CN100515420C - 脱乙酰基硝噻醋柳胺和硝噻醋柳胺的药用组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种药物组合物，其中的药物组合物含有至少一种选自于通式(I)和通式(II)组中的化合物作活性剂。该活性剂优选为粒度小于200μm和平均粒度大于10μm的颗粒状。该药物组合物优选用至少一种药学上可接受的酸来稳定。该药物组合物尤其可用于治疗免疫系统已遭致损害的或被抑制的患者的机会致病菌的感染以及治疗吸虫感染。

Description

脱乙酰基硝噻醋柳胺和硝噻醋柳胺的药用组合物

发明背景

发明领域

本发明涉及一种含有至少一个选自于通式(I)

和通式(II)

的化合物作活性剂的药用组合物。

该活性剂优选为小于200μm的粒度和大于10μm的平均粒度的颗粒状。

本发明也涉及用至少一种药学上可接受的酸稳定化的药用组合物。

该药用组合物尤其用于治疗免疫系统已受危害或抑制的患者的机会致病菌感染和吸虫感染。

相关技术的描述

目前，对开发治疗免疫系统已遭致损害(AIDS、癌症患者、老年人、衰老者、对免疫抑制药物依赖的器官移植患者)的人的多种寄生虫和细菌感染的方法有一种迫切的需求。其他地区尤其是热带气候关注的是吸虫感染。这样对一种甚至是免疫损伤的人也能够耐受的并且甚至在热带环境储存稳定的药用组合物有一种需求。

更具体地说，鼠弓形体(Toxoplasma gondii)是一种原生动物并且是全球中枢神经系统的潜伏感染中最普遍的原因。该寄生虫可以感染许多健康人，但通常免疫系统能够控制这些生物体。鼠弓形体是AIDS患者大脑的最普遍的机会致病性病原体。目前，弓形体病在逐渐成为一个严重的问题，这不仅因为AIDS，而且还因为免疫抑制药物的广泛使用(如给器官移植患者给药)。弓形体病一般用乙胺嘧啶和磺胺嘧啶结合治疗。尽管这些药物有效，但它们却不能杀死寄生虫的胞囊，所以这种治疗必须以一定的剂量连续治疗。但常常因为毒性迫使药物中断，尤其在免疫抑制的患者中，并造成了复发的结果。据报导在免疫缺陷患者中大约70％的死亡率和中间存活4个月方面，这种统计是不良的。

隐孢子虫病是由用显微镜可见的原生动物寄生虫小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)所引起的。在具有正常免疫功能的患者中，由隐孢子引起的腹泻是强烈的和时间较长的，但是可自身限制的。在AIDS患者中，小隐孢子虫腹泻通常威胁到生命。据估计15-20％的AIDS患者患有这种病。到目前为止，现在没有对隐孢子虫病疗效稳定或被认可的疗法。

在AIDS患者中最常鉴别出的病原体是Enterocytozoonbieneusi，一种微孢子虫寄生虫，已发现有将近四份之一的患者。现在似乎这种微小寄生虫可以解释清楚大部分在HIV患者所见到的吸收障碍、腹泻和消瘦许多不能解释的症状的原因。但到目前为止，仍没有有效的治疗方法。

微孢子目的几个其他种也能够感染 HIV-阳性的患者，它们包括Encephalitozoon hellem和cuniculi，以及一种被命名为Septataintestinalis的新种。最近报导表明散播的微孢子目感染开始显著增加。

人等孢虫(Isospora belli)的感染在临床上不能从隐孢子虫病中区分出来。尽管在热带气候中较普遍的人等孢虫的实际发病率可能是较高的，但据报导在美国只有1％以下的患者。

一般把卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)归类为一种病原体寄生虫；一些研究表明它可能是一种真菌，具有特定的基因序列。卡氏肺囊虫通常感染肺部(卡氏肺囊虫肺炎(PCP))。据报导在大约40-60％的患者中治疗是成功的，伴随的问题包括尤其是在免疫已受危害的患者中药物的毒性。在感染人免疫缺陷病毒(HIV)的儿童的许多严重表现中，PCP突出是因为它的高发病率、独特年龄分布和经常性致死率的缘故。PCP是HIV感染的儿童最普遍的严重机会致病性感染；据估计在没有接受预防感染有HIV的婴儿中在生命的第一年中PCP的发病率至少12％。许多死于短暂的PCP的发展变化。

鸟型结核分支杆菌综合征(MAC)涉及到非常相似的分支杆菌生物，鸟型结核分支杆菌(Mycobacterium avium)和胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)的感染。当MAC出现在没有受损伤免疫系统患者中时，通常感染方式在呼吸道。在患有AIDS的患者中，经常散布有MAC(散布的MAC或DMAC)，并且几乎包括任何器官系统。在最近的研究中，在AIDS诊断后2年存活的患者中有43％发现有MAC细菌。对散布的MAC建立标准的治疗方法。处方通常开药物的组合，并且如果成功的话，需要为生命而持续治疗。急需一种更有效的疗法。

感染有HIV的患者特别容易受到结核分支杆菌的感染，并加速疾病的病程。当肺外结核在非HIV感染的患者中不普遍时，它却频繁出现在HIV-阳性的患者中。CDC已经公布了治疗TB的准则，即强调了抗多种药物的TB(MDR-TB)的逐渐流行。在患有MDR-TB的AIDS患者中致死率是非常高的(大约80％)并且疾病的进程极其快速。

所以，道切需要开发一种治疗这些流行于并危害人和动物的感染的疗法。

目前也需要一种广泛起作用的药物，使得治疗吸虫感染简单化。当前，必需诊断出特殊的吸虫病原体，然后开出对这些吸虫具有特异疗效的药物。许多发展中国家没有诊断特殊吸虫的设备。开发一种广泛起作用的药物将取消对诊断的需求。

曼氏血吸虫(schistosoma mansoni)，一种血吸虫是血吸虫病的成因剂，血吸虫病是人类第二大重要的热带寄生虫疾病(排在疟疾之后)，并且是人类最重要的吸虫感染。埃及血吸虫(schistosomahaematobium)是另外一个感染人类的重要菌种。全世界范围内200百亿个体患有血吸虫病，其中包括在美国的几十万人。

肝片吸虫(Fasciola hepatica)通常为肝吸虫，是羊的主要疾病，但人是一个偶然的宿主。寄生虫在健壮宿主的免疫反映中设法生存。有人建议使用硫双二氯酚治疗，但在美国没有被批准。

这样需求一种药用组合物，它甚至在热带环境中存放稳定并具有广泛的抗吸虫作用。

发明概述

现已在动物试验和人临床试验中观察到使用通式(I)和(II)的化合物的疗法功效取决于该活性物质的粒度和该化合物的稳定性。

所述的药用组合物适合于治疗由下列吸虫引起的人和动物的吸虫感染：血吸虫属如曼氏血吸虫、埃及血吸虫、湄公血吸虫(Schistosomamekongi)、日本血吸虫(Schistosoma japantcum)、居间血吸虫(Schistosma infercalatum)；片吸虫属如肝片吸虫和大片吸虫(Fasciola giganticu)、比氏姜片虫(Fasciolopsis biski)；以及支双腔吸虫、异形异形吸虫(Heterophytes heterophyes)和横川后殖吸虫(Metagonimus yokogawa)。

该药用组合物也对治疗免疫妥协的机会致病菌感染有效，这些机会致病菌包括小隐孢子虫、人等孢子虫、Encephalitozoonintestinalis、结核分支杆菌、鸟型结核分支杆菌、胞内分枝杆菌、卡氏肺囊虫和冈氏弓形虫。

该药用组合物可以是适合口服的剂型如固体剂型、液体悬浮液或糊剂。

附图的简要说明

为了更完全地理解本发的特性和目的，应当把下列结合附图所进行的详细描述作为参考：

图1显示了硝噻醋柳胺抗E.intestinalis的抑制率百分数和宿主细胞生存力。

图2显示了硝噻醋柳胺抗V.corneae的抑制率百分数和宿主细胞生存力。

图3显示了阿苯达唑抗E.intestinalis的抑制率百分数和宿主细胞生存力。

图4显示了阿苯达唑抗V.corneae的抑制率百分数和宿主细胞生存力。

图5和6显示了对各冈氏弓形虫培养孔所得到的OD值对培养基中药物浓度的曲线图。

图7是一幅以测定硝噻醋柳胺抗生长在液体肉汤中的分支杆菌功效为主的曲线图。

图8显示了小于

μm大小的活性颗粒的百分率。

发明的详细描述

本发明治疗感染的方法包括把含有至少一种选自于通式(I)的脱乙酰基硝噻醋柳胺：

和通式(II)的硝噻醋柳胺：

组中的化合物作活性剂的药用组合物给药。

通式(II)的化合物硝噻醋柳胺(NTZ)是2-(乙酰氧基)-N-(5-硝基-2-噻唑基)苯甲酰胺，一种最先由Rossignol和Cavier在1975年合成的化合物。在1ml的DMSO中能够溶解2mg的硝噻醋柳胺。硝噻醋柳胺容易被口服吸收。

到目前为止，没有证据表明通式(I)和/或通式(II)可能对广泛的寄生虫感染有效，或者它们的毒性足以使甚至免疫损伤的患者耐受。

在US3,950,351以及本发明人的出版物中公开了硝噻醋柳胺的制剂和特定用途。有时把通式为(I)的化合物脱乙酰基-硝噻醋柳胺称作为tizoxanide或d-NTZ，它是硝噻醋柳胺的一种代谢产物。

在WO 95/28393中，本发明人公开了一种生产通式(II)的纯化合物的方法，以及含有通式(I)和(II)的化合物的混合物的组合物的用途。

现已观察到当给动物或人口服时，粒度在170和520μm之间(平均粒度＝352μm)的通式(I)化合物、通式(II)化合物或其混合物的固体颗粒具有非常有限的功效。这类颗粒的功效还不如现存的药品，所以不能被管理或商业目的所接受。

从狗中也观察到动物口服每千克50毫克单一剂量的粒度小于5μm的通式(I)化合物和通式(II)化合物的固体颗粒引起严重的副作用。

现已观察到为了对动物和人被寄生虫、细菌、真菌和病毒所引起的感染有一个有效而安全的疗法，该药用组合物，或者是固体剂型或者是液体悬浮液必须包括有效剂量的粒度小于200μm的固体颗粒状的活性剂，该活性剂包括通式(I)化合物和/或通式(II)的化合物，活性固体颗粒的平均大小大于10μm。

相对于粒度在5和200μm的颗粒含量而言，高含量的粒度大于200μm的颗粒存在会降低该化合物的化疗活性。本发明的药用组合物优选不含有5％以上的粒度大于200μm的活性固体颗粒。本发明的药用组合物更优选几乎不含粒度大于200μm的活性固体颗粒。

在动物或人中，相对于粒度在5和200μm的颗粒含量而言，高含量的粒度小于5μm的活性剂颗粒的存在能够产生副作用。另外，现已观察到胃肠道能够更快地吸收粒度小于5μm的颗粒到血流中，所以对共生于动物和人的胃肠道中的寄生虫、细菌、真菌和病毒没有抵抗作用。

熟练的科学家不能预见通式(I)的化合物和通式(II)的化合物的粒度会对动物和人中的抗微生物活性有这样显著的影响。例如，在发明人进行的研究中，抗寄生虫化合物如阿苯达唑、甲苯达唑、氯硝柳胺、吡喹酮和甲硝唑没有证实在人或动物中的抗寄生虫活性依赖于它们粒度而产生这样显著的差异。另外，一名熟练科学家不能预见通式(I)的化合物和通式(II)的化合物的粒度会对动物或人服用该活性剂的耐受力具有这样一种不利影响。

通式(I)和(II)的化合物可以或者固体剂型或者液体悬浮液给药，优选该药用组合物以通式(I)和/或(II)的固体颗粒形式含有有效量的活性剂，该固体颗粒具有正如用一台

Counter LS100所测定的小于200μm的粒度和大于10μm的平均活性粒度。该设备使用750nm的激光通过光衍射法测定0.4到900μm直径的颗粒的大小。为了增加粉末的湿润性和抗絮凝性，在含有少量的Triton X-100的水中测定样品。

有益的是，该活性固体颗粒的平均粒度在10和100μm之间，优选在20和50μm之间。优选组合物的例子是：

·一种组合物，其中粒度大于100μm的活性固体颗粒低于10％(重量)；

·一种组合物，其中粒度小于50μm的活性固体颗粒至少为50％(重量)。

有益的是，该活性固体颗粒的平均粒度在10和100μm之间，优选在20和50μm之间。按照该组合物优选的实施方案，该活性固体颗粒的10％以下具有小于5μm的粒度。

在固体剂型或悬浮液中所用的活性剂最好是通式(I)和通式(II)的化合物的固体颗粒的混合物，其中固体粒度小于200μm，相对于该混合物中所含的通式(I)和通式(II)的化合物的重量而言，通式(I)的化合物的含量在0.5和20％之间，优选在0.5和10％之间。

本发明也涉及上述药用组合物，它最好含有至少一种药学上可接受的酸。这类酸的例子是柠檬酸、谷氨酸、琥珀酸、乙磺酸、乙酸、酒石酸、抗坏血酸、甲磺酸、延胡索酸、己二酸、苹果酸及其混合物。柠檬酸是非常合适的。该酸的存在提高了活性剂的稳定性。

药学上可接受的酸与该活性固体颗粒的重量比最好在0.01和0.5之间，优选在0.03和0.2之间。酸的用量最好足以能够调节悬浮液的pH值在2和6之间，优选在3和5之间，更优选在3.5和4.5之间。

WP 95/28393中公开了该药用组合物的固体和液体剂型的制备技术和优选实施例，本文将该说明书引用为参考文献。该组合物最好含有一种湿润剂和可能是一种淀粉衍生物如在US 5,578,621中所公开的那些。为了公开可能的湿润剂和淀粉衍生物本文将该美国专利的内容引用为参考文献。在US 5,578,621中把湿润剂描述为一种分散剂。

这种药用组合物或者作为固体或者为液体剂型或着作为糊剂或油膏剂能够任选含有额外的活性剂如抗菌剂、抗病毒剂或质子泵抑制剂。当它不利时，也可能这类药用制剂含有大于200μm的通式(I)和/或通式(II)的化合物的活性固体颗粒。

该组合物能够含有公知的赋型剂从而达到制备适合于口服剂型的目的。

为了具有优异的抗广谱寄生虫、细菌、真菌和病毒功效，该活性固体颗粒的分布系数最好在0.8和2之间，优选在1.1和1.9之间，最佳大于1.5，该分布系数可以按照下列公式计算：

其中：

·F_90％是在90％时的分布系数；

·是相对于90％的活性固体颗粒的最大颗粒直径的颗粒部分；

·是相对于10％的活性固体颗粒的最大颗粒直径的颗粒部分。

按照本发明的特殊实施方案，按照上述方法制备通式(I)和/或(II)的化合物的颗粒，然后磨碎从而使10％以下的活性颗粒大于100μm，50％以下的该颗粒大于50μm并且10％以下的该活性颗粒的直径小于5μm，平均粒度在20和50μm。然后用含有活性固体颗粒和至少一种制粒剂的混合物来把该活性颗粒制成颗粒状。制粒剂的例子是：聚乙烯吡咯烷酮、水、乙醇、蔗糖、羟基纤维素及其混合物。在制粒步骤中最好加入至少一种药学上可接受的酸。

本发明涉及含有本发明组合物的固体剂型如片剂、分散片剂、包衣片、骨架类等。本发明的剂型包括，例如：

·粒度小于200μm的固体活性颗粒，10％以下的该颗粒具有大于100μm的大小，50％以下的该颗粒具有大于50μm的大小并且10％以下的该颗粒具有小于5μm的大小，平均颗粒大小在20的50μm之间。

·至少一种制粒剂；

·至少一种湿润剂；

·至少一种淀粉衍生物；

·至少一种药学上可接受的酸，优选在制粒步骤中加入。

本发明的液体剂型如含水悬浮液包括，例如：

·作为活性剂，固体颗粒含有通式(I)化合物和/或通式(II)化合物，这些颗粒具有小于200μm的粒度，该颗粒中10％以下具有大于100μm的大小，该颗粒中50％以下具有大于50μm的大小并且该颗粒中10％以下具有小于5μm的大小

以及

·至少一种制粒剂；

·至少一种湿润剂；

·至少一种药学上可接受的酸，该悬浮液的pH值在2和6之间，优选在3和5之间，最佳为3.5和4.5之间；

·至少一种增稠剂，例如黄原胶、瓜尔胶、晶体纤维素、carruba胶、羧甲基纤维素及其混合物。

适合于口服的本发明糊剂或油膏剂包括，例如：

·作为活性剂，固体颗粒含有通式(I)化合物和/或通式(II)化合物，这些颗粒具有小于200μm的粒度，该颗粒中10％以下具有大于100μm的大小，该颗粒中50％以下具有大于50μm的大小并且该颗粒中10％以下具有小于5μm的大小以及

·至少一种湿润剂；

·至少一种药学上可接受的酸，该悬浮液的pH值在2和6之间，优选在3和5之间，最佳为3.5和4.5之间；

·至少一种增稠剂，例如黄原胶、瓜尔胶、晶体纤维素、carruba胶、羧甲基纤维素或其混合物。

适合于局部或阴道内给药的本发明糊剂或油膏剂包括，例如：

·作为活性剂，固体颗粒含有通式(I)化合物和/或通式(II)化合物，这些颗粒具有小于200μm的粒度，该颗粒中10％以下具有大于100μm的大小，该颗粒中50％以下具有大于50μm的大小并且该颗粒中10％以下具有小于5μm的大小以及

·至少一种湿润剂；

·至少一种药学上可接受的酸，该悬浮液的pH值在2和6之间，优选在3和5之间，最佳为3.5和4.5之间；

·鲸蜡醇和/或甘油衍生物和/或丙二醇；

·至少一种增稠剂，例如黄原胶、瓜尔胶、晶体纤维素、carruba胶、羧甲基纤维素或其混合物。

药用组合物的制备描述

使干燥纯化的通式(I)化合物和干燥纯化的通式(II)化合物经受研磨并借助目筛分出大小。

研磨之后，通式(I)化合物、通式(II)化合物及其混合物就具有图8所给出的粒度的分布。图8显示了粒度小于μm的颗粒百分数。

从该图中似乎可以看到：

·该颗粒10％(重量)以下具有小于大约5μm的粒度；

·该颗粒10％(重量)以下具有大于大约70μm的粒度；

·平均粒度约为40μm；

·该颗粒的分布系数是大约1.73，该分布系数可用下列公式计算：

其中：

·F_90％是在90％时的分布系数；

·是相对于90％的活性固体颗粒的最大颗粒直径的颗粒部分；

·是相对于10％的活性固体颗粒的最大颗粒直径的颗粒部分。

下表中公开该组合物的具体例子。

表1.含有通式(I)化合物和通式(II)化合物作活性剂的口服分散片的组合物例子

硝噻醋柳胺(99％)+脱乙酰基硝噻醋柳胺(1％)  200mg

微晶纤维素                                116mg

由FMC-USA出售的Avicel pH 102              25mg

聚维酮                                    3mg

硬脂酸镁                                  5mg

胶体二氧化硅                              10mg

柠檬酸                                    10mg

由Robertet出售的草莓香料877720号          10mg

糖精钠                                    2mg

表2.含有通式(I)化合物和通式(II)化合物作活性剂的口服包衣片的组合物例子

硝噻醋柳胺                                500mg

玉米淀粉                                  60mg

预凝胶化的玉米淀粉      70mg

羟丙基甲基纤维素        5mg

蔗糖                    20mg

淀粉乙醇酸钠            30mg

柠檬酸                  25mg

滑石粉                  8mg

硬脂酸镁                7mg

包衣：

在含有500mg活性剂的片或胶囊上喷洒热糖液或膜包衣。

表3.含有通式(I)化合物和通式(II)化合物作活性剂的口服含水悬浮液的例子。该悬浮液的pH值大约为4.1。

硝噻醋柳胺(98％)+脱乙酰基硝噻醋柳胺(2％)   2g

蒸馏水                                     100ml

苯甲酸钠                                   0.2g

蔗糖                                       30.5g

黄原胶                                     0.2g

微晶纤维素和羧甲基纤维素钠

由FMC-USA出售的Avicel RC-591               0.8g

柠檬酸                                     0.2g

二水合柠檬酸钠                             50mg

由Robertet出售的草莓香料877720号           125mg

红色颜料33D和C号                           1mg

表4.含有通式(I)化合物和通式(II)化合物作活性剂的口服糊剂的例子

硝噻醋柳胺(98％)+脱乙酰基硝噻醋柳胺(2％)   500mg

矿物油                                     10g

棕色糖                                     1g

微晶纤维素和羧甲基纤维素钠

由FMC出售的Avicel RC-591                   0.8g

柠檬酸                                     0.2g

表5.阴道内或表面使用的糊剂或油膏剂的例子，该糊剂或油膏剂含有通式(I)化合物和通式(II)化合物作活性剂

硝噻醋柳胺(98％)+脱乙酰基硝噻醋柳胺(2％)      8mg

Cremaphor A6                              2g

Cremaphor A25                             1.5g

矿物油                                    7g

Luvitol EHO                               7g

单甘油酯                                  4g

鲸蜡醇                                    3g

Simeticone                                0.5g

Germaben II                               1g

丙二醇                                    3.5g

蒸馏水                                    62.5g

本发明的药用组合物是对寄生虫、细菌、真菌和病毒具有广谱作用的组合物，尤其是在口服时。

以上所公开的药用组合物的功效和安全性对动物和人是优异的。尤其是，在人的临床研究中，现已观察到在治疗寄生虫感染方面，上述药用组合物的功效比使用粒度在170和520μm之间(平均粒度＝352μm)的活性化合物的效果更显著，甚至是与给患者以高达三次的剂量和更长的时间把较大颗粒给药相比。表6显示了所获得的治愈率的例子。

表6.把使用粒度在170μm到520μm范围(平均＝352μm)的通式(I)和通式(II)的化合物与使用粒度在从5μm到200μm(平均＝34μm)通式(I)和通式(II)的化合物所获得的人临床研究结果的比较。

通式(I)的化合物(98％)+通式(II)的化合物(2％)

粒度170μm到520μm粒度5到200μm

剂量＝15到50mg/kg/天  剂量＝15mg/kg/天

3到7天                       3天

寄生虫  治愈数/总数＝％治愈率  治愈数/总数＝％治愈率

人芽囊原虫  12/27＝44％         10/10＝100％

(Blastocystis hominis)

痢疾阿米巴           29/47＝62％      106/133＝80％

(Entamoeba histolytica)

兰氏贾第鞭毛虫       11/37＝30％      50/73＝68％

(Giardia Camblia)

人蛔虫               3/69＝4％        144/179＝80％

(Ascaris Cumbricoides)

毛首鞭虫             7/48＝15％       58/79＝73％

(Trichuris trichiura)

对表6中所列的各寄生虫，用5和200μm之间的活性颗粒比用170μm到520μm大小的活性颗粒治疗患者，治愈率会显著地好，在每种情况统计性的显著性为p＜0.02(使用标准的X²检验法)。这种情况即使较大的粒度活性剂的剂量通常较高并且治疗期间经常长于接受具有小于200μm粒度的活性剂的药用组合物的患者的给药期间。对每组患者作出的报告没有严重的副作用。

在动物的检验中也观察到了与上述对人研究结果相似的结果。

另外，在广泛的动物研究中使用粒度在5和200μm(平均＞10μm)的通式(I)化合物和通式(II)的化合物没有观察到给狗口服单一剂量每千克50毫克的通式(I)的化合物和通式(II)的化合物所观察到的副反应，即使90天或更长时间每天度服用相同剂量或较高剂量的化合物。

而且，该组合物是稳定的(甚至当经受40℃的温度和65％的相对湿度6个月，或者在液体悬浮液中，当在这些条件下悬浮在水中3个月时)，由此推测活性组分没有降解并且组合物在为了医疗和商业目的进行适当的制备后一段时期内都保持了它的功效。

下列将证实该药用组合物的功效。

实施例I

小隐孢子虫

在临床试验初期，每天口服500至2000mg的硝噻醋柳胺治疗患有慢性隐孢子虫腹泻的30名AIDS患者。如果继续腹泻，使患者接受另外四周的硝噻醋柳胺直到一天2000mg。

28人完成了两周或更多周的治疗并且其中16名对由第8周治疗引起的治疗反应是可评估的。在之后的组中，12人在每天的肠运动频率有50％或更大的下降并且10人有显著的下降或者在粪便中消灭了寄生虫，其中该微生物在4人中逐渐测定不到了。6名患者在益处上都符合临床和寄生虫学反应标准。

长期接受较高药物每日剂量的患者更有可能有阳性反应。

对AIDS-相关隐孢子虫腹泻的硝噻醋柳胺的开标研究证实了在每天服用500、1000、1500或2000mg的药物的人中降低了肠运动。试验参与者都具有42个细胞/mm³的平均CD4+计数(在0-303个细胞/mm³之间)、平均15个月内每天平均6.7次肠运动、粪便中有小隐孢子虫卵囊并且没有其他明显的肠道病原体。用阿齐红霉素或巴龙霉素治疗几乎所有参与者都失败了。

23周后，13名中的9名具有了完全的临床反应(显著地形成了每天1到3次肠运动)，并且13名中的4名具有了部分临床反应(每天肠运动至少有50％的下降或者粪便稠度的变化至少有75％形成)。试验最后，11名中的8名已经完全地消灭了寄生虫并且其他3名在粪便的程度上实际下降了。用每天1000mg或更高的剂量和更长的治疗有一个好转的趋势。两名试验参与者有了寻麻疹类的皮肤疹；90％以上的坚持试验制度四周多。

实施例II

小隐孢子虫

体外剂量信息：

把硝噻醋柳胺溶于无菌二甲基亚砜(DMSO)并以100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml和0.1μg/ml的浓度试验抗完整的小隐孢子虫粪便感染的单细胞层。进行第二个试验以在另外的20、2、0.2和0.02μg/ml浓度测试硝噻醋柳胺。用DMEM的完全培养基连续稀释得到这些浓度从而获得最终DMSO的浓度为0.5％。该培养基对照组也接触了0.5％的DMSO。

试验使用了一种生长在7mm腔室中的MDBKF5D2细胞的细胞培养物，并且每孔5×10⁴GCH1粪便作为小隐孢子虫，并进行巴龙霉素(阳性对照)与硝噻醋柳胺(试验药物)的比较。物质包括免疫的抗-小隐孢子虫子孢子兔血清(0.1％)和结合荧光素的山羊抗-兔抗体(1％)。

毒性试验测定：

把200μl的以100、10、1和0.1μg/ml的浓度含有硝噻醋柳胺的培养基和适当的对照物接种到含有汇合MDBKF5D2细胞单层的96孔培养皿的两个孔中和不含单层的两个孔中。在37℃和8％CO₂单细胞层上培养该药物。在24小时(试验1)和48小时(试验2)，MTS(Owen溶液)中，分别以333μg/ml的浓度和25μl把PMS加到每个孔中。把培养皿放回黑暗中的恒温箱中进行两小时。在两小时时，把100μl的各上清液转移到一个新的显微滴定平台上并在ELISA读数器的490nm处读数。记录并分析结果。毒性百分数是这样计算的：从培养基对照上清液(不含药)的平均光密度(OD)中减去药物上清液的平均光密度(OD)除以培养基对照物的OD并乘以100。

完整小隐孢子虫粪便测定：

37℃下(8％CO₂)在汇合的MDBKF5D2细胞单层上硝噻醋柳胺(100、20、10、2、1、0.2、0.1和0.02μg/ml)培养每孔中5×104个小隐孢子虫卵囊。测定在每个孔中的感染程度并用一台免疫荧光测定仪分析24到48小时。计算抑制百分数，即从培养基对照组(不含药物)中平均寄生虫数/10个视野减去药物试验孔中平均寄生虫数/10个视野，除以平均对照数，然后乘以100。

结果：

试验1：24小时。

化合物	浓度	平均数(+SD)<sup>*</sup>	毒性百分数	抑制率百分数
					感染的培养基	0	983.5(±128.2)	0	0
巴龙霉素	2mg/ml	482(±47.1)	23.8	51
					NTZ	100μg/ml	丢失	88.1	NA<sup>**</sup>
	10μg/ml	55.5(±13.5)	65.1	94.4

	1μg/ml	224.5(±28.5)	8.3	77.2
						0.1μg/ml	474.5(±29.5)	19.3	51.8

*寄生虫数/10个视野

**因为毒性而没有提供。

试验2：48小时。

化合物	浓度	平均数(+SD)<sup>*</sup>	毒性百分数	抑制率百分数
					感染的培养基	0	2231.25(±90.03)	0	0
巴龙霉素	2mg/ml	580(±33.42)	40.8	74.01
					NTZ	20μg/ml	68.75(+13.77)	92.87	96.92
	2μg/ml	113.75(±21.36)	24.93	94.90
						0.2μg/ml	1020(±158.48)	16.56	54.29
	0.02μg/ml	1041(±191.46)	21.23	53.33

*寄生虫数/10个视野

硝噻醋柳胺对完整的小隐孢子虫的卵囊的作用：

在试验1中，10、1和0.1的浓度的硝噻醋柳胺分别造成了94.4、77.2和51.8％的寄生虫抑制程度，并且细胞毒性程度分别为65.1、8.3和19.3％。尽管在10μg/ml出现了接近完全抑制寄生虫的感染，但却显出了高毒性率。在1μg/ml的硝噻醋柳胺，寄生虫的抑制和细胞毒性好于在2mg/ml浓度的巴龙霉素(对1μg/ml的硝噻醋柳胺，77.2％的寄生虫抑制和8.3％毒性与对2mg/ml浓度的巴龙霉素51％的寄生虫抑制和23.8％的细胞毒性)。

在试验2中，改进该药物以获得最小毒性的更好剂量分布。结果是，培养物能够存活48小时替代了试验中的24小时。培养48小时明显导致了更高的相关细胞毒性，这正如在两种试验中对巴龙霉素检测所得到的数据。尽管细胞单层似乎仍然是完整的，但是在48小时培养的20μg/ml的硝噻醋柳胺仍然有太大的毒性。有可能影响细胞功能的较高毒性也影响寄生虫的感染/发生。2μg/ml的硝噻醋柳胺对寄生虫的感染有显著的抑制同时也具有相对较低的细胞毒性。进一步稀释也能够产生显著的抑制和低毒性。在药物浓度为2μg/ml时，中等细胞毒性和94.90％的抑制活性表明在体外小隐孢子虫感染2μg/ml的硝噻醋柳胺优于2mg/ml的巴龙霉素(如1000倍的较高浓度)。

实施例III

小隐孢子虫

体外剂量和存放资料：

测试存放的硝噻醋柳胺和脱乙酰基硝噻醋柳胺(NTZ和NTZdes)在10、1、0.1和0.01μg/ml的浓度时抗完整的小隐孢子虫卵囊脱囊的子孢子感染的细胞单层。把每种化合物溶于100％的二甲基亚砜(DMSO)并且用无菌DMEM稀释到理想的浓度。硝噻醋柳胺和培养基对照物的各种浓度都包括0.025％DMSO作一个常数。

该试验使用了生长在7mm腔室的MDBKF5D2细胞的细胞培养物和用每孔5×10⁴的GCH1卵囊作为小隐孢子虫，并且进行该试验来对比巴龙霉素(阳性对照)和硝噻醋柳胺(试验药物)。材料包括免疫的抗-小隐孢子虫子囊兔血清(0.1％)和结合荧光的山羊抗-兔抗体(1％)。

毒性试验测试：

把200μl上述提到的浓度的含有硝噻醋柳胺的培养基溶液和适当的对照物接种到含有汇合的MDBKFD2细胞单层的96孔培养皿的两个孔中和没有单层的两个孔中。在37℃和8％CO₂条件下在该单细胞层上培养该药物。48小时时，分别以333μg/ml和25μM的浓度把MTS(Owen溶液)和PMS加入各孔中。把该培养皿放回黑暗中的恒温箱培养2小时。在2小时时，把100μl的各上清液转移到一个新的显微滴定片上并在ELISA读数计的290nm处读数。记录并分析结果。这样计算毒性的百分数：从对照的培养基上清液(没有药物)的平均光密度(OD)中减去药物上清液的平均光密度(OD)，除以对照培养基的OD并乘以100。

按如下给细胞毒性打分：

0.5％毒性＝0，6-25％ 毒性＝1，26-50％ 毒性＝2，51-75％毒性＝3和76-100％ 毒性＝4。按照标准，把0或1的细胞毒性分数当作可接受的毒性程度。把2、3或4的毒性当作高程度或对细胞单层的毒性。

完整的小隐孢子虫卵囊测定：

在37℃(8％CO₂)汇合的MDBKF5D2细胞单层以上面所提到的硝噻醋柳胺浓度培养5×10⁴个小隐孢子虫卵囊。测定在每孔的感染程度并且在48小时通过免疫荧光测定法进行计算机分析。这样计算抑制的百分数：从培养基对照组(不含药物)中平均寄生虫数/每个视野减去药物试验孔中平均寄生虫数/每个视野，除以平均对照数，然后乘以100。

结果：

小隐孢子虫卵囊测定法(48小时)

药物	浓度	寄生虫	±SD	毒性/OD	±SD	抑制率％	毒性％	分数
									含水培养基	0	681.58	±271.02	2.024	±0.18	0	0	0
巴龙霉素	2000	115.75	±44.65	1.219	±0.009	83.02	39.79	2
									0.025％DMS0培养基	0	628.50	±171.94	1.799	±1.45	0	0	0
NTZ	10	11.75	±7.33	0.413	±0.13	98.13	77.07	4
										1	39.67	±13.13	1.618	±0.326	93.69	10.09	1
	0.1	643.42	±229.73	1.878	±0.154	≤0	≤0	0
										0.01	714.33	±194.79	1.617	±0.072	≤0	10.12	1
新NTZdes	10	13.75	±6.66	0.337	±0.005	97.81	81.27	4
										1	39.92	±13.49	1.710	±0.033	93.65	4.97	0
	0.1	649.86	±152.19	1.506	±0.119	≤0	16.29	1
										0.01	749.33	±139.49	1.721	±0.144	≤0	4.36	0

浓度-μg/ml；寄生虫-平均寄生虫数/视野(分析的12个视野)；

％抑制率-寄生虫感染的抑制百分数；

％毒性-药物对细胞毒性的百分数。

从上述可以看出NTZdes的抑制活性与实施例II NTZ的相同。当每种组合物分别用10和1μg/ml所得到98和94％抑制率的平行试验时，硝噻醋柳胺和脱乙酰基硝噻醋柳胺二者在体外抗小隐孢子虫的功效是相同的。对硝噻醋柳胺，1μg/ml是得到90％以上的抑制率的最低浓度而用硝噻醋柳胺的较底浓度如0.2、0.1和0.02μg/ml可能获得50％的抑制率。在相同试验条件下，用作阳性对照的巴龙霉素比在2,000μg/ml的浓度达到51到83％范围的抑制浓度的功效小2,000倍。

实施例IV

E.INTESTINALIS和V.CORNEA

以每孔2.6×10⁵个细胞的浓度把2RK-13细胞(兔肾细胞系)加入到24孔培养板(1.0ml培养基；具有2mM L-谷氨酸的RPMI 1640和5％热灭活的胎牛血清)。在37℃CO₂恒温箱把碟子培养过夜，这时细胞已达到了汇合(增加一倍，估计每孔5×10⁵个)。

以相对于所估计的宿主细胞3∶1的比率或以每孔15×10⁶个生物把Septata intestinalis(来自组织培养物的)生物加到宿主细胞中。该比率造成大约50％的逐渐感染的宿主细胞。

把药物溶于MDSO、水或甲醇(取决于溶解度)来生产1.0mg/ml的贮存液。把该贮存液存放在-70℃。在试验中在完全组织培养基中使用稀释液。在一式三份的孔中试验所有稀释液。

每隔三到四天更换培养基(含有新鲜稀释的药物)。

在第六天(加入寄生虫和药物后)，检测细胞的毒性。检测给药但没寄生虫的对照细胞的汇合、细胞形态和死亡或漂浮细胞的存在。检测只用寄生虫培养的细胞来证实寄生虫的感染(即寄生虫类的空泡的存在)。细胞培养寄生虫并且评估药物对宿主细胞毒性和寄生虫空泡的相对数(即高度、中度或低度)。

在第10天，把100μl的10％SDS(0.5％最终浓度)加到培养基孔中来破裂宿主细胞膜并引起小孢子虫目的释放。通过计算血细胞计数器上的整除数来测定每孔中存在的寄生虫总数。用抑制百分数来表示结果(相对于没给药的感染细胞)。

在图1-4中显示了结果。

实施例V

冈氏弓形虫

试验硝噻醋柳胺和脱乙酰基硝噻醋柳胺抗寄生虫，更具体地说是鼠连续排便所保留的冈氏弓形虫的RH株。用冈氏弓形虫培养96孔微培养板中培养MRC5成纤维细胞(Bio-Merieux，法国)的细胞培养物。向各培养物孔中加入200个新鲜收获的速殖子，除了8个对照孔(阴性对照)。培养4小时后，把药物稀释液加入培养基中。

在8.10^-4和40mg/L之间的浓度试验硝噻醋柳胺(NTZ)和脱乙酰基硝噻醋柳胺(dNTZ)。开始以2mg/mL的浓度把药物溶于DMSO中，然后在培养基中制备连续的稀释液。没有观察到沉淀。

把药物稀释液加入培养物中(各稀释液的8个孔中)，然后把该培养物培养72小时。然后用冷甲醇固定培养物。用过氧化酶标记的抗冈氏弓形虫的兔抗体通过ELISA进行冈氏弓形虫生长的测定。记录每孔的光密度。

通过绘制从每个培养孔所得到的OD值对培养物中药物的浓度图表示结果。统计分析由95％置信区间的回归分析和来自各药物所产生的OD值的剂量-反应曲线的测定所组成。

用吉姆萨给一个平皿染色来检查培养物中细胞病的作用。

了解这三种试验。在每个试验中，每个化合物用两个培养皿；在每个培养皿中，对各药物浓度使用8个同样的孔。

结果：

在三组试验中得到了相似的结果。在图5a、b、c和6a、b、c上显示了每种药物一个代表性试验的图示。

硝噻醋柳胺(图5a、b、c)：

对10^-4mg/l和0.3mg/L之间浓度没有注意到抑制作用。对≥0.6mg/L的浓度注意到显著的作用，对≥2.5mg/L的浓度能够完全抑制冈氏弓形虫的生长。但是，对≥2.5mg/L的浓度能够在细胞单层上注意到显著的毒性。

细胞单层的显微镜检查表明在1.25mg/L的浓度的NTZ诱发了对寄生的细胞的细胞病作用，伴有放大的寄生虫样的空泡和细胞内寄生虫数目的减少。从回归分析中，估计在1.2mg/L能够达到50％的抑制浓度。

脱乙酰基硝噻醋柳胺(图7a、b、c)：

用脱乙酰基硝噻醋柳胺得到了相似的结果：在10mg/L和0.3mg/L之间的浓度没有作用，≥0.6mg/L的浓度能够抑制并且≥2.5mg/L的浓度有显著毒性。估计在1.2mg/L能够达到50％的抑制浓度。

所得到的结果在三次不同的试验中是可重复的，同时也评估了各药物浓度时对重复培养物的药物抑制作用。

对硝噻醋柳胺和脱乙酰基硝噻醋柳胺来说，在大约1.2mg/L的浓度能够观察到对弓形虫生长的显著抑制，同时改变了寄生虫样的空泡但没有显著改变寄生虫本身。

这些结果表明这些药物对抗冈氏弓形虫具有良好的活性，并且在体内血清或组织中得到大约1mg/L的浓度能够预期有治疗作用。

实施例VI

分支杆菌

现已发现硝噻醋柳胺具有抗TB器官的抗菌活性。下表显示了一种由琼脂稀释技术硝噻醋柳胺和脱乙酰基硝噻醋柳胺的MIC抗胞内分支杆菌的测定方法。这些结果以几个试验为基础，对使用Middlebrook琼脂的琼脂稀释方法来说，其中每个试验花费约3周的时间。使用来自ATCCd胞内分支杆菌的标准菌株，按照标准琼脂稀释方法所得到的这些数据表明硝噻醋柳胺在2μg/ml具有抗分支杆菌的MIC而脱乙酰基硝噻醋柳胺在4μg/ml具有MIC。

硝噻醋柳胺和脱乙酰基硝噻醋柳胺对胞内分支杆菌的MIC

*MIC是通过使用Middlebrook 7H11琼脂的标准琼脂稀释法测定3周。

该试验使用了一种标准菌株胞内分支杆菌ATCC13950。

图7是一幅以测定硝噻醋柳胺抗液体肉汤中分支杆菌生长的功效的图表。我们使用了MTS比色测定法，该方法使我们能够测定在4小时而不是用琼脂计数方法所测的3周的生长。正如从图7数据中所看到的，当在开始培养后72小时加入硝噻醋柳胺时，比单独的对照培养基中的生长有对持续生长更迅速的作用。硝噻醋柳胺3μg/ml的剂量在24小时后能够终止生长，然后在2天后会有一个缓慢的生长。在培养物的144小时过程中50μg/ml的剂量是可完全制菌的。

实施例VII

小隐孢子虫

在试验性感染鼠中试验硝噻醋柳胺的抗小隐孢子虫的作用。硝噻醋柳胺是由佛罗里达的Tampa的Romark实验室L.C.提供的。

按照Paget和Barnes改良人的总剂量(1g/天7天，即7g)来用于小鼠。把人的剂量乘以0.0026用于小鼠(称量大约20g)来得到对每个宿主连续7天早晚所需药物的重量。每个小鼠接受2.6mg/天(7000mg×0.0026/7)。用装有圆形倾斜针头的塑料注射器由口把所述剂量给药。

通过口服100,000个从感染的小牛得到的小隐孢子虫的卵囊，把20只(20)2天龄的哺乳小鼠感染。在对小鼠给药前，按照Fayer & Ellis所述的技术使用糖溶液浓缩该卵囊。获取每只小鼠的直肠化验样本并每天用Graczyl等所述的改良的Niehl-Neelsen染色技术进行检查。在动物口服感染后2天脱落的卵囊出现在粪便中。在动物感染后第三天，10只小鼠早晚连续7天接受了1.3mg的硝噻醋柳胺，同时保留10只剩余的小鼠作未治疗的对照。在治疗的7天中的每天和治疗后7天的每天获取直肠化验样本。把卵囊悬浮于油中并在显微镜下每100视野计数。

结果：

在下表中显示的结果清楚地表明把硝噻醋柳胺以2.6mg/天的每日剂量连续7天可以有效地抗小隐孢子虫，相对于对照动物减少感染小鼠粪便中的卵囊数。在治疗第三天结束时，试验药物能够减少10只治疗小鼠中的6只的脱落的卵囊。在治疗第7天结束时，完全降低了脱落的卵囊，当与未治疗的对照小鼠相比时，所有治疗小鼠的粪便检查都呈阴性。正如通过在治疗后第3和7天所观察到阴性检查所示，这种作用在治疗后至少持续7天。

实施例VIII

分支杆菌

把硝噻醋柳胺与izoniazide抗菌药比较。原始记录使用了BCG(卡介菌)作分支杆菌菌株。该菌株的敏感性与结核分支杆菌的相同，但该菌株更无害，所以不需要高含量的结核病药剂的内容物。

给小鼠服用每天4mg/每只鼠的0.2ml向日葵油。用硝噻醋柳胺治疗的小鼠结果与接受izoniazide组是相当的。

实施例IX

肝片吸虫

试验硝噻醋柳胺和脱乙酰基硝噻醋柳胺体内抗肝片吸虫的功效。

在LA.Bunkie，Hardy’s Meat Packers的Louisiana Veterinary医疗诊断实验室中由于姜片虫病而宣告不适用的3个牛肝脏的胆管中收集成熟的肝片吸虫。在无菌生理盐水中洗涤吸虫1小时并转入无菌生理盐水或RPMI(pH7.4)另外3小时。然后在37℃5％CO₂条件下，把吸虫放于无菌RPMI-兔血浆(50∶50v/v)或无菌RPMI(pH7.4)过夜。

按照改良的Ibarra和Jenkins的方法(Z.Parasitenkd.70：655-661，1984)进行体外培养(37℃，5％CO₂)。使用无菌技术，在hank平衡盐溶液(pH7.2)中把吸虫洗涤两次2-3分钟并分别方于6孔Linbro培养平板的孔中，其中培养板中含有10ml等分的药物在培养基中定义的稀释液。培养基是由含有2％兔血的无菌50∶50v/vRPMI-兔血清加100ppm青霉素和100ppm链霉素组成。只使用具有正常活性和形态的吸虫。

使用100ml的容量瓶，把由Romark提供的NTZ或其D-NTZ的备用溶液溶于DMSO(2000μg/ml)并用培养基稀释来生成特定的药物浓度(100、50、25、10、5、3、1μg/ml)。在每个复制品中培养两个对照吸虫，一个在含有RBC的没有药物的培养基而另一个在含有RBC的没有药物的培养基中。

使用带背景光的操纵台和一个3×放大的带光镜片，为了药物治疗的功效检查吸虫，把与未治疗的对照吸虫相比死亡、能动性分布或形态变化作为证据。

结果：

试验1：对D-NTZ来说，在50和100μg治疗中的吸虫是濒死的或在1小时内死亡的。在25μg的治疗中7条吸虫中的4条是濒死的，两条是具有活性的，并且在第1小时内一条是迟钝的；到3小时所有都死亡了除了两条缓慢的吸虫并且在4小时后仅有1条迟钝的吸虫存活。在10μg时，在1、3和4小时注意到了降低的活性并且到7小时所有的都濒死或死亡。在有3μg缓慢发作的5μg和3μg组中直到24小时才看到一些个体中下降的活性；在各组中除了一条迟钝的吸虫外到50小时3和5μg治疗孔中全部死亡。在42-47小时注意1μg组有一些延缓的活性并只有3条存活，在91小时还存活着一条濒死的吸虫；在115小时只有1条濒死的吸虫存活在1/g组。在66小时(一条吸虫)、91小时(一条吸虫)和115小时(四条吸虫)观察到含有RBC的对照组中的能动性。在不含RBC的对照组中，在91小时所有都活着并且在15小时一条是死亡的。

试验2：

通过在8次重复中对能动性分数和死亡率的早期作用注意到NTZ相对于D-NTZ的结果具有稍微好的活性。在100、50和25μg组，除了25μg组在1小时存在1条吸虫外，所有的吸虫都死亡，而存在的那条吸虫在3小时后死亡。在开始后第1小时可以看到其他各用药治疗组在死亡率上有与剂量相关的下降。在10μg组，只有一条吸虫存活到16小时。在5μg组，只有3条吸虫在第6小时是活的并且在16小时没有一条存活。到23小时，在3μg组中只有2条呆滞的吸虫存活着；到41小时就死亡了。对1μg组来说，到16小时有一条吸虫死亡，到41小时有3条而到74小时有5条死亡；在91小时有3条吸虫存活并且在115小时有一条吸虫具有活性。在有RBS对照组中，在74小时7或8条吸虫是活的，在91小时有3条是活的并且在115小时有2条是存活的。在没有RBC的对照组中，6或8条吸虫在74小时具有活性，在91小时有4只具有活性而在115小时有2只具有活性。

在高剂量组(25、50、100μg)中吸虫的死亡是迅速的并与收缩和腹侧‘卷曲’有关。在较低的给药剂量时，在一定时期多数吸虫是缓慢的，当濒死或死亡时吸虫变得更松弛和‘扁平’。

在91小时污染对一些重复开始的试验结果有限制。对D-NTZ试验来说，到115小时在两次重复平皿中出现了大多数细菌或真菌的生长过度和相关的死亡率。对NTZ试验中，到91小时(有两次重复)和115小时(有5次重复)在全部重复平皿中出现生长过度和吸虫的死亡率。由于多数平皿的一般性污染，把139小时的观察视为无效。

结论：

通过两组测试药物的试验表明硝噻醋柳胺具有很强的杀吸虫功效。据观察硝噻醋柳胺对肝片吸虫的杀吸虫活性稍微好于脱乙酰基硝噻醋柳胺，脱乙酰基硝噻醋柳胺被认为是在肝浓度中具有活性的主要代谢产物。

在D-NTZ体外给药率＞50μg时，1小时内出现吸虫的快速死亡，在25μg为4小时并且在10μg到6-7小时。如果药物动力学数据表明单一治疗后＞6-8小时保持组织浓度，10μg可能是一个适当的单一治疗靶向药物运送率。

在3和5μg剂量率观察到两种化合物74小时(三天)杀吸虫的强烈活性。在1μg给药量观察到延长的存活途径但不等于没有给药治疗的对照吸虫；所以在肝组织中需要3到4天把这种含量的药物运送给吸虫可能对寄生虫具有不足的治疗作用。

实施例X

大片吸虫

在试验性感染的兔中测试硝噻醋柳胺对成熟的和未成熟的大片吸虫抵抗作用。

在使用Abdel-Ghany所述的技术用大片吸虫感染L.calludi蜗牛28-35天后，在透明纸上收集包在囊内的大片吸虫的后囊蚴(EBC)，其中在纯净的脱氯自来水中使蜗牛暴露在人工光线30分钟。在4℃的冰箱中把所得到的包在囊内的后囊蚴(EMC)保存在水面下5到8天直到把它们用于感染的试验动物。

在试验中包括40只重量在1.5到2kg的Boscat兔，并分成每组20只的两个治疗组。

用包在莴苣叶中并放在动物舌根上的35-40个包在囊内的后囊蚴口服感染第1组动物。用手紧闭动物口腔直到把包在囊内的后囊蚴吞咽下去。用第1组的这些动物测试硝噻醋柳胺抗未成熟状态(4-5周大的)的大片吸虫的功效。

如上所述把第2组动物用10-15个包在囊内的后囊蚴口服感染并用来测试硝噻醋柳胺抗成熟吸虫(＞10周大的)的功效。

在寄生虫循环的未成熟状态感染后4周，使第1组中的10只动物早晚连续7天接受35mg的硝噻醋柳胺。第1组中剩余10只动物作为未治疗的对照。

在寄生虫成熟状态感染后4周，使第2组中的10只动物早晚连续7天接受35mg的硝噻醋柳胺。第2组中剩余10只动物作为未治疗的对照。

用干燥的饲料配量喂养这些动物直到试验结束。

在硝噻醋柳胺最后剂量给药后7天，杀死各组的所有动物。检查肝脏表面是否存在坏死的迁移性皱纹尤其是在寄生虫循环的未成熟状态。用两个手术针检查这些坏死区从而按照E1-Bahy所述的技术提取迁移的幼稚吸虫。把特别是迁移性皱纹周围的肝脏切成小片并在显微镜下浸软来提取存在的吸虫。用温水清洗腹腔和内脏表面。然后收集清洗水，筛选并检查识别幼稚吸虫。在第1和2组中治疗的和未治疗的动物中计算所收集的所有寄生虫以及部分寄生虫的数目。活着的吸虫颜色为粉红色、显出半透明的完整体肤，特别是从用温水从肝脏组织中提取得到的吸虫，同时死亡的吸虫在颜色损失上是灰色的并且显示出断裂的坏死表面。用下列公式计算硝噻醋柳胺的功效：

其中：

a＝对照组动物粪便中收集的吸虫数

b＝治疗组动物粪便中收集的吸虫数。

结果：

如表7所示的研究结果表明与对照组相比从治疗组兔肝脏所收集的未成熟的吸虫数有显著的下降。下降的平均百分数计算为46.77％(范围：40-60％)。

表7：在试验性感染的兔中硝噻醋柳胺抗未成熟(4周大)大片吸虫的功效

正如表8所示的，在感染的早期成熟状态，硝噻醋柳胺显示出了一种完全的作用(100％下降)并且在检查治疗兔肝脏后与未治疗对照动物相比可以看到没有肠虫。

表8：在试验性感染的兔中硝噻醋柳胺抗早期成熟(10周大的)大片吸虫的功效

以70mg/天的剂量连续7天给药硝噻醋柳胺对抗大片吸虫的未成熟状态具有中等程度的功效并且对抗该寄生虫早期成熟状态具有完全的功效。

实施例XIII

血吸虫

在试验性感染的小鼠中测试硝噻醋柳胺抗曼氏血吸虫和埃及血吸虫的功效。

把重量为30到50克的40只白鼠分为两个治疗组，每组20只动物。用悬浮于0.25ml蒸馏水中300-500曼氏血吸虫的游离活性尾蚴并通过腹腔注射为每只小鼠给药来感染第1组。除了埃及血吸虫尾蚴不同外用相同的方式感染第2组。然后把这两组在实验室放置总共70天。

动物感染70天后，用1.3mg口服剂量早晚连续7天把硝噻醋柳胺给药来治疗每组中的10只小鼠。治疗结束后7天，杀死所有小鼠并用温热水(37℃)灌注法从每只动物的肝脏中提取寄生虫。计算所有治疗和对照动物的所提取血吸虫的数目。用下列公式计算硝噻醋柳胺的功效：

其中：

a＝对照组动物粪便中收集的血吸虫数

b＝治疗组动物粪便中收集的血吸虫数。

结果：

如表9和10所示的结果清楚地表明当与对照动物相比时，以2.6mg/天的每日剂量连续7天把硝噻醋柳胺给药抗埃及血吸虫更有效，其中观察到虫子的下降率为82.85％，而抗曼氏血吸虫相对于对照小鼠虫子下降率只得到59.91％。这些结果与Abaza等对患者的那些报告是一致的，其中所述的报告是如硝噻醋柳胺治疗后阳性虫卵数所示的硝噻醋柳胺对曼氏血吸虫无效。

表9：硝噻醋柳胺抗小鼠中成熟(13周大的)的曼氏血吸虫的功效

表10：硝噻醋柳胺抗小鼠中成熟(13周大的)的埃及血吸虫的功效

Claims (28)

1.一种药物组合物，它含有

至少一种选自下组中的化合物作活性剂：

通式(I)的化合物

和通式(II)的化合物

一种药学上可接受的酸；

其中所述活性剂为活性固体颗粒形式，具有小于200μm的粒度并且平均粒度大于10μm，且所述药学上可接受的酸与所述活性固体颗粒的重量比在0.01和0.5之间。

2.按照权利要求1的组合物，其中该药学上可接受的酸选自于下组：柠檬酸、谷氨酸、琥珀酸、乙烷磺酸、乙酸、酒石酸、抗坏血酸、甲烷磺酸、延胡索酸、己二酸、苹果酸及其混合物。

3.按照权利要求1的组合物，其中所述组合物用于口服。

4.按照权利要求3的组合物，其中该药学上可接受的酸选自于下组：柠檬酸、谷氨酸、琥珀酸、乙烷磺酸、乙酸、酒石酸、抗坏血酸、甲烷磺酸、延胡索酸、己二酸、苹果酸及其混合物。

5.按照权利要求1-4中任一项的组合物，其中药学上可接受的酸与该活性固体颗粒的重量比在0.03和0.2之间。

6.按照权利要求1-4中任一项的组合物，其中所述活性固体颗粒的平均粒度为10-100μm。

7.按照权利要求1-4中任一项的组合物，其中所述活性固体颗粒的平均粒度为20-50μm。

8.按照权利要求1-4中任一项的组合物，其中所述活性固体颗粒的10％重量以下具有大于100μm的粒度。

9.按照权利要求1-4中任一项的组合物，其中所述活性固体颗粒的50％重量以下具有大于50μm的粒度。

10.按照权利要求1-4中任一项的组合物，其中所述活性固体颗粒的10％重量以下具有小于5μm的粒度。

11.按照权利要求1的组合物，其中该药学上可接受的酸是柠檬酸。

12.按照权利要求1的组合物，其中该药学上可接受的酸是抗坏血酸。

13.一种药物组合物，它含有

式(II)的化合物作活性剂：

一种药学上可接受的酸；

其中所述活性剂为活性固体颗粒形式，具有小于200μm的粒度并且平均粒度大于10μm，并且所述药学上可接受的酸的含量足以使所述药物组合物在与水接触时的pH值为2-6，其中所述药学上可接受的酸与所述活性固体颗粒的重量比在0.01和0.5之间。

14.按照权利要求13的组合物，其中所述药学上可接受的酸与所述活性固体颗粒的重量比在0.03和0.2之间。

15.按照权利要求13的组合物，其中所述组合物为固体制剂形式，并且其中所述活性固体颗粒在至少一种成粒剂的存在下成粒，以形成成粒后的活性固体颗粒。

16.按照权利要求15的组合物，其中在成粒之前所述活性固体颗粒具有小于200μm的粒度，并且平均粒度大于10μm。

17.按照权利要求16的组合物，其中所述活性固体颗粒的平均粒度在10和100μm之间。

18.按照权利要求15的组合物，其中所述成粒剂选自于下组：聚乙烯吡咯烷酮、水、乙醇、蔗糖、羟基纤维素及其混合物。

19.按照权利要求15的组合物，其中在所述成粒后的活性固体颗粒中，药学上可接受的酸与活性剂的重量比在0.01和0.5之间。

20.按照权利要求15的组合物，其中该药学上可接受的酸选自于下组：柠檬酸、谷氨酸、琥珀酸、乙烷磺酸、乙酸、酒石酸、抗坏血酸、甲烷磺酸、延胡索酸、己二酸、苹果酸及其混合物。

21.按照权利要求13的组合物，其中所述组合物为至少一种通式(I)和通式(II)的化合物的固体颗粒在液体中的悬浮液形式。

22.按照权利要求21的组合物，其中在形成所述悬浮液之前所述活性固体颗粒在至少一种成粒剂的存在下成粒，以形成成粒后的活性固体颗粒。

23.按照权利要求21的组合物，其中所述液体是水。

24.按照权利要求21的组合物，其中所述悬浮液的pH值为2-6。

25.按照权利要求21的组合物，其中所述悬浮液的pH值为3-5。

26.按照权利要求13的组合物，其中所述组合物为糊剂形式，包含至少一种通式(I)和通式(II)的化合物的活性固体颗粒，一种湿润剂和一种增稠剂。

27.按照权利要求26的组合物，其中该药学上可接受的酸选自于下组：柠檬酸、谷氨酸、琥珀酸、乙烷磺酸、乙酸、酒石酸、抗坏血酸、甲烷磺酸、延胡索酸、己二酸、苹果酸及其混合物。

28.按照权利要求26的组合物，其中所述活性固体颗粒的粒度小于200μm，其中颗粒重量的10％以下具有大于100μm的粒度，颗粒重量的50％以下具有大于50μm的粒度，并且颗粒重量的10％以下具有小于5μm的粒度。

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