KR100426657B1

KR100426657B1 - 티족사나이드 및 니타족사나이드의 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR100426657B1
Application number: KR10-1999-7009930A
Authority: KR
Inventors: 로시놀장-흐랑스와
Original assignee: 로마크 레버러토리즈, 엘.씨.
Priority date: 1997-05-07
Filing date: 1998-05-06
Publication date: 2004-04-13
Also published as: SI20149A; ES2150404T1; EA002908B1; NO20021832D0; EP1005342A4; CA2418634A1; EE9900578A; AP9901675A0; CA2418634C; DE69809928T2; UA57079C2; KR100576646B1; LV12492A; BR9808722A; BG103958A; HUP0003330A3; IS5223A; CN1158074C; IL132516A0; HK1025907A1

Abstract

활성제로서 최소한 다음의 구조식 (Ⅰ) 및 (Ⅱ)로 이루어지는 군으로부터 선택되어지는 하나의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물.

상기 활성제은 바람직하게는 그 입자크기가 200 ㎛ 보다 작고 평균적으로 10 ㎛ 보다 큰 입자들의 형태이다. 상기 약제학적 조성물은 바람직하게는 최소한 하나이상의 약제학적으로 허용되는 산을 가지며 안정되어진다. 상기 약물 화합물은 특히 흡충에 감염되었을 경우 및 면역력이 떨어진 또는 억제된 면역시스템을 갖는 사람이 우연히 감염되었을 경우 그 치료에 유용하다.

Description

티족사나이드 및 니타족사나이드의 약제학적 조성물{pHARMACEUTICAL COMPOSITIONS OF TIZOXANIDE AND NITAZOXANIDE}

억제된 면역 시스템을 갖는 사람들(AIDS, 암환자, 장년층, 노년층, 면역억제 약물을 써서 조직이 이식된 환자들)이 수 많은 기생충 및 박테리아에 감염되었을 경우의 그 치료법의 개발 필요성이 절실하다. 또 다른 관심의 분야는, 특히 열대기후에서, 흡충감염의 경우이다. 따라서 열대 환경에서도 안전하게 저장되고, 면역력이 억제된 인간도 견딜 수 있는 약제학적 조성물이 필요하다.

특히, 톡소플라즈마 뇌척수염 병원체(Toxoplasma gondii)는 원생동물이며 전세계를 통해 중추 신경계의 잠재적 감염에 대한 가장 주요한 원인들 중의 하나이다. 많은 건강한 사람들이 상기 기생충에 감염되지만, 보통 면역 시스템이 상기 조직체를 조절하고 있다. 톡소플라즈마 뇌척수염 병원체(T. gondii)는 에이즈 환자의 뇌에 가장 일반적인 기회 병원균이다. 현재, 톡소플라즈마병은 에이즈 때문만이 아니라 면역억제제(예를 들어, 조직이식 환자에게 투여되는 것과 같은)의 광범위한 사용때문에 문제가 점점 커져가고 있다. 톡소플라즈마병은 보통 피리메타민(pyrimethamine)과 설파디아진(sulfadiazine)의 배합으로 치료되어진다. 상기 약물은 효과적인 반면에, 기생충의 낭포(cyst)를 파괴하지는 않으므로, 치료는 지속적인 복용(a maintenance dose)으로 계속되어야 한다. 약의 독성은, 특히 면역력이 억제된 경우에, 종종 계속적인 약의 복용을 못하도록 하고 그로 인해 재발되는 결과를 낳는다. 통계상으로도, 면역결핍환자들의 약 70% 사망률과 4개월의 생존도 중간(50%)을 나타내는 것으로 보고되고 있다.

잠재스포리듐증(cryptosporidiosis)은 극미의 원생생물 기생충인 잠재스포리듐 기생충(Cryptosporidium parvum)에 의해 유발된다. 보통의 면역기능을 갖는 사람들에게서, 잠재스포리듐 기생충(C. parvum)에 의해 유발된 설사는 강력하고 길 수 있으나 자기제한적이다. 에이즈 환자에게서, 잠재스포리듐 설사는 종종 생명을 위협할 정도이다. 에이즈 환자들의 15-20% 가 이로 인해 고생하고 있다. 지금까지, 상기 잠재스포리듐증에 대해 효과적이거나 또는 인정된 치료법은 밝혀지지 않고 있다.

에이즈 환자들에게서 가장 흔히 확인된 병원균은 환자들의 거의 1/4 에서 발견되는 미세스포리디안 기생충(a microsporidian parasite)인 장세포기생원충(Enterocytozoon bieneusi)이다. 상기 조그만 기생충은 HIV로 고생하는 환자들로부터 보이는 저흡수(malabsorption), 설사, 체력소모(wasting)의 많은 설명할 수 없는 경우의 원인으로서 상당히 큰 부분을 차지할 수 있는 것으로 보이고 있다. 지금까지 효과적인 치료법은 알려져 있지 않고 있다.

미포자충의 1속(EncepHalitozoon hellem), 집토끼뇌회백염의 병원체(EncepHalitozoon cuniculi) 및 장내 셉타타(Septata intestinals)로 새로 명칭된 신종을 포함한 여러가지 미포자충목들(microsporidia)의 다른 종들은 HIV 양성 환자들을 감염시킨다. 최근의 한 보고서에서는 유포된 미포자충목 감염들이 중요한 문제로 커지고 있음을 나타내고 있다.

기생충 구충속 원충(Isospora belli) 감염은 잠재스포리듐증(cryptosporidiosis)과는 의학적으로 구별할 수 없다. 열대기후지방에서 더 흔한 구충속 원충(I. belli)은, 비록 실제 발생빈도는 아마도 더 높겠지만, 미국에서는 환자들의 1% 미만으로 보고되어 왔다.

소아 폐렴 원충(Pneumocystics carinii)은 일반적으로 원생동물 기생충(protozoan parasite)으로 분류된다; 어떤 연구에서는 특정 유전 배열을 공유하는 균류일 가능성을 제시하고 있다. 소아 폐렴 원충(P. carinii)은 보통 폐를 감염시킨다 (소아 원충 폐렴, Pneumocystics carinii Pneumonia(PCP)). 치료법은, 특히 면역력이 억제된 환자들에게 약물 독성을 포함한 문제를 유발하면서, 환자들의 약 40-60 % 정도 성공적인 것으로 보고된다. 인간후천성면역결핍 바이러스(HIV)에 감염된 어린이들의 많은 심각한 증세 중, PCP는 높은 발생 빈도, 독특한 연령 분포, 빈번한 사망률로 유명하다. PCP는 HIV에 감염된 어린이들에게서 가장 흔하고 심각한 감염이다; 예방되지 않은 HIV-감염 유아들 중에 PCP의 발생 빈도는 태어난 후 첫해에 최소한 12% 이상인 것으로 추산되고 있다. 많은 아이들이 변형 PCP가 전개되자마자 곧 사망하고 있다.

미코박테륨속 균 조성물(Mycobacterium Avium Complex, MAC)은 미코박테리아 균(Mycobacterium avium), 미코박테리아 세포내 물질(M. intracellulare)같은 매우 유사한 미코박테리아 조직체들(Mycobacterial organisms)의 군에 의한 감염과 관련된다. 상기 MAC가 면역력이 저하되지 않은 사람한테 발생할 때에는, 보통 호흡관의 감염 형태로 나타나고 있다. 에이즈 환자에서, 거의 모든 조직계가 포함될 정도로, MAC는 아주 잘 퍼져나간다(유포된 MAC 또는 DMAC). 최근 연구에서, MAC 박테리아는 에이즈 진단 후 2년간 생존해 온 환자들의 43%에서 발견되었다. 유포된 MAC에 대한 어떠한 표준 치료법도 서있지 않다. 조제된 약들이 보통 처방되고, 성공적이라면, 상기 치료가 일생동안 계속되어야 할 것이다. 더 효과적인 치료가 절실히 필요하다.

HIV에 감염된 사람들은 특히 미코박테리윰 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)의 감염에 걸리기 쉽고, 상기 병의 과정도 촉발된다. 폐이외의 결핵균은 HIV에 감염되지 않은 사람들에게는 드문 반면, HIV 양성인 사람들에서는 종종 발생하고 있다. CDC는 점점 우세해가는 다중-약물 저항 결핵균(multi-drug resistant TB, MDR-TB)을 겨냥한 결핵균의 치료에 대한 안내지침서를 배포하고 있다. 다중-약물 저항 결핵균(MDR-TB)을 갖는 에이즈 환자들의 사망률은 매우 높고(대략 80%) 병의 진전도 매우 빠르다.

따라서, 인간과 동물을 위협하고 아주 유행되고 있는 이러한 감염에 대한 치료법의 개발이 절실히 필요하다.

또한, 흡충 감염 치료법의 단순화를 위한 광범위하게 작용하는 약물의 개발도 필요하다. 현재, 특정 흡충 병원균을 진단하고, 이 후 상기 흡충에 대한 약물 치료의 상세한 사항을 처방하는 것이 필요하다. 많은 미개발 국가들에서는 특정 흡충을 진단하는 장치가 구비되지 않고 있다. 광범위하게 작용하는 약물의 개발로 진단이 필요없게 된다.

피 흡충인 만손 주혈 흡충(Schistosoma mansoni)은 두번째로 중요한 인간의 열대 기생충 병(말라리아 이후)인 주혈흡충증 (Schstosomasis)의 원인이 되는 인자이고 가장 중요한 인간 흡충 감염이다. 빌하르쯔 주혈 흡충 (Schistosoma haematobium)은 인간을 감염시키는 또 다른 중요한 종이다. 미국에서의 수십만의 사람들을 포함하여 전세계적으로 200만 이상의 사람들이 주혈 흡충증(schistosomiasis)으로 고생하고 있다.

일반적인 간 흡충(Fasciola hepatica)은 주로 양의 질병이나, 때때로 인간도 숙주가 된다. 상기 기생충은 숙주의 활발한 면역반응의 존재하에서 생존하고 있다. 비티오놀(Bithionol)이 치료제로서 제시되어 왔으나 미국내에서는 그 사용이 허락되지 않고 있다.

따라서 흡충류들에 대해 광범위하게 작용하고, 열대 환경에서조차도 안전하게 저장될 수 있는 약제학적 조성물이 필요하다.

본 발명은 활성제로서 최소한 다음의 구조식 (Ⅰ) 및 (Ⅱ)로 이루어지는 군으로부터 선택되어지는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물에 관련된다.

상기 활성제은 바람직하게는 그 입자크기가 200 ㎛ 보다 작고 평균적으로 10 ㎛ 보다 큰 입자들의 형태이다.

본 발명은 또한 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 산으로 안정화된 약제학적 조성물에 관한 것이다.

상기 약제학적 조성물은 특히 흡충에 감염되었을 경우 및 면역력이 떨어진 또는 억제된 면역시스템을 갖는 사람이 쉽게 감염되었을 경우 그 치료에 특히 유용하다.

본 발명의 목적 및 성질을 완전히 이해하기 위해서 다음의 첨부 도면을 상세한 설명과 함께 참고 한다:

도 1은 장내 미포자충(E. intestinals)에 대한 니타족사나이드 (nitazoxanide)의 억제율 및 숙주세포 생존율을 도시한 것이고,

도 2는 브이 각막(V. corneae)에 대한 니타족사나이드의 억제율 및 숙주세포 생존율을 도시한 것이고,

도 3은 장내 미포자충에 대한 알벤다졸(albendazole)의 억제율 및 숙주세포 생존율을 도시한 것이고,

도 4는 브이 각막(V. corneae)에 대한 알벤다졸의 억제율 및 숙주세포 생존율을 도시한 것이고,

도 5및 도 6은 배양에서 약물의 농도에 대한 각각의 뇌척수염 병원체(T. gondii) 배양대(culture well)에서 얻어진 광밀도 수치(OD value)의 점선표를 도시한 것이고,

도 7은 액상브로스(liquid broth)에서 성장하는 미코박테리아(mycobacteria)에 대한 니타족사나이드의 효능 분석에 기초한 도표이며,

도 8은㎛ 보다 작은 크기를 갖는 활성입자의 비율을 나타낸 것이다.

동물 연구 및 인간 의학 연구에서 구조식 (Ⅰ) 및 (Ⅱ)의 화합물을 이용한 치료의 효능은 화합물의 안정성과 활성 약물의 입자크기에 달려 있다는 것이 관찰되었다.

상술한 약제학적 조성물은 만손 주혈 흡충(Schistosoma mansoni), 빌하르쯔 주혈 흡충(Schistosoma haematobium), 메콘기 주혈 흡충(Schistosoma mekongi), 일본 주혈 흡충(Schistosoma japonicum), 인터칼라툼 주혈 흡충(Schistosoma intercalatum)과 같은 주혈 흡충; 간 흡충(Fasciola hepatica), 거대 간디스토마(Fasciola gigantica), 비대 흡충(Fasciolopsis biski)과 같은 간 흡충속; 및 창꼴 흡충(Dicrocoelium dendriticum), 이형 흡충(HeteropHyes heteropHyes), 요코가와 흡충(Metagonimus yokogawa)에 의해 유발된 인간 및 동물 흡충 감염을 치료하는데 적당하다.

상기 약제학적 조성물은 또한 면역력이 억제된 사람들이 잠재스포리듐 기생충 (Cryptosporidium parvum), 구충속 원충(Isospora belli), 장세포기생원충 (Enterocytozoon bieneusi), 장내 미포자충(EncepHalitozoon intestinalis), 미코박테리윰 결핵균(Mycobacterium tuberculosis), 미코박테리아 세포내 물질 (Mycobacterium avium intracellulare), 소아 폐렴 원충(Pneumocystics carinii) 및 톡소플라즈마 뇌척수염 병원체(Toxoplasma gondii)에 쉽게 감염되었을 때 효과적이다.

상기 약제학적 조성물은 고형의 복용가능 형태, 액상 현탁액(suspension) 형태 또는 페이스트(paste) 형태로 구강 투약될 수 있다.

본 발명의 감염 치료법은 활성제로서 다음의 구조식 (Ⅰ)의 데사세틸- 니타족사나이드(desacetyl-nitazoxanide)

및 다음의 구조식 (Ⅱ)의 니타족사나이드(nitazoxanide)

로 이루어지는 군으로부터 선택되는 최소한 하나의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물의 투약을 포함한다.

구조식 (Ⅱ)의 화합물인 니타족사나이드(Nitazoxanide, NTZ)는 1975년 로시그놀과 캐비어(Rossignol and Cavier)에 의해 처음으로 합성된 화합물인 2-(아세토릴옥시)-N-(5-니트로 2-티아졸리)벤자마이드 (2-(acetolyloxy)-N-(5-nitro 2-thiazoly) bezamide)에 대한 일반 명칭이다. 니타족사나이드 2 mg은 DMSO 1 ml 에 용해될 수 있다. 니타족사나이드는 구강에서 쉽게 흡수된다.

지금까지 구조식 (Ⅰ) 및/또는 구조식 (Ⅱ)의 화합물들이 흡충 감염에 대해 광범위하게 효과적일 수 있다거나, 또는 면역력이 억제된 사람들도 견뎌낼 수 있을 만큼 충분한 비독성(non-toxic)일 것이라는 증거는 없다.

니타족사나이드의 제법 및 특정 용법은 본 발명가에 의한 출판물 뿐만 아니라 미국 특허 3,950,351(US Patent 3,950,351)에 나타나 있다. 구조식 (Ⅱ)의 화합물인 데사세틸-니타족사나이드(desacetyl-nitazoxanide)는 때때로 티족사나이드 (tizoxanide) 또는 d-NTZ 로 언급되며, 니타족사나이드의 대사산물이다.

WO 95/28393 에서, 본 발명자는 구조식 (Ⅰ) 및 (Ⅱ)의 화합물의 혼합물을 포함한 화합물의 사용뿐만 아니라, 구조식 (Ⅱ)의 순수 화합물의 제법을 나타내고 있다.

170 및 520 ㎛ 사이의 입자크기(평균 입자 크기= 352 ㎛)를 갖는 구조식 (Ⅰ)의 화합물, 구조식 (Ⅱ)의 화합물, 또는 그 조성물의 고형 입자는 동물 또는 인간에게 구강 투약되었을 때 매우 제한된 효능을 갖는다. 그러한 입자의 효능은 현존하는 약물 생산품에 비해 떨어지고 따라서 일반적인 또는 상업적인 목적으로 사용될 수 없다.

또한 5㎛보다 작은 입자크기를 갖는 구조식 (Ⅰ) 및 (Ⅱ)의 화합물 고형입자 kg당 50 mg을 한번 구강투약했을 때 동물들에게서 심각한 부작용을 일으키는 것으로 개(dogs)에서 관찰되어 왔다.

인간 및 동물에 대한 기생충, 박테리아, 균, 바이러스에 의해 유발된 감염의 효과적이고 안전한 치료를 위해서는, 고형의 투약 형태 또는 수용성 현탁액 형태인 약제학적 조성물은 구조식 (Ⅰ) 및/또는 구조식 (Ⅱ)의 화합물을 포함하고 평균 10 ㎛ 보다 큰 활성 고형 입자로서 200 ㎛ 보다 작은 입자크기를 갖는 고형입자의 형태로 활성제의 효과적 복용량을 함유하고 있어야 한다.

5와 200 ㎛ 사이의 입자크기를 갖는 입자들의 내용물에 관련해서 200 ㎛보다 큰 입자의 활성제 입자가 고농도로 존재함은 화합물의 화학요법 활동을 대폭 감소시킨다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물은 200 ㎛보다 큰 크기를 갖는 활성 고형 입자를 중량비 5% 이상으로 포함하지 않는다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물은 200 ㎛보다 큰 크기를 갖는 활성 고형 입자를 실질적으로 전혀 포함하지 않는다.

5와 200 ㎛ 사이의 입자크기를 갖는 입자들의 내용물에 관련해서 5 ㎛보다 작은 크기의 활성제의 입자들이 고농도로 존재하면 동물 또는 인간에게 부작용을 일으킬 수 있다. 게다가, 5 ㎛보다 작은 크기를 갖는 입자들은 위장계통에서 혈관으로 더 빨리 흡수되고, 따라서 일반적으로 동물과 인간의 위장계통 내에 살고 있는 기생충, 박테리아, 균 및 바이러스에 대해 효과적이지 못하다.

숙련된 과학자라도 구조식 (Ⅰ) 및 (Ⅱ)의 화합물의 입자크기가 동물과 인간에 있어서 항미생물(antimicrobial) 활성에 큰 영향력을 갖고 있다고 추정할 수 없다. 예를 들어, 본 발명자에 의해 행해진 연구에서, 알벤다졸(albendazole), 메벤다졸(mebendazole), 니클로사마이드(niclosamide), 프레지콴텔(praziquantel) 및 메트로니다졸(metronidazole)과 같은 항기생충(anti-parasitic) 화합물들은 그들의 입자크기에 따른 동물 또는 인간에서의 항기생충 활동에서 커다란 차이가 있음을 증명하지 못하였다. 게다가, 숙련된 과학자라도 구조식 (Ⅰ)의 화합물 및 구조식 (Ⅱ)의 화합물의 입자크기가 동물 또는 인간이 상기 활성제의 투약에 대해 견딜 수 있는 능력에 반대효과를 갖는다고 추정할 수 없다.

구조식 (Ⅰ) 및 (Ⅱ)의 화합물(들)은 고형의 투약 형태 또는 수용성 현탁액으로 투약될 수 있고, 상기 약제학적 조성물은 코울터 계수기 LS 100 에 의해 측정할 때 평균 10 ㎛ 보다 큰 활성 고형 입자로서 200 ㎛ 보다 작은 입자크기를 갖는 구조식 (Ⅰ) 및/또는 (Ⅱ)의 고형입자의 형태로 활성제의 효과적 복용량을 포함할 것이 바람직하다. 상기 장치는 광 회절에서 직경 0.4에서 900 ㎛사이 크기의 입자에 750 nm의 레이저 광을 사용한다. 표본들은 분말의 습윤성(wettability) 및 해교성(deflocculate)을 증가시키기 위하여 소량의 트리톤 X-100(Triton X-100)이 첨가된 물에서 측정된다.

유익하게도, 상기 활성 고형 입자의 평균 입자 크기는 10 에서 100 ㎛ 사이이며, 바람직하게는 20 에서 50 ㎛ 사이이다. 바람직한 조성물의 예는 다음과 같다:

·상기 활성 고형 입자의 중량비 10% 이하가 100 ㎛ 보다 큰 입자크기를 갖는 조성물;

·상기 활성 고형 입자의 최소 중량비 50% 이상이 50 ㎛ 보다 작은 입자크기를 갖는 조성물.

유익하게도, 상기 활성 고형 입자들의 평균 입자 크기는 10 에서 100 ㎛ 사이이며, 바람직하게는 20 에서 50 ㎛ 사이이다. 본 조성물의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 활성 고형 입자들의 10% 이하는 5 ㎛ 보다 작은 입자 크기를 갖는다.

고형의 투약 형태 또는 현탁액에 사용되는 활성제 또는 활성제들은 유익하게도 200 ㎛ 보다 작은 입자 크기를 갖는 구조식 (Ⅰ) 및 구조식 (Ⅱ)의 화합물의 조성물로서, 상기 조성물의 구조식 (Ⅰ) 및 구조식 (Ⅱ)의 중량과 관련되어 구조식 (Ⅰ)의 화합물의 중량은 0.5와 20% 사이, 바람직하게는 0.5와 10% 사이이다.

본 발명은 또한 유익하게는 최소한 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 산을 가지는 상술한 약제학적 조성물에 관련된다. 그러한 산들의 예는 다음과 같다:

시트르 산(citric acid), 글루탐 산(glutamic acid), 석신 산(succinic acid), 에탄술폰 산(ethanesulfonic acid), 아세트 산(acetic acid), 타트르 산(tartric acid), 아스코르브 산(ascorbic acid), 메탄술폰 산(methanesulfonic acid), 푸마르 산(fumaric acid), 아디프 산(adipic acid), 말 산(malic acid) 및 이들의 조성물. 시트르 산은 아주 적절하다. 상기 산의 존재는 활성제 또는 활성제들의 안정성을 개선한다.

상기 활성 고형 입자의 중량에 대한 약제학적으로 허용되는 산의 중량의 비는 유익하게는 0.01에서 0.5 사이이며, 바람직하게는 0.03 에서 0.2 사이이다. 상기 산의 양은 유익하게는 현탁액 pH 를 2와 6 사이로, 바람직하게는 3과 5 사이로, 가장 바람직하게는 3.5와 4.5 사이로 조정하는데 충분하면 된다.

상기 약제학적 조성물의 고형 및 액상의 투약 형태의 제조 기술 및 바람직한 실시예들은 WO/95/28393 에 기술되어 있고, 그 기술사항은 참고문헌으로 본 명세서에 기재된다. 상기 조성물들은 유익하게는 그 내용상 가능한 습윤제 및 녹말 유도체들(Starch derivatives)을 기술하고 있어 참고문헌으로 포함되는 미국 특허 5,578,621 에 기술되어 있는 것들과 같은 습윤제 및 가능하게는 녹말 유도체를 포함한다. 미국 특허 5,578,621 에 기술된 습윤제는 하나의 분산제로서 작용한다.

고형 또는 액상의 투약 형태 또는 페이스트 또는 연고 형태인 상기한 약제학적 조성물은 선택적으로 항생제(antibiotics), 항바이러스성 인자 또는 양성자 펌프 저해제(proton pump inhibitors)와 같은 부가적인 활성제들을 포함할 수 있다. 유익하지는 않을 지라도, 상기한 약제학적 제법이 200 ㎛ 보다 큰 구조식 (Ⅰ)의 화합물 및/또는 구조식 (Ⅱ)의 화합물의 활성 고형 입자들을 포함하는 것이 또한 가능하다.

상기 조성물은 구강 투약에 적당한 형태로 제조할 목적에 쓰이는 것으로 알려진 부형제(excipients)를 포함할 수 있다.

기생충, 박테리아, 균 및 바이러스의 넓은 범위에 대해 뛰어난 효능을 갖기 위해서는, 다음의 공식에 따라 계산된 상기 활성 고형 입자의 분산 계수는 유익하게는 0.8과 2 사이이며, 바람직하게는 1.1과 1.9 사이이고, 가장 바람직하게는 1.5 보다 크면 된다:

F_90%= (Ø_90%- Ø_10%) / ( (Ø_90%+ Ø_10%)/2 )

여기서

·F_90%는 90%에서의 분산 계수;

·Ø_90%는 상기 활성 고형 입자들의 90%에 상당하는 입자들 중 최대 입자크기이고, 및

·Ø_10%는 상기 활성 고형 입자들의 10%에 상당하는 입자들 중 최대 입자 크기이다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 구조식 (Ⅰ) 및/또는 (Ⅱ)의 화합물의 입자들은 상술한 방법에 의해 제조되고 이후 크기에 있어서 상기 활성 입자들의 10% 이하가 100 ㎛ 보다 크고, 상기 입자들의 50% 이하가 50 ㎛ 보다 크고, 상기 활성 입자들의 10% 이하가 5 ㎛ 보다 작으며, 평균 입자 크기가 20과 50 ㎛ 사이가 되도록 제분된다. 이후 상기 활성 입자들은 최소한 하나의 미립화제 (granulating agent) 및 활성 고형 입자들을 포함한 조성물을 사용하여 미립화된다. 미립화제의 예는 다음과 같다: 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrrolidone), 물, 알콜, 슈크로즈 하이드록실 셀룰로오스 (sucrose hydroxyl cellulose) 및 이들의 조성물. 유익하게는, 최소한 하나의 약제학적으로 허용되는 산이 상기 미립화 과정에 첨가된다.

본 발명은 정제 알약, 분산형 정제 알약, 코팅 정제 알약, 종이형 약 등과 같은 발명의 조성물을 포함하는 고형의 투약 형태들과 연관된다. 본 발명의 투약 형태들은 다음과 같은 예들을 포함한다:

상기 입자들의 10% 이하가 그 크기가 100 ㎛ 보다 크고, 상기 입자들의 50% 이하는 50 ㎛ 보다 크며, 상기 입자들의 10% 이하는 5 ㎛ 보다 작으며, 평균 입자 크기는 20 과 50 ㎛ 사이에 있는, 200 ㎛ 보다 작은 입자 크기를 갖는 고형 활성 입자들

·적어도 하나의 미립화제;

·적어도 하나의 습윤제;

·적어도 하나의 녹말 유도체, 및

·바람직하게는 미립화 과정동안에 첨가될 수 있는 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 산.

본 발명의 수용성 현탁액과 같은 액상의 투약 형태를 예로 들면 다음과 같다:

·활성제로서, 입자들의 10% 이하는 그 크기에 있어서 100 ㎛ 보다 크며, 상기 입자들의 50% 이하는 50 ㎛ 보다 크며, 상기 입자들의 10% 이하는 5 ㎛ 보다 큰 입자 크기를 갖고, 200 ㎛ 보다 작은 입자 크기를 갖는 구조식 (Ⅰ)의 화합물 및/또는 구조식 (Ⅱ)의 화합물을 포함하는 고형 입자들, 및

·적어도 하나의 미립화제;

·적어도 하나의 습윤제;

·현탁액의 pH는 2와 6의 사이이며, 바람직하게는 3과 5의 사이이고, 가장 바람직하게는 3.5와 4.5 사이인 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 산;

·예를 들어 크산탄 고무(a xanthan gum), 아구아 고무(agua gum), 크리스탈 셀룰로오스(crystalline cellulose), 카루바 고무(carruba gum), 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose) 또는 이들의 조성물과 같은 적어도 하나의 티크너(thickner).

본 발명의 구강 투약에 적당한 페이스트 또는 연고 형태를 예를 들면 다음과 같다:

·활성제로서, 입자들의 10% 이하는 그 크기에 있어서 100 ㎛ 보다 크며, 상기 입자들의 50% 이하는 50 ㎛ 보다 크며, 상기 입자들의 10% 이하는 5 ㎛ 보다 큰 입자 크기를 갖고, 200 ㎛ 보다 작은 입자 크기를 갖는 구조식 (Ⅰ)의 화합물 및/또는 구조식 (Ⅱ)의 화합물을 포함하는 고형 입자들, 그리고

·적어도 하나의 습윤제;

·현탁액의 pH가 2와 6의 사이이며, 바람직하게는 3과 5의 사이이고, 가장 바람직하게는 3.5와 4.5 사이인 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 산;

국부적인 또는 질내(intravaginal)에 적용될 수 있는 페이스트 또는 연고 형태를 예를 들면 다음과 같다:

·적어도 하나의 습윤제;

·세틸릭 알콜(cetylic alcohol) 및/또는 글리세라이드 유도체(glyceride derivatives) 및/또는 프로필렌글리콜(propyleneglycol);

약제학적 조성물의 제조에 관한 상세한 설명

구조식 (Ⅰ)의 건조된 순수 화합물 및 구조식 (Ⅱ)의 순수 화합물이 분쇄되도록 제공되고 메쉬 망(mesh screen)에 의해 크기가 조절된다.

분쇄 후 구조식 (Ⅰ), 구조식 (Ⅱ) 및 이들의 조성물의 입자들은 도 8에 도시된 것과 같은 입자 크기 분포를 가진다. 도 8은 Ø ㎛ 보다 작은 크기를 갖는 입자들의 비율을 나타낸다.

상기 도면에는 다음과 같은 것이 나타나 있다:

·입자들의 중량비 10% 이하는 대략 5 ㎛ 보다 작은 입자 크기를 가졌다;

·입자들의 중량비 10% 이하는 대략 70 ㎛ 보다 작은 입자 크기를 가졌다;

·평균 입자 크기는 대략 40 ㎛ 이다;

·다음의 공식에 의해 계산되는 입자들의 분산 계수는 약 1.73이다:

F_90%= (Ø_90%- Ø_10%) / ( (Ø_90%+ Ø_10%)/2 )

여기서

·F_90%는 90%의 분산 계수;

·Ø_90%는 상기 활성 고형 입자들의 90%에 상당하는 입자의 일부분 중 최대 입자크기이고, 및

·Ø_10%는 상기 활성 고형 입자들의 10%에 상당하는 입자의 일부분 중 최대 입자 크기이다.

상기 조성물의 구체적인 예들은 다음의 표에 나타난다.

표 1. 활성제로서 구조식 (Ⅰ)의 화합물 및 구조식 (Ⅱ)의 화합물을 포함하는 분산가능한 구강 투약용 정제 알약의 조성의 예.

니타족사나이드(99%) + 데사세틸-니타족사나이드(1%) 200 mg

미국 FMC(FMC-USA)에서 판매되는 미정질 셀룰로오스(Microcrystalline cellulose) 아비셀 pH 102(Avicel pH 102) 116 mg

크로스포비돈(Crospovidone) 25 mg

마그네슘 스테아린산염(Magnesium stearate) 3 mg

교질 실리콘 이산화물(Colloidal silicon dioxide) 5 mg

시트르 산 10 mg

로베르테트(Robertet) 플레이트매 딸기 향신료 번호 877720 10 mg

나트륨 사카린염(Sodium saccharinate) 2 mg

표 2. 활성제로서 구조식 (Ⅰ)의 화합물 및 구조식 (Ⅱ)의 화합물을 포함하는 구강 투약용 코팅 알약의 조성의 예.

니타족사나이드 500 mg

옥수수 녹말 60 mg

미리젤라틴화된 옥수수 녹말(Pregelatinized Maize starch) 70 mg

수산화프로필 메틸셀룰로오스(Hydroxypropyl methylcellulose) 5 mg

슈크로즈 20 mg

나트륨 녹말 글리콜염(Sodium starch glycollate) 30 mg

시트르 산 25 mg

활석(Talc) 8 mg

마그네슘 스테아린산염(Magnesium stearate) 7 mg

코팅 : 500 mg의 활성제를 포함하는 정제 알약 또는 미립(granules) 상에 뿌려짐으로서 코팅되는 필름 코팅 또는 뜨거운 슈크로즈 용액

표 3. 활성제로서 구조식 (Ⅰ)의 화합물 및 구조식 (Ⅱ)의 화합물을 포함하는 구강 투약용 수용성 현탁액의 예. 현탁액의 pH는 약 4.1이다.

니타족사나이드(98%) + 데사세틸-니타족사나이드(2%) 2 g

증류수 100 ㎖

나트륨 안식향산염(Sodium benzoate) 0.2 g

자당(Saccharose) 30.5 g

크산탄 고무 0.2 g

미국 FMC(FMC-USA)에서 판매되는 미정질 셀룰로오스(Microcrystalline cellulose) 및 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose sodium) 아비셀 RC-591(Avicel RC-591) 0.8 g

시트르 산 0.2 g

이수산화 나트륨 시트르염(Dihydrated sodium citrate) 50 mg

로베르테트(Robertet) 플레이트매 딸기 향신료 제 877720호 125 mg

적색 염료 제 33 D 및 C호 1 mg

표 4. 활성제로서 구조식 (Ⅰ)의 화합물 및 구조식 (Ⅱ)의 화합물을 포함하는 구강 투약용 페이스트의 예.

니타족사나이드(98%) + 데사세틸-니타족사나이드(2%) 500 mg

미네랄 오일 10 g

브라운 슈크로즈 1 g

시트르 산 0.2 g

표 5. 활성제로서 구조식 (Ⅰ)의 화합물 및 구조식 (Ⅱ)의 화합물을 포함하는 국부적인 또는 질내(intravaginal)에 적용되는 페이스트 또는 연고의 예.

니타족사나이드(98%) + 데사세틸-니타족사나이드(2%) 8 g

크레마포르 A6 (Cremaphor A6) 2 g

크레마포르 A25 (Cremaphor A25) 1.5 g

미네랄 오일 7 g

루비톨 EHO(Luvitol EHO) 7 g

글리세롤 모노에스테르(Glycerol monoester) 4 g

세틸 알콜(Cetylic alcohol) 3 g

시메티콘(Simeticone) 0.5 g

게르마벤(Germaben) Ⅱ 1 g

프로필렌글리콜(propyleneglycol) 3.5 g

증류수 62.5 g

본 발명의 약제학적 조성물은 특히 구강 투약될 때 기생충, 박테리아, 균 및 바이러스에 대해 광범위하게 작용하는 조성물이다.

상술한 바와 같이 나타난 약제학적 조성물은 동물 및 인간에서 뛰어난 효능 및 안정성을 보인다. 특히 인간 의학 연구에서, 상술한 바와 같은 약제학적 조성물의 효능은 170 에서 520 ㎛ 사이의(평균 입자 크기 = 352 ㎛) 입자 크기를 갖는 활성제을 사용하는 같은 제제보다, 심지어 더 큰 크기의 입자들이 더 오랜 기간으로 3배 이상으로 완전히 복용될 때 보다도, 기생충 감염을 치료하는데 더욱 효과적이다. 달성된 치료의 비율의 예는 다음의 표 6에 나타난다.

표 6. 170 에서 520 ㎛ 사이의(평균 입자 크기 = 352 ㎛) 입자 크기를 갖는 구조식 (Ⅰ) 및 구조식 (Ⅱ)의 화합물을 사용한 인간 의학 연구들의 결과와 5 에서 200 ㎛ 사이의(평균 = 34 ㎛) 입자 크기를 갖는 구조식 (Ⅰ) 및 구조식 (Ⅱ)의 화합물을 이용한 결과들의 비교.

구조식 (Ⅰ)의 화합물(98%) + 구조식 (Ⅱ)의 화합물(2%)

170-520 ㎛ 입자 크기 5-200 ㎛ 입자 크기

복용량=15-50mg/kg/day복용량=15mg/kg/day

3 내지 7일 동안 3일 동안

치료된 수/전체 = 치료된 수/전체 =

% 치료율 % 치료율

기생충

인아생균(Blastocystis hominis) 12/27 = 44% 10/10 = 100%

이질 아메바(Entamoeba histolytica) 29/47 = 62% 106/133 = 80%

람블 편모충(Giardia lamblia) 11/37 = 30% 50/73 = 68%

회충(Ascaris lumbricoides) 3/69 = 4% 144/179 = 80%

편충(Trichuris trichiura) 7/48 = 15% 58/79 = 73%

표 6에 열거된 기생충 각각에 있어서, 비례적인 치료율은, 각 경우에 p＜0.02(표준 X²테스트를 사용하여)인 통계 의미로, 170 에서 520 ㎛ 사이의 입자크기를 갖는 활성 입자들로 치료되는 환자들에 대해서보다 5 에서 200 ㎛ 사이의 입자크기를 갖는 활성 입자들로 치료되는 환자에 대해서 매우 잘 나타난다. 이것은 200 ㎛보다 작은 입자 크기를 갖는 활성제의 약제학적 조성물을 환자에게 투여할 때의 경우보다 치료 기간이 길거나 및 보통 활성제가 더 높은 더 큰 입자 크기를 복용할지라도 마찬가지이다. 어떤 환자 집단에서도 심각한 부작용이 있다고 보고된 바 없다.

또한 인간 연구에 대한 상술한 바와 유사한 결과들이 동물 실험에서도 관찰되었다.

게다가, 구조식 (Ⅰ)의 화합물 및 구조식 (Ⅱ)의 화합물의 킬로그램(kg)당 50 밀리그램(mg)의 구강투약 복용 후 개에게서 관찰됐던 부작용들은 5 에서 200 ㎛사이의 입자 크기(평균＞10 ㎛)를 갖는 구조식 (Ⅰ)의 화합물 및 구조식 (Ⅱ)의 화합물을 사용한 동물들의 광범위한 연구-상기 화합물의 똑같은 복용량 또는 그 이상의 복용량이 90일 이상 매일 이루어졌을 때 조차도-에서 관찰되지 않았다.

게다가, 상기 조성물들은 (온도 40℃ 및 상대 습도 65%에서 6개월간 노출될 때조차도 또는 액상 현탁액의 경우에 3개월 동안 상기 조건하에 물에 현탁될 때 조차도) 안정하므로 활성 구성요소가 분해되지 않고 의약 및 상업적 목적에 적당한 사기 조성물이 제조된 후에도 상당한 기간 동안 효능을 유지할 수 있도록 한다.

약제학적 조성물의 효능은 다음에서 증명된다.

실시예 1

잠재스포리듐 기생충(Cryptosporidium parvum)

예비 임상 실험에서, 만성적인 잠재스포리듐 설사 증세를 보이는 30명의 에이즈 환자들이 매일 500에서 2000 mg씩 니타족사나이드(nitazoxanide)를 구강 복용하였다. 만약 상기 설사가 계속되면, 상기 환자들은 하루에 2000 mg까지 니타족사나이드를 4주 동안 추가적으로 복용했다.

28명의 사람들의 2 주이상의 기간을 완수했고 그중 16명이 8 주에 접어들어 치료에 해당하는 반응을 보였다. 후자의 그룹에서, 12명은 내장 운동 회수에서 50% 이상의 감소를 보였고, 상기 기생충을 발견할 수 없는 4명을 포함한 10명은 대변에서 상기 기생충이 제거되었거나 또는 현저한 감소를 보였다. 6명의 환자들은 의학적으로 및 기생충학적으로 좋은 반응 기준을 보였다.

매일 더 오랜 기간에 걸쳐 더 많은 약의 복용량을 복용한 환자들일수록 양성 반응을 더 잘 나타낸다.

에이즈 관련 잠재스포리듐 설사증에 대한 니타족사나이드의 공개-라벨(open-label) 연구로 매일 500, 1000, 1500, 2000 mg의 약을 복용하는 사람들로부터 감소된 내장 운동이 입증되었다. 실험 참가자들은, 평균 15 개월 동안 평균 매일 6.7 내장 운동으로, 대변에서 42 세포/㎣(0-303 세포/㎣ 범위)에서 평균 CD4+ 값의 잠재스포리듐 기생충 낭포체(oocysts)를 나타내었고, 다른 장 병원체는 나타나지 않았다. 거의 모든 참가자들은 아지드로미신(azithromycin) 또는 파로모마이신(paromomycin)으로한 치료에 실패했다.

23주 후, 13명중 9명이 전적으로 의학적 반응을 보였고(1/3이 현저히 매일 내장 운동을 보임), 4명이 부분적으로 의학적 반응(매일의 내장 운동에서 최소 50% 감소 또는 최소 75% 가 이루어질 때 까지의 계속적인 대변에서의 변화)을 보였다. 연구가 끝날 즈음, 11명중 8명은 완전히 기생충을 제거했으며 나머지 3명은 낭포체 양이 실질적으로 감소되었다. 더 오랜 기간에 걸쳐 매일 1000 mg 이상을 복용한 경우 더 좋은 반응을 나타냈다. 2명의 실험 참가자는 두드러기성 피부 발진을 나타냈고; 90% 이상이 4주 이상동안 식이요법에 매달렸다.

실시예 2

잠재스포리듐 기생충(Cryptosporidium parvum)

실험실내 복용 정보(In vitro Dose Information):

니타족사나이드가 살균된 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSO)에 용해되고 100 ㎍/ml, 10 ㎍/ml, 1 ㎍/ml 및 0.1 ㎍/ml 농도의 손상되지 않은 잠재스포리듐 기생충 낭포체로 감염된 세포 단층(monolayers)에 대해 실험되었다. 두번째는 추가적으로 20, 2, 0.2, 및 0.02 ㎍/ml 의 농도에 대해 실험하였다. 이러한 농도들은 완전한 DMEM 배지에서 최종적으로 0.5% 농도의 DMSO를 생산하도록 연속적으로 희석하여 얻었다.

실험은 7 mm 챔버(chamber)에서 성장한 MDBKF5D2 세포들의 세포 배양을 사용하였고, 잠재스포리듐 기생충으로서 웰(well) 당 5 ×10⁴의 GCH1 낭포체를 사용하였고, 니타족사나이드(실험 약)에 대한 파로모마이신(paromomycin, 양성 대조군) 비교실험을 하였다. 원료는 면역 항잠재스포리듐 기생충 포자소체 (Sporozoite) 토끼 혈청(0.1%) 및 플루오레스세인이 결합된(Fluorescein-conjugated) 염소 항-토끼 항체(1%)를 포함한다.

독성 테스트 분석:

100, 10, 1 및 0.1 ㎍/ml 농도의 니타족사나이드 및 적절한 대조군을 포함하는 배지 200 ㎕ 가 든 융합성의(confluent) MDBKF5D2 세포 단층을 포함하는 96 웰 플레이트의 2 웰(well) 및 단층이 없는 2 웰로 도입된다. 약은 37℃ 및 8% 이산화탄소 농도의 단층에서 배양된다. 24시간 때(실험 1) 및 48시간 때(실험 2), MTS(오웬의 용액) PMS는 각각 333 ㎍/ml 및 25 μM 의 농도의 각 배지에 첨가된다. 상기 플레이트은 2시간 동안 더욱 배양하기 위해 암실의 배양기에서 다시 배양된다. 2시간 째에, 각각의 상층액은 새로운 미세역가(microtiter) 플레이트로 옮겨졌고 490 ㎚의 ELISA 판독기로 읽혀졌다. 결과들이 기록되고 분석된다. 독성율은 배지 대조군 상층액(약물 없음)의 평균 광 밀도(Optical density, OD)에서 약물 상층액의 평균 광 밀도를 빼고, 배지 대조군의 OD로 나누고 100을 곱하여 계산한다.

(배지 OD - 약 OD)/(배지 OD) ×100손상되지 않은 잠재스포리듐 기생충 낭포체 분석(Intact C. parvum Oocyst Assay):

융합성의 MDBKF5D2 세포 단층상으로 37℃(8% 이산화탄소 농도)의 니타족사나이드(100, 20, 10, 2, 1, 0.2, 0.1 및 0.02 ㎍/ml)에서 웰 당 5 ×10⁴의 잠재스포리듐 기생충 낭포체(C. parvum Oocysts)가 배양되었다. 각 웰에서의 감염 정도는 24시간에서 48시간까지의 면역형광(immunofluorescence) 실험에 의해 결정되고 분석된다. 저해율은 배지 대조군(약물 없음)에서의 10 영역당 평균 기생충 수에서 약물 실험 배지에서의 10 영역당 평균 기생충 수를 뺀 후 배지 대조군 수로 나누고 100을 곱하여 계산한다.

(배지 대조군의 수-약물 실험에서의 수)/(배지 대조군의 수) ×100

결과:

- 실험 1 : 24 시간

화합물	농도	평균(+ SD)*	독성률	저해율
감염 배지파로모마이신NTZ	02 mg/ml100 ㎍/ml10 ㎍/ml1 ㎍/ml0.1 ㎍/ml	983.5(±128.2)482(±47.1)Lost55.5(±13.5)224.5(±28.5)474.5(±29.5)	023.888.165.18.319.3	051NA**94.477.251.8

* 10 영역당 기생충 수

** 독성에 대해 유용하지 못함

실험 2 : 48 시간

화합물	농도	평균(+ SD)*	독성률	저해율
감염 배지파로모마이신NTZ	02 mg/ml20 ㎍/ml2 ㎍/ml0.2 ㎍/ml0.02 ㎍/ml	2231.25(±90.03)580(±33.42)68,75(±13.77)113.75(±13.5)1020(±28.5)1041(±29.5)	040.892.8724.9316.5621.23	074.0196.9294.9054.2953.33

* 10 영역당 기생충 수

손상되지 않은 잠재스포리듐 기생충 낭포체에 대한 니타족사나이드의 영향 (Impact of nitazoxanide on the intact C. parvum Oocysts):

실험 1에서, 10, 1 및 0.1의 농도의 니타족사나이드는 각각 기생충 저해율 94.4, 77.2 및 51.8%을 나타냈으며, 각각 세포독성률을 65.1, 8.3 및 19.3%를 나타냈다. 거의 완전한 기생충 감염의 저해가 10 ㎍/ml 에서 일어났지만, 고독성율은 분명하였다. 니타족사나이드 1 ㎍/ml 에 기생충 감염 및 세포 독성은 2 ㎎/ml 농도의 파라모마이신에 나타난 것에 필적했다(1 ㎍/ml의 니타족사나이드에 대한 77.2% 기생충 저해와 8.3% 독성은 2 mg/ml의 파라모마이신에 대한 51% 기생충 저해 및 23.8% 세포 독성과 필적했다.).

실험 2에서, 상기 약은 최소 독성으로 더 좋은 복용 분포를 얻도록 수정된다. 결과적으로, 배양물들은 실험 1에서의 24시간이 아닌 48시간 동안 생존해 남았다. 48시간 동안의 배양은 분명히 양 실험에서의 파라모마이신의 명백한 상태검사로부터 더 높은 상대 세포 독성을 초래했다. 니타족사나이드 20 ㎍/ml 농도는 세포단층이 아직 손상되지 않아 보이는데도 48시간의 배양시 여전히 독성이 강했다. 세포기능에 영향을 미치는 고독성은 또한 기생충 감염/확장에 영향을 미칠 수 있다. 니타족사나이드 2 ㎍/ml에서, 상대적으로 낮은 세포 독성으로 기생충 감염의 상당히 감소되었다. 더 희석한 경수 상당한 저해 및 낮은 독성을 초래했다. 2 ㎍/ml의 약물 농도에서, 보통의 세포 독성과 94.90%의 저해 활동은 2 ㎍/ml의 니타족사나이드가 2mg/ml의 실험실 잠재스포리듐 기생충 감염에 대해(예를 들어 1000배의 고농도)의 파라모마이신보다 월등하였다.

실시예 3

잠재스포리듐 기생충(CRYPTOSPORIDIUM PARVUM)

복용 및 저장 정보:

니타족사나이드 및 데사틸-니타족사나이드(NTZ 및 NTZdes) 원료가 10, 1, 0.1 및 0.01 ㎍/ml 농도의 손상되지 않은 잠재스포리듐 기생충 낭포체 및 탈 포자소체 감염 세포단층(excysted sporozoite infected cell monolayers)에 대해 실험된다. 각 화합물은 100% 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 에 용해되고 살균 된 DMEM 으로서 원하는 농도로 희석된다. 니타족사나이드 및 배지 대조군 각각의 농도는 동일하게 0.025% DMSO를 포함했다.

실험은 7 mm 챔버(chamber)에서 성장한 MDBKF5D2 세포들의 세포 배양을 사용하였고, 잠재스포리듐 기생충으로서 웰(well) 당 5 ×10⁴의 GCH1 낭포체를 사용하였고, 니타족사나이드(실험 약)에 대한 파로모마이신(paromomycin, 양성 대조군) 비교실험을 하였다. 원료는 면역 항잠재스포리듐 기생충 포자소체 (Sporozoite) 토끼 혈청(0.1%) 및 플루오르스세인이 결합된(Fluorescein-conjugated) 염소 항-토끼 항체(1%)를 포함한다.

독성 테스트 분석:

전에 언급한 농도의 니타족사나이드 용액을 포함하는 배지 200 ㎕ 및 적절한 대조군이 융합성의(confluent) MDBKF5D2 세포 단층을 포함하는 96 웰 플레이트의 2 웰 및 단층이 없는 2 웰로 도입된다. 약은 37℃ 및 8% 이산화탄소 농도의 단층에서 배양되었다. 48시간(실험 2), MTS(오웬의 용액) 및 PMS는 각각 333 ㎍/ml 및 25 μM 의 농도의 각 배지에 첨가된다. 상기 플레이트은 2시간 동안 암실의 배양기에서 재배양된다. 2시간 째에, 각각의 상층액은 새로운 미세역가(microtiter) 플레이트으로 옮겨져 490 ㎚의 ELISA 판독기로 분석된다. 결과가 기록되고 분석된다. 독성율은 배지 대조군 상층액(약물 없음)의 평균 광 밀도(Optical density, OD)에서 약물 상층액의 평균 광 밀도를 빼고, 배지 대조군의 OD로 나누고 100을 곱하여 계산된다.

(배지 OD - 약 OD)/(배지 OD) ×100

세포독성(Cytotoxicity) 값은 다음과 같이 지정된다: 0-5% 독성=0, 6-25% 독성=1, 26-50% 독성=2, 51-75% 독성=3, 76-100% 독성=4. 표준으로서, 0 또는 1의 세포독성 값은 독성의 허용되는 수준으로 고려된다. 2, 3 또는 4의 독성 값은 높은 수준 또는 세포 단층에 대한 독성으로 고려된다.손상되지 않은 잠재스포리듐 기생충 낭포체 분석(Intact C. parvum Oocyst Assay):

융합성의 MDBKF5D2 세포 단층상으로 37℃(8% 이산화탄소 농도)의 전에 언급한 농도의 니타족사나이드에서 웰 당 5 ×10⁴의 잠재스포리듐 기생충 낭포체(C. parvum Oocysts)가 배양되었다. 각 웰에서 감염의 정도는 48시간에 면역형광(immunofluorescence) 실험에 의해 결정되고 컴퓨터분석된다. 저해율은 배지 대조군(약물 없음)에서의 영역당 평균 기생충 수에서 약물 실험 배지에서의 영역당 평균 기생충 수를 뺀 후 배지 대조군의 수로 나누고 100을 곱하여 계산한다.

결과:

잠재스포리듐 기생충 낭포체 실험(48시간)

약	농도	기생충	±SD	독성/OD	±SD	저해율	독성률	값
수용 배지파로모마이신0.025% DMSO 배지NTZ신 NTZdes	0200001010.10.011010.10.01	681.58115.75628.5011.7539.67643.42714.3313.7539.92649.86749.33	±271.02± 44.65±171.94± 7.33± 13.13±229.73±194.79± 6.66± 13.49±152.19±139.49	2.0241.2191.7990.4131.6181.8781.6170.3371.7101.5061.721	±0,18±0.009±1.45±0.13±0.326±0.154±0.072±0.005±0.033±0.119±0.144	083.02098.1393.690 이하0 이하97.8193.650 이하0 이하	039.79077.0710.090 이하10.1281.274.9716.294.36	02041014010

농도-㎍/ml; 기생충-평균 기생충 수/영역(12 영역이 분석됨); 저해율-기생충 감염의 저해율; 독성률-세포에 대해 약에 의한 독성률

NTZdes의 저해 활동은 실시예 2의 NTZ와 같음을 상기한 바로부터 알 수 있다. 니타족사나이드 및 데사틸 니타족사나이드 모두 각각 10 및 1 ㎍/ml 농도로 취득된 98 및 94% 저해로 동등하게 실험되었을 때 잠재스포리듐 기생충에 대해 실험실에서 똑같이 효과적이었다. 왜냐하면 0.2, 0.1 및 0.02 ㎍/ml 와 같은 니타족사나이드의 낮은 농도로 50%의 저해가 얻어질 수 있는 반면에 90% 이상의 저해를 주는 가장 낮은 니타족사나이드 농도는 1 ㎍/ml이었기 때문이다. 똑같은 조건에서 양성 대조군으로 사용되는 파로모마이신은 2,000 ㎍/ml의 농도에서 51에서 83% 범위의 저해농도로는 2,000 배 덜 효과적이었다.

실시예 4

장내 미포자충 및 브이 각막(E. intestinals and V. cornea)

2RK-13 세포들(토끼 콩팥 세포 선)은 웰(1.0 ml 배지; 2 mM L-글루타민 및 5% 열-불활성 소 배 혈청(heat-inactivated fetal bovine serum)을 가진 RPMI 1640)당 2.6 ×10⁵세포들 농도의 24-웰 배양 플레이트에 첨가되어진다. 플레이트들은 웰이 융합하는(한 번 2배로 되면, 웰 당 5×10⁵세포들이 된다.) 밤새도록 37℃의 이산화탄소 배양기에서 배양된다.

조직 배양에서 얻어낸(tissue culture-derived) 장내 셉타타(Septata intestinals) 조직체들은 숙주세포에 웰 당 15 ×10⁶조직체로 또는 숙주세포와 비교할 때 3 : 1의 비율로 첨가되었다. 상기 비는 대략 숙주세포의 50%가 전염되었다.

약들은 1.0 mg/ml 의 군체를 생성하기 위하여 (용해도에 따라) DMSO, 물 또는 메탄올에 용해된다. 군체들은 -70℃에서 저장된다. 실험에 사용된 희석액은 완전한 조직 배양 배지에서 만들어진다. 모든 희석액은 3중으로 잘 실험되었다.

배지는 3 내지 4일마다 교체되었다(새롭게 희석화된 약물을 포함하여).

여섯 째 되는 날에(기생충 및 약물을 첨가한 후), 상기 세포들의 독성을 실험하였다. 약물은 있으나 기생충은 없는 대조군 세포들은 융합성, 세포들의 구조, 죽은 또는 부유하는 세포의 존재 여부에 대해 검사된다. 단지 기생충만을 갖고 배양된 세포들은 기생충들이 전염성인지 확인하기 위하여 검사되었다(즉, 기생충 액포(parasitopHorous vacuoles)의 존재). 세포 배양 기생충 및 약물들은 숙주 세포 독성 및 기생충 액포의 상대적 수로 평가된다(즉, 고, 중, 또는 저).

10일 째 되는 날에, 10% SDS (0.5% 최종농도)는 배양 배지에 숙주세포막을 파괴하고 미포자충목(microsporidia)의 방출을 일으키기 위하여 첨가되었다. 각 배지에 존재하는 기생충의 전체 수는 헤마토사이토미터(hemacytometer)상에 나타난 수를 계산함으로서 결정된다. 결과는 (어떤 약도 주어지지 않은 감염세포에 관한) 저해율로 표현된다.

결과는 도 1-4에 나타나 있다.

실시예 5

톡소플라즈마 뇌척수염 병원체(Toxoplasma gondii)

니타족사나이드 및 데사틸 니타족사나이드가 기생충, 특히 쥐안에서 연속적으로 이동되어 유지된 톡소플라즈마 뇌척수염 병원체의 RH 균주에 대해 실험된다. 96-웰 미세플레이트에서 배양된 MRC5 섬유아세포(fibroblasts),(바이오-메류, 프랑스)의 세포 배양물들은 톡소플라즈마 뇌척수염 병원체로 접종된다. 200의 새로운 타치조이트(tachyzoites)가 8 개의 대조군 배지(음성 배지)를 제외하고 각 배지에 첨가된다. 배양 4시간 후, 약물 희석액이 배양액 안에 첨가된다.

니타족사나이드(NTZ) 및 데사틸 니타족사나이드(dNTZ)가 8 ×10^-4과 40 mg/L 사이의 농도에서 실험된다. 약물은 초기 2mg/ml의 농도로 DMSO에 용해되었고, 이 후 배양 배지로 연속적인 희석을 한다. 어떤 침전물도 관찰되지 않았다.

약물 희석액이 배양액에 첨가되었고(각 희석에 대한 8 배지들) 이 후 배양 플레이트은 72시간 동안 배양된다. 이후 배양액은 차가운 메탄올로 고정된다. 톡소플라즈마 뇌척수염 병원체의 성장은 과산화효소가 붙은 토끼 항톡소플라즈마 뇌척수염 병원체 항체을 사용하여 ELISA에서 평가된다. 각 배지에 대한 광 밀도 값이 기록된다.

결과들은 배양에서의 약물의 농도에 대한 각 배양 배지에 대해 얻어진 OD 값의 곡선으로 제시된다. 통계 분석은 95% 신뢰간격을 갖는 회귀(regression) 분석 및 각 약으로 부터 얻은 OD 값의 복용반응곡선으로 이루어진다.

한 플레이트은 배양액에서의 세포 병리학 효과를 검사하기 위하여 김사 염색액으로 염색된다.

별개로 세번 실험했다. 각 실험에서, 2개의 배양 플레이트는 각 화합물로 사용되었고; 각 배양 플레이트에서, 8개의 교체된 배지들이 각 약물 농도에 대해 사용된다.

결과:

실험의 3 세트에서 비슷한 결과들을 얻었다. 각 약에 대한 대표적 실험의 결과에 대한 대표적인 그래픽 예시는 도 5 a, b, c 및 도 6 a, b, c 에 나타난다.

니타족사나이드(도 5 a, b, c) :

10^-4mg/l 와 0.3 mg/l 사이의 농도에 대한 어떠한 저해 효과도 나타나지 않았다. 0.6 mg/l 이상일 때 의미있는 효과가 나타났으며, 2.5 mg/l 이상일 때는 톡소플라즈마 성장이 완전히 억제되었다. 그러나, 2.5 mg/l 이상의 농도일 때는 눈에 띄는 독성이 세포 단층상에서 보였다.

상기 단층의 미세 검사는 1.25 mg/l 농도의 NTZ가 기생충 액포의 확장 및 세포간 기생충 수의 감소와 함께 기생충화된 세포에 대한 세포병리학적인 효과를 나타냈다. 회귀 분석결과, 50%의 대조군 농도는 1.2 mg/l에서 나올 수 있다.

데사세틸 니타족사나이드(도 7 a, b, c) :

데사세틸 니타족사나이드에서 비슷한 결과를 얻었다: 10^-4과 0.3 mg/l사이의 농도에 대한 효과 없음, 0.6 mg/l 이상의 농도에 대한 억제, 및 2.5 mg/l이상의 농도에 대한 현저한 독성. 50% 억제 농도는 1.2 mg/l에서 나올 수 있다.

상기 결과는 각 약물 농도에 대한 반복된 배양물에 대한 약물 억제 효과의 수집과 함께, 3개의 별개 실험으로 재현될 수 있다.

NTZ 및 데사틸 NTZ 모두 톡소플라즈마 성장의 현저한 억제가 기생충 그 자체는 변형됨이 없이 기생충 액포의 변형과 함께, 대략 1.2 mg/l의 농도에서 관찰될 수 있다.

이러한 결과들은 상기 약물들이 톡소플라즈마 뇌척수염 병원체에 대한 좋은 활성을 가지며, 그리고 치료효과는 혈청 또는 조직에 대략 1 mg/l 농도에서 기대될 수 있다.

실시예 6

미코박테리아(MYCOBACTERIA)

니타족사나이드는 TB 조직체에 대해 항미생물 활성을 갖는 것으로 발견되었다. 다음의 표는 한천(agar) 희석 기술에 의해 미코박테리윰 세포내 물질에 대한 니타족사나이드 및 티족사나이드의 MIC 에 대한 표준을 보여주고 있다. 이러한 결과들은 여러 실험에서 근거하며, 그 실험 각각은 미들브루크(Middlebrook) 한천이 있는 한천 희석 방법에 의해 3주동안 실시하였다. 결과적으로, 표준 한천 희석 기준 및 ATCC로부터의 미코박테리윰 세포내 물질의 표준 변형을 사용할 때 니타족사나이드의 2 ㎍/ml의 미코박테리아에 대한 MIC 및 티족사나이드(tizoxanide)의 4 ㎍/ml에 대한 MIC를 가졌다.

미코박테리윰 세포내 물질에 대한 니타족사나이드 및 티족사나이드의 MICs

	MIC
니타족사나이드	2 ㎍/ml
티족사나이드	4 ㎍/ml

*MICs는 3주동안 미들브루크 7H11 한천을 이용한 표준 한천 희석에 의해 결정된다. 미코박테리윰 세포내 물질 ATCC 13950, 표준 변형이 이 실험에 사용되었다.

도 7은 액상에서 성장하는 미코박테리아에 대한 니타족사나이드 효능 표준에 기초한 그림이다. 우리는 한천 계수법으로서 3주보다는 4시간안에 성장을 결정할 수 있는 MTS 비색 분석(MTS colorimetric assay)을 사용했다. 도 7의 자료로부터, 니타족사나이드가 배양이 시작된 후 72시간째에 첨가될 때, 대조군 배지 그 자체만의 성장과 비교할 때 계속되는 성장에 대해 즉각적인 효과가 있었다. 니타족사나이드를 3 ㎍/ml 복용할 경우 다음 24시간동안 성장이 정지되고, 이후 다음 2일동안은 느리게 성장한다. 50 ㎍/ml을 복용할 경우 144시간의 배양동안 완전히 정지상태(bacteriostatic)에 이르렀다.

실시예 7

잠재스포리듐 기생충(CRYPTOSPORIDIUM PARVUM)

니타족사나이드의 효능을 실험상 감염된 쥐의 잠재스포리듐 기생충에서 실험하였다. 니타족사나이드는 플로리다, 탐파 소재 로마르크 연구소에 의해 공급되었다.

전체 인간 복용량(7일 동안 1일 1g, 즉 7g)은 파겟과 바네스(paget and barnes)에 따라 쥐에 사용되도록 수정되었다. 인간 복용량은 7일동안 아침과 저녁에 각 숙주에 필요로 되는 약의 전체 양을 얻기 위하여 쥐에 해당하는 양에 0.0026을 곱한 양(대략 20 그램 무게)이다. 각 쥐는 매일 2.6 mg을 복용했다(7000 mg ×0.0026/7). 복용 시 바늘 끝(tip needle) 주위에 플라스틱 주사기를 사용하여 쥐에 투여했다.

태어난 지 2일된 20마리의 젖먹이 쥐가 전염된 소들로부터 얻어진 잠재스포리듐 기생충의 100,000 낭포의 구강 투여에 의해 전염됐다. 쥐에 투여하기 전에, 낭포들은 파이어와 엘리스(Fayer and Ellis)에 의해 서술된 기술에 따라 슈크로즈 용액을 사용하여 농축되었다. 각 쥐로부터의 직장 약솜(Rectal swabs)은 그래크직 등(Graczyk et al)에 의해 서술된 수정된 닐-넬슨(Niehl-Neelsen) 염색 기술을 사용하여 매일 얻어 검사되었다. 난포 발산은 동물들의 구강 투약 2일 후 배설물에서 나타났다. 3일 째에 동물들의 감염에 따라, 10 마리는 매일 아침과 저녁에 연속하여 7일 동안 니타족사나이드 1.3 mg을 복용하였고 반면에 남은 열 마리는 투여하지 않은 채로 두었다. 직장 약솜은 치료기간인 7일 동안 매일 그리고 치료후 7일동안 매일 얻었다. 난포들은 오일로 현탁하였고 미세현미경으로 100영역당 수를 계산하였다.

결과 :

다음의 표에는 매일 7일동안 하루 2.6 mg 니타족사나이드를 투여한 결과 대조군 동물들과 비교할 때 감염된 쥐의 배설물에서 난포의 수를 감소하는 잠재스포리듐 기생충에 대한 효과를 갖고 있음이 나타나 있다. 실험 약은 치료 3일 째 막바지에 10 마리의 치료된 쥐 중 6마리에서 난포 발산을 감소시켰다. 7일 째의 치료 막바지에, 치료되지 않은 대조군 쥐와 비교할 때 모든 치료된 동물들이 음성 배설물 검사결과를 나타냈고, 즉 난포 발산이 완전히 감소하였다. 이 효과는 치료후 3일 및 7일 째에 관찰된 음성 검사에서 나타나는 것과 같이 최소한 치료후 7일동안 지속되었다.

	가해진 오일 영역당 검출된 난포의 수
	치료 3일 째	치료 마지막 날	치료후 3일 째	치료후 7일 째
쥐 번호	대조군 그룹	치료 그룹	대조군 그룹	치료 그룹	대조군 그룹	치료 그룹	대조군 그룹	치료 그룹
1	3.0	0.0	5.0	0.0	4.0	0.0	2.0	0.0
2	4.0	0.0	4.0	0.0	3.0	0.0	1.0	0.0
3	6.0	0.0	5.0	0.0	4.0	0.0	0.5	0.0
4	3.0	2.0	3.0	0.0	2.0	0.0	1.0	0.0
5	5.0	2.0	3.0	0.0	3.0	0.0	0.5	0.0
6	3.0	0.0	4.0	0.0	5.0	0.0	2.0	0.0
7	3.0	0.0	5.0	0.0	4.0	0.0	1.0	0.0
8	5.0	1.0	5.0	0.0	1.0	0.0	0.5	0.0
9	3.0	3.0	3.0	0.0	2.0	0.0	1.0	0.0
10		0.0	5.0	0.0	2.0	0.0	0.5	0.0
전체	35	8.0	4.2	0.0	30	0.0	10	0.0
평균	3.5	0.8	4.2	0.0	3.0	0.0	1.0	0.0
효능		60%		100%		100%		100%

실시예 8

미코박테리윰

니타족사나이드는 이조니아자이드(izoniazide) 항생제와 비교된다. 표준으로 미코박테리윰의 변형인 BCG(Bacille de Calmette et Guerin)을 사용하였다. 이 변형체의 민감도는 미코박테리윰 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)의 그것과 같았으나, 이 변형체는 더 해롭고 따라서 결핵인자를 고 수준으로 포함시킬 필요가 없다.

해바라기 기름 0.2ml에 쥐 한마리당 4 mg이 매일 투여되었다. 니타족사나이드로 치료받은 쥐들과 이조니아자이드를 복용한 그룹이 비교된다.

	10⁷	10⁵
	비장	간	허파	비장	간	허파
니타조(Nitazo)	1 575000800000875000950000	1 5750001 5500001 550000750000	57500122 5003000075000	68 25065 00075 00060 000	70 00087 50035 00060 000	507515050
INH	475000255000200000	1 050000750000975000	11 00057504 000	20 00015 25060 00020 000	21 25027 50052 50037 500	501255050
PBS	1 5000001 5250001 9250001 675000	2 1250001 8000001 7500001 800000	92 50098 000177 500117 500	102 500140 00098 000105 000	195 000175 000150 000150 000	750800500750

실시예 9

간 흡충(Fasciola hepatica)

니타족사나이드 및 데사틸-니타족사나이드의 효능을 간 흡충(Fasciola hepatica)에서 실험하였다.

성장한 간 흡충은 LA, Bunkie, Hardy's Meat parkers 소재 루이지애나 수의학 연구소에서 간 흡충에 걸린 3마리 소의 간의 담즙 통로에서 얻었다. 흡충들은 1시간 동안 소독 염분에서 씻겨지고 추가적으로 3시간동안 소독 염분 또는 RPMI(pH 7.4)에 옮겨졌다. 이 후 흡충들은 5% 이산화탄소 농도를 갖는 소독 RPMI-토끼 혈청 (50 : 50 v/v) 또는 소독 RPMI (pH7.4)에 37℃로 밤새도록 저장된다.

배양(37℃, 5% CO₂)은 이바라 및 젠킨스법의 수정에 따라 이루어졌다(Z. Parasitenkd. 70:655-661, 1984). 소독 기술을 사용할 때, 흡충들은 행크의 비례적인 소금 용액(pH 7.2)에 2-3분간 2번 씻겨지고 배양 배지 약물의 지정된 희석액을 10 ml로 나눈 것을 포함한 6개-배지 린브로 배양 플레이트의 웰에 각각 놓여진다. 후자는 2% 토끼 피에 100ppm 페니실린 및 100ppm 스트렙토미신(Streptomycin)이 첨가된 소독 50:50 v/v RPMI-토끼 혈청으로 구성된다. 단지 보통의 활동력과 변형을 가진 흡충들만이 사용된다.

NTZ의 균체 용액 또는 로마르크에 의한 그의 대사산물 D-NTZ는 특정한 약물 농도(100, 50, 25, 10, 5, 3, 1 ㎍/ml)를 생산하기 위하여 DMSO (2000 ㎍/ml)에 용해되고 배양 배지에 희석된다. 각 교체에는 2개의 대조군 흡충들이 포함되었는데, 하나는 RBC를 갖는 투약되지 않은 배양 배지에 포함되었고 또 하나는 RBC를 갖는 조정되지 않은 배양 배지에 포함되었다.

흡충들은 배후조명된 패널 및 조명된 3X 확대 렌즈를 사용할 때, 처리되지 않은 대조군 흡충과 비교함으로써 사망률, 운동성 분포 또는 구조적 변형률에 의해 증명되는 약물 치료의 효능에 대해 검사된다.

결과:

실험 1:D-NTZ의 경우, 50 및 100 ㎍ 처리에 있는 흡충들은 1시간내에 빈사 되거나 죽었다. 1시간내에 25 ㎍ 을 처리한 7마리의 흡충 중 4마리는 빈사상태에 이르렀고, 2마리는 활동력이 있었으며, 1마리는 활동이 둔해졌다; 3시간 경과시 2마리의 행동이 둔한 흡충만 제외하고 모두 죽었으며 4시간 후에는 단지 한마리의 행동이 둔한 흡충만이 생존해 있었다. 10 ㎍ 의 경우, 1, 3, 4 시간에서 활동이 감소했으며 7시간 째에는 모두 빈사상태이거나 죽었다. 약간의 개체에 있어 감소된 활동이 5 ㎍ 및 3㎍ (3 ㎍ 상에서는 조금 느리지만)에서 24시간 경과시 보였다; 50시간 경과시 각 그룹의 한 마리의 행동이 느린 흡충을 제외하고 3 및 5 ㎍ 처리에서 모두 죽었다. 1 ㎍에서 42-74시간 경과시 행동력이 조금 느려지는 것이 보였고 91시간 경과시 단지 3마리만이 활동력이 있었으며 한 마리만이 빈사상태로 생존해 있었으며; 115시간 경과시 단지 한 마리의 행동력이 둔한 흡충만이 1 ㎍의 그룹에서 생존해 남았다. RBC를 갖는 대조군그룹의 사망은 66시간(1 흡충), 91시간(1흡충) 및 115시간(4흡충)에서 관찰되었다. RBC가 없는 대조군 그룹에서는, 91시간 때 모두 살아있었고 115시간에는 한 마리가 죽었다.실험 2:NTZ의 경우, D-NTZ에 대한 결과와 비교할 때 다소 큰 활동력이 8 개의 교체에서의 활동성 수치 및 사망률에 대한 초기 효과로서 보여졌다. 1시간 경과시 100, 50, 25 ㎍ 그룹에서 모든 흡충들은 25 ㎍ 에서 3시간 경과시 사망한 한 마리의 흡충을 제외하고 빈사 또는 사망하였다. 활동성의 복용-관련 감소는 1시간 경과 초기에 다른 투약된 그룹 각각에 보였다. 10 ㎍ 에서, 16시간 경과시 단지 한 마리의 흡충만이 생존했다. 5 ㎍ 그룹에서, 6시간 경과시 단지 3마리의 흡충만이 활동력이 있었으며 16시간 경과시 어떤 것도 활동력이 없었다. 23시간 경과시, 3 ㎍ 에서 단지 2 마리의 행동력이 둔한 흡충만이 생존해 남았고; 41시간 경과시 상기한 것들은 모두 죽었다. 1 ㎍ 그룹에 대해선, 16시간 경과시 한 마리의 흡충이 죽었고, 41시간 경과시 3 마리 및 74시간 경과시 5 마리의 흡충이 죽었다; 91시간 경과시 3 마리의 흡충이 활동력이 있었으며 115시간 경과시 한 마리의 흡충이 활동력을 가졌다. RBC를 갖는 대조군 그룹에서, 8 마리 흡충 중 7 마리는 74시간 경과시 살아있었고, 91시간 경과시 3 마리가 살아 있었고 115시강 경과시 2 마리가 살아남았다. RBC가 없는 대조군그룹에서, 8 마리 흡충 중 6마리는 74시간 경과시 활동력을 가졌고, 91시간 경과시 4 마리가 살아남았고 115시간 경과시 2 마리가 살아남았다.

높은 복용량(25, 50, 100 ㎍) 그룹 중 흡충 사망은 빨랐고 수축 또는 복부 '위축'('curling')과 관련되었다. 더 낮은 농도의 투약시, 대부분의 흡충들은 일정 기간 동안 속도가 느려졌고 힘이 빠졌으며 빈사상태이거나 '납작'('flattened')한 상태로 죽었다.

오염은 91시간 경과 초기에 일부 교체에 대한 실험결과에 한정 되었다. D-NTZ 실험에 있어서, 2 개의 교체된 플레이트에서의 주요 박테리아 또는 균의 과성장 및 관련 사망률이 115시간 경과시 발생하였다. NTZ 실험에 있어서, 전체 교체 플레이트에서의 과성장 및 흡충 사망률은 91시간(2 개의 교체) 및 115시간(5 개의 교체) 경과시 일어났다. 139시간의 결과는 플레이트 대부분이 일반적인 오염을 나타냈으므로 고려하지 않았다.

결론:

니타족사나이드 및 니타족사나이드의 강한 흡충 살균 효과는 두 약 모두를 포함한 실험에서 나타난다. 간 흡충(F. hepatica)에 대한 다소 큰 흡충살균 활동은 주요 대사산물인 데사세틸-니타족사나이드에 대한 것보다는 간장 수준에서 활동적인 것으로 고려되는 니타족사나이드에 대해 관찰되었다.

빠른 흡충 사망은 1시간내에 50 ㎍ 이상의 D-NTZ의 투약속도, 4시간내에 25 ㎍, 6-7시간내에 10 ㎍의 투약속도에서 일어난다. 10 ㎍은, 약물운동(pharmacokinetic) 자료가 조직 수준이 1회 처리후 6-8시간 이상 동안 유지된다라고 나타낸다면, 적절한 1회 처리 목표 약 전달율이 될 것이다.

74시간(3일)의 강한 흡충살균 활동이 3 및 5 ㎍ 복용 속도의 양 화합물에 관찰되었다. 투약되지 않은 대조군 흡충과 동일하지는 않자만 길어진 생존 도달이 1 ㎍ 복용 수준에서 관찰되었다; 그러므로 간장 조직의 흡충에 3 내지 4일동안 이러한 수준으로 약을 전달함은 기생충에 대해 부적절한 요법 효과를 갖는다. 실시예 10

거대 간디스토마(Fasciola gigantica)

니타족사나이드는 실험상 감염된 토끼들의 미성장 및 성장한 거대 간디스토마(Fasciola gigantica)에 대해 실험되었다.

거대 간디스토마 낭포 피낭유충(Fasciola gigantica encysted metacercariae, EMC)은 압델-가니(Abdel-Ghany)에 의해 서술된 기술을 사용하여 염소가 제거된 물(dechlolorinated tap water)에 30분 동안 인조 광에 매일 노출된 엘. 칼루디 달팽이(L. calludi snails)에 의한 전염으로부터 28-35일 후 셀로판 종이에 수집되었다. 결과적인 낭포 피낭유충(EMC)은 실험 동물들을 감염하도록 사용되기까지 수면 아래에서 5 내지 8일 동안 냉장고에서 4℃에서 저장되었다.

각각 1.5-2 kg의 무게가 나가는 40 마리의 보스켓(Boscat) 토끼들이 연구에 포함되었고 20 마리의 동물 그룹들로 분배되었다.

그룹 1의 동물들은 양상치 잎을 싸인 35- 40 낭포 피낭유충에 구강으로 전염되었고 동물들의 혀뿌리 위로 집어넣어졌다. 동물들의 입은 낭포 피낭유충이 삼켜질 때까지 손으로 막는다. 이 그룹 1의 동물들은 거대 간디스토마의 미성장 단계(4-5 주 된)에 대한 니타족사나이드의 효능을 실험하기 위하여 사용되었다.

그룹 2의 동물들은 10-15의 낭포 피낭유충에 의해 상기한 바와 같이 구강 전염되었으며 초기 성장한 흡충들(10주 이상된)에 대해 니타족사나이드의 효능을 실험하기 위하여 사용되었다.

그룹 1의 동물들은 기생충 주기의 미성장 단계의 감염후 연속 7일간 4주동안 아침과 저녁으로 니타족사나이드 35 mg을 투여받았다.

그룹 2의 10 마리의 동물들은 기생충 주기의 성장 단계의 감염후 연속 7일간 10주동안 아침과 저녁으로 니타족사나이드 35 mg을 투여받았다. 그룹 2의 10 마리의 남은 동물들은 미처리 대조군으로 두었다.

모든 동물들은 실험이 끝날 때까지 건조 식량으로 먹었다.

니타족사나이드의 마지막 복용 투약후 7일 째에, 각 그룹의 모든 토끼들은 사망했다. 간의 표면은 특별히 기생충 주기의 미성장 단계에서 사멸된 이동 자국의 존재에 대해 검사되었다. 이러한 사멸된 영역은 엘-바희(El-Bahy)에 의해 서술된 기술에 따라 발육기의 이동 흡충을 추출하기 위하여 외과 바늘을 사용하여 검사되었다. 간들은 작은 조각들로 썰고, 존재하는 흡충들을 추출하기 위하여 현미경 아래에서 연하게 만든다. 복부의 공동과 내장의 표면들은 온수로 씻는다. 상기 물은 발육기의 흡충 존재를 확인하기 위하여 수집되고, 나뉘고, 검사된다. 수집된 흡충들 및 그 부분 모두는 그룹 1 및 2에서 처리 및 미처리된 동물들로부터 모두 계산된다. 살아있는 흡충들은 온수를 사용하여 쉽게 추출가능한 투명한 손상되지 않은 외피를 보이면서 색깔상으로는 매우 소량(pin)을 나타내었고, 반면에 죽은 흡충들은 색깔상으로는 회색을 나타냈고 손상된 사멸 표면을 나타낸다. 니타족사나이드의 효능은 아래의 공식을 사용하여 계산된다:

% 효율 = (a-b)/a ×100

여기서: a = 대조군 동물의 배설물로부터 얻은 흡충의 수

b = 처리 동물의 배설물로부터 얻은 흡충의 수결과

표 7에 나타난 바와 같은 연구의 결과들은 대조군 그룹과 비교할 때 처리 그룹에서 토끼들의 간으로부터 얻어진 미성장 흡충들의 수에서 현저한 감소를 보여주고 있다. 감소의 평균 퍼센트는 46.77%로 계산된(범위 : 40-60%).

표 7 : 실험적으로 감염된 토끼들의 미성장(4주 된) 거대 간 흡충에 대한 니타족사나이드의 효능

간으로 부터 추출된 흡충들의 수
토끼 번호	미처리 대조군	처리 토끼	% 효율
1	7	4	42%
2	7	4	42%
3	6	3	50%
4	8	4	50%
5	5	3	40%
6	5	2	60%
7	5	3	40%
8	6	3	50%
9	8	4	50%
10	5	3	40%
평균	6.2	3.3	46.77%

감염의 초기 성장단계에서, 니타족사나이드는 완전한 효율(100% 감소)을 보여줬고 어던 벌레들도 표 8에 보여지는 미처리 대조군 동물들과 비교할 때 처리 토끼의 간 검사에서 나타나지 않았다.

표 8 : 실험상 감염된 토끼들의 성장(10주 된) 거대 간 흡충에 대한 니타족사나이드의 효능

간으로 부터 추출된 흡충들의 수
토끼 번호	미처리 대조군	처리 토끼	% 효율
1	4	0.0	100%
2	4	0.0	100%
3	3	0.0	100%
4	3	0.0	100%
5	2	0.0	100%
6	2	0.0	100%
7	2	0.0	100%
8	3	0.0	100%
9	3	0.0	100%
10	3	0.0	100%
평균	2.9	0.0	100%

연속 7일 동안 매일 70 mg 복용으로 투약된 니타족사나이드는 거대 간 디스토마의 미성장 단계에 대해서는 약간 효과적이고 상기 기생충의 초기 성장단계에서는 완전히 효과적이다.

실시예 13

주혈 흡충(SCHISTOSOMA)

니타족사나이드는 실험적으로 감염된 쥐에서의 만손 주혈 흡충(Schistosoma mansoni) 및 빌하르쯔 주혈 흡충(Schistosoma hematobium)에 대해 검사되었다.

30에서 50 그램이 나가는 40 마리의 휜쥐들은 각 그룹당 20 마리의 2개의 처리 그룹으로 분배된다. 첫 번째 그룹은 증류슈 0.25 ml에 현탁된 만손 주혈 흡충인 300-500 마리의 자유 활동 세르카리아(free active cercariae)로 감염되고 각 쥐에 복강내 주사로 투여되었다. 두 번째 그룹도 똑같은 방식으로 감염되었으나 다만 빌하르쯔 주혈 흡충의 세르카리아였다. 이 두 그룹들은 이후 전체 70일 동안 실험실내에서 두었다.

동물들이 감염된 후 70일 째에, 각 그룹의 10 마리 쥐들은 연속 7일동안 아침과 저녁으로 니타족사나이드 1.3mg을 구강 복용 투약되었다. 처리 후 70일 째에 큰 쥐들은 사망했고 상기 벌레들은 미지근한 물을 집어넣음으로서 각 동물들의 간으로부터 추출되었다. 추출된 간 흡충들은 모든 처리군 및 대조군 동물들에서 계산되었다. 니타족사나이드의 효능은 아래의 공식을 사용하여 계산된다:

% 효율 = (a-b)/a ×100

여기서: a = 대조군 동물의 배설물로부터 얻은 간 흡충의 수

b = 처리 동물의 배설물로부터 얻은 간 흡충의 수

결과

표 9 및 10에 나타난 결과들은 명백히 연속 7일동안 매일 2.6 mg 복용 투약된 니타족사나이드는 대조군 쥐들에 대해 단지 59.91%의 만손 주혈 흡충 감소를 갖는 대조군동물과 비교할 때 빌하르즈 주혈 흡충에 대해 82.85%의 벌레 감소가 관찰되는 것으로 더 효과적이었다. 이러한 결과들은 환자들에게 있어서 만손 주혈 흡충에 대한 니타족사나이드는 니타족사나이드 후처리 양성 달걀 계수(post-treatment positive egg-counts)로 보여지는 바와 같이 효과적이지 않았다는 아바자 등(Abaza et al.)에 의한 보고서와 일치한다.

표 9 : 쥐안의 성장(13주 된) 만손 주혈 흡충에 대한 니타족사나이드의 효능

간으로부터 얻어진 흡충들의 수
쥐의 번호	미처리 대조군	대조군 쥐
1	21	10
2	29	9
3	32	10
4	26	11
5	24	13
6	19	10
7	20	9
8	24	12
9	22	8
10	30	7
전체	247	99
쥐당 평균	24.7	9.9
효율		59.91

표 10 : 쥐안의 성장(13주 된) 빌하르쯔 주혈 흡충에 대한 니타족사나이드의 효능

간으로부터 얻어진 흡충들의 수
쥐의 번호	미처리 대조군	대조군 쥐
1	18	3
2	16	3
3	14	2
4	19	2
5	12	4
6	10	4
7	13	2
8	12	2
9	17	0.0
10	9	2
전체	140	24
쥐당 평균	14	2.4
효율		82.85

상기 약제학적 조성물은 특히 흡충에 감염되었을 경우 및 면역력이 떨어진 또는 억제된 면역시스템을 갖는 사람이 쉽게 감염되었을 경우 그 치료에 유용하다.

상술한 약제학적 조성물은 만손 주혈 흡충(Schistosoma mansoni), 빌하르쯔 주혈 흡충(Schistosoma haematobium), 메콘기 주혈 흡충(Schistosoma mekongi), 일본 주혈 흡충(Schistosoma japonicum), 인터칼라툼 주혈 흡충(Schistosoma intercalatum)과 같은 주혈 흡충; 간 흡충(Fasciola hepatica), 거대 간디스토마 (Fasciola gigantica), 비대 흡충(Fasciolopsis biski)과 같은 간 흡충속; 및 창꼴 흡충(Dicrocoelium dendriticum), 이형 흡충(HeteropHyes heteropHyes), 요코가와 흡충(Metagonimus yokogawa)에 의해 유발된 인간 및 동물 흡충 감염을 치료하는데 적당하다.

상기 약제학적 조성물은 고형의 투약 형태, 액상 현탁액 형태 또는 페이스트(paste) 형태로서 구강 투여될 수 있다.

Claims

활성제로서 다음의 구조식 (Ⅰ)

및 구조식 (Ⅱ)

로 이루어지는 군으로부터 선택되어지는 일 이상의 화합물을 포함하되,

상기 활성제는 200 ㎛ 이하로서 평균 10 ㎛ 이상의 입자크기를 갖는 활성입자의 형태인 구강 투약의 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서,

상기 활성 고형 입자의 평균 입자 크기가 10 내지 100 ㎛ 인 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서,

상기 활성 고형 입자의 평균 입자 크기가 20 내지 50 ㎛ 인 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서,

상기 활성 고형 입자의 중량비 10% 이하는 100 ㎛ 보다 큰 입자 크기를 갖는 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서,

최소한 상기 활성 고형 입자의 중량비 50% 이상은 50 ㎛ 보다 작은 입자 크기를 갖는 것인 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서,

상기 활성 고형 입자의 중량비 10% 이하는 5 ㎛ 보다 작은 입자 크기를 갖는 것인 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서,

상기 활성 고형 입자의 분산계수는 0.8 내지 2 사이이며, 상기 분산 계수는 다음의 식으로 계산되며:

F_90%= (Ø_90%- Ø_10%) / ( (Ø_90%+ Ø_10%)/2 )

여기서

F_90%는 90%에서의 분산 계수;

Ø_90%는 상기 활성 고형 입자들의 90%에 상당하는 입자들 중 최대 입자크기이고, 및

Ø_10%는 상기 활성 고형 입자들의 10%에 상당하는 입자들 중 최대 입자 크기인 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서,

상기 활성 고형 입자의 분산계수는 1.1 내지 1.9 사이이며, 상기 분산 계수는 다음의 식으로 계산되며:

F_90%= (Ø_90%- Ø_10%) / ( (Ø_90%+ Ø_10%)/2 )

여기서

F_90%는 90%에서의 분산 계수;

Ø_90%는 상기 활성 고형 입자들의 90%에 상당하는 입자들 중 최대 입자크기이고, 및

Ø_10%는 상기 활성 고형 입자들의 10%에 상당하는 입자들 중 최대 입자 크기인 약제학적 조성물.
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활성제로서, 다음의 구조식 (Ⅰ)의 화합물

및 구조식 (Ⅱ)의 화합물

로 이루어지는 군으로부터 선택되어지는 하나 이상의 화합물의 고형 입자를 포함하되:

상기 입자는 입자 크기가 200 ㎛ 보다 작고 평균 입자 크기가 10 ㎛ 보다 큰 입자 크기를 가지며;

일 이상의 증점제(thickner);

일 이상의 습윤제; 및

페이스트의 pH가 2 내지 6 사이에 있는 일 이상의 약제학적으로 허용되는 산을 포함하는 국부적인 투약을 위한 약물 페이스트(paste).
제 31항에 있어서,

상기 페이스트은 세틸 알콜(cetylic alcohol), 글리세라이드 유도체(glyceride derivatives), 프로필렌 글리콜(propylene glycol) 및 이들의 조성물로 이루어지는 군으로부터 선택되어지는 하나 이상의 첨가물을 더 포함하는 약물 페이스트.
미립화제의 존재하에 미립화된 활성제를 포함하되,

상기 활성제는 구조식 (Ⅰ)의 화합물

및 구조식 (Ⅱ)의 화합물

로 이루어지는 군으로부터 선택되어지는 하나 이상의 화합물의 고형 활성 입자의 형태이고 상기 활성 입자는 입자 크기가 200 ㎛ 보다 작고 평균 입자의 크기가 10 ㎛ 보다 큰 입자 크기를 갖는 구강 투약을 위한 약제학적 조성물.
제 33항에 있어서,

상기 미립화제는 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrrolidone), 물, 알콜, 슈크로즈, 하이드록실 셀룰로오스(hydroxyl cellulose) 및 이들의 혼성물로 이루어지는 군으로부터 선택되어지는 것인 약제학적 조성물.
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활성제, 습윤제 및 녹말유도체를 포함하되,

상기 활성제는 다음의 구조식 (Ⅰ)의 화합물

및 구조식 (Ⅱ)의 화합물

로 이루어지는 군으로부터 선택되어지는 하나 이상의 화합물의 고형 활성 입자의 형태이고 상기 활성 입자는 입자 크기가 200 ㎛ 보다 작고 평균 입자의 크기가 10 ㎛ 보다 큰 입자 크기를 갖는 구강 투약을 위한 약제학적 조성물.
제 38항에 있어서,

상기 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 산을 더 포함하는 것인 약제학적 조성물.
제 38항에 있어서,

상기 활성 입자는 상기 활성제에 대해 중량비로 2 내지 99.97%이며 미립화제에 대해 중량비로 0.03 내지 10% 인 것을 포함하는 미립화된 활성제를 형성하기 위하여 미립화제의 존재하에 미립화되는 것인 약제학적 조성물.
제 40항에 있어서,

상기 미립화제는 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrrolidone), 물, 알콜, 슈크로즈, 하이드록실 셀룰로오스(hydroxyl cellulose) 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되어지는 것인 약제학적 조성물.
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