗体は、さらに遺伝子操作されて、「ヒト化」抗体を生成し得る。このような抗体は、非ヒト哺乳動物種の免疫グロブリン由来の複数のＣＤＲ、少なくとも１つの可変フレームワーク領域、および少なくとも１つのヒト免疫グロブリン定常領域を有する。ヒト化が、非ヒトモノクローナル抗体またはキメラ抗体と比較した場合、減少した結合親和性を有する抗体を生じ得る。従って、当業者は、ヒト化抗体を設計するために１つ以上のストラテジーを使用する。
【０１１７】
特定の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントの使用が好ましくあり得る。このようなフラグメントは、ＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントを含み、これらは、それぞれ、パパインまたはペプシンでのタンパク質分解性消化によって調製され得る。この抗原結合フラグメントは、例えば、固定化されたプロテインＡまたは固定化されたリガンドペプチド、あるいはその改変体またはフラグメントを使用して、アフィニティクロマトグラフィーによって、Ｆｃフラグメントから分離され得る。Ｆａｂフラグメントを生成するための代替の方法は、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントンの穏やかな還元、続くアルキル化を含む。（例えば、Ｗｅｉｒ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｏｓｔｏｎを参照のこと）。
【０１１８】
上記のＩｇ分子のいずれかの非ヒト、ヒト、またはヒト化重鎖および軽鎖可変領域は、単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）フラグメント（単鎖抗体）として構築され得る。例えば、Ｂｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４２：４２３−４２６，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：５８７９−５８８３，１９８８を参照のこと。多機能性融合タンパク質が、ｓＦｖをコードするヌクレオチド配列を、インフレームで、種々のエフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に連結することによって生成され得る。これらの方法は、当該分野で公知であり、そして例えば、ＥＰ−Ｂ１−０３１８５５４、米国特許第５，１３２，４０５号、米国特許第５，０９１，５１３号、および米国特許第５，４７６，７８６号に開示される。
【０１１９】
リガンドポリペプチドあるいはその改変体またはフラグメントに特異的に結合する抗体を選択するためのさらなる方法は、ファージディスプレイによる（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら，Ａｎｎｕｌ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−５５，１９９４；Ｂｕｒｔｏｎら，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７：１９１−２８０，１９９４を参照のこと）。ヒトまたはマウス免疫グロブリン可変領域遺伝子コンビナトリアルライブラリーは、リガンドタンパク質あるいはその改変体またはフラグメントに特異的に結合するＩｇフラグメント（Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖまたはそのマルチマー）を選択するためにスクリーニングされ得るファージベクターにおいて作製され得る（例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４６：１２７５−８１，１９８９；Ｋａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８：４３６３−６６，１９９１；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１−３８８，１９９２；Ｓｃｈｌｅｂｕｓｃｈら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　１６：４７−５２，１９９７、ならびにそこに引用される参考文献を参照のこと）。
【０１２０】
（細胞集団）
上に議論されたように、本発明は、結合に所望される細胞表面部分を有する任意の細胞型への広い適用可能性を有する。この点に関して、多くの細胞シグナル伝達事象が本発明の方法によって増強され得る。このような方法論は、エキソビボ設定において、治療的に使用されて、患者への注入のために細胞を活性化および刺激し得るか、またはインビボで使用して、標的細胞集団に対する細胞シグナル伝達事象を誘導し得る。しかし、また上記のように、本明細書中に提供される典型的な実施例は、Ｔ細胞に関するが、それに限定されない。
【０１２１】
Ｔ細胞に関して、本明細書中に記載される種々の拡張した方法論から生じるＴ細胞集団は、使用される条件に依存して、種々の特定の表現型特性を有し得る。このような表現型特性は、ＣＤ２５、ＣＤ１５４、ＩＦＮ−およびＧＭ−ＣＳＦの増加した発現、ならびにＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＣＤ６２Ｌ、およびＣＤ４９ｄの変更された発現を含む。これらの部分の発現を示差的に制御する能力は、非常に重要であり得る。例えば、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、単球、および白血病性Ｂ細胞またはリンパ腫でさえ）上で発現されるＣＤ４０分子との接触を介して、より高いレベルの、「調節されたＴ細胞（ｔａｉｌｏｒｅｄ　Ｔ−ｃｅｌｌ）」でのＣＤ１５４の表面発現は、抗原提示および免疫応答を増強する。このようなストラテジーは、現在、抗体または組換えＣＤ４０Ｌを介してＣＤ４０を結合するために、種々の企業によって使用されている。本明細書中に記載されるアプローチは、この同じシグナルが、より生理学的な様式で、例えば、Ｔ細胞によって、送達されることを可能にする。Ｔ細胞活性化（ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ）プロセスを調節することによるＩＦＮ分泌を増加させる能力は、抗腫瘍および抗ウイルス応答に重要な、ＴＨＩ型免疫応答の生成を促進することを助け得る。ＣＤ１５４と同様に、ＧＭ−ＣＳＦの増加した発現は、特に、より機能的なコンピテントＡＰＣ（樹状細胞）へのＡＰＣ前駆体の成熟を促進することに対する効果を介して、ＡＰＣ機能を増強するように機能し得る。ＣＤ１３７およびＣＤ１３４の発現を変更することは、アポトーシスシグナルに耐性であるか、またはアポトーシスシグナルに感受性であるＴ細胞の能力をもたらし得る。接着／ホーミングレセプター（例えば、ＣＤ６２Ｌおよび／またはＣＤ４９ｄ）の発現を制御することは、リンパ系器官、感染部位、または腫瘍部位に向かう注入されたＴ細胞の能力を決定し得る。
【０１２２】
本発明のさらなる局面は、増殖の前に、Ｄ８＋またはＣＤ４＋が枯渇したＴ細胞集団または組成物を提供する。１つの実施形態において、ＣＤ８＋細胞は、ＣＤ８＋マーカーに指向する抗体によって枯渇される。当業者は、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋のサンプルの枯渇あるいは逆にＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞含量を増加させるための、種々の特定の方法論を容易に同定し得る。ＣＤ４＋細胞の増加に関して、本発明の１つの局面は、Ｔ細胞集団の刺激の際に、極端に健全なＣＤ１５４発現プロフィールの同定に焦点が当てられ、ここで、Ｔｃ（ＣＤ８＋）が枯渇されている。上に示したように、ＣＤ１５４は、重要な免疫調節分子であり、その発現は、免疫応答を増幅する際に、極端に有益である。従って、ＣＤ１５４発現の増加は、より有効なＴ細胞組成物を導くようである。
【０１２３】
本発明のＴ細胞集団の表現型特性は、当業者に公知である標準的なフローサイトメトリー法およびＥＬＩＳＡ法を含む、種々の方法によってモニタリングされ得る。
【０１２４】
当業者は、本明細書中に記載される細胞刺激方法論が、種々の環境（すなわち、容器）で、実施され得ることを容易に理解する。例えば、このような容器は、特に、滅菌環境中の、培養フラスコ、培養バックまたは細胞を保持し得る任意の容器であり得る。本発明の１つの実施形態において、バイオリアクターがまた、有用である。例えば、いくつかの製造業者が、現在、細胞を増殖するために使用され得、そして本発明の方法と組合せて使用され得るデバイスを作製する。例えば、Ｃｅｌｄｙｎｅ　Ｃｏｒｐ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ；Ｕｎｉｓｙｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ；Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ，Ｉｎｃ．Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ；Ａａｓｔｒｏｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ，ＭＩ；Ｗａｖｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　ＬＬＣ，Ｂｅｄｍｉｎｓｔｅｒ，ＮＪを参照のこと。さらに、このようなバイオリアクターをカバーする特許としては、米国特許第６，０９６，５３２号；同第５，９８５，６５３号；同第５，８８８，８０７号；同第５，１９０，８７８号（これらは、本明細書中で参考として援用される）が挙げられる。
【０１２５】
（使用方法）
上記の方法に加えて、本明細書中に記載される方法によって刺激および／または活性化される細胞は、種々の状況において利用され得る。Ｔ細胞の模範的な例に関して、本明細書中に記載される方法論は、感染性の疾患、癌の処置、および免疫療法での使用のためのＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、またはＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞集団の選択的な増殖のために使用され得る。結果として、表現型的に独特なＴ細胞集団（これは、抗原反応性についてはポリクローナルであるが、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかに関しては本質的に同質である）が産生され得る。さらに、この方法は、個体の総ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞集団の再構成に十分な数で、Ｔ細胞集団の増殖を可能にする（個体におけるリンパ球集団は、約１０１１である）。得られるＴ細胞集団はまた、遺伝的に形質導入され得、そして免疫療法のために使用されるか、または感染因子のインビトロ分析方法において使用され得る。例えば、腫瘍浸潤リンパ球の集団は、癌に罹患した個体および十分な数まで増殖するために刺激されたＴ細胞から得られ得る。得られるＴ細胞集団は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）または他のタンパク質を発現するために遺伝的に形質導入され得、そして個体に与えられる。
【０１２６】
本発明のＣＤ４＋Ｔ細胞集団についての１つの特定の使用は、個体におけるＨＩＶ感染の処置である。ＨＩＶでの長期の感染は、最終的にＣＤ４＋Ｔリンパ球の数における顕著な減少を生じる。次に、この減少は、顕著な免疫欠損状態を引き起こし、生命を脅かす多くの日和見感染症に対して患者を感受性にする。正常なレベルへのＣＤ４＋Ｔ細胞の数の補充は、有意な程度まで免疫機能を回復することが予期され得る。したがって、本明細書中に記載される方法は、ＨＩＶに感染した患者において、この集団を再構成するために十分な数までＣＤ４＋Ｔ細胞を選択的に増殖するための手段を提供する。長期の刺激の間のＴ細胞の感染を回避することもまた必要であり得るか、またはＨＩＶ感染に対してＴ細胞を持続的に耐性にすることが望ましくあり得る。感染した個体にＴ細胞を回復する前に、Ｔ細胞をＨＩＶ感染に対して耐性にするか、またはウイルスを産生できないようにするかのいずれかを行い得る多くの技術が存在する。例えば、１つ以上の抗レトロウイルス剤は、ＨＩＶの複製またはウイルスの産生を阻害するために、増殖の前にＣＤ４＋Ｔ細胞と共に培養され得る（例えば、ウイルスの仕組み（ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）の逆トランスクリプターゼおよび／または他の成分を標的化する薬物。例えば、Ｃｈｏｗら，Ｎａｔｕｒｅ　３６１：６５０−６５３，１９９３を参照のこと）。
【０１２７】
いくつかの方法が、ＨＩＶの感染または複製を阻害する分子を生成するためにＴ細胞を遺伝的に形質導入するために使用され得る。例えば、種々の実施形態において、Ｔ細胞は、トランス優性（ｔｒａｎｓｄｏｍｉｎａｎｔ）インヒビター、「囮分子（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｄｅｃｏｙ）」、アンチセンス分子、または毒素を産生するために、遺伝的に形質導入され得る。このような方法論は、米国特許出願第０８／２５３，７５１号、同第０８／２５３，９６４号、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ　９５／３３８２３（これらは、その全体において本明細書中に参考として援用される）においてさらに詳細に記載される。
【０１２８】
抗原特異的Ｔ細胞の集団を刺激および増殖するための方法は、被験体へのＴ細胞の投与の際に免疫応答を上方制御すること（例えば、応答の誘導または既存の応答の増大）が所望される治療的状況において有用である。例えば、この方法は、腫瘍関連抗原に対するＴ細胞応答を増大するために使用され得る。被験体由来の腫瘍細胞は、代表的に腫瘍関連抗原を発現するが、Ｔ細胞における同時刺激シグナルを刺激できないかもしれない（例えば、これらが同時刺激分子の発現を欠くため）。したがって、腫瘍細胞は、被験体由来のＴ細胞とインビトロで接触され得、そして抗原特異的Ｔ細胞が本発明の方法に従って増殖され、そしてＴ細胞が被験体に戻される。
【０１２９】
従って、１つの実施形態において、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）およびＢ細胞慢性リンパ球白血病（Ｂ−ＣＬＬ）のような悪性疾患が処置され得る。増殖したＴ細胞を使用する初期の研究が、ＮＨＬにおいて試験されてきたが（Ｌｉｅｂｏｗｉｔｚら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃ．１０：５３３−５４１，１９９８を参照のこと）、本発明のＴ細胞集団は、増加した移植（おそらく、ＣＤ２８シグナルの刺激によって供給される）および反応性を提供することによって、免疫療法の成功を劇的に増大し得る独特の表現型特徴を提供する。しかし、Ｂ−ＣＬＬを有する患者は、特別な困難（全身的なＴ細胞免疫抑制を伴なう末梢血における高い白血病細胞負荷での、比較的少ないＴ細胞数を含む）を示す。本発明のＴ細胞集団は、この疾患の処置において、特に幹細胞（ＣＤ３４＋）移植治療と組合される場合に、劇的に改善された効力を提供し得る。従って、抗ＣＤ３×抗ＣＤ２８同時固定ビーズを用いる、増加するＴ細胞機能および抗ＣＬＬ　Ｔ細胞活性は、有利である。
【０１３０】
例えば、Ｂ−ＣＬＬ患者のＴ細胞でのＣＤ１５４（ＣＤ４０についてのリガンド）の不完全な発現が、疾患の主要な免疫学的欠損として言及されると仮定すると、本発明のＴ細胞集団（これは、再注入の際に、維持された高レベルのＣＤ１５４発現を提供し得る）は、その処置において補助し得る。研究者らは、ＣＬＬにおいて、白血病Ｂ細胞がＣＤ８０およびＣＤ８６を発現する能力と同様に、患者のＴ細胞がＣＤ１５４を発現する能力が不完全であることを報告する。ＣＬＬにおける白血病Ｂ細胞によるＣＤ２８についてのリガンドの適切な発現の失敗は、腫瘍応答性Ｔ細胞の完全な活性化の失敗を生じ得、従って、Ｔ細胞の見かけ上の寛容状態の根底にある機構を示し得る。溶解性抗ＣＤ４０抗体を介してかまたはＣＤ１５４で形質導入された白血病Ｂ細胞を介してかのいずれかで、ＣＤ４０がＣＬＬ　Ｂ細胞に係合される研究は、ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現における欠損を補正し、そしてＭＨＣ表面発現を上方制御するようである。Ｋａｔｏら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：１１３３−１１４１，１９９８；ＲａｎｈｅｉｍおよびＫｉｐｐｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：９２５−９３５，１９９３。このようにして処置される細胞は、特異的なＴ細胞の抗腫瘍応答を刺激することが可能であった。
【０１３１】
本発明のＴ細胞集団の表面上のＣＤ１５４の増強された発現に関して、このようなＴ細胞は、自己Ｂ−ＣＬＬ細胞と相互作用することが予想され、従って、ＭＨＣ、ＣＤ８０、およびＣＤ８６の発現を駆動することによって腫瘍の免疫原性を増加する。これは次に、強力な抗腫瘍応答を導くはずである。さらに、当業者は、本発明のエキソビボ拡大されたＴ細胞を用いた患者の処置が従来の癌治療（例えば、化学療法）と組み合わされ得ることを容易に理解する。この点に関して、例えば、患者は、フルダラビンまたはカンパス（ｃａｍｐａｔｈ）のような薬剤を用いて処置され、続いて、本発明のＴ細胞集団または両方で注入され得る。
【０１３２】
あるいは、Ｔ細胞は、本明細書中に記載されるように刺激され拡大されて、病原性因子（例えば、ウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス）、細菌、寄生虫および真菌）に対する応答性を誘導または増強し得る。
【０１３３】
本発明はさらに、Ｔ細胞の混合集団からＴ細胞の特定の亜集団を選択的に拡大するための方法を提供する。詳細には、本発明は、かなり高い割合のＣＤ４＋およびＣＤ８＋二重ポジティブＴ細胞を有する特異的に富化されたＴ細胞集団を提供する。
【０１３４】
本発明の別の実施形態は、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団からＴＨ１細胞集団を選択的に拡大するための方法を提供する。この方法において、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ２８抗体（例えば、モノクローナル抗体９．３）を用いて同時刺激され、ＴＨ１特異的サイトカイン（ＩＦＮ−γを含む）の分泌を誘導し、ＴＨ２細胞を超えたＴＨ１細胞の富化をもたらす。
【０１３５】
活性化Ｔ細胞の表現性特性が拡大プロセスの間の長い間に変化するという本明細書中における観察は、Ｔ細胞が数時間内に活性化されることが実証された事実と合わせられた（Ｉｅｚｚｉら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　８：８９−９５、１９９８）。従って、本明細書中に記載される方法論と組合わせて、これは、短い期間にあつらえのＴ細胞集団のサブセットを拡大する能力を提供する。１つの実施形態において、この技術は、腎臓透析の使用に類似して、被験体のベッドの側で、外来患者の様式で、または被験体の自宅において利用され得る。例えば、Ｔ細胞が活性化シグナル（例えば、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体など）と接触してインキュベートされ、そして連続した流れにおいて即座に患者に戻されるか、または数時間の拡大期間の後に患者に戻される、方法およびデバイス。１つの局面において、このような拡大技術は、フィルター成分を有する孤立したチャンバを使用し得、その結果、３×２８のビーズまたは同様にコーティングされた微粒子が、血液／濃縮細胞の連続した流れと混合される。別の実施形態において、装置内の固体表面は、抗体または他の成分と直接的（共有結合的を含む）または間接的（例えば、ストレプトアビジン／ビオチンなど）にコーティングまたは刺激されて、Ｔ細胞の活性化および拡大を刺激し得る。例えば、血液／細胞の収集デバイスおよび／または使い捨てデバイス（これは、被験体に細胞を戻す前のＴ細胞活性化に必要とされるレセプターを刺激するための２つ以上の固定された抗体（例えば、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体）または他の成分を含む）を介した患者からの連続した流体経路が、使用され得る（プラスチック表面上に固定されるかまたは分離可能な微粒子に固定される）。このようなシステムは、既存の製造業者らの使い捨てのセットと合体されたかまたはまたは製造業者らの使い捨てセットに対して適応させた、滅菌の使い捨てセットを備える白血球除去血輸血装置を含み得る（例えば、抗体／活性化成分が固定／含有される表面プラットフォームは、アフェレーシスの間の末梢血単核球の収集のためのバッグ／容器内にある）。さらに、固体表面／表面プラットフォームは、デバイスチャンバのうちの１つに挿入される取り外し可能な挿入物の一部であり得るか、または使い捨て成分の１つの内に物理的に存在する。上記の連続的な流れの局面の別の実施形態において、このシステムは、患者への流路と連続して据え付けられた血液収集デバイス内のチャンバまたはインキュベーションチャンバを用いて、室温または生理学的温度において、細胞を活性化成分と接触させることを含み得る。
【０１３６】
別の例において、血液は、患者から直接的に独立型の使い捨てデバイスに引かれ、このデバイスは、細胞を被験体へ投与する前にＴ細胞活性化に必要とされるレセプターを刺激するための２つ以上の固定された抗体（例えば、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体）または他の成分（例えば、プラスチック表面上に固定されるかまたは分離可能な微粒子に固定される）を含む。１つの実施形態において、使い捨てのデバイスは、シリンジおよび滅菌合体デバイスとの結合／合体に適した適切な管の接続を有する容器（例えば、プラスチックバッグ、またはフラスコ）を含み得る。このデバイスは、Ｔ細胞活性化成分（例えば、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体）の固定のための固体表面を含み；これらは、容器自体の表面であり得るかまたは挿入物であり得、そして代表的には平らな表面、エッチングされた平らな表面、不規則な表面、多孔性パッド、繊維、パッド、繊維、臨床的に受容可能／安全な鉄流体（ｆｅｒｒｏ−ｆｌｕｉｄ）、ビーズなどである。さらに、独立型のデバイスを使用する場合、被験体は、デバイスに接続されたままであり得るか、またはこのデバイスは、患者から離され得る。さらに、このデバイスは、室温で利用され得るか、または移動式インキュベーターを用いて生理学的温度でインキュベートされ得る。
【０１３７】
血液および血液産物を収集および処理するためのデバイスおよび方法は周知なので、当業者は、本明細書中に提供される教示を考慮すれば、上記の必要性を満たす種々のデバイスが容易に設計され得るかまたは既存のデバイスを改変し得ることを容易に認識する。従って、このようなデバイスおよび方法は本明細書中に示される特定の実施形態によって限定されないので、無菌性を維持し得、そして補体の活性化が減少される流体形態の血液を維持する任意のデバイスまたは方法論を含み得、そしてここで、Ｔ細胞活性化に必要な成分（例えば、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体またはこれらに対するリガンド）は、被験体への投与前に固定されるか、または血液もしくは血液産物から分離され得る。さらに、当業者が容易に理解し得るように、種々の血液産物が、本明細書中に記載のデバイスおよび方法と組合わせて利用され得る。例えば、この方法およびデバイスは、融解の際および被験体投与の前の、低温保存された全血、末梢血単核急、他の低温保存された血液由来細胞、または低温保存されたＴ細胞株の由来のＴ細胞の迅速な活性化を提供する。別の例において、この方法およびデバイスは、被験体への投与前に、事前にエキソビボ拡大されたＴ細胞産物の活性をブーストするために使用され得、このようにして、高く活性化されたＴ細胞産物を提供する。最後に、容易に理解されるように、上記の方法およびデバイスは、被験体およびドナーの同時の自家細胞治療または同種細胞治療のために利用され得る。
【０１３８】
本発明の方法はまた、ワクチンと合わせて利用され得て、抗原の反応性を増大し、そしてインビボでの効果を増大する。さらに本発明により増大したＴ細胞が、体内において、相対的に長い半減期を有する場合、これらの細胞は、目的の所望される核酸配列を送達し、そして癌、疾患、または感染部位に潜在的に帰巣することによって、遺伝子治療のための完璧なビヒクルとして機能し得る。したがって、本発明によって増大される細胞は、ワクチン、１つ以上のサイトカイン、１つ以上の治療抗体などとの組み合わせにおいて患者に送達され得る。実質的に、より強力なＴ細胞集団によって得られる任意の治療は、本明細書に記載される使用方法の文脈に含まれる。
【０１３９】
（薬学的組成物）
標的細胞集団（例えば、本発明のＴ細胞集団）は、単独でかあるいは、希釈剤および／または他の成分（例えば、ＩＬ−２または他のサイトカイン）または細胞集団との組み合わせの薬学的組成物のいずれかで投与され得る。手短に言えば、本発明の薬学的組成物は、１つ以上の薬学的または生理学的に受容可能なキャリア、希釈剤もしくは賦形剤と組み合わせて、本明細書中で記載する標的細胞集団を含み得る。そのような組成物は、緩衝剤（例えば、中性の緩衝化生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水など）；糖質（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール）；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸（例えば、グリシン）；抗酸化剤；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および防腐剤を含み得る。本発明の組成物は、好ましくは静脈内投与のために処方される。
【０１４０】
本発明の薬学的組成物は、処置される（または予防される）べき疾患に適切な様式で投与され得る。適切な投与量は、臨床試験によって決定され得るとは言え、投与の量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の型および重篤度などの因子によって決定される。
【０１４１】
本明細書中で言及される参考文献はすべて、その全体が本明細書により参考として援用される。さらに、本明細書において利用される全ての数値域は、その特定の数値域の範囲および選択において、全ての整数値を明白に含み、特定の使用に依存して、その範囲が考慮される。さらに、以下の実施例が例示として提供され、これらは限定として提供されるのではない。
【０１４２】
（実施例）
（実施例１）
（Ｔ細胞の刺激）
本明細書に記載される特定の実験において、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＴＭとよぶプロセスを利用した。簡単に言えば、この方法は、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥＤ　Ｔ細胞を末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）アフェレーシス産物から製造した。医療現場において患者から収集した後、ＰＢＭＣアフェレーシスを洗浄し、次いで「コートされていない」ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０　Ｅｐｏｘｙ　Ｔとともに、インキュベートした。この間に、単球のような食細胞はビーズを貪食する。インキュベーションの後、細胞およびビーズを、ＭａｘＳｅｐ　Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｓｅｐａｒａｔｏｒ上で処理して、ビーズおよびビーズに結合していたいずれの単球／食細胞も除く。この単球−除去の工程に続いて、全体で５×１０８のＣＤ３＋Ｔ細胞を含む容積を取り、そして１．５×１０９ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０　ＣＤ３／ＣＤ２８　Ｔを用いて調製して、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥＴＭのプロセス（ビーズとＴ細胞の比が約３：１）を開始する。次いで細胞とＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０　ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔの混合物を３７℃、５％二酸化炭素の下で約８日間インキュベートし、第１の注入のためのＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥＤ　Ｔ細胞を生産する。単球除去されたＰＢＭＣの残りを、第２またはさらなる細胞生産の増大（約２１日後）まで凍結保存し、この時にそれらを、解凍し、洗浄し、次いで全体で５×１０８のＣＤ３＋Ｔ細胞を含む容積を取り、そして１．５×１０９ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０　ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔと調製して、第２の注入のためのＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥプロセスを開始する。３７℃、５％二酸化炭素の下での約８日間インキュベション期間の間に、ＣＤ３＋Ｔ細胞が活性化され、増大する。抗ＣＤ３ｍＡｂ（ＯＫＴ３）は、Ｏｒｔｈｏ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．（Ｒａｒｉｔａｎ、ＮＪ）から得られ、そして抗ＣＤ２８ｍＡｂ（９．３）は、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ　Ｓｑｕｉｂｂ（Ｓｔａｍｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ）から得られる。
【０１４３】
ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩＴＭとよばれる改変プロセスを用いて、上に記載されるプロセスは、いくつかの改変とともに利用され、ここで、別個の単球を除去する工程は利用されず、特定のプロセスにおいて、細胞を、ビーズとの最初の接触前に、凍結した後、そしてさらに、濃縮および刺激を実施した（図５Ａおよび図５Ｂを参照）。このプロセスの１つのバージョンにおいて、Ｔ細胞をアフェレーシスによって、ドナーまたは患者の循環血から得られた。アフェレーシス産物の成分は、典型的には、リンパ球、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核細胞（白血球）、赤血球、および血小板を含む。典型的なアフェレーシス産物は、１〜２×１０１０有核細胞を含む。これらの細胞をカルシウム不含、マグネシウム不含のリン酸緩衝化生理食塩水を用いて洗浄して、血漿タンパク質および血小板を除く。洗浄工程は、細胞を遠心分離し、上清液を除き、次いでＰＢＳに置換することによって実施した。このプロセスを、半自動化「貫流」遠心分離（ＣＯＢＥ　２９９１　Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂａｘｔｅｒ）を用いて達した。細胞は、それらを処理するような閉鎖系内に維持する。
【０１４４】
非結合細胞（単球（活性化細胞に富んでいる）を含む）を減少させ、次いで刺激を継続することによって、細胞を、さらに処理し得る。あるいは、洗浄細胞を、凍結し、保存し、後に処置し得るが、増殖の強さを増加することおよび顆粒球を減少することが、本明細書において実証される。１つの例は、細胞を凍結するため、細胞の３５ｍｌ懸濁液を２５０ｍｌのＣｒｙｏｃｙｔｅ凍結バッグ中に３５ｍｌの凍結溶液と共に置く。３５ｍｌ細胞懸濁液は、典型的には、ＰＢＳ中に３．５×１０９〜５．０×１０９細胞を含む。等量の凍結溶液（ＰＢＳ中、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミン）を加える。細胞は最終濃度５０×１０６細胞／ｍｌである。Ｃｒｙｏｃｙｔｅバッグは、３０〜７０ｍｌの範囲の容量を含み得、そして細胞濃度は、１０〜２００×１０６細胞／ｍｌの範囲であり得る。一旦、Ｃｒｙｏｃｙｔｅバッグに細胞および凍結溶液を充填すると、バッグを、速度を調節された冷凍庫に置いて、そして細胞を、１℃／分で−８０℃まで下げて凍結する。次いで、凍結細胞を、液体窒素保存システムに必要なときまで置く。
【０１４５】
細胞を、液体窒素保存システムから取りだし、そして３７℃において解凍する。次いでＤＭＳＯを除くため、解凍した細胞をＣＯＢＥ２９９１システム上でカルシウム不含、マグネシウム不含のＰＢＳを用いて洗浄する。次いで洗浄した細胞を、８０ミクロンメッシュフィルターに通す。
【０１４６】
解凍した細胞（約０．５×１０９のＣＤ３＋細胞）を、１００ｍｌのカルシウム不含、マグネシウム不含のＰＢＳを含んだプラスチック製１Ｌ　Ｌｉｆｅｃｅｌｌバッグに置く。このＰＢＳは、１％〜５％のヒト血清を含む。１．５×１０９ＣＤ３×ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ−４５０）もまた細胞と共にバッグに置く（３：１　ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ　Ｍ−４５０　ＣＤ３／ＣＤ２８　Ｔ：ＣＤ３＋　Ｔ細胞）。ビーズと細胞を約３０分間１ＲＰＭ（回転して循環する）で室温で混合する。ビーズと細胞を含むバッグをＭａｘＳｅｐ　Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｎｅｘｅｌｌ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡｂ）上に配置する。バッグとＭａｘＳｅｐの間にプラスチックスペーサー（約６ｍｍ厚）を配置する。（磁力を増大させるためには、スペーサーを除く。）ＰＢＳおよび非結合細胞は、排出されるが、ビーズとビーズに付着した任意の細胞が磁石に保持される。
【０１４７】
ＣＤ３×ＣＤ２８ビーズおよびビーズに結合した濃縮された細胞は、細胞培養培地（Ｘ−Ｖｉｖｏ　１５を含む１Ｌ、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ；熱非働化されたプールされたヒト血清５０ｍｌ、１Ｍ　Ｈｅｐｅｓ　２０ｍｌ、２００ｍＭ　Ｌ−グルタミン１０ｍｌの添加、約１００，０００Ｉ．Ｕ．のＩＬ−２の添加また不添加）を用いて３Ｌ　Ｌｉｆｅｃｅｌｌ培養バッグ中にリンスされる。ＣＤ３×ＣＤ２８ビーズおよびポジティブに選択された細胞をＬｉｆｅｃｅｌｌバッグに移した後、培養培地をバッグが１０００ｍｌを含むまで加える。細胞を含むバッグをインキュベーター（３７℃および５％ＣＯ２）に置き、そして細胞を増大させる。
【０１４８】
細胞を３日および５日毎に、１つから４つに分割する。培養の３日後および８日後に、細胞を収集してＴ細胞活性化および増殖を測定した。Ｔ細胞の活性化を、細胞のサイズ、細胞表面メーカー（特に、培養３日目におけるＣＤ２５およびＣＤ１５４の発現）の発現レベル、を測定することによって評価した。８日目において、細胞をＭａｘＳｅｐ磁石上における引力の下で流して（約１５０ｍｌ／ｍｉｎ）、磁石粒子除き、そして上に記載のＣＯＢＥ装置を用いて細胞を洗浄および濃縮し、そして静脈内投与に適した平衡化電解質溶液（例えば、Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ　Ａ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））に再懸濁する。
【０１４９】
本明細書中に記載されるように、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＴＭは、上記のものと類似の状態をいうが、ただし、刺激および濃縮を行わず、かつ単球欠失を刺激前に行った場合を除く。
【０１５０】
ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＴＭプロセスおよびＩＩＴＭプロセス両方を行い、そしてＴ細胞増殖を培地中での８日後に測定した。拡大したＴ細胞の収率は、細胞培養前にＣＤ３＋細胞を濃縮した場合よりも高かった（表１参照）。さらに、この細胞集団は９０％ＣＤ３＋細胞より多くを有した。
【０１５１】
【表１】
Figure 2004500095
さらなる実験をこの点について行い、そして拡大した細胞の総数、ならびにＣＤ３＋濃縮なしで刺激した細胞の９つのバッチおよびＣＤ３＋濃縮して刺激した細胞の５つのバッチのひだ（ｆｏｌｄ）拡大を表す（図１および図２を参照）。
【０１５２】
培養前に、磁力の適用によって細胞を濃縮することは、ＣＤ３＋細胞の純度およびＣＤ１５４レベルを効率的に増加させる（表２、図３および４はＣＤ１５４レベルを図解的に表す）。さらに、Ｔ細胞の集団を異なる強度の磁石に曝す場合、Ｔ細胞増殖の比較は、より強い磁石での曝露がより高いＣＤ３＋細胞の収率を得ることを示した（表２）。
【０１５３】
【表２】
Figure 2004500095
Figure 2004500095
５つのさらなる実験を行い、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＴＭプロセスをＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩＴＭプロセスと比較した。これら２つのプロセスによって活性化した細胞および拡大した細胞について、培養の３日目および８日目の細胞活性マーカー（細胞サイズ、ＣＤ２５発現およびＣＤ１５４発現）を以下の表３および図６〜７に示す。
表３：３日目における細胞活性化マーカー
【０１５４】
【表３】
Figure 2004500095
凍結／解凍された細胞を使用して、表３中の全ての培養を開始した。
【０１５５】
表３および図６〜７中のデータは、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩＴＭプロセスが細胞（３日目における細胞の大きさおよびＣＤ２５発現活性化マーカーが平均で類似してしているが、刺激の代表的に直後により高くかつより高くなり続ける細胞）を生成したことを示す。しかしながら、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩＴＭプロセスからのＴ細胞に対する３日目におけるＣＤ１５４活性化マーカーは、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＴＭプロセスからのＴ細胞のものに対するＣＤ１５４活性化マーカーよりも非常に大きかった。さらに、上記に示されるように、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩＴＭプロセスは、各ドナーで一貫して他の方法よりも高いＣＤ２５およびＣＤ１５４レベルを生成した。
【０１５６】
ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩＴＭプロセスの３日目におけるＣＤ１５４の発現は、実際にＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＴＭと比較して、より非常に高い。この観測は、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＴＭプロセス中よりも、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩＴＭプロセスの間、Ｔ細胞はより高い活性化状態にあることを示す。これが、インビボにおいて投与される場合、より有効な産物へ翻訳し得ることが予測される。
【０１５７】
ＣＤ３＋細胞純度、ＣＤ４細胞／ＣＤ８細胞比、および３日目における培養物中の細胞の生存率をまた、５人の患者サンプルについて決定した。ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＴＭプロセスおよびＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩＴＭプロセスにかけて使用した細胞の表現型および生存率を、フローサイトメトリーまたはトリパン青染色によって測定されたように、以下の表４において示す。
表４
【０１５８】
【表４】
Figure 2004500095
＊＝ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　Ｉプロセスにおける単級除去後、またはＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩプロセスにおける磁気濃縮後、０日目におけるＣＤ３＋Ｔ細胞の純度
Ψ＝ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　Ｉプロセスにおける単球除去後、またはＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩプロセスにおける磁気濃縮後、０日目におけるＣＤ４＋細胞：ＣＤ８＋細胞の比
（実施例ＩＩ）
（ＣＤ３＋細胞集積、単球除去および顆粒球除去の効率）
この研究に関して、Ｘｃｙｔｅ　Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙでの受取り時に、受け入れるＰＢＭＣアフェレーシス産物を洗浄し、分割しそして：
１．ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　Ｉプロセスについて、単球除去工程を実行し、そしてＣＤ１４＋単球除去ＰＢＭＣを低温保存し、そしてＬＮ２フリーザーの蒸気相中で保存した（実施例Ｉにおいて示されるように）。ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　Ｉプロセスの準備（ｓｅｔ−ｕｐ）の日に、実施例Ｉに詳述したように、ＣＤ１４＋単球除去されたＰＢＭＣを解凍し、そしてＤＹＮＡＢＥＡＤＳ　Ｍ−４５０　ＣＤ３／ＣＤ２８　Ｔを用いて、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥプロセスを開始した。これらの開始工程におけるＮ＝５ドナーについての、平均的な細胞組成およびＣＤ３＋Ｔ細胞集積、ＣＤ１４＋単球除去および顆粒球除去の平均的な効率を表５．１に示し、各々の個々のドナーに関するデータを表５．２に示す。
【０１５９】
２．ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩプロセスについて、ＰＢＭＣアフェレーシス産物細胞を低温保存し、そしてＬＮ２フリーザーの蒸気相中で保存した。ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩプロセスの準備の日に、実施例Ｉに詳述したように、低温保存されたＰＢＭＣアフェレーシス産物細胞を解凍し、そしてＤＹＮＡＢＥＡＤＳ　Ｍ−４５０　ＣＤ３／ＣＤ２８　Ｔを用いて、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩプロセスを開始した。これらの開始工程におけるＮ＝５ドナーについての、平均的な細胞組成およびＣＤ３＋Ｔ細胞集積、ＣＤ１４＋単球除去および顆粒球除去の平均的な効率を表５．１に示し、各々の個々のドナーに関するデータを表５．２に示しす。
【０１６０】
表５．１および表５．２に示されるように、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩプロセス構成（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）における解凍されたＰＢＭＣアフェレーシス産物から導かれる、ＣＤ３＋Ｔ細胞の磁気濃縮前の、ＰＢＭＣアフェレーシス産物の凍結／解凍の組み合わせは、ＣＤ１４＋単球および顆粒球の効果的排除をもたらす（表５．１および表５．２）。ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩプロセスにおけるＣＤ１４＋単球および顆粒球の排除の効率は、さらなる「コーティングされていない」ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ　Ｍ−４５０　Ｔ試薬を使用して個別の除去工程に対する必要性を排除し、そして一貫してより高いＣＤ４／ＣＤ８比を導く利点を有するＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　Ｉプロセスと、同程度良好である。
【０１６１】
表５．１：ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩおよびＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩプロセス構成の初期工程におけるＣＤ３＋Ｔ細胞集積、ＣＤ１４＋単球除去および顆粒球除去の平均的（Ｎ＝５）効率。
【０１６２】
【表５】
Figure 2004500095
細胞組成は、標準的プロトコルに基づいて、フローサイトメトリーによって決定した。
【０１６３】
（表５．２：ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩおよびＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩのプロセス構成の開始工程におけるＣＤ３＋Ｔ細胞濃縮、ＣＤ１４＋単球除去および顆粒球除去の効率の比較）
【０１６４】
【表６】
Figure 2004500095
細胞の組成物を標準的プロトコルに従ってフローサイトメトリによって決定した。
【０１６５】
ＣＤ１４＋単球除去の工程を除くことによるプロセスの単純化および合理化ならびにこれらの関連試薬に加えて、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩＴＭプロセスにおける磁気濃縮（ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）工程もまた、Ｔ細胞活性化の開始時により高純度のＣＤ３＋Ｔ細胞、およびＣＤ３＋　ＣＤ４＋：ＣＤ３＋　ＣＤ８＋がより高割合のＴ細胞を提供した（表５．１および表５．２）。
【０１６６】
ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＴＭプロセスおよびＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩＴＭプロセスの８日目に予め収集された活性化ＣＤ３＋Ｔ細胞の収率、純度、生存度および組成をまた比較した。
【０１６７】
表５．３に示されるように、８日目の収集前のＣＤ３＋Ｔ細胞の平均収率、純度および生存度は、代表的にＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＴＭプロセスと比較してＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩＴＭプロセスについて増加した。
【０１６８】
（表５．３：ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＴＭプロセスおよびＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩＴＭプロセスの８日目に予め収集された活性化ＣＤ３＋Ｔ細胞の収率、純度、生存度および組成）
【０１６９】
【表７】
Figure 2004500095
＊＝ＣＤ３＋　ＣＤ４＋：ＣＤ３＋　ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合。
【０１７０】
また、表５．３に示すように、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩＴＭプロセスは、このプロセスの間中、ＣＤ３＋　ＣＤ４＋：ＣＤ３＋　ＣＤ８＋Ｔ細胞のより高い割合を維持する。これは、磁気濃縮（ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）工程間のＣＤ３＋　ＣＤ４＋細胞の優先（ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ）濃度に起因し得る（表５．１および表５．２）。
【０１７１】
「入手した（ｉｎｃｏｍｉｎｇ）」とは、新鮮な、洗浄して入手したアフェレーシス細胞をいう。ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＴＭプロセスについて表５．２に列挙した開始細胞は、洗浄し、単球を除去し、そして／または凍結／融解したアフェレーシスされた細胞であった。ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩＴＭプロセスについて表５．２に列挙した開始細胞は、洗浄して凍結／融解したアフェレーシス細胞であった。
【０１７２】
＊＝ＣＤ３＋　ＣＤ４＋：ＣＤ３＋　ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合。
【０１７３】
表５．３は、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩＴＭプロセスが、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＴＭプロセスからの細胞産物よりも純粋（ＣＤ３＋細胞％を考慮して）である細胞産物を生じることを示す。すなわち、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩＴＭプロセスからの産物細胞では、平均（±標準偏差）ＣＤ３＋細胞純度が９６％±１％であり、一方、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＴＭプロセスからの細胞では、平均純度が９３％±２％であった。
【０１７４】
また、表５．３に示すように、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩＴＭプロセスは、ＣＤ４／ＣＤ８細胞のより高割合を維持した。入手した細胞では、平均ＣＤ４／ＣＤ８細胞の割合が２．２のであり、そしてＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩＴＭプロセスからの産物細胞では、ＣＤ４／ＣＤ８割合が１．８であり、一方、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＴＭプロセスからの産物細胞では、ＣＤ４／ＣＤ８割合が１．２であった。
【０１７５】
表５．３のデータはまた、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩＴＭプロセスでは、平均生存度が９８％の産物細胞を得、一方、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＴＭプロセスでは、平均生存度が９７％の産物細胞を得た。
【０１７６】
（実施例ＩＩＩ）
（単球除去）
単球（ＣＤ１４＋食細胞）を、種々の「無関係な（ｉｒｒｅｌｅｖａｎｔ）」（すなわち、非抗体でコートされたかまたは非標的抗体でコートされた）Ｄｙｎａｌビーズを用いて磁気除去（ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）を介してＴ細胞調製物から除去した。除去を、およそ２：１の細胞に対するビーズの割合で、Ｄｙｎａｌヒツジ抗マウスＭ−４５０ビーズ、またはＤｙｎａｌヒト血清アルブミンコートされたビーズ（Ｍ−４５０）、またはＤｙｎａｌ　Ｅｐｏｘｙ（Ｍ−４５０）ビーズとともにフィコールにおける分離後の全血液またはアフェレースされた末梢血液のいずれかをプレインキュベートすることによって実施した。これらの細胞およびビーズを、２２〜３７℃にて１〜２時間インキュベートし、次いで、ビーズに接着したかまたはビーズを取り込んだ細胞の磁気除去を行った。残りの細胞を、未処置の細胞と平衡して培養下に置いた。細胞を、除去前および除去後の細胞の表現型についてフローサイトメトリによって特徴付けた。
【０１７７】
（実施例ＩＶ）
（フローサイトメトリー設定）
Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲサイトメータは、収集されたデータおよび提示されたデータの全てに有用であった。３色分析を実施し得るいずれかのフローサイトメータは、同一データ必要とする熟練の操作者によって用いられ得る。例えば、ＦＡＣＳＣＡＮ、Ｖａｎｔａｇｅ　Ｃｅｌｌ　Ｓｏｒｔｅｒ、または他のＢＤ製品は、類似のデータ−を収集するために機能する。また、Ｃｏｕｌｔｅｒ製品（例えば、Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅｐｉｃ　Ｓｏｒｔｅｒ）も同様に機能する。
【０１７８】
以下に与えられる機器の設定は、これらの研究を実施したように、データを収集するための機器の適合のために一般的なガイドラインとして用いられ得る。これらの設定を本明細書中に提供される実施例のために用いる；しかし、これらの設定の改変は、熟練した機器操作者によって補正（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）および検出電圧を適切に調整され得るし、このようにされるべきである。また、異なる蛍光タグを有する異なる検出抗体の使用は、他のチャンネル（ｃｈａｎｎｅｌ）（例えば、補正）に、最小の「浸出オーバー（ｂｌｅｅｄｉｎｇ−ｏｖｅｒ）」で最適シグナル分離（電圧）を与えるように任意の特定の機器に対して固有の調整を必要とする。補正コントロール（ｃｏｎｔｒｏｌ）、アイソタイプコントロール、を使用することを熟知しており、Ｔ細胞の生物学を一般的に理解している、熟練したフロー操作者は、以下に提示されたデータのいずれかを再現し得るべきである。
【０１７９】
さらに留意すべき点としては、種々の設定（特に電圧設定）は、機器のレーザーの効率に依存して変化させてもよい。例えば、より古いレーザーは、より新しいレーザーと比較してシグナルを生じるために、より高い電圧を必要とし得る。しかし、得たデータは（電圧が高かろうが低かろうがいずれにしても）、生物学的に同様のパターンを示すべきである。
【０１８０】
ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲＴＭ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で用いられた設定は、以下である：
検出器／増幅器：
パラメーター　　検出器　　電圧　　増幅器／ゲイン　　モード
ＰＩ　　　　　ＦＳＣ　　ＥＯＯ　　１．３０　　　　Ｌｉｎ
Ｐ２　　　　　ＳＳＣ　　３７０　　１．００　　　　Ｌｉｎ
Ｐ３　　　　　ＦＬ１　　６１０　　１．００　　　　Ｌｏｇ
Ｐ４　　　　　ＦＬ２　　５５０　　１．００　　　　Ｌｏｇ
Ｐ５　　　　　ＦＬ３　　５２０　　１．００　　　　Ｌｏｇ。
【０１８１】
パラメータの電圧は、一般的に一定であるが、Ｐ３、Ｐ４、およびＰ５は、対数（ｌｏｇ）モードのシグナル強度で最初の１０進（０〜１０）内かまたは付近で陰性のコントロールシグナル値を維持しながら、最大シグナル分離に達するようにわずかに上げたり下げたりして調整してもよい。
【０１８２】
閾値：
第１パラメーター：ＦＳＣ（順方向散乱）
値：５２
第２パラメーター：なし
補正（Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）：
ＦＬ１−４．０％　ＦＬ２
ＦＬ２−２１．４％　ＦＬ１
ＦＬ２−２．６％　ＦＬ３
ＦＬ３−１５．２％　ＦＬ２。
【０１８３】
これらの設定が以下に提示されるデータのほとんどを収集するために用いられる設定の近似を提供した場合、これらの設定を変更してもよく、刺激したＴ細胞において、おおよそ等価なデータ−を生じるべきである。上に列挙した電圧での補正について、一般に受容可能な範囲は、以下に示す通りである：
ＦＬ１−ＦＬ２　０．４−４％
ＦＬ２−ＦＬ１　１８−２７％
ＦＬ２−ＦＬ３　２−８％
ＦＬ３−ＦＬ２　１０−１６％
特定の補償または電圧値の決定を、以下の目的でフローサイトメトリーオペレーターで実験することによって行った：
１）電圧：陽性シグナルと陰性シグナルとの間のシグナル分離の最大値（例えば、表面抗原マーカー陰性対低レベル表面抗原対高レベル表面抗原）
２）補償：補償制御の使用による内部チャネル相互作用（出血過剰）の最小化。
【０１８４】
電圧設定を変更する場合、補償の設定も同様に変更する。
【０１８５】
（実施例Ｖ）
（細胞増殖および細胞生存率アッセイ）
細胞増殖および細胞生存率を、標準トリパンブルー染色および、血球計算盤を使用して細胞を数えることによって測定した。図５Ａ〜５Ｂを参照のこと。
【０１８６】
（実施例ＶＩ）
（活性化マーカーアッセイ）
ＣＤ１５４は、時間的な様式で活性化されたＴ細胞上で発現され、ＡＰＣに対するＣＤ４０を介したＴ細胞相互作用における鍵の要素として示される。これらの２つのレセプターの相互作用を遮断することによって、免疫応答を効果的に変更し、そして遮断さえし得る。ＣＤ３ｘＣＤ２８常磁性ビーズでの集中によって刺激されるＴ細胞のアリコートを、３日目、５日目、および８日目の細胞培養物から除去し、そしてＣＤ１５４発現のレベルについて分析した。このＣＤ１５４発現のレベルを、単球が枯渇しているがＣＤ３ｘＣＤ２８常磁性ビーズでインキュベートしていないＴ細胞（すなわち、このＴ細胞は、培養開始で磁性的に集中されていない）と比較した。抗ＣＤ３ビーズおよび抗ＣＤ２８ビーズでの磁性的な集中によって刺激されたＴ細胞の非常に大きな活性化で、培養開始時に同様に刺激されていない細胞と比較して、培養の３日目のＣＤ１５４発現のレベルにおいて３倍上昇することを示した。（図４および図７を参照のこと）。同様の様式で測定されたＣＤ２５レベル（図６）は、より高い活性に向かう傾向を示す。
【０１８７】
一般に、マーカーの発現は、種々の時間にわたってモニターされた。この点において、細胞を、抗ヒトＣＤ４（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ１１ａ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ２６（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ４９ｄ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ５４（ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎおよびＢｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ９５（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ１３４（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ２５Ａｂ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ６９Ａｂ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＦＩＴＣまたはＰＥ結合抗ヒトＣＤ１５４Ａｂ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、あるいはＦＩＴＣまたはＰＥ結合ＩｇＧ１アイソタイプコントロールＡｂで標識する。細胞の２×１０５を、２０分間４℃で、３０μｌの最終量中のそれぞれの抗体の２μｌで標識し、洗浄し、そして１％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中に再懸濁した。
【０１８８】
細胞の表面マーカー分子発現レベルの比較を、種々の方法によって実行し、そして従って絶対値は変化し得る。しかし、２つの値を比較した場合、この相対倍の値は容易に計算し得る。例えば、異なる「活性化」方法によって産生されたＴ細胞のＣＤ１５４発現レベルは、フローサイト方法によって比較的正確に測定され得る。例えば、Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎの抗ＣＤ１５４−ＰＥ結合体（カタログ番号３４０４７７）のような試薬を使用して、休止期または活動期のＴ細胞を染色し得、そしてこのマーカー（またはフローサイトメーター操作で実験される周知の他のもの）についての発現レベルを評価し得る。Ｔ細胞、すなわちＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方に対するＣＤ１５４の上昇した発現レベルを提供する方法が本明細書中に記載される。本明細書中に記載されるように、培養開始時に、同時にＴ細胞を刺激して集中することによって、発現レベルは標準３×２８活性化によって得られる値、すなわちおよそ２０％から１００％以上の上昇レベル（フローサイトメトリー（ＢＤ　ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒおよび上記に記載される抗体）を使用する平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定されるような）を越えて跳ね上がる。例えば、刺激されないＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ１５４について陰性であり、そして従って１〜１０の間のＭＦＩ値を得る。ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＴＭによる活性化の際、活性後３日目に、ＣＤ１５４に対するＣＤ４＋Ｔ細胞についてのＭＦＩ値は、２０〜４０の範囲であり得、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩＴＭプロセスは、６０〜２００のＣＤ１５４　ＭＦＩ値を得た。Ｔ細胞で発現するＣＤ１５４分子の数から考えると絶対値は存在しない一方、上昇する発現の相対レベルを測定するための十分な量が存在する。従って、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＴＭプロセスと比較して、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩＴＭプロセスが、活性後１〜４日の間のＣＤ１５４レベルにおいておよそ１．１〜２０倍の上昇を実証し得ることを実証し得る。
【０１８９】
（実施例ＶＩＩ）
（サイトカインアッセイ）
細胞を、上記に記載するように調製する。種々の時間刺激した細胞由来の上清を、製造者指示書（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）に従うＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＮＦ−γまたはＴＮＦ−αＥＬＩＳＡに供した。
【０１９０】
代替のアッセイにおいて、ＩＬ−２を、フローサイトメトリーを使用してＣＤ４Ｔ細胞の細胞内染色によって測定する。ＩＬ−２またはＩＦＮ−γの細胞内標識のために、細胞を最初に１μｇ／ｍｌのＭｏｎｅｎｓｉｎ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）でアッセイ前の４時間インキュベートする。この細胞を、続いて上記に記載されるように表面タンパク質について染色し、固定し、Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ細胞内染色キットを使用して透過処理し、ＰＥ結合抗ヒトＩＬ−２ＡｂおよびＦＩＴＣ結合抗ヒトＩＦＮ−γもしくは製造業者によって記載されるような対応するコントロールＡｂで標識する。データ収集およびフローサイトメトリー分析は、製造者プロトコール（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に従ってＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを使用するＢｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで実行する。
【０１９１】
ＩＦＮ−γ集中は、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩＴＭ方法論を使用する場合、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＴＭと反対に、３日目で約２倍、３倍、４倍およびいくつかの場合５倍高かった（データは示さない）。さらに、ＴＮＦ−αレベルはまた、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＴＭと比較した場合、刺激後５日目まで、著しく高かった（１．５倍〜３倍の間より高い）（データは示さない）。
【０１９２】
（実施例ＶＩＩＩ）
（再構築後の表現型細胞分析）
再構築分析のために、約５×１０６個の細胞を、終了日の培養から採取する。いくつかの実施例において、終了日は培養の８日目である。この細胞を５ｍＬの、Ｘ−ｖｉｖｏ１５培地（血清を有し、およびＩＬ−２を含むかまたはＩＬ−２を含まない）中に、上記に示すように６ウェルプレートの１ウェルにプレートする。約５×１０６Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ−４５０ＣＤ３／ＣＤ２８　Ｔを、細胞を含むウェルに数珠繋ぎにし、そして細胞およびビーズを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中に配置する。２日後、このサンプルを除去し、生存率について試験し、そしてＦＡＣＳによって細胞の大きさ、ならびに細胞マーカーおよび／またはサイトカイン発現レベル（例えば、ＣＤ２５発現レベル、ＣＤ１５４発現レベル）を測定する。表６は、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＴＭプロセスおよびＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩＴＭプロセスに対する５つの患者サンプル被験体についての以下のこれらの結果を実証する。
【０１９３】
【表８】
Figure 2004500095
（実施例ＩＸ）
（代替的な細胞収集および細胞培養プロトコル　ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥＴＭ）
ヒト血液から単離した細胞を、Ｘ−ｖｉｖｏ培地（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ　Ｉｎｃ．，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中で増殖させ、そして、これは２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）が補充されたかまたはされない使用、ならびに５％ヒト血清（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）、２ｍＭグルタミン（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）および２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を補充された使用に依存する。Ｊｕｒｋａｔ　Ｅ６−１細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）、２ｍＭグルタミン（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２ｍＭペニシリン（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および２ｍＭストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＲＰＭＩ　１６４０（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、増殖する。
【０１９４】
健康なヒトの自発的なドナーからの軟膜を得る（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｒｅｄ　Ｃｒｏｓｓ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、製造者の指示書に従ったＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉａ（ＩＣＮ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃｏｓｔａ　Ｍｅｓａ，ＣＡ）を使用して得る。
【０１９５】
末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、培養フラスコ（Ｃｏｓｔａｒ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）中のコートしてないＤｙｎａｂｅａｄ（Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）、１０８細胞／ｍｌ、２ビーズ／細胞，３７℃、２時間で用いたインキュベーションによりＰＢＭＣフラクションから得る。単球およびマクロファージを、培養フラスコへの粘着性によって取り除き得る。あるいは、これらを、常磁性ビーズを貪食すること、そして次ぐ、製造者による指示書（Ｄｙｎａｌ）に従った磁気的細胞分離によるこれらの細胞除去によって取り出し得る。ＣＤ４＋細胞を、ＣＤ８（クローンＧ１０−１）、ＣＤ２０（クローンＩＦ５）、ＣＤ１４（クローンＦ１３）およびＣＤ１６（Ｃｏｕｌｔｅｒ）に対する１０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を、１０８細胞／ｍｌ、４℃、２０分で用いたインキュベーションすることによって、ＰＢＬフラクションから得る。洗浄後、細胞を、ヒツジ抗マウスＩｇ結合Ｄｙｎａｂｅａｄ（１０６細胞／ｍｌ、６ビーズ／細胞、４℃で２０分）を用いて処理し、そして、次いで、磁気性細胞分離を介して２度除去する。ＣＤ４＋細胞の純度は、フローサイトメトリーによって測定すると約９１〜９５％である。
【０１９６】
樹状細胞を、１０８細胞／ｍｌ、２時間、３７℃（Ｄｙｎａｂｅａｄなし）で、培養フラスコ（Ｃｏｓｔａｒ）に対するＰＢＭＣの第１の接着化により生成する。広範囲な洗浄後、接着したＴ細胞を、５００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および１２．５Ｕ／ｍｌのＩＬ−４（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含む培地中で７日間培養する。得た細胞集団は、微弱な接着性であり、そして樹状細胞（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ１１ｃを発現し、そしてＣＤ４の発現を欠損する）の表面マーカー特性を発現する（全抗体を、Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ，ＣＡから得た）。
【０１９７】
他の技術は、組織培養プレートおよび／もしくは組織培養フラスコ（Ｂａｘｔｅｒ　ｂａｇｓ）、または培地（これは、ＲＰＭＩ、Ｘ−Ｖｉｖｏ　１５、またはいくつかの他のＴ細胞培養培地を含む）中の他の通常の培養ベッセル中でインキュベーションしたＴ細胞を含むヒト末梢血リンパ球を使用する。Ｔ細胞の活性化およびＴ細胞増殖について必要とされないが、グルタミンおよびＨＥＰＥＳを、培養培地に添加する。ウシ胎仔血清（最終的に１０％）、ヒトＡ／Ｂ血清（５％）、または自系ヒト血清（５％）を培養培地に添加した。血清のパーセンテージを、Ｔ細胞の生態またはＴ細胞の培養結果に多大な影響を与えることなしに変化し得る。いくつかの例において、組換えヒトＩＬ２を、培養物に添加する。いくつかの例において、食作用ＣＤ１４＋細胞および他の食作用細胞を、既述の磁気的除去によって取り出し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８（３×２８ビーズ）を表面上に固定したビーズを、３：１のビーズ対細胞比で添加する。培地を、５〜７％Ｃ０２におおいて３７℃で維持する。細胞を、１４日間に亘るいくつかの時点において取出し、細胞密度（細胞数）、細胞サイズ、および種々の表面抗原のフローサイトメトリー分析を介して測定した細胞表面の表現型を決定した。上清をまた、培地から回収し以下を含むがこれらに限定されないサイトカインの分泌プロファイルを決定した：ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮ−ｙ、ＴＮＦ−α。活性化された細胞が増殖して分裂するに従って、培地を、０．２〜２×１０６ＣＤ３＋Ｔ細胞／ｍｌで維持する。Ｔ細胞密度が、約１．５×ｌ０６／ｍｌを超過した場合、培地を分割して、そして新鮮な培地を、０．２〜１．４×１０／ｍｌ範囲で細胞密度を与えるように供給する。最初の刺激後の約１４日間ついて約２時間、活性化されたＴ細胞がより静止した（ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ）相（例えば、ＣＤ２５レベルの漸減し、前方散乱により決定された細胞サイズが漸減し、細胞分裂速度を減少し得る）に入ろうとする場合、細胞を、この被験体に注入するか、または以下の刺激うちのいずれか１つを用いて再刺激する：
１）刺激なし
２）２μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）
３）１：１のビーズ対細胞比での（３×２８ビーズ）。
細胞を再び、細胞表現型および活性化／機能的状態について長期間にわたり分析した。上清は、選択されたサイトカイン分析のために再度回収される。細胞３つの異なった方法論で刺激する：１）製造者による指示書（Ｄｙｎａｌ）に従って抗ＣＤ３（ＯＫＴ−３）抗体および抗ＣＤ２８（９．３）抗体（３×２８ビーズ）に共有結合的に結合したＤｙｎａｂｅａｄ（Ｍ−４５０）、３ビーズ／細胞、２）Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）（１００ｎｇ／ｍｌ）およびホルボール１２−ミリスチン酸−１３−酢酸（ＰＭＡ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）（１０ｎｇ／ｍｌ）、３）同種異系の樹状細胞（２５，０００樹状細胞／２００，０００ＣＤ４細胞）。全ての細胞を、濃度１０６細胞／ｍｌで刺激する。増殖アッセイを、９６ウェル平底プレートにおいて４連で実施する。細胞を、２００μｌの最終容量中１０６細胞／ｍｌで刺激する。増殖を、ＭＴＴアッセイ（ＭＴＴアッセイキット，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）を、第３日（刺激方法１および刺激方法２）または第６日（刺激方法３）において実施し、そして結果を、この４連の平均値として表現する。ＰＢＬ培地または精製されたＣＤ４＋細胞培地を、３×２８ビーズ、ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ／ＰＭＡ、または同種異系の樹状細胞を用いて刺激した。
【０１９８】
図８Ａ〜８Ｂで説明したように、細胞数（Ｃｏｕｌｔｅｒ　ｃｏｕｎｔｅｒ）は、ＰＨＡ、ヒツジ抗マウス（ＳＡＭ）を介してこのビーズに結合した３×２８ビーズ（ビーズ上の抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８同時免疫化）、このビーズに共有結合的に連結した抗体を有する３×２８ビーズ、またはプレート上に１つまたは２つで固定された抗体を用いて刺激した後、劇的に増加する。図９はまた、（＋／−単球除去および＋／−２０単位のＩＬ−２で）ビーズ上に共有結合的に固定化された抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を用いた刺激の後の細胞数の増加を説明する。
【０１９９】
（実施例Ｘ）
（磁気的除去を介した単球除去）
単球（ＣＤ１４＋食作用細胞）を、種々の「関連性のない」（すなわち、コートされた非抗体またはコートされた非標的抗体）Ｄｙｎａｌビーズを使用して、磁気的除去を介してＴ細胞調製物から取り出す。フィコール化（ｆｉｃｏｌｌｅｄ）血液全体または血漿交換された末梢血を、ビーズ対細胞比が約２：１のＤｙｎａｌヒツジ抗マウスＭ−４５０ビーズ、もしくはＤｙｎａｌヒト血清アルブミン被膜（ａｌｂｕｍｉｎｃｏａｔｅｄ）ビーズ（Ｍ−４５０）、または１〜２時間の期間中２２〜３７℃でＤｙｎａｌ　Ｅｐｏｘｙ（Ｍ−４５０）ビーズを用いたプレインキュベートすることによって、除去を実施し、その後、ビーズまたは取り込まれたビーズに対して付着する細胞の磁気的な除去を行った。残余細胞を、未操作の細胞の傍らの培養物中に静置した。細胞を、除去の前後の細胞表現型に対するフローサイトメトリーによって特徴付けた。図９は、単球の非存在下での増大した増殖を説明する。
【０２００】
（実施例ＸＩ）
（活性化前および活性化後の動力学的タイムコース研究）
１連の実験を、種々の条件下で培養された、全血または除去した末梢血由来のヒトＴ細胞において実施した。これらの条件を以下に挙げる：
１）　刺激なし。
２）　２μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で刺激。
３）　３：１または１：１のビーズ対Ｔ細胞比において３×２８　Ｄｙｎａｂｅａｄ（抗ＣＤ３および抗Ｃ２８に結合化されたビーズを有するビーズ）で刺激。
４）　外因的に添加された１０Ｕ／ｍｌ（５ｎｇ／ｍｌ）の組換えヒトＩＬ−２存在下または非存在下における刺激または培養。
５）　単球（ＣＤ１４＋食細胞）の存在下での培養、または種々の「無関係な」ダイナビーズを使用して磁気性欠乏を介して上述の細胞の除去後に培養された単球（ＣＤ１４＋食細胞）の存在下での培養。欠乏は、実施例２に例示されるように実施された。
【０２０１】
以下の細胞表面マーカーを、フローサイトメトリによって分析して、細胞表現型および活性状態を決定した：ＣＤ２．ＣＤ３．ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤｗ１３７（４１ＢＢ）、ＣＤ１５４．細胞サイズはまた、フローサイトメトリを介する順方向散乱プロフィールによって決定されるように、試験される。
【０２０２】
マーカー（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯ）は、Ｔ、Ｂおよび単球系列ならびに亜集団を決定するために使用するが、順方向散乱、ＣＤ２５、ＣＤ６５Ｌ、ＣＤ５４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４は、細胞の活性化状態および機能的性質を決定するために使用される。
【０２０３】
Ｔ細胞を含むヒト末梢血リンパ球は、実施例ＩＸに記載するように調製された。細胞を、細胞型および活性化状態／機能的状態に対して長時間分析する。上清を、分泌サイトカイン分析のために回収する。図８および９は、１０Ｕ／ｍｌの３×２８ビーズ＋／−組換えヒトＩＬ−２および＋／−単球欠乏での活性化後のヒトＴ細胞の一般的な増殖性質を示す。全ての細胞をＢａｘｔｅｒ　Ｌｉｆｅｃｅｌｌ　フラスコ（３００ｍｌ）中で培養した。１プロット標識化「スケールアップ」は、Ｂａｘｔｅｒ　Ｌｉｆｅｃｅｌｌ３リットルフラスコまで拡張した３００ｍｌフラスコ培養（ＩＬ−２／欠乏した単球）を示す。このグラフは、種々の条件下でのヒトＴ細胞の約２−４ｌｏｇ拡張を示す。
【０２０４】
図１０は、長時間の順方向散乱フリーサイトメトリープロフィールによって決定されるような細胞サイズの動力学的な分析を示す。Ｔ細胞を、活性化直後にサイズの増大、および続くサイズの減少を示し、その結果１４日まで、これらは、静止状態を示す、より小さい順方向散乱フリーサイトメトリープロフィールを示す。
【０２０５】
図１１は、３×２８ビーズ刺後に長時間のＩＬ−２発現（ＣＤ２５）を示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方は、レセプターレベルにおいて早い増加を示す。１４日まで、ＣＤ２５発現レベルは、より静止状態を示す、Ｔ細胞の過半数を一般に減少する。
【０２０６】
３×２８刺激Ｔ細胞が、より静止状態（低いＣＤ２５、低い順方向散乱）になった場合、これらは、以下に示されるように再刺激された。
１）　刺激なし。
２）　ＰＨＡ　２μｇ／ｍｌ。
３）　１ビーズ／ＣＤ３＋Ｔ細胞における３×２８（Ｘｃｅｌｌｅｒａｔｅ）ビーズ刺激。
【０２０７】
次いで、細胞サイズ（順方向散乱）、表面型、活性化マーカー発現およびサイトカイン分泌の動力学的な分析は、実施された。図１２は、第１のおよび第２の刺激後の順方向散乱（細胞サイズ）動力学を示す。図１３は、第１のおよび第２の刺激後のＣＤ２５（ＩＬ−２レセプター）発現動力学を示す。図１６は、ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ａ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｂ）における、第２の刺激後のＣＤ５４（Ｉ−ＣＡＭ）発現を示し、ここで第１の刺激は、ＰＨＡかまたはＣＤ３×ＣＤ２８ビーズかのいずれかであり、そして再刺激は、なしか、ＰＨＡか、または３×２８ビーズのいずれかであった。ＣＤ４陽性細胞とＣＤ８陽性細胞間を示すマーカーをまた、３×２８抗ビーズ活性化の間に相対的な比を決定するために使用した（図１９および２２）。
【０２０８】
（実施例ＸＩＩ）
（同時刺激Ｔ細胞のサイトカイン発現パターンの分析）
種々のサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−、およびＩＬ−４を含む）の役割は、Ｔ細胞維持、発現および分化に関連するように、広範に研究されている。特にＩＬ−２は、Ｔ細胞維持および発現の支持的であることがしめされている。ＩＦＮ−γは、ＴＨＩ型免疫レスポンダーへのＴ細胞の分化を駆動することが示唆されているが、ＩＬ−４は、ＴＨ２型応答に対するＴ細胞の駆動について示唆されている。ＰＨＡかまたはＣＤ３×ＣＤ２８かのいずれかによって活性化される第１のヒトＴ細胞におけるサイトカイン放出レベルを、実施例ＩＸ（第１の刺激に対する応答および第２の刺激に対する応答の動力学的な研究を含む）のようにＴ細胞を刺激することによって分析した。このデータを、図１８Ａ−Ｃに示す、そして図２３−２４は、ＣＤ３×ＣＤ２８ビーズ刺激の特有の性質を示す。２日目と４日目との間の最初の刺激後（１日目は、評価されなかった）、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γの両方の非常に高いレベルを観察した。絶対的なＩＬ−２レベルの約５陪の増大を、ＰＨＡで刺激されたＴ細胞で観察されたレベルと比較して３×２８ビーズ刺激されたＴ細胞について示した。ＩＦＮγレベルの約７倍に増大をまた、ＰＨＡ対応物と比較して３×２８刺激したＴ細胞において観察した。ＩＬ−４の場合、増大は、第１の刺激に対して劇的ではなかった。興味深いことに、おそらく大きな有意さは、第１の刺激後に細胞が、静止状態（上記される３つのサイトカインをもはや分解しないかまたは分泌しない）になった後に、これらが、ＣＤ３×ＣＤ２８ビーズ、ＰＨＡまたは未刺激のままかのいずれかで刺激されたことである。ＣＤ３×ＣＤ２８ビーズを介して最初の活性化／発現シグナルを受け取るＴ細胞は、第１の刺激後に観察されるよりもさらに高いレベルのＩＦＮγを分泌する。反対に、ＰＨＡで最初に刺激された細胞は、３×２８対応物に見られるよりもより低いレベルのＩＦＮγを分泌した。類似の差異をまた、ＩＬ−４レベルで観察した。
【０２０９】
これらのデータは、ＣＤ３×ＣＤ２８ビーズを介して媒介された以下の活性化／発現を得た細胞が、例えば、ＰＨＡのような、拡張の他の手段から得られた細胞よりも機能的に異なる。この得られた細胞は、ＴＨＩ型プロフィール（ＩＦＮ−γ）を支持する可能性がある、ＴＨＩサイトカインおよびＴＨ２サイトカインの非常に高いレベルを促進する、改変されたサイトカイン分泌応答を有することが明らかである。培養物におけるこれらサイトカインのこのような高いレベルの分泌は、多くの効果（抗腫瘍応答および抗ウイルス応答を支持する、ＴＨＩ分化経路にＴ細胞を駆動すること；および得られたＴ細胞に基礎的な機能性を改変すること（例えば、活性の閾値を下げることおよびプログラムされた細胞死経路を阻害すること）によってまたことを含む）を有し得る。
【０２１０】
（実施例ＸＩＩＩ）
（同時刺激されたＴ細胞のＣＤ５４発現の分析）
図１６は、ＣＤ１４＋Ｔ細胞（Ａ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｂ）において、第２の刺激後のＣＤ５４（Ｉ−ＣＡＭ）発現を示す場合、第１の刺激が、ＰＨＡかまたはＣＤ３×ＣＤ２８ビーズかのいずれかであり、そして細胞刺激が、なしかまたはＰＨＡ、または３×２８ビーズであった。
【０２１１】
（実施例ＸＩＶ）
（短期間活性化マーカーアッセイ）
マーカー発現を、実施例ＩＸに記載されるＴ細胞の刺激後の種々の時間にわたってモニターした。この点に関して、細胞を、抗ヒトＣＤ４（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ　Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）、ＦＩＴＣ−結合化抗ヒトＣＤ１１ａ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＦＩＴＣ結合化抗ヒトＣＤ２６（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＦＩＴＣ−結合化抗ヒトＣＤ４９ｄ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＦＩＴＣ−結合化抗ヒトＣＤ５４（ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎおよびＢｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＦＩＴＣ−結合化抗ヒトＣＤ９５（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＦＩＴＣ−結合化抗ヒトＣＤ１３４（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＦＩＴＣ−結合化抗ヒトＣＤ２５Ａｂ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）、ＦＩＴＣ−結合化抗ヒトＣＤ６４Ａｂ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＦＩＴＣ−またはＰＥ−結合化抗ヒトＣＤ１５４Ａｂ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｓｏｎ）、またはＦＩＴＣまたはＰＥ−結合化ＩｇＧ１アイソタイプコントロールＡｂで標識化した。細胞（２×１０５）を、３０μｌの終濃度中の各濃度の２μｌで４℃において２０分間標識し、洗浄しそして１％のパラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中で再懸濁した。図２１−２２および２６Ａ−２６Ｌを参照のこと、これらの図によって実施されたように、ＣＤ４＋細胞とＣＤ８＋細胞との間と同様に活性化時間にわたって有意な差異が見られる。
【０２１２】
前述から、本発明の特定の実施形態は、例示の目的で本明細書中に記載されるが、種々の改変は、本発明の精神および範囲を逸脱することなく行なわれ得ることが理解される。従って、本発明は、添付の請求項の範囲を除いて限定されない。全ての参照、特許、特許出願など（上に引用される）は、全体が本明細書中に援用される。さらに、本明細書に引用される全ての数値的な範囲は、範囲内の全ての整数値を明白に含む。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、磁性濃縮および刺激した約０．５×１０９Ｔ細胞（ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩＴＭ）または磁性濃縮および刺激していない約０．５×１０９Ｔ細胞（ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＴＭ）で開始し、８日目に測定した活性化され、かつ拡張されたＴ細胞の総数を比較したプロットである。
【図２】
図２は、８日目に測定した磁性濃縮および刺激した（ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩＴＭ）または磁性濃縮および刺激していない（ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＴＭ）、活性化され、かつ拡張されたＴ細胞の拡大倍を比較したプロットである。
【図３】
図３は、磁性濃縮および刺激した後に８日間培養する前のＴ細胞（ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩＴＭ）または磁性濃縮および刺激していないＴ細胞（ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＴＭ）の再刺激を比較したＣＤ１５４発現のフローサイトメーター分析を示すプロットである。
【図４】
図４は、磁性濃縮および刺激した（ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩＴＭ）と磁性濃縮および刺激せずに活性化された細胞（ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＴＭ）を比較した培養３日目のＣＤ１５４発現のフローサイトメーター分析を示すプロットである。
【図５】
図５Ａ〜５Ｂは、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＴＭ処理を開始するためにＰＢＭＣ（５Ａ）または凍結されそして解凍されたＰＢＭＣ（５Ｂ）を加えるＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＴＭでのＴ細胞活性化および拡張を描いたプロットである。
【図６】
図６Ａ〜６Ｂは、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＴＭまたはＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩＴＭ処理の間の１つのドナーサンプル（ＰＣ０７１）におけるＴ細胞の活性化後のＣＤ２５発現の時間推移分析を描いたプロットである。再刺激は、インビボでの活性化を刺激するために８日目のマークで実施された。図６Ａは、ＣＤ４＋細胞上のＣＤ２５発現を描き、一方、図６Ｂは、ＣＤ８＋細胞上のＣＤ２５発現を描く。
【図７】
図７Ａ〜Ｂは、ＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＴＭまたはＸＣＥＬＬＥＲＡＴＥ　ＩＩＴＭ処理の間の１つのドナーサンプル（ＰＣ０７１）におけるＴ細胞の活性化後のＣＤ１５４発現の時間推移分析を描いたプロットである。再刺激は、インビボでの活性化を刺激するために８日目のマークで実施された。図７Ａは、ＣＤ４＋細胞上のＣＤ１５４発現を描き、一方、図６Ｂは、ＣＤ８＋細胞上のＣＤ１５４発現を描く。
【図８】
図８Ａおよび８Ｂは、実施例ＩＸに示される抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８同時固定化ビーズを利用する処理を用いた刺激後のヒト末梢血Ｔ細胞の増殖を示すプロットである。
【図９】
図９は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８同時固定化ビーズを用いた、１０ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２　有／無（＋／−）および単球除去　有／無での刺激後のヒト末梢血Ｔ細胞の増殖を示すプロットである。全ての細胞は、Ｂａｘｔｅｒ　Ｌｉｆｅｃｅｌｌ　Ｆｌａｓｋｓ（３００ｍｌ）で培養された。スケールアップとは、Ｂａｘｔｅｒ　Ｌｉｆｅｃｅｌｌ　３Ｌフラスコまで拡張される３００ｍｌフラスコ培養（ＩＬ−２無し／単球除去）をいう。
【図１０】
図１０は、経時的な前方散乱フローサイトメトリープロファイルによって決定されるような細胞サイズの動力学分析を示すプロットである。
【図１１】
図１１Ａおよび１１Ｂは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８同時固定化ビーズを用いた初回刺激後の経時的なＣＤ２５発現を示すプロットである。図１１Ａは、ＣＤ４＋細胞上のＣＤ２５の発現プロファイルを示し、一方、図１１Ｂは、ＣＤ８＋細胞上のＣＤ２５の発現プロファイルを示す。
【図１２】
図１２は、一次刺激および二次刺激後の経時的な前方散乱フローサイトメトリープロファイルによって決定されるような細胞サイズにおける変化を示すプロットである。
【図１３Ａ】
図１３Ａは、一次刺激および二次刺激後の経時的なＣＤ２５発現を示すプロットである。図１３Ａは、ＣＤ４＋細胞上のＣＤ２５の発現プロファイルを示す。
【図１３Ｂ】
図１３Ｂは、一次刺激および二次刺激後の経時的なＣＤ２５発現を示すプロットである。図１３Ｂは、ＣＤ８＋細胞上のＣＤ２５の発現プロファイルを示す。
【図１４】
図１４Ａおよび１４Ｂは、二次刺激後のＣＤ１５４発現を示すフローサイトメトリーデータプロットであり、ここで、一次刺激供給源および二次刺激供給源は変更された。図１４Ａは、ＣＤ４＋細胞上のＣＤ１５４の発現プロファイルを示し、一方、図１４Ｂは、ＣＤ８＋細胞上のＣＤ１５４の発現プロファイルを示す。
【図１５】
図１５は、二次刺激後のサンプル中の全ての拡張されたＴ細胞上のＣＤ１３７発現を示すフローサイトメトリープロットである。
【図１６】
図１６Ａおよび１６Ｂは、二次刺激後のＣＤ５４発現を示すフローサイトメトリーデータプロットであり、ここで、一次刺激供給源および二次刺激供給源は変更された。図１６Ａは、ＣＤ４＋細胞上のＣＤ５４の発現プロファイルを示し、一方、図１６Ｂは、ＣＤ８＋細胞上のＣＤ５４の発現プロファイルを示す。
【図１７】
図１７Ａ〜１７Ｄは、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病を有する親から得られたＴ細胞の抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８結合ビーズによる二次刺激後の細胞表現型ならびにＣＤ１５４およびＣＤ１３７発現を示すフローサイトメトリーデータプロットである。図１７Ａおよび１７Ｂは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８結合ビーズを用いる一次刺激後１３日目のサンプル中に存在するＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞（１７Ａ）ならびに抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８結合ビーズを用いる一次刺激後１８日目および二次刺激後７日目のサンプル中に存在するＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞（１７Ｂ）を示す。図１７Ｃおよび１７Ｄは、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病を有する親から得られた細胞の二次刺激後のＣＤ１５４発現およびＣＤ１３７発現を示すフローサイトメトリーデータプロットである。
【図１８Ａ】
図１８Ａは、正常なドナー由来のＴ細胞の一次刺激および二次刺激後のＩＬ−２の経時的な発現を示すプロットである。
【図１８Ｂ】
図１８Ｂは、正常なドナー由来のＴ細胞の一次刺激および二次刺激後のインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の経時的な発現を示すプロットである。
【図１８Ｃ】
図１８Ｃは、正常なドナー由来のＴ細胞の一次刺激および二次刺激後のＩＬ−４の経時的な発現を示すプロットである。
【図１９Ａ】
図１９Ａは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８結合ビーズでの刺激後のＣＤ６２Ｌの経時的な発現を示すプロットである。
【図１９Ｂ】
図１９Ｂは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８結合ビーズでの刺激後のＣＤ６２Ｌの経時的な発現を示すプロットである。
【図２０】
図２０は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８同時固定ビーズでの刺激後のＣＤ４細胞またはＣＤ８細胞のパーセンテージを描くプロットである。
【図２１】
図２１Ａ〜２１Ｂは、実施例ＩＸにおける抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８同時固定化ビーズならびに刺激の有り／無しを利用する処理を用いた刺激後のＣＤ２５発現およびＣＤ１５４発現平均蛍光強度の関数として、それぞれ、フローサイトメトリーデータを示すプロットである。
【図２２】
図２２Ａ〜２２Ｂは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８同時固定化ビーズ刺激の前の、ＣＤ４亜集団およびＣＤ８亜集団の両方（２２Ａ）またはＣＤ４富化集団（２２Ｂ）を有する細胞におけるＣＤ１５４染色　対　コントロール染色（例えば、バックグランド）のフローサイトメトリー分析を示すプロットである。
【図２３】
図２３Ａ〜２３Ｂは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８同時固定化ビーズを用いる末梢血リンパ球の刺激後の培地中のＴＮＦ−　（２３Ａ）およびＩＦＮ−　（２３Ｂ）のＥＬＩＳＡ分析を示すプロットである。
【図２４】
図２４Ａ〜２４Ｂは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８同時固定化ビーズを用いる末梢血リンパ球の刺激後の培地中のＩＬ−４（２４Ａ）およびＩＬ−２（２４Ｂ）のＥＬＩＳＡ分析を示すプロットである。
【図２５】
図２５は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８同時固定化ビーズを用いる末梢血リンパ球の刺激後に、前方散乱分析を使用したＴ細胞サイズにおける増加を描くプロットである。
【図２６Ａ】
図２６Ａは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８同時固定化ビーズを用いる刺激ならびに８日目に同じものを用いる再刺激後のＣＤ６２Ｌ発現（平均蛍光強度、ＭＦＩ）（２６Ａ）のフローサイトメトリーデータを示す棒グラフである。
【図２６Ｂ】
図２６Ｂは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８同時固定化ビーズを用いる刺激ならびに８日目に同じものを用いる再刺激後のＣＤ４９ｄ（ＭＦＩ）発現のフローサイトメトリーデータを示す棒グラフである。
【図２６Ｃ】
図２６Ｃは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８同時固定化ビーズを用いる刺激ならびに８日目に同じものを用いる再刺激後のＣＤ２５（ＭＦＩ）（２６Ｃ）発現のフローサイトメトリーデータを示す棒グラフである。
【図２６Ｄ】
図２６Ｄは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８同時固定化ビーズを用いる刺激ならびに８日目に同じものを用いる再刺激後のＣＤ６９（ＭＦＩ）発現のフローサイトメトリーデータを示す棒グラフである。
【図２６Ｅ】
図２６Ｅは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８同時固定化ビーズを用いる刺激ならびに８日目に同じものを用いる再刺激後のＣＤ１５４（ＭＦＩ）発現のフローサイトメトリーデータを示す棒グラフである。
【図２６Ｆ】
図２６Ｆは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８同時固定化ビーズを用いる刺激ならびに８日目に同じものを用いる再刺激後の前方光散乱（サイズ）発現のフローサイトメトリーデータを示す棒グラフである。
【図２６Ｇ】
図２６Ｇは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８同時固定化ビーズを用いる刺激ならびに８日目に同じものを用いる再刺激後の生存力（％生存ゲート）発現のフローサイトメトリーデータを示す棒グラフである。
【図２６Ｈ】
図２６Ｈは、刺激後の４時間目ならびに１８時間目でのＣＤ６２Ｌを描く。
【図２６Ｉ】
図２６Ｉは、刺激後の４時間目ならびに１８時間目でのＣＤ６９を描く。
【図２６Ｊ】
図２６Ｊは、刺激後の４時間目ならびに１８時間目でのＣＤ４９ｄ描く。
【図２６Ｋ】
図２６Ｋは、刺激後の４時間目ならびに１８時間目でのＣＤ１５４を描く。
【図２６Ｌ】
図２６Ｌは、それぞれ、刺激後の４時間目ならびに１８時間目でのＣＤ２５を描く。

Claims (171)

  1. 同時のＴ細胞の濃縮および細胞表面部分の連結によって、Ｔ細胞の集団を刺激するための方法であって、以下：
    （ａ）細胞の集団を提供する工程であって、ここで該集団の少なくとも一部がＴ細胞を含む、工程；
    （ｂ）該細胞の集団を表面に接触させる工程であって、ここで、該表面が、該Ｔ細胞の少なくとも一部の細胞表面部分を連結しかつＴ細胞の少なくとも該一部を刺激する１以上の因子を有し、該因子が該表面に結合している、工程；
    （ｃ）Ｔ細胞の濃縮およびＴ細胞表面部分の連結を優勢に駆動する力を適用し、それによってＴ細胞の刺激を誘導する工程、
    を包含する、方法。
  2. 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記表面が、Ｔ細胞の第１の細胞表面部分を連結する第１の因子を有し、該第１の因子が該表面に結合しており；そして該表面または第２の表面が、該Ｔ細胞の第２の部分を連結する第２の因子を有し、該第２の因子が該表面または該第２の表面に結合しており、ここで、該連結が、該Ｔ細胞の増殖を誘導する該第１の因子および該第２の因子による、方法。
  3. 前記表面が、生体適合性である、請求項１に記載の方法。
  4. 前記表面が、天然表面または合成表面である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記表面が、ポリマーを含む、請求項４に記載の方法。
  6. 前記表面が、コラーゲン、精製タンパク質、精製ペプチド、多糖類、グリコサミノグリカン、および細胞外マトリックス構成物からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
  7. 前記多糖類が、キトサン、アルギナート、デキストラン、ヒアルロン酸、およびセルロースからなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
  8. 請求項５に記載の方法であって、ここで、前記ポリマーが、ポリスチレン、ポリエステル、ポリエーテル、ポリ無水物、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリビニルアセテート、ブロックコポリマー、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、およびポリウレタンからなる群より選択される、方法。
  9. 前記ポリマーが、乳酸を含む、請求項８に記載の方法。
  10. 前記ポリマーが、コポリマーである、請求項５に記載の方法。
  11. 前記コポリマーが、乳酸およびグリコール酸（ＰＬＧＡ）を含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記生体適合性表面が、生分解性である、請求項３に記載の方法。
  13. 前記生体適合性表面が、非生分解性である、請求項３に記載の方法。
  14. 前記非生分解性物質が、ポリ（ジメチルシロキサン）およびポリ（エチレン−ビニルアセテート）からなる群より選択されるポリマーを含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 請求項３に記載の方法であって、ここで、前記生体適合性表面が、コラーゲン、金属、ヒドロキシアパタイト、ガラス、アルミネート、バイオセラミック物質、ヒアルロン酸ポリマー、アルギナート、アクリル酸エステルポリマー、乳酸ポリマー、グリコール酸ポリマー、乳酸／グリコール酸ポリマー、精製タンパク質、精製ペプチド、および細胞外マトリックス構成物からなる群より選択される、方法。
  16. 前記生体適合性表面が、移植可能なデバイスと結合される、請求項３に記載の方法。
  17. 前記デバイスが、ステント、カテーテル、繊維、中空繊維、パッチ、および縫合糸からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記表面が、ガラス、シリカ、シリコン、コラーゲン、ヒドロキシアパタイト、ヒドロゲル、ＰＴＦＥ、ポリプロピレン、ポリスチレン、ナイロン、およびポリアクリルアミドからなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
  19. 前記表面が、脂質、プレート、皿、袋、棒、ペレット、繊維、およびメッシュからなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
  20. 前記表面が、粒子である、請求項４に記載の方法。
  21. 前記粒子が、ビーズ、ミクロスフェア、ナノ粒子、およびコロイド粒子からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記ビーズが、直径約５ナノメートル〜約５００ミクロンである、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記因子が、タンパク質リガンド、天然リガンド、および合成リガンドからなる群より独立して選択される、請求項１に記載の方法。
  24. 請求項２３に記載の方法であって、前記因子が、抗体、抗体フラグメント、ペプチド、ポリペプチド、糖ペプチド、レセプター、ステロイド、ホルモン、マイトジェン、抗原、スーパー抗原、増殖因子、サイトカイン、レクチン、ウイルスタンパク質、接着分子、およびケモカインからなる群より独立して選択される、方法。
  25. 少なくとも１つの因子が、抗体または抗体フラグメントである、請求項２４に記載の方法。
  26. 第１の因子が、抗体および抗体フラグメントであり、そして第２の因子が、抗体および抗体フラグメントである、請求項２４に記載の方法。
  27. 前記第１の因子および前記第２の因子が、異なる抗体である、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記第１の因子が、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２抗体、または抗ＣＤ３抗体もしくは抗ＣＤ２抗体の抗体フラグメントである、請求項２４に記載の方法。
  29. 前記第２の因子が、抗ＣＤ２８抗体またはその抗体フラグメントである、請求項２４または２７のいずれかに記載の方法。
  30. 前記第２の因子が、ＣＤ２８に対する天然のリガンドである、請求項２４または２７のいずれかに記載の方法。
  31. 前記天然のリガンドが、Ｂ７−１またはＢ７−２を含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記力が、重力より大きい力、水力、膜透過圧によって生成される濾過力、遠心力、および磁力からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  33. 前記磁力が、磁石によって生成され、該磁石は、該磁石の表面で約２００ガウスと約１２，０００ガウスとの間の範囲の磁場強度を有する、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記表面が、常磁性粒子の表面である、請求項１に記載の方法。
  35. 前記表面への前記因子の結合が、共有結合、非共有結合、静電気結合、または疎水結合である、請求項１に記載の方法。
  36. 前記連結されているＴ細胞が、連結されていないＴ細胞から分離される、請求項１に記載の方法。
  37. 前記Ｔ細胞が、免疫応答不全を改善する、請求項１に記載の方法。
  38. 同時の細胞表面部分の連結およびＴ細胞の凝集によるＴ細胞の刺激のための方法であって、以下：
    （ａ）Ｔ細胞を含む細胞集団を提供する工程；
    （ｂ）該細胞集団を表面に接触させる工程であって、ここで、該表面が、細胞表面部分に対して特異的な１以上のリガンドを有し、該リガンドが該表面に結合している、工程；
    （ｃ）Ｔ細胞および表面の濃縮を駆動する力を適用する工程；および
    （ｄ）所望の刺激を達成するために十分な期間該細胞をインキュベートする工程、
    を包含する、方法。
  39. 前記所望の刺激を達成するために十分な時間が、１分〜８日である、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記所望の刺激を達成するために十分な時間が、１日〜５日である、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記表面が、生体適合性である、請求項３８に記載の方法。
  42. 前記表面が、天然表面または合成表面である、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記表面が、ガラス、シリカ、シリコン、コラーゲン、ヒドロキシアパタイト、ヒドロゲル、ＰＴＦＥ、ポリプロピレン、ポリスチレン、ナイロン、デキストラン、およびポリアクリルアミドからなる群より選択される、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記表面が、プレート、皿、袋、棒、ペレット、繊維、およびメッシュからなる群より選択される、請求項３８に記載の方法。
  45. 前記表面が、粒子である、請求項３８に記載の方法。
  46. 前記粒子が、ビーズ、ミクロスフェア、ナノ粒子、およびコロイド粒子からなる群より選択される、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記ビーズが、直径約５ナノメートル〜約５００ミクロンである、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記リガンドが、タンパク質、天然リガンド、および合成リガンドからなる群より選択される、請求項３８に記載の方法。
  49. 請求項３８に記載の方法であって、ここで、前記リガンドが、抗体、抗体フラグメント、ペプチド、ポリペプチド、糖ペプチド、可溶レセプター、ステロイド、ホルモン、マイトジェン、抗原、リガンド、スーパー抗原、増殖因子、サイトカイン、レクチン、およびケモカインからなる群より選択される、方法。
  50. 少なくとも１つのリガンドが、抗体または抗体フラグメントである、請求項４９に記載の方法。
  51. 少なくとも２つのリガンドが、抗体または抗体フラグメントである、請求項４９に記載の方法。
  52. 少なくとも２つのリガンドが存在し、そしてそれらが異なる抗体または抗体フラグメントである、請求項４９に記載の方法。
  53. 少なくとも１つのリガンドが、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２抗体、または抗ＣＤ３抗体もしくは抗ＣＤ２抗体の抗体フラグメントである、請求項４９に記載の方法。
  54. 少なくとも１つのリガンドが、抗ＣＤ２８抗体またはその抗体フラグメントである、請求項４９または５３のいずれかに記載の方法。
  55. 少なくとも１つのリガンドが、ＣＤ２８に対する天然のリガンドである、請求項４９または５３のいずれかに記載の方法。
  56. 前記天然リガンドが、Ｂ７−１またはＢ７−２を含む、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記力が、重力より大きい力、水力、膜透過圧によって生成される濾過力、遠心力、および磁力からなる群より選択される、請求項３８に記載の方法。
  58. 前記磁力が、磁石によって生成され、該磁石は、該磁石の表面で約２００ガウスと約１２，０００ガウスとの間の範囲の磁場強度を有する、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記表面が、常磁性粒子の表面である、請求項３８に記載の方法。
  60. 前記表面への前記リガンドの結合が、共有結合、非共有結合、静電気結合、または疎水結合である、請求項３８に記載の方法。
  61. 工程（ｄ）の前または工程（ｄ）と同時に、非濃縮細胞から、表面を用いて濃縮されたＴ細胞を分離する工程を包含する、請求項３８に記載の方法。
  62. インビボでＴ細胞の活性化を誘導するために適用される方法であって、動物に常磁性粒子を提供する工程であって、該粒子が、Ｔ細胞の活性化を誘導するＴ細胞表面部分に対して特異的なリガンドを有し、該リガンドが該粒子に結合している、工程；該動物の別々の領域に磁場を適用する工程；およびそれによって該別々の領域で該粒子に結合したＴ細胞の局在および活性化を誘導する工程、を包含する、方法。
  63. 同時の標的細胞の濃縮および標的細胞表面部分の連結によって、標的細胞の集団を刺激するための方法であって、以下：
    （ａ）細胞の集団を提供する工程であって、該集団の少なくとも一部が標的細胞を含む、工程；
    （ｂ）該細胞の集団を表面に接触させる工程であって、ここで、該表面が、該標的細胞の少なくとも一部の細胞表面部分を連結しかつ標的細胞の少なくとも該一部を刺激する１以上の因子を有し、該因子が該表面に結合している、工程；
    （ｃ）標的細胞の濃縮および標的細胞表面部分の連結を優勢に駆動する力を適用し、それによって標的細胞の刺激を誘導する工程、
    を包含する、方法。
  64. 請求項６３に記載の方法であって、ここで、前記表面が、標的細胞の第１の細胞表面部分を連結する第１の因子を有し、該第１の因子が該表面に結合しており；そして該表面または第２の表面が、該標的細胞の第２の部分を連結する第２の因子を有し、該第２の因子が該表面または該第２の表面に結合しており、ここで、該連結が、該標的細胞のシグナル伝達を誘導する該第１および第２の因子による、方法。
  65. 前記表面が、生体適合性である、請求項６３に記載の方法。
  66. 前記表面が、天然表面または合成表面である、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記表面が、ポリマーを含む、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記表面が、コラーゲン、精製タンパク質、精製ペプチド、多糖類、グリコサミノグリカン、および細胞外マトリックス構成物からなる群より選択される、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記多糖類が、キトサン、アルギナート、デキストラン、ヒアルロン酸、およびセルロースからなる群より選択される、請求項６８に記載の方法。
  70. 請求項６７に記載の方法であって、ここで、前記ポリマーが、ポリエステル、ポリエーテル、ポリ無水物、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリビニルアセテート、ブロックコポリマー、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、およびポリウレタンからなる群より選択される、方法。
  71. 前記ポリマーが、乳酸を含む、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記ポリマーが、コポリマーである、請求項６７に記載の方法。
  73. 前記コポリマーが、乳酸およびグリコール酸（ＰＬＧＡ）を含む、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記生体適合性表面が、生分解性である、請求項６５に記載の方法。
  75. 前記生体適合性表面が、非生分解性である、請求項６５に記載の方法。
  76. 前記非生分解性物質が、ポリ（ジメチルシロキサン）およびポリ（エチレン−ビニルアセテート）からなる群より選択されるポリマーを含む、請求項７５に記載の方法。
  77. 請求項６５に記載の方法であって、ここで、前記生体適合性表面が、コラーゲン、金属、ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミネート、バイオセラミック材料、ヒアルロン酸ポリマー、アルギナート、アクリル酸エステルポリマー、乳酸ポリマー、グリコール酸ポリマー、乳酸／グリコール酸ポリマー、精製タンパク質、精製ペプチド、および細胞外マトリックス構成物からなる群より選択される、方法。
  78. 前記生体適合性表面が、移植可能なデバイスと結合される、請求項６５に記載の方法。
  79. 前記デバイスが、ステント、カテーテル、繊維、中空繊維、パッチ、および縫合糸からなる群より選択される、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記表面が、ガラス、シリカ、シリコン、コラーゲン、ヒドロキシアパタイト、ヒドロゲル、ＰＴＦＥ、ポリプロピレン、ポリスチレン、ナイロン、およびポリアクリルアミドからなる群より選択される、請求項６６に記載の方法。
  81. 前記表面が、脂質、プレート、皿、袋、棒、ペレット、繊維、およびメッシュからなる群より選択される、請求項６６に記載の方法。
  82. 前記表面が、粒子である、請求項６６に記載の方法。
  83. 前記粒子が、ビーズ、ミクロスフェア、ナノ粒子、およびコロイド粒子からなる群より選択される、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記ビーズが、直径約５ナノメートル〜約５００ミクロンである、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記因子が、タンパク質リガンド、天然リガンド、および合成リガンドからなる群より独立して選択される、請求項６３に記載の方法。
  86. 請求項８５に記載の方法であって、前記因子が、抗体、抗体フラグメント、ペプチド、ポリペプチド、糖ペプチド、レセプター、ステロイド、ホルモン、マイトジェン、抗原、スーパー抗原、増殖因子、サイトカイン、レクチン、ウイルスタンパク質、接着分子、およびケモカインからなる群より独立して選択される、方法。
  87. 少なくとも１つの因子が、抗体または抗体フラグメントである、請求項８６に記載の方法。
  88. 第１の因子が、抗体または抗体フラグメントであり、そして第２の因子が、抗体または抗体フラグメントである、請求項８６に記載の方法。
  89. 前記第１の因子および前記第２の因子が、異なる抗体または抗体フラグメントである、請求項８６に記載の方法。
  90. 前記力が、重力より大きい力、水力、遠心力、膜透過圧によって生成される濾過力、および磁力からなる群より選択される、請求項６３に記載の方法。
  91. 前記磁力が、磁石によって生成され、該磁石は、該磁石の表面で約２００ガウスと約１２，０００ガウスとの間の範囲の磁場強度を有する、請求項３２に記載の方法。
  92. 前記表面が、常磁性粒子の表面である、請求項６３に記載の方法。
  93. 前記表面への前記因子の結合が、共有結合、非共有結合、静電気結合、または疎水結合である、請求項６３に記載の方法。
  94. 細胞表面部分の連結および標的細胞の濃縮による標的細胞の刺激のための方法であって、以下：
    （ａ）標的細胞を含む細胞集団を提供する工程；
    （ｂ）該細胞集団を表面に接触させる工程であって、ここで、該表面は、細胞表面部分に対して特異的な１以上のリガンドを有し、該リガンドが該表面に結合している、工程；
    （ｃ）標的細胞の濃縮および該表面上での該細胞の濃縮を駆動する力を適用する工程；および
    （ｄ）所望の刺激を達成するために十分な期間、該細胞をインキュベートする工程、
    を包含する、方法。
  95. 所望の刺激を達成するために十分な前記期間が、約１分〜約３０日である、請求項９４に記載の方法。
  96. 所望の刺激を達成するために十分な前記期間が、約１日〜約５日である、請求項９５に記載の方法。
  97. 前記表面が、生体適合性である、請求項９４に記載の方法。
  98. 前記表面が、天然の表面または合成表面である、請求項９７に記載の方法。
  99. 前記表面が、ガラス、シリカ、シリコン、コラーゲン、ヒドロキシアパタイト、ヒドロゲル、ＰＴＦＥ、ポリプロピレン、ポリスチレン、ナイロン、デキストラン、およびポリアクリルアミドからなる群より選択される、請求項９８に記載の方法。
  100. 前記表面が、プレート、袋、皿、棒、ペレット、繊維、およびメッシュからなる群より選択される、請求項９４に記載の方法。
  101. 前記表面が、粒子である、請求項９４に記載の方法。
  102. 前記粒子が、ビーズ、ミクロスフェア、ナノ粒子、およびコロイド粒子からなる群より選択される、請求項１０１に記載の方法。
  103. 前記ビーズが、直径約５ナノメートル〜約５００ミクロンである、請求項１０２に記載の方法。
  104. 前記リガンドが、タンパク質、天然リガンド、および合成リガンドからなる群より選択される、請求項９４に記載の方法。
  105. 請求項９４に記載の方法であって、ここで、前記リガンドが、抗体、抗体フラグメント、ペプチド、ポリペプチド、糖ペプチド、レセプター、ステロイド、ホルモン、マイトジェン、抗原、リガンド、スーパー抗原、増殖因子、サイトカイン、レクチン、およびケモカインからなる群より選択される、方法。
  106. 少なくとも１つのリガンドが、抗体または抗体フラグメントである、請求項１０５に記載の方法。
  107. 少なくとも２つのリガンドが、抗体または抗体フラグメントである、請求項１０５に記載の方法。
  108. 少なくとも２つのリガンドが存在し、そして異なる抗体または抗体フラグメントである、請求項１０５に記載の方法。
  109. 前記標的細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、または幹細胞からなる群より選択される、請求項６３または９４のいずれかに記載の方法。
  110. 前記力が、重力より大きい力、水力、膜透過圧によって生成される濾過力、遠心力、および磁力からなる群より選択される、請求項９４に記載の方法。
  111. 前記磁力が、磁石によって生成され、該磁石は、該磁石の表面で約２００ガウスと約１２，０００ガウスとの間の範囲の磁場強度を有する、請求項１１０に記載の方法。
  112. 前記表面が、常磁性粒子の表面である、請求項９４に記載の方法。
  113. 前記表面への前記リガンドの結合が、共有結合、非共有結合、静電気結合、または疎水結合である、請求項９４に記載の方法。
  114. 工程（ｄ）の前または工程（ｄ）と同時に、非濃縮細胞から、濃縮された標的細胞を分離する工程をさらに包含する、請求項９４に記載の方法。
  115. インビボで標的細胞の刺激を誘導する方法であって：動物に常磁性粒子を提供する工程であって、該粒子は、標的細胞の刺激を誘導する標的細胞表面部分に対して特異的なリガンドを有し、該リガンドが該粒子に結合している、工程；該動物の別々の領域に磁場を適用する工程；およびそれによって該別々の領域で該粒子に結合した該標的細胞の局在化および刺激を誘導する工程、を包含する、方法。
  116. レセプターを保有する細胞においてレセプターの分極を誘導する方法であって、以下：
    ａ）細胞集団を提供する工程；
    ｂ）該細胞集団を固体表面に接触させる工程であって、ここで、該固体表面が、該細胞集団の少なくとも一部上に存在する細胞表面レセプターに対して特異的な１以上のリガンドを有し、該リガンドが該表面に結合している、工程；および　ｃ）細胞の濃縮および細胞表面レセプターの連結を駆動する力を適用する工程、
    を包含する、方法。
  117. 細胞表面分子の凝集を誘導するための方法であって、以下：
    ａ）標的細胞表面分子を有する細胞の集団を提供する工程；
    ｂ）固体表面に該細胞の集団を接触させる工程であって、ここで、該固体表面が、少なくとも１つの標的細胞表面分子に対するリガンドを有し、該リガンドが該固体表面に結合している、工程；
    ｃ）標的細胞表面分子の凝集を駆動する力を適用する工程、
    を包含する、方法。
  118. 該細胞集団が、リンパ球を含む、請求項１１７に記載の方法。
  119. 前記固体表面が、プレート、袋、皿、棒、ペレット、繊維、ミクロスフィア、およびビーズからなる群より選択される、請求項１１６または１１７のいずれかに記載の方法。
  120. 前記リガンドが、抗体、天然リガンド、および合成リガンドからなる群より選択される、請求項１１６または１１７のいずれかに記載の方法。
  121. 前記リガンドが、抗体、ペプチド、ポリペプチド、増殖因子、サイトカイン、またはケモカインを含む、請求項１２０に記載の方法。
  122. 前記力が、重力より大きい力、水力、膜透過圧によって生成される濾過力、遠心力、および磁力からなる群より選択される、請求項１１６または１１７のいずれかに記載の方法。
  123. 前記磁力が、磁石によって生成され、該磁石は、該磁石の表面で約２００ガウスと約１２，０００ガウスとの間の範囲の磁場強度を有する、請求項１２２に記載の方法。
  124. 前記固体表面が、常磁性である、請求項１１６または１１７のいずれかに記載の方法。
  125. 前記レセプター結合が、細胞性事象のダウンレギュレーションまたは抑制を導く、請求項１１６または１１７のいずれかに記載の方法。
  126. 前記レセプター結合が、細胞性事象のアップレギュレーションまたは活性化を導く、請求項１１６または１１７のいずれかに記載の方法。
  127. 前記細胞性事象が、レセプター媒介性シグナル伝達である、請求項１１６に記載の方法。
  128. 前記力が、細胞表面部分の濃縮または方向付けを駆動する、請求項９４に記載の方法。
  129. Ｔ細胞の集団が増殖するように誘導するための方法であって、約２時間〜約９日の間の期間、該Ｔ細胞を固体表面に接触させる工程であって、該固体表面が、該表面上に固定された第１の因子および第２の因子を有し、そしてここで、該第１の因子が活性化シグナルを提供し、かつ該第２の因子が該Ｔ細胞に対する同時刺激シグナルを提供する、工程、を包含する、方法。
  130. 前記期間が、約２時間と約４８時間との間である、請求項１２９に記載の方法。
  131. 前記期間が、約２時間と約１２時間との間である、請求項１３０に記載の方法。
  132. 前記期間が、約２日と約８日との間である、請求項１２９に記載の方法。
  133. 前記期間が、約３日と約６日との間である、請求項１２９に記載の方法。
  134. 前記第１の因子および前記第２の因子が、同じ固体表面上に固定される、請求項１２９に記載の方法。
  135. 前記固体表面が、平らな表面、不規則な表面、球状の表面からなる群より選択される、請求項１３４に記載の方法。
  136. 前記固体表面が、ビーズである、請求項１２９に記載の方法。
  137. 前記不規則な固体表面が、可塑性の表面である、請求項１３５に記載の方法。
  138. 前記第１の因子が、ＣＤ３を結合する抗体または抗体フラグメントを含み、そして前記第２の因子が、ＣＤ２８を結合する抗体または抗体フラグメントを含む、請求項１２９に記載の方法。
  139. 請求項１２９〜１３８のいずれか１つに記載の方法によって生成された、Ｔ細胞の集団。
  140. 請求項１３９に記載のＴ細胞の集団および薬学的に受容可能な賦形剤を含む、組成物。
  141. Ｔ細胞の集団が増殖するように誘導するための方法であって、以下：
    ａ．Ｔ細胞をビーズ上に固定した第１の因子に接触させることによって該Ｔ細胞の集団を活性化する工程であって、ここで、該ビーズが約２０ミクロンと約１ミリメートルとの間の直径を有する、工程；および
    ｂ．該Ｔ細胞の表面上の補助分子を、該補助分子と結合する第２の因子で刺激し、それによって該Ｔ細胞の増殖を誘導する工程であって、ここで、該第２の因子が該ビーズ上に固定されている、工程、
    を包含する、方法。
  142. 前記ビーズが、約８０ミクロンと約５００ミクロンとの間の直径を有する、請求項１４１に記載の方法。
  143. 前記ビーズが、約１００ミクロンと約４００ミクロンとの間の直径を有する、請求項１４２に記載の方法。
  144. 前記ビーズが、約２５０ミクロンと約３００ミクロンとの間の直径を有する、請求項１４３に記載の方法。
  145. 前記ビーズが、常磁性ビーズである、請求項１４１〜１４４のいずれか１項に記載の方法。
  146. 前記第１の因子が抗ＣＤ３抗体を含み、そして前記第２の因子が抗ＣＤ２８抗体を含む、請求項１４１に記載の方法。
  147. 前記Ｔ細胞の集団が、ヘルパーＴ細胞を含む、請求項１４６に記載の方法。
  148. 濾過によって前記Ｔ細胞から前記ビーズを分離する工程をさらに含む、請求項１４１〜１４４のいずれか１項に記載の方法。
  149. 前記第１の因子が抗ＣＤ３抗体を含み、そして前記第２の因子が抗ＣＤ２８抗体を含む、請求項１４８に記載の方法。
  150. 前記Ｔ細胞の集団が、ヘルパーＴ細胞を含む、請求項１４９に記載の方法。
  151. 活性化Ｔ細胞の集団であって、ここで、該細胞の少なくとも部分集団が、刺激後約１日と約４日との間でＣＤ１５４レベルがピークに達する表現型を有する、集団。
  152. 活性化Ｔ細胞の集団であって、ここで、該集団が約６０％より多くのＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、集団。
  153. 活性化Ｔ細胞の集団であって、ここで、該集団が少なくとも約７０％のＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、集団。
  154. 活性化Ｔ細胞の集団であって、約２時間〜約９日間の期間にわたって、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体またはこれらのフラグメントとの接触によって増殖するように予め刺激された、集団。
  155. 前記接触の期間が、約４時間〜約８日間である、請求項１５４に記載の集団。
  156. 前記接触の期間が、約４時間〜約８日間である、請求項１５４に記載の集団。
  157. 活性化Ｔ細胞の集団であって、ここで、該Ｔ細胞が、約２時間〜約９日間の間の期間にわたる固定された第１の因子および第２の因子との接触によって増殖するように予め誘導されており、ここで、該第１の因子が活性化シグナルを提供し、そして該第２の因子が該Ｔ細胞に対する同時刺激シグナルを提供する、集団。
  158. 前記Ｔ細胞が、一次シグナルおよび二次シグナルの活性化後、約２日と約７日との間にピークのインターロイキン−４レベルを生じる、請求項１５７に記載の集団。
  159. 前記Ｔ細胞が、一次シグナルおよび二次シグナルの活性化後、約２日と約７日との間にピークのインターロイキン−２レベルを生じる、請求項１５７に記載の集団。
  160. 前記Ｔ細胞が、一次シグナルおよび二次シグナルの活性化後、約２日と約７日との間にピークの腫瘍壊死因子−αレベルまたはインターロイキン−γレベルを生じる、請求項１５７に記載の集団。
  161. 請求項１５１〜１６０のいずれか１項に記載のＴ細胞および薬学的に受容可能な賦形剤を含む、組成物。
  162. Ｔ細胞および単球を含む懸濁物から単球を除去するための方法であって、該懸濁物を常磁性ビーズに接触させる工程であって、ここで、該ビーズが約２．８μｍと約１０μｍとの間の直径を有する、工程、およびその後、磁気引力によって該懸濁物から該単球を分離する工程、
    を包含する、方法。
  163. 前記懸濁物が、全血球懸濁物である、請求項１６２に記載の方法。
  164. 前記ビーズが、該ビーズに結合した少なくとも１つの抗体を有する、請求項１６２および１６３のいずれか１項に記載の方法。
  165. 前記抗体が、非特異的抗体である、請求項１６４に記載の方法。
  166. 患者において腫瘍を処置する方法であって、該患者に、請求項１６１に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。
  167. 前記患者が、投与の前に内在性のリンパ球を除去される、請求項１６６に記載の方法。
  168. 前記Ｔ細胞が、活性化前の前記患者由来である、請求項１６６に記載の方法。
  169. 前記Ｔ細胞集団が、単球を除去される、請求項１６６に記載の方法。
  170. 刺激されたＴ細胞の集団であって、該集団が、同時の濃縮および刺激の非存在下で抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で刺激されたＴ細胞よりも、少なくとも１０％高いＣＤ１５４発現レベルを有し、ここで、該レベルが、Ｔ細胞の刺激後１〜４日の間にフローサイトメトリーによって決定される、集団。
  171. 刺激されたＴ細胞の集団であって、該集団が、同時の濃縮および刺激の非存在下で抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で刺激されたＴ細胞よりも、少なくとも１０％高いＣＤ２５発現レベルを有し、ここで、該レベルが、Ｔ細胞の刺激後１〜４日の間にフローサイトメトリーによって決定される、集団。
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