ES2568436T3 - Procedimiento para controlar la farmacocinética en sangre de anticuerpos - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para producir un anticuerpo IgG modificado, con una semivida en sangre que se prolonga o se reduce en comparación con antes de la modificación del anticuerpo, en el que el procedimiento comprende: (a) modificar un ácido nucleico que codifica el anticuerpo para cambiar la carga de al menos un residuo de aminoácido que puede estar expuesto en la superficie del anticuerpo, en el que dicho al menos un residuo es un residuo de aminoácido en una región variable de la cadena pesada o cadena ligera del anticuerpo, y en el que se logra el cambio de carga por sustitución de aminoácidos; (b) cultivar una célula huésped para expresar el ácido nucleico; y (c) recoger el anticuerpo del cultivo de célula huésped.

Description

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La fig. 5 muestra los resultados del análisis de anticuerpos A69 humanizados (hA69a y hA69-N97R; hA69-N97R, hA69-p18 y hA69-PF) con regiones variables no modificadas o modificadas para determinar su actividad de unión al factor IXa de antígeno. Los resultados demuestran que los anticuerpos modificados con puntos isoeléctrico desplazados tienen una actividad de unión comparable a la de los anticuerpos no modificados.

La fig. 6 es un gráfico que muestra el resultado del análisis de anticuerpos B26 humanizados (hB26-F123e4 y hB26p15) con regiones variables no modificadas o modificadas, respectivamente, para determinar su actividad de unión al factor X de antígeno. Los resultados demuestran que el anticuerpo modificado con punto isoeléctrico desplazado tiene una actividad de unión comparable a la de los anticuerpos no modificados.

La fig. 7 es un gráfico que muestra las evoluciones temporales de las concentraciones plasmáticas de ATF, hA69-PF, BiAb y hB26-PF.

La fig. 8 muestra la correlación entre el pI y parámetros farmacocinéticos, aclaramiento (CL) y semivida (T1/2), para ATF, hA69-PF, BiAb, hB26-PF, hA69-N97R, hA69-p18, hB26-F123e4 y hB26-p15.

Descripción detallada

La presente divulgación proporciona procedimientos para el control de la farmacocinética de polipéptidos que comprenden un dominio de unión a FcRn en sangre. En un modo de realización preferente, los procedimientos de la presente invención comprenden cambiar la carga de al menos un residuo de aminoácido que puede estar expuesto en la superficie de dichos polipéptidos. Específicamente, se puede controlar la farmacocinética de estos polipéptidos en sangre desplazando su punto isoeléctrico (pI) cambiando la carga de sus residuos de aminoácidos.

Como se describe anteriormente, la farmacocinética en sangre de minicuerpos tales como scFv y Fab no se puede controlar necesariamente desplazando el pI. Se sabe que la excreción renal es la vía metabólica principal de dichos minicuerpos. Sin embargo, algunos de los documentos distintos de patente 19 a 22 describen que la eficacia de la filtración renal en la excreción renal es menor si la carga de proteína es más negativa, mientras que otros informan de que la carga de proteína no tiene influencia sobre la eficacia de la filtración renal. Además, algunos de los documentos distintos de patente 14 a 18 informan de que la semivida de un minicuerpo en sangre se puede prolongar disminuyendo su pI, mientras que otros informan de que se puede acortar disminuyendo su pI. Las proteínas filtradas a través del riñón se reabsorben por el túbulo proximal. Esta reabsorción se puede llegar a suprimir más cuando la carga de una proteína es más negativa. Esto sugiere que la semivida de un minicuerpo no se puede controlar de forma exacta como se pretende desplazando el pI.

Por otra parte, la vía metabólica principal de los anticuerpos IgG no es la excreción renal debido a que su peso molecular es relativamente alto. Se sabe que los anticuerpos IgG con Fc se reciclan por medio de la vía de rescate de FcRn expresada en las células endoteliales de vasos sanguíneos y similares, y por tanto tienen una semivida larga. Se asume que la IgG se metaboliza principalmente en las células endoteliales (documento distinto de patente 23). En consecuencia, se ha especulado con que las moléculas de IgG libres se metabolizan mientras que las moléculas de IgG incorporadas de forma no específica en células endoteliales se reciclan por medio de su unión a FcRn. Las IgG con una disminución en la actividad de unión a FcRn tienen una semivida más corta en sangre, mientras que su semivida en sangre se puede prolongar incrementando su actividad de unión a FcRn (documento distinto de patente 23). En consecuencia, se han llevado a cabo procedimientos previos para controlar la farmacocinética de las IgG en sangre alterando la actividad de unión a FcRn a través de la modificación de Fc. Por el contrario, el ejemplo 8 en el presente documento demuestran que cuando las IgG comparten el mismo dominio Fc, la semivida de la IgG se correlaciona con el pI mostrando un coeficiente de correlación alto independientemente del tipo de antígeno objetivo, y que la semivida en sangre de dos tipos de anticuerpos frente a diferentes antígenos se puede controlar en realidad modificando los pI de sus regiones variables sin modificar el Fc. Se supone que la tasa de captación de anticuerpo inespecífico por las células endoteliales depende de la interacción fisicoquímica de Coulomb entre una IgG y una superficie celular cargada negativamente. Por lo tanto, se cree que una disminución (un incremento) en el pI de IgG reduce (potencia) la interacción de Coulomb, y esto está seguido de una reducción (un incremento) en una captación inespecífica por células endoteliales, lo que da lugar a una disminución (un incremento) en el metabolismo en estas células, y como resultado, se puede controlar la farmacocinética en sangre. Puesto que la interacción de Coulomb entre la superficie celular cargada negativamente de las células endoteliales es una interacción fisicoquímica, se supone que la interacción no depende del antígeno objetivo. Por tanto, los procedimientos de la presente divulgación para controlar la farmacocinética en sangre son ampliamente aplicables a polipéptidos tales como IgG arbitrarias que comprenden un dominio de unión a FcRn que se reciclan por medio de la vía de rescate de FcRn y con una vía metabólica principal que no es la excreción renal, independientemente del tipo de antígeno.

Por tanto, los polipéptidos divulgados en el presente documento que comprenden un dominio de unión a FcRn no se limitan a anticuerpos IgG, sino que pueden ser cualquier proteína que se pueda unir (que tenga actividad o afinidad de unión) a un receptor Fc (FcRn). Por tanto, los polipéptidos divulgados en el presente documento que comprenden un dominio de unión a FcRn no están particularmente limitados; sin embargo, son preferentemente proteínas que comprenden dominio Fc de anticuerpo o dominio de tipo Fc. Los polipéptidos divulgados en el presente documento que comprenden un dominio de unión a FcRn incluyen, por ejemplo, anticuerpos IgG. Además, los polipéptidos

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FcRn, con una farmacocinética en sangre que está controlada, repitiendo las modificaciones de carga de superficie y la evaluación de la farmacocinética en sangre.

En monos Rhesus, el documento distinto de patente 24 informa de una comparación de la farmacocinética en sangre EP5C7.g4 quimérico, un anticuerpo quimérico (IgG4), y HuEP5C7.g4, un anticuerpo humanizado (IgG4), de los que ambos se derivan de un anticuerpo anti-E, P-selectina, en la que se descubrió que la farmacocinética era comparable entre sí. El documento distinto de patente 25 describe una comparación de la farmacocinética en sangre en macacos de Java entre ch5d8, un anticuerpo quimérico, y Hu5c8, un anticuerpo humanizado, de los que ambos se derivan de un anticuerpo anti-CD154, en la que se descubrió que la farmacocinética era comparable entre sí. El documento distinto de patente 26 demuestra que la farmacocinética en sangre en ratones de cCC49, un anticuerpo quimérico, era comparable a la de HuCC49, un anticuerpo humanizado. Además, los documentos distintos de patente 27 y 28 informa de que la farmacocinética y la distribución en sangre de los anticuerpos de ratón eran comparables a las de los anticuerpos humanizados cuando se evaluaron usando ratones. Puesto que tanto los Fc de ratón como los Fc humanos son reactivos con el FcRn de ratón, los hallazgos anteriores sugieren que la farmacocinética y la distribución en sangre de los anticuerpos quiméricos son comparables a las de los anticuerpos humanizados descritos anteriormente. Como se muestra por estos ejemplos, la farmacocinética de los anticuerpos quiméricos en sangre es comparable a la de los anticuerpos humanizados. Específicamente, cuando se humaniza un anticuerpo por un procedimiento conocido tal como el descrito en el documento distinto de patente 7, su farmacocinética en sangre es comparable a la de un anticuerpo quimérico. Por tanto, los anticuerpos humanizados con una farmacocinética en sangre que está controlada no se pueden producir por procedimientos conocidos.

Se pueden producir anticuerpos humanizados con una farmacocinética en sangre que está controlada (específicamente, se prolonga la semivida en sangre o se reduce la farmacocinética en sangre) en comparación con anticuerpos quiméricos desplazando sus pI a través de la modificación de aminoácidos de superficie en el momento de la humanización de anticuerpos quiméricos, usando los procedimientos descubiertos por la presente invención. La modificación de los aminoácidos de superficie para controlar la farmacocinética en sangre se puede realizar en el momento de la humanización o después de la humanización.

El documento distinto de patente 29 describe que la farmacocinética en sangre de tres tipos de anticuerpos humanizados, trastuzumab, bevacizumab y pertuzumab, obtenidos a través de la humanización usando la misma secuencia de FR de un anticuerpo humano, era casi la misma. Específicamente, la farmacocinética en sangre es casi la misma cuando se realiza la humanización usando la misma secuencia de FR. La concentración en sangre se puede controlar sólo cuando se desplazan los pI de los anticuerpos modificando los aminoácidos de superficie usando los procedimientos descubiertos por la presente invención, además del procedimiento de humanización descrito anteriormente.

Además, se pueden producir anticuerpos humanos, con una farmacocinética en sangre está controlada (específicamente, se prolonga la semivida en sangre o se reduce la farmacocinética en sangre) en comparación con los anticuerpos humanos originales desplazando los pI de anticuerpos humanos preparados a partir de colecciones de anticuerpos humanos o de ratones que producen anticuerpos humanos y similares, a través de la modificación de aminoácidos de superficie.

Los “anticuerpos” de la presente divulgación incluyen los anticuerpos obtenidos introduciendo adicionalmente sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones y similares de aminoácidos en las secuencias de aminoácidos de anticuerpos que ya se han modificado para cambiar las cargas de sus residuos de aminoácidos como se describe anteriormente. Los anticuerpos de la presente divulgación también incluyen los anticuerpos obtenidos cambiando adicionalmente la carga de los residuos de aminoácidos en anticuerpos con secuencias de aminoácidos que ya se han modificado por sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones de aminoácidos, quimerización, humanización o similares.

Se pueden lograr modificaciones de aminoácidos tales como sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones de aminoácidos, y quimerización y humanización, por procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Asimismo, las secuencias de aminoácidos de las regiones constantes y variables de anticuerpos que se usan para producir los anticuerpos divulgados en el presente documento como anticuerpos recombinantes también se pueden modificar por sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones de aminoácidos, o quimerización, humanización o similares.

Los anticuerpos divulgados en el presente documento pueden ser anticuerpos derivados de cualquier animal tal como un ratón, ser humano, rata, conejo, cabra o camello. Además, los anticuerpos pueden ser anticuerpos modificados, por ejemplo, anticuerpos quiméricos y en particular, anticuerpos humanizados que comprenden sustituciones de aminoácidos en su secuencia. Los anticuerpos también incluyen productos de modificación de anticuerpos unidos a diversas moléculas.

“Anticuerpos quiméricos” son anticuerpos preparados combinando secuencias derivadas de diferentes animales. Los anticuerpos quiméricos incluyen, por ejemplo, anticuerpos que comprenden regiones variables (V) de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo de ratón y regiones constantes (C) de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo humano. Se pueden preparar anticuerpos quiméricos por procedimientos conocidos, por ejemplo, por el siguiente

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determinar las secuencias de ADN que codifican las regiones variables de anticuerpos humanos que se unen a los antígenos. Una vez que se revelan las secuencias de ADN de los scFv que se unen a los antígenos, se pueden producir vectores de expresión adecuados en base a estas secuencias para obtener anticuerpos humanos. Estos procedimientos ya son bien conocidos, y se puede hacer referencia a los documentos WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438 y WO95/15388.

En cuanto a los procedimientos para obtener genes que codifican anticuerpos a partir de hibridomas, se pueden usar técnicas conocidas, que implican el uso de antígenos deseados o células que expresan los antígenos deseados como antígenos sensibilizantes, usando estos para realizar las inmunizaciones de acuerdo con los procedimientos de inmunización convencionales, fusionando las células inmunitarias así obtenidas con células originales conocidas por procedimientos de fusión celular habituales, cribando las células productoras de anticuerpos monoclonales (hibridomas) por procedimientos de cribado habituales, sintetizando los ADNc de regiones variables de anticuerpo (regiones V) a partir de los ARNm de los hibridomas obtenidos usando una transcriptasa inversa, y uniéndolos a los ADN que codifican las regiones constantes de anticuerpo deseado (regiones C).

Más específicamente, sin limitarse particularmente a los siguientes ejemplos, los antígenos sensibilizantes para obtener los genes de anticuerpo mencionados anteriormente que codifican las cadenas H y cadenas L incluyen tanto antígenos completos con inmunogenicidad como antígenos incompletos que comprenden haptenos y similares que no muestran inmunogenicidad. Por ejemplo, se pueden usar proteínas de longitud completa y péptidos parciales de proteínas de interés. Además, se sabe que las sustancias compuestas de polisacáridos, ácidos nucleicos, lípidos y similares se pueden convertir en antígenos. Por tanto, no existen limitaciones particulares sobre los antígenos de los anticuerpos de la presente invención. Se pueden preparar antígenos por procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, y se pueden preparar, por ejemplo, por los procedimientos que usan baculovirus (por ejemplo, véase el documento WO98/46777). Se pueden producir hibridomas, por ejemplo, por el procedimiento de Milstein et al. (G. Kohler y C. Milstein, Metods Enzymol. 1981, 73: 3-46). Cuando la inmunogenicidad de un antígeno es baja, se puede unir a una macromolécula que tenga inmunogenicidad, tal como albúmina, y a continuación usarse para la inmunización. Además, al unir los antígenos a otras moléculas en caso necesario, se pueden convertir en antígenos solubles. Cuando se usan moléculas transmembranarias tales como receptores como antígenos, se pueden usar porciones de las regiones extracelulares de los receptores como fragmentos, o se pueden usar células que expresan moléculas transmembranarias en su superficie celular como inmunógenos.

Se pueden obtener células productoras de anticuerpos inmunizando animales usando los antígenos sensibilizantes adecuados descritos anteriormente. De forma alternativa, se pueden preparar células productoras de anticuerpos por inmunización in vitro de linfocitos que pueden producir anticuerpos. Se pueden usar varios mamíferos como animales para la inmunización, en la que, en general, se usan roedores, lagomorfos y primates. Los ejemplos de dichos animales incluyen ratones, ratas y hámsteres para roedores, conejos para lagomorfos, y monos incluyendo macacos de Java, macacos de la India, hamadryas y chimpancés para primates. Además, también son conocidos animales transgénicos que llevan repertorios de genes de anticuerpos humanos, y se pueden obtener anticuerpos humanos usando estos animales (véase el documento WO96/34096; Mendez et al., Nat. Genet. 1997, 15: 146-56). En lugar de usar dichos animales transgénicos, por ejemplo, se pueden obtener los anticuerpos humanos deseados que tienen actividad de unión a antígenos deseados sensibilizando linfocitos humanos in vitro con los antígenos deseados o células que expresan los antígenos deseados, y a continuación fusionando los linfocitos sensibilizados con células de mieloma humano tales como U266 (véase la solicitud de patente japonesa Kokoku n.º H1-59878 (solicitud de patente japonesa examinada y aprobada publicada para oposición)). Además, se pueden obtener anticuerpos humanos deseados inmunizando animales transgénicos que llevan un repertorio completo de genes de anticuerpos humanos, con los antígenos deseados (véanse los documentos WO93/12227, WO92/03918, WO94/02602, WO96/34096 y WO96/33735).

La inmunización animal se puede llevar a cabo diluyendo y suspendiendo apropiadamente un antígeno sensibilizante en solución salina tamponada con fosfato (PBS), solución salina fisiológica o similares, y formando una emulsión mezclando un coadyuvante en caso necesario, seguido de una inyección intraperitoneal o subcutánea en los animales. Después de eso, el antígeno sensibilizante mezclado con adyuvante incompleto de Freund se administra preferentemente varias veces cada de cuatro a 21 días. Se puede confirmar la producción de anticuerpos midiendo la valoración del anticuerpo objetivo en el suero del animal usando procedimientos convencionales.

Se pueden fusionar células productoras de anticuerpos de linfocitos o animales inmunizados con un antígeno deseado con células de mieloma usando agentes de fusión convencionales (por ejemplo, polietilenglicol) para generar hibridomas (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986, 59-103). Cuando se requiera, se pueden cultivar y hacer crecer células de hibridoma, y se puede medir la especificidad de unión de los anticuerpos producidos a partir de estos hibridomas usando procedimientos de análisis conocidos tales como inmunoprecipitación, radioinmunoensayo (RIA) y un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Después de esto, se pueden subclonar hibridomas que producen anticuerpos en los que se ha determinado la especificidad, afinidad o actividad de interés por procedimientos tales como dilución limitante.

A continuación, se pueden clonar los genes que codifican los anticuerpos seleccionados a partir de hibridomas o células productoras de anticuerpos (linfocitos sensibilizados y similares) usando sondas que se pueden unir específicamente a los anticuerpos (por ejemplo, oligonucleótidos complementarios para las secuencias que codifican

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La presente divulgación también proporciona ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que comprenden polipéptidos (por ejemplo, anticuerpos humanizados) que comprenden un dominio de unión a FcRn, con una farmacocinética en sangre que está controlada por los procedimientos divulgados en el presente documento. Además, los vectores que llevan estos ácidos nucleicos se engloban por la presente divulgación.

La presente divulgación también proporciona células huésped que llevan los ácidos nucleicos descritos anteriormente. Las células huésped no están limitadas particularmente e incluyen, por ejemplo, E. Coli y células de diversos animales. Las células huésped se pueden usar, por ejemplo, como sistema de producción para producir y expresar los anticuerpos o los polipéptidos divulgados en el presente documento. Los sistemas de producción in vitro e in vivo están disponibles para sistemas de producción de polipéptidos. Los sistemas de producción que usan células eucariotas o células procariotas son ejemplos sistemas de producción in vitro.

Las células eucariotas que se pueden usar como célula huésped incluyen, por ejemplo, células animales, células vegetales y células fúngicas. Las células animales incluyen células de mamífero tales como CHO (J. Exp. Med. (1995) 108: 945), COS, HEK293, 3T3, mieloma, BHK (riñón de cría de hámster), HeLa y Vero; células de anfibios tales como ovocitos de Xenopus laevis (Valle, et al. (1981) Nature 291: 338-340); y células de insecto tales como Sf9, Sf21 y Tn5. En la expresión de los anticuerpos de la presente invención, se pueden usar de forma adecuada CHO-DG44, CHO-DX11B, células COS7, células HEK293 y células BHK. Entre las células animales, las células CHO son particularmente preferentes para la expresión a gran escala. Se pueden introducir vectores en una célula huésped por, por ejemplo, procedimientos con fosfato de calcio, procedimientos con DEAE-dextrano, procedimientos que usan liposomas catiónicos-DOTAP (Boehringer-Mannheim), procedimientos de electroporación o procedimientos de lipofección.

Las células vegetales incluyen, por ejemplo, células derivadas de Nicotiana tabacum y lenteja de agua (Lemna menor) conocido como sistema de producción de proteínas. Los callos se pueden cultivar a partir de estas células para producir los anticuerpos de la presente invención. Los sistemas de producción de proteínas conocidos son los que usan células fúngicas incluyendo células de levadura, por ejemplo, células del género Saccharomyces (tal como Saccharomyces cerevisiae y Saccharomyces pombe); y células de hongos filamentosos, por ejemplo, género Aspergillus (tal como Aspergillus niger). Estas células se pueden usar como huésped para producir los anticuerpos de la presente invención.

Se pueden usar células bacterianas en sistemas de producción procariotas. Los ejemplos de células bacterianas incluyen Bacillus subtilis así como E. Coli descritos anteriormente. Se pueden usar dichas células para producir los anticuerpos de la presente invención.

Cuando se produce un anticuerpo usando una célula huésped divulgada en el presente documento, el polinucleótido que codifica un anticuerpo de la presente invención se puede expresar cultivando la célula huésped transformada con un vector de expresión que contiene el polinucleótido. Se puede realizar el cultivo usando procedimientos conocidos. Por ejemplo, cuando se usan células animales como huésped, se pueden usar DMEM, MEM, RPMI 1640

o IMDM como medio de cultivo, y se pueden usar con o sin complementos de suero tales como FBS o suero fetal bovino (FCS). El pH preferente es de aproximadamente 6 a 8 durante el cultivo. El cultivo se realiza típicamente a una temperatura de aproximadamente 30 a 40 ºC durante aproximadamente de 15 a 200 horas. El medio se intercambia, se oxigena se agita, según sea necesario.

Por otra parte, se pueden usar sistemas de producción que usan animales o plantas como sistemas para producir polipéptidos in vivo. Por ejemplo, se introduce un polinucleótido de interés en un animal o planta y se produce el polipéptido en el cuerpo del animal o vegetal y después se recoge. Los “huéspedes” divulgados en el presente documento incluyen dichos animales y plantas.

Los animales que se van a usar para sistemas de producción incluyen mamíferos e insectos. Se pueden usar mamíferos tales como cabras, cerdos, ovejas ratones y reses (Vicki Glaser SPECTRUM Biotechnology Applications (1993)). De forma alternativa, los mamíferos pueden ser animales transgénicos.

Por ejemplo, se puede preparar un polinucleótido que codifica un anticuerpo de la presente invención como gen de fusión con un gen que codifica un polipéptido producido específicamente en la leche, tal como el gen β-caseína de cabra. Se inyectan fragmentos de polinucleótidos que contienen el gen de fusión en embriones de cabra, que a continuación se trasplantan en cabras hembra. Se puede obtener el anticuerpo deseado a partir de leche producida por las cabras transgénicas nacidas de las cabras que recibieron los embriones, o de sus crías. Se pueden administrar hormonas apropiadas a las cabras transgénicas para incrementar el volumen de leche que contiene el anticuerpo producido por las cabras (Ebert et al., Bio/Technology 12: 699-702 (1994)).

También se pueden usar insectos tales como gusanos de seda para producir los anticuerpos de la presente invención. Se pueden usar baculovirus que llevan un polinucleótido que codifica un anticuerpo de interés para infectar gusanos de seda, y se puede obtener el anticuerpo de interés de los fluidos corporales de los gusanos de seda (Susumu et al., Nature 315: 592-594 (1985)).

Las plantas usadas para producir los anticuerpos de la presente invención incluyen, por ejemplo, tabaco. Cuando se usa tabaco, se inserta un polinucleótido que codifica un anticuerpo de interés en un vector de expresión vegetal, por

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ejemplo, pMON 530, y a continuación se introduce el vector en una bacteria tal como Agrobacterium tumefaciens. A continuación, se usan las bacterias para infectar el tabaco tal como Nicotiana tabacum, y se puede obtener el anticuerpo deseado de las hojas (Ma et al., Eur. J. Immunol. 24: 131-138 (1994)). De forma alternativa, se infecta una lenteja de agua (Lemna menor) con bacterias similares y a continuación, se clona. Se puede obtener el anticuerpo deseado de las células de lenteja de agua clonada (Cox KM et al. Nat. Biotechnol. 2006 Dic; 24(12): 1591-1597).

Se puede aislar el anticuerpo resultante del interior o del exterior (tal como el medio y la leche) de células huésped, y se purifica como un anticuerpo homogéneo y sustancialmente puro. Los procedimientos para aislar y purificar los anticuerpos no se limitan a ningún procedimiento específico y se puede usar cualquier procedimiento estándar para aislar y purificar polipéptidos. Los anticuerpos se pueden aislar y purificar, seleccionando o combinando de forma apropiada, por ejemplo, columnas de cromatografía, filtración, ultrafiltración, desalado, precipitación con disolvente, extracción con disolvente, destilación, inmunoprecipitación, electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS, enfoque isoeléctrico, diálisis, recristalización y otros.

Las cromatografías incluyen, por ejemplo, cromatografías de afinidad, cromatografías de intercambio iónico, cromatografías hidrófobas, filtraciones en gel, cromatografías en fase inversa, y cromatografías de adsorción (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Estas cromatografías se pueden llevar a cabo usando cromatografías fase líquida tales como HPLC y FPLC. Los ejemplos de columnas de cromatografía de afinidad incluyen columnas de proteína A y columnas de proteína G. Los ejemplos de las columnas de proteínas A incluyen Hyper D, POROS y Sepharose F. F. (Pharmacia).

Se puede modificar libremente un anticuerpo y se pueden eliminar porciones peptídicas de él tratando el anticuerpo con una enzima modificadora de proteínas apropiada antes o después de la purificación del anticuerpo, según sea necesario. Dichas enzimas modificadoras de proteínas incluyen, por ejemplo, tripsinas, quimotripsinas, lisil endopeptidasas, proteína cinasas y glucosidasas.

Los procedimientos descritos anteriormente para producir polipéptidos como se divulga en el presente documento que comprenden un dominio de unión a FcRn, con una farmacocinética en sangre que está controlada, que comprenden cultivar células huésped de la presente invención y recoger los polipéptidos de los cultivos celulares, también son modos de realización preferentes de la presente invención.

Ejemplos

A continuación en el presente documento, se describe específicamente la presente invención con referencia a los ejemplos.

[Ejemplo 1] Humanización de anticuerpo biespecífico

Se humanizó un anticuerpo biespecífico que consistía en la combinación de VH-anticuerpo A69 anti-Factor IXa, VHanticuerpo B26 anti-Factor X, y cadena L híbrida (BBA), que se descubrió que era el más eficaz para acortar el tiempo de coagulación sanguínea en la solicitud de patente japonesa n.º 2005-112514, como se describe a continuación.

1-1. Búsqueda por homología de anticuerpos humanizados

Usando una base de datos construida obteniendo datos de secuencias de aminoácidos de anticuerpos humanos a partir de la base de datos Kabat divulgada públicamente (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/) y la base de datos IMGT (http://imgt.cines.fr/), se llevó a cabo la búsqueda por homología por separado para región variable de la cadena H-A69 de ratón (secuencia de aminoácidos; SEQ ID NO: 15), región variable de la cadena H-B26 de ratón (secuencia de aminoácidos; SEQ ID NO: 16), y región variable de la cadena L-BBA de ratón (secuencia de aminoácidos; SEQ ID NO: 17). Los resultados confirmaron que tienen homologías altas para las secuencias de anticuerpos humanos mostradas a continuación, y por tanto, se decidió que se iban a usar como regiones estructurales (a continuación en el presente documento abreviadas como FR) de los anticuerpos humanizados.

(1)

región variable de la cadena H-A69: KABATID-000064 (base de datos Kabat)

(Kipps et al., J. Clin. Invest. 1991; 87:2087-2096)

(2)

región variable de la cadena H-B26: N.º de acceso EMBL AB063872 (base de datos IMGT) (datos no publicados)

(3)

región variable de la cadena L-BBA: KABATID-024300 (base de datos Kabat)

(Welschof et al., J. Immunol. Method 1995; 179:203-214)

Se prepararon anticuerpos humanizados en los que se injertaron regiones determinantes de la complementariedad (a continuación en el presente documento abreviadas como CDR) de cada anticuerpo de ratón en las FR de los anticuerpos humanos (1)-(3).

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una incubadora con CO2 (37 °C, 5 % CO2). A continuación, se retiró el medio por succión, y se añadieron 6,9 ml de medio CHO-S-SFM-II (Invitrogen) que contenía suero bovino fetal al 1 % (Invitrogen). Se mezcló la solución de mezcla de ADN plasmídico preparada en el ejemplo 1-2 (total de 13,8 μg) con 20,7 μl de 1 μg/ml de polietilenimina (Polisciences Inc.) y 690 μl de medio CHO-S-SFMII, se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 10 minutos, a continuación se añadieron las células a las células en cada placa y se incubó en una incubadora con CO2 (37 °C, 5 % CO2) durante 4-5 horas. A continuación, se añadieron 6,9 ml de medio CHO-S-SFM-II (Invitrogen) que contenía suero bovino fetal al 1 % (Invitrogen) y a continuación se incubaron las células en una incubadora de CO2 durante 3 días. Se recuperó el sobrenadante de cultivo, a continuación se retiraron las células por centrifugación (aproximadamente a 2000 g durante 5 minutos a temperatura ambiente), y se esterilizó la solución pasándola a través de un filtro MILLEX®-GV de 0,22 μm (Millipore). Se almacenó la muestra a 4 ºC hasta su uso.

1-4. Purificación del anticuerpo biespecífico humanizado

Se añadieron 100 μl de rProtein A Sepharose ™ Fast Flow (Amersham Biosciences) al sobrenadante de cultivo obtenido de acuerdo con el procedimiento descrito en el ejemplo 1-2, y se mezcló la solución por inversión a 4 ºC durante 4 horas o más. Se transfirió la solución a un recipiente de filtro de 0,22 μm, Ultrafree®-MC (Millipore), y después de lavar 3 veces con 500 μl de TBS que contenía Tween® 20 al 0,01 %, se suspendió la resina rProtein A Sepharose ™ en 100 μl de solución de acetato de sodio 50 mM que contenía Tween® 20 al 0,01 % a pH 3,3 y se dejó en reposo durante 2 minutos. A continuación, se eluyó el anticuerpo, y se neutralizó inmediatamente el eluato añadiendo 6,7 μl de Tris-HCl 1,5 M, pH 7,8.

1-5. Cuantificación de la concentración de anticuerpo biespecífico humanizado

Se determinó la concentración de anticuerpo usando los siguientes dos tipos de procedimientos.

Se ajustó anti-IgG humana de cabra (Biosource International) a 1 μg/ml con un tampón de recubrimiento, y se inmovilizó en una placa Nunc-Immuno (Nunc). Después del bloqueo con un tampón de diluyente (D.B.), se añadió una muestra del sobrenadante de cultivo diluida de forma adecuada con D.B. Además, como patrón para calcular la concentración de anticuerpo, se añadió de forma similar IgG4 humana (anticuerpo anti-TF humanizado, véase el documento WO 99/51743) diluida con D.B. en una serie de dilución triple hasta once fases partiendo de 2000 ng/ml. Después de tres lavados, se hizo reaccionar una fosfatasa alcalina anti-IgG humana de cabra (Biosource International). Después de cinco lavados, se desarrolló el color usando sustrato de fosfatasa Sigma 104® (Sigma-Aldrich) como sustrato, y se midió la absorbancia a 405 nm en un lector de absorbancia Model 3550 (Bio-Rad Laboratories) con una longitud de onda de referencia de 655 nm. Usando el programa informático Microplate Manager III (Bio-Rad Laboratories), se calculó la concentración de IgG humana en el sobrenadante de cultivo a partir de la curva estándar.

Además, se cuantificó la concentración de anticuerpo usando Sensor Chip CM5 (BIACORE) en el que se había inmovilizado la proteína A, con Biacore 1000 o Biacore Q (BIACORE). Más específicamente, se preparó un chip de sensor con proteína A inmovilizada de acuerdo con el protocolo del fabricante haciendo reaccionar un chip de sensor activado con una solución de proteína A (SIGMA) diluida a 50 μg/ml con solución de acetato de sodio acuosa 10 mM (pH 4,0, BIACORE) a 5 μl/min durante 30 minutos, y realizando a continuación una operación de bloqueo. Se usó este chip de sensor para medir la concentración del sobrenadante de cultivo y el producto purificado usando BIAcore 1000 (BIACORE). Se usó el tampón HBS-EP (BIACORE) para la inmovilización del chip de sensor y para las medidas de concentración. Como patrón para las medidas de concentración, se usó anticuerpo IgG4 humanizado (anticuerpo anti-factor tisular humanizado, véase el documento WO 99/51743) diluido con tampón HBS-EP en una serie de dilución doble hasta seis fases comenzando a 4000 ng/ml.

1-6. Evaluación de la actividad de coagulación sanguínea de anticuerpo biespecífico humanizado

Para determinar si un anticuerpo biespecífico corrige la capacidad de coagulación de sangre hemofílica A, se examinaron los efectos del anticuerpo biespecífico sobre el tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPa) usando plasma deficitario en factor VIII. Se calentó una solución mezclada que comprende 50 μl de una solución de anticuerpo en varias concentraciones, 50 μl de plasma deficitario en factor VIII (Biomerieux), y 50 μl de reactivo TTPa (Dade Behring) a 37 ºC durante 3 minutos. Se inició la reacción de coagulación añadiendo 50 μl de CaCl2 20 mM(Dade Behring) a esta solución mezclada. Se midió el tiempo requerido para la coagulación con KC10A (Amelung) conectado con CR-A (Amelung).

Usando una curva de calibrado proporcionada definiendo el tiempo de coagulación de plasma deficitario en factor VIII como en el 0 % y el del plasma normal como en el 100 %, se calculó la actividad de tipo factor VIII (%) de un anticuerpo biespecífico a partir del tiempo de coagulación medido cuando se añadió el anticuerpo biespecífico.

1-7. Preparación de anticuerpo biespecífico humanizado que retiene la actividad de coagulación sanguínea

Para los anticuerpos biespecíficos humanizados que habían reducido su capacidad de coagulación sanguínea en la evaluación de la actividad de coagulación sanguínea descrita anteriormente, se modificaron los aminoácidos de sus FR de anticuerpo humano para incrementar sus actividades. Específicamente, se introdujeron mutaciones en la región variable del anticuerpo humanizado usando un kit de mutagénesis dirigida a sitio QuikChange (Stratagene) de

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Tabla 1

Nombre

Región variable de cadena H-A69 humanizado

Sitio de modificación

Aminoácido, SEQ ID NO:

hA69a

- 2

hA69-p18

Q43E, Q105E 7

hA69-N97R

N97R 9

Nombre

Región variable de cadena H-B26 humanizado

Sitio de modificación

Aminoácido, SEQ ID NO:

hB26-F123e4

- 4

hB26-p15

Q39K, Q43K, Q105R 10

[Ejemplo 4] Establecimiento de una línea celular que expresa un anticuerpo biespecífico derivado de anticuerpos A69 o B26 humanizados

Para preparar un anticuerpo biespecífico humanizado, se estableció una línea celular de expresión de anticuerpo por el procedimiento descrito a continuación.

Se amplificó una región constante de la cadena H por PCR usando un gen de la región constante de la cadena H de IgG4 humana natural como molde y usando un cebador 5’-terminal diseñado de modo que la secuencia de nucleótidos que codifica dos aminoácidos (Ala-Ser) en el lado N terminal de la región constante de la cadena H será una secuencia de reconocimiento Nhel (GCTAGC) y un cebador que se hibrida en el extremo 3’ y que lleva un sitio de reconocimiento Notl. A continuación, se unieron los fragmentos amplificados al vector pBluescriptKS (TOYOBO) digerido con Nhel y No I (ambos de Takara) para preparar pBCH4 (que comprende un gen de región constante de IgG4). Se realizó la PCR usando cebadores que son complementarios a la secuencia de nucleótidos 5’-terminal de las regiones variables de la cadena H del anticuerpo de cadena H-A69 humanizado (hA69-PFL: SEQ ID NO: 11) y anticuerpo de cadena H-B26 humanizado (hB26-PF: SEQ ID NO: 12) y que tienen una secuencia de Kozak (CCACC) y una secuencia de reconocimiento de EcoRI, y un cebador en la secuencia de nucleótidos 3’-terminal que tiene una secuencia de reconocimiento Nhel. Se digirieron los productos de PCR obtenidos con EcoRI y Nhel (ambos de Takara) y se insertaron en pBCH4 también digerido con EcoRI y Nhel, y a continuación las se unieron las regiones variables y las regiones constantes. Se digirió el vector preparado para el anticuerpo de cadena H-A69 humanizado con EcoRI y Notl (ambos de Takara), y a continuación se clonó en el vector de expresión de célula animal pCXND3 digerido con EcoRI y Notl. El procedimiento para la construcción del vector pCXND3 se describe a continuación.

Se escindió DHFR-∆E-rVH-PM 1-f (véase el documento WO92/19759) en los sitios de restricción EcoRI y Smal para separar el esqueleto del vector del gen de cadena H de anticuerpo. Sólo se recuperó el esqueleto del vector, y a continuación se clonó en él un adaptador EcoRI-NotI-BamHI (Takara). El vector resultante se denominó pCHOI. Se clonó la región de expresión génica DHFR derivada de pCHOI en pCXN (Niwa et al., Gene 108: 193-200 (1991)) en el sitio de restricción Hindlll. El vector resultante se denominó pCXND3. Además, se digirió el vector preparado para el anticuerpo de cadena H-B26 humanizado con EcoRI y Notl (ambos de Takara), y a continuación se clonó en el vector de expresión de célula animal pCXZD1 digerido con EcoRI y Notl. El vector pCXZD1 es un vector de expresión obtenido de pCXND3 sustituyendo el gen de resistencia a zeocina por el gen de resistencia a neomicina. Además, se preparó un vector de expresión de cadena L insertando la región variable de cadena L del anticuerpo de cadena L-BBA humanizado (hAL-s8; SEQ ID NO: 8) en un plásmido (pCAG-gκADN) que tiene una región constante de cadena L insertada de acuerdo con ejemplo 1-2. Se linealizaron los tres tipos preparados de vectores de expresión con enzimas de restricción y después se introdujeron en células CHO-DG44 para establecer una línea celular que expresa anticuerpos.

Se preparó una línea celular de expresión estable por el procedimiento descrito a continuación. Se introdujeron genes por electroporación usando GenePulserXcell (Bio-Rad). Se combinó cada vector de expresión de anticuerpo con 0,75 ml de células CHO suspendidas en PBS (1 x 107 células/ml). Se enfriaron las mezclas en hielo durante diez minutos, se transfirieron a cubetas, y se pulsaron a 1,5 kV y 25 μFD. Después de un periodo de restauración diez minutos a temperatura ambiente, se suspendieron las células electroporadas en 40 ml de medio CHO-S-SFMII (Invitrogen) que contenía 1x suplemento de HT (Invitrogen). Se diluyó la suspensión 10 veces con el mismo medio y se alicuotó en placas de cultivo de 96 pocillos a 100 μl/pocillo. Después de 24 horas de cultivo en una incubadora de CO2 (5 % CO2), se añadieron geneticina y zeocina (ambos de Invitrogen) a 0,5 mg/ml y 0,6 mg/ml, respectivamente. Se cultivaron las células durante dos semanas. Se realizaron secuencialmente cultivos de expansión para colonias de transformantes resistentes a fármacos. Se usó una línea celular de expresión alta establecida para el cultivo a gran escala para obtener el sobrenadante de cultivo.

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marcador de pI y los pI calculados a partir de la curva se muestran en la fig. 4. Se calcularon los pI en base a la movilidad de las bandas principales ya que cada muestra presentó heterogeneidad de carga derivada de anticuerpo.

El resultado mostró que se cambiaron las cargas de superficie debido a las diferencias en las secuencias de aminoácidos de las regiones variables y que se desplazaron los pI debido al cambio en la carga de superficie a través de modificaciones de aminoácidos. Los pI fueron los siguientes: aproximadamente 9,2 para hB26-PF, aproximadamente 8,7 para BiAb, aproximadamente 8,0 para hA69-PF, aproximadamente 7,2 para ATF, aproximadamente 8,9 para hA69-N97R, aproximadamente para hA69-p18, aproximadamente 8,7 para hB26-F123e4, y aproximadamente 9,0 para hB26-pl5. Se obtuvieron HA69-N97R, hA69-p18 y hA69-PF modificando la misma región variable de anticuerpo humanizado. Se pudo lograr un desplazamiento del pI de aproximadamente un 0,9 en hA69-PF en comparación con hA69-N97R, y se pudo lograr un desplazamiento del pI de aproximadamente 0,3 en hB26-p15 en comparación con hB26-F123e4. El examen descrito anteriormente demuestra que el pI se puede desplazar dependiendo de la secuencia de aminoácidos de una región variable así como por la modificación de un aminoácido de superficie en H10, H12, H23, H39, H43, H97, o H105 en una región variable seleccionada para cambiar su carga.

[Ejemplo 7] Evaluación de los anticuerpos humanizados A69 y B26 y formas modificadas de los mismos para determinar su actividad de unión

Se evaluaron las funciones del anticuerpo A69 humanizado y su forma modificada por el ensayo de sus actividades de unión al antígeno de Factor IXa, como se describe a continuación. Se evaluaron el anticuerpo A69 humanizado (hA69a) y su forma modificada, hA69-N97R, por el siguiente procedimiento. Se alicuotó (100 μl/pocillo) el factor IXaβ (Enzyme Research Laboratories) diluido a 1 μg/ml con un tampón de recubrimiento (bicarbonato de sodio 100 mM (pH 9,6), azida de sodio al 0,02 %) en una placa de Nunc-Immuno (una placa MaxiSorp™ de 96 MicroWell™ Nunc-Immuno™ (Nalge Nunc International)), y a continuación se incubó la placa durante la noche a 4 ºC. Después de lavar tres veces con PBS (-) que contenía Tween(R) 20, se bloqueó la placa con un tampón diluyente (Tris-HCl 50 mM (pH 8,1), seroalbúmina bovina al 1 %, MgCl2 1 mM, NaCl 0,15 M, Tween(R) 20 al 0,05 %, azida de sodio al 0,02 %) a temperatura ambiente durante dos horas. Después de la retirada del tampón, se añadieron los anticuerpos purificados diluidos con el tampón de diluyente a la placa a 100 μl/pocillo. A continuación, se incubó la placa a temperatura ambiente durante una hora. Después de que se lavara la placa tres veces, se añadió anticuerpo anti-IgG de ratón de cabra marcado con fosfatasa (BIOSOURCE) diluido a 1/4000 con el tampón de diluyente a 100 μl/pocillo. A continuación, se incubó la placa a temperatura ambiente durante una hora. Después de lavar la placa cinco veces, se añadió un sustrato cromogénico (Sigma) a 100 μl/pocillo. A continuación, se incubó la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se midió la absorbancia a 405 nm (referencia a 655 nm) usando el lector de microplacas Model 3550 (Bio-Rad Laboratories).

Se evaluaron los anticuerpos modificados (hA69-N97R, hA69-p18 y hA69-PF) usados en el ejemplo 8 por el siguiente procedimiento. Después de que se alicuotara (100 μl/pocillo) el factor IXa (Enzyme Research Laboratories) diluido a 1 μg/ml con un tampón de recubrimiento (tampón de carbonato-bicarbonato 0,05 M, pH 9,6) en una placa de Nunc-Immuno (una placa MaxiSorp™ de 96 MicroWell™ Nunc-Immuno™ (Nalge Nunc International)), se incubó la placa a 4 ºC durante la noche o durante un período más largo. Después de lavar tres veces con PBS que contenía Tween(R) 20 al 0,05 %, se añadió un tampón de diluyente (solución salina tamponada con Tris que contenía Tween 20 (pH 8,0) (Sigma), seroalbúmina bovina al 1 %, azida de sodio al 0,02 %) a la placa a 200 μl/pocillo. A continuación, se bloqueó la placa a temperatura ambiente durante dos horas. Después de la retirada del tampón, se añadieron los anticuerpos purificados diluidos con el tampón de diluyente a 100 μl/pocillo. A continuación, se incubó la placa durante la noche a 4 ºC. Después de lavar la placa tres veces, se añadió anti-IgG4 humana de ratón marcado con fosfatasa alcalina (Southern Biotechnology)) diluido a 1/500 con el tampón de diluyente a 100 μl/pocillo. Se incubó la placa a temperatura ambiente durante dos horas. Después de lavar la placa cinco veces, se añadió el sistema BluePhos Microwell Phosphatase Substrates System (Kirkegaard & Perry Laboratories) como sustrato a 100 μl/pocillo. A continuación, se incubó la placa a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. Se midió la absorbancia a 650 nm usando el lector de microplacas Vmax (Molecular Devices). Como se muestra en la fig. 5, los resultados demuestran que los anticuerpos en los que se había modificado la región variable para cambiar la carga de superficie mostraron una actividad de unión comparable a la de los anticuerpos originales antes de la modificación.

Además, se evaluaron las funciones del anticuerpo B26 humanizado hB26-F123e4 y su forma modificada, hB26-p15, por el ensayo de sus actividades de unión al antígeno de Factor X. Se alicuotó (100 μl/pocillo) el factor X (Enzyme Research Laboratories) diluido a 1 μg/ml con un tampón de recubrimiento (bicarbonato de sodio 100 mM (pH 9,6), azida de sodio al 0,02 %) en una placa de Nunc-Immuno (una placa MaxiSorp™ de 96 MicroWell™ Nunc-Immuno™), y a continuación se incubó la placa durante la noche a 4 ºC. Después de lavar tres veces con PBS (-) que contenía Tween(R) 20, se bloqueó la placa con un tampón diluyente (Tris-HCl 50 mM (pH 8,1), seroalbúmina bovina al 1 %, MgCl2 1 mM, NaCl 0,15 M, Tween(R) 20 al 0,05 %, azida de sodio al 0,02 %) a temperatura ambiente durante dos horas. Después de la retirada del tampón, se añadieron los anticuerpos purificados diluidos con el tampón de diluyente a 100 μl/pocillo a la placa. Se incubó la placa a temperatura ambiente durante una hora. Después de que se lavara la placa tres veces, se añadió anticuerpo anti-IgG de ratón de cabra marcado con fosfatasa (BIOSOURCE) diluido a 1/4000 con el tampón de diluyente a 100 μl/pocillo. A continuación, se incubó la placa a temperatura ambiente durante una hora. Después de lavar la placa cinco veces, se añadió un sustrato

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cromogénico (Sigma) a 100 μl/pocillo. A continuación, se incubó la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se midió la absorbancia a 405 nm (referencia a 655 nm) usando el lector de microplacas Model 3550 (Bio-Rad Laboratories). Como se muestra en la fig. 6, los resultados demostraron que el anticuerpo en el que se había modificado la región variable para cambiar la carga de superficie mostraron una actividad de unión comparable a la del anticuerpo original antes de la modificación.

Los hallazgos descritas anteriormente demuestran que las modificaciones de las regiones variables realizadas en los ejemplos no tienen influencia sobre la actividad de unión a antígeno de los anticuerpos.

[Ejemplo 8] Evaluación de los anticuerpos preparados para determinar la farmacocinética 8-1. Prueba de farmacocinética usando ratones

Se obtuvo el ATF como un anticuerpo monoclonal frente al factor tisular humano, y es un anticuerpo humanizado que comprende las regiones constantes de la IgG4 humana. El origen de ATF se describe en detalle en el documento WO99/051743. Las secuencias de aminoácidos de sus regiones variables de cadena H y cadena L se muestran en SEQ ID NO: 13 y 14, respectivamente. Se evaluaron HA69-PF, BiAb y hB26-PF preparados en el ejemplo 5, hA69-N97R, hA69-p18, hB26-e y hB26-p15 preparados en el ejemplo 3, y ATF para determinar la cinética in vivo en ratones (C57BL/6J; Charles River Japón, Inc.). Se administraron por vía intravenosa ATF, hA69-PF, BiAb y hB26-PF una vez a 5 mg/kg a los ratones (C57BL/6J; Charles River Japón, Inc.). Se extrajo sangre antes de la administración y 15 minutos, dos horas, ocho horas, y uno, dos, cuatro, siete, 11, 14, 21 y 28 días después de la administración. Se centrifugó de inmediato la sangre extraída a 4 ºC y 15.000 rpm durante 15 minutos para obtener plasma. Se almacenó el plasma separado en un congelador a -20 °C o menos hasta su uso. Asimismo, se administrar por vía intravenosa hA69-N97R, hA69-p18, hB26-F123e4 y hB26-p15 una vez a 1 mg/kg a ratones (C57BL/6J; Charles River, Japón, Inc.). Se extrajo sangre antes de la administración y 15 minutos, dos horas, ocho horas, y uno, dos, cinco, siete, nueve, 14, 21 y 28 días después de la administración. Se centrifugó de inmediato la sangre extraída a 4 ºC y 15.000 rpm durante 15 minutos para obtener plasma. Se almacenó el plasma separado en un congelador a -20 °C o menos hasta su uso.

8-2. Medida de la concentración plasmática por ELISA

Se determinaron las concentraciones plasmáticas en ratones por ELISA. Se prepararon muestras de plasma de curvas de calibrado de concentraciones plasmáticas 6,4, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4, 0,2, y 0,1 μg/ml. Se alicuotaron muestras de curvas estándar y muestras de plasma de ratón que se van a someter a prueba en inmunoplacas (placas MaxiSorp Nunc-Immuno (Nalge nunc International) inmovilizadas con un F(ab’)2 anti-IgG humana (específico de γcadena) (Sigma). Se dejaron las muestras en reposo a temperatura ambiente durante una hora, y a continuación se hicieron reaccionar con BIOT anti-IgG humana de cabra (Southern Biotechnology Associates) y conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina (Roche Diagnostics) sucesivamente. Se llevó a cabo el desarrollo de color usando el sistema BluePhos Microwell Phosphatase Substrates System (Kirkegaard & Perry Laboratories) como sustrato. Se midió la absorbancia a 650 nm usando un lector de microplaca. Se calcularon las concentraciones plasmáticas en ratones a partir de la absorbancia en la curva de calibración usando el programa informático de análisis SOFTmax PRO (Molecular Devices). Las evoluciones temporales de las concentraciones plasmáticas de ATF, hA69-PF, BiAb y hB26-PF se muestran en la fig. 7.

8-3. Procedimiento para calcular los datos farmacocinéticos

Se evaluaron los datos obtenidos sobre las evoluciones temporales de las concentraciones plasmáticas por un análisis independiente del modelo usando el programa informático de análisis farmacocinético WinNonlin (Pharsight) para calcular los parámetros farmacocinéticos (aclaramiento (CL), semivida (T1/2)). Se calculó la T1/2 a partir de las concentraciones plasmáticas en los tres últimos puntos o en la fase terminal seleccionada automáticamente por WinNonlin. Los parámetros farmacocinéticos determinados se muestran en la tabla 2.

Tabla 2

hA69-N97R

hA69-p18 hA69-PF ATF

pI

8,9 8,5 8,0 7,2

CL

ml/h/kg 0,412 0,300 0,204 0,136

T1/2

día 12,6 15,0 18,7 26,1

hB26-F123e4

hB26-p15 hB26-PF BiAb

pI

8,7 9,0 9,2 8,7

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Claims (1)

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