SK288032B6 - Use of IL-18 inhibitors for manufacture of medicament for treatment and/or prevention of alcoholic hepatitis - Google Patents

Abstract

Use of IL-18 inhibitor selected from the group of an IL-18 antibody and an IL-18 binding protein or an isoform, a mutein, fused protein, functional derivative, active fraction or circularly permutated derivative thereof having essentially the same activity as an IL-18 binding protein, for the manufacture of a medicament for treatment and/or prevention of chronic liver injury, selected from the group consisting of alcoholic hepatitis.

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka terapeutického použitia IL-18 inhibítorov na liečenie a/alebo prevenciu alkoholickej hepatitídy.

Doterajší stav techniky

V roku 1989 bola opísaná endotoxínom indukovaná sérová aktivita, ktorá indukuje interferón γ (IFN-γ) získaný z myšacích slezinových buniek (Micallef a ďalší, 1996). Táto sérová aktivita nefungovala ako priamy induktor IFN-γ, ale ako ko-stimulant spolu s IL-2 alebo mitogénmi. Pokus oddeliť aktivitu od postendotoxínového myšacieho séra odhalil zdanlivo homogénny 50-55kDa proteín. Keďže aj iné cytokíny môžu slúžiť ako ko-stimulanty IFN-γ produkcie, až z neschopnosti neutralizačných protilátok proti IL-1, IL-4, IL-5, IL-6 alebo TNF neutralizovať sérovú aktivitu vyplynulo, že ide o odlišný faktor. V roku 1995 tí istí vedci demonštrovali, že endotoxínom indukovaný ko-stimulant IFN-γ produkcie sa nachádza v extraktoch pečení z myší, na ktoré sa predtým pôsobilo P. acnes (Novick a ďalší, 1992). V tomto modeli expanduje pečeňová makrofágová populácia (Kupfferove bunky) a v týchto myšiach sa stáva letálnou nízka dávka bakteriálneho lipopolysacharidu (LPS), ktorá nie je letálna v myšiach, ktoré neboli predtým ošetrené. Faktor, pomenovaný ako IFN-γ indukujúci faktor (IGIF) a neskôr označený ako interleukín-18 (IL-18), sa purifikoval do homogenity z 1200 gramov pečení myší ošetrených s P. acnes. Degenerované oligonukleotidy odvodené od aminokyselinových sekvencii purifikovaného IL-18 sa použili na klonovanie myšacej IL-18 cDNA (Novick a ďalší, 1992). IL-18 je 18-19kDa proteín obsahujúci 157 aminokyselín, ktorý nemá zrejmé podobnosti so žiadnym peptidom v databázach, Mediátorové RNA IL-18 a interleukínu-12 (IL-12) sa bez problémov dajú detegovať v Kupfferových bunkách a v aktivovaných makrofágoch. Rekombinantný IL-18 indukuje IFN-γ účinnejšie ako IL-12, zjavne prostredníctvom inej dráhy (Novick a ďalší, 1992). Podobne, pri endotoxínom indukovanej sérovej aktivite, IL-18 neindukuje IFN-γ sám, ale primáme fúnguje ako ko-stimulant s mitogénmi alebo s IL-2. IL-18 zosilňuje T bunkovú proliferáciu, zjavne prostredníctvom IL-2-závislej dráhy, a zosilňuje produkciu Thl cytokínu in vitro a vykazuje synergizmus, keď sa kombinuje s IL-12, vo vzťahu k posilneniu produkcie IFN-γ (Maliszewski a ďalší, 1990).

Ukázalo sa, že neutralizačné protilátky proti myšaciemu IL-18 zabraňujú letálnosti nízkej dávky LPS pri myšiach predošetrených s P. acnes. Iné publikácie uvádzajú dôležitosť IFN-γ ako mediátora LPS letality v predošetrených myšiach. Napríklad, neutralizačné anti-IFN-γ protilátky chránili myši pred Shwartzmanpodobnému šoku (Fantuzzi a ďalší, 1998) a myši, ktorým chýbal IFN-γ receptor a boli ošetrené s galaktozamínom, boli rezistentné proti LPS-indukovanému usmrteniu (Bym, 1990). Takže nebolo neočakávaným, že neutralizačné protilátky proti myšaciemu IL-18 chránili myši, vopred ošetrené s P. acnes, proti letálnemu LPS (Novick a ďalší, 1992). Liečba s anti-myšacím IL-18 tiež chránila prežívajúce myši pred ťažkou pečeňovou cytotoxicitou.

Po tom, ako sa klonovala myšacia forma, zverejnila sa ľudská cDNA sekvencia pre IL-18 v roku 1996 (Okamura a ďalší, 1995). Rekombinantný ľudský IL-18 má prirodzenú IL-18 aktivitu (Okamura a ďalší, 1995). Ľudský rekombinantný IL-18 nemá priamy IFN-γ indukujúci účinok v ľudských T-bunkách, ale fúnguje ako ko-stimulant na produkciu IFN-γ a iných T-pomocných bunkových 1 (Thl) cytokínov (Okamura a ďalší, 1995). Doteraz sa IL-18 považuje primáme za ko-stimulant produkcie Thl cytokínov (IFN-γ, IL-2 a faktora stimulujúceho granulocytové makrofágové kolónie) (Izaki, 1978) a aj za ko-stimulant FAS-ligandom sprostredkovanej cytotoxicity klonov myšacích prirodzených zabíjačských buniek (Novick a ďalší, 1989).

Prostredníctvom klonovania IL-18 z postihnutých tkanív a prostredníctvom študovania IL-18 génovej expresie sa zistilo úzke spojenie tohto cytokínu s autoimunitným ochorením. Pri neobéznych diabetických myšiach (NOD) sa spontánne vyvíja autoimunitná inzulitída a cukrovka, ktoré môžu byť urýchlené a synchronizované jedinou injekciou cyklofosfamidu. Prostredníctvom reverznej transkriptázovej PCR sa v NOD myšacích pankreasoch dokázala IL-18 mRNA v priebehu skorých štádií inzulitídy. Hladiny IL-18 mRNA sa rýchlo zvyšovali po ošetrení s cyklofosfamidom a predchádzali zvýšeniu IFN-γ mRNA a následnej cukrovke. Je zaujímavé, že tieto kinetiky napodobujú kinetiky IL-12-p40 mRNA, čo vedie k úzkej korelácii hladín jednotlivých mRNA. Po klonovaní IL-18 cDNA z pankreatickej RNA nasledovalo sekvenovanie, ktoré odhalilo zhodnosť s IL-18 sekvenciou klonovanou z Kupfferových buniek a in vivo pred-aktivovaných makrofágov. Aj NOD myšacie makrofágy odpovedali na cyklofosfamid expresiou IL-18 génu, zatiaľ čo makrofágy paralelne ošetrených Balb/c myší nie. Takže IL-18 expresia je abnormálne regulovaná v autoimunitných NOD myšiach a je úzko spojená s vývinom cukrovky (Novick a ďalší, 1992).

IL-18 má potenciálnu úlohu pri imunoregulácii alebo pri zápale prostredníctvom oslabenia funkčného účinku Fas ligandu na Thl bunky (Conti a ďalší, 1997). 11-18 sa exprimuje aj v kôre nadobličiek a preto mô2

SK 288032 Β6 že byť vylučovaným neuroimunomodulátorom, ktorý má dôležitú úlohu pri zosúlad’ovaní imunitného systému po stresujúcej skúsenosti (Chater, 1986).

In vivo sa IL-18 vytvára štiepením pro-IL-18 a zdá sa, že jeho endogénna aktivita je zodpovedná za produkciu lFN-γ pri P. acnes- a LPS-sprostredkovanej letalite. Zrelý IL-18 sa produkuje zo svojho prekurzora prostredníctvom IL-Ιβ konvertujúceho enzýmu (IL-lbeta-konvertujúci enzým, ICE, kaspáza-1).

IL-18 receptor pozostáva z najmenej dvoch zložiek, ktoré spolupracujú pri viazaní ligandu. V myšacích T bunkách stimulovaných s IL-12 sa našlo väzobné miesto s vysokou afinitou a väzobné miesto s nízkou afinitou (Yoshimoto a ďalší, 1998), čo naznačuje viacreťazcový receptorový komplex. Doteraz boli identifikované dve receptora vé podjednotky, pričom obe patria do IL-1 receptora vej rodiny (Pamet a ďalší, 1996). Prenos signálu IL-18 zahŕňa aktiváciu NF-κΒ (DiDonato a ďalší, 1997).

Niekoľkými známymi cytokín viažucimi proteínmi sú rozpustné cytokínové receptory a tieto zodpovedajú extracelulámym ligand viažucim doménam im prislúchajúcich bunkových povrchových cytokínových receptorov. Odvodené sú buď alternatívnym zostrihom pre-mRNA, ktorá je spoločná pre bunkový povrchový receptor, alebo proteolytickým štiepením bunkového povrchového receptora. Takéto rozpustné receptory boli v minulosti opísané a medzi inými zahŕňajú rozpustné receptory IL-6 a IFN-γ (Nakamura a ďalší, 1989), TNF (Dao a ďalší, 1996; Engelmann a ďalší, 1989), IL-1 a IL-4 (John, 1986), IFN-α/β (Mizushima a Nagata, 1990) a iné. Jeden cytokín-viažuci protein, s názvom osteoprotegerín (OPG, známy aj ako osteoklastový inhibičný faktor - OCIF), člen TNFR/Fas rodiny, sa zdá byť prvým príkladom rozpustného receptora, ktorý existuje len vo forme vylučovaného proteinu (Ariderson, 1997; Bollon, 1980).

V súčasnosti sa z ľudského moču izoloval rozpustný protein majúci vysokú afinitu proti IL-18 a opísali sa myšacie cDNAs (Novick a ďalší, 1999; WO 99/09063). Protein sa označil ako IL-18 viažuci protein (IL-18BP).

IL-I8BP nie je extracelulámou doménou jedného zo známych IL-18 receptorov, aleje vylučovaným, prirodzene cirkulujúcim proteínom. Patrí do novej rodiny vylučovaných proteinov. Táto rodina okrem toho zahŕňa niekoľko Poxvírusom kódovaných proteinov, ktoré majú vysokú homológiu s IL-18BP (Novick a ďalší, 1999). IL-18BP sa konštitutívne exprimuje v slezine, patrí do imunoglobulínovej superrodiny a má obmedzenú homológiu s receptorom IL-1 typu II. Tento gén bol lokalizovaný na ľudský chromozóm 1 lql3 a v 8,3kb genomickej sekvencii sa nenašiel žiadny exón kódujúci transmembránovú doménu (Novick a ďalší, 1999).

Štyri ľudské a dve myšacie izoformy IL-18BP, ktoré sú výsledkom mRNA zostrihu a našli sa v rôznych cDNA knižniciach, sa exprimovali, purifikovali a zhodnotilo sa ich viazanie a neutralizácia IL-18 biologických aktivít (Kim a ďalší, 2000). Ľudská IL-18BP izoforma a (IL-18BPa) má najvyššiu afinitu proti IL-18 s rýchlym nástupom a pomalým odbúravaním a disociačnou konštantou (K(d)) 399 pM. IL-18BPc zdieľa Ig doménu IL-18BPa okrem 29 C-koncových aminokyselín; K(d) IL-18BPc je desaťnásobne nižšia (2,94 nM). Napriek tomu IL-18BPa a IL-18BPc neutralizujú IL-18 na viac ako 95 % pri dvojnásobnom molovom nadbytku. IL-18BPb a IL-18BPd izoformám úplne chýba Ig doména a nemajú schopnosť viazať alebo neutralizovať IL-18. Myšacie IL-18c a IL-18d izoformy, obsahujúce rovnakú Ig doménu, tiež neutralizujú na viac ako 95 % myšací IL-18 v dvojnásobnom molovom nadbytku. Ale myšací IL-18BPd, ktorý zdieľa spoločný C-koncový motív s ľudským IL-18BPa, neutralizuje aj ľudský IL-18. Molekulový modeling identifikoval veľké zmiešané elektrostatické a hydrofóbne väzobné miesto v Ig doméne IL-18BP, ktoré by mohlo byť zodpovedné za vysokú afinitu viazania ligandu (Kim a ďalší, 2000).

V súčasnosti sa uvažuje o tom, že interleukín IL-18 sa podieľa na progresii patogénnosti pri chronických zápalových ochoreniach, vrátane endotoxínového šoku, hepatitídy a autoimunitnej cukrovky (Kahiwamura a Okamura, 1998). Ďalšia indikácia o možnej úlohe IL-18 pri vývoji poškodenia pečene je výsledkom experimentov zverejnených Tsuijom a ďalšími (Tsuij a ďalší, 1999), ktoré dokazujú zvýšenie hladiny IL-18 pri lipopolysacharidom indukovanom akútnom poškodení pečene na myšacom modeli. Ale mechanizmus multifúnkčného faktora IL-18 pri vývoji poškodenia pečene doteraz nebol objasnený.

Poškodenie alebo poranenie pečene môže mať rôzne príčiny. Môže byť napríklad spôsobené vírusovými alebo bakteriálnymi infekciami, závislosťou od alkoholu, imunologickými poruchami alebo rakovinou.

Vírusové hepatitídy spôsobené napríklad vírusom hepatitídy B a vírusom hepatitídy C sú veľmi ťažko zvládnuteľné ochorenia, ktoré postihujú veľké množstvo ľudí na celom svete. Počet známych vírusov hepatitídy konštantné rastie. Doteraz boli okrem vírusov hepatitídy B a hepatitídy C objavené najmenej štyri iné vírusy spôsobujúce s vírusom asociovanú hepatitídu, označované vírus hepatitídy A, D, E a G.

Alkoholové ochorenie pečene je ďalším rozšíreným ochorením spojeným s chronickou konzumáciou alkoholu. Imunitná hepatitída je zriedkavé autoimunitné ochorenie, ktoré je ťažko zvládnuteľné. Poškodenie pečene zahŕňa aj poškodenie žlčovodov. Primárna žlčová cirhóza (PBC) je autoimunitné pečeňové ochorenie vyznačujúce sa deštrukciou žlčovodov vnútri pečene.

Niekoľko štúdií demonštrovalo, že poškodenie pečene pri chorobách, ako napríklad alkoholickej hepatitíde, cirhóze pečene, vírusovej hepatitíde a primárnej Žlčovej cirhóze, je spojené s odpoveďami T-pomocných buniek-1 (Thl). V jednej štúdii sa zaviedol nový model poškodenia pečene na myšiach prostredníctvom za3

SK 288032 Β6 vedenia lipozómov obsahujúcich ovalbumín do pečene, po ktorom nasledoval adoptívny transfer ovalbumín-špecifických Thl buniek. Kombinované pôsobenie na myši lipozómami obsahujúcimi ovalbumín a Thl bunkovým transferom spôsobilo zvýšenie sérovej transaminázovej aktivity, ktoré bolo paralelné so zvýšením sérových IFN-γ hladín. V ostrom kontraste bol výsledok transferu Th2 buniek, ktorý viedol k zvýšeniu sérových IL-4 hladín, ale neindukoval poškodenie pečene. Poškodenie pečene bolo blokované anti-IFN-γ protilátkami a protilátkami proti tumorovému nekrotickému faktoru (TNF)-oc. Z týchto zistení vyplýva, že Thl bunky sú hlavné efektorové bunky pri akútnom poškodení pečene (Nishimura a Ohta, 1999). V inom súbore štúdií sa dokázalo, že myši nadmerne exprimujúce IFN-γ majú spontánnu hepatitídu bez akéhokoľvek patogénu alebo akéhokoľvek iného stimulantu (Okamoto a ďalší, 1998).

Iná štúdia skúmala Thl odpovede pri primárnej žlčovej cirhóze (PBC). PBC je autoimunitné pečeňové ochorenie vyznačujúce sa deštrukciou žlčovodov vnútri pečene. Vo všeobecnosti sa verí, že bunkové imunitné mechanizmy, najmä mechanizmy zahŕňajúce T bunky, vedú k tomuto poškodeniu žlčovodov. V súčasnosti sa navrhuje relatívna sila Thl a Th2 odpovedí ako dôležitý faktor pri patofyziológii rôznych autoimunitných ochorení. V tejto štúdii sa hodnotila rovnováha v PBC prostredníctvom detekcie cytokínov špecifických pre jednotlivé podtriedy T buniek, t. j. IFN-γ pre Thl bunky a IL-4 pre Th2 bunky. Pozitívne bunky obsahujúce IFN-γ a IL-4 mediátorové RNA (mRNA) sa počítali v pečeňových rezoch od 18 pacientov s PBC a v kontrolách zahŕňajúcich 35 ochorení vrátane chronickej aktívnej hepatitídy C, obštrukcie mimopečeňových žlčovodov a normálnej pečene, použitím neizotopovej in situ hybridizácie a imunohistochémie. Mononukleáme bunky exprimujúce IFN-γ a IL-4 mRNA sa agregovali v zapálených portálnych žlčovodoch v PBC pečeniach, ale len zriedkavo boli prítomné pri mimopečeňovej žlčovej obštrukcii, alkoholickej fibróze alebo v normálnych pečeňových rezoch. IFN-γ a IL-4 mRNA pozitívne bunky v PBC pečeniach boli detegované vo významne vyšších množstvách ako v kontrolných pečeniach (p < 0,01). Okrem toho IFN-γ mRNA expresia bola bežnejšie detegovaná ako IL-4 expresia v PBC pečeniach a hladiny IFN-γ mRNA expresie vysoko korelovali so stupňom portálnej zápalovej aktivity. IFN-γ mRNA-pozitívne bunky sa detegovali primárne okolo poškodených žlčovodov, ktoré boli obklopené lymfoidnými agregátmi. Z údajov vyplýva, že Thl bunky sú prominentnej šou T bunkovou podtriedou pri lymfoidných infiltrátoch pri PBC (Harada a ďalší, 1997).

Verí sa, že cytokínová vzorka pri rozoznávaní antigénu má zásadný vplyv na rozlišovanie vírusových infekcií a na odbúravanie vírusu. V jednej štúdii sa skúmalo, či cytokínová nerovnováha orientovaná smerom k Th2 typu odpovede má úlohu pri chronickej hepatitíde B. Prostredníctvom RT-PCR sa analyzovali cytokínové profily periférnych krvných mononukleámych buniek asociovaných s chronickou hepatitídou B. Po stimulácii hepatitídovým B povrchovým antigénom (HbsAg) sa detegovala expresia IFN-γ u 41 % pacientov, 1L-2 u 8 % pacientov, IL-4 u 41 % pacientov a IL-10 u 50 % pacientov. Spomedzi týchto cytokínov bola expresia Thl cytokínu IFN-γ asociovaná s vysokými hladinami sérových AST/ALT (aspartát aminotransferáza/alanín aminotransferáza), ktoré predstavujú typické markery poškodenia pečene. Nedokázal sa ochranný účinok Th2 typu cytokínov na hepatocyty. Z toho vyplýva, že produkcia Thl cytokínu, IFN-γ, HBsAg-reaktívnymi bunkami bola spojená s hepatocytovým poškodením pri chronickej hepatitíde B (Lee a ďalší, 1999). Boli zverejnené vysoké hladiny FAS ligandu a jeho receptora (CD95) v pečeni pacientov s hepatitídou B (Luo a ďalší, 1997). FAS ligand sa považuje zajedno z hlavných cytotoxických činidiel vedúcich k apoptóze hepatocytov.

Iná štúdia identifikovala faktory asociované s progresiou poškodenia pečene u 30 neliečených pacientov pozitívnych na vírus hepatitídy C/RNA (HCV/RNA) s chronickou hepatitídou. Nekrozápalové a architektonické poškodenie bolo hodnotené použitím Ishakovho skóre. Aktivované pečeňové hviezdicové bunky (HSC) sa vizualizovali imunohistochemicky, pričom sa vizualizoval a aktín hladkej svaloviny (aSMA), a kvantifikovali sa morfometricky. Plazmatická HCV/RNA sa hodnotila použitím kompetitívnej RT-PCR metódy. Na študovanie typu imunitnej odpovede podieľajúcej sa na progresii poškodenia pečene sa IFN-y-pozitívne bunky (ako expresia Thl-podobnej odpovede) hodnotili imunohistochemicky a kvantifikovali sa prostredníctvom morfometrie. Zistilo sa, že HSC sa poväčšine detegujú v blízkosti oblastí lalokového nekrozápalu alebo pri hranici fibrotického septa. aSMA-pozitívny a Sirius červeňou farbený parenchým významne koreloval s nekrozápalovým a architektonickým skóre. IFNy-pozitívne bunky sa detegovali v peritoneálnych oblastiach asociovaných so zápalovými infiltrátmi a významne korelovali s architektonickým poškodením. Preto sa z toho vyvodilo, že aktivácia HSC a progresia poškodenia pečene sú asociované s Thl-podobnou odpoveďou (Baróni a ďalší, 1999). Podobne ako v prípade hepatitídy B, FAS ligand a jeho receptor sa našli v pečeni a sére pacientov s hepatitídou C (Hiramatsu a ďalší, 1994; Okazaki a ďalší, 1996; Lio a ďalší, 1998).

Zistilo sa, že Thl cytokíny a iné Thl markery sú asociované s alkoholickou hepatitídou a cirhózou pečene. Zápalové stimuly a lipidový peroxidačný aktivovaný nukleárny faktor κ B (NF-κΒ) nadregulujú prozápalové cytokíny a chemokíny. V jednej štúdii sa hodnotil vzťah medzi patologickým poškodením pečene, endotoxémiou, lipidovou peroxidáciou a aktiváciou NF-κΒ a nerovnováha medzi pro- a proti-zápalovými cytokínmi. Potkany (5 na skupinu) sa kŕmili prostredníctvom vnútrožalúdkovej infúzie etanolom a strava obsahovala nasýtený tuk, palmový olej, obilninový olej alebo rybací olej. Pri kontrolných potkanoch dextróza izoka4 loricky nahradila etanol. Uskutočnila sa patologická analýza a robili sa merania endotoxínov, lipidovej peroxidácie, NF-κΒ a hladín mediátorových RNA (mRNA) prozápalových cytokínov (TNFa, IL-lbeta, IFN-γ a IL-12), C-C chemokínov (regulovaných pri aktivácii, exprimovaných a vylučovaných normálnymi T bunkami [RANTES], monocytového chemotaktického proteínu [MCP]-1, makrofágového zápalového proteínu [MIP]-l-a), C-X-C chemokínov (cytokínom indukovaného neutrofilového chemoatraktanu [CINC], MIP-2, IP-10 a epiteliálneho neutrofilového aktivovaného proteínu [ENAJ-78) a antizápalových cytokínov (IL-10, IL-4 a IL-13). Pri potkanoch majúcich nekrozápalové poškodenie (rybací olej-etanol, obilninový olej-etanol) sa pozorovala aktivácia NF-κΒ a zvýšená expresia prozápalových cytokínov C-C a C-X-C chemokínov. Tieto skupiny mali aj najvyššie hladiny endotoxínu a lipidovej peroxidácie. Hladiny 1L-10 a IL-4 mRNA boli nižšie v skupine majúcej zápalové poškodenie pečene. Takže aktivácia NF-κΒ nastáva v prítomnosti prozápalového stimulu a vedie k zvýšenej expresii Thl prozápalových cytokínov a chemokínov (Naji a ďalší, 1999). Pri alkoholických ochoreniach pečene je zvýšená aj hladina FAS ligandu a jeho receptora, čo znova naznačuje, že Thl cytokíny sa podieľajú na autoimunitných procesoch indukovaných pri alkoholickej hepatitíde (Galie a ďalší, 1995; Taieb a ďalší, 1998; Fiore a ďalší, 1999).

TNF-α sa objavil aj v bežnej dráhe pri patogenéze alkoholického pečeňového nekro-zápalu. Zvýšené hladiny pečeňového a sérového TNF boli dokumentované na zvieracích modeloch alkoholického ochorenia pečene a pri humánnom alkoholickom ochorení pečene. Stanovilo sa, že tento disregulovaný TNF metabolizmus má úlohu pri mnohých metabolických komplikáciách a pri poškodení pečene pri alkoholickom ochorení pečene (Grove a ďalší, 1997; McClain a Cohen, 1989). V jednej štúdii sa napríklad zistilo, že pacienti s alkoholickou hepatitídou majú vyššie hladiny TNF-α (priemer 26,3 ng/1; 95 % Cl, 21,7 až 30,9) ako normálny jedinci (6,4 ng/1; Cl, 5,4 až 7,4). Pacienti, ktorí následne zomreli, mali vyššiu hladinu TNF-a (34,7 ng/1; Cl, 27,8 až 41,6) ako tí, ktorí prežili (16,6 ng/1; Cl, 14,0 až 19,2). U pacientov s alkoholickou hepatitídou pozitívne korelovali hladiny TNF-α so sérovým bilirubínom (r = 0,74; P = 0,0009) a sérovým kreatinínom (r = = 0,81; P = 0,0003). Pacienti s alkoholickou hepatitídou mali vyššie hladiny TNF-α ako pacienti s inaktívnou alkoholickou cirhózou (11,1 ng/1; Cl, 8,9 až 13,3) a ťažkí alkoholici bez ochorenia pečene (6,4 ng/1; Cl 5,0 až 7,8). Pacienti s abnormálnou funkciou obličiek mali nižšie hladiny TNF-a (14,1 ng/1; Cl, 5,4 až 22,8) ako pacienti s alkoholickou hepatitídou. Takže sa zhrnulo, že zvýšenie TNF-α pri alkoholickej hepatitíde je najväčšie v najťažších prípadoch, z čoho vyplýva, že TNF-α má úlohu pri patogenéze (Bird a ďalší, 1990).

TNF sprostredkúva mnohé z biologických účinkov endotoxínu. Súčasné štúdie ukázali, že podanie TNF môže spôsobiť poškodenie pečene, a že TNF môže sprostredkovávať letalitu hepatotoxín galaktozamínu. Jedným z najúčinnejších TNF induktorov je endotoxín. Keďže pacienti s alkoholickým pečeňovým ochorením majú často endotoxémiu, a keďže mnohé z klinických manifestácií alkoholickej hepatitídy sú známymi biologickými účinkami TNF, hodnotila sa jeho aktivita u pacientov s alkoholickou hepatitídou. Bazálne a lipopolysacharidom stimulované uvoľňovanie TNF z periférnych krvných monocytov, hlavného zdroja produkcie TNF, sa stanovovalo u 16 pacientov s alkoholickou hepatitídou a u 16 zdravých dobrovoľníkov. Osem zo 16 pacientov s alkoholickou hepatitídou a len dvaja zo 16 zdravých dobrovoľníkov mali detegovateľnú spontánnu TNF aktivitu (p menšie ako 0,05). Po lipopolysacharidovej stimulácii sa významne zvýšil priemer vylučovania TNF monocytmi od pacientov s alkoholickou hepatitídou, pričom bol viac ako dvojnásobný oproti zdravým kontrolám (25,3 ± 3,7 vs. 10,9 ± 2,4 jednotky na ml, p menšie ako 0,005). Na základe toho sa urobil záver, že monocyty od pacientov z alkoholickou hepatitídou majú významne zvýšené spontánne a lipopolysacharidom stimulované uvoľňovanie TNF v porovnaní s monocytmi od zdravých dobrovoľníkov (McClain a Cohen, 1989).

Lipopolysacharid (LPS)-viažuci protein (LBP) a CD14 majú kľúčové sprostredkovateľské úlohy pri aktivácii buniek endotoxínom. Stanovilo sa, že črevný LPS sa podieľa na podpore patologického pečeňového poškodenia pri alkoholickom ochorení pečene. Demonštrovalo sa, že potkany, ktoré boli vnútrožalúdočne kŕmené etanolom v oleji 4 týždne, mali zvýšené hladiny CD 14 v Kupfferových bunkách a LBP v hepatocytoch. Expresia CD14 mRNA bola hodnotená aj v nemyeloidných bunkách. Zosilnenie expresie LBP a CD14 rýchlo zvyšuje LPS-indukovanú expresiu rôznych prozápalových cytokínov a koreluje s prítomnosťou patologického poškodenia pečene pri alkoholickom poškodení pečene (Su a ďalší, 1998; Lukkari a ďalší, 1999).

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je použitie IL-18 inhibítora vybraného zo skupiny, ktorá obsahuje IL-18 protilátku a IL-18 viažuci protein alebo ich izoformu, muteín, fúzovaný protein, funkčný derivát, aktívnu frakciu alebo kruhovo permutovaný derivát, ktoré majú v podstate rovnakú aktivitu ako IL-18 viažuci protein, na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu chronického poškodenia pečene, ktoré je vybrané zo skupiny obsahujúcej alkoholickú hepatitídu.

Použitie kombinácie IL-18 inhibítora a/alebo interferónu, a/alebo TNF antagonistu, a/alebo COX-2 inhibítora sa tiež považuje za spadajúce do rozsahu vynálezu. Na aplikáciu génových terapeutických prístupov na

SK 288032 Β6 dodanie IL-18 inhibítora do chorých tkanív alebo buniek sa ďalšie predmety vynálezu týkajú použitia expresných vektorov obsahujúcich kódujúcu sekvenciu IL-18 inhibítora na liečenie a/alebo prevenciu alkoholickej hepatitídy. Vynález sa ďalej týka použitia endogénnej génovej aktivácie IL-18 inhibítorov a použitia buniek pripravených génovým inžinierstvom na expresiu IL-18 inhibítorov na prevenciu a/alebo liečenie alkoholickej hepatitídy.

Výraz „inhibítor IL-18“ v kontexte tohto opisu označuje akúkoľvek molekulu modulujúcu IL-18 produkciu a/alebo funkciu takým spôsobom, že produkcia a/alebo funkcia IL-18 je oslabená, redukovaná alebo čiastočne, podstatne alebo úplne zastavená alebo blokovaná. Výraz IL-18 inhibítor je mienený tak, že zahŕňa inhibítory IL-18 produkcie, ako aj inhibítory IL-18 funkcie.

Inhibítorom produkcie môže byť akákoľvek molekula negatívne ovplyvňujúca syntézu, spracovanie alebo zrenie IL-18. Inhibítormi v súlade s opisom môžu byť napríklad supresory génovej expresie interleukínu IL-18, antisense mRNAs redukujúce alebo predchádzajúce transkripcii IL-18 mRNA alebo vedúce k degradácii mRNA, proteíny narušujúce správne poskladanie alebo čiastočne, alebo podstatne zabraňujúce vylučovaniu IL-18, proteázy degradujúce IL-18, ktorý sa už nasyntetizoval, inhibítory proteáz štiepiacich pro-IL-18 a tým generujúce zrelý IL-18, ako napríklad inhibítory kaspázy-1, a podobne.

Inhibítorom IL-18 funkcie môže byť napríklad IL-18 agonista. Antagonisty môžu buď viazať, alebo odlúčiť samotnú IL-18 molekulu s dostatočnou afinitou a špecificitou, aby sa čiastočne alebo podstatne neutralizoval IL-18 alebo IL-18 väzobné miesto (miesta) zodpovedné za viazanie IL-18 na jeho ligandy (ako napr. na jeho receptory). Antagonista môže tiež inhibovať IL-18 signalizačnú dráhu, ktorá je aktivovaná vnútri buniek prostredníctvom väzby IL-18/receptor.

Inhibítormi funkcie IL-18 môžu byť aj rozpustné IL-18 receptory alebo molekuly napodobujúce receptory, alebo činidlá blokujúce IL-18 receptory, alebo IL-18 protilátky, ako napríklad polyklonálne alebo monoklonálne protilátky, alebo akékoľvek iné činidlo alebo molekula zabraňujúca viazaniu sa IL-18 na jeho ciele, a tým oslabujúca spúšťanie alebo zabraňujúca spúšťaniu intra- alebo extra-celulárnych reakcií sprostredkovaných s IL-18.

V súlade s predmetom vynálezu sa používajú inhibítory IL-18 na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu alkoholickej hepatitídy.

Výraz poškodenie pečene alebo ochorenie pečene, tak ako sa používa tu, zahŕňa viacero rôznych patologických stavov. Niekoľko zo stavov, ktoré sú brané do úvahy predloženým opisom, bolo podrobne vysvetlených v časti Doterajší stav techniky. Ďalšie ochorenia pečene, ktoré je možné liečiť a/alebo je im možné predchádzať v súlade s predloženým vynálezom, zahŕňajú napríklad pyrogénny pečeňový abses. Toto ochorenie sa nazýva aj bakteriálna pečeň a je to dutina vnútri pečene, ktorá produkuje hnis. Je viacero príčin spôsobujúcich pečeňový abses. Môže sa vyvinúť z abdominálnej infekcie, ako napríklad apendicitídy, divertikulitídy alebo perforovaného čreva; infekcie krvi; infekcie žlčového (pečeňová sekrécia) traktu; alebo traumy, keď sa infikuje pomliaždená pečeň. Najbežnejšími organizmami spôsobujúcimi abses pečene sú Escherichia coli, Proteus vulgaris a Enterobacter aerogenes. Incidencia je 1 prípad na 10 000 ľudí.

V súlade s predloženým vynálezom je možné liečiť a/alebo predchádzať alkoholickým ochoreniam pečene použitím IL-18 inhibítora. Tieto ochorenia zahŕňajú akútny alebo chronický zápal pečene indukovaný nadmerným požívaním alkoholu. Alkoholická hepatitída zvyčajne nastáva po rokoch závislosti od alkoholu. Čím dlhšie trvá požívanie alkoholu a čím je konzumácia alkoholu vyššia, tým je väčšia pravdepodobnosť vývoja pečeňového ochorenia. Podvýživa sa vyvíja ako následok prázdnych kalórií z alkoholu, zníženej chuti do jedla a nesprávnej absorpcie (neadekvátna absorpcia výživových látok z črevného traktu). Podvýživa sa podieľa na pečeňovom ochorení. Na vývoji alkoholického pečeňového ochorenia sa podieľa aj toxicita etanolu pre pečeň, individuálna náchylnosť na alkoholom indukované ochorenie pečene a genetické faktory.

Vo výhodnom uskutočnení predloženého opisuje inhibítor IL-18 výhodne vybraný z inhibítorov kaspázy-1 (ICE), protilátok nasmerovaných proti IL-18, protilátok nasmerovaných proti ktorejkoľvek z IL-18 receptorových podjednotiek, inhibítorov IL-18 signalizačnej dráhy, antagonistov IL-18, ktoré súťažia s IL-18 a blokujú IL-18 receptor a IL-18 viažucich proteínov a ich izoforiem, muteínov, fuzovaných proteínov, funkčných derivátov, aktívnych frakcií alebo cirkuláme permutovaných derivátov, ktoré majú rovnakú aktivitu.

Výraz „IL-18 viažuce proteíny“ sa tu používa synonymne s výrazom „IL18BP“. Zahŕňa IL-18 viažuce proteíny ako sú definované vo WO 99/09063 alebo v Novick a ďalší, 1999, vrátane zostrihových variantov a/alebo izoforiem IL-18 viažucich proteínov, ako sú definované v Kim a ďalší, 2000. V súlade s predloženým opisom sú užitočné najmä ľudské IL-18BP izoformy a a c. Proteíny užitočné podľa predloženého vynálezu môžu byť glykozylované alebo neglykozylované, môžu byť získané z prirodzených zdrojov, ako napríklad z moču, alebo sa výhodne môžu produkovať rekombinantne. Rekombinantná expresia sa môže uskutočňovať v prokaryotických expresných systémoch, ako E. coli, alebo v eukaryotických, a výhodne v cicavčích, expresných systémoch.

Tak ako sa používa tu, výraz muteíny označuje analógy IL-18BP alebo analógy vírusového 1L-18BP, v ktorých je jeden alebo viacero aminokyselinových zvyškov prirodzeného IL-18BP alebo vírusového IL-18BP nahradených odlišnými aminokyselinovými zvyškami, alebo je deletovaný jeden alebo viacero amino6

SK 288032 Β6 kyselinových zvyškov, alebo je jeden alebo viacero aminokyselinových zvyškov pridaných do prirodzenej sekvencie IL-18BP alebo do vírusového IL-18BP bez toho, aby sa významne zmenila aktivita výsledných produktov v porovnaní s divým typom 1L-18BP alebo vírusovým 1L-1PB. Tieto muteíny sa pripravujú známymi technikami syntézy a/alebo miestne špecifickej mutagenézy, alebo akoukoľvek inou vhodnou známou technikou.

Akýkoľvek takýto muteín má výhodne aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je dostatočne podobná so sekvenciou IL-18BP alebo je dostatočne podobná so sekvenciou vírusového IL-18BP, tak, aby mala v podstate podobnú aktivitu ako IL-18BP. Jednou aktivitou IL-18BP je jeho schopnosť viazať IL-18. Pokiaľ má muteín podstatnú väzobnú aktivitu proti IL-18, môže sa použiť na purifikáciu IL-18, napríklad prostredníctvom afinitnej chromatografie, a tým sa môže považovať za muteín majúci v podstate podobnú aktivitu ako IL-18BP. Takže to, či akýkoľvek daný muteín má v podstate rovnakú aktivitu ako IL-18BP, je možné stanoviť prostredníctvom rutinných pokusov zahŕňajúcich podrobenie takéhoto muteínu napr. jednoduchému sendvičovému kompetičnému testu, aby sa stanovilo, či sa viaže, alebo nie na príslušným spôsobom značený IL-18, ako napríklad rádio-imunologickým testom alebo ELISA testom.

Muteíny IL-18BP polypeptidov alebo muteíny vírusových IL-18BPs, ktoré je možné použiť podľa predloženého opisu, alebo nukleové kyseliny, ktoré ich kódujú, zahŕňajú konečnú súpravu v podstate zodpovedajúcich sekvencii vo forme substitučných peptidov alebo polynukleotidov, ktoré môže priemerný odborník v oblasti získať rutinným spôsobom bez nadmerného experimentovania na základe tu prezentovaných návodov a informácií.

Výhodnými zmenami v muteínoch podľa predloženého vynálezu sú zmeny známe ako „konzervatívne“ substitúcie. Konzervatívne aminokyselinové substitúcie IL-18BP polypeptidov alebo proteínov, alebo vírusových IL-18BPs môžu zahŕňať synonymné aminokyseliny v skupine, ktorá má dostatočne podobné fyzikálno-chemické vlastnosti na to, aby substitúcie v rámci členov skupiny zachovávali biologickú funkciu molekuly (Grantham, 1974). Je zrejmé, že v definovaných sekvenciách je možné robiť aj inzercie a delécie aminokyselín bez toho, aby sa zmenila ich funkcia, najmä ak inzercie alebo delécie zahŕňajú len niekoľko aminokyselín, napríklad menej ako tridsať, a výhodne menej ako desať, a neodstraňujú alebo nepremiestňujú aminokyseliny, ktoré sú kritické pre funkčnú konformáciu, napr. cysteínové zvyšky. Proteíny a muteíny produkované prostredníctvom takýchto delécií a/alebo inzercií spadajú do rozsahu predloženého vynálezu.

Výhodne sú synonymnými aminokyselinovými skupinami skupiny definované v tabuľke I. Výhodnejšie sú synonymnými aminokyselinovými skupinami skupiny definované v tabuľke II a najvýhodnejšie sú synonymnými aminokyselinovými skupinami skupiny definované v tabuľke III.

Tabuľka I - Výhodné skupiny synonymných aminokyselín

Aminokyselina Synonymná skupina

Ser Ser, Thr, Gly, Asn

Arg Arg, Gin, Lys, Glu, His

Leu íle, Phe, Tyr, Met, Val, Leu

Pro Gly, Ala, Thr, Pro

Thr Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr

Ala Gly, Thr, Pro, Ala

Val Met, Tyr, Phe, íle, Leu, Val

Gly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly íle Met, Tyr, Phe, Val, Leu, íle

Phe Trp, Met, Tyr, íle, Val, Leu, Phe

Tyr Trp, Met, Phe, íle, Val, Leu, Tyr

Cys Ser, Thr, Cys

His Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His

Gin Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gin

Asn Gin, Asp, Ser, Asn

Lys Glu, Gin, His, Arg, Lys

Asp Glu, Asn, Asp

Glu Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, Glu

Met Phe, íle, Val, Leu, Met

Trp Trp

Tabuľka II - Výhodnejšie skupiny synonymných aminokyselín

Aminokyselina Synonymná skupina

Ser Ser

Arg His, Lys, Arg

Leu Leu, íle, Phe, Met

SK 288032 Β6

Pro	Ala, Pro
Thr	Thr
Ala	Pro, Ala
Val	Val, Met, íle
Gly	Gly
íle	íle, Met, Phe, Val, Leu
Phe	Met, Tyr, íle, Leu, Phe
Tyr	Phe, Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His, Gin, Arg
Gin	Glu, Gin, His
Asn	Asp, Asn
Lys	Lys, Arg
Asp	Asp, Asn
Glu	Glu, Gin
Met	Met, Phe, íle, Val, Leu
Trp	Trp
Tabuľka III - Najvýhodnejšie skupiny synonymných aminokyselín
Aminokyselina	Synonymná skupina
Ser	Ser
Arg	Arg
Leu	Leu, íle, Met
Pro	Pro
Thr	Thr
Ala	Ala
Val	Val
Gly	Gly
lle	íle, Met, Leu
Phe	Phe
Tyr	Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His
Gin	Gin
Asn	Asn
Lys	Lys
Asp	Asp
Glu	Glu
Met	Met, lle, Leu
Trp	Met

Príklady produkcie aminokyselinových substitúcií v proteínoch, ktoré môžu byť použité na získanie muteínov IL-18BP polypeptidov alebo proteínov, alebo muteínov vírusových IL-18BPs, na použitie v predloženom opise, zahŕňajú ktorékoľvek známe spôsobové kroky, ako napríklad kroky prezentované v US patentoch RE 33653, 4959314, 4588585 a 4737462 v mene Mark a ďalší; v 5116943 v mene Koths a ďalší, v 4965195 v mene Namen a ďalší; v 4879111 v mene Chong a ďalší; a v 5017691 v mene Lee a ďalší; a lyzínové substituované proteíny prezentované v US patente č. 4904584 (Shaw a ďalší).

Výraz „fúzovaný proteín“ označuje polypeptid obsahujúci IL-18BP, alebo vírusový IL-18BP, alebo ich muteín alebo fragment, ktorý je fúzovaný s iným proteínom, ktorý je napríklad dlhšie prítomný v telesných tekutinách. IL-18BP alebo vírusový IL-18BP tak môže byť fúzovaný s iným proteínom, polypeptidom alebo podobne, napr. imunoglobulínom alebo jeho fragmentom.

Výraz „funkčné deriváty“, tak ako sa používa tu, zahŕňa deriváty IL-18BPs alebo vírusového IL-18BP a ich muteíny a fúzované proteíny, ktoré môžu byť pripravené z funkčných skupín, ktoré sa vyskytujú ako bočné reťazce na zvyškoch alebo ako N- alebo C-koncové skupiny, prostriedkami známymi v oblasti, a sú zahrnuté v tomto opise, pokiaľ ostávajú farmaceutický prijateľné, t. j. neničia aktivitu proteínu, ktorá je v podstate rovnaká ako aktivita IL-18BP alebo vírusového IL-18BP, a neprepožičiavajú toxické vlastnosti prostriedkom, ktoré ich obsahujú.

Tieto deriváty môžu napríklad obsahovať polyetylénglykolové bočné reťazce, ktoré môžu maskovať antigénne miesta a môžu predlžovať prítomnosť IL-18BP alebo vírusového IL-18BP v telesných tekutinách. Iné deriváty zahŕňajú alifatické estery karboxylových skupín, amidy karboxylových skupín prostredníctvom re8

SK 288032 Β6 akcie s amoniakom alebo primárnym, alebo sekundárnym amínom, Λ'-acylové deriváty voľných aminoskupín aminokyselinových zvyškov vytvorené s acylovými skupinami (napr. alkanolylovou alebo karbocyklickou aroylovou skupinou) alebo O-acylové deriváty voľných hydroxylových skupín (napríklad serylových alebo treonylových zvyškov) vytvorené s acylovými skupinami.

Ako „aktívne frakcie“ IL-18BP alebo vírusového IL-18BP, muteínov a fuzovaných proteínov, zahŕňa predložený opis akýkoľvek fragment alebo prekurzor polypeptidového reťazca proteínovej molekuly, samotný alebo spolu s asociovanými molekulami alebo zvyškami, ktoré sú naň pripojené, napr. sacharidové alebo fosfátové zvyšky, alebo agregáty samotnej proteínovej molekuly alebo sacharidových zvyškov, s podmienkou, že takáto frakcia má v podstate podobnú aktivitu ako IL-18BP.

V ďalšom výhodnom uskutočnení opisuje IL-18 inhibítorom IL-18 protilátka. Anti-IL-18 protilátky môžu byť polyklonálne alebo monoklonálne, chiméme, humanizované alebo aj úplne humánne. Rekombinantné protilátky a ich fragmenty sa vyznačujú vysoko afinitným viazaním sa na IL-18 in vivo a nízkou toxicitou. Protilátky, ktoré sa môžu použiť v opise, sa vyznačujú schopnosťou liečiť pacientov v priebehu času dostatočne dlhého na dobrú až vynikajúcu regresiu alebo odstránenie patogénneho stavu alebo akéhokoľvek symptómu alebo skupiny symptómov súvisiacich s patogénnym stavom, a nízkou toxicitou.

Neutralizačné protilátky sa jednoducho vyvolávajú v zvieratách, ako napríklad králikoch, kozách alebo myšiach, imunizáciou s IL-18. Imunizované myši sú užitočné najmä na poskytnutie zdrojov B buniek na výrobu hybridómov, ktoré sa zase môžu kultivovať na produkciu veľkých množstiev anti-IL-18 monoklonálnych protilátok.

Chiméme protilátky sú imunoglobulínové molekuly charakteristické dvoma alebo viacerými segmentmi alebo časťami odvodenými od rozličných živočíšnych druhov. Vo všeobecnosti je variabilná oblasť chimérnej protilátky odvodená od nehumánnej cicavčej protilátky, ako napríklad myšacej monoklonálnej protilátky, a imunoglobulínová konštantná oblasť je odvodená od humánnej imunoglobulínovej molekuly. Výhodne majú tak oblasti, ako aj ich kombinácia, nízku imunogénnosť v súlade s rutinným stanovovaním (Elliott a ďalší, 1994). Humanizované protilátky sú imunoglobulínové molekuly vytvorené technikami génového inžinierstva, v ktorých sú myšacie konštantné oblasti nahradené humánnymi náprotivkami, pričom sa zachovávajú myšacie antigén viažuce oblasti. Výsledná myšaco-humánna chiméma protilátka má výhodne zníženú imunogénnosť a zlepšené farmakokinetiky u ľudí (Knight a ďalší, 1993).

Takže v ďalšom výhodnom uskutočnení je IL-18 protilátkou humanizovaná IL-18 protilátka. Výhodné príklady humanizovaných anti-IL-18 protilátok sú opísané napríklad v európskej prihláške vynálezu EP 0974600.

V ešte ďalšom výhodnom uskutočnení je IL-18 protilátka kompletne humánna. Technológia na produkciu humánnych protilátok je podrobne opísaná napr. vo WO 00/76310, WO 99/53049, US 6162963 alebo AU5336100. Kompletne humánne protilátky sú výhodne rekombinantné protilátky produkované vtransgénnych zvieratách, napr. xenomyšiach, ktoré obsahujú celé alebo časti funkčných humánnych Ig lokusov.

Vo veľmi výhodnom uskutočnení predloženého opisuje IL-18 inhibítorom IL-18BP, alebo jeho izoforma, muteín, fúzovaný protein, funkčný derivát, aktívna frakcia alebo cirkuláme permutovaný derivát. Tieto izoformy, muteíny, fúzované proteiny alebo funkčné deriváty si zachovávajú biologickú aktivitu IL-18BP, najmä viazanie sa na IL-18, a výhodne majú nevyhnutne aspoň aktivitu podobnú s IL-18BP. Ideálne majú takéto proteiny biologickú aktivitu, ktorá je ešte zvýšená v porovnaní s nemodifikovaným IL-18BP. Výhodné aktívne frakcie majú aktivitu, ktorá je lepšia ako aktivita IL-18BP, alebo majú iné výhody, napríklad lepšiu stabilitu alebo nižšiu toxicitu, alebo imunogénnosť, alebo sa ľahšie produkujú vo väčších množstvách, alebo sa jednoduchšie purifikujú.

Sekvencie IL-18BP a jeho zostrihových variantov/izoforiem je možné zobrať z W099/09063 alebo z Novick a ďalší, 1999, ako aj z Kim a ďalší, 2000.

Funkčné deriváty IL-18BP môžu byť konjugované s polymérmi na zlepšenie vlastností proteínu, ako napríklad na zlepšenie stability, polčasu rozpadu, biologickej dostupnosti, tolerancie ľudským telom alebo imunogénnosti. Na dosiahnutie tohto cieľa sa 1L-18BP môže spojiť napr. s polyetylénglykolom (PEG). PEGylácia sa môže uskutočňovať známymi spôsobmi, opísanými napríklad vo WO 92/13095.

Preto je 1L-18BP vo výhodnom uskutočnení predloženého vynálezu PEGylovaný.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je inhibítorom IL-18 fúzovaný protein obsahujúci celý alebo časť IL-18 viažuceho proteínu, ktorý je fúzovaný s celým alebo s časťou imunoglobulínu. Priemernému odborníkovi v oblasti bude zrejmé, že výsledný fúzovaný protein si zachováva IL-18BP biologickú aktivitu, najmä viazanie sa na ÍL-18. Fúzia môže byť priama, alebo prostredníctvom krátkeho spojovacieho peptidu, ktorý môže mať 1 až 3 aminokyselinové zvyšky, alebo viac, napríklad 13 aminokyselinových zvyškov. Uvedeným spojovníkom môže byť napríklad tripeptid zo sekvenciou E-F-M (Glu-Phe-Met), alebo 13-aminokyselinová spojovníková sekvencia obsahujúca Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met, ktorá je začlenená medzi IL-18BP sekvenciu a imuno-globulínovú sekvenciu. Výsledný fúzovaný protein má zlepšené vlastnosti, ako napríklad predĺženú prítomnosť v telesných tekutinách (polčas rozpadu), zvýšenú špecifickú aktivitu, zvýšenú úroveň expresie alebo je uľahčená puriflkácia fúzovaného proteínu.

Vo výhodnom uskutočnení je IL-18BP fuzovaný s konštantnou oblasťou Ig molekuly. Výhodne je fuzovaný s oblasťami ťažkých reťazcov, ako napríklad CH2 a CH3 doménami ľudského IgGl. Generovanie špecifických fuzovaných proteínov, obsahujúcich 1L-18BP a časť imunoglobulínu, je opísané napríklad v príklade 11 vo WO 99/09063. Aj iné izoformy Ig molekúl sú vhodné na generovanie fuzovaných proteínov podľa predloženého opisu, ako napríklad izoformy IgG₂ alebo IgG₄, alebo iné triedy, ako napríklad IgM alebo IgA. Fúzované proteíny môžu byť monoméme alebo multiméme, hetero- alebo homomultiméme.

Interferóny sú prednostne známe svojimi inhibičnými účinkami na vírusovú replikáciu a bunkovú proliferáciu. Interferón-γ má napríklad dôležitú úlohu pri podpore imunitnej a zápalovej odpovede. Hovorí sa, že interferón β (IFN-β, interferón typu I) má protizápalovú úlohu. Zo štúdií zverejnených Trianta-phyllopoulosom a ďalšími (1999) vyplýva, že IFN-β má užitočnú účinok pri terapii reumatoidnej artritídy, ako to bolo ukázané na myšacom modeli ochorenia, na modeli kolagénom indukovanej artritídy (CIA). Tento užitočný účinok IFN-β bol potvrdený v uvedených príkladoch.

Vynález sa týka aj použitia kombinácie ÍL-18 inhibítora a interferónu na výrobu lieku na liečenie artritídy, najmä reumatoidnej artritídy.

Interferóny tiež môžu byť konjugované s polymérmi, aby sa zlepšila stabilita proteínov. Vo WO 99/55377 bol napríklad opísaný konjugát medzi interferónom β a polyolom, polyetylénglykolom (PEG).

V inom výhodnom uskutočnení vynálezu je interferónom interferón-β (IFN-β) a výhodnejšie IFN-β la.

Produkcia a/alebo účinok IL-18 inhibítora sa výhodne používa simultánne, postupne alebo oddelene od interferónu.

V ešte ďalšom uskutočnení vynálezu sa IL-18 inhibítor používa v kombinácii s TNF antagonistom. Účinky TNF antagonistov pôsobia niekoľkými spôsobmi. Po prvé sa antagonisty môžu viazať na TNF molekulu, alebo môžu sekvestrovať samotnú TNF molekulu s dostatočnou afinitou a špecificitou na to, aby sa čiastočne alebo podstatne neutralizoval TNF epitop alebo epitopy zodpovedné za viazanie sa na TNF receptor (tu ďalej označované ako „sekvestračné antagonisty“). Sekvestračným antagonistom môže byť napríklad protilátka nasmerovaná proti TNF.

Alternatívne môžu TNF antagonisty inhibovať TNF signalizačnú dráhu aktivovanú bunkovým povrchovým receptorom po naviazaní TNF (tu ďalej označované ako „signalizačné antagonisty“). Obe skupiny antagonistov sú užitočné, buď samostatne alebo spolu, v kombinácii s IL-18 inhibítorom, na liečenie artritídy, najmä reumatoidnej artritídy.

TNF antagonisty sa dajú jednoducho identifikovať a hodnotiť rutinným skríningom kandidátov z hľadiska ich vplyvu na aktivitu prirodzeného TNF v náchylných bunkových líniách in vitro, napríklad v ľudských B bunkách, v ktorých TNF spôsobuje proliferáciu a vylučovanie imunoglobulínu. Test zahŕňa TNF formuláciu s rôznymi riedeniami kandidátskeho antagonistu. V teste sa napríklad používa od 0,1 do 100-násobného molového množstva TNF a kontroly bez TNF alebo len s antagonistom (Tucci a ďalší, 1992).

Sekvestračné antagonisty sú výhodnými TNF antagonistami na použitie v súlade s predloženým opisom. Spomedzi sekvestračných antagonistov sú výhodné tie polypeptidy, ktoré viažu TNF s vysokou afinitou a majú nízku imunogénnosť. Výnimočne výhodné sú rozpustné TNF receptorové molekuly a neutralizačné protilátky proti TNF. V predloženom vynáleze sú užitočné napríklad rozpustné TNF-RI a TNF-RII. Výnimočne výhodnejšími antagonistami podľa predloženého vynálezu sú skrátené formy týchto receptorov, ktoré obsahujú extra-celuláme domény receptorov alebo ich funkčné časti. V EP914431 je napríklad opísaný rozpustný TNF receptor typu I a typu II.

Skrátené formy TNF receptorov sú rozpustné a boli detegované v moči a sére ako 30kDa a 40kDa proteíny inhibujúce viazanie TNF, ktoré sa označujú ako TBPI, respektíve TBPII (Engelmann a ďalší, 1990). Podľa vynálezu je výhodné simultánne, postupné alebo oddelené použitie IL-18 inhibítora s TNF antagonistom a/alebo interferónom.

Podľa vynálezu sú TBPI a TBPII výhodné TNF antagonisty na použitie v kombinácii s IL-18 inhibítorom. Deriváty, fragmenty, oblasti a biologicky aktívne časti receptorovej molekuly, ktoré sa funkciou podobajú funkcii receptorových molekúl, môžu byť taktiež použité v predloženom vynáleze. Takýto biologicky aktívny ekvivalent alebo derivát receptorovej molekuly označuje časť polypeptidu alebo sekvencie kódujúcej receptorovú molekulu, ktorá má dostatočnú veľkosť na to, aby viazala TNF s takou afinitou, že sa inhibuje alebo blokuje interakcia s TNF receptorom naviazaným na membránu.

V ďalšom výhodnom uskutočnení je ľudský rozpustný TNF-RI (TBPI) TNF antagonistom na použitie podľa vynálezu. Prirodzené a rekombinantné molekuly rozpustného TNF receptora a spôsoby ich výroby boli opísané v európskych patentoch EP 308378, EP398327 a EP433 900.

IL-18 inhibítor sa môže používať simultánne, postupne alebo oddelene s TNF inhibítorom. Výhodne sa používa kombinácia IL-18 protilátky alebo antiséra a rozpustného TNF receptora, ktorý má TNF inhibičnú aktivitu.

V ďalšom výhodnom uskutočnení podľa vynálezu liečivo ďalej obsahuje COX-inhibítor, výhodne COX-2 inhibítor. COX-inhibítory sú v oblasti známe. Vo WO 01/00229 sú napríklad opísané špecifické COX-2 inhibítory.

Vynález sa ďalej týka použitia kombinácie IL-18 inhibítorov a/alebo interferónov, a/alebo TNF antagonistov, a/alebo COX-2 inhibítorov. Táto kombinácia je vhodná na liečenie a/alebo prevenciu artritídy, najmä reumatoidnej artritídy, a na liečenie a/alebo prevenciu poškodenia pečene a na liečenie a/alebo prevenciu zápalového črevného ochorenia, najmä Crohnovej choroby a vredovej kolitídy. Účinné zložky sa môžu používať simultánne, postupne alebo oddelene.

Vo výhodnom uskutočnení predloženého vynálezu sa IL-18 inhibítor používa v množstve približne 0,0001 až 10 mg/kg telesnej hmotnosti alebo približne 0,01 až 5 mg/kg telesnej hmotnosti alebo približne 0,1 až 3 mg/kg telesnej hmotnosti alebo približne 1 až 2 mg/kg telesnej hmotnosti. V ešte ďalšom výhodnom uskutočnení sa IL-18 inhibítor používa v množstve približne 0,1 až 1000 pg/kg telesnej hmotnosti alebo 1 až 100 pg/kg telesnej hmotnosti, alebo približne 10 až 50 pg/kg telesnej hmotnosti.

Vynález sa ďalej týka použitia expresného vektora obsahujúceho kódujúcu sekvenciu IL-18 inhibítora na výrobu lieku na prevenciu a/alebo liečenie artritických stavov alebo artritídy, najmä reumatoidnej artritídy, na liečenie poškodenia pečene a na liečenie zápalového črevného ochorenia. Génový terapeutický prístup je tak použitý na liečenie a/alebo prevenciu ochorenia. Výhodne sa potom bude expresia IL-18 inhibítora uskutočňovať in situ, a tým bude účinne blokovať IL-18 priamo v tkanive (tkanivách) alebo bunkách postihnutých ochorením.

Vynález zahŕňa aj použitie vektora na indukciu a/alebo posilnenie endogénnej produkcie IL-18 inhibítora v bunke, ktorá normálne neexprimuje IL-18 inhibítor, alebo ktorá exprimuje také množstvá inhibítora, ktoré nie sú dostatočné. Vektor môže obsahovať regulačné sekvencie funkčné v bunkách, v ktorých je potrebná expresia IL-18 inhibítora. Takýmito regulačnými sekvenciami môžu byť napríklad promótory alebo zosilňovače. Regulačná sekvencia sa potom môže zaviesť do správneho lokusu genómu homologickou rekombináciou, a tým sa regulačná sekvencia operatívne spojí s génom, ktorého expresiu je potrebné indukovať alebo posilniť. Táto technológia sa zvyčajne označuje ako „endogénna génová aktivácia“ (EGA) a je opísaná napr. vo WO 91/09955.

Pre priemerného odborníka v oblasti bude zrejmé, že použitím rovnakej technológie je možné aj zastaviť expresiu IL-18, t. j. prostredníctvom zavedenia negatívneho regulačného elementu, ako napr. stišujúceho elementu, do IL-18 génového lokusu, čo vedie k zníženiu alebo k zastaveniu expresie IL-18. Pre priemerného odborníka v oblasti bude zrejmé, že takéto zníženie alebo zastavenie expresie IL-18 má rovnaký účinok ako použitie IL-18 inhibítora na prevenciu a/alebo liečenie ochorenia.

Vynález sa ďalej týka použitia bunky, ktorá bola geneticky modifikovaná tak, aby produkovala IL-18 inhibítor, na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu poškodenia pečene.

Opis sa ďalej týka farmaceutických prostriedkov, najmä prostriedkov užitočných na prevenciu a/alebo liečenie zápalovej artritídy, poškodenia pečene alebo zápalového črevného ochorenia, ktoré obsahujú terapeuticky účinné množstvo IL-18 inhibítora a terapeuticky účinné množstvo interferónu. Ako IL-18 inhibítor môže prostriedok obsahovať inhibítory kaspázy-1, protilátky proti IL-18, protilátky proti ktorejkoľvek z IL-18 receptorových podjednotiek, inhibítory IL-18 signalizačnej dráhy, IL-18 antagonisty, ktoré súťažia s IL-18 a blokujú IL-18 receptor a IL-18 viažuce proteíny, ich izoformy, muteíny, fuzované proteíny, funkčné deriváty, aktívne frakcie alebo cirkuláme permutované deriváty, ktoré majú rovnakú aktivitu.

Výhodnými účinnými zložkami farmaceutických prostriedkov sú opísané IL-18BP a jeho izoformy, muteíny, fuzované proteíny, funkčné deriváty, aktívne frakcie alebo cirkuláme permutované deriváty.

Interferónom nachádzajúcim sa vo farmaceutickom prostriedku je výhodne IFN-β.

V ešte inom výhodnom uskutočnení farmaceutický prostriedok obsahuje terapeuticky účinné množstvá IL-18 inhibítora, voliteľne interferónu, a TNF antagonistu. TNF antagonistami môžu byť protilátky neutralizujúce TNF aktivitu alebo rozpustné skrátené TNF receptorové fragmenty, nazývané aj TPBI a TBPII. Farmaceutický prostriedok podľa vynálezu môže ďalej obsahovať jeden alebo viacero COX inhibítorov, výhodne COX-2 inhibítorov.

Definícia „farmaceutický prijateľný“ zahŕňa akýkoľvek nosič, ktorý neinterferuje s účinnosťou biologickej aktivity účinnej zložky a nie je toxický pre hostiteľa, ktorému sa podáva. Na parenterálne podávanie môže byť aktívny protein (proteíny) formulovaný napríklad v dávkovej jednotkovej forme na injekciu vo vehikulách, akými sú napríklad fyziologický roztok, dextrózový roztok sérový albumín a Ringerov roztok.

Lieky vyrobené s použitím IL-18 inhibítorov môžu byť jedincovi podávané rôznymi spôsobmi. Spôsoby podávania zahŕňajú intradermálne, transdermálne (napr. formulácie s pomalým uvoľňovaním), intramuskuláme, intraperitoneálne, intravenózne, subkutánne, orálne, epidurálne, topické a intranazálne spôsoby. Použitý môže byť akýkoľvek iný terapeuticky účinný spôsob podania, napríklad absorpcia epiteliálnymi alebo endoteliálnymi tkanivami, alebo génová terapia, pri ktorej sa DNA molekula kódujúca aktívne činidlo podáva pacientovi (napr. prostredníctvom vektora), čo spôsobuje, že aktívne činidlo sa exprimuje a vylučuje in vivo. Okrem toho môže byť protein (proteíny) podľa vynálezu podávaný spolu s inými zložkami biologicky aktívnych činidiel, ako napríklad farmaceutický prijateľnými povrchovo aktívnymi látkami, excipientmi, nosičmi, riedidlami a vehikulami.

Na parenterálne (napr. intravenózne, subkutánne, intramuskuláme) podanie sa aktívny protein (proteíny) môže formulovať ako roztok, suspenzia, emulzia alebo lyofilizovaný prášok spolu s farmaceutický prijateľným parenterálnym vehikulom (napr. vodou, fyziologickým roztokom, dextrózovým roztokom) a aditívami, ktoré udržiavajú izotonicitu (napr. manitolom) alebo chemickú stabilitu (napr. konzervačnými látkami a tlmivými roztokmi). Formulácia sa sterilizuje bežne používanými technikami.

Biologická dostupnosť aktívneho proteínu (proteínov) podľa opisu sa môže zlepšiť použitím konjugačných postupov, ktoré predlžujú polčas rozpadu molekuly v ľudskom tele, napríklad pripojením molekuly na polyetylénglykol, ako je opísané v PCT prihláške vynálezu WO 92/13095.

Terapeuticky účinné množstvá aktívneho proteínu (proteínov) budú funkciou mnohých premenných, vrátane typu antagonistu, afinity antagonistu proti IL-18, akejkoľvek zvyškovej cytotoxickej aktivity vykazovanej antagonistami, spôsobu podania, klinického stavu pacienta (vrátane vhodnosti udržiavať netoxickú hladinu endogénnej IL-18 aktivity).

„Terapeuticky účinné množstvá“ sú také množstvá, v ktorých keď sa podá IL-18 inhibítor, tak vedú k inhibícii biologickej aktivity IL-18. Dávky podávané jedincovi, ako jednotlivé alebo viacnásobné dávky, sa budú meniť v závislosti od rôznych faktorov, vrátane farmakokinetických vlastností IL-18 inhibítora, spôsobe podávania, stavov a vlastností pacientov (pohlavie, vek, telesná hmotnosť, zdravotný stav, veľkosť), rozsahu symptómov, paralelne prebiehajúcich terapií, frekvencie liečby a požadovaného účinku. Do schopností priemerného odborníka v oblasti spadá upravovanie a manipulácia v stanovených dávkových rozsahoch, ako aj in vitro a in vivo spôsoby determinácie inhibície IL-18 u jedinca.

V súlade s vynálezom sa IL-18 inhibítor používa v množstve približne 0,0001 až 10 mg/kg alebo približne 0,01 až 5 mg/kg telesnej hmotnosti, alebo približne 0,01 až 5 mg/kg telesnej hmotnosti, alebo približne 0,1 až 3 mg/kg telesnej hmotnosti, alebo približne 1 až 2 mg/kg telesnej hmotnosti. Ďalšie výhodné množstvá IL-18 inhibítorov sú množstvá približne 0,1 až 1000 pg/kg telesnej hmotnosti alebo približne 1 až 100 pg/kg telesnej hmotnosti, alebo približne 10 až 50 pg/kg telesnej hmotnosti.

Výhodným spôsobom podávania podľa predloženého vynálezu je podávanie subkutánnym spôsobom. Ďalej je podľa vynálezu výhodné intramuskuláme podávanie.

V ďalších výhodných uskutočneniach sa IL-18 inhibítor podáva denne alebo každý druhý deň.

Denné dávky sa zvyčajne podávajú v rozdelených dávkach alebo vo forme s nepretržitým uvoľňovaním, ktoré sú účinné na získanie požadovaných výsledkov. Druhé alebo následné podávania sa môžu uskutočňovať v dávke, ktorá je rovnaká, menšia alebo väčšia ako počiatočná alebo predchádzajúca dávka podávaná jedincovi. Druhé alebo následné podanie sa môže uskutočňovať v priebehu alebo pred nástupom ochorenia.

V súlade s vynálezom sa IL-18 inhibítor môže jedincovi podávať profylaktický alebo terapeuticky, pred, zároveň alebo postupne s inými terapeutickými režimami alebo činidlami (napr. viacnásobné liekové režimy), v terapeuticky účinnom množstve, najmä s interferónom a/alebo TNF antagonistom, a/alebo COX inhibítorom. Aktívne činidlá, ktoré sa podávajú zároveň s inými terapeutickými činidlami, sa môžu podávať v rovnakom prostriedku alebo v rôznych prostriedkoch.

Opis sa ďalej týka spôsobu prípravy farmaceutického prostriedku, ktorý obsahuje zmes účinného množstva IL-18 inhibítora a/alebo interferónu, a/alebo TNF antagonistu, a/alebo COX inhibítora s farmaceutický prijateľným nosičom.

Opísaný vynález bude teraz jasnejší s odvolaním sa na nasledujúce príklady, ktoré sú poskytnuté ako ilustrácia a nie sú mienené ako obmedzujúce predložený vynález.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 znázorňuje histogram zobrazujúci sérové hladiny IFN-γ (pg/ml) po injekcii rôznych množstiev rekombinantného IL-18BP (0; 0,04; 0,4; 4 mg/kg) myšiam, 1 hodinu pred injekciou LPS. Vzorky krvi sa odoberali 5 hodín po LPS injekcii a analyzovalo sa cirkulujúce IFN-γ prostredníctvom ELISA.

Obrázok 2 znázorňuje histogram zobrazujúci sérové hladiny alanín amino-transferázy (ALT). Myšiam sa injekčné podávali zvyšujúce sa dávky rekombinantného ľudského IL-18BP (0; 0,04; 0,4; 4 mg/kg) pred injekciou LPS do myší senzitizovaných s P. acnes. Vzorky krvi sa odoberali 5 hodín po LPS injekcii a merali sa sérové hladiny ALT. SF = Sigma-Frankel: 1 SF jednotka AST/ALT bude tvoriť 4,82x10“* pmol glutamátu za minútu pri pH 7,5 a 25 °C.

Obrázok 3 znázorňuje čas prežívania myší po LPS injekcii. Myšiam sa injekčné podávali rôzne dávky rekombinantného ľudského IL-18BP (0; 0,04; 0,4; 4 mg/kg) 20 minút pred injekciou LPS do myší senzitizovaných s P. acnes. Trojuholníky: 4 mg/kg; malé kosoštvorce: 0,4; veľké kosoštvorce 0,04; krúžky; bez IL-18BP (len LPS).

Obrázok 4 znázorňuje histogram zobrazujúci sérové hladiny IFN-γ merané 5 hodín po injekcii rôznych množstiev IL-18BP (0; 0,04; 0,4; 4 mg/kg), ktoré boli podávané 20 minút pred LPS injekciou do myší senzitizovaných s P. acnes.

SK 288032 Β6

Obrázok 5 znázorňuje prežívanie myší, ktorým bolo injekčné podané buď polyklonálne IL-18 antisérum, alebo normálne králičie sérum (NDS = kontrola), 30 minút pred injekciou 40 mg/ml (letálne dávka) LPS z E. coli (obr. 5A) alebo zo S. thyphimurium (obr. 5B). Trojuholníky: myšiam sa injekčné podalo IL-18 antisérum; krúžky: myšiam sa injekčné podal NDS. Na x osiach sú uvedené dni po stimulácii s LPS. *p<0,05.

Obrázok 6 znázorňuje histogram zobrazujúci priemer + SEM piatich myší v skupine liečených nasledujúcim spôsobom. Myšiam sa intraperitoneálnou injekciou (i. p.) podalo buď anti-IL-18 antisérum, alebo rozpustné TNF-α receptory (TNF-sRp55), alebo vehikulum (fyziologický roztok), a po nich okamžite nasledovalo intravenózne (i. v.) podanie konkanavalínu A (ConA; obr. 6A) alebo PEA (Pseudomonas aeruginosa, obr. 6B). **p<0,01; ***p<0,001 vs ConA alebo PEA samostatne; # p<0,01 vs buď TNDsRp55, alebo antiIL-18 faktoriálna ANOVA.

Obrázok 7 znázorňuje vplyv IL-18BP na klinické skóre v myšacom modeli artritídy. Obr. 7A znázorňuje diagram zobrazujúci klinické skóre merané po dennom podávaní rôznych množstiev IL-18BP alebo IFN-β, alebo vehikula (NaCl) i. p, (intraperitoneálne) myšiam. Symboly: plné trojuholníky: 10 000 IU IFN-β; prázdne trojuholníky: 10 mg/kg IL-18BP, obrátené trojuholníky: 3 mg/kg IL-18BP, kosoštvorce: 1 mg/kg IL-18BP; krúžky: 0,5 mg/kg IL-18BP; prázdne štvorčeky: 0,25 mg/kg IL-18BP a plné štvorčeky: NaCl. Dni liečenia sú znázornené na x-osiach, klinické skóre (priemerné hodnoty) je znázornené na y-osiach. Štatistické hodnoty sa vypočítavali Mann Whitney testom. Obrázok 7B znázorňuje histogram zobrazujúci AUC (oblasť pod krivkou) odvodenú z grafu na obrázku 7A. n = počet zvierat.

Obrázok 8 znázorňuje vplyv IL-18BP na puchnutie labky. Obrázok 8A znázorňuje diagram zobrazujúci výsledky získané meraním hrúbky labky (napuchnutia) chorých zadných labiek jednotlivých zvierat ošetrených s rôznymi množstvami IL-18BP. y-osi znázorňujú zmenu hrúbky labky v milimetroch od začiatku liečenia. Symboly sú rovnaké ako na obrázku 7. Obrázok 8B znázorňuje histogram zobrazujúci AUC odvodenú od obrázku 8A. n = počet zvierat.

Obrázok 9 znázorňuje analýzu počtu chorých zadných labiek v čase akútnej artritídy, t. j. rozširovanie ochorenia na ďalšie kĺby. Symboly: plné štvorčeky: NaCl (kontrola), trojuholníky: 10 mg/kg IL-18BP, obrátené trojuholníky: 3 mg/kg IL-18BP, kosoštvorce: 1 mg/kg IL-18BP, krúžky: 0,5 mg/kg IL-18BP a prázdne štvorčeky: 0,25 mg/kg IL-18BP.

Obrázok 10 znázorňuje histogram zobrazujúci erozívne skóre chrupaviek chorých kĺbov.

Obrázok 11 znázorňuje histopatológiu myšacích kĺbov. Na konci experimentu sa labka, na ktorej sa ako prvej vyvinula artritída, odrezala, fixovala sa a spracovala sa, ako je opísané v príklade 10. Obrázok 1 IA: normálny myšací kĺb; obrázok 11B: kĺb od artritickej myši; obrázok 11C: kĺb od myši ošetrenej s rhlL-18BP.

Obrázok 12 znázorňuje histogram zobrazujúci hladiny protilátok proti kolagénu typu II s izotypom IgGl (prázdne stĺpce) alebo IgG2a (prúžkované stĺpce) myší ošetrených s 3 mg/kg IL-18BP alebo fyziologickým roztokom (vehikulum). Merania sa uskutočňovali na 4. (D4) alebo na 8. (D8) deň choroby.

Obrázok 13 znázorňuje histogram zobrazujúci hladiny IL-6 v pg/ml zvierat ošetrených s 1, 3 alebo 10 mg/kg IL-18BP, 10 000 IU interferónu β (IFN-β), normálnym myšacím sérom (NMS), respektíve fyziologickým roztokom (NaCl).

Obrázok 14 znázorňuje expresiu hlL-18BP a IL-18 mRNA transkriptov v črevných biopsiách od pacientov trpiacich na aktívnu Crohnovu chorobu, vredovú kolitídu alebo od normálnych zdravých jedincov. Reprezentatívne RT-PCR produkty sú znázornené pre IL-18BP, IL-18 a udržiavací gén (β-aktín) (obrázok 14A). Relatívna kvantifikácia pásov farbených etidiumbromidom sa uskutočňovala použitím Kodak digitálneho zobrazovacieho softvéru a uvádza sa ako pomer cieľového génu ku β-aktínu. Cieľovým génom je IL-18 na obrázku 14B a IL-18B na obrázku 14C.

Obrázok 15 znázorňuje expresiu hIL-18BP mRNA transkriptov a proteínu HUVECs (ľudskými endoteliálnymi bunkami pupočníkovej žily) a expresiu proteínu THP1 (ľudskou monocytovou bunkovou líniou). RNA sa izolovala z neošetrených endoteliálnych buniek (médium) a endoteliálnych buniek stimulovaných s IL-Ιβ, TNFa, IFNy. Pozitívna kontrola: črevo od pacienta s Crohnovou chorobou, negatívna kontrola: bez cDNA. 1L-18BP a IL-18 expresia sa analyzovala semi-kvantitatívnou RT-PCR (obrázok 15A). Kultivačný supematant z neošetrených buniek (médium) a z buniek po 24 hodinovej aktivácii s IL-Ιβ, TNFa, IFNy HUVEC (obrázok 15B) alebo THP1 (obrázok 15C) sa analyzoval z hľadiska produkcie IL-18BP a IL-18 prostredníctvom ELISA.

Obrázok 16 znázorňuje vývoj telesnej hmotnosti medzi dňom 1 a dňom 10 na myšacom modeli IBD po intraperitoneálnom (i.p) podaní buď fyziologického roztoku (NaCl), alebo IL-18BP (8 mg/kg). Zmena hmotnosti je vyjadrená ako percento zmeny telesnej hmotnosti odo dňa 1. Znázornené sú priemerné hodnoty a SEM dvoch skupín obsahujúcich po 8 myší.

Obrázok 17 znázorňuje výsledky analýzy hrubých čriev, kaudálnych lymfatických uzlín a sleziny odobratých IL-18BP ošetreným vs. neošetreným myšiam. Obrázok 17A znázorňuje hmotnosť posledných 6 centimetrov čreva v mg. Obrázok 17B znázorňuje celkový počet buniek nachádzajúci sa v kaudálnej lymfatickej

SK 288032 Β6 uzline. Obrázok 17C znázorňuje percento buniek v slezine, ktoré sa pozitívne farbia s CD4*/CD69*. Údaje predstavujú priemerné hodnoty a SEM. * označuje významný rozdiel.

Obrázok 18 znázorňuje množstvo IFNy (obrázok 18A a B) a TNFa (obrázok 18C a D) produkované po 48 hodinách kaudálnymi lymfatickými uzlovými bunkami (obrázok 18A a C) a slezinovými bunkami (obrázok 18B a D) po stimulácii s CD3/CD28, ktoré sa nachádza v supematantoch. Znázornený je priemer a SEM.

Obrázok 19 znázorňuje obsah TNFa (obrázok 19A) a IFNy (obrázok 19B) v homogenátoch hrubého čreva. Údaje sú upravované vo vzťahu k hmotnosti čreva. Znázornené sú priemerné hodnoty a SEM. * označuje významný rozdiel.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príkladová časť I:

Príklady 1 až 8 sa týkajú použitia IL-18 inhibítorov pri poškodení pečene.

Príklad 1

Produkcia IL-18BP s His príveskom

Purifikovaný rekombinantný ľudský IL18BP obsahujúci his prívesok (r-Hil-18bp-His) sa produkoval v CHO bunkách. Pre priemerného odborníka v oblasti je produkcia rekombinantných proteínov v eukaryotických bunkách známa. Dostupné sú dobre známe spôsoby na konštrukciu príslušných vektorov nesúcich DNA, ktorá kóduje 1L-18BP, a vhodných na transfekciu eukaryotických buniek na účely produkcie rekombinantného IL-18BP. Aby sa exprimovala v bunkách, vyštiepi sa DNA kódujúca IL-18BP (pozri napr. Novick a ďalší, 1999) a začlení sa do expresných vektorov vhodných na transfekciu buniek. Alternatívne sa takáto DNA môže pripraviť prostredníctvom PCR s vhodnými sense a antisense primermi. Výsledné cDNA konštrukty sa potom zavedú do vhodne skonštruovaných eukaryotických expresných vektorov technikami, ktoré sú v oblasti dobre známe (Maniatis, 1982). Rekombinantný proteín sa purifikoval do viac ako 95 % čistoty a zistilo sa, že je biologicky aktívny in vitro a in vivo s vysokou afinitou proti svojmu ligandu.

Príklad 2

Ochranný účinok IL18BP proti endotoxínom indukovanej smrti na myšacom modeli

Myšací model sa použil na testovanie toho, či by IL18BP, IL-18 inhibítor, chránil myši pred vysokou dávkou lipopolysacharidov (LPS). LPS vyvoláva akútne poškodenie pečene, po ktorom nasleduje rýchla smrť myší.

mg/kg rekombinantného, ľudského IL-18BP (rhlL18BPhis) obsahujúceho his-prívesok (ktorý je výsledkom rekombinantnej produkcie proteínu) sa injektovali intraperitoneálne (i. p.) do C57BL/6 myší. O hodinu neskôr sa injekčné podalo 60 mg/kg LPS (letálna dávka). Prežívanie myší sa porovnávalo so skupinou zvierat, ktoré dostali len LPS (bez IL18BP).

Päť zo 7 myší, ktorým sa injekčné podal rhlL-18BP-his, prežilo LPS injekciu, na rozdiel od kontrolných myší, z ktorých všetky uhynuli do troch dní.

hodín po LPS injekcii v neprítomnosti alebo prítomnosti zvyšujúcich sa dávok rhlL-18BP-his sa odobrali vzorky krvi a analyzovali sa ELISA testom z hľadiska cirkulujúceho IFN-γ (obrázok 1). 0,4 a 4 mg/kg rhlL-18BP indukujú dvojnásobné zníženie sérového IFN-γ. Táto inhibícia sa stratila pri nižších dávkach rhlL-18BP (0,004 a 0,4 mg/kg).

Príklad 3

IL18BP má ochranný účinok proti poškodeniu pečene na myšacom modeli ochorenia

Myšací model prudkej hepatitídy bol použitý na testovanie účinku IL18BP. Pri myšiach sa vyvíja akútne poškodenie pečene, keď sa podrobia postupnému podávaniu Propionibacterium acnes (P. acnes) a lipopolysacharidu (LPS).

Myšiam sa injekčné podávali zvyšujúce sa dávky rhlL-18BP-his (4; 0,4; 0,04; 0 mg/kg) v rôznych časoch (1 h, 20 min., simultánne) pred injekciou LPS C57BL/6 P. acnes senzitizovaným myšiam. Keď sa i. p. podal rhlL-18BP-his v rovnakom čase ako LPS, žiadna myš neprežila a hladiny cirkulujúcich IFN-γ a TNF-α neboli ovplyvnené. Prekvapujúco, rhlL-18BP (4 a 0,4 mg/kg) indukoval 70 % zníženie cirkulujúcej alanín aminotransferázy (marker poškodenia pečene), ako je znázornené na obrázku 2.

Okrem toho sa monitorovalo prežívanie myší (obrázok 3). Keď sa rhlL-18BP podával i. p. 20 minút pred LPS, dve najvyššie dávky IL-18BP (4 a 0,4 mg/kg) oddialili uhynutie myší o 10 hodín v porovnaní s kontrolnými myšami, ktoré dostali namiesto IL-18BP len NaCI.

Výsledky merania sérových hladín IFN-γ sú znázornené na obrázku 4. rhIL18BP (4 mg/kg) inhiboval 90 % cirkulujúceho IFN-γ a 80 % cirkulujúcej alanín aminotransferázy (nie je znázornené).

Keď sa rhIL-18BP podával hodinu pred LPS, krivky prežívania a hladiny cirkulujúceho IFN-γ boli podobné ako tie, ktoré boli pozorované, keď sa rhlL-18BP-his podával 20 min. pred LPS, ale hladiny cirkulujúcej alanín aminotransferázy ostali neovplyvnené (nie je znázornené).

Okrem toho sa myšacie pečeňové tkanivo analyzovalo hematoxilín-eozínovým farbením, ako aj tunelovou mikroskopiou. Pečene myší, pri ktorých sa predtým indukovala ťažká hepatitída, mali závažnú nekrózu v porovnaní s normálnym pečeňovým tkanivom. Na rozdiel od toho pečeňové tkanivo myší ošetrených s IL18BP malo významne nižší počet nekrotických ohnísk ako neošetrené myši.

Príklad 4

Anti-IL-18 protilátky chránia proti letálnej endotoxémii

Na zhodnotenie toho, či by blokovanie IL-18 s IL-18 protilátkami chránilo myši pred letálnymi dávkami lipopolysacharidov, sa C57BL/6J myšiam najprv injekčné podala neutralizačná králičia anti-myšia IL-18 protilátka (polyklonálna) alebo normálne králičie sérum (NDS) ako kontrola. 30 minút po ošetrení s protilátkou sa injekčné podala letálna dávka LPS získaného buď z E. coli (obrázok 5A), alebo zo S. thyphimurium (obrázok 5B). Experimenty zahŕňali 10 až 12 myší na skupinu a uskutočňovali sa dvojmo pri dvoch rozličných príležitostiach.

Ako je ukázané na obrázku 5A, ošetrenie myší s anti-IL-18 antisérom predchádzalo mortalite indukovanej 40 mg/kg E. coli LPS. 100 % myší prežilo po anti-IL-18 ošetrení oproti 10 % prežívaniu pri myšiach ošetrených s normálnym králičím sérom (p < 0,005).

Obrázok 5B ukazuje, že myši ošetrené protilátkou boli chránené aj pred S. thyphimurium letálnymi účinkami (50 % v.s. 0 % prežívanie; p < 0,05).

Príklad 5

Blokovanie IL-18 a TNF-α chráni myši pred ConA- a PEA-indukovanou hepatotoxicitou

Dva experimentálne modely hepatotoxicity boli použité na zhodnotenie úlohy IL-18 a TNF-α pri poškodení pečene. Tak injekcia konkanavalínu A (Con A), ako aj Pseudomonas aeruginosa (PEA) myšiam indukuje poškodenie pečene a sú preto modelmi T bunkami sprostredkovanej hepatitídy.

C57BL/6J myši sa vopred ošetrili s anti-IL-18 antisérom alebo rozpustným TNF-α receptorom, TNFsRp55. Zmerali sa sérové hladiny alanín aminotransferázy (ALT) ako indikátory poškodenia pečene (obrázok 6).

Ako je znázornené na obrázku 6A, tak IL-18 antisérum, ako aj rozpustné TNF-receptory, významne znižujú ConA-indukované sérové ALT hladiny, v porovnaní s kontrolnou injekciou samostatného vehikula (fyziologického roztoku bez pyrogénu). Súčasné podávanie rozpustného TNF receptora a IL-18 antiséra vedie ku kompletnej inhibícii poškodenia pečene indukovaného s Con-A.

Ako je ukázané na obrázku 6B, pri myšiach, ktorým bol injekčné podaný PEA, viedla neutralizácia TNFoc inhibítorov k 93 % inhibícii sérových hladín ALT a neutralizácia anti-IL-18 protilátok k 83 % inhibícii sérových hladín ALT. Kombinovaná blokáda oboch viedla k 99 % ochrane.

Príklad 6

Plazmatické hladiny IL-18-viažuceho proteínu sú zvýšené u pacientov s chronickým ochorením pečene

IL-18 BP plazmatické hladiny sa merali u 133 pacientov s chronickým ochorením pečene (CLD) rôzneho pôvodu a u 31 zdravých kontrolných jedincov prostredníctvom špecifickej ELISA použitím IL18BP monoklonálnej protilátky.

Plazmatické hladiny IL-18 BP boli významne vyššie u CLD pacientov (12,91 ± 0,89 ng/ml; priemer ± SEM) ako u zdravých subjektov (4,96 ± 0,43 ng/ml, p < 0,001). Cirhotickí pacienti mali významne vyššie hladiny ako pacienti s necirhotickou CLD (19,23 ± 1,28 ng/ml, n=67, vs. 6,49 ± 0,51 ng/ml, n=66, p < 0,001). Pacienti so štádiom B Child-Pugh klasifikácie mali vyššie hladiny IL-18 BP ako pacienti so štádiom A (2,48 ± 2,44 ng/ml vs. 9,57 ± 1,25 ng/ml, p < 0,001). Ale nebol žiadny významný rozdiel medzi Child B a C (22,48 ± 2.44 ng/ml vs. 20,62 ± 4,75 ng/ml, p=0,7). Plazmatické hladiny IL-18 BP pozitívne korelovali s GOT, bilirubínom a rýchlosťou sedimentácie erytrocytov. Zistila sa negatívna korelácia s protrombínovým časom.

Možno zhrnúť, že výsledky dokazujú, že plazmatické hladiny IL-18 BP sú zvýšené pri CLD a korelujú so závažnosťou ochorenia bez ohľadu na etiológiu ochorenia. Napriek endogénnemu antagonistovi prozápalového IL-18 sa zvýšené hladiny IL18-BP nezdajú byť dostatočnými na kladenie odporu veľkej väčšine prozápalových mediátorov pri CLD.

Príklad 7

Inhibícia alkoholovej hepatitídy prostredníctvom IL-18BP

Štyri skupiny potkanov (5 na skupinu) sa kŕmili etanolom a stravou obsahujúcou obilninový olej prostredníctvom vnútrožalúdočnej infúzie 4 týždne. Pri kontrolných potkanoch dextróza izokaloricky nahradila etanol.

Potkanom sa denne injekciou podával myšací IL-18BP (1 mg/kg) alebo fyziologický roztok. Na pečeňových rezoch sa uskutočňovala patologická analýza a v sére sa uskutočňovali merania TNF-α, Fas ligandu a IFN-γ. Pri potkanoch kŕmených etanolom, ktorým sa injekčné podával fyziologický roztok, je vidieť nekrozápalové poškodenie a expresiu pečeňových enzýmov, TNF-α, Fas ligandu a IFN-γ.

Potkany, ktorým sa injekčné podával IL-18BP, sú chránené pred nekrozápalovým poškodením a hladiny pečeňových enzýmov, TNF-α, Fas ligandu a IFN-γ sú významne znížené (> 90 %).

Príklad 8

Inhibícia konkanavalínom A indukovanej hepatitídy prostredníctvom IL-18BP

Balb/c myšiam sa injekčné podalo 12 mg/kg konkanavalínu A (Con A) s alebo bez injekcie myšacieho IL-18BP (1 mg/kg) 2 hodiny pred Con A podaním a potom denne. Poškodenie sa hodnotilo prostredníctvom stanovenia sérových hladín pečeňových enzýmov, TNF-α, Fas ligandu a IFN-γ. Pečeňová histopatológia sa porovnávala s myšami ošetrovanými len s konkanavalínom A.

Predošetrenie s IL-18BP významne znižovalo sérové hladiny pečeňových enzýmov a TNF-α, pričom nebol žiadny dôkaz zápalu pri histopatologickom skúmaní v porovnaní s kontrolnými myšami ošetrenými s Con A.

Claims (24)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použitie IL-18 inhibítora vybraného zo skupiny, ktorá obsahuje IL-18 protilátku a IL-18 viažuci proteín alebo ich izoformu, muteín, fúzovaný proteín, funkčný derivát, aktívnu frakciu alebo kruhovo permutovaný derivát, ktoré majú v podstate rovnakú aktivitu ako IL-18 viažuci proteín, na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu chronického poškodenia pečene, ktoré je vybrané zo skupiny obsahujúcej alkoholickú hepatitídu.
2. 2. Použitie podľa nároku 1, kde IL-18 protilátkou je humanizovaná IL-18 protilátka.
3. 3. Použitie podľa nároku 1, kde IL-18 protilátkou je ľudská IL-18 protilátka.
4. 4. Použitie podľa nároku 1, kde IL-18 viažuci proteín je PEGylovaný.
5. 5. Použitie podľa nároku 1, kde inhibítorom IL-18 je fúzovaný proteín zahŕňajúci celý alebo časť IL-18 viažuceho proteínu fuzovanú s celým alebo časťou imunoglobulínu, pričom sa fúzovaný proteín viaže na 1L-18.
6. 6. Použitie podľa nároku 5, kde fúzovaný proteín zahŕňa celú alebo časť konštantnej oblasti imunoglobulinu.
7. 7. Použitie podľa nároku 6, kde imunoglobulín je IgGl alebo IgG2 izotyp.
8. 8. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov 1 až 7, kde liek zahŕňa aj interferón.
9. 9. Použitie podľa nároku 8, kde interferón je interferón-β.
10. 10. Použitie podľa nároku 8 alebo 9, kde sa inhibítor IL-18 používa zároveň, postupne alebo oddelene s interferónom.
11. 11. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov 1 až 10, kde liek zahŕňa aj antagonistu nádorového nekrotického faktora - TNF.
12. 12. Použitie podľa nároku 11, kde TNF antagonistom je rozpustný TNF receptor I - TBPI a/alebo rozpustný TNF receptor II - TBPII.
13. 13. Použitie podľa nároku 11 alebo 12, kde inhibítor IL-18 a/alebo interferón sa používa zároveň, postupne alebo oddelene s TNF antagonistom.
14. 14. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov 1 až 13, kde liek zahŕňa aj COX-inhibítor.
15. 15. Použitie podľa nároku 14, kde COX-inhibítorom je COX-2 inhibítor.
16. 16. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov 1 až 15, kde sa IL-18 inhibítor používa v množstve 0,0001 až 10 mg/kg telesnej hmotnosti, alebo 0,01 až 5 mg/kg telesnej hmotnosti, alebo 0,1 až 3 mg/kg telesnej hmotnosti, alebo 1 až 2 mg/kg telesnej hmotnosti.
17. 17. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov 1 až 16, kde sa IL-18 inhibítor používa v množstve 0,1 až 1000 pg/kg telesnej hmotnosti, alebo 1 až 100 pg/kg telesnej hmotnosti, alebo 10 až 50 pg/kg telesnej hmotnosti.
18. 18. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov 1 až 17, kde sa IL-18 inhibítor podáva subkutánne.

    SK 288032 Β6
19. 19. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov 1 až 18, kde sa IL-18 inhibítor podáva intramuskuláme.
20. 20. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov 1 až 19, kde sa IL-18 inhibítor podáva denne.

    5
21. 21. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov 1 až 20, kde sa IL-18 inhibítor podáva každý druhý deň.
22. 22. Použitie expresného vektora obsahujúceho kódujúcu sekvenciu IL-18 inhibítora na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu chronického poškodenia pečene, ktoré je vybrané zo skupiny zahŕňajúcej alkoholickú hepatitídu.

    10
23. 23. Použitie podľa expresného vektora podľa nároku 22 na génovú terapiu.
24. 24. Použitie bunky, ktorá bola geneticky modifikovaná na účely produkcie IL-18 inhibítora, na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu chronického poškodenia pečene, ktoré je vybrané zo skupiny zahŕňajúcej alkoholickú hepatitídu.

    15 14 výkresov