EA005583B1 - Применение ингибиторов il-18 - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к применению ингибиторов IL-18 при получении лекарственного средства для лечения и/или предупреждения повреждения печени. Изобретение также относится к применению ингибиторов IL-18 при получении лекарственного средства для лечения и/или предупреждения артрита, в частности ревматоидного артрита. Кроме того, изобретение относится к применению ингибиторов IL-18 при получении лекарственного средства для лечения и/или предупреждения воспалительного заболевания кишечника, в частности болезни Крона или неспецифического язвенного колита.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к лечебному применению ингибиторов 1Ь-18 при некоторых паталогических состояниях. Конкретнее, изобретение относится к лечению и/или предупреждению артрита, к лечению и/или предупреждению болезней печени и к лечению и/или предупреждению воспалительных заболеваний кишечника (ΙΒΌ).

Предпосылки создания изобретения

В 1989 г. описана эндотоксининдуцированная сывороточная активность, индуцирующая интерферон-γ (ΙΡΝ-γ), полученный из клеток селезенки мыши (Мюа11е£ с1 а1., 1996). Такая сывороточная активность действует не как прямой индуктор ΙΡΝ-γ, а как костимулятор вместе с 1Ь-2 или митогенами. При попытке выделить активность в чистом виде из постэндотоксинной мышиной сыворотки обнаружили явно гомогенный белок в 50-55 кДа. Так как другие цитокины могут действовать как костимуляторы для продуцирования ΙΡΝ-γ, неэффективность нейтрализующих антител к ГС-1, №4. ΙΤ-5, ГЬ-6 или Т№ для нейтрализации сывороточной активности позволила предположить, что она является особым фактором. В 1995 г. те же ученые показали, что эндоксининдуцированный костимулятор для продуцирования ΙΡΝγ присутствует в экстрактах печени мышей, предварительно кондиционированных Р. аспек (ΝονΤΚ е1 а1., 1992 г.). На данной модели растет популяция печеночных макрофагов (клетки Купфера), и у таких мышей низкая доза бактериального липополисахарида (ЬР8), нелетальная для мышей, предварительно некондиционированных, становится летальной. Фактор, названный ΙΡΝ-γ-индуцирующим фактором (ΙΟΙΡ), а позднее названный интерлейкином-18 (ТС-18), выделен в чистом виде из 1200 г печени мышей, обработанных Р. аспек. Вырожденные олигонуклеотиды, полученные из аминокислотных последовательностей очищенного ТС-18, использовали для клонирования кДНК мышиного ТС-18 (ΝονχΚ е1 а1., 1992 г.). ТС-18 представляет собой белок в 18-19 кДа из 157 аминокислот, не обладающий явным подобием с какимлибо пептидом в базе данных. Матричные РНК РС-18 и интерлейкина-12 (ΙΤ-12) хорошо обнаруживаются в клетках Купфера и активированных макрофагах. Рекомбинантный РС-18 индуцирует ΙΡΝ-гамма сильнее, чем ΙΤ-12, очевидно, через отдельный каскад (ΝονΤΚ е1 а1., 1992 г.). Подобно эндотоксининдуцированной сывороточной активности РС-18 сам не индуцирует ΙΡΝ-γ, а действует в первую очередь как костимулятор с митогенами или ΙΤ-2. ЛС-18 усиливает клеточную пролиферацию, очевидно, через ΙΤ-2зависимый каскад, и усиливает продуцирование цитокинов ТЫ ίη νίίτο, и обнаруживает синергизм при сочетании с ΙΤ-2 в смысле усиленного продуцирования ΙΡΝ-γ (МаЫе\\'кк| е1 а1., 1990 г.).

Показано, что нейтрализующие антитела к мышиному РС-18 предотвращают летальность низкой дозы ЬР8 для мышей, предварительно кондиционированных Р. аспек. Имеются другие сообщения о важности ΙΡΝ-γ как медиатора летальности ЬР8 у предварительно кондиционированных мышей. Например, нейтрализующие анти-IΡN-γ-антитела защищают мышей от шока, подобного шоку Шварцмана (ΡηηΙυζζί е1 а1., 1998 г.), и обработанные галактозамином мыши с недостатком в ΙΡΝ-γ-рецепторах были устойчивы к вызываемой ЬР8 гибели (Вут, 1990). Поэтому не стало неожиданностью, что нейтрализующие антитела к мышиному РС-18 защищают мышей, предварительно кондиционированных Р. аспек, от летального ЬР8 (ΝονχΚ е1 а1., 1992 г.). Обработка антимышиным РС-18 также защищала выживших мышей от тяжелой печеночной цитотоксичности.

После того как была клонирована мышиная форма, в 1996 г. появилось сообщение о последовательности кДНК для РС-18 человека (Окатига е1 а1., 1995 г.). Рекомбинантный РС-18 человека обнаруживает природную ΙΤ-18-активность (Окатига е1 а1., 1995 г.). Рекомбинантный РС-18 человека не проявляет прямой ΙΡΝ-γ-индуцирующей активности в отношении Т-клеток человека, но действует как костимулятор продуцирования ΙΡΝ-γ и других цитокинов Т-хелперных клеток-1 (ТЫ) (Окатига е1 а1., 1995 г.). На сегодняшний день РС-18 рассматривают в первую очередь как костимулятор продуцирования цитокинов ТЫ (ΙΡΝ-γ, ΙΤ-2 и колониестимулирующего фактора гранулоцитов-макрофагов) (Сак1, 1978 г.), а также как костимулятор ΡΆδ-лиганд-опосредованной цитотоксичности мышиных клонов клеток природных киллеров (ΝονχΚ е1 а1., 1989).

Путем клонирования РС-18 из пораженных тканей и исследования экспрессии гена РС-18 обнаружена тесная связь этого цитокина с аутоиммунной болезнью. У мыши с диабетом, не связанным с ожирением (ΝΌΌ), спонтанно развивается аутоиммунный инсулит и диабет, которые можно ускорить и синхронизировать одной инъекцией циклофосфамида. На ранних стадиях инсулита в поджелудочной железе ΝΌΌ-мыши методом ПЦР с обратной транкрипцией показано наличие мРНК РС-18. Уровни мРНК РС-18 быстро повышаются после обработки циклофосфамидом и предшествуют возрастанию уровня мРНК ΙΡΝ-γ и затем развитию диабета. Представляет интерес то, что такая кинетика напоминает кинетику мРНК ΙΤ-12-ρ40, причем получают тесную корреляцию уровней отдельных мРНК. Клонирование кДНК РС-18 из РНК поджелудочной железы с последующим секвенированием показывает идентичность с последовательностью РС-18, клонированной из клеток Купфера и предварительно активированных ίη νΐνο макрофагов. Также макрофаги ΝΌΌ-мыши отвечали на циклофосфамид экспрессией гена РС-18, в то время как макрофаги параллельно обработанных мышей Ва1Ь/с не реагировали. Следовательно, экспрессия СС-18 у аутоиммунной ΝΌΌ-мыши регулируется аномально и тесно связана с развитием диабета (ΝονχΚ е1 а1., 1992 г.).

- 1 005583

ГБ-18 играет возможную роль в иммунорегуляции или в воспалении путем увеличения функциональной активности Бак-лиганда на клетках ТЫ (Сопб е! а1., 1997 г.). 1Б-18 также экспрессируется в корковом веществе надпочечника и, следовательно, может представлять собой секретируемый нейромодулятор, играя важную роль в организации иммунной системы после сильного стресса (С11а1сг. 1986 г.).

Ιη νίνο 1Б-18 образуется путем расщепления про-1Б-18, и оказывается, что его эндогенная активность отвечает за продуцирование ΙΡΝ-γ при летальности, опосредованной Р. аспек и БР8. Зрелый ГБ-18 продуцируется из своего предшественника с помощью 1Б-1 (/-конвертирующего фермента (1Б-1бетаконвертирующий фермент, 1СЕ, каспаза-1).

Рецептор 1Б-18 состоит по меньшей мере из двух компонентов, совместно действующих при связывании лиганда. Высоко- и низкоаффинные сайты связывания 1Б-18 обнаружены в Т-клетках, стимулированных мышиным 1Б-12 (Υοδίιίιηοίο е! а1., 1998 г.), что наводит на мысль о многоцепном рецепторном комплексе. Пока идентифицированы две рецепторные субъединицы, причем обе принадлежат семейству рецепторов 1Б-1 (Рагпе! е! а1., 1996 г.). Сигнальная трансдукция 1Б-18 участвует в активации ΝΡ-кВ (ΌίБопа!о е! а1., 1997 г.).

Некоторые известные цитокинсвязывающие белки являются растворимыми цитокиновыми рецепторами и соответствуют внеклеточным лигандсвязывающим доменам их соответствующих цитокиновых рецепторов клеточной поверхности. Они образуются или путем альтернативного сплайсинга пре-мРНК, обычного для рецептора клеточной поверхности, или путем протеолитического расщепления рецептора клеточной поверхности. Такие растворимые рецепторы описаны, в том числе, среди прочих, растворимые рецепторы 1Б-6 и ΙΡΝ-γ Щакашига е! а1. , 1989 г.), ΤΝΡ (Бао е! а1., 1996 г.; Епд1етапп е! а1., 1989 г.), 1Б-1 и 1Б-4 (1о1т, 1986 г.), ΙΡΝ-α/β (Μίζιΐδΐιίιηη апб №ща1а, 1990 г.) и другие. Оказывается, что один цитокинсвязывающий белок, названный остеопротегерином (ОРС, также известный как фактор, ингибирующий остеокласты - ОС1Б), член семейства ТОТКТБак, является первым примером растворимого рецептора, который существует только в виде секретируемого белка (Апбегкоп, 1997 г.; Во11оп, 1980 г.).

Недавно растворимый белок с высокой аффинностью к 1Б-18 выделен из человеческой мочи, и описаны кДНК человека и мыши (ΑνΑ е! а1., 1999 г.; XVО 99/09063). Белок назван 1Б-18-связывающим белком (1Б-18ВР).

1Б-18ВР является не внеклеточным доменом одного из известных рецепторов 1Б-18, а секретируемым естественно циркулирующим белком. Он принадлежит новому семейству секретируемых белков. Семейство также включает в себя некоторые кодируемые поксвирусами белки с высокой гомологией с 1Б-18ВР (№\тск е! а1., 1999 г.). 1Б-18ВР конститутивно экспрессируется в селезенке, принадлежит суперсемейству иммуноглобулинов и имеет ограниченную гомологию с рецептором 1Б-1 типа II. Его ген локализуется на хромосоме человека 11η13, и экзон, кодирующий трансмембранный домен, в геномной последовательности 8,3 т.п.н. не обнаружен (ΑνΑ е! а1., 1999 г.).

Четыре изоформы 1Б-18ВР человека и две изоформы мыши, являющиеся результатом сплайсинга мРНК, обнаружены в различных библиотеках кДНК и экспрессированы, очищены и испытаны на связывание и нейтрализацию биологической активности 1Б-18 (К1те! а1., 2000 г.). Изоформа 1Б-18ВР человека (1Б-18ВРа) обнаружила самую высокую аффинность к 1Б-18 с быстрым включением (гар1б оп-га!е) и медленным выключением (к1о\у ой-га!е) и константой диссоциации (К(б)) 399 пМ. 1Б-18ВРС разделяет общий 1д-домен с 1Б-18ВРа, за исключением 29 С-концевых аминокислот; К(б) 1Б-18ВРс в 10 раз меньше (2,94 нМ). Тем не менее, 1Б-18ВРа и 1Б-18ВРС нейтрализуют 1Б-18 >95% при молярном избытке того и другого. Изоформы 1Б-18ВРБ и !Б-18ВРб утрачивают полный 1д-домен и утрачивают способность связывать или нейтрализовывать 1Б-18. Мышиные изоформы 1Б-18ВРС и 1Б-18ВРб, обладающие идентичностью с 1д-доменом, также нейтрализуют >95% мышиного 1Б-18 при молярном избытке того и другого. Однако мышиный !Б-18ВРб, разделяющий общий обычный С-концевой мотив с 1Б-18ВРа человека, также нейтрализует 1Б-18 человека. С помощью молекулярного моделирования идентифицирован большой избыток электростатического и гидрофобного связывающего сайта в 1д-домене 1Б-18ВР, который может отвечать за его высокоаффинное связывание с лигандом (К1т е! а1., 2000 г.).

Недавно сделано предположение, что интерлейкин 1Б-18 участвует в развитии патогенности при хронических воспалительных заболеваниях, в том числе эндотоксинного шока, гепатита и аутоиммунного диабета (Кайтатига апб Окатига, 1998 г.). Другое указание на положительную роль 1Б-18 в развитии повреждения печени следует из экспериментов, результаты которых опубликованы Ткш е! а1. (Ткш е! а1., 1999), где на мышиной модели показан повышенный уровень 1Б-18 при вызванном липополисахаридом остром повреждении печени. Однако механизм действия многофункционального фактора 1Б-18 при развитии повреждения печени пока не выяснен.

Повреждение печени может иметь разные причины. Это может происходить, например, из-за вирусных или бактериальных инфекций, злоупотребления алкоголем, иммунных расстройств или рака.

Вирусные гепатиты, вызванные, например, вирусом гепатита В или вирусом гепатита С, являются плохо управляемыми болезнями, поражающими большое число людей во всем мире. Число известных вирусов гепатита постоянно растет. Кроме вирусов гепатита В и С пока обнаружены по меньшей мере

- 2 005583 четыре других вируса, вызывающих связанный с вирусом гепатит, названные вирусами гепатита Α, Ό, Е и 6.

Алкогольная болезнь печени является другим широкораспространенным заболеванием, связанным с хроническим употреблением алкоголя. Иммунный гепатит является редким аутоиммунным заболеванием, которое плохо лечится. Повреждение печени также включает в себя повреждения желчных протоков. Первичный билиарный цирроз (ПБЦ) является аутоиммунным заболеванием печени, характеризующимся разрушением внутрипеченочных желчных протоков.

В некоторых исследованиях показано, что повреждение печени при болезнях, таких как алкогольный гепатит, цирроз печени, вирусный гепатит и первичный билиарный цирроз, связано с реакциями Тхелперных клеток-1 (ТЫ). В одной из работ создана новая модель поврежденя печени у мышей путем направленной доставки в печень овальбуминсодержащих липосом с последующим адаптивным переносом овальбуминспецифических клеток ТЫ. Комбинированная обработка мышей овальбуминсодержащими липосомами и переносчиком клеток ТЫ вызывала повышение сывороточной трансаминазной активности параллельно с повышением уровней ΙΡΝ-γ в сыворотке. Как резкий контраст, перенос овальбуминспецифических клеток Т112 приводил к повышению уровней 1Ь-4 в сыворотке, но не вызывал повреждения печени. Повреждение печени блокировалось антителами против ΙΡΝ-γ и антителами против фактора некроза опухоли ΤΝΡ-α. Такие результаты показывают, что клетки ТЫ являются главными эффекторными клетками при остром повреждении печени (МкЫтита апб 0111а. 1999 г.). В ряде других работ показано, что у мышей со сверхэкспрессией обнаруживается спонтанный гепатит без какого-либо патогена или какого-либо другого стимулятора (Окато1о с1 а1., 1998 г.).

Другое исследование связано с реакциями Т11 при первичном билиарном циррозе (ПБЦ). ПБЦ является аутоиммунной болезнью печени, характеризующейся разрушением внутрипеченочных желчных протоков. Как правило, полагают, что к такому повреждению желчных протоков приводят клеточные иммунные механизмы, в частности, с участием Т-клеток. В последнее время сделано предположение, что относительная сила реакций Т11 и Т12 является важным фактором в патофизиологии различных аутоиммунных болезней. В данном исследовании баланс подмножеств при ПБЦ оценивали путем обнаружения цитокинов, специфичных для двух подмножеств Т-клеток, т.е., ΙΡΝ-γ для клеток ТЫ и 1Ь-4 для клеток Т12. Клетки, положительные в отношении ΙΡΝ-γ-матричной РНК (мРНК) и 1Ь-4-мРНК, подсчитывали в отделах печени 18 пациентов с ПБЦ и 35 контрольных больных, имевших хронический активный гепатит С, внепеченочную билиарную обструкцию и здоровую печень, с использованием неизотопной гибридизации ίη δίΐιι и иммуногистохимии. Мононуклеарные клетки, экспрессирующие мРНК ΙΡΝ-γ и 1Ь4, при ПБЦ собирались в воспаленных входных путях в печени, но редко присутствовали в отделах печени при внепеченочной билиарной обструкции, алкогольном фиброзе или при здоровой печени. Клетки, положительные в отношении мРНК ΙΡΝ-γ и 1Ь-4, при ПБЦ печени обнаруживались в значительно большем числе, чем в печени в контроле (Р<0,01). Кроме того, при ПБЦ печени экспрессия мРНК ΙΡΝ-γ обнаруживалась чаще, чем экспрессия ΙΕ-4, и уровни экспрессии мРНК ΙΡΝ-γ больше коррелируют со степенью воспалительной активности на входах. Клетки, положительные в отношении мРНК ΙΡΝ-γ, обнаруживались, главным образом, вблизи поврежденных желчных протоков, которые окружались лимфоидными агрегатами. Результаты показывают, что клетки Т11 являются более заметной субпопуляцией Тклеток в лимфоидных инфильтратах при ПБЦ (Нагаба с1 а1., 1997 г.).

Картина цитокинов при узнавании вирусных антигенов также, как полагают, оказывает глубокое влияние на растворение вирусных инфекций и вирусный клиренс. В одной из работ исследовалось, играет ли какую-либо роль цитокиновый дисбаланс, ориентированный на реакцию клеток типа Т12, при хроническом гепатите В. Профили цитокинов мононуклераных клеток периферической крови, связанных с хроническим гепатитом В, анализировали методом ОТ-ПЦР. После стимуляции поверхностного антигена гепатита В (НЫАд) обнаруживали экспрессию ΙΡΝ-γ, Ш-2, Ш-4 и ΙΠ-10 у 41, 8, 41 и 50% пациентов, соответственно. Среди указанных цитокинов экспрессию цитокина Т11 ΙΡΝ-γ связывали с высокими уровнями в сыворотке А8Т/АЬТ (аспартатаминотрансферазы/аланинаминотрансферазы), представляющих собой типичные маркеры повреждения печени. Не показано, что цитокины типа Т12 оказывают защитное действие на гепатоциты. Как вывод, продуцирование цитокина Т11 ΙΡΝ-γ, НВкАд-реактивными клетками связано с повреждением гепатоцитов при хроническом гепатите В (Ъее с1 а1., 1999 г.). Есть сообщение о высоких уровнях ΡΑδ-лиганда и его рецептора (СИ95) в печени пациентов с гепатитом В (Ьио е1 а1., 1997 г.). Считается, что ΡΑδ-лиганд является одним из главных цитотоксических факторов, приводящих к апоптозу гепатоцитов.

В другой работе идентифицированы факторы, связанные с развитием повреждения печени у 30 не подвергавшихся лечению пациентов с хроническим гепатитом, положительных в отношении вируса гепатита С/РНК (НСУ/ΚΝΑ). Некровоспалительные и архитектурные повреждения оценивали с использованием шкалы Ш1ак. Активированные звездчатые клетки печени (Н8С) визуализировали методом иммуногистохимии для α-актина гладких мышц (αδΜΑ) и определяли количественно методом морфометрии. НСУ/ΚΝΑ в плазме оценивали с использованием метода ОТ-ПЦР. Для того чтобы исследовать тип иммунного ответа, участвующего в развитии повреждения печени, ΙΡΝ-γ-положительные клетки (как выра

- 3 005583 жение Т111 -подобной реакции) оценивали методом иммуногистохимии и определяли количественно методом морфометрии. Обнаружено, что больше всего Н8С определяли вблизи областей долькового некровоспаления или фиброзных перегородок выстилки. Паренхима, αδΜΑ- и сириус красныйположительная, существенно коррелирует с оценками некровоспаления и архитектуры. ΙΡΝ-γположительные клетки обнаружены вокруг входных областей, связанных с воспалительными инфильтратами, что хорошо коррелирует с архитектурными повреждениями. Поэтому сделан вывод, что активация Н8С и развитие повреждения печени связаны с ТЫ-подобной реакцией (Вагош е! а1., 1999 г.). Подобным образом, в случае гепатита В в печени и сыворотке пациентов с гепатитом С обнаружены ΡΑ8лиганд и его рецептор (Нйашаки е! а1., 1994 г.; Окахак! е! а1., 1996 г.; Ио е! а1., 1998 г.).

Обнаружено, что цитокины ТЫ и другие маркеры ТЫ связаны с алкогольным гепатитом и циррозом печени. Воспалительные стимулы и перекисное окисление липидов активируют нуклеарный фактор кВ (ΝΡ-кВ) и активируют провоспалительные цитокины и хемокины. В одной из работ оценивали соотношение между патологическим повреждением печени, эндотоксикозом, перекисным окислением липидов и активацией ΝΡ-кВ и дисбалансом между про- и противовоспалительными цитокинами. Крысам (5 особей в группе) путем внутрижелудочной инфузии давали этанол и корм, содержащий насыщенный жир, пальмовое масло, кукурузное масло или рыбий жир. Контрольным крысам этанол заменяли изокалорийным количеством декстрозы. Осуществляли анализ патологии и определяли уровни эндотоксина, перекисного окисления липидов, ΝΡ-кВ и матричной РНК (мРНК) провоспалительных цитокинов (ΪΝΙα, 1Ь-1-бета, ΙΡΝγ и 1Ь-12), С-С-хемокинов (регулируемые при активации экспрессируемые и секретируемые нормальными Т-клетками |ВАНТЕ8|. хемотаксический белок моноцитов [МСР]-1, макрофагальный воспалительный белок [М1Р]-1а), С-Х-С-хемокинов (цитокининдуцированный нейтрофильный хемоаттрактант [СЕЛС], ΜΙΡ-2, ΙΡ-10 и эпителиальный нейтрофилактивирующий белок [ΕΝΑ]-78) и противовоспалительных цитокинов (ΙΠ-10, 1Ь-4 и ΙΠ-13). У крыс, обнаруживающих некровоспалительное повреждение (рыбий жир и этанол и кукурузное масло и этанол), видна активация ΝΡ-кВ и повышенная экспрессия провоспалительных цитокинов С-С и хемокинов С-Х-С. В указанных группах также были самые высокие уровни эндотоксина и перекисного окисления липидов. Уровни мРНК ΙΠ-10 и ΙΕ-4 были ниже в группе, обнаруживающей воспалительное повреждение печени. Таким образом, активация ΝΡ-кВ происходит в присутствии провоспалительных стимулов и приводит к повышенной экспрессии провоспалительных цитокинов ТЫ и хемокинов (№)ί е! а1., 1999 г.). При алкогольных болезнях печени также повышались количества ΕΑδ-лиганда и его рецептора, что еще раз наводит на мысль о том, что цитокины Т111 вовлекаются в аутоиммунные процессы, индуцированные при алкогольном гепатите (Са11е е! а1., 1995 г.; Та1еЬ е! а1., 1998 г.; Йоге е! а1., 1999 г.).

ТЕРа также выявляется как обычный путь метаболизма при патогенезе некровоспаления печени, связанного с алкголем. Повышенные уровни ТХЕ в печени и сыворотке подтверждены на животных моделях алкогольной болезни печени и при алкогольной болезни печени у людей. Постулировано, что такой разрегулированный метаболизм ΊΝΕ играет роль при многих метаболических осложнениях и повреждении печении при алкогольной болезни печени (Сгоуе е! а1., 1997; МсС1ап аиб Сойеи, 1989). Например, при исследовании обнаружено, что у пациентов с алкогольным гепатитом более высокие уровни ТNЕα (в среднем 26,3 нг/л; 95% С1 - 21,7-30,9), чем у здоровых людей (6,4 нг/л; С1 - 5,4-7,4). У больных, умерших впоследствии, уровень ТNЕα более высокий (34,7 нг/л; С1 - 27,8-41,6), чем у оставшихся в живых (16,6 нг/л; С1 - 14,0-19,2). У пациентов с алкогольным гепатитом уровни ТNЕ-α положительно коррелируют с билирубином сыворотки (г = 0,74; Р = 0,0009) и креатинином сыворотки (г = 0,81; Р = 0,0003). У пациентов с алкогольным гепатитом уровни ТNЕ-α выше, чем у пациентов с неактивным алкогольным циррозом (11,1 нг/л; С1 - 8,9-13,3) и тяжелых алкоголиков без болезни печени (6,4 нг/л; С1 - 5,0-7,8). У пациентов с аномальной функцией почек уровни 'ТМЕ-а ниже (14,1 нг/л; С1 - 5,4-22,8), чем у пациентов с алкогольным гепатитом. Поэтому сделан вывод, что повышение уровня ТОТ-а при алкогольном гепатите наиболее заметно в тяжелых случаях, что наводит на мысль о том, что ТЫЕ-а играет некую роль при патогенезе (Виб е! а1., 1990 г.).

ТЫЕ опосредует многие биологические действия эндотоксина. Недавно проведенные исследования показали, что введение ТЛЕ может вызвать повреждение печени и что ТЫЕ может опосредовать летальность гепатотоксина галактозамина. Одним из наиболее сильных индукторов 'ТЫЕ является эндотоксин. Поскольку у пациентов с алкогольной болезнью печени часто имеется эндотоксемия и поскольку многие клинические проявления алкогольного гепатита являются известными биологическими эффектами ТКЕ, оценивали его активность у пациентов с алкогольным гепатитом. Базальное и стимулированное липополисахаридами высвобождение ТNЕ из моноцитов периферической крови - главного источника продуцирования ТNЕ - определяли у 16 пациентов с алкогольным гепатитом и 16 здоровых добровольцев. У восьми из 16 пациентов с алкогольным гепатитом и только у двоих из 16 здоровых добровольцев имелась обнаруживаемая спонтанная ТNЕ-активность (р менее 0,05). После стимуляции липополисахаридами средний уровень высвобождения ТNЕ из моноцитов у пациентов с алкогольным гепатитом существенно, более чем в два раза, превышал уровень высвобождения ТNЕ у здоровых людей (25,3±3,7 против 10,9±2,4 единиц на мл, р менее 0,005). Поэтому сделан вывод, что моноциты пациентов с алкогольным

- 4 005583 гепатитом имеют существенно повышенное спонтанное и стимулированное липополисахаридами высвобождение ΤΝΓ по сравнению со здоровыми добровольцами (МсС1аш аиб СоНсп. 1989 г.).

Липополисахарид (ЬР8)-связывающий белок (ЬВР) и СЭ14 играют ключевые посреднические роли в активации клеток эндотоксином. Постулировано, что ЬР8, образовавшийся в кишечнике, принимает участие в промотировании патологического повреждения печени при алкогольной болезни печени. Показано, что у крыс, которым давали внутрижелудочно этанол в масле в течение 4 недель, повышались уровни СО 14 и ЬВР в Купферовских клетках и гепатоцитах, соответственно. Экспрессия мРНК СЭ14 также может повыситься в немиелоидных клетках. Усиленная экспрессия ЬВР и СЭ14 способствует быстрому повышению ЬР8-индуцированной экспрессии различных провоспалительных цитокинов и коррелирует с наличием патологического повреждения печени при алкогольном повреждении печени (8и е! а1., 1998; Ьиккап е! а1., 1999 г.).

Артрит является заболеванием, заключающимся в воспалении суставов. Суставы опухают, теряют подвижность, становятся болезненными, краснеют или горят. Симптомы могут сопровождаться потерей веса, лихорадкой или слабостью. Когда указанные симптомы продолжаются более двух недель, это может означать воспалительный артрит, например ревматоидный артрит. Самым обычным типом артрита является дегенеративная болезнь суставов (остеоартрит).

Лекарственные средства, обычно назначаемые в случае артрита, относятся к нестероидным противовоспалительным средствам (Ν8ΑΙΌ). К Ν8ΑΙΌ относятся аспирин и подобные аспирину лекарственные средства. Они уменьшают воспаление, являющееся причиной боли в суставах, неподвижности и опухания суставов. Однако Ν8ΑΙΌ являются неспецифическими лекарственными средствами с рядом побочных действий, включая желудочное кровотечение (Нотераде оГ !Не Эераг1атеп1 оГ Оййораеб1с5 оГ !Не Ишуегкйу оГ Аа§Ыпд!оп оп ΑτίΗπίίκ, Ртебепск Макеп (Сйайтаап), \\л\л\\ог11юрл\'ак1ппд1оп.еби.). Кроме Ν8ΑΙΌ, для ослабления признаков и симптомов остеоартрита и ревматоидного артрита у взрослых применяют целебрекс™ - ингибитор циклооксигеназы (СОХ-2). Он также показан для лечения больных с семейным аденомным полипозом.

В АО 01/00229 описывается комбинация антагонистов фактора некроза опухолей (ΤΝΡ) и ингибиторов СОХ-2 для лечения воспаления.

Антагонисты ΤΝΡ также применяются для лечения артрита. Антагонисты ΤΝΡ описываются, например, в АО 9103553.

Недавние исследования показали, что интерлейкин 1Ь-18 играет роль провоспалительного фактора при метаболизме в суставах. О1ее е! а1. (1999) показали, что 1Ь-18 продуцируется суставными хондроцитами и индуцирует провоспаление и катаболические реакции. В хонодроцитах мРНК 1Ь-18 индуцируется Ι1-1β. Хондроциты продуцируют предшественник 1Ь-18 и в ответ на стимуляцию 1Ь-1 секретируют зрелую форму ГЛ-18. Исследование действия ΙΓ-1 на хондроциты также показало, что он ингибирует ΤΟΓ-βиндуцируемую пролиферацию и усиливает продуцирование окиси азота. СЛ-18 стимулирует экспрессию некоторых генов в суставных хондроцитах здоровых людей, включая индуцируемую синтазу окиси азота, индуцируемую циклооксигеназу, Ш-б и стромелизин. Экспрессия гена связана с синтезом соответствующих белков. Обработка суставного хряща здорового человека СЛ-18 повышала высвобождение гликозаминогликанов. Указанные результаты идентифицируют СЛ-18 как цитокин, регулирующий реакции хондроцитов и вносящий вклад в деградацию хрящей.

Локализация интерлейкин-1в-конвертирующего фермента (ΙΟΕ)/ каспазы-1 в остеоартритных тканях человека и его роль в созревании интерлейкина-1-бета и интерлейкина-18 показаны 8аНа е! а1. (1999 г.). 8аНа е! а1. исследовали экспрессию и продуцирование каспазы-1 в хряще и синовии здорового человека и в случае остеоартрита (ОА) количественно определяли уровень ΙΟΕ в ОА-хондроцитах и проверяли соотношение между топографическим распределением ΙΟΕ, интерлейкина-1 β (СЛ-1 β) и СЛ-18, а также апоптоз хондроцитов. Эксперименты, проведенные при данном исследовании, показали, что ΙΟΕ экспрессировался и синтезировался как в синовиальной мембране, так и в хряще человека, причем значительно большее число клеток окрашивалоь в ОА-положительной ткани, чем в здоровой ткани. Продуцирование ΙΟΕ локализовано преимущественно во внешних и верхних промежуточных слоях суставного хряща. Продуцирование зрелого ΙΓ-1-бета в ОА-хрящевых эксплантатах и хондроцитах полностью блокировалось путем обработки специфическим ингибитором ΙΟΕ, который также заметно уменьшает число ΙΓ-18-положительных клеток. Соотношение между активным ΙΓ-1-бета и ΙΟΕ наводит на мысль, что ΙΟΕ может промотировать развитие ОА путем активации данного провоспалительного цитокина и что СЛ-18 может играть некую роль в патологии хряща.

Отас1е е! а1. (1999 г.) предположили для СЛ-18 роль провоспалительного фактора при ревматоидном артрите. Отас1е е! а1. обнаружили мРНК СЛ-18 и белок в синовиальных тканях при ревматоидном артрите в существенно большем количестве, чем при остеоартрите (контроль). Также показано, что сочетание ΙΓ12 или ТЛ-15 с ТЛ-18 вызывает продукцию ΙΓΝ-γ синовиальными тканями ίη νίίΐΌ. Кроме того, введение ТЛ-18 мышам, иммунизированным коллагеном/неполным адъювантом Фрейнда, облегчает развитие эрозивного воспалительного артрита, что наводит на мысль, что ТЛ-18 может являться провоспалительным фактором ίη у1уо.

- 5 005583

Однако на сегодняшний день показано, что, кроме химических соединений, только блокада ΤΝΕα и Ш-1 β путем использования рецепторов или мононуклеарных антител ослабляет коллагениндуцированный артрит у мышей (С1А, является мышиной моделью ревматоидного артрита) (^1Шаш8 с1 а1., 1994 г.) и поэтому предлагается в качестве лечения ревматоидного артрита.

Термин хронические или идиопатические воспалительные заболевания кишечника охватывает по меньшей мере два состояния: болезнь Крона и неспецифический язвенный колит. Оба заболевания являются болезнями кишечного тракта, причем болезнь Крона обычно поражает тонкую кишку. Когда в патологический процесс вовлекается также и ободочная кишка, дифференциальная диагностика, отличающая это заболевание от неспецифического язвенного колита, может быть проблематичной.

Хроническое воспаление и изъязвление при болезни Крона обычно начинается или с обструкции тонкой кишки, или с боли в брюшной полости, напоминающей острый аппендицит; другие описания могут относится к ее осложнениям. Ход болезни хронический, и могут быть обострения и ремиссии, несмотря на лечение. Начало, как правило, имеет место в ранней молодости, причем примерно половина всех случаев относится к возрасту 20-30 лет и 90% - к 10-40 годам. Поражается несколько больше мужчин, чем женщин.

Микроскопия отражает массивные явления. Воспаление является прерывистым: оно очаговое или пятнообразное. Скопления лимфоцитов и клеток плазмы обнаруживаются, главным образом, в слизистой оболочке и слое ткани под слизистой оболочкой, но, как правило, поражаются все слои (трансмуральное воспаление). Классической микроскопической особенностью болезни Крона является наличие тучных клеток, окруженных скоплением лимфоцитов. Возникновение идиопатических воспалительных заболеваний кишечника имеет существенные географические различия. Указанные болезни чаще случаются в Северной Европе и Соединенных Штатах, чем в странах Южной Европы, Африки, Южной Америки и Азии, хотя повышение урбанизации и экономического процветания ведет к более частым случаям в областях Южной Европы и Японии (Оепега1 аиб ЗухЮтабс Ра11ю1оду. СйигсйШ ЬМидДоие, 3^гб ебйюп 2000, Ι0Έ Иибегоооб, Еб.).

При болезни Крона клинически имеются две основные группы, причем первая включает пациентов, болезнь которых входит в длительную ремиссию в течение трех лет с начала заболевания, а вторая включает пациентов, болеющих более трех лет.

Какая бы ни была этиология, имеется доказательство персистентности и несоответствия активации Т-клеток и макрофагов при болезни Крона с повышенным продуцированием провоспалительных цитокинов, в частности интерлейкинов (1Ь) 1, 2, 6 и 8, интерферона (ΙΕΝ)-γ и фактора некроза опухоли (ΤΝΕ)α. Болезнь Крона характеризуется длительным (хроническим) воспалением, сопровождающимся фиброзом. Процесс пролиферации фибробластов и осаждения коллагена может быть опосредован переносом фактора роста β, обладающего некоторым противовоспалительным действием, а именно рекрутментом фибробластов, синтезом матрицы и дезактивацией клеток зоны воспаления, но также вероятно, что могут вовлекаться многие другие медиаторы.

Неспецифический язвенный колит является неспецифическим воспалительным расстройством в толстой кишке, которое начинается в прямой кишке и немедленно распространяется в различной степени. В отличие от болезни Крона, неспецифический язвенный колит ограничивается толстой кишкой.

Все больше становится свидетельств, указывающих на то, что неспецифический язвенный колит является следствием изменения аутоиммунной реактивности, но повреждение слизистой оболочки также может быть результатом несоответствующей Т-клеточной активации и косвенного повреждения, вызванного цитокинами, протеазами и метаболитами и реактивным кислородом макрофагов и нейтрофилов. Последний механизм повреждения эпителия ободочной кишки назван повреждением с безвредным свидетелем. Доказательством поддержки аутоиммунитета является наличие аутореактивных Тлимфоцитов и аутоантител против эпителиальных клеток ободочной кишки и эндотелиальных клеток, и цитоплазматических аутоантител против нейтрофилов (АNСА). Однако неспецифический язвенный колит не должен рассматриваться как аутоиммунное заболевание, при котором повреждение слизистой оболочки является прямым следствием иммунной реакции на аутоантигены (Оеиега1 аиб 8ух1ета11С Ра1йо1оду, цит. выше).

Что касается лечения болезни Крона, то большинство людей лечат сначала лекарственными средствами, содержащими мезаламин, вещество, способствующее борьбе с воспалением. Больные, которым он не помогает или которые его не переносят, могут получать другие мезаламинсодержащие лекарственные средства, как правило, известные как 5-А8А. К возможным побочным действиям препаратов мезаламина относятся тошнота, рвота, изжога, диарея и головная боль.

Некоторые пациенты для борьбы с воспалением принимают кортикостероидные препараты. Такие лекарственные средства наиболее эффективны в случае активной болезни Крона, но они могут вызвать сильное побочное действие, включая повышенную восприимчивость к инфекции.

Лекарственные средства, подавляющие иммунную систему, также применяют для лечения болезни Крона. Чаще всего выписывают 6-меркаптопурин и родственное лекарственное средство азатиоприн. Иммунодепрессивные средства действуют путем блокирования иммунной реакции, вносящей вклад в

- 6 005583 воспаление. Такие лекарственные средства могут вызвать побочное действие, подобное тошноте, рвоте и диарее, и могут снизить сопротивление человека инфекции. Когда пациентов лечат сочетанием кортикостероидных и иммунодепрессивных лекарственных средств, доза кортикостероидов, в конечном счете, может быть снижена. Некоторые исследователи полагают, что иммунодепрессивные лекарственные средства могут усилить эффективность кортикостероидов.

Управление США по пищевым продуктам и лекарственным средствам одобрило лекарственное средство инфликсимаб для лечения умеренной и тяжелой форм болезни Крона, не реагирующей на стандартную терапию (мезаламины, кортикостероиды, иммунодепрессивные средства), и для лечения открытых дренирующих свищей. Инфликсимаб - первое лекарственное средство, одобренное специально для болезни Крона, представляет собой моноклональные антитела против фактора некроза опухоли (ΤΝΡ). Анти-ΤΝΡ удаляют ΤΝΡ из кровотока до того, как он достигнет кишечника, посредством чего предупреждается воспаление.

Антибиотики применяют для лечения чрезмерного развития микрофлоры в тонкой кишке, вызванного стенозом, свищами или проведенной ранее операцией. В случае такой обычной проблемы врач может назначить один или несколько из следующих антибиотиков: ампициллин, сульфонамид, цефалоспорин, тетрациклин или метронидазол.

Диарея и судорожная боль в брюшной полости часто облегчаются, когда утихает воспаление, но также может потребоваться дополнительная лекарственная терапия. Можно использовать некоторые противодиарейные средства, включая дифеноксилат, лоперамид и кодеин. Пациентов, обезвоженных изза диареи, обычно лечат жидкостями и электролитами.

Остается потребность в эффективной терапии для лечения и/или предупреждения воспалительных заболеваний кишечника, в частности болезни Крона и неспецифического язвенного колита, с пониженным побочным действием или, в идеале, даже без побочного действия.

Как гистологические, так и иммунологические наблюдения показывают, что клеточноопосредованный иммунитет и Т-клеточная активация являются ключевыми особенностями СБ. Исследования на человеке и на экспериментальных моделях наводят на мысль, что при СБ локальная иммунная реакция имеет тенденцию развиваться преимущественно по типу Τ111 (Бектеитаих е! а1., 1997 г.) и что локально высвобождаемые цитокины, такие как ΙΡΝ-γ, ΙΠ-Ιβ и ΤΝΡ-α, вносят вклад в промотирование и распространение воспалительной реакции (Кштипб е! а1., 1996 г.).

Цитокин Ш-18 играет важную роль в ΤΜ-опосредуемой иммунной реакции совместно с цитокином Ш-12 путем стимуляции секретирования ΙΡΝ-γ, усиления цитотоксичности природных киллерных клеток и стимуляции дфференцировки клеток ТН1 (ИкейИо е! а1., 1996).

Ш-18 действует вместе с Ш-12, Ш-2, антигенами, митогенами и также, возможно, другими факторами для индукции продуцирования ΙΡΝ-γ. Ш-18 также усиливает продуцирование СМ-С8Р и Ш-2, усиливает пролиферацию Т-клеток, индуцируемую анти-СБ-3, и усиливает Рак-опосредованный киллинг природных киллерных клеток. Зрелый Ш-18 продуцируется из своего предшественника ΙΠ-1βконвертирующим ферментом ЦСЕ, каспаза-1). Рецептор ΙΠ-18 состоит по меньшей мере из двух компонентов, совместно действующих при связывании лиганда. Высоко- и низкоаффинные сайты связывания ΙΠ-18 обнаружены в Т-клетках, стимулированных мышиным Ш-12 (Окатойэ е! а1., 1998 г.), что наводит на мысль о многоцепном рецепторном комплексе. Пока идентифицированы две рецепторные субъединицы, причем обе принадлежат семейству рецепторов Ш-1 (Окато!о е! а1., 1999 г.). Сигнальная трансдукция Ш-18 участвует в активации ΝΡ-κΒ (Ма!§ито!о е! а1., 1997 г.).

Недавно сделано предположение, что Ш-18 принимает некоторое участие в воспалительных заболеваниях кишечника (Ρί/агго е! а1., 1999; Моп!е1еопе е! а1., 1999 г.).

Ρί/агго е! а1. (1999 г.) охарактеризовали экспрессию и локализацию ΙΠ-18 в образцах ободочной кишки и выделили популяции слизистых клеток у пациентов с болезнью Крона. С использованием схемы полуколичественной ОТ-ПЦР обнаружено, что количество транскриптов мРНК Ш-18 в свежевыделенных интестинальных эпителиальных клетках и мононуклеарных клетках собственной пластинки пациентов при СБ возрастает при сравнени с пациентами с неспецифическим язвенным колитом и контролем без воспаления. Транскриптов мРНК Ш-18 было больше в интестинальных эпителиальных клетках по сравнению с мононуклеарными клетками собственной пластинки.

Иммуногистохимический анализ иссеченных тканей ободочной кишки обнаружил локализацию Ш18 как в мононуклеарных клетках собственной пластинки (в частности, макрофагах и дендритных клетках), так и в интестинальных эпителиальных клетках. Вестерн-блоттинг показал, что полоса 18,3 кДа, соответствующая как рекомбинатному, так и зрелому белку Ш-18, при биопсии слизистой облочки кишечника обнаруживается преимущественно при СБ по сравнению с ИС; другая полоса 24 кДа, соответствующая неактивному предшественнику ΙΠ-18, определяется при биопсии невоспаленных областей как при СБ, так и при ИС, и является единственной формой, обнаруженной в контроле без воспаления.

Моп!е1еопе е! а1. (1999 г.) подтвердили указанные результаты. Цельную ткань слизистой оболочки кишечника и мононуклеарные клетки собственной пластинки 12 пациентов с болезнью Крона, 9 с неспецифическим язвенным колитом и 15 человек (контроль) без воспалительного заболевания кишечника

- 7 005583 испытывали на ГБ-18 методом полуколичественной ОТ-ПЦР и вестерн-блоттинга. В испытанных образцах обнаружены транскрипты ГБ-18. Однако повышенное накопление мРНК ГБ-18 обнаружено в образцах как слизистой оболочки, так и мононуклеарных клеток собственной пластинки при болезни Крона, при сравнении с неспецифическим язвенным колитом и контролем. При болезни Крона больше транскриптов ГБ-18 накапливалось в образцах слизистой оболочки, взятых из пораженных участков. Полоса 18 кДа, соответствующая зрелому ГБ-18, преимущественно обнаруживалась в образцах слизистой оболочки при болезни Крона. В образцах слизистой оболочки контроля без ГВО ΣΕ-18 присутствовал как полипептид в 24 кДа. Сообразно, активная субъединица (р20) ГБ-1-бета-конвертирующего фермента (1СЕ) экспрессировалась в образцах или при СО или при ИС, в то время как в слизистой оболочке ободочной кишки контроля без ГВО 1СЕ синтезировался только в виде предшественника (р45).

Оаует (1999 г.) рассматривал различные и частично противоречивые функции ГБ-18. В итоге, ГБ-18 представляет собой плейотропный интерлейкин, имеющий функции как усиления, так и ослабления воспаления. С одной стороны, он усиливает продуцирование провоспалительных цитокинов, подобных ΤΝΡ-α, следовательно промотирует воспаление. С другой стороны, он индуцирует продуцирование ΝΟингибитора каспазы-1, таким образом блокируя созревание ГБ-1 β и ГБ-18 и, возможно, ослабляя воспаление. Такая неопределенная роль ГБ-18 ставит под сомнение эффективность ингибиторов ГБ-18 при воспалительных заболеваниях. Кроме того, из-за взаимодействия великого множества различных цитокинов и хемокинов при регуляции воспаления благоприятное действие при лечении или предупреждении воспалительных заболеваний путем блокирования только одного из участников непредсказуемо.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение основано на выводе, что ингибиторы ГБ-18 эффективны для лечения и/или предупреждения различных заболеваний и расстройств.

Первой целью настоящего изобретения является новое средство для лечения и/или предупреждения повреждения печени. Поэтому изобретение относится к применению ингибитора ГБ-18 для производства лекарственного средства для лечения и/или предупреждения поврежденя печени в острой или хронической стадии. Конкретнее, изобретение относится к лечению и/или предупреждению алкогольного гепатита, иммунного гепатита, молниеносного гепатита, цирроза печени и первичного билиарного цирроза.

Второй целью настоящего изобретения является новое средство для лечения и/или предупреждения артрита. Поэтому изобретение также относится к применению ингибиторов ГБ-18 для получения лекарственного средства для лечения и/или предупреждения артрита. Благоприятное действие ингибиторов ГБ-18 включает в себя снижение тяжести болезни, а также предупреждение распространения болезни. Эти результаты являются неожиданными, так как из состояния техники, описанного выше, нельзя сделать вывод, что блокада одного специфического фактора, участвующего в артрите, а именно интерлейкина ГБ-18, может привести к облегчению при артрите или даже к лечению пораженного артритом сустава.

На мышиной модели также обнаружено, что введение ингибитора ГБ-18 существенно уменьшает эрозию хряща. Таким образом, настоящее изобретение также относится к применению ингибитора ГБ-18 при изготовлении лекарственного средства для лечения и/или предупреждения разрушения хряща.

Третьей целью настоящего изобретения является новое средство для лечения и/или предупреждения воспалительного заболевания кишечника (ГВО), в частности болезни Крона и неспецифического язвенного колита. Поэтому изобретение также относится к применению ингибитора ГБ-18 для изготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения ГВО. Согласно настоящему изобретению теперь обнаружено, что в биоптатах пациентов с болезнью Крона в зонах воспаления слизистой оболочки повышаются концентрации мРНК ГБ-18ВР и белка. Кроме того, на мышиной модели воспалительного заболевания кишечника показано, что два различных ингибитора ГБ-18 защищают животных от заболевания.

Применение сочетаний ингибитора ГБ-18, и/или интерферона, и/или антагониста ΤΝΡ, и/или ингибитора СОХ-2 также рассматриваются согласно изобретению. Для того чтобы применить геннотерапевтические подходы к доставке ингибитора ГБ-18 в больные ткани или клетки, другие аспекты изобретения относятся к применению экспрессирующих векторов, содержащих кодирующую последовательность ингибитора ГБ-18, для лечения и/или предупреждения болезненных состояний. Изобретение также относится к применению активации эндогенного гена ингибиторов ГБ-18 и к применению созданных методами генной инженерии клеток для экспрессии ингибиторов ГБ-18 для предупреждения и/или лечения повреждения печени, артрита и ГВО.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлена гистограмма, отображающая уровень ГР№у в сыворотке (пг/мл) после инъекции различных количеств рекомбинантного ГБ18ВР (0; 0,04; 0,4; 4 мг/кг) мышам за 1 ч до инъекции БРЗ. Образцы крови берут через 5 ч после инъекции БР8 и методом ЕБГ8А анализируют наличие в них циркулирующего ГЕ№у.

На фиг. 2 представлена гистограмма, отображающая уровень аланинаминотрансферазы (АБТ) в сыворотке. Мышам делают инъекции возрастающих доз рекомбинантного ГБ18ВР человека (0; 0,04; 0,4; 4

- 8 005583 мг/кг) перед инъекцией БР8 мышам, сенсибилизированным Р. аеиек. Образцы крови берут через 5 ч после инъекции БР8 и измеряют содержание АБТ в сыворотке. 8Ε = сигма Френкеля: 1 единица 8Ε А8Т/АБТ будет образовывать 4,82 х 10^-4 мкмоль глутамина в минуту при рН 7,5 при 25°С.

На фиг. 3 показано время выживания мышей после инъекции БР8. Мышам делают инъекции разных доз рекомбинантного 1Ь18ВР человека (0; 0,04; 0,4; 4 мг/кг) за 20 мин до инъекции БР8 мышам, сенсибилизированным Р. аеиек. Треугольники - 4 мг/кг; маленькие ромбы - 0,4; большие ромбы - 0,04; кружочки - 1Ь18ВР отсутствует (только БР8).

На фиг. 4 представлена гистограмма, отображающая уровень ΙΕΝ-γ в сыворотке, измеренный через 5 ч после инъекции различных количеств 1Ь18ВР (0; 0,4; 4 мг/кг), который вводят за 20 мин до инъекции БР8 мышам, сенсибилизированным Р. аеиек.

На фиг. 5 показана выживаемость мышей, инъецированных или поликлональной антисывороткой против ΙΠ-18 или обычной кроличьей сывороткой (ΝΏ8 = контроль) за 30 мин до инъекции 40 мг/мл (летальная доза) БР8, полученного из Е. сой (фиг. 5А) или 8. Ιΐινρΐιίιηιιπιιιη (фиг. 5В). Треугольники: мышей инъецируют антисывороткой против ΙΠ-18; кружочки: мышей инъецируют ΝΏ8. По оси X отмечены дни после заражения ЬР8. *р<0,05.

На фиг. 6 представлена гистограмма, отображающая среднее + 8ЕМ (среднеквадратичная ошибка) для группы из пяти мышей, обработанных следующим способом. Мышам инъецируют интраперитонеально (ί.ρ.) антисыворотку против 1Б-18, растворимые рецепторы ΤΝΕ-α (ΤΝΕκΒρ55) или носитель (физиологический раствор) сразу же после внутривенного (ί.ν.) введения конканавалина А (Соп А; фиг. 6А) или РЕА (Ркеибошопак аетидшока, фиг. бВ). **р<0,01; ***р<0,001 против одного только СопА или РЕА; # р<0,01 против или ΤΝΕκΒρ55 или анти-Ь-18, факториальный ΑΝΟνΑ.

На фиг. 7 показано действие 1Б-18ВР на клинические показатели на мышиной модели артрита. Фиг. 7А представляет собой диаграмму, отборажающую клинические показатели, измеренные после ежедневного ί.ρ. (интраперитонеального) введения мышам различных количеств или 1Б-18ВР. или ΙΕΝ-β, или носителя (№1С1). Обозначения: заштрихованные треугольники - 10000 МЕ ΙΕΝ-β; незаштрихованные треугольники - 10 мг/кг ГЕ-18ВР; перевернутые треугольники - 3 мг/кг ГЕ-18ВР; ромбы - 1 мг/кг ГЕ-18ВР; кружочки - 0,5 мг/кг ГЕ-18ВР; незаштрихованные квадраты - 0,25 мг/кг ГЕ-18ВР; и заштрихованные квадраты - №С1. Дни обработки откладывают по оси X, клинические показатели (средние значения) откладывают по оси Υ. Статистические показатели вычисляют с помощью критерия Манна-Уитни. На фиг. 7 представлена гистограмма, отображающая АИС (площадь под кривой), полученную из графика на фиг. 7А. п = число животных.

На фиг. 8 показано действие ГЕ-18ВР на опухание лап. На фиг. 8 А представлена диаграмма, отображающая результаты, полученные при измерении толщины больных задних лап (опухание) у отдельных животных, обработанных различными количествами ГЕ-18ВР. По оси X откладывают изменение толщины лап в мм от начала обработки. Обозначения те же, что на фиг. 7. Фиг. 8В представляет собой гистограмму, отображающую АИС, полученные с фиг. 8А. п = число животных.

На фиг. 9 показан анализ числа больных задних лап со временем при остром артрите, т.е. распространение заболевания в другие суставы. Обозначения: заштрихованные квадраты - №1С1 (контроль); треугольники - 10 мг/кг ГЕ-18ВР; перевернутые треугольники - 3 мг/кг ГЕ-18ВР; ромбы - 1 мг/кг ГЕ-18ВР; кружочки - 0,5 мг/кг ГЕ-18ВР; и незаштрихованные квадраты - 0,25 мг/кг ГЕ-18ВР.

На фиг. 10 представлена гистограмма, отражающая показатели эрозии хряща больных суставов.

На фиг. 11 показана гистопатология мышиных суставов. По окончании эксперимента лапу, где артрит развивался в первую очередь, отсекают, фиксируют и обрабатывают, как описано ниже в примере 10. Фиг. 11А - здоровый сустав мыши; фиг. 11В - сустав мыши, больной артритом; фиг. 11С - сустав мыши, обработанной тЫЬ-18ВР.

На фиг. 12 представлена гистограмма, отображающая уровни антител против коллагена типа ΙΙ изотипа ΙβΟ1 (незаштрихованные столбцы) или Ι§Ο2η (заштрихованные столбцы) у мышей, обработанных 3 мг/кг ГЕ-18ВР или физиологическим раствором (носителем), соответственно. Измерения проводили на 4 день (Ό4) или на 8 день (Ό8) заболевания.

На фиг. 13 представлена гистограмма, отображающая уровни ГБ-б, в пг/мл, у животных, обработанных 1, 3 или 10 мг/кг ΙΗ-18ВР, 10000 МЕ интерферона β (ΙΕΝ-β), нормальной мышиной сывороткой (ΝΜ8) или физиологическим раствором (№1С1), соответственно.

На фиг. 14 показана экспрессия ЫБ-18ВР и транскриптов мРНК ББ-18 в интестинальных биоптатах пациентов, страдающих активной болезнью Крона, неспецифическим язвенным колитом или здоровых индивидуумов. Видны характерные продукты ОТ-ПЦР ББ-18ВР, ББ-18 и обязательного гена (β-актина) (фиг. 14А). Относительную количественную оценку окрашенных этидийбромидом полос осуществляют с использованием программного обеспечения для анализа изображений Кобак Οίβίΐηΐ и приводят как отношение гена-мишени к β-актину. Геном-мишенью является ΙΠ-18 на фиг. 14В и Ш-кЕР на фиг. 14С.

На фиг. 15 показана экспрессия транскриптов мРНК ЫБ-18ВР и белка ΗυVЕС (эндотелиальные клетки пупочной вены человека) и экспрессия белка ТНР1 (клеточная линия моноцитов человека). РНК выделяют из необработанных эндотелиальных клеток (среда) и эндотелиальных клеток, стимулирован

- 9 005583 ных !И-1 β, ΤΝΡα, ΙΡΝγ. Положительный контроль: ободочная кишка пациента с болезнью Крона; отрицательный контроль: без кДНК. Экспрессию 1Ь-18ВР и 1Ь-18 анализируют методом полуколичественной ОТ-ПЦР (фиг. 15А). Культуральный супернатант необработанных (среда) клеток и клеток после 24часовой активации 1Ь-1 β, ΤΝΡα, ΙΡΝγ или НИУЕС (фиг. 15В), или ТНР1 (фиг. 15С) анализируют на продуцирование белка Ш-18ВР и [И-18 методом ЕЬ1§А.

На фиг. 16 показано изменение массы тела между 1 и 10 днями на мышиной модели ΙΒΌ после интраперитонеального (ίρ) введения либо физиологического раствора (ΝαΟΊ), либо 1Ь-18ВР (8 мг/кг). Изменение массы выражают в процентах изменения массы тела по сравнению с днем 1. Приводятся средние значения и 8ЕМ для двух групп по 8 мышей в группе.

На фиг. 17 показаны результаты анализов ободочных кишок, каудальных лимфоузлов и селезенок, полученных у мышей с ΙΒΌ, обработанных 1Ь-18ВР и необработанных. На фиг. 17А отображена масса, в мг, последних 6 см ободочной кишки. На фиг. 17В показано общее число клеток, присутствующих в каудальном лимфоузле.

Фиг. 17С отображает процентное содержание клеток в селезенке, окрашивающихся положительно на ΟΌ4'/ΟΌ69'. Данные представляют собой средние значения величин и 8ЕМ. Знак * показывает значимое различие.

На фиг. 18 показано количество ΙΡΝγ (фиг. 18, А и В) и ΤΝΡα (фиг. 18, С и Ό), продуцированных через 48 ч клетками каудального лимфоузла (фиг. 18, А и С) и клетками селезенки (фиг. 18, В и Ό) после стимуляции ΟΌ3/ΟΌ28, присутствующих в супернатанте. Приводятся средние значения и 8ЕМ.

На фиг. 19 показано содержание ΤΝΡα (фиг. 19А) и ΙΡΝγ (фиг. 19В) в гомогенатах из ободочной кишки. Данные исправлены на массу ободочной кишки. Приводятся средние значения и 8ЕМ. Знак * показывает значимое различие.

Описание изобретения

Настоящее изобретение основано на обнаружении благоприятного действия ингибитора ΙΕ-18 при различных заболеваниях и расстройствах.

Термин ингибитор в контексте данного изобретения относится к любой молекуле, модулирующей продуцирование и/или действие ΙΡ-18 таким образом, что продуцирование и/или действие ΙΕ-18 ослабевает, уменьшается или частично, существенно или полностью предотвращается или блокируется. Термин ингибитор предназначен для обозначения ингибиторов продуцирования ΙΕ-18, а также ингибиторов действия ΙΕ-18.

Ингибитор продуцирования может представлять собой любую молекулу, отрицательно влияющую на синтез, процессинг или созревание ΙΕ-18. Ингибиторы, рассматриваемые согласно изобретению, могут представлять собой, например, супрессоры экспрессии гена интерлейкина И-18, антисмысловые мРНК, снижающие или предупреждающие транскрипцию мРНК ΙΕ-18 или приводящие к деградации мРНК, белки, нарушающие правильную пространственную упаковку или частично, или существенно предотвращающие секрецию И-18, протеазы, разрушающие ΙΕ-18 сразу же после синтеза, ингибиторы протеаз, расщепляющих про-ГЕ-18 для генерации зрелого ΙΕ-18, такие как ингибиторы каспазы-1, и т.п.

Ингибитор действия ΙΕ-18 может представлять собой, например, антагонист ΙΕ-18. Антагонисты могут либо связываться с молекулой ΙΕ-18, либо изолировать саму молекулу с достаточной аффинностью и специфичностью для частичной или полной нейтрализации ΙΕ-18 или сайта(ов) связывания ΙΕ-18, ответственных за связывание ΙΕ-18 со своим лигандом (например, подобно его рецепторам). Антагонист также может ингибировать каскад передачи сигналов ΙΕ-18, который активируется в клетках после связывания ΙΕ-18 и рецептора.

Ингибитор действия ΙΕ-18 также может представлять собой растворимые рецепторы ΙΕ-18 или молекулы, напоминающие рецепторы, или агенты, блокирующие рецепторы ΙΕ-18, или антитела к ΙΕ-18, такие как поликлональные или моноклональные антитела, или любой другой агент или молекулу, предупреждающие связывание ΙΕ-18 со своими мишенями, причем таким образом уменьшается или предотвращается включение механизмов внутри- или внеклеточных реакций, опосредуемых ΙΕ-18.

Согласно первому аспекту настоящего изобретения ингибиоры ΙΕ-18 применяют для изготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения повреждения печени.

Предпочтительно, изобретение относится к применению ингибитора ΙΕ-18 для изготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения острых и хронических болезней печени и, предпочтительнее, алкогольного гепатита, вирусного гепатита, иммунного гепатита, молниеносного гепатита, цирроза печени и первичного билиарного цирроза.

Термин повреждение печени или болезнь печени, используемый в данном описании, включает в себя самые разные патологические состояния. Некоторые их таких состояний, рассматриваемых в настоящем изобретении, подробно объясняются выше в разделе Предпосылки создания изобретения. К другим болезням печени, которые можно лечить и/или предупреждать согласно изобретению, относится, например, пирогенный абсцесс печени. Он также называется бактериальной печенью и представляет собой полость в печени, продуцирующую гной. Причин абсцесса печени много. Он может развиться из абдоминальной инфекции, такой как аппендицит, дивертикулит или перфорированная кишка; инфекции

- 10 005583 в кровотоке; инфекции из билиарного (печеночный секрет) тракта или травмы, когда ушибленная печень становится инфицированной. Наиболее обычными микроорганизмами, вызывающими абсцесс печени, являются ЕкйепсЫа сой, Рто1еи8 уи1дап8 и Еи1егоЬас1ег аетодеиек. Частота заболевания составляет 1 случай на 10000 человек.

Алкогольные болезни печени можно лечить и/или предупреждать с использованием ингибиторов 1Б-18 согласно изобретению. К ним относятся острое и хроническое воспаление печени, вызванное злоупотреблением алкоголем. Алкогольный гепатит, как правило, имеет место после нескольких лет усиленного употребления алкоголя. Чем больше длительность применения алкоголя и больше потребление алкоголя, тем больше вероятность развития болезни печени. Недостаточность питания развивается как результат малой калорийности алкоголя, пониженного аппетита и малабсорбции (неадекватное поглощение питательных веществ из кишечного тракта). Недостаточность питания вносит вклад в болезнь печени. Токсичность этанола для печени, индивидуальная чувствительность к вызываемой алкоголем болезни печени и генетические факторы также вносят вклад в развитие алкогольной болезни печени.

Согласно данному изобретению с использованием ингибиторов 1Б-18 можно лечить и/или предупреждать цирроз печени. Цирроз является хронической болезнью печени, которая вызывает повреждение ткани печени, рубцевание печени (фиброз; нодулярная регенерация), прогрессивное снижение функции печени, образование избыточной жидкости в брюшной полости (асцит), кровотечения (коагулопатия), повышенное давление в кровеносных сосудах (портальная гипертензия) и расстройства функций головного мозга (печеночная энцефалопатия). Поврежденная и зарубцевавшаяся печень становится неспособной адекватно удалять продукты жизнедеятельности (токсины) из крови, а образование рубцовой ткани ведет к повышенному давлению (портальная гипертензия) в венах между кишечником и селезенкой и печенью.

Избыточное употребление алкоголя является ведущей причиной цирроза. К другим причинам относятся инфекционные болезни (такие как гепатит), болезни и дефекты желчной дренажной системы (такие как билиарные стеноз или обструкция), кистозный фиброз и повышенное поглощение железа и меди.

Тип цирроза зависит от причины заболевания. При циррозе могут быть тяжелые осложнения. В США цирроз является 9-й причиной смертности. Могут появиться неврологические проблемы (такие как печеночная энцефалопатия). Повышенное скопление жидкости в брюшной полости (асцит) вызывается пониженным содержанием белка в организме, повышенным содержанием натрия и повышенным давлением в кровеносных сосудах печени (портальная гипертензия). Портальная гипертензия может вызвать повышенное давление, увеличение и утолщение кровеносных сосудов в пищеводе (пищеводное раширение вен). Могут появиться проблемы кровотечения и коагуляции крови. Повышенное давление в кровеносных сосудах и проблемы коагуляции крови могут повысить возможность тяжелого и опасного для жизни кровоизлияния.

Другим расстройством, охватываемым термином повреждение печени согласно настоящему изобретению, является аутоиммунный гепатит. Он представляет собой воспаление печени, вызванное взаимодействием с иммунной системой. Аутоиммунный гепатит является типом хронического активного гепатита. В крови пациентов с хроническим активным гепатитом можно обнаружить различные циркулирующие антитела. Другие аутоиммунные болезни могут быть связаны с хроническим активным гепатитом или могут иметь место у родственников больных с хроническим активным гепатитом. Такими болезнями являются тиреоидит, сахарный диабет, неспецифический язвенный колит, СоошЬкположительная гемолитическая анемия, пролиферативный гломерулонефрит и синдром Шегрена. Факторы риска могут включать в себя указанные болезни, или факторы риска связаны с хроническим активным гепатитом. Частота заболевания - 4 случая на 10000 человек.

Билиарная атрезия является другим расстройством в сфере термина повреждение печени. Она представляет собой обструкцию желчных протоков, вызванную недостаточностью их развития, как правило, до рождения (в утробе). Билиарная атрезия вызывается аномальным и неадекватным развитием желчных протоков внутри и вне печени. Назначение билиарной системы - удаление продуктов жизнедеятельности из печени и вынос желчных солей, необходимых для переваривания жиров в тонкой кишке. При таком состоянии блокируется выделение желчи из печени в желчный пузырь. Это может привести к повреждению печени и циррозу печени, который, если его не лечить, в конечном счете смертелен.

Согласно изобретению ингибиторы 1Б-18 также применяют для изготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения хронического активного гепатита, также называемого хроническим агрессивным гепатитом. Он представляет собой длительное воспаление печени, повреждающее клетки печени. К причинам хронического активного гепатита относятся вирусная инфекция, реакция/поглощение лекарственного средства, метаболические нарушения или аутоиммунные болезни. Причина также может быть неявной. Болезнь характеризуется некрозом или гибелью клеток печени, активным воспалением и фиброзом, которые могут привести к печеночной недостаточности, циррозу и смерти. Частота заболевания - 1 случай на 10000 человек. Факторами риска являются аутоиммунные болезни, предшествующее - свыше 6 месяцев - заражение гепатитом С или положительная реакция на антиген гепатита А или гепатита В.

- 11 005583

Хронический персистирующий гепатит является умеренной непрогрессирующей формой воспаления печени и также представляет собой болезнь, согласно настоящему изобретению охватываемую термином повреждение печени.

Согласно изобретению ингибиторы 1Й-18 также применяют для изготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения первичного билиарного цирроза (ПБЦ). ПБЦ является воспалительным состоянием, являющимся результатом обструкции выделения желчи в печени, вызывающей повреждение клеток печени. Желчные протоки в печени воспаляются по неизвестной причине. Болезнь поражает наиболее часто женщин среднего возраста. Симптомы появляются постепенно, и первым симптомом является зуд кожи. Происходит воспаление желчных протоков в печени. В конце концов, развивается цирроз печени. Заболевание может ассоциироваться с аутоиммунными расстройствами. Частота заболевания - 8 случаев на 100000 человек. Ингибиторы 1Й-18, рассматриваемые в данном описании, также можно применять для лечения острого отравления печени, например, вызванного большим количеством парацетамола. Такое острое отравление печени может произойти из-за передозировки парацетамола, случайной или преднамеренной.

Как показано ниже в примерах, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что ингибиторы 1Й-18 особенно эффективны при предупреждении и лечении молниеносного гепатита (острый гепатит). Поэтому изобретение предпочтительно относится к предупреждению и/или лечению молниеносного гепатита.

Согласно второму аспекту настоящего изобретения, ингибиторы 1Й-18 применяют для изготовления лечебного стредства для лечения и/или предупреждения артрита.

Термин артрит, используемый в данном описании, включает в себя все различные типы артрита и артритных состояний, как острый, так и хронический артрит, как указано, например, в Нотераде о£ 1Ис Эераг1теп1 о£ ОййораеФез о£ 1Ие Ищуегайу о£ ХУазЫпдЮп оп Аййгйщ (\у\у\у.ог11юрлуа51ипд1оп.еби). Примерами артритных состояний являются анкилозирующий спондилит, боль в спине, синдром запястных отложений, синдром Элерса-Данлоса, подагра, ювенильный артрит, красная волчанка, миозит, несовершенный остеогенез, остеопороз, полиартрит, полимиозит, псориатический артрит, синдром Рейтера, склеродерма, артрит с болезнью кишечника, болезнь Бехчета, детский артрит, дегенеративная болезнь суставов, фибромиалгия, инфекционный артрит, болезнь Лайма, синдром Марфана, остеоартрит, остеонекроз, болезнь Педжета, ревматоидная полимиалгия, псевдоподагра, рефлекторная симпатическая дистрофия, ревматоидный артрит, ревматизм, синдром Шегрена, семейный аденомный полипоз и т.п.

Предпочтительно согласно изобретению ингибиторы 1Й-18 предлагаются для лечения и/или предупреждения воспалительного артрита. Воспалительный артрит классифицируется как хронический артрит в соответствии с упорным, длительным или возвратным течением болезни.

В предпочтительном варианте воплощения изобретения воспалительный артрит представляет собой ревматоидный артрит (ВЛ). ВЛ вызывает воспаление в выстилке суставов (синовиальная мембрана, эпителий с одним слоем клеток) и/или внутренних органов. Болезнь имеет тенденцию удерживаться многие годы, как правило, поражает многие разные суставы тела и, в конце концов, может вызвать повреждение хряща, кости, сухожилий и связок. Суставы, которые могут поражаться ВА, являются суставами, расположенными, например, в шее, плечах, локтях, бедрах, запястьях, кистях рук, коленях и стопах. Во многих случаях суставы воспаляются при ВА симметрично.

ВА распространен примерно среди 1% населения в Соединенных Штатах, причем распределяется в пределах всех этнических групп и возрастов. Он встречается во всем мире, и число женщин и мужчин с ВА соотносится как 3 к 1.

Как показано ниже в примерах, доказано, что ингибитор 1Й-18 обнаруживает весьма эффективное благоприятное действие на эрозию хряща. Поэтому изобретение также относится к применению ингибитора 1Й-18 при изготовлении лекарственного средства для лечения и/или предупреждения разрушения хряща, т.е. к применению ингибитора 1Й-18 в качестве хондрозащитного средства. Ингибитор 1Ь-18 можно применять при любом состоянии, при котором происходит разрушение или эрозия хряща. Разрушение хряща является прогрессирующим ухудшением структурной целостности суставного хряща. Оно происходит, например, при состояниях, поражающих суставной хрящ, таких как ревматоидный артрит, ювенильный артрит или остеоартрит, но также, например, при инфекционном синовите.

Третий аспект настоящего изобретения относится к применению ингибитора 1Й-18 для изготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения воспалительного заболевания кишечника. Такое применение основано на выводе, что ингибитор 1Й-18 активируется в воспаленной слизистой оболочке у пациентов с СИ. Оно также основывается на выводе, что введение различных ингибиторов 1Й-18 имеет защитное действие на мышиной модели колита.

Активация 1Й-18 в больной слизистой оболочке у пациентов с СИ уже описана в технике (Моп1е1еопе е! а1., 1999; Ρίζ/аго е! а1., 1999 г.).

После того как показано присутствие больших количеств 1Й-18ВР в воспаленных участках слизистой оболочки кишечника согласно изобретению, стало даже более неожиданным обнаружение явного благоприятного действия 1Й-18ВР, введенного системно, на развитие и симптомы колита на животной модели. Хотя 1Й-18ВР уже активируется эндогенно в кишке пациентов с СИ, как показано ниже в приме

- 12 005583 рах, количество 1Ь-18ВР в организме, способного к продуцированию, как оказывается, недостаточно для борьбы с заболеванием.

Согласно изобретению воспалительным заболеванием кишечника предпочтительно является болезнь Крона или неспецифический язвенный колит.

В предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения ингибитор ΣΗ-18 выбирают среди ингибиторов каспазы-1 (1СЕ), антител, направленных против 1Ь-18, антител, направленных против любой из субъединиц рецептора 1Ь-18, ингибиторов сигнального каскада 1Ь-18, антагонистов 1Ь-18, конкурирующих с ΣΗ-18 и блокирующих рецептор ΣΗ-18, и 1Ь-18-связывающих белков, изоформ, мутеинов, слитых белков, функциональных производных, активных фракций или их производных с циклической перестановкой, обладающих такой же активностью.

Термин 'ТЬ-18-связывающие белки используется в данном описании как синоним 1Ь-18ВР. Он охватывает ΣΕ-18-связывающие белки по определению, данному в \УО 99/09063 или в ΝονίοΚ с1 а1., 1999 г., включая сплайс-варианты и/или изоформы ΣΕ-18-связывающих белков по определению, данному в К1ш с1 а1., 2000 г. В частности, согласно данному изобретению полезны изоформы а и с [Ь-18ВР человека. Белки, полезные согласно данному изобретению, могут быть гликозилированными или негликозилированными, они могут происходить из природных источников, таких как моча, или предпочтительно могут быть получены рекомбинантными методами. Экспрессию рекомбинантов можно осуществить в прокариотических экспрессирующих системах, подобных Е. со11, или в эукариотических, и предпочтительно в экспрессирующих системах млекопитающих.

Используемый в данном описании термин мутеины относится к аналогам [Б-18ВР или аналогам вирусного [Б-18ВР. в которых один или несколько аминокислотных остатков природного [Б-18ВР или вирусного [Б-18ВР заменены различными аминокислотными остатками или делегированы, или один или несколько аминокислотных остатков добавлены к природной последовательности [Б-18ВР или вирусного [Б-18ВР без существенного изменения активности полученных продуктов по сравнению с [Б-18ВР дикого типа или вирусным [Ь-18ВР. Такие мутеины получают известными методами синтеза и/или методами сайтнаправленного мутагенеза или любым подходящим для такой цели известным способом.

Любой такой мутеин имеет последовательность аминокислот, по существу, дублирующую последовательность [Ь-18ВР или, по существу, дублирующую последовательность вирусного [Ь-18ВР, так что активность, по существу, подобна активности [Ь-18ВР. Одной из активностей [Ь-18ВР является его способность к связыванию ΣΗ-18. До тех пор пока мутеин обладает существенной связывающей активностью в отношении ΣΗ-18, он может использоваться при очистке ΣΗ-18 таким способами, как аффинная хроматография, и, таким образом, может рассматриваться как обладающий активностью в основном подобной активности [Ь-18ВР. Таким образом, можно определить, обладает ли любой данный мутеин активностью в основном подобной активности [Ь-18ВР, с помощью обычных экспериментов, включающих в себя определение того, связывается ли такой мутеин или не связывается с соответствующим образом помеченным ΣΗ-18, например, путем простого конкурентного сэндвич-анализа, например радиоиммуноанализа или анализа методом ЕЫЗА.

Мутеины полипептидов Ш-^ВР или мутеины вирусного ^-^ВР, которые можно использовать согласно настоящему изобретению, или кодирующая их нуклеиновая кислота, включают в себя ограниченный ряд, по существу, соответствующих последовательностей в виде замещенных пептидов или полинуклеотидов, которые может получить обычными методами рядовой специалист в данной области техники без излишнего экспериментирования, основываясь на указаниях и руководстве, представленных в данном описании.

Предпочтительными изменениями для мутеинов согласно настоящему изобретению являются изменения, известные как консервативные замены. Консервативные замены аминокислот полипептидов ^-^ВР или белков вирусного Ш-^ВР могут включать в себя тождественные аминокислоты в пределах группы, которая имеет, по существу, подобные физико-химические свойства, и при заменах между членами группы будет сохраняться биологическая функция молекулы (ОгалШаш, 1974 г.). Ясно, что в вышеуказанных последовательностях также можно осуществить вставки или делеции без изменения их функции, в частности, если вставки или делеции включают в себя только несколько аминокислот, например до тридцати, а предпочтительно до десяти, и не удаляются или не заменяются аминокислоты, критические для функциональной конформации, например цистеиновые остатки. Белки и мутеины, полученные посредством таких делеций и/или инсерций, входят в сферу действия настоящего изобретения.

Предпочтительно, когда тождественными аминокислотами являются аминокислоты, указанные в табл. Σ. Предпочтительнее, если тождественными аминокислотами являются аминокислоты, указанные в табл. ΣΣ; и наиболее предпочтительно, когда тождественными аминокислотами являются аминокислоты, указанные в табл. ΣΣΣ.

- 13 005583

Таблица I

Предпочтительные группы тождественных аминокислот

.минокислота	Тождественная группа
Зег	Зег, ТЬг, С1у, Азп
Агд	Агд, ΘΙη, Ьуз, В1и, Ηί3
Ьеи	Не, РЬе, Туг, Ме1, Уа1, Ьеи
Рго	61у, А1а, ТЬг, Рго
ТЬг	Рго, Зег, А1а, <31у, Ηίβ, ΘΙη, ТЬг
А1а	<31у, ТЬг, Рго, А1а
Уа1	МеЕ Туг, РЬе, Не, Ьеи, Уа1
С1у	А1а, ТЬг, Рго, Зег, ©1у
Не	МеЕ Туг, РЬе, Уа1, Ьеи, Не
РЬе	Тгр, МеЕ Туг, Не, Уа!, Ьеи, РЬе
Туг	Тгр, МеЕ РЬе, Не, Уа1, Ьеи, Туг
Суз	Зег, ТЬг, Суз
ΗΪ3	61и, Ьуз, ΘΙη, ТЬг, Агд, Ηί3
ΘΙη	С1и, Ьуз, Азп, Ηί3, ТЬг, Агд, ΘΙη
Азл	С1п, Азр, 5ег, Азп
1_уз	С1и, ΘΙη, ΗΪ3, Агд, Ьуз
Азр	С1и, Азп, Азр
С1и	Азр, Ьуз, Азп, ΘΙη, ΗΪ5, Агд, С1и
Мс1	РЬе, Не, \/а1, Ьеи, Ме1
Тгр	Тгр

Таблица II Более предпочтительные группы тождественных аминокислот

Аминокислота	Тождественная группа
Зег	Зег
Агд	Ηϊδ, Ьуз, Агд
Ьеи	Ьеи, Не, РЬе, Ме1
Рго	А1а, Рго
ТЬг	ТЬг
А1а	Рго, А1а
Уа1	Уа1, МеЕ Не
61у	О1у
Не	Не, МеЕ РЬе, А/а1, Ьеи
РЬе	МеЕ Туг, Не, Ьеи, РЬе
Туг	РЬе, Туг
Суз	Суз, Зег
ΗΪ3	ΗΪ3, ΘΙη, Агд
ΘΙη	61и, ΘΙη, Ηίε
Азп	Азр, Азп
Ьуз	Ьуз, Агд
Азр	Азр, Азп
ею	С1и, ΘΙη
Ме1	МеЕ РЬе, Не, Уа1, Ьеи
Тгр	Тгр

- 14 005583

Таблица III

Наиболее предпочтительные группы тождественных аминокислот

1МИНОКИ слота	Тождественная группа
Зег	Зег
Агд	Агд
Ьеи	Ьеи, Не, Ме<
Рго	Рго
ТПг	ТЬг
А1а	А1а
νβΙ	Уа1
С1у	С1у
Не	Не, Ме1, Ьеи
РЬе	РЬе
Туг	Туг
Суз	Суз, Зег
Ηίε	ΗΪ5
βΐη	С1п
Азп	Азп
Ьуз	Ьуз
Азр	Азр
С1и	С1и
Ме1	МеЬ Не, Ьеи
Тгр	Ме1

Примеры осуществления замен аминокислот в белках, которые можно использовать для получения мутеинов полипептидов, или белков 1Ь-18ВР, или мутеинов вирусного 1Ь-18ВР для применения в настоящем изобретении, включают в себя любые известные методы, например, представленные в патентах США КЕ 33653, 4959314, 4588585 и 4737462, Магк е! а1.; 5116943, КоЛз е! а1., 4965195, Иашей е! а1.; 4879111, С1юпд е! а1. и 5017691, Ьее е! а1.; и белки с лизиновым замещением, представленные в патенте США № 4904584 (БВам е! а1.).

Термин слитый белок относится к полипептиду, содержащему Ш-18ВР, или вирусный Ш-18ВР, или его мутеин или фрагмент, слитый с другим белком, который, например, имеет длительное время пребывания в жидкостях организма. Ш-18ВР или вирусный 1Ь-18ВР, таким образом, можно гибридизовать с другим белком, полипептидом или подобным элементом, например иммуноглобулином или его фрагментом.

Используемый в данном описании термин функциональные производные охватывает производные 1Ь-18ВР или вирусного 1Ь-18ВР и их мутеинов и слитых белков, которые можно получить по функциональным группам, имеющимся в боковых цепях остатков Ν- или С-концевых групп, способами, известными в технике, и входят в изобретение до тех пор, пока они остаются фармацевтически приемлемыми, т.е. они не разрушают активность белка, которая в основном подобна активности Ш-18ВР или вирусного Ш-18ВР, и не придают токсических свойств содержащим их композициям.

Такие производные могут включать в себя, например, боковые цепи полиэтиленгликоля, которые могут маскировать антигенные сайты и удлинять время пребывания Ш-18ВР или вирусного Ш-18ВР в жидкостях организма. К другим производным относятся алифатические эфиры, образованные карбоксильными группами, амиды, образованные карбоксильными группами посредством взаимодействия с аммиаком или первичными или вторичными аминами, Ν-ацилпроизводные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, образованные с ацильными группами (например, алканоильными или карбоциклическими ароильными группами), или О-ацилпроизводные свободных гидроксильных групп (например, группы серильных и треонильных остатков), образованные с ацильными группами.

В качестве активных фракций Ш-18ВР или вирусного Ш-18ВР, их мутеинов и слитых белков настоящее изобретение охватывает любой фрагмент или предшественник полипептидной цепи белковой молекулы как таковой или вместе с ассоциированными молекулами или присоединенными к ней остатками, например остатки сахаров или фосфатов, или агрегаты белковой молекулы или остатки сахаров как таковых по себе, при условии, что указанная фракция обладает активностью в основном подобной активности Ш-18ВР.

В другом предпочтительном варианте воплощения изобретения ингибитором Ш-18 являются антитела к Ш-18. Антитела против Ш-18 могут быть поликлональными или моноклональными, химерными, гуманизированными или даже полностью человеческими. Рекомбинантные антитела и их фрагменты характеризовались высокоаффинным связыванием с Ш-18 ίη νίνο и низкой токсичностью. Антитела, ко- 15 005583 торые можно использовать в изобретении, отличаются своей способностью лечить пациентов на протяжении периода, достаточного для получения превосходной регрессии или облегчения патогенного состояния или любого симптома или группы симптомов, связанных с патогенным состоянием, и низкой токсичностью.

Нейтрализующие антитела легко получить у животных, таких как кролики, козы или мыши, путем их иммунизации 1Ь-18. Иммунизированные мыши особенно полезны для обеспечения источников Вклеток для получения гибридом, которые, в свою очередь, культивируют и получают моноклональные антитела против Ш-18 в больших количествах.

Химерные антитела являются молекулами иммуноглобулина, характеризующимися двумя или большим числом сегментов или частей, полученных у животных разных видов. Как правило, вариабельную область химерного антитела получают из антитела млекопитающего, не являющегося человеком, такого как мышиное моноклональное антитело, а иммуноглобулиновую константную область получают из молекулы иммуноглобулина человека. Предпочтительно, обе области и сочетание имеют низкую иммуногенность, определяемую обычными способами (ЕШо! а! а1., 1994 г.). Гуманизированные антитела представляют собой молекулы иммуноглобулина, созданные методами генной инженерии, в которых мышиные константные области заменяют соответствующими частями иммуноглобулина человека, сохраняя при этом мышиные области связывания антигена. Полученные мышино-человеческие антитела предпочтительно имеют пониженную иммуногенность и улучшенную фармакокинетику в организме человека (Кшдй! е! а1., 1993 г.).

Таким образом, в другом предпочтительном варианте антитела к Ш-18 представляют собой гуманизированные антитела к Ш-18. Предпочтительные примеры гуманизированных антител к Ш-18 описываются, например, в заявке на европейский патент ЕР 0974600.

В еще одном предпочтительном варианте антитела к Ш-18 являются полностью человеческими. Технология получения человеческих антител подробно описывается, например, в XVО 00/76310, XVО 99/53049, И8 6162963 или АИ5336100. Полностью человеческие антитела являются, предпочтительно, рекомбинантными антителами, полученными у трансгенных животных, например, ксеномышах, содержащими все функциональные локусы 1д человека или часть их.

В весьма предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения ингибитором Ш-18 является 1Ь-18ВР или его изоформа, мутеин, слитый белок, функциональное производное, активная фракция или производное с циклической перестановкой. Указанные его изоформы, мутеины, слитые белки или функциональные производные сохраняют биологическую активность 1Ь-18ВР, в частности связывание с Ш-18, и предпочтительно имеют, по существу, по меньшей мере, активность, подобную активности 1Ь-18ВР. В идеале такие белки имеют биологическую активность, которая даже выше по сравнению с активностью немодифицированного 1Ь-18ВР. Предпочтительные активные фракции имеют активность, лучшую, чем активость 1Ь-18ВР, или имеют другие преимущества, такие как повышенная стабильность или меньшая токсичность или иммуногенность, или их легче получать в больших количествах, или легче очищать.

Последовательности 1Ь-18ВР и ее сплайс-варианты/изоформы можно взять из ΧνΟ 99/09063 или из е! а1., 1999 г., а также в К1т е! а1., 2000 г.

Функциональные производные 1Ь-18ВР можно конъюгировать с полимерами для улучшения свойств белка, таких как стабильность, время полужизни, биологическая доступность, переносимость организмом человека или иммуногенность. Для достижения такой цели 1Ь-18ВР можно соединить, например, с полиэтиленгликолем (ПЭГ). Обработку ПЭГ можно осуществить известными способами, описанными, например, в νΟ 92/13095.

Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения 1Ь-18ВР обрабатывают ПЭГ.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения ингибитором Ш-18 является слитый белок, содержащий весь 1Ь-18-связывающий белок или его часть, слитые со всем иммуноглобулином или его частью. Специалисту в данной области техники будет понятно, что полученный слитый белок сохраняет биологическую активность 1Ь-18ВР, в частности связывание с Ш-18. Гибридизация может быть прямой или через короткий пептидный линкер, который может быть недлинным, например длиной 1-3 аминокислотных остатка или длиннее, например длиной 13 аминокислотных остатков. Указанный линкер может представлять собой трипептид, например, с последовательностью Е-Р-М (С1и-Рйе-Ме!), или линкерную последовательность из 13 аминокислот, содержащую С1и-Рйе-С1у-А1а-С1у-Ьеи-Уа1-ЬеиС1у-С1у-С1и-Рйе-Ме!, встроенную между последовательностью 1Ь-18ВР и последовательностью иммуноглобулина. Полученный слитый белок имеет улучшенные свойства, такие как увеличенное время пребывания в жидкостях организма (период полувыведения), повышенную удельную активность, повышенный уровень экспрессии, или слитый белок легче очищается.

В предпочтительном варианте 1Ь-18ВР гибридизуют с константной областью молекулы 1д. Предпочтительно, его гибридизуют с участками тяжелой цепи, подобными, например, доменам СН2 и СН3 1дС| человека. Получение специфических слитых белков, содержащих 1Ь-18ВР и часть иммуноглобулина, описывается, например, в примере 11 VР 99/09063. Другие изоформы молекул 1д также подходят для

- 16 005583 получения слитых белков согласно настоящему изобретению, такие как изоформы 1дС2 или 1дС₄, или другие классы 1д, подобные, например, 1дМ или 1дА. Слитые белки могут быть мономерными или полимерными, гетеро- или гомополимерными.

Интерфероны известны, главным образом, их ингибирующим действием на репликацию вирусов и пролиферацию клеток. Интерферон-γ, например, играет важную роль в промоции иммунных и воспалительных реакций. Сообщается, что интерферон β (ΙΕΝ-β, интерферон типа I) играет роль противовоспалительного фактора. Данные исследований, опубликованных 1лап1арйу11орои1и8 е1 а1. (1999 г.), показывают, что ΙΕΝ-Ρ оказывает благоприятное действие при лечении ревматоидного артрита, как показано на мышиной модели болезни - модели артрита, вызванного коллагеном (С1А). Такое благоприятное действие ΙΕΝ-β подтверждается ниже в примерах.

Изобретение также относится к применению сочетания ингибитора ГЬ-18 и интерферона при изготовлении лекарственного средства для лечения артрита, в частности ревматоидного артрита.

Интерфероны также можно конъюгировать с полимерами для увеличения стабильности белков. Конъюгат интерферона β и полиола полиэтиленгликоля (ПЭГ) описывается, например, в νθ 99/55377.

В другом предпочтительном варианте воплощения изобретения интерферон представляет собой интерферон β (ΙΕΝ-β) и предпочтительнее - ΙΕΝ-β 1а.

Ингибитор продуцирования и/или действия ГЬ-18 предпочтительно применяют одновременно с интерфероном или отдельно от него.

Еще в одном из вариантов воплощения изобретения ингибитор ГЬ-18 применяют в сочетании с антагонистом ΤΝΕ. Антагонисты ΤΝΕ проявляют свою активность несколькими способами. Во-первых, антагонисты могут связываться с самой молекулой ΤΝΕ или изолировать ее с достаточной аффинностью и специфичностью и частично или существенно нейтрализовать эпитоп ΤΝΕ или эпитопы, ответственные за связывание с рецептором ΤΝΕ (далее называются секвестрирующими антагонистами). Секвестрирующим антагонистом могут являться, например, антитела, направленные против ΤΝΕ.

С другой стороны, антагонисты ΤΝΕ могут ингибировать каскад передачи сигнала ΤΝΕ, активируемый рецептором клеточной поверхности после связывания ΤΝΕ (далее называются антагонистами передачи сигнала). Обе группы антагонистов полезны либо порознь, либо вместе, в сочетании с ингибитором ГЬ-18 при лечении артрита, в частности ревматоидного артрита.

Антагонисты ΤΝΕ легко идентифицировались и оцениваются путем обычного скрининга кандидатов по их действию на активность нативного ΤΝΕ ίη уйто на сенсибилизированных клеточных линиях, например на В-клетках человека, в которых ΤΝΕ вызывает пролиферацию и секрецию иммуноглобулина. Анализ включает в себя анализ композиций ΤΝΕ при разных разведениях антагониста-кандидата, например, от 0,1- до 100-кратного разведения молярного количества ΤΝΕ, используемого при анализе, и контроль без ΤΝΕ или только с антагонистом (Τικα е1 а1., 1992 г.).

Секвестрирующие антагонисты являются предпочтительными антагонистами ΤΝΕ для использования согласно настоящему изобретению. Среди секвестрирующих антагонистов предпочтительными являются полипептиды, связывающиеся с ΤΝΕ с высокой аффинностью и обладающие низкой иммуногенностью. Особенно предпочтительными являются растворимые молекулы рецептора ΤΝΕ и нейтрализующие антитела к ΤΝΕ. Например, растворимые ΤΝΕ-ΚΙ и ΤΝΕ-ΚΙΙ полезны в настоящем изобретении. Усеченные формы указанных рецепторов, содержащие внеклеточные домены рецепторов или их функциональные части, являются еще более предпочтительными антагонистами согласно настоящему изобретению. Усеченные растворимые рецепторы ΤΝΕ типа Ι и типа ΙΙ описываются, например, в ЕР 914431.

Усеченные формы рецепторов ΤΝΕ являются растворимыми и обнаружены в моче и сыворотке как ингибирующие связывание ΤΝΕ белки в 30 и 40 кДа, названные ΤΒΡΙ и ΤΒΡΙΙ, соответственно (Еиде1таии е1 а1., 1990 г.). Согласно изобретению предпочтительно одновременное, последовательное или раздельное применение ингибитора ГЬ-18 с антагонистами ΤΝΕ и/или интерфероном.

Согласно изобретению ΤΒΡΙ и ΤΒΡΙΙ являются предпочтительными антагонистами ΤΝΕ для применения в сочетании с ингибитором ГЬ-18. Производные, фрагменты, области и биологически активные части рецепторных молекул функционально схожи с рецепторными молекулами и также могут использоваться в настоящем изобретении. К таким биологически активным эквивалентам или производным рецепторной молекулы относится часть полипептида или последовательности, кодирующей рецепторную молекулу, которая имеет достаточный размер и способна связываться с ΤΝΕ с такой аффинностью, что взаимодействие ΤΝΕ с мембрансвязанным рецептором ингибируется или блокируется.

В другом предпочтительном варианте антагонистом ΤΝΕ для применения согласно изобретению является растворимый ΤΝΕ-ΚΙ (ΤΒΡΙ) человека. Природные и рекомбинантные растворимые молекулы рецепторов ΤΝΕ и способы их получения описываются в европейских патентах ЕР 308378, ЕР 398327 и ЕР 433900.

Ингибитор ГЬ-18 можно применять одновременно, последовательно или раздельно с ингибитором ΤΝΕ. Выгодно применять сочетание антитела или антисыворотки против ГЬ-18 и растворимый рецептор ΤΝΕ, обладающий ΤΝΕ-ингибирующей активностью.

- 17 005583

В другом предпочтительном варианте воплощения изобретения лекарственное средство также включает в себя ингибитор СОХ, предпочтительно ингибитор СОХ-2. Ингибиторы СОХ известны в технике. Конкретные ингибиторы СОХ-2 описываются, например, в \УО 01/00229.

Изобретение также относится к применению сочетания ингибиторов ΙΠ-18, и/или интерферонов, и/или антагонистов ТХЕ, и/или ингибиторов СОХ-2. Такое сочетание подходит для лечения и/или предупреждения артрита, в частности ревматоидного артрита, и для лечения и/или предупреждения повреждения печени и для лечения и/или предупреждения воспалительного заболевания кишечника, в частности болезни Крона и неспецифического язвенного колита. Активные компоненты можно применять одновременно, последовательно или раздельно.

В предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения ингибитор ΙΠ-18 используют в количестве примерно 0,0001-10 мг на кг массы тела, или примерно 0,01-5 мг на кг массы тела, или примерно 0,1-3 мг на кг массы тела, или примерно 1-2 мг на кг массы тела. В другом предпочтительном варианте ингибитор ΙΠ-18 используют в количестве примерно 0,1-1000 мкг на кг массы тела, или примерно 1-100 мкг на кг массы тела, или примерно 10-50 мкг на кг массы тела.

Изобретение также относится к применению экспрессирующего вектора, содержащего кодирующую последовательность ингибитора ΙΠ-18, при получении лекарственного средства для предупреждения и/или лечения артритных состояний, в частности ревматоидного артрита, для лечения повреждения печени и для лечения воспалительного заболевания кишечника. Таким образом, для лечения и/или предупреждения болезни применяют генотерапевтический подход. Затем выгодно провести экспрессию ингибитора ΙΠ-18 ίη δίΐιι, причем таким образом ΙΠ-18 эффективно блокируется непосредственно в ткани (тканях) или клетках, пораженных болезнью.

Для того чтобы лечить и/или предупреждать артрит, генотерапевтический вектор, содержащий последовательность ингибитора продуцирования и/или действия ΙΠ-18, можно инъецировать, например, непосредственно в больной сустав, избежав таким образом проблем, связанных с системным введением генотерапевтических векторов, подобных разбавлению векторов, достижения и нацеливания на клеткиили ткани-мишени и побочного действия.

Применение вектора для индукции и/или усиления эндогенного продуцирования ΙΠ-18 в клетке, обычно молчащей в отношении экспрессии ингибитора ΙΠ-18, или экспрессирующей недостаточные количества ингибитора, также рассматривается согласно изобретению. Вектор может содержать регуляторные последовательности, функциональные в клетках, желательных для экспрессии ингибитора ΙΠ-18. Такие регуляторные последовательности могут представлять собой, например, промоторы или энхансеры. Затем регуляторную последовательность можно встроить в правый локус генома методом гомологичной рекомбинации, таким образом операбельно связывая регуляторную последовательность с геном, экспрессию которого требуется индуцировать или усилить. Такую технологию обычно называют эндогенной генной активацией (ЕСЛ), и она описывается, например, в \УО 91/09955.

Специалисту в данной области техники будет понятно, что с использованием такого метода также можно прекратить экспрессию ΙΠ-18, т.е. ввести в генный локус ΙΠ-18 элемент отрицательной регуляции, подобный, например, молчащему элементу, причем таким образом дезактивируется или предотвращается экспрессия Ш-18. Специалисту в данной области техники будет понятно, что такая дезактивация или глушение экспрессии ΙΠ-18 имеет такое же действие, как применение ингибитора ΙΠ-18 для предупреждения и/или лечения заболевания.

Изобретение также относится к применению клетки, генетически модифицированной для продуцирования ингибитора Ш-18, для изготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения повреждения печени, артрита или воспалительного заболевания кишечника.

Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, в частности, полезным для предупреждения и/или лечения воспалительного артрита, повреждения печени или воспалительного заболевания кишечника, содержащим терапевтически эффективное количество ингибитора ΙΠ-18 и терапевтически эффективное количество интерферона. В качестве ингибитора ΙΠ-18 фармацевтическая композиция может содержать ингибиторы каспазы-1, антитела против ΙΠ-18, антитела против субъединиц рецептора ΙΠ-18, ингибиторы каскада передачи сигнала ΙΠ-18, антагонисты ΙΠ-18, конкурирующие с ΙΠ-18 и блокирующие рецептор ΙΠ-18, и белки, связывающие ΙΠ-18, их изоформы, мутеины, слитые белки, функциональные производные, активные фракции или производные с циклическими перестановками, обладающие такой же активностью.

ΙΕ-18ΒΡ и его изоформы, мутеины, слитые белки, функциональные производные, активные фракции или производные с циклическими перестановками, описанные выше, являются предпочтительными активными ингредиентами фармацевтических композиций.

Интерферон, содержащийся в фармацевтической композиции, предпочтительно представляет собой ΙΡΝ-β.

В еще одном предпочтительном варианте фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективные количества ингибитора ΙΠ-18, необязательно интерферона и антагониста ТОТ'. Антагонисты Т№ могут представлять собой антитела, нейтрализующие активность ТОТ, или растворимые усеченные фрагменты рецептора ΤNΡ, также называемые ΤΒΡI и ТВРП. Фармацевтическая композиция со

- 18 005583 гласно изобретению также может содержать один или несколько ингибиторов СОХ, предпочтительно ингибиторы СОХ-2.

Определение фармацевтически приемлемый предназначено для обозначения любого носителя, не влияющего на эффективность биологической активности активного ингредиента и нетоксичного для хозяина, которому его вводят. Например, для парентерального введения активный(е) белок(белки) можно ввести в состав стандартной лекарственной формы для инъекции в таком носителе, как физиологический раствор, раствор декстрозы, сывороточный альбумин и раствор Рингера.

Активные ингредиенты фармацевтической композиции согласно изобретению можно вводить индивидууму разными способами. Способы введения включают в себя интрадермальный, трансдермальный (например, в композициях с медленным высвобождением), внутримышечный, интраперитонеальный, внутривенный, подкожный, пероральный, эпидуральный, местный и интраназальный способы. Можно использовать любой другой эффективный способ введения, например поглощение через эпителиальную или эндотелиальную ткани или генную терапию, когда пациенту вводят молекулу ДНК, кодирующую активный агент (например, с помощью вектора), которая вызывает экспрессию и секрецию активного агента ίη νίνο. Кроме того, согласно изобретению белок(белки) можно вводить вместе с другими компонентами биологически активных средств, такими как фармацевтически приемлемые поверхностноактивные вещества, эксципиенты, носители, разбавители и наполнители.

Для парентерального (например, внутривенного, подкожного, внутримышечного) введения активный(е) белок(белки) можно ввести в такую композицию, как раствор, суспензия, эмульсия или лиофилизованный порошок, в сочетании с фармацевтически приемлемым парентеральным носителем (например, водой, физиологическим раствором, раствором декстрозы) и добавками, которые поддерживают изотоничность (например, маннитом) или химическую стойкость (например, консервантами и буферными веществами). Композицию стерилизуют используемыми обычно методами.

Биологическую доступность активного(ых) белка(белков) согласно изобретению также можно улучшить, используя процедуры конъюгации, повышающие время полужизни молекулы в организме человека, например присоединяя молекулу к полиэтиленгликолю, как описывается в заявке на международный патент РСТ \УО 92/13095.

Терапевтически эффективные количества активного(ых) белка(белков) будут функцией многих переменных, включая тип антагониста, аффинность антагониста к ГБ-18, остаточную цитотоксическую активность любого рода, обнаруживаемую антагонистами, способ введения, клиническое состояние пациента (в том числе желательность поддержания нетоксичного уровня эндогенной активности ГБ-18).

Терапевтически эффективное количество является таким количеством ингибитора ГБ-18, которое будучи введенным, приводит к ингибированию биологической активности ГБ-18. Дозировка, вводимая индивидууму в виде однократной или нескольких доз, будет зависеть от разных факторов, в том числе от фармакокинетических свойств ингибитора ГБ-18, способа введения, состояния пациента и его особенностей (пол, возраст, масса тела, состояние здоровья, объем), тяжести симптомов, сопутствующего лечения, частоты лечения и нужного эффекта. Регулирование и манипуляция в установленных дозировочных интервалах находятся в пределах возможностей специалистов в этой области техники, так же как и способы определения ίη νίίτο и ίη νίνο ингибирования ГБ-18 у индивидуума.

Согласно изобретению ингибитор ГБ-18 используют в количестве примерно 0,0001-10 мг на кг массы тела, или примерно 0,01-5 мг на кг массы тела, или примерно 0,1-3 мг на кг массы тела, или примерно 1-2 мг на кг массы тела. Другими предпочтительными количествами ингибитора ГБ-18 являются количества примерно 0,1-1000 мкг на кг массы тела, или примерно 1-100 мкг на кг массы тела, или примерно 10-50 мкг на кг массы тела.

Способом введения, предпочтительным по изобретению, является введение подкожным способом. Согласно изобретению также предпочтительно внутримышечное введение. В других предпочтительных вариантах ингибитор ГБ-18 вводят ежедневно или через день.

Ежедневные дозы, как правило, дают в виде разделенных доз или в форме с отсроченным высвобождением, эффективной для получения нужных результатов. Второе или последующие введения можно осуществлять в дозировке, которая такая же, как начальная или предшествующая доза, введенная индивидууму, или меньше или больше нее. Второе или последующие введения можно осуществлять во время или до начала заболевания.

Согласно изобретению ингибитор ГБ-18 можно вводить индивидууму в терапевтически эффективном количестве профилактически или терапевтически до, одновременно или после других видов лечения или лекарственных средств (например, схемы с несколькими лекарственными средствами), в частности с интерфероном, и/или антагонистом ΤΝΡ, и/или ингибитором СОХ. Активные средства, вводимые одновременно с другими лечебными средствами, можно вводить в тех же или в других композициях.

Изобретение также относится к способу получения фармацевтической композиции, включающему в себя смешивание эффективного количества ингибитора ГБ-18, и/или интерферона, и/или антагониста ΤΝΡ, и/или ингибитора СОХ с фармацевтически приемлемым носителем.

Имея описание изобретения, его будет легче понять, обратившись к приведенным далее примерам, которые даются в целях иллюстрации и не предназначены для ограничения настоящего изобретения.

- 19 005583

Примеры

Часть Ι. Примеры 1-8, относящиеся к применению ингибиторов ΙΠ-18 при повреждении печени.

Пример 1. Получение ΙΕ-18ΒΡ с меткой Ηίκ (ΙΕ-18ΒΡ-Ηίκ !ад).

Очищенный рекомбинантный ΙΕ-18ΒΡ человека, содержащий метку 1нк (τ-ΡίΕ-ΙΕ-18ΒΡ-Ηίκ !ад), получали в клетках СНО. Получение рекомбинантных белков в эукариотических клетках известно специалистам в данной области техники. Хорошо известные способы доступны для конструирования соответствующих векторов, содержащих ДНК, кодирующую ΙΕ-18ΒΡ, и подходящих для трансфекции эукариотических клеток с целью получения рекомбинантного ΙΕ-18ΒΡ. Для экспрессии в клетках ДНК, кодирующую ΙΕ-18ΒΡ (см., например, №у1ск е! а1., 1999 г.), вырезали и встраивали в экспрессирующие векторы, подходящие для трансфекции клеток. С другой стороны, такую ДНК можно получить методом ПЦР с подходящими смысловыми и антисмысловыми праймерами. Затем полученные конструкции ДНК встраивали в соответствующим образом сконструированные эукариотические экспрессирующие векторы методами, хорошо известными в технике (Мапайй, 1982 г.). Рекомбинантный белок очищали до чистоты свыше 95% и обнаруживали, что он биологически активен ш уйто и ш у1уо и обладает высокой аффинностью к своим лигандам.

Пример 2. Защитное действие ΙΕ-18ΒΡ против вызываемой эндотоксином гибели на мышиной модели.

Использовали мышиную модель для проверки того, будет ли ингибитор ΙΠ-18 ΙΕ-18ΒΡ защищать мышей от высокой дозы липополисахаридов (ΕΡ8). ΕΡ8 вызывает острое повреждение печени и вслед за тем быструю гибель мышей.

Мышам ί.'57ΒΡ/6 инъецировали интраперитонеально (ί.ρ.) 4 мг/кг рекомбинантного ΙΕ-18ΒΡ человека (Ύ1ιΙΡ18ΒΡ1ιί5). содержащего метку 1нк (полученного при рекомбинантном продуцировании белка). Спустя 1 ч инъецировали 60 мг/кг ΕΡ8 (летальные дозы). Выживание мышей в данной группе сравнивали с выживанием в группе животных, получавших только ΕΡ8 (без ГР-18ВР).

Пять мышей из 7, инъецированных τΗΙΕ-18ΒΡ-Ρίκ, выжили после инъекции ΕΡ8, в отличие от контрольной группы, где все животные погибли в течение 3 дней.

Брали образцы крови через 5 ч после инъекции ΕΡ8 в отсутствие или в присутствии возрастающих доз Γ1ιΙΡ-18ΒΡ-1ιίκ и анализировали методом ЕЫ8Л на наличие циркулирующего ΙΡΝ-γ (фиг. 1). Дозы ιΊιΙΡ-18ΒΡ-1ιίκ в 0,4 и 4 мг/кг вызывали 2-кратное снижение содержания ΙΡΝ-γ в сыворотке. Такое ингибирующее действие утрачивалось при более низких дозах 1Ί1ΙΡ-18ΒΡ (0,004 и 0,04 мг/кг).

Пример 3. ΙΕ-18ΒΡ обладает защитным действием против повреждения печени на мышиной модели заболевания.

Мышиную модель молниеносного гепатита использовали для проверки действия ΙΕ-18ΒΡ. У мышей развивалось острое повреждение печени, когда им дополнительно вводили БюрюЩ^-кЛепит аспек (Ρ. аспек) и липополисахарид (ΕΡ8).

Мышам инъецировали возрастающие дозы ιΊιΙΡ-18ΒΡ-1ιίκ (4; 0,4; 0,04; 0 мг/кг) в различные моменты времени (1 ч, 20 мин, одновременно) перед инъекцией ΕΡ8 мышам С57Β^/6. сенсибилизированным Ρ. аспек. Когда ιΊιΙΡ-18ΒΡ-1ιίκ вводили ί.ρ. в то же время, что и ΕΡ8, выживших мышей не осталось, и уровни циркулирующих ΙΡΝ-γ и ΤΝΡ-α оставались неизменными. Неожиданно 1Ί1ΙΡ-18ΒΡ (4 и 0,4 мг/кг) вызывал у 70% мышей снижение циркулирующей аланин-аминотрансферазы (маркер повреждения печени), как показано на фиг. 2.

В дополнение к указанному проверяли выживание мышей (фиг. 3). Когда 1Ί1ΙΡ-18ΒΡ вводили ί.ρ. на 20 мин раньше ΕΡ8, две самые высокие дозы ΙΕ-18ΒΡ (4 и 0,4 мг/кг) замедляли гибель мышей на 10 ч по сравнению с контрольной группой, где вместо ΙΕ-18ΒΡ мыши получали №С1.

Результаты измерения содержания ΙΡΝ-γ в сыворотке приводятся на фиг. 4. 1Ί1ΙΡ-18ΒΡ (4 мг/кг) ингибирует уровни циркулирующего ΙΡΝ-γ на 90% и циркулирующей аланин-аминотрансферазы на 80% (не показано).

Когда 1Ί1ΙΡ-18ΒΡ вводили ί.ρ. на 1 ч раньше ΕΡ8, кривые выживания и уровни циркулирующего ΙΡΝ-γ были схожи с показателями, наблюдаемыми в случае, когда 1Ί1ΙΡ-18ΒΡ вводили ί.ρ. на 20 мин раньше ΕΡ8, но уровни циркулирующей аланин-аминотрансферазы оставались неизменными (не показано).

Кроме указанного, анализировали ткань мышиной печени методом окрашивания гематоксилином и эозином, а также туннельной микроскопии. Печени мышей, у которых ранее был вызван тяжелый гепатит, обнаруживают тяжелый некроз при сравнении с тканями здоровой печени. В противоположность этому ткань печени мышей, обработанных ΙΕ-18ΒΡ, обнаруживает значительно меньше некротических очагов, чем в случае необработанных мышей.

Пример 4. Антитела против ΙΠ-18 защищают от летальной эндотоксемии.

Для того чтобы оценить, будет ли блокада ΙΠ-18 антителами против ΙΠ-18 защищать мышей от действия летальных доз бактериальных липополисахаридов, мышам ί.'57ΒΡ/6ί инъецировали сначала нейтрализующие кроличьи антимышиные антитела к ΙΠ-18 (поликлональные) или сыворотку здоровых кроликов (ΝΏ8) в качестве контроля. Через 30 мин после обработки антителами инъецировали летальные

- 20 005583 дозы ЬР8, полученных или из Е. со11 (фиг. 5А) или из 8. ШурЫтигшт (фиг. 5В). Эксперименты включали в себя 10-12 мышей на группу и осуществлялись дважды в двух разных случаях.

Как видно на фиг. 5 А, обработка мышей антисывороткой против 1Ь-18 предотвращает смертность, вызываемую 40 мг/кг ЬР8 из Е. со11. Выживает 100% мышей против 10% выживших мышей, обработанных сывороткой здоровых кроликов (р<0,005).

На фиг. 5В показано, что обработанные антителами мыши также защищены от летального действия 8. ШурЫтигшт (50% выживших против 0% выживших; р<0,05).

Пример 5. Блокада 1Ь-18 и ΤΝΕ-α защищает мышей от гепатотоксичности, вызываемой СопА и РЕА.

Использовали две экспериментальные модели гепатотоксичности для оценки роли ГЕ-18 и ΤΝΕ-α при повреждении печени. Обе инъекции конканавалина А (СопА) и Ркеийотопак аегидшока (РЕА) вызывали у мышей повреждение печени и являлись моделями гепатита, опосредованного Т-клетками.

Мышей С57ВЬ/61 обрабатывали антисывороткой против 1Ь-18 или растворимым рецептором ΤΝΕα ΤΝΕκΒρ55. Измеряли сывороточные уровни аланин-аминотрансферазы (АЬТ) как индикаторы повреждения печени (фиг. 6).

Как видно на фиг. 6 А, как антисыворотка против 1Ь-18, так и растворимые рецепторы ΤΝΕ существенно снижали индуцируемые СопА уровни ΑΕΤ в сыворотке по сравнению с контрольной инъекцией одного носителя (апирогенного физиологического раствора). Совместное введение растворимого рецептора ΤΝΕ и антисыворотки против 1Ь-18 приводит к полному ингибированию вызываемого СопА повреждения печени.

Как видно на фиг. 6В, у мышей, инъецированных РЕА, нейтрализация либо ингибиторами ΤΝΕ-α, либо антителами против 1Ь-18 приводит к 93 и 83% ингибированию уровней ΑΕΤ в сыворотке, соответственно. Комбинированная блокада тем и другим приводит к 99%-ной защите.

Пример 6. Уровни 1Ь-18-связывающего белка в плазме повышены у пациентов с хронической болезнью печени.

Измеряли уровни 1Ь-18ВР в плазме у 133 пациентов с хронической болезнью печени (СЬЭ) различной этиологии и 31 здорового человека (контроль) методом специфического ЕЫ8А с использованием моноклональных антител к 1Ь-18.

Уровни 1Ь-18ВР в плазме были существенно выше у больных СЬЭ (12,1 + 0,89 нг/мл; среднее ±8ЕМ), чем у здоровых людей (4,96 ± 0,43 нг/мл, р<0,001). Пациенты с циррозом имели значительно более высокие уровни, чем пациенты СЕЮ без цирроза (19,23 ± 1,28 нг/мл, п = 67, против 6,49 ± 0,51, п = 66, р<0,001). Пациенты в стадии В по классификаци СЫ1й-Рцдй имеют более высокие уровни 1Ь-18ВР, чем пациенты в стадии А (22,48 ± 2,44 нг/мл против 9,57 ± 1,25 нг/мл, р<0,001). Однако нет существенного различия между стадиями С1и1й В и С (22,48 ± 2,44 нг/мл против 20,62 ± 4,75 нг/мл, р = 0,7). Уровни 1Ь18ВР в плазме положительно коррелировали с ΟΘΤ, билирубином и скоростью оседания эритроцитов. Обнаружена отрицательная корреляция с протромбиновым временем.

Как вывод, результаты показывали, что уровни 1Ь-18ВР в плазме при СБЭ повышаются и коррелируют с тяжестью болезни независимо от этиологии болезни. Несмотря на эндогенный антагонист провоспалительного 1Ь-18 оказывается, что повышенных уровней 1Ь-18ВР недостаточно для противодействия бесчисленным медиаторам провоспаления при СЬЭ.

Пример 7. Подавление алкогольного гепатита с помощью 1Ь-18ВР.

Четырем группам крыс (5 на группу) путем внутрижелудочной инъекции в течение 4 недель давали этанол и корм, содержащий кукурузное масло. Контрольным животным этанол заменяли декстрозой изокалорийно. Крыс инъецировали ежедневно мышиным 1Ь-18ВР (1 мг/кг) или физиологическим раствором. Анализ патологии осуществляли на срезах печени и проводили измерения содержания в сыворотке ферментов печени, ΤΝΕ-α, Еак-лиганда и ΙΕΝ-γ. У крыс, которым давали этанол и инъецировали им физиологический раствор, наблюдали некро-воспалительное повреждение и экспрессию ферментов печени, ΤΝΕ-α, Εаκ-лиганда и ΙΕΝ-γ.

Крысы, инъецированные 1Ь-18ВР, защищены от некровоспалительного повреждения, и уровни ферментов печени, ΤΝΕ-α, Гак-лиганда и ΙΕΝ-γ у них существенно снижены (>90%).

Пример 8. Подавление гепатита, индуцированного Соп А, с помощью 1Ь-18ВР.

Мышам Ва1Ь/с вводили 12 мг/кг конканавалина А (Соп А) вместе с инъекцией мышиного 1Ь-18ВР (1 мг/кг) за 2 ч до введения Соп А или без нее и затем ежедневно. Повреждение печени оценивали, определяя уровни в сыворотке ферментов печени, ΤΝΕ-α, Εак-лиганда и ΙΕΝ-γ. Сравнивали гистопатологию печени таких мышей и мышей, обработанных только конканавалином А.

Предварительная обработка 1Ь-18ВР существенно снижает сывороточные уровни ферментов печени и ΤΝΕ-α с отсутствием доказательств воспаления при гистопаталогической проверке по сравнению с контрольными животными, не обработанными Соп А.

Часть II. Примеры 9 и 10, относящиеся к применению ингибиторов 1Ь-18 при артрите.

Пример 9. Получение [И-18ВР с меткой Ηίκ (!Е-18ВР-Н|к 1ад).

- 21 005583

Для эксперимента, подробно описанного ниже в примере 10, в клетках СНО получали рекомбинантный !Ы-18ВР человека, содержащий метку из 6 остатков Ык (г-ЫЬ-18ВР-Н1к 1ад), и очищали, как описывается у К1т е1 а1., 2000. Рекомбинантный белок очищали до степени свыше 95% и обнаруживали его биологическую активность ίη νίίτο и ίη νΐνο с высокой аффинностью к его лигандам.

Получение рекомбинантных белков в других эукариотических системах без меток или с метками, облегчающими очистку рекомбинантных белков, известно специалистам в данной области техники. Хорошо известные способы доступны для конструирования соответствующих векторов, содержащих ДНК, кодирующую [Ы-18ВР и подходящих для трансфекции эукариотических клеток с целью получения рекомбинантного Ш-^ВР. Для экспрессии в клетках ДНК, кодирующую Ш-^ВР (см., например, ΝονΤΚ е1 а1., 1999 г.), вырезали и встраивали в экспрессирующие векторы, подходящие для трансфекции клеток. С другой стороны, такую ДНК можно получить методом ПЦР с подходящими смысловыми и антисмысловыми праймерами. Затем полученные конструкции ДНК встраивали в соответствующим образом сконструированные эукариотические экспрессирующие векторы методами, хорошо известными в технике (Машайк, 1982 г.).

Пример 10. Блокада эндогенного РС-18 на мышиной модели артрита.

Методы

Индукция вызываемого коллагеном артрита (ΟΙΆ).

СИЛ индуцировали у самцов мышей ΌΒΆ/1 (возраст 8-12 недель) путем иммунизации нативным бычьим коллагеном типа ΙΙ (СП), как описано ранее (Р1а1ет-2уЬегк е1 а1., 1995 г.). С 25 дня после иммунизации мышей ежедневно проверяли на начало заболевания.

Обработка тЫЬ-18ВР-6Ык.

Обработку мышей ΌΒΆ/1, иммунизированных СП, начинали при первом появлении клинических признаков болезни. Рекомбинантный ^-^ВР человека, содержащий метку из 6 гистидинов (тЫЬ-18ВР6Ык), использовали для нейтрализации эндогенного РС18 у мышей, обработанных коллагеном. тЫЬ18ВР-6Ык инъецировали интраперитонеально (ί.ρ.) ежедневно в течение 7 (семи) дней при 5 различных концентрациях - 10, 3, 1, 0,5 и 0,25 мг/кг/инъекцию. Контрольные мыши в качестве плацебо получали только носитель (0,9% раствор ЫаС1).

Оценка развития заболевания.

Клиническая оценка (клинические показатели).

При первом появлении клинических симптомов мышей каждый день проверял сотрудник, связанный с лечением. Каждую конечность оценивали на тяжесть заболевания (шкала 0-3,5, максимальное число оценок = 14/мышь). На лапах, на которых признаки болезни появились первыми, измеряли развитие отека (воспаления) с использованием точных циркулей (Ргос1ек1 2Т, Кгоерйп Ьапдептекк1есйшк).

Развитие болезни оценивали ежедневно в течение 8 дней от начала, после чего мышей умерщвляли, и собирали лапы для гистопаталогической проверки.

Гистологическая оценка эрозий хряща и оценка микровоспаления.

По окончании экспериментов, т.е. на 8 день после начала болезни, мышей умерщвляли и отсекали лапы, на которых признаки болезни появились первыми. Суставы фиксировали, декальцинировали и заливали парафином. Делали стандартные срезы и окрашивали гематоксилином/эозином/сафранином О. Каждый сустав оценивали 2 исследователя, не знакомых с протоколом обработки (отсутствие разрушения хряща или кости = 0; локализованные эрозии хряща = 1-2; более обширные эрозии = 3; общее разрушение хряща и наличие эрозии кости = 4). Конечные оценки для каждой мыши являлись средним из результатов для всех оцененных суставов. Оценку микровоспаления под микроскопом или синовит осуществляли по шкале от 0 до 4 следующим образом: отсутствие воспаления = 0; небольшое утолщение слоя выстилки и/или немного инфильтрирующих клеток в слое под выстилкой = 1-2; утолщение слоя выстилки и/или более выраженный приток клеток слоя под выстилкой = 3; наличие клеток в синовиальном пространстве и синовия, сильно пронизанного многими инфильтрирующими клетками = 4.

Определение антиколлагеновых антител.

Антитела против бычьего коллагена типа ΙΙ проверяли с использованием твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫ8А). Измеряли титры Ι§Ο1 и ΙβΟΣη. Вкратце, планшеты сенсибилизировали 10 мкг бычьего коллагена и затем блокировали сайты неспецифического связывания 0,1 М раствором этаноламина (81дта). Добавляли сериные разведения (1:2) сывороток и затем инкубировали с изотипспецифической козьей антимышиной пероксидазой (δοιιΙΙκΓΠ В^есИшЕ^у Α^ο^ί^, Витатдйат, А1., И8А) и субстратом (5-аминосалициловая кислота, 8щта). Планшеты считывали при 492 нм. Титры выражали как среднее ±8Ό разведение, которое дает значение в половину от максимального.

Анализы ΙΕ-6.

Уровни ΙΕ-6 определяли коммерческим ЕЫ8А (системы Β&Ό, Миннеаполис, Миннесота, США). Биологическую активность ΙΕ-6 определяли путем анализа пролиферации с использованием клеток В9. Вкратце, в круглодонные лунки титрационнго микропланшета помещали 5 х 10³ клеток В 9 в 200 мкл на лунку среды ΚΓΜΙ 1640 с 5% ΡС8 и инкубировали в течение 3 суток с использованием в качестве стандарта рекомбинантного ΙΕ-6 человека (системы Β&Ό, Миннеаполис, Миннесота, США). По окончании инкубации добавляли 0,5 мкКи ³[Н]тимидина (ΝΕΝ-ΌυροπΙ, Бостон, Миннесота, США) на лунку. Через

- 22 005583 три часа клетки собирали и определяли включение тимидина. Предел обнаружения для биоанализа на ГЬ6 составлял 1 пг/мл.

Статистический анализ.

Значимость различий оценивали с помощью критерия Манна-Уитни с использовванием программы статистического анализа 81§та81а! и программы СгарйРаб Ргып.

Результаты.

Мышиную экспериментальную модель ΟΙΛ (коллагениндуцированный артрит) использовали для оценки эффективности ΙΕ-18ΒΡ как средства для лечения артрита. Введение коллагена и неполного адъюванта Фрейнда мышам ΌΒΑ/1 вызывает развитие эрозивного воспалительного артрита и представлет идеальную возможность исследования лечебного потенциала ΙΕ-18ΒΡ. С этой целью эндогенный ΙΠ-18 нейтрализуют с использованием ΙΕ-18ΒΡ и оценивают действие на различные патогенные параметры.

Исследование проводят в зависимости от дозы. Три группы мышей ΌΒΑ/1 с коллагениндуцированным артритом обрабатывают терапевтически (т.е., после начала заболевания) 5 дозами ΙΕ-18ΒΡ 1.р. (интраперитонеально). ΙΕ-18ΒΡ в концентрациях 10, 3, 1, 0,5 или 0,25 мг/кг вводят при первых клинических признаках болезни. Инъекцию физиологического раствора (хлорида натрия, №С1) используют в качестве контроля. Кроме того, вводят 1.р. 10000 ΜΕ интерферона β (ΙΡΝ-β) для оценки влияния ΙΡΝ на данной экспериментальной модели артрита. Влияние на тяжесть заболевания контролируют ежедневно, оценивая визуально каждую отдельную лапу, как описано выше. Мышей умерщвляют на 8 день от начала заболевания.

Оценивают следующие показатели:

- визуальные клинические показатели (каждую лапу, шкала 0-3,5) (фиг. 7, А и В);

- опухание/отек суставов (в мм, измеренные циркулем) первой заболевшей лапы, при условии, что это задняя лапа (фиг. 8);

- число лап, охваченных болезнью (фиг. 9);

- показатели эрозии первой заболевшей лапы (разрушение хряща - 0-4, фиг. 10);

- при гистологическом анализе лапы, ставшей первой, в которой развился артрит (фиг. 11);

- уровни антител против коллагена типа ΙΙ (фиг. 12);

- уровни ГО-6 (фиг. 13).

Клиническая тяжесть заболевания.

Как видно на фиг. 7, А и В, клиническая тяжесть заболевания существенно снижается в группах, обработанных 1 мг/мл (Р<0,01) и 0,5 мг/мл (0,01<Р<0,05) τΗΙΕ-18ΒΡ. Мыши, получающие низкую дозу τΗΕ-18ΒΡ (0,25 мг/мл) или высокую дозу в 10 мг/мл, имеют клиническую оценку, подобную оценки группы плацебо. Доза 1 мг/мл ΙΕ-18ΒΡ эффективна приблизительно так же, как интерферон β (обозначенный на фиг. 7А как ΙΕ№).

Воспаление и опухание (отек) суставов.

Макровоспаление (опухание) исследовали, измеряя отек лап от дня 1 после начала болезни до дня 8 окончания эксперимента. Результаты приводятся на фиг. 8, А и В. Эффективными дозами ΙΕ-18ΒΡ являлись 1, 3 и 10 мг/кг. Введение более низких доз не оказывает благоприятного действия на опухание лап. Как видно на фиг. 8, А и В, интерферон β (ΙΕ№) при концентрации 10000 ΜΕ показывает благоприятное действие на опухание лап.

Микросиновит проверяют по окончании эксперимента на гистопатологических срезах и выражают как показатели по шкале (показатель синовита). Результаты по воспалению (отеканию) и показатели синовита сведены в табл.1. Хотя обработка 1Ί1ΙΕ-18ΒΡ при дозировках 1 и 3 мг/кг приводит к тенденции уменьшения опухания, обработка любой дозой ΙΕ-18ΒΡ оказывает только ограниченное действие на воспалительный синовит (табл.1).

Таблица 1. Влияние обработки ΙΕ-18ΒΡ на воспаление суставов

Обработка	Опухание (А1)С, средн.±зет)	Показатель синовита(средн.±зет)
РЫЫ8ВР-6И|3 3 мг/кг	1,55±0,64	2,17±0,5
1 мг/кг	1,53±0,60	1,98±0,4
0,5 мг/кг	3,38±0,70	1,92+0,5
0,25 мг/кг	3,06+0,90	2,08+0,5
Плацебо	3,11±0,77	2,23±0,3

На фиг. 9 показано, что число лап, пораженных болезнью, уменьшается после введения ΙΕ-18ΒΡ. В частности, терапевтические инъекции ΙΕ-18ΒΡ при дозах 1 и 0,5 мг/кг снижали число лап, вовлекаемых в болезнь, что показывает, что блокада ΙΠ-18 ίη у1уо задерживает распространение артрита на другие суставы. Обработка 1 и 0,5 мг/кг ΙΕ-18ΒΡ способна даже вызвать нормализацию пораженных артритом суставов.

Защита от разрушения суставов.

Обработка мышей τΜΕ-18ΒΡ приводит к защите суставов от разрушения (фиг. 10). Система полуколичественной оценки показывает, что по эрозии кости видно зависящее от дозы защитное действие,

- 23 005583 существенное при 10 и 3 мг/кг (Р<0,05, фиг. 10). У мышей, получающих 1 мг/кг гЫЬ-18ВР, эрозия меньше, чем у мышей, получающих только носитель. Защитное действие не обнаружено при дозах 0,5 мг/кг и 0,25 мг/кг. Представлял интерес тот факт, что защитное действие на суставы при дозах 3 и 10 мг/кг гЫЬ18ВР сравнимо и даже более выражено, чем благоприятное действие 10000 МЕ интерферона β (ΣΡΝ-β).

На фиг. 11 показана гистология здорового (А) и больного (В) сустава в сравнении с суставом животного, обработанного !Е-18ВР (С). Срезы сделаны по окончании эксперимента с лап первых, где развился артрит.

В суставе мыши, пораженной артритом, выявляется тяжелый деструктивный артрит с исчезновением хряща и эрозиями и многочисленными инфильтрирующими клетками в воспаленном синовии. В суставе мыши, обработанной гЫЬ-18ВР, хрящ выглядит почти здоровым, несмотря на наличие клеток зоны воспаления в синовиальном пространстве. Хрящевая ткань не только представлена в большем количестве, но и выглядит более гладко.

Обработка антиЧЬ-Ш модулирует уровни антител против коллагена типа ΣΣ.

У мышей СΣА в кровотоке повышены уровни антител Σ§01 и Σд^2а против коллагена типа ΣΣ. Антитела изотипа Σ§01 ассоциировались с заболеваниями, опосредуемыми ТН2, в то время как антитела изотипа ΣβΟΣπ и изотипа Σ§Θ2Β ассоциируются с заболеваниями, опосредуемыми ТН1.

Определяют изотипы антител Σ§01 и Σд^2а против коллагена типа ΣΣ (СП) в сыворотке животных, обработанных Ш-^ВР (фиг. 12). Содержание изотипов Σ§01 и Σд^2а анти-СП не изменяется существенно на 4 или 8 день (Ό4, Ό8) клинической болезни. Однако после 8 дней обработки гЫЬ-18ВР наблюдается уменьшение отношения Σд^1/Σд^2а в 2,6 и 3,4 раза при дозах 1 и 3 мг/кг, соответственно. На фиг. 12 отражен эксперимент, при котором используют 3 мг/кг. По существу, такие же результаты получают с использованием 1 мг/кг гЫЬ-18ВР. Пониженное отношение Σ§01/ Σд^2а антител против СП указывает на пониженную концентрацию антител против коллагена типа ΣΣ изотипа ΣβΟΣπ и повышенную концентрацию антител против коллагена типа ΣΣ изотипа Σ§01, что наводит на мысль, что в данной модели артрита имеется смещение в сторону заболевания, опосредуемого ТН2.

Снижение уровней ΣΕ-6 после нейтрализации ΣΗ-18.

Для того чтобы получить представление о действии блокады ΣΗ-18, измеряли содержание ΣΕ-6 в сыворотке животных, обработанных ^-^ВР. На фиг. 13 показано, что содержание биологически активного ΣΕ-6 существенно уменьшается у животных, получающих ^-^ВР, при всех измеренных дозах, т.е. 1, 3 и 10 мг/кг, так же, как в случае интерферона β (ΣΕΝΒ). Иммунноактивные уровни ΣΕ-6, измеренные в сыворотке животных, обработанных 3 мг/кг гЫЬ-18ВР, существенно ниже (Р < 0,0023), чем у животных, обработанных физиологическим раствором. Сывороточные уровни ΣΕ-6 у больных животных, обработанных 1, 3 или 10 мг гЫЬ-18ВР или 10000 МЕ ΣΕΝ-β, схожи с уровнями в нормальной мышиной сыворотке (ΝΜ8), полученной от здоровых животных, т.е. от животных, не имеющих воспалительного заболевания.

Полученные результаты показывают, что ΣΗ-18 регулирует уровни ΣΕ-6 в начале заболевания. Так как ΣΕ-6 являлся маркером воспаления, такие результаты показывают, что обработка больных мышей ΣΕ18ВР снижает воспаление у животного.

Из описанных выше экспериментов можно сделать следующие выводы:

- введение ^-^ВР уменьшает клиническую тяжесть артрита;

- Ш-^ВР ингибирует дальнейшее развитие или распространение болезни;

- введение ^-^ВР уменьшает отек;

- введение ^-^ВР уменьшает разрушение хряща;

- после лечения Ш-^ВР снижались сывороточные уровни ΣΕ-6 и уменьшается отношение ΣβΟΙ/ΣβΟΣπ.

Данные, представленные выше, показывают, что нейтрализация биологической активности ΣΕ-18 после начала заболевания представляет собой противоревматическую терапию, модифицирующую заболевание. Результаты четко показывают, что блокада ΣΕ-18 снижает клиническое развитие артрита и, что более важно, задерживает развитие разрушения хряща и костей. Следовательно, блокада ΣΕ-18 с помощью ^-^ВР, антител против ΣΕ-18 или любым другим блокирующим ΣΕ-18 средством представляет собой новую противоревматическую терапию, модифицирующую заболевание.

Приведенное выше описание конкретных вариантов воплощения изобретения показывает общий характер изобретения, так что другие специалисты, применяя имеющиеся знания, легко модифицировали и/или адаптировали такие конкретные варианты для разных применений без отхода от основной концепции, следовательно, такие адаптации и модификации должны быть включены и предназначены для включения в замысел и пределы эквивалентов описанных вариантов. Следует иметь в виду, что фразеология или терминология, используемые в данном описании, имеют целью описание, а не ограничения.

Часть ΣΣΣ. Примеры 11 и 12, относящиеся к воспалительному заболеванию кишечника.

Пример 11. Экспрессия Ш-^ВР эндотелиальными клетками и макрофагами во время активной болезни Крона.

- 24 005583

Сбор образцов.

Образцы интестинальных слизистых тканей извлекают при иссечении образцов, взятых у пациентов с СО или ИС. Включают четырнадцать пациентов с СО (трех мужчин и одиннадцать женщин), средний возраст 37,8 лет (интервал 20-78 лет), длительность заболевания 8,3 года (интервал 1-21 год). У восьми пациетов болезнь локализована в подвздошной кишке и у шести - в ободочной кишке. Двенадцать пациентов принимают иммунодепрессивные средства. Диагноз СО поставлен с помощью гистопаталогический проверки и основан на следующих критериях: наличие язв, повышенное число клеток воспалительного инфильтрата и трансмуральное воспаление. Идентифицируют семь пациентов с активной СО и семь пациентов с неактивной болезнью. Существенных различий по возрасту, локализации болезни, полу, лекарственной терапии и длительности заболевания между пациентами с активной и неактивной СО не было. Средний возраст 5 пациентов с ИС (трое мужчин и две женщины) 37,6 лет (интервал 30-44 года). У всех пациентов болезнь локализована в ободочной кишке, и всех лечили иммуннодепрессивными средствами. Средняя продолжительность заболевания 4 года (интервал 1-9 лет). Контрольные образцы берут у 5 пациентов, подвергающихся резекции по поводу расстройств, не связанных с ΙΡΩ (трое мужчин и две женщины). Средний возраст этой группы 55,2 года (интервал 24-76 лет). У всех пациентов болезнь локализована в ободочной кишке.

Полуколичественная ОТ-ПЦР для ΙΠ-18 человека и ΙΕ-18ϋρ.

Полную РНК экстрагируют из замороженных образцов интестинальной ткани пациентов с СО, с ИС или контроля. Экстракцию РНК осуществляют с использованием тризола (С1Ьсо) согласно рекомендациям изготовителя. Полученные образцы оценивают количественно, измеряя поглощение при 260 нм. Целостность РНК анализируют методом электрофореза на 1% агарозных гелях. Синтезируют кДНК из 1 мкг полной РНК с использованием системы обратной транскрипции Рготеда согласно схеме изготовителя. Реакции ПЦР проводят в общем объеме 50 мкл в присутствии 1 Е ДНК-полимеразы АтцИТац (Регкш Е1тег, Воске, США), 2,5 мМ бЭТР (Атешкат, США) и 50 пмоль прямых и обратных праймеров ПЦР. Реакционные смеси инкубируют в термоячейке РТС-200 РеШег ЕГГес! (М1 Векеагсй, США) в следующих условиях: денатурация - 1 мин при 94°С, ренатурация - 1 мин при 55°С и растяжение - 1 мин при 72°С. Определяют оптимальное число циклов для ^-^ВР, ΙΠ-18 и β-актина до насыщения полос (соответственно, 31, 28 и 25). Создают следующие праймеры ПЦР на основе опубликованных последовательностей (АЕ110799, Ό49950, Х00351): Ш-18, обратный - 5'-СССТСАСТАСАСТСАССТАА-3'; прямой -5'СССТАСАССТАТСССТСТАА-3'; Ш-18ВР, прямой - 5'-АССТСТСТАССТССАСТСАА-3'; обратный 5'-ССАССААСАТАССААСТСТС-3'; β-актин, обратный - 5'-ССАССАССААТСАТСТТСАТСТТС-3'; прямой - 5'-ССТСАССАТССАТСАТСАТАТССС-3'. Для того чтобы исключить амплификацию геномной ДНК, загрязняющей образцы, реакции ПЦР проводят в отсутствие матрицы кДНК. Продукты ПЦР (10 мкл) анализируют на 1% агарозных гелях при электорофорезе в буфере 1хТАЕ. Размер продуктов ПЦР подтверждают путем сравнения с цепью длиной 1 т.п.н. (С1Ьсо) после окрашивания гелей. Определяют относительное количество полос, окрашенных этидийбромидом в УФ-свете с использованием аналитического программного обеспечения Кобак ЭщШ-б 8с1епсе5, и результаты приводят в виде соотношения гена-мишени (ЫЬ-18ВР, ЫЬ-18) и обязательных генов (Ηβ-актин).

Получение моноклональных антител, направленных против ЫЬ-18ВР.

Мышам ВАЬВ/с подкожно в четыре конечности, а также в загривок вводили 50 мкг изоформы гЫЬ18ВР-61Й5 (выделенного в чистом виде из клеток яичника китайского хомячка, Ше^Нат ЬаЬогайэпек, Νε8 2юпа, Израиль) в РВ8 с адъювантом (эмульсия МРЬ+ТОМ, ΒΙΡΙ ЕптипосНет Векеагсй, Шс.) в дни 0, 7 и 28. Через 4 дня после 3-й иммунизации получают лимфоузлы и гидролизуют 2,4 мкг/мл коллагеназы (коллагеназа Ιν, ХУоПЫпЦоп, Вюс11е1шса1 Согц.) и 0,1% ДНКазы (81дта). Затем выделенные клетки сливают с миелоидными клетками 8ρ2/0 с использованием ПЭГ-1000 (ЕЬИКА). Клетки ресуспендируют в ЭМЕМ-Е12, 10% ЕС8 (С1Ьсо) в присутствии НАТ (гипоксантин, аминоптерин, тимидин) и распределяют в 96-луночные планшеты в концентрации 5х10^-4 клеток/мл. Образцы супернатантов гибридомных культур скринируют на присутствие реакционноспособных антител при анализе прямым скринингом. Для этого планшеты для ЕЫ8А сенсибилизируют козьими антимышиными антителами Е(аЬ')₂ Цаскюп Ιιтипо Векеагсй, Мбап апа1убса, Швейцария), добавляют супернатанты гибридомных культур и затем биотинилованный гЫЬ-18ВР-6Ы5 (выделенный в чистом виде из клеток СО8, как описывается в Хо\зск е! а1., 1999 г.) с добавлением или без гЫЬ-18 (выделенного в чистом виде из рекомбинантной Е.соН, 8егопо РНагтасеибса1 Векеагсй ЕМШИе, Женева) и, наконец, проявляют стрептавидином и пероксидазой хрена (НРВ) (баск5оп Ι^πμ Векеагсй, Мбап апа1убса, Швейцария) с использованием о-фенилендиамина (ОРЭ) (81дта). Отбирают ненейтрализующие антитела и субклонируют. При таком исследовании использовали мышиные моноклональные антитела Ι§Ο1 95-Н20.

Иммуногистохимические исследования локализации клеток, положительных в отношении ΙΕ-18Ερ.

Образцы ткани быстро замораживают и хранят при -80°С. Получали серийные криостатные срезы (10 мкм), заключают в среду на покрытых поли-Ь-лизином стеклянных пластинах 8иρе^Г^05/Р1и5 (Ро1уаЬо, Р1ап-1е5-Оиа1е5, Швейцария) и фиксируют в охлажденном льдом ацетоне. Локализацию белка ^-^ВР человека анализируют методом иммуногистохимии с использованием МаЬ 95-Н20. После крат

- 25 005583 кой повторной гидратации в РВ8 срезы предварительно инкубируют в течение 30 мин в РВ8 с добавлением 2% фетальной телячьей сыворотки (Е8С) (Сапкега, Онтарио, Канада), 1% сыворотки человека (сыворотка АВ⁺, Τ^аη5ίи5^оη Сеп!ег, Аннемасс, Франция) и 0,5% бычьего сывороточного альбумина (В8Л) (81дта, Сент-Луис, Миссури, США). Активность эндогенной пероксидазы блокируют, помещая пластины в раствор РВ8 с 2% Е8С, 1% сыворотки человека, 0,5% В8Α и 1% пероксида водорода (Н₂О₂) (Р1ика, Швейцария) на 1 ч. После промывки РВ8 срезы инкубируют в течение ночи с неразведенным культуральным супернатантом МаЬ 95-Н20. После еще одной промывки РВ8 срезы инкубируют в течение 1 ч с биотинилированными козьими антимышиными антителами Цасккоп Iттиηо ВекеагсЬ, М11ап апа1уйса, Швейцария) (5 мкг/мл) в РВ8, содержащем 0,5% В8Α. Чувствительность к окрашиванию повышали путем инкубации с комплексом авидинОН/биотинилированного НИР (Уес1айа1ш БШе ЛВС Кй, Уес!ог ЬаЬога!опе8, Калифорния, США) в течение 30 мин. Затем пластины промывают РВ8 и проявляют с использованием раствора 30% Н₂О₂, 3,3-амино-9-этилкарбазола (АЕС) (81дта) и Ν,Ν-диметилформамида (Мегск) в ацетатном буфере, рН 5. После контрокрашивания гематоксилином (81дта) срезы покрывают глицерином и используют покровные стекла. В качестве изотипического контроля используют мышиные антитела ΙβΟ1 (система И и Ό).

Для того чтобы идентифицировать клеточную локализацию Ш-18ВР человека, проводят два иммуногистохимических исследования с окрашиванием на срезах слизистой оболочки кишечника. После повторной гидратации в РВ8 в течение 10 мин срезы предварительно инкубируют в РВ8 с добавлением 2% РС8, 1% сыворотки человека и 0,5% В8Α. Для солокализации с эндотелиальными клетками срезы инкубируют в течение ночи с биотинилированными МаЬ 95-Н20 (20 мкг/мл), смешанными с мышиными античеловеческими СО31, конъюгированными с ЕЕГС (1:50) (РЬагтшдеп, Калифорния, США), в РВ8/0,5% В8Α. Для солокализации с макрофагами срезы инкубируют в течение ночи с биотинилированными МаЬ 95-Н20 (20 мкг/мл), смешанными с античеловеческими СП68, конъюгированными с МТС (1:25) (Пако, Дания). После промывки в РВ8 в течение 1 ч добавляют стрептавидин Τеxа8-Κеб (8ои!Ьегп Вю!есЬпо1оду Α88ос^а!е8, ΑΒ, США). Пластины снова промывают, срезы покрывают мовиолом, и применяют покровные стекла. В качестве изотипического контроля используют биотинилированные мышиные антитела ЦС1 (РЬагтшдеп), а затем стрептавидин Τеxа8-Κеб.

Клеточная культура.

Культивировали эндотелиальные клетки пупочной вены человека (НИУБС) (С1опейс8 Согр., СанДиего, Калифорния) с использованием среды для выращивания эндотелиальных клеток (ИСМ) с добавлением рекомбинантного эпидермального фактора роста человека (ΗΕΟΕ) (10 нг/мл), гидрокортизона (1 мкг/мл), гентамицина и амфотерицина В (50 мкг/мл), экстракта бычьего головного мозга (ВВЕ) (3 мг/мл) и 2% фетальной телячьей сыворотки (ЕВ 8) (С1опе-йс§ Согр., Сан-Диего, Калифорния), согласно рекомендациям изготовителя. В чашки с культурами тканей предварительно наносили слой фибронектина человека (10 мкг/см²) (ВоеНппдег, Маннгейм). Клетки инкубировали во влажной камере с 5% СОг, и эксперименты осуществляли с использованием клеток НиУЕС в 3-ем пассаже. Клетки НиУЕС обрабатывали ЕЛ-1 β человека (10 нг/мл), ΤΝΕα (10 нг/мл) и ΙΓΝγ (20 нг/мл) (системы И и Ό, Германия) в течение 24

ч. По окончании периода культивирования клетки собирали, выделяли ДНК и подвергали ОТ-ПЦР для анализа транскриптов мРНК Ш-18ВР и ЕЛ-18. Супернатанты собирали, и в них анализировали экспрессию белка Ш-18ВР и ЕЪ-18 методом ΕΕΙ8Α.

Линию моноцитов человека ТНР-1 поддерживали в суспензионной культуре в среде ΚРМI с добавлением 10% инактивированной нагреванием ЕС8, Б-глутамина (2 мМ), пенициллина-стрептомицина (10 Е/мл) (С1Ьсо ВВБ, БгГе ΤесНηо1од^е5) и β-меркаптоэтанола (50 мкМ) (Е1ика). Клетки инкубировали во влажной камере с 5% СО₂ и пассировали при 1:10 каждые 5 дней. За три дня до эксперимента моноциты человека были дифференцировании при плотности 0,4х10⁶ клеток/мл витамином Ό3 (80 нМ) (Вюшо1 ВекеагсЬ БаЬога!ойе8, США) и их оставляли для прикрепления. После дифферецировки к клеточной культуре добавляли БР8 (100 нг/мл) (Са1ЬюсЬеш), ЕЬ-1 β человека (10 нг/мл), ΤΝΕα (10 нг/мл) и ΙΓΝγ (20 нг/мл). Через 48 ч суспернатанты собирали и в них определяли экспрессию ΙΌ-18ВР и ΙΒ-18 методом ΕΕΙ8Α.

Измерение продукции Ш-18ВР и ΙΒ-18 человека.

Наличие Ш-18ВР оценивали методом ΕΕΙ8Α в бесклеточных супернатантах НиУВС, нестимулированных и стимулированных в течение 24 ч смесью цитокинов (ΙΒ-1 β, ΤΝΕα, ΙΓΝγ), а также клеточной линии ТНР-1, нестимулированной и стимулированной в течение 24 ч смесью цитокинов (БР8, ΙΒ-1β, ΤΝΕα, ΙΓΝγ). Для этого на планшеты в течение ночи наносили иммобилизованные МаЬ (клон 657.27 в количестве 0,5 мкг на 100 мкл на лунку, ЕиегрНагт БаЬогаЮпец 2юпа, Израиль), направленные против гЫБ-18ВР (изоформа а). Затем определяли растворимый гЫБ-18ВР с использованием кроличьих поликлональных антител (разведение 1/10000), направленных против гЫБ-18ВР-6Ы5 (выделен в чистом виде из клеток яичника китайского хомячка, ЕНегрНагт БаЬогаЮпец 2юпа, Израиль), с последующей инкубацией с аффинным очищенным козьим антикроличьим ЦС, конъюгировнным с пероксидазой (разведенным 1/20000) (Заскюп Iттиηо ВекеагсЬ, М11ап апа1уйса, Швейцария). Иммобилизованные МаЬ, а также кроличьи поликлональные антитела тестировали методом вестерн-блоттинга для подтверждения

- 26 005583 специфичности к 1Ь-18ВР. Рекомбинантный гЫЬ-18ВР-6Ы5 использовали в качестве стандарта. Чувствительность ЕЬ18А 100 пг/мл. Параллельно определяли количество 1Ь-18 с использованием набора для ЕЫ8А для 1Ь-18 человека (МВЬ, 1ттиио1есй). Чувствительность ЕЫ8А составляла 12,5 пг/мл.

Экспрессия гЫЕ-18ВРа-Н15б в клетках СНО.

Рекомбинантный 1Ь-18ВР человека (гЫЬ-18ВРа, метка Ηίδ6) выделяли в чистом виде из клеток яичника китайского хомячка (1п1егр11агт ЬаЬогаФпез, №з 2юпа, Израиль).

Результаты.

Экспрессия транскриптов мРНК 1Ь-18ВР в интестинальных биоптатах.

Анализ экспрессии мРНК 1Ь-18ВР осуществляли методом ОТ-ПЦР в гомогенатах тканей полученных при операции образцов ободочной кишки пациентов с активной СО или неактивной СО или с ИС и без воспаления тканей кишечника (фиг. 14). Транскрипты 1Ь-18ВР и актина обнаруживали во всех испытанных интестинальных гомогенатах. Подобным образом, транскрипты 1Ь-18 обнаруживали во всех гомогенатах тканей в случае СО, ИС или контроле без 1ВЭ (фиг. 14А). Отношение 1Й-18ВР или 1Ь-18 к уровням контрольной мРНК актина показывает значительное возрастание (как описано ниже) количества транскриптов в биоптатах как 1Ь-18ВР, так и 1Ь-18, полученных у пациентов с активной СО по сравнению с биоптатами пациентов с неактивной СО, ИС или контроля без 1ВЭ (фиг. 14, В и С). Такие данные показывали, что 1Ь-18ВР активируется в ткани слизистой оболочки во время активной СО, и являлись первым доказательстовом того, что уровень экспрессии 1Ь-18ВР четко отличает активную СО от неактивной СО, ИС и контроля без 1ВЭ.

Статистический анализ экспрессии транскриптов мРНК 1Ь-18ВР в интестинальных биоптатах.

Анализ дисперсии осуществляли, собирая вместе все доступные данные. Отклик ясно показывает статистический выброс, относящийся к результатам для одного из пациентов из группы с активной СО (очень высокое отношение ΟΌ для 1Ь-18, а именно 16252, и низкое отношение ΟΌ для 1Ь-18ВР, а именно 1058). Единственная и очень атипичная пара измерений не дает возможности непризнания выборки беспристрастной по модели ΛΝΟνΛ (величина р по критерию Шапиро-Уилкса для нормальности остатков < 0,0001). Поэтому решено игнорировать указанную пару измерений при статистическом анализе.

Используемая модель АNΟVА принимает в расчет фактор группы (контроль, активная СО, неактивная СО и ИС), белок (ЕС-18 или 1Ь-18ВР) и число пациентов (23 пациента). Имеется значительное различие в группе (величина р < 0,0001). Также интересно отметить, что различие отношения ΟΌ между 1С-18 и 1Ь-18ВР не существенно (величина р = 0,369). Кроме того, выполнена также корреляция между экспрессией 1С-18 и 1Й-18ВР. Коэффициент корреляции между 1С-18 и 1Й-18ВР равен 0,67, что предполагает наличие строгой связи между отношением ΟΌ, измеренным для 1С-18 и 1Ь-18ВР. Далее, для результатов, касающихся эффекта группы, использовали метод 8сйеГГе для сравнения различных групп. Можно сделать вывод, что отношение ΟΌ для активной СО существенно выше, чем для контроля ( + 3280), ИС (+2590) и особенно неактивной СО ( + 4580) как для экспрессии 1С-18, так и для экспрессии [С-18ВР.

Иммуногистохимическая локализация 1Й-18ВР в тканях кишечника.

Для того чтобы оценить клеточную экспрессию 1Ь-18ВР ίΐ'ΐ Щи, с использованием специфичесих моноклональных антител против ЫЕ-18ВР выполняли иммунногистохимические исследования на криостатных срезах, полученных из тканей кишечника пациентов с активной СО и контроля без 1ВЭ. Клетки, положительные в отношении 1Ь-18ВР, обнаруживались в собственной пластинке, слое ткани под слизистой оболочкой и в мышечной пластинке слизистой оболочки (не показано). Положительно окрашенные клетки, присутствующие в собственной пластинке и слое ткани под слизистой оболочкой, обладали обильной цитоплазмой, везикулярными сетевидными ядрами и морфологически напоминали тканевые макрофаги. В мышечной пластинке слизистой оболочки положительно окрашенные клетки имели обильную цитоплазму с открытым некоторое время просветом в середине, что предполагает положительное окрашивание капилляров, и морфологически напоминали эндотелиальные клетки. Крупные сосуды также специфически окрашивались моноклональными антителами против ЫЕ-18ВР. Существенное увеличение числа положительно окрашенных клеток, наблюдаемое в образцах, полученных у пациентов с активной СО, по сравнению с образцами, полученными в контроле без 1ВЭ, коррелирует с повышенной экспрессией 1Ь-18ВР, наблюдаемой при анализе методом ОТ-ПЦР. Смежные срезы инкубировали с соответствующим мышиным изотипическим контролем.

Идентификация клеток, продуцирующих 1Ь-18ВР, в биоптатах слизистой оболочки.

Клетки, положительные в отношении 1Ь-18ВР, присутствующие в воспаленных тканях кишечника, идентифицировали с использованием специфических маркеров макрофагов (анти-СО68) и эндотелиальных клеток (анти-СЭ31) (не показано). С.'О68-положительные клетки (зеленый цвет) и 1Ь-18ВРположительные клетки (красный цвет) обнаруживаются в собственной пластинке и слое ткани под слизистой оболочкой тканей кишечника при активной СО (не показано). СЭ31 -положительные клетки (зеленый цвет) и 1Ь-18ВР-положительные клетки (красный цвет) обнаруживаются в слое ткани под слизистой оболочкой. Для того чтобы подтвердить, что макрофаги и эндотелиальные клетки также являются 1Ь-18ВР-позитивными, оба цвета - зеленый от анти-СЭ68 или анти-СЭ31 и красный от анти-1Ь-18ВР анализировали вместе, при этом показали, что все клетки, связывающие антитела против 1Ь-18ВР, являлись или СП68-положительными, или СП31-положительными (оранжево-желтый цвет). Двойное иммун

- 27 005583 ное окрашивание показало, что макрофаги и эндотелиальные клетки являлись основным источником окрашивания 1Ь-18ВР в воспаленных тканях, полученных у пациентов с СО.

Экспрессия мРНК 1Ь-18ВР и белка эндотелиальными клетками.

Для того чтобы исследовать способность эндотелиальных клеток человека продуцировать 1Ь-18ВР, а также подтвердить результат, полученный при иммунноокрашивании и ОТ-ПЦР на общих биоптатах, осуществляли дальнейшие эксперименты методом ОТ-ПЦР на эндотелиальных клетках пупочной вены человека (НИУЕС) (фиг. 15А). Эндотелиальные клетки обрабатывали смесью цитокинов (1НИ-1 β, ΤΝΕα, ΙΕΝγ) и собирали через 24 ч для экстракции РНК и ПЦР-анализа. Отношение содержания 1Ь-18ВР к уровням контрольной мРНК актина свидетельствовало о возрастании через 24 ч количества транскриптов 1Ь-18ВР в обработанных клетках по сравнению с нестимулированными клетками. Кроме того, оказалось, что в эндотелиальных клетках, по-видимому, существенно экспрессируется мРНК 1Ь-18ВР. Также анализировали уровень мРНК 1Ь-18ВР и выявили его слабое повышение в обработанных клетках. Однако мРНК 1Ь-18ВР не экспрессировался в нестимулированных эндотелиальных клетках.

Исследование методом ЕЬ18Л культуральных супернатантов нестимулированных клеток (среда) и НИУЕС, обработанных в течение 24 ч, показало, что белок 1Ь-18ВР присутствует как в среде, так и в стимулированных клетках, возрастая в 30 раз после 24-часовой стимуляции (фиг. 15В).

Экспрессия белка 1Ь-18ВР клеточной линией моноцитов (ТНР-1).

Экспрессию 1Ь-18 и 1Ь-18ВР анализировали в культуральных супернатантах нестимулированных и стимулированных дифференцированных клеток ТНР-1 методом ЕЫ8Л (фиг. 15С). В этом эксперименте пбыло выявлено усиление экспрессии 1Ь-18ВР после 48-часовой стимуляци ЬР8, ЫЬ-ф, ΤΝΕα, ΙΕΝγ. Одновременно с этим после стимуляции повышается секреция 1Ь-18 (фиг. 15С).

Резюме.

В настоящем исследовании охарактеризована экспрессия и локализация 1Ь-18ВР в ткани слизистой оболочки пациентов с болезнью Крона и неспецифическим язвенным колитом. С использованием схемы полуколичественной ОТ-ПЦР обнаружено, что количество транскриптов мРНК 1Ь-18ВР в биоптатах слизистой оболочки пациентов с активной болезнью Крона выше по сравнению с биоптатами пациентов с неспецифическим язвенным колитом и контроля без воспаления. Иммуногистохимический анализ биоптатов слизистой оболочки показал, что белок 1Ь-18ВР локализуется в эндотелиальных клетках и макрофагах, инфильтрирующих слизистую оболочку во время болезни Крона. Экспрессия 1Ь-18ВР эндотелиальными клетками и активированными макрофагами подтверждается в первичных эндотелиальных клетках пупочной вены человека (НИУЕС) и клеточной линии моноцитов ТНР1, стимулированных ίη νί!το. После стимуляции указанные клетки секретируют биологически активный 1Ь-18ВР.

Пример 12. Обработка ингибиторами 1Ь-18 дает улучшения при экспериментальном колите.

Материалы и методы.

Мыши и индукция колита.

Все эксперименты разрешены Комитетом по этике исследований на животных Амстердамского университета. Мышей ВЛЬВ/с получали в Наг1ап 8ргадие Эа\\'1еу 1пс. (Хорст, Нидерланды). Мышей содержали в стандартных условиях и обеспечивали питьевой водой и кормом (АМ-ΙΙ 10 мм, Норе Еагтз, Нидерланды).

Эксперименты проводили на самках мышей ВАЕВ/с в возрасте 8 и 10 недель. Колит индуцировали путем ректального введения двух 2-мг доз (с 7-дневным интервалом) 2,4,6-триниробензолсульфоновой кислоты (ΤΝΕ3) (81§та С1ет1са1 Со., Сент-Луис, Миссури, США) в 40% этаноле (Мегск, Дармштадт, Германия) с использованием винилового катетера, который вводили в анус на 3 см (10 мышей на группу). Во время инстилляции мышам давали наркоз с использованием изофлурана (дифторметиловый эфир 1-хлор-2,2,2-трифтор-этилизофлурана, АЬЬой ЬаЬога!ог1е8 Ь!б., ОиеепЬогоидй, Кент, ИК), и после инстилляции их держали вертикально в течение 60 с. Контрольных мышей подвергали идентичной процедуре, но инстиллировали физиологический раствор. Всех мышей умерщвляли на 9 день после первого введения ТИВ8 (т.е. через 48 ч после второго введения ΤΝΕ3).

Мышей обрабатывали интраперитонеально 1Й-18ВР человека в 500 мкл 0,9% физиологического раствора.

Н1Й-18ВР является 6-кратно меченым гистидином рекомбинантным белком человека, полученным в экспрессирующей системе СНО. Н1Й-18ВР биологически активен, так как ингибирует продуцирование ΙΕΝγ в клеточной линии КС-1 и снижает продуцирование ΙΕΝγ клетками слезенки мыши (К1т е! а1., 2000).

Оценка воспаления.

Ежедневно регистрировали массу тела. После умерщвления собирали селезенки, каудальные лимфоузлы и ободочные кишки. Ободочную кишку удаляли через умеренный разрез и вскрывали в продольном направлении. После удаления фекального материала регистрировали массу во влажном состоянии дистального участка в 6 см и использовали в качестве показателя связанного с заболеванием утолщения интестинальной стенки. Затем ободочную кишку в продольном направлении разделяли на две части, одну из которых использовали для гистологической оценки.

- 28 005583

Гистологический анализ.

Ободочные кишки, разделенные в продольном направлении, скатывали, фиксировали в 4% формалине и заливали парафином для обычной гистологии. Два исследователя, производившие обработку мышей слепым методом, проводили оценку следующих параметров: 1) процента пораженной площади, 2) гиперплазии фолликулярных агрегатов, 3) отека, 4) эрозии/изъязвления, 5) утраты крипты и 6) инфильтрации моно- и полиморфноядерных клеток. Процент пораженной площади и утрату крипты оценивали по шкале в интервале от 0 до 4 следующим образом: 0 - нормальное состояние; 1 - менее 10%; 2 - 10%; 3 - 1050%; 4 - свыше 50%. Эрозию определяли как 0, если эпителий без изменений, как 1 - в случае поражения собственной пластинки, как 2 - в случае поражения слоя ткани под слизистой оболочкой и как 3 - в случае, если изъязвления трансмуральные. Степень тяжести других показателей оценивали по шкале от 0 до 3 следующим образом: 0 - отсутствие; 1 - слабое проявление; 2 - умеренное и 3 - тяжелое. Такая шкала заключает в себе от 0 до 26 точек максимум.

Гомогенаты ободочной кишки.

Из ободочной кишки получали гомогенаты с помощью гомогенизатора тканей в 9 объемах буфера Гринбургера для лизиса (300 мМ №С1, 15 мМ трис, 2 мМ МдС1₂, 2 мМ тритона (Х-100), пепстатин А, лейпептин, апротинин (всех по 20 нг/мл), рН 7,4). Ткани лизировали в течение 30 мин на льду с последующим двукратным центрифугированием (10 мин, 14000 д). До использования гомогенаты хранили при -20°С.

Клеточная культура и ЕЫ8А для определения цитокинов.

Для получения суспензии клеток селезенки и каудальных лимфоузлов использовали сетчатые фильтры с фильтрующими ячейками (Вес1оп/Бюкткоп БаЬ^аге, Нью-Джерси, США). Клетки суспендировали в среде ВРМ1 1640 (В^οVЫ!ΐаке^-Вοейπηде^, Вервьерс, Бельгия), содержащей 10% ГС8 и ципроксин (10 мкг/мл) (8щта Сйет1са1 Со., Сент-Луис, Миссури, США). Клетки селезенки центрифугировали со стерильным фиколлом (Рйагтааа, Упсала, Швеция), одноядерные клетки переносили в КРМ1 и проводили подсчет клеток в клеточной суспензии. Клетки общим числом 1 х 10⁵ на мышь инкубировали при трехкратном повторе в лунках в 200 мкл ВРМ1 (В^ο\V^иаке^ Еигоре, А СатЬгех Сотрапу, Вервьерс, Бельгия), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки. Клетки стимулировали путем предварительного нанесения слоя антител против СБ3 (концентрация 1:30; клон 145.2С11) и растворимых антител против СБ28 (концентрация 1:1000; Рйагтшдеп). Через 48 ч удаляли супернатанты и методом анализа ЕЫ8А измеряли концентрации ΙΕΝ-γ (Рйагтшдеп) и ТА-α (В&Б кук!етк, Абингдон, Объединенное Королевство).

Проточная цитометрия.

Выделенные клетки селезенки промывали буфером Гаск (РВ8, содержащим 0,5% В8А, 0,3 ммоль/л ЭДТК и 0,01% азида натрия) и оставляли на льду для выполнения оставшейся процедуры. Клетки (2^.10⁵ клеток на лунку, 96-луночный микропланшет с У-образными лунками, Сгепег В.У. 1аЬог !есйшек, А1реп аап бе Вуп, Нидерланды) инкубировали со следующими антителами (тАЬк): крысиными антимышиными СБ4, конъюгированными с Су-хромом (клон ВМ4-5), крысиными антимышиными СБ69, конъюгированными с Е1!с, и крысиными антимышиными СБ25, конъюгированными с Е1!с (Рйагтшдеп, Сан-Диего, Калифорния). Лимфоциты направляли с помощью переднего и бокового рассеивателя с использованием проточного цитометра ЕАС8сап в сочетании с программным обеспечением Еасксап (Вес!оп Бюкшкоп, Моип!ат У1ете, США) и отсчитывали 5000 клеток. Результаты выражали в процентах пропущенных клеток, положительных в отношении используемых тАЬк.

Статистический анализ.

Величины приводятся как среднее и 8ЕМ для обработанной группы. Различия между группами анализируются с использованием непараметрического и-критерия Манна-Уитни. Изменения массы со временем анализируются методом одностороннего дисперсионного анализа. Значимым считается Р<0,05. Для всех анализов используется статистическое программное обеспечение 8Р88 (8Р88 Ечс., Чикаго, США).

Результаты.

ЕБ-18ВР защищает от потери массы на мышиной модели колита.

Для того чтобы исследовать роль ΙΕ-18 при экспериментальном колите и, в частности, защитное действие ΙΕ-18-связывающего белка (ΙΠ-18ВР), у мышей ВАБВ/с индуцировали ТИВ8-колит. Данная модель включает в себя локальное воздействие тринитробензолсульфоновой кислоты (ТХВ8) в 40% этаноле. Она вызывает гиперчувствительную реакцию замедленного типа на гаптен(тринитрофенил)модифицированный аутоантиген, и реакция являлся реакцией типа Т1 1 с усиленным продуцированием провоспалительных цитокинов.

Мышей ежедневно обрабатывали интраперитонеально (1р) ЕБ-18ВР человека или контролем.

Ежедневные интраперитонеальные дозы в интервале от 12,5 до 50 мкг ЫБ-18ВР не влияли на тяжесть заболевания (данные не приводятся). Однако использование дозы в 200 мкг ЫБ-18ВР, вводимой интраперитонеально ежедневно, явилось эффективным для уменьшения потери массы в связи с индукцией заболевания.

- 29 005583

Как и ожидалось, интраректальная инстилляция ΤΝ^ приводит к диарее и истощению. Как видно на фиг. 16, животные в обеих обработанных группах теряли 15% от исходной массы на день 3. Однако в отличие от контрольных мышей, начиная с 4 дня после инстилляции ΤNΒ§, животные, обработанные ЫЬ-18ВР, быстро восстанавливали начальную потерю массы, возвращаясь к исходной массе тела на день

8. У контрольных мышей второе введение в день 8 снова приводит к значительной потере массы, которое, по существу, предотвращается введением ЫЬ-18ВР. Введение ЫЬ-18ВР мышам, обработанным физиологическим раствором, эффекта не имеет (данные не приводятся). Следовательно, введение ЫЬ18ВР существенно ослаблял потерю массы, связанную с колитом, индуцированным ΤNΒ§ (ρ<0,05).

Действие на параметры воспаления.

На 10 день мышей умерщвляли и определяли массу последних 6 см ободочной кишки (фиг. 17А). При ΤNΒ§-колите масса ободочной кишки возрастала по сравнению с массой ободочной кишки у мышей, обработанных физиологическим раствором. Такое возрастание массы существенно меньше у мышей, обработанных ЫЬ-18ВР (181,6 мг ± 11,4 по сравнению с 268 мг ± 27,3 у мышей, обработанных физиологическим раствором ((р<0,05)). Ранее сообщалось, что 'ГИВ^-колит ассоциируется с повышенной миграцией клеток в каудальные лимфоузлы (Сатодйо с1 а1., 2000). Обработка ΙΌ-18ВР снижала число клеток, проникающих в каудальный лимфоузел по сранению с числом клеток в каудальном лимфоузле ΤNΒ§-мышей (мышей с ΤNΒ§-колитом), обработанных физиологическим раствором (фиг. 17В).

Изменения экспрессии 0Ό69, являющиеся ранним маркером активации Т-лимфоцитов, определяли анализом Еаасап (фиг. 17С). Процент клеток селезенки ΟΌ4', экспрессирующих ΟΌ69, у мышей, обработанных ΤΝΈ8, составлял 11,4%, но у ΤNΒ§-мышей, обработанных ЫЬ18-ВР, процент ΟΌ4'/ΟΌ69' составлял 7,3% (Р<0,05).

Продуцирование цитокинов селезенкой, каудальными лимфоузлами и гомогенатами ободочной кишки.

Для того чтобы исследовать действие ЫЬ-18ВР на способность Т-лимфоцитов осуществлять синтез провоспалительных цитокинов после активации Т-клеточного рецептора, выделяли клетки из каудального лимфоузла и селезенки и стимулировали их в течение 48 ч антителами против ΟΌ3/ΟΌ28. В супернатантах измеряли продуцирование ΙΡΝγ и ΤΝΡα (фиг. 18). Не наблюдали существенных различий между продуцированием цитокинов у мышей, обработанных ЫЬ-18ВР, и контрольных мышей. Следовательно, нейтрализация ГС-18 ЫГ-18ВР не вызывает общего снижения способности Т-лимфоцитов реагировать на активацию Т-клеточного рецептора.

Анализировали гомогенаты ободочной кишки на содержание в них цитокинов, определяя локальную продукцию цитокинов (фиг. 19). Не обнаружили различий в уровнях ΙΡΝγ в гомогенатах ободочной кишки ВЫВ^-мышей и ΤNΒ§-мышей, обработанных ЫЬ-18ВР (134 пг/мл ± 7,8 и 139 пг/мл ± 23, соответственно). Однако уровни ΤΝΡα в гомогенатах ободочной кишки мышей, обработанных ЫГ-18ВР, существенно снижались - от 110 пг/мл ± 3 у ΤNΒ§-мышей до 59 пг/мл ± 2,7 у ΤNΒ§-мышей, обработанных ЫЬ-18ВР.

Гистологические результаты.

Для того чтобы исследовать, влияло ли снижение параметров воспаления, опосредованное ЫГ-18ВР, также и на гистологические показатели, выполняли гистопатологический анализ на парафинированных срезах. Общая оценка воспаления при гистологии значительно снижается для мышей, обработанных ЫГ-18ВР, по сравнению с оценкой контрольных мышей (15,9 ± 1,1 у необработанных мышей к 9,8 ± 1,3 у мышей, обработанных ЫГ-18ВР), главным образом, в результате снижения числа лейкоцитов, инфильтрирующих слизистую оболочку (р<0,05). Заметным результатом является полное отсутствие изъязвлений слизистой оболочки у мышей, обработанных ЫГ-18ВР (ρ<0,05). Результаты сведены в табл.2, приведенную ниже. Заметно почти полное предотвращение изъязвлений у мышей, обработанных ЫГ-18ВР.

Таблица 2 Различные показатели зоны колита у ТОВЗ-мышей, обработанных физиологическим раствором или ЫЬ-18ВРа

	ΤΝΒδ-мыши, обработанные физиол.раствором	ΤΝΒδ-мыши, обработанные ЫИ8ВР
Пораж.площадь, %	3,4 ± 0,4	3,2 ± 0,5
Фолликулярные агрегаты	2,0 ± 0,4	1,5 ±0,4
Отек	2.1 ± 0,3	1,3 ± 0,3
Фиброз	0,85 ± 0,26	0,50 ± 0,2
Изъязвления	2,0 + 0,3	0,0 ± 0,0*
Потеря крипты	1,7 ±0,3	1,0 ±0,3’
Полиморфноядерные клетки	2,6 ± 0,2	1,3 ±0,2*
Одноядерные клетки	1,1 ± 0,1	0,33 ±0,21·

Данные приводятся как среднее + 8ЕМ по шкале 0-4, * представлял значимое различие

- 30 005583

Поликлональные антитела против шГЬ-18 защищали от заболевания на мышиной модели колита, индуцируемого декстрансульфатом натрия

В данной модели давали 1б декстрансульфат натрия (Ό88) в питьевой воде, начиная со дня 0 до дня умерщвления животных. Поликлональные антитела против ГБ-18ВР вводили ί.ρ. в дни 0, 4 и 8. Дозы составляли 200 и 400 мкл кроличьей сыворотки. Самая высокая доза (400 мкл) давала значительное снижение потери массы, клинического показателя, ректального кровотечения и укорачивания ободочной кишки (не показано). Обработка кроличьими анти-тГБ-18-антителами приводила к замедлению инициирования заболевания и предотвращала его развитие (не показано).

Резюме.

Пример 12, представленный выше, демонстрирует, что нейтрализация ГБ-18 путем введения или ЫБ-18ВР или поликлональной антисыворотки против ГБ-18 эффективно снижает тяжесть вызванного экспериментально колита у мышей.

Мыши, обрабатываемые ежедневно ЫБ-18ВР интраперитонеально, быстро восстанавливались после первичной потери веса по сравнению с контрольными мышами. Другие параметры воспаления ободочной кишки, измеренные по массе ободочной кишки и притоку клеток в каудальный лимфоузел у мышей, обработанных ЫБ-18ВР, снижались. Гистопатология обработанных мышей характеризовалась уменьшением тяжести разрушения ткани (изъязвления), и значительно снижалось количество инфильтрирующих клеток. Действие ЫБ-18ВР также являлось системным, что демонстрируется пониженной экспрессией ΓΌ69 клетками селезенки.

Локальное продуцирование ΤΝΓα, измеренное в гомогенатах ободочной кишки, существенно падало у ΤNΒ8-мышей, обработанных ЫБ-18ВР. Это обстоятельство показывает, что ΤΝΓα играет важную роль в развитии болезни. Уровни ГЕИу у ΤNΒ8-мышей и ΤNΒ8-мышей, обработанных ЫБ-18ВР, сравнимы, что можно объяснить избыточностью ШЫу-индуцирующих стимулов.

В итоге данные, представленные выше, демонстрируют благоприятное действие ингибиторов ГБ-18 при лечении воспалительных заболеваний кишечника.

Ссылки

1. АГГогб. 8.С., еГ а1., Όίδΐίηοΐ райегпк οί ейетокте ехргеккюп аге а880С1а1еб хуНН 1еикосу1е гесгибтеШ ίη ηΓοΙιοΙΕ Ьера(1118 амб -ΒοΗο^ απΊιοδίδ. ί РабюГ 1998. 186(1): р. 82-9.

2. Λι^Γδοη, Ό.Μ., еГ а1., А Июптокдие οί ГИе ΤΝΕ гесерЮг аг1б ίΐδΐίβπηά еки-тсе Τ-сеИ дго\\111 аиб бембгШс-сеИ ГипсГюп. №11иге, 1997. 390(6656): р. 175-179.

3. Вагот, С.8., еГ а1., Нерайс δΐ^ΐ^ΐ^ се11 асΓ^νаί^οη шчб Шег ΓίόΓοδίδ аге аδδοс^аΓеб хуНН ηес^ο^ηГ1аттакгу ш)шу пп6 ΤΜ-Нке ^еδροηδе ίη сИгошс ИераНЦ^ С. Бйег, 1999. 19(3): р. 212-9.

4. В1гб, 6.Б., еГ а1., Iηс^еаδеб ркюпа ΐιιιηοΓ ικ^οδίδ ГасЮг ίη δеνе^е -ΕοΗο^ ИераЕШ. Апп йиет Меб, 1990. 112(12): р. 917-20.

5. Βο11οη, Ό. Р., еГ а1. (1980) I С1ш. НетаЮ1. Οη^1. 10:39-48.

6. ΒοΓδΓе^η, Ό., еГ а1. (1982) М1ат1 \νίηΕ 8утр. 19:265-274.

7. ВгоасИ, Г Κ., ίη Τίκ ΜοΕαιΡίΓ Вккду οΓ 1Ие Υеаδΐ 8ассηа^οтусеδ: Б1Ге Сус1е аг1б Iηйеήίаηсе, С.о1б Зргшд Η-γΕογ Ба^г-кгу, Со1б Зргшд Η-γΕογ, ΝΥ, рр. 445-470(1981).

8. ВгоасИ, Б Κ., (1982) Се11 28:203-204.

9. Вут Κ. А. еГ а1., 1990, №11иге (Βο^οη) 344:667-670.

10. Сатοд1^ο Б, Ге Уе1бе АА, бе Βοе^ А, 1ег1 КаГе ЕГ КцрГ Μ, ναη ЭеуеЩег 81 НаρΓеη-^ηбисеб сο1^ΐ^δ аδδοс^аΐеб ШИ татктеб Τ11 аг1б тПаттаЮгу ^еδροηδеδ ίη ГЕк-датта ^есеρГο^-беΓ^с^еηГ тке. Еиг Г Гттиηο1 2000;30:1486-95.

11. Саг, В. Ό., V. М. Епд, В. Зскнубег, Б. Охтеи 8. Нт-ид, Р. Са11ау, Ό. Нейтам, М. АдиеГ, аг1б В. РуГГе1. 1994. IηΓе^Γе^οη датта гесерГОг бейскШ тке аге ^еδ^δГаηГ Γο еηбοГοx^с δИοск. Г. Ехр. Меб. 179:143744 ίδδη: 0022-1007.

12. СИаГег, К. Г. еГ а1., ίη 81хГИ IηΓетаΓ^οηа1 8утροδ^ит οη Асί^ηοтусеΓа1еδ Вккду, Акабет1а1 Ка^бο, ΒибаρеδΓ, Нипдагу (1986), рр. 45-54).

13. СогиГ В., Г. ГаИ^, С Τίπη, Г. Н. 8οη, аг1б Т. Н. Γοη. 1997. Μυ^ίοη οΓ ^ηΓе^Γе^οη-датта шбисшд

Гаск!^- ίη ГИе абгегий отгкх. Г. Вю1. СИет. 272:2035-2037.

14. Ωαο, Т., К. ΟΗαδΗί, Т. Кауам, М. Ки^^тοΓο, пп6 Н. Окатига. 1996. IηΓе^Γе^οη-датта-^ηбис^ηд ГасГОг, а ηονе1 суккте, еηйаηсеδ Е-δ ИдаМ-тебх-Геб суккхкйу οΓ тигте Τ Ие1рег 1 сеШ. Се^тин^В 173:230-5 ίδδη: 0008-8749.

15. Оауег, 1-М (1999). Г. Ст. Гпу. 104,1337-1339.

16. ^еδ^еитаиx Р., Вшп6Г Е., СатЫех Б, Етйк Ό., 6еЬοеδ К., К1ет О., Ескт Ν., ШгкГ А., Сарют М., С^тЬе! ГЕ. □ίδΕη^ суккте раЕепъ ίη еаг1у аг1б сИгошс беа1 Εδίοηδ οΓ Сгокк б^δеаδе. &Шгоегиего1οду 1997; 113:118-126.

17. ^^^οηаΓο, Г А, Науака^а, М, ΚοΠ^ιΐ, Ό М, 2аг1бГ Е пп6 Кагт, М. (1997), №Шге 388,1651416517.

18. Е11кН, М.Б, Машр Κ.Ν., Ее1бта1т М., Βο^-Γο^ А., СИагШ, Р.,Ву1, Н.. пп6 ^οο6\', Ι.Ν., 1994, БмсеГ 344,1125-1127.

- 31 005583

19. Епде1тапп, Н., Ό. Αбе^ка, Μ. КиЬткГет, Ό. КоГтап, апб Ό. \Уа11асй. 1989. Α (итог песгокк ГасГогЬтбшд ргоГеш риййеб Го йотодепейу Ггот йитап игше ргоГесГк се11з Ггот (итог песгокк ГасГог Гохкйу. 1. Вю1. Сйет. 264:11974-11980.

20. Епде1тапп, Н., Ό. Шукк, апб Ό. \Уа11асй. 1990. Т\уо (итог песгокк ГасГог-Ьтбшд ргоГетк рипйеб Ггот йитап ийпе. Еу1бепсе Гог 1ттипо1од1са1 сгокк-геасбуйу у1Гй се11 кигГасе (итог песгокк ГасГог гесерГогк. I. Вю1. Сйет. 265:1531-1536.

21. Еап1и//1, С., еГ а1., ΙΠ-18 геди1айоп оГ ΙΡΝ-д ргобисйоп апб се11 ргойГегайоп ак геуеа1еб т шГегкикш-1Ь сопуегГшд епхуте-беГккпГ т1се. В1ооб, 1998. 91: р. 2118-2125.

22. Ноге, С., еГ а1., Ыуег бккие ехргекккп оГ СЭ80 апб СЭ95 апбдепк ш сйгошс йераййк С: ге1аГкпкЫр у1Гй Ью1одка1 апб ЫкГо1одка1 б1кеаке асЙУЙГек. МкгоЬкк, 1999. 97(386): р. 29-38

23. СаЛе, Ρ.Κ., еГ а1., ИкокетепГ оГ Гйе СЭ95 (ΑΡΟ-1/Ρη8) гесерГог апб йдапб ш йуег батаде. 1 Ехр Меб, 1995.182(5): р. 1223-30.

24. Сгабе, Α 1, Рогкеу, Κ 1, Сйап, й, Сйтоиг, Α, йеипд, В Р, Сгеег, Α Κ, Кеппебу, К, СагГег, Κ, \УеГ

Х-О, Хи, Ό., Ке1б, М, Ρоийк, Α, Ыеу, Ρ Υ, апб Мс1ппек, Ι В.(1999). й Сйп. ]пу. 104:1393-1401

25. СгапГйат (1974), Зскпсе, 185. 862-864.

26. Сгоуе, й, еГ а1., Λккос^а(^оη оГ а (итог песгок1к ГасГог рготоГег ро1утогрй1кт у1Гй киксерЛЬШГу Го а1сойойс кГеаГойераГйГк [кее соттепГк]. НераГо1оду, 1997. 26(1): р. 143-6.

27. Сгус/ап, Т., Тйе Мо1еси1аг Вк1оду оГ Гйе ВааШ, Αсабет^с Ргекк, ΝΥ (1982), рр. 307-329).

28. СиГктб, ЙЗ., еГ а1., Α поуе1 с-Гдг ехоп иГШхеб т ЕркГет-Вагг уйик-шГесГеб В 1утрйсуГек ЬиГ поГ ш тогта1 топосуГек. Мо1ес. Се11. Вю1., 1991. 11: р. 1500-1507.

29. Нагаба, К., еГ а1., Ш кйи пис1е1с ас1б йуЬпб1хаиоп оГсуГокшек ш рйтагу ЬШагу сйтйокк: ргебот1папсе оГ Гйе Тй1 киЬкеГ. НераГо1оду, 1997. 25(4): р. 791-6.

30. Негетапк, Н., й Уап Оатте, С ЭШеп, Κ. О|)ктапк, апб Α. В1Шаи. 1990. йиегГегоп датта, а теб1аГог оГ 1еГйа1 11роро1укассйапбе-тбисеб ЗйуагГхтап-йке кйоск геасйопк т тке. й Ехр. Меб. 171:1853-69 1ккп: 0022-1007.

31. НШ, Э.В., еГ а1., Шсгеакеб р1акта шГег1еикт-6 сопсепГгаГкпк ш а1сойойс йераГШк. 1 йаЬ Сйп Меб, 1992.119(5): р. 547-52.

32. НШ, Э.В., Й8. Магкапо, апб С.й МсС1аш, Шсгеакеб р1акта тГеЛеикт-8 сопсепГгаЛопк ш а1сойойс йераЛЛк. НераГо1оду, 1993.18: р. 576-580.

33. НйатаГки, Ν., еГ а1., Iттиηой^кГосйет^са1 беГесЛоп оГ Ρак апЛдеп ш йуег йккие оГ раЛепГк уйй сйгошс йераГйГк С. НераГо1оду, 1994. 19(6): р. 1354-9.

34. Ниапд, Υ.8., еГ а1., Зегит 1еуе1к оГ тГеЛеикт-8 ш акойойс йуег бкеаке: ге1аЛопкЫр уйй бкеаке кГаде, Ьксйетка1 рагатеГегк апб кшУ1уа1. 1 НераГо1, 1996. 24(4): р. 377-84.

35. йо, З., еГ а1., Зегит 1еуе1к оГ ко1иЬ1е Ρак апЛдеп т сйгошс йераЛЛк С раЛепГк. 1 НераГо1, 1998. 29(4): р. 517-23.

36. ЬаИ, К. (1978) 1рп. й ВасГейок 33:729-742.

37. 1ойп, й Ρ., еГ а1. (1986) Кеу. ШесГ. ϋΐδ. 8:693-704.

38. Каййуатига, З., Окатига, Н. (1998), Мрроп. Шпкйо. 56, рр. 1798-1806.

39. Кепба11, К. й еГ а1. (1987) й ВасГейок 169:4177-4183).

40. К1т ЗН, ЕкепкГет М, йехшког й, РапГихх! С, №гкк Ό, КиЬткГет М, ОтагеНо СΑ. ЗГгисГига1 гедшгетепГк оГ к1х паГига11у осситпд 1коГогтк оГ Гйе ΙΠ-18 Ьтбшд ргоГеш Го шй1ЫГ ΙΠ-18. Ргос №1Г1 Αсаб Зс1 и З Α 2000:97:1190-1195.

41. КшдйГ ОМ, ТЛпй Н, Йе 1, Зкде1 З, Зйеа1у Ό, МсЭопоидй М, Зса11оп В, Мооге ΜΑ, УПсек 1, Эаббопа Р, еГ а1. СопкГгисЛоп апб 1тЛа1 сйагасГеЛхаЛоп оГ а тоике-йитап сЫтеЛс апЛ-ТОТ апйЬобу.Мо1 типо1 1993 Νβν 30:16 1443-53.

42. Койпо, К., й КаГаока, Т. ОйГкикд Υ. ЗиетоГо, Ι. ОкатоГо, М. Икш, М. Шеба, апб М. КиЛтоГо.

1997. ΙΡΝ-датта-тбистд ГасГог (ЮШ) 1к а сокЛти1аГогу ГасГог оп Гйе асЛуаЛоп оГ Тй1 ЬиГ поГ Тй2 се11к апб ехегГк 1Гк еГГесГ тберепбепГ1у оГ 1Й-12. й Iттиηо1. 158:1541 -1550.

43. йее, М., еГ а1., Ехргекккп оГ Тй1 апб Тй2 Гуре суГокшек гекропбтд Го НВ^д апб НΒxΑд ш сйгошс йераЛЛк В раГкпГк. I Когеап Меб За, 1999. 14(2): р. 175-81.

44. йиккап, ТА, еГ а1., ЗйогГ-Гегт еГйапо1 ехрокиге тсгеакек Гйе ехргекккп оГ КирГГег се11 СЭ14 гесерГог апб йроро1укассйайбе Ьшбтд ргоГеш ш гаГ йуег. Α1^^1 Α^^β 1999. 34(3): р. 311-9.

45. йио, К.Х., еГ а1., Ш кйи туекЛдаЛоп оГРак/Ракй ехргекккп ш сйгошс йераЛЛк В 1пГесЛоп апб ге1аГеб йуег бкеакек. I Уйа1 НераГ, 1997.4(5): р. 303-7.

46. Майкхеукк1, С. Κ., Т. Α. ЗаГо, Т.Уапбеп Вок, З. ^аидй, З. К. Эоуег, й З1аск, М. Р. Весктапп, апб К. Н. СгаЬкГет. 1990. СуГокте гесерГогк апб В се11 ГипсГкпк. Ι. КесотЬшапГ ко1иЬ1е гесерГогк креайсайу шй1Ьй ΙΠ-1- апб ШЧ-шбисеб В се11 асйгйкк т уйго. й Iттиηо1. 144:3028-3033.

47. Машайк, Т., ш Се11 Вк1оду: Α Сотргейепауе Тгеайке, Уо1. 3: Сепе Ехргекккп, Αсабет^с Ргекк, ΝΥ, рр. 563-608 (1980).

48. Машайк еГ а1., Мо1еси1аг С1ошпд: Α ЬаЬогаГогу Мапиа1, Со1б Зрппд НагЬог ЬаЬогаГогу, №у Уогк, 1982.

49. МагНиех, Ρ., еГ а1., ЕГйапо1 апб суГокше кесгебоп. Α^^β 1992. 9(6): р. 455-8.

- 32 005583

50. МсС1а1и, С.Е. е! а1., Штог иесгокк ГасЮг апб а1соНоНс Нуег бкеаке. А1соНо1 СНи Ехр Кек, 1998. 22(5 8ирр1): р. 2488-2528.

51. МсС1а1и, С.1. аиб Б.А. СоНеи, [исгеакеб 1итог иесгокк Гас1ог ргобисбои Ьу тоиосу!ек ш а1соНоНс НераШк. Нера!о1оду, 1989. 9(3): р. 349-51.

52. М1са11еГ, М. 1., Τ. ОН1кпк1, К. КоНио, Ε. ΤаиаЬе, 8. БкНю, М. NатЬа, Τ. Τаи^то!о, К. Ш^дое, М. Γηρί, М. Шеба, 8. Гикиба, аиб М. КиптоЮ. 1996. ШегГегои-датта-тбистд Гас1ог еиНаисек Τ Не1рег 1 су!окше ргобисбои Ьу к!1ти1а!еб Нитам Τ се11к: куиегдкт \νί11ι ш!ег1еикш-12 Гог ш!егГегои-датта ргобисбои. Епг-д1-1ттиио1 26:1647-51 1кки: 0014-2980.

53. М1/пкН1та, 8. аиб Νада1а, 8. (1990) рЕΕ-ΒΟ8, а ро\уегГи1 таттаНаи ехргеккюи уес!ог. ШсШс Ааб Кек. 18:5322-5328.

54. Мои1е1еоие 6, Шаракко Ε, Ριπό^ Τ, Β^аисоие Ь. 8!е11а АДиНаио К, Бп/ха Ε, Еиксо А, Ρа11оие Ε. ГЪ-18 ехргеккюи 1к ир-геди1а!еб ш СгоНи'к б1кеаке. 1 Iттиио1 1999; 163: 143-147.

55. МиН1 Н, КатрГег Н, Βоктаии М, Вгаик 8, Кабеке Н, ΡΚί1^Ηίί^Γ 1. Iи!е^Ге^ои-датта теб1а!ек деие ехргеккюи оГ ГЪ-18 Ьшбшд рго!еш ш иои1еикосубс се11к. БюсНет БюрНук Кек Соттии 2000;267:960-963.

56. Накатит, К., Н. Окатига, М. ’№аба, К. №1да1а, аиб Τ. Τатш^а. 1989. Еибо1охт-тбисеб кегит Гас1ог 1На( кбти1а!ек датта ш!егГегои ргобисбои. IηГес!-Iттши 57:590-5 1кки: 0019-9567.

57. Иаир, А.А., е! а1., АсНуаНои оГ иис1еаг Гас1ог к В аиб су!окше 1тЬа1аисе ш ехрег1теи!а1 а1соНоНс Нуег б1кеаке ш !Не га!. Нера!о1оду, 1999. 30(4): р. 934-43.

58. ^кИтита, Τ. аиб А. ОН!а, А сгШса1 го1е Гог аибдеи-кресШс ΤΗ1 се11к ш аси!е Нуег шЦгу ш тке. 1. ^тиио^ 1999.162: р. 6503-6509.

59. коиск, Б., Β. СоНеи, аиб М. КиЬтк!ет. 1994. Ше Нитаи Iи!е^Ге^ои а1рНа/Ье!а Кесер!ог - СНагас1епха1юг1 аиб Мо1еси1аг С1ошид. Се11 77:391-400.

60. кочск, Б., Β. СоНеи, аиб М. КиЬтк!еш. 1992. 8о1иЬ1е Iи!е^Ге^ои-а1рНа Кесер!ог Мо1еси1ек Аге Ριόкеи! 1и Βобу Б1п1бк. ΕЕΒ8 Ье!1 314:445-448.

61. Миск, Б., Н. Еиде1таии, Б. Vа11асН, аиб М. КиЬтк!еш. 1989. 8о1иЬ1е су!окше гесер!огк аге ргекеи! 1и иогта1 Нитаи игте. 1. Ехр. Меб. 170:1409-1414.

62. Шукк, Б, К1т, 8-Н, Багиих/Н 6, Ее/шког, Ь, Бтаге11о, С, аиб КиЬтк!ет, М (1999). Ι·!'!!!'!!.!!’!!!}· 10, 127-136.

63. ОНЛидег, V., е! а1., IттшиоН^к!осНет^са1 бе!ес!юи оГ !итог иесгокк Гас!ог-а, о!Нег су!окшек аиб абНекюи то1еси1ек ш Нитаи Нуегк \уНН -КоНоШт НераННк. УисНо\ук АгсН А Ρа!Но1 Аиа! Нк!ора1Но1, 1993.423(3): р. 169-76.

64. Окатига, Н., Н. Τ^^ί, Τ. Котаки, М. Уикибо, А. Накига, Τ. Τаи^то!о, К. ШЕдое, Τ. Окига, Υ. Шкаба, К. На!!оп, К. Ак1!а, М. №ипЬа, Ε. ΤаиаЬе, К. КоикЫ, 8. Бикиба, аиб М. Кипто!о. 1995. С1ошид оГ а иеу су!окше !На! шбисек ΙΕΝ-датта ргобисбои Ьу Τ се11к. Nа!и^е 378:88-91.

65. Окато!о, Т., е! а1., МисНои оГ как Ндаиб аиб как аибдеи тКЫА ехргеккюик ш ш!егГегои-у !гаикдешс тоике Нуег. 1ри 1 ΡНа^тасо1, 1998. 78(2): р. 233-5.

66. Ока/акБ М., е! а1., НераНс Ε-к аибдеи ехргеккюи ЬеГоге аиб айег ш!егГегои !Негару ш ра!ки!к уНН сНгошс НераШк С Б1д Ок 8с1, 1996.41(12): р. 2453-8.

67. Окато!о, Т., К. Υататш^а, аиб О. Ншо, Ше тоике ш!егГегои-у !гаикдеие сНгошс НераШк тобе! (Кеу1еу). Ш! 1 Мо1 Меб, 1999. 3(5): р. 517-20.

68. О1ее Τ, НакЫто!о 8, ОиасН 1, Бо1/ М. (1999). 1 Iттшио1 162:2 1096-100

69. ΡηπκΙ, Ρ, 6агка, К Е, Βоиие^!, Τ Ρ, Бо\уег, 8 К, аиб 81тк, 1 Е. (1996), 1. Β^о1. СНет. 271,3967-3970.

70. ΡΗιΚγ-Ζ\^γ1< С, ΒоииеГоу ΤΥ. Магкеб атеНогабои оГ ек!аЬ1кНеб соНадеи-шбисеб абНп!к Ьу !геа!теи! \У11Н аиНЬобкк !о СБ23 ш у1уо. ΝηΙ Меб 1995;1:781-785.

71. Ρί/агго ΤΤ, МкЫе МН, Βеи!ζ М, ’№огага!аиабНагт 1, 8тНН МΕ, 1г., Εо1еу Е. Мокка1ик СА, Βκ1<к!ои 81, СотшеШ Ε. ГЪ-18, а иоуе1 НптшюгедикИогу су!окше, к ир-геди1а1еб ш СгоНи'к бкеаке: ехргеккюи аиб ксаН/абои ш ш!ек!ша1 тисока1 се11к. 1 Iттшио1 1999,162:6829-6835.

72. Ке1тииб ГМ, ’№1!!егкНе1т С, Битон! 8, Ми11ег СБ, Βаштаии К, Ρо^иб^ои Ρ, Бис!ок Β. Мисока1 шДатта!огу су!окше ргобисбои Ьу ш!ек!та1 Ыорккк ш ра!ки!к уНН и1сега!1уе соН1к аиб СгоНи'к бкеаке. 1 СНи Iттшио1 1996;16:144-150.

73. Ко!Не, Н., Ν. А. 1еикшк, Ν. 6. Соре1аиб, аиб Н.Ко1Ь. 1997. АсНуе к!аде оГ аи!о1ттш1е б1аЬе!ек к аккос1а!еб уНН !Не ехргеккюи оГ а иоуе1 су!окше, Ι6ΙΕ, \уН1сН к 1оса!еб иеаг Ι662. ЬСНи-Шуек.! 99:469-74 кки: 0021-9738.

74. 8аиа Ν, Мо1боуаи Ε, ΤΗΐύίΙ 6, Ρе11е!^е^ ΓΡ, С1ои!1ег ГМ, Ма^!е1-Ρе11е!^е^ 1.(1999). Аг1Нп!к КНеит 42:8 1577-87.

75. 8атЬгоок, 1., ЕЕ. Επίδο^ аиб М. Т., Мо1еси1аг С1ошид: А 1аЬога!огу таииа1. 2иб еб. еб. 1989, Со1б 8ргшд НагЬог, №\у Υо^к: Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу.

76. 81тоие!, ν.8., е! а1., Ок!еорго!едегш: а иоуе1 кесге!еб рго!еш шуокеб ш !Не геди1а!юи оГ Ьоие беи8йу. Се11, 1997. 89(2): р. 309-319.

77. 8Негои, Ν., е! а1., Е1еуа!еб р1акта ш1епеикш-6 аиб шсгеакеб кеуегНу аиб тог!а11!у ш а1соНоНс НераНбк. СНи Ехр Iттшио1, 1991. 84(3): р. 449-53.

- 33 005583

78. Зотраугас, ЬН. аиб К.Ь. Оаииа, Е£йс1еи! 1и£есйои о£ тоикеу се11к \уйй ΌΝΛ о£ к1тгаи улик 40. Ргос. №!'1. Асаб. Зск ИЗА, 1981. 78: р. 7575-7578.

79. Зрагкк, С.А., е! а1., Акыдитеи! о£ !йе иис1еаг тйойс аррага!ик рго!ет №МА деие !о йитаи сйготокоте 11ц13. Сеиотгск, 1993.17: р. 222-224.

80. Зи, 6.Й., е! а1., ΟΌ14 аиб 11роро1укассйапбе Ьтбтд рго!ет ехргеккюи т а га! тобе1 о£ а1сойойс 11уег б1кеаке. Ат I Ра!йо1, 1998.152(3): р. 841-9.

81. Та1еЬ, I., е! а1., Ка1кеб р1акта ко1иЬ1е Ра® аиб Рак-йдаиб т а1сойойс йуег бйеаке [1е!!ег]. Ьаисе!,

1998. 351(9120): р. 1930-1.

82. Тйаи!арйу11орои1ок, К А, VШ^атκ, К, ТаПог, Н, аиб Сйетакоукку, Υ (1999). Айййкк аиб Кйеитайкт 42, 90-99.

83. Тки!кш, Н., К. Nакаи^κй^, К. Ма!кш, К. Шдакйто, Н. Окатига, Υ. М1уахауа, аиб К. Калеба. 1996. ΙΡΝ-датта-тбисшд £ас!ог ир-геди1а!ек Рак 11даиб-теб1а!еб су!о!ох1с асйуйу о£ типие иа!ига1 кШег се11 с1оиек. I. 1ттиио1. 157:3967-73 1кки: 0022-1767.

84. Ткиу, Н., Мика1ба, N.. Нагаба А., Камеко, З., Ма!кикййа, Е.. Nакаηита, Υ., Тки!кш, Н., Окатига, Н., №1кашкйг К., Тада\уа,т Υ, руаклга, Υ., КоЬауакЫ, К., аиб Ма!киксЫта, К.(1999), I. 1ттиио1. 162, рр. 1049-1055.

85. Тисс1, А., 1атек, Н., СЫсйерогйсйе, К., Воиле^у, ΙΥ., Оауег, !М., аиб 2иЬ1ег, К.Н., 1992, Иттииок 148, 2778-2784.

86. ИкЫо, З., М. №1тЬа, Т. Окига, К. Найоп, Υ. Nикаба, К. Акйа, Р. ТапаЬе, К. КошкЫ, М. МюаПеГ, М. Ри)й, К. Топдое, Т. Татто!о, З. Рикиба, М. 1кеба, Н. Окатига, аиб М. КлптоЮ. 1996. С1ошид о£ !йе с^NА £ог йитаи 1Р№датта-тбистд £ас!ог, ехргеккюи т ЕксйепсЫа сой, аиб к!иб1ек ои !йе Ью1одю аскуй йек о£ !йе рго!ет. I. 1ттиио1. 156:4274-4279.34. Окауата, Н. аиб Вегд, Р. (1983) А с^NА с1ошид уес!ог !йа! регтйк ехргеккюи о£ с^NА ткейк т таттайаи се11к. Мо1. Се11. Вю1. 3:280-289.

87. V^11^атк КО, Макои Ы, Ре1бтаии М, Малл ΚΝ. Зуиегду ЬеЩееи аий-СО4 аиб аий-!лтог иесгоык £ас!ог 1и Иге атейогайои о£ ек!аЬ11кйеб сойадеи-тбисеб аййпйк. Ргос №111 Асаб За и З А 1994 Маг 29 91:7 2762-6.

88. Уаклба, Н., е! а1., 1беи1йу о£ ок!еос1ак!одеиек1к тЫЬйогу £ас!ог (ОС1Р) аиб ок!еорго!едейи (ОРО): а тесйашкт Ьу уЫсй ОРО/ОС1Р шй1Ьйк ок!еос1ак!одеиек1к т уйго. Еибоспио1оду, 1998.139: р. 1329-1337.

89. Υокй^то!о Т., Такеба, К., Танака, Т., Ойкики, К., Какйлуатлга, З., Окатига, Н., Акла, З. аиб ΝιкашкЫ, К. (1998), I. 1ттиио1. 161, 3400-3407.

Claims (47)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Применение ингибитора Ш-18 для изготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения повреждения печени, где повреждение печени представляет собой алкогольный гепатит, вирусный гепатит, иммунный гепатит, молниеносный гепатит, цирроз печени и первичный билиарный цирроз.
2. 2. Применение по п.1, где повреждение печени представляет собой молниеносный гепатит.
3. 3. Применение ингибитора Ш-18 при изготовлении лекарственного средства для лечения и/или предупреждения псориатического артрита.
4. 4. Применение ингибитора Ш-18 при изготовлении лекарственного средства для лечения и/или предупреждения разрушения хряща.
5. 5. Применение по п.4, где разрушение хряща вызвано ревматоидным артритом, ювенильным ревматоидным артритом, остеоартритом или инфекционным синовитом.
6. 6. Применение ингибитора Ш-18 для изготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения болезни Крона.
7. 7. Применение ингибитора Ш-18 для изготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения неспецифического язвенного колита.
8. 8. Применение по любому из пп.1-7, где ингибитор Ш-18 выбран из ингибиторов каспазы-1 (1СЕ), антител против 1Й-18, антител против любой из субъединиц рецептора 1Й-18, ингибиторов каскада передачи сигнала 1Й-18, антагонистов 1Й-18, конкурирующих с Ш-18 и блокирующих рецептор 1Й-18, и 1Й-18связывающих белков, их изоформ, мутеинов, слитых белков, функциональных производных, активных фракций или производных с циклической перестановкой, обладающих по существу такой же активностью, как и 1Ь-18-связывающий белок.
9. 9. Применение по п.8, где ингибитор Ш-18 представляет собой антитело к 1Й-18.
10. 10. Применение по п.9, где антитело к Ш-18 представляет собой гуманизированное антитело к 1Ь18.
11. 11. Применение по п.9, где антитело к Ш-18 представляет собой антитело к 1Й-18 человека.
12. 12. Применение по п.8, где ингибитор Ш-18 представляет собой 1Ь-18-связывающий белок или его изоформу, мутеин, слитый белок, функциональное производное, активную фракцию или производное с циклической перестановкой.
13. 13. Применение по п.12, где 1Ь-18-связывающий белок обработан полиэтиленгликолем.

    - 34 005583
14. 14. Применение по п.12, где ингибитор ΣΕ-18 представляет собой слитый белок, содержащий весь ΣΕ-18-связывающий белок или его часть, слитый со всем иммуноглобулином или его частью, и где слитый белок связывается с ΣΕ-18.
15. 15. Применение по п.14, где слитый белок содержит всю константную область иммуноглобулина или ее часть.
16. 16. Применение по п.15, где иммуноглобулин является изотипом Σ§01 или Σ§02.
17. 17. Применение по любому из предшествующих пунктов, где лекарственное средство содержит также интерферон.
18. 18. Применение по п.17, где интерферон представляет собой интерферон-β.
19. 19. Применение по п.17 или 18, где ингибитор ΣΕ-18 применяется одновременно, последовательно или отдельно от интерферона.
20. 20. Применение по любому из предшествующих пунктов, где лекарственное средство содержит также антагонист фактора некроза опухоли (ΤΝΕ).
21. 21. Применение по п.20, где антагонист ΤΝΕ представляет собой ТВИ и/или ТВРП.
22. 22. Применение по п.20 или 21, где ингибитор ΣΕ-18 и/или интерферон применяется одновременно, последовательно или отдельно от антагониста ΤΝΕ.
23. 23. Применение по любому из предшествующих пунктов, где лекарственное средство содержит также ингибитор СОХ.
24. 24. Применение по п.23, где ингибитор СОХ представляет собой ингибитор СОХ-2.
25. 25. Применение по любому из предшествующих пунктов, где ингибитор ΣΕ-18 применяется в количестве примерно 0,0001-10 мг на кг массы тела, или примерно 0,01-5 мг на кг массы тела, или примерно 0,1-3 мг на кг массы тела, или примерно 1-2 мг на кг массы тела.
26. 26. Применение по любому из предшествующих пунктов, где ингибитор ΣΕ-18 применяется в количестве примерно 0,1-1000 мкг на кг массы тела, или 1-100 мкг на кг массы тела, или примерно 10-50 мкг на кг массы тела.
27. 27. Применение по любому из предшествующих пунктов, где ингибитор ΣΕ-18 вводят подкожно.
28. 28. Применение по любому из предшествующих пунктов, где ингибитор ΣΕ-18 вводят внутримышечно.
29. 29. Применение по любому из предшествующих пунктов, где ингибитор ΣΕ-18 вводят ежедневно.
30. 30. Применение по любому из предшествующих пунктов, где ингибитор ΣΕ-18 вводят через день.
31. 31. Применение экспрессирующего вектора, содержащего кодирующую последовательность ингибитора ΣΕ-18, при изготовлении лекарственного средства для лечения и/или предупреждения повреждения печени, где повреждение печени представляет собой алкогольный гепатит, вирусный гепатит, иммунный гепатит, молниеносный гепатит, цирроз печени и первичный билиарный цирроз.
32. 32. Применение экспрессирующего вектора, содержащего кодирующую последовательность ингибитора ΣΕ-18, при изготовлении лекарственного средства для лечения и/или предупреждения псориатического артрита.
33. 33. Применение экспрессирующего вектора, содержащего кодирующую последовательность ингибитора ΣΕ-18, при изготовлении лекарственного средства для лечения и/или предупреждения разрушения хряща.
34. 34. Применение экспрессирующего вектора, содержащего кодирующую последовательность ингибитора ΣΕ-18, при изготовлении лекарственного средства для лечения и/или предупреждения болезни Крона или неспецифического язвенного колита.
35. 35. Применение по любому из пп.33-34 для генной терапии.
36. 36. Применение вектора для индукции и/или усиления эндогенной продукции ингибитора ΣΕ-18 в клетке при изготовлении лекарственного средства для лечения и/или предупреждения повреждения печени, где повреждение печени представляет собой алкогольный гепатит, вирусный гепатит, иммунный гепатит, молниеносный гепатит, цирроз печени и первичный билиарный цирроз.
37. 37. Применение вектора для индукции и/или усиления эндогенной продукции ингибитора ΣΕ-18 в клетке при изготовлении лекарственного средства для лечения и/или предупреждения псориатического артрита.
38. 38. Применение вектора для индукции и/или усиления эндогенной продукции ингибитора ΣΕ-18 в клетке при изготовлении лекарственного средства для лечения и/или предупреждения разрушения хряща.
39. 39. Применение вектора для индукции и/или усиления эндогенной продукции ингибитора ΣΕ-18 в клетке при изготовлении лекарственного средства для лечения и/или предупреждения болезни Крона или неспецифического язвенного колита.
40. 40. Применение клетки, генетически модифицированной для продуцирования ингибитора ΣΕ-18, при изготовлении лекарственного средства для лечения и/или предупреждения повреждения печени, где повреждение печени представляет собой алкогольный гепатит, вирусный гепатит, иммунный гепатит, молниеносный гепатит, цирроз печени и первичный билиарный цирроз.

    - 35 005583
41. 41. Применение клетки, генетически модифицированной для продуцирования ингибитора ΙΗ-18, при изготовлении лекарственного средства для лечения и/или предупреждения псориатического артрита.
42. 42. Применение клетки, генетически модифицированной для продуцирования ингибитора ΙΗ-18, при изготовлении лекарственного средства для лечения и/или предупреждения разрушения хряща.
43. 43. Применение клетки, генетически модифицированной для продуцирования ингибитора ΙΗ-18, при изготовлении лекарственного средства для лечения и/или предупреждения болезни Крона или неспецифического язвенного колита.
44. 44. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество ингибитора ΙΗ-18 и терапевтически эффективное количество интерферона.
45. 45. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество ингибитора ΙΗ-18 и терапевтически эффективное количество антагониста ТИР.
46. 46. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество ингибитора ΙΗ-18 и терапевтически эффективное количество ингибитора СОХ-2.
47. 47. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество ингибитора ΙΗ-18 в сочетании с терапевтически эффективным количеством любого или всех компонентов из числа интерферона, антагониста ТИР и ингибитора СОХ-2.