KR100620554B1

KR100620554B1 - Ｔａｇ-72에 대한 인간화 항체

Info

Publication number: KR100620554B1
Application number: KR1020050033303A
Authority: KR
Inventors: 홍효정; 김상직; 윤선옥; 장명희; 김근수; 이태섭; 최창운
Original assignee: 한국생명공학연구원; (주) 에이프로젠
Priority date: 2004-06-05
Filing date: 2005-04-21
Publication date: 2006-09-06
Also published as: CN101035809A; KR20060047362A; EP1761566A1; EP1761566B1; WO2005121180A1; CA2569200A1; ES2561420T3; EP1761566A4; US20080279847A1; US8119132B2; CA2569200C; JP2008509656A; CN101035809B

Abstract

본 발명은 암 특이항원 TAG-72(tumor-associated glycoprotein-72)에 특이적인 인간화 항체 및 상기 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 TAG-72에 특이적인 인간화 항체 AKA/HzK의 중쇄를 돌연변이시켜 항원에 대한 친화도를 증가시킨 인간화 항체 및 상기 인간화 항체의 경쇄를 인간 경쇄로 치환한 항체 및 상기 항체를 포함하는 항암 조성물에 관한 것이다.

TAG-72, 인간화 항체

Description

ＴＡＧ-72에 대한 인간화 항체{Humanized Anti-TAG-72 Monoclonal Antibodies}

도 1은 서열번호 1로 기재되는 암 특이항원 TAG-72에 대한 인간화 항체 AKA/HzK의 중쇄 HCDR3 아미노산 서열 중, 99번째부터 103번째까지의 아미노산을 무작위로(random) 돌연변이시켜서 돌연변이된 항체의 발현벡터를 제조하는 방법을 나타낸 개략도이다.

도 2는 항원에 대한 친화도가 높은 변이체 Fab 클론들을 선별하기 위한 콜로니 리프트 어세이를 나타낸다.

도 3은 항원에 대한 친화도가 높은 변이체 클론의 중쇄 가변영역 아미노산 서열을 나타낸 결과이다.

도 4는 항원결합 친화도가 가장 높은 변이체 3E8를 전체 IgG 발현을 위한 플라스미드를 제조하는 방법을 나타내는 개략도이다.

도 5a 와 5b는 IgG 형태의 3E8, 3C4, 3D5, NV 및 NI 항체와 기존의 IgG 형태의 AKA/HzK 항체의 항원 결합능을 비교하여 나타낸 그래프이다.

도 6은 본 발명의 항체를 환원한 경우와 환원하지 않은 경우의 분자량을 보여주는 전기영동 사진이다.

레인 1 : 환원한 경우, 레인 2 : 환원하지 않은 경우

도 7은 3E8/BSM22 항체의 인간 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 AKA/HzK의 경쇄 가변영역의 아미노산 서열과 비교한 것이다.

도 8은 3E8/BSM22 항체의 전체 IgG 발현을 위한 플라스미드를 제조하는 방법을 나타내는 개략도이다.

도 9는 3E8과 3E8/BSM22 항체의 항원결합친화도를 AKA/HzK과 비교한 결과이다 (○는 3E8, ▼는 3E8/BSM22, ●는 AKA/HzK를 나타낸다).

도 10은 인간 대장암을 이종 이식한 아티믹 마우스(athymic mice)에 3E8 및 AKA/HzK 항체의 생체내 분포 및 암 적중 능력을 연구하였다. ¹²⁵I-표지된 AKA/HzK 또는 3E8을 마우스 모델로 정맥내 주사하고 ¹²⁵I-AKA/HzK(A) 또는 ¹²⁵3E8(B)의 생체내 분포로 AKA와 3E8 항체의 생물학적 분포 및 암 적중 능력을 살펴본 것이다.

도 11은 암성장 저해 효과를 분석하기 위하여 3E8 항체의 방사면역 치료효과를 살펴본 것으로, ¹²⁵I-3E8(●), 3E8(■) 투여된 마우스에서의 암의 Td(a) 및 체중 변화(b)를 살펴본 것이다.

도 12는 암성장 저해 효과를 분석하기 위하여 3E8 항체의 방사면역 치료효과를 살펴본 것으로, ¹²⁵I-3E8(●), 3E8(■) 투여된 마우스에서의 생존률(a) 및 체중 변화(b)를 살펴본 것이다.

본 발명은 암 특이항원 TAG-72에 특이적인 인간화 항체 및 상기 항체를 포함하는 항암 조성물에 관한 것이다.

종양-특이 당단백질-72(tumor-associated glycoprotein-72, 이하 “TAG-72”라 약칭함)는 일종의 뮤신(mucin) 단백질로서, 대장암, 위암, 이자암, 유방암, 난소암 등의 광범위한 인간 암종(human carcinomas)에서 발현되는 암 특이 항원이다. TAG-72에 특이한 항체로서는 1980년대 초 미국 NIH 국립 암 연구소(NIH National Cancer Institute)의 제퍼리 쉬롬 박사(Dr. Jeffrey Schlom) 그룹에 의하여 사람 유방암 조직의 막 분획을 면역원으로 사용하여 제조한 B72.3 생쥐 단일클론항체가 처음으로 보고되었다(Colcher et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78(5):3199-3203). 그 후 B72.3보다 항원결합 친화도가 높은 2세대 항체인 CC49과 CC83 등이 동 연구그룹에서 개발되었다(Muraro et al., 1988, Cancer Res., 48(16):4588-4596)

CC49이나 CC83는 80% 이상의 대장암과 약 50%의 유방암에 결합하나 정상조직에는 거의 결합하지 않았다. 또한, ¹³¹I-로 표지된 CC49나 CC83을 암환자를 대상으로 생체내 이미징(in vivo imaging) 결과 원발성 암과 전이된 암을 검출하였다 (Divgi et al.,1994, Nucl. Med. Biol.,21(1):9-15). 그러나, 생쥐 단일클론항체를 인체 반복 투여 시 인체 면역반응 유발로 인하여 부작용이 생기거나 치료효과가 감소되었다. 이러한 면역반응을 최소한으로 줄이기 위하여 생쥐 항체의 항원결합 부위인 CDR(complementarity determining region)과 항원결합 친화도를 높여주기 위하여 FR(framework regoin)의 몇 아미노산 잔기들을 인간 항체에 이식시킨 인간화 항체들을 제조하여 왔다(Owens et al, 1994, J. Immunol. Methods, 168(2):149-65). 실제로 이러한 인간화 항체들을 환자에게 반복 투여할 경우 인체면역 반응이 많이 감소됨이 보고되었다(Brown et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:2663).

TAG-72 항체에 대한 인간화 항체 연구의 일환으로, 생쥐항체 CC49의 인간화 항체(HuCC49)가 생쥐 항체의 CDR을 인간 단일클론 항체의 경쇄 및 중쇄의 Fr로 이식되고, 항원 결합-위치 구조의 보존에 필요한 생쥐 Fr 잔기는 보유하는 인간화된 CC49 (HuCC49)가 제조되었다 (Kashmiri et al., Hybridoma 14:461-473, 1995).

미국 특허 제5,976,531호는 인간 카파 서브그룹 Ⅳ 점라인 유전자 (human kappa subgroup Ⅳ germline gene: Hum4 V_L) 유래의 경쇄 가변영역 (V_L)와 TAG-72와 결합능을 가지는 3차 구조를 형성하기 위하여 경쇄 가변영역과 결합할 수 있는 중쇄 가변영역 (V_H)을 가지는 TAG-72 특이적 항체인 Hum4V_L,V_H항체에 대하여 기술하고 있다.

미국특허 제6,495,137호는 CC49, CC83, CC46, CC92, CC30, CC11 등의 TAG-72 에 대한 생쥐항체 (murine anti-TAG-72 antibody) 경쇄 CDR이 Hum4V_L로 이식된 CDR 이식된 경쇄(CDR-grafted light chain)를 포함하는 인간화된 항-TAG72 항체 또는 이의 단편에 대하여 기술하고 있다.

이 외에도, 다양한 TAG-72 인간화 항체들이 개발되었음에도 불구하고, 여전히 높은 항원 결합성을 가지면서도 사람에서 면역반응을 유발시킬 가능성이 낮은 항체가 필요하였다.

이에, 본 발명자들은 선행 발명에서 TAG-72에 대한 생쥐항체 CC49의 CDR 및 FR 서열과 가장 유사한 사람 유전자를 검색하고, 이를 대상으로 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자를 제조한 후 이들을 발현벡터에 클로닝하여 숙주세포를 형질전환한 다음 이를 배양하여 인간화 항체 AKA/HzK를 개발하였다(대한민국 특허 제 0318761호). 인간화 항체 AKA/HzK는 기존의 인간화 항체 HuCC49에 비하여 CDR 및 FR의 아미노산 잔기가 보다 인간에 가깝게 치환되어 인간에 대하여 더 감소된 면역원성을 가지지만 항원 결합능은 기존의 항체와 실질적으로 거의 유사하다. 그럼에도 불구하고, 인체에 의한 면역반응 유발은 감소시키고 항원 결합능과 친화도는 더 증가한 기능적으로 우수한 항체에 대한 필요성은 여전히 요구되고 있다.

이런 배경하에서, 본 발명자는 TAG-72에 대한 결합능과 친화력이 우수한 항체를 제조하기 위하여, 기존 인간화 항체 AKA/HzK의 중쇄 가변영역의 CDR3 영역을 무작위로 돌연변이시켜 인간화 중쇄 라이브러리 세포를 제작하고 이 라이브러리 세포를 대상으로 콜로니 리프트 어세이(colony lift assay)를 실시하여 항원 결합능이 높은 변이체 클론을 선별한 후 선별된 클론들을 대상으로 경쟁적 ELISA를 실시하여 각 클론의 항원 결합능을 분석하는 방법으로 TAG-72에 대한 항원 결합능과 항원 결합 친화도가 증가한 신규한 항체를 제조하고, 더 나아가 상기 신규 인간화 항체의 경쇄를 인간 경쇄로 치환한 인간화 항체를 제조하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 (i) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 100번 내지 103번 아미노산 잔기 중 하나 이상의 잔기가 치환 될 수 있는 중쇄 가변 영역 및 (ii) 서열번호 21 또는 서열번호 22로 기재되는 아미노산 서열의 경쇄 가변영역을 갖는 TAG-72((tumor-associated glycoprotein-72)에 대한 인간화 항체에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 서열 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산서열을 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하여 상기 인간화 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체를 포함하는 항암 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체를 투여하여 암을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체를 투여하여 암을 진단하는 방법에 관한 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 (i) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 100번 내지 103번 아미노산 잔기가 하기 서열식 1로 기재되는 서열을 갖는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역 및 (ii) 서열번호 21 또는 서열번호 22로 기재되는 아미노산 서열의 경쇄 가변영역을 갖는 TAG-72((tumor-associated glycoprotein-72)에 대한 인간화 항체에 관한 것이다.

서열식 1

-X100-X101-X102-X103-

상기식에서,

X100은 루이신(Leu) 또는 트립토판(Trp) 아미노산 잔기이고,

X101은 이소루이신(Ile), 발린(Val), 루이신(Leu) 또는 알라닌(Ala) 아미노산 잔기이며,

X102는 메티오닌(Met) 또는 글루타민(Gln) 아미노산 잔기이고,

X103은 알라닌(Ala), 글루타민(Gln) 또는 글리신(Gly) 아미노산 잔기이다.

생쥐 유래 항체는 인체내에서 항원으로 작용하여 이에 대한 새로운 항체(Human Anti-Mouse Antibody: HAMA, 인체 항-쥐 항체)가 생성되기 때문에 바람직하지 않은 면역 반응을 유발한다. 이런 점을 극복하기 위하여 인체에서 비-인체 항체의 면역원성을 감소시키기 위한 제안이 이루어졌다. 인간화(Humanization) 기술이라고 명명된 이 기술은 일반적으로 항체분자의 폴리펩타이드 사슬을 암호화 하는 DNA 서열을 조작하는 재조합 DNA 기술을 사용한다. 인간화된 항체 제조의 초기 방법은, 비-인간 항체의 항원결합부위 전체로 구성되는 항체 결합부위와, 인간 항체의 불변영역을 연결시킨 키메릭 항체를 생산하는 것이다. 국제공개 특허 WO86/01533에는 마우스 항체 기원의 가변성 영역만을 인체 항체 불변 영역과 결합시켜서 인간화시킨 키메릭 항체를 제조하는 방법을 개시하고 있다. 이런 키메릭 항체의 경우 생쥐 항체보다 면역반응을 덜 일으키고 기능을 증진시키는 장점들을 보였다. 그러나 키메릭 항체는 생쥐의 가변 영역, 즉 다시 말하면 비-인간 가변성 영역의 아미노산 서열을 여전히 함유하고 있으므로 반복적으로 인체에 투여할 경우 여전히 HAMA 반응을 일으킨다.

키메라 항체를 좀 더 인간화시키기 위하여 항원간의 결합 기능을 나타내는 생쥐 단클론 항체의 CDR 부분을 사람 항체의 FR과 재조합 시키는 시도가 생쥐 항체의 결합 특이성과 친화도를 유지시키면서 인체에는 면역반응을 유발하지 않을 거라는 개념 하에 있었다(Jones et al., 1986, Nature, 4;321(6069):522-525). 상기와 같은 생쥐 항체의 CDR 루프(loop)부분을 인간 항체에 이식하는 CDR 이식(grafting) 방법으로 제조된 인간화된 항체는 비인간 아미노산 서열을 훨씬 작은 비율로 포함하고 있기 때문에 키메릭 항체보다 HAMA 반응을 훨씬 덜 일어나게 하기도 하나 항체의 친화도가 낮을 수 있다. 항체 결합능을 유지하기 위하여 원래 항체인 생쥐 항체의 FR 영역이 필요할 수도 있으므로 CDR 구조에 영향을 줄 것이라 생각하는 몇 개 FR 영역의 아미노산 잔기를 생쥐 항체의 것으로 치환하여 원래의 생쥐 항체와 유사한 수준으로 친화도를 증진시킬 수도 있었다(Riechmann et al., 1988, Nature, 332: 323-327; Queen et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10023-10029; Tempest et al.,1991, Biol. Technology, 9:266-271; Co et al., 1991, Nature, 351:501-502).

본 발명에서, 용어 "인간화 항체(humanized antibody)"란, 이상에서 설명한 바와 같이, 인간에게 비-면역원성(non-immunogenic)이거나 또는 면역원성이 감소된 항체를 총칭한다. 인간화 항체는 아미노산 서열이 변형된 항체(altered antibody)이고 항체의 아미노산 서열은 원하는 목적에 맞게 재구성할 수 있다. 이러한 가능한 변화는 수없이 많고 하나 또는 몇 가지 아미노산을 변화시키는 것부터 항체의 가변 및/ 또는 불변 영역의 완전한 재구성 까지 가능하다. 일반적으로 가변영역의 변형이 항원의 결합능과 친화도를 증대시키기 위하여 행하여지는데 비하여 불변영역에서의 변형은 보체(complement)의 고정, 막과의 상호작용 및 기타 효과제의 기능과 같은 세포내 작용을 증대시키기 위하여 행하여진다.

본 발명과 관련된 인간화 항체는, 생쥐항체 CC49 경쇄 및 중쇄의 서열과 가장 유사한 유전자를 진뱅크 데이터 베이스(GeneBank data base)에서 선별하고 이들 유전자 각각을 사람 경쇄 불변 영역 유전자 Cκ 및 사람 중쇄 불변 영역 유전자 Cγ1과 재조합시켜 얻은 선행 발명의 인간화된 항체(AKA/HzK)의 중쇄 가변영역의 CDR3 부위를 돌연변이시켜서 얻은 항체로, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역과 서열번호 21로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역을 가지는 AKA/HzK 보다 항원 결합능과 친화도가 증가된 항체이다.

상기에서 용어, "가변 영역"이란 항원과 특이적으로 결합하는 기능을 수행하면서 서열상의 많은 변이(variation)을 보이는 항체 분자의 부분을 의미하고, 가변영역에는 CDR1, CDR2 및 CDR3가 존재한다. “상보성 결정 영역(complementarity determining regions: CDR)”은 항원의 인식에 관여하는 고리모양의 부위로서 이 부위의 서열이 변함에 따라 항체의 항원에 대한 특이성이 결정되는 중요한 부위이다. 본 발명은 구체적으로 CDR3의 아미노산 서열 변이를 통하여 항원 결합 친화도를 증가시킨 항체를 제조하였다. CDR 사이에는, 적절한 배향으로 “프레임워크 영역(frame work: FR)”이 존재하여 CDR 고리를 지지해주는 역할을 하고, 구체적으로 FR1, FR2, FR3 및 FR4가 존재한다. 본 발명의 항체 중쇄 가변영역은 1번부터 30번까지의 FR1 부위, 31번부터 35번까지의 CDR1, 36번부터 49번까지의 FR2, 50번 부터 66번까지의 CDR2, 67번부터 98번까지의 FR3, 99번부터 104번까지의 CDR3 및 105번부터 115번까지의 FR4로 이루어져 있다. 본 발명의 항체 경쇄 가변영역은 1번부터 23번까지의 FR1 부위, 24번부터 40번까지의 CDR1, 41번부터 55번까지의 FR2, 56번부터 62번까지의 CDR2, 63번부터 94번까지의 FR3, 95번부터 103번까지의 CDR3 및 104번부터 113번까지의 FR4로 이루어져 있다.

본 발명자는, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 중쇄 가변영역 중의 CDR3의 101번(Kabat No: 97번) 아스파라긴(Asn) 잔기가 지방족(aliphatic) 잔기로 치환될 때 TAG-72에 대한 친화도가 증가하는 것을 알 수 있었다. 본 발명에서 지방족 단백질은 이소루이신, 발린, 루이신 또는 알라닌을 의미한다.

구체적인 양태로서, 본 발명은 (i) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 101번(Kabat No: 97번) 아스파라긴 잔기가 지방족 잔기 예를 들어, 이소루이신, 발린, 루이신 또는 알라닌 잔기로 치환되고 100번(Kabat No: 96번) 루이신 잔기가 트립토판 잔기로 치환되고/되거나, 102번(Kabat No: 98) 메티오닌 잔기가 글루타민 잔기로 치환되고/되거나, 및/또는 103번(Kabat No: 99) 알라닌 잔기가 글루타민 잔기, 글리신으로 치환된 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 (ii) 서열번호 21로 기재되는 아미노산 서열의 경쇄 가변영역을 포함하는 TAG-72에 대한 인간화 항체를 제공한다.

보다 바람직하게는, 중쇄 가변 영역의 101번 아스파라긴 잔기가 발린, 102번 메티오닌 잔기가 글루타민, 103번 알라닌 잔기가 글리신으로 치환된 것이다. 이에 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 21로 기재되는 아미노산 서열의 경쇄 가변영역을 포함하는 TAG-72에 대한 인간화 항체 3C4를 제공한다. 또한 보다 바람직하게는, 중쇄 가변 영역의 101번 아스파라긴 잔기가 이소루이신이, 102번 메티오닌 잔기가 글루타민, 103번 알라닌 잔기가 글리신으로 치환된 것이다. 이에 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 21로 기재되는 아미노산 서열의 경쇄 가변영역을 포함하는 TAG-72에 대한 인간화 항체 3D5를 제공한다. 또한 보다 바람직하게는, 중쇄 가변 영역의 101번 잔기 아스파라긴이 이소루이신, 100번 잔기 루이신이 트립토판, 103번 잔기 알라닌이 글루타민으로 치환된 것이다. 이에 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 21로 기재되는 아미노산 서열의 경쇄 가변영역을 포함하는 TAG-72에 대한 인간화 항체 3E8를 제공한다. 또한 보다 바람직하게는, 중쇄 가변 영역의 101번 아스파라긴 잔기가 발린으로 치환된 것이다. 이에 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 21로 기재되는 아미노산 서열의 경쇄 가변영역을 포함하는 TAG-72에 대한 인간화 항체 NV를 제공한다. 또한 보다 바람직하게는, 중쇄 가변 영역의 101번 아스파라긴 잔기가 이소루이신으로 치환된 것이다. 이에 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 21로 기재되는 아미노산 서열의 경쇄 가변영역을 포함하는 TAG-72에 대한 인간화 항체 NI를 제공한다.

상기의 항체는 모두 기존의 항체 AKA/HzK 보다 친화도가 크게 증가한 항체 로, 전체(whole) 항체 3C4는 1.33x10^-9M, 전체 항체 3D5는 2.27x10^-9M, 전체 항체 3E8은 0.65x10^-9M의 항원 결합 친화도(K_D)를 가지고, 이는 AKA/HzK의 1.45x10^-8M보다 각각 약 11배, 6배 및 22배가 증가한 수치이다. 전체 NV는 1.66x10^-9M, 전체 항체 NI은 3.38x10^-9 M의 항원 결합 친화도(K_D)를 가지고, 이는 AKA/HzK의 1.45x10^-8M보다 각각 약 8배 및 4배가 증가한 수치이다.

본 발명자는 상기 항체의 경쇄를 인간 경쇄로 대체하고자 하였다.

인간화 경쇄를 대체하여 중쇄 가변영역과 함께 사용될 수 있는 인간 경쇄를 선별하기 위하여, 인간 PBL(peripheral blood lymphocytes)로부터 인간 경쇄 라이브러리를 제작한 뒤, 가장 우수한 효과를 보이는 인간화 항체 3E8 의 Fab 발현 벡터인 pC3-Q-3E8의 인간화 경쇄 유전자 대신에 삽입하고, 항원 결합능이 높은 변이체 클론을 선별하기 위하여 리프트 어세이를 실시하였다. 세포 클론의 결합능이 야생형인 3E8 Fab 에 비해 우수한 클론들을 분리한 뒤 이 클론의 경쇄 가변영역의 염기서열을 확인한 결과, 서열번호 22로 기재되는 아미노산 서열을 가짐을 확인할 수 있었다. 상기의 방법으로 얻은 서열번호 22로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 인간 경쇄 가변영역은 통상적인 유전자 재조합적인 방법으로 상기 인간화 항체의 경쇄 가변영역으로 대체할 수 있다.

또 다른 구체적인 양태로서, 본 발명은 101번(Kabat No: 97번) 아스파라긴 잔기가 지방족 잔기 예를 들어, 이소루이신, 발린, 루이신 또는 알라닌 잔기로 치환되고 100번(Kabat No: 96번) 루이신 잔기가 트립토판 잔기로 치환되고/되거나, 102번(Kabat No: 98) 메티오닌 잔기가 글루타민 잔기로 치환되고/되거나, 및/또는 103번(Kabat No: 99) 알라닌 잔기가 글루타민 잔기, 글리신으로 치환된 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 (ii) 서열번호 22로 기재되는 아미노산 서열의 경쇄 가변영역을 포함하는 TAG-72에 대한 인간화 항체를 제공한다.

바람직하게는, 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 22로 기재되는 아미노산 서열의 경쇄 가변영역을 포함하는 TAG-72에 대한 인간화 항체를 제공한다. 또한 바람직하게는, 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 22로 기재되는 아미노산 서열의 경쇄 가변영역을 포함하는 TAG-72에 대한 인간화 항체를 제공한다. 또한 바람직하게는, 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 22로 기재되는 아미노산 서열의 경쇄 가변영역을 포함하는 TAG-72에 대한 인간화 항체를 제공한다. 또한 바람직하게는, 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 22로 기재되는 아미노산 서열의 경쇄 가변영역을 포함하는 TAG-72에 대한 인간화 항체를 제공한다. 또한 바람직하게는, 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 22로 기재되는 아미노산 서열의 경쇄 가변영역을 포함하는 TAG-72에 대한 인간화 항체를 제공한다.

상기의 항체는 모두 기존의 항체 AKA/HzK 보다 친화도가 크게 증가한 항체이다. 그 중에서, 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 22로 기재되는 아미노산 서열의 경쇄 가변영역을 포함하는 인간화 항체 3E8/BSM22가 가장 바람직하다. 전체(whole) 3E8/BSM22 항체는 0.45x10^-9M의 항원 결합 친화도(KD)를 가지고, 이는 3E8 항체의 0.65x10^-9M보다 약 1.5배가 증가한 수치이다.

본 발명에서 “항체(antibody)”는 전체 항체(whole) 형태일 뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 국제공개 특허 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부 위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하며 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다) 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. 본 발명에서 항체는 바람직하게는 Fab 형태이거나 전체 항체 형태이다.

본 발명에서 제공하는 인간화 항체는 모든 종류의 불변영역과 재조합적인 방법으로 결합될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ). 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다(Coleman et al., Fundamental immunology, 2nd Ed., 1989, 55-73). 바람직하게는 중쇄 불변영역은 감마1 및 감마3 이고 가장 바람직하게는 감마1 이소타입이다. 바람직하게는 경쇄 불변영역은 카파 타입이다. 본 발명에서 바람직한 항체는 카파(κ) 경쇄와 감마1(γ1) 중쇄를 가지는 Fab 형태 또는 IgG1 형태이다.

본 발명의 항체의 불변영역은 이의 아미노산 서열이 변이된 변이체를 포함한다. 바람직하게는, 면역글로불린 불변영역 변이체는, 변이체의 단백질 서열이 인간의 것과 상이하지 않아 면역반응을 유발하지 않는 범위내에서, 아미노산 서열상의 유도와 수식에 의해서 단백질의 열, pH등에 대한 구조적 안정성 또는 가용성이 증가하거나, 황화 결합 형성, 발현 숙주와의 친화성, 보체와의 결합, Fc 수용체와 의 결합, 항체 의존성 세포독성 등이 개선된 변이체이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다.

중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 101번 아스파라긴 잔기가 지방족 잔기 예를 들어, 이소루이신, 발린, 루이신 또는 알라닌 잔기로 치환되고 100번 루이신 잔기가 트립토판 잔기로 치환되고/되거나, 102번 메티오닌 잔기가 글루타민 잔기로 치환되고/되거나, 및/또는 103번 알라닌 잔기가 글루타민 잔기, 글리신으로 치환된 아미노산 서열을 코딩한다. 바람직하게는, 서열번호 2, 3, 4, 5, 또는 6으로 기재되는 아미노산 서열을 코딩하는 서열이다.

보다 바람직하게는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 16의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산 서열이고, 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 17의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산 서열이고, 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 18의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산 서열이고, 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 19의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산 서열이고, 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 20의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산 서열이다.

경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 22로 기재되는 경쇄 가변영역을 코딩한다. 바람직하게는 서열번호 23의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산 서열이다.

상기 항체의 불변 영역 및 가변영역을 코딩하는 핵산서열은 재조합 발현 벡터에서 삽입되어 발현된다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 서열 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산서열을 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

바람직하게는, 서열번호 2 내지 6으로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 중쇄 가변영역과 서열번호 21 또는 22로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산서열을 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 구체적인 예에서, pC3-Q-3C4, pC3-Q-3D5, pC3-Q-3E8, pC3-Q-NV, pC3-Q-NI 또는 pC3-Q-3E8/BSM22인 재조합 벡터를 제공한다. 또한 pdCMV-dhfr-3C4, pdCMV-dhfr-3D5, pdCMV-dhfr-3E8, pdCMV-dhfr-NV, pdCMV-dhfr-NI 또는 pdCMV-dhfrC-3E8/BSM22인 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서 용어, 본 발명에서, "재조합 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명에서 "작동가능하게 연결된 (operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 용이하게 할 수 있다

본 발명의 적합한 발현 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 일반 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 원핵 세포에는 lac, tac, T3 및 T7 프로모터가 있으나 이로 제한되지는 않는다. 진핵세포에는 원숭이 바이러스 40(SV40), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 사람 면역 결핍 바이러스(HIV), 예를 들면 HIV의 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스, 시토메갈로바이러스(CMV), 엡스타인 바 바이러스(EBV), 로우스 사코마 바이러스(RSV)프로모터 뿐만 아니라, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈, 사람 근육 크레아틴, 사람 메탈로티오네인 유래의 프로모터가 있으나 이것으로 제한되지는 않는다.

발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함할 수 있다. 선택마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제 (selective agent)가 처리된 환경에서 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하므로 형질전환된 세포가 선별 가능하다. 또한, 벡터는 복제가능한 발현벡터인 경우, 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 복제원점 (replication origin)을 포함할 수 있다. 바이러스(예를 들어, 바쿨로바이러스) 또는 파지 벡터, 및 레트로바이러스 벡터와 같은 숙주 세포의 게놈내로 삽입될 수 있는 벡터도 사용 가능하다.

전체 항체 또는 항체 단편을 발현하는 벡터는, 경쇄와 중쇄가 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 경쇄와 중쇄를 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환(co-transfomation) 및 표적 형질전환(targeted transformation)을 통하여 숙주세포로 도입하고, 경쇄(또는 중쇄)를 함유하는 벡터로 형질전환된 세포를 선별하고 경쇄를 발현하는 선별된 세포를 중쇄(또는 경쇄)를 포함하는 벡터로 다시 형질전환하여 경쇄 및 중쇄 모두를 발현하는 세포를 최종적으로 선별한다.

Fab 형태의 항체를 제작하기 위해서, 인간 경쇄의 가변영역(VL)과 불변영역(CL) 및 인간 중쇄의 가변영역(VH)과 첫 번째 불변 영역 도메인(CH1)의 아미노산을 코딩하는 유전자가 삽입한 벡터를 이용한다. 본 발명에서는 구체적인 예에서는, pComb3HSS 벡터를 사용하였고, 보다 바람직하게는 중쇄의 첫 번째 아미노산인 글루타민을 유지시켜 주기 위하여 벡터의 xhoⅠ위치 앞에 있는 아미노산 서열 EVQL(글루탐산-발린-글루타민-루이신)을 QVQL(글루타민-발린-글루타민-루이신)으로 변형하고/하거나 가용성 Fab를 발현시키기 위해서는 geneⅢ를 제거한 벡터 pC3-Q이다. 이 벡터는 lacZ 프로모터를 가지고 시그널 펩타이드는 OmpA와 pelB를 가지는 것을 특징으로 한다.

바람직한 양태에서, 본 발명은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 21로 기재되는 경쇄 가변영역을 포함하는 pC3-Q-3C4, 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 21로 기재되는 경쇄 가변영역을 포함하는 pC3-Q-3D5, 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 21로 기재되는 경쇄 가변영역을 포함하는 pC3-Q-3E8, 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 21로 기재되는 경쇄 가변영역을 포함하는 pC3-Q-NV, 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 21로 기재되는 경쇄 가변영역을 포함하는 pC3-Q-NI 및 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 22로 기재되는 경쇄 가변영역을 포함하는 pC3-Q-3E8/BSM22등을 제공한다.

전체 항체를 제작하기 위해서, 인간 경쇄의 가변영역(VL)과 불변영역(CL) 및 인간 중쇄의 가변영역(VH)과 모든 불변영역 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 코딩하는 유전자가 삽입된 벡터를 이용한다. 본 발명의 구체적인 예에서는, pCMV-dhfr(KCTC 8671P: 대한민국 등록특허 제 162021호)를 이용하여 만든 두개의 발현단위를 가지는 pdCMV-dhfr를 이용하였다. 상기 벡터는 각각의 프로모터에서 중쇄와 경쇄가 발현되는 두개의 CMV 프로모터를 가지는 것을 특징으로 한다.

바람직한 양태에서, 본 발명은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 21로 기재되는 경쇄 가변영역을 포함하는 pdCMV-dhfr-3C4, 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 서 열번호 21로 기재되는 경쇄 가변영역을 포함하는 pdCMV-dhfr-3D5, 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 21로 기재되는 경쇄 가변영역을 포함하는 pdCMV-dhfr-3E8, 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 21로 기재되는 경쇄 가변영역을 포함하는 pdCMV-dhfr-NV, 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 21로 기재되는 경쇄 가변영역을 포함하는 pdCMV-dhfr-NI 및 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 22로 기재되는 경쇄 가변영역을 포함하는 pdCMV-dhfrC-3E8/BSM22 등을 제공한다.

그 중에서, 전체 항체 3E8를 발현하는 pdCMV-dhfr-3E8 벡터는 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, 대한민국 대전 유성구 어은동 52)에 2001년 6월 21일자로 제KCTC 1039BP호로 기탁되었고, 전체 항체 3E8/BSM22 를 발현하는 pdCMV-dhfrC-3E8/BSM22 벡터는 KCTC에 2004년 5 월 31일자로 제KCTC 10647BP호로 기탁되었다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다.

상기 벡터의 적합한 숙주세포는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 세포일 수 있다. 또한, 아스페르길러스 속 (Aspergillus species)과 같은 진균, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시아(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)같은 효모, 그 밖의 하등진핵 세포, 및 곤충으로부터의 세포와 같은 고등 진핵생물의 세포와 같은 진핵 세포일 수 있다. 또한 식물, 포유동물로부터 유래할 수 있다. 바람직하게는, 원숭이 신장 세포7(COS7:monkey kidney cells)세포, NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO:chinese hamster ovary)세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK:baby hamster kidney)세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 293 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 CHO 세포이다. 본 발명의 pdCMV-dhfr-3E8벡터를 CHO 세포로 리포펙타민을 이용한 방법으로 형질전환된 형질전환 세포주 9E8을 제조하였고 KCTC에 2001년 6월 21일자로 제KCTC 1040BP호로 기탁하였다. 또한, 본 발명의 pdCMV-dhfrC-3E8/BSM22 벡터를 CHO 세포로 형질전환하여 형질전환 세포주 4D12-B31을 제조하였고 KCTC에 2004 년 5월 31 일자로 제KCTC 10646BP호로 기탁하였다

본 발명에서 숙주세포로의 “형질 전환"은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO4)) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하여 제1항의 인간화 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

상기 항체 제조에서 형질전환체의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.

형질전환체를 배양하여 수득한 항체는 정제하지 않은 상태로 사용될 수 있으며 추가로 다양한 통상의 방법, 예를 들면 투석, 염 침전, 크로마토그래피 등을 이용할 수 있으며, 이들을 단독 또는 조합하여 이용할 수 있다. 그 중에서 크로마토그래피가 가장 많이 사용되며, 이온교환 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등이 있다.

상기 방법으로 제작된 항체는 항원에 대한 친화도(affinity)가 증가된 항체이다. 용어 “친화도”는 항원의 특정부위를 특이적으로 인식하고 결합하는 능력으로 이런 항체의 항원에 대한 특이성과 함께 고도의 친화도는 면역 반응에서 중요한 요소이다. 본 발명에서는 중쇄 가변영역을 무작위로 돌연변이시켜 인간화 중쇄 라이버러리 세포를 제작하고 이 라이버러리 세포를 대상으로 콜로니 리프트 어세이를 실시하여 항원 결합능이 높은 변이체 클론을 먼저 선별하였고 선별된 클론들을 대상으로 경쟁적 ELISA를 실시하여 각 클론의 친화도를 조사하였다. 그 외에 도 항원에 대한 친화도를 측정하기 위한 다양한 방법을 사용할 수 있고, 표면 플라즈몬 공명 기술(surface plasmon resonance technology:SRP)가 그 예다.

본원에 사용되는 용어 “K_D”는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 칭하며 항체의 항원에 대한 친화도를 측정하는 척도로 사용되었다. 상기 방법으로 제작한 본 발명의 항체는 항원 TAG-72에 결합할 수 있는 능력이 원래의 항체 AKA/HzK 보다 월등하였다.

따라서, 상기 방법으로 제작된 친화도가 증가한 항체는 암의 진단 및 치료에 유용하게 응용될 수 있다. 항체는 그 자체 또는 항체를 포함하는 조성물로 제공될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 항체를 사용하여 암을 진단하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 항체는, TAG-72에 높은 친화성으로 결합하므로 TAG-72와 상기 항체와의 결합체 형성을 검출 라벨(detection label)의 시그널 크기를 정성 또는 정량적으로 측정할 수 있고 이를 통하여 암 여부를 진단할 수 있다. 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하는 라벨에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소등이 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 실제, 면역조직화학적 염색(immunohistochemistry) 결과, 본 발명의 항체가 대장암에 대하여 매우 강한 반응 성을 보이는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명의 항체는 이미징 마커(imaging marker)와 결합시켜 환자에 투여하고 이를 확인함으로써 인간의 종양 또는 그들의 전이를 진단할 수 있다. 본 발명의 항체는 기존의 항체보다 항원에 대한 친화력이 높고, 보다 인간화된 항체이므로 환자에게 투여하기에 매우 적합하다. 항체-이미징 마커 결합체(antibody-imaging marker conjugated)의 투여와 확인 및 항체를 이미징 마커에 연결시키는 방법은 (Goldenberg et al., 1978, New England J. Med. 298, 1384-1388; Goldenberg et al., 1983,J. Amer. Med. Assoc. 280, 630-635; Goldengerg et al.,1983, Gastroenterol. 84, 524-532; Siccardi et al., 1986, Cancer Res. 46, 4817-4822; Epenetos et al., 1985, Cancer 55, 984-987; Philben et al., 1986, Cancer 57, 571-576; Chiou et al., 1986, Cancer Inst. 76, 849-855; Colcher et al., 1983, Cancer Res., 43, 736-742; Colcher, E. et al., Laboratory Research Methods in Biology and Medicine Immunodiagnostics. New York, Alan R. Liss. pp. 215-258(1983); Keenan, A.M. et al., 1984, J. Nucl. Med. 25, 1197-1203; Colcher D. et al., 1987, Cancer Res. 47, 1185-1189; Estaban, J.M. et al., 1987, Intl. J. Cancer 39, 50-59; Martin, D.T., et al., 1984, Curr. Surg. 41, 193-194; Martin, E.W. Jr. et al., 1986, Hybridoma 5, S97-S108; Martin, D.T. et al., 1985, Am. J. Surg. 150, 672-675; Meares et al., Anal. Biochem. 1984, 142, 68-78; 및 Krejcarek et al., 1977, Biochem. and Biophys. Res. Comm. 77, 581-585) 등의 문헌에 기술되어 있다. 투여량은 환자의 연령과 체중에 따라 변할 수 있다. 항체-이미징 마커 결합체 투여량은 정상적인 조직과 구별되는 종양 부위를 가시화시키거나 확인할 수 있도록 효과적인 양이어야 한다.

항체에 결합할 수 있는 이미징 마커의 예에는 당 분야의 기술자들에게 널리 알려져 있으며, 감마 스캐너(gamma scanner) 또는 수동 감마 프로브(hand held gamma probe) 또는 양성자 방출 단층 촬영기(positron Emission Tomograpy)등을 사용하여 진단상(diagnostic imaging)에 의하여 확인할 수 있는 물질과 또는 핵자기 공명 분광기(nuclear magnetic resonance spectrometer)등을 이용한 핵자기 공명상에 의하여 확인할 수 있는 물질을 포함한다. 감마 스캐너 등에 의하여 확인될 수 있는 물질의 적절한 예로서는 ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹²³I, ¹¹In, ¹⁰⁵Rh, ¹⁵³Sm, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga,¹⁶⁶Ho, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, 및 ⁹⁹mTc과 같은 방사성 동위원소를 포함한다. ¹²⁵I, ¹²³I, ¹⁵³Sm 및 ⁹⁹mTC는 적은 에너지와 광범위한 확인이 적절하기 때문에 바람직하다. 핵자기공명 분광기 등을 이용하여 확인될 수 있는 물질의 예로는 가돌리니움(Gadolinium: Gd)이 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 항체를 포함하는 항암 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, “항암”이란 “예방” 및 “치료”를 포함하며, 여기서 "예방"이란 본 발명의 항체를 포함하는 조성물 투여에 의해 암이 억제되거나 지연되는 모든 행위을 의미하고, "치료"란 본 발명의 항체 투여에 의해 암의 증세가 호 전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 항체는 인간 대장암을 이종 이식한 마우스에서 기존의 AKA/HzK보다 높게 흡수되고, 혈액에서의 보유력도 높았다. 인간 대장암을 이종 이식한 마우스를 본 발명의 항체로 투여할 경우, 50% 생존률은 대조구 마우스 보다 크게 증가하였다.

본 발명의 조성물로 치료할 수 있는 암에는 TAG-72가 발현되는 모든 암을 포함한다. TAG-72는 인간 암종에서 광범위하게 발현되므로 이러한 발현이 있는 모든 암을 치료할 수 있으며, 대장암, 난소암, 위암, 이자암, 유방암 등을 예로 들 수 있다.

치료용 항체로 사용될 경우, 항체는 기존의 치료제와 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 커플링(예를 들어, 공유결합)되어 항체-치료제 결합체 형태로 생체내로 투입하여 암 치료에 이용할 수 있다. 항체-치료제 결합체에서 항체와 결합될 수 있는 치료제에는 화학치료제, 방사성핵종(radionuclide), 면역치료제, 사이토킨, 케모킨, 독소, 생물작용제, 효소 저해물질, 이형가능성 항체 등이 있으나 이로 제한되지는 않는다: (1) ¹³¹I, ⁹⁰Y, ¹⁰⁵Rh, ⁴⁷Sc, ⁶⁷Cu, ²¹²Bi, ²¹¹At, ⁶⁷Ga, ¹²⁵I, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁷⁷Lu, ¹⁵³Sm, ¹²³I, ¹¹¹In과 같은 방사성핵종(radionuclide)에 결합된 항체, 이들은 (Goldengerg et al., 1981, Cancer Res. 41, 4354-4360)등에 기술되어 있다; (2) 메토트렉세이트(methotrexate), 아드리아마이신(adriamycin), 및 인터페론과 같은 림포카인(lympokine) 등의 생물학적 반응 변형체 또는 약물과 결합된 항체, 이들은 (Chabner et al., 1985, Cancer, Principles and Practice of Oncology, Philadelphia, PA, J.B. Lippincott Co. Vol. 1, pp. 290-328) 등에 기술되어 있다; (3) 리신, 아브린, 드프테리아 등과 같은 독소와 결합된 항체, 이들은 (Uhr et al., 1983, Monoclonal antibodies and Cancer, Academic Press, Inc., pp. 85-98) 등에 기술되어 있다; (4) 이형기능성 항체(heterofunctional antibodies), 즉 다른 항체와 결합되어서 그 복합체가 암 세포와 효능 세포(예를들면, T 세포와 같은 K 세포(killer cell) 모두에 결합하는 항체, 이들은 (Perez et al., 1986, J. Exper. Med. 163, 166-178; 및 Lau et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 82, 8648-8652)등에 기술되어 있다; 및 (5) 자연적인, 즉 비-연관 또는 비-복합된 항체, 이들은 (Herlyn et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci., (USA) 79, 4761-4765) 등에 기술되어 있다.

항체 조성물의 경우 투여 방식에 따라 허용 가능한 담체를 포함하여 적절한 제제로 제조된다. 투여 방식에 적합한 제제는 공지되어 있고, 전형적으로 막을 통과한 이동을 용이하게 하는 계면활성제를 포함한다. 이러한 계면활성제는 스테로이드에서 유도된 것이거나 N-[1-(2,3-디올레오일)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTMA) 등의 양이온성 지질, 또는 콜레스테롤 헤미숙시네이트, 포스파티딜 글리세롤 등의 각종 화합물 등이 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 항체를 투여하여 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.

상기 조성물은 암을 치료하기에 충분한 양으로 환자에게 투여되며 암 종류, 환자의 연령, 체중, 증상의 특성 및 정도, 현재 치료법의 종류, 치료 회수, 투여 형태 및 경로 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 상기한 약리학적 또는 생리학적 성분을 함께 투여하거나 순차적으로 투여할 수 있으며, 또한 추가의 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 이러한 투여는 단일 또는 다중 투여일 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명에서, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하면 본 발명의 항체를 포함하는 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 단백질은 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 하는 것이 바람직하다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

이하, 구체적으로 본 발명을 설명한다.

먼저, 본 발명의 TAG-72에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변영역을 제작하였다:

인간화 항체 AKA/HzK의 중쇄 가변영역은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되어 있으며, 1번부터 30번까지의 FR1 부위, 31번부터 35번까지의 CDR1, 36번부터 49번까지의 FR2, 50번부터 66번까지의 CDR2, 67번부터 98번까지의 FR3, 99번부터 104번까지의 CDR3 및 105번부터 115번까지의 FR4로 이루어져 있다. 이 중에서, CDR3 부위를 임의의 다른 아미노산으로 돌연변이시켜 원래의 AKA/HzK 항체보다 TAG-72에 대한 항원 결합능이 우수한 신규한 항체를 제조하였다.

서열번호 1로 기재되는 AKA/HzK 인간화 항체 중쇄 가변영역의 아미노산 서열 중에서 CDR3 부위를 나타내는 99번째 아미노산인 세린(Ser), 100번째 루이신(Leu), 101번째 아스파라긴(Asn), 102번째 메티오닌(Met) 및 103번째 알라닌(Ala)을 무작위로 돌연변이시켰다. 구체적으로, 인간화 항체 AKA/HzK의 유전자 발현벡터 pC3-Q-AKA/HzK(대한민국 특허등록 제0318761호의 pC3-Q-HzCC49Fab-1-dgIII 벡터의 중쇄 가변영역 97번 트레오닌 잔기를 알라닌으로 치환시킨 것)을 주형으로 하여 중쇄 CDR3 부위가 돌연변이된 서열을 포함하는 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행하였고, 그 결과 CDR3 부위가 돌연변이된 DNA 단편들을 얻었다(도 1). 상기에서 얻은 DNA 단편과 pC3-Q-AKA/HzK 벡터를 각각 XhoⅠ과 ApaⅠ으로 절단한 후 정제하였고, 절단된 두 DNA 단편을 결합시킨 후 DNA를 이. 콜라이 Electro-Ten blue(미국 Stratagene 사)에 형질전환시켰다.

TAG-72에 대한 항원결합 친화도가 증가된 신규한 항체를 제조하기 위하여, 상기에서 제조한 인간화 중쇄 라이브러리를 포함하고 있는 이. 콜라이 대하여 3차례에 걸쳐 콜로니 리프트 어세이 (J. Immunol. Meth. 272: 219-233, 2003)를 실시하였고, 1, 2, 3회 검색한 후에 얻어진 클론들의 항원 결합능이 AKA/HzK Fab에 비해서 우수한 지를 알아보기 위하여 바이오틴이 결합된 AKA/HzK Fab을 사용한 경쟁적인 ELISA를 수행하였다.

상기 검색 과정에서 선택된 클론들의 항원 결합능을 확인한 결과, 97번의 아스파라긴 잔기가 비극성 아미노산, 바람직하게는 이소루이신 또는 발린으로 치환된 변이체가 AKA/HzK보다 높은 항원 결합능을 가지는 것으로 나타났다.

상기 과정으로 분리한 변이체 클론을 각각 3C4, 3D5, 3E8, NV, NI라 명명하고, 상기 변이체 클론들의 중쇄 가변 영역의 염기 서열을 분석한 결과, 각각 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 가짐을 확인하였다(도 3).

Fab 형태의 항체를 전체 IgG 형태로 제조하기 위해, 중쇄 및 경쇄의 가변영역을 전체 IgG 형태 발현 벡터로 삽입하는 일반적인 재조합적인 방법을 수행하였다. 먼저, 항체 유전자의 신호 서열, 변이체의 가변영역을 연결한 DNA 단편을 재조합 PCR 방법을 이용하여 합성하고, 인간화 항체 AKA/HzK의 전체 IgG 형태 발현벡터 pdCMV-dhfr-AKA/HzK(대한민국 특허 제 0318761) 내의 중쇄 유전자의 동일 제한효소 위치에 삽입하여 전체 IgG 형태의 항체 발현 플라스미드를 제조하였다. 그 중에서, pdCMV-dhfr-3E8는 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, 대한민국 대전 유성구 어은동 52)에 2001년 6월 21일자로 제KCTC 1039BP호로 기탁하였다.

상기 제조한 발현벡터를 세포내로 형질전환시켜서 형질전환체를 제조하였다. dhfr 결핍 CHO 세포를 계대배양한 후 상기의 전체 항체 발현 벡터를 리포펙타민을 이용하는 방법으로 CHO 세포를 형질전환시킨 후, G418이 첨가된 선택배지와 MTX가 첨가된 선택배지에서 살아남은 세포 클론들을 분리하여 본 발명의 변이체 항체를 발현하는 벡터로 형질전환된 세포주를 제조할 수 있었다. 그 중에서 pdCMV-dhfr-3E8로 형질전환된 형질전환 세포주 9E8를 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, 대한민국 대전 유성구 어은동 52)에 2001년 6월 21일자로 제KCTC 1040BP호로 기탁하였다.

상기에서 제조한 형질전환 세포주에서 발현되는 항체를 암의 진단 및 치료에 사용할 수 있는지 확인하기 위하여, 항체의 항원결합 친화도를 결정하였다. 그 결과 본 발명의 방법으로 제조된 항체는 모두 기존의 항체 AKA/HzK 보다 친화도가 크게 증가하였다. 변이체의 항원결합 친화도를 AKA/HzK와 비교한 결과 AKA/HzK 항체의 친화도(K_D)는 1.45x 10^-8M이고, 전체 항체 3C4는 1.33x10^-9M, 전체 항체 3D5는 2.27x10^-9M, 전체 항체 3E8은 0.65x10^-9M의 항원 결합 친화도(K_D)를 가지고, 이는 AKA/HzK의 1.45x10^-8M보다 각각 11배, 6배 및 22배가 증가한 수치이다. 전체 NV는 1.66x10^-9M, 전체 항체 NI은 3.38x10^-9M의 항원 결합 친화도(KD)를 가지고, 이는 AKA/HzK의 1.45x10^-8M보다 각각 약 8배 및 4배가 증가한 수치이다.

이어서, 3E8의 인간화 경쇄를 임의의 인간 경쇄로 치환시켜 3E8 항체보다 인체에 투여 시 면역반응을 유발할 가능성이 줄어들고 TAG-72에 대한 항원 결합능이 우수한 항체를 제조하기 위해, 서열번호 21로 기재되는 경쇄 가변영역을 인간 항체의 경쇄로 치환한 신규 항체를 제조하였다.

본 발명의 인간화 항체의 경쇄를 대체할 수 있는 인간 경쇄를 선별하기 위하여, PBL(peripheral blood lymphocytes)로부터 인간경쇄 라이브러리를 제조하였다. 구체적으로, 인간 PBL로부터 총(total) RNA를 분리하고 이를 주형으로 인간경쇄 cDNA를 선택적으로 합성한 뒤, cDNA를 주형으로 인간 경쇄 (Kappa chain) 가변 영역(variable region)의 5' 특이 프라이머들과 인간 카파 경쇄 불변영역의 3' 말단 특이 프라이머를 사용하여 인간항체 경쇄 유전자를 PCR을 이용하여 선택적으로 증폭하였다. 상기 PCR로부터 얻은 DNA 단편들과 pC3-Q-3E8 벡터를 각각 SacI과 XbaI으로 절단한 후 정제하였고, 정제된 두 DNA 단편을 접합(ligation)시킨 후 이. 콜라이 Electro-Ten blue를 형질전환시켰다.

TAG-72에 대한 항원결합친화도가 증가된 신규한 항체를 제조하기 위하여, 상기에서 제조한 인간 경쇄 라이브러리를 포함하고 있는 이. 콜라이 대하여 3차례에 걸쳐 콜로니 리프트 어세이를 실시하였고, 1, 2, 3회 검색한 후에 얻어진 클론들의 항원 결합능이 3E8 Fab에 비해서 우수한 지를 알아보기 위하여 바이오틴이 결합된 3E8 Fab을 사용한 경쟁적인 ELISA를 수행하였다.

상기 검색 과정으로 선별된 클론들의 항원 결합능을 확인하여 3E8 Fab과 유사한 항원 결합능을 가지는 클론들을 분리하였고, 정제된 Fab 항체의 항원 결합능 을 확인한 결과, 본 발명의 3E8 Fab 보다 높은 항원 결합능을 가지는 것을 확인하였다. 이 클론을 pC3-Q-3E8/BSM22라 명명하였다. 3E8/BSM22 클론의 경쇄 가변영역 염기서열을 확인한 결과, 서열번호 22로 기재되는 아미노산 서열을 가지고, 이를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 23의 뉴클레오타이드 서열을 가졌다.

상기 인간 경쇄 가변영역을 포함하는 전체 IgG 형태의 인간화 항체를 제조하기 위하여, 인간화 항체 3E8의 발현벡터 pdCMV-dhfr-3E8의 경쇄 가변영역 유전자의 클로닝 위치에 서열번호 23의 핵산서열을 가지는 경쇄 가변영역유전자를 클로닝하였다.

상기 발현벡터 pdCMV-dhfr-3E8의 경쇄 유전자 안에 가변영역 유전자만을 클로닝 할 수 있도록 가변영역과 불변영역 연결부위에 BsiWI 제한효소 인식서열을 넣은 카셋트 벡터 pdCMV-dhfrC-3E8을 제조하였다. 그 다음, 항체 유전자의 신호 서열과 상기 pC3-Q-3E8/BSM22 내에 있는 인간 경쇄 가변영역 서열을 재조합 PCR 방법으로 연결하여 합성하고, HindIII와 BsiWI 제한효소를 이용하여 pdCMV-dhfrC-3E8의 HindIII-BsiWI 위치에 서브클로닝하여 pdCMV-dhfrC-3E8/BSM22를 제조하였다. pdCMV-dhfrC-3E8/BSM22는 KCTC에 2004년 5월 31일자로 제KCTC 10647BP호로 기탁하였다.

리포펙타민(Lipofectamine)을 이용하여 상기에서 제조한 본 발명의 발현플라스미드를 동물세포에 도입시켜 형질전환 시켰으며, 이로부터 전체 형태의 IgG를 발현하였다.

상기에서 제조한 동물세포에서 발현되는 항체의 항원결합 친화도를 경쟁적 ELISA 방법으로 측정하고 본 발명의 3E8 항체의 항원결합친화도와 비교한 결과, 3E8/BSM22 항체는 3E8 항체보다 항원 결합능이 더 우수함을 확인하였다(도 9). 구체적으로, 3E8/BSM22 항체의 친화도(K_D)는 약 0.45 x 10^-9 M인 반면, 3E8 항체의 K_D는 0.65 x 10^-9M로 결정되어, 3E8/BSM22 항체가 3E8 항체보다 항원에 대한 친화도가 약 1.5배 더 높음을 확인하였다.

상기에서 제조한 본 발명의 발현 플라스미드 pdCMV-dhfrC-3E8/BSM22를 dhfr결핍 CHO 세포에 트랜스팩션시킨 후, G418이 첨가된 선택배지와 MTX가 첨가된 선택배지에서 살아남은 세포 클론들을 분리함으로써 본 발명의 pdCMV-dhfrC-3E8/BSM22 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세포주 4D12-B31을 제조하였고 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, 대한민국 대전 유성구 어은동 52)에 2004년 5월 31일자로 제KCTC 10646BP호로 기탁하였다.

상기의 결과로부터 확인되는 바와 같이, 본 발명의 신규한 항체는 항원에 대한 결합친화도가 우수하고 면역유발능이 낮은 인간화된 항체이므로 암의 진단 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 - AKA 인간화 중쇄 CDR3의 라이브러리 제조

인간화 항체 AKA보다 항원결합 친화도가 증가한 신규한 인간화 항체를 제조하기 위하여, 먼저 서열번호 1로 기재되는 AKA 항체의 인간화 중쇄 HCDR3 아미노산 서열 중에서 1번째 99번 세린(Ser), 2번째 100번 루이신(Leu), 3번째 101번 아스파라긴(Asn), 4번째 102번 메티오닌(Met) 및 5번째 103번 알라닌(Ala)을 무작위로 돌연변이시켰다(도 1).

구체적으로, 인간화 항체 AKA의 유전자 발현벡터 pC3-Q-AKA/HzK(대한민국 등록특허 제318761호)를 주형으로 하여 서열번호 7로 기재되는 프라이머 VH135와 서열번호 8으로 기재되는 프라이머 HCDR3BACK 및 서열번호 9로 기재되는 프라이머 HCDR3FORWARD와 서열번호 10으로 기재되는 프라이머 LHS11 쌍을 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응조건은 95℃에서 3분간 예비변성 후, 95℃에서 50초, 55℃에서 50초, 72℃에서 1분으로 Taq DNA 중합효소(polymerase)를 사용하여 25회 수행하였다. 프라이머 VH135와 HCDR3BACK 쌍을 사용한 PCR로부터 얻어진 296 bp DNA 단편과 프라이머 HCDR3FORWARD와 LHS11 쌍을 사용한 PCR로부터 얻어진 180 bp 크기의 DNA 단편을 어닐링(annealing)하고 프라이머 VH135와 LHS11을 사용하여 재조합 PCR을 수행하여 458 bp 크기의 DNA 단편을 얻었다. 재조합 PCR의 반응조건은 95℃에서 3분간 예비변성 후, 95℃에서 50초, 55℃에서 50초, 72℃에서 1분으로 Taq DNA 중합효소(polymerase)를 사용하여 25회 수행하였다. 상기 재조합 PCR로부터 얻은 DNA 단편들과 pC3-Q-AKA/HzK 벡터를 각각 제한효소 XhoI과 ApaI으로 절단한 후 정제하였고 절단된 두 DNA 단편을 16℃에서 하룻밤동안 방치하여 접합(ligation)시킨 후 70℃에서 10분간 가열하여 효소를 불활성화시켰다. 그 후에 글리코겐(glycogen)과 3M 아세트산 나트륨(sodium acetate)을 20 ㎕ 첨가시키고, -20℃에서 에탄올을 가하여 DNA를 하룻밤동안 침전시켰다. 침전된 DNA를 70%의 에탄올로 세척한 후 건조시켜 20 ㎕의 증류수에 현탁하였으며, 상기 library DNA를 이. 콜라이 Electro-Ten Blue에 전기충격유전자전달법(electroporation)으로 형질전환시켰다. 상기 형질전환 과정을 구체적으로 설명하면, 이. 콜라이 Electro-Ten Blue 세포를 2x YT 500 ㎖에서 37℃에서의 OD(optical density)가 0.5 내지 0.7 정도가 될 때까지 진탕배양한 다음 얼음 위에서 30분간 방치하였다. 4℃, 4000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액을 제거한 후, 침전된 세포를 10% 글리세롤(glycerol) 500 ㎖로 현탁하였다. 4℃, 5000 rpm에서 15분간 다시 원심분리하여 상등액을 제거한 후, 침전된 세포를 10% 글리세롤 250 ㎖로 현탁하였고, 4℃, 5000 rpm에서 15분간 다시 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 침전된 세포를 10% 글리세롤 20 ㎖로 현탁한 후 4℃, 4000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액을 제거한 후, 세포를 10% 글리세롤 1 내지 2 ㎖로 현탁하여 컴피턴트(competent) 세포를 제조하였다. 상기 컴피턴트 세포를 1.5 ㎖ 튜브에 300 ㎕씩 분주하여 사용할 때까지 -70℃에 보관하였다.

실시예 2 - 항원 결합능이 높은 변이체 클론의 선별

TAG-72에 결합하는 신규 인간화 항체를 찾아내기 위하여 상기 실시예 1에서 제조한 라이브러리 세포를 콜로니 리프트 어세이 방법(Radosevic et al,. J. Immunol. Methods, 2003, 272(1-2), 219-233)으로 검색을 실시하였다 (도 2).

이를 위하여, 먼저 2X YTA 플레이트에 직접 니트로셀룰로오즈 막(nitrocellulose membrane)을 깔고 그 위에 약 1,000,000개의 세포를 도말한 후 하룻밤을 배양을 시킨다. 이 때의 막을 마스터 막(master membrane)이라 한다.

그 동안 항원 결합능이 강한 세포를 찾기 위한 포획 막(capture membrane)을 TAG-72(＋) 항원인 BSM (bovine submaillary mucin, type-I-S, Sigma사 제품)을 10㎍/ml 농도로 PBS (phosphate buffered saline) 와 함께 37℃에서 6시간 동안 방치하여 코팅 하였다. 이 막을 PBS로 2회 정도 세척한 후, 5% 탈지유(skim milk)를 첨가하여 37℃에서 2시간동안 방치하였다. 탈지유를 제거한 후 100㎍/ml 앰피실린과 1 mM IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)가 첨가된 2X YT 배지에 적셨다. 이 포획 막을 100 ㎍/ml 앰피실린과 1mM IPTG가 첨가된 2X YT 플레이트에 올린 후 그 위에 라이브러리 세포를 도말한 마스터 막을 올려서 상온에서 16-24 시간 동안 방치하였다.

상기 포획 막을 0.05% Tween 20이 첨가된 PBS (PBST)로 5회 세척한 후, 탈지유가 들어있는 PBS로 37℃에서 6시간동안 방치하였다. 항원인 BSM에 결합한 클론들을 찾기 위해, 포획 막에 홀스래디쉬 퍼옥시데이즈 (horseradish peroxidase)가 부착된 항-인간 F(ab‘)2 항체를 1:1000 으로 희석하여 첨가한 후, 37℃에서 1시간 방치하였다. 결합하지 않은 항체를 없애기 위해서 PBST로 5회 정도 세척하였으며, ECL로 반응시켜 항원 결합능을 확인하였다.

이렇게 항원 결합능을 확인한 세포들을 같은 위치의 마스터 막에서 얻어 2X YTA를 첨가한 후, 37℃에서 OD가 약 0.7 될 때 까지 키운 후, 상기와 동일한 과정으로 콜로니 리프트 어세이를 실시하였다. 1, 2 및 3차 스크링 후에 얻어진 Fab 클론들의 결합능이 야생형인 AKA/HzK Fab 에 비해 우수한 지를 알아보기 위해서 경쟁적인 ELISA를 수행하였다.

경쟁적인 ELISA를 위하여, 3차 스크링 후에 얻어진 E.coli Fab 클론들을 37℃에서 진탕배양하면서 600 nm에서의 O.D 값이 0.5 내지 1.0 사이가 되도록 키운 후, 1mM IPTG 용액으로 30℃에서 하룻밤동안 배양하여 Fab의 발현을 유도하였다. 배양 상등액만 분리하였으며, 상기 Fab 항체가 야생형인 AKA/HzK Fab 에 비해 항원 결합능이 우수한 지를 알아보기 위해서 ELISA 플레이트의 각 웰에 BSM 각 1㎍씩을 하룻밤 동안 코팅하였으며, 2% BSA로 블록시킨 후 TBS-T로 3회 세척하였다. 비오틴(Biotin)이 부착된 야생형 AKA/HzK Fab 항체 (1mg/ml 에서 1:2000 으로 희석하여 사용)와 상기 검색 과정에서 얻은 Fab 항체들을 각각 25 ㎕ 씩 한 웰에 함께 넣은 후 37℃ 에서 1시간 동안 반응시켰고 TBS-T로 항원과 결합하지 않은 항체를 제거하였다. TAG-72 와 결합하는 비오틴화된 AKA/HzK Fab의 상대적인 양을 확인하기 위해서 비오틴과 결합할 수 있는 스트렙타이비딘-알카라인 포스파타아제(Streptavidin-alkaline phosphatase)를 1:1000 으로 희석하여 50 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 30분간 반응하였다. 결합하지 않은 스트렙타이비딘-알카라인 포스파타아제를 제거하기 위해서 TBS-T로 3회 세척하였고 파라-니트로페닐포스페이트(para-nitrophenylphosphate) 용액 50㎕로 최소 20분 동안 발색하여 405 내지 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때, 양성 대조군 (positive control) 은 5 ㎍/ml AKA/HzK Fab과 10 ㎍/ml AKA/HzK Fab를 사용하였으며, 음성 대조군 (negative control)은 2% BSA만 사용하였다. 경쟁적 ELISA에서 대조구인 AKA/HzK Fab을 넣은 값보다 ELISA 값을 더 낮게 나타내는 변이체 클론들을 선별하여 다음 실시예 3에서와 같이 각 클론의 항원 결합능을 분석하였다.

실시예 3 - 변이체 클론의 항원 결합능 분석

상기 검색 과정에서 선택된 각 클론 Fab의 항원 결합능을 분석하기 위하여 변이체 클론들을 37℃에서 진탕 배양하면서 600 nm에서의 O.D 값이 0.5 내지 1.0 사이가 되도록 키운 후, 1 mM IPTG 용액으로 30℃에서 하룻밤동안 배양하여 Fab의 발현을 유도하였다. 세포를 수거하고 TES(0.2 M Tris-HCl, pH 8.0; 0.5 mM EDTA, 0.5 M 수크로즈(sucrose) 완충용액을 이용하여 삼투압 충격(osmotic shock)을 주어 페리플라즘 추출물(periplasmic extract)에 있는 용해된 변이체 Fab 항체를 확보하였다.

변이체 Fab의 항원결합특이성과 결합능을 알아보기 위하여 ELISA 플레이트의 각 웰에 BSM과 BSA 각 1 ㎍씩을 하룻밤 동안 코팅하였고 2% BSA로 블록시킨 후 TBS-T로 4번 세척하였다. 페리플라즘 추출물에 존재하는 Fab 항체를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰고 TBS-T 완충용액으로 항원과 결합하지 않은 항체를 제거하였다. 2차 항체로 항-인간 F(ab')₂ IgG HRP를 TBS-T로 희석해서 결합시키고 OPD와 H₂O₂로 발색하여 492 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과 야생형인 AKA/HzK Fab보다 월등하게 우수한 항원 결합능을 갖는 클론들을 분리하였고, 각 변이체 클론의 HCDR3 부위 염기서열을 T7 Sequenase V2.0 DNA 시퀀싱 키트(Amersham)로 결정하여 전체 염기서열을 확인한 결과, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6으로 기재되는 서로 다른 아미노산 서열을 코딩하고 있음을 확인하였다(도 3 참조). 이 변이체의 Fab을 각각 3C4, 3D5, 3E8, NV, NI라 명명하였고 이들의 발현벡터들을 각각 pC3-Q-3C4, pC3-Q-3D5, pC3-Q-3E8, pC3-Q-NV, pC3-Q-NI라 명명하였다.

실시예 4 - 인간화 클론의 전체(whole) IgG 발현을 위한 발현 플라스미드의 제조

항원 결합능이 가장 우수한 Fab 변이체 3E8로부터 전체 IgG 형태의 항체를 제조하기 위하여, 항체유전자의 신호 서열, 상기 Fab 변이체의 가변영역, 인간항체의 불변영역을 재조합 PCR 방법을 이용하여 합성하였다(도 4).

구체적으로, 항체유전자의 신호 서열을 합성하기 위하여, 전체 IgG 형태의 인간화 항체 AKA/HzK의 발현벡터 pdCMV-dhfr-AKA/HzK를 주형으로 하고 서열번호 11로 기재되는 프라이머 LHS39와 서열번호 12로 기재되는 프라이머 LHS43 쌍으로 PCR 을 수행하였다. 그 결과, 96 bp 크기의 DNA 단편을 합성하였다.

또한, 상기 Fab 변이체의 중쇄의 가변영역 유전자의 앞부분을 합성하기 위하여, 상기의 pC3-Q-3C4, pC3-Q-3D5, pC3-Q-3E8, pC3-Q-NV, pC3-Q-NI 벡터를 주형으로 하여 서열번호 13으로 기재되는 프라이머 LHS44와 서열번호 14로 기재되는 type C back 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 결과 306 bp 크기의 DNA 단편이 합성되었다.

아울러, 상기 가변영역유전자의 뒷부분을 합성하기 위하여, pC3-Q-3C4, pC3-Q-3D5, pC3-Q-3E8, pC3-Q-NV, pC3-Q-NI 벡터를 각각 주형으로 하여 전방 프라이머로 서열번호 15로 기재되는 type C forward 프라이머와 후방 프라이머로 서열번호 10으로 기재되는 LHS11 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응 조건은 95℃에서 3분간 예비변성 후, 94℃에서 50초, 55℃에서 50초, 72℃에서 1분으로 Taq DNA 중합효소를 사용하여 25회 수행하였다. 그 결과, 159 bp 크기의 DNA 단편이 합성되었음을 확인하였다.

상기 세 DNA 단편(96 bp, 306 bp, 159 bp)을 주형으로 하고 서열번호 10으로 기재되는 프라이머 LHS11과 서열번호 11로 기재되는 프라이머 LHS39로 PCR을 수행하여 이들을 서로 연결함으로써 각각 531 bp 크기의 DNA 단편을 합성하였고, 상기 DNA 단편의 양끝을 제한효소 EcoRI과 ApaI으로 절단한 후 기존의 AKA/HzK 인간화 항체유전자가 클론되어 있는 동물발현 벡터인 pdCMV-dhfr-AKA/HzK의 EcoRI/ApaI 위치에 삽입하여 본 발명의 발현 플라스미드를 제조하였으며 pdCMV-dhfr-3C4, pdCMV-dhfr-3D5, pdCMV-dhfr-3E8, pdCMV-dhfr-NV, pdCMV-dhfr-NI 이라 명명하였고, 그 중 에서 pdCMV-dhfr-3E8는 2001년 6월 2일자로 생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호; KCTC 1039BP).

실시예 5 - 인간화 항체의 항원결합친화도 결정

상기에서 제조된 항체의 항원 결합능 및 항원결합 친화도를 결정하기 위하여, 먼저 상기 실시예 4에서 제조한 본 발명의 발현 플라스미드를 동물세포내로 도입시켜 전체 형태의 IgG를 제조하였다.

우선, COS7 세포를 소 태아 혈청이 10% 첨가된 DMEM 배양배지(GIBCO)에 접종하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 계대배양하였다. 상기 세포를 100 ㎜ 배양접시에 1 ×106 세포/㎖ 농도로 접종하고 37℃에서 밤새 배양한 후 OPTI-MEM I(GIBCO) 용액으로 3회 세척하였다. 한편, 상기에서 제조한 항체 발현벡터 pdCMV-dhfr-3C4, pdCMV-dhfr-3D5, pdCMV-dhfr-3E8, pdCMV-dhfr-NV, pdCMV-dhfr-NI을 5 ㎍ 취하여 OPTI-MEM I 500 ㎕로 희석하였고, 25 ㎕의 리포펙타민(Lipofectamine, GIBCO)도 동일하게 OPTI-MEM I 500 ㎕로 희석하였다. 상기 발현 벡터와 리포펙타민 희석액을 15 ㎖ 튜브에 혼합하여 DNA-리포펙타민 혼합물을 제조한 후 이를 15분 이상 실온에서 방치하였다. 상기 각각의 DNA-리포펙타민 혼합물에 5 ㎖의 OPTI-MEM I을 첨가하였고 이를 깨끗이 세척된 COS7 세포에 골고루 혼합한 후 37℃, 5% CO2 항온기에서 48시간 동안 배양함으로써 본 발명의 3C4, 3D5, 3E8, NV, 및 NI 항체를 발현시켰다.

상기 세포의 배양액으로부터 얻은 3C4, 3D5, 3E8, NV, NI 항체의 항원 결합능과 항원결합 친화도를 ELISA로 측정하였다. 먼저, BSM을 웰당 250 ng씩 면역플레이트(immunoplate)에 넣은 후 4℃에서 하룻밤동안 배양하여 플레이트에 결합시킨 후, 2% BSA로 블록시키고 TBS-T로 4번 세척하였다. 상기에서 얻은 전체 IgG 변이체가 포함된 COS7 세포배양액을 PBS를 사용하여 희석한 후 동일한 농도로 플레이트에 첨가하여 37℃에서 30분 동안 반응시켰고 항원과 결합하지 않은 항체를 TBS-T로 제거하였다. 2차 항체로 사용된 항-인간 IgG(Fc specific)-HRP를 TBS-T를 사용하여 1: 5000 농도로 희석하여 상기 1차 항체와 결합시키고 OPD와 H₂O₂로 발색하여 492 nm에서 흡광도를 측정하였다.

3E8 항체의 항원결합 친화도를 AKA/HzK와 비교, 결정하기 위하여 본 발명자들은 여러 농도의 경쟁항원과 아포화(submaximum) 농도의 3C4, 3D5, 3E8, NV, NI 혹은 AKA/HzK 항체를 혼합하여 37℃에서 3시간 정치한 후, 250 ng의 항원을 미리 결합시킨 ELISA 플레이트의 각 웰에 첨가하여 30분간 결합시킨 후, 항-인간 IgG(Fc specific)-HRP를 결합시키는 경쟁적(competitive) ELISA 방법으로 발색정도를 측정하였다

그 결과, AKA/HzK 항체의 친화도(K_D)는 1.45 x 10^-8M, 3C4는 1.33x10^-9M, 3D5는 2.27x10^-9M, 3E8은 0.65x10^-9M, NV는 1.66x10^-9M, NI는 3.38x10^-9 M의 항원 결합 친화도(KD)를 가지는 것을 알수 있었고, 이는 각 변이체 항체가 AKA/HzK의 1.45x10^{- 8}M보다 각각 약 11배, 6배, 22배, 8배 및 4배가 증가한 항체임을 의미한다(도 5a 및 5b).

실시예 6 - 3E8 항체의 발현 세포주의 제조

상기 3E8 항체를 생산하고자, 3E8 항체의 발현벡터인 pdCMV-dhfr-3E8로 형질전환된 CHO 세포주를 제조하였다.

우선, DHFR-minus CHO 세포주인 DG44 세포(ATCC CRL 9096)를 소 태아 혈청이 10% 첨가된 DMEM/F12 배양배지(GIBCO)에 접종하여 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 계대배양하였다. 상기 세포를 100 ㎜ 배양접시에 1 ×10⁶ 세포/㎖ 농도로 접종하고 37℃에서 밤새 배양한 후 OPTI-MEM I(GIBCO) 용액으로 3회 세척하였다. 한편, 실시예 4에서 제조한 항체 발현벡터 pdCMV-dhfr-3E8을 5 ㎍ 취하여 OPTI-MEM I 500 ㎕로 희석하였고, 25 ㎕의 리포펙타민(Lipofectamine, GIBCO)도 동일하게 OPTI-MEM I 500 ㎕로 희석하였다. 상기 항체발현 벡터와 리포펙타민 희석액을 15 ㎖ 튜브에 혼합하여 DNA-리포펙타민 혼합물을 제조한 후 이를 15분 이상 실온에서 방치하였다. 상기 각각의 DNA-리포펙타민 혼합물에 5 ㎖의 OPTI-MEM I을 첨가하였고 이를 깨끗이 세척된 DG44 세포에 골고루 혼합한 후 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 6시간동안 배양한 다음 송아지혈청 20%를 포함하는 DMEM/F12 배지 3 ㎖을 첨가하여 동일조건 에서 48시간 동안 배양하였다. 이렇게 변이체 발현벡터가 형질전환된 형질전환 세포를 뉴클레오타이드가 첨가되어 있지 않은 MEM-α 배지에 10% 투석된(dialyzed) FBS와 550 ㎍/㎕ 농도의 G418이 첨가된 선택배지로 1×10⁴ 세포/㎖ 농도로 희석하여 96 웰 플레이트에 분주하였다. 1 주일 이상 배양한 후 콜로니(colony)를 형성하는 각 세포 클론이 생성하는 항체의 양을 ELISA 방법으로 하여 측정하여 높은 농도로 항체를 발현하는 세포 클론을 선별하였다.

ELISA는 항-인간 IgG를 웰당 100 ng씩 면역플레이트에 넣은 후 4℃에서 하룻밤 동안 배양하여 플레이트에 결합시킨 후, 2% BSA로 블록시키고 TBS-T로 4번 세척하였다. 상기에서 얻은 세포배양액을 PBS를 사용하여 희석한 후 플레이트에 첨가하여 37℃에서 1시간동안 반응시켰고 항원과 결합하지 않은 항체를 TBS-T로 제거하였다. 2차 항체로 사용된 항-인간 IgG(Fc specific)-HRP를 TBS-T를 사용하여 1: 5000의 농도로 희석하여 상기 1차항체와 결합시키고 OPD와 H₂O²로 발색하여 492 nm에서 흡광도를 측정하였다.

이들 클론 중에서 많은 양의 항체를 분비하는 클론들을 선정한 뒤 MTX의 농도를 20 nM 첨가한 배지에서 2주 동안 배양한 후 다시 80 nM MTX가 첨가된 선택배지에서 배양하였다. 이 클론들 중에서 가장 높은 농도로 항체를 발현하는 클론을 선택하여 9E8 세포주라 명명하였고 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, 대한민국 대전 유성구 어은동 52)에 2001년 6월 21일자로 제KCTC 1040BP호로 기탁하였다.

실시예 7 - 전체 IgG 변이체의 정제 및 항원결합친화도의 확인

상기 실시예 6에서 제조한 9E8 세포주를 무혈청배지(Gibco, CHO-S-SFMⅡ)에서 배양한 후 상기 배양액을 Protein G-Sepharose 4B 컬럼(Pharmacia사 제품)을 통과시켰으며, 컬럼에 결합된 항체를 0.1 M 글라이신 용액(pH 2.7)으로 용출시킨 후 1.0 M Tris 용액(pH 9.0)으로 중화시키고 PBS 완충용액(pH 7.0)에서 투석하였다. 정제된 3E8 항체를 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동(SDS-PAGE)하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 이 항체를 환원시켰을 때에 중쇄 및 경쇄의 분자량으로 알려진 55 kDa 및 25 kDa의 분자량을 나타내는 단백질 밴드가 검출되었다(lane 1 참조). 상기 결과로부터, 본 발명의 9E8 세포들이 테트라머로 구성된 전체 형태의 항체를 제조함을 확인하였다.

또한, 정제된 3E8 항체의 항원결합 친화도를 상기 실시예 5에서와 동일한 방법으로 측정한 결과 약 0.65 x 10^-9M 임을 확인하였다.

실시예 8 - 인간 경쇄 라이브러리의 제조

상기의 3E8 인간화 항체보다 HAMA 반응의 가능성이 적고 항원 결합능은 그대 로 보유한 신규 항체를 제조하고자 하였다. 이를 위하여, 3E8 항체의 인간화 경쇄를 인간 경쇄로 대체하기 위하여, 먼저 Hofman 등의 방법(Hofman et al., 1982, Am. J. Clin. Pathol., 77(6):710-713)을 이용하여 분리한 인간 PBL(peripheral blood lymphocytes)로부터 인간 경쇄 라이브러리를 제작하였다

구체적으로, 인간 PBL로부터 RNA를 분리하여, 이를 주형으로 역전사효소 (Superscript II, Gibco BRL)와 서열번호 24로 기재되는 프라이머 CK1d를 사용하여 인간 경쇄 cDNA를 선택적으로 합성하였다. 다시 상기 cDNA를 주형으로 인간 경쇄의 Kappa 가변 영역의 서열번호 25 내지 서열번호 29로 기재되는 5’ 특이 프라이머들 (VK1, VK2, VK3, VK4 및 VK5) 과 프라이머 CK1d를 각기 쌍으로 사용하여 인간 항체 경쇄 유전자를 PCR을 이용하여 선택적으로 증폭하였다.

이 때, 이들 PCR 반응조건은 95℃에서 5분간 예비 변성 후, 95℃에서 50초, 55℃에서 50초, 72℃에서 1분으로 Taq DNA 중합효소를 사용하였으며, 인간 항체의 다양성을 높이기 위해서 PCR 반응 주기를 20회를 수행하였다.

상기 PCR로부터 얻은 인간 경쇄 라이브러리의 DNA 단편들을 SacI-XbaI 으로 절단한 후, 본 발명의 인간화 항체 3E8 의 Fab 발현 벡터인 pC3-Q-3E8의 SacI-XbaI 위치에 삽입하였다.

구체적으로 pC3-Q-3E8 벡터를 각각 제한효소 SacI 과 XbaI 으로 절단하여 정제하고, 상기 PCR로부터 얻은 DNA 단편을 16℃에서 하룻밤동안 방치하여 접합시킨 후 70℃에서 10분간 가열하여 효소를 불활성화 시켰다. 그 후에 글리코겐 과 3M 아세트산 나트륨 을 첨가시키고, -20℃에서 에탄올을 가하여 DNA를 하룻밤 동안 침 전시켰다. 침전된 DNA를 70% 에탄올로 세척한 후 건조시켜 20㎕의 증류수에 현탁하였으며, 상기 라이브러리 DNA를 이. 콜라이 Electro-Ten blue 에 전기충격 유전자전달법으로 도입하였다.

실시예 9 - 항원 결합능이 높은 3E8/BSM22 변이체 클론의 선별

실시예 8에서 제조한 라이브러리 세포로부터 TAG-72에 결합하는 신규 항체를 찾아내기 위하여, 상기 실시예 2에서와 같이 콜로니 리프트 어세이를 실시하였다.

항원 결합능을 나타내는 세포 클론들의 결합능이 야생형인 3E8 Fab 에 비해 우수한 지를 알아보기 위해서, 상기 실시예 2에서와 같이 비오틴이 부착된 3E8 Fab 항체를 이용하여 경쟁적인 ELISA를 수행하였다. 그 결과, 대조구인 3E8 Fab을 넣은 값보다 ELISA 값을 더 낮게 나타내는 변이체 클론들을 얻었다.

실시예 3에서와 같이 각 클론의 항원 결합능을 분석한 결과, 야생형인 3E8 Fab보다 우수한 항원 결합능을 갖는 클론들을 분리하였다. 이 클론의 경쇄 가변영역의 염기서열을 T7 Sequenase V2.0 DNA 시퀀싱 키트(Amersham)로 결정하여 확인한 결과, 서열번호 22로 기재되는 아미노산 서열을 코딩하고 있음을 확인하였다(도 7). 이 변이체의 Fab을 3E8/BSM22라 명명하였고 이 발현벡터를 pC3-Q-3E8/BSM22라 명명하였다.

실시예 10 - 전체(whole) IgG 형태의 3E8/BSM22 항체의 발현플라스미드 제조

상기 bsm22의 인간경쇄를 포함하는 전체 IgG 형태의 3E8/BSM22 항체를 제조하기 위하여, 본 발명의 인간화 항체 3E8의 발현벡터 pdCMV-dhfr-3E8의 경쇄유전자의 클로닝 위치에 상기 인간경쇄 유전자를 클로닝하였다.

먼저, 본 발명자들은 상기 발현벡터 pdCMV-dhfr-3E8의 경쇄 유전자 안에 가변영역 유전자만을 클로닝할 수 있도록 가변영역과 불변영역 연결부위에 BsiWI 제한효소 인식서열을 넣은 카셋트 벡터 pdCMV-dhfrC-3E8을 제조하였다(도 8). 구체적으로, pdCMV-dhfr-3E8을 주형으로 서열번호 30으로 기재되는 프라이머 LHS42와 KCBsiWIback 및 서열번호 32로 기재되는 프라이머 KCBsiWIfor와 CK1d를 각기 쌍으로 PCR을 행한 후, 다시 서열번호 30으로 기재되는 프라이머 LHS42와 CK1d를 이용하여 재조합 PCR을 수행하였다. 이를 제한효소 HindIII와 XbaI으로 자른 후 원래의 pdCMV-dhfr-3E8 벡터의 경쇄부위에 치환하여 pdCMV-dhfrC-3E8을 제작하였다(도 8).

그 다음, 본 발명자들은 경쇄 유전자의 신호 서열과 상기 BSM22의 가변영역 서열을 재조합 PCR 방법으로 연결하여 가변영역유전자를 합성하였다. 구체적으로, 항체유전자의 신호 서열을 합성하기 위하여 pdCMV-dhfr-AKA/HzK를 주형으로 하고 서열번호 30 및 서열번호 33로 기재되는 프라이머 LHS42 및 KCleaderBack을 쌍으로 PCR을 수행하였다. 또한, 상기 Fab의 인간경쇄 가변영역 유전자를 합성하기 위하여, pC3-Q-3E8/BSM22에 서열번호 34 및 서열번호 31로 기재되는 프라이머 KCfor 및 KCBsiWIback를 사용하여 PCR을 수행하였고, 다시, 신호서열과 인간경쇄 가변영 역를 연결하기위하여 서열번호 30 및 서열번호 31로 기재되는 프라이머 LHS42 및 KCBsiWIback를 이용하여 재조합 PCR을 수행하였다. 이 때, PCR 반응 조건은 95℃에서 5분간 예비변성 후, 94℃에서 50초, 55℃에서 50초, 72℃에서 1분으로 Taq DNA 중합효소를 사용하여 30회 수행하였다.

상기 DNA 단편의 양끝을 제한효소 HindIII과 BsiWI으로 절단한 후 상기의 동물발현 벡터인 pdCMV-dhfrC-3E8의 HindIII-BsiWI 위치에 삽입하여 본 발명의 발현 플라스미드를 제조하였으며, pdCMV-dhfrC-3E8/BSM22라 명명하였다. 이 pdCMV-dhfrC-3E8/BSM22는 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, 대한민국 대전 유성구 어은동 52)에 2004 년 5월 31일자로 제KCTC 10647BP호로 기탁하였다

실시예 11 - 3E8/BSM22 항체의 항원결합 친화도 결정

본 발명의 3E8/BSM22 항체의 항원결합 친화도를 결정하기 위하여, 본 발명의 발현 플라스미드 pdCMV-dhfrC-3E8/BSM22를 상기 실시예 5에서와 같이 COS7 세포에 도입시켜 전체 형태의 IgG를 제조한 후, 세포 배양액에 존재하는 본 발명의 3E8/BSM22 항체의 항원결합 친화도를 경쟁적 ELISA에 의하여 측정하였다. 그 결과, 3E8/BSM22 항체의 K_D는 약 4.5 x 10^-10M인 반면, 3E8 항체의 K_D는 6.5 x 10^-10M로 결정되어, 3E8/BSM22 항체가 3E8 항체보다 항원에 대한 친화도가 약 1.5배 더 높음을 확인하였다(도 9).

실시예 12 - 3E8/BSM22 항체의 발현 세포주의 제조

상기 3E8/BSM22 항체를 생산하고자, 상기 실시예 6에서와 같이 발현벡터인 pdCMV-dhfr-3E8/BSM22로 형질전환된 CHO 세포주를 제조하였다.

이 CHO 세포주들 중에서 높은 농도로 항체를 발현하고 성장 속도가 좋은 세포주를 선택하여 4D12-B31 세포주라 명명하였고 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, 대한민국 대전 유성구 어은동 52)에 2004 년 5월 31일자로 제KCTC 10646BP호로 기탁하였다.

실시예 13 - AKA와 3E8 항체의 생물학적 분포(Biodistribution) 및 암 적중(tumor targeting)

인간 대장암을 이종 이식한 아티믹 마우스(athymic mice)에 3E8 및 AKA/HzK 항체의 생체내 분포 및 암 적중 능력을 연구하였다. 정제된 3E8 및 AKA/HzK를 ¹²⁵I-방사성 동위원소로 표지하고, 방사화학적(radiochemical) 순도를 TLC(Thin layer chromatography)를 이용하여 측정한 결과, 99% 이상이었다. ¹²⁵I-표지된 AKA/HzK 또는 3E8을 마우스 모델로 정맥내 주사하고 ¹²⁵I-AKA/HzK 또는 3E8의 생체내 분포를 주사 후, 4, 24, 48 및 72 시간 후에 조사하였다. 각 암 또는 분화된 조직에서의 %ID/g은 도 10 및 표1에 나타냈다. AKA/HzK(도 10a)및 3E8(도 10b)은 암에 적중함을 보여주고, 24 시간에서 최대를 나타내고, 모든 조사 시점에서 암은 3E8를 AKA/HzK 보다 높게 흡수하였다. 그러나, ¹²⁵I-3E8은 시험 기간 동안 암에서 대체로 유지되는 것에 반하여 암에 축적된 ¹²⁵I-AKA/HzK는 시간-의존적 방식으로 감소하였다. 그 결과, 주사 후 24, 48 또는 72 시간에서 암의 ¹²⁵I-3E8 흡수는 ¹²⁵I-AKA/HzK에 비하여 각각 약, 167%, 224% 또는 236%가 되었다. 이는 3E8이 AKA/HzK 보다 친화도가 높아 암에 대한 결합력이 높다는 것을 의미한다.

실시예 14 - 3E8의 방사면역 치료 효과

3E8 항체의 항암효과를 시험하기 위하여, 두 가지의 방법, 즉 암성장 저해 효과분석과 생존율을 시험하였다. 첫 번째, 암성장 저해 효과를 분석하기 위하여, 인간 대장암을 이종 이식한 8마리의 아티믹 마우스(athymic mice)의 정맥에 ¹³¹I-3E8(20 mg/7.4 MBq, 200 mCi) 로 주 1회씩 6회 투여하였다. 대조구 마우스(8마리)에서는 ¹³¹I-3E8 대신 3E8을 사용하였다. 그 결과, ¹³¹I-3E8로 투여된 마우스는 암 성장이 지연되는 것으로 나타났다(도 11). 치료한 마우스에서 암의 Td(tumor doubling time) 13.2일은 대조구 마우스(unlabeled 3E8) 5.6일 보다 현저하게 길었다. 대조구 마우스의 체중은 시간이 경과함에 따라 102% 정도였고, 치료한 마우스의 체중은 원래 체중의 87%로 감소하여서 체중의 변화는 심하지 않았다.

¹³¹I-3E8로 치료받은 마우스의 생존률을 살펴보기 위하여, 아티믹 마우스(7마리)를 6주 동안 매주 ¹³¹I-3E8 7.4MBq로 투여 받았다. 치료받은 마우스의 50% 생존률은, 대조구 마우스의 42.5일에서 90.5일로 연장되어 대조구 마우스보다 50% 생존률이 2.1배 높다는 것을 보여준다(도 12). 대조구 마우스의 체중은 시간이 경과함에 따라 별로 증가되지 않았고, 치료한 마우스의 체중은 10% 정도 감소하여 체중의 변화는 심하지 않았다.

본 발명의 AKA/HzK의 중쇄를 돌연변이시켜 항원에 대한 친화도가 증가한 인간화 항체, 및 상기 인간화 항체의 경쇄를 인간 경쇄로 치환하여 항원에 대한 친화도가 증가한 인간화 항체를 제공함으로써, 이러한 항체 또는 이를 포함하는 항암 조성물은 기존의 AKA/HzK 항체보다 TAG-72 항원에 대한 결합 친화도가 높고, 기존의 TAG-72에 대한 인간화 항체보다 암의 진단 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

(i) 서열번호 1의 아미노산 서열에서 100번 내지 103번 아미노산 잔기가 하기 서열식 1로 기재되는 서열을 갖는 아미노산 서열의 중쇄 가변 영역 및 (ii) 서열번호 21 또는 서열번호 22로 기재되는 아미노산 서열의 경쇄 가변영역을 갖는 TAG-72((tumor-associated glycoprotein-72)에 대한 인간화 항체.

서열식 1

-X100-X101-X102-X103-

상기식에서,

X100은 루이신(Leu) 또는 트립토판(Trp) 아미노산 잔기이고,

X101은 이소루이신(Ile), 발린(Val), 루이신(Leu) 또는 알라닌(Ala) 아미노산 잔기이며,

X102는 메티오닌(Met) 또는 글루타민(Gln) 아미노산 잔기이고,

X103은 알라닌(Ala), 글루타민(Gln) 또는 글리신(Gly) 아미노산 잔기이다.
제1항에 있어서, X101이 이소루이신(Ile), 발린(Val) 또는 루이신(Leu)인 인 간화 항체.
제1항에 있어서, 중쇄 가변영역의 아미노산 서열이 서열번호 2 내지 6으로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 인간화 항체.
제1항의 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 서열.
서열번호 22로 기재되는 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산서열.
제1항의 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 서열 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산서열을 포함하는 재조합 벡터.
제6항에 있어서, 플라스미드 pC3-Q-3C4, pC3-Q-3D5, pC3-Q-3E8, pC3-Q-NV, pC3-Q-NI 또는 pC3-Q-3E8/BSM22인 재조합 벡터.
제6항에 있어서, 플라스미드 pdCMV-dhfr-3C4, pdCMV-dhfr-3D5, pdCMV-dhfr-3E8, pdCMV-dhfr-NV, pdCMV-dhfr-NI 또는 pdCMV-dhfrC-3E8/BSM22인 재조합 벡터.
제6항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
제9항에 있어서, KCTC 1040BP로 기탁된 형질전환체.
제9항에 있어서, KCTC 10646BP로 기탁된 형질전환체.
제9항의 형질전환체를 배양하여 제1항의 인간화 항체를 제조하는 방법.
제1항의 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항암 조성물.
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