BG66134B1

BG66134B1 - Използване на инхибитори на il-18

Info

Publication number: BG66134B1
Application number: BG107018A
Authority: BG
Inventors: Yolande Chvatchko; Charles Dinarello; Christine Plater-Zyberk; DEVENTER Santer VAN; Menachem Rubinstein; Daniela Novick; Soo-Hyun Kim
Original assignee: Applied Research Systems Ars Holding N.V.; Yeda Research And Development Co. Ltd.
Priority date: 2000-02-21
Filing date: 2002-08-20
Publication date: 2011-06-30
Also published as: AU4063601A; CA2399298C; NO331971B1; HRP20020652A2; DK1257292T3; KR20070087256A; KR20020086540A; YU60402A; NZ546294A; EE200200463A; CZ304485B6; PL357554A1; AU2001240636B2; BR0108514A; SK12082002A3; BG107018A; JP2003523403A; CN1322897C; KR20070057282A; DE60144514D1

Abstract

Изобретението се отнася до използването на инхибитори на IL-18 за получаване на медикамент за лечение и/или предпазване от чернодробно увреждане. Изобретението по-нататък се отнася до използване на инхибитори на IL-18 за приготвяне на медикамент за лечение и/или предпазване от артрит, по-специално ревматоиден артрит. В допълнение на това, изобретението се отнася до използване на инхибитори на IL-18 за приготвянето на медикамент за лечение и/или предпазване от чревно възпалително заболяване, по-специално болест на Crohn и язвен колит.

Description

(54) ИЗПОЛЗВАНЕ HA ИНХИБИТОРИ HA IL18

Област на техниката

Настоящото изобретение се отнася до терапевтичното приложение на инхибитори на IL18 при няколко патологични състояния. По-специално, изобретението се отнася до лечение и/ или предпазване от артрит, до лечение и/или предпазване от чернодробни заболявания и до лечение и/или предпазване от чревни възпалителни заболявания (IBD).

Предшестващо състояние на техниката

През 1989 година, е описана ендотоксининдуцирана активност на серумния интерферонгама (IFN-гама), изолиран от миши далачни клетки (Micallef et al., 1996). Тази серумна активност е функционална не като директен индуктор на IFN-гама, а по-скоро като ко-стимулант заедно със IL-2 или митогени. Опит да се пречисти активната форма от серум на мишки след ендотоксин-индукция, даде като резултат значително хомогенен 50-55 кДа протеин. Въпреки че и други цитокини могат да действат като ко-стимуланти за продукцията на INF-гама, липсата на ефект на антителата, неутрализиращи IL-1, IL-4, IL-5, IL-6 или TNF, използвани за неутрализиране на серумна активност, предполага, че става въпрос за различен от тях фактор. През 1995 година, същите учени показват, че ендотоксин-индуциращ ко-стимулант на продукцията на INF-гама присъства в екстракти от черни дробове от мишки, предварително третирани с P.acnes (Novick et al., 1992). В този модел, популацията от чернодробни макрофаги (Купферови клетки) се увеличава и в тези мишки, ниска доза от бактериален липополизахарид (LPS), който при нетретирани мишки не е летален, се оказва летален. Факторът, наречен INF-гама-индуциращ фактор (IGIF) и покъсно означен като интерлевкин-18 (IL-18) е пречистен до хомогенност от 1,200 g от P.acens-третирани миши черни дробове. Изродени олигонуклеотиди, получени на база на аминокиселинни секвенции от пречистен IL-18 се използват за клониране на миша IL-18 кДНК (Novick et al., 1992). IL-18 е 18-19 кДа белтък, представен от 157 аминокиселини, които нямат очевидни при лики с който и да е пептид от базата данни. Информационни РНКи за IL-18 и интерлевкин12 (IL-12) се наблюдават често в Купферовите клетки и активираните макрофаги. Рекомбинантен IL-18 има по-голяма индуцираща INFгама активност, в сравнение с IL-12, очевидно чрез различен сигнален път (Novick et al., 1992). Подобно на ендотоксин-индуцираната серумна активност, IL-18 не индуцира INF-гама самостоятелно, но функционира първоначално като ко-стимулант с митогени или IL-2. IL-18 повишава Т-клетъчната пролиферация очевидно по IL-2 независим сигнален път и повишава продукцията на Thl цитокините in vitro и показва синергизъм когато е в комбинация с IL-12 по отношение на повишената INF-гама продукция (Maliszewski et al., 1990).

Показано е, че антитела неутрализиращи мишия IL-18 предпазват от леталния ефект на ниски дози LPS при предварително третирани с P.acnes мишки. Други автори съобщават за значението на INF-гама, като медиатор на LPS леталния ефект при предварително третирани мишки. Например, неутрализиращите анти-INFгама антитела защитават мишките от Shwartzmanподобен шок (Fantuzzi et al., 1998) и галактозамин-третирани мишки, дефицитни по отношение на рецептора за INF-гама са резистентни към LPS-индуцираната смърт (Вут, 1990). Следователно, не е неочаквано, че неутрализиращите антитела за мишия IL-18 предпазват предварително третираните с P.acnes мишки срещу леталния ефект на LPS (Novick et al., 1992). Третиране с анти-мишо IL-18 също защитава преживяемостта на мишките при остра чернодробна токсичност.

След като мишата форма е клонирана, през 1996 е съобщена и човешка форма на кДНК последователност за IL-18 (Okamura et al., 1995). Рекомбинантен човешки IL-18 показва естествена IL-18 активност (Okamura et al., 1995). При човешки рекомбинантен IL-18 липсва директна INF-гама индуцираща активност върху човешки Т-клетки, но той действа като ко-стимулант за продукцията на INF-гама и други Т хелперни (Thl) цитокини (Okamura et al., 1995). Днес се счита, че IL-18 действа първо като ко-стимулант за продукцията на Thl цитокините (INF-гама, IL-2 и гранулоцит-макрофагиален колонно стимулиращ фактор) (Izaki,

66134 Bl

1978) и също така, като ко-стимулант за FAS лиганд медиираната цитотоксичност на мишите клонове от клетки-естествени убийци (Novick et al, 1989).

Чрез клониране на IL-18 от засегнати тъкани и изучаване на генната експресия на IL-18, е открита тясна връзка между цитокините и автоимунните заболявания. Мишки заболели от формата на диабет, при която липсва затлъстяване (NOD) спонтанно развиват автоимунни инсулити и диабети, които могат да бъдат ускорени и синхронизирани чрез еднократно инжектиране с циклофосфамид. IL-18 иРНК е доказана, чрез обратно-транскриптазна полимеразна верижна реакция (RT-PCR) на панкреаси от NOD мишки в ранни етапи на инсулити. Нивата на IL18 иРНК се увеличават бързо след третирането на циклофосфамид и предизвикват повишаване на иРНК за INF-гама и последващи диабети. Интересно е, че тези кинетики наподобяват тези на IL-12-р40 иРНК, които показват тясна връзка между отделните иРНК профили. Клонирането на IL-18 кДНК от РНК взети от панкреаси и последващото секвениране показва идентичност със секвенцията на IL-18 клониран от Купферови клетки и in vivo активиращ макрофагите. Също така NOD миши макрофаги от паралелно третирани Balb/c мишки, не показват такава идентичност. Ето защо, експресията на IL-18 е ненормално регулирана при автоимунни NOD мишки и е в тясна връзка с развиването на диабети (Novick et al, 1992).

IL-18 играе основна роля в имунорегулацията или при възпалителните реакции, чрез повишаване на функционалната активност на Fas лиганда на Thl клетките (Conti et al, 1997). IL18 също се експресира в адреналния кортекс и затова може да бъде секретиран, като невроимуномодулатор, който играе основна роля в регулацията на имунната система, чрез стрес-активиране (Chater, 1986).

In vivo IL-18 се образува от късането на npo-IL-18 и неговата ендогенна активност изглежда води до продукцията на INF-гама при P.acens и LPS-медииран летален ефект. Зрялата форма на IL-18 се образува от неговия прекурсор, чрез ШНбета конвертиращ ензим (IL-16eта-конвертиращ ензим, ICE, каспаза-1).

IL-18 рецепторът се състои най-малко от два компонента, коопериращи се при свързва нето с лиганда. Високо и ниско-афинитетни свързващи места за IL-18 са открити в миши IL-12 стимулирани Т-клетки (Yoshimoto et al, 1998), което предполага рецепторен комплекс от много вериги. Две рецепторни субединици са открити за сега, и двете принадлежат към семейството на IL-1 рецептора (Pmet et al, 1996). Предаването на сигнала, чрез IL-18 рецептора, включва активиране HaNF-kB (DiDonato et al, 1997).

Няколко известни цитокин-свързващи протеини са разтворими цитокинови рецептори и отговарят на извънклетъчните лиганд-свързващи домени, съответстващи на техните цитокинови рецептори, разположени върху клетъчните повърхности. Те се получават както в резултат от алтернативен сплайсинг от пре-иРНК, обща за клетъчно повърхностния рецептор, или чрез протеолитично късане на клетъчно-повъърхностния рецептор. Такива разтворими рецептори на IL-6 и INF-гама (Nakamura et al, 1989), TNF (Dao et al, 1996; Engelmann et al, 1989), IL-1 и IL-4 (John, 1986), INF-алфа/бета (Mizushima и Nagata, 1990) и други. Един цитокин-свързващ белтък, наречен остеопротегерин (OPG, също известен като остеокласт-инхибиращ фактор OCIF), член на TNFR/Fas семейството е първия пример за разтворим рецептор, който съществува само като секреторен протеин (Anderson, 1997; Bollon, 1980).

Наскоро открит разтворим белтък, който има висок афинитет към IL-18 е изолиран от човешка урина и са описани човешките и мишите кДНКи (Novick et al, 1990; WO 1999/009063), Белтъкът е означен като IL-18 свързващ белтък (IL-18BP).

IL-18ВР не е извънклетъчния домен на известните IL-18 рецептори, но се секретира естествено като циркулиращ протеин. Той принадлежи на ново семейство секреторни протеини. Семейството по-нататък включва някои Поксвирусни-кодирани протеини, които притежават висока хомология с IL-18BP (Novick et al, 1999). IL-18BP се експресира постоянно в далака и принадлежи към суперсемейството на имуноглобулините и има ограничена хомология с IL-1 тип II рецептора. Неговият ген е локализиран в човешката хромозома 1 lql3 и липсва екзон, кодираш трансмембранен домен в 8.3 kb геномната секвенция (Novick et al, 1999).

Четири човешки и две миши изоформи на

66134 Bl

IL-18BP, водещи до иРНК сплайсинг са открити в няколко кДНК библиотеки и са експресирани, пречистени и анализирани за свързващата им способност и за неутрализиране на биологичните активности на IL-18 (Kim et al., 2000). Изоформа на човешки IL-18BP (IL-18BPa) показва повисок афинитет към IL-18 с бърза скорост на стартиране и спиране и дисоциационна константа (K(d)) 399 рМ. IL-18BPc притежава общ Ig домен с IL-18Pa, с изключение на С-крайните 29 аминокиселини; K(d) на IL-18PC е 10 пъти пониска (2.94 пМ). Въпреки това, IL-18Ра и IL-18Рс неутрализират над 95% IL-18 при крайните моларности и на двата. При IL-18BPb и IL-18BPd изоформите липсва пълния Ig домен и те притежават идентичен Ig домен, който също неутрализира над 95 % мишия IL-18 при крайните моларности и на двата. IL-18BPd обаче, който има общ С-краен мотив с човешкия IL-18BPa също неутрализира човешкия IL-18. Чрез молекулно моделиране е идентифициран голямо смесено електростатично и хидрофобно свързващо място в Ig домена на IL-18BP, на което би могло да се дължи високият афинитет към свързване с лиганд (Kim et al., 2000).

Наскоро се предположи, че интерлевкин IL-18 е включен в индуцирането на патогенността на хроничните възпалителни реакции, включващи ендотоксинов шок, хепатити и автоимунни диабети (Kahiwamura и Okamura, 1998). Следваща индикация за възможната роля на IL-18 при развитието на чернодробни заболявания е резултат от експериментите, публикувани от Tsuij et al., (Tsuij etal., 1999), който показва повишаване на нивото на IL-18 в липополизахарид-индуцираното остро чернодробно увреждане в миши модел. За сега обаче не е изяснен механизма на мултифункционалния фактор IL-18, отговарящ за развитието на чернодробни увреждания.

Чернодробните нарушения или увреждания могат да бъдат причинени от различни фактори. Могат да се дължат на вирусни или бактериални инфекции, на злоупотреба с алкохол, на имунологични нарушения или на ракови заболявания, например.

Вирусните хепатити, които се дължат на Хепатит В вируса и Хепатит С вируса, са слабо управляеми заболявания, които засягат голям брой хора в световен мащаб. Броят на известните хепатитни вируси постоянно се повишава.

Освен Хепатит В и С вирусите, най-малко още четири вируса, предизвикващи вирус-асоциирани хепатити са открити до сега, наречени Хепатит

A, D, Е и G-вируси.

Чернодробните заболявания при алкохолиците е друго широко разпространено заболяване, свързано със хронична консумация на алкохол. Имунните хепатити са рядко автоимунно заболяване, което е слабо контролирано. Чернодробните увреждания също включват увреждания на жлъчните канали. Първичната жлъчна цироза (РВС) е автоимунно чернодробно заболяване, което се характеризира с деструкция на вътречернодробните жлъчни канали.

Някои проучвания показват, че уврежданията на черния дроб при заболявания, като хепатити при алкохолици, чернодробни цирози, вирусни хепатити и първични жлъчни цирози са свързани отговора на Т-хелперните клетки - тип 1 (Thl отговори). В едно от проучванията, нов модел на чернодробно заболяване е установено при мишки, чрез насочване на овоалбумин-съдържащи липозоми към черния дроб и последващ овоалбумин-специфичен отговор от Thl клетките. Комбинирано третиране на мишките с овоалбумин-съдържащи липозоми и Thl клетъчно пренасяне предизвиква повишаване на серумната транс аминазна активност, паралелно с увеличаването на нивата на серумния INF-гама. В остър противовес, овоалбумин-специфично Th2 клетъчно пренасяне, води до повишаване на нивата на серумния IL-4, но не предизвиква чернодробни увреждания. Чернодробното увреждане се блокира от анти-ЮТ-гама антитела и антитумор некрозис фактор (TNFj-алфа антитела. Тези открития показват, че Thl клетките са главните ефекторни клетки при остри чернодробни увреждания (Nishimura и Ohta, 1999). В друга група изследвания е показано, че свръхекспресията на миши INF-гама води до спонтанни хепатити без какъвто и да е патоген или какъвто и да е стимулант (Okamoto et al., 1998).

Друго изследване показва Thl отговорите при първична жлъчна цироза (РВС). РВС е автоимунно чернодробно заболяване, което се характеризира с деструкция на вътречернодробните жлъчни канали. Обикновено се смята, че клетъчния имунен механизъм, по-специално въвличането на Т-клетките води до увреждания

66134 Bl в жлъчния канал. Наскоро беше предположено, че относително силните Th 1 и Th2 отговори са важен фактор в патофизиологията на много автоимунни заболявания. В това изследване, се оценява баланса между двата типа Т-клетки при РВС, чрез детекция на цитокини, специфични за двата Т-клетъчни типа, т.е. INF гама за Th 1 клетките и IL-4 за Th2 клетките. Отчитат се INF гама и IL-4 информационна РНК (иРНК) позитивните клетки в чернодробни срези от 18 пациенти с РВС и 35 контроли на заболяването, включващи активни форми на хроничен хепатит С, екстрахепатитни жлъчни обструкции и нормални черни дробове, като се използва не-изотопна in situ хибридизация и имунохистохимия. Мононуклеарни клетки, експресиращи INF гама и IL-4 иРНК образуват агрегати на входовете на възпалените пътища в черни дробове на болни от РВС, но те присъстват в известно количество и в екстрахепатитните жлъчни обструкции, във фиброзите при алкохолици или в нормалните чернодробни срези. INF гама и IL-4 иРНК позитивните клетки при РВС черните дробове се наблюдават, в значително увеличен брой, в сравнение с контролните черни дробове (Р<0.01). Още повече, експресията на INF гама иРНК по-често се наблюдава в сравнение с тази на IL-4 при черни дробове на болни от РВС, и нивата на експресия на INF гама иРНК корелират в голяма степен с тези при порталните възпалителни реакции. INF гама иРНК позитивни клетки се наблюдават първоначално около увредените жлъчни канали, които са оградени от лимфоидни агрегати. Данните показват, че Thl клетките са по-често срещащият се тип Т-клетки в лимфоидните инфилтрати при РВС (Harada et al., 1997).

Цитокиновият профил на разпознаване на вирусни антигени също се счита, че оказва силно влияние върху вирусните инфекции и вирусното пречистване. Едно проучване изследва дали цитокиновия имбаланс в посока към тип Th2 клетъчен отговор играе роля при хроничния хепатит В. Цитокиновите профили на мононуклеарните клетки в периферната кръв се свързва с хроничния хепатит Вие анализиран чрез RTPCR. Що се отнася до стимулирането на Хепатит В-повърхностния антиген (HbsAg), експресията на INF гама, IL-2, IL-4 и IL-10 се наблюдава като 41%, 8%, 41% и 50% от пациентите, съответно. Между тези цитокини, експресията на Thl цитокина INF гама се свързва с високите нива на серумните AST/ALT (Аспартат аминотрансфераза/Аланин аминотрансфераза), които представляват типични маркери за чернодробно увреждане. Не се наблюдава, Th2 тип цитокините да указват защитен ефект върху хепатоцити. В заключение, продукцията на Thl цитокина, INF гама, от HBsAg-реактивните клетки се свързва с хепатоцитно увреждане при хроничен хепатит В (Lee et al., 1999). Високи нива на FAS лиганд и неговия рецептор (CD95) са съобщени за черните дробове на пациенти с хепатит В (Luo et al., 1997). FAS лиганда се счита като един от главните цитотоксични агенти, водещи до апоптозис.

Друго проучване идентифицира фактори, свързани с прогресията на чернодробните увреждания при 30 хепатит С вирус/PHK (HCV/RNA) позитивни нелекувани пациенти с хронични хепатити. Некротичните възпалителни и структурни увреждания се определят по Ishak точкова система. Активираните хепатоцитни звездовидни клетки (HSC) се визуализират имунохистохимично, с реакция за алфа-актин на гладкомускулните клетки (алфаБМА) и се прави морфометрична количествена оценка. Плазменият HCV/RNA се анализира, чрез използване на конкурентен RT-PCR метод. За проследяване на типа на имунен отговор, включен при прогресията на чернодробни заболявания, INF гама-позитивни клетки (както при експресия при Thl-подобен отговор) се анализират имунохистохимично и количествено - морфометрично. Установено е, че HSC се наблюдават най-често, близо до областите на възпалени некротични лобуларни участъци или до тези постилащи фиброзните септи. Алфа-SMA и Sirius Red-позитивната паренхима показват значителна корелация с точките за некротичните възпалителни и структурни увреждания. Ето защо може да се направи заключение, че активирането на HSC и прогресията на чернодробни увреждания се свързва с Th 1 -отговорите (Baroni et al., 1999). Подобно на случаите на Хепатит В, FAS лиганда и неговия рецептор са открити в черни дробове и серуми на хепатит С пациенти (Hiramatsu et al., 1994; Okazaki et al., 1996; Lio et al., 1998).

Thl цитокините и други Thl маркери са открити асоциирани с хепатитите при алкохолици и при чернодробни цирози. Възпалителни стимули и активирането на липидна пероксидация,

66134 Bl активира ядрения фактор kB (NF кВ) и увеличава продукцията на провъзпалителни цитокини и хемокини. В едно проучване се анализира връзката между патологичните чернодробни увреждания, ендотоксемиата, липиднатапероксидация и NF-kB активирането, и имбаланса между прои антивъзпалителните цитокини. Плъхове (по 5 в група) се хранят с етанол, и са подложени на диета с храни наситени с мазнини, чрез интрастомашна инфузия на палмово масло, царевично олио или рибено масло. При контролните плъхове, декстрозата се използва, като изокалоричен заместител на етанола. Провежда се анализ на патологията и измерване на ендотоксините, както и на липидната пероксидация, на нивото на NF-kB и на информационна РНК (иРНК) на провъзпалителните цитокини (ЮТалфа, IL-beta, INF гама и IL-12), на С-С хемокините (регулирани от активирането на нормални Т-клетки, експресирани и секретирани [RANTES], на моноцитния хемотактичен хемокин [MCPJ-1, макрофагиален възпалителен протеин [М1Р]-1-алфа), на С-Х-С хемокините (цитокин индуциран неутрофилен хепоатрактант [CINC], на MIP-2, на IP-10 и на епителиалния неутрофил активиращ протеин [ENA]78) и антивъзпалителните цитокини (IL-10, IL-4 и IL-13). Активирането на NF-kB и повишаването на експресията на провъзпалителните цитокини С-С и С-Х-С хемокините се наблюдава в плъхове, показващи некротични възпалителни увреждания (хранени с рибено масло, етанол, царевично олио и етанол). Тези групи също имат повишени нива на ендотоксини и липидна пероксидация. Нивата на IL-10 и IL-4 иРНК са по-ниски в групите, показващи възпалителни чернодробни увреждания. Така активирането на NF-kB се появява в присъствие на провъзпалителни стимули и води до повишена експресия на Th 1 провъзпалителни цитокини и хемокини (Naji et al., 1999). FAS лиганда и неговия рецептор също са анализирани при чернодробни заболявания при алкохолици, които показват още един път, че Th 1 цитокините участват в автоимунните процеси, индуцирани при хепатити при алкохолици (Galle et al., 1995; Taieb et al., 1998; Fiore et al., 1999).

TNF-алфа също се явява основен сигнален път за некротичните възпаления, характерни за патогенезата на хепатитите при алкохолици. Доказани са повишени нива на чернодробен и серумен TNF при животински модели, изучаващи чернодробните увреждания при алкохолици и при чернодробни заболявания при хора-алкохолици (Grove et al., 1997; McClam и Cohen, 1989). Например открито е при едно от проучванията, че пациенти-алкохолици с хепатити имат по-високи нива на TNF-алфа (средно 26.3 ng/ L; 95% Cl, 21 до 30.9) в сравнение с нормални обекти (6.4 ng/L; Cl, 5.4 до 7.4). Пациентите, които впоследствие умират имат по-високи нива на TNF-алфа (34.7 ng/L; Cl, 27.8 до 41.6) в сравнение с пациентите, които преживяват (16.6 ng/L; Cl, 14.0 до 19.2). При пациенти-алкохолици с хепатити нивото на TNF-алфа показва позитивна корелация със серумния билирубин (г = 0.74: Р = 0.0009) и серумния креатинин (г = 0.81; Р = 0.0003). Пациенти-алкохолици с хепатит имат повишени нива на TNF-алфа в сравнение с пациенти-алкохолици с неактивни цирози (11.1 ng/L; Cl, 8.9 до 13.3) и при хора с остра форма на алкохолизъм но без чернодробни заболявания (6.4 ng/L, Cl, 5.0 до 7.8). Пациенти с аномална бъбречна функция имат по-ниски нива на TNF-алфа (14.1 ng/L; Cl, 5.4 до 22.8) в сравнение с пациенти-алкохолици с хепатити. Ето защо може да се направи заключението, че тези анализи на TNF-алфа при хепатити при алкохолици са по-показателни при острите форми, което предполага, че TNF-алфа играе роля за патогенезата (Bird et al., 1990).

TNF медиира много от биологичните действия на ендотоксина. Последни изследвания показват, че въвеждането на TNF може да причини чернодробни увреждания и че TNF може да медиира летален ефект на хепатотоксина галактозамин. Едни от мощните индуктори на TNF е ендотоксина. Тъй като пациенти-алкохолици с хепатити, често имат ендотоксемия и тъй като много от клиничните показатели за хепатит при алкохолици са известни с това, че имат биологичните действия HaTNF, направен е анализ за неговата активност при пациенти-алкохолици с хепатити. Базалното и липополизахарид-стимулирано TNF освобождаване от моноцитите на периферната кръв, като основен източник на TNF продукцията, са анализирани при 16 пациенти-алкохолици с хепатити и 16 здрави доброволци. Осем от 16-те пациента-алкохолици с хепатити и само един от 16-те здрави доброволци показаха спонтанна активност на TNF (р по-мал

66134 Bl ко от 0.05). След липополизахаридното стимулиране, средните стойности на освобождаването HaTNF от моноцитите на пациенти-алкохолици с хепатити е значително увеличено над два пъти, в сравнение със здравите контроли (25.3 +/- 3.7 спрямо 10.9 +/- 2.4 единици на ml, р помалко от 0.005). Ето защо може да се направи заключението, че моноцитите на пациентите-алкохолици с хепатити показват значително повишаване на спонтанно освободения и липополизахарид-стимулирано освобождаване на TNF в сравнение с моноцити от здрави доброволци (Ме Clain и Cohen, 1989).

Липополизахарид (ЬРЗ)-свързващият протеин (LBP) и CD 14 играят ключови роли, като интермедиатори при активирането на клетките от ендотоксини. Смята се, че изолиран от черва LPS участва в предизвикването на патологично чревно увреждане при чернодробни увреждания при алкохолици. Показано е, че при плъхове, хранени интрагастрално с етанол в масло за 4 седмици се повишават нивата на CD 14 иРНК и LBP в техните Купферови клетки и хепатоцити, съответно. Експресията на CD 14 иРНК също се анализира в немиелоидни клетки. Повишената LBP и CD 14 експресия бързо увеличава LPSиндуцираната експресия на различни провъзпалителни цитокини и корелира с присъствието на патологични чернодробни увреждания при алкохолици (Su et al., 1998; Lukkari et al., 1999).

Артритът е заболяване, което включва ставни възпаления. Ставните възпаления се проявяват като подувания, втвърдявания, увреждания свързани със сухожилията, зачервявалия и затопляния. Симптомите могат да бъдат съпроводени със загуба на тегло, повръщане или слабост. Когато тези симптоми продължават повече от две седмици, възпалителните артрити, например ревматоидните артрити могат да бъдат причина. Ставните възпаления могат да бъдат също причинени от инфекции, които могат да водят до специфични артрити. Много типове ставни артрити представляват дегенеративни ставни заболявания (остеоартрити).

Медикаментите, които обикновено се предписват за артрити и се отнасят до такива състояния са нестероидни антивъзпалителни лекарствени препарати (NSAIDs). NSAIDs включват аспирин и аспирин-подобни лекарствени препарати. Те редуцират възпалителните реакции, които причиняват ставната болка, втвърдяване и подуване на ставата. Обаче, NSAIDs са неспецифични лекарствени препарати, които предизвикват голям брой странични ефекти, включително къркорене на стомаха (Интернет страница на Департамента по Ортопедия, Вашингтонски Университет по Артритни заболявания, с Frederick Matsen (Chairman), www.orthop.washington.edu). В допълнение към NSAIDs, Celebrex™, циклооксигеназен (СОХ-2) инхибитор, се използва за да облекчи признаците и симптомите на остеоартрит и ревматоиден артрит при възрастни. Предписва се също за лечението на пациенти с фамилни аденоматозни полипозиси.

WO 2001/000229 описва комбинация от антагонисти на тумор некрозис фактор (TNF) и СОХ-2 инхибитори за лечение на възпаления.

TNF антагонистите също се използват за лечение на артрити. TNF антагонистите са описани например в WO 1991/003553.

Последни проучвания показват, че интрелевкин IL-18 играе провъзпалителна роля при ставният метаболизъм. Olee et al. (1999) показват, че IL-18 се продуцираот артикуларните хондроцити и индуцира провъзпалителни и катаболитни отговори. иРНК на IL-18 се индуцира от IL-1 бета в хондроцитите. Хондроцитите продуцират прекурсора на IL-18 и в отговор на IL-1 стимулират секрецията на зрялата форма на IL-18. Изследвания върху ефектите на IL-18 върху хондроцитите, по-нататък показват, че той инхибира TGF-бета-индуцираната пролиферация и увеличават продукцията на азотен окис. IL-18 стимулира експресията на някои гени в нормалните човешки артикуларни хондроцити, включително и тези за азотен-оксид синтетазата, индуцируемата циклооксигеназа, IL-6 и стромелизин. Генната експресия е свързана със синтезата на съответните протеини. Третирането на нормални човешки артикуларни хрущяли с IL-18 повишава освобождаването на глюкозаминогликани. Тези открития показват, че IL-18 е цитокин, който регулира хондроцитните отговори и допринася за хрущялната деструкция.

Локализацията на интерлевкин 1-бета-конвертиращия ензим (1СЕ)/каспаза-1 в човешките остеоартритни тъкани и неговата роля при зреенето на интерлевкин-1 бета и интерлевкин-18 е показана от Saha et al. (1999), Saha et al. изучават експресията и продукцията на каспаза-1 в

66134 Bl човешки нормални и остеоартритни (ОА) хрущяли и сухожилия, като правят количествен анализ на нивото на ICE в ОА хондроцитите и изследват връзката между топографското разположение на ICE, интерлевкин-1бета (IL-1-бета) и IL-18, както и апоптозиса на хондроцитите. Експериментите проведени при тези изследвания, показват, че ICE се експресира и синтезира и в човешки синовиални мембрани и в хрущяла, при значително поголям брой позитивно оцветени клетки в ОА тъканите, в сравнение с нормалните тъкани. ICE продукцията предимно се локализира в супрафициалната и горна средна обвивка на артикуларния хрущял. Продукцията на зрял 1Ь-1бета в ОА хрущялни експланти и хондроцити се блокира напълно от третиране със специфичен ICE инхибитор, който също значително намалява броя на IL-18 позитивните клетки. Връзката между активния IL-1 бета и ICE предполага, че ICE може да стимулира ОА прогресията чрез активиране на този провъзпалителен цитокин и че IL-18 може да играе роля при хрущялните патологични промени.

Grade et al. (1999) предполагат за провъзпалителната роля на IL-18 при ревматоидните артрити. Grade et al., забелязват значително повисоки нива на IL-18 иРНК и протеин в синовиалните тъкани при ревматоидни артрити в сравнение с нивата им при остеоартритните контроли. Показано е също така, че комбинацията от IL-12 и IL-15 с IL-18 индуцира продукцията на INFгама от синовиалните тъкани in vitro. По-нататьк, въвеждането на IL-18 в колаген/непълни Freund’s адювант-имунизирани мишки, улеснява развитието на ерозивни възпалителни артрити, което предполага, че IL-18 може да бъде и провъзпалител in vivo.

Обаче, за сега, освен за някои химични съединения, само за Т№алфа и 1Ь-1бета е показано, че чрез използването на разтворими техни рецептори или моноклонални антитела се редуцира колаген-индуцирания артрит (CIA, който е миши модел на ревматоиден артрит) (Williams et al., 1994), което се предлага като терапевтично средство за ревматоидни артрити.

Терминът “хронично или идиопатично възпалително чревно заболяване” включва най-малко две състояния: Болест на Crohn и язвени колити. И двете са заболявания на стомашно-чревния тракт, болестта на Crohn най-често оказва влияние върху тънкото черво. Тъй като той също засяга и дебелото черво, диференциална диагностика на язвените колити (виж по-долу) може да се окаже проблем.

Хронични възпалителни и язвени признаци при болестта на Crohn често започват с малки чревни обструкции или анормални болки, които могат да имитират остър апендицит; други прояви могат да доведат до усложнения. Протичането на болестта е хронично, и може да покаже ремисии при терапията. Появява се обикновено в ранните етапи от живота на възрастния индивид, като при половината от всички случаи започва между 20-30 години и в 90% от случаите между 10 и 40 години. Малко повече от мъжете са засегнати, в сравнение с жените.

Микроскопията показва общи прояви. Възпалението е непрекъснато: проявява се като фокуси на възпаление или като петна. Събиране на лимфоцити и плазмени клетки се среша главно в мукозата и субмукозата, но обикновено засяга всички слоеве (транс-стенно възпаление). Класическа микроскопска характеристика на болестта на Crohn е наличието на гранулирани клетки, заобиколени от лимфоцити. Разпространението на идиопатичните възпалителни чревни заболявания показват значителни вариации в географско отношение. Тези заболявания имат пошироко разпространение в Северна Европа и Съединените Щати, отколкото в страните от Южна Европа, Африка, Южна Америка и Азия, въпреки че с нарастването на урбанизацията и просперитети води до по-високо разпространение в частите на Южна Европа и Япония (Geberak abd Systematic Pathology, Churchill Livingstone, 3^rd edition 2000, JCE Underwood, Ed.).

При болестта на Crohn, клинично се различават две главни групи, първата включва пациенти, чиито заболявания продължават с ремисия около 3 години след началото на болестта, втората включва пациенти със заболявания продължаващи по-малко от три години.

Независимо от етиологията, има доказателства за присъствието на неподходящи Т-клетки и макрофагиално активиране при болестта на Crohn с повишена продукция на провъзпалителни цитокини, по-специално интерлевкини (IL) 1,2,6 и 8, интерферон (INF)-raMa и тумор некрозис фактор (ТКР)алфа. Болестта на Crohn се характеризира с постоянно (хронично) възпа8

66134 Bl ление, съпроводено от фибрози. Процесите на фибробластна пролиферация и отлагане на колаген, могат да бъдат медиирани от трансформиращия растежен фактор бета, който има доказано противовъзпалително действие, именно подпомагащо фибробластното възстановяване, синтеза на матрикс и потискане на възпалителните клетки, но вероятно участват също и много други медиатори.

Язвените колити са неспецифични възпалителни увреждания на дебелите черва, които обикновено започват в ректума и се разпространяват в различна степен. За разлика от болестта на Crohn, язвените колити са характерни само за дебелите черва,

Все повече данни показват, че язвеният колит е последствие от променена автоимунна реактивност, на мукозните увреждания, също могат да бъдат резултат от неподходящо Т-клетъчно активиране и индиректно увреждане, което е резултат от действието на цитокини, протеази и реактивни метаболити на кислорода от макрофагите и неутрофилите. Този по-късен механизъм на увреждане на чревния епител е наречен увреждане чрез “неправилния заместител”. Доказателства за автоимунна реакция е присъствието на себеактивирани Т-лимфоцити и автоантитела, насочени срещу чревно епителните клетки и ендотелните клетки и анти-неутрофилни цитоплазмени автоантитела (ANCA). Язвените колити, обаче не могат да бъдат считани за автоимунни заболявания, при които мукозното увреждане е директно последствие от автоимунна реакция на собствените антигени (General and Systematic Pathology, supra).

По отношение на терапията на болестта на Crohn, повечето хора първо са лекувани с лекарствени препарати, съдържащи мезаламин, субстанция, която подпомага контрола върху възпалителните реакции. Пациенти, които не се повлияват от него, или които не могат да го приемат могат да бъдат подложени на други мезаламин-съдържащи лекарствени препарати, общо известни като 5-ASA агенти. Възможни странични ефекти на мезаламиновите препарати включват гадене, повръщане, парливо усещане в гърдите, диария и главоболия.

Някои пациенти взимат кортикостероиди за контролиране на възпалителните реакции. Тези лекарствени препарати са по-ефективни при активна форма на болестта на Crohn, но те могат да предизвикат сериозни странични ефекти, включващи дори по-голямо предразположение към инфекция.

Лекарствени препарати, които супресират имунната система също се използват за лечение на болестта на Crohn. Най-често се предписват 6-меркаптопурин и подобния лекарствен препарат, азатиопин. Имуносупресивните агенти действат, чрез блокиране на имунната реакция, което допринася за възпалението. Тези лекарствени препарати могат да причинят странични ефекти, като гадене, повръщане и диария и могат да понижат резистентността на пациента към инфекции. Когато пациентите са лекувани с комбинация от кортикостероиди и имуносупресивни лекарствени препарати, дозата на кортикостероидите трябва във всички случаи да бъде намалена. Някои изследвания дават основание да се предположи, че имунносупресивните лекарствени препарати могат да повишат ефективността на кортикостероидите.

U. S. Food and Drug Administration одобрява лекарството инфликсимаб за лечение на умерена до остра форма на болестта на Crohn, което не отговаря на стандартните терапии (мезаламинови субстанции, кортикостероиди, имуносупресивни агенти) и за лечение на отворени, течащи фистули. Инфликсимаба първоначално е използван за лечение специфично за болестта на Crohn и представлява антитумор некрозис фактор - моноклонално антитяло. Анти-TNF премахва TNF от кръвния поток преди той да достигне до червата, и по този начин предотвратява възпалителните процеси.

Антибиотиците се използват за лечение на увеличаване на бактериалната флора в тънките черва, причинено от фистули или се дават при предхирургично състояние. За този общ проблем, доктора може да предпише един или повече от следните антибиотици: ампицилин, сулфонамид, цефалоспорин, тетрациклин или метронидазол.

Диарията и аномалната спазматична болка често се развиват, когато възпалението е отстранено, но допълнително лечение може също да бъде необходимо. Някои вещества против диария могат да бъдат използвани, включително дифеноксилат, лоперамид и кодеин. Пациенти, които са дехидратирани поради диария често са ле9

66134 Bl кувани c флуиди и електролити.

Остава като необходимост за ефективна терапия за лечение и/или предпазване от чревни възпалителни заболявания, по-специално болест на Crohn (CD) и язвени колити (UC), които се характеризират с намалени странични ефекти или при които почти липсват странични ефекти.

И хистологични и имунологични наблюдения показват, че клетьчно-медиираният имунитет и Т-клетъчното активиране са ключови характеристики на CD. Изследвания при хора и експериментални модели показват, че при CD, локалния имунен отговор предимно е Th 1-тип (Desreumaux et al. 1997) и че локално освободените цитокини, като INF-гама и TNF-алфа допринасят за подобряването и разширяването на възпалителния отговор (Reimund et al. 1996).

Цитокинът IL-18 играе важна роля за Th 1 медиираният имунен отговор и е в тясна връзка с действието на цитокина IL-12, при стимулирането на INF-гама. IL-18 също повишава продукцията на GM-CSF и IL-2, стимулира анти-СОЗ индуцираната Т-клетъчна пролиферация и повишава Fas-медиираното унищожаване на клетките - естествени убийци (NK клетките). Зрелият IL-18 се получава от неговия прекурсор чрез IL1бета-конвертиращия ензим (ICE, каспаза - 1). Рецепторът за IL-18 се състои от най-малко два компонента, коопериращи се при свързването с лиганда. Високо и ниско афинитетни свързващи места за IL-18 са открити в миши IL-12 стимулирани Т клетки (Okamoto et al., 1998), което предполага многостранен верижен рецепторен комплекс. Две рецепторни субединици са открити за сега и двете принадлежат на IL-1 рецепторното семейство (Okamoto et al., 1999). Сигналната трансдукция на IL-18 включва активиране HaNFkB (Matsumoto et al. 1997).

Наскоро е предположено, че IL-18 има известно участие при чревните възпалителни заболявания (Pizarro et al., 1999; Monteleone, et al. 1999).

Pizarro et al. (1999) характеризират експресията и локализацията на IL-18 във видовете чревни клетки и изолираните мукозни клетъчни популации от пациенти с болест на Crohn. Чрез използване на полуколичествен RT-PCR протокол, е открито, че IL-18 иРНК транскриптите се увеличават при свежо изолирани чревни епителни клетки и мононуклеарни клетки от ламина проприа при CD и сравнени с такива от язвени колити и контролни пациенти, при които липсва възпаление. Имунохистохимични анализи на хирургично отстранени чревни тъкани, показват локализация на IL-18 в мононуклеарните клетки от ламина проприа (по-специално в макрофагите и в дендритните клетки), както и в чревноепителните клетки. Western блот анализът доказва наличието на 18,3 кДа ивица, която дава реакция и с рекомбинантен и със зрял човешки IL-18 белтък, който се открива предимно при CD в сравнение с UC чревни мукозни биопсии; втора ивица, отговаряща на 24 кДа, която дава реакция с IL-18 прекурсора се наблюдава в невъзпалените области, както при CD, така и при UC биопсии и е единствената, която се среща при контроли, при които липсва възпаление.

Monteleone et al. (1999) потвърждават тези открития. Цялата чревна мукозна тъкан и мононуклеарните клетки на ламина проприа при 12 пациента с болест на Crohn и 9 пациента с язвени колити, и 15 пациента-контроли, които не страдат от чревни възпалителни заболявания са тествани за IL-18 чрез полуколичествен RT-PCR и Western блот анализ. Транскриптите на IL-18 се откриват при всички тествани проби. Повишено акумулиране на IL-18 иРНК, обаче, се наблюдава в мукозните клетки и в мононуклеарните клетки на ламина проприа при болни от болест на Crohn, за разлика от пробите от пациенти с язвени колити и пациентите-контроли. При пробите от пациенти с болест на Crohn, транскриптите за IL-18 са в по-голямо количество в мукозните проби, взети от засегнатите области. 18 кДа ивица, даваща реакция със зрелия IL-18 се открива предимно при мукозните проби. При мукозни проби от пациенти-контроли, не страдащи от IBD, IL-18 присъства, като 24 кДа полипептид. Субединицата (р20) на стабилно активния IL-1 -бета-конвертиращ ензим (ICE) се експресира в проби от CD или UC, където при чревно мукозните клетки от нестрадащи от IBD контроли, ICE се синтезира само като прекурсор (р45).

Day ег (1999) обобщава различните и частични противоречия относно функциите на IL18. Накратко, IL-18 е плейотропен интерлевкин, който има повишаваща възпалителните реакции и отслабваща функция. От друга страна, той повишава продукцията на провъзпалителни цито

66134 Bl кини, като TNF-алфа, поради което подпомага възпалението. От друга страна, той индуцира продукцията на N0, и е инхибитор на каспаза-1, и по този начин блокира зреенето на IL-1 бета и IL18, и вероятно намалява възпалението. Тази двусмислена роля на IL-18 сериозно отправя въпроса относно ефикасността на IL-18 инхибиторите по отношение на възпалителните реакции. По-нататък, поради взаимодействието на голям брой различни цитокини и хемокини в регулацията на възпалителните реакции, позитивния ефект при терапията или предпазването от възпалителни заболявания чрез блокиране само на един от участниците в предизвикването на възпалителните реакции, не е предвидим.

Във W0 1999/009063 се споменава за използването на инхибитор на IL-8 при хроничен и остър хепатит.

ЕР-А-0864585 описва използването на инхибитор за IL-18 при първична цироза и автоимунен хепатит, примерите се отнасят само до изолиране и клониране на IL-18 рецептор и получаването на негова разтворима форма.

ЕР-А-0974600 (негов аналог е BG 65519 В1) изброява няколко хепатитни заболявания, за които се споменава, че могат да бъдат лекувани с инхибиторите на IL-18. В същото време експерименталната част е ограничена само до получаване на антитяло срещу IL-18, без функционални данни свързани с това заболяване.

The Journal of Immunology, vol. 159, No 8 (1997) се отнася до предпазване от чернодробно увреждане, индуцирано от ендотоксин, чрез прилагане на антитяло за IL-18.

Кратко описание на изобретението

Настоящото изобретение се базира на откритието, че инхибиторите на IL-18 са ефективни за лечение и/или предпазване от различни заболявания или нарушения.

Първата цел на настоящото изобретение е да осигури нови средства за лечение и/или предпазване от увреждане. Ето защо изобретението се отнася до използването на инхибитор на IL18 за производството на медикамент за лечение и/или предпазване от чернодробно увреждане, било то остро или хронично. По-специално, изобретението се отнася до лечение и/или предпазване от хапатит при алкохолици, вирусен хепатит, имунен хепатит, фулминантен хепатит, чернодробна цироза и първична жлъчна цироза.

Втората цел на настоящото изобретение е да осигури нови средства за лечение и/или предпазване от артрит. Ето защо изобретението също се отнася до използването на инхибитори на IL18 за приготвянето на медикамент за лечение и/ или предпазване от артрит. Позитивният ефект на инхибиторите на IL-18 включва понижаване на остротата на заболяването, както и предпазване от разпространение на заболяването. Това откритие е неочаквано, тъй като от нивото на техниката, описано по-горе, не би могло да се заключи, че блокирането на един специфичен фактор, причинител на артрита, именно интерлевкин IL-18, би могъл да доведе до облекчаване на артрита или даже до лечение на ставни артритни заболявания.

Открито е също, че въвеждането на инхибитор на IL-18 значително намалява хрущялната ерозия в модел на зряла форма на артрит. Настоящото изобретение, следователно по-нататък се отнася до използването на инхибитор на IL-18 за производството на медикамент за лечение и/или предпазване от хрущялна деструкция.

Трета цел на настоящото изобретение е да осигури нови средства за лечение и/или предпазване от чревни възпалителни заболявания (IBD), по-специално на болест на Crohn и язвени колити. Изобретението, следователно също се отнася до използването на инхибитор на IL-18 за производство на медикамент за лечение и/или предпазване от IBD. В съгласие с настоящото изобретение е открито, че концентрациите на IL18ВР иРНК и белтък се повишават във възпалените райони на мукозата при биопсия, взета от пациенти страдащи от болест на Crohn. По-нататък при миши модел на чревни възпалителни заболявания е показано, че два различни инхибитора на IL-18 предпазват животните от тези заболявания.

Използването на комбинации от инхибитор на IL-18 и/или интерферон и/или TNF антагонист и/или СОХ-2 инхибитор също се считат, че са в съответствие с настоящото изобретение. За да се приложат генно терапевтични подходи за доставяне на инхибитор на IL-18 към заболелите тъкани или клетки, следващи аспекти на изобретението се отнасят до използването на експресионни вектори, включващи кодиращи секвенции на инхибитор на IL-18 за лечение и/или предпазване на болестни състояния. Изобре

66134 Bl тението по-нататък се отнася до използването на ендогенно генно активиране на инхибитори на IL18 и до използването на клетки, генетично модулирани да експресират инхибитори на IL-18 за предпазване и/или лечение на чернодробни заболявания, артрити и IBD.

Кратко описание на фигурите

Фигура 1 показва хистограма, отбелязваща нивата на серумен INF-гама (pg/ml) след инжектиране на различни количества от рекомбинантен IL18BP (0; 0,04; 0,4; 4 mg/kg) в мишки, 1 h преди инжектирането на LPS. Кръвните проби са взети 5 h след LPS инжекцията и са анализирани за циркулиращ IFN-гама чрез ELISA.

Фигура 2 показва хистограма, отбелязваща нивата на серумен Аланин аминотрансфераза (ALT). Мишките са инжектирани с нарастващи дози от рекомбинантен IL 18ВР (0,0,04,0,4,4 mg/ kg), преди инжектиране с LPS в P.acnes сензитирани мишки. Кръвните проби са взети 5 h след LPS инжекцията и серумните нива на ALT са измерени SF=Sigma-Frankel: 1SF Единица от AST/ ALT ще бъде 4,82 х 10⁴ micromol глутамат/min при pH 7.5 при 25°С.

Фигура 3 показва времето на оцеляване на мишките след LPS инжекция. Мишките са инжектирани с различни дози от рекомбинантен IL18BP (0; 0,04; 0,004; 4 mg/kg) 20 min преди инжектирането на LPS в Р. acnes сензитирани мишки. Триъгълници: 4 mg/kg; малък ромб: 0,4; голям ромб 0,04; кръгове: неинжектирани с IL18ВР.

Фигура 4 показва хистограма, отбелязваща нивата на серумен INF-гама, измерени 5 h след инжектиране на различни количества от рекомбинантен IL18BP (0; 0,4; 4 mg/kg), който е въведен 20 min преди инжектирането на LPS в P.acnes сензитирани мишки.

Фигура 5 показва оцеляването на мишките след инжектиране на поликлонален IL-18 антисерум или нормален заешки серум (NDS = контрола) 30 min преди инжектирането на 40 mg/ ml (летална доза) LPS получен от Е. coli (Фиг. 5А) или от S. thyphimurum (Фиг. 5Б). Триъгълници: мишките са инжектирани с IL-18 антисерум; кръгчета: мишките са инжектирани с NDS. Върху Х-осите са отбелязани дните след LPS въвеждането. *р<0.05.

Фигура 6 показва хистограма, отбелязваща н средното + SEM от 5 мишки на група, третирани по следния начин. Мишки, инжектирани интраперитонеално (i.p.) с анти-Ш-18 антисерум, с разтворими TNF-алфа рецептори (TNFsRp55) или със солеви разтвор, непосредствено след интравенозно (i.v.) въвеждане на Конкавалин A (Con А; Фиг. 6А) или РЕА (Pseudomonas aeruginosa, Фиг. 6Б). **р<0.01, ***р<0.001, спрямо СопА или РЕА само; # р<0.01 спрямо TNFsRp55 или IL-18, обработени чрезАМЗУА.

Фигура 7 показва ефекта на IL-18ВР върху клинични стойности при миши модели на артрити. Фиг. 7А показва диаграма, отбелязваща стойностите, измерени 1 ден след въвеждането в мишки на различни количества IL18BP или INF-бета или NaCl i.p. (интраперитонеално). Символи: запълнени триъгълници: 10 000IU IFNбета; незапълнени триъгълници: 3 mg/kg IL18ВР; ромбове: 1 mg/kg IL-18BP; кръгчета: 0.5 mg/kg IL-18BP; незапълнени квадратчета: 0.25 mg/kg IL-18BP и запълнени квадратчета: NaCl. Дните на третиране са отбелязани върху х-осите. Статистическите данни са изчислени чрез Mann Whitney тест-а. Фиг. 7Б показва хистограма, отбелязваща AUC (областта под кривата), получена от графиката на Фиг. 7А η = броя на животните.

Фигура 8 показва ефектът на IL 18ВР върху подуването на лапата. Фиг. 8А показва диаграма, отбелязваща резултатите, получени от измерването на плътността на лапата (подуването) на засегнатите задни лапи на всяко едно от животните, третирани с различни количества IL-18ВР. У-оста показва промените в плътността в милиметри от началото на третирането. Символите са както в предишната фигура 7. Фиг. 8Б показва хистограма, отбелязваща AUC получена от Фиг. 8А. η = броя на животните.

Фигура 9 показва анализа от броя на засегнатите задни лапи по време наостри артрити, т.е. разпространението на заболяването към други стави. Символи: запълнени квадратчета NaCl (контрола), триъгълничета: 10 mg/kg IL-18BP, обърнати триъгълничета: 3 mg/kg IL-18BP, ромбове: 1 mg/kg IL-18BP, кръгчета: 0,5 mg/kg IL-18 ВР и незапълнени квадратчета: 0.25 mg/ kgIL-18BP.

Фигура 10 показва хистограма, отбеляз

66134 Bl ваща скоростта на ерозия на хрущялите при ставни заболявания.

Фигура 11 показва хистопатологията на миши стави. В края на експеримента лапите, които първо са развили артрит се дисектират, фиксират се и се обработват, както е описано в Пример 10 по-долу. Фиг. ПА: нормална миша става. Фиг. 11Б: става от мишка развила артрит. Фиг. 11 В: става от мишки третирани с rhIIL-18BP.

Фигура 12 показва хистограма, отбелязваща нивата на анти-колаген тип II антитела от изотип IgGl (незапълнени колони) или IgG2a (защриховани колони) от мишки третирани с 3 mg/kg IL-18BP или солеви разтвор, съответно. Измерванията са направени на 4-тия ден (D4) или 8-ия ден (D8) от заболяването.

Фигура 13 показва хистограма, отбелязваща нивата IL-6 в pg/ml при животни, третирани с 1, 3 или 10 mg/kg от IL18BP, 10 000 Ш от интерферон бета (IFN-b), нормален миши серум (NMS) или солеви разтвор (NaCl), съответно.

Фигура 14 показва експресията на hllL18ВР и IL-18 иРНК транскрипти в чревни биопсии от пациенти, страдащи от активна форма на болестта на Crohn, язвени колити или от нормални здрави индивиди. Представените RT-PCR продукти са показани за IL-18ВР, за IL-18 и за house keeping генът (бета-актин) (Фиг. 14А). Относителни количествени анализи въз основа на ивиците, оцветени с етидиев бромид са направени, чрез използването на Kodak Digital Imaging Software и са представени като съотношение спрямо прицелният ген за бета-актин. Прицелният ген за IL-18 е показан на Фиг. 14Б и за IL-18BP е показан на Фиг. 14В.

Фигура 15 показва експресията на hlL18ВР транскрипти и на белтък в HUVECs (човешки ендотелни клетки на пъпната връв) и експресията на белтъка в ТНР1 (човешка моноцитна клетъчна линия). РНК е изолирана от нетретирани ендотелни клетки (в средата) и ендотелни клетки, стимулирани с Ш-1бета, TNF-алфа, INF-гама. Положителна контрола: черво от пациент, страдащ от болест на Crohn; негативна контрла: без кДНК. Анализ на IL-18BP и IL-18 експресията се прави чрез полуколичествен RTPCR (Фиг. 15 А). Културална супернатанта от нетретирани клетки (в средата) и след 24 h активиране с 1Б-1бета, TNF-алфа, INF-гама на HUVEC (Фиг. 15Б) или ТНР1 (Фиг. 15В) клетки се ана лизират за IL-18ВР и IL-18 белтъчна продукция, чрез ELISA.

Фигура 16 показва промени в телесното тегло между ден 1 и ден 10 при миши модел на IBD след интраперитонеално (i.p.) въвеждане на солеви разтвор (NaCl) или на IL-18ВР (8 mg/kg). Промените в телесното тегло се представят като процент променено тегло спрямо ден 1. Показани са средните стойности на SEM от две групи, 8 мишки на група.

Фигура 17 показва анализа при чревни клетки, каудални лимфни възли и далак, изолирани от IL-18 ВР третирани спрямо нетретирани IBD мишки. Фиг. 17 Б показва общият брой на клетките, които присъстват в каудалните лимфни възли. Фиг. 17В показва процента от клетките, оцветени позитивно за CD47CD69* в далака. Данните представят средните стойности и SEM. * показва статистически значимите стойности.

Фигура 18 показва количеството на INF гама (Фиг. 18А и Б) и Т№алфа (Фиг. 18 В и Г) продуцирани след 48 h от клетките на каудалните лимфни възли (Фиг. 18 А и В) и от клетките на далака (Фиг. 18 Б и Г) след стимулиране с CD3/ CD28, присъстващ в супернатантите. Показани са средните стойности и SEM.

Фигура 19 показва съдържанието на TNFалфа (Фиг. 19А) и INFraMa (Фиг. 19Б) в чревни хомогенати. Данните са коригирани за теглото на червото. Показани са средните стойности и SEM. * показва статистически значима разлика.

Подробно описание на изобретението

Настоящото изобретение се базира на откритието за позитивния ефект на инхибиторите на IL-18 при различни заболявания и нарушения.

Терминът “инхибитор на IL-18” във връзка със същността на това изобретение, се отнася до която и да е молекула, модулираща продукцията на IL-18 и/или действието му, по такъв начин, че продукцията на IL-18 и/или действието му се намалява, редуцира или частично, съществено или напълно се предотвратява или блокира. Терминът “инхибитор на IL-18” се използва, за да обхване инхибитори на продукцията на IL-18 както и инхибитори на действието на IL-18.

Инхибитор на продукцията може да бъде която и да е молекула, която негативно влияе вър

66134 Bl xy синтезата, процесинга или зреенето на IL-18. Инхибитори, считани съгласно настоящето изобретение могат да бъдат например, супресори на генната експресия на интерлевкин IL-18, антисенс-иРНК редуциращи или предотвратяващи транскрипцията на IL-18иРНК или водещи до деградиране на иРНК, протеините предотвратяващи коректното нагъване, или такива, които частично или значително предотвратяват секрецията на IL18, протеази разграждащи IL-18, след като веднъж е синтезиран, инхибитори на протеазите късащи прекурсора на IL-18 с цел да се предотврати образуването на зряла форма на IL-18, такива като инхибиторите на каспаза-1 и други подобни.

Инхибитор на действието на IL-18 може да бъде IL-18 антагонист. Антагонистите могат или да се свързват или да отделят самата молекула на IL-18 тъй като притежават значителен афинитет и специфичност за частично или значително неутрализиране на IL-18 или на IL-18 свързващото място (свързващите места) отговорни за свързването на IL-18 с неговите лиганди (като например към неговия рецептор). Антагонистът може също да инхибира IL-18 сигналния път, който се активира в клетките при свързване на IL-18 с рецептора.

Инхибитори на действието на IL-18 могат също да бъдат разтворими IL-18, рецептори или молекули, имитиращи рецепторите, или агентите блокиращи рецепторите за IL-18, или IL-18 антитела, такива като поликлонални или моноклонални антитела, или който и да е друг агент или молекула, предотвратяваща свързването на IL-18 с неговите прицелни места, като по този начин намалява или предотвратява насочването на вътреклетъчни или извънклетъчни реакции, медиирани otIL-18.

Съгласно първия аспект на настоящото изобретение, инхибитори на IL-18 се използват за производството на медикамент за лечение и/ или предпазване от чернодробно увреждане. Поспециално, изобретението се отнася до използване на инхибитор на IL-18 за производството на медикамент за лечение и/или предпазване от остри и хронични чернодробни заболявания, и по-специално от хепатит при алкохолици, вирусен хепатит; имунен хепатит, фулминантен хепатит, чернодробна цироза и първична жлъчна цироза.

Терминът чернодробно увреждане или чер нодробно заболяване, използван тук включва различни и разнообразни патологични състояния. Някои от състоянията са отнесени към настоящото изобретение и са обяснени в детайли в “Предшестващо ниво на техниката” по-горе. Понататък чернодробните заболявания, които могат да бъдат лекувани и/или предотвратени съгласно настоящето изобретение включват, например пирогенен чернодробен абсцес. Това заболяване също се нарича бактериално чернодробно заболяване и представлява гной-избиваща дупка в черния дроб. Причините за чернодробен абсцес са многостранни. Той може да се развие при абдоминална инфекция като апендицит, дивертикулит или перфорация на червата; инфекция на кръвта; инфекция на жлъчните (в чернодробния секрет) пътища; или травма, при която нараненият черен дроб се инфектира. Найчесто срещаните причинители на чернодробен абсцес са Escherichia coli, Proteus vulgaris и Enterobacter aerogenes. Случаите обхващат 1 на 10,000 хора.

Чернодробните заболявания при алкохолици могат да бъдат лекувани и/или предотвратени, чрез използването на инхибитори на IL18, съгласно изобретението. Те включват остри или хронични възпаления на черния дроб индуцирани от злоупотреба с алкохол. Хепатитите при алкохолици, обикновено се появяват след години на продължително пиене. Колкото по-дълго продължава и в колкото по-големи количества е алкохолната консумация, толкова по-голяма е вероятността от развиване на чернодробни заболявания. Липсата на хранителни вещества се получава като резултат от поемането на празни калории от алкохола, редукция на апетита и понижена абсорбция (неадекватна абсорбция на хранителни вещества в чревния тракт). Липсата на хранителни вещества води до чернодробни заболявания. Токсичността на етанола върху черния дроб, индивидуалното предразположение към алкохол-индуцирани чернодробни заболявания и генетичните фактори също допринасят до развитието на чернодробни заболявания при алкохолици.

В съответствие с настоящото изобретение, чернодробната цироза може да бъде лекувана и/или предотвратена чрез използване на инхибитори на IL-18. Цирозата е хронично чернодробно заболяване, което причинява увреждане

66134 Bl на чернодробната тъкан, нараняване на черния дроб (фибрози, нодуларни регенерации), прогресивно намаляване на чернодробната функция, изтичане на течност в абдомена (асцити), нарушения свързани с кървенето (коагулопатия), повишено налягане на кръвоносните съдове (портална хипертензия) и нарушения в мозъчната функция (чернодробна енцефалопатия). В следствие на увреждания и наранявания на черния дроб, той става неспособен за адекватно отстраняване на остатъчните продукти на обмяната (токсините) от кръвта, нараняването на тъканите води до повишено налягане (портална хипертензия) във вените между червата и слезката към черния дроб. Повишена алкохолна консумация води до цироза. Други причини за цироза включват инфекции (като хепатити), заболявания и дефекти при филтрирането на жлъчката (като жлъчна стеноза или обструкция), цистична фиброза и повишена абсорбция на желязо и кобалт.

Типът на цироза зависи от причината на заболяването. Усложненията причинени от цироза могат да бъдат много остри. В U.S. цирозата е 9тата поред причина за смъртността. Неврологични проблеми (като хепатитна енцефалопатия) могат да бъдат развити. Повишено събиране на течност в абдоминалната празнина (асцити) се причинява от понижено ниво на телесните протеини, повишен натрий и повишено налягане на кръвоносните съдове в черния дроб (портална хипертензия). Порталната хипертензия може да причини повишено налягане, повишен размер и напълване с кръв на кръвоносните съдове в езофагуса (езофагиални разширения). Могат да се появят проблеми с кървенето и съсирването. Повишеното налягане на кръвоносните съдове и проблемите с кръвосъсирването могат да повишат вероятността от остри и животозастрашаващи хеморагии.

Следващо увреждане, което може да бъде причислено към термина “чернодробно увреждане” съгласно настоящото изобретение е автоимунния хепатит. Това заболяване е възпаление на черния дроб, причинено от взаимодействие с имунната система. Автоимунният хепатит е тип хронично активен хепатит. Клетъчни имунни реакции могат да причинят хроничен активен хепатит. Много от циркулиращите антитела могат да бъдат открити в кръвта на пациенти с хронични активни хепатити. Други автоимунни за болявания могат да бъдат свързани с хроничен активен хепатит или могат да се намерят в роднини на пациенти с хроничен активен хепатит. Тези заболявания са тироидит, захарен диабет, язвени колити, Combs-позитивна хемолитична анемия, пролиферативни гломерулонефрити и синдром на Sjogren. Рисковите фактори могат да включват тези заболявания или рискови фактори, свързани с хроничен активен хепатит. Заболяването се среща при 4 от всеки 10,000 хора.

Жлъчната артрезия е следващо заболяване в обхвата на термина “чернодробно увреждане”. Тя представлява обструкция на жлъчните канали, причинена от неспособност да функционират още в процеса на образуването им преди раждането (in utero). Жлъчната артрезия се причинява от аномално и неадекватно развитие на жлъчните канали вътре или извън черния дроб. Целта на жлъчната система е да отвежда остатъчните продукти от черния дроб, да доставя жлъчните соли необходими за разграждане на мазнините до тънките черва. При това състояние, жлъчният поток от черния дроб до жлъчния мехур е блокиран. Това може да доведе до чернодробно увреждане и цироза на черния дроб, което ако не се лекува при всички случаи е фатално.

Съгласно изобретението, инхибитори на IL-18 също се използват за производството на медикамент, за лечение и/или предпазване от хроничен активен хепатит, също наречен хроничен агресивен хепатит. Той представлява продължително възпаление на черния дроб, което причинява увреждания на чернодробните клетки. Причините за хроничен активен хепатит, включват вирусна инфекция, реакция срещу въвеждане на лекарствен препарат, метаболитни нарушения или автоимунни заболявания. Може да няма и никаква очевидна причина. Заболяването се характеризира с некроза или смърт на чернодробните клетки, активна възпалителна реакция и фиброза, която може да доведе до чернодробна дисфункция, цироза или смърт. Заболяването се среща при всеки 1 от 10,000 хора. Рискови фактори са автоимунните заболявания, предишна инфекция с хепатит С или позитивна реакция за хепатит А или хепатит В антиген над 6 месеца.

Хроничният хепатит продължава известно време, като мека, непрогресивна форма на

66134 Bl чернодробно възпаление и също е заболяване, причисляващо се към термина “чернодробно увреждане”, съгласно настоящото изобретение.

Съгласно настоящото изобретение, инхибитори на IL-18 също се използват за производството на медикаменти за лечение и/или предпазване от първична жлъчна цироза (РВС). РВС е състояние на възпаление, причинено от обструкции на жлъчния поток в черния дроб, причиняващи увреждания на чернодробните клетки. Жлъчните канали в черния дроб се възпаляват поради неизвестна причина. Заболяването се среща предимно при жени на средна възраст. Началните симптоми са постепенни, като първо се появява сърбеж на кожата. Появява се и възпаление на жлъчните канали в черния дроб. Във всички случаи се развива жлъчна цироза. Заболяването може да бъде свързано с автоимунни нарушения. Заболяването се среща при всеки 8 от 100,000 души. Инхибиторите на IL-18 описани тук, могат да бъдат използвани за лечение на остри чернодробни натравяния, например причинени от високо количество парацетамол. Такива остри чернодробни натравяния могат да се дължат на предозиране с парацетамол и могат да бъдат случайно или нарочно причинени.

Както е показано в примерите по-долу, изобретателите на настоящото изобретение изненадващо откриват, че инхибитори на IL-18 са отчасти ефективни за предпазването и лечението на фулминантен хепатит (остър хепатит). Ето защо изобретението за предпочитане се отнася до предпазване и/или лечение на флуминантен хепатит.

Съгласно втори аспект на настоящото изобретение, инхибитори на IL-18 се използват за производството на медикамент за лечение и/ или предпазване от артрит. Терминът “артрит” както се използва тук включва всички типове артрити и артритни състояния, и острите и хронични артрити, както е дефинирано например в интернет страницата на Департамента по Ортопедия на Университета по артритни заболявания, Вашингтон (www.orthop.washington.edu). Примери за артритни състояния са анкилозните спондилити, болки в гърба, синдрома на разместената китка (carpal), синдрома на Ehlers-Danlos, подагра, младежки артрит, лупус еритроматозус, миозити, остеогенни нарушения, остеопорози, полиартрерити, полимиозити, псориазис-артрити, синдром на Reiter, склеродема, артрити свързани с чрев ни заболявания, болест на Behcet, детски артрити, дегенеративни ставни заболявания, фибромиалгия, инфекциозни артрити, болест на Lyme, синдром на Marfan, остеоартрити, остеонекрози, болест на Pagets, полимиалгия ревматика, превдоподагра, дистрофия на симпатикусовия рефлекс, ревматоиден артрит, ревматизъм, синдром на Sjorgen, семейни аденоматози, полипоза и други подобни.

За предпочитане, съгласно настоящото изобретение, инхибитори на IL-18 са осигурени, за лечение и/или предпазване от възпалителни артрити. Възпалителните артрити се класифицират като хронични артрити, съгласно появата и продължителността им, или повтарящата се поява на болестта.

В предпочитан вариант на изобретението, възпалителен артрит е ревматоидния артрит (RA). RA причинява възпаление на обвивките на ставите (синовиалната мембрана, епителна клетъчна обвивка) и/или на вътрешните органи. Тенденцията на заболяването е да продължи много години, като засяга обикновено много различни стави на тялото и от друга страна може да причини увреждания на хрущялите, костите, сухожилията и лигаментите. Ставите, които могат да бъдат засегнати от RD са вратните стави, раменните стави, лакътните стави, бедрените стави, китките, ставите на ръцете, колянните стави, глезените и ставите на стъпалата например. В много случаи, ставите са възпалени симетрично, което е типична картинка за RA.

RA преобладава при 1% от популацията на Съединените Щати и е разпространен при всички етнически групи и възрасти. Появява се по целия свят и като броят на жените превъзхожда 3 пъти този на мъжете, страдащи от RA.

Както е показано в примерите по-долу, доказано е, че инхибитор на IL-18 показва висока ефективност и позитивен ефект върху ерозирането на хрущялите. Ето защо изобретението по-нататък се отнася до използване на инхибитор на IL-18 за производството на медикамент за лечение и/или предпазване на хрущялна деструкция, т.е. до използването на инхибитор на IL-18 като хондропротективен агент. Инхибиторът на IL-18 може да се използва за всяко едно състояние, при което се появява хрущялна деструкция или ерозия. Хрущялната деструкция представлява е прогресивно разруша

66134 Bl ване на структурния интегритет на ставния артикуларен хрущял. Тя се появява например при състояния, засягащи артикуларния хрущял, като ревматоиден артрит, младежки ревматоиден артрит или остеоартрит, но също и при синовиални инфекции например.

Трети аспект от настоящото изобретение се отнася до използването на инхибитор на IL18 за производството на медикамент за лечение и/или предпазване от възпалително чревно заболяване. То се базира на откритието, че инхибитор на IL-18 потиска възпалението на мукозата при пациенти, страдащи от CD. По-нататък то се базира на откритието, че въвеждането на различни инхибитори на IL-18 имат предпазен ефект при миши модели на колити.

Повишаването на IL-18 в мукозата при заболели от CD пациенти, вече е описана в нивата на техниката (Monteleone, et al. 1999, Pizarro, et al. 1999).

След като е демонстрирано присъствието на големи количества от IL-18 ВР в районите на възпаление на чревната мукоза, съгласно изобретението, още по-изненадващо е откритието, че системното въвеждане на IL-18BP има изявен позитивен ефект при развиването на симптомите на колити при животински модели. Въпреки че IL-18BP вече ендогенно се повишава при подагра на CD пациенти, демонстрирано е в примерите по-долу, че количеството на IL18ВР в тялото, което е възможно да се продуцира, не е достатъчно, за да се пребори с болестта.

За предпочитане, съгласно настоящото изобретение, възпалителното заболяване на червата е болест на Crohn или язвен колит.

В предпочитан вариант на настоящото изобретение, инхибитор на IL-18 се избира от инхибиторите на каспаза-1 (ICE), от антитела, насочени срещу IL-18, от антитела срещу която и да е субединица на рецептора за IL-18, от инхибитори на IL-18 сигналния път, антагонисти на IL-18, които се конкурират с IL-18 и блокират IL-18 рецептора и IL-18-свързващи белтъци, от изоформи, мутеини, рекомбинантни белтъци, функционални пермутирани производни, активни фракции или произхождащи от тях циклични премутирани производни, които имат същата активност.

Терминът “IL-18 свързващи белтък” се из ползва тук като синоним на “IL-18BP”. Той включва IL-18 свързващи белтъци, дефинирани в WO 1999/009063 или в Novick et al., 1999, включващи комбинирани варианти и/или изоформи на IL-18 свързващите белтъци, както е дефинирано в Kim et al., 2000. По-специално, човешките изоформи а и с на IL-18BP се използват, съгласно настоящето изобретение. Белтъците използвани, съгласно настоящето изобретение могат да бъдат гликозилирани или негликозилирани, те могат да бъдат производни на естествени източници, като урината или за предпочитане да бъдат получени, като рекомбинантни. Рекомбинантната експресия може да бъда осъществена в прокариотни експресионни системи, като Е. coli или в еукариотни и за предпочитане от бозайници, експресионни системи.

Както се използва тук, терминът “мутеини” се отнася до аналози на IL-18ВР, или аналози на вирусен IL-18ВР, при които един или повече аминокиселинни остатъка, са отстранени или един или повече аминокиселинни остатъка са добавени към естествената секвенция на IL18ВР, или на вирусния IL-18BP, без да се променя съществено активността на получените продукти, в сравнение с дивия тип IL-18ВР. Тези мутеини се приготвят чрез известни синтетични методи и/или чрез техника на насочен мутагенез или чрез други подходящи известни техники.

Всеки мутеин за предпочитане има секвенция от аминокиселини, значително дублираща тази на IL-18BP, или значително дублираща тази на вирусния IL-18ВР. Една от активностите на IL-18BP е свързана със способността му да се свързва с IL-18. Колкото по-дълго време мутеина има значителна свързваща активност към IL-18, толкова по-успешно той може да бъде използван за пречистване на IL-18 чрез афинитетна хроматография и по този начин може да се счита, че има значително наподобяваща активност на тази на IL-18ВР. Следователно, може да се определи дали даден мутеин има по същество същата активност, като IL-18ВР чрез рутинни експериментални средства, включващи подлагане на такъв мутеин, например на прост сандвич-конкурентен анализ за определяне дали се свързва или не се свързва правилно с белязан IL-18, чрез радиоимуноанализ или чрез ELISA.

Мутеините на полипептидите на IL-18ВР или мутеините на вирусните IL-18BP, които мо

66134 Bl гат да бъдат използвани, съгласно настоящото изобретение, или кодиращите ги нуклеинови киселини, включват ограничена група от значително съответстващи секвенции или заместващи пептиди или полинуклеотиди, които могат да бъдат рутинно получени от който и да е специалист в областта, без провеждане на крайни експерименти, на базата на техники и ръководства, представени тук.

Предпочитани промени при приготвянето на мутеини, съгласно настоящото изобретение са тези, известни като “консервативни замествания”. Консервативни аминокиселинни замествания в полипептидите или в белтъците на IL-18BP или във вирусните IL-18ВР могат да включват синонимия аминокиселини, от групата, в която аминокиселините имат съществено еднакви физикохимични свойства, при които замествания между отделните членове на групата ще се запази биологичната функция на молекулата (Grantham,

1974). Ясно е, че инсерции и делеции на аминокиселини, могат също да бъдат направени в горедефинираните секвенции, без да се промени тяхната функция, по-специално ако инсерци5 ите или делециите да обхващат само няколко аминокиселини, например под 30 и за предпочитане под десет, и при които не се отстранява или заместват аминокиселините които са от критично значение за функционалната конформация, например цистеинови остатъци. Белтъци и мутеини, получени чрез такива делеции и/или инсерции са включени в настоящото изобретение.

За предпочитане синонимните аминокиселинни групи са тези, дефинирани в Таблица I. По-предпочитани, синонимни аминокиселинни групи за тези, дефинирани в Таблица II; и най-предпочитани синонимни аминокиселинни групи са тези, дефинирани в Таблица III.

ТАБЛИЦА I

ПРЕДПОЧИТАНИ ГРУПИ ОТ СИНОНИМНИ

АМИНОКИСЕЛИНИ

Аминокиселини

Синонимни групи

Ser	Ser, Thr, Gly, Asn
Arg	Arg, Gin, Lys, Glu, His
Leu	lie, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Pro	Gly, Ala, Thr, Pro
Thr	i Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr

66134 Bl

1. ?, III:!, LiSIJ, '/ai c, Her. G!

п ^: А>	11:1,' ч L·, Va:, I.'-ij, le ίιρ h (: yi lie, Va L'=sj, Fhes
Г/1	ilp \ 1:. · his, lie, Va. Lnu, yr
:;уз	!:·} Ί Ί yi
rli=	Gu L’! L , Thr, Arc, is
Giri	•3u L ί sn, His.’Tr, Ar·:, Sin
Λ!>'	G П 4 d _t ASn
Ι-F⁵	G is G !i is. Arg, Lys
iuj:	G и 4 > i, i; :>

Gilii

Mb

Till

Asp 1 / i, sί,Gin, Hs, Aig, Glu

F^:li = , I ·ι ' ΊΙ, Lsu, IViet

T: J

ТАБЛИЦА It

АМИНОКИСЕЛИ В И

A ин : киселини r У.· ¹ груки

Pi:	Hi .ya, Arg
Li ii	1 ., He, Phe, Mel
Fl?	All Pro
711	А’ 1
Al: ’yi G,	^;:,r:, AJa A Met, llo •4 1 •*l I h:, heL Ph€!, VsJ. !..ej
Fl 3 Pi	M - I., “)T, lie, Leu, Fha ^:3l ϊ. Tyr
v 5 H ; G ί	¹ ϋ, Ser -A, Gh, Arg J 11, Sin, His

66134 Bl

Asn	Asp, Asn
Lys	Lys, Arg
Asp	Asp, Asn
Glu	Glu, Gin
Met	Met, Phe, lie, Val, Leu
Trp	Trp

ТДЕДИЦАЩ ДАЙ-ПРЕДПОШТАНИ·ГРУПИ ОТ СИНОНИМНИ АМИНОКИСЕЛИНИ

Аминокиселини

Синонимни групи

Ser	Ser
Arg	Arg
Leu	Leu, lie, Met
Pro	Pro
Thr	Thr
Ala	Ala
Val	Val
Gly	Gly
He	lie, Met, Leu
Phe	Phe
Tyr	Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His
Gin	Gin
Asn	Asn
Lys	Lys
Asp	Asp
Glu	Glu
Met	Met, ...
Trp	Met

66134 Bl

Примери за получаването на аминокиселинни замествания в белтъци, които могат да бъдат използвани за получаване на мутеини от полипептиди или белтъци на IL-18 ВР, или мутеини от вирусни IL-18BP за приложение в настоящото изобретение включват които и да са известни стъпки на метода, както са представени в US патенти RE 33,653, 4,959,314, 4,588,585, и 4,737,462 на Mark et al.; 5,116,943 на Koths et al.,4,965,195 HaNamenetal.;4,879,lll на Chong et al., и 5,017,691 на Lee et al.; и лизин заместени белтъци представени в US патенти No. 4,904,584 (Shaw et al.).

Терминът “рекомбинантен белтък” се отнася до полипептид, включващ IL-18ВР или вирусен IL-18ВР, или мутеин или фрагменти от тях, рекомбинантно свързани с друг белтък, който например има по-дълго време на живот в телесните течности. IL-18 ВР или вирусен IL-18ВР може по този начин да бъде рекомбинантно свързан с друг белтък, полипептид или подобни, например с имуноглобулин или фрагмент от него.

“Функционални производни”, както се използва тук, включва производни на IL-18 BPs или на вирусен IL-18BP и техни мутеини и рекомбинантни белтъци, които могат да бъдат приготвени от функционални групи, които се явяват странични вериги на остатъците или на N- или на С-крайно разположените групи, известни в областта и които са включени в изобретението дотолкова доколкото те остават фармацевтично приемливи, т. е. те не нарушават активността на белтъка, която е по същество същата като активността на IL-18ВР или на вирусните IL-18ВР и не се съобщава съединенията, които ги включват да имат токсични свойства.

Тези производни могат например да включват полиетилен гликолови странични вериги, които могат да маскират антигенните места и да удължат времето на живот на IL-18BP или на вирусния IL-18ВР в телесните течности. Други производни включват замествания със алифатни естери на карбоксилни групи, със амиди на карбоксилни групи, чрез реакция с амоний или първични или вторични амини, с N-ацилни производни на свободни амино групи на аминокиселинни остатъци образувани с ацилни остатъци (например алканоил или карбоциклени арилни групи) или О-ацилни производни на свободни хидроксилни групи (например тези на серилови или треонилови остатъци), формиращи ацилови остатъци.

Като “активни фракции” на IL-18ВР, или на вирусен IL-18BP, мутеини и рекомбинантни белтъци, настоящото изобретение включва който и да е фрагмент или прекурсори на полипептидни вериги от белтъчните молекули, самостоятелни или заедно със свързани към тях молекули или остатъци, например захари или фосфатни остатъци, или агрегати на белтъчна молекула, или самите захарни остатъци, които осигуряват споменатата функция да запазят по същество същата активност на IL-18ВР.

В предпочитан вариант на изобретението, инхибитор на IL-18 е IL-18 антитялото. Анти-IL18 антителата могат да бъдат поликлонални или моноклонални, химерни, хуманизирани, или даже да са човешки. Рекомбинантните антитела и фрагментите от тях се характеризират с висок афинитет на свързване към IL-18 in vivo и с ниска токсичност. Антителата, които могат да бъдат използвани в изобретението са характеризирани в зависимост от тяхната способност за лечение на пациенти за достатъчен период, за да се получи добра регресия или облекчаване на патогенно състояние или симптом или група от симптоми, отнасящи се до патогенно състояние или ниска токсичност.

Неутрализиращите антитела лесно се получават от животни, като плъхове, кози, мишки чрез имунизация с IL-18. По-специално се използват имунизираните мишки, като източник, осигуряващ В-клетки за производство на хибридоми, които се култивират, за да продуцират големи количества от анти-IL-l 8 моноклонални антитела.

Химерните антитела са имуноглобулинови молекули, характеризирани по два или повече сегмента или участъци, получени от различни животински видове. Най-общо, вариабълните райони на химерните антитела се получават от бозайници, различни от човека, като от миши моноклонални антитела, а имуноглобулиновия константен район се получава от човешка имуногпобулинова молекула. За предпочитане е двата района и комбинацията от тях да дава ниска имуногенност както рутинно е определено (Elliott et al., 1994). Хуманизираните антитела са имуноглобулинови молекули, създадени чрез генно-инженерни подходи, в които мишата константна об21

66134 Bl ласт е заместена с човешка част и е оставена мишата антиген-свързваща част. Получените мишочовешки химерни антитела за предпочитане притежават редуцирана имуногенност и подобрени фармакокинетични свойства при прилагане при хора (Knight et al., 1993).

Следователно, по-нататък в предпочитан вариант, IL-18 антитялото е хуманизирано IL-18 антитяло. Предпочитани примери нахуманизирани анти-1Ь-18 антитела са описани, например в заявка на ЕР 0 974 600.

В още по-предпочитан вариант, IL-18 антитялото е напълно с човешки произход. Технологията за продуциране на човешки антитела е описана в подробности, например в WO 2000/ 076310, WO 1999/053049, US 6,162,963 или AU 5336100. Човешките антитела са за предпочитане рекомбинантни антитела, получени от трансгенни животни, например ксеномишки, включващи всички части на функционалните човешки Ig локуси.

В един от най-предпочитаните варианти на настоящото изобретение, инхибиторът на IL-18 е IL-18 ВР или изоформа, мутеин, рекомбинантен протеин, функционално производно или негово циклично пермутирано производно. Тези изоформи, мутеини, рекомбинантни протеини или функционални производни, запазват биологичната активност на IL-18BP, по-специално свързващата способност на IL-18 и за предпочитане имат по същество активност най-малко подобна на тази на IL-18BP. Такива идеални протеини имат даже повишена биологична активност в сравнение са немодифицирания IL-18BP. Предпочитаните активни фракции имат активност, която е по-добра от активността на IL-18ВР или имат други предимства, като по-добра стабилност или намалена токсичност или имуногенност, или са полесни за получаване в големи количества или са по-лесни за пречистване.

Секвенциите на IL-18ВР и техните варианти на сплайсинг/изоформи могат да бъдат взети от WO 1999/009063 или от Novick et al., 1999, както и от Kim et al., 2000.

Функционалните производни на IL-18BP могат да бъдат конюгирани към полимери, за да се подобрят качествата на белтъка, като например стабилност; полуживот, бионаличност, толерантност към човешкото тяло, или имуногенност. За да се осъществи тази цел, IL-18BP може да бъде свързан например към полиетиленгликол (PEG), PEG-свързването може да бъде направено, например чрез известни методи, описани в WO 1992/013095.

Ето защо в предпочитан вариант на настоящото изобретение, IL-18BP е PEG-свързан.

По-нататък в предпочитан вариант на изобретението, инхибитор на IL-18 е рекомбинантен белтък, включващ целия или част от IL18 свързващия протеин, която се свързва рекомбинантно с целия или с част от имуноглобулин. За специалистите в областта ще стане ясно, че полученият рекомбинантен протеин запазва биологичната активност на IL-18BP, поспециално способността да се свързва с IL-18. Рекомбинантното свързване може да бъде опосредствано, от къс линкерен пептид, който може да бъде къс от 1 до 3 аминокиселинни остатъка или по-дълъг, например 13 аминокиселинни остатъци. Споменатият линкер може да бъде трипептид на секвенцията E-F-M (Glu-Phe-Met), например или 13 аминокиселинният линкер може да има секвенция Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-LeuVal-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met въведен между IL18ВР секвенцията и имуноглобулиновата секвенция. Полученият рекомбинантен белтък има подобрени качества, като повишено време на живот в телесните течности (време на полуживот), повишена специфична активност, повишено ниво на експресия или възможност за улеснено пречистване на рекомбинантния протеин.

В предпочитан вариант, IL-18 ВР е рекомбинантно свързан с константната област на Ig молекулата. За предпочитане, той е рекомбинантно свързан с тежката верига на районите, като например СН2 и СНЗ домените на човешкия IgG 1. Създаването на специфични рекомбинантни белтъци, съдържащи IL-18ВР и части от имуноглобулини е описано например в Пример 11 на WO 1999/009063. Други изоформи на Ig молекулите са също подходящи за създаването на рекомбинантни белтъци, съгласно настоящото изобретение, като изоформите IgG2 или IgG4 или други Ig класове, като например IgM или IgA. Рекомбинантните белтъци могат да бъдат мономерни и мултимерни, хетеро- или хомомултимерни.

Интерфероните са известни предимно с техните инхибиторни ефекти върху вирусната репликация и върху клетъчната пролиферация.

66134 Bl

Интерферон-гама, например играе основна роля в стимулирането на имунните и възпалителните отговори. За интерферон бета (INF-бета, интерферон тип I) се казва, че играе противовъзпалителна роля. Изследвания, публикувани от Triantaphyllopoulos et al. (1999) показват, че INFгама има благоприятен ефект при лечение на ревматоиден артрит, както е показано за миши модел на заболяването, и при модел на колагениндуциран артрит (CIA). Този благоприятен ефект на INF-бета е потвърден в примерите по-долу.

Изобретението също се отнася до използването на комбинация на инхибитор на IL-18 и интерферон за производството на медикамент за лечение на артрит; по-специално за лечение на ревматоиден артрит.

Интерфероните могат също да бъдат свързани с полимери, за да подобрят стабилността на белтъците. Конюгат между интерферон-бета и полиолът полиетиленгликол (PEG) е описана например в WO 1999/055377.

В друг предпочитан вариант на изобретението, интерферонът е интерферон-бета (INFбета), и в още по-предпочитан вариант INFбета! а

Инхибиторът на продукцията и/или действието на IL-18 за предпочитане се използва едновременно, последователно или поотделно с интерферона.

В друг следващ вариант на изобретението, инхибитор на IL-18 се използва в комбинация с TNF антагонист. TNF антагонистът оказва влияние върху тяхната активност по няколко начина Първо, антагонистът може да свърже към или поотделно да се свърже към самата TNF молекула със значителен афинитет и специфично или частично или съществено да неутрализира TNF епитопа или епитопите отговорни за TNF рецепторното свързване (дадени тук с термина “секвесиращи антагонисти”). Секвестиращ антагонист може да бъде например, антитяло, насочено срещу TNF.

От друга страна, TNF антагонистите могат да инхибират TNF сигналният път, активиран от клетъчно повърхностния рецептор след TNF свързването (дадени тук с термина “сигнални антагонисти”). И двете групи антагонисти са приложими самостоятелно или заедно, в комбинация с инхибитор на IL-18 за лечение на артрити, по-специално на ревматоиден артрит.

TNF антагонистите лесно се идентифицират и се анализират чрез рутинен скрининг на кандидатите, притежаващи техния ефект, на активността на нативния TNF върху in vitro компетентна клетъчна линия, например човешки Вклетки, в които TNF води до пролиферация или секреция на имуноглобулини. Анализът касае TNF състава на различни разреждания на кандидатите антагонисти, например от 0,1 до 100 пъти моларната концентрация на използвания TNF в анализа и контроли без TNF или само с антагонисти (Tucci et al., 1992).

Секвестиращите антагонисти са предпочитаните TNF антагонисти, които се използват съгласно настоящето изобретение. Между секвестиращите антагонисти, тези полипептиди, които свързват TNF с висок афинитет и притежават ниска имуногенност са предпочитани. По-специално предпочитани са разтворимите TNF рецепторни молекули и неутрализиращите антитела за TNF. Например разтворимият TNF-RI и TNF-RII се използват в настоящото изобретение. Скъсени форми на тези рецептори, включващи извънклетъчни домени на рецепторите или функционални части от тях са още по-предпочитани антагонисти, съгласно настоящото изобретение. Скъсени разтворими TNF тип-I и тип-П рецептори са описани например в ЕР 914431.

Скъсените форми на TNF рецепторите са разтворими и те се срещат в урината и серума, като 30 кДа и 40 кДа протеини, инхибиращи свързването с TNF, които се наричат TBP I и ТВРII, съответно (Engelmann et al., 1990). Едновременното, последователното или поотделното използване на инхибитори на IL-18 с TNF антагонисти и/или предпочитан интерферон, е за предпочитане съгласно настоящото изобретение.

Съгласно изобретението ТВР I и ТВР II са предпочитани TNF антагонисти, които се използват в комбинация с инхибитор на IL-18. Производни, фрагменти, райони и биологично активни участъци на рецепторните молекули функционално наподобяващи рецепторните молекули, могат също да бъдат използвани в настоящото изобретение. Такива биологично активни еквиваленти или производни на рецепторните молекули се отнасят към участъци от полипептида или от секвенцията кодиращ рецепторните молекули, които са със значителен размер и са способни да свързват TNF с такъв афинитет, че

66134 Bl взаимодействието c мембранно-свързания TNF се инхибира или блокира.

В следващ предпочитан вариант, човешки разтворим TNF-RI (TBPI) е TNF антагонист, който се използва съгласно настоящото изобретение. Естествени и рекомбинантни TNF рецепторни молекули и методи за тяхното получаване са описани в ЕР 308 378, ЕР 398 327 и ЕР 433 900.

Инхибиторът на IL-18 може да бъде използван едновременно, последователно или поотделно с TNF инхибитор. Предимно, комбинация от IL-18 антитяло или антисерум и разтворима форма на TNF рецептора, която притежават TNF инхибираща активност се използват.

В следващ предпочитан вариант на изобретението, медикаментът по-нататък включва СОХинхибитор, за предпочитане СОХ-2 инхибитор. СОХ инхибиторите са известни в областта. Специфичните СОХ-2 инхибитори са описани в WO 2001/000229, например.

Изобретението по-нататък се отнася до използването на комбинация от IL-18 инхибитори и/или интерферони, и/или TNF антагонисти и/или СОХ-2 инхибитори. Комбинацията е подходяща за лечение и/или предпазване от артрит, по-специално от ревматоиден артрит и за лечение и/или предпазване от чернодробни увреждания и за лечение и/или предпазване от чревни възпалителни заболявания, по-специално болест на Crohn и язвен колит. Активните компоненти могат да бъдат използвани едновременно, последователно или поотделно.

В предпочитан вариант на настоящото изобретение, инхибитор на IL-18 се използва в количество около 0,0001 до 10 mg/kg от телесното тегло, или около 0,01 до 5 mg/kg от телесното тегло или около 0,1 до 3 mg/kg от телесното тегло или около 1 до 2 mg/kg от телесното тегло. В друг следващ вариант на изобретението, инхибиторът на IL-18 се използва в количество от около 0,1 до 1000 microg/kg или от 1 до 100 microg/ kg от телесното тегло, или около 10 до 50 microg/ kg от телесното тегло.

Изобретението по-нататък се отнася до използване на експресионен вектор, включващ кодираща последователност на инхибитор на IL-18 при приготвянето на медикамент за предпазване и/или лечение на артритни състояния или артрити, по-специално ревматоиден артрит, за лечение на чернодробни увреждания, и за лечение на чрев ни възпалителни заболявания. Следователно се прилага подход на генна терапия, за лечение и/ или предпазване от заболявания. С предимство се използва in situ експресията на инхибитор на IL-18, като така се блокира директно IL-18 в засегнатите тъкан (тъкани) или клетки при заболяванията.

За да оказва ефект при лечението и/или предпазването от артрит, за генната терапия се използва вектор, включващ последователност на инхибитор на IL-18 продукцията и/или действието и той може да бъде инжектиран в заболялата става, например, като по този начин се избягват проблемите при системното въвеждане на вектори за генна терапия, като разтваряне на векторите, насочване и достигането им до прицелните клетки или тъкани, и странични ефекти.

Използването на вектор за индуциране и/ или повишаване на ендогенната продукция на инхибитор на IL-18 в клетка, която нормално не експресира инхибитор на IL-18 или която експресира недостатъчни количества от инхибитора, също се обсъждат съгласно изобретението. Вектора може също да включва регулаторни последователности, които функционират в клетките по желаният начин, за да експресират инхибитор на IL-18. Такива регулаторни последователности могат да бъдат въведени в правилния локус на генома чрез хомоложна рекомбинация, като по този начин оперативно свързват регулаторната последователност с гена, чиято експресия трябва да се индуцира или повиши. Технологията обикновено се отнася до “едногенно генно активиране” (EGA) и е описана, например в WO 1991/009955.

Ще се разбере от този, който е специалист в областта, че също е възможно да се потисне експресията на IL-18, чрез използване на същия метод, т.е. чрез въвеждане на негативно регулаторен елемент, като например елемент, който потиска експресията в локуса на гена за IL18, като това води до намаляване или предотвратяване на експресията на IL-18. Този, който е специалист в областта, ще разбере, че това намаляване или потискане на експресията на IL18 има същия ефект, както и използването на инхибитор на IL-18, за да се предотврати и/или осъществи лечение на заболяването.

Изобретението също се отнася до изпол

66134 Bl зване на клетка, която е генетично модифицирана да продуцира инхибитор на IL-18 за производството на медикамент за лечение и/или предпазване на чернодробно увреждане, артрит или чревно възпалително заболяване.

Изобретението по-нататък се отнася до фармацевтични състави, частично използвани за предпазване и/или лечение на възпалителни артрити, чернодробни увреждания или чревни възпалителни заболявания, които включват прилагането на терапевтично ефективно количество на инхибитор на IL-18 и терапевтично ефективно количество от интерферон. Като инхибитор на IL-18, съставът може да включва инхибитори на каспаза-1, антитела срещу IL-18, антитела срещу която и да е субединица на рецептора за IL18, инхибитори на IL-18 сигналния път, антагонисти на IL-18, които се конкурират с IL-18 и блокират рецептора за IL-18 и IL-18 свързващи белтъци, изоформи, мутеини, рекомбинантни белтъци, функционални производни, активни фракции или циклични пермутирани техни производни, които имат същата активност.

IL-18ВР и изоформите, мутеините, рекомбинантните белтъци, функционалните производни, активните фракции или цикличните пермутирани производни, както е описано по-горе са предпочитани активни съставки на фармацевтичните състави.

Интерферонът, включен във фармацевтичния състав за предпочитане е INF-бета.

В друг предпочитан вариант, фармацевтичният състав включва терапевтично ефективни количества от инхибитор на IL-18, по избор интерферон и TNF антагонист. TNF антагонистите могат да бъдат антитела, неутрализиращи TNF активността, или разтворими скъсени фрагменти от рецептора за TNF, също наречени ТВР1 и ТВРИ. Фармацевтичен състав, съгласно изобретението може по-нататък да включва един или повече СОХ инхибитори, за предпочитане СОХ2 инхибитори.

Дефиницията “фармацевтично приемлив” има за цел да обхване който и да е носител, който не взаимодейства ефективно с биологичната активност на активната съставка и следователно не е токсичен за гостоприемника, при който се прилага. Например, за пренатално въвеждане, активния белтък (белтъци) може да бъде формулиран в единица доза от инжекция със солеви разтвор, декстрозен разтвор, серумен албумин и Рингеров разтвор.

Активните съставки на фармацевтичния състав съгласно изобретението могат да бъдат въведени в индивида по различни начини. Начините на въвеждане включват интрадермално, трансдермално (например като слабо освобождаващи се състави), вътремускулно, интраперитонеално, интравенозно, подкожно, орално, епидурално, повърхностно и интраназално. Всеки от терапевтично ефикасните пътища на въвеждане може да бъде използван, например абсорбцията чрез епителната или ендогенната тъкан или генната терапия, където ДНК молекула кодираща активния агент се въвежда в пациент (например чрез вектор), която води до експресията на активен агент или секрецията му in vivo. В допълнение, белтъкът (белтъците) съгласно настоящото изобретение могат да бъдат въведени заедно с други компоненти на биологично активни агенти, като фармацевтично приемливи сърфактанти, ексципиенти, носители, разтворители или физиологични разтвори.

За пренатално (например интравенозно, подкожно вътремускулно) въвеждане на активния белтък (белтъци) може да бъде направен разтвор, суспензия, емулсия или лиофилизиран прах във фармацевтично приемлив пренатален физиологичен разтвор (например вода, солеви разтвор, декстрозен разтвор) и добавки, които поддържат изотоничността (например манитол) или химичната стабилност (например презервативи или буфери). Смесите се стерилизират, съгласно общоприети използвани техники.

Бионаличността на активния белтък (белтъци) съгласно изобретението могат също да бъдат подобрени чрез използването на конюгиращи методи, които увеличават полуживота на молекулите в човешкото тяло, например свързването на молекули с полиетиленгликол, както е описановРСТ патентна заявка WO1992/013095.

Терапевтично ефективните количества от активния белтък (белтъци) ще зависят от много параметри, включващи типа на антагониста, афинитета на антагониста за IL-18, който и да е остатък с цитотоксична активност от страна на антагониста, пътя на въвеждане, клиничното състояние на пациента (включително и изискването за под държане на нетоксично ниво на ендогенната активност на IL-18).

66134 Bl “Терапевтично ефективно количество” е това, което когато е въведено, инхибиторът на IL18 води до инхибиране на биологичната активност на IL-18. Дозата на въвеждане като единична доза или като многократни дози, в индивид ще варира в зависимост от много фактори, включително фармакокинетиката на инхибитора на IL18, пътя на въвеждане, състоянията на пациента и други характеристики (пол, възраст, телесно тегло, здравословно състояние, размер) степента на симптомите, текущо лечение, честота на лечението и желания ефект. Нагласяването и манипулациите с установени дозови вариации са в компетенцията на специалистите в областта, както и in vitro, така и in vivo методите за определяне на инхибирането на IL-18 в един индивид.

Съгласно изобретението, инхибитор на IL18 се използва в количество около 0,0001 до 10 mg/kg или около 0,01 до 5 mg/kg на телесно тегло или около 1 до 2 mg/kg от телесното тегло. Други предпочитани количества от инхибитори на IL-18 са количествата около 0,1 до 1000 microg/ kg телесно тегло или около 1 до 100 microg/kg телесно тегло или около 10 до 50 microg/kg телесно тегло.

Пътят на въвеждане, който е за предпочитане съгласно изобретението е подкожно въвеждане. На второ място, съгласно изобретението се предпочита вътремускулното въвеждане.

По-нататък в предпочитани варианти, инхибиторът на IL-18 се въвежда всеки ден или през ден.

Дневните дози обикновено се дават на разделни дози или като задържащо освобождаване до ефективно, за да се получат желаните резултати. Повторни или последващи въвеждания могат да се приложат при дозиране, което е същото, по-малко или повече от първоначалното или от предишното дозово въвеждане в индивида. Второто или последващо въвеждане може да бъде приложено по време или преди началото на заболяването.

Съгласно изобретените, инхибитор на IL18 може да бъде въведен профилактично или терапевтично в индивид преди, по време на или последователно при терапевтичен режим или агент (например многократен лекарствен режим) в терапевтично ефективно количество, по-специално с интерферон и/или TNF антагонист, и/ или СОХ инхибитор. Активни агенти, които се въвеждат едновременно с други терапевтични агенти могат да бъдат въведени в същия или като други състави.

Изобретението по-нататък се отнася до метод за приготвяне на фармацевтичен състав, включващ смесване на ефективно количество на IL-18 инхибитор и/или интерферон и/или TNF антагонист и/или СОХ инхибитор с фармацевтично приемлив носител.

Описанието на това изобретение, ще може по-лесно да се разбере чрез посочените примери, които са илюстративни и които не ограничават настоящото изобретение.

Примери за изпълнение на изобретението

Част I: Примери от 1 до 8, отнасящи се до използването на инхибитори на IL-I8 при чернодробни увреждания.

Пример 1

Продукция на IL-18BP-His tag

Пречистеният, рекомбинантен човешки IL18BP, съдържащ his-tag (rhIL-18BP-His tag) се продуцира от СНО клетки. Продукцията на рекомбинантни белтъци в еукариотни клетки е известна на специалистите в областта. Добре известни методи са налични за конструиране на подходящи вектори, носещи ДНК, която кодира IL-18ВР и подходящи за трансфекция в еукариотни клетки, за да се продуцира рекомбинантен IL-18BP. Например за да бъде експресирана в клетки, ДНК кодираща IL-18ВР (виж например Novick et al., 1999) се изрязва и се въвежда в експресионен вектор, подходящ за трансфекция на клетки. От друга страна, такава ДНК може да бъде направена, чрез PCR с използването на подходящи сенс- и антисенс праймери. Получените кДНК конструкти след това се въвеждат в подходящи конструирани еукариотни експресионни вектори, чрез техники добре известни в областта (Maniatis, 1982). Рекомбинантният белтък е пречистен с над 95% чистота и за него се знае, че е биологично активен in vitro и in vivo с висок афинитет към лиганда.

Пример 2

Защитен ефект на IL18ВР срещу ендотоксин-индуцирана смърт в миши модел

Миши модел се използва, за да се провери дали IL 18ВР, инхибитор на IL-18 има защитна функция срещу високи дози на липополиза26

66134 Bl хариди (LPS). LPS предизвиква остри, чернодробни увреждания, които водят до бърза смърт при мишките.

mg/kg от рекомбинантния, човешки IL18ВР (rhIL-18BPhis) носещ his-tag (получен при продукцията на рекомбинантния протеин) се инжектират интраперитонеално (i.p.) в C57BL/6 мишки. 1 h по-късно, се инжектират 60 mg/kg LPS (летална доза). Оцеляването на мишките се сравнява с група животни, които са получили само LPS (без IL-18BP).

от 7 мишки, инжектирани с rh IL-18BPhis оцеляват след LPS инжекцията, за разлика от контролните мишки, при които всички животни умират за 3 дни.

Кръвни проби са взети 5 h след LPS инжекцията в отсъствие или присъствие на нарастващи дози на rh IL-18BP-his и са анализирани чрез ELISA за определяне на INF-гама. Това инхибиране се губи при ниските дози от rh IL-18ВР (0,004 и 0,4 mg/kg).

Пример 3

IL-18BP има защитен ефект при чернодробно увреждане в миши модел на заболяването

Миши модел на фулминантен хепатит се използва, за да се провери ефекта на IL-18BP. Мишките развиват остра форма на чернодробно увреждане, когато са подложени на последователно въвеждане на Propinabacterium acens (P.acens) и липополизахарид (LPS).

Мишките се инжектират с нарастващи дози от rh IL-18BP-his (4; 0,4, 0,04; 0 mg/kg) на различни времеви интервали (1 h, 20 min едновременно) преди инжектиране с LPS в C57BL/6 Р. acens сензитирани мишки. Когато rh IL-18ВРhis се подава i.p. едновременно с LPS, нито една от мишките не оцеляват и нивата на циркулиращия INF-гама и TNF-алфа не се променят. Изненадващо, rh IL-18ВР (4 и 0,4 mg/kg) индуцира 70% редукция на циркулираща Аланин аминотрансфераза (маркер за чернодробно увреждане), както е показано на Фиг. 2.

В допълнение на това, е проследено оцеляването (Фиг. 3): Когато rh IL-18BP се подава i.p 20 min преди LPS при двете от най-високите дози на IL-18ВР (4 и 0,4 mg/kg) се забавя смъртта на мишките с 10 h, в сравнение с контролните мишки, които получават NaCl вместо IL-18ВР.

Резултатите от измерването на серумния

INF-гама са показани на Фиг.4. rh IL-18BP (4 mg/kg) показват инхибиране на 90% от нивата на циркулиращия INF-гама и 80% от циркулиращата Аланин аминотрансфераза (не е показано).

Когато rh IL-18BP-his се подава 1 h преди LPS, кривите на оцеляване и нивата на циркулиращия INF-гама са същите като тези, наблюдавани когато се подава rhlL-18BP-his 20 min преди LPS, но нивата на циркулираща Аланин аминотрансфераза остават непроменени (не е показано).

В допълнение на това, миши чернодробни тъкани се анализират чрез хематоксилин-еозин оцветяване, както и чрез тунелна микроскопия. Черните дробове на мишки, в които преди това са индуцирани остри хепатити, показват остри некрози в сравнение с нормалната чернодробна тъкан. За разлика от тях, чернодробна тъкан на мишки, третирани с IL-18ВР показва значително по-малко некротични фокуси, в сравнение с нетретирани мишки.

Пример 4

Анти-IL-18 антителата предпазват от летална ендотоксемия

За да се оцени, дали блокирането на IL-18 с IL-18 антитела, ще предпази от летални дози на бактериални липоподизахариди, C57BL/6J мишки първо се инжектират с неутрализиращи заешки анти-миши IL-18 антитела (поликлонални) или с нормален заешки серум (NDS) като контрола. 30 min след третирането с антитяло, летални дози от LPS получени от E.coli (Фиг. 5А) или от S. Thyphimurium (Фиг. 5Б) се инжектират. Експериментите включват 10-12 мишки/група и се провеждат два пъти за два различни случая.

Като е показано на Фиг. 5А, третирането на мишки с анти IL-18 антисерум предпазва от смъртността, индуцирана от 40 mg/kg Е. coli LPS. 100% от мишките оцеляват след анти-Ш-18ВР третирането срещу 10% от мишките оцелели след третиране с нормален заешки серум (р<0.005).

Фиг. 5Б показва, че мишки третирани с антитела също са защитени срещу леталният ефект на S. typhimurium (50% спрямо 0% оцелели; р<0,05).

Пример 5

Блокирането на IL-18 И TNF-алфа защитава мишките от СопА- и РЕА-индуцирана хепатотоксичност

66134 Bl

Два експериментални модела на хепатотоксичност се използват, за да се оцени ролята на IL-18 и TNF-алфа при чернодробни увреждания. Инжектирането на Конкавалин A (Con А) и Pseudomonas aeruginos (PEA) в мишки индуцират чернодробно увреждане и същевременно са модели за Т-клетъчно медииран хепатит.

C57BL/6J мишки се претретират с анти-IL18 антисерум или разтворим рецептор за TNFалфа, TNFsRp55. Нивата на серумната Аланин аминотрансфераза (ALT) се измерват като индикатори за чернодробно увреждане (Фиг. 6).

Както е показано на Фиг. 6 А, и IL-18 антисерума и разтворимите TNF-алфа-рецептори значително редуцират Con-А-индуцираните нива на ALT, в сравнение с контроли, инжектирани само със солеви разтвор (непирогенен солеви разтвор). Паралелното въвеждане на разтворим TNF-алфа рецептор и 1L-18 антисерум води до напълно инхибиране на Con-А индуцираното чернодробно увреждане.

Както е показано на Фиг. 6Б при РЕА-инжектирани мишки, неутрализирането с TNF-алфа инхибитори или с анти-IL-18 антитела води до 93% и 83% инхибиране на нивата на серумната ALT, съответно. Комбинираното блокиране и на двете води до 99% предпазване.

Пример6

Плазмените нива на IL-18-свързващият белтък се покачват при пациенти с хронични чернодробни заболявания

Плазмените нива на IL-18BP се измерват при 133 пациента с хронични чернодробни заболявания (CLD) с различни етиологии и при 31 здрави пациента-контроли чрез специфична ELISA, с използване на IL-18BP моноклонално антитяло.

Плазмените нива на IL-18ВР са значително повишени в пациентите с CLD (12.91 ± 0.89 ng/ml, осреднено ± SEM) в сравнение с тези при здрави лица (4.96 ± 0.43 ng/ml, р<0.001). Пациентите с цироза имат значително повишени нива в сравнение с пациентите с CLD, които не страдат от цироза (19 23 ± 1.28 ng/ml η = 67, спрямо 6.49 ± 0.51 ng/ml η = 66, р<0.001). Пациенти в стадий В според Child-Pugh класификацията имат повишени нива на IL-18ВР в сравнение с тези в стадий А (22.48 ± 2.44 ng/ml в спрямо 9.57 ± 1.25 ng/ml, р<0.001). Няма обаче статистически достоверни разлики при Child ста дий В и С (22.48 ± 2.44 ng/ml спрямо 20 20.62 ± 4.57 ng/ml, р=0.7). Плазмените нива на IL-18BP корелират позитивно с тези на GOT, билирубина и скоростта на еритроцитна седиментация. Наблюдава се негативна корелация спрямо времето за протромбина.

В заключение, резултатите показват, че плазмените нива на IL-18BP се повишават при CLD и корелират при острите форми на заболяването независимо от етиологията на заболяването. Въпреки че ендогенен антагонист на провъзпалителния IL-18 повишава нивата на IL18ВР, изглежда не е достатъчно да попречи и да потисне провъзпалителните медиатори при CLD.

Пример 7

Потискане на хепатит при алкохолици, чрез IL-18BP

Четири групи плъхове (по 5 на група) се хранят с етанол и диета, съдържаща царевично олио, чрез интрагастрална инфузия за 4 седмици. Декстрозата изокалорично замества етанола при контролни плъхове. Плъховете се инжектират всеки ден с миши IL-18BP (1 mg/kg) или със солеви разтвор. Анализ на патологията се провежда върху чернодробни срези и се вземат предвид измерванията на серумните ензими, TNF-алфа, Fas-лиганда и INF-гама. Некровъзпалителните увреждания и експресията на чернодробни ензими, TNF-алфа, Fas-лиганда и INF-гама се наблюдават при плъховете, хранени с етанол инжектирани със солеви разтвор.

Плъховете, инжектирани с миши IL-18ВР са защитени от некровъзпалителни увреждания и нивата на серумните ензими, TNF-алфа, Fasлиганда и INF-гама са значително понижени (>90%).

Пример 8

Инхибиране на конкавалин А-индуциран хепатит чрез IL-18ВР

Balb/c мишки се инжектират с 12 mg/kg Конкавалин A (Con А), като при някои от тях се инжектира IL-18BP (1 mg/kg), 2 h преди Con A въвеждането и след това един път дневно. Чернодробните увреждания се анализират, чрез определяне на нивата на чернодробните ензими, TNF-алфа, Fas-лиганда и INF-гама. Хистологични препарати са приготвени и от черен дроб на мишки, третирани само с Конкавалин А.

Третирането с повишени дози IL-18BP значително редуцира нивата на чернодробни

66134 Bl те ензими, TNF-алфа, без да се наблюдава възпаление при хистопатологичния анализ, в сравнение с контролни мишки, третирани само с Con А.

Част II: Примери 9 и 10, отнасящи се до използването на инхибитори на IL-18 при артрити

Пример 9

Получаване на IL-18BP-His tag

За експеримента, описан подробно в Пример 10, по-долу, рекомбинантен, човешки IL-18ВР, носещ his-tag от 6 остатъка (rg IL-18ВРHis tag) се продуцира от СНО клетки и се пречиства, както е описано от Kim et al., 2000. Рекомбинантният белтък е пречистен с чистота над 95% и за него е открито, че е биологично активен in vitro и in vivo с висок афинитет към неговия лиганд.

Получаването на рекомбинантни белтъци в еукариотни системи със или без tag последователности, улесняващи пречистването на рекомбинантните протеини, е известно на специалистите в областта. Използват се добре известни методи за конструиране на подходящи вектори, които носят ДНК, която кодира IL-18BP и подходящи затрансфекция еукариотни клетки, които да продуцират рекомбинантния IL-18ВР. За експресирането в клетки, ДНК кодираща IL-18ВР (виж например Novick et al., 1999) се изрязва от клонирания вектор и се въвежда в експресионни вектори, подходящи затрансфекция на клетки. От друга страна, такава ДНК може да бъде получена, чрез PCR с използването на подходящи сенс и антисенс праймери. Получените кДНК конструкти след това се въвеждат в подходящи конструирани еукариотни експресионни вектори, чрез техники, известни в областта (Manitatis et al., 1982).

Пример 10

Блокиране на ендогенния IL-18 в миши модел на артрит

Методи

Индуциране на колаген-индуциран артрит (CIA)

CIA е индуциран в мъжки DBA/1 мишки (на възраст от 8 до 12 седмици), чрез имунизиране с нативен говежди колаген тип II (СП), както е описано преди (Plater-Zyberk et al., 1995). 25 дена след СП имунизацията, мишките се изследват ежедневно за начало на заболяването.

Третиране с rh IL-18BP-6his

Третирането на СП-имунизирани DBA/1 започва при първите симптоми на заболяването. Рекомбинантен, човешки IL-18ВР съдържащ tag от 6 хистидина (rh-IL-18BPa6his) се използва за неутрализиране на ендогенния IL-18 при колаген-третирани мишки. rh-IL-18BP-6his се инжектира всеки ден в продължение на 7 дни в 5 различни концентрации 10, 3, 1, 0.5, 0.25 mg/kg/ инжекция интраперитонеално (i.p.). Плацебо контролните мишки получават само солеви разтвор (0.9% NaCl).

Анализ на развитието на заболяването

Клиничен анализ (точки на клинична оценка)

На първо време, клиничните симптоми на мишките се проверяват всеки ден от изследовател, който не е известен за третирането. Всеки крак се степенува за острота на заболяването (точки 0 3.5, максимален брой точки = 14/мишка). Напредването на едемата (възпалението) се измерва на първите лапи, показали признаци на заболяването, чрез използване на точни калипери (Proctest 2Т, Kroeplin Langenmesstechnik).

Напредването на заболяването се оценява всеки ден в продължение на 8 дена, след като е започнало, за което време всички мишки са заболели и лапите им са събрани за хистопатологичен анализ.

Хистопатологичен анализ на хрущялната ерозия и мукозното възпаление

В края на експеримента, т.е. на 8 ден след началото, мишките се убиват и лапата, която първа развива симптомите на заболяването се дисектира. Ставите се фиксират, декалцифицират и се включват в парафин. Стандартни срези (5 до 7 microm) от ставите се приготвят и се оцветяват с хематоксилин/еозин/Сафранин О. Всяка става се оценява от двама изследователя, които не са известени за протокола на третиране (липса на деструкция на хрущялът или костта = 0; локализирани хрущялни ерозии = 1-2; по-разпространени ерозии = 3; общи хрущялни деструкции и наличие на костни ерозии=4). Крайните резултати за всяка мишка са осреднените резултати за всяка от ставите. Микроскопски възпалението или синовитите се изчисляват от 0 до 4, както следва: липса на възпаление = 0; слабо уплътняване на покриващата обвивка и/или известно количество инфилтрирани клетки под об

66134 Bl вивката = 1-2; уплътняване на покриващата обвивка и неоспоримо навлизане на клетки под обвивката - 3; присъствие на клетки в синовиалното пространство и наличие на голямо количество инфилтрат в синовиума, с много клетки, характерни за възпалителни реакции = 4.

Определяне наличието наантиколагеновите антитела

Антитела срещу говежди колаген тип II се анализират чрез използване на ензим-свързан имуносорбентен анализ (ELISA). Титрите наIgGl и IgG2a се измерват. Накратко, плаките се покриват с 10 microg говежди колаген и след това неспецифично свързаните места се блокират с 0.1М етаноламин (Sigma). Серийни разреждания 1:2 от серумите се добавят след инкубацията със специфични за изотипа кози анти-миши анти пероксидазни антитела (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL, USA) и субстрат (5аминосиалоциклична киселина, Sigma). Плаките се анализират колориметрично при 492 nm. Хитрите се определят като средни стойности за разреждане ± SD, което дава полумаксимапна стойност.

Анализ на IL-6

Нивата на IL-6 се определят чрез ELISA кит (R&D systems Minneapolis, MN, USA). IL-6 биоактивността се определя, чрез пролиферативен анализ с използването на В9 клетки. Накратко 5x10’ В9 клетки в 200 microl на гнездо, със RPMI 1640 среда, съдържаща 5% FCS се посяват в микротитрови плаки, със заоблени дъна на гнездата и се инкубират 3 дена, с човешки рекомбинантен IL-6 (R&D systems, Minneapolis, MN, USA) като стандарти. В края на инкубацията във всяко гнездо се добавят 0.5 microCi от ³[Н]тимидин (MEN-Dupont, Boston, МА, USA). 3 h покъсно, клетките се събират и се определя инкорпорирането на тимидира. Границата на детекция за IL-6 биоанализа е 1 pg/ml.

Статистически анализ

Статистически достоверните разлики се оценяват чрез Mann Whitney теста, с използване на SigmaStat програма за статистически анализ и с програма за GraphPad Prism.

Резултати

Миши експериментален модел, CIA (колаген-индуциран артрит) се използва за анализ на ефективността на IL-18ВР, като вещество за лечение на артрит. Въвеждането на колаген и непъ лен адювант на Freund в DBA/1 мишки индуцира развитие на ерозивни, възпалителни артрити и представя идеална възможност за изследване на терапевтичните възможности на IL-18ВР. До тук ендогенния IL-18 се неутрализира, чрез използването на IL-18BP и се оценява ефекта на различни патогенни параметри.

Проведено е дозозависимо изследване. Три групи DBA/1 мишки с колаген-индуциран артрит се третират с терапевтична цел (т. е. след началото на заболяването) с 5 дози от IL-18BP i.p. (интраперитонеално). IL-18BPC концентрации 10, 3, 1, 0.5, 0.25 mg/kg се въвеждат при първия клиничен симптом на заболяването. Инжектирането на физиологичен солеви разтвор (натриев хлорид, NaCl) се прилага като контрола. В допълнение на това, 10 000 IU от интерферон бета (INF-бета) се въвеждат i.p. за оценка на ефекта на INF при този експериментален модел на артрит. Ефекта на степента на заболяването се следи чрез дневно визуално определяне на токите за всяка отделна лапа, както е описано по-горе. Мишките са третирани на 8мия ден след началото.

Измерени са следните стойности:

• визуално определени точки за клиничната картина (0-3,5 на лапа) (Фиг. 7А и Б);

• подуване на ставата/едема (в mm, измерване с calipers) за първата лапа, показваща признаци на възпалението, задна лапа (Фиг. 8);

• брой на възстановените след заболяването лапи (Фиг. 9);

• точки на ерозията на първата лапа, показваща признаци на заболяването (0-4 за хрущялна деструкция, Фиг. 10);

• хистопатологичен анализ на лапата, която първа е развила артрит (Фиг. 11);

• нива на антиколаген тип II антителата (Фиг. 12);

• нива на IL-6 (Фиг. 13).

Клинична степен на заболяването

Както е показано на Фигури 7А и Б, клиничната степен на заболяването се понижава значително при мишки, третирани с 1 mg/ml (РО.01) и 0.5 mg/ml (0.01<Р<0.05) от rhlL18ВР. Мишките получили ниската доза от rhlL18ВР (0.25 mg/kg) или високата доза от 10 mg/ kg показват клиничен резултат, подобен на този на плацебо-групата. Дозата от 1 mg/kg от IL18ВР е почти толкова ефективна, колкото интер

66134 Bl ферон бета (означен като INFb на Фиг.7А).

Ставно възпаление и подуване на лапата (едема)

Макроскопски възпалението (подуването) се анализира, като се измерва едемата на лапата от първия ден след началото на заболяването, до 8-ия ден - края на експеримента. Резултатите са показани на Фигури 8А и Б. Ефективните дози на IL-18BP са 1, 3 и 10 mg/kg. Въвеждането на ниски дози не води до благоприятен ефект върху подуването на лапите. Както е показано на Фигури 8А и 8Б, Интерферон-бета (INFb) при концентрации от 10 000IU показва благоприятен ефект върху подуването на лапата.

Микроскопски, синовитите се изследват в края на експеримента върху хистопатологични срези и резултатите се дават като точки (“точки за синовит”). Резултатите за възпалението (подуването) и за синовитите са обобщени в Таблица 1. Докато третирането с rhIL-18ВР с дози 1 и 3 mg/kg водят до тенденция на понижаване на подуването, третирането с която и да е доза от IL-18ВР има само ограничен ефект върху възпалителните синовити (Таблица 1).

ТАБЛИПА 1;

ЕФЕКТ НА ТРЕТИРАНЕТО С IL-18BP ВЪРХУ СТАВНО

ВЪЗПАЛЕНИЕ

Лечение	Подеване (AUC, средни стойности ±sem)	Синовит точки (средни стойности ±sem)
RhIL-18BP-6his 3mg/kg	1.55±0.64	2.17±0.5
1 mg/kg	1.53±0.60	1.98±0.4
0.5 mg/kg	3.38±0.70	1.92±0.5
0.25 mg/kg	3.06±0.90	2.08±0.5
Плацебо	3.11±0.77	2.23±0.3

Фигура 9 показва, че броят на засегнати- 40 те лапи от заболяването се намалява, след въвеждането на IL-18BP. По-специално, терапевтични инжекции с IL-18BP при дози от 1 до 0.5 mg/kg редуцира броят на лапите, засегнати при заболяването, което демонстрира, че блоки- 45 рането на IL-18 in vivo спира разпространяването на артрита към други стави. При лечението с 1 и 0.5 mg/kg от IL-18 даже се става възможно да се възстановят някои от артритните стави до нормални. сп

Предпазване от деструкция на ставата

Третирането на мишки с rh IL-18BP води до предпазване на лапите от деструкция (Фиг. 10). Полуколичествено отчитаща система показва, че по отношение на костната ерозия се проявява дозозависим защитен ефект, който е значителен при 10 и 3 mg/kg (Р<0.05, Фиг. 10). Мишки, получаващи 1 mg/kg rh IL-18BP показват по-слаба ерозия, в сравнение с мишки, които получават само солеви разтвор. Липсва предпазен ефект при дози 0.5 mg/kg и 0.25 mg/kg.

66134 Bl

Интересно е, че предпазният ефект върху ставите при дози 3 и 10 mg/kg IL-18BP е сравним с или даже по-голям отколкото благоприятният ефект на 10 000IU Интерферон бета (INF-бета).

Фигура 11 показва хистология на здрави (А) и заболели (Б) стави в сравнение със стави на животни, третирани с IL-18ВР (В). Срезите са направени в края на експеримента от лапите, които първи са развили артрит.

Ставата от артритна мишка показва остри деструктивни артрити с хрущялно намаляване и ерозии и много инфилтрирани клетки във възпаления синовиум. При стави от мишки, третирани с rh IL-18ВР, хрущялът изглежда почти нормален, с изключение на присъствието на клетки, характерни за възпалителен процес в синовиалното пространство. Не само, че се наблюдава голямо количество хрущял, но хрущялът също има погладка повърхност.

Третирането с анти-IL-18 модулира нивата на анти-колаген тип II антителата

CIA мишките показват повишени нива на IgG 1 и IgG2a анти-колаген тип II антителата в циркулиращата кръв. Антителата от изотип IgG 1 са свързани с ТН2 медиираните заболявания, докато антителата от изотип IgG2a и IgG2b са свързани с TH 1 медиираните заболявания.

Анти-колаген тип II (СП) IgG 1 и IgG2a антитяло изотиповете се наблюдават в серуми от животни, които са третирани с IL-18ВР (Фиг. 12). Нивата на анти-СП от IgG изотипове IgG 1 и IgG2a не се променя значително от третирането с IL18ВР на 4-ия или на 8-ия (D4, D8) от клиничните прояви на заболяването. 2.6 и 3.4 пъти намаляване на колаген-специфичните съотношения IgG l/IgG2a, обаче, се наблюдава 8 дена след третиране с rh IL-18BP при 1 и 3 mg/kg съответно. Фиг. 12 показва експеримент, при който са приложени 3 mg/kg. По същество същите резултати се получават, когато се използва количество 1 mg/kg IL-18ВР. Редуцираното съотношение IgG 1 / IgG2a на анти-СП антителата показва намаляване на концентрацията на анти-колаген тип II антителата от изотип IgG2a и повишаване на концентрацията на анти-колаген тип II антителата от изотип IgG 1, от което може да се предположи, че се преминава към ТН2 медиирано заболяване при този модел на артрит.

Понижаване на нивата на IL-6 след неутрализирането на IL-18

За да се вникне в ефектите на блокирането на IL-18, IL-6 се измерва в серумите на IL18ВР третирани животни. Фиг. 13 показва, че нивата на блокиращия IL-6 значително се понижават при животни, получили IL-18BP, при всички измерени дози, т.е. 1,3 и 10 mg/kg, както е и с интерферон бета (INF-b). Имуноактивните нива на IL-6 се измерват в серуми на животни, третирани с 3 mg/kg rh IL-18BP, значително се понижават (Р<0.0023) в сравнение с животните, третирани със солеви разтвор. Нивата на IL-6 в серума на заболели животни, третирани с 1,3 или 10 mg или IL-18BP или 10 000 Ш от INF-бета наподобяват тези на нормалният серум (NMS), получен от здрави животни, т.е. от тези животни, при които не се наблюдават заболявания, свързани с възпаления.

Тези открития показват, че IL-18 контролира нивата на IL-6 по време на заболяването. Тъй като IL-6 е маркер за възпалителна реакция, тези открития показват, че лечението на заболелите мишки с IL-18BP понижават възпалителните реакции на животното.

От експериментите, описани по-горе, могат да бъдат направени следните изводи:

• въвеждането на IL-18ВР понижава клинично остротата на артрит.

• IL-18ВР инхибира продължаването и понататъшно разпространение на заболяването;

• въвеждането на IL-18ВР потиска едемата;

• въвеждането на IL-18BP понижава хрущялната деструкция;

• серумните нива на IL-6 се понижават и съотношението IgG 1 /IgG2a на анти-СП антителата се понижава след IL-18ВР терапията.

Данните, изложени по-горе показват, че неутрализирането на биоактивността на IL-18 след началото на заболяването представлява модифицираща заболяването, антиревматоидна терапия. Резултатите ясно показват, че блокирането на IL-18 понижава клиничното продължаване на артрита и по-важно, спира продължаването на хрущялна и костна деструкция. Блокирането на IL-18 чрез IL-18BP, чрез антиIL-18 антитела или чрез друг блокиращ агент на IL-18, следователно представлява нова модифицираща заболяването, анти-ревматоидна терапия.

Гореизложените описания на специфичните варианти, разкриват общата природа на

66134 Bl изобретението, така че другите да могат да придобият общи знания, които да могат веднага да бъдат модифицирани и/или адаптирани за приложения, като специфични варианти, без да се отклоняват от главната концепция, и следователно такива адаптации и модификации ще могат да бъдат разбрани в смисъла и степента на еквивалентите на описаните варианти. Това е с цел да се разбере, че фразите или терминологията, използвани тук са с описателна цел, а не с ограничителна.

Част III: Примери 11 и 12, отнасящи се до чревни възпалителни заболявания

Пример 11

Експресия на IL-18ВР от ендотелни клетки и макрофаги по време на активна форма на болестта на Crohn

Събиране на проби

Чревните мукозни биопсии са изолирани от хирургично отстранени проби от пациенти с CD или UC. Включени са 14 CD пациента (трима мъже и единадесет жени) на средна възраст 37,8 години (в границите от 20 до 78 години) и с продължителност на заболяването 8.3 години (в границите 1-21 години). В осем пациента, заболяването е локализирано в илеума, а в шест в дебелото черво. Дванадесет пациента вземат имуносупресивни лекарства. Диагнозите на активна форма на CD се определя чрез хистопатологично изследване и се базира на следните критерии: наличие на улцерации, повишен брой на клетките, характерни за възпалителните реакции и възпаление на стените. При седем от пациентите се наблюдава активна форма на CD и при седем - неактивна форма. Няма значителни разлики по отношение на възрастта, локализирането, пола, приемането на лекарства и продължителността на заболяването, при наблюдаваните пациенти с активна и неактивна форма на CD. Средната възраст на 5-имата UC пациента (трима мъже и две жени) е 37.6 години (варира от 30 до 44 години). При всички пациенти заболяването се локализира в дебелото черво и всички се подлагат на имуносупресивна терапия. Средната продължителност на заболяването е 4 години (от 1 до 9 години). Контролни проби се вземат от 5 пациента, които не страдат от IBD или подобни нарушения (трима мъже и две жени). Средната възраст на тази група е 55.2 години (от 24 до 76 години). При всички пациенти, заболяването се локализира в червото.

Полуколичествен RT-PCR на човешки IL18 и IL-18BP

Тотална РНК се екстрахира от замразени чревни биопсии на пациенти с CD, с UC или от контролни пациенти. РНК екстракцията се прави, чрез Trizol (Gibco) съгласно инструкциите на производителя. Получените проби, се определят количествено, чрез измерване на абсорбциите при 260 nm. Целостта на РНК се анализира, чрез електрофореза в 1% агарозен гел. кДНК се синтезира от 1 microg тотална РНК, чрез използване на Promega обратна транскриптазна система, съгласно протокол на производителя. PCR реакциите се провеждат в тотален обем 50 microl в присъствието на 1U от AmpliTaq ДНК Полимераза (Perkin Elmer, Roche, U.S.A), 2.5 mM dNTPs (Amersham, U.S.A) и 50 pmol от правия и обратния PCR праймер. Реакционните смеси се инкубират в РТС-200 Peltier Effect Thermal Cycler (MJ Research, U.S.A) при следните условия: денатурация 1 min при 94°С, хибридизация за 1 min при 55°С и елонгация за 1 min при 72°С. Оптималният брой цикли за IL-18 ВР, IL-18 и бета-актин преди сатурацията на ивиците (31,28 и 25, съответно). PCR праймерите се приготвят на базата на публикувани секвенции (AF110799, D49950, Х00351) и са следните: за IL-18, обратният праймер 5-GCGTCACTACACTCAGCTAA3'; правият праймер 5'-GCCTAGAGGTATGG CTGTAA-3'; за IL-18BP, правият праймер 5'ACCTGTCTACCTGGAGTGAA-3'; обратният праймер е 5'-GC ACGAAGATAGGAAGTCTG-3', за бета-актина, обратният праймер е 5-GGAG GAGCAATGATCTTGATCTTC-3'; правият 5'GCTC ACC ATGGATGATG ATATCGC-3'. За да се изключи амплифициране на геномна ДНК, съдържаща се в пробите, PCR реакциите се провеждат в отсъствие на кДНК матрица. PCR продуктите (10 microl) се анализират електрофоретично в 1% агарозни гелове в ТАЕ буфер. Размерът на PCR продуктите се определя чрез 1 КЬ стълбица (Gibco) след оцветяване на теловете. Относителен количествен анализ се прави по интензитета на оцветените с етидиев бромид ивици под UV светлина, чрез използване на Kodak Digital Sciences аналитичен софтуер и се дава като съотношение прицелен гел (hIL-18ВР, hIL-18) спрямо “housekeeping” гена(Ьбета-актин).

Създаване на моноклонални антитела, на33

66134 Bl сочени срещу hIL-18BP

BALB/c мишки се инжектират подкожно в четирите крайника, както и интранукално с 50 microg от изоформата rhIL-18BP-6his (пречистен от клетки от яйчник на китайски хамстер, Interpharm Laboratories, Nes Ziona, Israel) в PBS c адювант (MPL + TDM емулсия, RIBI Immunochem Research, Inc.) на ден 0,7 и 28. Четири дена след третата имунизация, лимфните възли се отделят с 2.4 ?g/ml колагеназа (колагеназа IV, Worthington Biochemical Corp.) и 0.1% Dnase (Sigma). Изолираните клетки след това се ресуспендират в DMEM-F12,10% FCS (Gibco) в присъствието на НАТ (хипоксантин, аминоптерин, тимидин) и се разпределят в 96-гнездни плаки с концентрация 5 χ 10⁴ клетки/ml. Пробите от хибридомната културална супернатанта се скринират за присъствието на реактивни антитела чрез директен скрининг анализ (Jackson Immuno Research, Milan analytica, Switzerland), хибридомните културални супернатанта се добавят, след което се добавя биотинилиран rhIL-18BP-6his (пречистен от COS клетки както е описано (Novick et al., 1999) със или без rhIL-18 (пречистен, рекомбинантно от Е. coli, Serano Pharmaceutical Research Institute, Geneva) и накрая стрептавидин-хрянова пероксидаза (HRP) (Jackson Immuno Research, Milan analytica, Switzerland) разработена, чрез използване на фениленедиамин (OPD) (Sigma). Не-неутрализиращите антитела са избрани и субклонирани. В това изследване се използва 95Н2О, мише IgGl моноклонално антитяло.

Имунохисто2химични изследвания за локализацията на IL-18Ьр-позитивни клетки

Тъканни проби се нарязват, замразяват се и се съхраняват на -80°С. Получават се серийни криосрези (10 microm), монтирани върху полиL-лизин покрити Supefrost/Plus стъкла (Plylabo, Plan-les-Ouates, Switzerland) и фиксирани в изстуден на лед ацетон. Локализацията на човешкия IL-18BP белтък се анализира, чрез имунохистохимия, като се използва Mab 95-Н2О. След кратко рехидратиране в PBS, срезите се преинкубират за 30 min в PBS, допълнен с 2% Фетален Телешки Серум (PCS) (Cansera, Ontario, Canada), 1% човешки серум (АВ* серум, Transfusion Center, Annemasse, France) и 0.5% Говежди Серумен Албумин (BSA) (Sigma, St. Louis, MO, U.S.A). Ендогенната пероксидазна активност се блокира чрез поставяне на стъклата в разтвор от

PBS, 2% FCS, 1% човешки серум, 0.5% BSA и 1% водороден прекис (Н₂О₂) (Fluka, Switzerland) за 1 h. След промиване в PBS, срезите се инкубират за една нощ в неразредена културална супернатанта от МаЬ-95-Н2О. След още една промивка в PBS, срезите се инкубират с биотинилирано козе, анти-мишо антитяло (Jackson Immuno Research, Milan analytica, Switzerland) (5 ?g/ml) в PBS, съдържащо 0.5% BSA за 1 h. Чувствителността на оцветяването се увеличава, чрез инкубиране с авидинОН/ биотинилиран HRP комплекс (Vectastain Elite ABC Kit, Vector Laboratories, CA, U.S.A) за 30 min. Стъклата след това се промиват с PBS и се проявяват, като се използва разтвор, съдържащ 30% Н₂О₂, 3,3-амино-9-етил карбазол (АЕС) (Sigma), Ν,Ν-диметилформамид (Merk) в ацетатен буфер, pH 5. След оцветяване с хематоксилин (Sigma), срезите се покриват с глицерол и се покриват с покривни стъкла. Мишето IgGl антитяло (R и D система) се използва като контрола-изотип.

За да се идентифицира локализацията на IL-18ВР в клетката, двойно имунохистохимично изследване се провежда върху срези от чревна мукоза. След 10 min рехидратиране в PBS, срезите се преинкубират за 30 min в PBS, допълнен с 2% FCS, 1% човешки серум и 0.5% BSA. За колокализация с ендотелни клетки, срезите се инкубират цяла нощ с биотинилирано Mab 95-Н2О (20 microg/ml) смесват се с FITCконюгирано мише античовешки CD31 (1:50) (Pharmingen, СА, U.S.A) в PBS/0.5% BSA. За капокализиране с макрофаги, срезите се инкубират цяла нощ с биотинилирано Mab 95-Н2О (20 microg/ml) смесено с FITC-конюгирано анти човешко CD68 (1:25) (Dako, Denmark). След промивка с PBS се добавя стрептавидин Texas Red (Southern Biotechnology Associates, AL, U.S.A) за 1 h. Стъклата се промиват още един път и срезите се покриват с мовиол и се монтират покривни стъкла. Биотинилираното мише IgGl антитяло (Pharmingen), последвано от стрептавидин Texas-Red се използва като контрола-изотип.

Клетъчно култивиране

Човешки ендотелни клетки на пъпна връв (HUVECs) (Clonetics Corp., San Diego, CA) ce култивират, като се използва Среда за ендотелни клетки (EGM) допълнена с човешки реком

66134 Bl бинантен епидермален растежен фактор (hEGF) (10 ng/ml), с говежди мозъчен екстракт (ВВЕ) (3 mg/ml) и 2 % фетален говежди серум (FBS) (Clonetics Corp., San Diego, СА) съгласно инструкциите на производителя. Културалните петрита се покриват с човешки фибронектин (10 ?g/cm²) (Boehringer, Mannheim). Клетките се инкубират във влажни условия в инкубатор, поддържащ 5% СО₂ и експериментите се провеждат, като се използват HUVECs на 3-ти пасаж. HUVECS се третират с човешки 1Ь-1бета (10 ng/ml), TNFалфа (10 ng/ml) и INFraMa (20 ng/ml) (R и D система, Germany) за 24 h. В края на периода на култивиране, клетките се събират, изолира се РНК и се провежда RT-PCR за IL-18BP и IL-18 иРНК транскриптен анализ. Супернатантите се събират и се анализират за IL-18ВР и IL-18 белтъчна експресия, чрез ELISA.

Човешка моноцитна клетъчна линия ТНР1 се под държа като суспензионна култура в RPMI среда, допълнена с 10% топлинно инактивиран FCS, L-глутамин (2 тМ), пеницилин-стрептомицин (10 U/ml) (Gibco BRL, Life Technologies) и бета-меркаптоетанол (50 ?M) (Fluka). Те се инкубират във влажни условия, в инкубатор, поддържащ 5% СО₂ и се пасажират 1:10 на всеки 5 дни. Три дни преди експеримента, човешките моноцитни клетки се довеждат до плътност 0.4 х 10⁶ клетки/ml, добавя се Vitamin D3 (80 пМ) (Biomol Research Laboratories, USA) и се оставят да адхерират. Веднъж отдиференцирани, към тях се добавя LPS (100 ng/ml) (Calbiochem), човешки IL-1 бета (10 ng/ml), Т№алфа (10 ng/ml) и INFraMa (20 ng/ml). След 48 h, супернатантите се събират и се анализират за IL-18BP и 1L-18 белтъчна експресия, чрез ELISA.

Измерване на продукцията на човешки IL18bpnIL-18

Присъствието на IL-18ВР се оценява чрез ELISA в културални супернатанти, без клетки, от HU VECs, които не са стимулирани и са стимулирани за 24 h с коктейл от цитокини (IL-16era, ЮТалфа, INFraMa), както и от клетъчната линия ТНР-1, нестимулирана и стимулирана за 48 h (LPS, IL-1 бета, ЮТалфа, INFraMa). За тази цел, плаките се покриват за една нощ с МаЬ (клон 657.27 0.5 microg /100 ?1/ на гнездо, Interpharm Laboratories, Nes Ziona, Israel) насочени срещу rhIL-18BP (изоформа a). Разтворимият hIL-18BP се детектира, като се из ползва плъшо поликлонално антитяло (разредено 1/10,000) срещу rhIL-18BP-6his (пречистено от клетки от яйчник на китайски хамстер, Interpharm Laboratories, Nes Ziona, Israel) и последваща инкубация с пероксидаза-конюгирано афинитетно пречистено козе анти-плъшо IgG (разредено 1/20,000) (Jackson Immuno Research, Milan analytica, Switzerland). Mab както и плъшото поликлонално антитяло се тестват чрез Western Blot, за да се потвърди тяхната специфичност спрямо IL-18BP. Рекомбинантно hlL18BP-his се използва като стандарт. Чувствителността на ELISA метода е 100 pg/ml. Паралелно се определят количествено нивата на IL18, като се използва ELISA кит за човешки IL18 (MBL, Immunotech). Чувствителността на ELISA метода е 12.5 pg/ml.

Експресия на hIL-18ВРа His6 в СНО клетки

Рекомбинантният човешки IL-18BP (hlL18ВРа His6-tag) е пречистен от клетки от яйчник на китайски хамстер (СНО, Interpharm Laboratories, Nes Ziona, Israel).

Резултати

Експресия на IL-18ВР иРНК транскрипти в чревни биопсии

Анализ за експресията на IL-18ВР иРНК е проведен, чрез RT-PCR на тъканни хомогенати от хирургически отстранени чревни проби на пациенти с активен CD, неактивен CD или UC и от невъзпалени чревни тъкани (Фиг. 14). IL-18BP и актиновите транскрипти се наблюдават във всички тествани чревни хомогенати. Подобно на това, транскриптите за IL-18 се откриват във всички тъканни хомогенати от CD, UC или от контроли, нестрадащи от IBD (Фиг. 14А). Съотношението на IL-18BP или IL-18 спрямо нивата на актин иРНК показват статистически достоверно повишаване (както е описано по-долу) в количеството на транскриптите на IL-18BP и IL-18 в биопсии, получени от пациенти с активни CD в сравнение с биопсии от пациенти с неактивни CD, UC и контроли, нестрадащи от IBD (Фиг. 14Б и В). Тези данни показват повишена продукция на IL-18BP в мукозна тъкан от активна форма на CD и осигурява първото доказателство, че нивото на IL-18ВР експресията ясно се отличава при активна и неактивна форма на CD, UC и при незаболели от IBD контроли.

Статистически анализ на експресията на

66134 Bl

IL-18BP иРНК транскрипти от чревни биопсии

Провежда се вариационен анализ, за да се обобщят всички налични данни. Изводите ясно показват статистически отнасяния на резултатите на един от пациентите от групата на тези с CD (много високо съотношение на OD за IL-18, именно 16252 и много ниско съотношение на OD за IL-18BP именно 1058). Тези единични нетипични измервания не позволяват да се направи анализ чрез ANOVA модела (р-стойността при теста на Shapiro-Wilks при нормални остатъци < 0.0001). Поради тази причина анализа на сдвояване на измерванията се игнорира при провеждане на статистическия анализ.

При ANOVA, който се използва се взема предвид фактор - Група (Контрола, Активна форма на CD, Неактивна форма на CD и UC), Белтък (IL-18 или IL-18BP) и Брой пациенти (23 пациента). Наблюдават се значителни разлики между групите (р стойността < 0,0001). Също така е интересно да се отбележи, че разликите при OD съотношението между IL-18 и IL-18ВР не се различават значително (р стойността е = 0.369). Още повече наблюдава се също корелацията между експресията на IL-18 и IL-18ВР. Коефициентът на корелация между IL-18 и IL-18BP е 0,67, което предполага очевидна връзка между OD съотношението измерено за IL-18 и IL-18BP. След получаване на резултатите, отнасящи се до ефекта в Групите, се използва метода на Scheffe, за да се направи сравнение между отделните групи. Може да се заключи, че съотношението между OD за активна форма на CD е значително повишено в сравнение с Контролната група (+3280), Групата на UC (+2590) и по-специално Групата на неактивна форма на CD (+4580) както и за експресията на IL-18ВР и IL-18.

Имунохистохимична локализация на IL18ВР в чревни тъкани

За да се оцени клетъчната експресия на IL18ВР in situ, се провежда Имунохистохимична реакция с използването наанти-Ь1Б-18ВР специфични моноклонални антитела върху криосрези, приготвени от чревни тъкани, получени от пациенти с активна форма на CD и от контроли, нестрадащи от IBD. IL-18BP позитивните клетки се наблюдават в ламина проприа, в субмукозата и в мускулната обвивка (не е показано). Позитивно оцветените мононуклеарни клетки, присъстващи в ламина проприа и субмукозата, притежават мно го цитоплазма, везикуларни ретиформени ядра и са морфологично съответстващи на тъканните макрофаги. В мускулната обвивка, позитивно оцветените клетки имат много цитоплазма с няколко отворени лумена в средната част, което предполага оцветяване на микросъдовете и те са морфологично съответстващи на ендотелните клетки Големите кръвоносни съдове също се оцветяват специфично с анти-hIL-lSBP моноклоналните антитела Значително повишаване на позитивно оцветените клетки се наблюдава в проби, получени от пациенти с активна форма на CD в сравнение със проби получени от контроли, нестрадащи от IBD, което корелира с повишеното ниво на експресия на IL-18ВР, наблюдавано при RT-PCR анализа. Съседни срези са инкубирани със съответната миша контролаизотип.

Идентифициране на IL-18bp продуциращи клетки, присъстващи в мукозните биопсии

IL-18BP позитивни клетки, присъстващи във възпалените чревни тъкани се идентифицират, като се използват специфични маркери за макрофагите (анти-СО68) и ендотелни клетки (анти-СОЗ 1) (не е показано). CD68 позитивни клетки (в зелено) и IL-18ВР позитивни клетки (в червено) се наблюдават в субмукозата. За да се потвърди, че макрофагите и ендотелните клетки също са позитивни за IL-18 ВР, и позитивно зелено оцветените контроли за анти-СО68 или анти-СО31 и червено оцветените за антиIL-18BP се анализират заедно, като се показва че всички тези клетки, които се свързват с анти-IL-l 8ВР антителата са позитивни или за CD68 или за CD31 (оранжево-жълт цвят). Двойното имунобелязане показва, че макрофагите и ендотелните клетки са главен източник на оцветяване за IL-18ВР на възпалените тъкани, получени от пациенти с CD.

Експресия на IL-18bp иРНК и белтък от ендотелните клетки

За да се изследва способността на човешките ендотелни клетки да продуцират IL-18ВР и за да се потвърди резултатът, наблюдаван от имунооцветяването и RT-PCR на всички биопсии, по-нататък RT-PCR експерименти се провеждат с човешки ендотелни клетки от пъпна връв (HUVECs) (Фиг. 15А). Ендотелните клетки се третират с коктейл от цитокини (НБ-1бета, ЬТ№алфа, hINFraMa) и се събират след 24 h за

66134 Bl екстракция на РНК и за PCR анализ. Съотношението на IL-18ВР спрямо контролните нива на иРНК за актин показва повишаване на количеството на IL-18BP транскриптите в третирани клетки, в сравнение с нестимулирани клетки след 24 h. Още повече, IL-18BP иРНК изглежда се експресира постоянно в ендотелните клетки. Нивата на IL-18 иРНК също се анализират и е показано слабо повишаване при третираните клетки. IL-18 иРНК обаче, не се експресира при нестимулирани ендотелни клетки.

ELISA на културални супернатанта от нестимулирани клетки (среда) и HUVECs третирани 24 h, показват, че IL-18BP белтъка присъства в средата и при стимулирани клетки се повишава 30 пъти след 24 h стимулиране (Фиг. 15Б).

Експресия на IL-18bp в моноцитна клетъчна линия (ТНР-1)

Експресията на IL-18 и на IL-18ВР се анализира в културални супернатанта на нестимулирани и стимулирани, диференцирани ТНР-1 клетки, чрез ELISA (Фиг. 15В). Този експеримент показва повишаване на експресията на IL18ВР след 48 h стимулиране с LPS, hIL-16eTa, ИЮТалфа, hlFNraMa. Паралелно, секрецията на IL-18 се повишава след стимулиране (Фиг. 15В).

Обобщение

В настоящото изследване се характеризират експресията на IL-18BP и локализацията в мукозна тъкан, получена от пациенти с болест на Crohn и язвени колити. Чрез използване на полуколичествен RT-PCR протокол, се установява, че IL-18ВР иРНК транскриптите се увеличават в мукозни биопсии на пациенти с активна форма на болестта на Crohn, в сравнение с пациенти с язвени колити или контролни пациенти, нестрадащи от възпаления. Имунохистохимичен анализ за локализацията на IL-18ВР белтък в ендотелните клетки и в активираните макрофаги от мукозни биопсии е потвърдено в първични човешки ендотелни клетки от пъпна връв (HUVECs) и в ТНР1 моноцитна клетъчна линия, стимулирани in vitro. След стимулиране, тези клетки секретират биоактивен IL-18ВР.

Пример 12

Лечението с инхибитори на IL-18 облекчава експериментално предизвикани колити

Материали и методи

Мишки и индуциране на колити

За всички експеримента бе получено раз решение от Animal Studies Ethics Committee, University of Amsterdam, The Netherlands. BALB/ c мишките са доставени от Harlan Sprague Dawley Inc (Horst, the Netherlands). Мишките се гледат при стандартни условия и им се доставя вода и храна (АМ-П 10 mm, Hope Farms, Woerden, The Netherland).

Експериментите се провеждат с 8- и 10седмични женски BALB/c мишки. Колитите се индуцират чрез ректално въвеждане на две дози (подавани на 7-дневен интервал) от 2 mg 2,4,6тринитробензен сулфониева киселина (TNBS) (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) в 40 % етанол (Merk, Darmstadt, Germany), c използване на винилов катетър, който се поставя в позиция на 3 cm от ануса (10 мишки във всяка група). По време на инсталацията, мишките се анестезират с изофлуран (1-хлоро-2,2,2-трифлуоретил-изофлуран-дифлуорметил-етер, Abbott Laboratories Ltd, Queenborough, Kent, UK) и след инсталацията те се държат вертикално за 60 s. Контролните мишки преминават през същите процедури, но им се инсталира физиологичен разтвор. Всички мишки се убиват 9 дена след първото TNBS въвеждане (т. е. 48 h след второто TNBS въвеждане).

Мишките се третират с човешки IL-18BP в 500 microl 0.9% солеви разтвор интраперитонеално.

HIL-18BP е свързан 6 пъти с хистидин tag човешки рекомбинантен протеин, получен от СНО експресионна система. HIL-18BP е биологично активен и инхибира INFraMa продукцията в KG-1 клетъчна линия и редуцира INFгама продукцията от миши далачни клетки (Kim et al., 2000).

Оценка на възпалението

Телесните тегла се записват всеки ден. Далачните, каудалните лимфни възли и чревните се отстраняват при убиването. Червата се отстраняват чрез срез в средната част и чрез надлъжно отваряне. След отстраняване на фекалния материал, се измерва и се записва теглото за дисталните 6 cm и се използва като индекс на плътността на чревната стена отнасяща се до заболяването. Впоследствие, червата се разделят надлъжно на две части, едната от които се използва за хистологична оценка.

Хистологичен анализ

Надлъжно разделените черва се навиват,

66134 Bl фиксират се в 4% формалин и се включват в парафин за рутинна хистология. Двама изследователи, които не са в течение за третирането на мишките, оценяват по следните параметри: 1) процент включена площ; 2) хиперплазия на фоликулни агрегати, 3) едема, 4) ерозия/улцерация, 5) загуба на крипти и 6) инфилтрация на моно- и полиморфонуклеарни клетки. Процентът от площта и загубата на крипти се оценява по скала, варираща от 0 до 4, както следва: 0, нормално; 1, по-малко от 10%; 2,10%; 3,10 до 50%; 4, повече от 50%. Ерозиите се определят като 0, ако епителия е интактен, 1 при засягане на ламина проприя, 2 при улцерации на субмукозата и 3, когато улцерациите пробили стената. Остротата на другите параметри се оценява по скала от 0 до 3, както следва: 0, липса; 1, слабо; 2, средно; 3 остра форма. Тези оценки се дават от 0 до максимум 26 точки.

Чревни хомогенати

Червата се отстраняват и хомогенати се приготвят чрез тъканен хомогенизатор в 9 обема от Greenburger лизис буфер (300 mM NaCl, 15 тМ Трие, 2 тМ MgCl, 2 тМ Тритон (Х-100), Пепстатин А, Леупептин, Апринин (всички 20 ng/ ml), pH 7.4). Тъканите се лизират за 30 min на лед, след 2 пъти центрофугиране (10 min, 14 000 g). Хомогенатите се съхраняват при -20°С преди да се използват.

Клетъчно култивиране и ELISA за цитокини

За приготвяне на клетъчни суспензии от далачни и каудални лимфни възли се използва филтър за клетъчно дрениране (Becton/Dickenson Labware, New Jersey, USA). Клетките се суспендират в среда RPMI 1640 (Bio WhittakerBoehringer, Verviers, Belgium), съдържащ 10% PCS и ципроксин (10 microg/ml) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Далачните клетки се центрофугират със стерилен Фикол (Pharmacia, Uppsala, Sweeden), мононуклеарните клетки се прехвърлят в RPMI и клетъчните суспензии се броят. Общият брой от 1 х 10⁵ клетки от мишка се инкубират в 20 microl RPMI (BioWittaker Europe, A Cambrex Company, Verviers, Belgium), съдържаща антибиотици и 10% фетален телешки серум в трикратно повторени гнезда. Клетките се стимулират чрез покрития от анти-СОЗ антитяло (1:30 концентрация; 145.2С11 клон) ис разтворимо анти-СВ28 антитяло (1:1000 концентрация; Pharminogen). Супернатантите се отстраняват след 48 h и IFN гама (Pharminogen) и

ТЖалфа (R&D системи, Abingdon, United

Kingdom) концентрациите се измерват чрез

ELISA анализ.

Флоу цитометрия

Изолираните далачни клетки се промиват с Facs буфер (PBS, съдържащ 0.5% BSA, 0.3 mmol/L ЕДТА и 0.01% натриев азид) и се държат на лед до края на процедурата. 2.10⁵ клетки на гнездо (96-гнездна, v-образна микротитърна плака, Greiner В. V. labor techniek, Alphen aan de Rijn, The Netherlands) се инкубират със следните антитела (mAbs): Cy-chrome-конюгирано плъшо анти-мишо CD4 (клон RM4-5), Fitc-конюгирано плъшо анти-мишо CD69 и Fitc-конюгирано плъшо анти-мишо CD25 (Pharmingen, San Diego, СА). Лимфоцитите се пропускат отпред и отстрани чрез разпръскване, като се използва FACScan flow цитометьр, свързан със Facscan софтуер (Becton Dickinson, Mountain View, USA), като се отброяват 5000 клетки. Резултатите се дават като процент позитивни за използваните mAbs от пропуснатите клетки.

Статистически анализ

Стойностите се дават като средни стойности и SEM за всяка третирана група. Разликите между групите се анализират, като се използва непараметричният Mann-Withney U тест. Разликите в теглата във времето се анализират чрез едностранният вариационен анализ. Стойностите Р<0,05 се считат като статистически значими. SPSS статистически софтуер (SPSS Inc., Chicago, USA) се използва за анализите.

Резултати

IL-18ВР предпазва от загуба на тегло при миши модел на колити

За да се изследва ролята на IL-18 при експериментални колити и по-специално предпазният ефект на IL-18 свързващия белтък (IL18ВР), TNBS колити се индуцират в BALB/c мишки. Този модел включва локално подаване на тринитробензен сулфониева киселина (TNBS) в 40% етанол. То води до късна форма на хиперчувствителна реакция към хаптена (тринитрофенил) модифицираща собственият антиген и Th 1-тип отговор с повишено ниво на продукция на цитокини.

Третирането с IL-18ВР, както и при мишките контроли, е чрез ежедневно интраперито38

66134 Bl неално въвеждане (ip).

Дневните интраперитонеални дози, вариращи от 12.5 до 50 microg hIL-18BP не се отразяват на остротата на заболяването (данните не са показани). Използвайки дневна доза от 200 microg hIL-18BP, обаче, ежедневно интраперитонеално въвеждана, показва ефект на редукция на загубата на тегло, което е свързано с индукцията на заболяването.

Както се очаква, интраректалната инсталация на TNBS води до диария и загуби. Както е показано на Фиг. 16, животните в двете третирани групи губят 15% от основното си тегло на третия ден. Обаче в противовес на контролните мишки, 4 дена след TNBS инсталирането, hlL18ВР-третираните животни започват бързо да възстановяват първоначалната загуба на тегло, като се връщат до основното си тегло на 8 ден. При контролните мишки, второто въвеждане на TNBS на 8 ден, отново води до значителна загуба на тегло, което се предотвратява в голяма степен при въвеждане на hIL-18ВР. Въвеждането на hIL-18ВР при мишките третирани със солеви разтвор не оказва ефект (данните не са показани). Следователно, въвеждането на hIL-18BP значително намалява телесната загуба, при TNBS-индуцираните колити (р<0.05).

Ефекти върху параметрите на възпалителните реакции

На 10 ден, мишките се убиват и се определя теглото на последните 6 cm на червото (Фиг. 17А). При TNBS колитите, теглото на червото се увеличава, в сравнение с това при третираните със солеви разтвор мишки. Това повишаване на теглото е значително по-малко при hIL-Ι 8ВР третирани мишки (181.6 mg ± 11.4 в сравнение с 268 mg ± 27.3 при третираните със солеви разтвор мишки (р<0.05)). В предходни изследвания е съобщено, че TNBS колитите са свързани с повишена миграция на клетки в каудавните лимфни възли (Camoglio et al., 2000). Третирането с IL-18 ВР редуцира броят на клетките в каудалните лимфни възли в сравнение с броя на клетките в каудалните лимфни възли при TNBS мишки третирани със солеви разтвор (Фиг. 17Б).

Промяната в експресията на CD69, която е маркер за ранно активиране на Т-лимфоцитите, се определя чрез Facscan анализ (Фиг. 17В). Процентът на СО4⁺далачните клетки експресиращи CD69 е 11.4% при TNBS-третирани миш ки, но при TNBS третирани и ML-18BP третирани мишки процента на CD4⁺/CD69⁺ е 7.3% (р<0,05).

Продукция на цитокини в далака, в клетките на каудалните лимфни възли и в чревните хомогенати.

За да се изследва ефекта на hIL-18ВР върху способността на Т-лимфоцитите да продуцират провъзпалителни цитокини, синтезата на които следва активирането на Т-клетичните рецептори, клетките са изолирани от каудални лимфни възли и от далак и са стимулирани за 48 h с aHTH-CD3/CD28 антитела. В супернатантите се измерва продукцията на INFraMa и Т№алфа (Фигура 18). Не се наблюдават значителни разлики между продукцията на цитокини при hlL18ВР третираните мишки и при контролните мишки. Следователно, неутрализирането на IL18 от hIL-18BP не води до обща редукция на способността на Т-лимфоцитите да отговарят на Т-клетьчното рецепторно активиране.

Чревните хомогенати са анализирани за техните нива на цитокини, затова се измерва локалната продукция на цитокини (Фиг. 19). Не се наблюдават разлики в нивата на INFraMa в чревните хомогенати на TNBS-третирани мишки, и TNBS третирани мишки, третирани и с hIL-Ι 8ВР (134 pg/ml ± 7.8 и 139 pg/ml ± 23 съответно). Нивата на Т№алфа, обаче значително се понижават в чревни хомогенати на мишки, третирани с hIL-18BP от 110 pg/ml ± 3 в TNBS третирани мишки до 59 pg/ml + 2.7 в мишки, третирани с TNBS HhIL-18BP.

Хистологични наблюдения

За да се изследва, дали МЕ-18ВР-медиираната редукция на параметрите на възпалителните реакции се отразява също на резултатите от хистологичните изследвания, хистопатологични изследвания се провеждат върху парафинови срези. Общият резултат за възпалителни реакции, при хистологичните изследвания, значително се понижава при hIL-18BP третирани мишки, в сравнение с контролни-третирани мишки (15.9 ±1.1 при нетретирани мишки до 9,8 ± 1,3 при hIL-18BP третирани мишки) (не е показано), главно като резултат от редукцията на броя на левкоцитите инфилтрирани в мукозата (р<0.05). Забележително откритие е напълното отсъствие на мукозни улцерации при IL-18BP третирани мишки (р<0.05). Откритията са сумирани в

66134 Bl

Таблица 2, по-долу. Пълното предпазване от улцерации при IL-18BP третирани мишки е забележително в тези случаи.

ТАБЛИЦА 2:

РАЗЛИЧНИ ТОЧКИ ОТ СЪРЦЕВИНАТА НА РАЗВИТИТЕ

КОЛИТИ ПРИ TNBS ТРЕТИРАНИ МИШКИ, ТРЕТИРАНИ СЪС

СОЛЕВИ РАЗТВОР ИЛИ С rblL-UBP.

	Контролни третирани с TNBS мишки	hIL-18BP третирани мишки, третирани и с TNBS
% Засегната площ	3.4 ±0.4	3.2 ±0.5
Фоликулни агрегати	2.0 ±0.4	1.5 ±0.4
Бдема	2.1 ±0.3	1.3 ±0.3
Фибрози	0.85 ±0.26	0.50 ±0.2
Улцерации	2.0 ±0.3	0.0 ±0.0*
Загуба на крипти	1.7 ±0.3	1.0 ±0.3
Полимороядрени клетки	2.6 ±0.2	1.3 ±0.2*
Мононуклеарни клетки	1.1 ±0.1	0.33 ±0.21*

Данните са показани, като средни стойности + SEM по скалата от 0-4, с * са показани статистически значимите разлики.

Анти mIL-18 поликлоналните антитела предпазват от заболявания, свързани с миши мо- 3 5 дел на декстран сулфат натрий - индуциран колит

В този модел, декстран сулфат натрий (DSS) се подава с водата за пиене, като началото на отчитането преди убиването на животните се 40 отбелязва, като ден 0. Анти-IL-l 8ВР поликлонални антитела се въвеждат на ден 0,4 и 8 i.p. Дозите са 200 и 400 ?1 от заешки серум. Най-високата доза (400 microl) дава значителна редукция на загубата на тегло, клинични резултати, ректално 45 кървене и скъсяване на дебелото черво (не е показано). Третирането със заешки анти-т1Е-18 показва забавяне на началото на симптомите и предотвратяване на развитието на заболяването (не е показано). 50

Обобщение

Пример 12, описан по-горе, показва, че неутрализирането на IL-18 чрез въвеждането на hIL-18BP или на поликлонален антисерум срещу IL-18, ефективно редуцира остротата на експериментално индуцирани колити в мишки.

Мишките, третирани дневно с hIL-18ВР интраперитонеално, бързо се възстановяват от първоначалната загуба на тегло, в сравнение с контролно-третирани мишки. Други параметри на чревни възпалителни реакции се определят чрез измерване на теглото на червата и инфлукса на клетки в каудалните лимфни възли, които се редуцират при hIL-18BP третирани мишки. Хистопатологичната картина при третирани мишки се характеризира с редукция на остра форма на тъканна деструкция (улцерации) и със значителна редукция на количеството инфилтрирани клетки. Ефектът на hlL-18BP е също системен, което се демонстрира от редукцията в експре

66134 Bl сията на CD69 от далачните клетки.

Локалната продукция на Т№алфа, измерен в чревни хомогенати, значително се редуцира при TNBS третирани мишки, третирани и с hIL-18ВР. Това показва, че ТЪТалфа играе важна роля за развитието на заболяването. Нивата на INFraMa са сравними при TNBS третирани мишки и мишки третирани с TNBS и с hIL-18ВР, което може да се обясни с редукцията на INFraма-индуциращи стимули.

В заключение, данните представени по-горе показват благоприятен ефект на инхибиторите на IL-18 при лечение на чревни възпалителни заболявания.

Claims

Патентни претенции

1. Използване на инхибитор за IL-18, избран от групата на IL-18 антитяло и свързващ се с IL-18 белтък или изоформа, мутеин, слят белтък, функционално производно, активна фракция или техни циклични пермутирани производни, притежаващи по същество същата активност както свързващия се с IL-18 белтък, за производство на лекарствен препарат, за лечение и/ или предпазване от хронично чернодробно увреждане, избрано от групата, съставена от алкохолен хепатит, вирусен хепатит, имунен хепатит; чернодробна цироза, първична билиарна цироза, хроничен активен хепатит, автоимунен хепатит и хроничен персистиращ хепатит.
2. Използване съгласно претенция 1, където антитялото IL-18 е хуманизирано IL-18 антитяло.
3. Използване съгласно претенция 1, където антитялото IL-18 е човешко IL-18 антитяло.
4. Използване съгласно претенция 1, където свързващият се с IL-18 белтък е ПЕГилиран.
5. Използване съгласно претенция 1, където инхибиторът на IL-18 е слят белтък, включващ целия или част от свързващ се с IL-18 белтък, слят с целия или с част от имуноглобулин и където слетият белтък се свързва с IL-18.
6. Използване съгласно претенция 5, където слетият белтък включва цялата или част от константната област на имуноглобулин.
7. Използване съгласно претенция 6, където имуноглобулинът е IgGl или IgG2 изотип.
8. Използване съгласно всяка една от предходните претенции, където лекарственият препарат включва в допълнение интерферон.
9. Използване съгласно претенция 8, където интерферонът е интерферон-бета.
10. Използване съгласно претенция 8 или 9, където инхибиторът за IL-18 се използва едновременно, последователно или отделно с интерферона.
11. Използване съгласно всяка една от предходните претенции, където лекарственият препарат включва в допълнение антагонист на Тумор Некрозис Фактор (TNF).
12. Използване съгласно претенция 11, където антагонист на TNF е разтворим TNF рецептор I (TBPI) и/или разтворим TNF рецептор II (ТВРП).
13. Използване съгласно претенция 11 или 12, където инхибиторът за IL-18 и/или интерферонът се използват едновременно, последователно или отделно с TNF антагониста.
14. Използване съгласно всяка една от предходните претенции, където лекарственият препарат включва в допълнение СОХ-инхибитор.
15. Използване съгласно претенция 14, където COX-инхибиторът е СОХ-2 инхибитор.
16. Използване съгласно всяка една от предходните претенции, където инхибиторът за IL-18 се използва в количество от около 0.0001 до 10 mg/kg телесно тегло, или около 0.01 до 5 mg/kg телесно тегло, или около 0.1 до 3 mg/kg телесно тегло, или около 1 до 2 mg/kg телесно тегло.
17. Използване съгласно всяка една от предходните претенции, където инхибиторът за IL-18 се използва в количество от около 0.1 до 1000 microg/kg телесно тегло, или от 1 до 100 microg/kg телесно тегло, или около 10 до 50 microg/kg телесно тегло.
18. Използване съгласно всяка една от предходните претенции, където инхибиторът за IL-18 се прилага подкожно.
19. Използване съгласно всяка една от предходните претенции, където инхибиторът за IL-18 се прилага интрамускулно.
20. Използване съгласно всяка една от предходните претенции, където инхибиторът за IL-18 се прилага ежедневно.
21. Използване съгласно всяка една от предходните претенции, където инхибиторът за IL-18 се прилага през ден.
22. Използване на експресионен вектор,

66134 Bl включващ кодиращата секвенция на свързващия се с IL-18 белтък, за производство на лекарствен препарат за лечение и/или предпазване от хронично чернодробно увреждане, избрано от групата, съставена от алкохолен хепатит, вирусен хепатит; имунен хепатит; чернодробна цироза, първична билиарна цироза, хроничен активен хепатит, автоимунен хепатит и хроничен персистиращ хепатит.
23. Използване съгласно претенция 22 за генна терапия.
24. Използване на клетка, която е модифицирана по генетичен път, за получаване на свързващ се с IL-18 белтък, за производство на лекарствен препарат за лечение и/или предпазване от хронично чернодробно увреждане, избрано от групата, съставена от алкохолен хепатит, вирусен хепатит, имунен хепатит, чернодробна цироза, първична билиарна цироза, хроничен активен хепатит, автоимунен хепатит и хроничен персистиращ хепатит.