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TW201836636A - 含有替代凝血因子ｖｉｉｉ功能之多特異性抗原結合分子之用於預防和／或治療凝血因子ｉｘ異常症的醫藥組合物 - Google Patents

含有替代凝血因子ｖｉｉｉ功能之多特異性抗原結合分子之用於預防和／或治療凝血因子ｉｘ異常症的醫藥組合物 Download PDF

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TW201836636A
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嶋緑倫
野上恵嗣
荻原建一
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公立大學法人奈良縣立醫科大學
日商中外製藥股份有限公司
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Abstract

本發明者們，使用源自FIX異常症患者的血液及血漿，檢證因替代FVIII功能之多特異性抗原結合分子所致之凝固促進作用。其結果，替代FVIII功能之多特異性抗原結合分子不僅顯示可作為針對起因於FVIII功能不全的血友病A、後天血友病A、溫韋伯氏症、及血友病C中的出血之預防法和/或治療法來利用，亦因其凝固促進活性可作為針對FIX異常症的出血之預防法和/或治療法來利用。再者，替代FVIII功能的多特異性抗原結合分子與FIX製劑併用時，可增強FIX製劑的效果，有望作為顯示安定的止血效果的併用療法。

Description

含有替代凝血因子VIII功能之多特異性抗原結合分子之用於預防和/或治療凝血因子IX異常症的醫藥組合物
本發明係關於含有替代凝血因子VIII功能之多特異性抗原結合分子之用於凝血因子IX(FIX)異常症的預防和/或治療的醫藥組合物。
FIX異常症，係起因於FIX的先天性缺損或功能不全的稀有出血性疾病(非專利文獻1)。FIX異常症，亦被稱為血友病B。FIX為酵素的前驅體，凝血反應開始之際，由前驅體變化為具有酵素活性的活性化凝血因子IX(FIXa)。FIXa與活性化凝血因子VIII(FVIIIa)等一起形成凝血因子X活性化複合體(tenase complex)，經由凝血因子X(FX)的活性化，於凝血反應促進擔任重要角色。同樣地，FVIII異常症，係起因於FVIII的先天性缺損或功能不全的出血性疾病，亦被稱為血友病A。FIX異常症中，活性化部分凝血酶時間(APTT)與FIII異常症同樣地異常延長。FVIII異常症及FIX異常症的鑑別，以FVIII及FIX的定量(作為活性定量之FVIII:C及FIX:C，作為因子抗原定量之FVIII:Ag及FIX:Ag)進行。對於FIX異常症主要以FIX製劑實施治療，為了預防出血亦實施定期地投予FIX製劑之定期補充療法(預防投予)。現在的情形，最普通使用之FIX異常症(血友病B)的定期補充療法方案，係一週二次靜脈內投予25至40 IU/kg的FIX製劑者。然而，同樣的國家中，甚至有為數多的不同方案實施，最適方案的檢討為今後的問題(非專利文獻1)。再者，近年我國中，以開發半衰期延長型的FIX製劑，成為亦可利用進行以50 IU/kg的一週一次或100 IU/kg的10日一次的頻率進行靜脈內投予的定期補充療法(非專利文獻2)。然而，靜脈內投予的重複，有血管確保困難度的課題，特別是於兒童中成為患者及照護者的大負擔(非專利文獻3)。
血友病是起因於凝血因子中的FVIII或FIX的先天性缺損或功能不全的出血性疾病。起因於FVIII異常的疾病稱為血友病A，起因於FIX異常的疾病稱為血友病B。血友病的出血症狀的重症度，與缺乏的凝血因子的血液中活性程度有相關。活性未達1%的患者分類為重症，活性1%以上未達5%的患者分類為中等症，活性5%以上未達40%的患者分類為輕症。佔血友病患者的約半數之重症患者中，雖呈現一個月數次的出血症狀，其與中等症患者及輕症患者相比為顯著的高頻率。由此咸信，重症血友病患者中，藉由缺乏的凝血因子(FVIII或FIX)的補充療法，血液中的凝血因子活性維持1%以上，有效於出血症狀的表現阻止(非專利文獻1)。
血友病患者之出血的預防和/或治療中，主要使用由血漿精製或經由基因重組技術所製作之凝固因子製劑(血友病A: FVIII，血友病B: FIX)。使用該等製劑，以出血時的止血為目的進行經要求(on-demand)投予，或為了防止出血事件的發生之預防投予(非專利文獻4)。然而，FVIII製劑的血中半衰期，由於約12小時，預防投予中必需一週3次左右的頻繁投予(非專利文獻5、6)。FIX製劑的血中半衰期，為16至28小時，亦報告有3至38小時之大的個人差異，預防投予中一週2次左右的頻繁投予為標準的方案(非專利文獻5、6、7)。經要求投予中，為了防止再出血，根據情況需要，以一定間隔追加投予有必要。再者，凝固因子製劑的投予係於靜脈內實施。因此，強烈的要求與現存的凝固因子製劑相比，投予的負擔少(投予頻率少、靜脈注射非必要)的藥劑。
再者，針對經投予的凝固因子製劑的抗體(抑制劑)，於血友病患者有產生的情況(非專利文獻8)。血友病A中，重症患者的20至30%產生抑制劑，血友病B中，與血友病A相比之產生頻率雖然低，但有1至6%產生抑制劑的報告(非專利文獻8、9)。由於抑制劑抵銷所補充的凝固因子製劑的效果，藉由以後的凝固因子製劑的預防/治療為困難。對於以產生抑制劑的患者(抑制劑患者)的出血，係投予繞道製劑(活性行凝血因子VII(FVII)製劑或APCC製劑)(非專利文獻1、8)。該等的作用機制，對FVIII製劑或FIX製劑的功能的依賴性少，即使抑制劑存在下的血友病亦可顯示止血作用。然而，由於其血中半衰期短約2至8小時左右，頻繁的靜脈注射為必要，且作為其止血活性的程度有無法充分止血的案例。因此，強烈的要求不受抑制劑存在的影響，投予負擔少的藥劑。
作為關聯的出血異常症，針對後天性凝血因子的自體中和抗體產生的原因，咸認為凝血因子不全之後天性血友病(非專利文獻10、11)。後天性血友病多數經由出現抗FVIII自體抗體所引起。對於該等後天性的出血異常患者的出血，投予繞道製劑等，但有同樣地頻繁的靜脈注射及作為止血活性的程度無法充分止血的案例的課題。
作為其他亦與FVIII相關的出血異常正，已知起因於溫韋伯氏(von Willebrand)因子(vWF)的功能異常或缺損的溫韋伯氏症。vWF不僅為血小板正常地黏著於血管壁的損傷部位的內皮下組織所必要，與FVIII形成複合物、保持正常的血液中的FVIII濃度亦為必要。溫韋伯氏症患者中，該等功能降低，成為止血功能異常(非專利文獻12)。對於溫韋伯氏症患者的出血，雖投予含有去胺加壓素(desmopressin; DDAVP)或源自血漿的vWF的FVIII製劑，但有同樣地頻繁的靜脈注射及作為止血活性的程度無法充分止血的案例的課題。
近年來，辨識FIXa及FX二者，發現FVIII的輔因子功能，亦即發現具有替代功能於促進經由FIXa而FX活化的功能之多特異性抗原結分子(專利文獻1、2、3)。多特異性抗原結合分子中，正進行開發雙特異性抗體，作為對於血友病的出血之預防和/或治療用的醫藥品組成物(專利文獻1、2、3，非專利文獻13、14、15、16、17、18)。再者，該雙特異性抗體，咸信亦適用對於FVIII功能不全相關的後天性血友病A、溫韋伯氏症、及血友病C的出血之預防和/或治療(專利文獻1、2、3、4)。進一步地，該雙特異性抗體，於血友病A的治療中，咸信亦與FIX製劑併用(專利文獻5)。 [先前技術文獻] 非專利文獻
非專利文獻1: Guidelines for the management of hemophilia, 2005, World Federation of Hemophilia 非專利文獻2: ALPROLIX靜脈注射用仿單，2017 非專利文獻3: Haemophilia 2011; 17: 2-10 非專利文獻4: Nature 1984; 312: 330-337 非專利文獻5: Nature 1984; 312: 337-342 非專利文獻6: Biohim Biophys Acta 1986; 871: 268-278 非專利文獻7: Haemophilia 2007; 13: 663-669 非專利文獻8: Blood 2007; 109(2): 546-551 非專利文獻9: Haemophilia 2013; 19: 2-10 非專利文獻10: Semin Thromb Hemost 2012; 38: 433-446 非專利文獻11: Thromb Haemost 2013; 110: 1114-1120 非專利文獻12: Blood 2013; 122: 3735-3740 非專利文獻13: Nature Medicine 2012; 18(10): 1570-1574 非專利文獻14: PLOS ONE 2013; 8(2): e57479 非專利文獻15: J Thromb Haemost 2014; 12(2): 206-213 非專利文獻16: Blood 2014; 124(20): 3165-3171 非專利文獻17: Blood 2016; 127(13): 1633-1641 非專利文獻18: N Engl J Med 2016; 374: 2044-2053 專利文獻
專利文獻1: WO2005/035756 專利文獻2: WO2006/109592 專利文獻3: WO2016/067176 專利文獻4: WO2016/171202 專利文獻5: WO2016/166014
[發明欲解決的課題】]
本發明係以含有替代FVIII功能的多特異性抗原結合分子之用於FIX異常症的預防和/或治療之醫藥組合物的提供為課題。 [解決課題用之手段]
本發明者們為了解決上述課題，使用源自FIX異常症患者的血液、血漿及市售之FIX缺乏人類血漿，藉由ROTEM及APTT之各凝固評估法，來檢證「替代FVIII功能的多特異性抗原結合分子(FVIII功能替代分子)」的血液、血漿凝固促進作用。
其結果，本發明者們發現，源自於FIX異常症患者的血液、血漿及FIX缺乏人類血漿中，於上述各凝固評估法中，替代FVIII功能的多特異性抗原結合分子顯示凝固促進作用。因此，替代FVIII功能的多特異性抗原結合分子顯示不僅可作為針對起因於FVIII功能不全的血友病A、後天性血友病A、溫韋伯氏症、及血友病C的出血之預防劑和/或治療劑來利用，亦因其凝固促進活性而可作為針對FIX異常症的出血之預防劑和/或治療劑來利用。 本發明係基於該等發現，為關於含有替代FVIII功能的多特異性抗原結合分子之用於血友病A、後天性血友病A、溫韋伯氏症、及血友病C以外的FIX異常症的預防和/或治療的醫藥組合物者，更具體地係關於下述者。 [1] 含有替代凝血因子VIII的多特異性抗原結合分子之用於凝血因子IX異常症的預防和/或治療的醫藥組合物。 [2] 替代凝血因子VIII功能的多特異性抗原結合分子，係辨識凝血因子IX和/或活性型凝血因子IX以及凝血因子X的雙特異性抗體之[1]記載的醫藥組合物。 [3] 前述雙特異性抗體為下述記載的抗體之[2]記載的醫藥組合物： 為第一多肽與第三多肽形成對，第二多肽與第四多肽形成對的雙特異性抗體，由第一多肽為包含序列編號: 1、2、3(Q499的H鏈CDR)記載的H鏈CDR1、2、3的胺基酸序列的H鏈，第二多肽為包含序列編號: 4、5、6(J327的H鏈CDR)記載的H鏈CDR1、2、3的胺基酸序列的H鏈，第三多肽與第四多肽為包含序列編號: 7、8、9(L404的L鏈CDR)記載的L鏈CDR1、2、3的胺基酸序列的共通L鏈所構成的雙特異性抗體。 [4] 前述雙特異性抗體為下述記載的抗體之[2]或[3]記載的醫藥組合物: 為第一多肽與第三多肽形成對，第二多肽與第四多肽形成對的雙特異性抗體，由第一多肽為包含序列編號: 13記載的H鏈可變區域的胺基酸序列的H鏈，第二多肽為包含序列編號: 14記載的H鏈可變區域的胺基酸序列的H鏈，以及第三多肽與第四多肽為包含序列編號: 15記載的L鏈可變區域的胺基酸序列的共通L鏈所構成的雙特異性抗體。 [5] 前述雙特異性抗體為下述記載的抗體之[2]至[4]中任一項記載的醫藥組合物: 為第一多肽與第三多肽形成對，第二多肽與第四多肽形成對的雙特異性抗體，由第一多肽為由序列編號: 10記載的胺基酸序列所構成的H鏈，第二多肽為由序列編號: 11記載的胺基酸序列所構成的H鏈，以及第三多肽與第四多肽為序列編號: 12記載的共通L鏈所構成的雙特異性抗體。 [6] 凝血因子IX異常症係經由凝血因子IX和/或活性型凝血因子IX的活性降低、功能異常和/或缺損而發症及/或進展的疾病之[1]至[5]中任一項記載的醫藥組合物。 [7] 凝血因子IX異常症係先天性或後天性的疾病之[1]至[6]中任一項記載的醫藥組合物。 [8] 凝血因子IX異常症係血友病B或凝血因子IX缺乏症之[1]至[7]中任一項記載的醫藥組合物。 [9] 用於與凝血因子IX製劑併用之[1]至[8]中任一項記載的醫藥組合物。 [10] 用於增強凝血因子IX製劑的凝血活性之[1]至[8]中任一項記載的醫藥組合物。 [11] 替代凝血因子VIII功能的多特異性抗原結合分子與凝血因子IX製劑組合而成之用於凝血因子IX異常症的預防和/或治療的併用醫藥。 [12] 使用替代凝血因子VIII功能的多特異性抗原結合分子來增強於凝血因子IX異常症患者中凝血因子IX製劑之凝血活性的方法。 [13] 用於與[1]至[8]中任一項記載的醫藥組合物併用的凝血因子IX製劑。 [14] 用於增強[1]至[8]中任一項記載的醫藥組合物的替代FVIII功能的活性的凝血因子IX製劑。 [15]使用凝血因子IX製劑增強於血友病B患者中替代凝血因子VIII功能的多特異性抗原結合分子的替代FVIII功能的活性的方法。 [A1] 包含對於患者，投予替代凝血因子VIII功能的多特異性抗原結合分子的步驟之用於凝血因子IX異常症的預防和/或治療的方法。 [A2] 替代凝血因子VIII功能的多特異性抗原結合分子，係辨識凝血因子IX和/或活性型凝血因子IX以及凝血因子X的雙特異性抗體之[A1]記載的方法。 [A3] 前述雙特異性抗體為下述記載的抗體之[A2]記載的方法: 為第一多肽與第三多肽形成對，第二多肽與第四多肽形成對的雙特異性抗體，由第一多肽為包含序列編號: 1、2、3(Q499的H鏈CDR)記載的H鏈CDR1、2、3的胺基酸序列的H鏈，第二多肽為包含序列編號: 4、5、6(J327的H鏈CDR)記載的H鏈CDR1、2、3的胺基酸序列的H鏈，第三多肽與第四多肽為包含序列編號: 7、8、9(L404的L鏈CDR)記載的L鏈CDR1、2、3的胺基酸序列的共通L鏈所構成的雙特異性抗體。 [A4] 前述雙特異性抗體為下述記載的抗體之[A2]或[A3]記載的方法： 為第一多肽與第三多肽形成對，第二多肽與第四多肽形成對的雙特異性抗體，由第一多肽為包含序列編號: 13記載的H鏈可變區域的胺基酸序列的H鏈，第二多肽為包含序列編號: 14記載的H鏈可變區域的胺基酸序列的H鏈，以及第三多肽與第四多肽為包含序列編號: 15記載的L鏈可變區域的胺基酸序列的共通L鏈所構成的雙特異性抗體。 [A5] 前述雙特異性抗體為下述記載的抗體之[A2]至[A4]中任一項記載的方法: 為第一多肽與第三多肽形成對，第二多肽與第四多肽形成對的雙特異性抗體，由第一多肽為由序列編號: 10記載的胺基酸序列所構成的H鏈，第二多肽為由序列編號: 11記載的胺基酸序列所構成的H鏈，以及第三多肽與第四多肽為序列編號: 12記載的共通L鏈所構成的雙特異性抗體。 [A6] 凝血因子IX異常症係經由凝血因子IX和/或活性型凝血因子IX的活性降低、功能異常和/或缺損而發症及/或進展的疾病之[A1]至[A5]中任一項記載的方法。 [A7] 凝血因子IX異常症係先天性或後天性的疾病之[A1]至[A6]中任一項記載的方法。 [A8] 凝血因子IX異常症係血友病B或凝血因子IX缺乏症之[A1]至[A7]中任一項記載的方法。 [A9] 用於與凝血因子IX製劑併用之[A1]至[A8]中任一項記載的方法。 [A10] 用於增強凝血因子IX製劑的凝血活性之[A1]至[A8]中任一項記載的方法。 [A11] 包含對於患者，組合替代凝血因子VIII功能的多特異性抗原結合分子與凝血因子IX製劑而投予的步驟之用於凝血因子IX異常症的預防和/或治療的方法。 [A12] 一方法為包含對於凝血因子IX異常症患者，投予替代凝血因子VIII功能的多特異性抗原結合分子的步驟之增強凝血因子IX製劑的凝血活性的方法，且該患者係於替代凝血因子VIII功能的多特異性抗原結合分子的投予之前、同時地或之後，投予凝血因子IX製劑的患者。 [A13] 一方法為包含對於患者，投予凝血因子IX製劑的步驟之用於凝血因子IX異常症的預防和/或治療的方法，且凝血因子IX製劑係與替代凝血因子VIII功能的多特異性抗原結合分子組合投予。 [A14] 一方法為包含對於血友病患者B，投予凝血因子IX製劑的步驟之增強替代凝血因子VIII功能的多特異性抗原結合分子的替代FVIII功能的活性的方法，且該患者係於凝血因子IX製劑的投予之前、同時地或之後，投予替代凝血因子VIII功能的多特異性抗原結合分子的患者。 [B1] 用於凝血因子IX異常症的預防方法和/或治療方法中使用之替代凝血因子VIII功能的多特異性抗原結合分子。 [B2] 替代凝血因子VIII功能的多特異性抗原結合分子，係辨識凝血因子IX和/或活性型凝血因子IX以及凝血因子X的雙特異性抗體之[B1]記載的抗原結合分子。 [B3] 前述雙特異性抗體為下述記載的抗體之[B2]記載的抗原結合分子: 為第一多肽與第三多肽形成對，第二多肽與第四多肽形成對的雙特異性抗體，由第一多肽為包含序列編號: 1、2、3(Q499的H鏈CDR)記載的H鏈CDR1、2、3的胺基酸序列的H鏈，第二多肽為包含序列編號: 4、5、6(J327的H鏈CDR)記載的H鏈CDR1、2、3的胺基酸序列的H鏈，第三多肽與第四多肽為包含序列編號: 7、8、9(L404的L鏈CDR)記載的L鏈CDR1、2、3的胺基酸序列的共通L鏈所構成的雙特異性抗體。 [B4] 前述雙特異性抗體為下述記載的抗體之[B2]或[B3]記載的抗原結合分子: 為第一多肽與第三多肽形成對，第二多肽與第四多肽形成對的雙特異性抗體，由第一多肽為包含序列編號: 13記載的H鏈可變區域的胺基酸序列的H鏈，第二多肽為包含序列編號: 14記載的H鏈可變區域的胺基酸序列的H鏈，以及第三多肽與第四多肽為包含序列編號: 15記載的L鏈可變區域的胺基酸序列的共通L鏈所構成的雙特異性抗體。 [B5] 前述雙特異性抗體為下述記載的抗體之[B2]至[B4]中任一項記載的抗原結合分子: 為第一多肽與第三多肽形成對，第二多肽與第四多肽形成對的雙特異性抗體，由第一多肽為由序列編號: 10記載的胺基酸序列所構成的H鏈，第二多肽為由序列編號: 11記載的胺基酸序列所構成的H鏈，以及第三多肽與第四多肽為序列編號: 12記載的共通L鏈所構成的雙特異性抗體。 [B6] 凝血因子IX異常症係經由凝血因子IX和/或活性型凝血因子IX的活性降低、功能異常和/或缺損而發症及/或進展的疾病之[B1]至[B5]中任一項記載的抗原結合分子。 [B7] 凝血因子IX異常症係先天性或後天性的疾病之[B1]至[B6]中任一項記載的抗原結合分子。 [B8] 凝血因子IX異常症係血友病B或凝血因子IX缺乏症之[B1]至[B7]中任一項記載的抗原結合分子。 [B9] 預防方法和/或治療方法，係與凝血因子IX製劑之併用療法之[B1]至[B8]中任一項記載的抗原結合分子。 [B10] 預防方法和/或治療方法，係用於凝血因子IX製劑之凝血活性的增強使用之方法之[B1]至[B8]中任一項記載的抗原結合分子。 [B11] 用於凝血因子IX異常症的預防方法和/或治療方法使用之替代凝血因子VIII功能的多特異性抗原結合分子及凝血因子IX製劑的併用醫藥。 [B12] 用於凝血因子IX異常症患者中凝血因子IX製劑的凝血活性增強使用之替代凝血因子VIII功能的多特異性抗原結合分子。 [B13] 一凝血因子IX製劑，為用於凝血因子IX異常症的預防方法和/或治療方法使用之凝血因子IX製劑，且與[B1]至[B8]中任一項記載的抗原結合分子組合投予。 [B14] 用於[B1]至[B8]中任一項記載的抗原結合分子之替代FVIII功能活性增強使用之凝血因子IX製劑。 [B15] 用於血友病B患者中替代凝血因子VIII功能的多特異性抗原結合分子的替代FVIII功能之活性的增強使用之凝血因子IX製劑。 [C1] 在用於凝血因子IX異常症的預防和/或治療用的醫藥製造中，替代凝血因子VIII功能的多特異性抗原結合分子的用途。 [C2] 替代凝血因子VIII功能的多特異性抗原結合分子，係辨識凝血因子IX和/或活性型凝血因子IX以及凝血因子X的雙特異性抗體之[C1]記載的用途。 [C3] 前述雙特異性抗體為下述記載的抗體之[C2]記載的用途： 為第一多肽與第三多肽形成對，第二多肽與第四多肽形成對的雙特異性抗體，由第一多肽為包含序列編號: 1、2、3(Q499的H鏈CDR)記載的H鏈CDR1、2、3的胺基酸序列的H鏈，第二多肽為包含序列編號: 4、5、6(J327的H鏈CDR)記載的H鏈CDR1、2、3的胺基酸序列的H鏈，第三多肽與第四多肽為包含序列編號: 7、8、9(L404的L鏈CDR)記載的L鏈CDR1、2、3的胺基酸序列的共通L鏈所構成的雙特異性抗體。 [C4] 前述雙特異性抗體為下述記載的抗體之[C2]或[C3]記載的用途： 為第一多肽與第三多肽形成對，第二多肽與第四多肽形成對的雙特異性抗體，由第一多肽為包含序列編號: 13記載的H鏈可變區域的胺基酸序列的H鏈，第二多肽為包含序列編號: 14記載的H鏈可變區域的胺基酸序列的H鏈，以及第三多肽與第四多肽為包含序列編號: 15記載的L鏈可變區域的胺基酸序列的共通L鏈所構成的雙特異性抗體。 [C5] 前述雙特異性抗體為下述記載的抗體之[C2]至[C4]中任一項記載的用途： 為第一多肽與第三多肽形成對，第二多肽與第四多肽形成對的雙特異性抗體，由第一多肽為由序列編號: 10記載的胺基酸序列所構成的H鏈，第二多肽為由序列編號: 11記載的胺基酸序列所構成的H鏈，以及第三多肽與第四多肽為序列編號: 12記載的共通L鏈所構成的雙特異性抗體。 [C6] 凝血因子IX異常症係經由凝血因子IX和/或活性型凝血因子IX的活性降低、功能異常和/或缺損而發症及/或進展的疾病之[C1]至[C5]中任一項記載的用途。 [C7] 凝血因子IX異常症係先天性或後天性的疾病之[C1]至[C6]中任一項記載的用途。 [C8] 凝血因子IX異常症係血友病B或凝血因子IX缺乏症之[C1]至[C7]中任一項記載的用途。 [C9] 醫藥係與凝血因子IX製劑之併用醫藥之[C1]至[C8]中任一項記載的用途。 [C10] 醫藥係用於增強凝血因子IX製劑的凝血活性的醫藥之[C1]至[C8]中任一項記載的用途。 [C11] 在用於凝血因子IX異常症的預防和/或治療的併用醫藥的製造中，替代凝血因子VIII功能的多特異性抗原結合分子與凝血因子IX製劑的用途。 [C12] 在用於凝血因子IX異常症患者中增強凝血因子IX製劑的凝血活性的醫藥的製造中，替代凝血因子VIII功能的多特異性抗原結合分子的用途。 [C13] 用於血因子IX異常症的預防和/或治療的併用醫藥，與替代凝血因子VIII功能的多特異性抗原結合分子的併用醫藥的製造中，凝血因子IX製劑的用途。 [C14] 在用於增強血友病B患者中替代凝血因子VIII功能的多特異性抗原結合分子的替代FVIII功能的活性的醫藥的製造中，凝血因子IX製劑的用途。 [發明的效果]
根據本發明，提供含有替代FVIII功能的多特異性抗原結合分子之用於血友病A、後天性血友病A、溫韋伯氏症、及血友病C以外的FIX異常症的預防和/或治療的醫藥組合物。
本發明之替代FVIII功能的多特異性抗原結合分子，也可替代稱為具有類FVIII活性的多特異性抗原結合分子，本發明之「替代FVIII功能」，意指經由FIXa促進FX的活化(經由FIXa促進FXa產生)。再者，更具體而言，本發明之「替代FVIII功能」，意指辨識FIX和/或FIXa以及FX，經由FIXa促進FX的活化(經由FIXa促進FXa產生)。FXa產生促進活性，可經由所屬技術領域中具有通常知識者所熟知的方法進行，例如，可由FIXa、FX、合成基質S-2222(FXa的合成基質)、磷脂質所構成的測定系來評估。更詳細而言，可根據專利WO 2005/035756、WO 2006/109592、WO 2012/067176等中所記載的方法來評估。
本發明之多特異性抗原結合分子，包含對於至少2種類的不同抗原或抗原決定基可特異性結合的第一抗原結合部位與第二抗原結合部位。第一抗原結合部位與第二抗原結合部位，只要個別具有對於FIX和/或FIXa及FX的結合活性，則無特別限定，例如可列舉與抗體、支架(scaffold)分子(類抗體分子)、肽等之與抗原結合的必要部位，或包含該部位之片段。支架分子，為藉由結合於標靶分子而發揮功能的分子，只要為可結合於至少1個標的抗原的立體構造安定的多肽的話，也可使用任何的多肽。作為如此之多肽之例，例如，抗體可變區域、纖維接合素(fibronectin)(WO 2002/032925)、蛋白質A域(WO 1995/001937)、LDL受體A域(WO 2004/044011、WO 2005/040229)、錨蛋白(ankyrin)(WO 2002/252565)等之外，可列舉Nygren等人(Current Opinion in Structural Biology 1997; 7: 463469，Journal of Immunol Methods 2004; 290: 3-28)、Binz等人(Nature Biotech 2005; 23: 1257-1266)、Hosse等人(Protein Science 2006; 15: 14-27)中所記載的分子。再者，亦可使用如Curr Opin Mol Ther 2010; 12(4): 487-95或Drugs 2008 68(7):901-12所記載方式之可結合於標的抗原之肽分子。
本發明中，作為多特異性抗原結合分子，只要為可與至少2種類的不同抗原或抗原決定基結合的分子，則無特別限定。例如，可列舉包含抗體或支架分子及該等之片段等之上述抗結合部位的多肽、核酸分子或肽所構成適體(aptamer)等，可為單一分子，亦可為該等之多聚體。作為較佳之多特異性抗原結合分子。可列舉對於至少2個不同的抗原可特異性結合的多特異性抗體。本發明之多特異性抗體中，作為特佳的抗體，可列舉對於2個不同抗原可特異性結合的雙特異性抗體(bispecific antibody；BsAb)(亦有稱為二種特異性抗體的情況)。
本發明之「共通L鏈」，意指與不同的2種以上的H鏈各自形成對，對於各自的抗原可顯示結合能力的L鏈。此處，「不同的H鏈」，較佳雖指稱對於不同抗原的抗體的H鏈，但不限定為該等，意指胺基酸序列為彼此不同的H鏈。共通L鏈，例如可根據WO 2006/109592記載的方法取得。
作為本發明之一態樣，本發明之多特異性抗原結合分子、多特異性抗體或雙特異性抗體各自具有複數的抗體L鏈的情況，該等抗體L鏈可彼此不同，亦可為共通L鏈。
作為本發明之一態樣，多特異型抗原結合分子，係辨識FIX和/或FIXa與FX且替代FVIII功能的多重特異性抗結合分子，較佳係辨識FIX和/或FIXa與FX且替代FVIII功能的多特異性抗體，更佳為辨識FIX和/或FIXa與FX且替代FVIII功能的雙特異性抗體。本發明之抗原結合分子或抗體，較佳包含抗FIXa抗體中之可變區域，與抗FX抗體中之可變區域。
作為本發明之一態樣，多特異性抗原結合分子、多特異性抗體或雙特異性抗體，包含含有辨識FIX和/或FIXa的抗原結合部位之第一多肽及第三多肽、以及含有辨識FX的抗原結合部位的第二多肽及第四多肽。第一多肽及第三多肽，以及第二多肽及第四多肽中，包含抗體的H鏈的抗原結合部位，與抗體的L鏈的抗原結合部位。
例如，本發明之多特異性抗原結合分子、多特異性抗體或雙特異性抗體中，第一多肽及第三多肽各自包含針對FIX或FIXa的抗體的H鏈或L鏈的抗原結合部位，第二多肽及第四多肽各自包含針對FX的抗體的H鏈或L鏈的抗原結合部位。此時，第一多肽及第三多肽，以及第二多肽及第四多肽所包含之抗體的L鏈的抗原結合部位，亦可為共通L鏈的抗原結合部位。
本發明之包含抗體的L鏈的抗原結合部位的多肽，較佳為包含結合於FIX、FIXa和/或FX的抗體的L鏈之全部或部分序列者。
作為本發明所記載之替代FVIII功能的多特異性抗原結合分子之較佳態樣，可例示辨識FIX和/或FIXa以及FX的雙特異性抗體。如此之抗體，例如可依據WO 2005/035756、WO 2006/109592、WO2012/67176等所記載的方法來取得。本發明的雙特異性抗體包含該等文獻所記載的抗體。
作為較佳的雙特異性抗體，可列舉為專利文獻(WO 2012/067176)所記載的雙特異性抗體的以下抗體(ACE910:依米珠單抗(Emicizumab))。 為第一多肽及第三多肽形成對，第二多肽及第四多肽形成對的雙特異性抗體，由第一多肽為包含序列編號: 1、2、3(Q499的H鏈CDR)所記載的H鏈CDR1、2、3的胺基酸序列的H鏈、第二多肽為包含序列編號: 4、5、6(J327的H鏈CDR)記載的H鏈CDR1、2、3的胺基酸序列的H鏈，第三多肽與第四多肽為包含序列編號: 7、8、9(L404的L鏈CDR)記載的L鏈CDR1、2、3的胺基酸序列的共通L鏈所構成的雙特異性抗體。 再具體而言，為第一多肽及第三多肽形成對，第二多肽及第四多肽形成對的雙特異性抗體，由第一多肽為包含序列編號: 13記載的H鏈可變區域的胺基酸序列的H鏈，第二多肽為包含序列編號: 14記載的H鏈可變區域的胺基酸序列的H鏈，以及第三多肽與第四多肽為包含序列編號: 15記載的L鏈可變區域的胺基酸序列的共通L鏈所構成的雙特異性抗體。 再具體而言，為第一多肽及第三多肽形成對，第二多肽及第四多肽形成對的雙特異性抗體，由第一多肽為由序列編號: 10記載的胺基酸序列所構成的H鏈，第二多肽為由序列編號: 11記載的胺基酸序列所構成的H鏈，以及第三多肽與第四多肽為序列編號: 12記載的共通L鏈所構成的雙特異性抗體(Q499-z121/J327-z119/L404-k)。
本發明所記載的胺基酸序列所包含的胺基酸也有受到轉譯後修飾(例如，N末端的麩胺酸的經由焦麩胺酸化而成為焦麩胺酸的修飾為所屬技術領域中具有通常知識者所習知的修飾)的情況，如此之胺基酸經轉譯後修飾的情況當然亦包含於本發明所使用的抗體。
本說明書中，「辨識抗原A的抗體」之「辨識」、「結合於抗原A的抗體」之「結合」、「特異性結合於抗原A的抗體」之「特異性結合」等用語，彼此具互換性可以廣泛的意義使用。
本發明之多肽，通常指稱具有10個胺基酸左右以上的長度的肽的肽，以及蛋白質。再者，通常雖然為源自生物的多肽，但無特別限定，亦可為由人工設計的序列所構成之多肽。再者，亦可為天然多肽、或合成多肽、重組多肽之任一者。進一步地，上述多肽的片段，亦包含於本發明之多肽。
「抗體」之用語，以最廣的意義使用，以顯示所期望的生物學活性為限，可為單株抗體、多株抗體、二聚體、多聚體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、抗體衍生物及抗體修飾物(Miller K et al. J Immunol. 2003, 170(9), 4854-61)。抗體可為小鼠抗體、人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體，亦可為源自其他種的抗體、亦可為人工合成者。本說明書中所揭示的抗體，可為免疫球蛋白分子的任意類別(type)(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、及IgA)、類型(class)(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgGA1、及IgGA2)或亞類型(subclass)。免疫球蛋白可為源自任意種(例如，人、小鼠或兔)。又，「抗體」、「免疫球蛋白」及「免疫球蛋白質」之用語具有互換性以廣泛意義使用。
「抗體衍生物」包含抗體的一部分，較佳為抗體的可變域，或至少抗體的抗原結合區域。抗體衍生物中，雖包含例如由Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、線狀抗體、單鏈抗體(scFv)、sc(Fv)2、Fab3、域抗體(dAb)(國際公開第2004/058821號、國際公開第2003/002609號)、雙功能抗體(diabody)、三功能抗體、四功能抗體、微抗體、及抗體衍生物所形成之多重特異性抗體，但不限定為該等。此處，「Fab」係由單鏈的輕鏈、以及單鏈的重鏈的CH1區域及可變區域所構成。再者，「Fv」為最小的抗體衍生物，包含完全的抗原辨識區域及抗原結合區域。再者，抗體衍生物以可為例如與IgG抗體的Fc的融合體。例如，可參照美國專利第5641870號說明書，實施例2；Zapata G et al. Protein Eng. 1995, 8(10), 1057-1062; Olafsen T et al. Protein Eng. Design & Sel. 2004, 17(4): 315-323; Holliger P et al. Nat. Biotechnol. 2005, 23(9); 1126-36; Fischer N et al. Pathology. 2007, 74(1): 3-14; Shen J et al. J Immunol Methods. 2007, 318, 65-74; Wu et al. Nat Biotechnol. 2007, 25(11), 1290-7。
雙功能抗體，意指經由基因融合所構築之二價(bivalent)的低分子化抗體(Holliger P et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90: 6444-6448、EP404097號、WO 93/11161號等)。雙功能抗體係由2個鏈的多肽鏈所構成的二聚體，多肽鏈各自地，於同鏈中L鏈可變區域(VL)及H鏈可變區域(VH)，於互相不可結合的位置，經由短的，例如較佳為2至12個殘基、更佳為3至10個殘基、特別是5個殘基左右的連結子而結合。編碼於同一多肽鏈上的VL及VH，由於其之間的連結子短而無法形成單鏈可變區域片段而形成二聚體，雙功能抗體成為具有2個抗原結合部位。
單鏈抗體或scFv抗體片段，包含抗體的VH及VL區域，該等區域存在於單一的多肽鏈中。一般而言，Fv多肽進一步於VH及L區域之間包含多肽連結子，經由該等，scFv可形成抗原結合用之必要的結構(關於scFv總論，參照Pluckthun『The Pharmacology of Monoclonal Antibodies』Vol. 113(Rosenburg and Moore ed (Springer Verlag, New York) pp. 269-315, 1994)。本發明之連結子，只要不為阻礙其兩端連結之抗體可變區域的表現者則無特別限定。
再者，Fab’可藉由化學性交聯製作雙特異性抗體。例如，由一方的抗體所調製的Fab’以o-PDM(鄰-伸苯基-馬來醯亞胺)馬來醯亞胺化，藉由將其與由另一方的抗體所調製的Fab'反應，可製作源自不同抗體的Fab'彼此交聯的雙特異性F(ab’)2(Keler T et al. Cancer Research 1997; 57: 4008-4014)。再者，亦已知化學性結合Fab’-硫基硝基苯甲酸鹽(TNB)衍生物與Fab’-硫醇(SH)等的抗體片段的方法(Brennan M et al. Science 1985; 229: 81-83)。
亦可使用源自Fos、Jun等的白胺酸拉鏈(leucine zipper)替代化學交聯。Fos、Jun雖亦形成同元二聚體，但利用優先形成的異元二聚體。調製表現經加成Fos白胺酸拉鏈的Fab’與經加成Jun白胺酸拉鏈的另一的Fab’。藉由將以溫和條件還原的單體Fab’-Fos、Fab’-Jun混合使其反應可形成雙特異性F(ab’)2(Kostlny SA et al. J of Immunology, 1992; 148: 1547-53)。該方法不限定於Fab’，亦可應用於scFv、Fv等。
再者， IgG-scFv(Protein Eng Des Sel. 2010; 23(4): 221-8)或BiTE等sc(Fv)2(Drug Discov Today 2005; 15; 10(18): 1237-44)、DVD-Ig(Nat Biolechnol 2007; 25(1):1290-7，Epub 2007 Oct 14, Mabs 2009; 1(4): 339-47，Epub 2009 Jul 10)等之外(IDrugs 2010; 13:698-700)，亦已知two-in-one抗體(Science 2009; 20: 323(5921): 1610-4，Immunotherapy 2009; 1(5): 749-51)、Tri-Fab或串聯scFv、雙功能抗體等雙特異性抗體(MAbs 2009; 1(6): 539-547)。此外，使用scFv-Fc、支架-Fc等分子形，由於使異元組合的Fc優先地分泌(Ridgway JB et al. Protein Engineering 1996; 9: 617-621，Merchant AM et al. Nature Biotechnology 1998; 16: 677-681，WO 2006/106905，Davis JH et al. Protein Eng Des Sel 2010; 4: 195-202)，可有效率地製作雙特異性抗體。
雙功能抗體中亦可製作雙特異性抗體。雙特異性雙翁能抗體係二個交叉(cross-over)的scFv片段的異元二聚體。亦即可使用二種源自抗體A、B的VH及VL經由5殘基前後比較短的連結子連結所製作的VH(A)-VL(B)、VH(B)-VL(A)所構成之異元二聚體(Holliger P et al. Proc of the National Academy of Sciences of the USA 1993; 90: 6444-6448)。
此時，二種scFv藉由以約15殘基之柔軟的比較長的連結子連結(單鏈雙功能抗體：Kipriyanov SM et al. J of Molecular Biology 1999; 293: 41-56)，進行適當的胺基酸置換(Knobs-into-holes: Zhu Z et al. Protein Science 1997; 6: 781-788，VH/VL interface engineering: Igawa T et al. Protien Eng Des Sel 2010; 8: 667-77)亦可促進目的之構成。
二種scFv藉由以約15殘基之柔軟的比較長的連結子連結可製作sc(Fv)2而可為雙特異性抗體(Mallender WD et al. J of Biological Chemistry 1994; 269: 199-206)。
作為抗體修飾物，例如，可列舉與聚乙二醇(PEG)等各種分子結合的抗體。本發明抗體，亦包含該等抗體修飾物。本發明的抗體修飾物中，結合物質並無限定。可獲得該等方式之抗體修飾物，可藉由對所得抗體施行化學性修飾而獲得。該等方法已於該領域中確立。
「雙特異性」抗體，意指同一抗體分子內具有辨識不同抗原決定基的可變區域的抗體。雙特異性抗體可為辨識2個以上不同抗原的抗體，亦可為辨識同一抗體上不同的2個以上的抗原決定基的抗體。雙特異性抗體不僅為完整抗體，亦包含抗體衍生物。本發明之抗體，亦包含雙特異性抗體。又，本說明書中，抗FIXa/FX雙特異性抗體，與辨識FIXa及FX雙特異性抗體以同義使用。
基因重組抗體的製作方法 作為抗體，可使用採用基因重組技術所產生的重組型抗體。重組型抗體，可由融合瘤、或產生抗體的敏化淋巴球等抗體產生細胞選殖編碼該抗體的DNA，組入至載體，將該載體導入宿主(宿主細胞)使抗體產生而獲得。
抗體為人類抗體、小鼠抗體、大鼠抗體等，其來源並不限定。再者，亦可為嵌合抗體或人源化抗體等基因改變抗體。
人類抗體的取得方法係為已知，例如，將具有人類抗體基因全部組庫(repertoire)的基因轉殖動物以目的抗原進行免疫而可取得目的之人類抗原(參照國際專利公開號WO 93/12227、WO 24/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096、WO 96/33735)。
基因改變抗體，可使用已知的方法製造。具體而言，例如嵌合抗體，係由免疫動物的抗體的H鏈及L鏈的可變區域，以及人類抗體的H鏈及L鏈的恆定區域所構成之抗體。藉由將編碼源自免疫動物的抗體的可變區域的DNA，與編碼人類抗體的恆定區域的DNA連結，將其組入至表現載體再導入宿主而使其產生，可獲得嵌合抗體。
人源化抗體係亦稱為重構(reshaped)人類抗體的改變抗體。人源化抗體係藉由將源自免疫動物的抗體的互補性決定區域(CDR；complementarity determining region)移植至人類抗體的CDR所構築。其之一般基因重組手法亦為已知(參照歐洲專利公開號EP 239400，國際專利公開號WO 96/02576，Sato K et al. Cancer Research 1993, 53; 851-856，國際專利公開號WO 99/51743)。
雙特異性抗體不限制為IgG類型者，例如IgG類型雙特異性抗體可藉由融合二種產生IgG抗體的融合瘤所生成的雜合融合瘤(hybrid hybridoma)(四源融合瘤(quadroma))使其分泌(Milstein C et al. Nature 1983; 305: 537-540)。再者，藉由將構成目的之二種IgG的L鏈及H鏈的基因，合計4種基因導入細胞使其共表現而可使其分泌。
此時藉由於H鏈的CH3區域施行適當的胺基酸置換，亦可對於鏈之異元組合的IgG優先地使其分泌(Ridgway JB et al. Protein Engineering 1996, 9: 617-621，Merchant AM et al. Nature Biotechnology 1998; 16: 677-687，WO 2006/106905，Davis JH et al. Protein Eng Des Sel, 2010, 4: 195-202)。
再者，關於L鏈，由於與H鏈可變區域相比，L鏈的多樣性低，期待可獲得對於兩個H鏈賦予結合能力的共通L鏈，本發明的抗體亦可為具有共通L鏈的抗體。藉由將該共通L鏈與兩H鏈的基因導入細胞使其表現IgG，可效率良好地表現雙特異性IgG。
抗體的製造方法 本發明之抗體可經由所屬技術領域中具有通常知識者習知的方法製造。具體而言，將編碼目的抗體之DNA組入表現載體。此時，表現調控區域，例如將增強子、啟動子之調控單元表現的方式組入表現載體。此時，可使用適當的宿主及表現載體的組合。
作為載體之例，可列舉M13系載體、pUC系載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。再者，cDNA的次選殖、提出作為目的的情況，上述的載體以外，例如可使用pGEM-T、pDIRECT、pT7等。
於生產抗體為目的而使用載體的情況中，特別地，表現載體為有用的。作為表現載體，例如，於JM109、DH5α、HB101、XL1-Blue等大腸菌作為宿主的情況，於大腸菌可更有效率地表現的啟動子，例如具有LacZ啟動子(Ward等，Nature(1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427)、araB啟動子(Better等，Science(1988) 240, 1041-1043)、或T7啟動子等為不可欠缺。作為該等方式之啟動子，上述載體之外，可列舉pGEX-5X-1(Pharmacia公司製)、「QIAexpres system」(QIAGEN公司製)、pEGFP、或pET(此時，宿主較佳為表現T7 RNA聚合酶的BL21)等。
再者，載體中，亦可包含用於多肽分泌之信號序列。作為多肽分泌用的信號序列，使其產生於大腸菌周質的情況，例如使用pelB信號序列(Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4397)即可。對於宿主細胞之載體的導入，例如可使用氯化鈣法、電穿孔法進行。
大腸菌表現載體以外，作為製造本發明抗體用之載體，例如，可列舉源自哺乳動物的表現載體(例如，pvDNA3(Invitrogen公司製)、或pEGF-BOS(Nucleic Acids. Res. 1990, 18(17), p5322)、pEF、pCDM8)、源自昆蟲細胞的表現載體(例如，「Bac-to-Bac桿狀病毒表現系統」(GIBCO BRL公司製)、pBacPAK8)、源自植物的表現載體(例如，pMH1、pMH2)、源自動物病毒的表現載體(例如，pHSV、pMV、pAdexLcw)、源自反轉錄病毒的表現載體(例如，pZIPneo)、源自酵母菌的表現載體(例如，「畢赤酵母表現套組(Pichia Expression Kit)」(Invitrogen公司製)、pNV11、SP-Q01)、源自枯草桿菌的表現載體(例如，pRL608、pKTH50)。
於CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等動物細胞的表現作為目的的情況，具有細胞內表現用的必要啟動子，例如SV40啟動子(Mulligan等，Nature (1979) 277, 108)、MMTV-LTR啟動子、EF1α啟動子(Mizushima等, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)、CAG啟動子(Gene. (1990) 108, 193)、CMV啟動子等為不可欠缺，更佳為具有選擇形質轉換細胞用的基因。作為選擇形質轉換細胞用的基因，例如，可經由藥劑(新黴素、G418等)判別方式之藥劑耐性基因。作為具有該等特性之載體，例如，可列舉pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等。
進一步地，以基因安定表現、且細胞內的基因複本樹的擴增為目的的情況，可列舉於核酸合成途徑有缺損的CHO細胞導入具有與其互補之 DHFR基因的載體(例如，pCHOI等)，經由甲胺蝶呤(MTX)使其擴增的方法，再者，以基因的瞬時表現為目的的情況，可列舉使用染色體上具有表現SV40 T抗原的基因的CHO細胞，以具有SV40的複製起點的載體(pcD等)形質轉換的方法。作為複製起始點，可使用源自多瘤病毒、腺病毒、牛乳突病毒(BPV)等者。進一步地，於宿主細胞系之基因複本數擴增用，表現載體可包含作為選擇標記之胺基糖苷轉移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大腸菌黃嘌呤鳥糞嘌呤磷酸核糖轉移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酵素(dhfr)基因等。
由此所得之本發明的抗體，可自宿主細胞內或細胞外(培養基等)單離、精製作為實質上純粹的均一抗體。抗體的分離、精製，使用通常的抗體精製中所使用之分離、精製方法即可，並無任何限定。例如，可適宜選擇、組合層析管柱、過濾器、超過濾、鹽析、溶劑沉澱、溶劑萃取、蒸餾、免疫沉降、SDS-聚丙烯醯胺電泳、等電點電泳、透析、再結晶等，進行分離、精製。
作為層析，例如可列舉親和性層析、離子交換層析、疏水性層析、膠體過濾、逆相層析、吸附層析等(Strategies for Protein Purification and Characterzation: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor laboratory Press, 1996)。該等層析，可使用液相層析，例如HPLC、FPLC等液相層析進行。作為使用於親和性層析的管柱，可列舉蛋白質A管柱、蛋白質G管柱。例如，作為使用蛋白質A的管柱，可列舉Hyper D、POROS、Sepharose FF (GE Amersham Biosciences)等。本發明亦包含使用該等精製方法，經高度精製的抗體。
使用於治療或預防目的之本發明的醫藥組合物，根據必要，可與適當的藥學上容許的載體、介質等混合而調製，可做成凍結乾燥製劑或溶液製劑。作為適當的藥學上容許的載劑、介質，例如，可列舉滅菌水或生理食鹽水、安定劑、賦形劑、抗氧化劑(抗壞血酸等)、緩衝劑(磷酸、檸檬酸、組胺酸、其他的有機酸等)、防腐劑、界面活性劑(PEG、Tween等)、螯合劑(EDTA等)、結合劑等。再者，亦可含有其他的低分子量多肽、血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白等蛋白質，甘胺酸、麩胺醯胺、天冬醯胺、麩胺酸、天冬胺酸、甲硫胺酸、精胺酸及離胺酸等胺基酸，多醣及單糖等糖類或碳水化合物甘露醇或山梨醇等糖醇。作為注射用水溶液的情況，例如生理食鹽水、包含葡萄糖或其他輔助劑的等張液，例如可列舉D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉，亦可併用適當的溶解輔助劑，例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、PEG等)、非離子性界面活性劑(聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、波洛沙姆188、HCO-50)等。再者，藉由於製劑中混合透明質酸酶(hyalurodinase)，亦可能更大液量進行皮下投予(Expert Opin Drug Deliv. 2007 Jul; 4(4): 427-40)。再者，本發明之醫藥組合物亦可預先裝入於注射筒。又，溶液製劑可根據WO 2011/090088記載的方法製作。
本發明之醫藥組合物的投予，可經由任意的適合路徑投予至患者。例如，作為推注劑(bolus)或歷經一定期間持續注入至靜脈內、肌肉內、腹腔內、腦脊髓內、經皮、皮下、關節內、舌下、滑液內、經口、吸入、經局部或外用路徑投予至患者。較佳為靜脈內或皮下投予。本發明之患者，包含人類患者及非人類動物患者。本發明中，「患者」之用語，與「對象」及「個體」係互換地使用。
投予量，例如前述雙特異性抗體的情況，為0.001至1000mg/kg。投予間隔，於前述雙特異性抗體的情況，至少為1日以上。
作為監控FVIII等凝血因子的藥效的方法，旋轉血栓彈力儀(rotation thromboelastometry(ROTEM))、部分活化凝血酶時間(APTT)、凝固波形解析(CWA)及血栓生成試驗(TGA)等廣為已知，只要為所屬技術領域中具有通常知識者可適宜改變、修正該等方法。該等方法可單獨使用，亦可數個併用，至少一個方法具有的結果可判斷藥效。
ROTEM係經由監控血栓彈力圖(凝固血液的彈力性變化)，可綜合地評估血液的凝固能力、凝固過程的檢查法。泛用於出血原因的分析及治療藥效果判定。於被檢血液添加Ca觸發劑等反應引起試劑，測定凝固時間(clotting time(CT))及凝塊成形時間(clot formation time (CFT))等，作為評估參數。
APTT係自以往泛用作為FVIII製劑的藥效監控方法。APTT係於被檢血漿添加APTT試劑後，添加CaCl2 ，測定纖維蛋白原變換為不溶性纖維蛋白的時間，亦即至凝固開始的時間的方法。
CWA係經時地測定凝固反應亢進中所生成的纖維蛋白量作為光學(例如，吸光度)變化量的試驗。CWA中，可經時地評估，自凝固反應的纖維蛋白生成的開始階段至擴增階段為止的連續凝固反應。進一步地，關於CWA的凝固開始試劑，有報告組合APTT試劑(Thromb Haemost 2002; 87(3): 436-41，J Thromb Haemost 2006; 4(2): 377-84)、低濃度的組織因子(TF)與凝血因子XII(FXII)的活性化劑(鞣花酸(ellagic acid))的混合溶液的試劑(J Thromb Haemost 2014; 12(3): 355-62)等。將凝固波形微分，算出凝固速度，利用最大凝固速度作為參數。將凝固速度微分(2次微分)，算出凝固加速度，利用最大凝固加速度作為參數(Haemophilia 2008; 14: 83-92，J Thromb Haemost 2014; 12(3): 355-62)
TGA係使用對凝血酶的螢光基質，經時地定凝固反應亢進中所生成之凝血酶量作為酵素活性的試驗(Haemophilia 2008; 14(suppl. 3): 83-92)。
作為本發明的一態樣，係提供含有替代FVIII功能的多特異性抗原結合分子，使用於FIX異常症的預防和/或治療的醫藥組合物。FIX異常症係起因於FIX先天性缺損或功能不全的罕見出血性疾病，例如可列舉血友病B或FIX缺乏症。再者，FIX的活性降低或缺損，雖可例示因先天性和/或後天性的原因，但不限定於該等。作為FIX的活性降低的程度，與健康者比較，可列舉患者較佳為未達40%(例如，未達40%、未達30%、未達20%、未達10%)，再佳為未達10%(例如，未達10%、未達9%、未達8%、未達7%、未達6%)，更佳為未達5%(例如，未達5%、未達4%、未達3%、未達2%)，特佳為未達1%，但不限定於該等。FIX活性的測定方法為所屬技術領域中具有通常知識者所習知(例如，「對每個人有幫助的血友病的基礎與臨床」（みんなに役立つ血友病の基礎と臨床），白幡　聡，醫藥雜誌社，2009等)。
作為本發明的一態樣，血友病B患者或FIX缺乏症患者，雖不限定於該等者，包含具有或不具有抑制劑(對於FIX的自體抗體)的患者、FIX的量降低或完全缺損的患者、FIX的活性降低或完全缺損的患者。
一面向中，血友病B患者或FIX缺乏症患者，係具有未達1.0 IU/dL的微量FIX活性的血友病B重症患者或FIX缺乏症重症患者。一面向中，血友病B患者或FIX缺乏症患者係不保有抑制劑的血友病B患者或FIX缺乏症患者。
又，「血友病B」及「FIX缺乏症」之用語係具互換性地以廣義的意義使用。
作為本發明的一態樣，係提供用以與凝血因子IX製劑(FIX製劑)併用之含有替代FVIII功能的多特異性抗原結合分子的凝血因子IX異常症的預防和/或治療用的醫藥組合物。併用可為該等藥劑同時地、連續、或亦可先投予一方後，經過時間再投與另一方。
再者，別的面向中，提供用以增強FIX製劑的凝血活性之含有替代FVIII功能的多特異性抗原結合分子的用於凝血因子IX異常症的預防和/或治療的醫藥組合物。
再者，別的面向中，提供替代凝血因子VIII功能的多特異性抗原結合分子與FIX製劑組合而成之用於凝血因子IX異常症的預防和/或治療的併用醫藥。
再者，別的面向中，提供於凝血因子IX異常症患者中使用替代凝血因子VIII功能的多特異性抗原結合分子的增強FIX製劑的凝血活性的方法。
又，凝血活性的增強，意指與該多特異性抗原結合分子投予前相比，經由投予該多特異性抗原結合分子，例如APTT至少縮短1秒，較佳至少縮短3秒或5秒，更佳至少縮短10秒。
再者，別的面向中，提供含有替代凝血因子VIII功能的多特異性抗原結合分子，用以與用於凝血因子IX異常症的預防和/或治療的醫藥組合物併用的凝血因子IX製劑。
提供含有替代凝血因子VIII功能的多特異性抗原結合分子，用於凝血因子IX異常症的預防和/或治療的醫藥組合物之替代FVIII功能的活性增強用的凝血因子IX製劑。
提供於使用凝血因子IX製劑之凝血因子IX異常症患者中，替代凝血因子VIII的多特異性抗原結合分子的替代FVIII功能的活性增強的方法。
FIX製劑，係不論FIX的來源及分子形等而只要為包含FIX的醫藥組合物即可，不限定為該等者，但包含Christmassin M、NOVACT M、PPSB-HT、beneFIX(Nonacog Alfa)、RIXUBIS(Nonacog gamma)、ALPROLIX(Eftrenonacog Alfa)、Idelvion (Albutrepenonacog Alfa)。
作為本發明的一態樣，FIX不限定為源自人類的FIX，可為源自人類、牛、豬、犬、貓及鼠的FIX。一面向中，FIX為人類FIX，意指由461個胺基酸殘基所構成之未成熟型人類FIX(序列編號: 16)，至由46個胺基酸成之N末段信號序列及前肽(pro-peptide)區域經除去的由415個胺基酸殘基所構成之人類FIX(例如，參照UniProtKB/Swiss-Prot Accession P00740-1)。又，人類FIX係以序列編號: 16的47位至461未表示。FIX中，包含具有FIX的典型特徵的任意型態FIX。一般而言，FIX包含GLA域(包含γ-羧基麩胺酸殘基的區域)、2個EGF域(人類EGF同源域)、活化肽域、以及C末端蛋白酶域。然而未必限定為包含該等者，亦可含有所屬技術領域中習知的與該等域同義的域，或者亦可為部分缺損的片段。FIX或序列變異體，不限定於該等，如美國專利第4,770,999號、美國專利第7,700,734號所說明的方式純株化，將編碼人類FIX的cDNA單離(例如，參照Choo et al., Nature 299:178-180(1982)；Fair et al., Blood 64: 194-204 (1984)；and Kurachi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79: 6461-6464 (1982))。該等習知序列變異體中，包含具有增強FIX作用之胺基酸置換及延長半衰期之胺基酸置患者。再者，以可達成本發明的目的為限，可使用所有的FIX改變體(例如人為的於胺基酸序列加入變異的FIX)及所有的FIX修飾體(例如經PEG化的FIX)。以下，本申請中，單純記載為「FIX」的情況，除非特別指名，否則包含其序列變異體、FIX改變體或FIX修飾體。
本說明書使用的情況，經由「包含(comprising)…」的表現所表示的態樣，包含經由「本質上由...所構成(essentially consisting of)」的表現所表示的態樣，以及「由...所構成(consisting of)」的表現所表示的態樣。 本說明書中揭示的引用的所有專利及參考文獻的內容，全文作為參照併入本說明書。 本發明雖藉由以下的實施例進一步例示，但不限定為下述的實施例者。 [實施例]
以下，藉由實施例，更詳細地說明本發明，但本發明不限制為該等實施例。 [實施例1] 本發明中，使用血友病A、後天性血友病A、溫韋伯氏症、及血友病C以外的FIX異常症的血液或血漿，嘗試藉由替代FVIII功能的多特異性抗原結合分子之血液、血漿凝血促進作用的檢證。具體而言，使用源自血友病B患者的血液、血漿及市售之FIX缺乏人類血漿(George King Bio-Medical)，經由ROTEM及APTT之各凝固評估法，研究藉由為前述多特異性抗原結合分子之一的專利文獻(WO 2012/067176)中所記載之為雙特異性抗體的ACE910(依米珠單抗(Emicizumab))的血液、血漿的凝固促進作用。
[實施例2] 為替代FVIII功能的抗FIXa/FX雙特異性抗體之ACE910的調製 ACE910，以WO 2005/035756、WO 2006/109592、WO 2012/067176所記載的方法取得。通過將抗體基因，組入動物細胞表現載體，將該表現載體轉染CHO細胞，來表現雙特異性抗體。接著，精製包含於細胞的培養上清的雙特異性抗體。 此方式所精製的雙特異性抗體的FVIII功能替代活性的測定，係經由以下所示酵素分析來進行。室溫下，將1nM人類FIXa(Enzyme Research Laboratories)、140nM的人類FX(Enzyme Research Laboratories)、20μM的磷脂質(10%磷脂絲胺酸、60%磷脂醯膽鹼(phosphatidylcholine)、30%磷脂醯乙醇胺 (phosphatidylethanolamine))、與雙特異性抗體，以包含5mM CaCl2 與0.1%牛血清白蛋白的Tris緩衝生理食鹽水溶液混合後培養2分鐘，經由FIXa進行FX活化反應。本反應藉由EDTA的添加而停止。其次，添加FXa特異性發色基質溶液S-2222 (CHROMOGENIX)，使用SpectraMax 340PC384(Molecular Devices)測定405nm的吸光度變化。從經由已知濃度之人類FXa(Enzyme Research Laboratories)的吸光度變化做成檢量線，評估因雙特異性抗體所致之FXa產生促進活性。
[實施例3] ROTEM測定 ROTEM測定係根據一般方法，使用ROTEM delta測定裝置(Tem International GmbH)來實施。使用鈣溶液star-tem試劑(Ref. No 503-01, Tem International GmbH)作為Ca觸發劑。 APTT測定 使用Thrombocheck APTT-SLA (Sysmex)作為APTT試劑。於包含ACE910和/或FIX-Gla抗體(Thromb Res 2000; 100: 73-79)之FIX缺乏人類血漿或源自FIX異常症患者的血漿50 μL中，添加APTT試劑50 μL。於37℃培養5分鐘後，添加0.02 mol/L氯化鈣溶液50 μL開始凝固反應，根據一般方法以凝血自動測定裝置(CS-2000i，Sysmex)來測定APTT。
[實施例4] ROTEM測定的結果 使用對源自FIX異常症患者的血液經添加ACE910的樣品，研究經由Ca觸發劑以ROTEM的凝血(開始)時間縮短率[(1-ACE910添加後的凝固(開始)時間/ACE910添加前的凝固(開始)時間) Í 100]。以ROTEM的凝血(開始)時間，係以利用ROTEM delta測定裝置所測定之凝固時間(clotting time, CT)及凝塊形成時間 (clot formation time, CFT)的和算出。 使用源自經由FIX製劑之定期投予療法中的FIX異常症患者17例的血液25檢體(FIX:C的中央值1.9 IU/dL；FIX:C的範圍未達0.2至16.5 IU/dL)，經由Ca觸發劑實施ROTEM時，經由離體(ex vivo)添加ACE910(50μg/mL)的凝固(開始)時間縮短率為，中央值為18%，大致縮短(第1圖顯示部分檢體的凝血(開始)時間比)。 APTT測定的結果 使用對FIX缺乏人類血漿或對源自FIX異常症患者的血漿經添加ACE910的樣品，研究APTT的縮短率[(1-ACE910添加後的APTT/ACE910添加前的APTT)Í100]。 FIX異常症患者10例的血漿中，經由離體添加ACE910(100μg/mL)的APTT縮短率為，於FIX抑制劑陽性的1例中，經由ACE910之縮短率為-6%(APTT率為1.06)而為無效，其餘9例(FIX:C的範圍0.9至6.4 IU/dL)中，中央值39%(範圍35%至45%)(APTT率0.55至0.65)，所有例皆顯示功效(第2圖)。 在市售FIX缺乏血漿中，將FIX製劑(BeneFix，Pfizer)以0、0.01、0.1、1、10、及100 IU/dL的濃度添加，更離體添加ACE910。在評估100 μg/mL的ACE910添加前後之APTT縮短率時，APTT縮短率為對應於FIX製劑濃度各為7%、11%、19%、26%、30%、及33%(第3-1圖)。ACE910的APTT縮短效果為FIX濃度依賴性，且FIX濃度於1至100 IU/dL中的縮短率變化量幾乎安定(26%至33%)。該效果雖然在未添加FIX製劑的IX缺乏人類血漿中稍微顯示(縮短率 7%)，但於其中再離體添加抗FIX-Gla抗體(抗-FIX Ab: 參照Thromb Res 2000; 100: 73-79調製)(抗FIX-Gla抗體: 150 μg/mL)時則無效化(縮短率-3%)(第3-2圖)。又，ACE910之添加群係添加100μg/mL的ACE910。因此，在ACE910的效果表現雖然FIX為必需的，但在極微量的FIX存在下(0.01 IU/dL的程度)亦顯示功效。對FIX缺乏人類血漿僅變化添加FIX製劑的濃度，作成根據FIX濃度變化之APTT縮短的檢量線，由該檢量線將ACE901添加時的APTT換算為FIX:C，FIX濃度0.1、1、及10 IU/dL存在時的ACE910的最大效果，作為FIX:C相當於0.6、11、及114 IU/dL(亦即%)，將FIX製劑的效果增強6至11倍。血友病B重症例的多數具有未達1.0 IU/dL的微量FIX活性。本結果建議微量FIX存在下對於血友病B患者的ACE910的應用可能性。 [產業上可利用性]
根據本發明，於血友病A、後天性血友病A、溫韋伯氏症、及血友病C以外的FIX異常症中，對於出血、伴隨出血的疾病、或起因於出血的及併發症和/或進展，提供使用替代FVIII功能的多特異性抗原結合分子的方法作為預防法和/或治療法。替代FVIII功能的多特異性抗原結合分子，不僅可利用作為對於起因於FVIII功能不全的血友病A、後天性血友病A、溫韋伯氏症、及血友病C的出血之預防法和/或治療法，咸認為可利用作為由其凝血促進活性對於其他FIX異常症的出血之預防法和/或治療法。FIX異常症的現行治療中，由於重複的靜脈內投予為必要，血管確保的困難度為課題，特別是兒童中，成為患者及照護者的大負擔。替代FVIII功能的多特異性抗原結合分子之抗體(例示為ACE910)，開發作為皮下投予製劑，相比於重複的靜脈內投予為必要的FIX製劑，期待投予負擔減輕，咸信本發明有望作為FIX異常症的預防劑和/或治療劑。再者，併用替代FVIII功能的多特異性抗原結合分子與FIX製劑，可增強FIX製劑的效果，咸信有望作為安定的顯示止血效果的併用療法。
無。
第1圖係顯示使用定期投予療法中的FIX異常症患者的血液檢體，在經由Ca觸發劑之全血凝固能力檢查(ROTEM)中的凝血(開始)時間縮短率的圖。 第2圖係顯示於FIX異常症患者的血漿中，ACE910(100μg/mL)離體(ex vivo)添加時之 APTT縮短率的圖。圖中的縮寫之說明於以下顯示。ACE: ACE910 sFIXd: 市售FIX缺乏人類血漿(Sysmex) CogtrN: 市售標準人類血漿(Coagtrol N, Sysmex) FIX: C: FIX活性量 FIX:Ag: FIX抗原量。 第3-1圖係於市售FIX缺乏類血漿(FIXd-plasma或sFIXd)中，以0、0.01、0.1、1、10、及100 IU/dL的濃度添加FIX製劑(rFIX，B eneFix，Pfrizer)，或添加抗FIX-Gla抗體(抗FIX Ab)，再離體添加ACE910，評估100μg/mL的ACE910的添加前後之APTT短縮率的圖。 第3-2圖係顯示於FIX缺乏人類血漿中，再離體添加抗FIX-Gla抗體(aFIXAb)的結果的圖。

Claims (12)

  1. 一種醫藥組合物，其係用於凝血因子IX異常症的預防和/或治療，該醫藥組合物包含替代凝血因子VIII功能的多特異性抗原結合分子。
  2. 如申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其中，替代凝血因子VIII功能的多特異性抗原結合分子，係辨識凝血因子IX和/或活性型凝血因子IX以及凝血因子X的雙特異性抗體。
  3. 如申請專利範圍第2項之醫藥組合物，其中，該雙特異性抗體為下述抗體： 為第一多肽與第三多肽形成對，第二多肽與第四多肽形成對的雙特異性抗體，由第一多肽為包含序列編號: 1、2、3(Q499的H鏈CDR)記載的H鏈CDR1、2、3的胺基酸序列的H鏈，第二多肽為包含序列編號: 4、5、6(J327的H鏈CDR)記載的H鏈CDR1、2、3的胺基酸序列的H鏈，第三多肽與第四多肽為包含序列編號: 7、8、9(L404的L鏈CDR)記載的L鏈CDR1、2、3的胺基酸序列的共通L鏈所構成的雙特異性抗體。
  4. 如申請專利範圍第2項或第3項之醫藥組合物，其中，該雙特異性抗體為下述抗體： 為第一多肽與第三多肽形成對，第二多肽與第四多肽形成對的雙特異性抗體，由第一多肽為包含序列編號: 13記載的H鏈可變區域的胺基酸序列的H鏈，第二多肽為包含序列編號: 14記載的H鏈可變區域的胺基酸序列的H鏈，以及第三多肽與第四多肽為包含序列編號: 15記載的L鏈可變區域的胺基酸序列的共通L鏈所構成的雙特異性抗體。
  5. 如申請專利範圍第2至4項中任一項之醫藥組合物，其中，該雙特異性抗體為下述抗體： 為第一多肽與第三多肽形成對，第二多肽與第四多肽形成對的雙特異性抗體，由第一多肽為由序列編號: 10記載的胺基酸序列所構成的H鏈，第二多肽為由序列編號: 11記載的胺基酸序列所構成的H鏈，以及第三多肽與第四多肽為序列編號: 12記載的共通L鏈所構成的雙特異性抗體。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之醫藥組合物，其中，凝血因子IX異常症，係經由凝血因子IX和/或活性型凝血因子IX的活性降低、功能異常和/或缺損而發症及/或進展的疾病。
  7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項之醫藥組合物，其中，凝血因子IX異常症係先天性或後天性的疾病。
  8. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之醫藥組合物，其中，凝血因子IX異常症係血友病B或凝血因子IX缺乏症。
  9. 如申請專利範圍第1至8項中任一項之醫藥組合物，其用於與凝血因子IX製劑併用。
  10. 如申請專利範圍第1至8項中任一項之醫藥組合物，其用於增強凝血因子IX製劑的凝血活性。
  11. 一種併用醫藥，其係替代凝血因子VIII功能的多特異性抗原結合分子與凝血因子IX製劑組合而成，使用於凝血因子IX異常症的預防和/或治療。
  12. 一種方法，係使用替代凝血因子VIII功能的多特異性抗原結合分子來增強於凝血因子IX異常症患者中凝血因子IX製劑的凝血活性。
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