TW202237660A

TW202237660A - FcγRIIb特異性Fc區域變異體

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Publication number: TW202237660A
Application number: TW111104886A
Authority: TW
Inventors: 堅田仁; 門野正次郎; 味元風太; 井川智之
Original assignee: 日商中外製藥股份有限公司
Priority date: 2012-08-24
Filing date: 2013-08-23
Publication date: 2022-10-01
Also published as: TWI717591B; TW202340236A; RU2729831C2; CA2882272A1; ES2776681T3; SG11201500873XA; MX371442B; EP2889377A1; TWI766493B; KR20210084688A; JP6501521B2; CA2882272C; AU2013306700B2; JP2023154045A; JP7308039B2; KR20150045443A; AU2013306700A1; DK2889377T3; TWI697501B; TWI855488B

Abstract

(課題) 以提供與包含未導入胺基酸變異之Fc區域的多胜肽相比，對FcγRIIb的結合活性增強，及∕或與FcγRIIa(R型)相比，對FcγRIIb的結合選擇性增強之Fc區域變異體；包含該Fc區域變異體之多胜肽；包含該多胜肽之醫藥組成物；包含該醫藥組成物之免疫發炎性疾病的治療劑或預防劑；以及上述者的製作方法，更提供對FcγRIIb之結合活性增強，且與FcγRIIa(R型)相比，對FcγRIIb之結合選擇性增強之方法為課題。 (解決手段) 發現包含EU編號第238號之胺基酸變異及變異其他特定胺基酸變異變異組合之胺基酸序列的抗體Fc區域變異體之多胜肽，對FcγRIIb之結合活性增強，及∕或與FcγRIIa(R型)相比，對FcγRIIb之結合選擇性增強。

Description

FcγRIIb特異性Fc區域變異體

本發明係關於，抗體的Fc區域導入胺基酸變異者變異，與沒有導入胺基酸變異之Fc區域相比，對FcγRIIb的結合活性增強，及∕或與FcγRIIa(R型)相比，對FcγRIIb之結合選擇性增強之Fc區域變異體；包含該Fc區域變異體之多胜肽；以及包含該多胜肽之醫藥組成物。

抗體在血液中的安定性高，副作用又少，因此其作為醫藥品受到重視(非專利文獻1、非專利文獻2)。現今市面上之抗體藥物幾乎都是人類IgG1亞綱抗體。已知IgG類抗體的功能之一，係引起抗體依賴型細胞毒殺之活性(以下簡稱為ADCC活性)(非專利文獻3)。抗體為了展現ADCC活性，抗體之Fc區域必須與殺手細胞、自然殺手細胞、活化之巨噬細胞等存在於效應子細胞表面上的抗體結合受體Fcγ受體(以下簡稱為FcγR)結合。

已有報導人體中FcγR之蛋白質家族中，有FcγRIa (CD64A)、FcγRIIa (CD32A)、FcγRIIb (CD32B)、FcγRIIIa (CD16A)、FcγRIIIb (CD16B)之異構體，以及各種異型(非專利文獻7)。FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa具有免疫活化功能，因此稱為活化型FcγR，而FcγRIIb具有免疫抑制功能，稱為抑制型FcγR(非專利文獻8)。

關於Fc區域與FcγR之結合，抗體之鉸鏈區及CH2結構域內的一些胺基酸殘基，以及連接至CH2結構域之附加在EU編號第297號之Asn上的糖鏈，顯示出重要性(非專利文獻4、非專利文獻5、非專利文獻6)。以在這些位置導入變異之抗体為中心，研究直至目前為止，具有各式各樣FcγR結合特性之變異體，得到了對活化型FcγR有更高結合活性之Fc區域變異體(專利文獻1、專利文獻2、專利文獻3、專利文獻4)。

活化型FcγR與免疫複合體交聯，引起細胞內結構域或相互作用對象FcR common γ-chain中所包含之免疫受體酪氨酸激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activating motifs，ITAMs)的磷酸化，活化信號傳遞物質SYK，開始活化信號之級聯反應(cascade)，而引發發炎性免疫反應(非專利文獻9)。

FcγRIIb是在B細胞上唯一表現的FcγR(非專利文獻10)。根據報告，透過和對FcγRIIb之抗體的Fc區域相互作用，抑制了B細胞的初次免疫(非專利文獻11)。另外，已有報導，B細胞上之FcγRIIb與B細胞受體(B cell receptor，BCR)會透過血液中的免疫複合體進行交聯，抑制B細胞之活化，從而抑制B細胞產生抗體(非專利文獻12)。透過BCR與FcγRIIb之免疫抑制信號的傳遞，FcγRIIb之細胞內結構域中所包含之免疫受體酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)係必要的(非專利文獻13、非專利文獻14)。信號傳入，使得ITIM磷酸化、招集含-SH2多磷酸肌醇5-磷酸酶(SH2-containing inositol polyphosphate 5-phosphatase，SHIP)、阻礙其他活化型FcγR之信號級聯的傳遞、抑制發炎性免疫反應(非專利文獻15)。另外，已有報導，透過僅FcγRIIb之締合化，使得非-BCR依賴性的生產IgM的B細胞不會發生細胞凋亡，能暫時性地抑制B細胞之增殖以及因BCR之交聯而產生的鈣離子內流(非專利文獻16)。

又，FcγRIIb也會表現於樹突細胞、巨噬細胞、活化之嗜中性球、肥大細胞、嗜鹼性球上。在這些細胞中，FcγRIIb透過吞噬作用或釋放發炎性細胞介素等方式，阻礙FcγR之功能，抑制發炎性免疫反應(非專利文獻8)。

迄今，已透過使用FcγRIIb基因剔除小鼠進行研究，揭露了關於FcγRIIb之免疫抑制功能的重要性。根據報告，FcγRIIb基因剔除小鼠之體液免疫沒有受到充足的控制(非專利文獻17)，其對於膠原蛋白誘發之關節炎(CIA)之敏感度增加(非專利文獻18)，或者會表現出類似狼瘡(Lupus)的症狀、類似古巴士德氏症候群(Goodpasture)的症狀(非專利文獻19)。

此外，亦有報告指出FcγRIIb功能失調與人類自體免疫疾病有相關。例如，根據報告，FcγRIIb的啟動子區域或細胞跨膜區域中之基因多型性，與全身性紅斑狼瘡(SLE)之發病率間具有關聯性(非專利文獻20、非專利文獻21、非專利文獻22、非專利文獻23、非專利文獻24)，或者SLE患者的B細胞表面上FcγRIIb的表現量會減少(非專利文獻25、非專利文獻26)。

從這些小鼠模型以及臨床知識，FcγRIIb被認為，特別是透過B細胞之參與，發揮了控制自體免疫疾病、發炎性疾病之功效，係用於控制自體免疫疾病、發炎性疾病之有潛能的目標分子。

已知市面上販售之抗體藥物主要係使用IgG1，其不僅只對應FcγRIIb，亦會與活化型FcγR強力地結合(非專利文獻27)。透過利用對FcγRIIb之結合增強、或者與活化型FcγR相比之下對FcγRIIb之結合選擇性向上提升之Fc區域，可以開發與IgG1相比之下具有免疫抑制性質之抗體藥物。舉例而言，利用具有對與BCR結合之可變區及FcγRIIb的結合能力增強之Fc的抗體，已知能夠阻礙B細胞之活化 (非專利文獻28)。根據報告，B細胞上之FcγRIIb與結合在B細胞受體之IgE，透過交聯作用，使得B細胞分化出漿細胞，導致IgE的產生受到抑制，而在移植了人類PBMC的小鼠體內，人類IgG與IgM之濃度雖維持不變，但人類IgE之濃度減少(非專利文獻29)。不僅只是IgE，根據報告，在B細胞受體之複合體的構成分子CD79b與FcγRIIb和抗體交聯的情況下，在體外(試管內)B細胞之增殖會受到抑制，在膠原蛋白關節炎模型中則能緩和其症狀(非專利文獻30)。B細胞以外亦然，根據報告，使用將與IgE之受體FcεRI結合之IgE的Fc部分、以及對FcγRIIb之結合增強之IgG的Fc部分融合之分子，透過肥大細胞上的FcεRI與FcγRIIb之交聯作用，引起FcγRIIb之磷酸化，抑制FcεRI依賴性鈣離子內流；已提出藉由增強對FcγRIIb之結合力，並通過刺激FcγRIIb，能夠阻礙去顆粒反應(非專利文獻31)。根據上文，具有對FcγRIIb之結合力向上提升的Fc之抗體，被表明為用於治療自體免疫疾病等發炎性疾病之有潛力的治療藥物。

此外，根據報告，在抗體和抗原之免疫複合體存在的情況下，藉由LPS刺激，透過Toll-like receptor 4抑制樹突細胞、巨噬細胞之活化；這些效果亦可透過免疫複合體之FcγRIIb產生作用(非專利文獻32，33)。因此，透過使用對FcγRIIb之結合增強的抗體，期望能夠增強通過TLR抑制活性信號之作用，被表明為係用於治療自體免疫疾病等發炎性疾病之有潛力的治療藥物。

此外，對FcγRIIb之結合增強的變異體，被表明係除了用於治療自體免疫疾病等發炎性疾病以外，也是治療癌症之有潛力的治療藥物。至今，已知FcγRIIb對於抗-TNF受體超家族之促效劑抗體的促效劑活性，扮演了重要的角色。具體而言，對應TNF受體家族中所包含之CD40、DR4、DR5、CD30、CD137的抗體之促效劑活性中，與FcγRIIb之相互作用是必要的(非專利文獻34、35、36、37、38、39、40)。在非專利文獻34中顯示，透過使用對FcγRIIb之結合增強的抗體，會使得抗-CD40抗體之抗腫瘤效果增強。因此，對FcγRIIb之結合增強的抗體，以對應抗-TNF受體超家族之抗體為首，預期會有增強促效劑抗體之促效劑功能的效果。除此之外，亦指出，使用能辨識其中一種受體酪胺酸激酶(Receptor Tyrosine kinase，RTK)——Kit——之抗體，透過在Kit表現細胞上交聯Kit與FcγRIIb，能抑制細胞的增殖。根據報告，Kit會持續保持活化狀態，在具有如促進癌變之變異的情況下，依然具有同樣的效果(非專利文獻41)。因此，透過使用對FcγRIIb之結合增強的抗體，對表現出具有持續保持活化狀態之變異的RTK之細胞，期待能夠有增強的抑制效果。

根據報告，至今已有具有對FcγRIIb之結合活性向上增加之Fc的抗體(非專利文獻28)。此文獻中，透過在抗體的Fc區域中加入S267E ∕ L328F、G236D ∕ S267E、S239D ∕ S267E等變異，而使得對FcγRIIb之結合活性向上提升。其中，導入了S267E ∕ L328F變異之抗體與FcγRIIb之結合能力最強，而對FcγRIa以及對FcγRIIa之第131號殘基為His之FcγRIIa H型的結合力，則維持在與天然IgG1相同的程度。然而，根據其他的報告，此變異中，對FcγRIIa之第131號殘基為His之FcγRIIa R型的結合力，比起對FcγRIIb之結合力要強上數百倍，與FcγRIIa R型相比之下，對FcγRIIb之結合選擇性並無向上改善(專利文獻5)。

對FcγRIIb之結合沒有增強、僅對FcγRIIa之結合增強的效果，被認為會對沒有表現FcγRIIb而表現了FcγRIIa之如血小板等細胞(非專利文獻8)產生影響。舉例而言，已知，在接受了對應VEGF之抗體bevacizumab投藥的患者群中，血栓栓塞之風險會提高(非專利文獻42)。另外，在對應CD40配位子(ligand)之抗體的臨床開發實驗中，同樣也觀察到血栓栓塞的症狀，因而中止了臨床實驗(非專利文獻43)。任何這些抗體，透過使用動物模型等來進行其後的研究，投入之抗體通過與血小板上之FcγRIIa結合，使得血小板凝聚、產生血栓(非專利文獻44、非專利文獻45)。根據報告，在自體免疫疾病之一的全身性紅斑狼瘡中，係透過FcγRIIa依賴性機制來活化血小板，而血小板的活化與病情嚴重程度相關(非專利文獻46)。若是對原本血栓栓塞發作風險已高的患者，投入對FcγRIIa之結合力增強的抗體，會更加提高血栓栓塞發作的風險，極度危險。

此外，根據報告，對FcγRIIa之結合增強的抗體，透過巨噬細胞增強了抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)之活性(非專利文獻47)。與該抗體結合之抗原在被巨噬細胞吞噬的同時，該抗體本身也會被吞噬。在將抗體作為藥物投藥之情況下，假設來自該投入抗體之胜肽片段也變得容易被抗原呈現，可預想對抗該抗體藥物之抗體(抗藥品抗體)產生的風險會上升。亦即，對FcγRIIa之結合增強，會使抗藥品抗體產生的風險增加，作為藥品之價值會大幅減少。另外，樹突細胞上之FcγRIIb會透過由抗原與抗體所組成之免疫複合體，抑制樹突細胞的活性，或者是通過活化型Fcγ受體，抑制對T細胞之抗原呈現，而有助於周邊免疫耐受性(非專利文獻48)。因為樹突細胞上亦表現出FcγRIIa，所以使用具有對FcγRIIb之選擇性結合增強之Fc的抗體作為藥品的情況下，由於對FcγRIIb之選擇性結合增強了，難以對樹突細胞等進行抗原呈現，產生抗藥品抗體之風險亦相對地降低，此特點被認為是相當有用的。亦即，對FcγRIIa之結合增強，會使得因血小板凝聚而產生血栓的風險上升、提高免疫原性、增加抗藥品抗體產生的風險，而令其作為藥品之價值大幅減少。

從這個觀點來看，關於前述之對FcγRIIb之結合力增強的Fc變異體，對FcγRIIa R型之結合，與天然IgG1相比之下，因為有顯著地增強，其作為具有FcγRIIa R型之患者的藥品之價值大幅地減少。據觀察，在白種人(Caucasian)與非裔美洲人(African-American)體內，FcγRIIa之H型與R型幾乎為同一頻率(非專利文獻49、非專利文獻50)。因此，在將此Fc變異體用於治療自體免疫疾病的情況下，能夠同時享受其作為藥物的治療效果、又能夠安全地使用之患者的數量是有限制的。

此外，根據報告，在缺少FcγRIIb的樹突細胞，或者是在透過抗-FcγRIIb抗體來阻礙FcγRIIb與抗體之Fc部分間的相互作用的樹突細胞之中，樹突細胞會成熟化(非專利文獻51、非專利文獻52)。根據此報告表示，FcγRIIb在沒有發炎等症狀、沒有被活化的穩定狀態下，會抑制樹突細胞的成熟。因為樹突細胞表面上除了FcγRIIb之外亦會表現出FcγRIIa，所以即使對例如抑制型FcγRIIb之結合增強，若是對活化型FcγRIIa等之結合也增強的話，結果仍是會促進樹突細胞的成熟。亦即，不僅只是對FcγRIIb之結合活性，改善對FcγRIIb之結合活性與對FcγRIIa之結合活性的比率，導致抗體之免疫抑制的效果提升，也被認為是重要的。因此，在利用通過與FcγRIIb結合所達到的免疫抑制效果來製造藥品的情況下，不僅只要增強對FcγRIIb之結合活性，對FcγRIIa H型、R型任一基因多型之結合亦要維持在與天然IgG1相同的程度、甚至更減弱之Fc變異體是必要的。

另一方面，根據報告，直到目前為止，有透過在Fc區域導入胺基酸變異，使得對FcγRIIb之結合選擇性向上提升的例子(非專利文獻53)。然而，該文獻中報告之任何改善了對FcγRIIb之選擇性的變異體，與天然IgG1相比，對FcγRIIb之結合能力均下降。因此，這些變異體要實際透過FcγRIIb引起超過IgG1的免疫抑制反應，被認為相當困難。

另外在先前描述之促效劑抗體中，因為FcγRIIb也發揮了重要的作用，所已透過增強其結合活性，亦可期望增強促效劑之活性。然而，因為對FcγRIIa之結合活性同樣也增強了，故會展現出非欲求目的之ADCC活性和ADCP活性等，恐怕會帶來副作用。從這個觀點來看，較佳者亦為能夠增強對FcγRIIb之選擇性結合活性者。

根據這些結果，在利用FcγRIIb，製造出目的為用於治療自體免疫疾病或癌症之抗體藥物時，與天然IgG相比之下，對FcγRIIa之任何基因多型的結合活性均維持不變或者減少，並且對FcγRIIb之結合活性增強，是相當重要的。然而，FcγRIIb與活化型FcγR之一的FcγRIIa之間，兩者的細胞外區域序列有93%是一致的，結構極為相似，進一步，FcγRIIa存在有基因多型，第131號胺基酸為His者為H型(H type)，為Arg者為R型(R type)，各者與抗體間的相互作用具有差異(非專利文獻54)。因此，要製造出能夠辨別FcγRIIa與FcγRIIb兩個極為類似的序列，同時，與FcγRIIa的兩種基因多型相比之下，對FcγRIIb之選擇性結合增強之Fc區域變異體，被認為是困難的課題，事實上至今仍未獲得對FcγRIIb具有充分的結合活性與選擇性之變異體。在專利文獻5中，也報告出對FcγRIIb之結合活性增強之變異體，但其程度偏弱，需要開發具有上述性質之變異體。先前發明文獻專利文獻

[專利文獻１]WO 2000∕42072 [專利文獻２]WO 2006∕019447 [專利文獻３]WO 2004∕99249 [專利文獻４]WO 2004∕29207 [專利文獻５]US2009∕0136485 非專利文獻

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發明所欲解決的課題

有鑑於這些狀況，本發明之目的為，透過在抗體之Fc區域導入胺基酸變異，製造出與沒有導入胺基酸變異之Fc區域相比，對FcγRIIb之結合活性增強，及∕或與FcγRIIa(R型)相比，對FcγRIIb之結合選擇性增強之Fc區域變異體，本發明提供包含該Fc區域變異體之多胜肽，及包含該多胜肽之醫藥組成物。用以解決課題的手段

本發明人等對於在Fc區域中導入胺基酸變異，製造出與沒有導入胺基酸變異之Fc區與相比，對FcγRIIb之結合增強，並且，與FcγRIIa(R型)相比，對FcγRIIb之結合選擇性增強之Fc區域變異體、對包含該Fc區域變異體之多胜肽進行相關之廣泛研究。結果，本發明人等發現，Fc區域之EU編號第238號胺基酸變異之Fc區域變異體，組合其他胺基酸變異，對FcγRIIb之結合選擇性增強，及∕或與FcγRIIa(R型)相比，對FcγRIIb之結合選擇性增強。

亦即，本發明有關下列所述者。 [1] 一種Fc區域變異體，其為EU編號第238號之胺基酸，以及，選自EU編號第233號之胺基酸、第234號之胺基酸、第235號之胺基酸、第237號之胺基酸、第264號之胺基酸、第265號之胺基酸、第266號之胺基酸、第267號之胺基酸、第268號之胺基酸、第269號之胺基酸、第271號之胺基酸、第272號之胺基酸、第274號之胺基酸、第296號之胺基酸、第326號之胺基酸、第327號之胺基酸、第330號之胺基酸、第331號之胺基酸、第332號之胺基酸、第333號之胺基酸、第334號之胺基酸、第355號之胺基酸、第356號之胺基酸、第358號之胺基酸、第396號之胺基酸、第409號之胺基酸、及第419號之胺基酸之至少一個胺基酸，改變成其他胺基酸之Fc區域變異體；該變異體對Fcγ受體之結合活性為 [包含未導入胺基酸變異之Fc區域的多胜肽對FcγRIIb 之KD值]∕[包含Fc區域變異體的多胜肽對FcγRIIb 之KD值]的數值為15.0以上。 [2] 如[1]記載之Fc區域變異體，其中EU編號第238號之胺基酸、第268號之胺基酸，以及第271號之胺基酸被改變成其他胺基酸，且更選自EU編號第233號之胺基酸、第237號之胺基酸、第264號之胺基酸、第267號之胺基酸、第272號之胺基酸、第296號之胺基酸、第327號之胺基酸、第330號之胺基酸、第332號之胺基酸、及第396號之胺基酸之至少一個胺基酸改變成其他胺基酸。 [3] 一種Fc區域變異體，其為具有EU編號第238號之胺基酸為Asp，以及，選自EU編號第233號之胺基酸為Asp，第234號之胺基酸為Tyr，第235號之胺基酸為Phe，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第265號之胺基酸為Glu，第266號之胺基酸為Phe、Leu或Met，第267號之胺基酸為Ala、Glu、Gly或Gln，第268號之胺基酸為Asp、Gln或Glu，第269號之胺基酸為Asp，第271號之胺基酸為Gly，第272號之胺基酸為Asp、Phe、Ile、Met、Asn、Pro或Gln，第274號之胺基酸為Gln，第296號之胺基酸為Asp或Phe，第326號之胺基酸為Ala或Asp，第327號之胺基酸為Gly，第330號之胺基酸為Lys、Arg或Ser，第331號之胺基酸為Ser，第332號之胺基酸為Lys、Arg、Ser或Thr，第333號之胺基酸為Lys、Arg、Ser或Thr，第334號之胺基酸為Arg、Ser或Thr，第355號之胺基酸為Ala或Gln，第356號之胺基酸為Glu，第358號之胺基酸為Met，第396號之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr，第409號之胺基酸為Arg，以及，第419號之胺基酸為Glu之至少一個胺基酸之Fc區域變異體，該Fc區域變異體對Fcγ受體之結合活性為 [包含未導入胺基酸變異之Fc區域的多胜肽對FcγRIIb 之KD值]∕[包含Fc區域變異體的多胜肽對FcγRIIb 之KD值]的數值為15.0以上。 [4] 如[3]之Fc區域變異體，其為具有EU編號第238號之胺基酸為Asp，第268號之胺基酸為Asp或Glu，以及第271號之胺基酸為Gly，且更具有選自第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala或Gly，第272號之胺基酸為Asp或Pro，第296號之胺基酸為Asp，第327號之胺基酸為Gly，第330號之胺基酸為Arg，第332號之胺基酸為Thr，以及，第396號之胺基酸為Leu或Met之至少一個胺基酸。 [5] 如[1]至[4]任一項記載之Fc區域變異體，其中，[包含未導入胺基酸變異之Fc區域的多胜肽對FcγRIIb 之KD值]∕[包含Fc區域變異體的多胜肽對FcγRIIb 之KD值] 之數值為50.0以上。 [6] 如[1]至[4] 任一項記載之Fc區域變異體，其中，[包含未導入胺基酸變異之Fc區域的多胜肽對FcγRIIb 之KD值]∕[包含Fc區域變異體的多胜肽對FcγRIIb 之KD值] 之數值為100.0以上。 [7] 如[1]至[6]任一項記載之Fc區域變異體，其中，[包含Fc區域變異體的多胜肽對FcγRIIa(R型)之KD值]∕[包含Fc區域變異體的多胜肽對FcγRIIb之KD值] 之數值為10.0以上。 [8] 如[1]至[6]任一項記載之Fc區域變異體，其中，[包含Fc區域變異體的多胜肽對FcγRIIa(R型)之KD值]∕[包含Fc區域變異體的多胜肽對FcγRIIb之KD值] 之數值為20.0以上。 [9] 如[1]至[8] 任一項記載之Fc區域變異體，其中該Fc區域變異體包含下列(a)~(x) 任一者記載之胺基酸變異: (a) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第237號、第268號、第271號、第296號以及第330號之胺基酸變異， (b) Fc區域之EU編號第238號、第237號、第268號、第271號、第296號以及第330號之胺基酸變異， (c) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第237號、第268號、第271號、第296號、第330號以及第332號之胺基酸變異， (d) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第237號、第264號、第267號、第268號、第271號以及第330號之胺基酸變異， (e) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第237號、第267號、第268號、第271號、第296號、第330號以及第332號之胺基酸變異， (f) Fc區域之EU編號第238號、第237號、第267號、第268號、第271號、第296號、第330號以及第332號之胺基酸變異， (g) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第237號、第268號、第271號、第296號、第327號以及第330號之胺基酸變異， (h) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第237號、第264號、第267號、第268號以及第271號之胺基酸變異， (i) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第237號、第264號、第267號、第268號、第271號、第296號以及第330號之胺基酸變異， (j) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第237號、第264號、第267號、第268號、第271號、第296號、第330號以及第396號之胺基酸變異， (k) Fc區域之EU編號第238號、第237號、第264號、第267號、第268號、第271號以及第330號之胺基酸變異， (l) Fc區域之EU編號第238號、第237號、第264號、第267號、第268號、第271號、第296號以及第330號之胺基酸變異， (m) Fc區域之EU編號第238號、第264號、第267號、第268號以及第271號之胺基酸變異， (n) Fc區域之EU編號第238號、第264號、第267號、第268號、第271號以及第296號之胺基酸變異， (o) Fc區域之EU編號第238號、第237號、第267號、第268號、第271號、第296號以及第330號之胺基酸變異， (p) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第237號、第264號、第267號、第268號、第271號、第330號以及第396號之胺基酸變異， (q) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第237號、第264號、第267號、第268號、第271號、第296號、第327號、第330號以及第396號之胺基酸變異， (r) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第237號、第264號、第267號、第268號、第271號、第272號以及第296號之胺基酸變異， (s) Fc區域之EU編號第238號、第237號、第264號、第267號、第268號、第271號、第272號以及第330號之胺基酸變異， (t) Fc區域之EU編號第238號、第237號、第264號、第267號、第268號、第271號、第272號、第296號以及第330號之胺基酸變異， (u) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第264號、第267號、第268以及第271號之胺基酸變異， (v) Fc區域之EU編號第238號、第237號、第267號、第268號、第271號、第296號以及第330號之胺基酸變異， (w) Fc區域之EU編號第238號、第264號、第267號、第268號、第271號、第272號以及第296號之胺基酸變異， (x) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第264號、第267號、第268號、第271號以及第296號之胺基酸變異。 [10] 如[1]至[8]任一項記載之Fc區域變異體，其中該Fc區域變異體具有下列(a)~(x) 任一者記載之胺基酸序列: (a) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第268號之胺基酸為Asp，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，以及第330號之胺基酸為Arg的胺基酸序列； (b) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第268號之胺基酸為Asp或Glu，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，以及第330號之胺基酸為Arg的胺基酸序列； (c) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第268號之胺基酸為Asp，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，第330號之胺基酸為Arg，以及第332號之胺基酸為Thr的胺基酸序列； (d) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Gly或Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，以及第330號之胺基酸為Arg的胺基酸序列； (e) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，第330號之胺基酸為Arg，以及第332號之胺基酸為Thr的胺基酸序列； (f) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，第330號之胺基酸為Arg，以及第332號之胺基酸為Thr的胺基酸序列； (g) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第268號之胺基酸為Asp，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，第327號之胺基酸為Gly，以及第330號之胺基酸為Arg的胺基酸序列； (h) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，以及第271號之胺基酸為Gly的胺基酸序列； (i) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，以及第330號之胺基酸為Arg的胺基酸序列； (j) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，第330號之胺基酸為Arg，以及第396號之胺基酸為Met或Leu的胺基酸序列； (k) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，以及第330號之胺基酸為Arg的胺基酸序列； (l) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，以及第330號之胺基酸為Arg的胺基酸序列； (m) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，以及第271號之胺基酸為Gly的胺基酸序列； (n) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，以及第296號之胺基酸為Asp的胺基酸序列； (o) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第267號之胺基酸為Ala或Gly，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，以及第330號之胺基酸為Arg的胺基酸序列； (p) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第330號之胺基酸為Arg，以及第396號之胺基酸為Met或Leu的胺基酸序列； (q) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，第327號之胺基酸為Gly，第330號之胺基酸為Arg，以及第396號之胺基酸為Met的胺基酸序列； (r) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第272號之胺基酸為Asp，以及第296號之胺基酸為Asp的胺基酸序列； (s) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第272號之胺基酸為Pro，以及第330號之胺基酸為Arg的胺基酸序列； (t) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第272號之胺基酸為Pro，第296號之胺基酸為Asp，以及第330號之胺基酸為Arg的胺基酸序列； (u) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，以及第271號之胺基酸為Gly的胺基酸序列； (v) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第267號之胺基酸為Gly，第268號之胺基酸為Asp，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，以及第330號之胺基酸為Arg的胺基酸序列； (w) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第272號之胺基酸為Asp，以及第296號之胺基酸為Asp的胺基酸序列； (x) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，以及第296號之胺基酸為Asp的胺基酸序列。 [11] 一種Fc區域變異體，其係由選自序列編號43~68、序列編號70、序列編號71及序列編號75~77之任一個胺基酸序列所構成。 [12] 一種多胜肽，其為包含[1]至[11]任一項記載之至少二個Fc區域變異體之多胜肽，該二個Fc區域變異體締合多胜肽 [13] 如[12]記載之多胜肽，其中該多胜肽所包含之締合的二個Fc區域變異體為相同的胺基酸序列。 [14] 如[12]記載之多胜肽，其中該多胜肽所包含之締合的二個Fc區域變異體為不同的胺基酸序列。 [15] 如[14]記載之多胜肽，其中該締合之二個Fc區域變異體的胺基酸序列為異於Fc區域變異體之選自EU編號第235號之胺基酸、第236號之胺基酸、第237號之胺基酸、第238號之胺基酸、及第239號之胺基酸之至少一個胺基酸的胺基酸。 [16] 如[15]記載之多胜肽，其中締合的二個Fc區域變異體的任一方的胺基酸序列為，具有選自Eu編號第235號之胺基酸為Asp、Gln、Glu或Thr，第236號之胺基酸為Asn，第237號之胺基酸為Phe或Trp，第238號之胺基酸為Glu、Gly或Asn，及第239號之胺基酸為Asp或Glu之至少1個胺基酸之胺基酸序列。 [17] 如[12]至[16]任一項記載之多胜肽，其中包含該Fc區域變異體之多胜肽為IgG抗體。 [18] 如[12]至[16] 任一項記載之多胜肽，其中包含該Fc區域變異體之多胜肽為Fc融合蛋白分子。 [19] 一種醫藥組成物，包含如[12]至[18] 任一項記載之多胜肽的醫藥組成物。

另外，本發明係關於，藉由在本發明中之Fc區域導入胺基酸變異，使得該Fc區域對FcγRIIb之結合活性增強，並且，與FcγRIIa(R型)相比，對FcγRIIb之結合選擇性增強的方法。另外，本發明亦係關於，藉由在本發明中之Fc區域導入胺基酸變異，來抑制對抗含有該Fc區域之多胜肽之抗體的產生之方法。

另外，本發明係關於，包含本發明之多胜肽之免疫發炎性疾病的治療或預防藥劑。另外，本發明亦關於，包含將本發明之多胜肽施用於受試者之步驟，以進行免疫發炎性疾病之治療或預防的方法。另外，本發明亦關於，包含本發明多胜肽之用於本發明之免疫發炎性疾病的治療方法或預防方法的套組。另外，本發明亦關於，將本發明之多胜肽用於免疫發炎性疾病之治療藥劑或預防藥劑的製造之使用。另外，本發明亦關於，用於本發明之免疫發炎性疾病的治療方法或預防方法的本發明之多胜肽。

另外，本發明係關於，含有本發明之多胜肽之B細胞、肥大細胞、樹突細胞及∕或嗜鹼性球的活性抑制劑。另外，本發明亦關於，包含將本發明中之多胜肽施用於受試者之步驟，抑制B細胞、肥大細胞、樹突細胞及∕或嗜鹼性球活性之方法。另外，本發明亦關於，包含本發明之多胜肽，用於抑制本發明之B細胞、肥大細胞、樹突細胞及∕或嗜鹼性球活性之方法的套組。另外，本發明亦關於，將本發明之多胜肽用於B細胞、肥大細胞、樹突細胞及∕或嗜鹼性球的活性抑制劑之製造之使用。另外，本發明亦關於，用於抑制本發明之B細胞、肥大細胞、樹突細胞及∕或嗜鹼性球的活化之方法的本發明之多胜肽。

另外，本發明係關於，包含本發明之多胜肽的缺乏生體必需蛋白質疾病的治療藥劑。另外，本發明亦關於，包含將本發明中之多胜肽施用於受試者之步驟，以進行缺乏生體必需蛋白質疾病的治療方法。另外，本發明亦關於，包含本發明之多胜肽，用於治療缺乏生體必需蛋白質疾病之方法的套組。另外，本發明亦關於，將本發明之多胜肽用於缺乏生體必需蛋白質疾病的治療藥劑之製造之使用。另外，本發明亦關於，用於治療本發明之缺乏生體必需蛋白質疾病之方法的本發明之多胜肽。

另外，本發明係關於，包含本發明之多胜肽的病毒增生抑制劑。另外，本發明亦關於，包含將本發明中之多胜肽施用於受試者之步驟，以抑制病毒增生之方法。另外，本發明亦關於，包含本發明之多胜肽，用於本發明之抑制病毒增生方法的套組。另外，本發明亦關於，將本發明之多胜肽用於病毒增生抑制劑之製造之使用。另外，本發明亦關於，用於抑制本發明之病毒增生之方法的本發明之多胜肽。發明效果

藉由本發明提供，與未導入胺基酸變異的Fc區域相比，對FcγRIIb之結合活性增強，及∕或與FcγRIIa(R型)相比，對FcγRIIb之結合選擇性增強之Fc區域變異體。藉由使用包含該Fc區域變異體之多胜肽，通過FcγRIIb之ITIM的磷酸化，能夠增強發炎性免疫反應之抑制性信號。另外，透過賦予Fc區域對FcγRIIb選擇性結合之特性，能夠抑制抗藥品抗體之產生。另外，在pH酸性環境的情況下，在具有對人類FcRn之結合活性、具有會根據離子濃度的條件，而使對應抗原之抗原結合分子的結合活性發生變化之抗原結合結構域，之多胜肽中，透過利用本發明之Fc區域變異體，能夠促使存在於血漿中、與該多胜肽結合的抗原消失。

本發明係提供，與未導入胺基酸變異之Fc區域相比，對FcγRIIb之結合活性增強，及∕或，與FcγRIIa(R型)相比，對FcγRIIb之結合選擇性增強之Fc區域變異體，以及，含有該Fc區域變異體之多胜肽。更具體而言，本發明係提供，含有EU編號第238號之胺基酸變異與其他特定胺基酸變異之組合的胺基酸序列之Fc區域變異體，以及，含有該Fc區域變異體之多胜肽。更進一步，本發明係提供，透過對Fc區域導入了該胺基酸變異，使得與未導入胺基酸變異之Fc區域相比之下，對FcγRIIb之結合活性增強，及∕或與FcγRIIa(R型)相比之下，對FcγRIIb之結合選擇性增強之方法。另外，本發明亦提供，透過對Fc區域導入該胺基酸變異，在將其投入生物體之場合中，與未導入胺基酸變異之Fc區域相比之下，能夠抑制抗-Fc區域抗體產生之方法。

本發明中之「多胜肽」，通常係指具有10個胺基酸長度以上之多胜肽，也係指蛋白質。另外，雖然通常是來自生物之多胜肽，但沒有特別限制，例如，亦可以是由人工設計序列而來之多胜肽。另外，亦可是任何天然多胜肽或合成多胜肽、重組多胜肽等。本發明之多胜肽較佳之實例，包括抗体。更佳之實例，包括天然IgG，尤其是天然人類IgG。天然IgG係指，包含與自然界中發現之IgG相同之胺基酸序列、屬於由免疫球蛋白γ基因實際編碼出之抗體類的多胜肽。例如，天然人類IgG係指天然人類IgG1、天然人類IgG2、天然人類IgG3、天然人類IgG4等。天然IgG亦包含自然產生之變異體等。抗體之輕鏈的恆定區，存在有IgK(Kappa、κ鏈)、IgL1、IgL2、IgL3、IgL6、IgL7(Lambda、λ鏈)之種類的恆定區，可以是任何一種輕鏈恆定區。人類IgK(Kappa)恆定區及人類IgL7(Lambda)恆定區，因為基因多型性而具有多種異型，其多種異型之序列記載於Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242之中，在本發明中使用其任何一種皆可。更進一步，本發明中之輕鏈恆定區，亦可以是進行了胺基酸之置換、添加、刪除、插入及∕或修改等變異之輕鏈恆定區。關於抗體之Fc區域，存在有例如IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM型之Fc區域。本發明中之抗體的Fc區域，可以使用例如人類IgG抗體之Fc區域，較佳者為人類IgG1抗體之Fc區域。關於本發明之Fc區域，可以使用，例如天然IgG之恆定區，具體而言是源自天然人類IgG1之恆定區(序列編號：11)、源自天然人類IgG2之恆定區(序列編號：12)、源自天然人類IgG3之恆定區(序列編號：13)、源自天然人類IgG4之恆定區(序列編號：14)之Fc區域。第21圖中顯示了天然IgG1、IgG2、IgG3、IgG4之恆定區的序列。天然IgG之恆定區亦包含自然產生之變異體等。人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3、人類IgG4抗體之恆定區，因為基因多型性而具有多種異型，其多種異型之序列記載於Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242之中，在本發明中使用其任何一種皆可。特別是人類IgG1之序列，EU編號第356-358號之胺基酸序列可被DEL也可被EEM。

Fcγ受體(本說明書中記載為Fcγ receptor、FcγR或FcgR)，係指能夠結合至IgG1、IgG2、IgG3、IgG4單株抗體之Fc區域的受體，亦係指由Fcγ受體基因實際編碼出之蛋白質家族的任何成員。在人類體內，此家族係指，含有FcγRIa、FcγRIb以及FcγRIc異構體之FcγRI(CD64)；含有FcγRIIa(包括異型H131(H型)及R131(R型))、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1及FcγRIIb-2)以及FcγRIIc異構體之FcγRII(CD32)；以及，含有FcγRIIIa(包括異型V158及F158)以及FcγRIIIb(包括異型FcγRIIIb-NA1及FcγRIIIb-NA2)異構體之FcγRIII(CD16)，並且亦包括任何尚未被發現之人類FcγR及FcγR的異構體與異型，且並非僅受限於此。另外，根據報告，人類FcγRIIb中有剪接變異體(Splicing variant) FcγRIIb1及FcγRIIb2。另外，根據報告，除此之外亦有剪接變異體FcγRIIb3(J. Exp. Med, 1989, 170: 1369)。人類FcγRIIb包含這些剪接變異體，此外，亦包含登錄於NCBI中NP_001002273.1、NP_001002274.1、NP_001002275.1、NP_001177757.1、NP_003992.3之所有剪接變異體。另外，人類FcγRIIb包含現有報告中之所有基因多型，亦包含FcγRIIb(Arthritis Rheum, 2003, 48: 3242-52, Hum Mol Genet, 2005, 14: 2881-92、Arthritis Rheum. 2002 May;46(5):1242-54.)，尚包含所有未來將報告之基因多型。 FcγR包含來自人類、小鼠、大鼠、兔子以及猴子者，且不僅限於此，可以係來自任何生物。小鼠FcγR包含FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)及FcγRIII-2 (CD16-2)，尚包含任何尚未發現之小鼠FcγR及FcγR異構體與異型，且並不僅限於此。這些Fcγ受體之理想的實例，包括人類FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA (CD16)及∕或FcγRIIIB(CD16)。

FcγRI之多核苷酸序列及胺基酸序列，分別記載於序列編號：1(NM_000566.3)及2(NP_000557.1)中， FcγRIIA之多核苷酸序列及胺基酸序列，分別記載於序列編號：3(BC020823.1)4及(AAH20823.1)中， FcγRIIB之多核苷酸序列及胺基酸序列，分別記載於序列編號：5(BC146678.1)及6(AAI46679.1)中， FcγRIIIA之多核苷酸序列及胺基酸序列，分別記載於序列編號：7(BC033678.1)及8(AAH33678.1)中，以及 FcγRIIIB之多核苷酸序列及胺基酸序列，分別記載於序列編號：9(BC128562.1)及10(AAI28563.1)中(括號內表示的是RefSeq登錄編號)。

另外，FcγRIIa存在有兩種基因多型，其第131號之胺基酸為組胺酸(H型)或者置換成精胺酸(R型)(J. Exp. Med, 172, 19-25, 1990)。

本說明書中之「未導入胺基酸變異之Fc區域」，係指導入本發明之胺基酸變異前的Fc區域。本發明中「未導入胺基酸變異之Fc區域」可以是，例如，天然IgG之Fc區域，或者也可以是在天然IgG中加入了本發明之胺基酸變異以外的變異之IgG的Fc區域。另外，本發明中「Fc區域變異體」係指，在未導入本發明之胺基酸變異的Fc區域中，將本發明之至少一個胺基酸改變成其他胺基酸的Fc區域。此處的「將至少一個胺基酸改變成其他胺基酸」，包含導入了該胺基酸變異之Fc區域，以及由同樣的胺基酸序列構成之Fc區域。

包含與自然界中發現之IgG相同之胺基酸序列、屬於由免疫球蛋白γ基因實際編碼出之抗體類的多胜肽。例如，天然人類IgG係指天然人類IgG1、天然人類IgG2、天然人類IgG3、天然人類IgG4等。天然IgG亦包含自然產生之變異體等。

天然IgG之Fc領域係指，包含與來自自然界中發現之IgG的Fc區域相同的胺基酸序列之Fc區域。天然IgG之重鏈恆定區係指，第21圖(序列編號：11~14)中所示之，例如，第21圖之源自天然人類IgG1之重鏈恆定區中的Fc區域、源自天然人類IgG2之重鏈恆定區中的Fc區域、源自天然人類IgG3之重鏈恆定區中的Fc區域、源自天然人類IgG4之重鏈恆定區中的Fc區域。天然IgG之Fc區域亦包含自然產生之變異體等。

如本實施例中所示，透過利用表面電漿子共振(SPR)現象之相互作用分析儀器BIACORE，對把抗體固定於自身上之感應晶片，或是對透過ProteinA、ProteinL、ProteinA∕G、ProteinG、抗-lamda鏈抗體、抗-kappa鏈抗體、抗原胜肽、抗原蛋白質等捕捉抗體之感應晶片，以各種FcγR作為分析物進行相互作用，根據從感應圖之分析結果得到的解離常數(KD)之值是下降或增加，從而能夠判斷本發明中包含本發明之Fc區域變異體的多胜肽或Fc區域變異體，對各種FcγR之結合活性是增強、維持不變還是減少。另外，亦可透過，對固定在感應晶片上之抗體，或是對透過ProteinA、ProteinL、ProteinA∕G、ProteinG、抗-lamda鏈抗體、抗-kappa鏈抗體、抗原胜肽、抗原蛋白質等捕捉到之感應晶片上的抗體，以各種FcγR作為分析物進行相互作用，將測得之相互作用前後的感應圖上的共振單位(RU)值之變化量，除以在感應晶片上將抗體固定化前後、或是在感應晶片上捕獲抗體前後之共振單位(RU)的變化量所得到之值是下降或增加來進行判斷。另外，亦可透過，使用直接將FcγR固定於自身上之感應晶片，或是透過抗-標籤抗體等固定化之感應晶片，以欲評估抗體等之樣品作為分析物進行相互作用，根據從感應圖之分析結果得到的解離常數(KD)之值是下降或增加來進行判斷。另外，亦可透過對將FcγR直接固定於自身上之感應晶片，或是對透過抗-標籤抗體等固定化之感應晶片，以欲評估抗體等之樣品作為分析物進行相互作用，根據測得之相互作用前後的感應圖之數值的變化量是下降或增加來進行判斷。

具體而言，對Fc區域變異體之Fcγ受體之結合活性，可以透過ELISA或FACS(fluorescence activated cell sorting)等、ALPHA screen(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)和利用表面電漿子共振(SPR)現象之BIACORE等方法進行測定(Proc.Natl.Acad.Sci.USA (2006) 103 (11), 4005-4010)。

ALPHA screen係，透過使用Donor 和 Acceptor之兩個Beads之ALPHA技術，根據以下的原理進行。鍵結在Donor bead上之分子，會與鍵結在Acceptor bead上之分子產生生物性相互作用，而只有在兩個Beads處於接近狀態時，才會檢測到螢光信號。被雷射激發的Donor bead內之光敏化劑，會將周圍的氧氣轉換成激發狀態之單態氧。單態氧擴散於Donor bead的周圍，碰到附近的Acceptor bead並引起Bead內之化學螢光反應，最後發出螢光。鍵結在Donor bead上之分子沒有與鍵結在Acceptor bead上之分子產生相互作用時，Donor bead產生之單態氧因為沒有碰到Acceptor bead，所以不會引起化學螢光反應。

例如，在Donor bead上鍵結了標記有生物素之多胜肽締合體，在Acceptor bead上鍵結了以麩胱苷肽-S-轉移酵素(GST)標記之Fcγ受體。在不存在競爭之包含Fc區域變異體之多胜肽締合體的情況下，包含野生型Fc區域之多胜肽締合體與Fcγ受體相互作用時會產生520-620nm之信號。包含未受標記之變異Fc區域的多胜肽締合體，與包含野生型Fc區域之多胜肽締合體，會競爭和Fcγ受體間之相互作用。透過定量競爭結果減少之螢光，而測得相對結合活性。已知抗體等之多胜肽締合體可使用磺基-NHS-生物素等進行生物素標記。以GST標記Fcγ受體之方法有，將編碼出Fcγ受體之多核苷酸與編碼出GST之多核苷酸，以內嵌框架(in frame)方式融合，並保持於能夠表現融合基因之載體上，於細胞等之中表現，可以採用透過麩苷光肽管柱進行純化等合適之方法。得到之信號係使用例如GRAPHPAD PRISM(GraphPad公司製、San Diego製)等軟體，透過利用非線性迴歸分析計算單點競爭(one-site competition)模型，來進行適當的分析。

將觀察之相互作用物質的其中一方(配體)固定在感應晶片之金薄膜上，從感應晶片背面透過金薄膜與玻璃的交界面發出全反射之光，在一些反射光中產生了反射強度降低之部分(SPR信號)。將觀察之相互作用物質的另外一方(分析物)在感應晶片之表面流動，使配體與分析物鍵結，而令固定化配體分子的質量增加，改變感應晶片表面之溶劑的折射率。藉由此折射率之變化，SPR信號的位置轉移了(相反地，鍵結解離時信號則會歸位)。Biacore系統係以上述之轉移量，即感應晶片表面上之質量變化，為縱軸，表示測得之隨時間變化的質量數據(感應圖)。從感應圖求得感應晶片表面上捕獲之配體與分析物的結合量。另外，從感應圖之曲線求得動力學：結合速率常數(ka)及解離素率常數(kd)，並從該些常數之比求得解離常數(KD)。BIACORE方法中亦適合使用抑制測定法。抑制測定法之例子記載於Proc.Natl.Acad.Sci.USA (2006) 103 (11), 4005-4010之中。

對FcγR之結合活性減少之Fc區域或含有該Fc區域之多胜肽係指，令包含未導入胺基酸變異之Fc區域的多胜肽(包含親代Fc區域之多胜肽，或稱為親代多胜肽)與包含至少一個胺基酸被變異之該Fc區域的多胜肽(包含Fc區域變異體之多胜肽，或稱為變異多胜肽)之數量基本上一致，並進行檢定時，對FcγR之結合活性，本質上比包含親代Fc區域之多胜肽更弱，之Fc區域變異體或包含該Fc區域變異體之多胜肽。

另外，對FcγR之結合活性增強之Fc區域或含有該Fc區域之多胜肽係指，令含有親代Fc區域之多胜肽的數量與含有Fc區域變異體之多胜肽的數量基本上一致，並進行檢定時，對FcγR之結合活性，本質上比包含親代Fc區域之多胜肽較強，之Fc區域變異體或包含該Fc區域變異體之多胜肽。

對FcγR之結合活性維持不變之多胜肽係指，令具有親代Fc區域之多胜肽與包含Fc區域變異體之多胜肽的數量基本上一致，並進行檢定時，與親代多胜肽本質上沒有差異，對FcγR具有同等之結合活性者。

本發明中，對FcγRIIb之結合活性增強係指，例如，根據上述測定方法所測得之KD值中，[包含親代Fc區域之多胜肽對FcγRIIb之KD值] ∕ [包含Fc區域變異體之多胜肽對FcγRIIb之KD值]之KD值比，較佳者為15.0以上、20.0以上、25.0以上、30.0以上、35.0以上、40.0以上、45.0以上者，更佳者為50.0以上、55.0以上、60.0以上、65.0以上、70.0以上、75.0以上、80.0以上、85.0以上、90.0以上、95.0以上、100.0以上者。

另外，本發明之Fc區域變異體，比起FcγRIIa，對FcγRIIb之結合選擇性更增強，係指 (i) 對FcγRIIb之結合活性增強，對FcγRIIa之結合活性維持不變或減少， (ii) 對FcγRIIb之結合活性增強，對FcγRIIa之結合活性亦增強，但對FcγRIIa之結合活性增強的程度，比起對FcγRIIb之結合活性增強的程度低，或者 (iii) 對FcγRIIb之結合之結合活性減少，但其減少的程度，比對FcγRIIa之結合活性減少的程度低，的意思。本發明之Fc區域變異體，比起FcγRIIa，對FcγRIIb之結合選擇性增強與否，係根據例如上述的例子所測定，包含本發明之Fc區域變異體的多胜肽，對FcγRIIa之KD值與對FcγRIIb之KD值之比(對FcγRIIa之KD值 ∕ 對FcγRIIb之KD值)，以及包含親代Fc區域之多胜肽，對FcγRIIa之KD值與對FcγRIIb之KD值之比(對FcγRIIa之KD值 ∕ 對FcγRIIb之KD值)，藉由比較兩者，可以判斷結合選擇性是否增強。具體而言，上述的KD值比之數值，在包含本發明之Fc區域變異體的多胜肽之KD值之數值，比包含親代Fc區域之多胜肽之數值要來的大的情況下，可以判斷出，包含本發明之Fc區域變異體的多胜肽，與包含親代Fc區域之多胜肽相比之下，對FcγRIIb之結合選擇性比FcγRIIa更增強。特別是對FcγRIIa(R型)之結合活性，因為比起對FcγRIIa(H型)，其更容易與對FcγRIIb之結合活性有所相關，因此尋找對FcγRIIb之結合選擇性，與FcγRIIa(R型)相比之下，更增強之胺基酸變異，比起尋找對FcγRIIb之結合選擇性，與FcγRIIb以外之其他的FcγR相比之下，更增強之變異，要來更的重要。 FcγRIIa(R型)與FcγRIIb之間的結合選擇性係，例如根據上述測定法測得之KD值中，[包含Fc區域變異體之多胜肽對FcγRIIa(R型)之KD值] ∕ [包含Fc區域變異體之多胜肽對FcγRIIb之KD值]之KD值比，較佳者為10.0以上，更佳者為20.0以上。 FcγRIIa(H型)與FcγRIIb之間的結合選擇性係，例如根據上述測定法測得之KD值中，[包含Fc區域變異體之多胜肽對FcγRIIa(H型)之KD值] ∕ [包含Fc區域變異體之多胜肽對FcγRIIb之KD值]之KD值比，較佳者為100.0以上、200以上、300以上、400以上、500以上，更佳者為600以上、700以上、800以上、900以上。

另外，本發明之多胜肽對各種FcγR之結合活性是維持不變、增強還是減少，係根據上述的例子測定各種FcγR對本發明之多胜肽的結合量之增減，並依此進行判斷。在這裡，各種FcγR對本發明之多胜肽的結合量係指，各種多胜肽與作為分析物之各種FcγR間進行相互作用，將相互作用前後變化的感應圖中之RU值的差，除以感應晶片上捕獲多胜肽之前後變化的感應圖中之RU值的差，所得到的數值。

另外，本發明之Fc區域變異體，雖然對FcγRIIb之KD值(mol∕L)並無特別限制，例如可為9×10 ^-7，但較佳者為5×10 ^-7以下，更佳者為3×10 ^-7以下，甚佳者為1×10 ^-7以下，尤佳者為5×10 ^-8以下。

「Fc區域」的意思，係指抗體分子中之鉸鏈區或其一部分，由CH2、CH3結構域組成之片段。IgG類之Fc區域係，在EU編號(本說明書中亦稱為EU INDEX)(參考第21圖)中，例如從第226號之半胱胺酸開始至C末端，或是從第230號之脯胺酸開始至C末端，且不僅限於此。

將IgG1、IgG2、IgG3、IgG4單株抗體等，以胃蛋白酶等蛋白質分解酵素局部分解之後，透過再溶解吸附到蛋白A管柱上之餾分，可以適當地取得Fc區域。如此之蛋白分解酵素，經由適當地設定如pH值等之酵素反應條件，只要能產生如限制性Fab或F(ab’)2等可以分解全長抗體之效果者即可，沒有特別的限制，例如，可以列舉胃蛋白酶和木瓜蛋白酶等。

本發明係提供，組合人類IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)之Fc區域EU編號第238號之胺基酸改變成其他胺基酸之變異，及選自EU編號第233號之胺基酸、第234號之胺基酸、第235號之胺基酸、第237號之胺基酸、第264號之胺基酸、第265號之胺基酸、第266號之胺基酸、第267號之胺基酸、第268號之胺基酸、第269號之胺基酸、第271號之胺基酸、第272號之胺基酸、第274號之胺基酸、第296號之胺基酸、第326號之胺基酸、第327號之胺基酸、第330號之胺基酸、第331號之胺基酸、第332號之胺基酸、第333號之胺基酸、第334號之胺基酸、第355號之胺基酸、第356號之胺基酸、第358號之胺基酸、第396號之胺基酸、第409號之胺基酸、及第419號之胺基酸之至少一個胺基酸改變成其他胺基酸之變異之Fc區域變異體。透過組合人類IgG之Fc區域EU編號第238號之胺基酸改變成其他胺基酸之變異，及選自EU編號第233號之胺基酸、第234號之胺基酸、第237號之胺基酸、第264號之胺基酸、第265號之胺基酸、第266號之胺基酸、第267號之胺基酸、第268號之胺基酸、第269號之胺基酸、第271號之胺基酸、第272號之胺基酸、第274號之胺基酸、第296號之胺基酸、第326號之胺基酸、第327號之胺基酸、第330號之胺基酸、第331號之胺基酸、第332號之胺基酸、第333號之胺基酸、第334號之胺基酸、第355號之胺基酸、第356號之胺基酸、第358號之胺基酸、第396號之胺基酸、第409號之胺基酸、及第419號之胺基酸之至少一個胺基酸改變成其他胺基酸之變異，與包含未導入這些胺基酸變異之Fc區域的多胜肽相比，對FcγRIIb之結合活性增強，及∕或與FcγRIIa相比，特別是與FcγRIIa(R型)相比，對FcγRIIb之結合選擇性增強，本發明能夠提供具有如此特性之包含Fc區域變異體的多胜肽。與EU編號第238號之胺基酸變異組合之其他的胺基酸變異有，較佳為選自EU編號第233號之胺基酸、第237號之胺基酸、第264號之胺基酸、第267號之胺基酸、第268號之胺基酸、第271號之胺基酸、第272號之胺基酸、第296號之胺基酸、第327號之胺基酸、第330號之胺基酸、第332號之胺基酸、第333號之胺基酸，以及第396號之胺基酸，其中特別是EU編號第233號之胺基酸、第237號之胺基酸、第264號之胺基酸、第267號之胺基酸、第268號之胺基酸、第271號之胺基酸、第296號之胺基酸、第330號之胺基酸，以及第396號之胺基酸較佳。特別是，將EU編號第238號之胺基酸、第268號之胺基酸，及第271號之胺基酸，與從EU編號第233號之胺基酸、第237號之胺基酸、第264號之胺基酸、第267號之胺基酸、第272號之胺基酸、第296號之胺基酸、第327號之胺基酸、第330號之胺基酸、第332號之胺基酸、及第396號之胺基酸之至少一個之胺基酸進行組合之變異，從FcγRIIb之結合活性增強，或者，與FcγRIIa相比之情況下，對FcγRIIb之結合選擇性增強之觀點來看，此組合包括了較佳的胺基酸變異之組合。

被變異之胺基酸，只要是與變異前相比，對FcγRIIb之結合活性會增強，或者是，與FcγRIIa相比，對FcγRIIb之結合選擇性會增強者即可，沒有特別的限制，不過，較佳者係，EU編號第238號之胺基酸為Asp、第233號之胺基酸為Asp，第234號之胺基酸為Tyr，第235號之胺基酸為Phe，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第265號之胺基酸為Glu，第266號之胺基酸為Phe、Leu或Met，第267號之胺基酸為Ala、Glu、Gly或Gln，第268號之胺基酸為Asp、Gln或Glu，第269號之胺基酸為Asp，第271號之胺基酸為Gly，第272號之胺基酸為Asp、Phe、Ile、Met、Asn、Pro或Gln，第274號之胺基酸為Gln，第296號之胺基酸為Asp或Phe，第326號之胺基酸為Ala或Asp，第327號之胺基酸為Gly，第330號之胺基酸為Lys、Arg或Ser，第331號之胺基酸為Ser，第332號之胺基酸為Lys、Arg、Ser或Thr，第333號之胺基酸為Lys、Arg、Ser或Thr，第334號之胺基酸為Arg、Ser或Thr，第355號之胺基酸為Ala或Gln，第356號之胺基酸為Glu，第358號之胺基酸為Met，第396號之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr，第409號之胺基酸為Arg，第419號之胺基酸為Glu。特別是，組合EU編號第238號之胺基酸、第268號之胺基酸，及第271號之胺基酸，與選自EU編號第233號之胺基酸、第264號之胺基酸、第267號之胺基酸、第272號之胺基酸、第296號之胺基酸、第327號之胺基酸、第330號之胺基酸、第332號之胺基酸、及第396號之胺基酸之至少一個胺基酸的情況下，EU編號第238號之胺基酸為Asp，第268號之胺基酸為Asp或Glu，第271號之胺基酸為Gly，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala或Gly，第272號之胺基酸為Asp或Pro，第296號之胺基酸為Asp，第327號之胺基酸為Gly，第330號之胺基酸為Arg，第332號之胺基酸為Thr，第396號之胺基酸為Leu或Met為較佳者。

本發明係，除了這些變異，更可以對Fc區域加入至少一個其他的變異。只要是對FcγRIIb之結合活性增強，及∕或比起FcγRIIa，對FcγRIIb之結合選擇性更增強者即可，沒有特別的限制。另外，變異也可以與Fc區域之一部分置換成其他不同異構體之Fc區域該部分的變異組合。例如，將來自IgG1之Fc區域EU編號第118號之Ala至第225號之Thr之胺基酸序列，置換成來自IgG4之Fc區域EU編號第118號之Ala至第222號之Pro之胺基酸序列之變異，透過將其與上述之胺基酸變異組合，可以增強對FcγRIIb之結合活性及∕或對FcγRIIb之結合選擇性。具體而言，包括有，例如如實施例7中記載之IL6R-BP478∕IL6R-L，在IL6R-BP230中導入之胺基酸變異，與將G1d之EU編號第118號之Ala至第225號之Thr之胺基酸序列，置換成G4d之EU編號第118號之Ala至第222號之Pro之胺基酸序列的變異組合。

在這些之中，較佳者為對FcγRIIb之結合活性更增強之變異，或是，比起FcγRIIa(R型)，對FcγRIIb之結合選擇性更增強之變異。如此之較佳的胺基酸變異之組合，包括有例如以下(a)至(x)之組合。 (a) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第237號、第268號、第271號、第296號以及第330號之胺基酸變異， (b) Fc區域之EU編號第238號、第237號、第268號、第271號、第296號以及第330號之胺基酸變異， (c) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第237號、第268號、第271號、第296號、第330號以及第332號之胺基酸變異， (d) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第237號、第264號、第267號、第268號、第271號以及第330號之胺基酸變異， (e) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第237號、第267號、第268號、第271號、第296號、第330號以及第332號之胺基酸變異， (f) Fc區域之EU編號第238號、第237號、第267號、第268號、第271號、第296號、第330號以及第332號之胺基酸變異， (g) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第237號、第268號、第271號、第296號、第327號以及第330號之胺基酸變異， (h) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第237號、第264號、第267號、第268號以及第271號之胺基酸變異， (i) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第237號、第264號、第267號、第268號、第271號、第296號以及第330號之胺基酸變異， (j) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第237號、第264號、第267號、第268號、第271號、第296號、第330號以及第396號之胺基酸變異， (k) Fc區域之EU編號第238號、第237號、第264號、第267號、第268號、第271號以及第330號之胺基酸變異， (l) Fc區域之EU編號第238號、第237號、第264號、第267號、第268號、第271號、第296號以及第330號之胺基酸變異， (m) Fc區域之EU編號第238號、第264號、第267號、第268號以及第271號之胺基酸變異， (n) Fc區域之EU編號第238號、第264號、第267號、第268號、第271號以及第296號之胺基酸變異， (o) Fc區域之EU編號第238號、第237號、第267號、第268號、第271號、第296號以及第330號之胺基酸變異， (p) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第237號、第264號、第267號、第268號、第271號、第330號以及第396號之胺基酸變異， (q) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第237號、第264號、第267號、第268號、第271號、第296號、第327號、第330號以及第396號之胺基酸變異， (r) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第237號、第264號、第267號、第268號、第271號、第272號以及第296號之胺基酸變異， (s) Fc區域之EU編號第238號、第237號、第264號、第267號、第268號、第271號、第272號以及第330號之胺基酸變異， (t) Fc區域之EU編號第238號、第237號、第264號、第267號、第268號、第271號、第272號、第296號以及第330號之胺基酸變異， (u) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第264號、第267號、第268號以及第271號之胺基酸變異， (v) Fc區域之EU編號第238號、第237號、第267號、第268號、第271號、第296號以及第330號之胺基酸變異， (w) Fc區域之EU編號第238號、第264號、第267號、第268號、第271號、第272號以及第296號之胺基酸變異， (x) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第264號、第267號、第268號、第271號以及第296號之胺基酸變異，

再者，這些變異組合中，包括以下(a)至(x)之胺基酸變異組合者為更佳之組合。 (a) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第268號之胺基酸為Asp，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，以及第330號之胺基酸為Arg之胺基酸序列， (b) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第268號之胺基酸為Asp或Glu，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，以及第330號之胺基酸為Arg之胺基酸序列， (c) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第268號之胺基酸為Asp，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，第330號之胺基酸為Arg，以及第332號之胺基酸為Thr之胺基酸序列， (d) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Gly或Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，以及第330號之胺基酸為Arg之胺基酸序列， (e) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，第330號之胺基酸為Arg，以及第332號之胺基酸為Thr之胺基酸序列， (f) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，第330號之胺基酸為Arg，以及第332號之胺基酸為Thr之胺基酸序列， (g) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第268號之胺基酸為Asp，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，第327號之胺基酸為Gly，以及第330號之胺基酸為Arg之胺基酸序列， (h) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，以及第271號之胺基酸為Gly之胺基酸序列， (i) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，以及第330號之胺基酸為Arg之胺基酸序列， (j) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，第330號之胺基酸為Arg，以及第396號之胺基酸為Met或Leu之胺基酸序列， (k) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，以及第330號之胺基酸為Arg之胺基酸序列， (l) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，以及第330號之胺基酸為Arg之胺基酸序列， (m) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，以及第271號之胺基酸為Gly之胺基酸序列， (n) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，以及第296號之胺基酸為Asp之胺基酸序列， (o) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第267號之胺基酸為Ala或Gly，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，以及第330號之胺基酸為Arg之胺基酸序列， (p) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第330號之胺基酸為Arg，以及第396號之胺基酸為Met或Leu之胺基酸序列， (q) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，第327號之胺基酸為Gly，第330號之胺基酸為Arg，以及第396號之胺基酸為Met之胺基酸序列， (r) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第272號之胺基酸為Asp，以及第296號之胺基酸為Asp之胺基酸序列， (s) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第272號之胺基酸為Pro，以及第330號之胺基酸為Arg之胺基酸序列， (t) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第272號之胺基酸為Pro，第296號之胺基酸為Asp，以及第330號之胺基酸為Arg之胺基酸序列， (u) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，以及第271號之胺基酸為Gly之胺基酸序列， (v) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第267號之胺基酸為Gly，第268號之胺基酸為Asp，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，以及第330號之胺基酸為Arg之胺基酸序列， (w) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第272號之胺基酸為Asp，以及第296號之胺基酸為Asp之胺基酸序列， (x) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，以及第296號之胺基酸為Asp之胺基酸序列。

另外，包含本發明之Fc區域變異體之多胜肽，亦可為了其他目的而進行胺基酸變異組合。例如，亦可以加入使得對FcRn之結合活性向上提升之胺基酸置換變異(J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56、J Biol Chem. 2006 Aug 18;281(33):23514-24.、Int Immunol. 2006 Dec;18(12):1759- 69.、Nat Biotechnol. 2010 Feb;28(2):157-9.、WO∕2006∕019447、WO∕2006∕053301、WO∕2009∕086320)、為了使抗體之異質性或安定性向上提升之胺基酸置換變異(WO∕2009∕041613)。或者是，本發明亦包含，對包含本發明之Fc區域變異體之多胜肽，賦予其WO2011∕122011、PCT∕JP2011∕072550中記載之能促使抗原消失之性質，或是賦予其WO2009∕125825、WO2012∕073992、WO2013∕047752中記載之能夠與多個抗原分子重複結合之性質。或者是，以提高其於血中的保留力為目的，亦可以令包含本發明之Fc區域變異體之多胜肽，與使得恆定區之pI降低之胺基酸變異(WO∕2012∕016227)組合。或者是，包含本發明之Fc區域變異體之多胜肽，為了使其具有對其他抗原之結合能力，亦可令其CH3與EP1752471、EP1772465中記載之胺基酸變異組合。

包含本發明之Fc區域變異體之多胜肽，在具有如抗體等之抗原結合分子存在的情況下，為了使抗原結合分子中、來自血漿之抗原消失之效果提升，可以與在pH酸性環境條件下用於增強人類FcRn結合活性之胺基酸變異進行組合。更具體而言，例如，在pH酸性環境條件下，用於增強人類FcRn結合活性所進行之變異，如將IgG抗體之EU編號第428號之Met置換成Leu、第434號之Asn置換成Ser之方法(Nat Biotechnol, 2010 28:157-159.)，將第434為之Asn置換成Ala之方法(Drug Metab Dispos. 2010 Apr;38(4):600-5.)，將第252號之Met置換成Tyr、第254號之Ser置換成Thr、第256號之Thr置換成Glu之方法(J Biol Chem, 2006, 281:23514-23524)，將第250號之Thr置換成Gln、第428號之Met置換成Leu之方法(J Immunol. 2006, 176(1):346-56)，將第434號之Asn置換成His之方法(Clinical Pharmacology & Therapeutics (2011) 89(2):283-290.)，以及如記載於WO2010106180、WO2010045193、WO2009058492、 WO2008022152、WO2006050166、WO2006053301、WO2006031370、WO2005123780、WO2005047327、WO2005037867、WO2004035752、WO2002060919等中之變異，亦可透過使用這些變異來實施。

另外，近年來，針對人源化抗CD4抗體，為了在pH酸性環境條件下增強其對人類FcRn之結合活性、為了提升其於血漿中之保留力，而將EU編號第434號之Asn置換成His，此抗體分子，根據報告，會與類風濕因子(Rheumatiod factor、RF)結合(Clin Pharmacol Ther. 2011 Feb;89(2):283-90)。此抗體雖然具有人類IgG1之Fc區域，但透過將對FcRn之結合區域中第434號之Asn置換成His，證實了此置換位置會與其所辨識之類風濕因子結合。

如上所述，在pH酸性環境之條件下，用於增強對人類FcRn之結合活性的變異，雖然根據報告已有各式各樣者，但是這些變異藉由導入Fc區域中之FcRn結合部位，會使得對辨識該部位之類風濕因子之結合活性增強。然而，在Fc區域之該部位中，藉由導入對FcRn之結合活性不會降低、只降低對類風濕因子之結合活性之變異，能夠製造出對類風濕因子不具有結合性、在pH酸性環境條件下增強對人類FcRn之結合活性之抗原結合分子。

如此之對類風濕因子之結合活性降低之變異係，使用EU編號第248-257、305-314、342-352、380-386、388、414-421、423、425-437、439、441-444號之變異。較佳者係使用387、422、424、426、433、436、438、440號之變異。尤佳者係使用將第422號之Val置換成Glu或Ser、第424號之Ser置換成Arg、第433號之His置換成Asp、第436號之Tyr置換成Thr、第438號之Gln置換成Arg或Lys、第440號之Ser置換成Glu或Asp之變異。這些變異可以單獨使用，也可以複數組合使用。

或者，為了使對類風濕因子之結合活性降低，亦可對該部位導入N型糖鏈之附加序列。具體而言，已知N型糖鏈附加序列為Asn-Xxx-Ser∕Thr(Xxx係Pro以外之任意氨基酸)，透過將此序列導入Fc區域之該部位而附加上N型糖鏈，透過N型糖鏈之位阻作用，可以抑制對RF之結合。為了附加上N型糖鏈之變異中，較佳者為使用了將第248號之Lys置換成Asn、第424號之Ser置換成Asn、第436號之Tyr置換成Asn並將第438號之Gln置換成Thr、第438號之Gln置換成Asn之變異。尤佳者為使用了將第424號之Ser置換成Asn之變異。

包含本發明之Fc區域變異體之多胜肽，較佳的例子有，如IgG抗體般，至少包含兩個Fc區域變異體之多胜肽，可以包括該兩個Fc區域變異體會彼此締合之多胜肽。在本發明之多胜肽係使用IgG抗體的場合，其恆定區之種類並無限制，可以使用IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等異構型(亞綱)之IgG。本發明之IgG抗體，較佳者為人類IgG，更佳者為人類IgG1、人類IgG4，且已知人類IgG1及人類IgG4之重鏈恆定區的胺基酸序列。人類IgG1之恆定區，因為基因多型性而具有數個亞型序列，該些亞型序列記載於Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242中，本發明中可以是任何一種。

上述之多胜肽中所包含之彼此締合的兩個Fc區域變異體，可以是導入了相同胺基酸變異之Fc區域變異體(以下稱為包含同質性Fc區域變異體之多胜肽)，也可以是各自導入不同胺基酸變異之不相同的胺基酸序列所形成之Fc區域變異體，另外，也可以是由僅在任一方之Fc區域中導入胺基酸變異之不同的胺基酸序列所形成的Fc區域變異體。(以下稱為包含異質性Fc區域變異體之多胜肽)。僅在任一方Fc區域中導入之胺基酸變異有，較佳者為有參與FcγRIIb及FcγRIIa之結合作用的Fc區域CH2結構域中EU編號第233至239號之環狀區域，較佳者為在一方之Fc區域中，導入能夠使CH2結構域之環狀區域結構對FcγRIIb之結合活性增強，及∕或，與FcγRIIa(R型)相比之下，對FcγRIIb之結合選擇性增強之變異，在另一方之Fc區域中，導入能夠使CH2結構域之環狀區域結構不穩定化之胺基酸變異。使CH2區域之環狀區域構造不穩定化之胺基酸變異有，例如，透過從EU編號第235號之胺基酸、第236號之胺基酸、第237號之胺基酸、第238號之胺基酸以及第239號之胺基酸之中，選擇至少一個胺基酸置換成其他胺基酸，可以使得環狀區域結構不穩定化。具體而言，例如，透過將EU編號第235號之胺基酸改變成Asp、Gln、Glu或Thr，第236號之胺基酸改變成Asn，第237號之胺基酸改變成Phe或Trp，第238號之胺基酸改變成Glu、Gly或Asn，以及第239號之胺基酸改變成Asp或Glu，可以使得CH2區域中之環狀區域結構不穩定化。

包含本發明之異質性Fc區域變異體的多胜肽之製造，是將彼此具有不同胺基酸之Fc區域變異體締合化，或者是，必須將包含目的欲求之異質性Fc區域變異體的多胜肽從其他包含同質性Fc區域變異體的多胜肽之中分離出來。

具有不同胺基酸之多胜肽之間的締合化，可以應用對抗體重鏈之第二恆定區(CH2)或重鏈之第三恆定區(CH3)的界面導入電荷性排斥、抑制住重鏈彼此間締合化之技術(WO2006∕106905)。

對CH2或CH3之界面導入電荷性排斥，而抑制重鏈彼此間締合化的技術中，與重鏈之其他的恆定區界面接觸之胺基酸殘基，可以包括有，例如與CH3區域中EU編號第356號之殘基、EU編號第439號之殘基、EU編號第357號之殘基、EU編號第370號之殘基、EU編號第399號之殘基、EU編號第409號之殘基相對之區域。

更具體而言，可以是，例如在包含2種重鏈CH3區域之抗體中，第1重鏈CH3區域中，具有從以下(1)~(3)所示之胺基酸殘基組中選擇1至3組之胺基酸殘基，且此些胺基酸殘基具有同種類電荷之抗體 (1) 重鏈CH3區域中所含之胺基酸殘基係，EU編號第356及第439號之胺基酸殘基， (2) 重鏈CH3區域中所含之胺基酸殘基係，EU編號第357及第370號之胺基酸殘基， (3) 重鏈CH3區域中所含之胺基酸殘基係，EU編號第399及第409號之胺基酸殘基。

更進一步，在與上述之第1重鏈CH3區域不同之第2重鏈CH3區域之中，從前述之(1)~(3)中所示之胺基酸殘基組中所選擇之胺基酸殘基組，可以係對應前述之第1重鏈CH3區域中、具有相同種類電荷之(1)~(3)中所示之胺基酸組的1至3組胺基酸殘基，且其具有與前述之第1重鏈CH3區域中之胺基酸殘基相反電荷之抗體。

上述之(1)~(3)中所記載之各個胺基酸殘基，在締合時會互相接近。本領域之技術人員，可以對欲求的重鏈之CH3區域或重鏈恆定區，使用市售之軟體，透過同源性建模(Homology modeling)等，找出對應上述(1)~(3)中記載之胺基酸殘基之區域，提供該區域之胺基酸殘基適當的變異作用。

上述之抗體中，「具有電荷之胺基酸殘基」為，例如，較佳者為擇自以下(X)或(Y)之任一群中所含的胺基酸殘基； (X) 麩胺酸(E)、天門冬胺酸(D) (Y) 離胺酸(K)、精胺酸(R)、組胺酸(H)。

在上述之抗體中，「具有同種類之電荷」的意思係指，例如，兩個以上之胺基酸殘基中任何一者，具有擇自上述(X)或(Y)之任一群中所含的胺基酸殘基。「具有相反之電荷」的意思係指，例如，兩個以上之胺基酸殘基中，在至少有一個胺基酸殘基具有上述(X)或(Y)之任一群中所含的胺基酸殘基的情況下，剩下的胺基酸殘基則具有另外一群中所含之胺基酸殘基。

在較佳之實施例中，上述之抗體可以係透過雙硫鍵鍵結而交聯第1重鏈之CH3區域與第2重鏈之CH3區域。

本發明中提供變異之胺基酸殘基，並非僅限於上述之抗體的可變區或抗體的恆定區之胺基酸殘基。本領域之技術人員，可以對多胜肽變異體或是異質性聚合體，使用市售之軟體，透過同源性建模等，找出形成界面之胺基酸殘基，能夠對該區域之胺基酸殘基提供，如抑制締合，等變異。

本發明之異質性Fc區域變異體之締合化，可以更進一步使用其他的已知技術。透過將存在於抗體一側的重鏈可變區中之胺基酸側鏈，置換成更大的側鏈(knob; 突起)，以及將存在於另一側的重鏈可變區中之相對的側鏈，置換成較小的側鏈(hole；空隙)，突起能夠放置於空隙中，因此能夠有效率地引發其Fc區域具有不同胺基酸之多胜肽間的締合(WO1996∕027011、Ridgway JB et al., Protein Engineering (1996) 9, 617-621、Merchant AM et al. Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681)。

除此之外，異質性Fc區域變異體之締合化，可以更進一步地使用其他的已知技術。透過使用在抗體一側的重鏈CH3的一部分導入了對應此部分、來自IgA的序列，對另一側的重鏈CH3之互補的部分導入了對應此部份、來自IgA的序列之鏈-交換工程結構域CH3(strand-exchange engineered domain CH3)，藉由CH3之互補性締合化，能夠有效率地引起具有不同序列之多胜肽間的締合化(Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010)。使用此已知技術，亦可以有效率地引起Fc區域具有不同胺基酸之多胜肽間的締合。亦可以使用，利用了WO2011∕028952中所記載之抗體的CH1與CL之締合化、VH、VL之締合化之異質性二聚化抗體之製造技術。亦可以使用如WO2008∕119353、WO2011∕131746中所記載之方法，預先製作出兩種類別之同質性二聚化抗體，透過將其於還原條件下進行培養，使其去締合化，並透過再次締合化以製造出異質性二聚化抗體之技術。另外，亦可使用如J. Mol. (2012) 420, 204-219中所記載之方法，導入對IgG1、IgG2之CH3之電荷排斥之離胺酸、精胺酸、麩胺酸、天門冬胺酸等之具有電荷的殘基，以製造出異質性二聚化抗體之技術。另外，亦可使用如WO2012∕058768中所記載之方法，透過對CH2、CH3區域加入變異，以製造出異質性二聚化抗體之技術。

另外，在無法有效率地產生包含異質性Fc區域變異體之多胜肽的情況下，透過將包含異質性Fc區域變異體之多胜肽，與包含同質性Fc區域變異體之多胜肽進行分離、純化，亦可以得到包含異質性Fc區域變異體之多胜肽。在製造由彼此間序列不同的第一多胜肽以及第二多胜肽所組成、包含異質性Fc區域變異體之多胜肽時，混入作為雜質之：由2個第一多胜肽所組成之包含同質性Fc區域之多胜肽、由2個第二多胜肽組成之包含同質性Fc區域之多胜肽。可以使用已知的技術，來作為有效率地去除此兩種包含同質性Fc區域之多胜肽之方法。根據報告，可以透過對此兩種重鏈之可變區導入胺基酸置換而賦予等電點之差異，使得此兩種同質體與所欲求之異質性二聚化抗體，可以透過離子交換層析進行純化之方法(WO2007114325)。根據報告，到目前為止，純化異質性二聚化抗體之方法係，透過使用蛋白A，對由會與蛋白A結合之小鼠IgG2a重鏈，和不會與蛋白A結合之大鼠IgG2b重鏈所組成之異質性二聚化抗體，進行純化之方法(WO98050431, WO95033844)。

另外，透過使用將IgG與蛋白A之結合區域——EU編號第435及436號之胺基酸殘基置換成Tyr、His等對蛋白A之結合力不一樣的胺基酸之重鏈，改變各重鏈與蛋白A間之相互作用，透過使用蛋白A管柱，亦可以有效率地僅純化出異質性二聚化抗體。

可以將這些置換、技術以複數，例如兩個以上，組合使用。另外，可以將這些變異，適當地各別加入第一多胜肽與第二多胜肽中。並且，本發明之多胜肽，亦可以是以加入上述變異者為基礎進行製作之多胜肽。

本發明中之胺基酸變異係指，置換、刪除、添加、插入或修改等任何一者或是一起組合之變異。在本發明中，胺基酸之變異亦可以說為胺基酸之變異，兩者為相同的意思。在將胺基酸殘基置換的場合中，透過置換成別的胺基酸殘基，以有關於例如下列(a)~(c)點之變異為目的。 (a) 在片型結構，或，螺旋結構之區域中，多胜肽之脊柱結構； (b) 目標區域中之電荷或疏水性，以及 (c) 側鏈的大小。

胺基酸殘基根據一般側鏈之特性，分類為以下之群組： (1) 疏水性：正白胺酸、甲硫胺酸(met)、丙胺酸(ala)、纈草胺酸(val)、白胺酸(leu)、異白胺酸(ile)； (2)中性親水性：胱胺酸(cys)、絲胺酸(ser)、羥丁胺酸(thr)、天冬醯胺(asn)、榖胺醯胺(gln) (3) 酸性：天門冬胺酸(asp)、麩胺酸(glu) (4) 鹼性：組胺酸(his)、離胺酸(lys)、精胺酸(arg)； (5) 影響鏈走向之殘基：甘胺酸(gly)、脯胺酸(pro)；以及 (6)芳香性：色胺酸(trp)、酪胺酸(tyr)、苯基丙胺酸(phe)。

這些於各自組內進行的胺基酸殘基之置換被稱為保守性置換，另一方面，與其他各組之間進行的胺基酸置換則被稱為非保守性置換。本發明中之置換作用，可以是保守性置換，可以是非保守性置換，也可以是保守性置換與非保守性置換一起組合。

胺基酸序列之變異，係透過該領域中已知的各種方法來進行製備。這些方法可以是，但不僅侷限於下列者：定點變異誘導法(Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide- directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors.Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer,W, Drutsa,V, Jansen,HW, Kramer,B, Pflugfelder,M, and Fritz,HJ(1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492)、PCR變異法、盒式變異法。

本發明之胺基酸變異包含轉異後變異。具體而言，轉異後變異可以表示為糖鏈之附加或刪除。例如，由序列編號：11中記載之胺基酸序列所形成的IgG1恆定區中，其EU編號第297號之胺基酸，可以透過糖鏈變異。用於變異之糖鏈結構沒有限制。一般而言，在真核細胞上發現之抗體，其恆定區中會包含糖鏈變異。因此，在如以下之細胞上發現之抗體，通常會被一些糖鏈變異。 ˙哺乳動物之抗體產生細胞 ˙透過包含編碼出抗體之DNA的表現載體所轉殖之真核細胞

此處所示之真核細胞，包含酵母及動物細胞。例如CHO細胞和HEK293H細胞，係包含編碼出抗體之DNA的表現載體、用於轉殖之代表性的轉殖動物細胞。另一方面，在該位置上不具糖鏈變異者，亦包含於本發明之恆定區中。恆定區沒有被糖鏈變異之抗體，其可以透過大腸桿菌等之原核細胞，來表現會編碼出抗體之基因。

更具體而言，亦可以是，例如對Fc區域之糖鏈附加上唾液酸者(MAbs. 2010 Sep-Oct;2(5):519-27.)。

更進一步，本發明提供包含上述所記載之任何Fc區域變異體之抗體。

本發明中所謂的「抗體」係，使用最廣泛的意義，只要該些抗體表示出所需的生物活性即可，包括有：單株抗體(包含全長單株抗體)、多株抗體、變異型抗體、抗體片段、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、嵌合抗體、人源化抗體等任何抗體。

本發明之抗體，對抗原的種類、抗體的來源等並無限制，可以是所有種類的抗體。抗體的來源並無特別限制，可以包括人類抗體、小鼠抗體、大鼠抗體、兔子抗體等。

製造抗體的方法係該領域中之技術人員所熟知的方法，可以是透過，例如在製造單株抗體的場合中所使用的融合瘤法(Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975))、重組方法(美國專利第4,816,567號)來進行製造。另外，亦可以係從噬菌體抗體庫分離(Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) ; Marks et al., J.Mol.Biol. 222:581-597 (1991))。

人源化抗體亦被稱為重塑(reshaped)人類抗體。具體而言，已知人源化抗體係，將人類以外的動物，例如小鼠，之抗體的CDR，移植到人類抗體上。亦已知，為了得到人源化抗體，而重組一般基因的方法。具體而言，已知將小鼠抗體之CDR移植到人類之FR上的方法有，例如重疊延伸PCR(Overlap Extension PCR)。

能夠編碼出，鏈接有3個CDR與4個FR之抗體可變區，的DNA，與能夠編碼出人類抗體恆定區之DNA，透過將兩者以內嵌框架方式融合，並插入至表現載體中，可以製造出表現人源化抗體之載體。將該整合載體導入宿主體內，建立起重組細胞之後，培養該些重組細胞，透過表現出能夠編碼出該人源化抗體之DNA，該些培養細胞之培養物中會產生該人源化抗體(參考歐洲專利公報EP 239400、國際公報WO1996∕002576)。

根據需要，重塑之人類抗體的CDR會產生合適的抗原結合區域，因此亦可以置換FR之胺基酸殘基。例如，透過應用將小鼠CDR移植到人類FR上之PCR法，可以對FR導入胺基酸序列之變異。

將具有人類抗體所有基因譜之基因轉殖動物(參考國際公報WO1993∕012227、WO1992∕003918、WO1994∕002602、WO1994∕025585、WO1996∕034096、WO1996∕033735)作為免疫動物，透過DNA免疫作用，可以得到所欲求之人類抗體。

更進一步，亦已知使用人類抗體庫、透過篩選(panning)取得人類抗體之技術。例如，將人類抗體之V區域作為單鏈抗體(scFv)，並透過噬菌體展示法，表現於噬菌體的表面上。可以選擇會表現出與抗原結合之scFv的噬菌體。透過分析被選擇之噬菌體的基因，可以測定能夠編碼出與抗原結合之人類抗體的V區域之DNA序列。在測定與抗原結合之scFv的DNA序列之後，將該V區域序列與所欲求之人類抗體C區域的序列以內嵌框架方式融合，之後，藉由將其插入到合適的表現載體中，而能夠製造出表現載體。將該表現載體導入如上述所列舉之適合的表現細胞中，透過表現出會編碼出該人類抗體之基因，而獲得該人類抗體。這些方法為公眾已知的方法(參考國際公報WO1992∕001047、WO1992∕020791、WO1993∕006213、WO1993∕011236、WO1993∕019172、WO1995∕001438、WO1995∕015388)。

構成本發明之抗體的可變區係能夠辨識任意抗原之可變區。

本說明書中之抗原沒有特別的限制，可以是任何抗原。抗原之合適的例子有包括如：配體(細胞介素、趨化因子等)、受體、癌抗原、MHC抗原、分化抗原、免疫球蛋白，以及含有部分免疫球蛋白之免疫複合體。

細胞介素之例子，可以列舉有：介白素1~18、群落刺激因子(Ｇ-ＣＳＦ、Ｍ-ＣＳＦ、ＧＭ-ＣＳＦ等)、干擾素(ＩＦＮ-α、ＩＦＮ-β、ＩＦＮ-γ等)、生長因子(ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ、ＨＧＦ等)、腫瘤壞死因子(ＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β)、淋巴毒素、紅血球生成素、瘦素、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＭＣＡＦ、ＢＭＰ。趨化因子之例子，可以列舉有：ＣＣＬ１～ＣＣＬ２８等之ＣＣ趨化因子、ＣＸＣＬ１～ＣＸＣＬ１７等之ＣＸＣ趨化因子、ＸＣＬ１～ＸＣＬ２等之Ｃ趨化因子、ＣＸ３ＣＬ１等之ＣＸ３Ｃ趨化因子。

受體之例子，可以列舉例如：屬於造血因子受體家族、細胞介素受體家族、酪胺酸激酶型受體家族、絲胺酸∕蘇胺酸激酶型受體家族、TNF受體家族、G蛋白連接型受體家族、GPI錨定型受體家族、酪胺酸磷酸酶型受體家族、黏附因子家族、荷爾蒙受體家族，等受體家族之受體。屬於這些受體家族的受體，以及關於它們的之特徵，記載於許多文獻中，例如，Cooke BA., King RJB., van der Molen HJ. ed. New Comprehesive Biochemistry Vol.18B "Hormones and their Actions Part II" pp.1-46 (1988) Elsevier Science Publishers BV.、Patthy(Cell (1990) 61 (1), 13-14)、Ullrichら(Cell (1990) 61 (2), 203-212)、Massague(e上附有重音記號)(Cell (1992) 69 (6), 1067-1070)、Miyajima等(Annu. Rev. Immunol. (1992) 10, 295-331)、Taga等(FASEB J. (1992) 6, 3387-3396)、Fantl等(Annu. Rev. Biochem. (1993), 62, 453-481)、Smith等(Cell (1994) 76 (6) 959-962)、Flower DR.(Biochim. Biophys. Acta (1999) 1422 (3) 207-234)等。

屬於上述之受體家族之受體，具體有例如：人類或小鼠紅血球生成素(EPO)受體(Blood (1990) 76 (1), 31-35、Cell (1989) 57 (2), 277-285)、人類或小鼠顆粒球群落刺激因子(G-CSF)受體(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1990) 87 (22), 8702-8706、mG-CSFR、Cell (1990) 61 (2), 341-350)、人類或小鼠血小板生成素(TPO)受體(Proc Natl Acad Sci U S A. (1992) 89 (12), 5640-5644、EMBO J. (1993) 12(7), 2645-53)、人類或小鼠胰島素受體(Nature (1985) 313 (6005), 756-761)、人類或小鼠Flt-3配體受體(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1994) 91 (2), 459-463)、人類或小鼠血小板衍生生長因子(PDGF)受體(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1988) 85 (10) 3435-3439)、人類或小鼠干擾素(IFN)-α、β受體(Cell (1990) 60 (2), 225-234.及Cell (1994) 77 (3), 391-400)、人類或小鼠瘦素受體、人類或小鼠生長激素(GF)受體、人類或小鼠介白素(IL)-10受體、人類或小鼠類胰島素生長因子(IGF)-I受體、人類或小鼠白血病抑制因子(LIF)受體、人類或小鼠睫狀神經營養因子(CNTF)受體等，為合適的例子。

癌抗原是伴隨著細胞惡性轉化而表現的抗原，又稱為腫瘤專一性抗原。另外，細胞癌變時，在細胞表面或蛋白質分子上出現之異常的糖鏈，也是癌抗原的一種，稱為癌糖鏈抗原。癌抗原之合適的例子有包括如：屬於上述之GPI錨定型受體家族，並表現於以肝癌為首之一些癌症中之GPC3(Int J Cancer. (2003) 103 (4), 455-65)、表現於以肺癌為首之數種癌症中之EpCAM(Proc Natl Acad Sci U S A. (1989) 86 (1), 27-31)、CA19-9、CA15-3、系列SSEA-1(SLX)等。

MHC抗原主要分類成MHC class I抗原及MHC class II抗原，在MHC class I抗原中，包含HLA-A、-B、-C、-E、-F、-G、-H，在MHC class II抗原中，包含HLA-DR、-DQ、-DP。

分化抗原中，可以包含CD1、CD2、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15s、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD23、CD25、CD28、CD29、CD30、CD32、CD33、CD34、CD35、CD38、CD40、CD41a、CD41b、CD42a、CD42b、CD43、CD44、CD45、CD45RO、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD51、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD64、CD69、CD71、CD73、CD95、CD102、CD106、CD122、CD126、CDw130。

免疫球蛋白中，包含IgA、IgM、IgD、IgG、IgE。另外，免疫複合體至少包含免疫球蛋白的任一成分。其他抗原有，可以舉例如下述之分子；17-IA、4-1BB、4Dc、6-酮-PGF1a、8-異-PGF2a、8-側氧-dG、A1 腺苷受體、A33、ACE、ACE-2、活化素、活化素A、活化素AB、活化素B、活化素C、活化素RIA、活化素RIA ALK-2、活化素RIB ALK-4、活化素RIIA、活化素RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17∕TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、地址素、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、α-1-抗胰蛋白酶、α-V∕β-1拮抗劑、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、青蒿琥酯、抗-Id、ASPARTIC、心房利尿鈉因子、av∕b3整合素、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴球刺激因子(BlyS)、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2 BMP-2a、BMP-3成骨素(Osteogenin)、BMP-4 BMP-2b、BMP-5、BMP-6 Vgr-1、BMP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a、OP-2)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BRK-2、RPK-1、BMPR-II(BRK-3)、BMP、b-NGF、BOK、鈴蟾素、骨源性神經營養因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、補體因子3(C3)、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125、CAD-8、降鈣素、cAMP、癌胚抗原(CEA)、癌相關抗原、組織蛋白酶A、組織蛋白酶B、組織蛋白酶C∕DPPI、組織蛋白酶D、組織蛋白酶E、組織蛋白酶H、組織蛋白酶L、組織蛋白酶O、組織蛋白酶S、組織蛋白酶V、組織蛋白酶X∕Z∕P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9∕10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67蛋白)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80(B7-1)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒桿菌毒素、產氣莢膜桿菌毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、細胞角質蛋白腫瘤相關抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、補體調節因子(衰變加速因子)、des(1-3)-IGF-I(腦IGF-1)、Dhh、長葉毛地黃苷(digoxin)、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV∕CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、EMA、EMMPRIN、ENA、內皮素受體、腦啡肽酶(Enkephalinase)、eNOS、Eot、趨化激素1、EpCAM、肝配蛋白B2∕EphB4、EPO、ERCC、E-選凝素、ET-1、凝血因子IIa、凝血因子VII、凝血因子VIIIc、凝血因子IX、纖維母細胞活化蛋白(FAP)、Fas、FcR1、FEN-1、鐵蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、纖維蛋白、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、濾泡刺激素、Fractalkine、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14、CDMP-1)、GDF-6(BMP-13、CDMP-2)、GDF-7(BMP-12、CDMP-3)、GDF-8(肌肉生長抑制素)、GDF-9、GDF-15(MIC-1)、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、GITR、升糖素、Glut4、糖蛋白IIb∕IIIa(GPIIb∕IIIa)、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、生長激素釋放因子、半抗原(NP-cap或NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCMV gB包膜糖蛋白、HCMV gH包膜糖蛋白、HCMV UL、造血生長因子(HGF)、Hep B gp120、乙酰肝素酶、Her2、Her2∕neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、疱疹病毒(HSV)gB糖蛋白、HSV gD糖蛋白、HGFA、高分子量黑色素瘤相關抗原(HMW-MAA)、HIV gp120、HIV IIIB gp 120 V3環、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、人類心肌肌凝蛋白、人類細胞巨大病毒(HCMV)、人類生長激素(HGH)、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受體、IgE、IGF、IGF結合蛋白、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-23、干擾素(INF)-α、INF-β、INF-γ、抑制素、iNOS、胰島素A鏈、胰島素B鏈、類胰島素生長因子1、整合素α2、整合素α3、整合素α4、整合素α4∕β1、整合素α4∕β7、整合素α5(αV)、整合素α5∕β1、整合素α5∕β3、整合素α6、整合素β1、整合素β2、干擾素γ、IP-10、I-TAC、JE、血管舒緩素2、血管舒緩素5、血管舒緩素6、血管舒緩素11、血管舒緩素12、血管舒緩素14、血管舒緩素15、血管舒緩素L1、血管舒緩素L2、血管舒緩素L3、血管舒緩素L4、KC、KDR、角質細胞生長因子(KGF)、層黏連蛋白5、LAMP、LAP、LAP(TGF-1)、潛在性TGF-1、潛在性TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LECT2、Lefty、Lewis-Y抗原、Lewis-Y相關抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-選凝素、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面、黃體素、淋巴細胞毒素β受體、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、METALLOPROTEASES、MGDF受體、MGMT、MHC(HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-1-α、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、黏蛋白(Muc1)、MUC18、輸卵管抑制物質、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-鈣黏蛋白、NCA 90、NCAM、NCAM、腦啡肽酶(Neprilysin)、神經滋養蛋白-3、神經滋養蛋白-4、神經滋養蛋白-6、neurturin、神經生長因子(NGF)、NGFR、NGF-β、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、副甲狀腺素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-鈣黏蛋白、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盤鹼性磷酸酶(PLAP)、PlGF、PLP、PP14、胰島素原、鬆弛素原、蛋白C、PS、PSA、PSCA、前列腺專一性膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、鬆弛素A鏈、鬆弛素B鏈、腎素、呼吸道細胞融合性病毒(RSV)F、RSV Fgp、Ret、類風濕因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF∕KL、SDF-1、SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72(腫瘤相關醣蛋白-72)、TARC、TCA-3、T細胞受體(例如T細胞受體α∕β)、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睪丸類-PLAP鹼性磷酸酶、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、TGF-β Pan Specific、TGF-βRI(ALK-5)、TGF-βRII、TGF-βRIIb、TGF-βRIII、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、凝血酶、胸腺Ck-1、甲狀腺刺激素、Tie、TIMP、TIQ、組織因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-α、TNF-αβ、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2、DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1、LIT、TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2、TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R、TRANCE R)、TNFRSF11B(OPG OCIF、TR1)、TNFRSF12(TWEAK R FN14)、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITR AITR)、TNFRSF19(TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF RI CD120a、p55-60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b、p75-80)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbR TNF RIII、TNFC R)、TNFRSF4(OX40 ACT35、TXGP1 R)、TNFRSF5(CD40 p50)、TNFRSF6(Fas Apo-1、APT1、CD95)、TNFRSF6B(DcR3 M68、TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1)、TNFRSF25(DR3 Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10(TRAIL Apo-2配體、TL2)、TNFSF11(TRANCE∕RANK配體ODF、OPG配體)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配體、DR3配體)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM配體、LTg)、TNFSF15(TL1A∕VEGI)、TNFSF18(GITR配體 AITR配體、TL6)、TNFSF1A(TNF-a 肌聯蛋白(Conectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC、p33)、TNFSF4(OX40配體 gp34、TXGP1)、TNFSF5(CD40配體 CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6(Fas配體 Apo-1配體、APT1配體)、TNFSF7(CD27配體 CD70)、TNFSF8(CD30配體 CD153)、TNFSF9(4-1BB配體 CD137配體)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、轉鐵蛋白受體、TRF、Trk、TROP-2、TSG、TSLP、腫瘤相關抗原CA125、表現腫瘤相關抗原之Lewis Y相關醣類、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-鈣黏蛋白、VE-鈣黏蛋白-2、VEFGR-1(flt-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3(flt-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整合素、溫韋伯氏因子、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B／13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、HMGB1、IgA、Aβ、CD81、CD97、CD98、DDR1、DKK1、EREG、Hsp90、IL-17∕IL-17R、IL-20∕IL-20R、氧化LDL、PCSK9、血漿激肽釋放黴原(prekallikrein)、RON、TMEM16F、SOD1、染色顆粒素A(Chromogranin A)、染色顆粒素 B、tau蛋白、VAP1、高分子激肽原、IL-31、IL-31R、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、EPCR、C1、C1q、C1r、C1s、C2、C2a、C2b、C3、C3b、C4、C4a、C4b、C5、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9、B因子、D因子、H因子、裂解素(properdin)、硬化蛋白(sclerostin)、纖維蛋白原(fibrinogen)、纖維蛋白(fibrin)、凝血酶原(prothrombin)、凝血酶(thrombin)、組織因子、凝血因子V、凝血因子Va、凝血因子VII、凝血因子VIIa、凝血因子VIII、凝血因子VIIIa、凝血因子IX、凝血因子IXa、凝血因子X、凝血因子Xa、凝血因子XI、凝血因子XIa、凝血因子XII、凝血因子XIIa、凝血因子XIII、凝血因子XIIIa、TFPI、抗凝血酶III、EPCR、血栓調節蛋白、TAPI、tPA、纖維蛋白溶酶原(plasminogen)、纖維蛋白溶酶(plasmin)、PAI-1、PAI-2、GPC3、多配體蛋白聚糖-1、多配體蛋白聚糖-2、多配體蛋白聚糖-3、多配體蛋白聚糖-4、LPA、S1P，以及荷爾蒙及生長因子的受體。

構成可變區之胺基酸序列，只要仍保持著抗原結合活性，可允許其一或多個胺基酸殘基受到變異。可變區之胺基酸序列受到變異的情況下，被變異的位置以及被變異的胺基酸數量並無特別限制。例如，可以適當地變異CDR及∕或FR中之胺基酸。可變區之胺基酸受到變異的情況下，並無特別限制，而較佳者為仍維持其結合活性者，例如，與變異前相比，具有50%以上，較佳者為80%以上，更佳者為100%以上之結合活性者。另外，亦可藉由胺基酸變異來提高結合活性，例如，與變異前相比，結合活性可以變成2倍、5倍、10倍等。在本發明之抗體中，胺基酸序列之變異，可以係指是胺基酸殘基的置換、添加、刪除，以及修改，之至少一種。

例如，透過將可變區之N端的麩醯胺酸給焦谷胺酰化，而變成焦谷胺酸之變異，為本技術領域中眾所周知的變異。因此，本發明之抗體，在重鏈之N端為麩醯胺酸的情況下，會包含將其變異成為焦谷胺酸之可變區。

本發明之抗體的可變區可以是任何序列，其可以是小鼠抗體、大鼠抗體、兔子抗體、山羊抗體、駱駝抗體，以及，將這些非人類抗體人源化所形成的人源化抗體，以及人類抗體等，可以是來自任何來源的抗體之可變區。人源化抗體，亦稱為重塑(reshaped)之人類抗體，係指將來自人類以外的哺乳動物之抗體，例如，小鼠抗體，的互補決定區域(CDR；complementarity determining region)移植到人類抗體的CDR位置上者。已知CDR的識別方法(Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342: 877)。另外，亦已知重組一般基因之方法(參考歐洲專利申請公開號EP 125023號公報、WO 96∕02576號公報)。另外，為了改善對抗原的結合、藥物動力學、安定性、免疫原性，亦可以對這些抗體之可變區導入各種胺基酸置換。本發明之抗體的可變區，因為其對抗原之結合具有pH依賴性，因此其亦能夠對抗原重複結合(WO2009∕125825)。

抗體之輕鏈恆定區中，雖然存在有κ鏈類型與λ鏈類型之恆定區，但可以是任何一種輕鏈恆定區。更進一步，本發明中之輕鏈恆定區，亦可以是進行了胺基酸置換、刪除、添加及∕或插入等變異之輕鏈恆定區。

本發明之抗體的重鏈恆定區可以是使用，例如，人類IgG抗體之重鏈恆定區，較佳者為人類IgG1抗體、人類IgG4抗體之重鏈恆定區。

另外，本發明之Fc區域變異體，可以與其他蛋白、生物活性肽等結合，成為Fc融合蛋白分子。此處之融合蛋白係指，包含至少兩個於自然界中沒有連接在一起的不同之多胜肽，所嵌合形成之多胜肽。其他之蛋白與生物活性肽，舉例有，但不僅限於：受體、黏著分子、配體、酵素。

本發明之Fc融合蛋白分子，較佳之例子包括，將受體中能夠與目標物結合之蛋白，融合入Fc區域所產生之融合蛋白，例如，包括TNFR-Fc融合蛋白、IL1R-Fc融合蛋白、VEGFR-Fc融合蛋白、CTLA4-Fc融合蛋白等(Nat Med. 2003 Jan;9(1):47-52、BioDrugs. 2006;20(3):151-60.)。另外，與本發明之多胜肽融合的蛋白，只要能夠與目標分子結合，任何分子均可，例如，scFv分子(WO2005∕037989)、單結構域抗體分子(WO2004∕058821, WO2003∕002609)、類抗體分子(Current Opinion in Biotechnology 2006, 17:653-658、Current Opinion in Biotechnology 2007, 18:1-10、Current Opinion in Structural Biology 1997, 7:463-469、Protein Science 2006, 15:14-27)例如包括DARPins(WO2002∕020565)、Affibody(WO1995∕001937)、Avimer(WO2004∕044011, WO2005∕040229)、Adnectin (WO2002∕032925)等。另外，抗體與Fc之融合蛋白分子，亦可以是會與多種類型之目標分子或抗原表位結合之多特異性抗體。

另外，本發明之抗體，亦包括抗體變異物。抗体變異物之例子，可以舉例如，與聚乙二醇(PEG)或細胞毒性物質等各種分子結合之抗體。可以透過對本發明之抗體施予化學變異，而得到這些抗體變異物。在本技術領域中，抗體變異方法已有良好的發展。

更進一步，本發明之抗體亦可以是雙特異性抗體(bispecific antibody)。雙特異性抗體係指，在同一個抗體分子中具有能辨識不同抗原表位的可變區之抗體，該些抗原表位可以是存在於不同的分子之中，也可以是存在於同一個分子之中。

本發明之多胜肽可以藉由本技術領域中已知的方法進行製造。例如，抗體可以透過以下的方法製造而出，且並不僅限於此。

編碼出抗體之重鏈的DNA係，表現出，能夠編碼出Fc區域中一個或多個胺基酸殘基被置換成其他所欲求之胺基酸的重鏈之DNA，及編碼出抗體之輕鏈的DNA。編碼出Fc區域中一個或多個胺基酸殘基被置換成起他所欲求之胺基酸的重鏈之DNA係指，例如，取得編碼出天然型重鏈之DNA的Fc區域部分，並透過導入合適的置換，使得該Fc區域中編碼出特定胺基酸之密碼子，能夠編碼出所欲求之其他的胺基酸。

另外，事先設計好能夠編碼出，天然型重鏈之Fc區域中一個或數個胺基酸殘基被置換成其他所欲求之胺基酸的蛋白質，之DNA，並透過化學合成該DNA，亦可得到能夠編碼出Fc區域中一個或多個胺基酸殘基被置換成所欲求之其他胺基酸的重鏈之DNA。關於胺基酸置換的位置、置換的類型，並無特別限制。此外，並不僅限於置換，亦可是刪除、添加、插入之任何一者或是其組合。

另外，會編碼出Fc區域中一個或數個胺基酸殘基被置換成其他所欲求之胺基酸的重鏈之DNA，可以分開製造局部DNA。局部DNA之組合有，例如，編碼出可變區之DNA與編碼出恆定區之DNA，或者是編碼出Fab之DNA與編碼出Fc區域之DNA等，並且並不僅限於這些組合。編碼出輕鏈之DNA一樣也是可以分開製造局部DNA。

表現出上述之DNA的方法有，如以下列舉之方法。例如，將編碼出重鏈可變區之DNA與編碼出重鏈恆定區之DNA，一起建入表現載體中，建構出重鏈表現載體。同樣地，將編碼出輕鏈可變區之DNA與編碼出輕鏈恆定區之DNA，一起建入表現載體中，建構出輕鏈表現載體。亦可將這些重鏈、輕鏈之基因，建入單一一個載體中。

在將編碼出所欲求之抗體的DNA建入表現載體時，係鍵入表現控制區域，例如，表現受增強子(Enhancer)、啟動子(Promoter)控制之表現載體。接著，藉由此表現載體對宿主細胞進行轉殖，使的抗體被表現。此時，可以使用合適的宿主與表現載體之組合。

載體的例子，舉例有M13系列載體、pUC系列載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。另外，以cDNA之亞基因選殖(subcloning)、表現為目的的場合中，亦可以使用上述以外之載體，例如pGEM-T、pDIRECT、pT7等。

為了生產出本發明之多胜肽，而使用了載體的場合中，表現載體尤其有用。表現載體之例子有，例如，在宿主為JM109、DH5α、HB101、XL1-Blue等大腸桿菌的場合之中，必須要具有能夠有效率地表現於大腸桿菌中之啟動子，例如lacZ啟動子(Ward等, Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427，此參考文獻之內容全部引入本說明書)、araB啟動子(Better等, Science (1988) 240, 1041-1043，此參考文獻之內容全部引入本說明書)、還有T7啟動子等。如此之載體，除了上述載體之外，還包括pGEX-5X-1(Pharmacia公司製)、「QIAexpress system」(QIAGEN公司製)、pEGFP、以及pET(此情況下，較佳之宿主為表現出T7RNA聚合酶之BL21)等。

另外，載體中，亦可包含用於分泌多胜肽之信號序列。用於分泌多胜肽之信號序列，在產生於大腸桿菌周質中之情況下，可以使用pelB信號序列(Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4397，此參考文獻之內容全部引入本說明書)。對宿主細胞導入載體時，可以使用例如脂質體法、磷酸鈣法、DEAE-Dewtran法。

除了大腸桿菌表現載體以外，用於製造本發明之多胜肽的載體可以是，舉例包括有，來自哺乳動物的表現載體(例如pcDNA3(Invitrogen公司製)、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322，此參考文獻之內容全部引入本說明書)、pEF、pCDM8)；來自昆蟲細胞的表現載體(例如「Bac-to-BAC baculovairus expression system」(GIBCO BRL公司製)、pBacPAK8)；來自植物的表現載體(例如pMH1、pMH2)；來自動物病毒的表現載體(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)；來自反轉錄病毒的表現載體(例如pZIPneo)；來自酵母的表現載體(例如「Pichia Expression Kit」(Invitrogen公司製)、pNV11、SP-Q01)；來自枯草桿菌的表現載體(例如pPL608、pKTH50)。

在透過CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等動物細胞來表現的情況下，為了在細胞內表現基因，必須具有不可或缺的啟動子，例如 SV40啟動子(Mulligan等， Nature (1979) 277, 108，此參考文獻之內容全部引入本說明書)、MMTV-LTR啟動子、EF1α啟動子(Mizushima等， Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322，此參考文獻之內容全部引入本說明書)、CAG啟動子(Gene. (1991) 108, 193此參考文獻之內容全部引入本說明書)、CMV啟動子等，若具有用於篩選轉殖細胞之基因(例如，能夠藉由藥物(新黴素、G418等)區別之抗藥性基因)者則更佳。具有如此之特性的載體，舉例包括有pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等。

更進一步，在以穩定地表現基因、並且增加細胞內之基因的複製數為目的的情況下，包括有，對缺乏核酸合成路徑之CHO細胞，導入互補之具有DHFR基因的載體(例如pCHOI等)，並透過甲胺蝶呤(MIX)增加基因數的方法，另外，在以暫時性表現基因為目的的情況下，包括有，使用染色體上具有會表現出SV40抗原之基因的COS細胞，透過具有SV40之複製起始點的載體(pcD等)進行細胞轉殖的方法。複製起始點亦可使用來自多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭狀瘤病毒(BPV)等之複製起始點。更進一步，為了增加宿主細胞族系之基因複製數，表現載體可以包含作為選擇標誌之胺基糖苷轉移酶(APH)基因、胸腺基酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等。

抗體之回收係，例如，轉殖細胞經過培養之後，可從分子轉殖細胞的細胞內部或培養液分離。抗體之分離、純化，可以透過適當地組合下列方法而進行：離心分離、硫酸銨份化、鹽析、超過濾、１ｑ、ＦｃＲｎ、蛋白A、蛋白G管柱、親合性層析、離子交換層析、凝膠過濾層析等。

另外本發明係，在包含抗體Fc區域變異體之多胜肽中，該Fc區域變異體中包含至少加入一個胺基酸變異，與包含親代Fc區域之多胜肽相比之下，對FcγRIIb之結合活性增強，本發明提供包含此種Fc區域變異體之多胜肽的製造方法。可以舉例包含下列步驟之製造方法； (ａ)在包含Fc區域之多胜肽中，對該Fc區加入至少一個胺基酸變異的步驟， (ｂ)測定上述步驟(ａ)所變異之多胜肽對FcγRIIb之結合活性的步驟，以及 (ｃ)篩選出，與包含親代Fc區域之多胜肽相比之下，包含對FcγRIIb之結合活性增強之Fc區域變異體之多胜肽的步驟。

較佳實施例為，包含Fc區域變異體之多胜肽，其製造方法包含下列步驟 (ａ)為了使該多胜肽，與包含親代Fc區域之多胜肽相比之下，對FcγRIIb之結合活性增強，而對編碼出該多胜肽之核酸進行變異之步驟， (ｂ)將該核酸導入宿主細胞中，並為了表現該核酸而進行培養之步驟， (ｃ)從宿主細胞培養物中回收該多胜肽之步驟。更進一步，本發明亦包含，透過該製造方法製造出之抗體與Fc融合蛋白分子。

另外本發明係，在包含抗體Fc區域變異體之多胜肽中，該Fc區域變異體中包含至少加入一個胺基酸變異，與包含親代Fc區域之多胜肽相比之下，對FcγRIIb之結合選擇性，比對FcγRIIa(R型)之結合選擇性增強了，本發明提供包含此種Fc區域變異體之多胜肽的製造方法。可以舉例如包含以下步驟之製造方法； (ａ)在包含Fc區域之多胜肽中，對該Fc區域加入至少一個胺基酸變異的步驟， (ｂ)測定上述步驟(ａ)所變異之多胜肽對FcγRIIa及對FcγRIIb之結合活性的步驟，以及 (ｃ)篩選出，與包含親代Fc區域之多胜肽相比之下，包含對FcγRIIb之結合選擇性，比對FcγRIIa(R型)之結合選擇性增強之Fc區域變異體之多胜肽的步驟。

較佳實施例為，包含Fc區域變異體之多胜肽，其製造方法包含下列步驟： (ａ)為了使該多胜肽，與包含親代Fc區域之多胜肽相比之下，對FcγRIIb之結合選擇性，比對FcγRIIa(R型)之結合選擇性增強，而對編碼出該多胜肽之核酸進行變異之步驟， (ｂ)將該核酸導入宿主細胞中，並為了表現該核酸而進行培養之步驟， (ｃ)從宿主細胞培養物中回收該多胜肽之步驟。更進一步，本發明亦包含，透過該製造方法製造出之抗體與Fc融合蛋白分子

更進一步，本發明係，在包含抗體Fc區域變異體之多胜肽中，該Fc區域變異體中包含至少加入一個胺基酸變異，與包含親代Fc區域之多胜肽相比之下，對FcγRIIb之結合活性增強，並且，對FcγRIIb之結合選擇性，比對FcγRIIa(R型)之結合選擇性增強之Fc區域變異體，本發明提供包含此種Fc區域變異體之多胜肽的製造方法。可以舉例包含下列步驟之製造方法； (ａ)在包含Fc區域之多胜肽中，對該Fc區域加入至少一個胺基酸變異的步驟， (ｂ)測定上述步驟(ａ)所變異之多胜肽對FcγRIIa及對FcγRIIb之結合活性的步驟，以及 (ｃ)篩選出，與包含親代Fc區域之多胜肽相比之下，包含對FcγRIIb之結合活性增強，並且，對FcγRIIb之結合選擇性，比對FcγRIIa(R型)之結合選擇性增強之Fc區域變異體之多胜肽的步驟。

較佳實施例為，包含Fc區域變異體之多胜肽，其製造方法包含下列步驟： (ａ)為了使該多胜肽，與包含親代Fc區域之多胜肽相比之下，對FcγRIIb之結合活性增強，並且，對FcγRIIb之結合選擇性，比對FcγRIIa(R型)之結合選擇性增強，而對編碼出該多胜肽之核酸進行變異之步驟， (ｂ)將該核酸導入宿主細胞中，並為了表現該核酸而進行培養之步驟， (ｃ)從宿主細胞培養物中回收該多胜肽之步驟。更進一步，本發明亦包含，透過該製造方法製造出之抗體與Fc融合蛋白分子。

另外本發明係，在包含抗體Fc區域變異體之多胜肽中，該Fc區域變異體中包含至少加入一個胺基酸變異，在將其投入生物體的場合中，與包含親代Fc區域之多胜肽相比之下，對抗該多胜肽的抗體之產生受到抑制，本發明提供包含此種多胜肽的製造方法。可以舉例如包含以下步驟之製造方法； (ａ)在包含Fc區域之多胜肽中，對該Fc區域加入至少一個胺基酸變異的步驟，以及 (ｂ)將上述步驟(ａ)所變異之包含Fc區域之多胜肽投入生物體內時，與包含親代Fc區域之多胜肽相比之下，抗體的產生被抑制，確認此現象之步驟。

對抗該多胜肽之抗體的產生，是否有受到抑制，可以透過實際將該多胜肽投入動物體內等方法來進行確認。或者是，測定對FcγRIIa之結合活性以及對FcγRIIb之結合活性，將對FcγRIIa之KD值除以對FcγRIIb之KD值，所得到之數值若是增加，即可判斷抗體的產生受到抑制。如此之多胜肽，因為不會激活活化型FcγR，而能夠抑制抗體的產生，被認為是有用的藥物。

上述製造方法中，較佳者為對FcγRIIb之結合活性增強，並且，比起FcγRIIa(R型)，對FcγRIIb之結合選擇性增強者。上述製造方法中，較佳之實施例為，例如在人類IgG之Fc區域中，導入將EU編號第238號之胺基酸改變成其他胺基酸之變異以及從EU編號第233號之胺基酸、第234號之胺基酸、第235號之胺基酸、第237號之胺基酸、第264號之胺基酸、第265號之胺基酸、第266號之胺基酸、第267號之胺基酸、第268號之胺基酸、第269號之胺基酸、第271號之胺基酸、第272號之胺基酸、第274號之胺基酸、第296號之胺基酸、第326號之胺基酸、第327號之胺基酸、第330號之胺基酸、第331號之胺基酸、第332號之胺基酸、第333號之胺基酸、第334號之胺基酸、第355號之胺基酸、第356號之胺基酸、第358號之胺基酸、第396號之胺基酸、第409號之胺基酸，以及第419號之胺基酸之中，選取至少一個胺基酸改變成其他胺基酸之變異，來變異該Fc區域。與EU編號第238號之胺基酸變異一起組合的其他胺基酸變異，較佳者為EU編號第233號之胺基酸、第237號之胺基酸、第264號之胺基酸、第267號之胺基酸、第268號之胺基酸、第271號之胺基酸、第272號之胺基酸、第296號之胺基酸、第327號之胺基酸、第330號之胺基酸、第332號之胺基酸、第333號之胺基酸、以及第396號之胺基酸，尤其是EU編號第233號之胺基酸、第237號之胺基酸、第264號之胺基酸、第267號之胺基酸、第268號之胺基酸、第271號之胺基酸、第296號之胺基酸、第330號之胺基酸，以及第396號之胺基酸為更佳者。從對FcγRIIb之結合活性增強，或者是，比起FcγRIIa，對FcγRIIb之結合選性增強的觀點來看，較佳的胺基酸變異之組合，尤其是包括了將EU編號第238號之胺基酸、第268號之胺基酸，以及第271號之胺基酸，與從EU編號第233號之胺基酸、第237號之胺基酸、第264號之胺基酸、第267號之胺基酸、第272號之胺基酸、第296號之胺基酸、第327號之胺基酸、第330號之胺基酸、第332號之胺基酸，以及第396號之胺基酸之中選取至少一個胺基酸組合之變異。

與變異前相比，經過變異後之胺基酸，只要是對FcγRIIb之結合活性增強者，或者是，比起FcγRIIa，對FcγRIIb之結合選擇性增強者即可，並無特別限制，不過較佳者為，EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第234號之胺基酸為Tyr，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第265號之胺基酸為Glu，第266號之胺基酸為Phe、Leu或Met，第267號之胺基酸為Ala、Glu、Gly或Gln，第268號之胺基酸為Asp、Gln或Glu，第269號之胺基酸為Asp，第271號之胺基酸為Gly，第272號之胺基酸為Asp、Phe、Ile、Met、Asn、Pro或Gln，第274號之胺基酸為Gln，第296號之胺基酸為Asp或Phe，第326號之胺基酸為Ala或Asp，第327號之胺基酸為Gly，第330號之胺基酸為Lys、Arg或Ser，第331號之胺基酸為Ser，第332號之胺基酸為Lys、Arg、Ser或Thr，第333號之胺基酸為Lys、Arg、Ser或Thr，第334號之胺基酸為Arg、Ser或Thr，第355號之胺基酸為Ala或Gln，第356號之胺基酸為Glu，第358號之胺基酸為Met，第396號之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr，第409號之胺基酸為Arg，第419號之胺基酸為Glu。經過變異後之胺基酸之更佳者為，比起變異前，對FcγRIIb之結合活性增強，並且，比起FcγRIIa，對FcγRIIb之結合選擇性增強者。特別是，在EU編號第238號之胺基酸、第268號之胺基酸，以及第271號之胺基酸，與從EU編號第233號之胺基酸、第264號之胺基酸、第267號之胺基酸、第272號之胺基酸、第296號之胺基酸、第327號之胺基酸、第330號之胺基酸、第332號之胺基酸，以及第396號之胺基酸之中選取至少一個胺基酸一起組合時，較佳者為， EU編號第238號之胺基酸為Asp，第268號之胺基酸為Asp或Glu，第271號之胺基酸為Gly，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala或Gly，第272號之胺基酸為Asp或Pro，第296號之胺基酸為Asp，第327號之胺基酸為Gly，第330號之胺基酸為Arg，第332號之胺基酸為Thr，第396號之胺基酸為Leu或Met。

這些組合之中，較佳者為，導入對FcγRIIb之結合活性更加增強之變異，或者，比起FcγRIIa，對FcγRIIb之結合選性更加增強之變異。如此之變異，較佳之胺基酸置換的組合，包括有例如以下(a)~(x)之組合。 (a) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第237號、第268號、第271號、第296號，以及第330號之胺基酸變異； (b) Fc區域之EU編號第238號、第237號、第268號、第271號、第296號，以及第330號之胺基酸變異； (c) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第237號、第268號、第271號、第296號、第330號，以及第332號之胺基酸變異； (d) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第237號、第264號、第267號、第268號、第271號，以及第330號之胺基酸變異； (e) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第237號、第267號、第268號、第271號、第296號、第330號，以及第332號之胺基酸變異； (f) Fc區域之EU編號第238號、第237號、第267號、第268號、第271號、第296號、第330號，以及第332號之胺基酸變異； (g) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第237號、第268號、第271號、第296號、第327號，以及第330號之胺基酸變異； (h) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第237號、第264號、第267號、第268號，以及第271號之胺基酸變異； (i) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第237號、第264號、第267號、第268號、第271號、第296號，以及第330號之胺基酸變異； (j) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第237號、第264號、第267號、第268號、第271號、第296號、第330號，以及第396號之胺基酸變異； (k) Fc區域之EU編號第238號、第237號、第264號、第267號、第268號、第271號，以及第330號之胺基酸變異； (l) Fc區域之EU編號第238號、第237號、第264號、第267號、第268號、第271號、第296號，以及第330號之胺基酸變異； (m) Fc區域之EU編號第238號、第264號、第267號、第268號，以及第271號之胺基酸變異； (n) Fc區域之EU編號第238號、第264號、第267號、第268號、第271號，以及第296號之胺基酸變異； (o) Fc區域之EU編號第238號、第237號、第267號、第268號、第271號、第296號，以及第330號之胺基酸變異； (p) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第237號、第264號、第267號、第268號、第271號、第330號，以及第396號之胺基酸變異； (q) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第237號、第264號、第267號、第268號、第271號、第296號、第327號、第330號，以及第396號之胺基酸變異； (r) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第237號、第264號、第267號、第268號、第271號、第272號，以及第296號之胺基酸變異； (s) Fc區域之EU編號第238號、第237號、第264號、第267號、第268號、第271號、第272號，以及第330號之胺基酸變異； (t) Fc區域之EU編號第238號、第237號、第264號、第267號、第268號、第271號、第272號、第296號，以及第330號之胺基酸變異； (u) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第264號、第267號、第268號，以及第271號之胺基酸變異； (v) Fc區域之EU編號第238號、第237號、第267號、第268號、第271號、第296號，以及第330號之胺基酸變異； (w) Fc區域之EU編號第238號、第264號、第267號、第268號、第271號、第272號，以及第296號之胺基酸變異； (x) Fc區域之EU編號第238號、第233號、第264號、第267號、第268號、第271號，以及第296號之胺基酸變異。

更進一步，這些變異之組合中，更佳之胺基酸置換的組合，包括有例如以下(a)~(x)之組合。 (a) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第268號之胺基酸為Asp，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，以及第330號之胺基酸為Arg之胺基酸序列， (b) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第268號之胺基酸為Asp或Glu，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，以及第330號之胺基酸為Arg之胺基酸序列， (c) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第268號之胺基酸為Asp，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，第330號之胺基酸為Arg，以及第332號之胺基酸為Thr之胺基酸序列， (d) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Gly或Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，以及第330號之胺基酸為Arg之胺基酸序列， (e) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，第330號之胺基酸為Arg，以及第332號之胺基酸為Thr之胺基酸序列， (f) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，第330號之胺基酸為Arg，以及第332號之胺基酸為Thr之胺基酸序列， (g) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第268號之胺基酸為Asp，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，第327號之胺基酸為Gly，以及第330號之胺基酸為Arg之胺基酸序列， (h) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，以及第271號之胺基酸為Gly之胺基酸序列， (i) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，以及第330號之胺基酸為Arg之胺基酸序列， (j) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，第330號之胺基酸為Arg，以及第396號之胺基酸為Met或Leu之胺基酸序列， (k) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，以及第330號之胺基酸為Arg之胺基酸序列， (l) c區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，以及第330號之胺基酸為Arg之胺基酸序列， (m) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，以及第271號之胺基酸為Gly之胺基酸序列， (n) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，以及第296號之胺基酸為Asp之胺基酸序列， (o) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第267號之胺基酸為Ala或Gly，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，以及第330號之胺基酸為Arg之胺基酸序列， (p) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第330號之胺基酸為Arg，以及第396號之胺基酸為Met或Leu之胺基酸序列， (q) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，第327號之胺基酸為Gly，第330號之胺基酸為Arg，以及第396號之胺基酸為Met之胺基酸序列， (r) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第272號之胺基酸為Asp，以及第296號之胺基酸為Asp之胺基酸序列， (s) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第272號之胺基酸為Pro，以及第330號之胺基酸為Arg之胺基酸序列， (t) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第272號之胺基酸為Pro，第296號之胺基酸為Asp，以及第330號之胺基酸為Arg之胺基酸序列， (u) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，以及第271號之胺基酸為Gly之胺基酸序列， (v) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第237號之胺基酸為Asp，第267號之胺基酸為Gly，第268號之胺基酸為Asp，第271號之胺基酸為Gly，第296號之胺基酸為Asp，以及第330號之胺基酸為Arg之胺基酸序列， (w) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，第272號之胺基酸為Asp，以及第296號之胺基酸為Asp之胺基酸序列， (x) Fc區域之EU編號第238號之胺基酸為Asp，第233號之胺基酸為Asp，第264號之胺基酸為Ile，第267號之胺基酸為Ala，第268號之胺基酸為Glu，第271號之胺基酸為Gly，以及第296號之胺基酸為Asp之胺基酸序列。

更進一步，本發明提供對多胜肽進行變異，以製作出，與包含親代Fc區域之多胜肽相比之下，對FcγRIIb之結合活性增強，或者，與FcγRIIa(R型)相比之下，對FcγRIIb之結合選擇性增強之多胜肽的方法。另外，本發明提供對多胜肽進行變異，以製作出，與包含親代Fc區域之多胜肽相比之下，對FcγRIIb之結合活性增強，並且，與FcγRIIa(R型)相比之下，對FcγRIIb之結合選擇性增強之多胜肽的方法。另外，本發明提供對多胜肽進行變異，以製作出，在投入生物體內時，與包含親代Fc區域之多胜肽相比之下，能抑制抗體產生之多胜肽的方法。

較佳之實施例，包括有例如，上述之對FcγRIIb之結合活性增強，或者，與FcγRIIa(R型)相比之下，對FcγRIIb之結合選擇性增強之Fc區域變異體，包含此Fc區域變異體之多胜肽的製造方法中所記載的胺基酸變異組合。更佳之實施例，包括有例如，上述之對FcγRIIb之結合活性增強，並且，與FcγRIIa(R型)相比之下，對FcγRIIb之結合選擇性增強之Fc區域變異體，包含此Fc區域變異體之多胜肽的製造方法中所記載的胺基酸變異組合。

更進一步，包含Fc區域之多胜肽中至少有一個胺基酸受到變異，與包含親代Fc區域之多胜肽相比之下，對FcγRIIb之結合活性增強，或者，與對FcγRIIa(R型)之結合活性相比之下，對FcγRIIb之結合選擇性增強之Fc區域變異體，本發明提供能編碼出包含此Fc區域變異體之多胜肽的核酸。另外，包含Fc區域之多胜肽中至少有一個胺基酸受到變異，與包含親代Fc區域之多胜肽相比之下，對FcγRIIb之結合活性增強，並且，與對FcγRIIa(R型)之結合活性相比之下，對FcγRIIb之結合選擇性增強之Fc區域變異體，本發明提供能編碼出包含此Fc區域變異體之多胜肽的核酸。本發明之該核酸，可以是DNA、RNA等，任何型態皆可。

更進一步，本發明提供包含上述的本發明之核酸的載體。載體的種類可以根據欲導入的宿主細胞，由本領域之技術人員適當地選擇之，例如可以使用上述之載體。

更進一步，本發明係關於，透過上述的本發明之載體被轉殖之宿主細胞。宿主細胞可以由本領域之技術人員適當地選擇之，例如可以使用上述之宿主細胞。具體而言，包括例如以下之宿主細胞。在宿主細胞係使用真核細胞的場合中，可以使用合適的動物細胞、植物細胞，或者是真菌細胞。具體而言，動物細胞可以如以下之例子。 (１)哺乳動物細胞：CHO(Chinese hamster ovary cell line)、COS(Monkey kidney cell line)、多發性骨隨瘤(Sp2∕O、NS0等)、BHK (baby hamster kidney cell line)、Hela、Vero、HEK293(human embryonic kidney cell line with sheared adenovirus (Ad)5 DNA)、Freestyle 293，PER.C6 cell (human embryonic retinal cell line transformed with the Adenovirus Type 5 (Ad5) E1A and E1B genes)等(Current Protocols in Protein Science (May, 2001, Unit 5.9, Table 5.9.1)) (２)兩棲動物細胞：有爪蟾蜍卵母細胞等 (３)昆蟲細胞：sf9、sf21、Tn5等

又或者是使用植物細胞時，已知能透過菸草(Nicotiana tabacum)等來自菸草屬(Nicotiana)之細胞的抗體基因之表現系統。植物細胞之轉殖，可以利用癒傷組織培養出之合適的細胞。

更進一步，使用真菌細胞時，可以利用下列細胞。－酵母：釀酒酵母(Saccharomyces serevisiae)等之酵母屬(Saccharomyces )、畢赤酵母(Pichia pastoris)等之畢赤酵母菌屬(Pichia) －絲狀真菌：黑麴菌(Aspergillus niger)等之麴菌屬(Aspergillus )

更進一步，本發明係提供，在包含Fc區域之多胜肽中，於該Fc區域中加入至少一個胺基酸變異，使得其與包含親代Fc區域之多胜肽相比之下，對FcγRIIb之結合活性增強，及∕或，與對FcγRIIa(R型)之結合活性相比之下，對FcγRIIb之結合選擇性增強之方法。另外，本發明係提供，在包含Fc區域之多胜肽中，該Fc區域中加入至少一個胺基酸變異，使得其在投入生物體內時，與包含親代Fc區域之多胜肽相比之下，能夠抑制對抗該多胜肽之抗體產生之方法。

較佳之實施例，舉例包括有，包含上述之對FcγRIIb之結合活性增強，及∕或，與對FcγRIIa(R型)之結合活性相比之下，對FcγRIIb之結合選擇性增強之Fc區域變異體之多胜肽，此多胜肽的製造方法中所記載的胺基酸變異組合。另外，本發明中亦包含透過上述的任何方法所製造之多胜肽。

本發明提供包含本發明之Fc區域變異體之多胜肽的醫藥組成物。本發明之醫藥組成物可以係，導入本發明之上述抗體或Fc融合蛋白分子以外之藥學上可接受的載體(carrier)，透過已知的方法製劑化。例如，與水或其他藥學上可接受之液體一起組成的無菌溶液或懸浮液，可以以注射的形式，非口服性地使用。例如，可以與藥學上可接受之載體或媒介，具體而言，無菌水或生理食鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、界面活性劑、安定劑、矯味劑、賦形劑、賦形劑(Vehicle)、防腐劑、黏結劑等，進行適當地組合，並根據一般採用之製藥時所要求的單位劑量形式進行混合而完成製劑化。具體而言，可以作為載體之者，包括輕質無水矽酸、乳糖、結晶纖維素，甘露醇、澱粉、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、羥丙織維素、羥丙甲基織維素、聚乙烯醇缩乙醛二乙氨基乙酸酯、聚乙烯四氫咯酮、明膠、中長鏈脂肪酸三酸甘油脂、聚氧乙烯氫化蓖麻油60、白糖、羧基甲基纖維素、玉米澱粉、無機鹽類等。這些製劑中之有效成分劑量，係在指示範圍內之適當用量。用於注射之無菌組成物，可以按照正常之製藥處方，使用如注射用蒸餾水等之賦形劑。

注射用水溶液，可以同時使用例如，生理食鹽水；含有葡萄糖或其他佐劑之等張溶液，包括有例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉等；合適的助溶劑，例如醇類，具體而言為乙醇，多元醇，例如丙二醇、聚乙二醇；非離子型介面活性劑，例如聚山梨醇酯80(TM)、HCO-50。

油性液體如芝麻油、大豆油，助溶劑如苯甲酸苄酯、苯甲醇，兩者亦可同時使用。另外，亦可與緩衝劑例如磷酸鹽緩衝液、醋酸鈉緩衝液，疏緩劑例如普羅卡因鹽酸鹽，安定劑例如苯甲醇、酚類，抗氧化劑等，一起組合。製備之注射液通常會填入合適的安瓿(密封管)內。

較好之給藥方式為非口服性給藥，具體而言，包括有注射給藥、鼻劑給藥、肺劑給藥、經皮給藥等。注射給藥係，例如，可以透過靜脈注射、肌肉注射、腹膜內注射、皮下注射等，全身性或局部性地給藥。

另外，本發明之醫藥組成物，可以係根據患者的年齡、症狀來選擇合適的給藥方法。包含抗體或是會編碼出抗體之多核苷酸的醫藥組成物，其給藥劑量可以選擇為，例如，每次給藥量之範圍為0.0001 mg至1000mg ∕ kg。或者是選擇，例如，每位患者之給藥量範圍為0.001至100000 mg∕body，且並非僅限於此些數值。給藥量、給藥方法可根據患者的體重及年齡、症狀等而變化，可以由本領域之技術人員進行適當的選擇。

包含上述本發明之Fc區域變異体的多胜肽，作為抑制B細胞、肥大細胞、樹突細胞及∕或噬鹼性球之活化的藥劑之有效成分，係有用的。包含本發明之Fc區域變異体的多胜肽，不會激活活化型FcγR，而會選擇性地對FcγRIIb作用，能夠抑制B細胞、肥大細胞、樹突細胞及∕或噬鹼性球之活化。B細胞之活化包括了增殖、產生IgE、產生IgM、產生IgA等。上述之包含本發明之Fc區域變異体的多胜肽，透過令FcγRIIb與IgE之交聯，而抑制B細胞使其無法產生IgE；透過與IgM交聯，而抑制B細胞使其無法產生IgM；透過與IgA交聯而抑制IgA之產生。除此之外，透過BCR、CD19、CD79b等表現於B細胞上之分子，令ITAM結構域、與包含於細胞內或是與ITAM結構域相互作用之分子、與FcγRIIb，直接或間接地產生交聯，而發揮與上述相同的抑制效果。另外，肥大細胞之活化包括了增殖、被IgE等激活、脱顆粒等。包含上述本發明之Fc區域變異体的多胜肽，在肥大細胞中，透過FcεRI、DAP12、CD200R3等表現於肥大細胞上之IgE受體，令ITAM結構域、與包含於細胞內或是與ITAM結構域相互作用之分子、與FcγRIIb，直接或間接地產生交聯，而抑制肥大細胞之增殖、被IgE等激活、脱顆粒等。另外，噬鹼性球之活化包括了增殖、脱顆粒等。包含上述本發明之Fc區域變異体的多胜肽，在噬鹼性球中，也是透過FcγRIIb與細胞膜上的分子，與ITAM結構域、與包含於細胞內或是與ITAM結構域相互作用之分子，直接或間接地產生交聯，因而抑制噬鹼性球之活化、脱顆粒、增殖。另外，樹突細胞之活化包括了增殖、脱顆粒等。包含上述本發明之Fc區域變異体的多胜肽，在樹突細胞中，透過細胞膜上之分子，令ITAM結構域、與包含於細胞內或是與ITAM結構域相互作用之分子、與FcγRIIb，直接或間接地產生交聯，因而抑制樹突細胞之活化、脱顆粒、增殖。

在本發明中，包含上述本發明之Fc區域變異体的多胜肽，作為免疫發炎性疾病的治療藥劑或預防劑之有效成分，係有用的。如上所述，包含本發明之Fc區域變異体的多胜肽，能夠抑制B細胞、肥大細胞、樹突細胞及∕或噬鹼性球之活化，因此，藉由將包含本發明之Fc區域變異体的多胜肽投入患者體內，可以治療或預防免疫發炎性疾病。「免疫發炎性疾病」包含以下列舉之者，但並非僅限於此：類風濕關節炎、自體免疫型肝炎、自體免疫型甲狀腺炎、自體免疫型水疱疾病、自體免疫型腎上腺皮質炎、自體免疫型溶血性貧血、自體免疫型血小板減少性紫癲病、巨紅細胞性貧血、自體免疫型萎縮性胃炎、自體免疫型噬中性球減少症、自體免疫型睪丸炎、自體免疫型腦脊髓炎、自體免疫型受體疾病、自體免疫型不孕症、慢性活動性肝炎、腎絲球性腎炎、肺間質纖維化、多發性硬化症、佩吉特氏病、骨質疏鬆症、多發性骨髓瘤、葡萄膜炎、急性及慢性脊椎炎、痛風性關節炎、發炎性腸疾、成人呼吸窘迫症候群(ARDS)、牛皮癬、局部性迴腸炎、突眼性甲狀腺腫、幼年糖尿病、艾迪森氏病、重症肌無力、水晶體性葡萄膜炎、全身性紅斑狼瘡、過敏性鼻炎、過敏性皮膚炎、潰瘍性結腸炎、過敏性疾病、肌肉變性、惡病質、全身性硬皮症、局部性硬皮症、休格倫氏症候群、貝雪氏病、雷德氏症候群、第I型及第II型糖尿病、骨吸收疾病、移植物抗宿主反應、缺血性再灌注損傷、動脈粥樣硬化、腦創傷、大腦瘧疾、敗血症、敗血性休克、毒性休克症候群、發燒、染色導致之肌痛(malgias)、再生不全性貧血、溶血性貧血、特發性血小板減少症、古巴士德氏症候群、格巴二氏症候群、橋本氏甲狀腺炎、天疱瘡、IgA腎病、花粉熱、抗磷脂質抗體症候群、多發性肌炎、華格納氏肉芽病、瘤狀動脈炎、混合性結締組織疾病、纖維性肌痛症、氣喘、異位性皮膚炎、慢性萎縮性胃炎、先天性膽汁肝硬化、先天性硬化性膽管炎、自體免疫型胰臟炎、主動脈炎症候群、快速進行性腎絲球腎炎、巨紅血球性貧血、特發性血小板減少性紫癲、先天性甲狀腺低能症、特發性艾迪森氏症、胰島素依賴型糖尿病、慢性盤狀紅斑性狼瘡、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線性IgA大疱性皮膚病、後天性表皮大皰性鬆解、圓形禿、尋常性白斑、薩燈後天性遠心性白斑、原田病、自體免疫型視神經病變、特發性精子缺乏症、慣性流產、低血糖症、慢性蕁麻疹、關節黏連性脊椎炎、牛皮癬性關節炎、腸疾性關節炎、反應性關節炎、脊椎關節病、肌腱接骨點炎、過敏性腸道症候群、慢性疲勞症候群、皮肌炎、包含體性肌炎、施密特氏症候群、突眼性甲狀腺腫、惡性貧血、類狼瘡肝炎、早老性癡呆、阿茲海默症、髓鞘脫失病、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、副甲狀腺低能症、心肌梗塞後症候群、伊頓-藍伯症候群、泡疹樣皮炎、禿髮症、進行性全身性硬化症、CREST症候群(鈣質沉著症、雷諾氏症候群、食道運動失調、指皮硬化，以及微血管擴張症)、類肉瘤病、風濕熱、多形性紅斑、庫欣氏症候群、輸血反應、痲瘋病、高安氏動脈炎、風濕性多發性肌痛症、顳動脈炎、巨細胞動脈炎、濕疹、淋巴瘤樣肉芽腫病、川崎病、心內膜炎、心肌內膜纖維化、眼內炎、胎兒紅血球母細胞增多症、噬酸性球筋膜炎、費爾提氏症候群、Henoch – Schonlein二氏紫斑病、移植排斥反應、流行性腮腺炎、心肌病變、化膿性關節炎、家族性地中海熱、Muckle - Wells 症候群、高IgD症候群。

另外，在對抗自體抗原之抗體(自體抗體)之產生為病因的自體免疫疾病中，包含上述本發明之Fc區域變異体的多胜肽，能抑制自體抗體的產生，作為該自體免疫疾病的治療藥劑或預防劑之有效成分，係有用的。根據報告，透過使用重症肌無力症之自體抗原AchR與抗體之Fc區域融合產生的融合分子，能夠抑制表現出辨認AchR之BCR的B細胞之增殖，並誘導細胞凋亡(J Neuroimmunol, 227, 35-43, 2010)。透過使用由自體抗體所辨認之抗原、與本發明中記載之抗體Fc區域融合所產生之融合蛋白，能夠使得表現出對抗該自體抗原之BCR的B細胞，其BCR與FcγRIIb交聯，而抑制表現出對抗該自體抗原之BCR的B細胞之增殖，並誘導細胞凋亡。這些自體免疫疾病，包括有，但不僅限於：格巴二氏症候群、重症肌無力症、慢性萎縮性胃炎、自體免疫型肝炎、先天性膽汁肝硬化、先天性硬化性膽管炎、自體免疫型胰臟炎、主動脈炎症候群、古巴士德氏症候群、快速進行性腎絲球腎炎、巨紅血球性貧血、自體免疫型溶血性貧血、自體免疫型噬中性球減少症、特發性血小板減少性紫癲、痲瘋病、橋本病、先天性甲狀腺低能症、特發性艾迪森氏病、胰島素依賴型糖尿病、慢性盤狀紅斑性狼瘡、局部性指皮硬化、天疱瘡、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線性IgA大疱性皮膚病、後天性大皰性表皮鬆解、圓形禿、尋常性白斑、薩燈後天性遠心性白斑、原田病、自體免疫型視神經病變、特發性精子缺乏症、慣性流產、第II型糖尿病、低血糖症、慢性蕁麻疹。

另外，包含上述本發明之Fc區域變異体的多胜肽，作為缺乏生體必需蛋白質之疾病的治療藥劑之有效成分，係有用的。針對缺乏生體必需蛋白質之疾病，使用將該些蛋白質作為藥劑投入用以補充的治療方法，但是因為患者原本欠缺該些蛋白質，因此會把來自體外之補充用的蛋白質辨識成異物，而產生對抗該些蛋白質之抗體。結果使得該些蛋白質容易被去除，作為藥劑的效果減弱。透過使用將這些蛋白質與本發明中記載之抗體Fc區域融合所產生之融合蛋白， B細胞上辨認該蛋白質之BCR會與FcγRIIb交聯，而能夠抑制對抗該蛋白質之抗體的產生。補充用蛋白質包括有Factor VIII、Factor IX、TPO、EPO、α-iduronidase、iduronate sulfatase、A型heparan N-sulfatase、B型α-N-acetylglucosaminidase、 C型acetyl CoA：α-glucosaminidase acetyltransferase、D型N-acetylglucosamine 6-sulfatase、galactose 6-sulfatase、N-acetylgalactosamine 4-sulfatase、β-glucuronidase、α-galactosidase、acidic α-galactosidase、glucocerebrosidase。另外，這些需要補充蛋白質的疾病，包括有，但不僅限於：血友病、特發性血小板減少性紫癲、腎性貧血、溶酶體疾病(黏多醣病、法布瑞氏症、龐貝氏症、高歇氏病)等。

另外，包含上述本發明之Fc區域變異体的多胜肽，作為抗病毒劑之有效成分，係有用的。將本發明中記載之包含Fc區域之抗體作為對抗病毒之抗體，可以抑制病毒對抗體所造成的抗體依賴型感染增強作用(antibody-dependent enhancement)。抗體依賴型感染增強作用係指，病毒利用抗-病毒之中和抗體，通過活化型FcγR進行吞噬，感染表現FcγR的細胞，而產生感染擴大的現象。根據報告，與抗-登革熱病毒之中和抗體的FcγRIIb的結合，對抗體依賴型感染增強作用的抑制效果，發揮了重要的功能(Proc Natl Acad Sci USA, 108, 12479-12484, 2011)。抗-登革熱病毒之中和抗體與登革熱病毒所形成之免疫複合體，透過與FcγRIIb交聯，抑制通過FcγR進行的吞噬，結果抑制了抗體依賴型感染增強作用。病毒有包括，但不僅限於，登革熱病毒(DENV1、DENV2、DENV4)及HIV。

另外，包含上述本發明之Fc區域變異体的多胜肽，作為動脈硬化之預防藥劑或治療藥劑之有效成分，係有用的。抗-氧化LDL之抗體係造成動脈硬化的原因，而包含本發明中記載之Fc區域的抗體，可以防止FcγRIIa依賴型炎症細胞的附著。根據報告，抗-氧化LDL抗體會阻礙氧化LDL與CD36之間的相互作用，但抗-氧化LDL抗體對內皮細胞結合時，單核球會FcγRIIa依賴性或FcγRI依賴性地辨識、附著於其Fc區域(Immunol Lett, 108, 52-61, 2007)。這些抗體，可以透過利用包含本發明中記載之Fc區域的抗體，阻礙與FcγRIIa依賴性之結合，並且通過FcγRIIb、藉由抑制信號，抑制單核球之附著。

本發明中，包含上述本發明之Fc區域變異体的多胜肽，作為癌症之治療藥劑或預防藥劑之有效成分，係有用的。如上所述，已知，透過對FcγRIIb之結合增強，而使得促效劑抗體之促效劑活性增強，該抗體所具有的抗腫瘤效果亦增強。因此，使用了本發明中記載之Fc區域變異體的促效劑抗體，對癌症的治療或預防係有用的。具體而言，本發明中記載之Fc區域變異體，例如，會增強對抗如Aliases、CD120a、CD120b、Lymphotoxin β receptor、CD134、CD40、FAS、TNFRSF6B、CD27、CD30、CD137、TNFRSF10A、TNFRSF10B、TNFRSF10C、TNFRSF10D、RANK、Osteoprotegerin、TNFRSF12A、TNFRSF13B、TNFRSF13C、TNFRSF14、Nerve growth factor receptor、TNFRSF17、TNFRSF18、TNFRSF19、TNFRSF21、TNFRSF25、Ectodysplasin A2 receptor等TNF受體家族之促效劑抗體的促效劑活性，可以利用於癌症的治療或預防之中。除了上述者之外，對該促效劑活性與FcγRIIb間之相互作用為必要的分子，對抗該分子之促效劑抗體的促效劑活性亦增強。此外，如Receptor Tyrosine kinase(RTK)之一的Kit一般，透過與FcγRIIb交聯而抑制細胞增殖之分子，對此分子具有結合活性的多胜肽，因為包含了本發明之Fc區域變異體，因此能夠增強對表現有該分子之細胞的抑制。癌症包括有，但不僅限於以下所列舉者：肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌，以及肺鱗狀細胞癌)、大腸癌、直腸癌、結腸癌、乳癌、肝癌、胃癌、胰臟癌、腎癌、前列腺癌、卵巢癌、甲狀腺癌、膽管癌、腹膜癌、中皮腫、鱗狀細胞癌、子宮頸癌、子宮癌、膀胱癌、食道癌、頭頸部癌、鼻咽癌、唾腺瘤、胸腺瘤、皮膚癌、基底細胞瘤、惡性黑色素瘤、肛門癌、陰莖癌、睪丸癌、胚性癌肉瘤、急性骨髓性白血病(包括有急性骨髓球性白血病、急性骨髓芽球性白血病、急性前骨髓球性白血病、急性骨髓單球性白血病，以及急性單球性白血病)、慢性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病、何傑金氏淋巴瘤、非何傑金氏淋巴瘤(柏基特氏淋巴瘤、慢性淋巴球性白血病、蕈樣肉芽腫、外套細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、毛細胞白血病漿細胞瘤、週邊型T細胞淋巴瘤，以及成人T細胞白血病∕淋巴瘤)、蘭格漢氏細胞組織球病、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常症候群、腦腫瘤(包括有神經膠質瘤、星型神經膠質瘤、神經膠質母細胞瘤、腦膜瘤，以及室管膜瘤)、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、骨肉瘤、卡波西氏肉瘤、骨幹骨肉瘤、血管肉瘤、血管外皮細胞瘤。

另外本發明亦包括，將包含本發明之Fc區域變異体的多胜肽，或是透過本發明之製造方法所製造出之包含Fc區域變異體的多胜肽，投入受試者(患者)的步驟，係有關於免疫發炎性疾病之治療方法或預防方法。

另外本發明至少包括了：包含本發明之Fc區域變異體的多胜肽，或是透過本發明之製造方法所製造出之包含Fc區域變異體的多胜肽，或是本發明之醫藥組成物，以提供給本發明之用於治療或預防方法的套組。該套組亦可以包裝其他物件，如藥物上可接受之載體、媒介、記載了使用方法之說明書等。另外本發明係關於，將包含本發明之Fc區域變異體的多胜肽，或是透過本發明之製造方法所製造出之包含Fc區域變異體的多胜肽，使用於免疫發炎性疾病之治療劑或預防劑的製造過程中。另外本發明係關於，將包含本發明之Fc區域變異體的多胜肽，或是透過本發明之製造方法所製造出之包含Fc區域變異體的多胜肽，使用本發明之治療方法或預防方法中。

本說明出中所使用之胺基酸的3字記號與1字記號，其對應之胺基酸如以下所示。丙胺酸：Ala：A 精胺酸：Arg：R 天冬醯胺：Asn：N 天門冬胺酸：Asp：D 胱胺酸：Cys：C 穀胺醯胺：Gln：Q 麩胺酸：Glu：E 甘胺酸：Gly：G 組胺酸：His：H 異白胺酸：Ile：I 白胺酸：Leu：L 離胺酸：Lys：K 甲硫胺酸：Met：M 苯基丙胺酸：Phe：F 脯胺酸：Pro：P 絲胺酸：Ser：S 羥丁胺酸：Thr：T 色胺酸：Trp：W 酪胺酸：Tyr：Y 纈草胺酸：Val：V

本說明書中所引用之所有的先前技術文獻，係作為參考而引入本文。 [實施例]

通過以下之實施例，對本發明進行更進一步的說明，同時本發明並非僅受限於下述實施例。

〔實施例1〕對現有之具有對FcgRIIb之結合能力增強之Fc的抗體，進行血小板聚集能力之評價如參考例4之表16所示，導入了將天然人類IgG1之EU編號第267號之Ser置換成Glu、第328號之Leu置換成Phe之變異之現有的FcgRIIb增強技術(非專利文獻28)，與IgG1相比之下，對FcgRIIb之結合增強為408倍，對FcgRIIaH之結合減弱為0.51倍，另一方面對FcgRIIaR之結合增強為522倍。如同「背景技術」中所述，儘管對FcgRIIa之結合增強，但對於只表現FcgRIIa之如血小板等細胞而言，其只會受到對FcgRIIa之增強效果的影響。亦即，對FcgRIIaR之結合效果增強之現有技術，會增強血小板之聚集活性，提高形成血栓的風險而造成危險。為了確認此點是否屬實，在抗體對FcgRIIa之結合活性實際增強的場合中，檢驗血小板之聚集活性是否增強。

與IgE結合之人類IgG1抗體之重鏈為omalizumab_VH-G1d(序列編號：25)，輕鏈為omalizumab_VL-CK(序列編號：26)，係使用參考例1之方法進行製造。另外，為了使對人類FcγRIIb之結合活性增強，將omalizumab_VH-G1d之EU編號第267號之Ser置換成Glu、第328號之Leu置換成Phe，從而製造出omalizumab_VH-G1d-v3。使用參考例1之方法，製造出包含重鏈為omalizumab_VH-G1d-v3、輕鏈為omalizumab_VL-CK之omalizumab-G1d-v3。使用此抗體，對血小板聚集能力進行評價。

血小板之聚集，係透過使用血小板聚集能力測量裝置Hema tracer712(LMS有限公司製)進行測量。首先，將大約50 mL的全血，等分地採取至含有0.5 mL 3.8%檸檬酸鈉的4.5 mL真空血液收集管中。將血液以200g離心15分鐘後，回收上清液，並作為富血小板血漿(Platelet Rich Plasma，PRP)。將得到之PRP以緩衝液1(137 mM NaCl、2.7 mM KCl、12 mM NaHCO ₃、0.42 mM NaH ₂PO ₄、2 mM MgCl ₂、5 mM HEPES、5.55 mM dextrose、1.5 U∕mL apyrase、0.35 % BSA)洗淨之後，再換成緩衝液2(137 mM NaCl、2.7 mM KCl、12 mM NaHCO ₃、0.42 mM NaH ₂PO ₄、2 mM MgCl ₂、5 mM HEPES、5.55 mM dextrose、2 mM CaCl ₂、0.35 % BSA)，調整成每1μL內大約含有300,000個洗淨之血小板。血小板聚集能力測量裝置中，設定好包含攪拌棒之測量用光析管，接著分別注入洗淨之血小板156 μL。機器中，光析管維持在37.0℃，攪拌棒以1000rpm之轉速攪拌血小板。加入44 μL 之mol比為1：1的omalizumab-G1d-v3與IgE之免疫複合體(最終濃度分別調製成600 μg∕mL與686 μg∕mL)，令其反應5分鐘。接著，加入濃度不足以引發2次聚集反應的二磷酸線苷(ADP、SIGMA)，以確保增強聚集反應。

從該檢驗所得到之每個捐贈者的FcγRIIa之基因多型(H∕H及R∕H)的結果，顯示於第1圖、第2圖中。第1圖之結果顯示，FcγRIIa之基因多型(R∕H)，在添加了免疫複合體之情況下，血小板之聚集增強。另一方面，如第2圖所示，在FcγRIIa之基因多型(H∕H)中，血小板之聚集沒有增強。

接下來，使用活化標誌來評估血小板之活化程度。血小板之活化，可以係透過測定CD62p(p-selectin)或被稱為活化型整合素之活化標誌於血小板膜表面上之表現量是否增加。對7.7μL之透過前述方法調整之洗淨的血小板，加入2.3μL之免疫複合體，於室溫下反應5分鐘後，接著加入ADP使最終濃度成為30μM，誘發活性化，藉由免疫複合體、透過ADP，以確保增強血小板之活化。負控制組中，使用添加了磷酸緩衝液(pH7.4、Gibco)之樣品，來取代免疫複合體。反應後，使用PE-標記抗CD62抗體(BECTON DICKINSON製)、PerCP-標記抗CD61抗體、FITC-標記PAC-1抗體(BD bioscience製)來將各樣品染色，透過流式細胞儀(FACS CantoII製、BD bioscience製)測量各種螢光強度。

透過此檢驗法所得到之CD62p之表現結果顯示於第3圖，活化型整合素之表現結果顯示於第4圖。洗淨之血小板係使用來自一位健康受試者之FcγRIIa的R∕H基因型。透過ADP刺激而被誘導表現於血小板膜表面上之CD62p及活化型整合素，在免疫複合體存在的情況下，兩者均增強。

從這些結果可知，具有將IgG1之Fc之 EU編號第267號之Ser置換成Glu、第328號之Leu置換成Phe的Fc、具有現有之對人類FcγRIIb之結合增強之Fc的抗體，在FcγRIIa之基因多型第131號之胺基酸為R的情況中，與第131號之胺基酸為H的情況相比之下，血小板之聚集活性增強。亦即，現有之具有對人類FcγRIIb之結合增強之Fc的抗體，在具有FcγRIIa R型的人體中，會因為血小板聚集而導致血栓形成之風險增加，具有危險性，為了克服這個問題，已知對FcγRIIb之結合選擇性增強之Fc的實用性。

〔實施例2〕對FcgRIIb之結合增強的變異體之製造如實施例1中所示，對FcgRIIb之結合增強時，為了盡可能地抑制對其他活化型FcgR之結合，必須增強對FcgRIIb之結合。在這裡研究，透過與同樣具有對FcgRIIb之結合增強、或選擇性增強之效果的變異體一起組合，使得對FcgRIIb之結合或選擇性更加增強之變異體的製作方式。具體而言，以對FcgRIIb之結合增強、選擇性向上提升兩個方面均表現出優秀效果之P238D變異為基礎，在參考例6、參考例8、參考例9中，與透過和P238D一起組合而產生效果之變異體，再更進一步地組合。製造之抗體重鏈的可變區為IL6R-H之可變區(序列編號：18)，其係在WO2009∕125825中所公開之、抗-人類介白素-6受體之抗體的可變區；抗體重鏈的恆定區為IL6R-Gld(序列編號：19)，其具有去除了人類IgG1之C末端的Gly與Lys之Gld。更進一步，製作出對IL6R-Gld導入了K439E之IL6R-B3(序列編號：23)。另一方面，在參考例6、參考例8、參考例9中，與P238D組合產生效果之變異，E233D、L234Y、G237D、S267Q、H268D、P271G、Y296D、K326D、K326A、A330R、A330K，製作出與該些變異組合之變異體。共同使用IL6R-L(序列編號：21)作為抗體輕鏈。按照參考例1之方法，表現、純化來自這些變異體之抗體，並透過參考例2之方法，評估對各種FcgR(FcgRIa、FcgRIIaH型、FcgRIIaR型、FcgRIIb、FcgRIIIaV型)之結合能力。

各種變異體對各種FcgR之KD值顯示於表1中。並且，表中之變異係指對IL6R-B3(序列編號：23)導入之變異。不過，製造各變異體時作為模板之IL6R-B3∕IL6R-L表示為*。表中的「KD(IIaR)∕KD(IIb)」係指，各變異體對FcgRIIaR之KD值除以各變異體對FcgRIIb之KD值所得到的數值，此數值越大表示對FcgRIIb之選擇性越高。「親代多胜肽之KD值(IIb)∕變異多胜肽之KD值(IIb)」係指，IL6R-B3 ∕ IL6R-L對FcgRIIb之KD值除以各變異體對FcgRIIb之KD值所得到的數值。另外，「親代多胜肽之KD值(IIaR)∕變異多胜肽之KD值(IIaR)」係指，IL6R-B3 ∕ IL6R-L對FcgRIIaR之KD值除以各變異體對FcgRIIaR之KD值所得到的數值。另外，表1中塗成灰色的表格，係表示FcgR對IgG之結合能力微弱，因為判斷無法透過動力學分析對其進行正確的分析，所以利用參考例2中記載之〔公式2〕

利用此公式計算出之數值。

[表1]

若是以導入了K439E之IL6-B3 ∕ IL6R-L對各FcgR之結合為1，具有天然人類IgG1序列之IL6R-Gld ∕ IL6R-L，對FcgRIa之結合為1.3倍、對FcgRIIaR之結合為1.1倍、對FcgRIIaH之結合為1.1倍、對FcgRIIb之結合為1.2倍、對FcgRIIIaV之結合活性為0.9倍，其對所有FcgR之結合的能力均同等於IL6R-Gld ∕ IL6R-L。因此，各變異體之結合能力，與導入變異之前的IL6R-B3 ∕IL6R-L相比的結果，等同於各變異體與具有天然人類IgG1序列之IL6R-Gld ∕ IL6R-L相比的結果。在以下的實施例中，各變異體之結合活性，係與導入變異前之IL6R-B3 ∕IL6R-L互相比較。

根據表1，與導入變異前之IL6R-B3相比之下，任何變異體對FcgRIIb之親合力均向上提升，最低者為IL6R-BF648∕IL6R-L，提升2.6倍，最高者為IL6R-BP230∕　IL6R-L，提升147.6倍。另外，表示選擇性之KD(IIaR)∕KD(IIb)之數值，最低者為IL6R-BP234∕IL6R-L，數值為10.0，最高者為IL6R-BP231∕IL6R-L，數值為32.2，與導入變異前之IL6R-B3 ∕IL6R-L之數值0.3相比之下，任何變異體之選擇性均向上提升。此外，任何變異體對FcgRIa、FcgRIIaH、FcgRIIIaV之結合能力，都比導入變異前之IL6R-B3 ∕IL6R-L要來的低。

〔實施例3〕對FcγRIIb之結合活性增強之Fc，與FcγRIIb細胞外區域組成之複合體，以及與FcγRIIaR型細胞外區域組成之複合體的X光晶體結構分析實施例2中對FcgRIIb之結合增強最多的變異體IL6R-BP230∕IL6R-L，與導入變異前之IL6R-B3 ∕IL6R-L相比之下，對FcgRIIb之結合能力增強為約150倍，對FcgRIIaR型之結合能力亦控制在1.9倍。因此，IL6R-BP230∕IL6R-L為一對FcgRIIb之結合、選擇性均優良之變異體，但是為了製作出更佳優良的變異體，較佳者為能夠盡可能地抑制對FcgRIIaR之結合而使得對FcgRIIb之結合能力更增強者。

如參考例7之第28圖所示，包含P238D變異之Fc中，CH2結構域B之EU編號第270號Asp，與FcγRIIb之第131號Arg之間，產生了強力的靜電相互作用，但是此第131號殘基在FcγRIIIa或FcγRIIaH型中為His，相對地在FcγRIIaR型中則與FcγRIIb一樣為Arg，結果導致此位置產生了相互作用與否的差異，這也是對FcγRIIaR型之選擇性低的主要原因。

另一方面，FcγRIIa與FcγRIIb兩者的細胞外區域之胺基酸序列有93%是一致的，相同性非常之高。分析由天然IgG1之Fc(以下表示為Fc(WT))與FcγRIIaR型的細胞外區域所組成之複合體的晶體結構(J. Imunol. 2011, 187, 3208-3217)，在兩者相互作用的介面附近，FcγRIIaR型與FcγRIIb之間僅有3個胺基酸(Gln127、Leu132、Phe160)之差異，因此要改善對FcγRIIaR型之選擇性，預計是相當困難。因此，為了能夠進一步增強對FcγRIIb之結合活性與提升結合選擇性，不僅僅只是要得到，由對FcγRIIb之結合增強的Fc與FcγRIIb細胞外區域所組成之複合體的立體結構，同時還要得到，與預計選擇性的改善是最困難之FcγRIIaR型細胞外區域所組成之複合體的立體結構，必須透過立體結構明白受體的差異所造成之相互作用間微妙的差異，以詳細地研究欲導入之胺基酸變異。於此，對在製作IL6R-BP230 ∕ IL6R-L時做為基礎之變異體IL6R-BP208 ∕ IL6R-L(參考例9中所製作)的Fc，去除K439E變異而得到Fc(P208)，對由該Fc(P208)與FcγRIIb細胞外區域、以及與FcγRIIaR型細胞外區域所組成之複合體，進行X光晶體結構分析。

3-1. Fc(P208)與FcγRIIb細胞外區域組成之複合體的X光晶體結構分析結構分析的結果，以2.81 Å之解析力測定Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區域複合體之立體結構，其分析結果得到之結構顯示於第5圖。兩個Fc CH2結構域彼此之間，透過夾在中間的FcγRIIb細胞外區域進行鍵結，類似於至今為止所分析之天然IgG之Fc，即Fc(WT)，與 FcγRIIIa　(Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 2011, 108, 12669-126674)、FcγRIIIb　(Nature, 2000, 400, 267-273; J.Biol.Chem. 2011, 276, 16469-16477)、FcγRIIa各種細胞外區域所組成之複合體的立體結構。

但是，觀看細節部分，Fc(P208)∕FcγRIIb細胞外區域複合體中，受到導入之G237D以及P238D的影響，與Fc(WT)∕FcγRIIaR型細胞外區域複合體相比之下，從Fc CH2結構域A之鉸鏈區開始接續之EU編號第233至239號之環狀區域的結構發生了改變(第6圖)。這個結果，被認為是由於Fc(P208)之EU編號第237號之Asp的主鏈與FcγRIIb之第160號Tyr的側鏈之間所產生之強力的氫鍵所導致(第7圖)。此Tyr160在FcγRIIa H型、R型中皆為Phe，因而無法形成氫鍵，因此，本氫鍵被認為對FcγRIIb之結合活性的提升，以及對FcγRIIa之結合活性的下降，即具有選擇性，具有重要的貢獻。

另一方面，Fc(P208)之EU編號第237號之Asp的側鏈本身與FcγRIIb之間沒有產生特別顯注的相互作用，與Fc內部之殘基也沒有發現相互作用。此EU編號第237號之Asp的周圍，坐落著 Fc內之EU編號第332號之Ile、EU編號第333號之Glu、EU編號第334號之Lys(第8圖)。若透過將這些位置置換成親水性殘基，則會與EU編號第237號之Asp側鏈之間產生相互作用，而能夠穩定本環狀區域結構，能夠減少與FcγRIIb之第160號之Tyr之間產生氫鍵時伴隨產生的熵能量損失，使得結合自由能增加，亦即，能夠導致結合活性向上提升。

參考例7中所示，具有P238D變異之Fc(P238D)和FcγRIIb細胞外區域複合體的X光晶體結構，與Fc(P208)和FcγRIIb細胞外區域複合體的X光晶體結構相比之下，Fc(P208)雖然比Fc(P238)包含了五個新的變異，但大部份的變異僅停留在變異側鏈的層級。不過，透過將Fc之CH2結構域B中EU編號第271號之Pro置換成Gly，除了可觀察到主鏈層級的位置變化，同時前面的EU編號第266-270號的環狀區域結構也發生變化(第9圖)。如參考例8中所示，Fc(P238D)中EU編號第270號Asp，與FcγRIIb之第131號Arg產生強力的靜電相互作用時，此EU編號第271號之Pro的位置，被提出可能會伴隨有立體化學性的壓力。現在，透過在EU編號第271號的位置導入Gly而產生的結構變化，認為可以消除在變異前之Pro位置所累積的結構性變形，據估計，此消除方法改善了與FcγRIIb之結合自由能，亦即，導致了結合活性的提升。

更進一步，已證實此EU編號第266-271號之環狀區域的結構變化，係因為EU編號第292號之Arg採取兩個狀態所導致的結構變化。此時，此EU編號第292號之Arg，會與Fc(P208)中其他變異殘基之一的EU編號第268號之Asp產生靜電相互作用(第9圖)，被認為有助於穩定本環狀區域之結構。因為本環狀區域中EU編號第270號之Asp與FcγRIIb之第131號之Arg之間產生的靜電相互作用，有助於增加與FcγRIIb之結合活性，H268D變異之導入係透過本環狀區域結構，使得FcγRIIb結合時之結構穩定化，能夠減少鍵結時伴隨產生的熵能量損失，使得結合自由能增加，亦即，能夠導致結合活性向上提升。

另外，以本結構分析結果為基礎，調查目標之能夠更進一步提升結合活性之變異的位置，發現變異導入位置的候補之一，是EU編號第239號之Ser。如第10圖所示，FcγRIIb之第117號之Lys，以結構性看起來最自然的形式延伸的方向，是此CH2結構域B之EU編號第239號之Ser的位置。不過，這次的分析中，尚未確認 FcγRIIb之第117號Lys的電子密度，因為本Lys殘基沒有固定的結構，故雖然認為現狀下此Lys殘基對Fc(P208)之相互作用的參予是被限制的，但在將此CH2結構域B之EU編號第239號的Ser置換成具有負電荷的Asp或Glu的情況下，可以預期其會與具有正電荷之FcγRIIb的第117號之Lys之間，產生靜電相互作用，而預期其結果是對FcγRIIb之結合活性向上提升。

另一方面，觀察CH2結構域A中EU編號第239號之Ser的結構，本胺基酸側鏈與EU編號第236號之Gly的主鏈產生氫鍵、與從鉸鏈區開始接續之FcγRIIb之Tyr160的側鏈產生氫鍵，被認為能夠穩定包含EU編號第237號之Asp之、從第233至239號之環狀區域的結構(第7圖)。本環狀區域結構將結合時的結構穩定化，能夠減少產生氫鍵時伴隨產生的熵能量損失，使得結合自由能增加，亦即，能夠導致合活性向上提升。另一方面，在將此CH2結構域A之EU編號第239號改變成Asp或Glu的情況下，會失去與EU編號第239號Gly主鏈間之氫鍵，進一步亦可能引起與鄰近之EU編號第265號Asp間的靜電排斥反應，被認為可能會導致環狀區域之結構非常不穩定。這些不穩定的能量，為了減少與FcγRIIb之結合自由能而作用，結果可能會導致結合活性降低。

［Fc(P208)之表現純化］ Fc(P208)之製備係如以下方式進行。首先，將IL6R-BP208(序列編號：24)之EU編號第439號之Glu置換成天然人類IgG1之序列中的Lys，製作出IL6R-P208。接著，將EU編號第220號之Cys置換成Ser、對EU編號第216號之Glu開始至C-末端以PCR進行選殖出之基因序列Fc(P208)，根據參考例1中記載之方法，進行表現載體之製作、表現、純化。此外，EU編號第220號之Cys，在正常的IgG1中，會與輕鏈之Cys之間產生雙硫鍵，但在只製備Fc的場合中，為了不共同表現出輕鏈，將Cys置換成Ser以避免產生不必要的雙硫鍵。

［FcγRIIb細胞外區域之表現純化］按照參考例2之方法進行製備。

［Fc(P208)FcγRIIb細胞外區域複合體之純化］對1.5mg結晶化所得到之FcγRIIb細胞外區域樣品，透過作為大腸桿菌的與glutathione S-transferase之融合蛋白，加入0.15mg經過表現純化之Endo F1(Protein Science 1996, 5, 2617-2622)，在0.1M Bis-Tris pH6.5之緩衝條件中，透過於室溫下靜置3日，使得N型糖鏈被切斷，留下直接鍵結在Asn上之N-acetylglucosamine。接著，對實施了此糖鏈斷開處理之FcγRIIb細胞外區域樣品，透過5000MWCO之超過濾膜進行濃縮，並在20mM HEPES pH7.5, 0.1M NaCl中達到平衡後，透過凝膠過濾管柱層析法(Superdex200 10∕300)進行純化。接著，對得到之斷開了糖鏈的FcγRIIb細胞外區域的餾分，依莫耳數比加入Fc(P208)，並使FcγRIIb細胞外區域稍微過量，透過10000MWCO之超過濾膜進行濃縮後，在25mM HEPES pH7.5, 0.1M NaCl中達到平衡，透過凝膠過濾管柱層析法(Superdex200 10∕300)進行純化，而得到Fc(P208)∕FcγRIIb細胞外區域複合體之樣品。

［Fc(P208)∕FcγRIIb複合體細胞外區域複合體之結晶化］將Fc(P208)∕FcγRIIb細胞外區域複合體之樣品，以10000MWCO之超過濾膜濃縮至大約為10mg∕ml，透過組合使用懸滴蒸氣擴散法與接種法(Seeding)而使之結晶化。結晶化係，使用VDXm板(Hampton Research製)，對0.1M Bis-Tris pH6.5、19%(w∕v) PEG3350, 0.2M Potassium Phosphate dibasic之儲存溶液(Reservoir solution)，依照儲存溶液：結晶化樣品＝0.85μl：0.85μl之比例混合，而製造出結晶滴(Crystallization drop)，此處，對在同樣的條件下所得到的相同複合體之結晶，加入0.15μl使用Seed Bead(Hampton Resaerch製)之由粉碎的晶種溶液作成之稀釋溶液，密閉於加入了儲存溶液的容器中，靜置於20℃下，成功得到板狀結晶。

［Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區域複合體結晶體的X光繞射數據之測量］將得到之Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區域複合體之一個單晶，浸泡於0.1M Bis-Tris pH6.5, 24%(w/v)PEG3350, 0.2M Potassium Phosphate dibasic, 20%(v/v)Ethylene glycol溶液之後，透過附有微小尼龍環的針汲取溶液，放入液態氮中冷凍，並透過Spring-8之BL32XU測量X光繞射數據。此外，測定時，放置在-178℃之氮氣中以維持凍結的狀態，並透過配備有射線的CCD探測儀MX-225HE(RAYONIX製)，將結晶體每旋轉0.6°就同時收集X光繞射圖像，共收集300張。根據得到之繞射圖像，使用Program Xia2(J. Appl. Cryst. 2010, 43, 186-190)、XDS Package(Acta Cryst. 2010, D66, 125-132)以及Scala(Acta Cryst. 2006, D62, 72-82)，決定晶格常數、編製繞射斑點索引，以及處理繞射數據，最後得到解析力高達2.81Å的繞射強度數據。本結晶體係屬於C222 ₁空間群，晶格常數a＝156.69Å、b＝260.17Å、c＝56.85Å、α＝90°、β＝90°、γ＝90°。

［Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區域複合體之X光晶體結構分析］結構測定係使用Program Phaser(J. Appl. Cryst. 2007, 40, 658-674)，透過分子置換法進行。根據得到之晶格大小與Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區域複合體的分子量，預測不對稱單位中複合體之數量為一。根據Fc(WT)/FcγRIIIa細胞外區域複合體之晶體結構PDB code: 3SGJ的結構座標，提取出A鏈第239-340號以及B鏈第239-340號部分的胺基酸殘基，作為不同的座標，各自用作Fc的CH2結構域之搜索用模型。同樣根據PDB code:3SGJ之結構座標，提取出A鏈第341-444號以及B鏈第341-443號部分的胺基酸殘基，作為一個座標，用作Fc CH3結構域之搜索用模型。最後，根據FcγRIIb細胞外區域之晶體結構PDB code: 2FCB的結構座標，提取出A鏈第6-178號部分的胺基酸殘基，用作Fc(P208)之搜索用模型。Fc CH3結構域、FcγRIIb細胞外區域、Fc CH2結構域的各個搜索用模型之晶格中的方向和位置，在根據旋轉函數與平移函數進行測定時，沒有測定到其中一個CH2結構域的位置。在這裡，根據從其他三個部分計算出之位相(Phase)，計算出電子密度圖，對照此電子密度圖，一邊參考Fc(WT)/FcγRIIIa細胞外區域複合體之晶體結構，一邊測定最後的CH2結構域之位置，而得到Fc(P208)/FcγRIIIb細胞外區域複合體之晶體結構的初始模型。對得到之初始模型，移動兩個Fc之CH2結構域、兩個Fc之CH3結構域，以及FcγRIIb細胞外區域，進行剛體精緻化時，此時25-3.0 Å之繞射強度數據的結晶學之可靠性因數R值為42.6%，Free R值為43.7%。接著，使用Program REFMAC5(Acta Cryst. 2011, D67, 355-367)將結構精緻化，並且以實驗測得之結構因子Fo、依模型計算出之結構因子Fc，以及依模型算出之位相(Phase)為基礎，計算出2Fo-Fc、Fo-Fc並作為係數，一邊看著電子密度圖，一邊在Program Coot(Acta Cryst. 2010, D66, 486-501)中進行模型修正，透過重複以上方法完成模型精緻化。最後，以2Fo-Fc、Fo-Fc作為係數，透過根據電子密度圖將水分子建入模型內、進行精緻化，使用27259個最終解析力為25-2.81Å之繞射強度數據，對應包含4786個非氫原子之模型，結晶學之可靠性因數R值為24.5%，Free R值為28.2%。

3-1. Fc(P208)與FcγRIIaR型細胞外區域之複合體的X光晶體結構分析結構分析的結果，測得Fc(P208)/FcγRIIaR型細胞外區域複合體之晶體結構的解析力為2.87Å。將Fc(P208)/FcγRIIaR型細胞外區域複合體的晶體結構，與實施例3-1中所示之Fc(P208)/FcγRIIb細胞外區域複合體的晶體結構相比時，反映出兩個受體具有非常高的胺基酸同源性，兩者的整體結構幾乎沒有差異(第11圖)。然而，若以電子密度層級詳細觀察，會發現有可以用於改善選擇性差異存在。在FcγRIIaR型中，第160號之殘基為Phe而非Tyr，正如第12圖所示，無法如包含P238D變異之Fc與FcgRIIb結合時，在與Fc CH2結構域A之EU編號第237號之胺基酸殘基的主鏈之間產生氫鍵。此即為何導入P238D變異會被認為是使FcγRIIaR型之選擇性改善的主要因素，更進一步，以電子密度層級的角度來比較，與FcγRIIb之複合體中，相對於Fc CH2結構域A中可辨識之EU編號第235號之Leu或第234號之Leu的側鏈之電子密度，在與FcγRIIaR型之複合體中，這些側鏈之電子密度並不清楚，被認為是因為隨著EU編號第237號之周邊的環狀區域與附近的FcgRIIaR型間的相互作用減少，而產生變動。另一方面，關於CH2結構域B，與相同區域之結構比較來看(第13圖)，在與FcγRIIb之複合體結構中，可以辨識直到EU編號第237號之Asp的電子密度，相對地，在與FcγRIIaR型之複合體中，僅辨識出直到EU編號第237號之Asp前面三個殘基的電子密度，與和FcγRIIb結合時相比之下，被認為使用了更廣的區域以產生相互作用。根據以上提出，在Fc(P208)之EU編號第234至238號的區域中，與FcγRIIb結合時CH2結構域A側之貢獻，會令與FcγRIIaR結合時CH2結構域B側之貢獻增加的可能性。

［FcγRIIaR型細胞外區域之表現純化］按照參考例2之方法進行製備。

［Fc(P208)/FcγRIIaR型細胞外區域複合體之純化］對1.5mg純化之FcγRIIaR細胞外區域樣品，透過作為大腸桿菌的與glutathione S-transferase之融合蛋白，加入經過表現純化的0.15mg之 Endo F1(Protein Science 1996, 5, 2617-2622)與20μl之5U∕ml Endo F2(QA-bio)，以及20μl之5U∕ml Endo F3(QA-bio)，在0.1M Na Acetate pH4.5之緩衝條件中，於室溫下靜置9日後，再透過作為大腸桿菌的與glutathione S-transferase之融合蛋白，追加經過表現純化的0.07mg之Endo F1(Protein Science 1996, 5, 2617-2622)與7.5μl之5U∕ml Endo F2(QA-bio)，以及7.5μl之5U∕ml Endo F3(QA-bio)，接著透過於室溫下靜置3日，使得N型糖鏈被切斷，留下直接鍵結在Asn上之N-acetylglucosamine。接著，對實施了此糖鏈斷開處理之FcγRIIaR型細胞外區域樣品，透過10000MWCO之超過濾膜進行濃縮，並在25mM HEPES pH7, 0.1M NaCl中達到平衡後，透過凝膠過濾管柱層析法(Superdex200 10∕300)進行純化。接著，對得到之斷開了糖鏈的FcγRIIaR型細胞外區域的餾分，依莫耳數比加入Fc(P208)，並使FcγRIIaR型細胞外區域稍微過量，透過10000MWCO之超過濾膜進行濃縮後，在25mM HEPES pH7, 0.1M NaCl中達到平衡，透過凝膠過濾管柱層析法(Superdex200 10∕300)進行純化，而得到Fc(P208)∕FcγRIIaR型細胞外區域複合體之樣品。

［Fc(P208)∕FcγRIIaR型細胞外區域複合體之結晶化］將Fc(P208)∕FcγRIIa R型細胞外區域複合體之樣品，以10000MWCO之超過濾膜濃縮至大約為10mg∕ml，透過坐滴蒸氣擴散法而使之結晶化。對0.1M Bis-Tris pH7.5、26%(w∕v)PEG3350, 0.2M Ammonium Sulfae之儲存溶液，依照儲存溶液：結晶化樣品＝0.8μl：1.0μl之比例混合，製造出結晶滴後，加蓋密封，靜置於20℃下，成功得到板狀結晶。

［Fc(P208)/FcγRIIaR型細胞外區域複合體結晶體的X光繞射數據之測量］將得到之Fc(P208)/FcγRIIaR型細胞外區域複合體之一個單晶，浸泡於0.1M Bis-Tris pH7.5, 27.5%(w/v)PEG3350, 0.2M Ammonium Sulfate, 20%(v/v)Glycerol溶液之後，透過附有微小尼龍環的針汲取溶液，放入液態氮中冷凍，透過高能加速器研究機構(High Energy Accelerator Research Organization)中同步輻射設施光子工廠(Phonton factory)之BL-17A，測量X光繞射數據。此外，測定時，放置在-178℃之氮氣中以維持凍結的狀態，並透過配備有射線的CCD探測儀Quantum 315r(ADSC製)，將結晶體每旋轉0.6°就同時收集X光繞射圖像，共收集225張。根據得到之繞射圖像，使用Program Xia2(J. Appl. Cryst. 2010, 43, 186-190)、XDS Package(Acta Cryst. 2010, D66, 125-132)以及Scala(Acta Cryst. 2006, D62, 72-82)，決定晶格常數、編製繞射斑點之索引，以及處理繞射數據，最後得到解析力高達2.81Å的繞射強度數據。本結晶體係屬於C222 ₁空間群，晶格常數a＝154.31Å、b＝257.61Å、c＝56.19Å、α＝90°、β＝90°、γ＝90°。

［Fc(P208)/FcγRIIaR型細胞外區域複合體之X光晶體結構分析］結構測定係使用Program Phaser(J. Appl. Cryst. 2007, 40, 658-674)，透過分子置換法進行。根據得到之晶格大小與Fc(P208)/FcγRIIaR型細胞外區域複合體的分子量，預測不對稱單位中複合體之數量為一。將實施例3-1中得到之Fc(P208)/FcγRIIIb細胞外區域複合體之晶體結構作為搜索用模型，根據旋轉函數與平移函數測定晶格中的方向和位置，進一步對得到之初始模型，移動兩個Fc之CH2結構域、兩個Fc之CH3結構域，以及FcγRIIIaR細胞外區域，進型剛體精緻化時，此時25-3.0 Å之繞射強度數據的結晶學之可靠性因數R為38.4%，Free R值為38.0%。接著，使用Program REFMAC5(Acta Cryst. 2011, D67, 355-367)將結構精緻化，並且以實驗測得之結構因子Fo、依模型計算出之結構因子Fc，以及依模型算出之位相為基礎，計算出2Fo-Fc、Fo-Fc並作為係數，一邊看著電子密度圖，一邊在Program Coot(Acta Cryst. 2010, D66, 486-501)中進行模型修正，透過重複以上方法完成模型精緻化。最後，以2Fo-Fc、Fo-Fc作為係數，透過根據電子密度圖將水分子建入模型內、進行精緻化，使用24838個最終解析力為25-2.87Å之繞射強度數據，對應包含4786個非氫原子之模型，結晶學之可靠性因數R值為26.3%，Free R值為29.8%。

〔實施例4〕以晶體結構為基礎測定變異位置之Fc變異體如實施例3中所示，對FcgRIIb結合能力增強之變異體Fc(P208)的CH2結構域B中，因為導入P271G之變異，而使周圍的結構產生變化，其結果為EU編號第268號之Asp與EU編號第292號之Arg產生了靜電相互作用(第9圖)。此相互作用之產生，使得EU編號第266-271號的環狀區域穩定化，被認為對FcγRIIb之結合增強的結果有所貢獻。已研究出，透過將此處的EU編號第268號之Asp改變成Glu，而強化了與FcγRIIb第292號之Arg間的靜電相互作用，使得本環狀區域之結構更加穩定，因而導致與FcgRIIb之相互作用增強。另外如第8圖所示，FcgRIIb之EU編號第160號之Tyr，會與 Fc(P208) CH2結構域A之EU編號第237號Asp的主鏈之間產生氫鍵，其對於與FcgRIIb之結合發揮了重要的功效。另一方面，與EU編號第237號之Asp的側鏈部分之間，沒有產生特定的相互作用之分子內EU編號第322號之Ile、EU編號第333號之Glu、EU編號第334號之Lys，坐落在附近的位置。一併驗證，是否能透過將這些位置置換成親水性殘基，增強與EU編號第237號Asp之相互作用、穩定本殘基附近之環狀區域結構，而使得與FcγRIIb第160號之Tyr之相互作用增強。

對實施例2中所製作之IL6R-BP230 ∕ IL6R-L(序列編號：27∕序列編號：21)，分別導入H268E、I332T、I332S、I332E、I332K、E333K、E333R、E333S、E333T、K334S、K334T、K334E，製作出各種變異體。共同使用IL6R-L(序列編號：21)作為抗體輕鏈。按照參考例1之方法，表現、純化來自這些變異體之抗體，並透過參考例2之方法，評估對各種FcgR(FcgRIa、FcgRIIaH型、FcgRIIaR型、FcgRIIb、FcgRIIIaV型)之結合能力。

各種變異體對各種FcgR之KD值顯示於表2中。並且，表中之變異係指對IL6R-B3(序列編號：23)導入之變異。不過，製造IL6R-BP230時作為模板之IL6R-B3∕IL6R-L表示為*。表中的親代多胜肽之KD值(IIb)∕變異多胜肽之KD值(IIb)係指，IL6R-B3∕IL6R-L對FcgRIIb之KD值除以各變異體對FcgRIIb之KD值所得到的數值。另外，親代多胜肽之KD值(IIaR)∕變異多胜肽之KD值(IIaR)係指，IL6R-B3 ∕ IL6R-L對FcgRIIaR之KD值除以各變異體對FcgRIIaR之KD值所得到的數值。KD(IIaR)∕KD(IIb)係指，各變異體對FcgRIIaR之KD值除以各變異體對FcgRIIb之KD值所得到的數值，此數值越大表示對FcgRIIb之選擇性越高。另外，表2中塗成灰色的表格，係表示FcgR對IgG之結合能力微弱，因為判斷無法透過動力學分析對其進行正確的分析，所以利用參考例2中記載之〔公式2〕

利用此公式計算出之數值。

[表2]

對IL6R-BP230∕IL6R-L導入了H268E之IL6R-BP264∕IL6R-L、導入了E333K之IL6R-BP465∕IL6R-L、導入了E333R之IL6R-BP466∕IL6R-L、導入了E333T之IL6R-BP470，在與IL6R-BP230∕IL6R-L相比之下，對FcgRIIb之結合力、選擇性均向上提升。另外，導入了I332T之IL6R-BP391∕IL6R-L，在與IL6R-BP230∕IL6R-L相比之下，對FcgRIIb之選擇性雖然降低，但對FcgRIIb之結合力向上提升。

〔實施例5〕對EU編號第271號周圍導入之全面的變異具有P238D變異之Fc(P238D)和FcγRIIb細胞外區域複合體之X光晶體結構，與Fc(P208)和FcγRIIb細胞外區域複合體之X光晶體結構相比之下，結構上發生最大變化的位置，是EU編號第271號附近的結構(第9圖)。如參考例8中所示，Fc(P238D)中EU編號第270號Asp與FcγRIIb之第131號Arg間產生強力的靜電相互作用時，在EU編號第271號Pro的位置，被提出可能會伴隨有立體化學性的壓力。在Fc(P208)∕FcγRIIb之結構中，透過導入P271G之變異，消除此結構性變形，因而發生主鏈層級的位置變化，被認為導致EU編號第271號周圍的結構發生劇烈改變。若是能在此發生改變之結構中導入使其更穩定化之變異的話，能夠更進一步地減少與FcγRIIb第131號Arg間產生靜電相互作用時伴隨產生的熵能量損失，使得結合活性向上提升。在這裡，對EU編號第271號周圍導入全面的變異，以尋找能夠顯示出對FcgRIIb之結合增強或選擇性向上提升效果的變異。對作為導入全面的變異之模板IL6R-B3(序列編號：23)，導入E233D、G237D、P238D、H268E、P271G，以製作出IL6R-BP267(序列編號：29)。對IL6R-BP267，將其EU編號第264號、265號、266號、267號、269號、272號之胺基酸，分別置換成除了原本的胺基酸和Cys以外之其他18種胺基酸。共同使用IL6R-L(序列編號：21)作為抗體輕鏈。按照參考例1之方法，表現、純化來自這些變異體之抗體，並透過參考例2之方法，評估對各種FcgR(FcgRIa、FcgRIIaH型、FcgRIIaR型、FcgRIIb、FcgRIIIaV型)之結合能力。從得到之變異體中，找出與導入變異前之IL6R-BP267 ∕ IL6R-L相比之下，對FcgRIIb之結合力增強者，或者是對FcgRIIb之選擇性向上提升者，並概括於表3中。

[表3]

各種變異體對各種FcgR之KD值顯示於表3中。並且，表中之「對IL6R-BP267加入之變異」，係指對作為模板之IL6R-BP267(序列編號：29)導入之變異。不過，製造IL6R-B3時，基礎之IL6R-B3∕IL6R-L表示為*。表中的親代多胜肽之KD值(IIb)∕變異多胜肽之KD值(IIb)係指，IL6R-B3∕IL6R-L對FcgRIIb之KD值除以各變異體對FcgRIIb之KD值所得到的數值。另外，親代多胜肽之KD值(IIaR)∕變異多胜肽之KD值(IIaR)係指，IL6R-B3∕IL6R-L對FcgRIIaR之KD值除以各變異體對FcgRIIaR之KD值所得到的數值。KD(IIaR)∕KD(IIb)係指，各變異體對FcgRIIaR之KD值除以各變異體對FcgRIIb之KD值所得到的數值，此數值越大表示對FcgRIIb之選擇性越高。另外，表3中塗成灰色的表格，係表示FcgR對IgG之結合能力微弱，因為判斷無法透過動力學分析對其進行正確的分析，所以利用參考例2中記載之〔公式2〕

利用此公式計算出之數值。

表3中所示之任何一個變異體，與IL6R-B3 ∕ IL6R-L相比之下，對FcgRIa、FcgRIIaH、FcgRIIIaV之結合能力均維持不變或減少。另外，對IL6R-BP267∕IL6R-L分別加入了S267A、V264I、E269D、S267E、V266F、S267G、V266M之變異體，與加入變異前之IL6R-BP267∕IL6R-L相比之下，對FcgRIIb之結合能力增強。另外，對IL6R-BP267∕IL6R-L分別加入了S267A、S267G、E272M、E272Q、D265E、E272D、E272N、V266L、E272I、E272F之變異體，與加入變異前之IL6R-BP267∕IL6R-L相比之下，KD(IIaR)∕KD(IIb)之值增加，表示其具有對FcgRIIb之選擇性向上提升的效果。

〔實施例6〕藉由導入變異至CH3區域，使得對FcgRIIb之結合增強根據報告，將EU編號第396號之Pro置換成Leu之變異，會使得對FcgRIIb之結合增強(Cancer Res., 2007, 67, 8882-8890)。EU編號第396號雖然是一個沒有直接參與和FcgR間之相互作用的位置，但透過改變抗體結構，其被認為會影響與FcgR間之相互作用。在這裡，透過對EU編號第396號導入全面的變異，以研究是否能夠使對FcgRIIb之結合或選擇性向上提升。對IL6R-B3(序列編號：23)導入E233D、G237D、P238D、S267A、H268E、P271G、A330R之變異，以製備出IL6R-BP423(序列編號：33)，並將其作為模板。對IL6R-BP423，製作出將EU編號第396號置換成除了原本的胺基酸和半胱胺酸以外之其他18種胺基酸之變異體。共同使用IL6R-L(序列編號：21)作為抗體輕鏈。按照參考例1之方法，表現、純化來自這些變異體之抗體，並透過參考例2之方法，評估對各種FcgR(FcgRIa、FcgRIIaH型、FcgRIIaR型、FcgRIIb、FcgRIIIaV型)之結合能力。得到之變異體對各種FcgR之結合能力概括於表4中。

[表4]

表中之「對IL6R-BP423加入之變異」，係指對IL6R-BP423導入之變異，不過，製作IL6R-B9423時，作為模板之IL6R-B3∕IL6R-L表示為*。表中的親代多胜肽之KD值(IIb)∕變異多胜肽之KD值(IIb)係指，IL6R-B3∕IL6R-L對FcgRIIb之KD值除以各變異體對FcgRIIb之KD值所得到的數值。另外，親代多胜肽之KD值(IIaR)∕變異多胜肽之KD值(IIaR)係指，IL6R-B3 ∕ IL6R-L對FcgRIIaR之KD值除以各變異體對FcgRIIaR之KD值所得到的數值。KD(IIaR)∕KD(IIb)係指，各變異體對FcgRIIaR之KD值除以各變異體對FcgRIIb之KD值所得到的數值，此數值越大表示對FcgRIIb之選擇性越高。另外，表4中塗成灰色的表格，係表示FcgR對IgG之結合能力微弱，因為判斷無法透過動力學分析對其進行正確的分析，所以利用參考例2中記載之〔公式2〕

利用此公式計算出之數值。

根據表4之結果，對IL6R-BP423∕IL6R-L導入了P396M之IL6R-BP456∕IL6R-L、導入了P396L之IL6R-BP455∕IL6R-L、導入了P396Y之IL6R-BP464∕IL6R-L、導入了P396F之IL6R-BP450∕IL6R-L、導入了P396D之IL6R-BP448∕IL6R-L、導入了P396Q之IL6R-BP458∕IL6R-L、導入了P396I之IL6R-BP453∕IL6R-L、導入了P396E之IL6R-BP449∕IL6R-L、導入了P396K之IL6R-BP454∕IL6R-L、導入了P396R之IL6R-BP459∕IL6R-L任何一者，與導入變異前之IL6R-BP423∕IL6R-L相比之下，對FcgRIIb之結合均向上提升。另外，根據KD(IIaR)∕KD(IIb)之數值，對IL6R-BP423∕IL6R-L導入了P396M之IL6R-BP456∕IL6R係，與導入變異前之IL6R-BP423∕IL6R-L相比之下，KD(IIaR)∕KD(IIb)之數值變大，對FcgRIIb之選擇性向上提升。表4中所製作之變異體，任何一者對FcgRIa、FcgRIIaH、FcgRIIIaV之親和性，均比親代多胜肽IL6R-B3∕IL6R-L要來的低。

〔實施例7〕利用亞綱序列製作FcgRIIb增強變異體人類IgG中有亞綱存在，其對FcgR之結合分佈不同。在這裡，無法利用IgG1與IgG4對各FcgR之親合性的差異，來驗證對FcgRIIb之結合、選擇性的向上提升。首先，分析IgG1與IgG4對各種FcgR之親和力。將作為抗體重鏈之人類IgG4EU編號第228號之Ser置換成Pro，製作出具有去除了C末端之Gly及Lys的G4d之IL6R-G4d(序列編號：30)。共同使用IL6R-L(序列編號：21)作為抗體輕鏈。按照參考例1之方法，表現、純化IL6R-G1d∕IL6R-L及IL6R-G4d∕IL6R-L，並透過參考例2之方法，評估對各種FcgR(FcgRIa、FcgRIIaH型、FcgRIIaR型、FcgRIIb、FcgRIIIaV型)之結合能力。得到之變異體對各種FcgR之結合能力概括於表5中。

[表5]

與IL6R-G1d∕IL6R-L相比之下，發現IL6R-G4d∕IL6R-L對FcgRIIb之結合增強了1.5倍，對FcgRIIaR之結合能力則減弱了2.2倍。另外，IL6R-G4d∕IL6R-L對FcgRIa、FcgRIIaH、FcgRIIIaV之親和力，均比IL6R-G1d∕IL6R-L要來的弱。根據以上結果可以明白，與IL6R-G1d相比之下，IL6R-G4d對FcgRIIb之結合、選擇性均較優秀。

第14圖為G1d與G4d之從CH1至C末端之序列(EU編號第118至445號)的比較圖。在第14圖中用框架圈起來的胺基酸，是表示G1d與G4d之間相差異的殘基。從這些不相同的胺基酸中，選擇一些預測有參與和FcgR間之相互作用的區域，透過將對FcgRIIb之結合、選擇性均優秀之G4d的序列移植到FcgRIIb增強變異體上，來驗證是否能使結合、選擇性更加提升。

具體而言，製作出對IL6R-BP230導入了A327G之IL6R-BP473、導入了A330S之IL6R-BP472、導入了P331S之IL6R-BP471、導入了A330S與P331S之IL6R-BP474、導入了A327G與A330S之IL6R-BP475、導入了A327G、A330S、P331S之IL6R-BP476、導入了A327G與P331S之IL6R-BP477。另外，將IL6R-BP230之從EU編號第118號之Ala到第225號之Thr，置換成G4d之序列(從EU編號第118號之Ala到222號之Pro)，製作出IL6R-BP478(序列編號31)。共同使用IL6R-L(序列編號：21)作為抗體輕鏈。按照參考例1之方法，表現、純化來自這些變異體之抗體，並透過參考例2之方法，評估對各種FcgR(FcgRIa、FcgRIIaH型、FcgRIIaR型、FcgRIIb、FcgRIIIaV型)之結合能力。

各種變異體對各種FcgR之KD值顯示於表6中。並且，表中的「親代多胜肽之KD值(IIb)∕變異多胜肽之KD值(IIb)」係指，IL6R-B3∕IL6R-L對FcgRIIb之KD值除以各變異體對FcgRIIb之KD值所得到的數值。「對IL6R-BP230加入之變異」，係指對IL6R-BP230導入之變異，不過，在製作IL6R-BP230時作為模板之IL6R-B3∕IL6R-L表示為*1，還有，將IL6R-BP230之從EU編號第118號之Ala到225號之Thr，置換成G4d之序列(從EU編號第118號之Ala到222號之Pro)所得到之IL6R-BP478(序列編號31)表示為*2。「親代多胜肽之KD值(IIaR)∕變異多胜肽之KD值(IIaR)」係指，IL6R-B3∕IL6R-L對FcgRIIaR之KD值除以各變異體對FcgRIIaR之KD值所得到的數值。KD(IIaR)∕KD(IIb)係指，各變異體對FcgRIIaR之KD值除以各變異體對FcgRIIb之KD值所得到的數值，此數值越大表示對FcgRIIb之選擇性越高。另外，表6中塗成灰色的表格，係表示FcgR對IgG之結合能力微弱，因為判斷無法透過動力學分析對其進行正確的分析，所以利用參考例2中記載之〔公式2〕

利用此公式計算出之數值。

[表6]

表6中所記載之變異體中，導入了A327G之IL6R-BP473∕IL6R-L，與IL6R-BP230∕IL6R-L相比之下，對FcgRIIb之結合增強了1.2倍。另外，將IL6R-BP230之從EU編號第118號之Ala到第225號之Thr，置換成G4d之序列(從EU編號第118號之Ala到222號之Pro)之IL6R-BP478∕IL6R-L，與IL6R-BP230∕IL6R-L相比之下，對FcgRIIb之結合、對FcgRIIaR之結合均增強了1.1倍。任何變異體對FcgRIa、FcgRIIaH、FcgRIIIaV之親合性，均較親代多胜肽IL6R-B3∕IL6R-L要來的低。

另外，如第14圖中所示，G1d與G4d之間其他相異的胺基酸區域，尚包括有EU編號第268號、第274號、第296號、第355號、第356號、第358號、第409號、第419號、第445號。因此，透過將這些區域置換成來自IgG4之胺基酸，被認為可以使對FcgRIIb之結合及選擇性向上提升。到目前為止之研究中，透過對變異體IL6R-BP230∕IL6R-L移植人類IgG4之序列A327G，能使對FcγRIIb之結合活性增強。在這裡，對IgG4與IgG1之序列間相差異的區域，進行更進一步的研究。具體而言，製作出對作為抗體重鏈之IL6R-BP230導入了K274Q之IL6R-BP541、導入了Y296F之IL6R-BP542、導入了H268Q之IL6R-BP543、導入了R355Q之IL6R-BP544、導入了D356E之IL6R-BP545、導入了L358M之IL6R-BP546、導入了K409R之IL6R-BP547、導入了Q419E之IL6R-BP548。共同使用IL6R-L作為抗體輕鏈。依照參考例1之方法，純化包含前述之重鏈變異體與IL6R-L之輕鏈的抗體。透過參考例2之方法，評估純化之抗體對各種FcgR(FcgRIa、FcgRIIaH型、FcgRIIaR型、FcgRIIb、FcgRIIIaV型)之結合能力各種變異體對各種FcγR之KD值顯示於表7中。並且，表中的「親代多胜肽之KD值(IIb)∕變異多胜肽之KD值(IIb)」係指，IL6R-B3∕IL6R-L對FcγRIIb之KD值除以各變異體對FcγRIIb之KD值所得到的數值。表中之「對IL6R-BP230加入之變異」，係指對IL6R-BP230導入之變異。不過，製造IL6R-BP230時，作為模板之IL6R-B3∕IL6R-L表示為*1。「親代多胜肽之KD值(IIaR)∕變異多胜肽之KD值(IIaR)」係指，IL6R-B3∕IL6R-L對FcgRIIaR之KD值除以該些變異體對FcgRIIaR之KD值所得到的數值。KD(IIaR)∕KD(IIb)係指，各變異體對FcγRIIaR之KD值除以該些變異體對FcγRIIb之KD值所得到的數值，此數值越大表示對FcγRIIb之選擇性越高。另外，表7中塗成灰色的表格，係表示FcγR對IgG之結合能力微弱，因為判斷無法透過動力學分析對其進行正確的分析，所以利用參考例2中記載之〔公式2〕

利用此公式計算出之數值。 [表7]

如表7中所示，對IL6R-BP230∕IL6R-L導入了K274Q之IL6R-BP541∕IL6R-L、導入了R355Q之IL6R-BP544∕IL6R-L、導入了D356E之IL6R-BP545∕IL6R-L、導入了L358M之IL6R-BP546∕IL6R-L，在與導入變異前之IL6R-BP230∕IL6R-L相比之下，對FcγRIIb之結合增強。並且其中，對IL6R-BP230∕IL6R-L導入了R355Q之IL6R-BP544∕IL6R-L、導入了D356E之IL6R-BP545∕IL6R-L、導入了L358M之IL6R-BP546∕IL6R-L，在與導入變異前之IL6R-BP230∕IL6R-L相比之下，KD(IIaR)∕KD(IIb)之數值增加，表示其為對FcγRIIb之選擇性向上提升的變異。

〔實施例8〕具有對FcgRIIb之結合增強、選擇性向上之變異的組合之研究對至今的研究中所發現之、對FcγRIIb之結合活性或選擇性向上提升之變異的組合進行研究，並且進一步嘗試最佳化。對IL6R-B3導入到目前為止的研究中對FcγRIIb之結合能力增強，及∕或選擇性向上提升之變異的組合。另外，作為比較對照的是，對IL6R-B3導入現有之對FcγRIIb之結合增強的變異(Seung等(Mol. Immunol.(2008)45, 3926-3933))，S267E及L328F，而製作出IL6R-BP253。使用IL6R-L作為抗體輕鏈。根據參考例1之方法表現，純化包含前述之重鏈變異體與IL6R-L之輕鏈的抗體。過參考例2之方法，評估純化之抗體對各種FcγR (FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIaR、FcγRIIb、FcγRIIIaV)之結合能力。各種變異體對各種FcγR之KD值顯示於表8中。並且，表中之變異係指對IL6R-B3導入之變異。不過，製作各種變異體時作為模板之IL6R-B3∕IL6R-L表示為*。親代多胜肽之KD值(IIb)∕變異多胜肽之KD值(IIb)係指，IL6R-B3∕IL6R-L對FcγRIIb之KD值除以各變異體對FcγRIIb之KD值所得到的數值。另外，親代多胜肽之KD值(IIaR)∕變異多胜肽之KD值(IIaR)係指，IL6R-B3∕IL6R-L對FcγRIIaR之KD值除以該些變異體對FcγRIIaR之KD值所得到的數值。KD(IIaR)∕KD(IIb)係指，各變異體對FcγRIIaR之KD值除以該些變異體對FcγRIIb之KD值所得到的數值，此數值越大表示，相較於FcγRIIaR，對FcγRIIb之選擇性越高。另外，KD(IIaH)∕KD(IIb)係指，各變異體對FcγRIIaH之KD值除以該些變異體對FcγRIIb之KD值所得到的數值，此數值越大表示，相較於FcγRIIaH，對FcγRIIb之選擇性越高。另外，表8中塗成灰色的表格中之數值，係表示FcγR對IgG之結合能力微弱，因為判斷無法透過動力學分析對其進行正確的分析，所以利用參考例2中記載之〔公式2〕

利用此公式計算出之數值。

[表8]

表8中所記載之變異體中，加入了現有之對FcγRIIb之結合增強的變異的IL6R-BP253∕IL6R-L，與導入變異前之IL6R-B3∕IL6R-L相比之下，其對FcγRIIb及對FcγRIIaR之結合活性分別增強了277倍與529倍。另外，IL6R-BP253∕IL6R-L對FcγRIa之結合活性，亦比IL6R-B3∕IL6R-L更增強。另一方面，IL6R-BP253∕IL6R-L，相較於IL6R-B3∕IL6R-L，對FcγRIIaH及對FcγRIIIaV之結合減弱了。在其他變異體中，IL6R-BP436∕IL6R-L、IL6R-BP438∕ IL6R-L、IL6R-BP567∕IL6R-L、IL6R-BP568∕IL6R-L，與導入變異前之IL6R-B3∕IL6R-L相比，對FcγRIa之結合能力也略有增強，但這些以外的其他變異體對FcγRIa之結合能力均減弱。另外，任何一種變異體，與IL6R-B3∕IL6R-L相比之下，對FcγRIIaH及對FcγRIIIaV之結合均減弱。本研究中所製作出之該些變異體，與現有的對FcγRIIb之結合增強的變異體IL6R-BP253∕IL6R-L相比之下，KD(IIaH)∕KD(IIb)之數值，最低者為IL6R-BP480∕IL6R-L之107.7，最高者為IL6R-BP426∕IL6R-L之8362，任何一種變異體均比IL6R-BP253∕IL6R-L之107.1要來的高。另外，KD(IIaR)∕KD(IIb)之數值，最低者為IL6R-BP479∕IL6R-L之16.1，最高者為IL6R-BP567∕IL6R-L之64.4，任何一種變異體均比IL6R-BP253∕IL6R-L之0.2要來的高。根據這些結果，證明表8中所記載之任何一種變異體，與加入了現有之對FcγRIIb之結合增強的變異的變異體相比之下，均為對FcγRIIb之選擇性向上提升之變異體。尤其是IL6R-BP559∕IL6R-L、IL6R-BP493∕IL6R-L、IL6R-BP557∕IL6R-L、IL6R-BP492∕　IL6R-L、IL6R-BP500∕IL6R-L、IL6R-BP567∕IL6R-L，任何一者對FcγRIIaR之結合，與IL6R-B3∕IL6R-L相比之下，均維持在1.5倍以下，同時對FcγRIIb之結合活性增強了100倍以上，因此，預期能夠避開因為對FcγRIIaR之結合增強而導致的副作用，同時對FcγRIIb之結合增強的效果。另外，IL6R-BP489∕IL6R-L、IL6R-BP487∕IL6R-L、IL6R-BP499∕IL6R-L、IL6R-BP498∕IL6R-L、IL6R-BP503∕　IL6R-L、IL6R-BP488∕IL6R-L、IL6R-BP490∕IL6R-L、IL6R-BP445∕　IL6R-L、IL6R-BP552∕IL6R-L、IL6R-BP507∕IL6R-L、IL6R-BP536∕　IL6R-L、IL6R-BP534∕IL6R-L、IL6R-BP491∕IL6R-L、IL6R-BP553∕　IL6R-L、IL6R-BP532∕IL6R-L、IL6R-BP506∕IL6R-L、IL6R-BP511∕　IL6R-L、IL6R-BP502∕IL6R-L、IL6R-BP531∕IL6R-L、IL6R-BP510∕　IL6R-L、IL6R-BP535∕IL6R-L、IL6R-BP497∕IL6R-L、IL6R-BP533∕　IL6R-L、IL6R-BP555∕IL6R-L、IL6R-BP554∕IL6R-L、IL6R-BP436∕　IL6R-L、IL6R-BP423∕IL6R-L、IL6R-BP440∕IL6R-L、IL6R-BP538∕　IL6R-L、IL6R-BP429∕IL6R-L、IL6R-BP438∕IL6R-L、IL6R-BP565∕　IL6R-L、IL6R-BP540∕IL6R-L、IL6R-BP426∕IL6R-L、IL6R-BP437∕　IL6R-L、IL6R-BP439∕IL6R-L、IL6R-BP551∕IL6R-L、IL6R-BP494∕　IL6R-L、IL6R-BP537∕IL6R-L、IL6R-BP550∕IL6R-L、IL6R-BP556∕　IL6R-L、IL6R-BP539∕IL6R-L、IL6R-BP558∕IL6R-L、IL6R-BP425∕　IL6R-L、IL6R-BP495∕IL6R-L對FcγRIIb之結合能力，遠高於加入了對FcγRIIb結合增強之現有的變異之IL6R-BP253∕IL6R-L，增強幅度從最低者IL6R-BP495∕IL6R-L至最高者IL6R-BP489∕IL6R-L，在以IL6R-B3∕IL6R-L之結合能力作為1的情況下，係從321倍至3100倍。因此，這些變異體可以說是，在對FcγRIIb之結合、選擇性兩方面，均較現有技術更優秀的變異體。在這裡，從對FcγRIIb之選擇性的角度來看被認為是最優秀的IL6R-BP567∕IL6R-L，以免疫原性的角度，對與之相關的變異體進行觀察。選擇性最高之IL6R-BP567∕IL6R-L，以及對FcγRIIaR之結合完全等同於天然型、對FcγRIIb之結合能力增強了147倍之IL6R-BP493∕IL6R-L中，有導入了Y296D之變異。根據報告，Y296D係包含在Tregitope序列之中(De Groot等(Blood(2008)112, 3303-3311))，在這個區域導入變異，可能會削弱原本之天然型IgG1所具有的免疫抑制功能。從免疫原性的角度來看，不包含Y296D變異之變異體為較佳者。IL6R-BP568∕IL6R-L及IL6R-BP492∕IL6R-L係，各自從IL6R-BP567∕IL6R-L及IL6R-BP493∕IL6R-L移除Y296D變異之者。從對FcγRIIb之結合活性及選擇性的角度來看，IL6R-BP492∕IL6R-L及IL6R-BP568∕IL6R-L透過移除掉Y296D變異，選擇性與結合活性均比包含Y296D的情況要來的低。然而，與天然型相比之下，IL6R-BP568∕IL6R-L對FcγRIIaR之結合為1.6倍、對FcγRIIb之結合為211倍，而且，IL6R-BP492∕IL6R-L對FcγRIIaR之結合為1.2倍、對FcγRIIb之結合為131倍，依然維持著高的選擇性與結合活性。根據這些結果， IL6R-BP568∕IL6R-L及IL6R-BP492∕IL6R-L可以說是，除了對FcγRIIb之結合活性、選擇性之外，對免疫原性方面而言亦是優良的變異體。

〔實施例9〕透過異質性二聚化抗體增強對FcgRIIb之結合 9-1.僅在單鏈上導入P238D之研究如參考例7中第26圖所示，Fc(P238D)得到對FcgRIIb之高FcgRIIb結合能力的主要因素，係透過導入P238D變異，使得Pro與周圍殘基組成之疏水性核心，因為被改變成Asp而使得疏水性核心將不復存在，而面向溶劑側，此即為造成結構域A之環狀區域的結構發生劇烈變化的原因。然而，是否有必要對兩條鏈都導入P238D變異，還有，是否可以對單鏈導入P238D變異、對另一鏈導入其他變異，針對這幾點仍有研究的空間。在這裡，利用對抗體之各重鏈導入了不同變異的異質性二聚化抗體，對此進行驗證。抗體重鏈係，使用包含，WO2009∕041062中公開之改善了血漿動力學的抗-Glypican 3抗體GpH7的CDR，之Glypican 3抗體的可變區(序列編號：15)。將可變區中具有GpH7的IgG1之C末端的Gly及Lys去除，而得到GpH7-G1d(序列編號：34)，使用對GpH7-G1d導入D356K與H435R變異而得到之GpH7-A5(序列編號：35)、對GpH7-G1d導入K439E變異而得到之GpH7-B3(序列編號：17)。對各個重鏈導入之D356K及K439E之變異係，在兩條重鏈形成異質性二聚化抗體時，為了使各重鏈之異質體有效率地形成，而被導入(WO2006∕106905)。H435R是會阻礙對ProteinA之結合的變異，其導入是為了更有效率的分離開由導入了不同變異的兩條重鏈所形成的二聚體異質體、與由導入了相同變異的兩條重鏈所形成的二聚體同質體。一側的重鏈，係使用將參考例1中製作之GpH7-B3(序列編號：17)EU編號第236號、237號、238號胺基酸置換回原本的胺基酸與Cys的變異體。另外一側的重鏈則是使用對GpH7-A5(序列編號：35)導入P238D所製作出之GpH7-AP001。抗體輕鏈係共同使用WO2009∕041062中公開之改善了血漿動力學的抗-Glypican 3抗體的GpL16-k0(序列編號：16)。按照參考例1之方法，表現、純化這些變異體，並透過參考例2之方法，評估對各變異體對FcgRIIaR型、對FcgRIIb之結合能力。各變異體對各種FcgR之結合量顯示於第15圖中。

第15圖中所示之G237W、G237F、G236N、P238G、P238N、P238E、P238D變異，係指對GpH7-B3導入之變異。另外，A5 ∕ B3不論哪一條鏈都沒有導入變異，表示為GpH7-A5 ∕ GpH7-B3 ∕ GpL16-k0，僅單鏈包含P238D之變異體，則表示為GpH7-A5 ∕ GpH7-BF648 ∕ GpL16-k0。這些結果顯示於表9中。

[表9]

表9中之「對FcgRIIb之結合量∕對FcgRIIaR之結合量」係指，各變異體對FcgRIIb之結合量除以各變異體對FcgRIIaR之結合量所得到的數值，此數值越大表示對FcgRIIb之選擇性越高。另外，「對GpH7-A5導入之變異」以及「對GpH7-B3導入之變異」，分別係指對GpH7-A5以及對GpH7-B3導入之變異，在製作GpH7-A5與GpH7-B3時，作為模板之GpH7-G1d表示為*。根據表9的結果，兩條鏈上皆具有P238D變異之GpH7-AP001∕GpH7-BF648∕GpL16-k0，對FcgRIIb之選擇性最高。另外，在另一鏈上具有P238E、P238N、P238G之GpH7-AP001∕GpH7-BP061∕GpL16-k0、GpH7-AP001∕GpH7-　BP069∕GpL16-k0、GpH7-AP001∕GpH7-BP063∕GpL16-k0，對FcgRIIb之結合量∕對FcgRIIaR之結合量，分別為2.9、2.2、1.7，與兩條鏈上皆具有P238D變異之GpH7-AP001∕GpH7-BF648∕　GpL16-k0相比之下，均維持對FcgRIIb之高選擇性。另外，關於對FcgRIIb之親和力，因為均維持在兩條鏈上皆具有P238D變異之GpH7-AP001∕GpH7-BF648∕GpL16-k0的69%以上，若在單鏈上存在有P238D變異的話，另一條鏈上則可以使用P238E、P238N、P238G代替。另外，著重於對FcgRIIb之結合時，已知，和在兩條鏈上皆含有P238D的GpH7-AP001∕GpH7-BF648∕GpL16-k0相比之下，僅在單鏈上含有P238D、另一鏈上未包含變異之GpH7-A5∕GpH7-BF648∕　GpL16-k0對FcgRIIb之結合能力較強；單鏈上含有P238D、另一鏈上分別含有G236N、G237F、G237W之GpH7-AP001∕GpH7-　BP032∕GpL16-k0、GpH7-AP001∕GpH7-BP044∕GpL16-k0、GpH7-　AP001∕GpH7-BP057∕GpL16-k0，對FcgRIIb之結合能力更強。

9-2. 以 Fc(P208)∕FcgRIIb之結構信息為基礎的變異之檢驗如第10圖所示，在Fc(P208)∕FcgRIIb之晶體結構中，尚未觀察到FcgRIIb第117號之Lys的電子密度，本殘基被認為並無明顯參與和Fc(P208)間的結合，透過將附近的CH2結構域B之EU編號第239號Ser置換成Asp或Glu，可使得與此FcgRIIb之第117號Lys之間產生靜電相互作用。另一方面，如第7圖中所示之CH結構域A中，EU編號第239號Ser與EU編號第236號Gly之間會產生氫鍵，穩定EU編號第233至239號之環狀區域結構，因此被認為有助於強化與FcgRIIb之EU編號第160號Tyr之間的結合，若置換此區域，預測會造成CH2結構域A中環狀區域結構的不穩定，並因此導致結合活性降低，而同質性變異則被預計能夠抵銷這些後果。在這裡，本研究係透過異質性二聚化，僅於單鏈上導入S239D或S239E變異，檢驗對FcgRIIb之結合的增強效果。

對作為一側抗體重鏈之IL6R-BP208(序列編號：24)導入S239D製作出IL6R-BP256，以及導入S239E製作出IL6R-BP257。同樣地，對IL6R-BP230(序列編號：27)導入S239D製作出IL6R-BP259，以及導入S239E製作出IL6R-BP260。對作為另一側抗體重鏈之IL6R-A5(序列編號：69)，導入與IL6R-BP208之CH2中所包含之相同的變異E233D、G237D、P238D、H268D、P271G、A330R，以製作出IL6R-AP002，以及導入與IL6R-BP230之CH2中所包含之相同的變異E233D、G237D、P238D、H268D、P271G、Y296D、A330R，以製作出IL6R-AP009，並使用之。另外，作為比較對象的，係對IL6R-B3導入現有的FcgRIIb增強技術(非專利文係28)，S267E、L328F，所製作出之IL6R-BP253(序列編號：32)。共同使用IL6R-L(序列編號：21)作為抗體輕鏈。按照參考例1之方法，表現、純化來自這些變異體之抗體，並透過參考例2之方法，評估對各種FcgR(FcgRIa、FcgRIIaH型、FcgRIIaR型、FcgRIIb、FcgRIIIaV型)之結合能力。

各種變異體對各種FcgR之KD值顯示於表10中。表中的「親代多胜肽之KD值(IIb)∕變異多胜肽之KD值(IIb)」係指，IL6R-B3∕IL6R-L對FcgRIIb之KD值除以各變異體對FcgRIIb之KD值所得到的數值。另外，「親代多胜肽之KD值(IIaR)∕變異多胜肽之KD值(IIaR)」係指，IL6R-B3∕IL6R-L對FcgRIIaR之KD值除以各變異體對FcgRIIaR之KD值所得到的數值。「KD(IIaR)∕KD(IIb)」係指，各變異體對FcgRIIaR之KD值除以各變異體對FcgRIIb之KD值所得到的數值，此數值越大表示對FcgRIIb之選擇性越高。另外，表10中塗成灰色的表格，係表示FcgR對IgG之結合能力微弱，因為判斷無法透過動力學分析對其進行正確的分析，所以利用參考例2中記載之〔公式2〕

利用此公式計算出之數值。

[表10]

根據表10的結果，對IL6R-BP208∕IL64-L之單鏈導入了S239D之IL6R-AP002∕IL6R-BP256∕IL6R-L、導入了S239E之IL6R-AP002∕IL6R-BP257∕IL6R-L，兩者對FcgRIIb之結合能力均比IL6R-BP208∕IL6R-L要來的增強。另外，KD(IIaR)∕KD(IIb)之數值亦均遠高於IL6R-BP208 ∕ IL6R-L，對FcgRIIb之選擇性亦向上提升。另一方面，對IL6R-BP208∕IL6R-L之兩鏈都導入了S239D之IL6R-BP256∕　IL6R-L，以及，對兩鏈都導入了S239E之IL6R-BP257∕IL6R-L，對FcgRIIb之結合、選擇性，與IL6R-BP208∕IL6R-L相比之下，均大幅地降低。相對於僅對一側的鏈導入S239D或S239E的情況下發現之對FcgRIIb的結合增強效果，在對兩鏈上都導入的情況下對FcgRIIb之結合大幅地降低的理由，如前所述，CH2結構域A中環狀區域結構的不穩定被認為是主要因素。在以IL6R-BP230 ∕ IL6R-L為模板，導入了S239D、S239E的情況下，也發現相同的結果。對IL6R-BP230∕IL6R-L的單鏈，分別導入了S239D、S239E之IL6R-AP009∕IL6R-BP259∕IL6R-L、IL6R-AP009∕IL6R-BP260∕IL6R-L，兩者對FcgRIIb之結合、選擇性均遠高於IL6R-BP230∕IL6R-L，而對兩鏈都分別導入了S239D、S239E之IL6R-BP259∕IL6R-L、IL6R-BP260∕IL6R-L，兩者者對FcgRIIb之結合、選擇性，與IL6R-BP230∕IL6R-L相比之下，均大幅降低。另外，對IL6R-BP208∕IL6R-L及IL6R-BP230∕IL6R-L的單鏈導入了S239D或S239E之變異體，對FcgRIIb之結合、選擇性，均遠高於利用了任何現有FcgRIIb增強技術之IL6R-BP253∕IL6R-L。

9-3. 以Fc(P208)∕FcgRIIaR之結構信息為基礎的變異之檢驗比較實施例3中與Fc(P208)之與FcgRIIb的晶體結構和與FcgRIIaR的晶體結構時，可以觀察到，與FcgRIIb160號Tyr間產生氫鍵之EU編號第237號的周圍，有電子密度上的差異，表示CH2結構域A側對與FcgRIIb之結合有大的貢獻、CH2結構域B側對與FcgRIIaR之結合有大的貢獻(第12圖、第13圖)。例如，從電位密度的角度來看，在與FcgRIIaR型之結合中，CH2結構域B之EU編號第234號Leu、第235號Leu，被認為參與了和受體之結合，但另一方面，在與FcgRIIb之結合中，這些殘基被認為參與的關係小。此處，透過將這兩個殘基置換成疏水性以外的殘基，認為能夠大幅降低與FcgRIIaR型間之相互作用。不過，CH2結構域A側中，EU編號第234號Leu、第235號Leu殘基，被認為對EU編號第237號附近的環狀區域結構的穩定化有所貢獻，特別是極有可能是透過與FcgRIIb之結合而使貢獻更大。因此，將這些殘基置換成疏水性以外的殘基，會更加降低在CH2結構域A中與FcgRIIb的相互作用。特別是EU編號第235號Leu，在與FcgRIIb之複合體結構的CH2結構域A中，其產生了良好的疏水性作用，被認為對EU編號第237號附近的環狀區域結構之穩定化有很大的貢獻，因此，進行僅在單鏈上將本殘基置換成疏水性以外殘基的研究。另外，透過將兩鏈之EU編號第235號Leu置換成其他的疏水性胺基酸，會特別更加強化CH2結構域A中的疏水性相互作用，若能使EU編號第237號附近的環狀區域結構更加穩定的話，能夠減少與FcγRIIb之第160號Tyr之間產生氫鍵時伴隨產生的熵能量損失，能夠導致對FcgRIIb之結合及選擇性向上提升，對此現象一併進行研究。

對作為抗體重鏈之IL6R-B3(序列編號：23)導入E223D、G237D、P238D、H268E、P271G、Y296D、A330R，製作出IL6R-BP264(序列編號：28)，並以之作為模板。製作出將IL6R-BP264之EU編號第234號之Leu，分別置換成Asn、Ser、Asp、Gln、Glu、Thr、Arg、His、Gly、Lys、Tyr的變異體。另外，製作出將IL6R-BP264之EU編號第235號的胺基酸，置換成除了原本的胺基酸與Cys以外的其他18種胺基酸之變異體。另一條抗體重鏈，係使用對IL6R-A5(序列編號：69)導入E233D、G237D、P238D、H268E、P271G、Y296D、A330R所製作出之IL6R-AP029(序列編號：42)。共同使用IL6R-L(序列編號：21)作為抗體輕鏈；對IL6R-BP264導入了L234N、L234S、L234D、L234Q、L234E、L234T、L234R、L234H、L234G、L234K、L234Y之變異體，與導入了L235W、L235M、L235P、L235F、L235A、L235V、L235I之變異體，作為兩鏈上含有相同變異之同質體；導入了L235N、L235S、L235D、L235Q、L235E、L235T、L235R、L235H、L235G、L235K、L235Y之變異體，與IL6R-AP029一起組合，作為異質性二聚化抗體，並對此進行研究。按照參考例1之方法，表現、純化來自這些變異體之抗體，並透過參考例2之方法，評估對各種FcgR(FcgRIa、FcgRIIaH型、FcgRIIaR型、FcgRIIb、FcgRIIIaV型)之結合能力。第16圖係以各變異體對FcgRIIb之KD值為橫軸，對FcgRIIaR之KD值為縱軸之曲線圖。

如第16圖所示，對IL6R-BP264∕IL6R-L之兩鏈導入了L234Y之IL6R-BP404∕IL6R-L，與導入變異前之IL6R-BP264∕IL6R-L相比之下，對FcgRIIb之結合能力略有增強。

將這些變異體中，對FcgRIIb之結合增強的IL6R-BP404∕IL6R-L，以及對FcgRIIb之選擇性向上提升的變異體，概括於表11中。表中的親代多胜肽之KD值(IIb)∕變異多胜肽之KD值(IIb)係指，IL6R-B3 ∕ IL6R-L對FcgRIIb之KD值除以各變異體對FcgRIIb之KD值所得到的數值。另外，親代多胜肽之KD值(IIaR)∕變異多胜肽之KD值(IIaR)係指，IL6R-B3∕IL6R-L對FcgRIIaR之KD值除以各變異體對FcgRIIaR之KD值所得到的數值。KD(IIaR)∕KD(IIb)係指，各變異體對FcgRIIaR之KD值除以各變異體對FcgRIIb之KD值所得到的數值，此數值越大表示對FcgRIIb之選擇性越高。另外，表11中塗成灰色的表格，係表示FcgR對IgG之結合能力微弱，因為判斷無法透過動力學分析對其進行正確的分析，所以利用參考例2中記載之〔公式2〕

利用此公式計算出之數值。

[表11]

如表11所示，對IL6R-BP264∕IL6R-L之兩鏈導入了L234Y之IL6R-BP404∕IL6R-L，與導入變異前之IL6R-BP264∕　IL6R-L相比之下，對FcgRIIb之結合提升了1.1倍。對IL6R-BP264 ∕ IL6R-L的兩鏈導入了L235Q之IL6R-BP408∕　IL6R-L、對兩鏈導入了L235F之IL6R-BP419∕IL6R-L、對單鏈導入了L235D之IL6R-AP029∕IL6R-BP407∕IL6R-L、對單鏈導入了L235Q之IL6R-AP029∕IL6R-BP408∕IL6R-L、對單鏈導入了L235E之IL6R-AP029∕IL6R-BP409∕IL6R-L、對單鏈導入了L235T之IL6R-AP029∕IL6R-BP410∕IL6R-L，任何一者的KD(IIaR)∕KD(IIb)之數值，均比導入變異前之IL6R-BP264∕　IL6R-L要來的大，是對FcgRIIb之選擇性提升的變異體。

〔實施例10〕透過in sillico免疫原性預測工具，對FcgRIIb之結合增強的Fc變異體進行免疫原性評估將本實施例中記載之Fc區域變異體作為抗體藥物使用的場合中，較佳者為不會誘導抗-藥物抗體的產生因而減弱其藥理作用者。因為免疫原性高的抗體很容易誘導抗-藥物抗體的生成，因此較佳者為免疫原性盡可能低的抗體藥物。為了盡可能地防止變異體之免疫原性增加，可以利用Epibase、EpiMatrix等用於預測T細胞抗原表位(T-cell epitope)之in silico免疫原性預測工具。Epibase Light (Lonza製)係一種使用FASTER algorism (Expert Opin Biol Ther. 2007 Mar;7(3):405-18.)，來計算與包含9肽與major DRB1等位基因之MHC ClassII之結合能力的in silico免疫原性預測工具。本工具可以辨認對MHC class II具有強力結合性之T-cell epitope(Strong epitopes)，與具有中等程度結合性之T-cell epitope(Medium epitopes)。計算結果係反映DRB1異型之豐度比，可以使用下列表12中顯示之白種人(Caucasian)中的豐度比。 [表12]

透過使用此工具，比較至今為止報告之各種Fc變異體、與本實施例中記載之對FcgRIIb選擇性結合增強之Fc變異體的序列中(EU編號第118號開始至C末端為止的序列)，所包含之聚有強力結合與中等程度結合之所有的T-cell epitope數量。具體而言，為了評價現有技術，而製作出下列者，作為比較對象：根據以往之報告(Proc Natl Acad Sci U S A. 2006,103:4005-10.)，對FcgRIIIa之結合增強、導入了S239D、A330L、I332E變異之抗體的Fc區域——Fc(DLE)(序列編號：78)，根據以往之報告(J Biol Chem. 2006, 281:23514-24.)，對FcRn之結合能力增強、導入了M252Y、S254T、T256E變異之抗體的Fc區域——Fc(YTE)(序列編號：79)，根據報告(Mol Immunol. 2008, 45:3926-33.)，對FcgRIIb之結合能力增強、導入了S267E、L328F變異之抗體的Fc區域——Fc(EF)(序列編號：80)，記載於WO2012∕115241中之對FcgRIIb之結合增強、導入了E233D、G237D、P238D、H268D、P271G、A330R變異之抗體的Fc區域——Fc(P208)(序列編號：81)；製作出，與本實施例中記載之對FcgRIIb之結合增強的變異體BP568一樣，導入了E233D、P238D、S264I、S267A、H268E、P271G變異之抗體的Fc區域 ——Fc(P587)(序列編號：70)，以及，與BP492一樣，導入了P238D、S264I、S267A、H268E、P271G變異之抗體的Fc區域 ——Fc(P588)(序列編號：71)，並使用Epibase，比較這些Fc變異體之所有的強力結合與中等程度結合之抗原表位數量。其結果顯示於表13。 [表13]

根據此結果，本實施例中所記載之變異體的Fc區域，Fc(P587)以及Fc(P588)，在現有的Fc變異體中，被證明其T-cell epitope數量少、免疫原性風險亦低。將此特性應用於醫藥品之使用上，被證明能夠減少抗-藥物抗體之誘導，屬優良者。

〔實施例11〕使用人類FcgRIIb基因轉殖小鼠，評估對人類FcgRIIb結合增強Fc變異體的血液動力學 (11-1)實驗概要如WO2013∕047752中所示，透過投入，在pH酸性環境的條件中具有對人類FcRn之結合活性、具有對抗抗原的抗原結合分子之結合活性會根據離子濃度條件而產生變化的抗原結合結構域、並且包含，與結合在EU編號第297號上之糖鏈為含有海藻糖的糖鏈之天然人類IgG的Fc區域對FcgR之結合結構域相比之下，對FcgR具有更高結合活性的FcgR結合結構域，之抗原結合分子，與天然人類IgG相比之下，能夠使得在生物體中成為目標物之可溶性抗原於血漿中的濃度大幅下降。根據報告，在FcgR之中也是，特別是在把對FcgRIIb之結合活性增強的抗原結合分子投入生物體內之情況下，能加速血漿中之可溶性抗原的消失，有效地降低血漿中可溶性抗原之濃度。本實施例中，藉由基因變異導入了人類FcgRIIb之基因轉殖小鼠，透過對其投入對人類FcgRIIb之結合增強的Fc變異體，來驗證利用本說明書中記載之實際對人類FcgRIIb之結合增強之Fc變異體中，能否加速成為目標物之可溶性抗原的消失速度。 (11-2)對FcgRIIb之結合增強之抗體的製備對人類FcgRIIb之結合增強的Fc變異體係使用以下的抗體。對WO2009∕125825中公開之抗-人類介白素6受體(人類IL-6R)抗體的可變區，與由去除了人類IgG1之C末端的Gly及Lys之G1d的恆定區域所製成的IL6R-G1d(序列編號：19)，導入與BP568相同的E233D、P238D、S264I、S267A、H268E、P271G變異，而製作出IL6R-P587。按照參考例1之方法，製備出具有以IL-6R-P587作為抗體重鏈，以WO2009∕125825中公開的抗-人類IL6R抗體之輕鏈IL6R-L2(序列編號：74)作為抗體輕鏈的Fv4-P587。另外，作為比較對象，同樣按照參考例1之方法，製備出具有分別將IL6R-G1d(序列編號19)與IL6R-L2(序列編號74)，作為抗體重鏈、輕鏈的Fv4-IgG1。在這裡製備的Fv4-G1d及Fv4-P587，正如WO2009∕125825中所記載一般，在酸性pH的條件下，比起在中性pH的條件下，對抗原，即人類IL-6R，為弱結合，具有抗原結合分子對抗原之結合活性會根據質子離子濃度的條件而產生變化的抗原結合結構域。 (11-3)人類FcgRIIb基因轉殖小鼠之製造人類FcgRIIb基因轉殖小鼠係根據以下方法製造。對C57BL∕6(B6)小鼠導入人類FcgRIIb基因，製作出基因轉殖小鼠。基因轉殖小鼠之製作，係按照「Nagy等(Manipulating the mouse embryo, CSHL press.(2003)399-506)」以及「上田等(基因標靶之最新技術，羊土社.(2000)190-207)」中記載之流程進行。亦即，透過對B6小鼠之受精卵原核仁，顯微注射選殖了人類FcgRIIb基因(GeneBank # NW_004077999：18,307,411-18,381,603)之基因組區域的大腸桿菌人工染色體(Bacterial artificial chromosome)而製成。使用人類FcgRIIb基因專一性雜交探針，以南方點墨法與PCR，從得到之小鼠中選出得到了人類FcgRIIb基因之小鼠。採集人類FcgRIIb基因轉殖小鼠之血液與肝臟，使用將人類FcgRIIb基因專一性放大之引子，以RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)確認人類FcgRIIb基因之表現。結果檢測出了人類FcgRIIb基因之表現。另外，從人類FcgRIIb基因轉殖小鼠之血液，分離出小鼠PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell)，透過FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting)分析，確認PBMC中之人類FcgRIIb的表現。結果檢測出了人類FcgRIIb基因之表現。根據以上，證實表現出人類FcgRIIb之人類FcgRIIb基因轉殖小鼠係可以建成的。 (11-4)使用人類FcgRIIb基因轉殖小鼠，進行於活體內同時投入抗原與抗體之實驗使用(11-3)中製作的人類FcgRIIb基因轉殖小鼠，同時投入作為抗原之可溶性人類IL-6R與(11-2)中製備的抗-人類IL-6R抗體，評估投入之後血漿中可溶性人類IL-6R之濃度以及抗-人類IL-6R抗體之濃度。從尾靜脈一次投入10 mL∕kg之可溶型人類IL-6R與抗-人類IL-6R抗體之混合溶液(分別為5μg∕mL、0.1 mg∕mL)。此時，因為對抗可溶型人類IL-6R的抗-人類IL-6R抗體足夠地過量，因此認為將近全部的可溶型人類IL-6R都會與抗體結合。收集投入5分鐘後、1小時後、4小時後、7小時後、1天後、3天後、7天後、14天後、21天後、28天後之血液。將收集之血液立即在4℃下，以15,000 rpm進行15分鐘的離心，得到其血漿。分離出之血漿，直到進行測量之前，都保存於溫度設定於-20℃以下的冷凍庫中。抗-人類IL-6R抗體，係使用上述之Fv4-P587、Fv4-IgG1。 (11-5)透過ELISA法測量血漿中抗-人類IL-6R抗體之濃度小鼠血漿中之抗-人類IL-6R抗體之濃度，係透過ELISA法進行測定。首先，將抗-人類IgG(γ鏈專一性) F(ab')2抗體片段(Sigma製)，分注到Nunc-ImmunoPlate, MaxiSorp(Nalge Nunc International製)中，並於4℃下靜置一晚，配製出抗-人類IgG固定化板(Immobolized plate)。製備出血漿中濃度為0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125μg∕mL之標準曲線樣品，以及稀釋了100倍以上之小鼠血漿測量樣品，對100μL之這些標準曲線樣品與血漿測量樣品中，加入200μL之20ng∕mL可溶型人類IL-6R，於室溫下攪拌一小時。之後，將其分注於抗-人類IgG固定化板中，接著於室溫下攪拌一小時。之後，將生物素化之抗-人類IL-6R抗體(R&D製)於室溫下反應一小時，接著將Streptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies製)於室溫下反應一小時，將TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories製)用作基質，進行顯色反應，接著以1N硫酸(Showa Chemical製)將反應停止後，在微量盤分析儀(Microplate reader)中以450nm吸光度進行測量。小鼠血漿中濃度係使用分析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices製)，從標準曲線之吸光度計算而出。透過此方法測定之靜脈內投藥後人類FcgRIIb基因轉殖小鼠血漿中抗體之濃度變化，顯示於第33圖。 (11-5)透過電化學發光法測量血漿中人類IL-6R之濃度小鼠血漿中人類IL-6R之濃度係透過電化學發光法進行測量。製備出血漿中濃度調整為12.5、6.25、3.13、1.56、0.781、0.391、0.195ng∕mL之人類IL-6R標準曲線樣品，以及稀釋了50倍以上之小鼠血漿測量樣品，在SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery製)中，將釕化之Monoclonal Anti-human IL-6R Antibody(R&D製)、Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D製)、與tocilizumab溶液混合，於37℃下反應1晚。之後，使用含有0.5%BSA(w∕v)之PBS-Tween溶液，於5℃下阻斷1晚後，分注於Streptavidin Gold Multi-ARRAY Plate(Meso Scale Discovery製)中。接著，於室溫下反應2小時洗淨後，分注於Read Buffer T(×2)(Meso Scale Discovery製)中，立即使用SECTOR Imager 2400 (Meso Scale Discovery製)進行測量。hSIL-6R之濃度係使用分析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices製)，從標準曲線之反應計算而出。透過此方法測定之靜脈內投藥後人類FcgRIIb基因轉殖小鼠血漿中可溶型IL-6R之濃度變化，顯示於第34圖。 (11-6)人類FcgRIIb結合增強之效果比較Fv4-IgG1，與對人類FcgRIIb之結合增強的Fv4-P587於活體內實驗的結果。如第33圖所示，兩者之抗體於血漿中的滯留性雖然幾乎相同，但如第34圖所示，確認了和對人類FcgRIIb之結合增強的Fv4-P587同時投入之人類IL-6R，與和Fv4-IgG1之同時投入之人類IL-6R相比之下，前者的人類IL-6R消失的速度變得較快。亦即，對pH依賴性人類IL-6R結合之抗體，透過增強對人類FcgRIIb之結合能力，發現能夠減少可溶型人類IL-6R之濃度。雖然沒有受到特定的理論約束，根據此結果，按照第35圖中所示之機制，觀察到透過納入以人類FcgRIIb來表現FcgRIIb的細胞，亦可以使得與該抗體結合之血漿中的可溶型抗原消失。結合在可溶型人類IL-6R上之抗體，與其所結合之可溶型人類IL-6R係，透過FcRn，與抗體一起在血漿中被回收，相對地，結合在pH依賴性可溶型人類IL-6R上之抗體Fv4-IgG1係，在核內體中之酸性條件下，將和抗體結合之可溶型人類IL-6R解離。因為解離之可溶型人類IL-6R會被溶酶體分解，能夠使得可溶型人類IL-6R之消失大幅加速，更進一步，結合在pH依賴性可溶型人類IL-6R上之抗體Fv4-IgG1，在核內體中與FcRN結合之後，於血漿中被回收。因為被回收之該些抗體可以再次與可溶型人類IL-6R結合，因此其不斷重複與抗原(可溶型人類IL-6R)結合以及被FcRn於血漿中回收。根據此結果，認為一個抗體分子能夠數次重複與可溶型人類IL-6R結合。更進一步，結合在pH依賴性抗原上之Fv4-IgG1，因為對FcgRIIb之結合活性增強，通過FcgRIIb，將結合在可溶型人類IL-6R上之抗體與可溶型人類IL-6R之複合體，快速地納入細胞內部，因此被認為能夠更有效率地減少可溶型人類IL-6R之濃度(第35圖)。

〔實施例12〕使用人類FcgRIIb與人類FcRn基因轉殖小鼠，評估對人類FcgRIIb結合增強Fc變異體的血液動力學 (12-1)實驗概要如WO2013∕047752中所示，透過使用，對FcγR之結合活性比對天然型IgG之Fc區域的結合活性更高、在pH酸性環境條件下對人類FcRn結合活性增強之抗原結合分子，與在pH酸性環境條件下對人類FcRn結合活性沒有增強之抗原結合分子相比之下，證實其於血漿中的滯留性向上提升。另一方面，根據報告，對FcγR之結合活性比對天然型IgG之Fc區域的結合活性更高、在pH酸性環境條件下對人類FcRn結合活性增強之抗原結合分子，與對FcγR之結合活性比對天然型人類IgG之Fc區域的結合活性更高、在pH酸性環境條件下對人類FcRn結合活性沒有增強之抗原結合分子相比之下，血漿中之目標抗原的濃度降低了。在這裡，對本實施例中記載之具有對人類FcgRIIb結合增強的Fc區域變異體之抗原結合分子，檢驗其是否具有同樣的性質。 (12-2)對FcγR之結合活性比對天然人類IgG之Fc區域的結合活性更高、在pH酸性環境條件下對人類FcRn結合活性增強的抗原結合分子之製造除了實施例11-2中記載之Fv4-IgG1、Fv4-P587之外，按照參考例1之方法，製備出，以對Fv4-P587的重鏈IL6R-P587，導入過去之改善了抗體血液動力學(Nat. Biotechnol. 2010. 28; 157-159)之將EU編號第428號之Met置換成Leu、第434號Asn之置換成Ser的變異，所製作出之IL6R-P587-LS(序列編號：73)作為抗體重鏈，以及以具有IL6R-L2的Fv4-P587-LS作為抗體輕鏈的抗體。 (12-3)分析對人類FcRn之相互作用製備之抗體對人類FcRn的相互作用分析，係使用NiacoreT200，於以下記載之感應晶片CM4(GE Healthcare製)上，透過胺偶合法將蛋白L(Bio Vision製)適量地固定化，並於此捕捉目標抗體。接著，注入FcRn稀釋液與電泳緩衝液(作為參考對照溶液)，使感應晶片上捕捉到之抗體與人類FcRn相互作用。電泳緩衝亦係使用50 mmol∕L磷酸鈉、150 mmol∕L NaCl、0.05%(w∕v)Tween20、pH6.0，FcRn亦是使用電泳緩衝液進行稀釋。晶片之再生係使用10 mmol∕L甘胺酸-HCl, pH1.5。全程於25℃下進行測量。根據測量得到之感應圖，計算出動力學參數之結合素率常數ka (1∕Ms)以及解離速率常素kd(1∕s)，以這些數值為基礎計算出各種抗體對人類FcRn之KD(M)。各參數係使用Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare製)進行計算。透過此方法進行測量時，這次所製備之抗體對人類FcRn之KD值，顯示於表14。如表14中所示，證明了Fv4-P587-LS，與Fv4-P587相比之下，對FcRn之結合在酸性條件中會增強。 [表14]

(12-4)人類FcgRIIb與人類FcRn基因轉殖小鼠之製造人類FcgRIIb、人類FcRn基因轉殖小鼠，以及鼠FcRn基因剔除小鼠，係根據以下方法進行製造。首先，製造出鼠FcRn基因剔除小鼠。基因剔除小鼠之製造係按照「Nagy等(Manipulating the mouse embryo, CSHL press.(2003)399-506)」中所記載之流程進行。亦即，製作出用於破壞鼠FcRn基因之標靶載體，將此載體導入ES細胞(來自C57BL∕6小鼠)，透過同源重組破壞鼠FcRn基因。從建立出之鼠FcRn基因剔除小鼠的肝臟提取出RNA，以RNA合成之cDNA作為模板，使用鼠FcRn專一性放大引子進行RT-PCR。其結果為，在鼠FcRn基因剔除小鼠中，檢測不到鼠FcRn基因。接著，對鼠FcRn基因剔除小鼠導入人類FcgRIIb與人類FcRn基因，製作出基因轉殖小鼠。基因轉殖小鼠之製造係按照「Nagy等(Manipulating the mouse embryo, CSHL press.(2003)399-506)」以及「上田等(基因標靶之最新技術, 羊土社.(2000)190-207)」中所記載之流程進行。亦即，透過對鼠FcRn基因剔除小鼠之受精卵原核仁，人類FcRn基因(GeneBank #NC_000019.9：50,000,108-50,039,865)及人類FcgRIIb基因(GeneBank # NW_004077999：18,307,411-18,381,603)之基因組區域的大腸桿菌人工染色體(Bacterial artificial chromosome)而製成。使用各基因專一性雜交探針，以南方點墨法與PCR，從得到之小鼠中選出導入了人類FcRn及人類FcgRIIb基因、並且鼠FcRn基因剔除等位基因被同型合子化之小鼠。採集人類FcgRIIb、人類FcRn基因轉殖小鼠，以及FcRn基因剔除小鼠之血液，使用將人類FcRn基因及人類FcgRIIb基因專一性放大之引子，以RT-PCR確認人類FcRn基因及人類FcgRIIb基因之表現。結果檢測出了人類FcRn基因及人類FcgRIIb基因之表現。根據以上，證實表現出人類FcRn及人類FcgRIIb、不表現鼠FcRn之人類FcgRIIb、人類FcRn基因轉殖小鼠，以及鼠FcRn基因剔除小鼠係可以建成的。 (12-5)pH酸性環境之條件下，透過增強對人類FcRn結合活性來改善藥物動力學對人類FcgRIIb及人類FcRn基因轉殖小鼠，分別投入Fv4-IgG1、Fv4-P587以及Fv4-P587-LS，進行與實施例11之方法相同的活體內實驗，測量該些小鼠群之血漿中可溶型IL-6R及血漿中抗-人類IL-6R抗體之濃度。血漿中抗-人類IL-6R抗體及血漿中可溶型IL-6R之濃度的測量結果，分別顯示於第36圖、第37圖中。在投入了於pH酸性環境中對人類FcRn之結合活性增強的Fv4-P587-LS之小鼠群中，與投入了Fv4-P587之小鼠群相比之下，證實Fv4-P587之抗體於血漿中的滯留性向上提升。除此之外，Fv4-P587-LS，比起Fv4-IgG1，於血漿中之滯留性更向上提升。另一方面，投入了Fv4-P587-LS之小鼠群的血漿中可溶型IL-6R濃度，相等於投入了Fv4-P587之小鼠群。投入了Fv4-P587-LS或Fv4-P587之小鼠群，比起投入了Fv4-IgG1之小鼠群，血漿中可溶型IL-6R之濃度降低。根據以上，透過投入，對人類FcgRIIb之結合活性比對天然型人類IgG之Fc區域的結合活性更高之抗原結合分子中，在pH酸性環境條件下對人類FcRn之結合活性增強的抗體，證實了接受該投藥之生物體中，投入之抗原結合分子於血漿中的滯留性能夠向上提升。更進一步，在投入了抗原結合分子之生物體中，證實了抗原結合分子於血漿中的滯留性向上提升，並且該生物體中抗原消失的效果並沒有減弱，而是能夠繼續維持抗原消失的效果。 pH酸性環境條件下，用於增強對人類FcRn之結合活性之變異，並無特別限制，亦可以使用：將IgG抗體之EU編號第428號之Met置換成Leu、第434號之Asn置換成Ser之方法(Nat. Biotechnol.(2010)28, 157-159)，將第434號之Asn置換成Ala之方法(Drug Metab. Dispos.(2010)38(4)600-605)，將第252號之Met置換成Ty、第254號之Ser置換成Thr、第256號之Thr置換成Glu之方法(J. Biol. Chem.(2006)281, 23514-23524)，將第250號之Thr置換成Gln、第428號之Met置換成Leu之方法(J. Immunol.(2006)176(1), 346-356)，將第434號之Asn置換成His之方法(Clin. Pharmcol. Ther.(2011)89(2)283-290)，以及記載於WO2010∕106180、WO2010∕045193、WO2009∕058492、 WO2008∕022152、WO2006∕　050166、WO2006∕053301、WO2006∕031370、WO2005∕123780、WO2005∕047327、WO2005∕037867、WO2004∕035752、WO2002∕　060919等中之變異。

〔參考例1〕抗體之表現載體的製作，以及抗體之表現與純化編碼出抗體可變區之重鏈及輕鏈的鹼基序列之全長基因的合成，係使用Assemble PCR等，以該領域中已知的方法進行製作。胺基酸置換的導入，係使用PCR等以該領域中已知的方法進行。將得到之質體片段插入動物細胞表現載體中，製作出重鏈表現載體與輕鏈表現載體。得到之表現載體的鹼基序列係以該領域中已知的方法來測定。將製造出之質體，暫時性地導入來自人類胚胎腎癌細胞之HEK293H株(Invitrogen公司製)或FreeStyle293細胞(Invitrogen公司製)中，進行抗體之表現。將得到之培養上清液回收後，通過0.22μm過濾器MILLEX(R)-GV(Millipore製)、或0.45μm過濾器MILLEX(R)-　GV(Millipore製)，得到培養上清液。使用rProtein A Sepharose Fast Flow(GE Healthcare製)或Protein G Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare製)，以該領域中已知的方法，從得到之培養上清液純化出抗體。純化之抗體的濃度係使用分光光度計，以280nm之吸光度測量，並以PACE等方法從得到之數值計算出消光係數，使用消光係數計算出抗體濃度(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423)。

〔參考例2〕FcγR之製備方法及變異抗體與FcγR間相互作用之分析方法用以下的方法來製備FcγR之細胞外結構域。首先，以該領域中已知的方法，合成FcγR之細胞外結構域的基因。此時，以NCBI中登錄之情報為基礎，製作各FcγR之序列。具體而言，FcγRI係以NCBI存取編號NM_000566.3之序列為基礎、FcγRIIa係以NCBI存取編號NM_001136219.1之序列為基礎、FcγRIIb係以NCBI存取編號NM_004001.3之序列為基礎、FcγRIIIa係以NCBI存取編號NM_001127593.1之序列為基礎、FcγRIIIb係以NCBI存取編號NM_000570.3之序列為基礎進行製作，並在C末端附加上His標籤。另外已知FcγRIIa、FcγRIIIa、FcγRIIIb為基因多型，而基因多型的區域，FcγRIIa係參考J. Exp. Med., 1990, 172: 19-25進行製作，FcγRIIIa係參考J. Clin. Invest., 1997, 100(5): 1059-1070進行製作，FcγRIIIb係參考J. Clin. Invest., 1989, 84, 1688-1691進行製作。

將得到之基因片段插入動物細胞表現載體，以製作出表現載體。將製作出之表現載體暫時性導入來自人類胚胎腎癌細胞之FreeStyle239細胞(Invitrogen公司製)中，使目標蛋白表現。並且，用於晶體結構分析之FcγRIIb，在最終濃度為10 μg∕mL之Kifunesine存在的情況下表現出目標蛋白，附加於FcγRIIb上之糖鏈為高甘露糖型。將培養後得到之培養上清液回收之後，通過0.22μm過濾器，得到培養上清液。得到之培養上清液，以下列四個步驟為原則進行純化。第1步驟為陽離子交換管柱層析(SP Sepharose FF)、第2步驟為對His標籤之親和性管柱層析(HisTrap HP)、第3步驟為凝膠過濾管柱層析(Superdex200)、第4步驟為無菌過濾。不過，關於FcγRI，第1步驟係改為使用Q sepharose FF進行陰離子交換管柱層析。對純化之蛋白質使用分光光度計，以280nm之吸光度進行測量，並以PACE等方法從得到之數值計算出消光係數，使用消光係數計算出純化之蛋白質濃度(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423)。

使用Biacore T100(GE Healthcare製)、Biacore T200(GE Healthcare製)、Biacore A100、Biacore 4000，分析各變異抗體與上述製備之Fcγ受體間的相互作用。電泳緩衝液係使用HBS-EP+(GE Healthcare製)，以25℃為測量溫度。使用之晶片係，以胺偶合法將抗原多胜肽、ProteinA(Thermo Scientific製)、Protein A∕G(Thermo Scientific製)、Protein L(ACTIGEN製或BioVision製)固定在Series S Sensor Chip CM5(GE Healthcare製)或者Series S sensor Chip CM4(GE Healthcare製)上之晶片，或者是對Series S Sensor Chip SA(certified)(GE Healthcare製)，以預先生物素化之抗原多胜肽進行相互作用、固定化之晶片。

在這些感應晶片上捕捉目標抗體，與以電泳緩衝液稀釋之Fcγ受體相互作用，測量對抗體之結合量，比較不同抗體間之結合量。不過，因為Fcγ受體之結合量依賴於捕獲之抗體的量，因此係以各抗體之捕獲量除以Fcγ受體之結合量所得到的修正值進行比較。另外，透過與10 mM glycine-HCl、pH1.5反應，來洗淨感應晶片上捕獲之抗體，將感應晶片再生並重複使用。

另外，為了計算出對各變異抗體對FcγR之KD值，根據以下的方法進行動力學分析。首先，在上述之感應晶片上捕捉目標抗體，使其與以電泳緩衝液稀釋之Fcγ受體相互作用，對得到之感應圖，透過Biacore Evaluation Software，將測量結果以1:1 Langmuir 結合模型進行整體擬合(global fitting)，並依此算出結合速率常數ka(L∕mol∕s)、解離速率常數kd(1∕s)，並從這些數值計算出解離常數KD(mol∕L)。

另外，在各變異抗體與FcγR間之相互作用微弱、判斷無法透過上述之動力學分析進行正確分析的情況下，關於該相互作用，係使用記載於Biacore T100 Software Handbook BR1006-48 Edition AE中之下列的1:1結合模型公式，計算出KD值。透過1:1結合模型，相互作用之分子在Biacore上的動作，可以由以下之公式1表示。〔公式1〕

R _eq：穩態結合水平對分析物濃度之曲線 C：濃度 RI：樣品中整體折射率之作用 R _max：分析物對表面之結合能力此公式之變化型，KD值可以表示成如以下之公式2。〔公式2〕

在此公式中代入R _max、RI、C 之數值，即可計算出KD值。關於RI、C，可以從測定結果之感應圖、測量條件來求得數值。關於R _max之計算，則是按照以下之方法。在本次測量中同時評估的、成為比較對象的相互作用夠強之抗體，將上述之透過1:1 Langmuir結合模型進行整體擬合時所得到之R _max值，除以成為比較對象之抗體於感應晶片上的捕獲量，再乘上欲評價之變異抗體的捕獲量，將得到之數值作為R _max。

〔參考例3〕Fc變異體對FcγR之結合的整體分析與IgG相比之下，對活化型FcγR，尤其是FcγRIIa之H型及R型的任何基因多型，均通過Fc減少結合程度，並且為了製作出對FcγRIIb之結合增強的抗體，對IgG1抗體導入變異，並進行對各FcγR之結合的整體分析。

抗體重鏈係，使用包含，WO2009∕041062中公開之改善了血漿動力學的抗-Glypican 3抗體GpH7的CDR，之Glypican 3抗體的可變區(序列編號：15)。同樣地，抗體輕鏈係共同使用WO2009∕041062中公開之改善了血漿動力學的抗-Glypican 3抗體的GpL16-k0(序列編號：16)。另外，抗體重鏈恆定區，係使用對去除了IgG1之C末端的Gly與Lys的G1d導入了K439E之B3。此重鏈稱為GpH7-B3(序列編號：17)、輕鏈稱為GpL16-k0(序列編號：16)。

將GpH7-B3中，被認為參與了FcγR之結合的胺基酸與其周圍之胺基酸(EU編號第234至239號、第265至271號、第295號、第296號、第298號、第300號、第324至337號)，分別置換成除了原本的胺基酸與Cys以外的其他18種胺基酸。將這些Fc變異體稱為B3 variant。B3 variant按照參考例1之方法，表現、純化，並透過參考例2之方法，全面地評估對各種FcγR(FcγRIa、FcγRIIa H型、FcγRIIa R型、FcγRIIb、FcγRIIIa)之結合能力。關於與各種FcγR間之相互作用的分析結果，係根據以下的方法製圖。將各種來自B3 variant之抗體對FcγR之結合量的數值，除以沒有對B3導入變異之作為比較對象的抗體(具有EU編號第234至239號、第265至271號、第295號、第296號、第298號、第300號、第324至337號為人類IgG1序列之抗體)對FcγR之結合量的數值。進一步將該數值乘上100倍，作為各變異體對FcγR之相對結合活性的指標。橫軸表示各變異體對FcγRIIb之相對結合活性數值，縱軸表示各變異體對活化型FcγR——FcγRIa、FcγRIIa H型、FcγRIIa R型、FcγRIIIa之相對結合活性數值(第1圖、第2圖、第3圖、第4圖)。其結果，如第1圖~第4圖中之標籤所示，所有變異中，僅導入了mutation A(EU編號第238號之Pro置換成Asp之變異)與mutation B(EU編號第328號之Leu置換成Glu之變異)者，與導入前相比之下，發現其具有對FcγRIIb之結合顯著地增強、對FcγRIIa兩型之結合顯著地抑制之效果。

〔參考例4〕FcγRIIb選擇性結合變異體之SPR分析關於實施例1中發現之，將EU編號第238號之Pro置換成Asp之變異，對各FcγR之結合，進行更詳細的分析。

IgG1之重鏈中，抗體重鏈可變區係使用，WO2009∕125825中公開之抗-人類介白素6受體抗體的可變區，即IL6R-H之可變區(序列編號：18)；抗體重鏈恆定區係使用，具有去除了人類IgG1之C末端的Gly與Lys之G1d，之IL6R-G1d(序列編號：19)。將IL6R-G1d之EU編號第238號之Pro置換成Asp，製作出IL6R-G1d-v1(序列編號：20)。接著，將IL6R-G1d之EU編號第328號之Leu置換成Glu，製作出IL6R-G1d-v2。另外，為了用於比較，將非專利文獻28中記載之IL6R-G1d之EU編號第267號之Ser置換成Glu、EU編號第328號之Leu置換成Phe，製作出IL6R-G1d-v3。抗體輕鏈係共同使用tocilizumab之輕鏈IL6R-L(序列編號：21)，與各個重鏈一起，按照參考例1之方法，表現、純化抗體。這裡得到之作為抗體重鏈的、具有來自IL6R-G1d、IL6R-G1d-v1、IL6R-G1d-v2、IL6R-G1d-v3之胺基酸序列的抗體，分別稱為IgG1、IgG1-v1、IgG1-v2、IgG1-v3。

接著，使用Biacore T100(GE Healthcare製)，對這些抗體與FcγR間之相互作用進行動力學分析。電泳緩衝液係使用HBS-EP+(GE Healthcare製)，以25℃為測量溫度。使用透過胺偶合法將ProteinA固定在Series S Sensor Chip CM5(GE Healthcare製)上之晶片。在這些感應晶片上捕捉目標抗體，與以電泳緩衝液稀釋之各種FcγR相互作用，測量對抗體之結合。測量後，透過與10 mM glycine-HCl、pH1.5反應，來洗淨感應晶片上捕獲之抗體，將感應晶片再生並重複使用。透過Biacore Evaluation Software，將得到的作為測量結果之感應圖，以1:1 Langmuir 結合模型分析，計算出結合速率常數ka(L∕mol∕s)、解離速率常數kd(1∕s)，並從這些數值計算出解離常數KD(mol∕L)。

這次，因為IgG1-v1與IgG1-v2對FcγRIIa H型和FcγRIIIa之結合微弱，無法計算出上述分析法中之KD等動力學參數。關於這些相互作用，係使用記載於Biacore T100 Software Handbook BR1006-48 Edition AE中之下列的1:1結合模型公式，計算出KD值。透過1:1結合模型，相互作用之分子在Biacore上的動作，可以由以下之公式1表示。

〔公式1〕

在此公式中代入R _max、RI、C 之數值，即可計算出KD值。從這次的測量條件，可以得到RI=0、C=2 μmol∕L。另外，R _max係，對從IgG1對各FcγR之相互作用的分析結果所得到之感應圖，透過1:1 Langmuir結合模型進行整體擬合時所得到之R _max值，除以IgG1之捕獲量，再乘上IgG1-v1、IgG1-v2之捕獲量，將得到之數值作為R _max。在對IgG1導入變異之任何變異體中，與IgG1相比之下，對各FcγR之結合限制數量均無變化，測量時之R _max，係基於測量時結合在晶片上之抗體數量成比例之假設，來進行計算。R _eq係測量時所觀察到之各FcγR對感應晶片上之各變異體的結合量。

這次的測量條件中，IgG1-v1、IgG1-v2對FcγRIIa H型之結合量(R _eq)分別為約2.5、10 RU；IgG1-v1、IgG1-v2對FcγRIIIa之結合量(R _eq)分別為約2.5、5 RU。進行對FcγRIIa H型相互作用分析時， IgG1、IgG1-v1、IgG1-v2之捕獲量為452、469.2、444.2 RU；進行對FcγRIIIa相互作用分析時，IgG1、IgG1-v1、IgG1-v2之捕獲量為454.5、470.8、447.1 RU。另外，參照IgG1與FcγRIIa H型、FcγRIIIa間之相互作用的分析結果所得到之感應圖，以1:1 Langmuir結合模型進行整體擬合時所得到之R _max值分別為69.8、63.8RU。使用這些數值，計算出IgG1-v1、IgG1-v2對FcγRIIa H型之R _max分別為72.5、68.6RU；IgG1-v1、IgG1-v2對FcγRIIIa之R _max分別為66.0、62.7RU。將這些數值代入〔公式2〕

之式子中，計算出IgG1-v1、IgG1-v2對FcγRIIa H型與對FcγRIIIa之KD值。

IgG1、IgG1-v1、IgG1-v2、IgG1-v3對各FcγR之KD値，顯示於表1(各種抗體對各種FcγR之KD值)中，另外，將IgG1對各FcγR之KD值除以IgG1-v1、IgG1-v2、IgG1-v3對各FcγR之KD値，得到之對IgG1-v1、IgG1-v2、IgG1-v3之相對KD值，顯示於表2(各種抗體對各種FcγR之相對KD值)中。

[表15]

在上述之表15中，*係指，因為觀察不到足夠的FcγR對IgG之結合，〔公式2〕

而利用此公式計算出KD值。

[表16]

根據表16，與IgG1相比之下，IgG1-v1對FcγRIa之結合活性下降為0.047倍，對FcγRIIa R型之結合活性下降為0.10倍，對FcγRIIa H型之結合活性下降為0.014倍，對FcγRIIIa之結合活性下降為0.061倍。另一方面，對FcγRIIb之結合活性向上提升為4.8倍。

另外，根據表16，與IgG1相比之下，IgG1-v2對FcγRIa之結合活性下降為0.74倍，對FcγRIIa R型之結合活性下降為0.41倍，對FcγRIIa H型之結合活性下降為0.064倍，對FcγRIIIa之結合活性下降為0.14倍。另一方面，對FcγRIIb之結合活性向上提升為2.3倍。

亦即，根據此結果證明了，具有將EU編號第238號之Pro置換成Asp之變異的IgG1-v1，以及包含將EU編號第328號之Leu置換成Glu之變異的IgG1-v2，對包含FcγRIIa之兩種基因多型的所有活化型FcγR之結合能力均減弱，另一方面對抑制型FcγR之FcγRIIb的結合能力則上升，具有如此之性質。

接著，以對FcγRIIb之結合活性與對FcγRIIa R型或H型之結合活性的比率為指標，評估得到之變異體對FcγRIIb的選擇性。具體而言，將對FcγRIIa R型或H型之KD值除以對FcγRIIb之KD值，並將所得到之數值I∕A(R)或I∕A(H)，用作FcγRIIb對各種FcγRIIa之選擇性的指標。此指標中，對FcγRIIb之KD值越小、或是對FcγRIIa之KD值越大的話，此指標所顯示之數值越大。亦即，表現出較大數值之變異體者，與FcγRIIa相比之下，對FcγRIIb之相對結合活性會向上提升。有關於各變異體之此指標，概括於表17中。

[表17]

根據表17之結果，與IgG1相比之下，應用現有技術之IgG1-v3表現出比IgG1更大的I∕A(H)數值，對FcγRIIb更具選擇性，但是表現出比IgG1較小之I∕A(R)數值，改善了對FcγRIIb之選擇性。另一方面，本實施例中發現之IgG1-v1與IgG1-v2的I∕A(R)及I∕A(H)，任何一者均表現出比IgG1更大之數值，對FcγRIIb之選擇性，相對於FcγRIIa之任何基因多型，均有所改善。具有如此特性之變異，實際如第18圖、第19圖、第20圖、第21圖中所示，為非常罕見的，至今為止之報告中都沒有如此之變異。將EU編號第238號之Pro置換成Asp之變異，或將EU編號第328號之Leu置換成Glu之變異，對免疫發炎性疾病等之治療藥物的開發，非常有用。

另外，根據表2，非專利文獻28中記載之IgG1-v3，確實對FcγRIIb之結合增強為408倍，對FcγRIIa H型之結合減少為0.51倍，但另一方面，對FcγRIIa R型之結合卻增強為522倍。由此結果，因為IgG1-v1及IgG1-v2均抑制對FcγRIIa R型與H型兩者之結合，並且增強對FcγRIIb之結合，因此被認為是，與IgG1-v3相比之下，對FcγRIIb更具選擇性結合之變異體。亦即，將EU編號第238號之Pro置換成Asp之變異，或將EU編號第328號之Leu置換成Glu之變異，對免疫發炎性疾病等之治療藥物的開發，非常有用。

〔參考例5〕組合FcγRIIb選擇性結合變異與其他Fc區域胺基酸置換變異所產生的效果以參考例3及參考例4中發現之，對FcγRIIb之選擇性向上提升的，將EU編號第238號之Pro置換成Asp之變異體為基礎，嘗試更進一步增強對FcγRIIb之選擇性。首先，在IL6R-G1d中導入了將EU編號第238號之Pro置換成Asp之變異的IL6R-G1d-v1(序列編號：20)，對其導入記載於參考例4中之，對FcγRIIb的選擇性增強的、將EU編號第328號之Leu置換成Glu之變異，製作出變異體IL6RG1d-v4，並與IL6R-L(序列編號：21)一起，按照參考例1之方法製備。將此處得到之具有來自抗體重鏈IL6R-G1d-v4之胺基酸序列的抗體，作為IgG1-v4。IgG1、IgG1-v1、IgG1-v2、IgG1-v4對FcγRIIb之結合活性，係按照參考例2之方法進行評估，其結果顯示於表18中。

[表18]

根據表18之結果，L328E使得對FcγRIIb之結合活性，與IgG1相比之下，向上提升了2.3倍，將其和對FcγRIIb之結合活性，與IgG1相比之下，同樣向上提升了4.8倍之P238D一起組合，預期對FcγRIIb之結合活性的提升程度能更增加，但是實際上發現，組合了這些變異的變異體，對FcγRIIb之結合活性，與IgG1相比之下，反而減少為0.47倍。此結果的效果，無法由各自變異的效果來進行預測。

同樣地，在IL6R-G1d中導入了將EU編號第238號之Pro置換成Asp之變異的IL6R-G1d-v1(序列編號：20)，對其導入記載於參考例4中之，對FcγRIIb的選擇性增強的、將EU編號第267號之Ser置換成Glu以及將EU編號第328號之Leu置換成Phe之變異，製作出變異體IL6R-G1d-v5，並按照參考例1之方法製備。將此處得到之具有來自抗體重鏈IL6R-G1d-v5之胺基酸序列的抗體，作為IgG1-v5。IgG1、IgG1-v1、IgG1-v3、IgG1-v5對FcγRIIb之結合活性，係按照參考例2之方法進行評估，其結果顯示於表19中。對P238D變異體導入參考例4中對FcγRIIb具有增強效果之S267E∕L328F，評估導入變異前後之對FcγRIIb的結合活性，其結果顯示於表19中。

[表19]

根據表19之結果，S267E∕L328F對FcγRIIb之結合活性，與IgG1相比之下，向上提升了408倍，將其和對FcγRIIb之結合活性，與IgG1相比之下，同樣向上提升了4.8倍之P238D一起組合，預期對FcγRIIb之結合活性的提升程度能更增加，但是實際上，則與前例相同，組合了這些變異的變異體，對FcγRIIb之結合活性，與IgG1相比之下，僅增加12倍，並沒有向上提升。此結果的效果，亦是無法由各自變異的效果來進行預測。

根據這些結果得知，單獨使用將EU編號第238號之Pro換成Asp之置換，對FcγRIIb之結合活性會向上提高，但是在與其他對FcγRIIb之結合活性提升的變異一起組合的情況下，則無法發揮此效果。造成此現象的主要因素之一系，Fc與FcγR間之相互作用介面的結構，會因為導入將EU編號第238號之Pro置換成Asp之變異而發生改變，因而無法反映出於天然型抗體中觀察到之變異效果。因此，將包含EU編號第238號之Pro被置換成Asp之Fc作為模板，創造出對FcγRIIb之選擇性更加優秀之Fc的計劃，因為無法利用天然型抗體中得到之變異效果的情報，而被認為極其困難。

〔參考例6〕除了P238D變異之外尚導入了hinge區域變異之變異體，對FcγRIIb之結合的整體分析如參考例5所示，對人類天然IgG1將EU編號第238號之Pro置換成Asp之Fc，與其他變異組合，預期對FcγRIIb之結合會向上增加，但卻無法得到預期中之組合產生的效果。在這裡，以EU編號第238號之Pro被置換成Asp之Fc變異體為基礎，透過對此Fc導入全面的變異，進行找出對FcγRIIb之結合更增強之變異體的研究。抗體重鏈係，對IL6R-G1d(序列編號：19)導入將EU編號第252號之Met置換成Tyr、第434號之Asn置換成Tyr之變異，製作出IL6R-F11(序列編號：22)，對其再進一步導入將EU編號第238號之Pro置換成Asp之變異，製作出IL6R-F652，並以此作為抗體重鏈。將IL6R-F652之EU編號第238號殘基附近的區域(EU編號第234至237號、第239號)，分別置換成除了原本的胺基酸與半胱胺酸以外的其他18種胺基酸，分別製備出包含抗體重鏈序列之表現質體。抗體輕鏈係共同使用IL6R-L(序列編號：21)。按照參考例1之方法，使這些變異體表現、純化、被表現。將這些Fc變異體稱為PD variant。透過參考例2之方法，全面地評估各PD variant對FcγRIIa R型及對FcγRIIb之相互作用。

與各種FcγR間之相互作用的分析結果，係根據以下的方法製圖。將各PD variant對各FcγR之結合量的數值，除以作為控制組之導入變異前的抗體(EU編號第238號之Pro被置換成Asp的IL6R-F652∕IL6R-L)對各FcγR之結合量的數值，再乘以100倍，作為各PD variant對各FcγR之相對結合活性數值。橫軸表示各PD variant對FcγRIIb之相對結合活性的數值，縱軸表示各PD variant對FcγRIIa R型之相對結合活性的數值(第22圖)。

結果發現有11種變異，與導入變異前之抗體相比之下，具有對FcγRIIb之結合增強、對FcγRIIa R型之結合維持不變或增強的效果。這11種變異體對FcγRIIb及對FcγRIIa R之結合活性，總結於表20中。並且，表中之變異係指對IL6R-F11(序列編號：22)導入之變異。

[表20]

對導入了P238D之變異體，再額外導入這11種變異的情況下對FcγRIIb之相對結合活性數值，以及對參考例3中不含有P238D的Fc導入這些變異的情況下對FcγRIIb之相對結合活性數值，顯示於第23圖中。將這11種變異進一步導入P238D變異，與導入前相比之下，對FcγRIIb之結合量增強了，但除了G237F、G237W、S239D以外的其他8種變異，在導入參考例3中不含有P238D之變異體(GpH7-B3∕GpL16-k0)的情況下，卻顯示出對FcγRIIb之結合減弱的效果。根據參考例5之結果得知，對天然型IgG1導入之變異的效果，難以用來預測，對Fc中包含P238D變異之變異體導入相同變異時得到之效果。換句話說，這次發現之8種變異係，若不進行本研究，則無法發現之變異。

表20中所示之變異體對FcγRIa、FcγRIIaR、FcγRIIaH、FcγRIIb、FcγRIIIaV之KD值，係透過參考例2中之方法進行測定，其結果概括於表21。並且，表中之變異係指對IL6R-F11(序列編號：22)導入之變異。不過，製作IL6R-F11時作為模板之IL6R-G1d∕IL6R-L表示為*。另外，表中之KD(IIaR)∕KD(IIb)以及KD(IIaH)∕KD(IIb)，分別係表示各變異體對FcγRIIaR之KD值除以各變異體對FcγRIIb之KD值所得到的數值，以及各變異體對FcγRIIaH之KD值除以各變異體對FcγRIIb之KD值所得到的數值。親代多胜肽之KD值(IIb)∕變異多胜肽之KD值(IIb)係指，親代多胜肽對FcγRIIb之KD值除以各變異體對FcγRIIb之KD值所得到的數值。除此之外，表21中顯示了各變異體對FcγRIIaR及對FcγRIIaH之結合活性中較強一方之KD值∕親代多胜肽對FcγRIIaR及對FcγRIIaH之結合活性中較強一方之KD值。這裡的親代多胜肽係指重鏈中具有IL6R-F11(序列編號：22)之變異體。另外，表21中塗成灰色的表格，係表示FcγR對IgG之結合能力微弱，因為判斷無法透過動力學分析對其進行正確的分析，所以利用參考例2中記載之〔公式2〕

利用此公式計算出之數值。

根據表21，任何變異體，與IL6R-F11相比之下，對FcγRIIb之親合性均向上提升，提升的幅度從1.9倍至5.0倍。各變異體對FcγRIIaR之KD值∕各變異體對FcγRIIb之KD值所得到之比值，以及各變異體對FcγRIIaH之KD值∕各變異體對FcγRIIb之KD值所得到之比值，係表示對FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性，對上對FcγRIIb之相對結合活性。亦即，此數值係表示各變異體對FcγRIIb之結合選擇性的程度，此數值若越大，對FcγRIIb之結合選擇性就越高。親代多胜肽IL6R-F11∕IL6R-L對FcγRIIaR之KD值∕對FcγRIIb之KD值所得到之比值，以及對FcγRIIaH之KD值∕對FcγRIIb之KD值所得到之比值皆為0.7，而表21中的任何變異體，比起親代多胜肽，對FcγRIIb之結合選擇性均更加向上提升。變異體對FcγRIIaR及對FcγRIIaH之結合活性中較強一方之KD值∕親代多胜肽對FcγRIIaR及對FcγRIIaH之結合活性中較強一方之KD值，所得到之數值為1以上者，意味著該變異體對FcγRIIaR及對FcγRIIaH之結合活性中較強一方之結合能力，同等於親代多胜肽對FcγRIIaR及對FcγRIIaH之結合活性中較強一方之結合能力，或是更降低。因為這次得到之變異體中，此數值為0.7至5.0，故可以說這次得到之變異體對FcγRIIaR及對FcγRIIaH之結合活性中較強一方的結合能力，近乎同等於親代多胜肽之較強者，或是更降低。根據這些結果得知，這次得到之變異體中，與親代多胜肽相比之下，雖然對FcγRIIaR型及對H型之結合活性維持不變或是降低，但是對FcγRIIb之結合活性增強、對FcγRIIb之選擇性向上提升。另外，與IL6R-F11相比之下，任何變異體對FcγRIa及對FcγRIIIaV之親和性均降低。

[表21]

〔參考例7〕包含P238D之Fc與FcγRIIb細胞外區域之複合體的X光晶體結構分析如先前的參考例5中所示，已知，對包含P238D之Fc導入能使對FcγRIIb之結合活性提升、或是對FcγRIIb之選擇性提升的變異，卻會使得對FcγRIIb之結合活性明顯減弱，原因被認為是因為導入P23D會使得Fc與FcγRIIb間之相互作用介面結構產生變化。在這裡，為了追求造成此現象的原因，透過X光晶體結構分析，揭示由具有P238D變異之IgG1的Fc(以下稱為Fc(P238D))和FcγRIIb細胞外區域所組成之複合體的立體結構，並且，與由天然型IgG1的Fc(以下稱為Fc(WT))和FcγRIIb細胞外區域所組成之複合體，一起比較立體結構和結合模式。另外，關於Fc與FcγR細胞外區域之複合體的立體結構，已有數份報告分析了Fc(WT)∕FcγRIIIb細胞外區域複合體(Nature, 2000, 400, 267-273; J.Biol.Chem. 2011, 276, 16469-16477)、Fc(WT)∕FcγRIIIa細胞外區域複合體(Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 2011, 108, 12669-126674)、Fc(WT)∕FcγRIIa細胞外區域複合体(J. Imunol. 2011, 187, 3208-3217)之立體結構。雖然至今為止尚無關於Fc(WT)∕FcγRIIb細胞外區域複合體之立體結構的分析，但已知與Fc(WT)與FcγRIIa之複合體的立體結構，而FcγRIIa與FcγRIIb在細胞外區域中之胺基酸序列有93%是一致的，具有非常高度同源性，因此Fc(WT)∕FcγRIIb細胞外區域複合體的立體結構，係從Fc(WT)∕FcγRIIa細胞外區域複合體之晶體結構建模推測而來。

Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體，係透過X光晶體結構分析，以2.6 Å解析力來測定其立體結構。該分析結果得到之結構顯示於第24圖。兩個Fc CH2區域彼此之間，透過夾在中間的FcγRIIb細胞外區域進行鍵結，類似於至今為止所分析之Fc(WT)與FcγRIIIa、FcγRIIIb、FcγRIIa各種細胞外區域所組成之複合體的立體結構。接著，為了進行全面的比較，將Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體之晶體結構，以及Fc(WT)/FcγRIIb細胞外區域複合體之模型結構，以Cα原子間距離為基準，以最小平方法對FcγRIIb細胞外區域以及Fc CH2結構域A進行疊加(第25圖)。此時，由於兩者之Fc CH2結構域B重疊的程度不佳，證明了此部分有立體結構上的差異。更進一步，使用Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體的晶體結構以及Fc(WT)/FcγRIIb細胞外區域複合體的模型結構，透過抽出FcγRIIb細胞外區域與Fc CH2結構域B之間距離為3.7Å以下之原子對並進行比較，比較Fc(WT)與Fc(P238D)兩者之FcγRIIb與Fc CH2結構域B之間的原子間相互作用差異。如表22中所示，Fc(P238D)與Fc(WT)中，Fc CH2結構域B與FcγRIIb之間的原子間相互作用並不一致。

[表22]

更進一步，對Fc(P238D)∕FcγRIIb細胞外區域複合體的X光晶體結構以及Fc(WT)∕FcγRIIb細胞外區域複合體的模型結構，將各自的Fc CH2結構域A以及Fc CH2結構域B，以Cα原子間距離為基準，透過最小平方法進行疊加，比較P238D附近的精細結構。Fc(P238D)與Fc(WT)中，導入變異之位置——EU編號第238號之胺基酸殘基的位置發生了變化，同時，從鉸鏈區開始接續之周圍的環狀區域結構也發生了變化(第26圖)。原來的Fc(WT)中，EU編號第238號之Pro位在蛋白的內側，並與周圍的殘基一起形成了疏水性核心，但在將其改變成具有電荷、非常親水之Asp的情況下，若是繼續處在疏水性核心中，對去溶劑化而言會成為能量障礙。在這裡，為了消除Fc(P238D)中之此能量障礙，EU編號第238號之胺基酸殘基會面向溶劑側形狀發生變化，此被認為對附近之環狀區域的結構帶來了變化。更進一步，因為此環狀區域係從透過S-S鍵進行交聯之鉸鏈區開始接續，所以此結構變化並不僅是局部變化，亦影響到Fc CH2結構域A與結構域B之相對位置，因此推測其導致了FcγRIIb與Fc CH2結構域B間原子間相互作用的差異。因此認為，將P238D變異，與現有之使Fc、天然型IgG中對FcγRIIb之選擇性、結合活性提升的變異一起組合，亦無法得到預計中的效果。

另外，在Fc CH2結構域A中，導入P238D所造成之結構變化的結果係，在旁邊的EU編號第237號Gly的主鏈與FcγRIIb之第160號Tyr之間，觀察到了氫鍵(第27圖)。在FcγRIIa中，對應此Tyr160之殘基為Phe，在與FcγRIIa結合的場合中，並無產生此氫鍵。第160號胺基酸係，在與Fc之相互作用界面中，FcγRIIa與FcγRIIb之間為數不多的差異之一，在FcγRIIb中成為特有的氫鍵，推測此氫鍵之存在與否，是導致Fc(P238D)對FcγRIIb之結合活性提升、對FcγRIIa之結合活性降低，使得選擇性向上提升的原因。另外，關於Fc CH2結構域B，在EU編號第270號Asp與FcγRIIb之第131號Arg之間，觀察到了靜電相互作用(第28圖)。在FcγRIIa的異型之一，FcγRIIa H型之中，對應的殘基變成了His，無法產生此靜電相互作用。此即說明了，與FcγRIIa R型相比之下，FcγRIIa H型中對Fc(P238D)之結合活性降低的理由。以如此之X光晶體結構分析的結果為基礎進行觀察，明白了P238D之導入會使得附近的環狀區域結構變化，並且伴隨產生結構域位置的相對變化，形成了天然IgG中所沒有之新的相互作用，導致P238D變異體對FcγRIIb之選擇性結合分佈。

［Fc(P238D)之表現純化］包含P238D變異之Fc的製備係如以下方式進行。首先，將hIL6R-IgG1-v1(序列編號：20)之EU編號第220號之Cys置換成Ser、對EU編號第216號之Glu開始至C末端以PCR進行選殖出之基因序列Fc(P238D)，根據參考例1中記載之方法，進行表現載體之製作、表現、純化。此外，EU編號第220號之Cys，在正常的IgG1中，會與輕鏈之Cys之間產生雙硫鍵，但在只製備Fc的場合中，為了不共同表現出輕鏈，將Cys置換成Ser以避免產生不必要的雙硫鍵。

［Fc(P238D)∕FcγRIIb細胞外區域複合體之純化］對2mg結晶化所得到之FcγRIIb細胞外區域樣品，透過作為大腸桿菌的與glutathione S-transferase之融合蛋白，加入0.29mg經過表現純化之Endo F1(Protein Science 1996, 5, 2617-2622)，在0.1M Bis-Tris pH6.5之緩衝條件中，透過於室溫下靜置3日，使得N型糖鏈被切斷，留下直接鍵結在Asn上之N-acetylglucosamine。接著，對實施了此糖鏈斷開處理之FcγRIIb細胞外區域樣品，透過5000MWCO之超過濾膜進行濃縮，並在20mM HEPES pH7.5, 0.1M NaCl中達到平衡後，透過凝膠過濾管柱層析法(Superdex200 10∕300)進行純化。接著，對得到之斷開了糖鏈的FcγRIIb細胞外區域的餾分，依莫耳數比加入Fc(P238D)，並使FcγRIIb細胞外區域稍微過量，透過10000MWCO之超過濾膜進行濃縮後，在25mM HEPES pH7.5, 0.1M NaCl中達到平衡，透過凝膠過濾管柱層析法(Superdex200 10∕300)進行純化，而得到Fc(P238)∕FcγRIIb細胞外區域複合體之樣品。

［Fc (P238D)∕FcγRIIb細胞外區域複合體之結晶化］將Fc(P238D)∕FcγRIIb細胞外區域複合體之樣品，以10000MWCO之超過濾膜濃縮至大約為10mg∕ml，透過坐滴蒸氣擴散法而使之結晶化。結晶化係，使用Hydra II Plus One (MATRIX製)，對100mM Bis-Tris pH6.5、17% PEG3350, 0.2M Ammonium acetate, 2.7%(w∕v) D-Galactose之儲存溶液，依照儲存溶液：結晶化樣品＝0.2μl：0.2μl之比例混合，製造出結晶滴後，加蓋密封，靜置於20℃下，成功得到板狀結晶。

［Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外複合體結晶體的X光繞射數據之測量］將得到之Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體之一個單晶，浸泡於100mM Bis-Tris pH6.5, 20% PEG3350, Ammonium acetate, 2.7%(w/v) D-Galactose, Ethylene glycol 22.5%(v/v)溶液之後，透過附有微小尼龍環的針汲取溶液，放入液態氮中冷凍，並透過高能加速器研究機構(High Energy Accelerator Research Organization)中同步輻射設施光子工廠(Phonton factory)之BL-1A，測量X光繞射數據。另外，測定時，放置在-178℃之氮氣中以維持凍結的狀態，透過配備有射線的CCD探測儀Quantum 270 (ADSC製)，將結晶體每旋轉0.8°就同時收集X光繞射圖像，共收集225張。根據得到之繞射圖像，使用Program Xia2(CCP4 Software Suite)、XDS Package(Walfgang Kabsch)以及Scala(CCP4 Software Suite)，決定晶格常數、編製繞射斑點之索引，以及處理繞射數據，最後得到解析力高達2.46Å之繞射強度數據。本結晶體係屬於P2 ₁空間群，晶格常數a＝48.85Å、b＝76.01Å、c＝115.09Å、α＝90°、β＝100.70°、γ＝90°。

［Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體之X光晶體結構分析］ Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體之晶體結構的測定，係使用Program Phaser(CCP4 Software Suite)，透過分子置換法進行。根據得到之晶格大小與Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體的分子量，預測不對稱單位中複合體之數量為一。根據Fc(WT)/FcγRIIIa細胞外區域複合體之晶體結構PDB code:3SGJ的結構座標，提取出A鏈第239-340號以及B鏈第239-340號部分的胺基酸殘基，作為不同的座標，各自用作Fc的CH2結構域之搜索用模型。同樣根據PDB code:3SGJ之結構座標，提取出A鏈第341-444號以及B鏈第341-443號部分的胺基酸殘基，作為一個座標，用作Fc CH3結構域之搜索用模型。最後，根據FcγRIIb細胞外區域之晶體結構PDB code: 2FCB的結構座標，提取出A鏈第6-178號部分的胺基酸殘基，用作FcγRIIb細胞外區域之搜索用模型。依照Fc CH3結構域、FcγRIIb細胞外區域、Fc CH2結構域的順序，根據旋轉函數與平移函數測定各個探索用模型之晶格內的方向和位置，而得到Fc(P238D)/FcγRIIb細胞外區域複合體晶體結構的初始模型。對得到之初始模型，移動兩個Fc之CH2結構域、兩個Fc之CH3結構域，以及FcγRIIb細胞外區域，進型剛體精緻化時，此時25-3.0 Å之繞射強度數據的結晶學之可靠性因數R值為40.4%，Free R值為41.9%。接著，使用Program Refmac5(CCP4 Software Suite)將結構精緻化，並且以實驗測得之結構因子Fo、依模型計算出之結構因子Fc，以及依模型算出之位相為基礎，計算出2Fo-Fc、Fo-Fc並作為係數，一邊看著電子密度圖，一邊在Program Coot(Paul Emsley)中進行模型修正，透過重複以上方法完成模型精緻化。最後，以2Fo-Fc、Fo-Fc作為係數，透過根據電子密度圖將水分子建入模型內、進行精緻化，使用24291個最終解析力為25-2.6Å之繞射強度數據，對應包含4846個非氫原子之模型，結晶學之可靠性因數R值為23.7%，Free R值為27.6%。

［Fc(WT)/FcγRIIb細胞外區域複合體之模型結構的製作］以Fc(WT)/FcγRIIa細胞外區域複合體的晶體結構，PDB code:3RY6，之結構座標為基礎，使用Programe Disovery Studio 3.1(Accelrys製)的Build Mutants功能，對與FcγRIIb之胺基酸序列一致的FcγRIIa之結構座標導入變異。此時，令Optimization Level為High、Cut Radius為4.5，製造5個模型，採用其中能量評比(energy score)最佳者來作為Fc(WT)/FcγRIIb細胞外區域複合體之模型結構。

〔參考例8〕根據晶體結構來決定變異位置的Fc變異體，對FcγR之結合的分析以參考例7中得到之Fc(P238D)與FcγRIIb細胞外區域之複合體的X光晶體結構分析結果為基礎，在EU編號第238號之Pro被置換成Asp之Fc變異體上，對預測會影響和FcγRIIb間之相互作用的部位(EU編號第233號、第240號、第241號、第263號、第265號、第266號、第267號、第268號、第271號、第273號、第295號、第296號、第298號、第300號、第323號、第325號、第326號、第327號、第328號、第330號、第332號、第334號殘基)，導入全面的變異，進一步研究對FcγRIIb之結合增強的組合變異體。

對參考例4中製作之IL6R-G1d(序列編號：19)導入將EU編號第439號之Lys置換成Glu之變異，製作出IL6R-B3(序列編號：23)。接著，對IL6R-B3導入將EU編號第238號之Pro置換成Asp之變異，製作出IL6R-BF648。抗體輕鏈係共同使用IL6R-L(序列編號：21)。對這些變異體，按照參考例1之方法，表現、純化抗體，並透過參考例2之方法，全面地評估對各種FcgR(FcgRIa、FcgRIIaH型、FcgRIIaR型、FcgRIIb、FcgRIIIaV型)之結合能力。

對各個FcγR間之相互作用的分析結果，係按照以下的方法製圖。將各變異體對各FcγR之結合量的數值，除以作為控制組之導入變異前的抗體(EU編號第238號之Pro被置換成Asp之IL6R-BF648∕IL6R-L)對各FcγR之結合量的數值，再乘上100倍後，將得到的數值作為各變異體對各FcγR之相對結合活性數值。橫軸表示各變異體對FcγRIIb之相對結合活性數值，縱軸表示各變異體對FcγRIIa R型之相對結合活性值(第29圖)。其結果如第29圖中所示，所有變異中，發現有24種變異，與導入變異前之抗體相比之下，具有對FcγRIIb之結合能力維持不變或者增強的效果。這些變異體對各種FcγR之結合顯示於表23中。並且，表中之變異係指對IL6R-B3(序列編號：23，表23中之IL6R-2B999)導入之變異。不過，製作IL6R-B3時，作為模板的IL6R-G1d∕IL6R-L則表示為*。

[表23]

表23中所示之變異體對FcγRIa、FcγRIIaR、FcγRIIaH、FcγRIIb、FcγRIIIa V型之KD值，係透過參考例2之方法測量，其結果概括於表24中。表中之變異係指對IL6R-B3(序列編號：23)導入之變異。不過，製作IL6R-B3時，作為模板的IL6R-G1d∕IL6R-L則表示為*。另外，表中之KD(IIaR)∕KD(IIb)以及KD(IIaH)∕KD(IIb)，分別係指各變異體對FcγRIIaR之KD值除以各變異體對FcγRIIb之KD值所得到的數值、各變異體對FcγRIIaH之KD值除以各變異體對FcγRIIb之KD值所得到的數值。親代多胜肽之KD值(IIb)∕變異多胜肽之KD值(IIb)係指，親代多胜肽對FcγRIIb之KD值除以各變異體對FcγRIIb之KD值所得到的數值。除此之外，各變異體對FcγRIIaR及對FcγRIIaH之結合活性中較強一方之KD值∕親代多胜肽對FcγRIIaR及對FcγRIIaH之結合活性中較強一方之KD值，顯示於表24中。這裡的親代多胜肽係指重鏈中具有IL6R-B3(序列編號：23)之變異體。另外，表24中塗成灰色的表格，係表示FcgR對IgG之結合能力微弱，因為判斷無法透過動力學分析對其進行正確的分析，所以利用參考例2中記載之〔公式2〕

利用此公式計算出之數值。

根據表24，任何變異體，與IL6R-B3(表24中之IL6R-2B999)相比之下，對FcγRIIb之親和性均向上提升，提升幅度為2.1至9.7倍。各變異體對FcγRIIaR之KD值∕各變異體對FcγRIIb之KD值之比，以及各變異體對FcγRIIaH之KD值∕各變異體對FcγRIIb之KD值之比，係表示對FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性，對上對FcγRIIb之相對結合活性。亦即，此數值係表示各變異體對FcγRIIb之結合選擇性的程度，此數值若越大，對FcγRIIb之結合選擇性就越高。親代多胜肽IL6R-B3∕IL6R-L對FcγRIIaR之KD值∕對FcγRIIb之KD值的比，以及對FcγRIIaH之KD值∕對FcγRIIb之KD值的比，分別為0.3、0.2，因此表24中之任何變異體，比起親代多胜肽，對FcγRIIb之結合選擇性均向上提升。變異體對FcγRIIaR及對FcγRIIaH之結合活性中較強一方之KD值∕親代多胜肽對FcγRIIaR及對FcγRIIaH之結合活性中較強一方之KD值為1以上的話，即意味著此變異體對FcγRIIaR及對FcγRIIaH之結合活性中較強一方的結合能力，同等於親代多胜肽對FcγRIIaR及對FcγRIIaH之結合活性中較強一方之結合能力，或是更降低。因為這次得到的變異體中，此數值為4.6至34.0，故可以說，這次得到之變異體對FcγRIIaR及對FcγRIIaH之結合活性中較強一方之結合能力，與親代多胜肽相比之下降低了。根據這些結果得知，這次得到之變異體中，與親代多胜肽相比之下，雖然對FcγRIIaR型及對H型之結合活性維持不變或是降低，但是對FcγRIIb之結合活性增強、對FcγRIIb之選擇性向上提升。另外，與IL6R-B3相比之下，任何變異體對FcγRIa及對FcγRIIIaV之親和性均降低。

[表24]

得到的組合變異體之中有潛力者，從其晶體結構來研究此效果之主要因素。圖30中顯示了Fc(P238D)∕FcγRIIb細胞外區域複合體之晶體結構。其中，位於左側之重鏈為Fc Chain A，位於右側之重鏈為Fc Chain B。在這裡已知，Fc Chain A中EU編號第233號的位置在FcγRIIb之EU編號第113號Lys的附近。不過，在本晶體解構中，並沒有清楚地觀察到E233之側鏈的電子密度，因為其具有相當高的活動性狀態。因此推測，將EU編號第233號之Glu置換成Asp的變異係，令側鏈短少一個碳含量，而使側鏈的自由度變小，結果使得在與FcγRIIb之EU編號第113號Lys間產生相互作用時之熵損失減少，導致結合自由能向上提升。

第31圖中顯示同樣的Fc(P238D)∕FcγRIIb細胞外區域複合體之構造中，EU編號第330號區域附近的環境。根據此圖，明白了Fc(P238D)之Fc Chain A的EU編號第330號區域附近，係由FcγRIIb之EU編號第85號之Ser、第86號之Glu、第163號之Lys等所構成的親水性環境。因此推測，將EU編號第330號之Ala置換成Lys或是Arg的變異，對與FcγRIIb之EU編號第85號之Ser、或EU編號第86號之Glu間之相互作用的強化有所貢獻。

第32圖係，將Fc(P238D)∕FcγRIIb細胞外區域複合體，與Fc(WT)∕FcγRIIIa細胞外區域複合體之晶體結構，以Cα原子間距離為基礎，透過最小平方法對FcγRIIb進行疊加，並顯示EU編號第271號之Pro的結構。這兩個結構雖然相當一致，但在EU編號第271號之Pro的位置上具有立體結構性差異。另外，在Fc(P238D)∕FcγRIIb細胞外區域複合體之晶體結構中，認為其周圍的電子密度微弱，並且由於Fc(P238D)∕FcγRIIb中EU編號第271號為Pro，而使得結構上產生大的負擔，所以此環狀區域結構可能無法得到最佳結構。因此推測，將EU編號第271號之Pro置換成Gly之變異，賦予了此環狀區域結構柔軟性，在取得與FcγRIIb相互作用的最佳結構時，減少了能量性障礙，而對結合之增強有所貢獻。

〔參考例9〕透過與P238D組合，研究對FcγRIIb之結合增強之變異組合之效果將參考例6、參考例8中得到的變異中，具有對FcγRIIb之結合增強效果，或是對FcγRIIb之結合維持不變、抑制與其他FcγR結合之效果的變異組合在一起，並檢驗其效果。與參考例8之方法相同，從表19、表22中選擇出特別優良的變異，組合導入抗體重鏈IL6R-BF648。抗體輕鏈係共同使用IL6R-L，按照參考例1之方法，表現、純化抗體，並透過參考例2之方法，全面地評估對各FcγR(FcγRIa、FcγRIIa H型、FcγRIIa R型、FcγRIIb、FcγRIIIa V型)之結合能力。與各個FcγR間之相互作用的分析結果，係按照以下的方法計算出相對結合活性。將各變異體對各FcγR之結合量的數值，除以作為控制組之導入變異前的抗體(EU編號第238號之Pro被置換成Asp之IL6R-BF648∕IL6R-L)對各FcγR之結合量的數值，再乘上100倍，將得到之數值作為各變異體對各FcγR之相對結合活性數值。橫軸表示各變異體對FcγRIIb之相對結合活性數值，縱軸表示各變異體對FcγRIIa R型之相對結合活性數值(表25)。並且，表中之變異係指對IL6R-B3(序列編號：23)導入之變異。不過，在製作IL6R-B3時，作為模板之IL6R-G1d∕IL6R-L表示為*。

[表25]

表25中所示之變異體對FcγRIa、FcγRIIaR、FcγRIIaH、FcγRIIb、FcγRIIIa V型之KD值，係透過參考例2之方法測量，其結果概括於表26。表中之變異係指對IL6R-B3(序列編號：23)導入之變異。不過，在製作IL6R-B3時，作為模板之IL6R-G1d∕IL6R-L表示為*。另外，表中之KD(IIaR)∕KD(IIb)及KD(IIaH)∕KD(IIb)，分別係表示各變異體對FcγRIIaR之KD値除以各變異體對FcγRIIb之KD所得到的數值、各變異體對FcγRIIaH之KD値除以各變異體對FcγRIIb之KD所得到的數值。親代多胜肽之KD值(IIb)∕變異多胜肽之KD值(IIb)，係指親代多胜肽對FcγRIIb之KD値除以各變異體對FcγRIIb之KD値所得到的數值。除此之外，各變異體對FcγRIIaR及對FcγRIIaH之結合活性中較強一方之KD值∕親代多胜肽對FcγRIIaR及對FcγRIIaH之結合活性中較強一方之KD值，顯示於表26中。這裡的親代多胜肽係指重鏈中具有IL6R-B3(序列編號：23)之變異體。另外，表26中塗成灰色的表格，係表示FcgR對IgG之結合能力微弱，因為判斷無法透過動力學分析對其進行正確的分析，所以利用參考例2中記載之〔公式2〕

利用此公式計算出之數值。

根據表26，任何變異體，比起IL6R-B3，對FcγRIIb之親合性均向上提升，提升幅度從3.0至99.0倍。各變異體對FcγRIIaR之KD值∕各變異體對FcγRIIb之KD值之比，以及各變異體對FcγRIIaH之KD值∕各變異體對FcγRIIb之KD值之比，係表示對FcγRIIaR及FcγRIIaH之結合活性，對上對FcγRIIb之相對結合活性。亦即，此數值係表示各變異體對FcγRIIb之結合選擇性的程度，此數值若越大，對FcγRIIb之結合選擇性就越高。親代多胜肽IL6R-B3∕IL6R-L對FcγRIIaR之KD值∕對FcγRIIb之KD值的比，以及對FcγRIIaH之KD值∕對FcγRIIb之KD值的比，分別為0.3、0.2，因此表26中之任何變異體，比起親代多胜肽，對FcγRIIb之結合選擇性均向上提升。變異體對FcγRIIaR及對FcγRIIaH之結合活性中較強一方之KD值∕親代多胜肽對FcγRIIaR及對FcγRIIaH之結合活性中較強一方之KD值為1以上的話，即意味著此變異體對FcγRIIaR及對FcγRIIaH之結合活性中較強一方的結合能力，同等於親代多胜肽對FcγRIIaR及對FcγRIIaH之結合活性中較強一方之結合能力，或是更降低。因為這次得到的變異體中，此數值為0.7至29.9，故可以說，這次得到之變異體對FcγRIIaR及對FcγRIIaH之結合活性中較強一方的結合能力，近乎同等於親代多胜肽，或是更降低。根據這些結果得知，這次得到之變異體中，與親代多胜肽相比之下，雖然對FcγRIIaR型及對H型之結合活性維持不變或是降低，但是對FcγRIIb之結合活性增強、對FcγRIIb之選擇性向上提升。另外，與IL6R-B3相比之下，任何變異體對FcγRIa及對FcγRIIIaV之親和性均降低。

[表26]

另外，各序列編號之序列中的可變區及恆定區，概括於下表。表中，「B3」係表示「2B999(B3)」、「omlizH」係表示「omalizumab_VH」、「omlizL」係表示「omalizumab_VL」。 [表27]

[產業應用性]

與包含未導入胺基酸變異之Fc區域的多胜肽相比之下，對FcγRIIb之結合活性增強，或者，與FcγRIIa(R型)相比之下，對FcγRIIb之結合選擇性增強之Fc區域變異體，透過本發明提供包含該Fc區域變異體之多胜肽。藉由使用該多胜肽，通過FcγRIIb之ITIM的磷酸化，可以傳遞發炎性免疫反應抑制信號。另外，透過賦予抗體之Fc對FcγRIIb選擇性結合之特性，通過以FcγRIIb發起的免疫抑制性作用，可以抑制抗藥物抗體的產生。

無

第1圖係使用來自具有FcγRIIa基因多型(R∕H)之捐贈者的血小板進行凝集檢定，透過omalizumab-G1d-v3∕IgE免疫複合體評估血小板凝聚能力，其評估結果之示意曲線圖。第2圖係使用來自具有FcγRIIa基因多型(H∕H)之捐贈者的血小板進行凝集檢定，透過omalizumab-G1d-v3∕IgE免疫複合體評估血小板凝聚能力，其評估結果之示意曲線圖。第3圖係表示評估洗淨之血小板膜表面上CD62p的表現，其評估結果之示意圖。填滿黑色之曲線圖係表示與PBS反應之後加入ADP刺激之結果，無填色之曲線圖係表示與免疫複合體反應之後以ADP刺激之結果。第4圖係表示評估洗淨之血小板膜表面上活化型整合素的表現，其評估結果之示意圖。填滿黑色之曲線圖係表示與PBS反應之後加入ADP刺激之結果，無填色之曲線圖係表示與免疫複合體反應之後以ADP刺激之結果。第5圖係透過X光進行晶體結構分析所測定之Fc(P208)∕FcγRIIb細胞外區域複合體之圖。關於Fc部分之各個CH2結構域、CH3結構域，以左側為結構域A，右側為結構域B。第6圖係將透過X光進行晶體結構分析所測定之Fc(P208) ∕FcγRIIb細胞外區域複合體之結構，以及Fc(WY)∕FcγRIIa細胞外區域複合體之結構(PDB code：3RY6)，在Fc部分之CH2結構域A中，以Cα原子間距離為基準，以最小平方法進行疊加之比較圖。圖中之粗線所描繪的是Fc(P208)∕FcγRIIb細胞外區域複合體，細線所描繪的是Fc(WY)∕FcγRIIa細胞外區域複合體之結構。並且，在Fc(WY)∕FcγRIIa細胞外區域複合體之結構中，只描繪了Fc部分之CH2結構域A。第7圖係在Fc(P208)∕FcγRIIb細胞外區域複合體之X光晶體結構中，FcγRIIb之第160號Tyr與主鏈部分中，產生了氫鍵的Fc部分CH2結構域A之EU編號第237號Asp附近的結構之詳細示意圖。第8圖係在Fc(P208)∕FcγRIIb細胞外區域複合體之X光晶體結構中，FcγRIIb之第160號Tyr與主鏈部分中，產生了氫鍵之Fc部分CH2結構域A之EU編號第237號Asp支鏈周圍的胺基酸殘基之結構示意圖。第9圖係將參考例7中所示之Fc(P238D)∕FcγRIIb細胞外區域複合體之X光晶體結構，以及Fc(P208)∕FcγRIIb細胞外區域複合體之X光晶體結構，在Fc部分之CH2結構域B中，以Cα原子間距離為基準，並以最小平方法進行疊加，係EU編號第266至271號之環狀區域周圍之比較圖。本環狀區域中，與Fc(P238D)相比之下，Fc(P208)之EU編號第268號之位置具有H268D變異，EU編號第271號之位置具有P271G變異。第10圖係在Fc(P208)∕FcγRIIb細胞外區域複合體之X光晶體結構中，透過X光對Fc部分CH2結構域B之Ser239周圍的構造進行晶體結構分析，將得到之2Fo-Fc作為係數，並且與電子密度一起表示之圖。第11圖係將透過X光晶體結構分析所測定之Fc(P208)∕ FcγRIIaR型細胞外區域複合體之立體結構，以及Fc(P208)∕ FcγRIIb細胞外區域複合體之立體結構，以Cα原子間距離為基準，並以最小平方法進行疊加之比較圖。第12圖係在Fc(P208)∕FcγRIIaR型細胞外區域複合體之X光晶體結構，以及Fc(P208)∕FcγRIIb細胞外區域複合體之X光晶體結構中，透過X光對Fc部分CH2結構域A之EU編號第237號Asp附近進行晶體結構分析，將得到之2Fo-Fc作為係數，並且與電子密度一起表示之圖。第13圖係在Fc(P208)∕FcγRIIaR型細胞外區域複合體之X光晶體結構，以及Fc(P208)∕FcγRIIb細胞外區域複合體之X光晶體結構中，透過X光對Fc部分CH2結構域B之EU編號第237號Asp附近進行晶體結構分析，將得到之2Fo-Fc作為係數，並且與電子密度一起表示之圖。第14圖係G1d與G4d之恆定區序列的比較圖。圖中，框起來之胺基酸係顯示G1d與G4d之間胺基酸殘基相異之部分。第15圖中，橫軸表示各變異體對FcgRIIb之結合量之值，縱軸表示各變異體對FcgRIIaR之結合量之值。圖中所示之G237W、G237F、G236N、P238G、P238N、P238E、P238D，係指對GpH7-B3導入之變異。另外，A5∕B3之任何鏈上均沒有導入變異，表現為GpH7-A5 ∕ GpH7-B3 ∕ GpL16-k0；僅在一鏈上含有P238D之變異體，則表示為GpH7-A5 ∕ GpH7-BF648 ∕ GpL16-k0。第16圖中，橫軸表示各變異體對FcgRIIb之KD值，縱軸表示各變異體對FcgRIIaR之KD值。圖中之IL6R-B3∕IL6R-L以及IL6R-G1d∕IL6R-L係表示，具有在評價各變異體時作為比較對象之天然型人類IgG之序列的抗體。另外，IL6R-BP264∕ IL6R-L係在製造各變異體時之原始變異體。IL6R-BP404∕ IL6R-L係，對IL6R-BP264∕IL6R-L之兩鏈導入了L234Y之變異體，與導入變異前之IL6R-BP264∕IL6R-L相比之下，對FcgRIIb之結合力向上增加。第17圖係對FcγRIa及對FcγRIIb之結合能力的比較示意圖，標記出EU編號第238號之Pro被置換成Asp之抗體、以及EU編號第328號之Leu被置換成Glu之抗體的結合。「mutation A」係指將EU編號第238號之Pro置換成Asp之變異，「mutation B」係指將EU編號第328號之Leu置換成Glu之變異。第18圖係對FcγRIIa H型及對FcγRIIb之結合能力的比較示意圖，標記出EU編號第238號之Pro被置換成Asp之抗體、以及EU編號第328號之Leu被置換成Glu之抗體的結合。「mutation A」係指將EU編號第238號之Pro置換成Asp之變異，「mutation B」係指將EU編號第328號之Leu置換成Glu之變異。第19圖係對FcγRIIa R型及對FcγRIIb之結合能力的比較示意圖，標記出EU編號第238號之Pro被置換成Asp之抗體、以及EU編號第328號之Leu被置換成Glu之抗體的結合。「mutation A」係指將EU編號第238號之Pro置換成Asp之變異，「mutation B」係指將EU編號第328號之Leu置換成Glu之變異。第20圖係對FcγRIIIa及對FcγRIIb之結合能力的比較示意圖，標記出EU編號第238號之Pro被置換成Asp之抗體、以及EU編號第328號之Leu被置換成Glu之抗體的結合。「mutation A」係指將EU編號第238號之Pro置換成Asp之變異，「mutation B」係指將EU編號第328號之Leu置換成Glu之變異。第21圖係表示構成IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之恆定區的胺基酸殘基，與EU編號(本說明書中亦稱為EU INDEX)間之關係。第22圖中，橫軸表示各PD variant對FcγRIIb之相對結合活性數值，縱軸表示各PD variant對FcγRIIa R型之相對結合活性數值。將各PD variant對各種FcγR之結合量數值，除以作為控制組的導入變異前之抗體IL6R-F652∕IL6R-L(EU編號第238號之Pro被置換成Asp之變異Fc)對各種FcγR之結合量數值，接著乘以100倍，得到之數值即是各PD variant對各種FcγR之相對結合活性數值。圖中之點F652係表示IL6R-F652∕IL6R-L之值。第23圖中，縱軸表示，對不具有P238D變異之GpH7-B3，導入了各種變異之變異體對FcγRIIb之相對結合活性數值，橫軸表示，對具有P238D變異之IL6R-F652，導入了各種變異之變異體對FcγRIIb之相對結合活性數值。並且，將各變異體對FcγRIIb之結合量數值，除以導入變異前之抗體對FcγRIIb之結合量數值，接著乘以100倍，得到之數值即是相對結合活性數值。在這裡，在導入不具有P238D之GpH7-B3的場合，與導入具有P238D之IL6R-F625的場合中，對FcγRIIb之結合均發揮增強效果之變異，包含於區域A中；在導入不具有P238D之GpH7-B3的場合中，對FcγRIIb之結合發揮增強效果，但在導入具有P238D之IL6R-F625的場合中，對FcγRIIb之結合沒有發揮增強效果之變異，包含於區域B中。第24圖係Fc(P238D)∕FcγRIIb細胞外區域複合體之晶體結構示意圖。第25圖係，將Fc(P238D)∕FcγRIIb細胞外區域複合體之晶體結構，以及Fc(WT)∕FcγRIIb細胞外區域複合體之模型結構，以Cα原子間距離為基準，以最小平方法對FcγRIIb細胞外區域以及Fc CH2結構域A進行疊加之圖。第26圖係將Fc(P238D)∕FcγRIIb細胞外區域複合體之晶體結構，以及Fc(WT)∕FcγRIIb細胞外區域複合體之模型結構，以Cα原子間距離為基準，以最小平方法分開對Fc CH2結構域A、Fc CH2結構域B進行疊加，係比較P238D附近之詳細結構之圖。第27圖係Fc(P238D)∕FcγRIIb細胞外區域複合體之晶體結構中，在Fc CH2結構域A之EU編號第237號之Gly的主鏈與FcγRIIb之第160號之Tyr之間，觀測到氫鍵的示意圖。第28圖係Fc(P238D)∕ FcγRIIb細胞外區域複合體之晶體結構中，在Fc CH2結構域B之EU編號第270號之Asp與FcγRIIb之第131號之Arg之間，觀測到靜電相互作用的示意圖。第29圖中，橫軸表示各2B variant對FcγRIIb之相對結合活性數值，縱軸表示各2B variant對FcγRIIa R型之相對結合活性數值。將各2B variant對各種FcγR之結合量數值，除以作為控制組的導入變異前之抗體(EU編號第238號之Pro被置換成Asp之變異Fc)對各種FcγR之結合量數值，接著乘以100倍，該數值即是各2B variant對各種FcγR之相對結合活性數值。第30圖中顯示，Fc(P238D)∕ FcγRIIb細胞外區域複合體之晶體結構中Fc Chain A之EU編號第233號之Glu，以及在FcγRIIb細胞外區域中其周圍之殘基。第31圖中顯示，Fc(P238D)∕ FcγRIIb細胞外區域複合體之晶體結構中Fc Chain A之EU編號第330號之Ala，以及在FcγRIIb細胞外區域中其周圍之殘基。第32圖係將Fc(P238D) ∕ FcγRIIb細胞外區域複合體，以及Fc(WT) ∕ FcγRIIIa細胞外區域複合體之晶體結構，以Cα原子間距離為基準，以最小平方法對Fc Chain B進行疊加，顯示Fc Chain B之EU編號第271號之Pro的結構之圖。第33圖係將Fv4-IgG1、Fv4-P587投入人類FcgRIIb基因轉殖小鼠後，該小鼠血漿中之投入的抗原結合分子之濃度變化示意圖。第34圖係將Fv4-IgG1、Fv4-P587投入人類FcgRIIb基因轉殖小鼠後，該小鼠血漿中之投入的人類IL-6R之濃度變化示意圖。第35圖係與現有之中和抗體相比之下，離子濃度依賴性抗原在中性pH之環境中對FcγR之結合增強，透過投入會與該抗原結合之抗體，使來自血漿中之可溶性抗原消失，如此之非限制性的作用機制示意圖。第36圖係將Fv4-IgG1、Fv4-P587、Fv4-P587_LS投入人類FcgRIIb及人類FcRn基因轉殖小鼠後，該小鼠血漿中之投入的抗原結合分子之濃度變化示意圖。第37圖係將Fv4-IgG1、Fv4-P587、Fv4-P587_LS投入人類FcgRIIb及人類FcRn基因轉殖小鼠後，該小鼠血漿中之投入的人類IL-6R之濃度變化示意圖。

Claims

一種如說明書及圖式所述之FcγRIIb特異性Fc區域變異體。