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TW202436355A - 抗原結合分子及使用方法 - Google Patents

抗原結合分子及使用方法 Download PDF

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TW202436355A
TW202436355A TW113108581A TW113108581A TW202436355A TW 202436355 A TW202436355 A TW 202436355A TW 113108581 A TW113108581 A TW 113108581A TW 113108581 A TW113108581 A TW 113108581A TW 202436355 A TW202436355 A TW 202436355A
Authority
TW
Taiwan
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seq
nos
antigen
antigen binding
binding molecule
Prior art date
Application number
TW113108581A
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English (en)
Inventor
麥可 Ｅ 庫恩
克里斯塔 寇提西歐
史都華特 Ａ 席維爾斯
Original Assignee
美商凱特製藥公司
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Publication date
Application filed by 美商凱特製藥公司 filed Critical 美商凱特製藥公司
Publication of TW202436355A publication Critical patent/TW202436355A/zh

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Abstract

本揭露描述抗原結合分子（包括抗體），其特異性結合至抗CD20 scFv-14或長臂猿白血病病毒gp70蛋白、以及包含所述序列之分子、及呈現此類分子之細胞。抗原結合分子可用於研究、診斷、臨床、及其他應用中。

Description

抗原結合分子及使用方法
本揭露係關於特異性結合至目標（包括抗CD20 scFv-14結合域或長臂猿白血病病毒(GALV)蛋白gp70、以及包含此等序列之分子、及呈現此類分子之細胞）之抗原結合分子（諸如抗體），亦揭示編碼此類抗原結合分子之多核苷酸、以及抗原結合分子之人源化形式及使用抗原結合分子之方法。
抗原結合分子（包括抗體）及片段（諸如Fab、F(ab’) 2、scFv等）係用於免疫療法及基於固相之應用中，諸如生物感測器、親和層析法、及免疫檢定。此等抗體及其他抗原結合分子因其特異性結合其目標之能力而得到其效用。
抗獨特型(anti-idiotypic)抗體係抗體之子集，且係針對免疫抗體產生之抗體。此等抗獨特型抗體展示出針對免疫抗體之獨特位(idiotope)（抗體表面上之獨特抗原決定位(antigenic determinant)）之特異性結合。抗獨特型抗體通常可分成三個不同群組：(1)識別與免疫抗體上之抗原結合位點(ABS)不同的獨特位之抗體；(2)識別ABS內之表位且模擬結構之抗體，並形成標稱抗原(nominal antigen)之所謂的「內影像(internal image)」；及(3)識別ABS內之表位而與標稱抗原不具有結構相似性之抗體（參見例如Pan et al., (1995) FASEB J9:43-49）。
進一步需要病毒顆粒之偵測及定量。具體而言，病毒套膜蛋白（諸如長臂猿白血病病毒(GALV)蛋白gp70）為病毒偵測提供極佳目標。對GALV gp70具有特異性之抗原結合分子將具有許多用途，例如用於檢定中，諸如基於流之病毒偵測方法。
本文揭示抗原結合分子（包括抗體），其特異性結合至抗CD20 scFv-14或GALV蛋白gp70、以及包含此等序列之分子、及呈現此類分子之細胞。所揭示之抗原結合分子之人源化形式亦形成為本揭露之態樣。亦揭示此等抗原結合分子之應用及用途。
在各種態樣中，揭示一種結合至抗CD20之經單離之抗原結合分子。在各種其他態樣中，揭示一種結合至長臂猿白血病病毒(GALV)蛋白gp70之經單離之抗原結合分子。在各種實施例中，重鏈可變(VH)序列與選自由SEQ ID NO: 1至10所組成之群組的序列具有至少約80%序列同一性。在各種實施例中，輕鏈可變(VL)序列與選自由SEQ ID NO: 11至20所組成之群組的序列具有至少約80%序列同一性。在各種實施例中，連接子將VH連接至VL。
在各種態樣中，揭示一種經單離之抗原結合分子，其包含與本文所述之抗原結合分子之VH至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一之VH胺基酸序列。
在各種態樣中，揭示一種經單離之抗原結合分子，其包含與本文所述之抗原結合分子之VL至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一之VL胺基酸序列。
在各種實施例中，經單離之抗原結合分子包含選自由SEQ ID NO: 21至41所組成之群組的重鏈CDR1。在各種實施例中，經單離之抗原結合分子包含選自由SEQ ID NO: 42至65所組成之群組的重鏈CDR2。在各種實施例中，經單離之抗原結合分子包含選自由SEQ ID NO: 66至85所組成之群組的重鏈CD3。在各種實施例中，經單離之抗原結合分子包含選自由SEQ ID NO: 86至99所組成之群組的輕鏈CDR1。在各種實施例中，經單離之抗原結合分子包含選自由SEQ ID NO: 100至111所組成之群組的輕鏈CDR2。在各種實施例中，抗原結合分子包含選自由SEQ ID NO: 112至120所組成之群組的輕鏈CDR3。
在各種實施例中，連接子包含胺基酸序列。在各種實施例中，連接子之胺基酸序列包含SEQ ID NO: 121。在各種實施例中，連接子之胺基酸序列包含SEQ ID NO: 126。在各種實施例中，經單離之抗原結合分子包含與本文所述之抗原結合分子之VL至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一之連接子胺基酸序列。
在各種實施例中，經單離之抗原結合分子包含選自由下列所組成之群組的可偵測標示：螢光標示、光致變色化合物、蛋白質螢光標示、磁性標示、放射性標示、及半抗原。
在各種實施例中，經單離之抗原結合分子包含選自由SEQ ID NO: 25、32、及39所組成之群組的重鏈CDR1序列。在各種實施例中，經單離之抗原結合分子包含選自由SEQ ID NO: 46、54、及62所組成之群組的重鏈CDR2序列。在各種實施例中，經單離之抗原結合分子包含選自由SEQ ID NO: 70及80所組成之群組的重鏈CDR3序列。在各種實施例中，經單離之抗原結合分子包含選自由SEQ ID NO: 90及98所組成之群組的輕鏈CDR1序列。在各種實施例中，經單離之抗原結合分子包含選自由SEQ ID NO: 104及110所組成之群組的輕鏈CDR2序列。在各種實施例中，經單離之抗原結合分子包含：包含SEQ ID NO: 116之輕鏈CDR3序列。
在某些態樣中，抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段包含GALV gp70結合模體，其中GALV gp70結合模體包含選自由SEQ ID NO: 303至314所組成之群組的重鏈可變區(HCVR)中之任一者的三個重鏈互補決定區(HCDR)之序列、及選自由SEQ ID NO:315至324所組成之群組的輕鏈可變區(LCVR)的三個輕鏈CDR (LCDR)之序列。
在某些態樣中，GALV gp70抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段包含：第一域，其包含三個重鏈互補決定區（HCDR1、HCDR2、及HCDR3）；及第二域，其包含三個輕鏈互補決定區（LCDR1、LCDR2、及LCDR3），其中 (i) HCDR1具有根據SEQ ID NO: 127至138、157至168、及187至198中任一者之序列； (ii) HCDR2具有根據SEQ ID NO: 139至150、169至180、及199至210中任一者之序列； (iii) HCDR3具有根據SEQ ID NO: 151至156、181至186、211至222、及DYY中任一者之序列； (iv) LCDR1具有根據SEQ ID NO: 223至232、253至262、及283至292中任一者之序列； (v) LCDR2具有根據SEQ ID NO: 233至242、263至272、SGS、GTN、RAS、DTS、及KVS中任一者之序列；且 (vi) LCDR3具有根據SEQ ID No: 243至252、273至282、及293至302中任一者之序列。
在某些態樣中，GALV gp70抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段包含HCDR，其包含： (i)根據SEQ ID No: 127、157、及187中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 139、169、及199中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 211或DYY之HCDR3； (ii)根據SEQ ID No: 128、158、及188中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 140、170、及200中任一者之HCDR2；根據SEQ ID No: 151、181、及212中任一者之HCDR3； (iii)根據SEQ ID No: 129、159、及189中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 141、171、及201中任一者之HCDR2；根據SEQ ID No: 152、182、及213中任一者之HCDR3； (iv)根據SEQ ID No: 130、160、及190中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 142、172、及202中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 214或DYY之HCDR3； (v)根據SEQ ID No: 131、161、及191中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 143、173、及203中任一者之HCDR2；根據SEQ ID No: 153、183、及215中任一者之HCDR3； (vi)根據SEQ ID No: 132、162、及192中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 144、174、及204中任一者之HCDR2；根據SEQ ID No: 154、184、及216中任一者之HCDR3； (vii)根據SEQ ID No: 133、163、及193中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 145、175、及205中任一者之HCDR2；根據SEQ ID No: 155、185、及217中任一者之HCDR3； (viii)根據SEQ ID No: 134、164、及194中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 146、176、及206中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 218或DYY之HCDR3； (ix)根據SEQ ID No: 135、165、及195中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 147、177、及207中任一者之HCDR2；根據SEQ ID No: 156、186、及219中任一者之HCDR3； (x)根據SEQ ID No: 136、166、及196中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 148、178、及208中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 220或DYY之HCDR3； (xi)根據SEQ ID No: 137、167、及197中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 149、179、及209中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 221或DYY之HCDR3；或 (xii)根據SEQ ID No: 138、168、及198中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 150、180、及210中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 222或DYY之HCDR3，及 及LCDR，其包含： (i)根據SEQ ID No: 232、262、及292中任一者之LCDR1；根據SEQ ID No: 242、272、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID No: 252、282、及302中任一者之LCDR3； (ii)根據SEQ ID No: 228、258、及288中任一者之LCDR1；根據SEQ ID No: 238、268、及KVS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID No: 248、278、及298中任一者之LCDR3； (iii)根據SEQ ID No: 227、257、及287中任一者之LCDR1；根據SEQ ID No: 237、267、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID No: 247、277、及297中任一者之LCDR3； (iv)根據SEQ ID No: 226、256、及286中任一者之LCDR1；根據SEQ ID No: 236、266、及DTS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID No: 246、276、及296中任一者之LCDR3； (v)根據SEQ ID No: 225、255、及285中任一者之LCDR1；根據SEQ ID No: 235、265、及RAS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID No: 245、275、及295中任一者之LCDR3； (vi)根據SEQ ID No: 224、254、及284中任一者之LCDR1；根據SEQ ID No: 234、264、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID No: 244、274、及294中任一者之LCDR3； (vii)根據SEQ ID No: 223、253、及283中任一者之LCDR1；根據SEQ ID No: 233、263、及SGS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID No: 243、273、及293中任一者之LCDR3； (viii)根據SEQ ID No: 229、259、及289中任一者之LCDR1；根據SEQ ID No: 239、269、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID No: 249、279、及299中任一者之LCDR3； (ix)根據SEQ ID No: 231、261、及291中任一者之LCDR1；根據SEQ ID No: 241、271、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID No: 251、281、及301中任一者之LCDR3；或 (x)根據SEQ ID No: 230、260、290中任一者之LCDR1；根據SEQ ID No: 240、270、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID No: 250、280、及300中任一者之LCDR3。
在某些態樣中，GALV gp70抗原結合系統、抗體、或抗原結合片段包含：第一域，其包含三個重鏈互補決定區(HCDR)；及第二域，其包含三個輕鏈互補決定區(LCDR)，其中： 該等HCDR及LCDR包含： (i)根據SEQ ID No: 127、157、及187中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 139、169、及199中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 211或DYY之HCDR3；根據SEQ ID No: 232、262、及292中任一者之LCDR1；根據SEQ ID No: 242、272、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID No: 252、282、及302中任一者之LCDR3； (ii)根據SEQ ID No: 128、158、及188中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 140、170、及200中任一者之HCDR2；根據SEQ ID No: 151、181、及212中任一者之HCDR3；根據SEQ ID No: 228、258、及288中任一者之LCDR1；根據SEQ ID No: 238、268、及KVS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID No: 248、278、及298中任一者之LCDR3； (iii)根據SEQ ID No: 129、159、及189中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 141、171、及201中任一者之HCDR2；根據SEQ ID No: 152、182、及213中任一者之HCDR3；根據SEQ ID No: 226、256、及286中任一者之LCDR1；根據SEQ ID No: 236、266、及DTS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID No: 246、276、及296中任一者之LCDR3 (iv)根據SEQ ID No: 130、160、及190中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 142、172、及202中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 214或DYY之HCDR3；根據SEQ ID No: 227、257、及287中任一者之LCDR1；根據SEQ ID No: 237、267、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID No: 247、277、及297中任一者之LCDR3； (v)根據SEQ ID No: 131、161、及191中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 143、173、及203中任一者之HCDR2；根據SEQ ID No: 153、183、及215中任一者之HCDR3；根據SEQ ID No: 227、257、及287中任一者之LCDR1；根據SEQ ID No: 237、267、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID No: 247、277、及297中任一者之LCDR3； (vi)根據SEQ ID No: 132、162、及192中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 144、174、及204中任一者之HCDR2；根據SEQ ID No: 154、184、及216中任一者之HCDR3；根據SEQ ID No: 226、256、及286中任一者之LCDR1；根據SEQ ID No: 236、266、及DTS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID No: 246、276、及296中任一者之LCDR3；； (vii)根據SEQ ID No: 133、163、及193中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 145、175、及205中任一者之HCDR2；根據SEQ ID No: 155、185、及217中任一者之HCDR3；根據SEQ ID No: 225、255、及285中任一者之LCDR1；根據SEQ ID No: 235、265、及RAS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID No: 245、275、及295中任一者之LCDR3； (viii)根據SEQ ID No: 134、164、及194中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 146、176、及206中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 218或DYY之HCDR3；根據SEQ ID No: 224、254、及284中任一者之LCDR1；根據SEQ ID No: 234、264、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID No: 244、274、及294中任一者之LCDR3 (ix)根據SEQ ID No: 135、165、及195中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 147、177、及207中任一者之HCDR2；根據SEQ ID No: 156、186、及219中任一者之HCDR3；根據SEQ ID No: 223、253、及283中任一者之LCDR1；根據SEQ ID No: 233、263、及SGS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID No: 243、273、及293中任一者之LCDR3； (x)根據SEQ ID No: 136、166、及196中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 148、178、及208中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 220或DYY之HCDR3；根據SEQ ID No: 229、259、及289中任一者之LCDR1；根據SEQ ID No: 239、269、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID No: 249、279、及299中任一者之LCDR3； (xi)根據SEQ ID No: 137、167、及197中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 149、179、及209中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 221或DYY之HCDR3；根據SEQ ID No: 231、261、及291中任一者之LCDR1；根據SEQ ID No: 241、271、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID No: 251、281、及301中任一者之LCDR3；或 (xii)根據SEQ ID No: 138、168、及198中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 150、180、及210中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 222或DYY之HCDR3；根據SEQ ID No: 230、260、290中任一者之LCDR1；根據SEQ ID No: 240、270、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID No: 250、280、及300中任一者之LCDR3。
在某些態樣中，GALV gp70抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段包含：第一重鏈可變域，其包含三個HCDR；及輕鏈可變域，其包含三個LCDR，其中： (i)該重鏈可變域與SEQ ID No: 303至314中任一者至少80%同一；且 (ii)該輕鏈可變域與SEQ ID No: 315至324中任一者至少80%同一。
在某些態樣中，GALV gp70抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段包含：第一重鏈可變域，其包含三個HCDR；及輕鏈可變域，其包含三個LCDR，其中： (i)該重鏈可變域與SEQ ID NO: 303至少80%同一，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO: 324至少80%同一； (ii)該重鏈可變域與SEQ ID NO: 304至少80%同一，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO: 320至少80%同一； (iii)該重鏈可變域與SEQ ID NO: 305至少80%同一，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO: 318至少80%同一； (iv)該重鏈可變域與SEQ ID NO: 306至少80%同一，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO: 319至少80%同一； (v)該重鏈可變域與SEQ ID NO: 307至少80%同一，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO: 319至少80%同一； (vi)該重鏈可變域與SEQ ID NO: 308至少80%同一，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO: 318至少80%同一； (vii)該重鏈可變域與SEQ ID NO: 309至少80%同一，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO: 317至少80%同一； (viii)該重鏈可變域與SEQ ID NO: 310至少80%同一，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO: 316至少80%同一； (ix)該重鏈可變域與SEQ ID NO: 311至少80%同一，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO: 315至少80%同一； (x)該重鏈可變域與SEQ ID NO: 312至少80%同一，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO: 321至少80%同一； (xi)該重鏈可變域與SEQ ID NO: 313至少80%同一，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO: 323至少80%同一；或 (xii)該重鏈可變域與SEQ ID NO: 314至少80%同一，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO: 322至少80%同一。
在某些態樣中，GALV gp70抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段之特徵在於，其中三個HCDR及三個LCDR係由單一多肽構成。
在某些態樣中，GALV gp70抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段之特徵在於，其中三個HCDR係由第一多肽構成，且三個LCDR係由第二多肽構成。
在某些態樣中，GALV gp70抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段之特徵在於，其中第一多肽係抗體重鏈，且第二多肽係抗體輕鏈。
在某些態樣中，揭示一種核酸，其編碼至少一種如上所述之GALV gp70結合多肽。
在某些態樣中，揭示一種載體，其包含此核酸。
在某些態樣中，揭示一種產生經工程改造細胞之方法，其中該方法包含將細胞用如緊接於上所述之核酸或載體轉染或轉導。
在某些態樣中，揭示一種編碼或表現GALV gp70抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段之細胞，可選地其中該細胞係免疫細胞。
在某些態樣中，GALV gp70抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段進一步包含可偵測標示。
在某些態樣中，GALV gp70抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段包含選自由下列所組成之群組的可偵測標示：螢光標示、光致變色化合物、蛋白質螢光標示、磁性標示、放射性標示、及半抗原。
在某些態樣中，GALV gp70抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段包含可偵測標示，其係選自由下列所組成之群組的螢光標示：Atto染料、Alexafluor染料、量子點、羥基香豆素、胺基香豆素、甲氧基香豆素、Cascade Blue、Pacific Blue、Pacific Orange、Lucifer Yellow、NBD、R-藻紅蛋白(PE)、PE-Cy5接合物、PE-Cy7接合物、Red 613、PerCP、TruRed、FluorX、螢光素、BODIPY-FL、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、TRITC、X-玫瑰紅、Lissamine玫瑰紅B、Texas Red、異藻藍蛋白(APC)、APC-Cy7接合物、Indo-1、Fluo-3、Fluo-4、DCFH、DHR、SNARF、GFP（Y66H突變）、GFP（Y66F突變）、EBFP、EBFP2、石青色螢光蛋白(Azurite)、GFPuv、T-Sapphire、天藍螢光蛋白(Cerulean)、mCFP、mTurquoise2、ECFP、CyPet、GFP（Y66W突變）、mKeima-Red、TagCFP、AmCyan1、mTFP1、GFP（S65A突變）、Midorishi Cyan、野生型GFP、GFP（S65C突變）、TurboGFP、TagGFP、GFP（S65L突變）、Emerald、GFP（S65T突變）、EGFP、Azami Green、ZsGreen1、TagYFP、EYFP、Topaz、Venus、mCitrine、Ypet、TurboYFP、ZsYellow1、Kusabira Orange、mOrange、異藻藍蛋白(APC)、mKO、TurboRFP、tdTomato、TagRFP、DsRed單體、DsRed2 (“RFP”)、mStrawberry、TurboFP602、AsRed2、mRFP1、J-Red、R-藻紅蛋白(RPE)、B-藻紅蛋白(BPE)、mCherry、HcRed1、Katusha、P3、多甲藻素葉綠素(PerCP)、mKate (TagFP635)、TurboFP635、mPlum、及mRaspberry。
在某些態樣中，揭示一種用於判定表現具有SEQ ID NO: 325之胺基酸序列的長臂猿白血病病毒(GALV) gp70蛋白之病毒顆粒之數目的方法，該方法包含： (a)          提供已知或疑似包含表現該GALV gp70蛋白之病毒顆粒的樣本； (b)          在允許形成一或多個包含病毒顆粒及如請求項21至29中任一項之抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段之結合複合物的條件下，使該樣本與該抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段接觸，其中該抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段進一步包含可偵測標示； (c)          藉由偵測該可偵測標示來偵測該一或多個結合複合物；及 (d)          基於步驟(c)之該偵測判定存在於該樣本中之病毒顆粒之數目。
在某些態樣中，揭示一種判定表現具有SEQ ID NO: 325之胺基酸序列的長臂猿白血病病毒(GALV) gp70蛋白之病毒顆粒之存在或不存在的方法，該方法包含： (a)          提供已知或疑似包含表現該GALV gp70蛋白之病毒顆粒的樣本； (b)          提供特異性結合該GALV gp70蛋白之抗原結合分子，其中該抗原結合分子進一步包含可偵測標示； (c)          在允許形成GALV gp70與該抗原結合蛋白之間的結合複合物之條件下，使該樣本與該抗原結合分子接觸； (d)          將非結合複合物之一部分的任何分子與該等結合複合物分離；及 (e)          偵測結合複合物之存在或不存在。
在某些態樣中，用於判定病毒顆粒之數目的方法或判定病毒顆粒之存在或不存在的方法之特徵在於，其中抗原結合分子係設置於選自由下列所組成之群組的表面上：瓊脂糖珠、磁珠、塑膠孔盤、玻璃孔盤、陶瓷孔盤、及細胞培養袋。
在某些態樣中，用於判定病毒顆粒之數目的方法或判定病毒顆粒之存在或不存在的方法之特徵在於，其中可偵測標示係選自由下列所組成之群組：螢光標示、光致變色化合物、蛋白質螢光標示、磁性標示、放射性標示、及半抗原。
在某些態樣中，用於判定病毒顆粒之數目的方法或判定病毒顆粒之存在或不存在的方法之特徵在於，其中螢光標示係選自由下列所組成之群組：Atto染料、Alexafluor染料、量子點、羥基香豆素、胺基香豆素、甲氧基香豆素、Cascade Blue、Pacific Blue、Pacific Orange、Lucifer Yellow、NBD、R-藻紅蛋白(PE)、PE-Cy5接合物、PE-Cy7接合物、Red 613、PerCP、TruRed、FluorX、螢光素、BODIPY-FL、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、TRITC、X-玫瑰紅、Lissamine玫瑰紅B、Texas Red、異藻藍蛋白(APC)、APC-Cy7接合物、Indo-1、Fluo-3、Fluo-4、DCFH、DHR、SNARF、GFP（Y66H突變）、GFP（Y66F突變）、EBFP、EBFP2、石青色螢光蛋白(Azurite)、GFPuv、T-Sapphire、天藍螢光蛋白(Cerulean)、mCFP、mTurquoise2、ECFP、CyPet、GFP（Y66W突變）、mKeima-Red、TagCFP、AmCyan1、mTFP1、GFP（S65A突變）、Midorishi Cyan、野生型GFP、GFP（S65C突變）、TurboGFP、TagGFP、GFP（S65L突變）、Emerald、GFP（S65T突變）、EGFP、Azami Green、ZsGreen1、TagYFP、EYFP、Topaz、Venus、mCitrine、Ypet、TurboYFP、ZsYellow1、Kusabira Orange、mOrange、異藻藍蛋白(APC)、mKO、TurboRFP、tdTomato、TagRFP、DsRed單體、DsRed2 (“RFP”)、mStrawberry、TurboFP602、AsRed2、mRFP1、J-Red、R-藻紅蛋白(RPE)、B-藻紅蛋白(BPE)、mCherry、HcRed1、Katusha、P3、多甲藻素葉綠素(PerCP)、mKate (TagFP635)、TurboFP635、mPlum、及mRaspberry。
在某些態樣中，用於判定病毒顆粒之數目的方法或判定病毒顆粒之存在或不存在的方法之特徵在於，其中偵測係用基於流之偵測方法執行。
在某些態樣中，用於判定病毒顆粒之數目的方法或判定病毒顆粒之存在或不存在的方法之特徵在於，其中基於流之偵測方法係流式病毒測量術(flow virometry)。
在某些態樣中，用於判定病毒顆粒之數目的方法或判定病毒顆粒之存在或不存在的方法之特徵在於，其中偵測係藉由ELISA、生物膜干涉技術(bio-layer interferometry, BLI)、西方墨點法、或其任何組合執行。
相關申請案之交互參照
本申請案主張於2023年3月9日提出申請之美國臨時專利申請案第63/489,373號及於2024年1月11日提出申請之美國臨時專利申請案第63/620,111號之優先權，其等各者之全文特此併入本文中。 序列表
本申請案含有以XML格式電子提交之序列表，且其全文特此以引用方式併入本文中。該.XML複本（建立於2024年2月8日）係命名為K-1137-WO-PCT_SL.xml，且檔案大小為312,108位元組。
在某些態樣中，本實施例係關於抗獨特型抗原結合分子，包括抗體，其特異性結合至與抗CD20 scFv14特異性結合之抗原結合分子（參見 Kanyarat Thueng-in, Jeeraphong Thanongsaksrikul, Surasak Jittavisutthikul, Watee Seesuay, Monrat Chulanetra, Yuwaporn Sakolvaree, Potjanee Srimanote & Wanpen Chaicumpa(2014) Interference of HCV replication by cell penetrable human monoclonal scFv specific to NS5B polymerase, mAbs, 6:5, 1327-1339, DOI: 10.4161/mabs.29978）。
抗CD20 scFv-14具有以下胺基酸序列： VH DNA – CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTAAAGAATATGGTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCTTACAGTGGTCACACATACTATGCACAGAAGCTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAGAGGGCCTCACTACGACGACTGGAGCGGATTTATCATATGGTTCGACCCATGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 122) VL DNA – GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCTTCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGGTTTCCTCCTACCTTTGGCCAAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA (SEQ ID NO: 123) VH蛋白– QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFKEYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYSGHTYYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGPHYDDWSGFIIWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 124) VL蛋白– DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRFPPTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 125)
亦提供抗原結合分子之人源化形式、包含抗CD20 scFv14之分子、及呈現包含抗CD20 scFv14之分子之細胞。另外，亦揭示編碼抗原結合分子之多核苷酸、以及包含多核苷酸之載體、及包含多核苷酸及載體之體外細胞。
提供使用所揭示之抗原結合分子之方法。本文所述之抗原結合分子、多核苷酸、載體、體外細胞、及方法可用於一系列應用中，例如作為試劑以偵測包含抗CD20 scFv14之部份、以及包含此序列之分子、及呈現此類分子之細胞之存在；定量包含抗CD20 scFv14之部份、以及包含此序列之分子、及呈現此類分子之細胞之量；篩選包含抗CD20 scFv14之部份、以及包含此序列之分子、及呈現此類分子之細胞；純化包含抗CD20 scFv14之部份、以及包含此序列之分子、及呈現此類分子之細胞；及聚焦於包含抗CD20 scFv之部份、以及包含此序列之分子、及呈現此類分子之細胞之生物標記研究。亦提供治療用途，例如包含抗CD20 scFv14之部份以及呈現此類分子之細胞之生物活性經調節（增強或抑制）之應用；以及與包含抗CD20 scFv14之治療劑、以及包含此序列之分子、及呈現此類分子之細胞相關之劑量範圍研究；及呈現此類分子之細胞。
本文所揭示之抗原結合分子（例如scFv、抗體等）係由使用小鼠來源之B細胞產生的融合瘤產生，但可使用所屬技術領域中具有通常知識者已知的標準方法以及本文所述者容易地人源化。所揭示之抗原結合分子之代表性人源化形式可如本文所述產生。
在某些進一步態樣中，本實施例係關於抗原結合分子，包括抗體，其特異性結合至病毒外殼蛋白。在某些態樣中，抗原結合分子結合至長臂猿白血病病毒gp70套膜蛋白(GALV gp70)。GALV gp70係表面蛋白質，其藉由與其受體結合將病毒附接至宿主細胞。
GALV gp70具有以下胺基酸序列： MVLLPGSMLLTSNLHHLRHQMSPGSWKRLIILLSCVFGGGGTSLQNKNPHQPMTLTWQVLSQTGDVVWDTKAVQPPWTWWPTLKPDVCALAASLESWDIPGTDVSSSKRVRPPDSDYTAAYKQITWGAIGCSYPRARTRMASSTFYVCPRDGRTLSEARRCGGLESLYCKEWDCETTGTGYWLSKSSKDLITVKWDQNSEWTQKFQQCHQTGWCNPLKIDFTDKGKLSKDWITGKTWGLRFYVSGHPGVQFTIRLKITNMPAVAVGPDLVLVEQGPPRTSLALPPPLPPREAPPPSLPDSNSTALATSAQTPTVRKTIVTLNTPPPTTGDRLFDLVQGAFLTLNATNPGATESCWLCLAMGPPYYEAIASSGEVAYSTDLDRCRWGTQGKLTLTEVSGHGLCIGKVPFTHQHLCNQTLSINSSGDHQYLLPSNHSWWACSTGLTPCLSTSVFNQTRDFCIQVQLIPRIYYYPEEVLLQAYDNSHPRTKREAVSLTLAVLLGLGITAGIGTGSTALIKGPIDLQQGLTSLQIAIDADLRALQDSVSKLEDSLTSLSEVVLQNRRGLDLLFLKEGGLCAALKEECCFYIDHSGAVRDSMKKLKEKLDKRQLERQKSQNWYEGWFNNSPWFTTLLSTIAGPLLLLLLLLILGPCIINKLVQFINDRISAVKILVLRQKYQALENEGNL (SEQ ID NO: 325)。
另外，亦揭示編碼GALV gp70結合分子之多核苷酸、以及包含多核苷酸之載體、及包含多核苷酸及載體之體外細胞。
提供使用所揭示之抗原結合分子之方法。本文所述之抗原結合分子、多核苷酸、載體、體外細胞、及方法可用於一系列應用中，例如作為試劑以偵測包含GALV gp70之部份、以及包含此序列之分子、及呈現此類分子之細胞以及病毒顆粒之存在；定量包含GALV gp70之部份、以及包含此序列之分子、及呈現此類分子之細胞之量；篩選包含GALV gp70之部份、以及包含此序列之分子、及呈現此類分子之細胞；純化包含GALV gp70之部份、以及包含此序列之分子、及呈現此類分子之細胞；及聚焦於包含GALV gp70之部份、以及包含此序列之分子、及呈現此類分子之細胞之生物標記研究。亦提供治療用途，例如包含GALV gp70之部份以及呈現此類分子之細胞之生物活性經調節（增強或抑制）之應用；以及與包含GALV gp70之治療劑、以及包含此序列之分子、及呈現此類分子之細胞相關之劑量範圍研究；及呈現此類分子之細胞。 I. 定義
為了能更容易理解本揭露，首先定義某些用語。如本申請案中所使用，除非本文中另外明確提供，否則以下用語之各者應具有下文所闡述之含義。在本申請案全文中提出了額外定義。本文所提供之標題並非對於本揭露之各種態樣的限制，本揭露之各種態樣應藉由參照本說明書整體來理解。
應理解的是，在本文中以措辭「包含(comprising)」描述態樣時，亦提供以用語「由……所組成(consisting of)」及/或「基本上由……所組成(consisting essentially of)」描述之其他類似態樣。
本文中所使用之單位、前綴、及符號係使用其國際單位制(SI)公認形式來提供。數字範圍涵括定義該範圍之數字。
除非另有定義，否則本文中所使用之所有技術及科學用語具有與本揭露所相關之技術領域中具有通常知識者一般理解者相同的意義。例如，Juo, The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, 2 nded., (2001), CRC Press； The Dictionary of Cell & Molecular Biology, 5 thed., (2013), Academic Press；及 The Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Cammack et al. eds., 2 nded, (2006), Oxford University Press為所屬技術領域中具有通常知識者提供本揭露中所使用之許多用語的通用詞典。
如本文中所使用，二十種習知（例如天然存在）胺基酸及其縮寫遵循習知用法。參見例如 Immunolo —y - A Synthesis(2nd Edition), Golub and Green, eds., Sinauer Assoc., Sunderland, Mass. (1991)，其出於任何目的以引用方式併入本文中。二十種習知胺基酸之立體異構物（例如D-胺基酸）、非天然胺基酸（諸如α-,α-二取代胺基酸、N-烷基胺基酸、乳酸、及其他非習知胺基酸）亦可係本發明之多肽的合適組分。非習知胺基酸之實例包括：4-羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、e-N-乙醯基離胺酸、O-磷酸絲胺酸、N-乙醯基絲胺酸、N-甲醯基甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基離胺酸、σ-N-甲基精胺酸、及其他類似胺基酸及亞胺酸（例如4-羥基脯胺酸）。在本文所使用之多肽表示中，根據標準用法及慣例，左手方向係胺基端方向，且右手方向係羧基端方向。
如本文中所使用，除非上下文另有規定，否則用語「一(a/an)」係依照標準慣例使用且意指一或多個/種。
如本文中所使用，用語「約(about)」係指在由所屬技術領域中具有通常知識者所判定之特定值或組成之可接受誤差範圍內的值或組成，其將部分取決於該值或組成係如何測量或判定的，亦即測量系統之限制。舉例而言，「約」或「基本上包含(comprising essentially of)」可意指根據所屬技術領域中之實踐之一或多個標準差內。替代地，「約」或「基本上包含」可意指至多10%之範圍（亦即±10%）。例如，約5 mg可包括在4.5 mg與5.5 mg之間的任何數目。此外，特別是關於生物系統或過程，該用語可意指至多一個數量級或至多5倍之值。除非另外說明，否則在本揭露中提供特定值或組成時，應假設「約」或「基本上包含」之意義係在該特定值或組成之可接受誤差範圍內。
如本文中所述，任何濃度範圍、百分比範圍、比率範圍、或整數範圍係理解為涵括所述範圍內之任何整數值，並且在適當時亦涵括其分數（諸如整數之十分之一及百分之一），除非另有指示。
如本文中所使用，用語「及/或(and/or)」應理解為具體揭示兩個指定特徵或組分之各者（包含或不包含另一者）。因此，如用於諸如「A及/或B (A and/or B)」之片語中的用語「及/或(and/or)」意欲包括「A及B (A and B)」、「A或B (A or B)」、「A」（單獨）、及「B」（單獨）。同樣地，如用於諸如「A、B、及/或C (A, B, and/or C)」之片語中的用語「及/或(and/or)」意欲涵蓋下列態樣中之各者：A、B、及C；A、B、或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A（單獨）；B（單獨）；及C（單獨）。
如本文中所使用，用語替代方案之使用（例如「或(or)」）應理解為意指替代方案中之一者、兩者、或其任何組合。
如本文中所使用，用語「同種異體(allogeneic)」係指衍生自一個個體之任何材料，接著將其引入相同物種之另一個體，例如同種異體T細胞移植。
用語「抗體(antibody)」包括天然存在及非天然存在（重組產生）之抗體、人類及非人類抗體、單特異性抗體、多特異性抗體（包括雙特異性抗體）、免疫球蛋白、合成抗體、包含兩個重鏈及兩個輕鏈分子之四聚體抗體、抗體輕鏈單體、抗體重鏈單體、抗體輕鏈二聚體、抗體重鏈二聚體、抗體輕鏈-抗體重鏈對、內抗體(intrabody)（參見例如Stocks, (2004) Drug Discovery Today9(22):960-66）、抗體融合（該用語涵蓋抗體藥物接合物，且在本文中有時稱為「抗體接合物(antibody conjugate)」）、異源接合物抗體、單域抗體、單價抗體、單鏈抗體或單鏈Fv (scFv)、駱駝化(camelized)抗體、親合抗體(affybody)、Fab片段、F(ab’) 2片段、雙硫鍵連接之Fv (sdFv)、抗獨特型(anti-idiotypic)（抗Id）抗體（包括例如抗-抗Id抗體）、微抗體(minibody)、域抗體、合成抗體（在本文中有時稱為「抗體擬似物(antibody mimetic)」）、及其抗原結合片段。在某些實施例中，本文所述之抗體係指多株抗體群。
除非另有指明，否則用語「抗體」亦涵蓋完整免疫球蛋白或其與完整抗體競爭特異性結合之抗原結合部分。抗原結合部分可藉由重組DNA技術或藉由酶或化學切割完整抗體來產生。抗原結合部分尤其包括Fab、Fab’、F(ab’) 2、Fv、域抗體(dAb)、包括互補決定區(CDR)之片段、單鏈抗體(scFv)、嵌合抗體、雙鏈抗體(diabody)、三鏈抗體(triabody)、四鏈抗體(tetrabody)、及至少含有免疫球蛋白足以賦予與多肽之特異性抗原結合的一部分之多肽。
關於特異性結合抗CD20 scFv14、以及包含此序列之分子、及呈現此類分子之細胞之抗體，如本文所揭示，可使用重組方法將非人類抗體人源化，以降低其在人類中之免疫原性。在未明確說明之情況下，且除非上下文另有指示，否則用語「抗體」亦包括任何前述免疫球蛋白之抗原結合分子之抗原結合片段，且包括單價及二價片段或部分及單鏈抗體（亦即scFv）。
如本文中所使用，用語「抗原(antigen)」意指任何引起免疫反應或能夠被抗體或其他抗原結合分子結合之分子。免疫反應可涉及抗體產生、或特定免疫機能健全細胞之活化、或兩者。所屬技術領域中具有通常知識者將容易理解，任何巨分子（包括幾乎所有蛋白質或肽（包括抗CD20 scFv14）、以及包含相同序列之分子、及呈現此類分子之細胞）皆可作為抗原。通常，抗原可內源性表現，亦即藉由基因體DNA表現，或其可重組表現，或其可化學合成。在一個特定實施例中，抗原包含抗CD20 scFv14之全部或一部分以及包含相同序列之分子，其可選地與佐劑（諸如鑰孔蟲戚血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)）或與Fc接合以促進篩選。
如本文中所使用，用語「抗原結合分子(antigen binding molecule)」意指蛋白質，其包含：結合至抗原或目標蛋白質之部分；及可選地支架或構架部分，其允許抗原結合部分採用促進抗原結合分子與抗原之結合的構形。抗原結合分子之代表性類型之實例包括scFv、人類抗體、小鼠抗體、或兔抗體；人源化抗體；嵌合抗體；重組抗體；單鏈抗體；雙鏈抗體；三鏈抗體；四鏈抗體；Fab片段；F(ab’)2片段；IgD抗體；IgE抗體；IgM抗體；IgGl抗體；IgG2抗體；IgG3抗體；或IgG4抗體、及其片段。
抗原結合分子可包含例如具有經移植互補決定區(CDR)或CDR衍生物之替代蛋白質支架或人工支架。此類支架包括但不限於：抗體衍生支架，其包含引入之突變，以例如穩定抗原結合分子之三維結構；以及全合成支架，其包含例如生物相容性聚合物。參見例如Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 53(1):121-129 (2003)；Roque et al., Biotechnol. Prog.20:639-654 (2004)。此外，可使用肽抗體擬似物(peptide antibody mimetic, “PAM”)以及基於利用各種組分（例如纖連蛋白(fibronectin)）之抗體擬似物之支架作為支架。抗原結合分子可具有例如天然存在之免疫球蛋白之結構。
抗原結合分子可具有一或多個結合位點。若有超過一個結合位點，則結合位點可彼此相同，或其等可不同。例如，天然存在之人類免疫球蛋白一般具有兩個相同的結合位點，而「雙特異性(bispecific)」或「雙功能(bifunctional)」抗體具有兩個不同的結合位點，且能夠特異性結合兩種不同的抗原（例如抗CD20 scFv14及細胞表面活化分子）。
在各種實施例中，抗原結合分子係抗體或其片段（包括一或多個本文所揭示之互補決定區(CDR)），其特異性結合抗CD20 scFv14、以及包含抗CD20 scFv14之分子、及呈現此類分子之細胞。在進一步實施例中，抗原結合分子結合至包含抗CD20 scFv14之CAR以及包含抗CD20 scFv14之分子，且可在免疫細胞（諸如T細胞）上表現。
用語「自體(autologous)」係指任何衍生自相同個體之材料，該材料之後會再重新引入至該個體。例如，本文所述之經工程改造之自體細胞療法(eACT™)方法涉及自患者收集淋巴球，接著將其工程改造以表現構築體（例如CAR構築體），接著投予回同一位患者。
如本文中所使用，用語「結合親和力(binding affinity)」意指分子（例如抗原結合分子，諸如抗體）之單一結合位點與其結合夥伴(partner)（例如抗原）之間的非共價交互作用之總和的強度。如本文中所使用，除非另有指示，否則「結合親和力」係指固有結合親和力，其反映結合對（例如抗體及抗原）之成員之間的1:1交互作用。分子X針對其夥伴Y之親和力通常可由解離常數(K D)表示。親和力可以所屬技術領域中已知之多種方式測量及/或表現，包括但不限於平衡解離常數(K D)及平衡締合常數(K A)。K D係由k off/k on之商計算，而K A係由k on/k off之商計算。k on係指例如抗體至抗原之締合速率常數，且k off係指例如抗體至抗原之解離。k on及k off可藉由所屬技術領域中具有通常知識者已知的標準技術判定，諸如BIAcore ®或KinExA或表面電漿共振。
如本文中所使用，用語「互補決定區(complementarity determining region)」或「CDR」意指有助於抗原結合特異性及親和力之胺基酸序列。構架區可幫助維持CDR之適當確認以促進抗原結合分子與抗原之間的結合。CDR之一些定義係通常使用：Kabat編號、Chothia編號、IMGT編號、AbM編號、或contact編號。AbM定義係Kabat與Chothia系統之間的折衷方案，且由Oxford Molec’lar之AbM抗體模型化軟體使用。表1使用各編號系統定義CDR。Contact定義係基於可用複雜晶體結構之分析。 表1
環 Kabat AbM Chothia Contact
L1 L24--L34 L24--L34 L24--L34 L30--L36
L2 L50--L56 L50--L56 L50--L56 L46--L55
L3 L89--L97 L89--L97 L89--L97 L89--L96
H1 H31--H35B H26--H35B H26--H32..34 H30--H35B
H1 H31--H35 H26--H35 H26--H32 H30--H35
H2 H50--H65 H50--H58 H52--H56 H47--H58
H3 H95--H102 H95--H102 H95--H102 H93--H101
用語「Kabat編號(Kabat numbering)」及類似用語在所屬技術領域中被認可，且係指抗體或其抗原結合分子之重鏈及輕鏈可變區中之胺基酸殘基之編號系統。在某些態樣中，抗體之CDR可根據Kabat編號系統判定（參見例如Kabat et al.之Sequences of Proteins of lmmunological Interes t ,5th Ed., NIH Publication 91-3242, Bethesda MD 1991）。使用Kabat編號系統，抗體重鏈分子內之CDR一般存在於胺基酸位置31至35，其可選地可包括一或兩個35以後之額外胺基酸（在Kabat編號方案中稱為35A及35B）(CDR1)、胺基酸位置50至65 (CDR2)、及胺基酸位置95至102 (CDR3)。使用Kabat編號系統，抗體輕鏈分子內之CDR一般存在於胺基酸位置24至34 (CDR1)、胺基酸位置50至56 (CDR2)、及胺基酸位置89至97 (CDR3)。在一些實施例中，本文所述之抗體之CDR可根據Kabat編號方案描述（儘管其可使用上表1以其他編號系統容易地解讀）。在一些實施例中，本文所述之抗體之CDR可根據Clothia編號方案描述。在一些實施例中，本文所述之抗體之CDR可根據IGMT編號方案描述。
在某些態樣中，抗體之CDR可根據Chothia編號方案判定，其係指免疫球蛋白結構環之位置（參見例如Chothia C & Lesk AM, (1987), J Mol Biol196: 901-917；Al-Lazikani B et al.,(1997) J Mol Biol273: 927-948；Chothia C et al.,(1992) J Mol Biol227: 799-817；Tramontano A et al.,(1990) J Mol Biol215(1): 175-82；及美國專利第7,709,226號）。一般而言，當使用Kabat編號慣例，Chothia CDR-H1環存在於重鏈胺基酸26至32、33、或34處，Chothia CDR-H2環存在於重鏈胺基酸52至56處，且Chothia CDR-H3環存在於重鏈胺基酸95至102處，而Chothia CDR-L1環存在於輕鏈胺基酸24至34處，Chothia CDR-L2環存在於輕鏈胺基酸50至56處，且Chothia CDR-L3環存在於輕鏈胺基酸89至97處。在使用Kabat編號慣例編號時，Chothia CDR-HI環之結束在H32與H34之間之變化，取決於環的長度（此係因為Kabat編號方案將插入部分置於H35A及H35B處；若35A及35B均不存在，則環在32處結束；若僅存在35A，則環在33處結束；若35A及35B均存在，則環在34處結束）。參見表1.在一些實施例中，本文所述之抗體之CDR已根據Chothia編號方案判定。
如本文中所使用，「保守性胺基酸取代(conservative amino acid substitution)」係其中胺基酸殘基被具有類似側鏈之胺基酸殘基置換者。所屬技術領域中已定義具有側鏈之胺基酸殘基之家族。此等家族包括具有鹼性側鏈之胺基酸（例如離胺酸、精胺酸、組胺酸）、酸性側鏈（例如天冬胺酸、麩胺酸）、未帶電極性側鏈（例如甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸）、非極性側鏈（例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸）、β-支鏈側鏈（例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸）、及芳族側鏈（例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸）。在某些實施例中，本文所提供之抗體或抗原結合分子（或其片段）之（多個）CDR內或（多個）構架區內的一或多個胺基酸殘基可用具有類似側鏈之胺基酸殘基置換。
本揭露所涵蓋之保守性胺基酸取代可涵蓋非天然存在之胺基酸殘基，其一般係藉由化學肽合成併入，而非在生物系統中合成。此等包括擬肽物及胺基酸部份之其他反轉或反向形式。天然存在之殘基可基於共同的側鏈性質分成以下類別： 疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； 酸性：Asp、Glu； 鹼性：His、Lys、Arg； 影響側鏈定向之殘基：Gly、Pro；及 芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代可涉及將此等類別之一者之成員換成另一類別之成員。可將此類經取代之殘基引入例如與非人類抗體同源之人類抗體之區中，或引入分子之非同源區中。例示性保守性胺基酸取代係闡述於下表2中。 表2
原始殘基 例示性取代 較佳取代
Ala Val、Leu、Ile Val
Arg Lys、Gln、Asn Lys
Asn Gln Gln
Asp Glu Glu
Cys Ser、Ala Ser
Gln Asn Asn
Glu Asp Asp
Gly Pro、Ala Ala
His Asn、Gln、Lys、Arg Arg
Ile Leu、Val、Met、Ala、Phe、正白胺酸 Leu
Leu 正白胺酸、Ile、Val、Met、Ala、Phe Ile
Lys Arg、1,4二胺基-丁酸、Gln、Asn Arg
Met Leu、Phe、Ile Leu
Phe Leu、Val、Ile、Ala、Tyr Leu
Pro Ala Gly
Ser Thr、Ala、Cys Thr
Thr Ser Ser
Trp Tyr、Phe Tyr
Tyr Trp、Phe、Thr、Ser Phe
Val Ile、Met、Leu、Phe、Ala、正白胺酸 Leu
如本文中所使用，用語「恆定區(constant region)」及「恆定域(constant domain)」可互換且具有所屬技術領域中常見的意義。恆定區係抗體部分，例如輕鏈及/或重鏈之羧基端部分，其不直接涉及抗體與抗原之結合，但可展現各種效應功能，諸如與Fc受體交互作用。免疫球蛋白分子之恆定區通常具有相對於免疫球蛋白可變域更保守之胺基酸序列。
如本文中所使用，用語「交叉競爭(cross compete)」意指以下情況：抗原與第一抗原結合分子或其結合片段之間的交互作用阻斷、限制、抑制、或以其他方式降低參考抗原結合分子或其結合片段與抗原交互作用之能力。交叉競爭可係完全的，例如結合分子與抗原之結合完全阻斷參考結合分子與抗原結合之能力，或其可係部分的，例如結合分子與抗原之結合降低參考結合分子與抗原結合之能力。在某些實施例中，與參考抗原結合分子交叉競爭之抗原結合分子結合與參考抗原結合分子相同或重疊之表位。在其他實施例中，與參考抗原結合分子交叉競爭之抗原結合分子結合與參考抗原結合分子不同之表位。許多類型的競爭結合檢定可用以判定一種抗原結合分子是否與另一種競爭，例如：固相直接或間接放射性免疫檢定(RIA)；固相直接或間接酶免疫檢定(EIA)；三明治競爭檢定(Stahli et al., (1983) Method Enzymol9:242-53)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA (Kirkland et al., (1986) J Immunol137:3614-19)；固相直接標示檢定、固相直接標示三明治檢定(Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press)；使用I 125標示之固相直接標示RIA (Morel et al., (1988) Molec Immunol25:7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA (Cheung et al., (1990) Virology176:546-52)；及直接標示RIA (Moldenhauer et al., (1990) Scand J Immunol32:77-82)。
用語「衍生物(derivative)」係指包括胺基酸（或核酸）之插入、缺失、或取代以外的化學修飾之分子。在某些實施例中，衍生物包含共價修飾，包括但不限於與聚合物、脂質、或其他有機或無機部份之化學鍵結。在某些實施例中，經化學修飾之抗原結合分子（衍生物）可具有較未經化學修飾之抗原結合分子更長的循環半衰期。在一些實施例中，衍生物抗原結合分子經共價修飾以包括一或多種水溶性聚合物附接物，包括但不限於聚乙二醇、聚氧乙二醇(polyoxyethylene glycol)、或聚丙二醇。
如本文中所使用，用語「雙鏈抗體(diabody)」或dAB意指包含兩條多肽鏈之二價抗體，其中各多肽鏈包含由連接子接合之VH域及VL域，該連接子太短而不允許相同鏈上之兩個域之間的配對，因此允許各域與另一條多肽鏈上之互補域配對（參見例如Holliger et al., (1993) Proc Natl Acad Sci U.S.A.90:6444-48、Poljak et al., (1994) Structure2: 1121-23、及Perisic et al., (1994) Strucure2(12): 1217-26）。若雙鏈抗體之兩條多肽鏈係相同的，則由其等配對產生之雙鏈抗體將具有兩個相同的抗原結合位點。具有不同序列之多肽鏈可用以製造具有兩個不同抗原結合位點之雙鏈抗體。類似地，三鏈抗體及四鏈抗體係分別包含三條及四條多肽鏈並分別形成三個及四個抗原結合位點之抗體，其等可相同或不同。
如本文中所使用，「表位(epitope)」係所屬技術領域中之用語，且係指抗體可特異性結合之抗原的局部區。表位可係例如多肽之連續胺基酸（線性或連續表位），或表位可例如一起來自一或多個多肽之二或更多個非連續區（構形、非線性、不連續、或非連續表位）。在某些實施例中，抗體結合之表位可藉由例如NMR光譜法、X射線繞射晶體學研究、ELISA檢定、與質譜法耦合之氫/氘交換（例如液相層析電灑質譜法）、基於陣列之寡肽掃描檢定、及/或誘變定位(mutagenesis mapping)（例如定點誘變定位）。對於X射線晶體學，可使用所屬技術領域中任何已知的方法完成結晶（例如Giege et al.,(1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr50(Pt 4): 339-350；McPherson, (1990) Eur J Biochem189: 1-23；Chayen, (1997) Structure5: 1269-1274；McPherson, (1976) J Biol Chem251: 6300-6303）。抗體：抗原晶體可使用熟知的X射線繞射技術研究，且可使用電腦軟體精修，諸如X-PLOR（Yale University, 1992, distributed by Molecular Simulations, Inc.；參見例如 Meth Enzymol(1985) Vols 114 & 115, eds Wyckoff et al.）及BUSTER (Bricogne, (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr49(Pt 1): 37-60; Bricogne, (1997) Meth Enzymol276A: 361-423, ed. Carter; Roversi et al.,(2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr56(Pt 10): 1316-1323)。誘變定位研究可使用所屬技術領域中具有通常知識者已知的任何方法完成。關於誘變技術之描述，參見例如Champe et al.,(1995) J Biol Chem270: 1388-94及Cunningham & Wells, (1989) Science244: 1081-85，包括丙胺酸及精胺酸掃描誘變技術。
如本文中所使用，用語「Fab片段」意指具有VL域、VH域、CL域、及CH域之單價片段；「F(ab’) 2片段」係具有藉由鉸鏈區之雙硫鍵連接的兩個Fab片段之二價片段；「Fv片段」具有抗體單臂之VH域及VL域；且「dAb片段」具有VH域、VL域、或VH域或VL域之抗原結合片段。
如本文中所使用，用語「免疫特異性結合(immunospecifically bind)」、「免疫特異性識別(immunospecifically recognize)」、「特異性結合(specifically bind)」、及「特異性識別(specifically recognize)」係類似用語，且在抗原結合分子之背景下可互換使用，且意指給定分子優先結合至抗原（例如表位或免疫複合物），所屬技術領域中具有通常知識者理解此類結合。例如，特異性結合至抗原之抗原結合分子可結合至其他肽或多肽，但具有相對較低的親和力，如藉由例如免疫檢定、BIAcore ®、KinExA 3000儀器(Sapidyne Instruments, Boise, ID)、或所屬技術領域中已知的其他檢定所判定。在一些實施例中，特異性結合至抗原之分子以當該分子結合至另一抗原時之K A之至少2個對數、2.5個對數、3個對數、4個對數、或更大的K A結合至該抗原。
在另一實施例中，特異性結合至抗原（例如抗CD20 scFv14、以及包含相同序列之分子、及呈現此類分子之細胞）之分子以約1 x 10 -7M之解離常數(K d)結合。在一些實施例中，當K d係約1 x 10 -9M至約5 x 10 -9M時，抗原結合分子以「高親和力」特異性結合抗原（例如抗CD20 scFv14、以及包含相同序列之分子、及呈現此類分子之細胞）。在一些實施例中，當K d係1 x 10 -10M至約5 x 10 -10M時，抗原結合分子以「極高親和力」特異性結合抗原（例如抗CD20 scFv14、以及包含相同序列之分子、及呈現此類分子之細胞）。
在又另一實施例中，特異性結合至抗原（例如抗CD20 scFv14、以及包含此序列之分子、及呈現此類分子之細胞）之分子在類似結合條件下不與其他蛋白質交叉反應。在一些實施例中，特異性結合至抗原（例如抗CD20 scFv14、以及包含相同序列之分子、及呈現此類分子之細胞）之分子不與其他不包含抗CD20 scFv14、包含此序列之分子、及呈現此類分子之細胞的蛋白質交叉反應。在一些實施例中，本文提供抗體或其片段，其以較與另一不相關抗原高的親和力結合至抗CD20 scFv14、以及包含相同序列之分子、及呈現此類分子之細胞。在某些實施例中，本文提供抗原結合分子（例如抗體）或其片段，其以較與另一不相關抗原高20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或更高的親和力結合至抗CD20 scFv14、以及包含此序列之分子、及呈現此類分子之細胞，如藉由例如放射性免疫檢定、表面電漿共振、或動力學排除檢定所測量。在一些實施例中，本文所述之特異性結合抗CD20 scFv14、以及包含此序列之分子、及呈現此類分子之細胞之抗原結合分子、抗體、或其抗原結合片段的結合程度相較於不相關蛋白質（其不包含抗CD20 scFv14、以及包含此序列之分子、及呈現此類分子之細胞），小於抗體與連接子片段蛋白質之結合的10%、15%、或20%，如藉由例如放射性免疫檢定所測量。
如本文中所使用，當用於提及抗體時，用語「重鏈(heavy chain)」可指任何不同類型，例如α、δ、ε、γ、及µ，基於恆定域之胺基酸序列，其分別產生IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM類別的抗體，包括IgG亞類，例如IgG 1、IgG 2、IgG 3、及IgG 4。
如本文中所使用，用語「免疫球蛋白(immunoglobulin)」意指來自任何普遍已知同型之免疫分子，包括但不限於IgA、分泌型IgA、IgG、及IgM。IgG亞類亦為所屬技術領域中具有通常知識者所熟知，且包括但不限於人類IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4。本文所述之許多分子係免疫球蛋白。如本文中所使用，「同型(isotype)」意指由重鏈恆定區基因編碼之抗體類別或亞類（例如IgM或IgG1）。
免疫球蛋白係四聚體分子，通常由兩對相同的多肽鏈所構成，各對具有一條「輕」鏈（約25 kDa）及一條「重」鏈（約50至70 kDa）。各鏈之胺基端部分包括主要負責抗原識別之約100至130個或更多個胺基酸之可變區。各鏈之羧基端部分定義主要負責效應功能之恆定區。人類輕鏈係分類為κ及λ輕鏈。重鏈係分類為μ、δ、γ、α、或ε，且分別將抗體之同型定義為IgM、IgD、IgG、IgA、或IgE。在輕鏈及重鏈內，可變區及恆定區係由約12個或更多個胺基酸之「J」區接合，且重鏈亦包括約10個或更多個胺基酸之「D」區。大致上參見Berzofsky & Berkower， Fundamental Immunology第7章（Paul, W., ed., Lippincott Williams & Wilkins (2012)；其章節及卷之全文出於所有目的以引用方式併入本文中）。各輕鏈/重鏈對之可變區形成抗體結合位點，使得完整的免疫球蛋白具有兩個主要結合位點。
天然存在之免疫球蛋白鏈展現出由三個高度變異區（亦稱為互補決定區或「CDR」）接合之相對保守的構架區(FR)之相同一般結構。自N端至C端，輕鏈及重鏈兩者皆包含域FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及FR4。各域之胺基酸分配可根據下列之定義進行：Kabat（參見例如Kabat et al.之 Sequences of Proteins of lmmunological Interest, 5th Ed., NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991)）或Chothia（本文中所使用之Chothia（參見例如Chothia & Lesk (1987), J. Mol. Biol.196:901-917；Chothia et al., 1989, Nature342:878-883或Honegger & Pluckthun (2001), J Mol Biol309:657-670）。在本文中更完整地描述Kabat、Chothia、IGMT、及Abm (Oxford Molecular)編號系統。
如本文中所使用，用語「體外細胞( in vitrocell)」係指任何離體培養之細胞。體外細胞可包括人類細胞（諸如T細胞或樹突細胞），或其可包括CHO、sP2/0、兔、及其他非人類細胞。
如本文中所使用，當用於提及抗體時，用語「輕鏈(light chain)」可指任何不同類型，例如基於恆定域之胺基酸序列之κ或λ。輕鏈胺基酸序列係所屬技術領域中已知的。在特定實施例中，輕鏈係人類輕鏈。
用語「中和(neutralizing)」係指結合至配體（例如包含抗CD20 scFv14之部份、以及包含此序列之分子及呈現此類分子之細胞）並防止或減少該配體之生物效應之抗原結合分子、scFv、抗體、或其片段。在一些實施例中，抗原結合分子、scFv、抗體、或其片段直接阻斷配體上之結合位點或另行透過間接方式改變配體結合之能力（諸如配體中之結構性或能量性改變）。在一些實施例中，抗原結合分子、scFv、抗體、或其片段防止其所結合之蛋白質執行生物功能。
如本文中所使用，用語「患者(patient)」意指針對異常生理狀況（諸如癌症）正在接受治療或已經正式診斷患有病症之任何人類、不具有經正式識別之病症者、正在接受醫療照顧者、具有發展病症之風險者等。用語「對象(subject)」及「患者(patient)」在本文中可互換使用且包括人類及非人類動物對象兩者。
如本文中所使用，用語「肽(peptide)」、「多肽(polypeptide)」、及「蛋白質(protein)」在本文中可互換使用且意指包含由肽鍵共價連接之胺基酸殘基的化合物。蛋白質或肽必須含有至少兩個胺基酸，但對可構成蛋白質或肽序列的胺基酸之最大數目沒有限制。用語多肽涵蓋包含彼此由肽鍵接合之二或更多個胺基酸的任何肽或蛋白質。如本文中所使用，該用語係同時指短鏈（亦常稱為肽、寡肽、及寡聚物）及長鏈（通常稱為蛋白質）。「多肽」包括例如生物活性片段、實質上同源之多肽、寡肽、同二聚體、異二聚體、多肽之變體、經修飾多肽、衍生物、類似物、融合蛋白等。用語「多肽」包括天然肽、重組肽、合成肽、或其組合。
在一些態樣中，多肽及/或蛋白質具有抗原結合分子之一或多個胺基酸之缺失、添加、及/或取代。可用多肽片段可包括抗原結合分子之免疫功能片段，包括但不限於一或多個CDR區、重鏈及/或輕鏈之可變域、抗體鏈之其他部分的一部分、及類似者。可取代抗原結合分子之一或多個胺基酸的部份包括例如胺基酸之D或L形式、與通常在抗原結合分子之相同位置發現之胺基酸不同的胺基酸、缺失、非天然存在之胺基酸、及胺基酸之化學類似物。
肽類似物在醫藥產業中常用作具有類似於模板肽之性質的非肽藥物，且形成本揭露之一態樣。此等類型的非肽化合物稱為「肽擬似物(peptide mimetic)」或「擬肽物(peptidomimetic)」。參見例如Fauchere, (1986) Adv. Drug Res.(Testa, ed.) 15:29-69；Veber & Freidinger, (1985) TINSp.392；及Evans et al., (1987) J. Med. Chem, 30:1229-39，其出於任何目的以引用方式併入本文中。
該用語具體涵蓋包含抗CD20 scFv14之多肽、肽、蛋白質、及類似分子、以及包含此序列之分子、及呈現此類分子之細胞。
如本文中所使用，用語「同一性百分比(percent identity)」意指在所比較分子中胺基酸或核苷酸之間的同一殘基之百分比。對於此等計算，比對中之間隙(gap)（若有）必須藉由特定數學模型或電腦程式（亦即「演算法」）處理。可用以計算經比對之核酸或多肽之同一性的方法包括描述於下列中者： Computational Molecular Biology, (Lesk, ed.), (1988) New York: Oxford University Press； Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, ed.), 1993, New York: Academic Press； Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin and Griffin, eds.), 1994, New Jersey: Humana Press；von Heinje, (1987) Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press； Sequence Analysis Primer, (Gribskov and Devereux, eds.), 1991, New York: M. Stockton Press；及Carillo et al., (1988) J. Applied Math.48:1073。
計算同一性百分比時，被比較之序列係以給予序列之間最大匹配的方式比對。用以判定同一性百分比之電腦程式可係例如MOE (Chemical Computing Group)或DNASTAR (University of Wisconsin, Madison, WI)。電腦演算法GAP可用於比對兩個多肽或多核苷酸，以判定其等之序列同一性百分比。序列針對其各別胺基酸或核苷酸之最佳匹配進行比對（如由演算法判定之「匹配跨度(matched span)」）。間隙開放罰分(gap opening penalty)（其係計算為3x平均對角線，其中「平均對角線(average diagonal)」係所使用之比較矩陣之對角線的平均值；「對角線(diagonal)」係藉由特定比較矩陣指派給各完美胺基酸匹配之分數或數目）、及間隙延伸罰分(gap extension penalty)（其經常係間隙開放罰分之1/10倍）、以及諸如PAM 250或BLOSUM 62之比較矩陣係與演算法結合使用。在某些實施例中，標準比較矩陣（參見例如Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure5:345-352（關於PAM 250比較矩陣）；Henikoff et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.89: 10915-10919（關於BLOSUM 62比較矩陣））亦被演算法使用。
用於比對兩個胺基酸序列之某些比對方案可導致僅匹配兩個序列之短區，且即使在兩個全長序列之間不存在顯著關係，此小的經比對區亦可具有非常高的序列同一性。因此，若為所欲，可調整所選之比對方法（例如GAP程式）以產生跨越目標多肽之至少50個連續胺基酸之比對。
如本文中所使用，用語「單鏈抗體(single-chain antibody)」及「單鏈可變片段(scFv)」可互換使用且意指其中V L及V H區係經由連接子接合以形成連續蛋白質鏈之抗原結合分子，其中連接子足夠長以允許蛋白質鏈自行摺疊並形成單價抗原結合位點（參見例如Zuhaida Asra Ahmad, Swee Keong Yeap, Abdul Manaf Ali, Wan Yong Ho, Noorjahan Banu Mohamed Alitheen, Muhajir Hamid, “scFv Antibody: Principles and Clinical Application”, Journal of Immunology Research, vol. 2012, Article ID 980250, 15 pages, 2012.，其全文出於任何目的以引用方式併入本文中）。scFv14係scFv之具體實例。
治療劑（例如包含抗CD20 scFv14之部份、以及包含此序列之分子、及呈現此類分子之細胞）之「治療有效量(therapeutically effective amount)」、「有效劑量(effective dose)」、「有效量(effective amount)」、或「治療有效劑量(therapeutically effective dosage)」係當單獨使用或與另一治療劑組合使用時保護對象免於疾病發作或促進疾病消退之任何量，其係藉由疾病症狀之嚴重性降低、無疾病症狀期之頻率及持續時間增加、或預防因罹患疾病之損傷或失能而獲得證明。治療劑促進疾病消退之能力可使用所屬技術領域中具有通常知識者已知的各種方法評估，諸如在臨床試驗期間在人類對象中、在預測人類功效之動物模型系統中、或藉由在體外檢定中檢定藥劑之活性。
用語「轉導(transduction)」及「經轉導(transduced)」係指經由病毒載體將外來DNA引入細胞中之程序（參見Hartl and Jones (1997) “ Genetics: Principles and Analysis,” 4 thed, Jones & Bartlett）。在一些實施例中，載體係反轉錄病毒載體、DNA載體、RNA載體、腺病毒載體、桿狀病毒載體、艾司坦-巴爾(Epstein Barr)病毒載體、乳多泡病毒載體、牛痘病毒載體、單純疱疹病毒載體、腺病毒相關載體、慢病毒載體、或其任何組合。
如本文中所使用，用語「可變區(variable region)」或「可變域(variable domain)」可互換使用且意指抗體之一部分，通常係輕鏈或重鏈之一部分，一般約在抗體之胺基端且包含重鏈中約100至130個胺基酸及輕鏈中約90至115個胺基酸，其在抗體之間的序列差異很大，且係用於特定抗體對其特定抗原之結合及特異性。序列之變異性集中在稱為互補決定區(CDR)之區中，而可變域中更高度保守的區稱為構架區(FR)。輕鏈及重鏈之CDR主要負責抗體與抗原之交互作用及特異性。
在某些實施例中，抗原結合分子之可變區係人類可變區。在進一步實施例中，可變區包含嚙齒動物、人類、或鼠類CDR及人類構架區(FR)。在進一步實施例中，可變區係靈長類（例如非人類靈長類）可變區。在又進一步實施例中，可變區係兔可變區。在其他實施例中，可變區包含人類CDR及非人類（例如兔、鼠類、大鼠、或非人類靈長類）構架區(FR)。在其他實施例中，可變區包含非人類（例如兔、鼠類、大鼠、或非人類靈長類）CDR及人類構架區(FR)。
用語「VH」、「VH域(VH domain)」、及「VH鏈(VH chain)」可互換使用且意指抗原結合分子、抗體、或其抗原結合片段之重鏈可變區。
用語「VL」、「VL域(VL domain)」、及「VL鏈(VL chain)」可互換使用且意指抗原結合分子、抗體、或其抗原結合片段之輕鏈可變區。
如本文中所使用，用語「病毒顆粒(viral particle)」意指一或多個完整病毒體以及一或多個病毒體之任何部分。
本發明之各種態樣係進一步詳細描述於以下小節中。 II. 概述
使用經工程改造以表現嵌合抗原受體(CAR)之T細胞的免疫療法已在臨床上顯示出非凡的前景，具有治癒復發性B細胞惡性疾病之潛力。然而，來自多個臨床研究之數據已確定用抗CD19 CAR T細胞治療的關鍵弱點，即腫瘤細胞易於發生抗原逃脫（亦即腫瘤細胞上可偵測抗原之下調或損失），導致在治療之後腫瘤再發。例如，在自體抗CD19 CAR T細胞產品西卡思羅(axicabtagene ciloleucel)之1/2期臨床研究(ZUMA-1)中，88名反應者中之39名(44%)在治療之後復發，且在所有具有可用復發後樣本之患者中，16名患者中之4名(25%)在診斷時表現為患有CD19陽性疾病且在治療之後表現為患有CD19陰性疾病。參見例如Locke et al., (2019) Lancet Oncol.2019(1):31-42、及Neelapu et al., (2017) The New England journal of medicine2017;377 (26):2531-44，其等之全文出於任何目的以引用方式併入本文中。另外，接受替沙津魯(tisagenlecleucel)（另一抗CD19 CAR T細胞療法）之患者遭受由抗原損失驅動之疾病復發。參見例如Maude et al., (2018) The New England Journal of Medicine2018;378 (5):439-48及Maude et al., (2016) Journal of Clinical Oncology2016;34 (15_suppl):3011，其等之全文出於任何目的以引用方式併入本文中。
非臨床數據已證明，相較於單價CAR T細胞，雙靶向方法（使用針對2種獨立的目標細胞表面抗原之CAR）在體外及體內更有效。參見例如Hegde et al., (2013) Mol. Ther.2013;21 (11):2087-101、Hegde et al., (2016) J. Clin. Invest2016;126 (8):3036-52、Ruella et al., (2018) Mol. Ther Oncolytics.2018;11:127-37、及Zah et al., (2016) J. Clin. Invest Cancer Immunol. Res.2016;4 (6):498-508，其等之全文出於任何目的以引用方式併入本文中。類似於CD19，CD20係在大部分健康B細胞（自前B細胞至記憶B細胞階段）以及白血病及淋巴瘤細胞中表現之細胞表面抗原。靶向CD20之概念已在單株抗體療法及CAR T細胞療法兩者之背景下在臨床上得到證實，且當與CD19靶向組合時，可代表降低抗原逃脫機率之有效策略。參見例如Boye et al., (2003) Annals of Oncology2003;14 (4):520-35、Brudno et al., (2018) Nat. Rev. Clin. Oncol.2018;15 (1):31-46、及Zah et al., (2016) J. Clin. Invest Cancer Immunol. Res.2016;4 (6):498-508，其等之全文出於任何目的以引用方式併入本文中。
用於治療患有復發性或難治性B細胞惡性疾病之患者的單抗原及雙抗原（諸如靶向抗CD19/CD20 CAR T細胞療法者）兩者在開發及製造程序期間皆需要經充分理解及表徵。更具體而言，本文中之實施例描述對scFv14具有特異性之抗體，以表徵抗CD20 CAR之特異性蛋白質表現。
進一步需要病毒顆粒之偵測及定量。在某些態樣中，病毒顆粒之偵測可藉由偵測病毒套膜蛋白（諸如長臂猿白血病病毒(GALV)蛋白gp70）達成。如本文所揭示之對GALV gp70具有特異性之抗原結合分子具有許多用途，例如用於檢定中，諸如基於流之病毒偵測方法。 III. 抗原結合分子：對抗CD20 scFv14 具有特異性
本揭露係關於抗原結合分子（包括抗體），其特異性結合抗CD20 scFv14、以及包含相同序列之分子、及呈現此類分子之細胞；及/或與一或多種本文所述之抗原結合分子交叉競爭者。重鏈抗原結合分子可包含如表3A、表3B、及表3C中所定義之一組獨特CDR序列，且係由表4A、表4B、及表4C中所闡述之提供的輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3序列例示。相關殖株可見於表5及表6中。在各種實施例中，抗原結合分子之scFv形式可包括重鏈結合分子，其係藉由連接子胺基酸序列（例如「Whitlow」連接子）接合至輕鏈結合分子。連接子序列之實例係描述於本文中。
在各種實施例中，本文所述之抗原結合分子可用於一或多種方法（例如本文及所屬技術領域所述之方法）中。
在各種實施例中，抗原結合分子可包含一或多個CDR。在各種實施例中，抗原結合分子可包含一或多個構架區。在各種實施例中，抗原結合分子可包含間隔開且在四個構架區之間的三個CDR。
在各種實施例中，抗原結合分子可包含併入可變重鏈中之一或多個CDR。在各種實施例中，抗原結合分子可包含併入可變輕鏈中之一或多個CDR。在各種實施例中，抗原結合分子可包含藉由連接子連接至可變輕鏈之可變重鏈。
在各種實施例中，抗原結合分子可包含輕鏈。在各種實施例中，抗原結合分子可包含重鏈。在各種實施例中，抗原結合分子可包含藉由雙硫鍵聯連接之輕鏈及重鏈。在各種實施例中，抗原結合分子可包含藉由雙硫鍵聯連接至第二重鏈之第一重鏈。在各種實施例中，抗原結合分子可包含兩條輕鏈及兩條重鏈。
本揭露之經編碼之抗體或抗原結合分子可係單鏈或雙鏈的。在一些實施例中，抗體或抗原結合分子可係單鏈的。在某些實施例中，抗原結合分子可選自由下列所組成之群組：scFv、Fab、Fab’、Fv、F(ab’) 2、dAb、及其任何組合。在一個特定實施例中，抗體或抗原結合分子可包含scFv。
在某些實施例中，諸如抗體之抗原結合分子可包含單鏈，其中重鏈可變區及輕鏈可變區可藉由連接子連接。在一些實施例中，V H可位於連接子之N端，且V L可位於連接子之C端。在其他實施例中，V L可位於連接子之N端，且V H可位於連接子之C端。 表3A：抗CD20重鏈抗原結合分子CDR1、CDR2、及CDR3胺基酸序列（Chothia格式）。
殖株ID # SEQ_aa_CDR1 SEQ_aa_CDR2 SEQ_aa_CDR3
22H5 GYSITSGY (SEQ ID NO: 21) SYSGS (SEQ ID NO: 42) EGYSNYFDS (SEQ ID NO: 66)
23C11 GYTFTSY (SEQ ID NO: 22) DPSDSE (SEQ ID NO: 43) AGRVFYYAMDY (SEQ ID NO: 67)
23E1 GFTFTDY--- (SEQ ID NO: 23) -----YPYNGG--------- (SEQ ID NO: 44) RGQRVWYFDV (SEQ ID NO: 68)
24C7 GYSFTSY (SEQ ID NO: 24) YPGSGN (SEQ ID NO: 45) CVLLDYFDY (SEQ ID NO: 69)
24C12 GHTFTGY (SEQ ID NO: 25) LPGSGS (SEQ ID NO: 46) EGFAY (SEQ ID NO: 70)
29F8 GYTFTTY (SEQ ID NO: 26) NTYSGV (SEQ ID NO: 47) YYYGSNYDY (SEQ ID NO: 71)
25B2 GYTFTTY (SEQ ID NO: 26) NTYSGV (SEQ ID NO: 47) TYYGNYFDY (SEQ ID NO: 72)
29F1 GYTFTTY (SEQ ID NO: 26) NTYSGV (SEQ ID NO: 47) FYYGSSFDY (SEQ ID NO: 73)
25F10 GYSFTSY (SEQ ID NO: 24) YPRSGN (SEQ ID NO: 48) SDFYYGSDY (SEQ ID NO: 74)
18D7 GFTFSNY (SEQ ID NO: 27) RLKSDNYA (SEQ ID NO: 49) GYYGSRRGFDY (SEQ ID NO: 75)
表3B：抗CD20重鏈抗原結合分子CDR1、CDR2、及CDR3胺基酸序列（Kabat格式）。
殖株ID # SEQ_aa_CDR1 SEQ_aa_CDR2 SEQ_aa_CDR3
22H5 SGYDWH (SEQ ID NO: 28) YISYSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 50) EGYSNYFDS (SEQ ID NO: 66)
23C11 SYWMH (SEQ ID NO: 29) NIDPSDSETHYNQKFKD (SEQ ID NO: 51) AGRVFYYAMDY (SEQ ID NO: 67)
23E1 -----DYYMH (SEQ ID NO: 30) ---LVYPYNGGTSYNQKFKG (SEQ ID NO: 52) RGQRVWYFDV (SEQ ID NO: 68)
24C7 SYYIH (SEQ ID NO: 31) WIYPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 53) CVLLDYFDY (SEQ ID NO: 69)
24C12 GYWIE (SEQ ID NO: 32) EILPGSGSTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 54) EGFAY (SEQ ID NO: 70)
29F8 TYGMS (SEQ ID NO: 33) WINTYSGVPTYADDFKG (SEQ ID NO: 55) YYYGSNYDY (SEQ ID NO: 71)
25B2 TYGMS (SEQ ID NO: 33) WINTYSGVPTYADDFKG (SEQ ID NO: 55) TYYGNYFDY (SEQ ID NO: 72)
29F1 TYGMS (SEQ ID NO: 33) WINTYSGVPTYADDFKG (SEQ ID NO: 55) FYYGSSFDY (SEQ ID NO: 73)
25F10 SYYIH (SEQ ID NO: 31) WIYPRSGNTNYNEKFKD (SEQ ID NO: 56) SDFYYGSDY (SEQ ID NO: 74)
18D7 NYWMN (SEQ ID NO: 34) QIRLKSDNYATHYAESVKG (SEQ ID NO: 57) GYYGSRRGFDY (SEQ ID NO: 75)
表3C：抗CD20重鏈抗原結合分子CDR1、CDR2、及CDR3胺基酸序列（IMGT格式）。
殖株ID # SEQ_aa_CDR1 SEQ_aa_CDR2 SEQ_aa_CDR3
22H5 GYSITSGYD (SEQ ID NO: 35) ISYSGST (SEQ ID NO: 58) AREGYSNYFDS (SEQ ID NO: 76)
23C11 GYTFTSYW (SEQ ID NO: 36) IDPSDSET (SEQ ID NO: 59) ARAGRVFYYAMDY (SEQ ID NO: 77)
23E1 GFTF—Y-- (SEQ ID NO: 37) ----VYPYNGGT-------- (SEQ ID NO: 60) ARRGQRVWYFDV (SEQ ID NO: 78)
24C7 GYSFTSYY (SEQ ID NO: 38) IYPGSGNT (SEQ ID NO: 61) ARCVLLDYFDY (SEQ ID NO: 79)
24C12 GHTFTGYW (SEQ ID NO: 39) ILPGSGST (SEQ ID NO: 62) AREGFAY (SEQ ID NO: 80)
29F8 GYTFTTYG (SEQ ID NO: 40) INTYSGVP (SEQ ID NO: 63) ARYYYGSNYDY (SEQ ID NO: 81)
25B2 GYTFTTYG (SEQ ID NO: 40) INTYSGVP (SEQ ID NO: 63) ARTYYGNYFDY (SEQ ID NO: 82)
29F1 GYTFTTYG (SEQ ID NO: 40) INTYSGVP (SEQ ID NO: 63) ARFYYGSSFDY (SEQ ID NO: 83)
25F10 GYSFTSYY (SEQ ID NO: 38) IYPRSGNT (SEQ ID NO: 64) GRSDFYYGSDY (SEQ ID NO: 84)
18D7 GFTFSNYW (SEQ ID NO: 41) IRLKSDNYAT (SEQ ID NO: 65) TGGYYGSRRGFDY (SEQ ID NO: 85)
表4A：抗CD20輕鏈抗原結合分子CDR1、CDR2、及CDR3序列（Chothia格式）。
SEQ_aa_CDR1 SEQ_aa_CDR2 SEQ_aa_CDR3
KASQSVSNDVA (SEQ ID NO: 86) YASNRYT (SEQ ID NO: 100) QQDYSSPLA (SEQ ID NO: 112)
RASQDISNYLN (SEQ ID NO: 87) YTSRLHS (SEQ ID NO: 101) QQGNTLYT (SEQ ID NO: 113)
KASQDINKYIA (SEQ ID NO: 88) YTSTLQP (SEQ ID NO: 102) LQYDNLYT (SEQ ID NO: 114)
RASQEISGYLS (SEQ ID NO: 89) AASTLDS (SEQ ID NO: 103) LQYASYPYT (SEQ ID NO: 115)
KASQDVGIAVA (SEQ ID NO: 90) WASTRHT (SEQ ID NO: 104) QQYSSYPYT (SEQ ID NO: 116)
RASENIYSYLA (SEQ ID NO: 91) NAKTLAE (SEQ ID NO: 105) QHHYGSPPT (SEQ ID NO: 117)
KASQDINKYIA (SEQ ID NO: 88) YTSTLQP (SEQ ID NO: 102) LQYDNLYT (SEQ ID NO: 114)
RASENIYSYLA (SEQ ID NO: 91) NAKTLAE (SEQ ID NO: 105) QHHYGTPLT (SEQ ID NO: 118)
RASQEISGYLG (SEQ ID NO: 92) AASTLDS (SEQ ID NO: 103) LQYASYPWT (SEQ ID NO: 119)
SASQGISNYLN (SEQ ID NO: 93) YTSSLHS (SEQ ID NO: 106) QQYSKLPFT (SEQ ID NO: 120)
表4B：抗CD20輕鏈抗原結合分子CDR1、CDR2、及CDR3序列（Kabat格式）。
SEQ_aa_CDR1 SEQ_aa_CDR2 SEQ_aa_CDR3
KASQSVSNDVA (SEQ ID NO: 86) YASNRYT (SEQ ID NO: 100) QQDYSSPLA (SEQ ID NO: 112)
RASQDISNYLN (SEQ ID NO: 87) YTSRLHS (SEQ ID NO: 101) QQGNTLYT (SEQ ID NO: 113)
KASQDINKYIA (SEQ ID NO: 88) YTSTLQP (SEQ ID NO: 102) LQYDNLYT (SEQ ID NO: 114)
RASQEISGYLS (SEQ ID NO: 89) AASTLDS (SEQ ID NO: 103) LQYASYPYT (SEQ ID NO: 115)
KASQDVGIAVA (SEQ ID NO: 90) WASTRHT (SEQ ID NO: 104) QQYSSYPYT (SEQ ID NO: 116)
RASENIYSYLA (SEQ ID NO: 91) NAKTLAE (SEQ ID NO: 105) QHHYGSPPT (SEQ ID NO: 117)
KASQDINKYIA (SEQ ID NO: 88) YTSTLQP (SEQ ID NO: 102) LQYDNLYT (SEQ ID NO: 114)
RASENIYSYLA (SEQ ID NO: 91) NAKTLAE (SEQ ID NO: 105) QHHYGTPLT (SEQ ID NO: 118)
RASQEISGYLG (SEQ ID NO: 92) AASTLDS (SEQ ID NO: 103) LQYASYPWT (SEQ ID NO: 119)
SASQGISNYLN (SEQ ID NO: 93) YTSSLHS (SEQ ID NO: 106) QQYSKLPFT (SEQ ID NO: 120)
表4C：抗CD20輕鏈抗原結合分子CDR1、CDR2、及CDR3序列（IMGT格式）。
SEQ_aa_CDR1 SEQ_aa_CDR2 SEQ_aa_CDR3
QSVSND (SEQ ID NO: 94) YAS QQDYSSPLA (SEQ ID NO: 112)
QDISNY (SEQ ID NO: 95) YTS QQGNTLYT (SEQ ID NO: 113)
QDINKY (SEQ ID NO: 96) YTS LQYDNLYT (SEQ ID NO: 114)
QEISGY (SEQ ID NO: 97) AAS LQYASYPYT (SEQ ID NO: 115)
QDVGIA (SEQ ID NO: 98) WAS QQYSSYPYT (SEQ ID NO: 116)
ENIYSY (SEQ ID NO: 99) NAK QHHYGSPPT (SEQ ID NO: 117)
QDINKY (SEQ ID NO: 96) YTS LQYDNLYT (SEQ ID NO: 114)
ENIYSY (SEQ ID NO: 99) NAK QHHYGTPLT (SEQ ID NO: 118)
QEISGY (SEQ ID NO: 97) AAS LQYASYPWT (SEQ ID NO: 119)
QDISNY (SEQ ID NO: 95) YTS QQYSKLPFT (SEQ ID NO: 120)
表5：抗CD20重鏈抗原結合分子可變域胺基酸序列。
殖株ID # SEQ_aa_FR1_FR4 SEQ ID NO.
22H5 DVQLQESGPGMVKPSQSLSLTCTVTGYSITSGYDWHWIRHFPGNKLEWMGYISYSGSTNYNPSLKSRISITHDTSKNHFFLKLNSVTTEDTATYYCAREGYSNYFDSWGQGTTLTVSS 1
23C11 QVQLQQPGAELVRPGSSVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPIQGLEWIGNIDPSDSETHYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARAGRVFYYAMDYWGQGTSVTVSS 2
23E1 EVQLQQSGPVLVKPGPSVKISCKASGFTFTDYYMHWVKQSHGKSLEWIGLVYPYNGGTSYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMELNSLTSEDSAVYYCARRGQRVWYFDVWGTGTTVTVSS 3
24C7 QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTSYYIHWVKQRPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARCVLLDYFDYWGQGTTLTVSS 4
24C12 QVQLQQSGAELMKPGASVKLSCKATGHTFTGYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTTEDSAIYYCAREGFAYWGQGTLVTVSA 5
29F8 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTTYGMSWVKQAPGKGLKWMGWINTYSGVPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDSATYFCARYYYGSNYDYWGQGTTLTVSS 6
25B2 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTTYGMSWVKQAPGKGLKWMGWINTYSGVPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARTYYGNYFDYWGQGTTLTVSS 7
29F1 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTTYGMSWVKQAPGKGLKWMGWINTYSGVPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARFYYGSSFDYWGQGTTLTVSS 8
25F10 QVHLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTSYYIHWVKQRPGQGLEWIGWIYPRSGNTNYNEKFKDKATLAADTSSSAAYMQLSSLTSEDSAVYYCGRSDFYYGSDYWGQGTTLTVSS 9
18D7 EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRLKSDNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGGYYGSRRGFDYWGQGTTLTVSS 10
表6：抗CD20輕鏈抗原結合分子可變域胺基酸序列。
殖株ID # SEQ_aa_FR1_FR4 SEQ ID NO.
22H5 SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLIFYASNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYSSPLAFGAGTKLELK 11
23C11 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLYTFGGGTKLEIK 12
23E1 DIQMTQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDINKYIAWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDNLYTFGGGTKLEIK 13
24C7 DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQEISGYLSWLQQKPDGTIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCLQYASYPYTFGGGTKLEIK 14
24C12 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVGIAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYSSYPYTFGGGTKLEIK 15
29F8 DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVNNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGSPPTFGSGTKLEIK 16
25B2 DIQMTQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDINKYIAWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDNLYTFGGGTKLEIK 17
29F1 DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPLTFGAGTKLELK 18
25F10 DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQEISGYLGWLQQKPDGTIKRLIYAASTLDSGVPRRFSGSRSGSDYSLTFSSLESEDFADYYCLQYASYPWTFGGGTKLEIK 19
18D7 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPFTFGSGTKLEIK 20
在一個實施例中，本揭露之抗原結合分子係抗體及其抗原結合片段。在一個實施例中，本揭露之對抗CD20 scFv具有特異性之抗體包含至少一個表3A至表3C及表4A至表4C中所闡述之CDR。在另一態樣中，本揭露提供能夠產生本文所揭示之抗體的融合瘤、及如本文所述及所屬技術領域中已知的由融合瘤產生抗體之方法。
人源化抗體係描述於本文中且可藉由已知技術製備。在一個實施例中，人源化單株抗體包含鼠類或兔抗體之可變域（或其抗原結合位點之全部或一部分）及衍生自人類抗體之恆定域。替代地，人源化抗體片段可包含鼠類或兔單株抗體之抗原結合位點及衍生自人類抗體之可變域片段（缺乏抗原結合位點）。用於產生經工程改造之單株抗體之程序包括Riechmann et al., (1988) Nature332:323、Liu et al., (1987) Proc. Nat. Acad. Sci. USA84:3439、Larrick et al., (1989) Bio/Technology7:934、及Winter et al., (1993) TIPS14:139中所述者。在一個實施例中，嵌合抗體係CDR移植抗體。用於將抗體人源化之技術係描述於例如美國專利第5,869,619號；第5225539號；第5821337號；第5859205號；第6881557號；Padlan et al., (1995) FASEB J.9:133-39；Tamura et al., (2000) J. Immunol. 164:1432-41；Zhang et al., (2005) Mol. Immunol.42(12):1445-1451；Hwang et al., Methods. (2005) 36(1):35-42；Dall’Acqua et al., (2005) Methods36(1):43-60；及Clark, (2000) Immunology Today21(8):397-402。
本發明之抗原結合分子亦可係完全人類單株抗體。完全人類單株抗體可藉由所屬技術領域中具有通常知識者熟悉的多種技術產生。此類方法包括但不限於人類周邊血液細胞（例如含有B淋巴球）之艾司坦-巴爾病毒(Epstein Barr Virus, EBV)轉形、人類B細胞之體外免疫、來自攜帶插入人類免疫球蛋白基因之經免疫基因轉殖小鼠之脾臟細胞的融合、自人類免疫球蛋白V區噬菌體庫單離、或所屬技術領域中已知且基於本文揭露之其他程序。
已開發出在非人類動物中產生人類單株抗體之程序。例如，已製備藉由各種手段使一或多種內源性免疫球蛋白基因去活化之小鼠。已將人類免疫球蛋白基因引入小鼠中以置換經去活化之小鼠基因。在此技術中，將人類重鏈及輕鏈基因座之元件引入衍生自胚胎幹細胞系之小鼠品系中，其含有內源性重鏈及輕鏈基因座之靶向破壞（亦參見Bruggemann et al., (1997) Curr. Opin. Biotechnol.8:455-58）。
用於產生及使用基因轉殖動物以產生人類或部分人類抗體之技術之實例係描述於美國專利第5,814,318號、第5,569,825號、及第5,545,806號；Davis et al., Antibody Engineering: Methods and Protocols, (Lo, ed) Humana Press, NJ, 191-200 (2003)；Kellermann et al., (2002) Curr Opin Biotechnol.13:593-97；Russel et al., (2000) Infect Immun.68:1820-26；Gallo et al., (2000) Eur J. Immun.30:534-40；Davis et al., (1999) Cancer Metastasis Rev. 18:421-25；Green, (1999) J Immunol Methods231:11-23；Jakobovits, (1998) Advanced Drug Delivery Reviews31:33-42；Green et al., (1998) J Exp Med. 188:483-95；Jakobovits, (1998) Exp. Opin. Invest. Drugs.7:607-14；Tsuda et al., (1997) Genomics,42:413-21；Mendez et al., (1997) Nat. Genet.15:146-56；Jakobovits, (1994) Curr Biol.4:761-63；Arbones et al., (1994) Immunity1:247-60；Green et al., (1994) Nat. Genet.7:13-21；Jakobovits et al., (1993) Nature362:255-58；Jakobovits et al., (1993) Proc Natl Acad Sci USA90:2551-55；Chen et al., (1993) Intl Immunol5:647-656；Choi et al., (1993) Nature Genetics4:117-23；Fishwild et al., (1996) Nature Biotechnology14:845-51；Lonberg et al., (1994) Nature368: 856-59；Lonberg, (1994) Handbook of Experimental Pharmacology113: 49-101；Neuberger, (1996) Nature Biotech14:826；Taylor et al., (1992) Nucleic Acids Research20:6287-95；Taylor et al., (1994) Intl Immunol6:579-91；Tomizuka et al., (1997) Nature Genetics16:133-43；Tomizuka et al., (2000) Proc Nat Acad Sci USA97:722-27；Tuaillon et al., (1993) Proc Nat Acad Sci USA90:3720-24；Tuaillon et al., (1994) J Immunol152:2912-20.；Lonberg et al., (1994) Nature368:856；Taylor et al., (1994) Intl Immunol6:579；美國專利第5,877,397號；Bruggemann et al., (1997) Curr. Opin. Biotechnol.8:455-58；Jakobovits et al., (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci.764:525-35。
用於獲得本發明之抗原結合分子的額外方法係藉由使用噬菌體展示，其為此目的已充分建立。參見例如Winter et al., (1994) Ann. Rev. Immunol.12:433-55；Burton et al., (1994) Adv. Immunol57:191-280。可在噬菌體載體中建立人類或鼠類免疫球蛋白可變區基因組合庫，噬菌體載體可經篩選以選擇結合scFv-14、以及包含此序列之分子、及呈現此類分子之細胞之Ig片段（Fab、Fv、sFv、或其多聚體）。參見例如美國專利第5,223,409號；Huse et al., (1989) Science246:1275-81；Sastry et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:5728-32；Alting-Mees et al., (1990) Strategies in Molecular Biology3:1-9；Kang et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA88:4363-66；Hoogenboom et al., (1992) J. Mol. Biol.227:381-388；Schlebusch et al., (1997) Hybridoma16:47-52及其中引用之參考文獻。例如，可將含有編碼Ig可變區片段之複數個多核苷酸序列之庫插入絲狀噬菌體（諸如M13或λ噬菌體）之基因體（λImmunoZap™(H)及λImmunoZap™(L)載體(Stratagene, La Jolla, Calif)亦可用於此方法中）或其變體中，其與編碼噬菌體外殼蛋白之序列同框(in frame)。
簡言之，mRNA係自B細胞群中單離，並用於在λImmunoZap™(H)及λImmunoZap™(L)及類似載體中建立重鏈及輕鏈免疫球蛋白cDNA表現庫。此等載體可經個別篩選或共表現以形成Fab片段或抗體。隨後可將陽性溶菌斑轉化成非裂解質體，其允許來自大腸桿菌之單株抗體片段之高水平表現。
在一個實施例中，在融合瘤中，使用核苷酸引子來擴增表現所關注單株抗體之基因之可變區。此等引子可由所屬技術領域中具有通常知識者合成，或可購自商業來源，其亦銷售用於小鼠及人類可變區之引子，包括用於V H、V L、C H、及C L區之引子等。此等引子可用以擴增重鏈或輕鏈可變區，接著可將其插入載體中。接著，可將此等載體引入大腸桿菌、酵母、或基於哺乳動物之系統中以進行表現。可使用此等方法產生大量含有V H域及V L域之融合物的單鏈蛋白質。
一旦已使用任何上述免疫及其他技術獲得產生本文所提供之抗原結合分子之細胞，特定抗體基因可根據如本文所述之標準程序藉由自其單離及擴增DNA或mRNA來選殖。可將由其產生之抗體定序，且可如先前所述操縱經識別之CDR及編碼CDR之DNA，以產生其他根據本發明之抗體。
所屬技術領域中具有通常知識者將理解，一些蛋白質（諸如抗體）可經歷各種轉譯後修飾。此等修飾之類型及程度常取決於用以表現蛋白質之宿主細胞系以及培養條件。此類修飾可包括醣基化、甲硫胺酸氧化、二酮哌 形成、天冬胺酸異構化、及天冬醯胺酸脫醯胺之變化。常見的修飾係由於羧肽酶之作用而損失羧基端鹼性殘基（諸如離胺酸或精胺酸）（如例如Harris, (1995) J Chromatog705:129-34中所述）。
用於產生鼠類單株抗體之替代方法係將融合瘤細胞注射至同基因小鼠之腹膜腔中，例如已經處理（例如經姥鮫烷初免(pristane-primed)）之小鼠以促進含有單株抗體之腹水形成。單株抗體可藉由各種充分建立的技術單離及純化。此類單離技術包括使用蛋白A Sepharose之親和層析法、粒徑篩析層析法、及離子交換層析法（參見例如Baines and Thorpe, (1992)之 Methods in Molecular Biology, 10:79-104 (The Humana Press)）。單株抗體可藉由親和層析法使用基於抗體特定性質選擇之適當配體（例如重鏈或輕鏈同型、結合特異性等）純化。固定於固體支撐物上之合適配體之實例包括蛋白A、蛋白G、抗恆定區（輕鏈或重鏈）抗體、及抗獨特型抗體。
儘管所揭示之抗原結合分子係在小鼠系統中產生，但人類、部分人類、或人源化抗體可適用於許多應用，特別是涉及向人類對象投予抗體之應用，其他類型的抗原結合分子將適用於某些應用。此類抗體可如本文所述製備並形成本揭露之一態樣。
本揭露提供抗原結合分子，其特異性結合至抗CD20 scFv-14結合域及其子序列、包含此序列之分子、及呈現此類分子之細胞。與本文所揭示之抗原結合分子交叉競爭的抗原結合分子形成本揭露之另一態樣。
在一些實施例中，特異性結合抗CD20 scFv-14結合域之抗體或抗原結合分子與本文所揭示之參考抗體結合相同或重疊表位。在某些實施例中，抗體或抗原結合分子與參考抗體結合相同或重疊表位。 IV. 抗原結合分子：對GALV gp70 蛋白具有特異性
本揭露係進一步關於抗原結合分子（包括抗體），其特異性結合GALV gp70蛋白、以及包含相同序列之分子、及呈現此類分子之細胞；及/或與一或多種本文所述之抗原結合分子交叉競爭者。重鏈抗原結合分子可包含如表7A、表7B、及表7C中所定義之一組獨特CDR序列，且係由表8A、表8B、及表8C中所闡述之提供的輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3序列例示。相關殖株可見於表9及表10中。在各種實施例中，抗原結合分子之scFv形式可包括重鏈結合分子，其係藉由連接子胺基酸序列（例如「Whitlow」連接子）接合至輕鏈結合分子。連接子序列之實例係描述於本文中。
在各種實施例中，本文所述之抗原結合分子可用於一或多種方法（例如本文及所屬技術領域所述之方法）中。
在各種實施例中，抗原結合分子可包含一或多個CDR。在各種實施例中，抗原結合分子可包含一或多個構架區。在各種實施例中，抗原結合分子可包含間隔開且在四個構架區之間的三個CDR。
在各種實施例中，抗原結合分子可包含併入可變重鏈中之一或多個CDR。在各種實施例中，抗原結合分子可包含併入可變輕鏈中之一或多個CDR。在各種實施例中，抗原結合分子可包含藉由連接子連接至可變輕鏈之可變重鏈。
在各種實施例中，抗原結合分子可包含輕鏈。在各種實施例中，抗原結合分子可包含重鏈。在各種實施例中，抗原結合分子可包含藉由雙硫鍵聯連接之輕鏈及重鏈。在各種實施例中，抗原結合分子可包含藉由雙硫鍵聯連接至第二重鏈之第一重鏈。在各種實施例中，抗原結合分子可包含兩條輕鏈及兩條重鏈。
本揭露之經編碼之抗體或抗原結合分子可係單鏈或雙鏈的。在一些實施例中，抗體或抗原結合分子可係單鏈的。在某些實施例中，抗原結合分子可選自由下列所組成之群組：scFv、Fab、Fab’、Fv、F(ab’) 2、dAb、及其任何組合。在一個特定實施例中，抗體或抗原結合分子可包含scFv。
在某些實施例中，諸如抗體之抗原結合分子可包含單鏈，其中重鏈可變區及輕鏈可變區可藉由連接子連接。在一些實施例中，V H可位於連接子之N端，且V L可位於連接子之C端。在其他實施例中，V L可位於連接子之N端，且V H可位於連接子之C端。 表7A：GALV gp70重鏈抗原結合分子CDR1、CDR2、及CDR3胺基酸序列（Chothia格式）。
殖株ID # SEQ_aa_CDRH1 SEQ_aa_CDRH2 SEQ_aa_CDRH3
9G11 GYTFTNY (SEQ ID NO: 127) YPSDSE (SEQ ID NO: 139) DYY
40A6 GFTFSSY (SEQ ID NO: 128) NSGGSY (SEQ ID NO: 140) HLIYYDYDGYYFDT (SEQ ID NO: 151)
40A3 DFSITSDY (SEQ ID NO: 129) HYSGG (SEQ ID NO: 141) YGSRDAVDY (SEQ ID NO: 152)
3C8 V2 GYTFTHY (SEQ ID NO: 130) YPSDGE (SEQ ID NO: 142) DYY
3C8 V1 GYTFTDY (SEQ ID NO: 131) TPNKGD (SEQ ID NO: 143) GKNYSGSSLHWYFDV (SEQ ID NO: 153)
36H3 GFTFSNY (SEQ ID NO: 132) SYSGAY (SEQ ID NO: 144) HVEYYDYDPYALDF (SEQ ID NO: 154)
35C11 GYTFTDY (SEQ ID NO: 133) STYSGK (SEQ ID NO: 145) GGLRDAMDY (SEQ ID NO: 155)
2D3 GYTFTNY (SEQ ID NO: 134) YPSDSE (SEQ ID NO: 146) DYY
13E7 GYTFTSH (SEQ ID NO: 135) DPNSGG (SEQ ID NO: 147) EGYEGYLGYFDF (SEQ ID NO: 156)
4F1 GYTFTSY (SEQ ID NO: 136) YPSDSE (SEQ ID NO: 148) DYY
9A1 GYTFTSY (SEQ ID NO: 137) YPSDSE (SEQ ID NO: 149) DYY
8G8 GYTFTNY (SEQ ID NO: 138) YPSDSE (SEQ ID NO: 150) DYY
表7B：GALV gp70重鏈抗原結合分子CDR1、CDR2、及CDR3胺基酸序列（Kabat格式）。
殖株ID # SEQ_aa_CDRH1 SEQ_aa_CDRH2 SEQ_aa_CDRH3
9G11 NYWMD (SEQ ID NO: 157) HIYPSDSETHYIQKFKD (SEQ ID NO: 169) DYY
40A6 SYVLS (SEQ ID NO: 158) TINSGGSYTYYPDSVKG (SEQ ID NO: 170) HLIYYDYDGYYFDT (SEQ ID NO: 181)
40A3 SDYTWH (SEQ ID NO: 159) YIHYSGGTNYNPSLRS (SEQ ID NO: 171) YGSRDAVDY (SEQ ID NO: 182)
3C8 V2 HYWMD (SEQ ID NO: 160) HIYPSDGETHYNQKFRD (SEQ ID NO: 172) DYY
3C8 V1 DYYMN (SEQ ID NO: 161) DITPNKGDTNYNQKFKD (SEQ ID NO: 173) GKNYSGSSLHWYFDV (SEQ ID NO: 183)
36H3 NYGMS (SEQ ID NO: 162) TISYSGAYTYYPDSVKG (SEQ ID NO: 174) HVEYYDYDPYALDF (SEQ ID NO: 184)
35C11 DYTMH (SEQ ID NO: 163) LISTYSGKTNYNQKLKD (SEQ ID NO: 175) GGLRDAMDY (SEQ ID NO: 185)
2D3 NYWMD (SEQ ID NO: 164) NIYPSDSETHYNQKFRD (SEQ ID NO: 176) DYY
13E7 SHWIH (SEQ ID NO: 165) RIDPNSGGTKYNEKFKS (SEQ ID NO: 177) EGYEGYLGYFDF (SEQ ID NO: 186)
4F1 SYWMD (SEQ ID NO: 166) HIYPSDSETHYNQKFKD (SEQ ID NO: 178) DYY
9A1 SYWMD (SEQ ID NO: 167) NIYPSDSETHYNQKFKD (SEQ ID NO: 179) DYY
8G8 NYWMD (SEQ ID NO: 168) NIYPSDSETHYNQNFKD (SEQ ID NO: 180) DYY
表7C：GALV gp70重鏈抗原結合分子CDR1、CDR2、及CDR3胺基酸序列（IMGT格式）。
殖株ID # SEQ_aa_CDRH1 SEQ_aa_CDRH2 SEQ_aa_CDRH3
9G11 GYTFTNYW (SEQ ID NO: 187) IYPSDSET (SEQ ID NO: 199) ARDYY (SEQ ID NO: 211)
40A6 GFTFSSYV (SEQ ID NO: 188) INSGGSYT (SEQ ID NO: 200) ARHLIYYDYDGYYFDT (SEQ ID NO: 212)
40A3 DFSITSDYT (SEQ ID NO: 189) IHYSGGT (SEQ ID NO: 201) LYYGSRDAVDY (SEQ ID NO: 213)
3C8 V2 GYTFTHYW (SEQ ID NO: 190) IYPSDGET (SEQ ID NO: 202) ARDYY (SEQ ID NO: 214)
3C8 V1 GYTFTDYY (SEQ ID NO: 191) ITPNKGDT (SEQ ID NO: 203) ARGKNYSGSSLHWYFDV (SEQ ID NO: 215)
36H3 GFTFSNYG (SEQ ID NO: 192) ISYSGAYT (SEQ ID NO: 204) SRHVEYYDYDPYALDF (SEQ ID NO: 216)
35C11 GYTFTDYT (SEQ ID NO: 193) ISTYSGKT (SEQ ID NO: 205) ARGGLRDAMDY (SEQ ID NO: 217)
2D3 GYTFTNYW (SEQ ID NO: 194) IYPSDSET (SEQ ID NO: 206) ARDYY (SEQ ID NO: 218)
13E7 GYTFTSHW (SEQ ID NO: 195) IDPNSGGT (SEQ ID NO: 207) AREGYEGYLGYFDF (SEQ ID NO: 219)
4F1 GYTFTSYW (SEQ ID NO: 196) IYPSDSET (SEQ ID NO: 208) ARDYY (SEQ ID NO: 220)
9A1 GYTFTSYW (SEQ ID NO: 197) IYPSDSET (SEQ ID NO: 209) ARDYY (SEQ ID NO: 221)
8G8 GYTFTNYW (SEQ ID NO: 198) IYPSDSET (SEQ ID NO: 210) ARDYY (SEQ ID NO: 222)
表8A：GALV gp70輕鏈抗原結合分子CDR1、CDR2、及CDR3序列（Chothia格式）。
殖株ID # SEQ_aa_CDRL1 SEQ_aa_CDRL2 SEQ_aa_CDRL3
13E7 RASKNISKYLA (SEQ ID NO: 223) SGSTLQS (SEQ ID NO: 233) QQHYEYPYT (SEQ ID NO: 243)
2D3 RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 224) GTNNRAL (SEQ ID NO: 234) ALWYSNHLV (SEQ ID NO: 244)
35C11 RASESVDSYGNSFMH (SEQ ID NO: 225) RASNLES (SEQ ID NO: 235) LQSNEDPRT (SEQ ID NO: 245)
36H3 STSSSVTYMH (SEQ ID NO: 226) DTSKLAS (SEQ ID NO: 236) QQWSSSPYT (SEQ ID NO: 246)
3C8 RSNTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 227) GTNNRVP (SEQ ID NO: 237) ALWYSNHWV (SEQ ID NO: 247)
40A6 RSSQTLVHSNGNIYLH (SEQ ID NO: 228) KVSNRFS (SEQ ID NO: 238) SQTTHVPPT (SEQ ID NO: 248)
4F1 RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 229) GTNNRAP (SEQ ID NO: 239) ALWYSNHLV (SEQ ID NO: 249)
8G8 RSSTGAVTRSNYAN (SEQ ID NO: 230) GTNNRAL (SEQ ID NO: 240) ALWYSNHLV (SEQ ID NO: 250)
9A1 RSSTGAVTRSNYAN (SEQ ID NO: 231) GTNNRAP (SEQ ID NO: 241) ALWYSNHLV (SEQ ID NO: 251)
9G11 RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 232) GTNNRAP (SEQ ID NO: 242) ALWYSSQLV (SEQ ID NO: 252)
表8B：GALV gp70輕鏈抗原結合分子CDR1、CDR2、及CDR3序列（Kabat格式）。
殖株ID # SEQ_aa_CDRL1 SEQ_aa_CDRL2 SEQ_aa_CDRL3
13E7 RASKNISKYLA (SEQ ID NO: 253) SGSTLQS (SEQ ID NO: 263) QQHYEYPYT (SEQ ID NO: 273)
2D3 RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 254) GTNNRAL (SEQ ID NO: 264) ALWYSNHLV (SEQ ID NO: 274)
35C11 RASESVDSYGNSFMH (SEQ ID NO: 255) RASNLES (SEQ ID NO: 265) LQSNEDPRT (SEQ ID NO: 275)
36H3 STSSSVTYMH (SEQ ID NO: 256) DTSKLAS (SEQ ID NO: 266) QQWSSSPYT (SEQ ID NO: 276)
3C8 RSNTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 257) GTNNRVP (SEQ ID NO: 267) ALWYSNHWV (SEQ ID NO: 277)
40A6 RSSQTLVHSNGNIYLH (SEQ ID NO: 258) KVSNRFS (SEQ ID NO: 268) SQTTHVPPT (SEQ ID NO: 278)
4F1 RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 259) GTNNRAP (SEQ ID NO: 269) ALWYSNHLV (SEQ ID NO: 279)
8G8 RSSTGAVTRSNYAN (SEQ ID NO: 260) GTNNRAL (SEQ ID NO: 270) ALWYSNHLV (SEQ ID NO: 280)
9A1 RSSTGAVTRSNYAN (SEQ ID NO: 261) GTNNRAP (SEQ ID NO: 271) ALWYSNHLV (SEQ ID NO: 281)
9G11 RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 262) GTNNRAP (SEQ ID NO: 272) ALWYSSQLV (SEQ ID NO: 282)
表8C：GALV gp70輕鏈抗原結合分子CDR1、CDR2、及CDR3序列（IMGT格式）。
殖株ID # SEQ_aa_CDRL1 SEQ_aa_CDRL2 SEQ_aa_CDRL3
13E7 KNISKY (SEQ ID NO: 283) SGS QQHYEYPYT (SEQ ID NO: 293)
2D3 TGAVTTSNY (SEQ ID NO: 284) GTN ALWYSNHLV (SEQ ID NO: 294)
35C11 ESVDSYGNSF (SEQ ID NO: 285) RAS LQSNEDPRT (SEQ ID NO: 295)
36H3 SSVTY (SEQ ID NO: 286) DTS QQWSSSPYT (SEQ ID NO: 296)
3C8 TGAVTTSNY (SEQ ID NO: 287) GTN ALWYSNHWV (SEQ ID NO: 297)
40A6 QTLVHSNGNIY (SEQ ID NO: 288) KVS SQTTHVPPT (SEQ ID NO: 298)
4F1 TGAVTTSNY (SEQ ID NO: 289) GTN ALWYSNHLV (SEQ ID NO: 299)
8G8 TGAVTRSNY (SEQ ID NO: 290) GTN ALWYSNHLV (SEQ ID NO: 300)
9A1 TGAVTRSNY (SEQ ID NO: 291) GTN ALWYSNHLV (SEQ ID NO: 301)
9G11 TGAVTTSNY (SEQ ID NO: 292) GTN ALWYSSQLV (SEQ ID NO: 302)
表9：GALV gp70重鏈抗原結合分子可變域胺基酸序列。
殖株ID # 胺基酸序列 SEQ ID NO.
9G11 QVQLQQPGAELVRPGSSVKLSCKASGYTFTNYWMDWVKQRPGQGLEWIGHIYPSDSETHYIQKFKDKATLTVDKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARDYYWGQGTTLTVSS 303
40A6 EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYVLSWVRQIPEKRLEWVATINSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAIYYCARHLIYYDYDGYYFDTWGQGTSLTVSS 304
40A3 DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTDFSITSDYTWHWVRQFPGNKLEWMAYIHYSGGTNYNPSLRSRISITRDTSKNQFFLHMNSVTTEDTATYYCLYYGSRDAVDYWGQGTSVTVSS 305
3C8 V2 QVQLQQPGAELVRPGSSVKLSCKASGYTFTHYWMDWVKQRPGQGLEWIGHIYPSDGETHYNQKFRDKATLTVDKSSSTAYVQLSSLTSEDSAVYYCARDYYWGQGTTLTVSS 306
3C8 V1 EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDITPNKGDTNYNQKFKDRATLTVDKSSNTAYMELRSLTSEDSSVYYCARGKNYSGSSLHWYFDVWGTGTTVTVSS 307
36H3 EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSNYGMSWVRQTPDKRLEWVATISYSGAYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMGSLKSEDTAMFFCSRHVEYYDYDPYALDFWGQATSVTVSS 308
35C11 QVQLQQSGPELVRPGVSVKISCKVSGYTFTDYTMHWVKQSHAKSLEWIGLISTYSGKTNYNQKLKDKATMTVDKSSSTAYMELARLTSEDSAIFYCARGGLRDAMDYWGQGTSVTVSS 309
2D3 QVQLQQPGAELVRPGSSVKLSCKASGYTFTNYWMDWVKQRPGQGLEWIGNIYPSDSETHYNQKFRDKATLTVDKPSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARDYYWGQGTTLTVSS 310
13E7 QVQLQQPGAEFVKPGASVKLSCEASGYTFTSHWIHWVKQRPGRGLDWIGRIDPNSGGTKYNEKFKSKATLTVDKPSSTAYMQLSSLTSEDPAVHYCAREGYEGYLGYFDFWGQGTTLTVSS 311
4F1 QVQLQQPGAELVRPGSSVKLSCKASGYTFTSYWMDWMKQRPGQGLEWIGHIYPSDSETHYNQKFKDRATLTVDKSSSAAFMQLSSLTSEDSAVYYCARDYYWGQGTTLTVSS 312
9A1 QVQLQQPGAELVRPGSSVRLSCKASGYTFTSYWMDWVKQRPGQGLEWIGNIYPSDSETHYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARDYYWGQGTTLTVSS 313
8G8 QVQLQQPGAELVRPGSSVKLSCKASGYTFTNYWMDWVKQRPGQGLEWIGNIYPSDSETHYNQNFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARDYYWGQGTTLTVSS 314
表10：GALV gp70輕鏈抗原結合分子可變域胺基酸序列。
殖株ID # 胺基酸序列 SEQ ID NO.
13E7 DVQITQSPSYLAASPGETITINCRASKNISKYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGNPSRFSASGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHYEYPYTFGGGTKLEIKLEIK 315
2D3 QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRALGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQIEDEAIYFCALWYSNHLVFGGGTKLTVLQPK 316
35C11 DIVLTQSPASLAVSLGQGATISCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLTINPVEADDVATYYCLQSNEDPRTFGGGTKLEIK 317
36H3 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSTSSSVTYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSSPYTFGGGTKLEIK 318
3C8 QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSNTGAVTTSNYANWVQERPDHLFTGLIGGTNNRVPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLQPK 319
40A6 DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQTLVHSNGNIYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGIYFCSQTTHVPPTFGGGTKLEIK 320
4F1 QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHLVFGGGTKLTVLQPK 321
8G8 QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTRSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRALGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHLVFGGGTKLTVLQPK 322
9A1 QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTRSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHLVFGGGTKLTVLQPK 323
9G11 QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSSQLVFGGGTKLTVLQPK 324
表11 GALV gp70結合抗體殖株。
抗體 重鏈殖株 輕鏈殖株
1 13E7-HC 13E7-LC
2 2D3-HC1 2D3-LC1
3 35C11-HC 35C11-LC
4 36H3-HC1 36H3-LC
5 3C8-HC1 3C8-LC
6 3C8-HC2 3C8-LC
7 40A3-HC 36H3-LC
8 40A6-HC 40A6-LC
9 4F1-HC 4F1-LC1
10 8G8-HC2 8G8-LC2
11 9A1-HC3 9A1-LC1
12 9G11-HC 9G11-LC
在一個實施例中，本揭露之抗原結合分子係抗體及其抗原結合片段。在某些實施例中，本揭露之抗體包含至少一個表7A至表7C及表8A至表8C中所闡述之CDR。在某些實施例中，本揭露之抗體包含至少一個表9中之重鏈可變區。在某些實施例中，本揭露之抗體包含至少一個表10中之輕鏈可變區。在某些實施例中，本揭露之抗體包含如表11中所示之重鏈可變區及輕鏈可變區之組合。在另一態樣中，本揭露提供能夠產生本文所揭示之抗體的融合瘤、及如本文所述及所屬技術領域中已知的由融合瘤產生抗體之方法。
人源化抗體係描述於本文中且可藉由已知技術製備。在一個實施例中，人源化單株抗體包含鼠類或兔抗體之可變域（或其抗原結合位點之全部或一部分）及衍生自人類抗體之恆定域。替代地，人源化抗體片段可包含鼠類或兔單株抗體之抗原結合位點及衍生自人類抗體之可變域片段（缺乏抗原結合位點）。用於產生經工程改造之單株抗體之程序包括Riechmann et al., (1988) Nature332:323、Liu et al., (1987) Proc. Nat. Acad. Sci. USA84:3439、Larrick et al., (1989) Bio/Technology7:934、及Winter et al., (1993) TIPS14:139中所述者。在一個實施例中，嵌合抗體係CDR移植抗體。用於將抗體人源化之技術係描述於例如美國專利第5,869,619號；第5225539號；第5821337號；第5859205號；第6881557號；Padlan et al., (1995) FASEB J.9:133-39；Tamura et al., (2000) J. Immunol. 164:1432-41；Zhang et al., (2005) Mol. Immunol.42(12):1445-1451；Hwang et al., Methods. (2005) 36(1):35-42；Dall’Acqua et al., (2005) Methods36(1):43-60；及Clark, (2000) Immunology Today21(8):397-402。
本發明之抗原結合分子亦可係完全人類單株抗體。完全人類單株抗體可藉由所屬技術領域中具有通常知識者熟悉的多種技術產生。此類方法包括但不限於人類周邊血液細胞（例如含有B淋巴球）之艾司坦-巴爾病毒(Epstein Barr Virus, EBV)轉形、人類B細胞之體外免疫、來自攜帶插入人類免疫球蛋白基因之經免疫基因轉殖小鼠之脾臟細胞的融合、自人類免疫球蛋白V區噬菌體庫單離、或所屬技術領域中已知且基於本文揭露之其他程序。
已開發出在非人類動物中產生人類單株抗體之程序。例如，已製備藉由各種手段使一或多種內源性免疫球蛋白基因去活化之小鼠。已將人類免疫球蛋白基因引入小鼠中以置換經去活化之小鼠基因。在此技術中，將人類重鏈及輕鏈基因座之元件引入衍生自胚胎幹細胞系之小鼠品系中，其含有內源性重鏈及輕鏈基因座之靶向破壞（亦參見Bruggemann et al., (1997) Curr. Opin. Biotechnol.8:455-58）。
用於產生及使用基因轉殖動物以產生人類或部分人類抗體之技術之實例係描述於美國專利第5,814,318號、第5,569,825號、及第5,545,806號；Davis et al., Antibody Engineering: Methods and Protocols, (Lo, ed) Humana Press, NJ, 191-200 (2003)；Kellermann et al., (2002) Curr Opin Biotechnol.13:593-97；Russel et al., (2000) Infect Immun.68:1820-26；Gallo et al., (2000) Eur J. Immun.30:534-40；Davis et al., (1999) Cancer Metastasis Rev. 18:421-25；Green, (1999) J Immunol Methods231:11-23；Jakobovits, (1998) Advanced Drug Delivery Reviews31:33-42；Green et al., (1998) J Exp Med. 188:483-95；Jakobovits, (1998) Exp. Opin. Invest. Drugs.7:607-14；Tsuda et al., (1997) Genomics,42:413-21；Mendez et al., (1997) Nat. Genet.15:146-56；Jakobovits, (1994) Curr Biol.4:761-63；Arbones et al., (1994) Immunity1:247-60；Green et al., (1994) Nat. Genet.7:13-21；Jakobovits et al., (1993) Nature362:255-58；Jakobovits et al., (1993) Proc Natl Acad Sci USA90:2551-55；Chen et al., (1993) Intl Immunol5:647-656；Choi et al., (1993) Nature Genetics4:117-23；Fishwild et al., (1996) Nature Biotechnology14:845-51；Lonberg et al., (1994) Nature368: 856-59；Lonberg, (1994) Handbook of Experimental Pharmacology113: 49-101；Neuberger, (1996) Nature Biotech14:826；Taylor et al., (1992) Nucleic Acids Research20:6287-95；Taylor et al., (1994) Intl Immunol6:579-91；Tomizuka et al., (1997) Nature Genetics16:133-43；Tomizuka et al., (2000) Proc Nat Acad Sci USA97:722-27；Tuaillon et al., (1993) Proc Nat Acad Sci USA90:3720-24；Tuaillon et al., (1994) J Immunol152:2912-20.；Lonberg et al., (1994) Nature368:856；Taylor et al., (1994) Intl Immunol6:579；美國專利第5,877,397號；Bruggemann et al., (1997) Curr. Opin. Biotechnol.8:455-58；Jakobovits et al., (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci.764:525-35。
用於獲得本發明之抗原結合分子的額外方法係藉由使用噬菌體展示，其為此目的已充分建立。參見例如Winter et al., (1994) Ann. Rev. Immunol.12:433-55；Burton et al., (1994) Adv. Immunol57:191-280。可在噬菌體載體中建立人類或鼠類免疫球蛋白可變區基因組合庫，噬菌體載體可經篩選以選擇結合scFv-14、以及包含此序列之分子、及呈現此類分子之細胞之Ig片段（Fab、Fv、sFv、或其多聚體）。參見例如美國專利第5,223,409號；Huse et al., (1989) Science246:1275-81；Sastry et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:5728-32；Alting-Mees et al., (1990) Strategies in Molecular Biology3:1-9；Kang et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA88:4363-66；Hoogenboom et al., (1992) J. Mol. Biol.227:381-388；Schlebusch et al., (1997) Hybridoma16:47-52及其中引用之參考文獻。例如，可將含有編碼Ig可變區片段之複數個多核苷酸序列之庫插入絲狀噬菌體（諸如M13或λ噬菌體）之基因體（λImmunoZap™(H)及λImmunoZap™(L)載體(Stratagene, La Jolla, Calif)亦可用於此方法中）或其變體中，其與編碼噬菌體外殼蛋白之序列同框(in frame)。
簡言之，mRNA係自B細胞群中單離，並用於在λImmunoZap™(H)及λImmunoZap™(L)及類似載體中建立重鏈及輕鏈免疫球蛋白cDNA表現庫。此等載體可經個別篩選或共表現以形成Fab片段或抗體。隨後可將陽性溶菌斑轉化成非裂解質體，其允許來自大腸桿菌之單株抗體片段之高水平表現。
在一個實施例中，在融合瘤中，使用核苷酸引子來擴增表現所關注單株抗體之基因之可變區。此等引子可由所屬技術領域中具有通常知識者合成，或可購自商業來源，其亦銷售用於小鼠及人類可變區之引子，包括用於V H、V L、C H、及C L區之引子等。此等引子可用以擴增重鏈或輕鏈可變區，接著可將其插入載體中。接著，可將此等載體引入大腸桿菌、酵母、或基於哺乳動物之系統中以進行表現。可使用此等方法產生大量含有V H域及V L域之融合物的單鏈蛋白質。
一旦已使用任何上述免疫及其他技術獲得產生本文所提供之抗原結合分子之細胞，特定抗體基因可根據如本文所述之標準程序藉由自其單離及擴增DNA或mRNA來選殖。可將由其產生之抗體定序，且可如先前所述操縱經識別之CDR及編碼CDR之DNA，以產生其他根據本發明之抗體。
所屬技術領域中具有通常知識者將理解，一些蛋白質（諸如抗體）可經歷各種轉譯後修飾。此等修飾之類型及程度常取決於用以表現蛋白質之宿主細胞系以及培養條件。此類修飾可包括醣基化、甲硫胺酸氧化、二酮哌 形成、天冬胺酸異構化、及天冬醯胺酸脫醯胺之變化。常見的修飾係由於羧肽酶之作用而損失羧基端鹼性殘基（諸如離胺酸或精胺酸）（如例如Harris, (1995) J Chromatog705:129-34中所述）。
用於產生鼠類單株抗體之替代方法係將融合瘤細胞注射至同基因小鼠之腹膜腔中，例如已經處理（例如經姥鮫烷初免(pristane-primed)）之小鼠以促進含有單株抗體之腹水形成。單株抗體可藉由各種充分建立的技術單離及純化。此類單離技術包括使用蛋白A Sepharose之親和層析法、粒徑篩析層析法、及離子交換層析法（參見例如Baines and Thorpe, (1992)之 Methods in Molecular Biology, 10:79-104 (The Humana Press)）。單株抗體可藉由親和層析法使用基於抗體特定性質選擇之適當配體（例如重鏈或輕鏈同型、結合特異性等）純化。固定於固體支撐物上之合適配體之實例包括蛋白A、蛋白G、抗恆定區（輕鏈或重鏈）抗體、及抗獨特型抗體。
儘管所揭示之抗原結合分子係在小鼠系統中產生，但人類、部分人類、或人源化抗體可適用於許多應用，特別是涉及向人類對象投予抗體之應用，其他類型的抗原結合分子將適用於某些應用。此類抗體可如本文所述製備並形成本揭露之一態樣。
本揭露提供抗原結合分子，其特異性結合至GALV gp70蛋白及其子序列、包含此序列之分子、及呈現此類分子之細胞。與本文所揭示之抗原結合分子交叉競爭的抗原結合分子形成本揭露之另一態樣。
在一些實施例中，特異性結合GALV gp70蛋白結合域之抗體或抗原結合分子與本文所揭示之參考抗體結合相同或重疊表位。在某些實施例中，抗體或抗原結合分子與參考抗體結合相同或重疊表位。 a) 抗體
抗體(Ab)可包括但不限於特異性結合至抗原之醣蛋白免疫球蛋白。大致上，抗體可至少包含兩條重鏈(HC)及兩條輕鏈(LC)且可藉由雙硫鍵互連；或抗原結合分子。各HC鏈包含重鏈可變區(V H)及重鏈恆定區(CH)。重鏈恆定區可包含三個恆定域CH1、CH2、及CH3。各LC鏈可包含輕鏈可變區(V L)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區可包含一個恆定域CL。V H區及V L區可進一步細分成稱為互補決定區(CDR)之高度變異區，其中散布稱為架構區(FR)之更具保守性的區。各VH及VL包含三個CDR及四個FR，其等自胺基端至羧基端以下列順序排列：各VH及VL包含三個CDR及四個FR，其等自胺基端至羧基端以下列順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原交互作用之結合域。Ab之恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子之結合，包括免疫系統之各種細胞（例如效應細胞）及經典補體系統之第一組分(C1q)。
在一些實施例中，本發明之抗原結合分子特異性結合至scFv-14之至少一部分、包含相同或相關序列之分子、及呈現此類分子之細胞。在某些實施例中，本揭露之抗原結合分子特異性結合至scFv-14之至少一部分、以及包含相同或類似序列之分子、及呈現此類分子之細胞，其中K D係小於1 x 10 -6M、小於1 x 10 -7M、小於1 x 10 -8M、或小於1 x 10 -9M。在一個特定實施例中，抗原結合分子特異性結合至scFv-14之至少一部分、以及包含此等序列之分子、及呈現此類分子之細胞，其中K D係小於1 x 10 -7M。在另一實施例中，抗原結合分子特異性結合scFv-14、以及具有相同或類似序列之分子、及呈現此類分子之細胞，其中K D係小於1 x 10 -8M。在一些實施例中，抗原結合分子結合scFv-14、以及包含相同或類似序列之分子、及呈現此類分子之細胞，其中K D係約1 x 10 -7M、約2 x 10 -7M、約3 x 10 -7M、約4 x 10 -7M、約5 x 10 -7M、約6 x 10 -7M、約7 x 10 -7M、約8 x 10 -7M、約9 x 10 -7M、約1 x 10 -8M、約2 x 10 -8M、約3 x 10 -8M、約4 x 10 -8M、約5 x 10 -8M、約6 x 10 -8M、約7 x 10 -8M、約8 x 10 -8M、約9 x 10 -8M、約1 x 10 -9M、約2 x 10 -9M、約3 x 10 -9M、約4 x 10 -9M、約5 x 10 -9M、約6 x 10 -9M、約7 x 10 -9M、約8 x 10 -9M、約9 x 10 -9M、約1 x 10 -10M、或約5 x 10 -10M。K D可使用如本文及所屬技術領域別處所述之標準方法計算。
在特定實施例中，本揭露之抗原結合分子係在表3至表4中識別，且各包含該等表中所述之經識別之重鏈及輕鏈胺基酸序列。 b) ScFv
在各種實施例中，scFv可係包含免疫球蛋白或類似物之V H及V L的融合蛋白。在各種實施例中，VH及VL可藉由連接子連接。在各種實施例中，VH及VL可藉由連接子連接。在各種實施例中，scFv不包括通常存在於抗體中之恆定區。
在各種實施例中，scFv促進噬菌體展示，其中方便將抗原結合域表現為單一肽。在其他實施例中，scFv可直接自衍生自融合瘤之經次選殖(subcloned)之重鏈及輕鏈產生。ScFv可用於各種不同目的。在各種實施例中，scFv可併入流式細胞術及免疫組織化學診斷檢定中。在其他實施例中，scFvs可用作人工T細胞受體（嵌合抗原受體）之抗原結合域。 c) 連接子
當連接子序列用於生物技術及生物治療性應用時可係基於肽的，且可用於一系列科學相關之應用。例如，連接子可簡單地用作間隔子部份，以賦予較大分子所欲的結構及/或功能性質。在另一實例中，連接子可賦予較大分子極少結構或功能性質或不賦予，但可簡單地用作獨特識別較大分子之區別特徵（例如「標記(marker)」、或「生物標記(biomarker)」、或「標籤(tag)」）。在又另一實例中，連接子可用以賦予可識別特徵，其可作為針對包含連接子序列之較大分子之抗體的結合位點。
在各種實施例中，連接子可包含形成肽之胺基酸序列。例如，連接子可包含約20至約30個胺基酸之間的肽序列。在一些實施例中，連接子可包含約25個胺基酸之肽序列。在一些實施例中，連接子包含至少約5、至少約8、至少約10、至少約13、至少約15、至少約18、至少約20、至少約25、至少約30、至少約35、至少約40、至少約45、至少約50、至少約60、至少約70、至少約80、至少約90、或至少約100個胺基酸。在一些實施例中，連接子包含約8個胺基酸與約18個胺基酸之間（例如10個胺基酸）。
在各種實施例中，連接子可包含可撓性部分。例如，可撓性部分可富含甘胺酸殘基。在各種實施例中，連接子可係可溶的或部分可溶的。例如，連接子可包含一或多個絲胺酸及/或蘇胺酸殘基。在各種實施例中，連接子可將V H之N端與V L之C端連接。在其他實施例中，連接子可將VH之C端與VL之N端連接。在其他實施例中，連接子可將VH之C端與VL之N端連接。
當連接子序列係用作較大分子之區別、可偵測、或可識別特徵時，特異性結合連接子序列（排除存在於較大分子中之其他序列）之抗體，該抗體可作為偵測劑。此類抗體可用在某些條件下可偵測之部份標示。此類抗體之額外應用包括：包含連接子之分子之純化及單離、分子在特定環境下之表徵、包含及/或呈現連接子之分子群體之濃度的富集、以及治療性應用。
1993年，Whitlow等人揭示一種合成連接子肽，其包含胺基酸序列GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 121) (Whitlow et al., (1993) Prot.Eng.6(8):989-95)。所揭示之肽係作為scFv之組分進行研究，且經設計以移除在先前的連接子肽中所識別之蛋白水解位點。Whitlow等人的結論是，當相較於其序列所基於之現有連接子肽時，此新設計之合成連接子肽在體外對蛋白水解更穩定，且相較於相同的現有連接子，亦顯示出較少聚集。Whitlow等人未揭示針對其第二代連接子肽之任何抗原結合分子。
在各種實施例中，「Whitlow」連接子序列可包括在本文所述之scFv抗原結合分子中。在各種實施例中，連接子序列可包括在亦包括重鏈胺基酸序列及輕鏈胺基酸序列之較大胺基酸序列中。
所屬技術領域中具有各種可能合適的其他可用連接子。一個實例係具有以下序列之「G4S連接子」：(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 (SEQ ID NO: 126)。在各種實施例中，連接子可包括SEQ ID NO: 126及1或多個額外Gly殘基。在各種實施例中，連接子可包括SEQ ID NO: 126及1或更少個Gly殘基。連接子之長度可基於Gly殘基之數目而有所變化。 V. 編碼抗體及抗原結合分子之多核苷酸 抗CD20 scFv-14 結合分子
在各種實施例中，多核苷酸可編碼抗原結合分子（SEQ ID NO: 1至120）。在各種實施例中，多核苷酸可編碼抗原結合分子（SEQ ID NO: 1至10）。在各種實施例中，多核苷酸可編碼抗原結合分子（SEQ ID NO: 11至20）。
在一些實施例中，本發明之多核苷酸編碼抗原結合分子，其中抗原結合分子包含與選自由SEQ ID NO: 1至10所組成之群組的重鏈可變區胺基酸序列至少約75%、至少約85%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%同一之重鏈可變區胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明之多核苷酸編碼抗原結合分子，其中抗原結合分子包含與選自由SEQ ID NO: 11至20所組成之群組的輕鏈可變區胺基酸序列至少約75%、至少約85%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%同一之輕鏈可變區胺基酸序列。
如所屬技術領域中具有通常知識者將理解，由於遺傳密碼之簡併性(degeneracy)，所揭示之多核苷酸序列可能發生變化。因此，所揭示之多核苷酸序列之此類變體形成本揭露之一態樣。 GALV gp70 結合分子
在各種實施例中，多核苷酸可編碼抗原結合分子（SEQ ID NO: 127至324）。在各種實施例中，多核苷酸可編碼抗原結合分子（SEQ ID NO: 303至314）。在各種實施例中，多核苷酸可編碼抗原結合分子（SEQ ID NO: 315至324）。
在一些實施例中，本發明之多核苷酸編碼抗原結合分子，其中抗原結合分子包含與選自由SEQ ID NO: 303至314所組成之群組的重鏈可變區胺基酸序列至少約75%、至少約85%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%同一之重鏈可變區胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明之多核苷酸編碼抗原結合分子，其中抗原結合分子包含與選自由SEQ ID NO: 315至324所組成之群組的輕鏈可變區胺基酸序列至少約75%、至少約85%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%同一之輕鏈可變區胺基酸序列。
如所屬技術領域中具有通常知識者將理解，由於遺傳密碼之簡併性(degeneracy)，所揭示之多核苷酸序列可能發生變化。因此，所揭示之多核苷酸序列之此類變體形成本揭露之一態樣。 表12：GALV gp70重鏈抗原結合分子可變域核酸序列。
殖株ID # 代表性核酸序列 SEQ ID NO.
9G11 CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTGGATGGATTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAATGGATTGGTCACATTTACCCTTCTGATAGTGAAACTCACTACATTCAAAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCCTCCAACACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGATTACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA 347
40A6 GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGTTATGTCCTGTCTTGGGTTCGCCAGATTCCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAATAGTGGTGGTAGTTACACTTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGTCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATATATTACTGTGCACGACATCTCATCTACTATGATTACGACGGTTACTACTTTGACACCTGGGGCCAAGGCACCTCTCTCACAGTCTCCTCA 326
40A3 GATGTGCAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGACCTAGTGAAACCTTCTCAGTCGCTTTCACTCACCTGCACTGTCACTGACTTCTCCATCACCAGTGATTATACCTGGCACTGGGTCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAATGGATGGCCTACATACACTACAGTGGTGGCACTAACTACAATCCATCTCTCAGAAGTCGAATCTCTATCACTCGAGACACATCCAAGAACCAGTTCTTCCTGCATATGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCCACATATTACTGTCTTTACTACGGTAGTAGAGATGCTGTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA 327
3C8 V2 CAGGTCCAACTACAGCAACCTGGGGCTGAACTGGTGAGGCCTGGGTCTTCAGTGAAACTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCCACTACTGGATGGATTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAATGGATTGGTCACATTTACCCTTCTGATGGTGAAACTCACTACAATCAAAAGTTCAGGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACGTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTGCAAGAGACTATTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA 328
3C8 V1 GAAGTCCAGCTGCARCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCTGTGAAGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACACGTTCACTGACTACTACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTACTCCTAACAAGGGTGATACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAGGGCCACATTGACTGTCGACAAGTCCTCCAACACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTTCAGTCTATTACTGTGCAAGAGGGAAAAATTACTCCGGTAGTAGCCTTCACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA 329
36H3 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGGCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGACAAGAGACTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTTATAGTGGTGCTTACACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGGGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTTTTTCTGTTCAAGACATGTTGAGTACTATGATTACGACCCTTATGCTTTGGACTTCTGGGGTCAAGCAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA 330
35C11 CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGCCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGTCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGTTTCCGGCTACACATTCACTGATTATACTATGCATTGGGTGAAGCAGAGTCATGCAAAGAGTCTAGAGTGGATTGGACTTATTAGCACTTACTCTGGTAAAACAAACTACAACCAGAAACTTAAGGACAAGGCCACAATGACTGTGGACAAATCCTCCAGCACAGCCTATATGGAACTTGCCAGATTGACATCTGAGGATTCTGCCATCTTTTACTGTGCAAGAGGGGGATTAAGGGATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA 331
2D3 CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCTTCAGTGAAACTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTGGATGGATTGGGTGAAACAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAATGGATTGGTAACATTTACCCTTCTGATAGTGAAACTCACTACAATCAAAAGTTCAGGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAACCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTGCAAGAGACTATTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA 332
13E7 CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGTTTGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGTGAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCCACTGGATACACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACGAGGCCTTGACTGGATTGGAAGGATTGATCCTAATAGTGGTGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAACCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACCCTGCGGTCCATTACTGTGCAAGAGAGGGCTATGAGGGTTACTTGGGTTACTTTGACTTCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTTTCCTCA 333
4F1 CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCTTCAGTGAAACTATCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGGATTGGATGAAACAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAATGGATTGGTCACATTTACCCTTCTGATAGTGAAACTCACTACAATCAAAAGTTCAAGGACAGGGCCACATTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCGCAGCCTTCATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGATTACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA 334
9A1 CAGGTCCAACTACAGCAACCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCTTCAGTGAGACTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGGATTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGCCTTGAATGGATTGGTAACATTTACCCTTCTGATAGTGAAACTCACTACAATCAAAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGACTACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA 335
8G8 CAGGTCCAACTACAGCAACCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCTTCAGTGAAACTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTGGATGGATTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGCCTTGAATGGATTGGTAACATTTACCCTTCTGATAGTGAAACTCACTACAATCAAAACTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGACTACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA 336
表13：GALV gp70輕鏈抗原結合分子可變域核酸序列。
殖株ID # 代表性核酸序列 SEQ ID NO.
13E7 GATGTCCAGATACTCCAGTCTCCATCTTATCTTGCTGCATCTCCTGGAGAAACCATTACTATTAATTGCAGGGCAAGTAAGAACATTAGCAAATATTTAGCCTGGTATCAAGAGAAACCTGGGAAAACTAATAAACTTCTTATCTACTCTGGATCCACTTTGCAATCTGGAAATCCATCAAGGTTCAGTGCCAGTGGATCTGGTACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAATGTATTACTGTCAACAGCATTATGAATACCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA 337
2D3 CAGGCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTATGCCAACTGGGTCCAAGAAAAACCAGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTACCAACAACCGAGCTCTAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGATTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCATTTGGTGTTCGGTGGAGGAACCAAACTGACTGTCCTA 338
35C11 GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGGGGGCCACCATATCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATAGTTATGGCAATAGTTTTATGCACTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCGTGCATCCAACCTAGAATCTGGGATCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCACCATTAATCCTGTGGAGGCTGATGATGTTGCAACCTATTACTGTCTGCAAAGTAATGAGGATCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA 339
36H3 CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTACCAGCTCAAGTGTAACTTATATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTAGCCCATACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA 340
3C8 CAGGCTGTTGTAACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACTTGTCGCTCAAATACTGGGGCTGTTACAACCAGTAACTATGCCAACTGGGTCCAAGAAAGACCAGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTACCAACAACCGAGTTCCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCATTGGGTGTTCGGTGGAGGAACCAAACTGACTGTCCTA 341
40A6 GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGACCCTTGTTCACAGTAATGGAAATATCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGACTGAGGATCTGGGAATTTATTTCTGCTCTCAAACCACACATGTTCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAACTGGAAATCAAA 342
4F1 CAGGCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTATGCCAACTGGGTCCAAGAAAAACCAGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTACCAACAACCGAGCTCCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCATTTGGTGTTCGGTGGAGGAACCAAACTGACTGTCCTA 343
8G8 CAGGCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAAGGAGTAACTATGCCAACTGGGTCCAAGAAAAACCAGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTACCAACAATCGAGCTCTAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCATTTGGTGTTCGGTGGGGGAACCAAACTGACTGTCCTA 344
9A1 CAGGCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAAGGAGTAACTATGCCAACTGGGTCCAAGAAAAACCAGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTACCAACAACCGAGCTCCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGCAACCATTTGGTGTTCGGTGGAGGAACCAAACTGACTGTCCTA 345
9G11 CAGGCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTATGCCAACTGGGTCCAAGAAAAACCAGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTACCAACAACCGAGCTCCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTGCTCTATGGTACAGTAGCCAATTGGTGTTCGGTGGAGGAACCAAACTGACTGTCCTA 346
VI. 載體、細胞、及醫藥組成物
在某些態樣中，本文提供載體，其包含本揭露之多核苷酸。在一些實施例中，本發明係關於一種載體或載體組，其包含編碼特異性結合抗CD20 scFv-14之抗體或抗原結合分子（SEQ ID NO: 1至120）之多核苷酸。在一些實施例中，本發明係關於一種載體或載體組，其包含編碼特異性結合GALV gp70之抗體或抗原結合分子（SEQ ID NO. 127至324）之多核苷酸。
所屬技術領域中已知的任何載體可適用於表現本揭露之抗體及抗原結合分子。在一些實施例中，載體係病毒載體。在一些實施例中，載體係反轉錄病毒載體、DNA載體、鼠類白血病病毒載體、SFG載體、質體、RNA載體、腺病毒載體、桿狀病毒載體、艾司坦-巴爾病毒載體、乳多泡病毒載體、牛痘病毒載體、單純疱疹病毒載體、腺病毒相關載體(AAV)、慢病毒載體、或其任何組合。
在其他態樣中，本文提供細胞，其包含本發明之多核苷酸或載體。在一些實施例中，本發明係關於細胞、體外細胞，其包含編碼抗原結合分子之多核苷酸，如本文所述。在一些實施例中，本發明係關於細胞（例如體外細胞），其包含編碼特異性結合至抗CD20 scFv-14或GALV gp70蛋白、包含此等序列之分子、及呈現此類分子之細胞之抗體或其抗原結合分子的多核苷酸，如本文所揭示。
任何細胞皆可用作編碼本發明之抗體及抗原結合分子之全部或片段的多核苷酸及載體之宿主細胞。在一些實施例中，宿主細胞可係原核細胞、真菌細胞、酵母細胞、或高等真核細胞，諸如哺乳動物細胞。合適的原核細胞包括但不限於真細菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如腸內菌科( Enterobacteriaceae)，諸如埃希氏菌屬( Escherichia)，例如大腸桿菌；桿菌綱( Bacilli)，諸如枯草桿菌( B. subtilis)及地衣芽孢桿菌( B. licheniformis)；假單孢菌屬( Pseudomonas)，諸如綠膿桿菌( P. aeruginosa)；及鏈黴菌屬( Streptomyces)。在一些實施例中，宿主細胞係哺乳動物細胞，諸如人類細胞。在一些實施例中，宿主細胞係CHO細胞，且在其他實施例中，宿主細胞係sP2/0或其他鼠類細胞。本發明之宿主細胞可透過所屬技術領域中已知的任何來源獲得。
本揭露之其他態樣可關於組成物，其包含本文所述之多核苷酸、本文所述之載體、本文所述之抗體、抗原結合分子、及/或本文所述之體外細胞。在一些實施例中，組成物包括醫藥上可接受之載劑、稀釋劑、助溶劑、乳化劑、防腐劑、及/或佐劑。在一些實施例中，組成物包含賦形劑。
在一個實施例中，組成物包含編碼特異性結合至抗CD20 scFV-14或GALV gp70蛋白、及包含此等序列之分子、及呈現此類分子之細胞之抗體或抗原結合分子的多核苷酸。在另一實施例中，組成物包含體外細胞，體外細胞包含編碼由本文所揭示之多核苷酸編碼之抗體或其抗原結合分子的多核苷酸。
在一些實施例中，組成物包含特異性結合至抗CD20 scFv-14或GALV gp70蛋白、及包含此等序列之分子、及呈現此類分子之細胞之超過一種不同的抗體或抗原結合分子。在一些實施例中，組成物包括特異性結合至抗CD20 scFv-14或GALV gp70蛋白、及包含此等序列之分子、及呈現此類分子之細胞之超過一種抗體或抗原結合分子，其中抗體或抗原結合分子結合超過一個表位。在一些實施例中，抗體或抗原結合分子將不會彼此競爭與該表位之結合。在一些實施例中，二或更多種本文所提供之抗體或抗原結合分子係在醫藥組成物中組合在一起。較佳地，此類組成物適用於向對象投予，包括人類。 VII. 例示性方法
以下章節描述使用本文所揭示之抗原結合分子之各種例示性方法。任何本文所揭示之抗原結合分子及其片段（包括表、圖式、及隨附序列表中所述者）皆可用於所揭示之方法中。
在一些所揭示之方法中，可採用T細胞。此類T細胞可來自所屬技術領域中已知的任何來源。例如，T細胞可體外分化自造血幹細胞群，或T細胞可獲自對象。T細胞可得自例如周邊血液單核細胞(PBMC)、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位之組織、腹水、胸膜積水、脾臟組織、及腫瘤。此外，T細胞可衍生自所屬技術領域中可用之一或多種T細胞系。T細胞亦可使用所屬技術領域中具有通常知識者已知之任何數量之技術，諸如FICOLL™分離及/或血球分離來自對象收集之血液之單位獲得。T細胞療法單離T細胞之額外方法揭示於美國專利公開案第2013/0287748號，其以全文以引用方式併入本文中。
在各種實施例中，抗原結合分子特異性結合至scFv-14之至少一部分、及/或包含類似序列之分子及呈現此類序列之細胞。在各種進一步實施例中，抗原結合分子特異性結合至GALV gp70蛋白之至少一部分、及/或包含類似序列之分子及呈現此類序列之病毒顆粒。在各種實施例中，抗原結合分子可包含下列中之一或多者：(a)輕鏈CDR1、(b)輕鏈CDR2、(c)輕鏈CDR3、(d)重鏈CDR1、(e)重鏈CDR2、及(f)重鏈CDR3。在各種實施例中，輕鏈及重鏈可藉由連接子連接。
在各種實施例中，抗原結合分子可包含可變重鏈。在抗CD20 scFv-14結合分子之各種實施例中，可變重鏈可變區可包含SEQ ID NO: 1至10中之一者。在各種實施例中，可採用抗原結合分子，其包含與本文所揭示之請求項之抗原結合分子（例如包含VH序列之抗原結合分子，該VH序列包含SEQ ID NO: 1至10）之VH至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一之VH胺基酸序列。
在各種實施例中，抗原結合分子可包含可變重鏈。在GALV gp70結合分子之各種實施例中，可變重鏈可變區可包含SEQ ID NO: 303至314中之一者。在各種實施例中，可採用抗原結合分子，其包含與本文所揭示之請求項之抗原結合分子（例如包含VH序列之抗原結合分子，該VH序列包含SEQ ID NO: 303至314）之VH至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一之VH胺基酸序列。
在抗CD20 scFv-14結合分子之各種實施例中，可變重鏈可包含CDR1中之一者，其中CDR1包含SEQ ID NO: 21至41中之一者。在各種實施例中，重鏈可包含CDR2中之一者，其中CDR2包含SEQ ID NO: 42至65中之一者。在各種實施例中，重鏈可包含CDR3中之一者，其中CDR3包含SEQ ID NO: 66至85中之一者。
在GALV gp70結合分子之各種實施例中，可變重鏈可包含CDR1中之一者，其中CDR1包含SEQ ID NO: 127至138、157至168、及187至198中之一者。在各種實施例中，重鏈可包含CDR2中之一者，其中CDR2包含SEQ ID NO: 139至150、169至180、及199至210中之一者。在各種實施例中，重鏈可包含CDR3中之一者，其中CDR3包含SEQ ID NO: 151至156、181至186、211至222、及DYY中之一者。
在抗CD20 scFv-14結合分子之各種實施例中，輕鏈可包含SEQ ID NO: 11至20中之一者。在各種實施例中，可採用抗原結合分子，其包含與本文所揭示之請求項之抗原結合分子（例如包含VL序列之抗原結合分子，該VL序列包含SEQ ID NO: 11至20）之VL至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一之VL胺基酸序列。
在GALV gp70結合分子之各種實施例中，輕鏈可包含SEQ ID NO: 315至324中之一者。在各種實施例中，可採用抗原結合分子，其包含與本文所揭示之請求項之抗原結合分子（例如包含VL序列之抗原結合分子，該VL序列包含SEQ ID NO: 315至324）之VL至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一之VL胺基酸序列。
在抗CD20 scFv-14結合分子之各種實施例中，可變輕鏈可包含CDR1中之一者，其中CDR1包含SEQ ID NO: 86至99中之一者。在各種實施例中，輕鏈可包含CDR2中之一者，其中CDR2包含SEQ ID NO: 100至111中之一者。在各種實施例中，輕鏈可包含CDR3中之一者，其中CDR3包含SEQ ID NO: 112至120中之一者。
在GALV gp70結合分子之各種實施例中，可變輕鏈可包含CDR1中之一者，其中CDR1包含SEQ ID NO: 223至232、253至262、及283至292中之一者。在各種實施例中，輕鏈可包含CDR2中之一者，其中CDR2包含SEQ ID NO: 233至242、263至272、SGS、GTN、RAS、DTS、及KVS中之一者。在各種實施例中，輕鏈可包含CDR3中之一者，其中CDR3包含SEQ ID NO: 243至252、273至282、及293至302中之一者。
在各種實施例中，可變輕鏈可藉由連接子（例如Whitlow連接子）連接至可變重鏈。
在所揭示之方法之進一步實施例中，抗原結合分子包含下列中之一或多者：(a)輕鏈CDR1、(b)輕鏈CDR2、(c)輕鏈CDR3、(d)重鏈CDR1、(e)重鏈CDR2、及(f)重鏈CDR3（SEQ ID NO: 21至120）。
在所揭示之方法之各種實施例中，抗CD20 scFv-14之抗原結合分子包含重鏈(HC)，且HC可包含重鏈可變區(VH)序列，重鏈可變區(VH)序列包含SEQ ID NO: 1至10中之一者。此外，在所揭示之方法之實施例中，可採用抗原結合分子，其包含與本文所揭示之請求項之抗原結合分子（例如包含可變區(VH)序列之抗原結合分子，該可變區(VH)序列包含SEQ ID NO: 1至10中之一者）之VH至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一之VH胺基酸序列。
在所揭示之方法之各種實施例中，GALV gp70之抗原結合分子包含重鏈(HC)，且HC可包含重鏈可變區(VH)序列，重鏈可變區(VH)序列包含SEQ ID NO: 303至314中之一者。此外，在所揭示之方法之實施例中，可採用抗原結合分子，其包含與本文所揭示之請求項之抗原結合分子（例如包含可變區(VH)序列之抗原結合分子，該可變區(VH)序列包含SEQ ID NO: 303至314中之一者）之VH至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一之VH胺基酸序列。
在所揭示之方法之各種實施例中，抗CD20 scFv-14之抗原結合分子包含輕鏈(LC)，且LC可包含輕鏈可變區(LH)序列，輕鏈可變區(LH)序列包含SEQ ID NO: 11至20中之一者。在所揭示之方法之各種實施例中，輕鏈包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、及輕鏈CDR3。此外，在所揭示之方法之實施例中，可採用抗原結合分子，其包含與本文所揭示之請求項之抗原結合分子（例如包含可變區(VL)之抗原結合分子，該可變區(VL)係包含SEQ ID NO: 11至20之序列中之一者）之VH至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一之VL胺基酸序列。
在所揭示之方法之各種實施例中，GALV gp70之抗原結合分子包含輕鏈(LC)，且LC可包含輕鏈可變區(LH)序列，輕鏈可變區(LH)序列包含SEQ ID NO: 315至324中之一者。在所揭示之方法之各種實施例中，輕鏈包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、及輕鏈CDR3。此外，在所揭示之方法之實施例中，可採用抗原結合分子，其包含與本文所揭示之請求項之抗原結合分子（例如包含可變區(VL)之抗原結合分子，該可變區(VL)係包含SEQ ID NO: 315至324之序列中之一者）之VH至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或約100%同一之VL胺基酸序列。
在所揭示之方法之特定實施例中，可變重鏈包含SEQ ID NO: 5。
在所揭示之方法之特定實施例中，可變輕鏈包含SEQ ID NO: 15。
在所揭示之方法之特定實施例中，抗CD20 scFv-14之抗原結合分子包含：包含胺基酸序列SEQ ID NO: 25之重鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 46之重鏈CDR2、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 70之重鏈CDR3、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 90之輕鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 104之輕鏈CDR2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 116之輕鏈CDR3。
在所揭示之方法之特定實施例中，抗CD20 scFv-14之抗原結合分子包含：包含胺基酸序列SEQ ID NO: 32之重鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 54之重鏈CDR2、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 70之重鏈CDR3、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 90之輕鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 104之輕鏈CDR2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 116之輕鏈CDR3。
在所揭示之方法之特定實施例中，抗CD20 scFv-14之抗原結合分子包含：包含胺基酸序列SEQ ID NO: 39之重鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 62之重鏈CDR2、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 80之重鏈CDR3、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 98之輕鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 110之輕鏈CDR2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 116之輕鏈CDR3
在所揭示之方法之特定實施例中，關於GALV gp70結合分子，結合分子之重鏈可變區包含：根據SEQ ID NO: 127、157、及187中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 139、169、及199中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 211或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 128、158、及188中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 140、170、及200中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 151、181、及212中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 129、159、及189中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 141、171、及201中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 152、182、及213中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 130、160、及190中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 142、172、及202中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 214或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 131、161、及191中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 143、173、及203中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 153、183、及215中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 132、162、及192中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 144、174、及204中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 154、184、及216中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 133、163、及193中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 145、175、及205中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 155、185、及217中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 134、164、及194中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 146、176、及206中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 218或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 135、165、及195中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 147、177、及207中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 156、186、及219中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 136、166、及196中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 148、178、及208中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 220或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 137、167、及197中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 149、179、及209中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 221或DYY之HCDR3；或根據SEQ ID NO: 138、168、及198中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 150、180、及210中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 222或DYY之HCDR3。
在所揭示之方法之特定實施例中，關於GALV gp70結合分子，結合分子之輕鏈可變區包含：根據SEQ ID NO: 232、262、及292中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 242、272、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 252、282、及302中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 228、258、及288中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 238、268、及KVS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 248、278、及298中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 227、257、及287中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 237、267、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 247、277、及297中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 226、256、及286中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 236、266、及DTS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 246、276、及296中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 225、255、及285中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 235、265、及RAS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 245、275、及295中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 224、254、及284中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 234、264、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 244、274、及294中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 223、253、及283中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 233、263、及SGS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 243、273、及293中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 229、259、及289中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 239、269、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 249、279、及299中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 231、261、及291中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 241、271、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 251、281、及301中任一者之LCDR3；或根據SEQ ID NO: 230、260、290中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 240、270、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 250、280、及300中任一者之LCDR3。
在所揭示之方法之特定實施例中，關於GALV gp70結合分子，結合分子之輕鏈可變區及重鏈可變區包含：根據SEQ ID NO: 127、157、及187中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 139、169、及199中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 211或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 232、262、及292中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 242、272、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 252、282、及302中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 128、158、及188中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 140、170、及200中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 151、181、及212中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 228、258、及288中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 238、268、及KVS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 248、278、及298中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 129、159、及189中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 141、171、及201中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 152、182、及213中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 226、256、及286中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 236、266、及DTS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 246、276、及296中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 130、160、及190中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 142、172、及202中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 214或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 227、257、及287中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 237、267、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 247、277、及297中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 131、161、及191中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 143、173、及203中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 153、183、及215中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 227、257、及287中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 237、267、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 247、277、及297中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 132、162、及192中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 144、174、及204中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 154、184、及216中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 226、256、及286中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 236、266、及DTS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 246、276、及296中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 133、163、及193中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 145、175、及205中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 155、185、及217中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 225、255、及285中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 235、265、及RAS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 245、275、及295中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 134、164、及194中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 146、176、及206中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 218或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 224、254、及284中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 234、264、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 244、274、及294中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 135、165、及195中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 147、177、及207中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 156、186、及219中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 223、253、及283中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 233、263、及SGS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 243、273、及293中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 136、166、及196中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 148、178、及208中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 220或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 229、259、及289中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 239、269、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 249、279、及299中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 137、167、及197中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 149、179、及209中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 221或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 231、261、及291中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 241、271、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 251、281、及301中任一者之LCDR3；或根據SEQ ID NO: 138、168、及198中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 150、180、及210中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 222或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 230、260、290中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 240、270、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 250、280、及300中任一者之LCDR3。
鑑於可用於所揭示之方法中的抗原結合分子之以上描述，現將更詳細論述代表性方法。 a) 判定呈現所關注分子之細胞或病毒顆粒之數目的方法
在某些情況下，可為所欲的是判定存在於樣本中之表現所關注分子之細胞之數目。例如，可為所欲的是判定存在於自對象獲得之樣本中之表現所關注分子之免疫細胞之數目。或者，可為所欲的是判定經轉染且表現所關注分子之細胞之數目，其可用作轉染效率水平之量度。所揭示之方法可用於此等及其他應用中，其中所欲的是判定存在於樣本中之表現所關注分子之細胞之數目。
因此，提供一種判定樣本中呈現分子之細胞之數目的方法，其中該分子包含選自由表3A至表3C、表4A至表4C、或表7A至表7C、表8A至表8C、表9至表10中所述之胺基酸序列中之任一或多者所組成之群組的胺基酸序列。
在一個實施例中，提供包含已知或疑似表現所關注分子之細胞的樣本，所關注分子包含選自由本文所述之胺基酸序列中之任一者所組成之群組的胺基酸序列。
在特定實施例中，所選胺基酸序列係QVQLQQSGAELMKPGASVKLSCKATGHTFTGYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTTEDSAIYYCAREGFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 5)；在其他實施例中，所選胺基酸序列係DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVGIAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYSSYPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 15)；在其他實施例中，所選胺基酸序列係選自（SEQ ID NO: 25、46、70、32、54、39、62、80、90、98、104、116）或任何組合。
在特定實施例中，所選胺基酸序列係 MVLLPGSMLLTSNLHHLRHQMSPGSWKRLIILLSCVFGGGGTSLQNKNPHQPMTLTWQVLSQTGDVVWDTKAVQPPWTWWPTLKPDVCALAASLESWDIPGTDVSSSKRVRPPDSDYTAAYKQITWGAIGCSYPRARTRMASSTFYVCPRDGRTLSEARRCGGLESLYCKEWDCETTGTGYWLSKSSKDLITVKWDQNSEWTQKFQQCHQTGWCNPLKIDFTDKGKLSKDWITGKTWGLRFYVSGHPGVQFTIRLKITNMPAVAVGPDLVLVEQGPPRTSLALPPPLPPREAPPPSLPDSNSTALATSAQTPTVRKTIVTLNTPPPTTGDRLFDLVQGAFLTLNATNPGATESCWLCLAMGPPYYEAIASSGEVAYSTDLDRCRWGTQGKLTLTEVSGHGLCIGKVPFTHQHLCNQTLSINSSGDHQYLLPSNHSWWACSTGLTPCLSTSVFNQTRDFCIQVQLIPRIYYYPEEVLLQAYDNSHPRTKREAVSLTLAVLLGLGITAGIGTGSTALIKGPIDLQQGLTSLQIAIDADLRALQDSVSKLEDSLTSLSEVVLQNRRGLDLLFLKEGGLCAALKEECCFYIDHSGAVRDSMKKLKEKLDKRQLERQKSQNWYEGWFNNSPWFTTLLSTIAGPLLLLLLLLILGPCIINKLVQFINDRISAVKILVLRQKYQALENEGNL (SEQ ID NO: 325)。
細胞可係任何類型，且可係人類或非人類的（例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠等）。在一較佳實施例中，細胞係免疫細胞。該方法之免疫細胞可係任何類型的免疫細胞（例如B淋巴球、單核球、樹突細胞、蘭格罕細胞(Langerhans cell)、角質細胞、內皮細胞、星狀細胞、纖維母細胞、及寡樹突細胞(oligodendrocyte)）。T細胞（包括細胞毒性T細胞、輔助T細胞、及Treg細胞）係特別較佳的。在特定實施例中，細胞係T細胞，其可如本文所述及藉由所屬技術領域中已知的方法獲得。在所揭示之方法之此實施例中可採用任何類型的免疫細胞。例示性細胞包括但不限於免疫細胞，諸如T細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、NK細胞、TCR表現性細胞、樹突細胞、及NK-T細胞。T細胞可係自體的、同種異體的、或異源的。T細胞可係CD4+ T細胞或CD8+ T細胞。當在所揭示之方法中採用T細胞時，T細胞可係體內T細胞或體外T細胞。此外，細胞可設置於能夠將細胞維持在存活形式之任何環境中或自其單離，諸如血液、組織、或自對象獲得之任何其他樣本、細胞培養基、離體生長之組織、合適的緩衝液等。
在特定實施例中，所關注分子係CAR。當分子係CAR時，其可包含選自由下列所組成之群組的分子或其片段：CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a (ITGAL)、CD11b (ITGAM)、CD11c (ITGAX)、CD11d (ITGAD)、CD18 (ITGB2)、CD19 (B4)、CD27 (TNFRSF7)、CD28、CD29 (ITGB1)、CD30 (TNFRSF8)、CD40 (TNFRSF5)、CD48 (SLAMF2)、CD49a (ITGA1)、CD49d (ITGA4)、CD49f (ITGA6)、CD66a (CEACAM1)、CD66b (CEACAM8)、CD66c (CEACAM6)、CD66d (CEACAM3)、CD66e (CEACAM5)、CD69 (CLEC2)、CD79A（B細胞抗原受體複合物相關α鏈）、CD79B（B細胞抗原受體複合物相關β鏈）、CD84 (SLAMF5)、CD96 (Tactile)、CD100 (SEMA4D)、CD103 (ITGAE)、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD158A (KIR2DL1)、CD158B1 (KIR2DL2)、CD158B2 (KIR2DL3)、CD158C (KIR3DP1)、CD158D (KIRDL4)、CD158F1 (KIR2DL5A)、CD158F2 (KIR2DL5B)、CD158K (KIR3DL2)、CD160 (BY55)、CD162 (SELPLG)、CD226 (DNAM1)、CD229 (SLAMF3)、CD244 (SLAMF4)、CD247 (CD3ζ)、CD258 (LIGHT)、CD268 (BAFFR)、CD270 (TNFSF14)、CD272 (BTLA)、CD276 (B7-H3)、CD279 (PD-1)、CD314 (NKG2D)、CD319 (SLAMF7)、CD335 (NK-p46)、CD336 (NK-p44)、CD337 (NK-p30)、CD352 (SLAMF6)、CD353 (SLAMF8)、CD355 (CRTAM)、CD357 (TNFRSF18)、可誘導T細胞共刺激分子(ICOS)、LFA-1 (CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80 (KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS (GrpL)、SLP-76 (LCP2)、PAG1/CBP、CD83配體、Fcγ受體、MHC 1類分子、MHC 2類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白蛋白質、細胞介素受體、整合素、活化NK細胞受體、類鐸受體、及其組合。
接著，在允許形成包含存在於樣本中之細胞及抗原結合分子之結合複合物的條件下，使樣本與特異性結合所關注分子且包含可偵測標示之抗原結合分子接觸。抗原結合分子較佳地係本文所揭示之抗原結合分子（或其片段），例如在圖式、序列表、或本揭露之目前章節中。特異性結合抗CD20 scFv-14分子之全部或一部分之任何抗原結合分子皆可用於所揭示之方法中。本文提供合適的抗原結合分子之多個實例，例如具有本文所呈現之表（諸如表3A至表3C、表4A至表4C、或表7A至表7C、表8A至表8C）中之任一者中所示之一或多個CDR者。
該方法中可採用任何可偵測標示，且可使用所欲的一組標準選擇合適的標示。可偵測標示之類型之實例包括螢光染料，其可選自由下列所組成之群組：Atto染料、Alexafluor染料、量子點、羥基香豆素、胺基香豆素、甲氧基香豆素、Cascade Blue、Pacific Blue、Pacific Orange、Lucifer yellow、NBD、R-藻紅蛋白(PE)、PE-Cy5接合物、PE-Cy7接合物、Red 613、PerCP、TruRed、FluorX、螢光素、BODIPY-FL、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、TRITC、X-玫瑰紅、Lissamine玫瑰紅B、Texas Red、異藻藍蛋白(APC)、APC-Cy7接合物、Indo-1、Fluo-3、Fluo-4、DCFH、DHR、SNARF、GFP（Y66H突變）、GFP（Y66F突變）、EBFP、EBFP2、石青色螢光蛋白(Azurite)、GFPuv、T-Sapphire、天藍螢光蛋白(Cerulean)、mCFP、mTurquoise2、ECFP、CyPet、GFP（Y66W突變）、mKeima-Red、TagCFP、AmCyan1、mTFP1、GFP（S65A突變）、Midoriishi Cyan、野生型GFP、GFP（S65C突變）、TurboGFP、TagGFP、GFP（S65L突變）、Emerald、GFP（S65T突變）、EGFP、Azami Green、ZsGreen1、TagYFP、EYFP、Topaz、Venus、mcitrine、YPet、TurboYFP、ZsYellow1、Kusabira Orange、mOrange、異藻藍蛋白(APC)、mKO、TurboRFP、tdTomato、TagRFP、DsRed單體、DsRed2 (“RFP”)、mStrawberry、TurboFP602、AsRed2、mRFP1、J-Red、R-藻紅蛋白(RPE)、B-藻紅蛋白(BPE)、mCherry、HcRed1、Katusha、P3、多甲藻素葉綠素(PerCP)、mKate (TagFP635)、TurboFP635、mPlum、及mRaspberry。其他類型的可偵測標示包括光學染料（其係描述於Johnson, Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Techniques, 11 thEdition, Life Technologies, (2010)，特此以引用方式明確併入本文中）、放射性標示（例如同位素標記，諸如 3H、 11C、 14C、 15N、 18F、 35S、 64CU、 90Y、 99Tc、 111In、 124I、 125I、 131I）、光致變色化合物、磁性標示（例如DYNABEADS）等。用於標示蛋白質之策略係所屬技術領域中已知的且可用於所揭示之方法中。
標示可在分子中之任何位置與抗原結合分子聯結，但較佳的是在使得分子之結合性質未經修飾（除非此類經修飾之結合活性係所欲的）的點之位置（或若採用多個標示，則在多個位置），將標示與分子聯結。特異性結合包含抗CD20 scFv-14分子之所關注分子之全部或一部分的任何抗原結合分子或其片段皆可用於所揭示之方法中。在其他態樣中，特異性結合包含GALV gp70分子之所關注分子之全部或一部分的任何抗原結合分子或其片段皆可用於所揭示之方法中。
在所揭示之方法之特定實施例中，關於抗CD20 scFv-14分子，抗原結合分子包含：包含胺基酸序列SEQ ID NO: 25之重鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 46之重鏈CDR2、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 70之重鏈CDR3、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 90之輕鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 104之輕鏈CDR2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 116之輕鏈CDR3。
在所揭示之方法之特定實施例中，關於抗CD20 scFv-14分子，抗原結合分子包含：包含胺基酸序列SEQ ID NO: 32之重鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 54之重鏈CDR2、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 70之重鏈CDR3、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 90之輕鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 104之輕鏈CDR2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 116之輕鏈CDR3。
在所揭示之方法之特定實施例中，關於抗CD20 scFv-14分子，抗原結合分子包含：包含胺基酸序列SEQ ID NO: 39之重鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 62之重鏈CDR2、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 80之重鏈CDR3、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 98之輕鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 110之輕鏈CDR2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 116之輕鏈CDR3。
在所揭示之方法之特定實施例中，關於GALV gp70結合分子，HCDR1具有根據SEQ ID NO: 127至138、157至168、及187至198中任一者之序列；HCDR2具有根據SEQ ID NO: 139至150、169至180、及199至210中任一者之序列；HCDR3具有根據SEQ ID NO: 151至156、181至186、211至222、及DYY中任一者之序列；LCDR1具有根據SEQ ID NO: 223至232、253至262、及283至292中任一者之序列；LCDR2具有根據SEQ ID NO: 233至242、263至272、SGS、GTN、RAS、DTS、及KVS中任一者之序列；且LCDR3具有根據SEQ ID NO: 243至252、273至282、及293至302中任一者之序列。
在所揭示之方法之特定實施例中，關於GALV gp70結合分子，結合分子之重鏈可變區包含：根據SEQ ID NO: 127、157、及187中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 139、169、及199中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 211或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 128、158、及188中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 140、170、及200中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 151、181、及212中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 129、159、及189中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 141、171、及201中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 152、182、及213中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 130、160、及190中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 142、172、及202中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 214或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 131、161、及191中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 143、173、及203中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 153、183、及215中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 132、162、及192中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 144、174、及204中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 154、184、及216中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 133、163、及193中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 145、175、及205中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 155、185、及217中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 134、164、及194中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 146、176、及206中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 218或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 135、165、及195中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 147、177、及207中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 156、186、及219中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 136、166、及196中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 148、178、及208中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 220或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 137、167、及197中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 149、179、及209中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 221或DYY之HCDR3；或根據SEQ ID NO: 138、168、及198中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 150、180、及210中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 222或DYY之HCDR3。
在所揭示之方法之特定實施例中，關於GALV gp70結合分子，結合分子之輕鏈可變區包含：根據SEQ ID NO: 232、262、及292中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 242、272、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 252、282、及302中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 228、258、及288中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 238、268、及KVS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 248、278、及298中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 227、257、及287中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 237、267、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 247、277、及297中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 226、256、及286中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 236、266、及DTS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 246、276、及296中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 225、255、及285中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 235、265、及RAS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 245、275、及295中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 224、254、及284中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 234、264、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 244、274、及294中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 223、253、及283中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 233、263、及SGS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 243、273、及293中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 229、259、及289中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 239、269、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 249、279、及299中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 231、261、及291中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 241、271、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 251、281、及301中任一者之LCDR3；或根據SEQ ID NO: 230、260、290中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 240、270、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 250、280、及300中任一者之LCDR3。
在所揭示之方法之特定實施例中，關於GALV gp70結合分子，結合分子之輕鏈可變區及重鏈可變區包含：根據SEQ ID NO: 127、157、及187中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 139、169、及199中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 211或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 232、262、及292中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 242、272、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 252、282、及302中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 128、158、及188中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 140、170、及200中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 151、181、及212中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 228、258、及288中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 238、268、及KVS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 248、278、及298中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 129、159、及189中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 141、171、及201中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 152、182、及213中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 226、256、及286中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 236、266、及DTS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 246、276、及296中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 130、160、及190中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 142、172、及202中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 214或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 227、257、及287中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 237、267、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 247、277、及297中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 131、161、及191中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 143、173、及203中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 153、183、及215中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 227、257、及287中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 237、267、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 247、277、及297中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 132、162、及192中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 144、174、及204中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 154、184、及216中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 226、256、及286中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 236、266、及DTS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 246、276、及296中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 133、163、及193中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 145、175、及205中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 155、185、及217中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 225、255、及285中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 235、265、及RAS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 245、275、及295中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 134、164、及194中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 146、176、及206中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 218或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 224、254、及284中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 234、264、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 244、274、及294中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 135、165、及195中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 147、177、及207中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 156、186、及219中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 223、253、及283中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 233、263、及SGS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 243、273、及293中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 136、166、及196中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 148、178、及208中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 220或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 229、259、及289中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 239、269、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 249、279、及299中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 137、167、及197中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 149、179、及209中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 221或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 231、261、及291中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 241、271、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 251、281、及301中任一者之LCDR3；或根據SEQ ID NO: 138、168、及198中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 150、180、及210中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 222或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 230、260、290中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 240、270、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 250、280、及300中任一者之LCDR3。
抗原結合分子可設置於任何表面上，或根本不設置於表面上。例如，抗原結合分子可存在於緩衝液中，且可使緩衝液-抗原結合分子與樣本接觸。替代地，抗原結合分子可與表面聯結。合適的表面包括瓊脂糖珠、磁珠（諸如DYNABEADS™）、或塑膠、玻璃、或陶瓷盤（諸如孔盤）、袋（諸如細胞培養袋）等。表面本身可設置於另一結構中，諸如管柱。
允許形成結合複合物之條件將取決於各種因素，然而，通常在生理pH及離子強度下之水性緩衝液（諸如磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)）將有利於結合複合物之形成且在所揭示之方法中係較佳的。
接下來，判定樣本中存在於結合複合物中之細胞之數目。用以判定存在於結合複合物中之細胞之數目的具體方法將取決於所選標示之本質。例如，當選擇螢光標示時，可採用FACS；當選擇同位素標示時，可採用質譜法、NMR、或其他技術；當選擇磁性標示時，可採用基於磁性之細胞分選；亦可採用顯微術。此等偵測方法之輸出可呈細胞之數目之形式，或輸出可呈允許基於該輸出計算細胞之數目之形式。 b) 判定分子之存在或不存在的方法
具有將不同分子群體、特別是生物相關分子彼此分離之能力係有價值的。使用本文所提供之抗原結合分子可實現此類分離，並用於一系列生物技術、生物醫藥、及治療性應用中。
在本揭露之一個態樣中，提供一種單離分子之方法，該分子包含抗CD20 scFv-14分子之全部或一部分。在本揭露之另一態樣中，提供一種單離分子之方法，該分子所包含之分子包含表3A至表3C及表4A至表4C中所述之胺基酸序列中之一或多者。
在本揭露之一進一步態樣中，提供一種單離分子之方法，該分子包含GALV gp70分子之全部或一部分。在本揭露之另一態樣中，提供一種單離分子之方法，該分子所包含之分子包含表7A至表7C及表8A至表8C中所述之胺基酸序列中之一或多者。
在一個實施例中，該方法包含提供已知或疑似包含抗CD20 scFv-14分子之全部或一部分的樣本。在一個實施例中，該方法包含提供已知或疑似包含GALV gp70分子之全部或一部分的樣本。
在一個實施例中，該方法包含提供已知或疑似包含所關注胺基酸序列中之一或多者的樣本。
在特定實施例中，所選胺基酸序列係QVQLQQSGAELMKPGASVKLSCKATGHTFTGYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTTEDSAIYYCAREGFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 5)；在其他實施例中，所選胺基酸序列係DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVGIAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYSSYPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 15)；在其他實施例中，所選胺基酸序列係選自（SEQ ID NO: 25、46、70、32、54、39、62、80、90、98、104、116）或任何組合。
在特定實施例中，所選胺基酸序列係 MVLLPGSMLLTSNLHHLRHQMSPGSWKRLIILLSCVFGGGGTSLQNKNPHQPMTLTWQVLSQTGDVVWDTKAVQPPWTWWPTLKPDVCALAASLESWDIPGTDVSSSKRVRPPDSDYTAAYKQITWGAIGCSYPRARTRMASSTFYVCPRDGRTLSEARRCGGLESLYCKEWDCETTGTGYWLSKSSKDLITVKWDQNSEWTQKFQQCHQTGWCNPLKIDFTDKGKLSKDWITGKTWGLRFYVSGHPGVQFTIRLKITNMPAVAVGPDLVLVEQGPPRTSLALPPPLPPREAPPPSLPDSNSTALATSAQTPTVRKTIVTLNTPPPTTGDRLFDLVQGAFLTLNATNPGATESCWLCLAMGPPYYEAIASSGEVAYSTDLDRCRWGTQGKLTLTEVSGHGLCIGKVPFTHQHLCNQTLSINSSGDHQYLLPSNHSWWACSTGLTPCLSTSVFNQTRDFCIQVQLIPRIYYYPEEVLLQAYDNSHPRTKREAVSLTLAVLLGLGITAGIGTGSTALIKGPIDLQQGLTSLQIAIDADLRALQDSVSKLEDSLTSLSEVVLQNRRGLDLLFLKEGGLCAALKEECCFYIDHSGAVRDSMKKLKEKLDKRQLERQKSQNWYEGWFNNSPWFTTLLSTIAGPLLLLLLLLILGPCIINKLVQFINDRISAVKILVLRQKYQALENEGNL (SEQ ID NO: 325)。
在特定實施例中，所關注分子係CAR。當分子係CAR時，其可包含選自由下列所組成之群組的分子或其片段：CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a (ITGAL)、CD11b (ITGAM)、CD11c (ITGAX)、CD11d (ITGAD)、CD18 (ITGB2)、CD19 (B4)、CD27 (TNFRSF7)、CD28、CD29 (ITGB1)、CD30 (TNFRSF8)、CD40 (TNFRSF5)、CD48 (SLAMF2)、CD49a (ITGA1)、CD49d (ITGA4)、CD49f (ITGA6)、CD66a (CEACAM1)、CD66b (CEACAM8)、CD66c (CEACAM6)、CD66d (CEACAM3)、CD66e (CEACAM5)、CD69 (CLEC2)、CD79A（B細胞抗原受體複合物相關α鏈）、CD79B（B細胞抗原受體複合物相關β鏈）、CD84 (SLAMF5)、CD96 (Tactile)、CD100 (SEMA4D)、CD103 (ITGAE)、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD158A (KIR2DL1)、CD158B1 (KIR2DL2)、CD158B2 (KIR2DL3)、CD158C (KIR3DP1)、CD158D (KIRDL4)、CD158F1 (KIR2DL5A)、CD158F2 (KIR2DL5B)、CD158K (KIR3DL2)、CD160 (BY55)、CD162 (SELPLG)、CD226 (DNAM1)、CD229 (SLAMF3)、CD244 (SLAMF4)、CD247 (CD3ζ)、CD258 (LIGHT)、CD268 (BAFFR)、CD270 (TNFSF14)、CD272 (BTLA)、CD276 (B7-H3)、CD279 (PD-1)、CD314 (NKG2D)、CD319 (SLAMF7)、CD335 (NK-p46)、CD336 (NK-p44)、CD337 (NK-p30)、CD352 (SLAMF6)、CD353 (SLAMF8)、CD355 (CRTAM)、CD357 (TNFRSF18)、可誘導T細胞共刺激分子(ICOS)、LFA-1 (CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80 (KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS (GrpL)、SLP-76 (LCP2)、PAG1/CBP、CD83配體、Fcγ受體、MHC 1類分子、MHC 2類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白蛋白質、細胞介素受體、整合素、活化NK細胞受體、類鐸受體、及其組合。
提供一種抗原結合分子，其特異性結合抗CD20 scFv-14分子或GALV gp70蛋白之全部或一部分，且可選地包含可偵測標示。如本文所述，當決定採用可偵測標示時，任何可偵測標示可用於該方法中，且可使用所欲的一組標準選擇合適的標示。可偵測標示之類型之實例包括螢光標示（例如螢光素、玫瑰紅、四甲基羅丹明(tetramethylrhodamine)、伊紅(eosin)、赤藻紅(erythrosin)、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀綠(Malachite green)、二苯乙烯、Lucifer Yellow、Cascade Blue、Texas Red、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC Red 640、Cy 5、Cy 5.5、LC Red 705、Oregon green、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680)、Cascade Blue、Cas-cade Yellow及R-藻紅蛋白(PE) (Molecular Probes)、FITC、玫瑰紅、及Texas Red (Pierce)、Cy5、Cy5.5、Cy7 (Amersham Life Science)）。合適的光學染料（包括螢光團）係描述於Johnson, Molecular Probes Handbook:A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Techniques, 11 thEdition, Life Technologies, (2010)，其特此以引用方式明確併入本文中；放射性標示（例如同位素標記，諸如 3H、 11C、 14C、 15N、 18F、 35S、 64CU、 90Y、 99Tc、 111In、 124I、 125I、 131I）。光致變色化合物、Halo-tag、Atto染料、Tracy染料、蛋白質螢光標示（例如蛋白質螢光標示亦包括但不限於綠色螢光蛋白（包括GFP之Renilla、Ptilosarcus、或Aequorea物種(Chalfie et al., (1994) Science263:802-805)、EGFP（Clon-tech Labs., Inc.，Genbank登錄號U55762））、藍色螢光蛋白(BFP, Quantum Biotechnologies, Inc; Stauber, (1998) Biotechniques24:462-471; Heim et al., (1996) Curr. Biol.6: 178-182)、增強型黃色螢光蛋白(Clontech Labs., Inc.)、螢光素酶(Ichiki et al., (1993) J. Immunol.150:5408-5417)、磁性標示（例如DYNABEADS）等皆可採用。用於標示蛋白質之策略係所屬技術領域中熟知的且可用於所揭示之方法中。
標示可在分子中之任何位置與抗原結合分子聯結，但較佳的是在使得分子之結合性質未經修飾（除非此類經修飾之結合活性係所欲的）的點之位置（或若採用多個標示，則在多個位置），將標示與分子聯結。關於抗CD20 scFv-14分子，可採用特異性結合抗CD20 scFv-14分子之全部或一部分之任何抗原結合分子或其片段，諸如本文所揭示者，例如具有一或多個表3A至表3C及表4A至表4C中所示之CDR者。關於GALV gp70蛋白，可採用特異性結合GALV gp70蛋白之全部或一部分之任何抗原結合分子或其片段，諸如本文所揭示者，例如具有一或多個表7A至表7C及表8A至表8C中所示之CDR者。
在所揭示之方法之特定實施例中，抗CD20 scFv-14之抗原結合分子包含：包含胺基酸序列SEQ ID NO: 25之重鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 46之重鏈CDR2、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 70之重鏈CDR3、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 90之輕鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 104之輕鏈CDR2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 116之輕鏈CDR3。
在所揭示之方法之特定實施例中，抗CD20 scFv-14之抗原結合分子包含：包含胺基酸序列SEQ ID NO: 32之重鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 54之重鏈CDR2、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 70之重鏈CDR3、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 90之輕鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 104之輕鏈CDR2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 116之輕鏈CDR3。
在所揭示之方法之特定實施例中，抗CD20 scFv-14之抗原結合分子包含：包含胺基酸序列SEQ ID NO: 39之重鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 62之重鏈CDR2、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 80之重鏈CDR3、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 98之輕鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 110之輕鏈CDR2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 116之輕鏈CDR3。
在所揭示之方法之特定實施例中，關於GALV gp70結合分子，結合分子之重鏈可變區包含：根據SEQ ID NO: 127、157、及187中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 139、169、及199中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 211或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 128、158、及188中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 140、170、及200中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 151、181、及212中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 129、159、及189中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 141、171、及201中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 152、182、及213中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 130、160、及190中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 142、172、及202中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 214或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 131、161、及191中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 143、173、及203中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 153、183、及215中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 132、162、及192中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 144、174、及204中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 154、184、及216中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 133、163、及193中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 145、175、及205中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 155、185、及217中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 134、164、及194中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 146、176、及206中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 218或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 135、165、及195中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 147、177、及207中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 156、186、及219中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 136、166、及196中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 148、178、及208中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 220或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 137、167、及197中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 149、179、及209中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 221或DYY之HCDR3；或根據SEQ ID NO: 138、168、及198中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 150、180、及210中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 222或DYY之HCDR3。
在所揭示之方法之特定實施例中，關於GALV gp70結合分子，結合分子之輕鏈可變區包含：根據SEQ ID NO: 232、262、及292中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 242、272、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 252、282、及302中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 228、258、及288中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 238、268、及KVS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 248、278、及298中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 227、257、及287中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 237、267、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 247、277、及297中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 226、256、及286中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 236、266、及DTS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 246、276、及296中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 225、255、及285中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 235、265、及RAS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 245、275、及295中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 224、254、及284中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 234、264、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 244、274、及294中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 223、253、及283中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 233、263、及SGS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 243、273、及293中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 229、259、及289中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 239、269、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 249、279、及299中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 231、261、及291中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 241、271、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 251、281、及301中任一者之LCDR3；或根據SEQ ID NO: 230、260、290中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 240、270、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 250、280、及300中任一者之LCDR3。
在所揭示之方法之特定實施例中，關於GALV gp70結合分子，結合分子之輕鏈可變區及重鏈可變區包含：根據SEQ ID NO: 127、157、及187中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 139、169、及199中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 211或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 232、262、及292中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 242、272、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 252、282、及302中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 128、158、及188中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 140、170、及200中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 151、181、及212中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 228、258、及288中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 238、268、及KVS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 248、278、及298中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 129、159、及189中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 141、171、及201中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 152、182、及213中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 226、256、及286中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 236、266、及DTS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 246、276、及296中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 130、160、及190中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 142、172、及202中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 214或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 227、257、及287中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 237、267、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 247、277、及297中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 131、161、及191中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 143、173、及203中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 153、183、及215中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 227、257、及287中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 237、267、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 247、277、及297中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 132、162、及192中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 144、174、及204中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 154、184、及216中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 226、256、及286中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 236、266、及DTS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 246、276、及296中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 133、163、及193中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 145、175、及205中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 155、185、及217中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 225、255、及285中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 235、265、及RAS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 245、275、及295中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 134、164、及194中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 146、176、及206中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 218或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 224、254、及284中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 234、264、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 244、274、及294中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 135、165、及195中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 147、177、及207中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 156、186、及219中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 223、253、及283中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 233、263、及SGS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 243、273、及293中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 136、166、及196中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 148、178、及208中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 220或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 229、259、及289中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 239、269、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 249、279、及299中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 137、167、及197中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 149、179、及209中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 221或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 231、261、及291中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 241、271、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 251、281、及301中任一者之LCDR3；或根據SEQ ID NO: 138、168、及198中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 150、180、及210中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 222或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 230、260、290中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 240、270、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 250、280、及300中任一者之LCDR3。
抗原結合分子可設置於任何表面上，或根本不設置於表面上。例如，抗原結合分子可存在於緩衝液中，且可使緩衝液-抗原結合分子與樣本接觸。替代地，抗原結合分子可與表面聯結。合適的表面包括瓊脂糖珠、磁珠（諸如DYNABEADS™）、或塑膠、玻璃、或陶瓷盤（諸如孔盤）、袋（諸如細胞培養袋）等。表面本身可設置於另一結構中，諸如管柱。
在允許形成結合複合物之條件下使樣本與抗原結合分子接觸，結合複合物包含：包含所選胺基酸序列之分子及抗原結合分子。允許形成結合複合物之條件將取決於各種因素，然而，通常在生理pH及離子強度下之水性緩衝液（諸如磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)）將有利於結合複合物之形成且在所揭示之方法中係較佳的。由於結合複合物之組分部分可如本文所述設置於表面上，因此所形成之結合複合物亦可設置於表面上。
在此階段，可能沒有形成結合複合物，或可能已形成包含一或多種抗原結合分子之複數個結合複合物，抗原結合分子結合至包含抗CD20 scFv-14分子或GALV gp70蛋白之全部或一部分的分子。包含所選胺基酸序列之未結合分子及/或未結合抗原結合分子亦可存在於任何所形成之結合複合物之局部環境中。
接著，將任何非結合複合物之一部分之分子與任何所形成之結合複合物分離。移除方法將取決於結合複合物之結構及/或局部環境。例如，若抗原結合分子係設置於珠、盤、或袋上，則可使用使所形成之結合複合物保持完整之溶液將反應混合物之未結合組分洗滌去除。若結合複合物係設置於珠上，則珠本身可位於管柱或其他結構中，且可使用相同方法。
可使用用以誘導結合複合物形成之溶液作為例如洗滌溶液以移除未結合組分。可使用不破壞所形成之結合複合物之任何合適的緩衝液或溶液。一般而言，當執行該方法之此步驟時，較佳地避免具有高鹽濃度、非生理pH、含有離散劑(chaotrope)或變性劑之緩衝液。
接著，將所形成之結合複合物分離成(a)包含抗CD20 scFv-14分子或GALV gp70蛋白之全部或一部分的分子及(b)抗原結合分子（例如SEQ ID NO. 21至120中之一或多者）或包含根據SEQ ID NO: 127至324中之一或多者之序列。分離可使用所屬技術領域中具有通常知識者已知的標準方法達成。例如，可將複合物用具有合適pH及組成之溶液洗滌。常用於此目的之溶液係0.1 M甘胺酸HCl (pH 2.5至3.0)，且可採用此溶液以達成分離。可採用之其他溶液包括100 mM檸檬酸(pH 3.0)、50至100 mM三乙胺或三乙醇胺(pH 11.5)；150 mM氫氧化銨(pH 10.5)；0.1 M甘胺酸•NaOH(pH 10.0)；5 M氯化鋰、3.5 M氯化鎂或氯化鉀、3.0 M氯化鉀、2.5 M碘化鈉或碘化鉀、0.2至3.0 M硫氰酸鈉、0.1 M Tris乙酸鹽與2.0 M NaCl (pH 7.7)；2至6 M胍HCl、2至8 M脲、1.0 M硫氰酸銨、1%去氧膽酸鈉1%SDS；及10%二 烷50%乙二醇（pH 8至11.5）。
在分離後，若包含抗CD20 scFv-14分子或GALV gp70蛋白之全部或一部分的分子係主要關注的，則可將其收集；替代地，若抗原結合分子係主要關注的，則可將其收集。 c) 判定分子之存在或不存在的方法
如本文所揭示，有時所欲的是單離包含抗CD20 scFv-14分子之全部或一部分的分子。在其他情況下，僅僅知道包含抗CD20 scFv-14分子之全部或一部分的分子存在或不存在於樣本中係足夠的資訊。例如，無論表現水平如何，知道此類分子被表現可能係有益的。在其他情況下，可為所欲的是知道經設計以移除此類分子之純化程序或步驟是否有效。因此，包含抗CD20 scFv-14分子之全部或一部分的分子之存在或不存在的定性判定可用於多個應用中。表3A至表3C及表4A至表4C中所述之胺基酸序列可用於本文所述之定量或定性方法中之任一者中，以判定抗CD20 scFv-14分子之全部或一部分之存在、不存在、及/或數量。
如本文所揭示，有時所欲的是單離包含GALV gp70蛋白之全部或一部分的分子。在其他情況下，僅僅知道包含GALV gp70蛋白分子之全部或一部分的分子存在或不存在於樣本中係足夠的資訊。例如，無論表現水平如何，知道此類分子被表現可能係有益的。在其他情況下，可為所欲的是知道經設計以移除此類分子之純化程序或步驟是否有效。因此，包含GALV gp70蛋白之全部或一部分的分子之存在或不存在的定性判定可用於多個應用中。表7A至表7C及表8A至表8C中所述之胺基酸序列可用於本文所述之定量或定性方法中之任一者中，以判定GALV gp70蛋白之全部或一部分之存在、不存在、及/或數量。
有鑑於此，提供一種判定樣本中包含抗CD20 scFv-14分子或GALV gp70蛋白之全部或一部分的分子於樣本中之存在或不存在的方法。
在一個實施例中，該方法包含提供已知或疑似包含抗CD20 scFv-14分子或GALV gp70蛋白之全部或一部分的樣本。
在特定實施例中，抗CD20 scFv-14分子之全部或一部分係CAR。當分子係CAR時，其可包含選自由下列所組成之群組的分子或其片段：CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a (ITGAL)、CD11b (ITGAM)、CD11c (ITGAX)、CD11d (ITGAD)、CD18 (ITGB2)、CD19 (B4)、CD27 (TNFRSF7)、CD28、CD29 (ITGB1)、CD30 (TNFRSF8)、CD40 (TNFRSF5)、CD48 (SLAMF2)、CD49a (ITGA1)、CD49d (ITGA4)、CD49f (ITGA6)、CD66a (CEACAM1)、CD66b (CEACAM8)、CD66c (CEACAM6)、CD66d (CEACAM3)、CD66e (CEACAM5)、CD69 (CLEC2)、CD79A（B細胞抗原受體複合物相關α鏈）、CD79B（B細胞抗原受體複合物相關β鏈）、CD84 (SLAMF5)、CD96 (Tactile)、CD100 (SEMA4D)、CD103 (ITGAE)、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD158A (KIR2DL1)、CD158B1 (KIR2DL2)、CD158B2 (KIR2DL3)、CD158C (KIR3DP1)、CD158D (KIRDL4)、CD158F1 (KIR2DL5A)、CD158F2 (KIR2DL5B)、CD158K (KIR3DL2)、CD160 (BY55)、CD162 (SELPLG)、CD226 (DNAM1)、CD229 (SLAMF3)、CD244 (SLAMF4)、CD247 (CD3ζ)、CD258 (LIGHT)、CD268 (BAFFR)、CD270 (TNFSF14)、CD272 (BTLA)、CD276 (B7-H3)、CD279 (PD-1)、CD314 (NKG2D)、CD319 (SLAMF7)、CD335 (NK-p46)、CD336 (NK-p44)、CD337 (NK-p30)、CD352 (SLAMF6)、CD353 (SLAMF8)、CD355 (CRTAM)、CD357 (TNFRSF18)、可誘導T細胞共刺激分子(ICOS)、LFA-1 (CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80 (KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS (GrpL)、SLP-76 (LCP2)、PAG1/CBP、CD83配體、Fcγ受體、MHC 1類分子、MHC 2類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白蛋白質、細胞介素受體、整合素、活化NK細胞受體、類鐸受體、及其組合。
提供包含可偵測標示之抗原結合分子（例如SEQ ID NO: 20至120），抗原結合分子（例如抗CD20 scFv-14分子之全部或一部分）特異性結合該可偵測標示。在其他態樣中，提供包含可偵測標示之抗原結合分子（例如SEQ ID NO: 127至324），抗原結合分子（例如GALV gp70蛋白之全部或一部分）特異性結合該可偵測標示。可使用所欲的一組標準選擇合適的標示。可偵測標示之類型之實例包括螢光標示（例如螢光素、玫瑰紅、四甲基羅丹明(tetramethylrhodamine)、伊紅(eosin)、赤藻紅(erythrosin)、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀綠(Malachite green)、二苯乙烯、Lucifer Yellow、Cascade Blue、Texas Red、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC Red 640、Cy 5、Cy 5.5、LC Red 705、Oregon green、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680)、Cascade Blue、Cas-cade Yellow及R-藻紅蛋白(PE) (Molecular Probes)、FITC、玫瑰紅、及Texas Red (Pierce)、Cy5、Cy5.5、Cy7 (Amersham Life Science)）。合適的光學染料（包括螢光團）係描述於Johnson, Molecular Probes Handbook:A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Techniques, 11 thEdition, Life Technologies, (2010)，其特此以引用方式明確併入本文中；放射性標示（例如同位素標記，諸如 3H、 11C、 14C、 15N、 18F、 35S、 64CU、 90Y、 99Tc、 111In、 124I、 125I、 131I）。光致變色化合物、Halo-tag、Atto染料、Tracy染料、蛋白質螢光標示（例如蛋白質螢光標示亦包括但不限於綠色螢光蛋白（包括GFP之Renilla、Ptilosarcus、或Aequorea物種(Chalfie et al., (1994) Science263:802-805)、EGFP（Clon-tech Labs., Inc.，Genbank登錄號U55762））、藍色螢光蛋白(BFP, Quantum Biotechnologies, Inc; Stauber, (1998) Biotechniques24:462-471; Heim et al., (1996) Curr. Biol.6: 178-182)、增強型黃色螢光蛋白(Clontech Labs., Inc.)、螢光素酶(Ichiki et al., (1993) J. Immunol.150:5408-5417)、磁性標示（例如DYNABEADS）等皆可採用。用於標示蛋白質之策略係所屬技術領域中熟知的且可用於所揭示之方法中。
在所揭示之方法之特定實施例中，抗CD20 scFv-14之抗原結合分子包含：包含胺基酸序列SEQ ID NO: 25之重鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 46之重鏈CDR2、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 70之重鏈CDR3、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 90之輕鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 104之輕鏈CDR2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 116之輕鏈CDR3。
在所揭示之方法之特定實施例中，抗CD20 scFv-14之抗原結合分子包含：包含胺基酸序列SEQ ID NO: 32之重鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 54之重鏈CDR2、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 70之重鏈CDR3、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 90之輕鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 104之輕鏈CDR2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 116之輕鏈CDR3。
在所揭示之方法之特定實施例中，抗CD20 scFv-14之抗原結合分子包含：包含胺基酸序列SEQ ID NO: 39之重鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 62之重鏈CDR2、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 80之重鏈CDR3、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 98之輕鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 110之輕鏈CDR2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 116之輕鏈CDR3。
在所揭示之方法之特定實施例中，關於GALV gp70結合分子，結合分子之重鏈可變區包含：根據SEQ ID NO: 127、157、及187中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 139、169、及199中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 211或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 128、158、及188中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 140、170、及200中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 151、181、及212中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 129、159、及189中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 141、171、及201中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 152、182、及213中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 130、160、及190中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 142、172、及202中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 214或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 131、161、及191中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 143、173、及203中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 153、183、及215中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 132、162、及192中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 144、174、及204中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 154、184、及216中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 133、163、及193中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 145、175、及205中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 155、185、及217中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 134、164、及194中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 146、176、及206中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 218或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 135、165、及195中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 147、177、及207中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 156、186、及219中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 136、166、及196中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 148、178、及208中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 220或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 137、167、及197中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 149、179、及209中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 221或DYY之HCDR3；或根據SEQ ID NO: 138、168、及198中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 150、180、及210中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 222或DYY之HCDR3。
在所揭示之方法之特定實施例中，關於GALV gp70結合分子，結合分子之輕鏈可變區包含：根據SEQ ID NO: 232、262、及292中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 242、272、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 252、282、及302中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 228、258、及288中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 238、268、及KVS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 248、278、及298中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 227、257、及287中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 237、267、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 247、277、及297中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 226、256、及286中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 236、266、及DTS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 246、276、及296中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 225、255、及285中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 235、265、及RAS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 245、275、及295中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 224、254、及284中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 234、264、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 244、274、及294中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 223、253、及283中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 233、263、及SGS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 243、273、及293中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 229、259、及289中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 239、269、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 249、279、及299中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 231、261、及291中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 241、271、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 251、281、及301中任一者之LCDR3；或根據SEQ ID NO: 230、260、290中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 240、270、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 250、280、及300中任一者之LCDR3。
在所揭示之方法之特定實施例中，關於GALV gp70結合分子，結合分子之輕鏈可變區及重鏈可變區包含：根據SEQ ID NO: 127、157、及187中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 139、169、及199中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 211或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 232、262、及292中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 242、272、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 252、282、及302中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 128、158、及188中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 140、170、及200中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 151、181、及212中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 228、258、及288中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 238、268、及KVS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 248、278、及298中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 129、159、及189中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 141、171、及201中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 152、182、及213中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 226、256、及286中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 236、266、及DTS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 246、276、及296中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 130、160、及190中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 142、172、及202中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 214或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 227、257、及287中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 237、267、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 247、277、及297中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 131、161、及191中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 143、173、及203中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 153、183、及215中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 227、257、及287中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 237、267、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 247、277、及297中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 132、162、及192中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 144、174、及204中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 154、184、及216中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 226、256、及286中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 236、266、及DTS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 246、276、及296中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 133、163、及193中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 145、175、及205中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 155、185、及217中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 225、255、及285中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 235、265、及RAS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 245、275、及295中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 134、164、及194中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 146、176、及206中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 218或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 224、254、及284中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 234、264、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 244、274、及294中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 135、165、及195中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 147、177、及207中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 156、186、及219中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 223、253、及283中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 233、263、及SGS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 243、273、及293中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 136、166、及196中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 148、178、及208中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 220或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 229、259、及289中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 239、269、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 249、279、及299中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 137、167、及197中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 149、179、及209中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 221或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 231、261、及291中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 241、271、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 251、281、及301中任一者之LCDR3；或根據SEQ ID NO: 138、168、及198中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 150、180、及210中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 222或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 230、260、290中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 240、270、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 250、280、及300中任一者之LCDR3。
標示可在分子中之任何位置與抗原結合分子聯結，但較佳的是在使得分子之結合性質未經修飾（除非此類經修飾之結合活性係所欲的）的點之位置（或若採用多個標示，則在多個位置），將標示與分子聯結。可採用特異性結合抗CD20 scFv-14分子或GALV gp70蛋白之全部或一部分之任何抗原結合分子，諸如本文所揭示者，例如具有一或多個表3A至表3C、表4A至表4C、或7A至表7C、表8A至表8C中所示之CDR者。
接下來，在允許形成結合複合物之條件下使樣本與抗原結合分子接觸，結合複合物包含存在於樣本中之細胞及抗原結合分子。抗原結合分子可設置於任何表面上，或根本不設置於表面上。例如，抗原結合分子可存在於緩衝液中，且可使緩衝液-抗原結合分子與樣本接觸。替代地，抗原結合分子可與表面聯結。合適的表面包括瓊脂糖珠、磁珠（諸如DYNABEADS™）、或塑膠、玻璃、或陶瓷盤（諸如孔盤）、袋（諸如細胞培養袋）等。表面本身可設置於另一結構中，諸如管柱。
在允許形成結合複合物之條件下使樣本與抗原結合分子接觸，結合複合物包含：分子，其包含包含抗CD20 scFv-14分子或GALV gp70蛋白之全部或一部分的分子；及抗原結合分子。允許形成結合複合物之條件將取決於各種因素，然而，通常在生理pH及離子強度下之水性緩衝液（諸如磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)）將有利於結合複合物之形成且在所揭示之方法中係較佳的。由於結合複合物之組分部分可如本文所述設置於表面上，因此所形成之結合複合物亦可設置於表面上。
在此階段，可能沒有形成結合複合物，或可能已形成包含一或多種抗原結合分子之複數個結合複合物，抗原結合分子結合至包含抗CD20 scFv-14分子之全部或一部分的分子（或包含結合至抗原結合分子[例如SEQ ID NO: 1至120]之抗CD20 scFv-14分子之全部或一部分的一或多種分子）。包含抗CD20 scFv-14分子之全部或一部分的未結合分子及/或未結合抗原結合分子亦可存在於任何所形成之結合複合物之局部環境中。
在其他態樣中，在此階段，可能沒有形成結合複合物，或可能已形成包含一或多種抗原結合分子之複數個結合複合物，抗原結合分子結合至包含GALV gp70蛋白之全部或一部分的分子。包含GALV gp70蛋白之全部或一部分的未結合分子及/或未結合抗原結合分子亦可存在於任何所形成之結合複合物之局部環境中。
接著，將任何非結合複合物之一部分之分子與任何所形成之結合複合物分離。移除方法將取決於結合複合物之結構及/或局部環境。例如，若抗原結合分子係設置於珠、盤、或袋上，則可使用使所形成之結合複合物保持完整之溶液將反應混合物之未結合組分洗滌去除。若結合複合物係設置於珠上，則珠本身可位於管柱或其他結構中，且可使用相同方法。
可使用用以誘導結合複合物形成之溶液作為例如洗滌溶液以移除未結合組分。亦可使用不破壞所形成之結合複合物之任何合適的緩衝液或溶液。一般而言，當執行該方法之此步驟時，應避免具有高鹽濃度、非生理pH、含有離散劑或變性劑之緩衝液。
最後，偵測結合複合物之存在或不存在，結合複合物將包含：包含抗CD20 scFv-14分子或GALV gp70蛋白結合分子之全部或一部分的分子（例如表3A至表3C、表4A至表4C、或表7A至表7C、表8A至表8C、表9至表10中所述之一或多者）。用以偵測結合複合物之存在或不存在的具體方法將取決於所選標示之本質。例如，當選擇螢光標示時，可採用FACS；當選擇同位素標示時，可採用質譜法、NMR、或其他技術；當選擇磁性標示時，可採用基於磁性之細胞分選；亦可採用顯微術。該方法之最終結果係包含可偵測標示之抗原結合分子之存在或不存在的定性評估、及因此其結合夥伴（包含抗CD20 scFv-14分子或GALV gp70蛋白之全部或一部分的分子）之存在或不存在的定性評估。
如所有所揭示之方法之情況，包含抗CD20 scFv-14分子或GALV gp70蛋白之全部或一部分的分子可設置於任何環境中。在較佳實施例中，包含抗CD20 scFv-14分子或GALV gp70蛋白之全部或一部分的分子係在細胞表面上表現。在此實施例中，細胞可係任何類型，且可係人類或非人類的（例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠等）。在一較佳實施例中，細胞係免疫細胞。該方法之免疫細胞可係任何類型的免疫細胞（例如B淋巴球、單核球、樹突細胞、蘭格罕細胞(Langerhans cell)、角質細胞、內皮細胞、星狀細胞、纖維母細胞、及寡樹突細胞(oligodendrocyte)）。T細胞（包括細胞毒性T細胞、輔助T細胞、及Treg細胞）係特別較佳的。在特定實施例中，細胞係T細胞，其可如本文所述及藉由所屬技術領域中已知的方法獲得。在所揭示之方法之此實施例中，可採用任何類型的免疫細胞，且細胞可係人類或非人類細胞。例示性細胞包括但不限於免疫細胞，諸如T細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、NK細胞、TCR表現性細胞、樹突細胞、及NK-T細胞。T細胞可係自體的、同種異體的、或異源的。在額外實施例中，細胞係呈現CAR之T細胞。T細胞可係CD4+ T細胞或CD8+ T細胞。當在所揭示之方法中採用T細胞時，T細胞可係體內T細胞或體外T細胞。
在額外實施例中，細胞可設置於能夠將細胞維持在存活形式之任何環境中或自其單離，諸如血液、組織、或自對象獲得之任何其他樣本、細胞培養基、離體生長之組織、合適的緩衝液等。 d) 增加分子之濃度的方法
所關注分子常常以低於所欲水平存在於樣本中。例如，當將細胞用外來基因轉染時，由外來基因編碼之（多種）蛋白質之表現水平低。對於自細胞分泌之分子亦是如此；若該分子包含抗CD20 scFv-14分子之全部或一部分及/或一或多個表3A至表3C及表4A至表4C中所述之分子中之一者，則此類分子常以低數量存在，但仍可使用本文所提供之方法偵測。對於病毒顆粒亦是如此；若該病毒顆粒包含GALV gp70蛋白之全部或一部分，則此類病毒顆粒常以低數量存在，但仍可使用本文所提供之方法偵測。低表現水平問題之解決方案係增加所關注分子之濃度，其可游離於溶液中或在細胞表面上表現。亦可增強胞內表現之所關注分子之濃度，然而，必須先將細胞裂解以釋放分子。
為了解決此問題，一種增加呈現分子之細胞之濃度的方法，該分子包含抗CD20 scFv-14分子之全部或一部分及/或表3A至表3C及表4A至表4C中所述之一或多種分子。在一進一步態樣中，本文描述一種增加呈現分子之病毒顆粒之濃度的方法，該分子包含GALV gp70蛋白之全部或一部分及/或一或多種分子法。
在一個實施例中，該方法包含提供包含已知或疑似包含分子之細胞的樣本，該分子包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：抗CD20 scFv-14分子之全部或一部分及/或表3A至表3C及表4A至表4C中所述之一或多種分子。在一進一步實施例中，該方法包含提供包含已知或疑似包含分子之細胞的樣本，該分子包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：GALV gp70蛋白分子之全部或一部分及/或表7A至表7C及表8A至表8C中所述之一或多種分子。
在所揭示之方法之特定實施例中，抗CD20 scFv-14之抗原結合分子包含：包含胺基酸序列SEQ ID NO: 25之重鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 46之重鏈CDR2、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 70之重鏈CDR3、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 90之輕鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 104之輕鏈CDR2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 116之輕鏈CDR3。
在所揭示之方法之特定實施例中，抗CD20 scFv-14之抗原結合分子包含：包含胺基酸序列SEQ ID NO: 32之重鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 54之重鏈CDR2、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 70之重鏈CDR3、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 90之輕鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 104之輕鏈CDR2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 116之輕鏈CDR3。
在所揭示之方法之特定實施例中，抗CD20 scFv-14之抗原結合分子包含：包含胺基酸序列SEQ ID NO: 39之重鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 62之重鏈CDR2、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 80之重鏈CDR3、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 98之輕鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 110之輕鏈CDR2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 116之輕鏈CDR3。
在所揭示之方法之特定實施例中，關於GALV gp70結合分子，結合分子之重鏈可變區包含：根據SEQ ID NO: 127、157、及187中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 139、169、及199中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 211或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 128、158、及188中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 140、170、及200中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 151、181、及212中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 129、159、及189中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 141、171、及201中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 152、182、及213中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 130、160、及190中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 142、172、及202中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 214或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 131、161、及191中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 143、173、及203中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 153、183、及215中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 132、162、及192中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 144、174、及204中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 154、184、及216中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 133、163、及193中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 145、175、及205中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 155、185、及217中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 134、164、及194中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 146、176、及206中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 218或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 135、165、及195中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 147、177、及207中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 156、186、及219中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 136、166、及196中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 148、178、及208中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 220或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 137、167、及197中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 149、179、及209中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 221或DYY之HCDR3；或根據SEQ ID NO: 138、168、及198中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 150、180、及210中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 222或DYY之HCDR3。
在所揭示之方法之特定實施例中，關於GALV gp70結合分子，結合分子之輕鏈可變區包含：根據SEQ ID NO: 232、262、及292中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 242、272、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 252、282、及302中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 228、258、及288中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 238、268、及KVS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 248、278、及298中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 227、257、及287中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 237、267、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 247、277、及297中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 226、256、及286中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 236、266、及DTS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 246、276、及296中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 225、255、及285中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 235、265、及RAS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 245、275、及295中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 224、254、及284中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 234、264、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 244、274、及294中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 223、253、及283中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 233、263、及SGS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 243、273、及293中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 229、259、及289中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 239、269、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 249、279、及299中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 231、261、及291中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 241、271、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 251、281、及301中任一者之LCDR3；或根據SEQ ID NO: 230、260、290中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 240、270、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 250、280、及300中任一者之LCDR3。
在所揭示之方法之特定實施例中，關於GALV gp70結合分子，結合分子之輕鏈可變區及重鏈可變區包含：根據SEQ ID NO: 127、157、及187中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 139、169、及199中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 211或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 232、262、及292中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 242、272、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 252、282、及302中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 128、158、及188中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 140、170、及200中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 151、181、及212中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 228、258、及288中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 238、268、及KVS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 248、278、及298中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 129、159、及189中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 141、171、及201中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 152、182、及213中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 226、256、及286中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 236、266、及DTS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 246、276、及296中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 130、160、及190中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 142、172、及202中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 214或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 227、257、及287中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 237、267、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 247、277、及297中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 131、161、及191中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 143、173、及203中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 153、183、及215中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 227、257、及287中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 237、267、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 247、277、及297中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 132、162、及192中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 144、174、及204中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 154、184、及216中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 226、256、及286中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 236、266、及DTS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 246、276、及296中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 133、163、及193中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 145、175、及205中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 155、185、及217中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 225、255、及285中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 235、265、及RAS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 245、275、及295中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 134、164、及194中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 146、176、及206中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 218或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 224、254、及284中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 234、264、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 244、274、及294中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 135、165、及195中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 147、177、及207中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 156、186、及219中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 223、253、及283中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 233、263、及SGS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 243、273、及293中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 136、166、及196中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 148、178、及208中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 220或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 229、259、及289中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 239、269、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 249、279、及299中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 137、167、及197中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 149、179、及209中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 221或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 231、261、及291中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 241、271、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 251、281、及301中任一者之LCDR3；或根據SEQ ID NO: 138、168、及198中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 150、180、及210中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 222或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 230、260、290中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 240、270、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 250、280、及300中任一者之LCDR3。
在特定實施例中，包含抗CD20 scFv-14分子之全部或一部分及/或表3A至表3C及表4A至表4C中所述之一或多種分子的分子係CAR。當分子係CAR時，其可包含選自由下列所組成之群組的分子或其片段：CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a (ITGAL)、CD11b (ITGAM)、CD11c (ITGAX)、CD11d (ITGAD)、CD18 (ITGB2)、CD19 (B4)、CD27 (TNFRSF7)、CD28、CD29 (ITGB1)、CD30 (TNFRSF8)、CD40 (TNFRSF5)、CD48 (SLAMF2)、CD49a (ITGA1)、CD49d (ITGA4)、CD49f (ITGA6)、CD66a (CEACAM1)、CD66b (CEACAM8)、CD66c (CEACAM6)、CD66d (CEACAM3)、CD66e (CEACAM5)、CD69 (CLEC2)、CD79A（B細胞抗原受體複合物相關α鏈）、CD79B（B細胞抗原受體複合物相關β鏈）、CD84 (SLAMF5)、CD96 (Tactile)、CD100 (SEMA4D)、CD103 (ITGAE)、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD158A (KIR2DL1)、CD158B1 (KIR2DL2)、CD158B2 (KIR2DL3)、CD158C (KIR3DP1)、CD158D (KIRDL4)、CD158F1 (KIR2DL5A)、CD158F2 (KIR2DL5B)、CD158K (KIR3DL2)、CD160 (BY55)、CD162 (SELPLG)、CD226 (DNAM1)、CD229 (SLAMF3)、CD244 (SLAMF4)、CD247 (CD3ζ)、CD258 (LIGHT)、CD268 (BAFFR)、CD270 (TNFSF14)、CD272 (BTLA)、CD276 (B7-H3)、CD279 (PD-1)、CD314 (NKG2D)、CD319 (SLAMF7)、CD335 (NK-p46)、CD336 (NK-p44)、CD337 (NK-p30)、CD352 (SLAMF6)、CD353 (SLAMF8)、CD355 (CRTAM)、CD357 (TNFRSF18)、可誘導T細胞共刺激分子(ICOS)、LFA-1 (CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80 (KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS (GrpL)、SLP-76 (LCP2)、PAG1/CBP、CD83配體、Fcγ受體、MHC 1類分子、MHC 2類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白蛋白質、細胞介素受體、整合素、活化NK細胞受體、類鐸受體、及其組合。
提供特異性結合抗CD20 scFv-14分子之全部或一部分之抗原結合分子（例如表3A至表3C及表4A至表4C中所述之分子中之一或多者）或特異性結合至GALV gp70蛋白且可選地包含可偵測標示之抗原結合分子。如本文所述，當較佳的是採用可偵測標示時，任何可偵測標示可用於該方法中，且可使用所欲的一組標準選擇合適的標示。可偵測標示之類型之實例包括螢光標示（例如螢光素、玫瑰紅、四甲基羅丹明(tetramethylrhodamine)、伊紅(eosin)、赤藻紅(erythrosin)、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀綠(Malachite green)、二苯乙烯、Lucifer Yellow、Cascade Blue、Texas Red、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC Red 640、Cy 5、Cy 5.5、LC Red 705、Oregon green、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680)、Cascade Blue、Cas-cade Yellow及R-藻紅蛋白(PE) (Molecular Probes)、FITC、玫瑰紅、及Texas Red (Pierce)、Cy5、Cy5.5、Cy7 (Amersham Life Science)）。合適的光學染料（包括螢光團）係描述於Johnson, Molecular Probes Handbook:A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Techniques, 11 thEdition, Life Technologies, (2010)，其特此以引用方式明確併入本文中；放射性標示（例如同位素標記，諸如 3H、 11C、 14C、 15N、 18F、 35S、 64CU、 90Y、 99Tc、 111In、 124I、 125I、 131I）。光致變色化合物、Halo-tag、Atto染料、Tracy染料、蛋白質螢光標示（例如蛋白質螢光標示亦包括但不限於綠色螢光蛋白（包括GFP之Renilla、Ptilosarcus、或Aequorea物種(Chalfie et al., (1994) Science263:802-805)、EGFP（Clon-tech Labs., Inc.，Genbank登錄號U55762））、藍色螢光蛋白(BFP, Quantum Biotechnologies, Inc; Stauber, (1998) Biotechniques24:462-471; Heim et al., (1996) Curr. Biol.6: 178-182)、增強型黃色螢光蛋白(Clontech Labs., Inc.)、螢光素酶(Ichiki et al., (1993) J. Immunol.150:5408-5417)、磁性標示（例如DYNABEADS）等皆可採用。用於標示蛋白質之策略係所屬技術領域中熟知的且可用於所揭示之方法中。
標示可在分子中之任何位置與抗原結合分子聯結，但較佳的是在使得分子之結合性質未經修飾（除非此類經修飾之結合活性係所欲的）的點之位置（或若採用多個標示，則在多個位置），將標示與分子聯結。關於抗CD20 scFv-14分子，可採用特異性結合下列之任何抗原結合分子（例如表3A至表3C及表4A至表4C中所述之分子中之一或多者）：包含抗CD20 scFv-14分子之全部或一部分的分子；或包含結合至抗原結合分子或其片段之抗CD20 scFv-14分子之全部或一部分的一或多種分子，諸如本文所揭示者，例如具有一或多個表3A至表3C及表4A至表4C中所述之CDR者。關於GALV gp70蛋白，可採用特異性結合GALV gp70蛋白之全部或一部分之任何抗原結合分子或其片段，諸如本文所揭示者，例如具有一或多個表7A至表7C及表8A至表8C中所示之CDR者。
在所揭示之方法之特定實施例中，抗CD20 scFv-14之抗原結合分子包含：包含胺基酸序列SEQ ID NO: 25之重鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 46之重鏈CDR2、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 70之重鏈CDR3、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 90之輕鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 104之輕鏈CDR2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 116之輕鏈CDR3。
在所揭示之方法之特定實施例中，抗CD20 scFv-14之抗原結合分子包含：包含胺基酸序列SEQ ID NO: 32之重鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 54之重鏈CDR2、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 70之重鏈CDR3、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 90之輕鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 104之輕鏈CDR2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 116之輕鏈CDR3。
在所揭示之方法之特定實施例中，抗CD20 scFv-14之抗原結合分子包含：包含胺基酸序列SEQ ID NO: 39之重鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 62之重鏈CDR2、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 80之重鏈CDR3、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 98之輕鏈CDR1、包含胺基酸序列SEQ ID NO: 110之輕鏈CDR2、及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 116之輕鏈CDR3。
在所揭示之方法之特定實施例中，關於GALV gp70結合分子，結合分子之重鏈可變區包含：根據SEQ ID NO: 127、157、及187中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 139、169、及199中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 211或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 128、158、及188中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 140、170、及200中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 151、181、及212中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 129、159、及189中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 141、171、及201中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 152、182、及213中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 130、160、及190中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 142、172、及202中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 214或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 131、161、及191中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 143、173、及203中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 153、183、及215中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 132、162、及192中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 144、174、及204中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 154、184、及216中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 133、163、及193中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 145、175、及205中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 155、185、及217中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 134、164、及194中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 146、176、及206中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 218或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 135、165、及195中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 147、177、及207中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 156、186、及219中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 136、166、及196中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 148、178、及208中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 220或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 137、167、及197中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 149、179、及209中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 221或DYY之HCDR3；或根據SEQ ID NO: 138、168、及198中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 150、180、及210中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 222或DYY之HCDR3。
在所揭示之方法之特定實施例中，關於GALV gp70結合分子，結合分子之輕鏈可變區包含：根據SEQ ID NO: 232、262、及292中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 242、272、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 252、282、及302中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 228、258、及288中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 238、268、及KVS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 248、278、及298中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 227、257、及287中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 237、267、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 247、277、及297中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 226、256、及286中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 236、266、及DTS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 246、276、及296中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 225、255、及285中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 235、265、及RAS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 245、275、及295中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 224、254、及284中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 234、264、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 244、274、及294中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 223、253、及283中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 233、263、及SGS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 243、273、及293中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 229、259、及289中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 239、269、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 249、279、及299中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 231、261、及291中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 241、271、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 251、281、及301中任一者之LCDR3；或根據SEQ ID NO: 230、260、290中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 240、270、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 250、280、及300中任一者之LCDR3。
在所揭示之方法之特定實施例中，關於GALV gp70結合分子，結合分子之輕鏈可變區及重鏈可變區包含：根據SEQ ID NO: 127、157、及187中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 139、169、及199中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 211或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 232、262、及292中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 242、272、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 252、282、及302中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 128、158、及188中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 140、170、及200中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 151、181、及212中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 228、258、及288中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 238、268、及KVS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 248、278、及298中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 129、159、及189中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 141、171、及201中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 152、182、及213中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 226、256、及286中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 236、266、及DTS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 246、276、及296中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 130、160、及190中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 142、172、及202中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 214或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 227、257、及287中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 237、267、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 247、277、及297中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 131、161、及191中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 143、173、及203中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 153、183、及215中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 227、257、及287中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 237、267、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 247、277、及297中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 132、162、及192中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 144、174、及204中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 154、184、及216中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 226、256、及286中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 236、266、及DTS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 246、276、及296中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 133、163、及193中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 145、175、及205中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 155、185、及217中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 225、255、及285中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 235、265、及RAS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 245、275、及295中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 134、164、及194中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 146、176、及206中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 218或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 224、254、及284中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 234、264、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 244、274、及294中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 135、165、及195中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 147、177、及207中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 156、186、及219中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 223、253、及283中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 233、263、及SGS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 243、273、及293中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 136、166、及196中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 148、178、及208中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 220或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 229、259、及289中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 239、269、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 249、279、及299中任一者之LCDR3；根據SEQ ID NO: 137、167、及197中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 149、179、及209中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 221或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 231、261、及291中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 241、271、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 251、281、及301中任一者之LCDR3；或根據SEQ ID NO: 138、168、及198中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 150、180、及210中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 222或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 230、260、290中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 240、270、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 250、280、及300中任一者之LCDR3。
抗原結合分子（例如表3A至表3C、表4A至表4C、表7A至表7C、表8A至表8C中所述之一或多種分子）可設置於任何表面上，或根本不設置於表面上。例如，抗原結合分子可存在於緩衝液中，且可使緩衝液-抗原結合分子與樣本接觸。替代地，抗原結合分子可與表面聯結。合適的表面包括瓊脂糖珠、磁珠（諸如DYNABEADS™）、或塑膠、玻璃、或陶瓷盤（諸如孔盤）、袋（諸如細胞培養袋）等。表面本身可設置於另一結構中，諸如管柱。
表現包含抗CD20 scFv-14分子之全部或一部分的分子之細胞可係任何類型，且可係人類或非人類的（例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠等）。在一較佳實施例中，細胞係免疫細胞。該方法之免疫細胞可係任何類型的免疫細胞（例如B淋巴球、單核球、樹突細胞、蘭格罕細胞(Langerhans cell)、角質細胞、內皮細胞、星狀細胞、纖維母細胞、及寡樹突細胞(oligodendrocyte)）。T細胞（包括細胞毒性T細胞、輔助T細胞、及Treg細胞）係特別較佳的。在特定實施例中，細胞係T細胞，其可如本文所述及藉由所屬技術領域中已知的方法獲得。可採用任何類型的免疫細胞，且細胞可係人類或非人類細胞。例示性細胞包括但不限於免疫細胞，諸如T細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、NK細胞、TCR表現性細胞、樹突細胞、及NK-T細胞。T細胞可係自體的、同種異體的、或異源的。在額外實施例中，細胞係呈現CAR之T細胞。T細胞可係CD4+ T細胞或CD8+ T細胞。當在所揭示之方法中採用T細胞時，T細胞可係體內T細胞或體外T細胞。此外，細胞可設置於能夠將細胞維持在存活形式之任何環境中或自其單離，諸如血液、組織、或自對象獲得之任何其他樣本、細胞培養基、離體生長之組織、合適的緩衝液等。
在允許形成結合複合物之條件下使包含細胞及/或病毒顆粒之樣本與抗原結合分子接觸，結合複合物包含抗CD20 scFv-14分子或GALV gp70蛋白之全部或一部分及抗原結合分子（例如表3A至表3C、表4A至表4C、表7A至表7C、或表8A至表8C中所述之一或多種分子）。允許形成結合複合物之條件將取決於各種因素，然而，通常在生理pH及離子強度下之水性緩衝液（諸如磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)）將有利於結合複合物之形成且在所揭示之方法中係較佳的。由於結合複合物之組分部分可如本文所述設置於表面上，因此所形成之結合複合物亦可設置於表面上。
在此階段，可能沒有形成結合複合物，或可能已形成包含一或多種抗原結合分子（例如表3A至表3C、表4A至表4C、表7A至表7C、表8A至表8C中所述之一或多種分子）之複數個結合複合物，抗原結合分子結合至抗CD20 scFv-14分子或GALV gp70蛋白之全部或一部分。包含抗CD20 scFv-14分子、GALV gp70蛋白之全部或一部分的未結合分子及/或未結合抗原結合分子（例如表3A至表3C、表4A至表4C、表7A至表7C、表8A至表8C中所述之一或多種分子）亦可存在於任何所形成之結合複合物之局部環境中。
接著，將任何非結合複合物之一部分之分子或細胞與任何所形成之結合複合物分離。移除方法將取決於結合複合物之結構及/或局部環境。例如，若抗原結合分子係結合於珠、盤、或袋上，則可使用使所形成之結合複合物保持完整之溶液將反應混合物之未結合組分洗滌去除。若結合複合物係結合於珠上，則珠本身可位於管柱或其他結構中，且可使用相同方法。
可使用用以誘導結合複合物形成之溶液作為例如洗滌溶液以移除未結合組分。亦可使用不破壞所形成之結合複合物之任何合適的緩衝液或溶液。一般而言，當執行該方法之此步驟時，應避免具有高鹽濃度、非生理pH、含有離散劑或變性劑之緩衝液。
在該方法之此階段，將存在呈現包含抗CD20 scFv-14分子之全部或一部分的分子之細胞群或呈現GALV gp70蛋白之病毒顆粒。若採用可偵測標示，則與標示之本質一致，可容易判定細胞或病毒顆粒之濃度。將不存在不表現包含抗CD20 scFv-14分子或GALV gp70蛋白之全部或一部分的分子之細胞或病毒顆粒，因此相較於執行該方法前的水平，呈現包含抗CD20 scFv-14分子之全部或一部分的分子之細胞或呈現GALV gp70蛋白之病毒顆粒之群體（或濃度）將增加。
若包含抗CD20 scFv-14分子之全部或一部分及/或表3A至表3C、表4A至表4C中所述之一或多種分子的分子、或呈現GALV gp70蛋白及/或表7A至表7C及表8A至表8C中所述之一或多種分子之病毒顆粒之濃度未達到所欲水平，則可將上述步驟重複所欲次數。在該方法之此步驟之背景下，若已存在所欲濃度的細胞，則所欲次數亦可係零。 實例
將超免疫小鼠用與衍生自小鼠免疫球蛋白蛋白質同型G2a之可結晶片段(Fc)域融合的scFv14免疫。對此等培養上清液針對顯示與scFv14特異性結合之抗體之存在進行篩選。使用來自選自此篩選之融合瘤之抗體重鏈及輕鏈基因序列（例如SEQ ID NO: 1至20）以產生抗體，再次檢查抗體對scFv14之特異性。將來自此篩選之所選抗體與藻紅蛋白(PE)及螢光異硫氰酸鹽(FITC)螢光團偶合，並藉由流式細胞術表徵。
在25種融合瘤上清液中，14種顯示與表現scFv14（靶向抗CD20之scFv）之人類CAR T細胞特異性結合，但不與不相關抗CD20 CAR scFv、帶有FMC63之抗CD19 CAR、或來自相同健康供體之未經轉導T細胞特異性結合。發現14種殖株中之10種適用於抗體產生。在抗體產生之後，重新測試所有10種殖株針對scFv14、及不相關抗CD20 CAR、及帶有FMC63之抗CD19 CAR之選擇性及敏感性。其中，將5種與螢光團偶合，以用於藉由流式細胞術表徵。其中一種殖株24C12顯示與scFv14穩健、敏感、且特異性結合，但不與不相關抗CD20 CAR或帶有FMC63之抗CD19 CAR穩健、敏感、且特異性結合，且選擇其用作流式細胞術試劑以表徵抗CD20樣本中之scFv14表現。
抗體產生及表徵活動產出抗體殖株24C12，無論與PE或FITC接合，其強烈地結合至抗CD20 CAR中所含有之抗CD20 scFv，但不結合至不相關抗CD20 CAR或抗CD19 CAR scFv。本文以下實例章節詳述相關方法。
用於此研究中之試劑包括FACS染色緩衝液、山羊抗小鼠IgG AF-488、小鼠IgG同型對照、Whitlow連接子對照(LC) PE、LC AF-647、Live/Dead fixable violet染色劑、Live/Dead fixable aqua染色劑、24C12 PE、及24C12 FITC，縮寫：AF，Alexa Fluor；FACS，螢光活化細胞分選儀；FITC，螢光異硫氰酸鹽；IgG，免疫球蛋白G；PE，藻紅蛋白。LC係客製化抗體，其與嵌合抗原受體(CAR)單鏈可變片段(scFv)之輕鏈與重鏈之間的肽連接子結合，使得能夠評估總CAR轉導效率。縮寫：AF，Alexa Fluor；FACS，螢光活化細胞分選儀；FITC，螢光異硫氰酸鹽；IgG，免疫球蛋白G；PE，藻紅蛋白。KIP-1係客製化抗體，其與嵌合抗原受體(CAR)單鏈可變片段(scFv)之輕鏈與重鏈之間的肽連接子結合，使得能夠評估總CAR轉導效率。用於此研究中之設備包括Sorvall Legend XTR離心機、Vi-Cell XR、及FACs Fortessa X-20 II。縮寫：FACS，螢光活化細胞分選儀。
此等研究使用一種抗CD19 CAR及三種抗CD20 CAR（表14）。抗CD19 CAR FMC63-28z包括FMC63抗CD19靶向性scFv。三種抗CD20 CAR差異僅在於用以靶向CD20之scFv；scFv包括scFv2、scFv14、及Leu16。scFv14及scFv2係互補決定區不同的完全人類抗CD20 scFv。Leu16係鼠類抗人類CD20 scFv。參見例如Wu et al., (2001) Protein Eng.2001;14 (12):1025-33，其全文出於任何目的以引用方式併入本文中。完成使用IgBLAST（Ig基本局部比對搜尋工具）進行之Leu16及FMC63生殖系基因識別之序列分析。 表14. 用於此研究中之CAR scFv
CAR scFv 域 Vl 基因 Vh 基因 目標
scFv2 人類Vk1-39 人類Vh1-18 CD20
scFv14 人類Vk1-39 人類Vh4-39 CD20
Leu16 鼠類Vk4-72 鼠類Vh1-12 CD20
FMC63 鼠類Vk10-96 鼠類Vh2-6 CD19
縮寫：CAR，嵌合抗原受體；scFv，單鏈可變片段；Vh，可變重鏈；Vl，可變輕鏈；Vk，可變區基因區段。 I. 實例1 ：融合瘤產生
將Abveris DiversimAb™超免疫小鼠(Canton, MA)用衍生自scFv14之scFv-Fc蛋白及鼠類IgG2a Fc免疫。首先以連續稀釋測試融合瘤上清液對帶有scFv14之CAR及作為陰性對照之帶有FMC63之CAR之敏感性，接著在針對含有scFv2、scFv14、及Leu16之CAR的選擇性篩選中進行測試。選擇scFv14之結合物進行抗體定序及重組蛋白產生，但不選擇FMC63、scFv2、或Leu16之結合物。再次測試經純化重組抗體以確認對scFv14之特異性，且隨後將其與螢光團接合。對經接合抗體針對特異性及敏感性重新篩選，且選擇一種殖株用於偵測scFv14。 II. 實例2 ：融合瘤敏感性篩選
為了測試融合瘤上清液之敏感性，執行連續稀釋篩選。將未經轉導(non-transduced, NTD)、或用帶有scFv14之CAR或帶有FMC63之CAR轉導之健康供體T細胞與融合瘤上清液一起培養，並用染色緩衝液連續稀釋。陰性對照由免疫球蛋白(Ig)同型對照、來自不相關融合瘤之條件培養基、及來自免疫前小鼠之匯集血清所組成。將來自小鼠免疫之多株血清用作陽性對照。
將細胞與經稀釋之上清液在室溫(RT)下一起培養45分鐘，接著收集，並用染色緩衝液洗滌兩次。將樣本染色。將上清液及對照樣本用與Alexa Fluor (AF)-488偶合之山羊抗小鼠IgG染色(1:4,000)。將用以判定整體CAR表現之對照用與藻紅蛋白(PE)接合之抗連接子特異性抗體LC染色(1:1,000)。所有樣本皆在含有活力染料Live-Dead Fixable Violet (1:2,000)之染色緩衝液中培養。將細胞在RT下染色45分鐘，收集，並用染色緩衝液洗滌兩次，接著立即在BD Fortessa TM流式細胞儀上讀取。使用FlowJo TM軟體（BD，版本10.6）分析數據，且將事件系統性地對細胞（使用前散射[FSC]面積側散射[SSC]面積圖）、單一細胞（使用FSC面積FSC高度圖）、活細胞（活力染料）、及藻紅蛋白(PE)（用於CAR對照抗體）或AF-488（用於上清液樣本）進行圈選(gated)，其中圈選臨限係基於NTD對照細胞設定。 III. 實例3 ：融合瘤特異性測試
對於特異性測試，使用用帶有scFv2、scFv14、或Leu16 scFv之CAR轉導之人類T細胞。為了確保特異性篩選中之穩健染色，以稀釋篩選中所使用之最高濃度對顯示與scFv14結合之上清液進行測試。將細胞染色並進行分析。 IV. 實例4 ：重組抗體表徵
在自連續稀釋及特異性篩選中選出之融合瘤的抗體可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)域定序之後，由Genscript (Piscataway, NJ)依標準程序製造抗體。簡言之，蛋白質係使用Expi293F細胞表現並使用MabSelect SuRe LX（GE Healthcare，目錄號17-5474-02）進行一步親和純化。藉由SDS-PAGE及SEC-HPLC評估純度。將抗體用0.22 μm過濾器無菌過濾，無菌封裝，並儲存在-80 °C下。
對於重組抗體特異性及選擇研究，收集用帶有scFv2、scFv14、或FMC63之CAR轉導之健康人類供體T細胞，將其用染色緩衝液洗滌兩次，接著與抗scFv14抗體或小鼠IgG同型對照之各者（皆為300 ng/mL）一起培養，或在不存在一級抗體之情況下作為陰性對照。亦包括NTD健康供體T細胞對照。將細胞染色並進行分析。 V. 實例5 ：螢光團與重組抗體之接合
將抗scFv14抗體24C12送至BD Pharmingen™以用於與螢光團PE及螢光異硫氰酸鹽(FITC)之客製化接合。簡言之，將雜雙官能交聯試劑4-(N-順丁烯二醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯(SMCC)與PE偶合，且將SMCC-PE與還原抗體共價接合。隨後，使用粒徑篩析層析法將1:1 PE接合抗體純化，並將緩衝液交換成PBS。依標準規程將反應性FITC分子與EV-aFMC63偶合，以將螢光團與抗體上之一級胺偶合。使用標準粒徑篩析層析方法將未經接合之螢光團移除，並將緩衝液交換成PBS (pH 7.4)。 VI. 實例6 ：經螢光團接合之抗體表徵
對於經螢光團接合之24C12抗體之表徵，收集用帶有scFv2、scFv14、或FMC63之CAR轉導之供體T細胞，將其用染色緩衝液洗滌兩次，接著與用PE或FITC標示之24C12之連續稀釋液一起培養。包括來自相同健康供體、同型對照、及未染色對照之NTD T細胞。所有樣本皆在含有活力染料Live-Dead Fixable Aqua (1:1,000)之染色緩衝液中培養。將細胞在4°C下染色15分鐘，收集，用染色緩衝液洗滌兩次，接著於0.6% (v/v)多聚甲醛中在RT下固定10分鐘，並儲存在4°C下直到在BD Fortessa™流式細胞儀上讀取。使用FlowJo™軟體（BD，版本10.6）分析數據，且將事件系統性地對細胞（使用前散射[FSC]面積側散射[SSC]面積圖）、單一細胞（使用FSC面積FSC高度圖）、活細胞（活力染料）、及PE、FITC、或AF-647進行圈選，其中圈選臨限係基於NTD對照細胞設定。 VII. 實例7 ：融合瘤上清液特性
將一小組25個經冷凍保存之融合瘤及相關培養上清液（研究報告KIT19025-1）送至Kite進行篩選（表15）。根據本文所述之方法將上清液表徵。基於本文之選擇標準，將融合瘤（表15）定序且作為重組抗體產生並表徵。 表15. 融合瘤上清液特性
融合瘤身分 濃度( μg/mL) KD (M)
23D4 21.1 1.61E x 10 12
24C12 低於偵測極限 1.38E x 10 12
29F8 20.9 1.31E x 10 12
25F10 22.6 4.08E x 10 12
29F1 13.8 5.34E x 10 11
25B2 低於偵測極限 3.82E x 10 10
21B5 13.3 8.23E x 10 09
22H5 6.6 6.33E x 10 10
26G4 33.2 1.66E x 10 08
20C4 36.1 1.02E x 10 08
24H1 33.2 3.12E x 10 08
13C2 28.6 2.41E x 10 09
24D9 10.2 8.80E x 10 09
27B9 17.1 2.87E x 10 08
23C11 2.9 3.72E x 10 09
23E1 34.2 3.28E x 10 09
24C7 4.3 3.90E x 10 09
26E1 16.9 5.54E x 10 09
23G3 31.4 1.04E x 10 07
23A9 22.9 1.78E x 10 08
12F8 28.2 1.34E x 10 05
13G4 8.8 NB
18D7 7.4 NB
19E5 34.8 NB
29C7 20.5 NB
縮寫：NB，無結合。 備註：此表列出融合瘤、上清液中對應的總蛋白質濃度、及藉由Octet平衡結合檢定估計之親和係數(KD (M))（參見ELN EXP-20-BD1634）。 VIII. 實例8 ：融合瘤敏感性及連續稀釋篩選
為了評估融合瘤培養上清液對scFv-14之相對結合敏感性，將上清液連續稀釋並針對NTD T細胞、含有scFv-14之CAR T細胞、或含有FMC63之CAR T細胞進行篩選。將來自小鼠免疫之多株血清(Abveris™ KIT19025-1)用作陽性對照。將來自未經免疫小鼠之匯集正常血清、來自不相關融合瘤之條件培養基(CM)、及小鼠IgG同型對照用作陰性對照。
圖1之圖A顯示帶有scFv14及帶有FMC63之CAR兩者皆由經轉導T細胞表現（分別為73.3%及83.7% LC +），如藉由用對照抗連接子抗體LC染色所判定。LC係客製化抗體，其與CAR scFv之輕鏈與重鏈之間的肽連接子結合，使得能夠評估總CAR轉導效率。CM、同型對照、及正常小鼠血清對照未顯示出與scFv-14之結合（圖1之圖B至D）。未觀察到此等對照與FMC63-28z CAR細胞之結合（數據未顯示）。如預期，帶有scFv14之CAR T細胞用多株抗血清染色呈陽性（圖1之圖E）。沒有上清液顯示出與NTD T細胞（數據未顯示）或表現帶有FMC63之CAR之T細胞（數據未顯示）之結合。
由於上清液中之低抗體濃度可能造成相對較差的結合，因此執行範圍尋找(range-finding)初步篩選，以判定合適的範圍以測試連續稀釋檢定中之相對敏感性。基於初步篩選之結果（數據未顯示），將25種融合瘤培養上清液分成2組；25種上清液中之9種為1組用螢光活化細胞分選(FACS)染色緩衝液以1:500 (v/v)稀釋開始，以2倍連續稀釋進行測試。與scFv-14之結合係藉由用與AF-488偶合之山羊抗小鼠IgG染色而判定（數據未顯示）。剩餘16種用FACS染色緩衝液以1:125 (v/v)稀釋開始，以2倍連續稀釋進行測試。與scFv-14之結合係藉由用與AF-488偶合之山羊抗小鼠IgG染色而判定（數據未顯示）。
作為最終檢查，在第一連續稀釋中未顯示出結合之上清液(29C7)以及在第二連續稀釋中不具有結合之12個樣本（23A9、23G3、24D9、24H1、26G4、27B9、12F8、13G4、18D7、19E5、20C4、及21B5）用染色緩衝液以1:2之單次稀釋進行測試。此最終稀釋揭露，2種上清液顯示與帶有scFv14之CAR結合，但不與NTD對照（參見圖2）或帶有FMC63之CAR（圖16）結合。選擇在各別最低連續稀釋下展示與scFv14結合、但不與NTD T細胞或FMC63-28z結合之融合瘤用於特異性篩選。
來自連續稀釋之結果顯示，整體而言，14種融合瘤上清液與scFv-14結合，但不與NTD對照或抗CD19 CAR T細胞結合。進一步選擇以下融合瘤用於特異性篩選：13C2、22H5、23C11、24C12、25B2、25F10、29F8、29F1、23D4、23E1、24C7、26E1、18D7、及24D9。
所選融合瘤之間的平均螢光強度(MFI)有大的偏移。圖3彙總相較於樣本之MFI，針對特異性篩選所選之14種融合瘤之各者在所測試之最高濃度下的結合。顯示的是各樣本中AF-488 +細胞之分率（參見圖3A）及AF-488 +群體之MFI（參見圖3B）。 IX. 實例9 ：融合瘤特異性篩選
為了評估對scFv14之特異性，對上清液針對與表現帶有scFv14之CAR、不相關的帶有抗CD20 scFv2或帶有Leu16之CAR的T細胞、或NTD T細胞對照之結合進行篩選。將匯集多株免疫後抗血清用作陽性對照，而陰性對照由匯集免疫前小鼠血清、來自不相關融合瘤之CM、及小鼠IgG同型對照所組成（參見圖4）。如藉由LC PE染色所判定，帶有scFv2、帶有scFv14、及帶有Leu16之CAR T細胞之整體CAR表現分別係77.7%、88.0%、及84.5%（參見圖4）。所有3種CAR皆顯示出一些與多株抗血清之結合。由於免疫原係抗CD20 CAR，因此預期多株抗血清會對此檢定中所測試之CAR中之各種共用域產生反應。隨後，在連續稀釋中顯示與scFv14結合之14種融合瘤以本文中所使用之最高濃度進行篩選（參見圖5）。包括LC PE +對照作為參考以判定各CAR之表現百分比。結果指示，所有14種融合瘤上清液皆與scFv-14特異性結合，但不與陰性對照中之任一者結合。 X. 實例10 ：選擇用於定序及抗體產生之融合瘤
本文實例中所述之連續稀釋及選擇篩選之目的係選擇用於產生之候選融合瘤。基於此等結果，選擇針對特異性測試之14種融合瘤中之10種用於定序及抗體產生。若一些殖株之序列與另一殖株太類似，或其在融合瘤上清液篩選中似乎係弱結合體，則不選擇該等殖株。10種融合瘤包括18D7、22H5、23C11、23E1、24C12、24C7、25B2、25F10、29F1、29F8。 XI. 實例11 ：抗體結合確認及用於表徵之選擇
為了確認抗體殖株對scFv-14之選擇性，對其等針對NTD T細胞或表現帶有scFv-14、scFv2、或FMC63之CAR之T細胞進行篩選。CAR表現係藉由LC染色判定且發現分別為68.4%、67.5%、及67.7%。在流式細胞術實驗中，抗體殖株24C12、29F1、24C7、23E1、23C11、18D7、25B2、及29F8顯示出與scFv-14之特異性結合。基於此等結果，將所有8種殖株送至BD Biosciences™ (San Diego, CA)以用於與PE及FITC之接合。 XII. 實例12 ：24C12 之接合後表徵
在送至BD™以用於與螢光染料(fluorochrome)之接合之8種重組抗體中，僅5種及時送達Kite Pharma™以納入此報告中。儘管基於整體優異的結合特性，發現所有5種抗scFv-14抗體皆對KITE-363之抗CD20 scFv組分具有選擇性（數據未顯示），但選擇抗體中之1種(24C12)以用於最終表徵。
對與PE或FITC接合之抗體殖株24C12針對健康供體T細胞進行篩選，健康供體T細胞保持NTD或經轉導以表現帶有scFv2、scFv14、或FMC63之CAR。無論螢光團接合物為何，抗體24C12顯示出與scFv14之特異性結合（參見圖6）。在所測試之最高抗體濃度(256 ng/mL)下，PE +（參見圖6A）或FITC +（參見圖6B）細胞之分率顯示出與帶有scFv14之CAR之選擇性結合，且缺乏與不相關的帶有scFv2或FMC63之CAR之結合。作為參考，如藉由用LC-AF647染色所判定，在帶有scFv2、帶有scFv14、及帶有FMC63之CAR轉導T細胞中整體CAR表現分別係80.6%、78.7%、及80.7%（參見圖6）。
24C12 PE（參見圖7A）及24C12 FITC（參見圖7B）之連續稀釋液顯示兩者皆對scFv14具有選擇性。 XIII. 實例13 ：重組蛋白免疫原及篩選試劑產生
為了促進識別套膜蛋白（長臂猿白血病病毒(GALV) gp70 (Uniprot P21415)）之抗體的開發及篩選，數種重組蛋白係設計、表現、及純化自含有鼠類Fc、人類mono Fc、或His標籤之人類Expi293細胞，以用作潛在免疫原及篩選試劑。此等蛋白質包括GALV gp70之受體結合域(RBD)（殘基42-474）、GALV gp70之捲曲螺旋(CC)域（殘基505-616）、或涵蓋RBD + CC域的GALV gp70之整個預測病毒表面暴露部分（殘基42-616）（圖8）。CC域係由七肽重複序列構成，該等重複序列聯結形成非共價三聚體。分析型粒徑篩析層析法證明含有重組蛋白之CC域形成三聚體。
將表現內源性SLC20A1 (PIT1)受體之K562細胞或陰性對照細胞系(CHO)用含有人類monoFc標籤及經螢光團接合之抗人類Fc二級抗體之各重組蛋白之連續稀釋液染色。包括抗SLC20A1抗體（Proteintech，目錄號12423-1-AP）作為對照。含有RBD之重組GALV gp70蛋白以劑量依賴性方式結合至K562細胞，而僅由CC域所組成之蛋白質則不然。未觀察到與陰性對照細胞之結合（ 圖 9A 至圖9B）。總而言之，此數據意味著具有適當的結構及功能，使吾等對用於抗體產生及篩選之吾等之試劑充滿信心。 XIV. 實例14 ：融合瘤活動及篩選
將Abveris DiversimAb™及DiverGimab™超免疫小鼠(Canton, MA)用含有套膜蛋白GALV gp70之不具複製能力的空反轉錄病毒(RVV)顆粒（無有效負載）免疫。將小鼠用重組鼠類IgG2a Fc標記之GALV gp70蛋白（殘基42-616）或空RVV顆粒加強(boosted)。藉由塗佈有重組可溶性huIgG1 monoFc標記之長臂猿GALV gp70蛋白（殘基42-616、殘基42-474、或殘基505-616）之間接ELISA藉由連續稀釋測試小鼠血清之力價。使用不相關的經huIgG1 monoFc標記之蛋白質作為陰性對照。亦藉由流式細胞術在連續稀釋液中測試小鼠血清對基於PG13之穩定封裝細胞系之敏感性，該細胞系組成性產生含有GALV gp70套膜蛋白之病毒顆粒。將PG13細胞用正常小鼠血清(NMS)、無染色(NS)、或同型對照染色作為陰性對照。基於陽性ELISA及流式細胞術數據，選擇兩隻小鼠用於融合瘤融合（ 圖 10A 至圖10B）。 XV. 實例15 ：融合瘤上清液篩選
使用塗佈有重組可溶性huIgG1 monoFc標記之長臂猿GALV gp70蛋白（殘基42-616）之間接ELISA對數千種融合瘤融合上清液進行篩選。使用不相關的經huIgG1 monoFc標記之蛋白質作為陰性對照。僅識別出60個陽性結合物，接著使其經受塗佈有重組可溶性huIgG1 monoFc標記之長臂猿GALV gp70蛋白（殘基42-616、殘基505-616、或殘基42-474）之二次ELISA篩選。使用不相關的經huIgG1 monoFc標記之蛋白質作為陰性對照。此進一步將陽性抗體清單縮小到17種殖株（ 圖 11）。在此分析後，發現其中一個融合瘤細胞系無法存活，因此陽性融合瘤之數目減少至16個。
對在基於ELISA之篩選中所測試之16個活陽性融合瘤系之上清液藉由流式細胞術在連續稀釋液中針對對基於PG13之穩定封裝細胞系之敏感性進行篩選，該細胞系組成性產生含有GALV gp70套膜蛋白之病毒顆粒（ 圖 12）。將NIH-3T3親本細胞用作陰性對照，且與相同融合瘤上清液一起培養，並用染色緩衝液連續稀釋。陰性對照由免疫球蛋白(Ig)同型對照及來自兩隻不同小鼠（未經免疫）之正常小鼠血清所組成。將細胞與經稀釋之上清液在室溫(RT)下一起培養45分鐘，接著收集，並用染色緩衝液洗滌兩次。將上清液及對照樣本用經PE接合之二級抗體染色。使用FlowJo™軟體（BD，版本10.6）分析數據，且將事件系統性地對細胞（使用前散射[FSC]面積側散射[SSC]面積圖）、單一細胞（使用FSC面積FSC高度圖）、及藻紅蛋白(PE)進行圈選，其中圈選臨限係基於陰性對照細胞設定。ELISA呈陽性之16種活融合瘤上清液中之8種亦藉由流式細胞術證實呈陽性。此實驗中之陽性殖株係：35C11、40A3、8G8、9A1、9G11、4F1、2D3、及40A6。 XVI. 實例16 ：重組抗體敏感性及特異性測試
對所有藉由ELISA與GALV gp70之結合呈陽性之融合瘤殖株使用次世代定序(NGS)進行定序。在融合瘤之抗體可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)域定序之後，將抗體以鼠類IgG2a格式選殖至標準哺乳動物表現載體中，並以小規模製造。所有獨特VH及VL序列皆導致產生一小組12種重組殖株抗體，若純化產量足夠高以用於測試，則對該等抗體進行小規模功能性測試。為了測試經純化抗體之敏感性及特異性，將各抗體之單一10倍稀釋液與PG13細胞或作為陰性對照之NIH-3T3細胞一起培養 （圖 13 ）。以下殖株具有足夠的純化產量以用於測試，且PG13染色呈陽性：8G8、9A1、40A3、4F1、35C11、及9G11。 XVII. 實例17 ：經純化抗體敏感性及連續稀釋篩選
為了確認小規模製造及篩選結果，且為了重新測試小規模純化產量差的殖株，將抗體以較大規模製造。簡言之，使用ExpiFectamine CHO轉染套組（Thermo Fisher，目錄號A29133）在ExpiCHO細胞中表現抗體。將抗體在HiTrap MabSelect SuRe管柱（Cytiva，產品編號11003493）上親和純化，接著在HiLoad Superdex 200 16/600（Cytiva，產品編號28989335）上進行粒徑篩析層析法。成功產生一小組9種抗體，且藉由SDS-PAGE凝膠及分析型SEC (SEC-UPLC)判定各抗體之純度為＞95%。將抗體用0.22 μm過濾器無菌過濾並儲存在-80 °C下。選擇以下殖株以用於進一步分析：35C11、3C8、40A3、40A6、8G8、9A1、9G11、2D3、及4F1。
為了測試經純化抗體之敏感性及特異性，執行滴定/3倍連續稀釋（最高濃度10 ug/mL降至0.005 ug/mL），且將PG13細胞與各抗體、或在最高濃度下之小鼠IgG同型對照一起培養（ 圖 14A 至圖14I）。將NIH-3T3細胞用作陰性對照並與具有染色緩衝液之相同經純化抗體連續稀釋液一起培養。兩個細胞系亦僅用二級抗體（在一級抗體不存在下）染色作為陰性對照。將細胞染色並進行分析。 XVIII. 實例18 ：使用生物膜干涉技術之經純化抗體親和力排序及特異性測試
使用Octet Red96 (Sartorius)藉由生物膜干涉技術測量經純化抗體之相對親和力排序、表位分倉(binning)、及特異性。簡言之，將經純化抗體以2 ug/mL裝載至AMC生物感測器（產品編號18-5088）上，並測試其與100 nM重組可溶性huIgG1 monoFc標記之長臂猿GALV gp70蛋白分析物（殘基42-616、殘基42-474、或殘基505-616）之結合（ 圖 15A 至圖15H ）。使用陰性對照分析物可溶性VSV-G（殘基17-467）huIgG1 monoFc標記之蛋白質確認抗體特異性。執行競爭檢定以識別具有獨特或非重疊表位之殖株。此等實驗識別出殖株35C11、8G8、及40A3在GALV-gp70之殘基42至474內具有非重疊或非競爭表位。 XIX. 實例19 ：經純化抗體特性
成功產生一小組9種重組抗體。將抗體根據實例18中所述之方法表徵並進行篩選。表16中之親和力值係抗體殖株針對huIgG1 monoFc標記之長臂猿GALV gp70蛋白（殘基42-474）之親和力值。 表16. 經純化抗體特性
抗體殖株 純化產量(mg/L) Kon (M-1 s-1) Koff (s-1) KD (M)
35C11 7.8 5.15E+04 6.29E-07 1.22E-11
40A3 4.8 1.14E+05 6.00E-07 5.24E-12
40A6 5.5 3.83E+04 6.72E-07 1.75E-11
8G8 10.9 3.28E+05 6.31E-05 1.93E-10
9A1 37.5 3.18E+05 4.47E-04 1.40E-09
9G11 6.0 3.66E+05 2.57E-04 7.04E-10
2D3 42.0 2.81E+05 4.80E-04 1.71E-09
4F1 82.0 3.59E+05 6.07E-04 1.69E-09
3C8 37.1 NB NB NB
縮寫：NB，無結合。 備註：此表列出當在ExpiCHO細胞中產生並經兩步驟純化時之抗體殖株及純化產量（以mg/L為單位）。藉由Octet結合檢定估計親和力值((KD (M))。 XX. 實例20 ：螢光團與重組抗體之接合
依標準規程將螢光團與抗體上之一級胺偶合，選擇三種抗GALV gp70抗體（殖株8G8、40A3、及35C11）作為先導抗體候選者，此係因為其等與Dylight™ 650 (Thermo Fisher)接合之結合性質。使用粒徑篩析層析方法將未經接合之螢光團移除。藉由分析型SEC (SEC-UPLC)判定各經接合抗體之純度為＞95%，且使用分光光度方法判定各者之標示程度。 XXI. 實例21 ：經螢光團接合之抗體表徵
為了表徵經螢光團接合之8G8、40A3、及35C11抗體，將PG13細胞與200 ng的各經螢光團標示之抗體一起培養。使用NIH-3T3細胞作為陰性對照。兩個細胞系亦僅用二級抗體（在一級抗體不存在下）染色作為陰性對照。將細胞染色並進行分析（ 圖 15A 至圖15H）。 以引用方式併入
本說明書中所提及之所有出版物、專利、及專利申請案係以引用方式併入本文中，有如特定及個別指示以引用方式併入各個別出版物、專利、及專利申請案。然而，在本文中引用參考文獻不應解讀為承認此類參考文獻係本發明之先前技術。在以引用方式併入之參考文獻中所提供之任何定義及用語不同於本文中所提供之用語及論述之情況下，則以本文之用語及定義為準。
認為以上書面說明書足以使所屬技術領域中具有通常知識者能夠實踐本發明。以上實施方式及隨後的實例詳述本發明之某些較佳實施例並描述發明人所設想之最佳模式。然而，應理解的是，無論前述內容在字面上看起來有多詳細，本發明仍可以許多方式實踐，且本發明應根據隨附申請專利範圍及其任何等效者解讀。
無
〔圖1〕之圖A至E係經轉導T細胞表現數據之對照的實驗數據。 〔圖2〕顯示實驗數據，其顯示相較於對照之帶有scFv14之CAR結合。 〔圖3〕之圖A顯示可能的融合瘤候選者之上清液與scFv14之結合的實驗數據。 〔圖3〕之圖B顯示可能的融合瘤候選者之上清液與scFv14之結合的實驗數據。 〔圖4〕顯示評估對scFv14之特異性的實驗數據。對上清液針對與表現帶有scFv14之CAR、不相關的帶有抗CD20 scFv2或帶有Leu16之CAR的T細胞、或NTD T細胞對照之結合進行篩選。 〔圖5〕顯示評估scFv14特異性的實驗數據。 〔圖6〕之圖A顯示與PE接合之殖株24C12針對健康供體T細胞進行篩選的實驗數據，健康供體T細胞保持NTD或經轉導以表現帶有scFv2、scFv14、或FMC63之CAR。 〔圖6〕之圖B顯示與FITC接合之殖株24C12針對健康供體T細胞進行篩選的實驗數據，健康供體T細胞保持NTD或經轉導以表現帶有scFv2、scFv14、或FMC63之CAR。 〔圖7〕之圖A顯示與PE接合之殖株24C12針對健康供體T細胞進行篩選的實驗數據，健康供體T細胞保持NTD或經轉導以表現帶有scFv2、scFv14、或FMC63之CAR。 〔圖7〕之圖B顯示與FITC接合之殖株24C12針對健康供體T細胞進行篩選的實驗數據，健康供體T細胞保持NTD或經轉導以表現帶有scFv2、scFv14、或FMC63之CAR。 〔圖8〕顯示重組GALV gp70病毒套膜蛋白設計之示意圖。所有構築體上皆包括分泌信號(secretion signal, SS)。包括各種親和標籤（monoFc huIgG1、muIgG2a Fc、或6x His (SEQ ID NO: 348)）以用於純化。製造GALV gp70之整個預測病毒表面暴露部分，其包括殘基42-616（編號根據Uniprot P21415），並具有N端親和標籤。製造包括捲曲螺旋區（殘基505-616）或僅受體結合域（殘基42-474）之截短，其具有C端親和標籤。 〔圖9A〕顯示用抗SLC20A1抗體（Proteintech，目錄號12423-1-AP）及PE接合二級抗體染色之K562或CHO細胞。將細胞僅用二級抗體染色作為對照。顯示SCL20A1表面表現陽性之細胞百分比（K562係94.7%，且CHO係0%）。〔圖9B〕顯示用重組GALV gp70蛋白、接著用PE接合二級抗體之連續稀釋液染色之K562或CHO細胞。當K562細胞用gp70 (42-474)或(42-616)染色時，PE平均螢光強度(MFI)以劑量依賴性方式增加，但(505-616)則不然。未觀察到CHO細胞染色。 〔圖10A〕顯示使用固定化GALV gp70 (42-616)蛋白針對免疫小鼠血清或作為陰性對照之正常小鼠血清測量的間接ELISA力價(titer)。選擇具有最高OD450讀數之兩個小鼠（Ms6609及Ms6423）用於融合瘤融合。圖10B顯示將穩定地產生含有GALV gp70套膜蛋白之病毒顆粒的PG13細胞用選擇用於融合瘤融合之免疫小鼠之血清連續稀釋液及PE接合二級抗體進行染色（左側及中間）。顯示陰性對照包括PG13細胞之無染色(NS)、正常小鼠血清（非免疫小鼠：NMS1及NMS2）、或同型對照抗體染色（右側） 〔圖11〕顯示使用固定化GALV gp70蛋白(42-616)、(505-616)、(42-616)、或經親和標記之陰性對照蛋白質之間接ELISA力價的相對比較，其係在與融合瘤上清液培養之後測量。顯示17個陽性融合瘤殖株。 〔圖12〕顯示穩定地產生含有GALV gp70套膜蛋白之病毒顆粒的PG13細胞與各融合瘤上清液之連續稀釋液一起培養並用PE接合二級抗體染色。顯示各融合瘤之相對PE信號。 〔圖13〕顯示將穩定地產生含有GALV gp70套膜蛋白之病毒顆粒的PG13細胞（上方）與成功小規模純化的各抗體殖株之單一稀釋液(1/10)一起培養。將NIH-3T3細胞（下方）用相同的抗體殖株染色作為陰性對照。 〔圖14A〕至〔圖14I〕顯示將穩定地產生含有GALV gp70套膜蛋白之病毒顆粒的PG13細胞（左側）與大規模純化的各抗體殖株之連續稀釋液（最高濃度10 ug/mL降至0.005 ug/mL）一起培養。將NIH-3T3細胞（右側）用相同的抗體殖株連續稀釋液染色作為陰性對照。亦包括兩種細胞系染色在10 ug/mL之最高濃度下的同型對照。 〔圖15A〕至〔圖15H〕顯示裝載至AMC生物感測器上之純化抗體殖株(2 ug/mL)。顯示所有殖株之Octet感測圖(sensorgram)（締合及解離），其展示出與100 nM經monoFc標記之GALV gp70蛋白殘基(42-474)之結合。 〔圖16〕顯示在所測試之最高濃度下不結合至FMC63-28z之融合瘤上清液。樣本身分係指示在各圖之左側。各圖顯示螢光強度值（x軸）相對於其標準化至其各別模式之頻率（y軸）作圖的直方圖。
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Claims (45)

  1. 一種結合至抗CD20結合區之經單離之抗原結合分子，其包含： 與選自由SEQ ID NO: 1至10所組成之群組的序列具有至少約80%序列同一性之重鏈可變(VH)序列； 與選自由SEQ ID NO: 11至20所組成之群組的序列具有至少約80%序列同一性之輕鏈可變(VL)序列；及 將VH連接至VL之連接子。
  2. 如請求項1之經單離之抗原結合分子，其包含與選自由SEQ ID NO: 1至10所組成之群組的序列具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%同一性之VH胺基酸序列。
  3. 如請求項1之經單離之抗原結合分子，其包含與選自由SEQ ID NO: 11至20所組成之群組的序列具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%同一性之VL胺基酸序列。
  4. 如請求項1至3中任一項之經單離之抗原結合分子，其中該經單離之抗原結合分子包含選自由SEQ ID NO: 21至41所組成之群組的重鏈CDR1。
  5. 如請求項1至3中任一項之經單離之抗原結合分子，其中該經單離之抗原結合分子包含選自由SEQ ID NO: 42至65所組成之群組的重鏈CDR2。
  6. 如請求項1至3中任一項之經單離之抗原結合分子，其中該經單離之抗原結合分子包含選自由SEQ ID NO: 66至85所組成之群組的重鏈CD3。
  7. 如請求項1至3中任一項之經單離之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含選自由SEQ ID NO: 86至99所組成之群組的輕鏈CDR1。
  8. 如請求項1至3中任一項之經單離之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含選自由SEQ ID NO: 100至111所組成之群組的輕鏈CDR2。
  9. 如請求項1至3中任一項之經單離之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含選自由SEQ ID NO: 112至120所組成之群組的輕鏈CDR3。
  10. 如請求項1至3中任一項之經單離之抗原結合分子，其中該連接子包含胺基酸序列。
  11. 如請求項10之經單離之抗原結合分子，其中該連接子之胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 121具有至少約80%序列同一性之序列。
  12. 如請求項10之經單離之抗原結合分子，其中該連接子之胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 126具有至少約80%序列同一性之序列。
  13. 如請求項11之經單離之抗原結合分子，其中該連接子之胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 121具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列同一性之序列。
  14. 如請求項12之經單離之抗原結合分子，其中該連接子之胺基酸序列包含與SEQ ID NO: 126具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列同一性之序列。
  15. 如請求項1至3中任一項之經單離之抗原結合分子，其進一步包含選自由下列所組成之群組的可偵測標示：螢光標示、光致變色化合物、蛋白質螢光標示、磁性標示、放射性標示、及半抗原。
  16. 如請求項1至3中任一項之經單離之抗原結合分子，其中該經單離之抗原結合分子包含選自由SEQ ID NO: 25、32、及39所組成之群組的重鏈CDR1序列。
  17. 如請求項1至3中任一項之經單離之抗原結合分子，其中該經單離之抗原結合分子包含選自由SEQ ID NO: 46、54、及62所組成之群組的重鏈CDR2序列。
  18. 如請求項1至3中任一項之經單離之抗原結合分子，其中該經單離之抗原結合分子包含選自由SEQ ID NO: 70及80所組成之群組的重鏈CDR3序列。
  19. 如請求項1至3中任一項之經單離之抗原結合分子，其中該經單離之抗原結合分子包含選自由SEQ ID NO: 90及98所組成之群組的輕鏈CDR1序列。
  20. 如請求項1至3中任一項之經單離之抗原結合分子，其中該經單離之抗原結合分子包含選自由SEQ ID NO: 104及110所組成之群組的輕鏈CDR2序列。
  21. 如請求項1至3中任一項之經單離之抗原結合分子，其中該經單離之抗原結合分子包含：包含SEQ ID NO: 116之輕鏈CDR3序列。
  22. 一種抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段，其包含GALV gp70結合模體，其中該GALV gp70結合模體包含選自由SEQ ID NO: 303至314所組成之群組的重鏈可變區(HCVR)中之任一者的三個重鏈互補決定區(HCDR)之序列、及選自由SEQ ID NO: 315至324所組成之群組的輕鏈可變區(LCVR)的三個輕鏈CDR (LCDR)之序列。
  23. 如請求項22之抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段，其中該GALV gp70結合模體包含：第一域，其包含三個重鏈互補決定區（HCDR1、HCDR2、及HCDR3）；及第二域，其包含三個輕鏈互補決定區（LCDR1、LCDR2、及LCDR3），其中 (i) HCDR1具有根據SEQ ID NO: 127至138、157至168、及187至198中任一者之序列； (ii) HCDR2具有根據SEQ ID NO: 139至150、169至180、及199至210中任一者之序列； (iii) HCDR3具有根據SEQ ID NO: 151至156、181至186、211至222、及DYY中任一者之序列； (iv) LCDR1具有根據SEQ ID NO: 223至232、253至262、及283至292中任一者之序列； (v) LCDR2具有根據SEQ ID NO: 233至242、263至272、SGS、GTN、RAS、DTS、及KVS中任一者之序列；且 (vi) LCDR3具有根據SEQ ID NO: 243至252、273至282、及293至302中任一者之序列。
  24. 如請求項22或23之抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段，其中該等HCDR包含： (i)根據SEQ ID NO: 127、157、及187中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 139、169、及199中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 211或DYY之HCDR3； (ii)根據SEQ ID NO: 128、158、及188中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 140、170、及200中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 151、181、及212中任一者之HCDR3； (iii)根據SEQ ID NO: 129、159、及189中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 141、171、及201中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 152、182、及213中任一者之HCDR3； (iv)根據SEQ ID NO: 130、160、及190中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 142、172、及202中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 214或DYY之HCDR3； (v)根據SEQ ID NO: 131、161、及191中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 143、173、及203中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 153、183、及215中任一者之HCDR3； (vi)根據SEQ ID NO: 132、162、及192中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 144、174、及204中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 154、184、及216中任一者之HCDR3； (vii)根據SEQ ID NO: 133、163、及193中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 145、175、及205中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 155、185、及217中任一者之HCDR3； (viii)根據SEQ ID NO: 134、164、及194中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 146、176、及206中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 218或DYY之HCDR3； (ix)根據SEQ ID NO: 135、165、及195中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 147、177、及207中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 156、186、及219中任一者之HCDR3； (x)根據SEQ ID NO: 136、166、及196中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 148、178、及208中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 220或DYY之HCDR3； (xi)根據SEQ ID NO: 137、167、及197中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 149、179、及209中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 221或DYY之HCDR3；或 (xii)根據SEQ ID NO: 138、168、及198中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 150、180、及210中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 222或DYY之HCDR3，且 該等LCDR包含： (i)根據SEQ ID NO: 232、262、及292中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 242、272、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 252、282、及302中任一者之LCDR3； (ii)根據SEQ ID NO: 228、258、及288中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 238、268、及KVS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 248、278、及298中任一者之LCDR3； (iii)根據SEQ ID NO: 227、257、及287中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 237、267、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 247、277、及297中任一者之LCDR3； (iv)根據SEQ ID NO: 226、256、及286中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 236、266、及DTS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 246、276、及296中任一者之LCDR3； (v)根據SEQ ID NO: 225、255、及285中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 235、265、及RAS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 245、275、及295中任一者之LCDR3； (vi)根據SEQ ID NO: 224、254、及284中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 234、264、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 244、274、及294中任一者之LCDR3； (vii)根據SEQ ID NO: 223、253、及283中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 233、263、及SGS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 243、273、及293中任一者之LCDR3； (viii)根據SEQ ID NO: 229、259、及289中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 239、269、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 249、279、及299中任一者之LCDR3； (ix)根據SEQ ID NO: 231、261、及291中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 241、271、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 251、281、及301中任一者之LCDR3；或 (x)根據SEQ ID NO: 230、260、290中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 240、270、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 250、280、及300中任一者之LCDR3。
  25. 如請求項22或23之抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段，其中該抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段包含：第一域，其包含三個重鏈互補決定區(HCDR)；及第二域，其包含三個輕鏈互補決定區(LCDR)，其中： 該等HCDR及LCDR包含： (i)根據SEQ ID NO: 127、157、及187中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 139、169、及199中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 211或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 232、262、及292中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 242、272、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 252、282、及302中任一者之LCDR3； (ii)根據SEQ ID NO: 128、158、及188中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 140、170、及200中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 151、181、及212中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 228、258、及288中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 238、268、及KVS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 248、278、及298中任一者之LCDR3； (iii)根據SEQ ID NO: 129、159、及189中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 141、171、及201中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 152、182、及213中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 226、256、及286中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 236、266、及DTS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 246、276、及296中任一者之LCDR3 (iv)根據SEQ ID NO: 130、160、及190中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 142、172、及202中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 214或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 227、257、及287中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 237、267、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 247、277、及297中任一者之LCDR3； (v)根據SEQ ID NO: 131、161、及191中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 143、173、及203中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 153、183、及215中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 227、257、及287中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 237、267、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 247、277、及297中任一者之LCDR3； (vi)根據SEQ ID NO: 132、162、及192中任一者之HCDR1；根據SEQ ID No: 144、174、及204中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 154、184、及216中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 226、256、及286中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 236、266、及DTS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 246、276、及296中任一者之LCDR3；； (vii)根據SEQ ID NO: 133、163、及193中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 145、175、及205中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 155、185、及217中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 225、255、及285中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 235、265、及RAS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 245、275、及295中任一者之LCDR3； (viii)根據SEQ ID NO: 134、164、及194中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 146、176、及206中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 218或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 224、254、及284中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 234、264、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 244、274、及294中任一者之LCDR3 (ix)根據SEQ ID NO: 135、165、及195中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 147、177、及207中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 156、186、及219中任一者之HCDR3；根據SEQ ID NO: 223、253、及283中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 233、263、及SGS中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 243、273、及293中任一者之LCDR3； (x)根據SEQ ID NO: 136、166、及196中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 148、178、及208中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 220或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 229、259、及289中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 239、269、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 249、279、及299中任一者之LCDR3； (xi)根據SEQ ID NO: 137、167、及197中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 149、179、及209中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 221或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 231、261、及291中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 241、271、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 251、281、及301中任一者之LCDR3；或 (xii)根據SEQ ID NO: 138、168、及198中任一者之HCDR1；根據SEQ ID NO: 150、180、及210中任一者之HCDR2；根據SEQ ID NO: 222或DYY之HCDR3；根據SEQ ID NO: 230、260、290中任一者之LCDR1；根據SEQ ID NO: 240、270、及GTN中任一者之LCDR2；根據SEQ ID NO: 250、280、及300中任一者之LCDR3。
  26. 如請求項22或23之抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段，其中該抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段包含：第一重鏈可變域，其包含該三個HCDR；及輕鏈可變域，其包含該三個LCDR，其中： (i)該重鏈可變域與SEQ ID NO: 303至314中任一者至少80%同一；且 (ii)該輕鏈可變域與SEQ ID NO: 315至324中任一者至少80%同一。
  27. 如請求項26之抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段，其中該抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段包含：第一重鏈可變域，其包含該三個HCDR；及輕鏈可變域，其包含該三個LCDR，其中： (i)該重鏈可變域與SEQ ID NO: 303至少80%同一，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO: 324至少80%同一； (ii)該重鏈可變域與SEQ ID NO: 304至少80%同一，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO: 320至少80%同一； (iii)該重鏈可變域與SEQ ID NO: 305至少80%同一，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO: 318至少80%同一； (iv)該重鏈可變域與SEQ ID NO: 306至少80%同一，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO: 319至少80%同一； (v)該重鏈可變域與SEQ ID NO: 307至少80%同一，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO: 319至少80%同一； (vi)該重鏈可變域與SEQ ID NO: 308至少80%同一，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO: 318至少80%同一； (vii)該重鏈可變域與SEQ ID NO: 309至少80%同一，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO: 317至少80%同一； (viii)該重鏈可變域與SEQ ID NO: 310至少80%同一，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO: 316至少80%同一； (ix)該重鏈可變域與SEQ ID NO: 311至少80%同一，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO: 315至少80%同一； (x)該重鏈可變域與SEQ ID NO: 312至少80%同一，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO: 321至少80%同一； (xi)該重鏈可變域與SEQ ID NO: 313至少80%同一，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO: 323至少80%同一；或 (xii)該重鏈可變域與SEQ ID NO: 314至少80%同一，且該輕鏈可變域與SEQ ID NO: 322至少80%同一。
  28. 如請求項22或23之抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段，其中該三個HCDR及該三個LCDR係由單一多肽構成。
  29. 如請求項22或23之抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段，其中該三個HCDR係由第一多肽構成，且該三個LCDR係由第二多肽構成。
  30. 如請求項29之抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段，其中該第一多肽係抗體重鏈，且該第二多肽係抗體輕鏈。
  31. 一種核酸，其編碼至少一種如請求項22至30中任一項之抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段。
  32. 一種載體，其包含如請求項31之核酸。
  33. 一種產生經工程改造細胞之方法，該方法包含將細胞用如請求項31之核酸或如請求項32之載體轉染或轉導。
  34. 一種編碼或表現如請求項22至30中任一項之抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段之細胞，可選地其中該細胞係免疫細胞。
  35. 如請求項22或23之抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段，其進一步包含可偵測標示。
  36. 如請求項35之抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段，其中該可偵測標示係選自由下列所組成之群組：螢光標示、光致變色化合物、蛋白質螢光標示、磁性標示、放射性標示、及半抗原。
  37. 如請求項36之抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段，其中該螢光標示係選自由下列所組成之群組：Atto染料、Alexafluor染料、量子點、羥基香豆素、胺基香豆素、甲氧基香豆素、Cascade Blue、Pacific Blue、Pacific Orange、Lucifer Yellow、NBD、R-藻紅蛋白(PE)、PE-Cy5接合物、PE-Cy7接合物、Red 613、PerCP、TruRed、FluorX、螢光素、BODIPY-FL、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、TRITC、X-玫瑰紅、Lissamine玫瑰紅B、Texas Red、異藻藍蛋白(APC)、APC-Cy7接合物、Indo-1、Fluo-3、Fluo-4、DCFH、DHR、SNARF、GFP（Y66H突變）、GFP（Y66F突變）、EBFP、EBFP2、石青色螢光蛋白(Azurite)、GFPuv、T-Sapphire、天藍螢光蛋白(Cerulean)、mCFP、mTurquoise2、ECFP、CyPet、GFP（Y66W突變）、mKeima-Red、TagCFP、AmCyan1、mTFP1、GFP（S65A突變）、Midorishi Cyan、野生型GFP、GFP（S65C突變）、TurboGFP、TagGFP、GFP（S65L突變）、Emerald、GFP（S65T突變）、EGFP、Azami Green、ZsGreen1、TagYFP、EYFP、Topaz、Venus、mCitrine、YPet、TurboYFP、ZsYellow1、Kusabira Orange、mOrange、異藻藍蛋白(APC)、mKO、TurboRFP、tdTomato、TagRFP、DsRed單體、DsRed2 (“RFP”)、mStrawberry、TurboFP602、AsRed2、mRFP1、J-Red、R-藻紅蛋白(RPE)、B-藻紅蛋白(BPE)、mCherry、HcRed1、Katusha、P3、多甲藻素葉綠素(PerCP)、mKate (TagFP635)、TurboFP635、mPlum、及mRaspberry。
  38. 一種用於判定表現具有SEQ ID NO: 325之胺基酸序列的長臂猿白血病病毒(GALV) gp70蛋白之病毒顆粒之數目的方法，該方法包含： (a)          提供已知或疑似包含表現該GALV gp70蛋白之病毒顆粒的樣本； (b)          在允許形成一或多個包含病毒顆粒及如請求項21至29中任一項之抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段之結合複合物的條件下，使該樣本與該抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段接觸，其中該抗原結合系統、抗體、或其抗原結合片段進一步包含可偵測標示； (c)          藉由偵測該可偵測標示來偵測該一或多個結合複合物；及 (d)          基於步驟(c)之該偵測判定存在於該樣本中之病毒顆粒之數目。
  39. 一種判定表現具有SEQ ID NO: 325之胺基酸序列的長臂猿白血病病毒(GALV) gp70蛋白之病毒顆粒之存在或不存在的方法，該方法包含： (a)    提供已知或疑似包含表現該GALV gp70蛋白之病毒顆粒的樣本； (b)          提供特異性結合該GALV gp70蛋白之抗原結合分子，其中該抗原結合分子進一步包含可偵測標示； (c)          在允許形成GALV gp70與該抗原結合蛋白之間的結合複合物之條件下，使該樣本與該抗原結合分子接觸； (d)          將非結合複合物之一部分的任何分子與該等結合複合物分離；及 (e)          偵測結合複合物之存在或不存在。
  40. 如請求項38或39之方法，其中該抗原結合分子係設置於選自由下列所組成之群組的表面上：瓊脂糖珠、磁珠、塑膠孔盤、玻璃孔盤、陶瓷孔盤、及細胞培養袋。
  41. 如請求項38或39之方法，其中該可偵測標示係選自由下列所組成之群組：螢光標示、光致變色化合物、蛋白質螢光標示、磁性標示、放射性標示、及半抗原。
  42. 如請求項41之方法，其中該螢光標示係選自由下列所組成之群組：Atto染料、Alexafluor染料、量子點、羥基香豆素、胺基香豆素、甲氧基香豆素、Cascade Blue、Pacific Blue、Pacific Orange、Lucifer Yellow、NBD、R-藻紅蛋白(PE)、PE-Cy5接合物、PE-Cy7接合物、Red 613、PerCP、TruRed、FluorX、螢光素、BODIPY-FL、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、TRITC、X-玫瑰紅、Lissamine玫瑰紅B、Texas Red、異藻藍蛋白(APC)、APC-Cy7接合物、Indo-1、Fluo-3、Fluo-4、DCFH、DHR、SNARF、GFP（Y66H突變）、GFP（Y66F突變）、EBFP、EBFP2、石青色螢光蛋白(Azurite)、GFPuv、T-Sapphire、天藍螢光蛋白(Cerulean)、mCFP、mTurquoise2、ECFP、CyPet、GFP（Y66W突變）、mKeima-Red、TagCFP、AmCyan1、mTFP1、GFP（S65A突變）、Midorishi Cyan、野生型GFP、GFP（S65C突變）、TurboGFP、TagGFP、GFP（S65L突變）、Emerald、GFP（S65T突變）、EGFP、Azami Green、ZsGreen1、TagYFP、EYFP、Topaz、Venus、mCitrine、YPet、TurboYFP、ZsYellow1、Kusabira Orange、mOrange、異藻藍蛋白(APC)、mKO、TurboRFP、tdTomato、TagRFP、DsRed單體、DsRed2 (“RFP”)、mStrawberry、TurboFP602、AsRed2、mRFP1、J-Red、R-藻紅蛋白(RPE)、B-藻紅蛋白(BPE)、mCherry、HcRed1、Katusha、P3、多甲藻素葉綠素(PerCP)、mKate (TagFP635)、TurboFP635、mPlum、及mRaspberry。
  43. 如請求項38或39之方法，其中該偵測係用基於流之偵測方法執行。
  44. 如請求項43之方法，其中該基於流之偵測方法係流式病毒測量術(flow virometry)。
  45. 如請求項38或39之方法，其中該偵測係藉由ELISA、生物膜干涉技術(BLI)、西方墨點法、或其任何組合執行。
TW113108581A 2023-03-09 2024-03-08 抗原結合分子及使用方法 TW202436355A (zh)

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