JP6048972B2 - ヘテロ多量体タンパク質の産生 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年４月２３日に提出された「ヘテロ多量体タンパク質の産生」と題された米国仮特許出願番号６１／３２７３０２に優先権を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、ヘテロ多量体タンパク質を産生するための方法に関する。

ＩｇＧタイプのモノクローナル抗体は、２つの同一の抗原結合アーム及び定常ドメイン（Ｆｃ）を含む。それらの結合アームの中で異なった特異性を有する抗体は、通常、自然界では発生せず、従って、化学工学の助け（例えば、化学的架橋など）、組換えＤＮＡ及び／又は細胞融合技術で作られなければならない。

二重特異性抗体は、同時に２つの異なる抗原に結合することができる。この特性は、従来のモノクローナル抗体では不可能である治療戦略の開発を可能にする。開発された想像上の二重特異性抗体フォーマットの大型パネルは、これらの分子の強い関心を反映している。Berg J, Lotscher E, Steimer KS, et al., “Bispecific antibodies that mediate killing of cells infected with human immunodeficiency virus of any strain,” Proc Natl Acad Sci USA (1991) 88(11): 4723-4727及びFischer N and Leger O., “Biospecific Antibodies: Molecules That Enable Novel Therapeutic Strategies,” Pathobiology (2007) 74:3-14を参照。

多選択性分子の別のクラスは、組換え融合タンパク質である。免疫調節タンパク質の細胞外ドメイン及び免疫グロブリン（Ｉｇ）の定常（Ｆｃ）ドメインからなる組換え融合タンパク質は、急成長しているクラスのヒトの治療法を表す。イムノアドヘシンは、タンパク質配列の結合領域と抗体のエフェクタードメインとを、所望の特異性で、組み合わせる。イムノアドヘシンは、治療薬としての可能性に対して意義のある２つの重要な特性、標的特異性、及び薬物動態学的安定性（抗体のそれに匹敵するインビボでの半減期）を有する。イムノアドヘシンは有害な相互作用を阻害するか、又はブロックするアンタゴニストとして、又は生理学的反応を模倣したり、強化するためにアゴニストとして使用することができる。Chamow SM, Zhang DZ, Tan XY, et al., “A humanized, bispecific immunoadhesin-antibody that retargets CD3+ effectors to kill HIV-1-infected cells,” J Hematother 1995; 4(5): 439-446を参照。

他の多選択性分子は他の場所で議論されてきた。例としては、限定されないが、Fisher et al., Pathobiology (2007) 74:3-14 (様々な二重特異性抗体の総説); Ｆｅｉｇｅらに２００３年１２月９日に発行された米国特許第６６６０８４３号（ペプチボディ）；米国特許出願公開第２００２−００４５８７号、２００２年１月１０日に公開（多選択性抗体）；Ｗｕらに２００９年１１月３日に発行された、米国特許第７６１２１８１号（二重可変ドメインフォーマット）；米国特許第６５３４６２８号, Nord K et al., Prot Eng (1995) 8:601-608, Nord K et al., Nat Biotech (1997) 15:772-777、及びGroenwall et al., Biotechnol Appl Biochem. (2008) Jun;50(Pt 2):97-112 (（アフィボディ）（Affibodies); Martens et al., Clin Cancer Res (2006), 12: 6144-6152 及びJin et al., Cancer Res (2008) 68(11):4360-4368 （ワンアームド抗体）(one armed antibodies); Bostrom et al., Science (2009) 323:1610-1614 (二重作用Ｆａｂ、別名混合原子価抗体)を含む。他のフォーマットは、当業者に知られている。

臨床グレードの材料の製造は、上記多選択性分子において挑戦的である。上で述べたように、混合結合アーム、即ち互いに同一ではない結合アームを有する分子の製造には多くの道筋がある。これらの各方法は、その欠点を有している。

化学的架橋は、関連する種を更にホモ二量及び他の望ましくない副産物から精製する必要があるかもしれないので大きな労力を要する。更に、化学修飾の工程は、タンパク質の完全性を変えることができ、よって安定性の劣化につながる。従って、この方法は多くの場合、非効率的であり、抗体活性の損失につながり得る。

細胞融合技術（例えば、ハイブリッドハイブリドーマ）で、ランダムに会合する２本の重鎖と２本の軽鎖を発現し、１０の抗体の組み合わせの生成へと導く。所望のヘテロ多量体抗体は、このように産生された抗体のほんの一部である。所望のヘテロ多量体タンパク質の精製は、劇的に生産収率を減らし、製造コストを増大させる。

組換えＤＮＡ技術は、様々なヘテロ多量フォーマット、例えばＦｃドメインを含んでいない単鎖、ダイアボディなどを生成するために使用されてきた。このタイプの抗体分子の主な欠点は、Ｆｃドメインの欠如、従って、エフェクター機能をトリガする抗体の能力（例えば、活性化、Ｆｃ受容体の結合等の補完）の欠如である。従って、機能性Ｆｃドメインを含む二重特異性抗体が望まれている。

組換えＤＮＡ技術はまた「ｋｎｏｂ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅ」二重特異性抗体を生成するために使用されている。米国特許出願公開第２００３００７８３８５号 (Arathoon et al. - Genentech)を参照。この戦略の１つの制約は、２つの親抗体の軽鎖は、同じ細胞で発現されているため、望まれない及び／又は不活性な分子の誤対合及び形成を防ぐために同一でなければならないということである。

従って、ヘテロ多量体タンパク質を生産する別の方法が必要とされている。本明細書に記載の本発明は、このような方法を提供する。本発明のこれら及び他の態様及び利点は、本明細書で提供される本発明の説明から明らかになるであろう。

最新技術を用いたヘテロ多量体タンパク質、例えば、多選択性抗体の産生は、とりわけ、生成物の混合物の生産、収量の減少、及びエフェクター機能の減少／除去を含む、欠点を有する。従って、ヘテロ多量体タンパク質を効率的かつ高レベルでを生成することが望まれる。

抗体分子の産生は、様々な手段によって、一般的によく理解されている。米国特許第６３３１４１５号 (Cabilly et al.)は、例えば、免疫グロブリンの組換え産生の方法を記述しており、そこでは、単一細胞において、重鎖と軽鎖が一本鎖ベクターから、又は２つの別個のベクターから同時に発現される。Wibbenmeyer et al., (1999, Biochim Biophys Acta 1430(2): 191 -202) and Lee and Kwak (2003, J. Biotechnology 101 :189-198) は、大腸菌の別個の培養で発現させたプラスミドを使用して、別々に発現させた重鎖と軽鎖からモノクローナル抗体の産生を説明している。抗体の産生に関連する様々な他の技術が、例えば、Harlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988) 及び国際公開第２００６０２８９３６号に記載されている。しかしこれらの各々は低収量や化学物質の使用などの欠点を持っている。

本発明の方法は、別個の宿主細胞におけるヒンジ含有ヘテロ多量体タンパク質の各成分、例えば、抗体の片腕の発現、及び還元剤を添加せずに、ヒンジ含有ヘテロ多量体タンパク質の会合体、例えば多選択性抗体を提供する。

本発明は、ヘテロ多量体タンパク質、例えば、多選択性抗体の経済的な生産を可能にする簡単で効率的な生産工程/方法を提供する。

本発明は、多選択性免疫複合体（例えば、多選択性抗体）、及び他の多量体タンパク質（まとめるとヘテロ多量体タンパク質と称す）の産生の効率的かつ新規な方法を提供する。二重特異性抗体のようなヘテロ多量体タンパク質は、本発明の方法に従って、非常に均質なヘテロ多量体ポリペプチドとして提供することができる。加えて、本明細書で提供される方法は、還元剤を添加することに依存しないで、ヘテロ多量体タンパク質で、少なくとも一、少なくとも二、少なくとも三、少なくとも四本の鎖間ジスルフィド結合の形成を達成する。

第一の態様において、本明細書に記載の方法は、第一のヘテロ二量体化ドメインを有する第一のヒンジ含有ポリペプチド、及び第二のヘテロ二量体化ドメインを有する第二のヒンジ含有ポリペプチドを含むヘテロ多量体タンパク質の調製を可能にし、ここで第二のヘテロ二量体化ドメインが第一のヘテロ二量体化ドメインと相互作用し、第一及び第二のヒンジ含有ポリペプチドが少なくとも一の鎖間ジスルフィド結合により連結されており、該方法は、
（ａ）ヒンジ含有ポリペプチドが発現される条件下で第一のヒンジ含有ポリペプチドをコードする第一の核酸を含む第一の宿主細胞を培養し；
（ｂ）ヒンジ含有ポリペプチドが発現される条件下で第二のヒンジ含有ポリペプチドをコードする核酸を含む第二の宿主細胞を培養し；
（ｃ）第一のヒンジ含有ポリペプチド及び第二のヒンジ含有ポリペプチドが細胞外環境に放出されるように、細胞膜を破壊し、ここで第一の宿主細胞及び第二の宿主細胞が単一の懸濁液中で一緒に組合わされ；
（ｄ）ヘテロ多量体タンパク質を回収する
工程を含み、
ここで、前記方法は還元剤の添加を必要としない。

第二の態様において、第一のヘテロ二量体化ドメインを有する第一のヒンジ含有ポリペプチド、及び第二のヘテロ二量体化ドメインを有する第二のヒンジ含有ポリペプチドを含むヘテロ多量体タンパク質を含むヘテロ多量体タンパク質を調製する方法であって、ここで第二のヘテロ二量体化ドメインが第一のヘテロ二量体化ドメインと相互作用し、第一及び第二のヒンジ含有ポリペプチドが少なくとも一の鎖間ジスルフィド結合により連結されており、該方法は、
（ａ）第一のヘテロ二量体化ドメインを有する精製された第一のヒンジ含有ポリペプチドを提供し；
（ｂ）第二のヘテロ二量体化ドメインを有する精製された第二のヒンジ含有ポリペプチドを提供し；
（ｃ）第一のヒンジ含有ポリペプチドと第二のヒンジ含有ポリペプチドを組合わせ、
（ｄ）第一のヒンジ含有ポリペプチドを第二のヒンジ含有ポリペプチドとともにリフォールディングし、
（ｄ）ヘテロ多量体タンパク質複合体を回収する
工程を含む。

第三の態様において、本明細書に与えられた方法は、免疫グロブリンの重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの第一の対、及び免疫グロブリンの重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの第二の対を、実質的に均一な抗体の集団を形成するために第一のポリペプチドの対及び第二のポリペプチドの対の多量体化を可能にする条件下で、インキュベートすることを含む、ヘテロ多量体タンパク質を調製する方法を対象にしており、ここで前記条件は還元剤の添加を含まず、第一のポリペプチドの対が、第一の標的に結合することができ、第二のポリペプチドの対が、第二の標的分子に結合することができ、及び第一の重鎖ポリペプチドのＦｃポリペプチドと第二の重鎖ポリペプチドのＦｃポリペプチドが界面で接触し、及び第二のＦｃポリペプチドの界面が、第一のＦｃポリペプチドの界面における空洞内に配置可能である突起を有している。

第四の態様において、ヘテロ多量体タンパク質のコンビナトリアルライブラリーを生成する方法があり、前記方法は第一のヘテロ二量体化ドメインを有する第一のヒンジ含有ポリペプチド、及び第二のヘテロ二量体化ドメインを有する第二のヒンジ含有ポリペプチドを含み、ここで第二のヘテロ二量体化ドメインが第一のヘテロ二量体化ドメインと相互作用し、第一及び第二のヒンジ含有ポリペプチドが少なくとも一の鎖間ジスルフィド結合により連結されており、該方法は、
（ａ）第一の宿主細胞と、少なくとも２つの更なる宿主細胞を培養し、
ａ． 第一の宿主細胞は、第一のヘテロ二量体化ドメイン含有ポリペプチドをコードする第一の核酸を含み；及び
ｂ． 前記更なる宿主細胞は、第二のヘテロ二量体化ドメイン含有ポリペプチドをコードする核酸を含み、
（ｂ）第一の宿主細胞及び少なくとも２つの更なる宿主細胞を組合わせ；
（ｃ）第一及び第二のヘテロ二量体ドメイン含有ポリペプチドが細胞外環境に放出されるように細胞を処置し、
（ｄ）ヘテロ多量体タンパク質を回収する
工程を含み、
ここで、前記方法は還元剤の添加を必要としない。

第五の態様において、本明細書に記載の方法により産生されたヘテロ多量体タンパク質が提供される。

本発明の方法は、一般的に、本明細書に記載の本発明の方法に包含されたプロセスを開始及び／又は完了するための明白なルーチン的工程である他の工程を含むことができることを理解すべきである。例えば、一実施態様において、本発明の方法の工程（ａ）は、第一のヒンジ含有ポリペプチドをコードする核酸が第一の宿主細胞に導入され、第二のヒンジ含有ポリペプチドをコードする核酸が第二の宿主細胞に導入される工程で始まる。一実施態様において、本発明の方法は、少なくとも２つの異なる標的への結合特異性を有するヘテロ多量体タンパク質を精製する工程を含む。一実施態様において、ヘテロ多量体タンパク質を精製する工程の前に、わずか１０％、１５％、又は２０％の単離されたポリペプチドがモノマー又は重鎖−軽鎖のダイマーとして存在する。

一実施態様において、第一及び／又は第二のヒンジ含有ポリペプチドは、抗体の重鎖である。更なる実施態様において、抗体の重鎖は抗体軽鎖と対になり、重鎖−軽鎖の対を提供する。幾つかの実施態様において、重鎖−軽鎖の対は共有結合で連結される。他の実施態様において、重鎖−軽鎖の対は標的結合アームを定める。幾つかの実施態様において、標的結合アームは同一である。幾つかの実施態様において、標的結合アームの各々は２つの異なる標的を認識する。

幾つかの実施態様において、第一及び／又は第二のヒンジ含有ポリペプチドは、Ｆｃ領域を含む。その他の実施態様において、第一及び／又は第二のヒンジ含有ポリペプチドは、少なくとも一の定常重鎖ドメインを含む。その他の実施態様において、第一及び／又は第二のヒンジ含有ポリペプチドは、可変重鎖ドメインを含む。その他の実施態様において、第一及び／又は第二のヒンジ含有ポリペプチドは、レセプター結合ドメインを含む。幾つかの実施態様において、第一及び／又は第二のヒンジ含有ポリペプチドは実質的に同一である（すなわち、ヘテロ二量体化ドメインは、同一であるヘテロ二量体化ドメインの外部領域と同一ではない可能性がある）。幾つかの実施態様において、第一及び／又は第二のヒンジ含有ポリペプチドは同一ではない。

幾つかの実施態様において、ヘテロ多量体タンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多選択性抗体（多重特異性抗体）、ワンアームド抗体、単一特異性一価抗体、多選択性一価抗体（多重特異性一価抗体）、二重特異性マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｙ）、モノボディ（ｍｏｎｏｂｏｄｙ）、イムノアドヘシン、ペプチボディ、二重特異性ペプチボディ、一価ペプチボディ、アフィボディ及びレセプター融合タンパク質からなる群から選択される。

幾つかの実施態様において、前記ヘテロ多量体タンパク質は、通常は重鎖間のジスルフィド結合を形成することが可能である、少なくとも一、少なくとも二、少なくとも三、少なくとも四、又は全ての任意の整数のシステイン残基を有するヒンジ領域を含む。幾つかの実施態様において、付加的なシステインが、ヒンジ領域に導入されている。

本発明のヘテロ多量体タンパク質はまた、免疫グロブリンのヒンジ領域を含むかぎり、例えば、Ｆｃ又はＦｃ融合ポリペプチドなどの抗体断片であってもよい。Ｆｃ融合ポリペプチドは、一般的に、異種ポリペプチド配列（例えば、抗原結合ドメインなど）に融合されたＦｃポリペプチド（又はその断片）、例えば、免疫グロブリンＦｃポリペプチドに融合されたレセプター細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（例えば、ＩｇＧ２のＦｃへ融合したＦＬＴレセプターＥＣＤ）などで構成されている。例えば、一実施態様において、Ｆｃ融合ポリペプチドは、ｆｌｔ，ｆｌｋなどを含むＶＥＧＦ結合ドメイン（ＶＥＧＦレセプターであり得る）を含む。本発明のヘテロ多量体タンパク質は一般的に重鎖定常ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む。一実施態様において、本発明のヘテロ多量体タンパク質は、重鎖間二量体化又は多量体化の形成のために、修飾（例えば、限定されないが、例えば、ロイシンジッパーなど２量体化配列を形成するための一以上のアミノ酸の挿入）を含む。幾つかの実施態様において、Ｆｃポリペプチドの一部（全てではない）は、それが免疫グロブリンのヒンジ領域を保持している限り、本発明のヘテロ多量体に欠損している。これらの実施態様の幾つかにおいて、Ｆｃポリペプチドの欠損配列は、Ｃ_Ｈ２及び／又はＣ_Ｈ３ドメインの一部又は全てである。これらの実施態様の幾つかにおいて、ヘテロ多量体タンパク質は、例えば重鎖断片のＣ末端に融合した二量化化ドメイン（例えば、ロイシンジッパー配列など）を含む。これらの実施態様の幾つかにおいて、ヘテロ多量体タンパク質は「ｋｎｏｂ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅ」２量体化ドメイン（以下で更に定義されるように）を提供するため、変異を含む二量体化ドメインを含む。

本発明の方法及びヘテロ多量体タンパク質の幾つかの実施態様において、ヒンジ含有ポリペプチドは、第一及び第二のヒンジ含有ポリペプチドの（例えば重鎖のＦｃポリペプチド間の）ヘテロ二量体化を促進する一方、ホモ二量体化を最小にする少なくとも一の特徴を含む。このような特性（ｓ）は、本明細書に記載の本発明の方法によって得られるヘテロ多量体タンパク質集団の収率及び／又は純度及び／又は均質性を向上させる。一実施態様において、第一のヒンジ含有ポリペプチド及び第二のヒンジ含有ポリペプチドのＦｃポリペプチドが界面で接触／相互作用する。第一及び第二のヒンジ含有ポリペプチドのＦｃポリペプチドが界面で接触する幾つかの実施態様において、第二のＦｃポリペプチドの界面は、第一のＦｃポリペプチドの界面における空洞内に配置可能である突起を有している。一実施態様において、第一のＦｃポリペプチドは、空洞をエンコードするテンプレート／元のポリペプチドから変更されているか、又は第二のＦｃポリペプチドは、突起をエンコードするテンプレート／元のポリペプチドから変更されているか、又はその両方である。一実施態様において、第一のＦｃポリペプチドは、空洞をエンコードするテンプレート／元のポリペプチドから変更されており、かつ第二のＦｃポリペプチドは、突起をエンコードするテンプレート／元のポリペプチドから変更されているか、又はその両方である。一実施態様において、第二のＦｃ融合ポリペプチドの界面は、第一のＦｃポリペプチドの界面にある空洞内に配置可能である突起を含み、ここで空洞又は突起又はその両方がそれぞれ、第一及び第二のＦｃポリペプチドの界面中に導入されている。第一及び第二のＦｃポリペプチドが界面で接触する幾つかの実施態様において、第一のＦｃポリペプチドの界面は、第二のＦｃポリペプチドの界面における空洞内に配置可能である突起を含む。一実施態様において、第二のＦｃポリペプチドは、空洞をエンコードするテンプレート／元のポリペプチドから変更されているか、又は第一のＦｃポリペプチドは、突起をエンコードするテンプレート／元のポリペプチドから変更されているか、又はその両方である。一実施態様において、第二のＦｃポリペプチドは、空洞をエンコードするテンプレート／元のポリペプチドから変更されており、かつ第一のＦｃポリペプチドは、突起をエンコードするテンプレート／元のポリペプチドから変更されているか、又はその両方である。一実施態様において、第一のＦｃ融合ポリペプチドの界面は、第二のＦｃポリペプチドの界面にある空洞に配置可能である突起を含み、ここで突起又は空洞又はその両方がそれぞれ、第一及び第二のＦｃポリペプチドの界面中に導入されている。

一実施態様において、突起及び空洞がそれぞれ、天然に存在するアミノ酸残基を含む。一実施態様において、突起を含んでなるＦｃポリペプチドは、テンプレート／元のポリペプチドの界面からの元の残基を、元の残基より大きい側鎖容積を有する移入残基と置換することによって生成される。一実施態様において、突起を含んでなるＦｃポリペプチドは、前記ポリペプチドの界面からの元の残基をコード化する核酸が、元の残基より大きい側鎖容積を有する移入残基をコード化する核酸と置換される工程を含む方法により生成される。一実施態様において、元の残基はスレオニンである。一実施態様において、移入残基はアルギニン（Ｒ）である。一実施態様において、移入残基はフェニルアラニン（Ｆ）である。一実施態様において、移入残基はチロシン（Ｙ）である。一実施態様において、移入残基はトリプトファン（Ｗ）である。一実施態様において、移入残基はＲ，Ｆ，Ｙ又はＷである。一実施態様において、突起はテンプレート／元のポリペプチド中の二以上の残基を置換することにより生成される。一実施態様において、突起を含むＦｃポリペプチドは、位置３６６のスレオニンのトリプロファンによる置換を含む（アミノ酸の番号付けはＫａｂａｔらによるＥＵ番号付け方式による（頁６８８−６９６、in Sequences of proteins of immunological interest, 5th ed., Vol. 1 (1991; NIH, Bethesda, MD））。

幾つかの実施態様において、空洞を含んでなるＦｃポリペプチドは、テンプレート／元のポリペプチドの界面にある元の残基を、元の残基より小さい側鎖容積を有する移入残基と置換することによって生成される。例えば、空洞を含んでなるＦｃポリペプチドは、前記ポリペプチドの界面からの元の残基をコード化する核酸が、元の残基より小さい側鎖容積を有するインポート残基をコード化する核酸と置換される工程を含む方法により生成される。一実施態様において、元の残基はスレオニンである。一実施態様において、元の残基はロイシンである。一実施態様において、元の残基はチロシンである。一実施態様において、移入残基はシステイン（Ｃ）ではない。一実施態様において、移入残基はアラニン（Ａ）である。一実施態様において、移入残基はセリン（Ｓ）である。一実施態様において、移入残基はスレオニン（Ｔ）である。一実施態様において、移入残基はバリン（Ｖ）である。空洞は、テンプレート／元のポリペプチドの一以上の元の残基を置換することによって生成することができる。例えば、一実施態様において、空洞を含むＦｃポリペプチドは、スレオニン、ロイシン及びチロシンからなる群から選択される二以上の元のアミノ酸の置換を含む。一実施態様において、空洞を含むＦｃポリペプチドは、アラニン、セリン、スレオニン及びバリンからなる群から選択される二以上の移入残基を含む。幾つかの実施態様において、空洞を含むＦｃポリペプチドは、スレオニン、ロイシン及びチロシンからなる群から選択される二以上の元のアミノ酸の置換を含み、ここで、前記元のアミノ酸が、アラニン、セリン、スレオニン及びバリンからなる群から選択される移入残基で置換されている。一実施態様において、空洞を含むＦｃポリペプチドは、位置３６６のスレオニンのセリンによる置換を含む（アミノ酸の番号付けは上掲のＫａｂａｔらによるＥＵ番号付け方式による）。一実施態様において、空洞を含むＦｃポリペプチドは、位置３６８のスロイシンのアラニンによる置換を含む（アミノ酸の番号付けは上掲のＫａｂａｔらによるＥＵ番号付け方式による）。一実施態様において、空洞を含むＦｃポリペプチドは、位置４０７のチロシンのバリンによる置換を含む（アミノ酸の番号付けは上掲のＫａｂａｔらによるＥＵ番号付け方式による）。一実施態様において、空洞を含むＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖからなる群から選択される二以上のアミノ酸置換を含む（アミノ酸の番号付けは上掲のＫａｂａｔらによるＥＵ番号付け方式による）。これらの抗体断片の一実施態様において、突起を含むＦｃポリペプチドは、位置３６６のスレオニンのトリプトファンによる置換を含む（アミノ酸の番号付けは上掲のＫａｂａｔらによるＥＵ番号付け方式による）。

様々な実施態様において、第一の重鎖ポリペプチド及び第二の重鎖ポリペプチドのＦｃポリペプチドは、それらがＦｃ領域を形成するために二量体化することができるという条件であれば、同一であってもなくても良い。第一のポリペプチドは一般に、一本鎖の免疫グロブリン重鎖の一以上のドメインに対して、例えば、ヒンジ配列、定常ドメイン配列及び／又は可変ドメイン配列により、連続して連結されている。一実施態様において、第一のＦｃポリペプチドは、ヒンジ配列の（全てを含む）少なくとも一部、Ｃ_Ｈ２ドメインの（全てを含む）少なくとも一部、及び／又はＣ_Ｈ３ドメインの（全てを含む）少なくとも一部を含む。一実施態様において、第一のＦｃポリペプチドは、ヒンジ配列、及び免疫グロブリンのＣ_Ｈ２ドメイン及びＣ_Ｈ３ドメインを含む。一実施態様において、第二のＦｃポリペプチドは、ヒンジ配列の（全てを含む）少なくとも一部、Ｃ_Ｈ２ドメインの（全てを含む）少なくとも一部、及び／又はＣ_Ｈ３ドメインの（全てを含む）少なくとも一部を含む。一実施態様において、第二のＦｃポリペプチドは、ヒンジ配列、及び免疫グロブリンのＣ_Ｈ２ドメイン及びＣ_Ｈ３ドメインを含む。一実施態様において、本発明の抗体は、第一のＦｃポリペプチド及び第二のＦｃポリペプチドを含み、その各々は少なくとも一の抗体の定常ドメインの少なくとも一部分を含む。一実施態様において、抗体定常ドメインはＣ_Ｈ２及び／又はＣ_Ｈ３ドメインである。定常ドメインを含む本発明の抗体の何れかの実施態様において、抗体定常ドメインは、任意の免疫グロブリンクラス、例えばＩｇＧ、由来であり得る。免疫グロブリンの起源は任意の適切な元の種であり得るか（例えば、ＩｇＧはヒトＩｇＧ_１であり得る）、合成型であり得る。

一実施態様において、本発明の抗体の、第一及び第二の標的分子結合アームにおける、第一の軽鎖ポリペプチド及び第二の軽鎖ポリペプチドは、それぞれ、別々の／異なる抗原結合決定因子（例えば、別々の／異なる可変ドメイン配列）を含む。一実施態様において、本発明の抗体の、第一及び第二の標的分子結合アームにおける、第一の軽鎖ポリペプチド及び第二の軽鎖ポリペプチドは、それぞれ、同一の（即ち共通の）抗原結合決定因子、例えば、同一の可変ドメイン配列を含む。

本発明の方法は、高い均質性でヘテロ多量体分子を生成することができる。よって、本発明は、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のポリペプチドが、第一の重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの対、及び、第二の重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの対を含んでなる複合体で存在する。一実施態様において、本発明は、約６０％から９９％の間、７０％から９８％の間、７５％から９７％の間、８０％から９６％の間、８５％から９６％の間、又は９０％から９５％の間のポリペプチドが、第一の重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの対、及び、第二の重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの対を含んでなる複合体で存在する方法を提供する。

一実施態様において、本発明の抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＤからなる群から選択される。幾つかの実施態様において、本発明の抗体のヒンジ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤからなる群から選択される免疫グロブリンであることが好ましい。例えば、幾つかの実施態様において、抗体又は抗体のヒンジ領域はＩｇＧであって、それは幾つかの実施態様において、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２（例えばＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂ）である。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤからなる群から選択される。一実施態様において、抗体は、ヒト、ヒト化、キメラ又は非ヒト（例えば、マウス）の起源である。

本発明のヘテロ多量体タンパク質は、一般的に抗原に、好ましくは特異的に結合することが可能である。このような抗原は、例えば、腫瘍抗原、細胞生存調節因子、細胞増殖調節因子、組織発達又は分化に関連する（例えば、既知の、又は機能的に寄与することが疑われる）分子、細胞表面分子、リンホカイン、サイトカイン、細胞周期の調節に関与する分子、血管形成に関与する分子、及び分子血管新生に関連する（例えば、既知の、又は機能的に寄与することが疑われる）分子を含む。本発明のヘテロ多量体タンパク質が結合することができる抗原は、上記のカテゴリの一のサブセットのメンバーであり得、ここで、前記カテゴリの他のサブセット（複数）は、（目的の抗原に関して）異なる特徴を有する他の分子／抗原を含む。目的の抗原はまた、２つ以上のカテゴリに属しているとみなすことができる。一実施態様において、本発明は、細胞表面分子ではない腫瘍抗原に、好ましくは特異的に結合するヘテロ多量体タンパク質を提供する。一実施態様において、腫瘍抗原は、レセプターポリペプチドなどの細胞表面分子である。その他の実施態様で、幾つかの実施態様において、本発明のヘテロ多量体タンパク質は、クラスター分化因子ではない腫瘍抗原に、好ましくは特異的に結合する。その他の実施態様において、本発明のヘテロ多量体タンパク質は、幾つかの実施態様において例えばＣＤ３又はＣＤ４ではないクラスター分化因子に、好ましくは特異的に結合することができる。幾つかの実施態様において、本発明のヘテロ多量体タンパク質は、抗ＶＥＧＦ抗体である。幾つかの実施態様において、本発明のヘテロ多量体タンパク質は、ＩＬ−１アルファ／ＩＬ−１ベータ，ＩＬ−１２／ＩＬ−１８；ＩＬ−１３／ＩＬ−９；ＩＬ−１３／ＩＬ−４；ＩＬ−１３／ＩＬ−５；ＩＬ−５／ＩＬ−４；ＩＬ−１３／ＩＬ−ｌベータ；ＩＬ−１３／ＩＬ−２５；ＩＬ−１３／ＴＡＲＣ；ＩＬ−１３／ＭＤＣ；ＩＬ−１３／ＭＥＦ；ＩＬ−１３／ＴＧＦ−β；ＩＬ−１３／ＬＨＲアゴニスト；ＩＬ−１２／ＴＷＥＡＫ，ＩＬ−１３／ＣＬ２５；ＩＬ−１３／ＳＰＲＲ２ａ；ＩＬ−１３／ＳＰＲＲ２ｂ；ＩＬ−１３／ＡＤＡＭ８，ＩＬ−１３／ＰＥＤ２，ＩＬ１７Ａ／ＩＬ１７Ｆ，ＣＤ３／ＣＤ１９，ＣＤ１３８／ＣＤ２０；ＣＤ１３８／ＣＤ４０；ＣＤ１９／ＣＤ２０；ＣＤ２０／ＣＤ３；ＣＤ３８／ＣＤ１３８；ＣＤ３８／ＣＤ２０；ＣＤ３８／ＣＤ４０；ＣＤ４０／ＣＤ２０；ＣＤ−８／ＩＬ−６；ＣＤ２０／ＢＲ３，ＴＮＦアルファ／ＴＧＦ−ベータ，ＴＮＦアルファ／ＩＬ−１ベータ；ＴＮＦアルファ／ＩＬ−２，ＴＮＦアルファ／ＩＬ−３，ＴＮＦアルファ／ＩＬ−４，ＴＮＦアルファ／ＩＬ−５，ＴＮＦアルファ／ＩＬ６，ＴＮＦアルファ／ＩＬ８，ＴＮＦアルファ／ＩＬ−９，ＴＮＦアルファ／ＩＬ−１０，ＴＮＦアルファ／ＩＬ−１１，ＴＮＦアルファ／ＩＬ−１２，ＴＮＦアルファ／ＩＬ−１３，ＴＮＦアルファ／ＩＬ−１４，ＴＮＦアルファ／ＩＬ−１５，ＴＮＦアルファ／ＩＬ−１６，ＴＮＦアルファ／ＩＬ−１７，ＴＮＦアルファ／ＩＬ−１８，ＴＮＦアルファ／ＩＬ−１９，ＴＮＦアルファ／ＩＬ−２０，ＴＮＦアルファ／ＩＬ−２３，ＴＮＦアルファ／ＩＦＮアルファ，ＴＮＦアルファ／ＣＤ４，ＴＮＦアルファ／ＶＥＧＦ，ＴＮＦアルファ／ＭＩＦ，ＴＮＦアルファ／ＩＣＡＭ−１，ＴＮＦアルファ／ＰＧＥ４，ＴＮＦアルファ／ＰＥＧ２，ＴＮＦアルファ／ＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦアルファ／Ｔｅ３８；ＴＮＦアルファ／ＢＡＦＦ；ＴＮＦアルファ／ＣＤ２２；ＴＮＦアルファ／ＣＴＬＡ−４；ＴＮＦアルファ／ＧＰ１３０；ＴＮＦα／ＩＬ−１２ｐ４０；ＶＥＧＦ／ＨＥＲ２，ＶＥＧＦ−Ａ／ＨＥＲ２，ＶＥＧＦ−Ａ／ＰＤＧＦ，ＨＥＲ１／ＨＥＲ２，ＶＥＧＦ−Ａ／ＶＥＧＦ−Ｃ，ＶＥＧＦ−Ｃ／ＶＥＧＦ−Ｄ，ＨＥＲ２／ＤＲ５，ＶＥＧＦ／ＩＬ−８，ＶＥＧＦ／ＭＥＴ，ＶＥＧＦＲ／ＭＥＴ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＶＥＧＦＲ／ＥＧＦＲ，ＨＥＲ２／ＣＤ６４，ＨＥＲ２／ＣＤ３，ＨＥＲ２／ＣＤ１６，ＨＥＲ２／ＨＥＲ３；ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２，ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３，ＥＧＦＲ／ＨＥＲ４，ＩＬ−１３／ＣＤ４０Ｌ，ＩＬ４／ＣＤ４０Ｌ，ＴＮＦＲ１／ＩＬ−１Ｒ，ＴＮＦＲ１／ＩＬ−６Ｒ，ＴＮＦＲ１／ＩＬ−１８Ｒ，ＥｐＣＡＭ／ＣＤ３，ＭＡＰＧ／ＣＤ２８，ＥＧＦＲ／ＣＤ６４，ＣＳＰＧｓ／ＲＧＭ Ａ；ＣＴＬＡ−４／ＢＴＮＯ２；ＩＧＦ１／ＩＧＦ２；ＩＧＦ１／２／Ｅｒｂ２Ｂ；ＭＡＧ／ＲＧＭ Ａ；ＮｇＲ／ＲＧＭ Ａ；ＮｏｇｏＡ／ＲＧＭ Ａ；ＯＭＧｐ／ＲＧＭ Ａ；ＰＤＬ−Ｉ／ＣＴＬＡ−４；及びＲＧＭ Ａ／ＲＧＭ Ｂ，ＩＬ１β／ＩＬ１８，ＮＲＰ１／ＶＥＧＦＡ，ＶＥＧＦＡ／ＮＲＰ２，ｃＭＥＴ／ＥＧＦＲ，ＡＬＫ１／ＢＭＰ９，ＶＥＧＦＡ／α５β１，ＨＥＲ１／ＨＥＲ３−ＢＵ、及びＣＭＶから選択される二重特異性抗体である。幾つかの実施態様において、本発明のヘテロ多量体タンパク質は、α５β１，ＡＬＫ１，ＢＭＰ９，ＩＬ−１アルファ，ＩＬ−１ベータ，ＴＡＲＣ，ＭＤＣ，ＭＥＦ，ＴＧＦ−β，ＬＨＲアゴニスト，ＴＷＥＡＫ，ＣＬ２５，ＳＰＲＲ２ａ，ＳＰＲＲ２ｂ，ＡＤＡＭ８，ＰＥＤ２，ＣＤ３，ＣＤ４，ＣＤ１６，ＣＤ１９，ＣＤ２０，ＣＤ２２，ＣＤ２８，ＣＤ４０，ＣＤ３８，ＣＤ６４，ＣＤ１３８，ＣＤ−８，ＢＲ３，ＴＮＦアルファ，ＴＧＦ−ベータ，ＩＬ−２，ＩＬ−３，ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−８，ＩＬ−９，ＩＬ−１０，ＩＬ−１１，ＩＬ−１２，ＩＬ−１３，ＩＬ−１４，ＩＬ−１５，ＩＬ−１６，ＩＬ−１７，ＩＬ−１７Ａ，ＩＬ−１７Ｆ，ＩＬ−１８，ＩＬ−１９，ＩＬ−２０，ＩＬ−２３，ＩＬ−２５，ＩＦＮアルファ，ＭＩＦ，ＩＣＡＭ−１，ＰＧＥ４，ＰＥＧ２，ＲＡＮＫリガンド，Ｔｅ３８，ＢＡＦＦ，ＣＴＬＡ−４，ＧＰ１３０，ＩＬ−１２ｐ４０，ＶＥＧＦ，ＶＥＧＦ−Ａ，ＰＤＧＦ，ＨＥＲ１，ＨＥＲ２，ＨＥＲ３，ＨＥＲ３−ＢＵ，ＨＥＲ４，ＶＥＧＦ−Ｃ，ＶＥＧＦ−Ｄ，ＤＲ５，ｃＭＥＴ，ＭＥＴ，ＭＥＴレセプター，ＶＥＧＦＲ，ＥＧＦＲ，ＣＤ４０Ｌ，ＴＮＦＲ１，ＩＬ−１Ｒ，ＩＬ−６Ｒ，ＩＬ−１８Ｒ，ＥｐＣＡＭ，ＭＡＰＧ，ＣＳＰＧｓ，ＢＴＮＯ２，ＩＧＦ１，ＩＧＦ２，ＩＧＦ１／２，Ｅｒｂ２Ｂ，ＭＡＧ，ＮｇＲ，ＮｏｇｏＡ，ＮＲＰ１，ＮＲＰ２，ＯＭＧｐ，ＰＤＬ−Ｉ，ＲＧＭ Ａ及び ＲＧＭ Ｂからなる群から選択される少なくとも２つの標的分子に結合する。いくつかの実施態様では、本発明のヘテロ多量体タンパク質はＣＤ３及びＢＬＲ１，ＢＲ３，ＣＤ１９，ＣＤ２０，ＣＤ２２，ＣＤ７２，ＣＤ７９Ａ，ＣＤ７９Ｂ，ＣＤ１８０（ＲＰ１０５），ＣＲ２，ＦｃＲＨ１，ＦｃＲＨ２，ＦｃＲＨ５，ＦＣＥＲ２，ＦＣＲＬ４，ＨＬＡ−ＤＯＢ，及びＮＡＧ１４から選択される少なくとも１つの更なる標的分子に結合する。

本発明の方法における第一の宿主細胞及び第二の宿主細胞は、目的のポリペプチドの発現及び単離を可能にする任意の設定で培養することができる。例えば、一実施態様において、本発明の方法における第一の宿主細胞及び第二の宿主細胞は、別個の細胞培養として増殖される。その他の実施態様において、本発明の方法における第一の宿主細胞及び第二の宿主細胞は、両方の宿主細胞を含む混合培養として増殖される。

幾つかの実施態様において、少なくとも一、少なくとも二、少なくとも三又はそれ以上の更なるヒンジ含有ポリペプチド発現宿主細胞は、第一のヒンジ含有宿主細胞及び／又は第二のヒンジ含有宿主細胞と同じ培養か又は別個の培養の何れかにおいて増殖され得る。幾つかの実施態様において、更なるヒンジ含有ポリペプチド（複数）は、第一のヒンジ含有ポリペプチドと同じヘテロ二量体化ドメインを含む。幾つかの実施態様において、更なるヒンジ含有ポリペプチド（複数）は、第二のヒンジ含有ポリペプチドと同じヘテロ二量体化ドメインを含む。

ヘテロ多量体タンパク質は、更なる所望の特性を増強及び／又は追加するように修飾することができる。このような特性は、免疫エフェクター機能、望まれるインビボ半減期／クリアランス、生物学的利用能、生体内分布又は他の薬物動態特性などの生物学的機能が含まれている。そのような修飾は、当技術分野で周知であり、また経験的に決定することができ、かつ、ペプチドベースであってもなくてもよい部分による修飾を含み得る。例えば、抗体は、グリコシル化又は非グリコシル化されることがあり、一般的には宿主細胞の性質に少なくとも部分的に依存する。好ましくは、本発明の抗体は、グリコシル化されている。本発明の方法により製造されたグリコシル化抗体は、その後、例えば当技術分野で周知のインビトロでのグリコシル化の方法を使用して、グリコシル化することができる。上記及び本明細書に記載したように、本発明のヘテロ多量体タンパク質は、例えば、大腸菌などの原核細胞で産生することができる。大腸菌で生産されるヘテロ多量体タンパク質は一般に非グリコシル化されており、かつ、哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ）が生成したヘテロ多量体タンパク質に見出されるグリコシル化プロファイルに関連付けられている生物学的機能を通常欠いている。

また、本発明は、異種部分とコンジュゲートした本発明のヘテロ多量体タンパク質を含む免疫複合体を提供する。抗体に対するそのコンジュゲーションが抗体の所望の機能及び／又は特性を実質的に減少させない任意の異種部分が適している可能性がある。例えば、幾つかの実施態様において、免疫複合体が細胞傷害性薬物である異種部分を含む。幾つかの実施態様において、前記細胞傷害性薬物は、放射性同位元素、化学療法剤及び毒素からなる群から選択される。幾つかの実施態様において、前記毒素はカリチアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅｍｉｃｉｎ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）及びトリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｎｅ）からなる群から選択される。幾つかの実施態様において、免疫複合体が検出可能なマーカーである異種部分を含む。幾つかの実施態様において、前記検出可能なマーカーは、放射性同位体、リガンド−レセプターの対のメンバー、酵素−基質の対のメンバー及び蛍光共鳴エネルギー移動の対のメンバーからなる群から選択される。

一態様において、本発明は、本発明のヘテロ多量体タンパク質及びいくつかの実施態様で薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。

その他の態様において、本発明は、本発明に記載の免疫複合体及びいくつかの実施態様で薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。

一態様において、本発明は、本発明の多選択性ヘテロ多量体タンパク質の集団を含む組成物を提供する。当業者に明らかなように、一般的にそのような組成物は、完全に（すなわち、１００％）均一ではないであろう。しかし、本明細書に記載のように、本発明の方法は、多選択性ヘテロ多量体タンパク質の実質的に均一な集団を産生することができる。例えば、本発明は、ヘテロ多量体タンパク質を含む組成物を提供し、ここで少なくとも４０％，４５％，５０％，５５％，６０％，６５％，７０％，８０％，８５％，９０％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％の前記ヘテロ多量体タンパク質が、本明細書に記載の発明による多選択性抗体（例えば、二重特異性抗体など）である。

一態様において、本発明は、第一の宿主細胞及び第二の宿主細胞の混合物を含む細胞培養液を提供し、ここで、第一の宿主細胞は、第一のヒンジ含有ポリペプチドをコード化する核酸を含み、及び第二の宿主細胞は、第二のヒンジ含有ポリペプチドをコード化する核酸を含み、そして、その２つの対が異なる標的結合特異性を有する。一態様において、本発明は、第一の宿主細胞及び第二の宿主細胞の混合物を含む細胞培養液を提供し、ここで、第一の宿主細胞は、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの第一の対を発現し、及び第二の宿主細胞は、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの第二の対を発現し、そして、その２つの対が異なる標的結合特異性を有する。

その他の態様において、本発明は、容器及びそれに含まれる組成物を含む製造品を提供し、ここでその組成物は、本発明のヘテロ多量体タンパク質（例えば、抗体）を含む。その他の態様において、本発明は、容器及びそれに含まれる組成物を含む製造品を提供し、ここでその組成物は、本明細書に記載される免疫複合体を含む。幾つかの実施態様において、これらの製造品は前記組成物を使用するための説明書を更に含んでいる。

更に別の態様において、本発明は、本発明のヘテロ多量体タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。更に別の態様において、本発明は、本明細書に記載される免疫複合体をコードするポリヌクレオチドを提供する。

一態様において、本発明は、本発明の分子（例えば、抗体）を発現するための組換えベクターを提供する。その他の態様において、本発明は、本発明の免疫複合体を発現するための組換えベクターを提供する。

多くの宿主細胞のいずれも本発明の方法に使用することができる。このような細胞は、当該分野で公知であるか（その一部は本明細書に記載される）、又は当該分野で公知の通常の技術を用いて本発明の方法における使用のための適性に関して経験的に決定することができる。一実施態様において、宿主細胞は、原核生物である。幾つかの実施態様において、宿主細胞は、グラム陰性細菌の細胞である。一実施態様において、宿主細胞は、大腸菌である。一実施態様において、大腸菌は、リポ蛋白の欠損株（ΔｌＰＰ）である。幾つかの実施態様において、大腸菌宿主細胞の遺伝子型はｄｅｇＰ及びｐｒｃ遺伝子を欠いており、変異型のｓｐｒ遺伝子を有する。一実施態様において、宿主細胞は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞である。

一態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチド又は組換えベクターを含む宿主細胞を提供する。一実施態様において、宿主細胞は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞である。一実施態様において、宿主細胞は、原核生物である。幾つかの実施態様において、宿主細胞は、いくつかの実施態様では大腸菌であるグラム陰性細菌の細胞である。本発明の宿主細胞は、分子をコードするポリヌクレオチド又は組換えベクターを含むことができ、宿主細胞内でのその発現は、本発明の方法においてヘテロ多量体タンパク質の収率を向上させる。例えば、そのような分子は、シャペロンタンパク質であってよい。一実施態様において、前記分子は、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＣを、ＤｓｂＧ及びＦｋｐＡからなる群から選択される原核生物ポリペプチドである。幾つかの実施態様において、前記ポリヌクレオチド又は組換えベクターは、ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣを両方をコード化する。幾つかの実施態様において、大腸菌宿主細胞は、内因性のプロテアーゼ活性の欠損株である。幾つかの実施態様において、大腸菌宿主細胞の遺伝子型は、ｄｅｇＰ及びｐｒｃ遺伝子を欠いており、変異型のｓｐｒ遺伝子を有する大腸菌株のものである。幾つかの実施態様において、大腸菌宿主細胞の遺伝子型はΔｌｐｐである。

本発明のヘテロ多量体タンパク質は、様々な設定で、様々な用途を見いだす。一例において、本発明のヘテロ多量体タンパク質は、治療用抗体である。その他の例において、本発明のヘテロ多量体タンパク質は、アゴニスト抗体である。その他の例において、本発明のヘテロ多量体タンパク質は、拮抗性抗体である。本発明のヘテロ多量体タンパク質はまた、診断抗体でもあり得る。更にその他の例において、本発明のヘテロ多量体タンパク質は、遮断抗体である。その他の例において、本発明のヘテロ多量体タンパク質は、中和抗体である。

一態様において、本発明は、被験体における疾患を治療又は遅延させる方法を提供し、該方法は本発明のヘテロ多量体タンパク質を該被検体に投与することを含む。一実施態様において、疾患は癌である。その他の実施態様において、その疾患は、血管新生の調節不全に関連している。その他の実施態様において、疾患は、関節リウマチ、免疫性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデスなどの免疫疾患である。

一態様において、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性障害、免疫（自己免疫など）障害及び／又は血管新生関連疾患などの疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の製造における、本発明のヘテロ多量体タンパク質（例えば、抗体）の使用を提供する。

一態様において、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性障害、免疫（自己免疫など）障害及び／又は血管新生関連疾患などの疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の製造における、本発明の核酸の使用を提供する。

一態様において、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性障害、免疫（自己免疫など）障害及び／又は血管新生関連疾患などの疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の製造における、本発明の発現ベクターの使用を提供する。

一態様において、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性障害、免疫（自己免疫など）障害及び／又は血管新生関連疾患などの疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の製造における、本発明の宿主細胞の使用を提供する。

一態様において、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性障害、免疫（自己免疫など）障害及び／又は血管新生関連疾患などの疾患の治療的及び/又は予防的処置のための医薬の製造における、本発明の製造品の使用を提供する。

一態様において、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性障害、免疫（自己免疫など）障害及び／又は血管新生関連疾患などの疾患の治療的及び/又は予防的処置のための医薬の製造における、本発明のキット使用を提供する。

本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、詳細な説明及び具体的な実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、本発明の範囲と趣旨における様々な変更及び修正が、当業者に対して、この詳細な説明から明らかになるであろうゆえ、単に例として与えられることを理解されるべきである。

図１Ａは、完全に酸化された半抗体（ｈａｌｆ−ａｎｔｉｂｏｄｙ）を示している。「ノブ」又は「ホール」又は他のヘテロ二量体化ドメインは示されていない。この図に示されている半抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプである。当業者は、他の免疫グロブリンのアイソタイプは、対応する鎖間結合及び鎖内結合を有する半抗体として想定することができることを理解するであろう。インタクトな抗体（Ａｂ）において、ヒンジのシステインは、鎖間ジスルフィド結合を形成することになる。 図１Ｂは全長二重特異性抗体を示している。ヒンジ領域にある重鎖間ジスルフィド結合は示されていない。 図２Ａ＆Ｂは、ノブ（ｋｎｏｂ）半抗体及びホール（ｈｏｌｅ）半抗体をコードするプラスミドを示している。 図３Ａは、一般的な軽鎖法を用いる、ヘテロ多量体タンパク質、例えば、二重特異性抗体の産生を示している。産生されたＢｓＡｂは、各々が共通の軽鎖と対をなしている２つの異なる重鎖を有する。 図３Ａは、別々に操作されて発現された半抗体を用いる、ヘテロ多量体タンパク質、例えば、二重特異性抗体の産生を示している。産生されたＢｓＡｂは、各々が同族の軽鎖と対をなしている２つの異なる重鎖を有する。この方法では、各軽鎖は、各半抗体に対して同じである必要はない。 図４Ａは、別々に操作されて発現された半抗体を用いる、二重特異性抗体の産生についてのフロー図である。この方法では、酸化還元化学が用いられる。 図４Ｂは、クマシー染色したゲルを示す。この２つの半抗体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、還元条件および非還元条件下で分析した。主たる画分は、非還元条件下での各半抗体の７５ｋＤの軽鎖と重鎖の対である。還元条件下（例えば、ＤＴＴによる処置）では、各鎖は別々のバンドとして見える。 図４Ｃは、１ｍＭのＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）処置のある場合と無い場合での半抗体のＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析の結果を示す。ＮＥＭによる処置により半抗体の質量には変化が観察されず、このことは全てのシステインが完全に参加されていることを示している。酸化されたヒンジシステインは、表示アミノ酸配列において環状ジスルフィドとして表されている。半抗体の予想質量は７２５４８ダルトンであり、これは質量分析により観察されているものであって、全く共有結合付加物がないことを示している。 図４Ｄは、カルボキシメチル（ＣＭ）のクロマトグラム、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真、及び抗ＥＧＦＲ／抗−ｃ−ｍｅｔ二重特異性抗体の産生についてデコンボリューションされた質量を示す。ＣＭのクロマトグラフィーはその後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された単一のピークを生成する。ゲル上の主要なバンドは、全長（すなわち、インタクトな）二重特異性抗体である。マイナーなバンドも７５ｋＤの範囲で見ることができる。主要バンドはその後、質量分析により分析され、検出可能なインタクトな抗体製品のみが抗ＥＧＦＲ／抗ｃ−ｍｅｔ二重特異性抗体の理論的な分子量（ＭＷ）と一致したことが示された。 図５Ａは、別々に操作されて発現された半抗体を用いる、二重特異性抗体の大規模生産についてのフロー図である。 図５Ｂは、精製された半抗体は非還元条件下で主に約７５ｋＤの種であったことを示すゲルの写真である。還元条件下（例えば、ＤＴＴによる処置）では、各鎖は別々のバンドとして見える。 図５Ｃは、凝集体を除去した後の精製された二重特異性のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示し、主要な種は１５０ｋＤのインタクトな二重特異性抗体であることを示している。また示されるのは、還元条件下における同じサンプルであって、全ての単離された産物は抗体の軽鎖又は重鎖であることを示している。 図６Ａは、サイトカインＩＬ−４及びＩＬ−１３の中和を試験するＴＦ−２細胞増殖アッセイにおける抗体の生物学的活性を示すグラフである。グラフは、二重特異性は、一緒か又は別個に添加された、２つの哺乳類の生産した、完全長の抗体と、同様の活性を有していることを示している。 図６Ｂは、ＥＬＩＳＡによって測定された、野生型Ｆｃ及び変異型ＦＣについて、カニクイザルにおける抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３二重特異性抗体の薬物動態（ＰＫ）特性を示す３つのグラフのパネルである。第一のグラフは、野生型Ｆｃについて、２ｍｇ／ｋｇの用量でのＰＫ特性を示している。中央のグラフは、また野生型Ｆｃについて、２０ｍｇ／ｋｇの用量でのＰＫ特性を示している。最後のグラフは、変異型Ｆｃについて、２０ｍｇ／ｋｇの用量でのＰＫ特性を示している。二重特異性は、試験動物において予想される２つのコンパートメントクリアランスを示す。メスは破線で示され、オスは実線で示されている。３つの動物において、２１日目の血清で測定された抗体の急激な減少によって示されるように抗治療応答が見られた。 図7は、ポリアクリルアミドゲルの写真である。全発酵ブロスは、様々な比率で溶解前に混合した。溶解後、タンパク質は、非還元条件下でゲル上に抽出され、ロードされた。この手順の中で形成された精製二重特異性体はゲル上で一番上のバンドとして見ることができる。 図８Ａは、細胞が半抗体を発現する細胞の共培養に別々に培養した場合の、二重特異性抗体の産生を比較した２つのポリアクリルアミドゲルの写真である。インタクトな二重特異性体が、共培養条件下で非常に高いレベルで生じる。半抗体が発現され、別個に精製され、後に混合した場合、半抗体は、５％未満のインタクトな二重特異性体を形成する。共培養条件下では、Ｌｉ−Ｃｏｒｅタンパク質の定量を使用した１５０ｋＤ／（１５０ｋＤ＋７５ｋＤ）により決定されたので、４０％以上がインタクトな二重特異性体である。 図８Ｂは、初回接種の細胞集団を変化させる共培養実験の模式図である。用いた比率、及び完全長二重特異性体の相対的な量が、図の下部に示される。 図８Ｃは、抗ＥＧＦＲと抗ｃ−Ｍｅｔとの１：１の細胞比の３つの独立した１０リットルの発酵の実行についてのゲルの写真である．それぞれの実行は、主な生成物として、完全長二重特異性体を生成し、処置の再現性を示している。 図８Ｄは、ヘテロ多量体タンパク質、例えば、二重特異性抗体の産生のための共培養処置のフローチャートである。 図８Ｅは保持時間９１．７９と１０２．３５で２つの顕著なピークを同定した２８０ｎｍでのＵＶ吸光度のクロマトグラムである。質量分析法によるその後の分析は、インタクトな二重特異性抗体が効果的に過剰の半抗体から分離されることを示した。 図８Ｆは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分析による、図８Ｅのピーク９１．７９の分析を示す。質量分析データのデコンボリューションは、二重特異性抗体の予想される質量と一致している１４６，０５１．８９ダルトンで単一ピークを作り出した。混入するホモ二量体種は検出されなかった。 図８Ｇは、ヘテロ多量体タンパク質の独立した生産及び共培養生産についての作業の流れを比較したものである。 図９Ａは３つのクロマトグラムを示している。上のクロマトグラムは、ＥＤＴＡを含まないサンプルについてその溶出中に吸収ピークが無いことを示している。中央のクロマトグラムは、ＥＤＴＡを含むサンプルが、個別の溶出ピークを持つことを示しており、そこから我々は約１．５ｍｇのタンパク質を回収した。下のクロマトグラムは、ＥＤＴＡ及びＭｇで処置されたサンプルが、類似の溶出ピークを持つことを示しており、そこから我々は約１．１ｍｇのタンパク質を回収した。ＥＤＴＡのサンプルからの回収されたタンパク質、ＥＤＴＡプラスＭｇのサンプル、及び未処置のＥＤＴＡサンプルの同じ保持時間からの画分のプールが、還元下及び非還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。 図９Ｂは、図９Ａに記載されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。ＥＤＴＡで処置したサンプルは、培地中に放出されたインタクトな二重特異性抗体を生産している。 図９Ｃ−１、図９Ｃ−２、及び図９Ｃ−３は、図９Ａにおいて回収され、説明されたサンプルについての質量分析クロマトグラムを示している。ＥＤＴＡを有するサンプルは、二重特異性抗体の予想される質量及び過剰の半抗体についての質量を示した。 図９Ｄは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及び示されたバンドのマスクロマトグラムの写真である。レーンは分子量（ＭＷ）マーカー、レーン２は独立して発現された抗ＩＬ−１３、レーン３は独立して発現された抗ＩＬ−４、レーン４は、２つの細胞の共培養である。全ての３つのサンプルの質量スペクトル分析は、インタクトな二重特異性及び過剰の一半抗体、抗ＩＬ−４を生成することを示している。これは、抗ＩＬ−１３半抗体は化学量論的に制限されていることを示している。半抗体が発現され、別個に精製され、後に混合した場合、半抗体は、約２％（抗ＩＬ−１３）及び３％（抗ＩＬ４）のインタクトな二重特異性体を形成する。共培養条件下では、Ｌｉ−Ｃｏｒｅタンパク質の定量を使用した１５０ｋＤ／（１５０ｋＤ＋７５ｋＤ）により決定されたため、約６０％がインタクトな二重特異性体である。 図９Ｅ−１及び図９Ｅ−２は、指示された初回の発酵種菌において異なる細胞比率を有していた２つの共培養に対する２つのＨＩＣのクロマトグラムである。生成物における明らかな違いが、初回の接種物率を反映していることが観察される。このアプローチを使用すると、初回接種率をヘテロ多量体タンパク質の最適な生産を達成するために変更することができることが明らかとなる。 図９Ｆは、本明細書に記載の共培養法により産生された８つの異なる二重特異性抗体の還元条件及び非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す４つの写真のパネルである。抗ＣＤ３／抗ＣＤ１９ヘテロ多量体タンパク質についての非還元ゲルは示されていない。矢印はインタクトな二重特異性抗体を示す。 図１０は、ヘテロ多量体タンパク質をスクリーニングしたマトリックス・アプローチの概略図である。 図１１は、本明細書に記載の方法を用いて産生された二重特異性抗体のインビトロ活性についての２つのグラフを示す。 図１２は、抗ＥＧＦＲ／抗ｃ−ｍｅｔ二重特異性体が、インビボモデルにおいて、ＫＰ４膵臓異種移植片で抗腫瘍活性を有することを示すグラフである。 図１３は、抗ＥＧＦＲ／抗ｃ−ｍｅｔ二重特異性体が、インビボモデルにおいて、Ａ４３１類表皮癌異種移植片で抗腫瘍活性を有することを示すグラフである。 図１４は、Ａ）ノブプリアセンブリ、Ｂ）ホールプレアセンブリ、Ｃ）二重特異性ポストアセンブリのＨＩＣを示している。図１４Ｄは、各アームのプレアセンブリのゲルである。 図１５は、構築された材料の電気泳動図を示し、材料の８６％が完全に酸化されていることを示している。 構築された二重特異性体の特性評価 Ａ）アニールされた二重特異性体のＨＩＣのクロマトグラムは、材料が９０．５パーセントを超えて二重特異性であることを示す。Ｂ）精製された材料のゲル。Ｃ）最終サンプルの質量分析のデコンボリューション、及びＤ）理論的質量の表。 図１７は、酸化還元手順の概略である（加熱有り）：ａ）サンプルは、ジスルフィド結合の環化を可能にするために１時間加熱される。ｂ）その後、冷却し、システインを２ｍＭのＤＴＴを用いて２時間還元する。ｃ）次いで濃縮し、システインが室温で透析によって空気酸化される。 図１８は、酸化還元手順の概略である（加熱無し）：ａ）サンプルを２時間混合する。ｂ）システインを２ｍＭのＤＴＴを用いて２時間還元する。ｃ）次いで濃縮し、透析によってＥＤＴＡを除きながら、システインが室温で空気酸化される。 構築された二重特異性体の解析 Ａ）加熱工程を伴う酸化還元手順を用いるＨＩＣのクロマトグラム。Ｂ）加熱工程を伴わない酸化還元手順を用いるＨＩＣのクロマトグラム。

略語
ＡＤＣＣ＝抗体依存性細胞傷害
ＡＰＩ＝抗病原体イムノアドヘシン
ＢＰＩ＝殺菌性/透過性増加タンパク質
Ｃ１ｑ＝補体因子１ｑ
ＣＤ＝分化のクラスター
ＣＤＣ＝補体依存性細胞傷害
ＣＨ１又はＣ_Ｈ１＝重鎖第一定常ドメイン
ＣＨ２又はＣ_Ｈ２＝重鎖第二定常ドメイン
ＣＨ３又はＣ_Ｈ３＝重鎖第三定常ドメイン
ＣＨ４又はＣ_Ｈ４＝重鎖第四定常ドメイン
ＣＬ又はＣ_Ｌ＝軽鎖定常ドメイン
ＣＬＴＡ＝細胞傷害性Tリンパ球関連分子
Ｆｃ＝結晶化可能断片
ＦｃγＲ＝ＩｇＧのＦｃタンパク質のレセプターガンマ
ＨＩＶ＝ヒト免疫不全ウイルス
ＩＣＡＭ＝細胞間接着分子
ＢｓＡｂ＝二重特異性抗体
ＢｓＤｂ＝二重特異性ダイアボディー
ｄｓＦｖ＝ジスルフィド安定化Fｖ
Ｆｃ＝抗体の定常ドメイン
Ｆｄ＝抗体のＶ_Ｈ＋Ｃ_Ｈ１
ＦｃＲ＝Ｆｃレセプター
Ｆｖ＝抗体の可変ドメイン
ＩｇＧ＝免疫グロブリンG
ｍＡｂ＝モノクローナル抗体
ＰＢＬ＝末梢血リンパ球
ｓｃＤＢ＝単鎖ダイアボディ
ｓｃＦｖ＝単鎖Ｆｖ
（ｓｃＦｖ）_２＝ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖタンデム型
Ｔａｎｄａｂ＝タンデムダイアボディ
ＶＨ又はＶ_Ｈ＝抗体の重鎖の可変ドメイン
ＶＬ又はＶ_Ｌ＝抗体の軽鎖の可変ドメイン

詳細の説明
本発明は、以下の定義及び実施例を使用する参照によってのみ詳細に説明される。本明細書で言及されるような特許及び刊行物は、そのような特許及び刊行物に開示すべての配列を含み、参照により明示的に援用される。

本明細書において別に規定されない限り、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるように、使用されるすべての技術用語および科学用語は、本明細書と同じ意味を持つ。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York (1994), and Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) は、本発明において使用される数多くの用語多くの一般的な辞書を使う技能を提供する。本明細書に記載したものと類似又は同等の任意の方法及び材料を本発明の実行又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料が記載される。数値の範囲は、範囲を定める数値が含まれる。特に断らない限り、核酸は５’から３’の向きで左から右に書かれ、アミノ酸配列は、アミノ基からカルボキシの向きで左から右に書かれている。実行者は、定義と技術の用語について、特にSambrook et al., 1989, and Ausubel FM et al., 1993に向いている。本発明は、特定の方法論、プロトコール、及び記載された試薬に対し、これらが変更し得るため、限定されるものでないことが理解されるべきである。

数値の範囲は、範囲を定める数値が含まれる。

特に断らない限り、核酸は５’から３’の向きで左から右に書かれ、アミノ酸配列は、アミノ基からカルボキシの向きで左から右に書かれている。

本明細書で提供される見出しは、本明細書を全体として参照することにより有することができる本発明の種々の態様又は実施態様を制限するものではない。従って、すぐ下に定義された用語は、本明細書を全体として参照することにより、より完全に定義される。

Ｉ．定義
「ヘテロ多量体」、「ヘテロ多量体複合体」、又は「ヘテロ多量体タンパク質」とは、少なくとも第一のヒンジ含有ポリペプチド及び第二のヒンジ含有ポリペプチドを指し、ここで第二のヒンジ含有ポリペプチドがアミノ酸配列において、第一のヒンジ含有ポリペプチドと少なくとも一つのアミノ酸残基だけ異なる。ヘテロ多量体は、第一及び第二のヒンジ含有ポリペプチドで形成される「ヘテロダイマー」を含むことができ、又は第一及び第二のヒンジ含有ポリペプチドに加えてポリペプチドが存在している高次立体構造を形成することができる。ヘテロ多量体のポリペプチドは、非ペプチド性、共有結合（例えば、ジスルフィド結合）及び／又は非共有結合性相互作用（例えば、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、及び／又は疎水性相互作用）により相互作用し得る。

本明細書に記載されるように、「ヘテロ多量体化ドメイン」は生体分子に対して、ヘテロ多量体形成を促進し、ホモ多量体の形成を阻害するなどの改変や追加を指す。ホモダイマーよりもヘテロダイマーの形成について強い優先度を持つ任意のヘテロ二量体化ドメインが、本発明の範囲内にある。実例となる例として、限定されないが、例えば、米国特許出願公開第２００３００７８３８５号 (Arathoon et al. Genentech; ノブ・イントゥー・ホールを記述); 国際公開第２００７１４７９０１号(Kjaergaard et al. Novo Nordisk: イオン性相互作用を記述); 国際公開第２００９０８９００４号 (Kannan et al.Amgen:静電的ステアリング効果（electrostatic steering effects）を記述);米国仮特許出願第６１／２４３，１０５号 (Christensen et al. - Genentech; コイルドコイルを記述)を含む。また、例えば、ロイシンジッパーを記述するPack, P. & Plueckthun, A., Biochemistry 31, 1579-1584 (1992)、又はヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフを記述するPack et al., Bio/Technology 11, 1271-1277 (1993) を参照。語句「ヘテロ多量体化ドメイン」及び「ヘテロ多二量体化ドメイン」は、本明細書にて互換的に用いられる。

本明細書にて使用される語句「ヒンジ含有ポリペプチド」は、当技術分野で理解されるように、免疫グロブリンのヒンジ領域、例えば、重鎖のＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン間の領域に対応する領域を含むポリペプチドを指す。「ヒンジ領域」、「ヒンジ配列」、及びそれらの変形は、本明細書にて使用される場合、当技術分野で既知の意味を含み、例えば、 Janeway’s Immunobiology, (Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC, NY) (7th ed., 2008); Bloom et al., Protein Science (1997), 6:407-415; Humphreys et al., J. Immunol. Methods (1997), 209:193-202に説明されている。また、例えば、Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985) and Papadea, C. and I. J. Check (1989) “Human immunoglobulin G and immunoglobulin G subclasses:biochemical, genetic, and clinical aspects." Crit Rev Clin Lab Sci 27(1): 27-58を参照。アミノ酸の数、並びに鎖間ジスルフィド結合を形成するために利用可能なシステイン残基の数は、免疫グロブリンのクラスおよびアイソタイプ間で変化することが当業者には理解されるであろう。このような全てのヒンジ領域は、ヒンジ含有ポリペプチドであり得、本発明の範囲内にある。

本明細書における用語「抗体」は、最も広義の意味で使用され、２本の重鎖と２本の軽鎖、及び所望の生物学的活性（例えば、エピトープ結合活性）を示す限り、それらの任意の断片、突然変異体、変異体又は誘導体を含む、任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子を指す。抗体の例には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多選択性抗体および抗体断片が含まれる。抗体は、ヒト、ヒト化、及び／又は親和性成熟であり得る。

参照の骨組みとして、本明細書で使用される場合、抗体は免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の構造を参照することにする。しかし、任意の免疫グロブリンクラスの抗体は、本明細書に記載の本発明の方法で利用することができることを当業者は理解する／認識するであろう。明確にするために、ＩｇＧ分子は一対の同一の重鎖（ＨＣｓ）、及び一対の同一の軽鎖（ＬＣｓ）を含む。各ＬＣは一可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）と一定常ドメイン（Ｃ_Ｌ）を有し、一方各ＨＣは一可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）と三つの定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１，Ｃ_Ｈ２，及びＣ_Ｈ３）を有する。Ｃ_Ｈ１ドメイン及びＣ_Ｈ２ドメインはヒンジ領域により連結されている。この構造は、当該技術分野において周知である。図１Ｂを参照する。

本明細書において用いられる場合、「半抗体」は、一免疫グロブリン軽鎖に結合する一免疫グロブリン重鎖を指す。典型的な半抗体が、図1Aに示されている。半抗体はまた、単一の可変ドメインを含む抗原結合ドメインを有し得ることを、当業者は容易に理解するであろう。

用語「マキシボディ」は、Ｆｃポリペプチドに融合したｓｃＦｖを含む融合タンパク質を指す。国際公開第２００９０８９００４号の図８ａに参照が行われる。二重特異性マキシボディについて、国際公開第２００９０８９００４号の図２に参照が行われる。

ヒトＩｇＧのＦｃ領域の用語「Ｃ_Ｈ２ドメイン」は、ＥＵ番号付けに従い、通常ＩｇＧの約２３１残基から約３４０残基に伸展する。Ｃ_Ｈ２ドメインは、それが他のドメインと密接に対をなしていない点でユニークである。むしろ、２つのＮ−結合型分枝糖鎖がインタクトな天然ＩｇＧ分子の２つのＣ_Ｈ２ドメインの間に挿入されている。糖は、ドメイン−ドメインの対合の代替を提供し、ＣＨ２ドメインの安定化を助長し得ることが推測されている。Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985).

用語「Ｃ_Ｈ３ドメイン」は、Ｆｃ領域のＣ末端からＣ_Ｈ２ドメインへの残基（即ち、ＥＵ番号付けシステムによって、ＩｇＧのアミノ酸残基３４１あたりからアミノ酸残基４４７あたりへ）の伸展を含む。

本明細書で使用される用語「Ｆｃ領域」は、一般に、免疫グロブリン重鎖のＣ末端ポリペプチドを含む二量体複合体を指し、ここで、Ｃ末端ポリペプチド配列は、インタクトな抗体のパパイン消化により得ることができるものである。Ｆｃ領域は、天然型又は変異体Ｆｃ配列を含んでもよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は様々であり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、Ｆｃ配列の位置Ｃｙｓ２２６のアミノ酸残基から、又はＰｒｏ２３０から、そのカルボキシル末端への伸展と定義される。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。免疫グロブリンのＦｃ配列は、一般に、２つの定常ドメイン、Ｃ_Ｈ２ドメイン及びＣ_Ｈ３ドメインを含み、任意でＣ_Ｈ４ドメインを含む。本明細書の「Ｆｃポリペプチド」により、Ｆｃ領域、例えば単量体Ｆｃを構成するポリペプチドの一つを意味する。Ｆｃポリペプチドは、任意の適切な免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭから得られ得る。Ｆｃ領域は、ジスルフィドにより一緒に保持される、両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域における配列によって決定され、この領域はまた、特定の種類の細胞に見出されるＦｃレセプター（ＦｃＲ）によって認識される部分である。幾つかの実施態様において、Ｆｃポリペプチドは、野生型ヒンジ配列の一部又は全部を（一般に、そのＮ末端で）含む。幾つかの実施態様において、Ｆｃポリペプチドは、機能性又は野生型ヒンジ配列を含まない。

「機能性Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を保有する。例示的な「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合；ＣＤＣ；Ｆｃレセプター結合；ＡＤＣＣ；貪食作用；細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター；ＢＣＲ）のダウンレギュレーションなどが含まれる。そのようなエフェクター機能は、結合ドメイン（例えば抗体可変ドメイン）と組み合わせるためにＦｃ領域を一般に必要とするので、例えば本明細書における定義に開示するような、様々なアッセイを用いて該エフェクター機能を評価することができる。

「天然配列Ｆｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトＦｃ領域には、天然配列ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域（非ＡおよびＡアロタイプ）；天然配列ヒトＩＧ２ Ｆｃ領域；天然配列ヒトＩＧ３ Ｆｃ領域；および天然配列ヒトＩＧ４ Ｆｃ領域；ならびにこれらの天然に生じる変異体が含まれる。
[146] 「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも１のアミノ酸修飾、好ましくは１以上のアミノ酸置換によって天然配列Ｆｃ領域のものとは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異体Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域と又は親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１のアミノ酸置換、例えば、天然配列Ｆｃ領域に又は親ポリペプチドのＦｃ領域に約１から約１０のアミノ酸置換、および好ましくは約１から約５のアミノ酸置換を有する。本明細書での変異体Ｆｃ領域は、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域との及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域との少なくとも約８０％の相同性、ならびに最も好ましくはそれらとの少なくとも約９０％の相同性、より好ましくはそれらとの少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の相同性を有する。

本明細書で用いる「Ｆｃ複合体」は、Ｆｃ領域のヒンジ領域、Ｃ_Ｈ２ドメイン又はＣ_Ｈ３ドメインを指す。

所定の実施態様において、ヒンジ含有ポリペプチドは、好ましくは野生型ヒトＩｇＧのＦｃ領域に由来のＩｇＧのＦｃ領域を含む。「野生型」ヒトＩｇＧのＦｃによって、ヒトの集団内で自然に発生するアミノ酸の配列を意味する。もちろん、Ｆｃ配列が個体間で若干差があり得るのと同様に、一以上の改変が野生型配列に作られる場合があり、それでもなお本発明の範囲内で維持される。例えば、Ｆｃ領域は、本発明に関連していない更なる改変、例えば、グリコシル化部位における変異、又は非天然アミノ酸の包含などを含めることができる。

用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン（それぞれＶ_ＨおよびＶ_Ｌ）は、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む各ドメインを持ち、一般的に似たような構造を有する。(例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co.,頁91 (2007)を参照）。単一のＶ_Ｈ又はＶ_Ｌドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、相補的なＶ_Ｌ又はＶ_Ｈドメインのそれぞれのライブラリーをスクリーニングするために抗原に特異的に結合する抗体由来のＶ_Ｈ又はＶ_Ｌドメインを用いて単離することができる。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照。

本明細書で使用する用語「Ｆａｂ」は、抗体の抗原結合断片を指す。上述したように、パパインはインタクトな抗体を消化するために用いることができる。抗体のパパイン消化は、２つの同一な抗原結合断片、即ち、「Ｆａｂ」断片、及び残りの「Ｆｃ」断片（即ち、上掲のＦｃ領域）を生成する。Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（Ｖ_Ｈ）と一緒のＬ鎖の全体、及び一方の重鎖の第一の定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１）からなる。

語句「抗原結合アーム」、「標的分子結合アーム」、「標的結合アーム」及びそれらの変形は、本明細書にて使用される場合、目的の標的に特異的に結合する能力を有する本発明のヘテロ多量体化タンパク質の構成部分を指す。一般的に好ましくは、抗原結合アームは免疫グロブリンポリペプチド配列、例えば、ＣＤＲ及び／又は免疫グロブリン軽鎖及び重鎖の可変ドメイン配列の複合体である。

「標的」又は「標的分子」は、ヘテロ多量体タンパク質の結合アームによって認識される部分をいう。例えば、ヘテロ多量体タンパク質が抗体である場合、標的は、文脈に応じて、単一分子上又は異なる分子上、又は病原体又は腫瘍細胞上のエピトープであり得る。同様に、ヘテロ多量体タンパク質が、レセプター−Ｆｃ融合タンパク質である場合、標的はレセプターに対して同族の結合パートナーとなるであろう。当業者は、標的は標的結合アームとの結合特異性によって決定され、異なる標的結合アームは異なる標的を認識することができることを理解するであろう。標的は、好ましくは１ｕＭのＫｄ（スキャッチャード分析による）よりも高い親和性を有する本発明のヘテロ多量体タンパク質に結合する。標的分子の例は、限定されないが、血清可溶性タンパク質及び／又はそれらのレセプター、例えば、サイトカイン及び／又はサイトカインレセプター等、アドヘシン、成長因子及び／又はそれらのレセプター、ホルモン、ウイルス粒子（例えば、ＲＳＶ Ｆタンパク質、ＣＭＶ、ＳｔａｐｈＡ、インフルエンザ、Ｃ型肝炎ウイルス）、微生物（例えば、細菌細胞タンパク質、真菌細胞）、アドヘシン、ＣＤタンパク質及びそれらのレセプターを含む。

「インタクト」又は「全長」抗体の一例は、抗原結合アーム並びにＣ_Ｌ及び少なくとも重鎖定常ドメイン、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、及びＣ_Ｈ３を含む。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体であり得る。

本明細書にて使用される用語「カップリング」は、第一のヒンジ含有ポリペプチド及び第二のヒンジ含有ポリペプチドをお互いに連結させること、例えば共有結合の形成に必要な工程を指す。このような工程は、鎖間ジスルフィド結合を形成するために、第一及び第二のヒンジ含有ポリペプチドのシステイン残基の還元、アニーリング及び／又は酸化を含む。カップリングは、化学的架橋，又は酸化還元系を用いることによって達成することができる。例えば、Humphreys et al., J. Immunol. Methods (1998) 217:1-10 and Zhu et al., Cancer Lett., (1994) 86: 127-134を参照。

用語「多選択性抗体」は最も広い意味で使用され、具体的にはポリエピトープ特異性を有する抗体を網羅する。このような多選択性抗体は、限定されないが、重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）および軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含む抗体を含み、Ｖ_ＨＶ_Ｌユニットはポリエピトープ特異性、２以上のＶ_Ｌドメイン及びＶ_Ｈドメインを有し、各Ｖ_ＨＶ_Ｌユニットは異なるエピトープに結合する抗体、２以上の単一可変ドメインを有し、各単一可変ドメインが異なるエピトープに結合する抗体、全長抗体、抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆｖを、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ及びトリアボディなど、共有結合又は非共有結合で連結している抗体断片を含む。「ポリエピトープ特異性」とは、同一または異なる標的（複数）上の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。「単一特異性」は唯一つのエピトープに結合する能力を指す。一実施態様によれば、多選択性抗体は、各エピトープに、５μＭから０．００１ｐＭ、３μＭから０．００１ｐＭ、１μＭから０．００１ｐＭ、０．５μＭから０．００１ｐＭ、又は０．１μＭから０．００１ｐＭの親和性で結合するＩｇＧ抗体である。二重特異性抗体の説明図が図１Ｂに与えられる。

「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）（Ｄｂ）；タンデムダイアボディ（ｔａＤｂ）；直鎖状抗体（米国特許第５６４１８７０号、実施例２；Zapata等, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]）；一アーム抗体、単一可変ドメイン抗体、ミニボディ；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多選択性抗体（例えば、Ｄｂ−Ｆｃ、ｔａＤｂ−Ｆｃ、ｔａＤｂ−ＣＨ３および(ｓｃＦＶ)４−Ｆｃが含まれるがこれらに限定されない）を含む。

「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）または「単一可変ドメイン（ＳＶＤ）抗体」という表現は、単一可変ドメイン（Ｖ_Ｈ又はＶ_Ｌ）が抗原結合を付与することができる抗体を一般に指す。言い換えると、単一可変ドメインは、標的抗原を認識するために別の可変ドメインと相互作用する必要がない。単一ドメイン抗体は、各抗原結合アーム上の単一の単量体可変抗体ドメイン（Ｖ_Ｈ又はＶ_Ｌ）からなる。単一ドメイン抗体の例には、ラクダ科（ラマおよびラクダ）および軟骨魚（例えばテンジクザメ）に由来するものならびにヒトおよびマウス抗体からの組換え法から得られるものが含まれる (Ward et al., Nature (1989) 341:544-546; Dooley and Flajnik, Dev Comp Immunol (2006) 30:43-56; Muyldermans et al., Trend Biochem Sci (2001) 26:230-235; Holt et al., Trends Biotechnol (2003):21:484-490;国際公開第２００５／０３５５７２号；国際公開第０３／０３５６９４号; Davies and Riechmann, Febs Lett (1994) 339:285-290; 国際公開第００／２９００４号；国際公開第０２／０５１８７０号）。単一可変ドメイン抗体は、他の可変領域又は可変ドメインを持つ抗原結合アーム（例えば、ホモ又はヘテロ多量体）中に存在することができる、その場合には、それは単一ドメイン抗体ではない。

「線形抗体」という表現は、Zapata等, Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)に記載された抗体を意味する。簡単に言えば、これら抗体は、相補的な軽鎖ポリペプチドと共に抗原結合領域の対を形成する一対の直列のＦｄセグメント（Ｖ_Ｈ-Ｃ_Ｈ１-Ｖ_Ｈ-Ｃ_Ｈ１）を含む。直鎖状抗体は二重特異性であっても単一特異性であってもよい。

本明細書において言及する「ノブ・イントゥー・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」または「ＫｎＨ」技術という用語は、インビトロまたはインビボで２つのポリペプチドの相互的な対合を導く技術であって、それらが相互作用する界面において一方のポリペプチドに突起（ノブ）をおよび他方のポリペプチドに空洞（ホール）を導入することによる技術を指す。例えば、ＫｎＨは、抗体のＦｃ：Ｆｃ結合界面、Ｃ_Ｌ：Ｃ_Ｈ１界面またはＶ_Ｈ／Ｖ_Ｌ界面において導入されている（例えば、米国特許出願公開第２００７／０１７８５５２号、国際公開第９６／０２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号及びZhu et al.(1997)Protein Science 6:781-788）。これは、多選択性抗体の製造中に２つの異なる重鎖の相互的な対合を駆動するのに特に有用である。例えば、Ｆｃ領域にＫｎＨを有する多選択性抗体は、各Ｆｃ領域に連結された単一可変ドメインをさらに含むことができ、または類似したもしくは異なる軽鎖可変領域と対合する異なる重鎖可変ドメインをさらに含むことができる。ＫｎＨ技術を用いて、２つの異なるレセプター細胞外ドメインを互いに対合させること、又は（例えばアフィボディ、ペプチボディおよび他のＦｃ融合体を含む）異なる標的認識配列を含む任意の他のポリペプチド配列を対合させることもできる。

「Ｆｖ」は１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。これら２つのドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を付与する６つの高頻度可変ループ(Ｈ及びＬ鎖から、それぞれ３つのループ)が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。

「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略称される「単鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖内に結合したＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それはｓＦＶが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓＦｖの概説については、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)；Malmborg et al., J. Immunol. Methods 183: 7-13, 1995を参照のこと。

用語「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）」は、鎖間ではなく鎖内でＶドメインを対形成させ、結果として二価の断片、すなわち２つの抗原−結合部位を有する断片が得られるように、Ｖ_ＨとＶ_Ｌドメインとの間に、短いリンカー（約５−１０残基）を持つｓＦｖ断片（前の段落を参照）を構築することにより調製される小型の抗体断片を意味する。二重特異性ダイアボディは２つの「交差」ｓＦｖ断片のヘテロダイマーであり、そこでは２つの抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開９３／１１１６１号；及びHolliger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)により十分に記載されている。

用語「ワンアームド抗体」は、（１）Ｃ_Ｈ２ドメイン、Ｃ_Ｈ３ドメイン又はＣ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３ドメインを含むポリペプチドに結合したペプチドによって連結された可変ドメインと（２）第二Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３又はＣ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３ドメインとを含む抗体であって、該可変ドメインが、該第二Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３又はＣ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３ドメインを含むポリペプチドに結合したペプチドによって連結されていない抗体を指す。一実施態様において、ワンアームド抗体は、（１）可変ドメイン（例えばＶ_Ｈ）、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３を含む第一ポリペプチドと（２）可変ドメイン（例えばＶ_Ｌ）およびＣ_Ｌドメインを含む第二ポリペプチドと（３）Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３ドメインを含む第三ポリペプチドの３つのペプチドとを含む。別の実施態様では、ワンアームド抗体は、定常重鎖を連結するジスルフィド結合を形成する２つのシステイン残基を含有する部分的ヒンジ領域を有する。一実施態様では、ワンアームド抗体の可変ドメインは抗原結合領域を形成する。別の実施態様では、ワンアームド抗体の可変ドメインは単一可変ドメインであり、各単一可変ドメインが抗原結合領域である一実施態様において、ワンアームド抗体は単一の可変ドメイン抗体である。

本発明の抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の種に由来する又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同であるが、その（それらの）鎖の残部は別の種に由来する又は別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体、ならびにそのような抗体の断片（但し、それらが所望の生物学的活性を示すことを条件とする）であり得る（米国特許第４８１６５６７号；およびMorrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984)）。本明細書における対象のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば旧世界ザル、類人猿など）及びヒト定常領域配列に由来する可変ドメイン抗原結合配列を含む霊長類化抗体が含まれる。

非ヒト(例えば齧歯類)抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト抗体から得られた最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の抗体特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、全て又はほとんど全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又はほとんど全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、状況に応じて免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細は、Jones等, Nature 321, 522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332, 323-327(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。

「ペプチボディ」は、ランダムに生成されたペプチドとＦｃドメインの融合体を指す。２００３年１２月９日にＦｅｉｇｅらに発行された（出典明記によりその全体が組み込まれる）米国特許第６，６６０，８４３号を参照のこと。それらは、Ｎ末端、Ｃ末端、アミノ酸側鎖にまたはこれらの部位の１つより多くに連結された１つ以上のペプチドを含む。ペプチボディ技術は、１つ以上のリガンドまたはレセプターを標的にするペプチド、腫瘍ホーミングペプチド、膜輸送ペプチド等を組み込む治療薬の設計を可能にする。ペプチボディ技術は、ジスルフィドによって拘束された線状ペプチド、「直列ペプチド多量体」（すなわち、Ｆｃドメインの単鎖上の１つより多くのペプチド）を含めて、多数のそのような分子の設計において有用であることが証明された。例えば、米国特許第６，６６０，８４３号；２００３年１０月１６日に公開された米国特許出願公開第２００３／０１９５１５６号（２００２年１１月２１日に公開された国際公開第０２／０９２６２０号に対応する）；２００３年９月１８日に公開された米国特許出願公開第２００３／０１７６３５２号（２００３年４月１７日に公開された国際公開第０３／０３１５８９号に対応する）；１９９９年１０月２２日に出願された米国特許出願第０９／４２２，８３８号（２０００年５月４日に公開された国際公開第００／２４７７０号に対応する）；２００３年１２月１１日に公開された米国特許出願公開第２００３／０２２９０２３号；２００３年７月１７日に公開された国際公開第０３／０５７１３４号；２００３年１２月２５日に公開された米国特許出願公開第２００３／０２３６１９３号（２００４年４月８日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ０４／０１０９８９号に対応する）；２００３年９月１８日に出願された米国特許出願第１０／６６６，４８０号（２００４年４月１日に公開された国際公開第０４／０２６３２９号に対応する）を参照のこと。これらの各々は出典明記によりその全体が本明細書に組み込まれる。

「アフィボディ」は、標的分子のための結合表面を生じさせるためにタンパク質を足場として使用する、ペプチド結合によりＦｃ領域に連結されたタンパク質の使用を指す。前記タンパク質は、多くの場合、天然に生じるタンパク質、例えばブドウ球菌プロテインＡもしくはＩｇＧ結合Ｂドメイン、またはそれらに由来するＺタンパク質（Nilsson et al(1987),Prot Eng 1,107-113、および米国特許第５，１４３，８４４号を参照）またはそれらの断片もしくは誘導体である。例えば、標的分子を結合できる変異体のライブラリを生じさせるようにランダム突然変異誘発によってＺタンパク質のセグメントを突然変異させたものである、標的分子への結合親和性が改変されたＺタンパク質変異体から、アフィボディを作ることができる。アフィボディの例には、米国特許第６５３４６２８号、Nord K et al,Prot Eng 8:601-608(1995)およびNord K et al,Nat Biotech 15:772-777(1997).Biotechnol Appl Biochem.2008 Jun;50(Pt 2):97-112が含まれる。

本明細書において用いる場合、用語「イムノアドヘシン」は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能を兼備する分子を示す。構造的には、イムノアドヘシンは、アミノ酸配列が抗体の抗原認識および結合部位以外である（すなわち、抗体の定常領域と比較して「異種」である）、所望の結合特異性を有するアミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列（例えばＩｇＧのＣ_Ｈ２及び／又はＣ_Ｈ３配列）との融合体を含む。例示的なアドヘシン配列には、対象のタンパク質に結合するレセプターまたはリガンドの一部分を含む隣接アミノ酸配列が含まれる。アドヘシン配列は、対象のタンパク質を結合するがレセプター又はリガンド配列ではない配列（例えばペプチボディ中のアドヘシン配列）でもあり得る。そのようなポリペプチド配列を、ファージディスプレイ技術及びハイスループット選別法をはじめとする様々な方法によって、選択または同定することができる。前記イムノアドヘシンにおける免疫グロブリンの定常ドメイン配列は、任意の免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＭから得ることができる。

本明細書で用いられる「複合体」または「複合体化した」は、ペプチド結合でない結合及び／又は力（例えば、ファンデルワールス、疎水性、親水性力）によって互いに相互作用する２つ以上の分子の会合を指す。一実施態様では、複合体はヘテロ多量体である。本明細書で用いられる「タンパク質複合体」又は「ポリペプチド複合体」という用語が、タンパク質複合体中のタンパク質にコンジュゲートした非タンパク質エンティティー（例えば、限定するものではないが、化学分子、例えば毒素又は検出剤を含む）を有する複合体を含むことは理解されるはずである。

本明細書で用いられる「ヘテロ多量体」とは、対象の抗原に結合し、ヘテロ多量体タンパク質が、タンパク質又は標的を発現する細胞又は組織を標的とする診断及び／又は治療剤として有用であるように、十分な親和性で標的に結合し、他のタンパク質とは有意に交差反応しないものである。そのような実施態様では、「非標的」タンパク質に対するヘテロ多量体タンパク質の結合範囲は、蛍光活性化細胞分類(ＦＡＣＳ)分析又は放射性免疫沈降法(ＲＩＡ)又はＥＬＩＳＡにより決定した場合、その特定の標的タンパク質に対する抗体の結合の約１０％未満である。標的分子へのヘテロ多量体タンパク質の結合に関して、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド標的上のエピトープに対する「特異的結合」又は「に特異的に結合する」又は「に特異的な」といった用語は、非特異的な相互作用とは測定可能な差異を有する結合を意味する(例えば、非特異的な相互作用はウシ血清アルブミンまたはカゼインへの結合であってよい)。特異的結合は、例えば、コントロール分子の結合と比較して分子の結合を決定することにより測定することができる。例えば、特異的結合は、標的、例えば標識していない過剰な量の標的に類似したコントロール分子との競合により決定することができるこの場合、プローブに対する標識した標的の結合が、標識していない過剰な量の標的により競合的に阻害された場合、特異的結合が示される。ここで用いる特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド標的上のエピトープに対する「特異的結合」又は「に特異的に結合する」又は「に特異的である」といった用語は、例えば、少なくともおよそ２００ｎＭ、あるいは少なくともおよそ１５０ｎＭ、あるいは少なくともおよそ１００ｎＭ、あるいは少なくともおよそ６０ｎＭ、あるいは少なくともおよそ５０ｎＭ、あるいは少なくともおよそ４０ｎＭ、あるいは少なくともおよそ３０ｎＭ、あるいは少なくともおよそ２０ｎＭ、あるいは少なくともおよそ１０ｎＭ、あるいは少なくともおよそ８ｎＭ、あるいは少なくともおよそ６ｎＭ、あるいは少なくともおよそ４ｎＭ、あるいは少なくともおよそ２ｎＭ、あるいは少なくともおよそ１ｎＭ又はそれ以上の対標的Ｋｄを有する分子によって提示されうる。一実施態様では、用語「特異的な結合」は、ヘテロ多量体タンパク質が他のいかなるポリペプチド又はポリペプチドエピトープに実質的に結合しないで特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに結合する結合を指す。

一般的に「結合親和性」は、分子(例えば抗体)の単一結合部位とその結合パートナー(例えば抗原）との間の非共有結合的な相互作用の総合的な強度を意味する。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映している本質的な結合親和性を指す。そのパートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般的に解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。例えば、Ｋｄは、２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、８ｎＭ、６ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ又はそれ以上の強さでありうる。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体は抗原にゆっくり結合して素早く解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は抗原により密接により長く結合したままとなる。結合親和性の様々な測定方法が当分野で公知であり、それらの何れかを本発明のために用いることができる。

一実施態様では、本発明の「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、およそ１０反応単位（ＲＵ）の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のＢＩＡｃｏｒｅ^ＴＭ−２０００又はＢＩＡｃｏｒｅ^ＴＭ−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）にて表面プラズモン共鳴アッセイを行って測定される。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．）を、提供者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化した。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈し、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入する。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。動力学的な測定のために、Ｆａｂの２倍の段階希釈（例えば、０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、２５℃で、およそ２５μｌ／分の流速で、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（ｓｉｍｐｌｅ ｏｎｅ−ｔｏ−ｏｎｅ Ｌａｎｇｍｕｉｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ）（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０^６Ｍ−^１Ｓ−^１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計（ｓｔｏｐ−ｆｌｏｗ ｅｑｕｉｐｐｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ）（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズのＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、２５℃で、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。

抗体、断片又はこれらの誘導体といった本発明のヘテロ多量体タンパク質に関して「生物学的に活性な」及び「生物学的活性」及び「生物学的特徴」は、特段の記載がない限り、生物学的分子に結合する能力を有することを意味する。

「単離された」とは、様々なヘテロ多量体ポリペプチドを記述するために用いられる場合、それが発現された細胞又は細胞培養液から分離され及び／又は回収されたヘテロ多量体を意味する。その自然環境の混入成分は、ヘテロ多量体の診断または治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質様または非タンパク質様溶質が含まれる。所定の実施態様において、ヘテロ多量体は、（１）ローリー法により判定してタンパク質９５重量％超、および最も好ましくは９９重量％超まで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、Ｎ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クーマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を用いる還元もしくは非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一になるまで精製される。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも1つの精製工程により調製されるであろう。

本発明のヘテロ多量体は、実質的に均一になるまで一般には精製される。「実質的に均一な」、「実質的に均一な形態」および「実質的均一」という句は、その産物に、望ましくないポリペプチドの組み合わせ（例えばホモ多量体）起源の副産物が実質的にないことを示すために用いられる。

純度に関して表現される、実質的に均一とは、副産物の量が、１０重量％、９重量％、８重量％、７重量％、６重量％、４重量％、３重量％、２重量％もしくは１重量％を超えない、または１重量％未満であることを意味する。一実施態様では、副産物は５％未満である。

「生物学的分子」は、核酸、タンパク質、糖質、脂質およびこれらの組合せを指す。一実施態様では、生物学的分子は天然に存在する。

本明細書で用いられる「連結された」または「連結する」とは、第一アミノ酸配列と第二アミノ酸配列の間の直接的なペプチド結合による結合、または第一および第二アミノ酸配列に結合した、該配列間のペプチドである、第三アミノ酸配列を伴う結合のいずれかを意味する。例えば、あるアミノ酸配列のＣ末端におよび他のアミノ酸配列のＮ末端に結合したリンカーペプチド。

本明細書で用いられる「リンカー」とは、２以上のアミノ酸長のアミノ酸配列を意味する。リンカーは、天然極性または非極性アミノ酸から成り得る。リンカーは、例えば、２から１００アミノ酸長、例えば２アミノ酸長と５０アミノ酸長の間、例えば、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸長であり得る。リンカーは、例えば自己切断または酵素的もしくは化学的切断により、「切断可能」であり得る。アミノ酸配列内の切断部位ならびにそのような部で切断する酵素および化学物質は、当該技術分野において周知であり、本明細書にも記載する。

本明細書で用いられる「テザー」とは、２つの別のアミノ酸配列を連結するアミノ酸リンカーを意味する。本明細書に記載するテザーは、免疫グロブリン重鎖可変ドメインのＮ末端と免疫グロブリン軽鎖定常領域のＣ末端を連結することができる。特定の実施態様において、テザーは、約１５アミノ酸長と５０アミノ酸長の間、例えば、２０アミノ酸長と２６アミノ酸長の間（例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６アミノ酸長）である。テザーは、例えば、当該技術分野において標準的な方法および試薬を用いる自己切断または酵素的もしくは化学的切断により、「切断可能」であり得る。

「リンカー」または「テザー」の酵素的切断は、例えばＬｙｓ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ、Ａｒｇ−Ｃ、Ｖ８、Ｇｌｕ−Ｃ、キモトリプシン、トリプシン、ペプシン、パパイン、トロンビン、ゲネナーゼ、第Ｘａ因子、ＴＥＶ（タバコエッチウイルスシステインプロテアーゼ）、エンテロキナーゼ、ＨＲＶ Ｃ３（ヒトライノウイルスＣ３プロテアーゼ）、キニノゲナーゼ、ならびにスブチリシン様プロプロテイン転換酵素（例えば、フリン（ＰＣ１）、ＰＣ２もしくはＰＣ３）またはＮ−アルギニン二塩基性転換酵素などの、エンドペプチダーゼの使用を必要とし得る。化学的切断は、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド、または臭化シアンの使用を必要とし得る。

本明細書で用いられる「Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼ切断部位」は、Ｌｙｓ−ＣエンドペプチダーゼによってＣ末端側で切断され得るアミノ酸配列内のリシン残基である。Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼは、リシン残基のＣ末端側で切断する。

「カオトロピック剤」とは、分子内相互作用（例えば水素結合、ファンデルワールス力または疎水性作用）の安定化を妨害することによりタンパク質（例えば抗体）の三次元構造を破壊する水溶性物質を意味する。例示的なカオトロピック剤には、限定するものではないが、尿素、グアニジン−ＨＣｌ、過塩素酸リチウム、ヒスチジンおよびアルギニンが含まれる。

「中性（ｍｉｌｄ）界面活性剤」とは、分子内相互作用（例えば水素結合、ファンデルワールス力または疎水性作用）の安定化を妨害することによりタンパク質（例えば抗体）の三次元構造を破壊するが、生物学的活性を喪失させるようにタンパク質構造を永久破壊しない（すなわち、タンパク質を変性しない）、水溶性物質を意味する。例示的な中性界面活性剤には、限定するものではないが、Ｔｗｅｅｎ（例えばＴｗｅｅｎ−２０）、Ｔｒｉｔｏｎ（例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ＮＰ−４０（ノニルフェノキシポリエトキシエタノール）、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が含まれる。

抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域(天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域)に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)；貪食作用；細胞表面レセプター(例えば、Ｂ細胞レセプター)のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。

「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」又は「ＡＤＣＣ」とは、ある種の細胞障害細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球及びマクロファージ)上に存在するＦｃレセプター(ＦｃＲｓ)と結合した分泌Ｉｇにより、これらの細胞障害エフェクター細胞が抗原-担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒により標的細胞を死滅させることを可能にする細胞障害性の形態を意味する。抗体は細胞障害細胞を「備えて」おり、これはこのような死滅には絶対に必要なものである。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) の４６４頁の表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイにおいて有用なエフェクター細胞には、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー細胞(ＮＫ細胞)が含まれる。代わりとして、もしくは付加的に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes等, PNAS (USA) 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価することが可能である。

「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するものである。好適なＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。さらに好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(ガンマレセプター)と結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含み、これらのレセプターの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態のものも含まれる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ(「活性型レセプター」)及びＦｃγＲＩＩＢ(「阻害型レセプター」)が含まれ、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型レセプターＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif ;ＩＴＡＭ)を含んでいる。阻害型レセプターＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター阻害性モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif ;ＩＴＩＭ)を含んでいる(Daeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)を参照)。ＦｃＲｓに関しては、 Ravetch and Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994); 及びde Haas等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に概説されている。将来的に同定されるものも含む他のＦｃＲsはここでの「ＦｃＲ」という言葉によって包含される。また、該用語には、母性ＩｇＧの胎児への移送を担い(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim等, J. Immunol.24:2429-2434(1994))、免疫グロブリンのホメオスタシスを調節する新生児性レセプターＦｃＲｎも含まれる。

「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。典型的な補体経路の活性化は補体系(Ｃｌｑ)の第１補体が、同族抗原と結合した(適切なサブクラスの)抗体に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。

「治療的有効量」なる用語は、対象の疾患又は疾病を治療するための抗体、抗体断片または誘導体の量を指す。腫瘍（例えば癌性腫瘍）の場合は、治療的有効量の抗体ないし抗体断片（例えば多選択性抗体ないし抗体断片）は、癌細胞の数を減少させる、腫瘍の大きさを小さくする、癌細胞の周辺器官への浸潤を阻害する（すなわち、ある程度に遅く、好ましくは止める）、腫瘍の転移を阻害する（すなわち、ある程度遅く、好ましくは止める）、腫瘍の成長をある程度阻害する、及び／又は疾患に関連する一又は複数の症状をある程度和らげうる。ある程度、抗体ないし抗体断片は、成長を妨げ及び／又は現存の癌細胞を殺し得、細胞分裂停止性及び／又は細胞障害性である。癌治療に対しては、インビボにおける効力は、例えば生存期間、病状の進行時間（ＴＴＰ）、応答速度（ＲＲ）、応答期間、及び／又は生活の質の測定により測定される。

「低減する又は阻害する」とは、概して好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上の減少を引き起こす能力を指す。低減する又は阻害するとは、治療する疾患の症状、転移の存在又は大きさ、原発腫瘍のサイズ、又は血管形成性疾患の血管の大きさ又は数を指しうる。

「癌」及び「癌性」なる用語は、典型的には調節されない細胞の成長／増殖を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。良性及び悪性の癌は、この定義に含まれる。癌の例には、これらに限定するものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病が含まれる。このような癌のより具体的な例には、扁平細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞性癌、胃腸癌を含む胃(gastric及びstomach)癌、膵癌、神経膠芽腫、膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌(例えば、腎臓細胞癌腫)、肝癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、肛門部の癌腫、陰茎癌腫、メラノーマ、及び様々な種類の頭頸部癌が含まれる。「初期段階の癌」は、浸潤性でも転移性でもなく、又はステージ０、Ｉ又はＩＩの癌として分類される癌を意味する。「前癌性」なる用語は、典型的に癌に進行する又は癌に発達する症状ないし成長を指す。「非転移性」とは、良性である癌、又は原発部位に止まり、リンパ管や血管系ないしは原発部位以外の組織に浸透しない癌を意味する。一般的に、非転移性癌は、ステージ０、Ｉ又はＩＩの癌、場合によってステージＩＩＩの癌のいずれかの癌である。

本明細書において「アレルギー性又は炎症性の疾患」は、個体の免疫系の過剰活性化から生じる疾患又は疾病である。例示的なアレルギー性又は炎症性の疾患には、喘息、乾癬、関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、全身狼瘡、エリテマトーデス、湿疹、臓器移植、年齢性黄斑変性、クローン病、潰瘍性大腸炎、好酸性食道炎および炎症に関連する自己免疫性疾患が含まれるが、これに限定されない。

本明細書中の「自己免疫疾患」は、個体の自己組織又は同時分離又はその徴候又は結果として生じるその症状に対する及びそれらから生じる疾患又は症状である。自己免疫疾患又は症状の例として、限定するものではないが、関節炎(関節リウマチ(例えば急性の関節炎、慢性の関節リウマチ、痛風性関節炎、急性の痛風性関節炎、慢性炎症性関節炎、変形性関節症、感染性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬の関節炎、椎骨関節炎及び若年性発症関節リウマチ、骨関節炎、関節炎慢性化、関節炎変形、関節炎慢性原発、反応性関節炎、及び強直性脊椎炎)、炎症性過剰増殖性皮膚病、乾癬、例えばプラーク乾癬、滴状乾癬、膿疱性乾癬及び爪乾癬)、皮膚炎、例として接触皮膚炎、慢性接触皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、ヘルペス状の皮膚炎、貨幣状皮膚炎、脂漏性皮膚炎、非特異的皮膚炎、一次刺激物接触皮膚炎及び過敏性皮膚炎、Ｘ連鎖性過剰ＩｇＭ症候群、蕁麻疹、例えば慢性アレルギー性蕁麻疹及び慢性特発性蕁麻疹、例として慢性自己免疫蕁麻疹、多発性筋炎／皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、中毒性上皮性表皮壊死症、強皮症(全身強皮症を含む)、硬化症、例えば全身性硬化症、多発性硬化症(ＭＳ)、例えば脊椎-眼(spino-optical) ＭＳ)、一次進行性ＭＳ(ＰＰＭＳ)及び再発性寛解ＭＳ(ＲＲＭＳ)、進行性全身性硬化症、アテローム性動脈硬化、動脈硬化症、硬化症汎発、失調性硬化症、炎症性腸疾患(ＩＢＤ)(例えばクローン病、自己免疫性胃腸疾患、大腸炎、例えば潰瘍性大腸炎、大腸性潰瘍、微細な大腸炎、膠原性大腸炎、大腸ポリープ、壊死性全腸炎及び経壁の大腸炎、及び自己免疫炎症性腸疾患)、膿皮症壊疽、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、上強膜炎、呼吸窮迫症候群、例として成人性又は急性の呼吸窮迫症候群(ＡＲＤＳ)、髄膜炎、葡萄膜の全部又は一部の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫血液疾患、リウマチ様脊椎炎、リウマチ様関節滑膜炎、突発性聴力障害、ＩｇＥ媒介性疾患、例えばアナフィラキシー及びアレルギー性鼻炎及びアトピー性鼻炎、脳炎、例えばラスマッセンの脳炎及び辺縁及び／又は脳幹脳炎、ブドウ膜炎、例として、前部ブドウ膜炎、急性前ブドウ膜炎、肉芽腫ブドウ膜炎、非顆粒性ブドウ膜炎、水晶体抗原性ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎又は自己免疫ブドウ膜炎、ネフローゼ症候群を有する又は有さない糸球体腎炎(ＧＮ)、例として、慢性又は急性の糸球体腎炎、例として原発性ＧＮ、免疫性ＧＮ、膜性ＧＮ(膜性ネフロパシ)、特発性膜性ＧＮ又は特発性膜性ネフロパシ、膜又は膜性増殖性ＧＮ(ＭＰＧＮ)(タイプＩ及びタイプＩＩを含む)、急速進行性ＧＮ、アレルギー性症状、アレルギー性反応、湿疹、例としてアレルギー性又はアトピー性湿疹、喘息、例えば喘息気管支炎、気管支喘息及び自己免疫喘息、Ｔ細胞の浸潤を伴う症状及び慢性炎症反応、慢性肺炎症性疾患、自己免疫心筋炎、白血球粘着力欠損、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)又は全身性ループスエリテマトーデス、例えば皮膚ＳＬＥ、亜急性の皮膚ＳＬＥ、新生児期ループス症候群(ＮＬＥ)、紅班性狼瘡汎発、ループス(例としてループス腎炎、ループス脳炎、小児ループス、非腎性ループス、腎外ループス、円板状ループス、脱毛症ループス)、若年性開始型(Ｉ型)真正糖尿病、例として小児インシュリン依存性真正糖尿病(ＩＤＤＭ)、成人発症型真正糖尿病(ＩＩ型糖尿病)、自己免疫性糖尿病、特発性の尿崩症、サイトカイン及びＴリンパ球によって媒介される急性及び遅発性過敏症と関係する免疫応答、結核、サルコイドーシス、肉芽腫症、例としてリンパ腫肉芽腫症、ヴェゲナーの肉芽腫症、無顆粒球症、脈管炎、例として血管炎、大血管性血管炎(例えば大脈管脈管炎(リウマチ性多発性筋痛及び巨細胞(高安)動脈炎を含む)、中脈管脈管炎(川崎病及び結節性多発動脈炎を含む)、微小多発動脈炎、ＣＮＳ脈管炎、壊死性血管炎、皮膚性血管炎又は過敏性血管炎、全身性壊死性血管炎、及びＡＮＣＡ関連の脈管炎、例としてチャーグ-ストラウス脈管炎又は症候群(ＣＳＳ))、側頭動脈炎、無形成性貧血、自己免疫無形成性貧血、クームズ陽性貧血症、ダイアモンドブラックファン貧血症、溶血性貧血又は免疫溶血性貧血、例として自己免疫溶血性貧血(ＡＩＨＡ)、悪性貧血(貧血症悪性熱)、アジソン病、純粋な赤血球貧血症又は形成不全(ＰＲＣＡ)、第VIII因子欠損症、血友病Ａ、自己免疫好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球血管外遊出を伴う疾患、ＣＮＳ炎症性疾患、多器官損傷症候群、例えば敗血症、外傷又は出血の二次症状、抗原-抗体複合体関連疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット又はベーチェット病、カールスマン症候群、グッドパスチャー症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンスジョンソン症候群、類天疱瘡、例えば水疱性類天ぽうそう及び類天疱瘡皮膚、天疱瘡(尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、ペンフィグス粘液膜類天疱瘡及び天疱瘡エリテマトーデスを含む)、自己免疫多腺性内分泌障害、ライター病又は症候群、免疫複合体腎炎、抗体媒介性腎炎、視神経脊髄炎、多発性神経炎、慢性神経障害、例えばＩｇＭ多発性神経炎又はＩｇＭ媒介性神経障害、血小板減少(例えば心筋梗塞患者によるもの)、例えば血栓性血小板減少性紫斑病(ＴＴＰ)、及び自己免疫性又は免疫媒介性血小板減少、例えば慢性及び急性のＩＴＰを含む特発性血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)、自己免疫性精巣炎及び卵巣炎を含む精巣及び卵巣の自己免疫性疾患、一次甲状腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、自己免疫内分泌性疾患、例えば甲状腺炎、例えば自己免疫性甲状腺炎、橋本病、慢性甲状腺炎(橋本甲状腺炎)又は亜急性の甲状腺炎、自己免疫甲状腺性疾患、特発性甲状腺機能低下症、グレーブ病、自己免疫多腺性症候群、例として多腺性症候群(又は、多腺性内分泌障害症候群)、腫瘍随伴症候群、例として神経系新生物関連症候群、例えばランバート-イートン筋無力症症候群又はイートン―ランバート症候群、スティッフマン又はスティッフマン症候群、脳脊髄炎、例として、アレルギー性脳脊髄炎又は脳脊髄炎性アレルギー及び実験的アレルギー性脳脊髄炎(ＥＡＥ)、重症筋無力症、例えば胸腺腫関連の重症筋無力症、小脳性退化、神経ミオトニ、眼球クローヌス又は眼球クローヌス筋硬直症候群(ＯＭＳ)及び感覚系神経障害、多病巣性運動神経障害、シーハン症候群、自己免疫肝炎、慢性肝炎、類狼瘡肝炎、巨細胞肝炎、慢性活動性肝炎又は自己免疫慢性活動性肝炎、リンパ系間隙間質性肺炎(ＬＩＰ)、閉塞性細気管支炎(非移植)対ＮＳＩＰ、ギラン‐バレー症候群、ベルガー病(ＩｇＡネフロパシ)、特発性ＩｇＡネフロパシ、線状ＩｇＡ皮膚病、原発性胆管萎縮症、肺線維症、自己免疫腸疾患症候群、セリアック病、コエリアック病、脂肪便症(グルテン腸疾患)、抵抗性スプルー、特発性スプルー、クリオグロブリン血症、アミロトロフィック側索硬化症(ＡＬＳ；筋萎縮性側索硬化症(Lou Gehrig's disease))、冠状動脈疾患、自己免疫性耳疾患、例として、自己免疫内耳疾患(ＡＩＥＤ)、自己免疫聴力障害、眼球クローヌス筋硬直徴候(ＯＭＳ)、多発性軟骨炎、例として、抵抗性又は再発性多発性軟骨炎、肺胞状蛋白症、アミロイドーシス、強膜炎、非癌性リンパ球増多症、一次リンパ球増多症、これにはモノクローナルＢ細胞リンパ球増多症(例えば良性モノクローナル免疫グロブリン症及び未同定の有意なモノクローナル免疫グロブリン血症(monoclonal gammopathy of undetermined significance)、ＭＧＵＳ)が含まれる、末梢性神経障害、腫瘍随伴症候群、チャネル病、例として、癲癇、片頭痛、不整脈、筋疾患、難聴、盲目、周期性麻痺及びＣＮＳのチャネル病、自閉症、炎症性ミオパシ、局所性分節性糸球体硬化症(ＦＳＧＳ)、内分泌性眼障害、ブドウ膜網膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫性肝臓病、線維症、多内分泌性不全、シュミット症候群、副腎炎、胃萎縮、初老期痴呆、脱髄性疾患、例として自己免疫脱髄性病、糖尿病性ネフロパシ、ドレスラー症候群、円形脱毛症、ＣＲＥＳＴ症候群(石灰沈着、レイノー現象、食道運動障害、強指症及び毛細管拡張症)、雌雄自己免疫性不妊性、混合性結合組織病、シャーガス病、リウマチ熱、再発性中絶、農夫肺、多形性紅斑、心切開術後症候群、クッシング症候群、愛鳥家肺、アレルギー性肉芽腫性脈管炎、良性リンパ球血管炎、アルポート症候群、肺胞炎、例えばアレルギー性肺胞炎及び繊維化肺胞炎、間隙肺疾患、輸血反応、ハンセン病、マラリア、リーシュマニア症、キパノソミアシス(kypanosomiasis)、住血吸虫症、蛔虫症、アスペルギルス症、サンプター症候群、カプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維形成、広汎性間質性肺線維形成、間質性肺線維形成、特発性の肺線維形成、嚢胞性線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、胎児赤芽球症、好酸性筋膜炎(eosinophilic faciitis)、シャルマン症候群、フェルティー症候群、フィラリア(flariasis)、毛様体炎、例えば慢性毛様体炎、ヘテロ慢性毛様体炎、虹彩毛様体炎、又はＦｕｃｈの毛様体炎)、ヘーノホ-シェーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)感染、エコーウィルス感染、心筋症、アルツハイマー病、パルボウィルス感染、風疹ウィルス感染、種痘後症候群、先天性風疹感染、エプスタインバーウイルス感染、耳下腺炎、エヴァンの症候群、自己免疫性腺機能不全、シドナム舞踏病、連鎖球菌感染後腎炎、閉塞性血栓性血管炎(thromboangitis ubiterans)、甲状腺中毒症、脊髄癆、脈絡膜炎、巨細胞多発性筋痛、内分泌性眼障害、慢性過敏性肺炎、乾性角結膜炎、流行性角結膜炎、特発性腎臓症候群、微小変化ネフロパシ、良性家族性及び乏血-再灌流障害、網膜自己免疫、関節炎症、気管支炎、慢性閉塞性気道疾患、珪肺症、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化症疾患、アスペルミオジェネース(aspermiogenese)、自己免疫性溶血、ベック病、クリオグロブリン血症、デュピュイトラン拘縮、水晶体過敏性眼内炎、腸炎アレルギー、結節性紅斑、leprosum、特発性顔麻痺、慢性疲労症候群、リウマチ性熱、ハンマンリッチ病、感覚器性(sensoneural)聴力障害、血色素尿症発作(haemoglobinuria paroxysmatica)、性機能低下、回腸炎領域、白血球減少症、単核細胞増加症感染、横移動脊髄炎、一次特発性の粘液水腫、ネフローゼ、眼炎symphatica、精巣炎肉芽腫症、膵炎、多発性神経根炎急性、膿皮症壊疽、Ｑｕｅｒｖａｉｎ甲状腺炎、後天性脾臓萎縮、抗精子抗体による不妊性、非悪性胸腺腫、白斑、ＳＣＩＤ及びエプスタインバーウイルス関連疾患、後天性免疫不全症候群(エイズ)、寄生虫病、例えばLesihmania、毒性ショック症候群、食中毒、Ｔ細胞の浸潤を伴う症状、白血球-粘着力欠損、サイトカイン及びＴリンパ球に媒介される急性及び遅発性過敏症関連免疫応答、白血球血管外遊出を伴う疾患、多器官損傷症候群、抗原-抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、アレルギー性神経炎、自己免疫多腺性内分泌障害、卵巣炎、原発性粘液水腫、自己免疫萎縮性胃炎、交感性眼炎、リウマチ性疾患、混合性結合組織病、ネフローゼ症候群、膵島炎、多内分泌性不全、末梢性神経障害、自己免疫多腺性症候群Ｉ型、成人発症型特発性副甲状腺機能低下症(ＡＯＩＨ)、完全脱毛症、拡張型心筋症、後天性表皮水疱症(ＥＢＡ)、ヘモクロマトーシス、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性又は非化膿性副鼻腔炎、急性又は慢性副鼻腔炎、篩骨、正面、上顎骨又は蝶形骨副鼻腔炎、好酸球性関連疾患、例えば好酸球増加症、肺浸潤好酸球増加症、好酸球増加症-筋肉痛症候群、レフラー症候群、慢性好酸性肺炎、熱帯肺好酸球増加症、気管支肺炎アスペルギルス症、アスペルギローム又は好酸球性を含有する肉芽腫、アナフィラキシー、血清陰性脊椎関節炎疹、多内分泌性自己免疫性疾患、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性皮膚粘膜カンジダ症、ブラットン症候群、乳児期の一過性低ガンマグロブリン血症、ウィスコット‐アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症候群、膠原病と関係する自己免疫疾患、リウマチ、神経病学的疾患、虚血性再灌流障害、血圧応答の減退、血管機能不全、antgiectasis、組織損傷、心血管乏血、痛覚過敏、脳虚血、及び脈管化を伴う疾患、アレルギー性過敏症疾患、糸球体腎炎、再灌流障害、心
筋又は他の組織の再灌流損傷、急性炎症性成分を有する皮膚病、急性化膿性髄膜炎又は他の中枢神経系炎症性疾患、眼性及び眼窩の炎症性疾患、顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘発性毒性、急性重症炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、肺線維症、糖尿病性網膜症、糖尿病性大動脈疾患、動脈内過形成、消化性潰瘍、弁膜炎、及び子宮内膜症などがある。

ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｒａ^２２３、Ｐ^３２及びＬｕの放射性同位体）、化学治療薬、例としてメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド(ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロランブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤、酵素及びその断片、例えば核溶解性酵素、抗生物質、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、そしてここに開示する種々の抗腫瘍剤、抗癌剤および化学療法剤を含むように意図されている。他の細胞障害性薬が下記に記載されている。殺腫瘍性剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。

「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロスホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethiylenethiophosphoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins）(特にブラタシン(bullatacin)及びブラタシノン(bullatacinone)）；δ-９-テトラヒドロカンナビノール(ドロナビノール、MARINOL(登録商標))；β-ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトセシン(合成類似体トポテカン(topotecan)(HYCAMTIN(登録商標))、ＣＰＴ-１１(イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標))、アセチルカンプトテシン(acetylcamptothecin)、スコポレクチン(scopolectin)、及び９-アミノカンプトテシン(9-aminocamptothecin)を含む）；ブリオスタチン；カリスタチン(callystatin）；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)及びバイゼレシン(bizelesin)合成類似体を含む)；ポドフィリン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン(cryptophycin)(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン(dolastatin）；デュオカルマイシン(duocarmycin ）（合成類似体、KW-2189及びCB1-TM1を含む）；エレトロビン(eleutherobin）；パンクラチスタチン(pancratistatin）；サルコディクチン(sarcodictyin）；スポンジスタチン(spongistatin）；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、ラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質（例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンガンマ１Ｉ、例えば、Agnew Chem Intl. Ed. Engl., 33：183-186(1994)を参照のこと；ダイネミシンＡ(dynemicinＡ）を含むダイネミシン(dynemicin）；エスペラマイシン(esperamicin）；同様にネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団）、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin）、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin）、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ADRIAMYCIN(登録商標)ドキソルビシン (モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin）、イダルビシン、マセロマイシン(marcellomycin）、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン(mitomycins）、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ）などの抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル(eniluracil)；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン(lonidainine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン(ansamitocin)のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダンモール(mopidanmol)；ニトラエリン(nitraerine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン(losoxantrone)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリデンＡ(roridin A)及びアングイデン(anguidine)）；ウレタン；ビンデシン(ELDISINE(登録商標)、FILDESIN(登録商標))；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ara-C」）；チオテパ；タキソイド、例えばタキソール(登録商標)パクリタキセル、（Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）、ABRAXANE^TM クレモフォール(Cremophor)を含まない、アルブミン設計のナノ粒子形状のパクリタキセル(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)及びタキソテア(登録商標）ドキセタキセル、（Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；GEMZAR(登録商標)ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン(VELBAN(登録商標))；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン(ONCOVIN(登録商標))；オキサリプラチン；ロイコボリン；NAVELBINE(登録商標)ビノレルビン；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド類；カペシタビン(capecitabine)(XELODA(登録商標))；上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体；並びに、上記のうちの２以上の組合せ、例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニソロンの併用治療の略記号であるCHOP、及び５-ＦＵとロイコボリン(leucovovin)と組み合わされるオキサリプラチン(ELOXATINTM)による治療投薬計画の略記号であるFOLFOXが含まれる。

また、癌の成長を促進しうるホルモンの影響を調節、低減、阻止(ブロック)又は阻害するように作用し、たびたび全身性、又は全身治療の形態にある抗ホルモン剤もこの定義に含まれる。これらはホルモン類自体でもよい。例として、抗卵胞ホルモン類及び、選択的なエストロゲンレセプターモジュレータ類(ＳＥＲＭ)、例えば、タモキシフェン(NOLVADEX(登録商標)タモキシフェン)、EVISTA(登録商標)ラロキシフェン、ドロロキシフェン(droloxifene)、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、LY117018、オナプリストン及びFARESTON(登録商標)トレミフェン、抗プロゲステロン類、エストロゲンレセプター下方制御因子(ＥＲＤ)、卵巣を抑制するか又は一時停止させるように機能する薬剤、例えば、黄体形成ホルモン放出ホルモン(ＬＨＲＨ)アゴニスト、例えば、LUPRON(登録商標)及びELIGARD(登録商標)酢酸ロイプロリド、ゴセレリンアセテート、ブセレリンアセテート及びトリプトレリン(tripterelin)、他の抗アンドロゲン類、例えばフルタミド、ニルタミド及びビカルタミド、及び、副腎のエストロゲン産生を制御する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害薬、例として、例えば４(５)-イミダゾール、アミノグルテチミド、MEGASE(登録商標)メゲストロールアセテート、AROMASIN(登録商標) エキセメスタン、ホルメスタン、ファドロゾール、RIVISOR(登録商標) ボロゾール、FEMARA(登録商標) レトロゾール及びARIMIDEX(登録商標) アナストロゾールなどがある。加えて、化学療法剤のこのような定義には、ビスホスホネート、例えばクロドロン酸(例えば、BONEFOS(登録商標)又はOSTAC(登録商標))、DIDROCAL(登録商標)エチドロン酸、NE-58095、ZOMETA(登録商標) ゾレドロン酸／ゾレドロネート、FOSAMAX(登録商標)アレンドロネート、AREDIA(登録商標)パミドロン酸、SKELID(登録商標) チルドロン酸又はACTONEL(登録商標)、リセドロン酸、並びにトロキサチタビン(troxacitabine)(1,3-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)、アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に関係するシグナル伝達経路の遺伝子の発現を阻害するもの、例として、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｆ、Ｈ-Ｒａｓ及び上皮性成長因子レセプター(ＥＧＦ-Ｒ)、ワクチン、例えばTHERATOPE(登録商標)ワクチン及び遺伝子治療ワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン及びVAXID(登録商標)ワクチン、LURTOTECAN(登録商標)トポイソメラーゼ１インヒビター、ABARELIX(登録商標) ｒｍＲＨ、ラパチニブジトシラート(ＥｒｂＢ-２及びＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子インヒビター、GW572016とも称される)、及び、上記の何れかの薬学的に受容可能な塩類、酸又は誘導体が含まれる。

ここで用いられる際の「増殖阻害剤」は、細胞の増殖をインビトロ又はインビボの何れかで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、増殖阻害剤は、Ｓ期でＨｉｐ発現細胞の割合を有意に減少させるものである。増殖阻害剤の例は、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス（例えばビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン類、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。タキサン類（パクリタキセル及びドセタキセル）は、共にイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（TAXOTERE（登録商標）、ローン・プーラン ローラー）は、パクリタキセル（TAXOL（登録商標）、ブリストル-マイヤー スクウィブ）の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、細胞の有糸分裂を阻害する結果となる脱重合を防ぐことによって微小管を安定化にする。

ここで用いる「抗癌療法」は、被検体の癌を低減するか又は阻害する処置を指す。抗癌療法の例には、細胞障害性放射線療法、並びに細胞障害性剤、化学療法剤、増殖阻害性剤、癌ワクチン、脈管形成インヒビター、プロドラッグ、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、副腎皮質ステロイド、免疫抑制因子、制吐剤、抗体ないし抗体断片又は鎮痛剤の治療上の有効量の被検体への投与が含まれる。

この出願で用いられる用語「プロドラッグ」なる用語は、親薬剤と比較して腫瘍細胞に対する細胞障害性が低く、酵素的に活性化又はより活性な親形態に変換されうる薬学的に活性な物質の前駆体又は誘導体の形態を指す。例として、Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986)およびStella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985)を参照のこと。プロドラッグには、限定するものではないが、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ-アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β-ラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ、又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５-フルオロシトシン及び他の５-フルオロウリジンプロドラッグを含む。限定はしないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞障害性剤の例には、前記の化学療法剤が含まれる。

「サイトカイン」なる用語は、一つの細胞集団から放出され、他の細胞に細胞間メディエータとして作用するタンパク質の一般用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インシュリン；プロインシュリン；レラキシン；プロレラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体化ホルモン（ＬＨ）；上皮性増殖因子（ＥＧＦ）；肝臓成長因子；線維芽成長因子（ＦＧＦ）；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミューラー阻害因子；マウス生殖腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ-β等の神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-β等のトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦｓ）；インシュリン様成長因子-Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘発因子；インターフェロン-α、-β、及び-γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えばマクロファージ-ＣＳＦ（Ｍ-ＣＳＦ）；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ（ＧＭ-ＣＳＦ）；及び顆粒球-ＣＳＦ（Ｇ-ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬｓ）、例えばＩＬ-１、ＩＬ-１α、ＩＬ-１β、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１０、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２、ＩＬ-１８；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ-α及びＴＮＦ-β；及びＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子である。ここで用いられる際、用語サイトカインには、天然供給源から、又は組換え細胞培養からのタンパク質、及び天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物が含まれる。

「サイトカインアンタゴニスト」とは、少なくとも一のサイトカインの生物学的活性を一部又は完全に遮断、阻害、又は中和する分子を意味する。例えば、サイトカインアンタゴニストは、サイトカイン発現および／または分泌を阻害することによって、または、サイトカイン又はサイトカインレセプターに結合することによってサイトカイン活性を阻害してよい。サイトカインアンタゴニストには、抗体、合成又は天然の配列ペプチド、イムノアドヘシン、及びサイトカイン又はサイトカインレセプターに結合する小分子アンタゴニストが含まれる。サイトカインアンタゴニストは場合によって、細胞障害性剤とコンジュゲートされるか又は融合される。例示的なＴＮＦアンタゴニストは、エタネルセプト(ＥＮＢＲＥＬ(登録商標))、インフリキシマブ(ＲＥＭＩＣＡＤＥ(登録商標))およびアダリムマブ(ＨＵＭＩＲＡ^ＴＭ)である。

本明細書中で用いる「免疫抑制剤」なる用語は、治療される被検体の免疫系を抑制するか又は隠すために作用する物質を指す。これには、サイトカイン産生を抑制する物質、自己抗原発現を下方制御は又は抑制する物質、又は、ＭＨＣ抗原をマスキングする物質が含まれる。免疫抑制剤の例には、２-アミノ-６-アリル-５-置換ピリミジン(米国特許第４６６５０７７号を参照)；ミコフェノール酸モフェチル、例えばＣＥＬＬＣＥＰＴ(登録商標)；アザチオプリン(ＩＭＵＲＡＮ(登録商標)、ＡＺＡＳＡＮ(登録商標)／６‐メルカプトプリン；ブロモクリプチン；ダナゾール；ダプソン；グルタールアルデヒド(米国特許第４１２０６４９号に記載のように、ＭＨＣ抗原をマスキングするもの)；ＭＨＣ抗原およびＭＨＣ断片のための抗イディオタイプ抗体；サイクロスポリンＡ；副腎皮質ステロイドおよび糖質コルチコイドといったステロイド、例えばプレドニゾン、プレドニソロン、例えばＰＥＤＩＡＰＲＥＤ(登録商標)(プレドニソロンリン酸ナトリウム)又はＯＲＡＰＲＥＤ(登録商標)(プレドニソロンリン酸ナトリウム経口溶液)、メチルプレドニゾロンおよびデキサメサゾン；メトトレキセート(経口又は皮下)(ＲＨＥＵＭＡＴＲＥＸ(登録商標)、ＴＲＥＸＡＬＬ^ＴＭ)；ヒドロキシクロロキン／クロロキン；スルファサラジン；レフルノミド；サイトカイン又はサイトカインレセプターアンタゴニスト、例として抗インターフェロン-γ、-β、又は-α抗体、抗腫瘍壊死因子-α抗体(インフリキシマブ又はアダリムマブ)、抗ＴＮＦαイムノアドヘシン(ＥＮＢＲＥＬ(登録商標)、エタネルセプト)、抗腫瘍壊死因子-β抗体、抗インターロイキン２抗体、及び抗ＩＬ−２レセプター抗体；抗ＣＤ１１ａおよび抗ＣＤ１８抗体を含む抗ＬＦＡ-１抗体；抗Ｌ３Ｔ４抗体；異種性抗リンパ球グロブリン；ポリクローナル又はパンＴ抗体、又はモノクローナル抗ＣＤ3又は抗ＣＤ４／ＣＤ4ａ抗体；ＬＦＡ-３結合ドメインを含む可溶性ペプチド(１９９０年７月２６日公開の国際公開１９９０／０８１８７)；ストレプトキナーゼ；ＴＧＦ-β；ストレプトドルナーゼ；宿主のＲＮＡ又はＤＮＡ；ＦＫ５０６；ＲＳ-６１４４３；デオキシスペルグアリン；ラパマイシン；Ｔ細胞レセプター(Cohen et al.、米国特許第５１１４７２１号)；Ｔ細胞レセプター断片(Offner et al. Science, 251: 430-432 (1991)；国際公開１９９０／１１２９４；Ianeway, Nature, 341: 482 (1989)；及び国際公開１９９１／０１１３３)；Ｔ１０Ｂ９といったＴ細胞レセプター抗体(欧州特許第３４０１０９号)；シクロホスファミド(ＣＹＴＯＸＡＮ(登録商標))；ダプソン；ペニシラミン(ＣＵＰＲＩＭＩＮＥ(登録商標))；血漿交換；または、静脈免疫グロブリン(ＩＶＩＧ)が含まれる。これらは単独で用いられても、互いに、特にステロイド及び他の免疫抑制剤との組合せ、又はこの組合せの後にステロイドの必要性を低減するために維持用量の非ステロイド剤を組み合わせて用いられてもよい。

「鎮痛剤」は、被検体の痛みを阻害するかまたは抑制するために作用する薬剤を指す。例示的な鎮痛剤には、非ステロイド系抗炎症薬(ＮＳＡＩＤ)、例えばイブプロフェン(ＭＯＴＲＩＮ(登録商標))、ナプロキセン(ＮＡＰＲＯＳＹＮ(登録商標))、アセチルサリチル酸、インドメタシン、スリンダクおよびトルメチン、これらの塩類及び誘導体、並びに、生じうる鋭い痛みを低減するために用いられる様々な他の医薬、例えば抗痙攣剤(ガバペンチン、ｐｈｅｎｙｌｏｉｎ、カルバマゼピン)又は三環系抗鬱薬が含まれる。具体例には、アセトアミノフェン、アスピリン、アミトリプチリン(ＥＬＡＶＩＬ(登録商標))、カルバマゼピン(ＴＥＧＲＥＴＯＬ(登録商標))、ｐｈｅｎｙｌｔｏｉｎ(ＤＩＬＡＮＴＩＮ(登録商標))、ガバペンチン(ＮＥＵＲＯＮＴＩＮ(登録商標))、(Ｅ)-Ｎ−バニリル−８−メチル−６−ノネアミド(ＣＡＰＳＡＩＣＩＮ(登録商標))又は神経遮断薬が含まれる。
「副腎皮質ステロイド」は、天然に生じる副腎皮質ステロイドの効果を模倣するかあるいは増大するステロイドの一般的な化学構造を有するいくつかの合成又は天然に生じる物質の何れか一つを指す。合成副腎皮質ステロイドの例として、プレドニゾン、プレドニゾロン(メチルプレドニゾロンを含む)、デキサメサゾン、トリアムシノロン及びベタメサゾンが含まれる。

ここで用いる「癌ワクチン」は、癌に対して被検体において免疫応答を刺激する組成物である。癌ワクチンは典型的に、抗原に対して免疫応答を更に刺激してブーストする他の構成成分(例えばアジュバント)とともに、被検体に対して自己由来性(自己から)又は同種異系性(他から)である癌関連の物質又は細胞(抗原)の供与源からなる。癌ワクチンにより望ましくは、被検体の免疫系が刺激され、１又はいくつかの特異的抗原に対して抗体が産生され、および／またはそれらの抗原を有する癌細胞を攻撃するためにキラーＴ細胞が産生される。

ここで用いる「細胞障害性放射線療法」は、細胞の機能を阻害又は予防し、および／または細胞の破壊を引き起こす放射線療法を指す。放射線療法には、例えば、外的光線照射又は抗体などの放射性標識した薬剤による療法が含まれうる。この用語は、放射性同位体(例えばＡｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｒａ^２２３、Ｐ^３２およびＬｕの放射性同位体)の使用を含むことを目的とする。

「被検体」は、脊椎動物、例として哺乳動物、例えばヒトである。哺乳動物には、家畜（例えばウシ）、スポーツ用動物、愛玩動物（例えばネコ、イヌおよびウマ）、霊長類、マウスおよびラットが含まれるが、これらに限定されない。

文脈により特に指示がある場合を除き、用語「第一の」ポリペプチド及び「第二の」ポリペプチド、及びその変形は単に汎用的な識別子であり、本発明の抗体の特異的又は特定のポリペプチド又は成分を識別していると取られるべきではない。

実施例において示す市販の試薬は、特に明記しない限り製造業者の指示に従って使用した。以下の実施例及び明細書全体にわたってＡＴＣＣ受託番号によって識別される細胞の供与源は、American Type Culture Collection, Manassas, VAである。特に明記しない限り、本発明は、組換えＤＮＡ技術の標準的な手順を用いる。これらは本明細書中及び以下のテキストに記載される。上掲のSambrook et al.；Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989)；Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc.: N.Y., 1990)；Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, 1988)；Gait, Oligonucleotide Synthesis (IRL Press: Oxford, 1984)；Freshney, Animal Cell Culture, 1987；Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991。

本明細書及び特許請求の範囲全体を通して、「含む」なる語彙、又は「含む」ないし「含んでいる」の変形型は、定めた完全体又は完全体の群を包含するもので、任意の他の完全体又は完全体の群を除外するものではない。

ＩＩ．ヘテロ多量体タンパク質の構築
一般的に、本明細書に記載されるヘテロ多量体タンパク質は、抗体のFc領域の大部分を含む。しかし、他の態様では、重鎖はC_H1, C_H2ドメイン及び／又はC_H3ドメインの部分のみを含む。

ヘテロ多量体化ドメイン
ヘテロ多量体タンパク質は、ヘテロ多量体化ドメインを含む。ヘテロ二量体分子の実質的に均一な集団を生成するため、ヘテロ二量体化ドメインは、ホモ二量体よりもヘテロ二量体を形成について強い優先度を持っている必要がある。本明細書に例示されるヘテロ多量体タンパク質は、ヘテロ二量体化を容易にするためノブ・イントゥー・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）技術を用いるが、当業者は、本発明において有用な他のヘテロ二量体化ドメインを認識するであろう。

ノブ・イントゥー・ホール
多重特異性抗体を産生する方法としてのノブ・イントゥー・ホールの使用は当技術分野でよく知られている。Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈに割り当てられ、１９９８年３月２４日に付与された米国特許第５７３１１６８号、Ａｍｇｅｎに割り当てられ、２００９年７月１６日に付与されたＰＣＴ公開国際公開第２００９０８９００４号、及びＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓに割り当てられ、２００９年７月１６日に公開された米国特許出願公開第２００９０１８２１２７号を参照。また、Marvin and Zhu, Acta Pharmacologica Sincia (2005) 26(6):649-658及びKontermann (2005) Acta Pharmacol. Sin., 26:1-9を参照。簡潔な議論がここに提供される。

「突起」とは、ヘテロ多量体を安定させ、それによって、例えばホモ多量体形成よりもヘテロ多量体形成を支持するように、第一のポリペプチドの界面から突き出し、従って隣接界面（即ち、第二のポリペプチドの界面）の代償空洞内に配置可能である少なくとも一つのアミノ酸側鎖を指す。突起は、元の界面に存在し得るか又は（例えば界面をコードする核酸を変更することで）合成的に導入することができる。通常は、第１のポリペプチドの界面をコードする核酸は、突起をコード化するために変更される。これを達成するために、第一のポリペプチドの界面において少なくとも一の「元の」アミノ酸残基をコードする核酸が、元のアミノ酸残基より大きい側鎖体積を有する少なくとも一つの「移入」アミノ酸残基をコードする核酸に置換される。複数の元の残基及びそれに対応する移入残基が存在し得ることが理解されるであろう。置換される元の残基の数の上限は、第一のポリペプチドの界面における残基の総数である。種々のアミノ酸残基の側鎖の体積を以下の表に示す。

突起の形成に好適な輸入残基は、一般に、天然に生じるアミノ酸残基であり、好ましくはアルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）から選択される。最も好ましいのは、トリプトファンとチロシンである。一実施態様において、突起の形成のための元の残基は、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、トレオニン又はバリンなど小さな側鎖の体積を有する。

「空洞（ｃａｖｉｔｙ）」は、第二のポリペプチドの界面から窪み、従って、第一のポリペプチドの隣接界面上の対応する突起を収容する少なくとも一つのアミノ酸側鎖を指す。空洞は、元の界面に存在し得るか又は（例えば界面をコードする核酸を変更することで）合成的に導入することができる。通常は、第二のポリペプチドの界面をコードする核酸が、空洞をコード化するために変更される。これを達成するために、第二のポリペプチドの界面において少なくとも一の「元の」アミノ酸残基をコードする核酸が、元のアミノ酸残基より小さい側鎖体積を有する少なくとも一つの「移入」アミノ酸残基をコードするＤＮＡに置換される。複数の元の残基及びそれに対応する移入残基が存在し得ることが理解されるであろう。置換される元の残基の数の上限は、第二のポリペプチドの界面における残基の総数である。種々のアミノ酸残基の側鎖の体積を上の表１に示す。空洞の形成に好適な輸入残基は、一般に、天然に生じるアミノ酸残基であり、好ましくはアラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）及びバリン（Ｖ）から選択される。最も好ましいのは、セリン、アラニン又はスレオニンである。一実施態様において、空洞の形成のための元の残基は、チロシン、アルギニン、フェニルアラニン又はトリプトファンなど大きな側鎖の体積を有する。

「元の」のアミノ酸残基は、元の残基より小さいか又は大きい側鎖の体積を持つことができる「移入」残基で置換されているものである。移入アミノ酸残基は、天然に生じるアミノ基残基か又は非天然型アミノ酸残基であり得るが、好ましくは前者である。「天然に生じる」アミノ基残基は、遺伝子コードによりコード化され、上記の表１に記載されているものである。「非天然型」アミノ酸残基とは、遺伝コードによってコード化されていないが、ポリペプチド鎖中で隣接するアミノ酸残基に共有結合することができる残基を意味する。非天然型アミノ酸残基の例としては、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、及び他のアミノ酸残基アナログ、例えば、Ellman et al., Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)に記載されるものなどである。非天然型アミノ酸残基を生成するために、Noren et al. Science 244: 182 (1989)及び上掲のEllman et al.,の手順を使用することができる。簡潔には、これは非天然型アミノ酸残基でサプレッサーｔＲＮＡを化学的に活性化し、続くインビトロでのＲＮＡの転写及び翻訳を含む。本発明の方法は、少なくとも一つの元のアミノ酸残基の置換を含むが、複数の元の残基を置換することができる。通常、第一又は第二のポリペプチドの界面における全残基だけが、置換される元のアミノ酸残基を含む。典型的には、置換される元の残基は「埋没」されている。「埋没」とは、残基が溶剤に本質的に接近不能であることを意味する。一般的に、移入残基は、酸化の可能性又はジスルフィド結合の誤対合を防止するために、システインではない。

突起は、空洞内に「配置することが可能」であり、このことは、第一ポリペプチド及び第二ポリペプチドのそれぞれの界面上の突起と空洞の空間的位置、及びその突起と空洞の大きさが、界面での第一ポリペプチド及び第二ポリペプチドの正常な会合を著しくを乱すことなく、その突起が空洞中に配置され得るようなものであることを意味している。Ｔｙｒ、Ｐｈｅ及びＴｒｐなどの突起は通常、界面の軸から垂直に延びておらず、好適なコンフォメーションをとっていないので、対応する空洞と突起の位置合わせは、Ｘ線結晶構造解析又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）により得られたものなど三次元構造に基づく突起／空洞の対のモデリングに依存している。このことは、当該技術分野において広く受け入れられている技術を用いて達成することができる。

「元の又は鋳型核酸」とは、突起又は空洞をコードするため、「改変」されうる（すなわち、遺伝子操作され又は変異され得る）目的のポリペプチドをコードする核酸を意味する。元の又は出発核酸は、天然に存在する核酸であってもよいし、又は事前の改変が施されている核酸（ヒト化抗体断片など）を含んでもよい。核酸を「改変する」とは、目的のアミノ基残基をコード化する少なくとも一のコドンの挿入、欠失、又は置換により元の核酸が変異されることを意味する。通常は、元の残基をコードするコドンは、移入残基をコード化するコドンに置換される。この方法により遺伝子的にＤＮＡを修飾するための技法がMutagenesis: a Practical Approach, M.J. McPherson, Ed., (IRL Press, Oxford, UK. (1991)に概説されており、例えば、部位特異的変異誘発、カセット変異導入、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）変異を含む。元の/鋳型核酸を変異させることにより、元の/鋳型核酸によってコードされた元の/鋳型ポリペプチドが、従ってそれに応じて改変される。

突起又は空洞は、合成手段によって、例えば、インビトロペプチド合成、ペプチドの酵素的又は化学的カップリング又はこれらの技術のある組合わせによる、先に説明した非天然型アミノ基残基を導入するための技術によって、第一又は第二ポリペプチドの界面に「導入」することができる。従って、「導入」されている突起又は空洞は、「非天然型」又は「非天然」 であり、このことは、それが自然の中で、または元のポリペプチドにおいて存在しないことを意味する（例えば、ヒト化モノクローナル抗体）。

一般的に、突起を形成するための移入アミノ酸残基は、 比較的少数の「回転異性体」を持っている（例えば、約３から６）。「回転異性体」はエネルギー的に好都合なアミノ酸側鎖のコンフォメーションである。様々なアミノ基残基の回転異性体の数は、Ponders and Richards, J. Mol. Biol. 193: 775-791 (1987)に総説されている。

ＩＩＩ．ベクター、宿主細胞及び組換え方法
本発明のヘテロ多量体タンパク質（例えば、抗体）の組み換え生成のために、コードする核酸を単離して、更なるクローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製ベクターに挿入する。抗体をコードするＤＮＡは従来の手順で簡単に単離し、配列決定される（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）。多くのベクターが利用可能である。用いる宿主細胞にある程度依存してベクターを選択する。一般的に、好適な宿主細胞は原核生物又は真核生物（一般的に哺乳動物であるが、菌類（例えば酵母）、昆虫、植物、および他の多細胞微生物の有核細胞）由来の細胞である。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ定常領域を含め、任意のアイソタイプの定常領域がこの目的のために使われてもよく、このような定常領域はヒト又は動物種の何れかから得られうることは理解されるであろう。

ａ．核生物の宿主細胞を用いたヘテロ多量体タンパク質の産生
ｉ．ベクター構築
本発明のヘテロ多量体タンパク質（例えば、抗体）のポリペプチド成分をコードしているポリヌクレオチド配列は標準的な組換え技術を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列は、例えば、ハイブリドーマ細胞のような抗体産生細胞から単離し配列決定することができる。あるいは、ポリヌクレオチドはヌクレオチド合成機又はＰＣＲ法を使用して合成することができる。ひとたび得られると、ポリペプチドをコードしている配列は原核生物宿主中で異種ポリヌクレオチドを複製し、発現することが可能な組換えベクター中に挿入される。当該分野において入手でき知られている多くのベクターを本発明の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主として、ベクターに挿入される核酸のサイズとベクターで形質転換される特定の宿主に依存する。各ベクターは、機能(異種性ポリヌクレオチドの増幅又は発現ないしその両方)及び属する特定の宿主細胞への適合性に応じて、様々な成分を含む。一般的に、限定するものではないが、ベクター成分には複製起源、選択マーカー遺伝子、プロモータ、リボゾーム結合部位(ＲＢＳ)、シグナル配列、異種性核酸挿入及び転写終末配列が含まれる。

一般には、レプリコン及び宿主細胞と適合性のある種に由来するコントロール配列を含んでいるプラスミドベクターが、宿主細胞と関連して使用される。そのベクターは、通常、複製開始点並びに形質転換細胞において表現型の選択を提供可能なマーキング配列を有する。例えば、一般的に大腸菌は、大腸菌種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換する。ｐＢＲ３２２はアンピシリン(Ａｍｐ)及びテトラサイクリン(Ｔｅｔ)耐性のコード遺伝子を含んでいるため、形質転換細胞を容易に同定することができる。ｐＢＲ３２２、その誘導体又は他の微生物プラスミド又はバクテリオファージも外来性タンパク質を発現する微生物によって使用可能なプロモータを含むか、含むように変更される。特定の抗体の発現に使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例はCarter等の米国特許第５６４８２３７号に詳細に記載されている。

また、レプリコン及び宿主微生物と適合性のあるコントロール配列を含んでいるファージベクターを、これらの宿主との関連でトランスフォーミングベクターとして使用することができる。例えば、λＧＥＭ.ＴＭ.-１１のようなバクテリオファージを、大腸菌ＬＥ３９２のような感受性の宿主細胞を形質転換するために使用できる組換えベクターを作製する際に利用することができる。

本発明の発現ベクターは各ポリペプチド成分をコードする２又はそれ以上のプロモータ−シストロン(翻訳単位)対を含みうる。プロモーターはその発現を調節するシストロンの上流(５')に位置している非翻訳配列である。原核生物のプロモーターは典型的には誘導性と構成的との二つのクラスのものがある。誘導性プロモーターは、例えば栄養分の有無又は温度の変化のような、培養条件の変化に応答してその調節下でシストロンの転写レベルを増大させるように誘導するプロモーターである。

様々な潜在的宿主細胞によって認識されるプロモータが非常にたくさん公知となっている。選択したプロモーターを、制限酵素消化によって供給源ＤＮＡからプロモータを除去し、本発明のベクター内に単離したプロモータを挿入することによって、例えば、軽鎖又は重鎖をコードするシストロンＤＮＡに作用可能に連結することができる。天然プロモーター配列と多くの異種プロモーターの双方を、標的遺伝子の増幅及び／又は発現を生じさせるために使用することができる。ある実施態様では、天然の標的ポリペプチドプロモーターと比較して、一般的に発現する標的遺伝子をより多く転写させ、効率をよくするので、異種プロモーターが有用である。

原核生物宿主での使用に好適なプロモーターには、ＰｈｏＡプロモーター、βガラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃ又はｔｒｃプロモーターが含まれる。しかし、細菌中で機能性である他のプロモーター(例えば他の既知の細菌又はファージプロモーター)も好適である。そのヌクレオチド配列は発表されており、よって当業者は、任意の必要とされる制限部位を供給するリンカー又はアダプターを使用して標的軽鎖及び重鎖をコードするシストロンにそれらを操作可能に結合させることができる(Siebenlist等 (1980) Cell 20:269)。

本発明の一態様では、組換えベクター内の各シストロンは、膜を貫通して発現されるポリペプチドの転写を誘導する分泌シグナル配列成分を含む。一般に、シグナル配列はベクターの成分でありうるか、ベクター中に挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部でありうる。この発明の目的のために選択されるシグナル配列は宿主細胞によって認識されプロセシングされる(つまりシグナルペプチダーゼにより切断される)ものでなければならない。異種ポリペプチドに天然のシグナル配列を認識せずプロセシングする原核生物宿主細胞に対しては、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンＩＩ(ＳＴＩＩ)リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ及びＭＢＰからなる群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。一実施態様では、発現系の双方のシストロンに使用されるシグナル配列はＳＴＩＩシグナル配列又はその変異体である。

他の態様では、本発明による免疫グロブリンは宿主細胞の細胞質内で産生されるので、各シストロン内に分泌シグナル配列の存在は必要でない。この点において、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖は発現され、折り畳まれ、集合して細胞質内に機能的免疫グロブリンを形成する。ジスルフィド結合形成に好適な細胞質条件を示し、発現したタンパク質サブユニットを好適に折り畳み、集合することができる宿主系が存在する(例として大腸菌ｔｒｘＢ⁻系)。Proba及びPluckthun Gene, 159:203 (1995)を参照。

本発明のヘテロ多量体タンパク質（例えば、抗体）を発現するのに適した原核生物宿主細胞には、古細菌及び真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物が含まれる。有用な細菌の例には、エシェリキア属（例えば大腸菌）、バシラス属（例えば枯草菌）、エンテロバクター属、シュードモナス種（例えば緑膿菌）、ネズミチフス菌、霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、クレブシエラ属、プロテウス属、赤痢菌、根粒菌、ビトレオシラ（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ）又はパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）が含まれる。一実施態様では、グラム陰性菌が使用される。一実施態様では、大腸菌細胞が本発明の宿主として使用される。大腸菌株の例として、遺伝子型Ｗ３１１０ ΔｆｈｕＡ（ΔｔｏｎＡ） ｐｔｒ３ ｌａｃ Ｉｑ ｌａｃＬ８ ΔｏｍｐＴΔ（ｎｍｐｃ−ｆｅｐＥ） ｄｅｇＰ４１ ｋａｎ^Ｒを有する３３Ｄ３株（米国特許第５６３９６３５号）を含むＷ３１１０株 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), 1190-1219頁；ＡＴＣＣ寄託番号２７３２５）及びその誘導体が含まれる。また、大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）２９４（ＡＴＣＣ ３１４４６），大腸菌Ｂ，大腸菌_λ１７７６（ＡＴＣＣ ３１５３７）及び大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ ３１６０８）など、他の株及びその誘導体も好適である。一実施形態では、大腸菌ΔＬＰＰは、特定の使用を見いだしている。この例は限定的なものでなく例示的なものである。定義した遺伝子型を有する上記の何れかの細菌の誘導体の構築方法は当業者に公知であり、例として, Bass等, Proteins, 8:309-314 (1990)に記載されている。一般的に、細菌細胞中でのレプリコンの複製能を考慮して適した細菌を選択することが必要である。ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、又はｐＫＮ４１０のようなよく知られたプラスミドを使用してレプリコンを供給する場合、例えば、大腸菌、セラシア属、又はサルモネラ種を宿主として好適に用いることができる。典型的に、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌しなければならず、望ましくは更なるプロテアーゼインヒビターを細胞培養中に導入することができる。

ｉｉポリペプチドの産生
上述した発現ベクターで宿主細胞を形質転換又は形質移入し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように修飾された通常の栄養培地中で培養する。

形質転換とは、ＤＮＡを原核生物宿主中に導入し、そのＤＮＡを染色体外要素として、又は染色体組込みによって複製可能にすることを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換はそのような細胞に適した標準的技術を使用してなされる。塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は実質的な細胞壁障害を含む細菌細胞のために一般に使用される。形質転換のための他の方法はポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。さらに別の方法はエレクトロポレーションである。

本発明のポリペプチドを生産するために使用される原核生物細胞は当該分野で知られ、選択された宿主細胞の培養に適した培地中で増殖させられる。好適な培地の例には、ルリア培地(ＬＢ)プラス必須栄養分サプリメントが含まれる。ある実施態様では、培地は発現ベクターを含む原核生物細胞の増殖を選択的に可能にするために、発現ベクターの構成に基づいて選択される選択剤をまた含む。例えば、アンピシリンがアンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖用培地に加えられる。

炭素、窒素及び無機リン酸源の他に任意の必要なサプリメントを、単独で、又は複合窒素源のような他のサプリメント又は培地との混合物として導入される適切な濃度で含有させられうる。場合によっては、培養培地はグルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリトリトール及びジチオトレイトールからなる群から選択される一又は複数の還元剤を含みうる。

原核生物宿主細胞は適切な温度で培養される。例えば、大腸菌の増殖に対しては、好適な温度は約２０℃から約３９℃、より好ましくは約２５℃から約３７℃の範囲、更により好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは、主として宿主生物に応じて、約５から約９の範囲の任意のｐＨでありうる。大腸菌に対しては、ｐＨは好ましくは約６．８から約７．４、より好ましくは約７．０である。

本発明の発現ベクターに誘導性プロモータが用いられる場合、プロモータの活性に適する条件下でタンパク質発現を誘導する。本発明の一態様では、ポリペプチドの転写制御のためにＰｈｏＡプロモータが用いられる。したがって、形質転換した宿主細胞を誘導のためにリン酸限定培地で培養する。好ましくは、リン酸限定培地はＣ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である(例として、Simmons等, J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147を参照)。様々な他の誘導因子は用いるベクターコンストラクトに応じて当業者に知りうるように用いてよい。

一実施態様において、第一及び第二のヒンジ含有宿主細胞は別々に培養され、本発明による発現されたポリペプチドが宿主細胞のペリプラズム中に分泌され、別々に回収される。第二の実施態様において、第一及び第二のヒンジ含有宿主細胞は別々に培養され、ヒンジ含有ポリペプチドの単離の前に、２つの宿主細胞培養物は一緒に混合され、細胞をペレット化する。第三の実施態様において、第一及び第二のヒンジ含有宿主細胞は別々に培養され、遠心分離し、別々に再懸濁され、次いで、ヒンジ含有ポリペプチドの単離の前に一緒に混合される。第四の実施態様において、第一及び第二のヒンジ含有宿主細胞は同じ培養容器で一緒に培養される。タンパク質の回収は、一般的には浸透圧ショック、超音波処理又は溶解のような手段によって典型的には微生物を破壊することを含む。ひとたび細胞が破壊されると、細胞片又は全細胞を遠心分離又はろ過によって除去することができる。タンパク質は、例えばアフィニティー樹脂クロマトグラフィーによって更に精製することができる。あるいは、タンパク質は培養培地に輸送しそこで分離することができる。細胞を培養物から除去することができ、培養上清はろ過され、生成したタンパク質の更なる精製のために濃縮される。発現されたポリペプチドを更に単離し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(ＰＡＧＥ)及びウェスタンブロットアッセイ法のような一般的に知られている方法を使用して同定することができる。単離されたポリペプチドは、ヘテロ多量体タンパク質を産生するために使用されるであろう。

本発明の一態様では、ヘテロ多量体タンパク質（例えば、抗体）の産生は発酵法によって多量に受け継がれる。組換えタンパク質の生産には様々な大規模流加発酵法を利用することができる。大規模発酵は少なくとも１０００リットルの容量、好ましくは約１０００から１０００００リットルの容量である。これらの発酵槽は、酸素と栄養分、特にグルコース(好ましい炭素／エネルギー源)を分散させる撹拌翼を使用する。小規模発酵とは一般におよそ１００リットル以下の容積で、約１リットルから約１００リットルの範囲でありうる発酵槽での発酵を意味する。

発酵法では、タンパク質の発現の誘導は、典型的には、細胞が適切な条件下にて、初期定常期に細胞があるステージで、所望の密度、例えば約１８０−２２０のＯＤ_５５０まで増殖したところで開始される。当該分野で知られ上述されているように、用いられるベクターコンストラクトに応じて、様々なインデューサーを用いることができる。細胞を誘導前の短い時間の間、増殖させてもよい。細胞は通常約１２−５０時間の間、誘導されるが、更に長い又は短い誘導時間としてもよい。

本発明のポリペプチドの生産収量と品質を改善するために、様々な発酵条件を変更することができる。例えば、分泌されるヘテロ多量体タンパク質（例えば、抗体）の正しい組み立てとフォールディングを改善するために、例えばＤｓｂタンパク質(ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ及び／又はＤｓｂＧ)又はＦｋｐＡ(シャペロン活性を持つペプチジルプロピルシス、トランス-イソメラーゼ)のようなシャペロンタンパク質を過剰発現する更なるベクターを用いて宿主原核細胞を同時形質転換させることができる。シャペロンタンパク質は細菌宿主細胞中で生産される異種性タンパク質の適切な折り畳みと溶解性を容易にすることが実証されている。Chen等 (1999)J Bio Chem 274:19601-19605；Georgiou等, 米国特許第６０８３７１５号；Georgiou等, 米国特許第６０２７８８８号；Bothmann及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105；Ramm及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113；Arie等 (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210。

発現された異種タンパク質(特にタンパク分解を受けやすいもの)のタンパク質分解を最小にするために、タンパク質分解酵素を欠くある種の宿主株を本発明に用いることができる。例えば、原核生物宿主細胞株を改変して、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ及びその組合せのような既知の細菌プロテアーゼをコードしている遺伝子に遺伝子突然変異を生じさせることができる。幾つかの大腸菌プロテアーゼ欠損株が利用でき、例えば、上掲のJoly等 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2773-2777；Georgiou等, 米国特許第５２６４３６５号；Georgiou等, 米国特許第５５０８１９２号；Hara等 (1996) Microbial Drug Resistance 2:63-72に記載されている。

ある実施態様では、タンパク質溶解性酵素を欠損した、一以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換した大腸菌株を本発明の発現系の宿主細胞として用いる。第二の実施態様では、大腸菌株は、外膜のリポ蛋白質が欠損している（ΔLPP）。

ｉｉｉ．ヘテロ多量体タンパク質の精製
一実施態様において、本明細書生産ヘテロ多量体タンパク質は、更なるアッセイ及び用途について、実質的に均質である調製を得るために更に精製される。当分野で公知の標準的なタンパク質精製方法を用いることができる。以下の方法は好適な精製手順の例である：免疫親和性又はイオン交換カラムによる分画化、エタノール沈降法、逆相ＨＰＬＣ、シリカ又はＤＥＡＥなどの陽性交換樹脂によるクロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈降法及び、例えばＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５を用いたゲルろ過法。

一態様では、固形層に固定したプロテインＡを、例えば本発明の完全長抗体産物の免疫親和性精製法に用いる。プロテインＡは抗体のＦｃ領域に高い親和性で結合する黄色ブドウ球菌から単離した４１ｋＤの細胞壁タンパク質である。Lindmark等 (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13。プロテインＡを固定した固形層は、ガラス又はシリカ表面、より好ましくは孔を調節したガラスカラム又はケイ酸カラムを含むカラムが好ましい。ある方法では、カラムは非特異的な混入物の接着を防ぐためにグリセロールなどの試薬でコートされている。

精製の初めの工程では、上記に記載のように細胞培養物からの調製物をプロテインＡ固定固形層にアプライし、プロテインＡに対象とする抗体を特異的に結合させる。ついで、固形層を洗浄して、固形層に非特異的に結合した混入物を除去する。ヘテロ多量体タンパク質（例えば、抗体）は溶出により固相から回収される。

ｂ．真核生物の宿主細胞を用いたヘテロ多量体タンパク質の産生：
一般的に、ベクターは、限定するものではないが、以下の一以上を含む：シグナル配列、複製起点、一以上のマーカ遺伝子、エンハンサー因子、プロモータ及び転写終末因子。

ｉ．シグナル配列成分
真核生物の宿主細胞に用いるベクターはまた、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいは対象とするポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドを含んでいてもよい。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。このような前駆体領域のＤＮＡは、所望のヘテロ多量体タンパク質（例えば抗体）をコードするＤＮＡに読み取り枠を一致させて結合される。

ｉｉ．複製開始点
一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である。例えば、ＳＶ４０開始点は典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる。

ｉｉｉ選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(ａ)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(ｂ)必要があれば栄養要求性欠陥を補い、又は(ｃ)複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。

選択方法の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。

哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの他の例は、抗体核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することを可能にするもの、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々である。

例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Ｍｔｘ)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞である（例として、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９０９６）。

あるいは、抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(ＡＰＨ)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。例として米国特許第４９６５１９９号を参照のこと。

ｉｖ．プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは通常は宿主生物体によって認識され、所望のヒンジ含有ポリペプチド（例えば、抗体）核酸に作用可能に結合しているプロモーターを含む。真核生物のプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に見出されるＡＴリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。

哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの所望のヒンジ含有ポリペプチド（例えば、抗体）の転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(ＳＶ４０)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、または熱ショックプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。

ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点を更に含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主中でＤＮＡを発現させる系が、米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の変形例は米国特許第４６０１９７８号に開示されている。単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下のマウス細胞におけるヒトβインターフェロンのｃＤＮＡの発現に関しては、Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)を参照。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。

ｖ．エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物による所望のヒンジ含有ポリペプチド（例えば、抗体）をコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強されうる。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(例えばグロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン遺伝子)。また、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられてよい。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化を亢進するのための因子の記載については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体ポリペプチドコード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされうるが、亢進されるのであれば、一般にプロモーターから５'位に位置している。

ｖｉ．転写終結成分
また、真核生物宿主細胞に用いられる発現ベクターは、典型的には、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、時には３'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、抗体をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。

ｖｉｉ．宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクター中のＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、脊椎動物の宿主細胞を含む本明細書中に記載の高等真核生物細胞を含む。培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１)；ヒト胚腎臓株(２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977))；ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))；マウスのセルトリ細胞(ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))；サルの腎細胞 (ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０); アフリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ-７６, ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞 (ＭＤＣＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ３Ａ, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞 (Ｗ１３８, ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２, ＨＢ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞 (ＭＭＴ０６０５６２, ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞;ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)である。

宿主細胞は、所望のヒンジ含有ポリペプチド（例えば、抗体）生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。

ｖｉｉｉ．宿主細胞の培養
本発明の所望のヒンジ含有ポリペプチド（例えば、抗体）を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((ＭＥＭ),(シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えばアデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ^ＴＭ薬）、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。

ｉｘ．ヘテロ多量体タンパク質の精製
組換え技術を用いる場合、ヒンジ含有ポリペプチドは細胞内で生成され、又は培地内に直接分泌される。ヒンジ含有ポリペプチドが細胞内に生成された場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外ろ過によって除去される。ヒンジ含有ポリペプチドが培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＰｅｌｌｉｃｏｎの限外ろ過装置を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。

細胞から調製したヘテロ多量体の組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる(Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983))。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている(Guss等, EMBO J. 5: 1567-1575 (1986))。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣ_Ｈ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ^ＴＭ樹脂（Ｊ.Ｔ.Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥ^ＴＭクロマトグラフィー(ポリアスパラギン酸カラム)、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。

予備的精製工程に続いて、目的の抗体及び混入物を含む混合液をｐＨ約２．５−４．５、好ましくは低塩濃度(例として、約０−０．２５Ｍ塩)の溶出緩衝液を用いて低ｐＨ疎水性作用クロマトグラフィを行う。ヘテロ多量体タンパク質の産生は、代替的または付加的に（上記の特定の方法のいずれかへ）ポリペプチドの混合物を含む溶液を透析することを含むことができる。

ｘ．バキュロウイルスを使用した抗体産生
組み換えバキュロウイルスは、スポドプテラ・フルギペルダ細胞（例えばＳｆ９細胞；ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）またはキイロショウジョウバエＳ２細胞のような昆虫細胞に抗体ないし抗体断片とＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ^ＴＭウイルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をコードするプラスミドを、例えばリポフェクチン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから市販されている）を使用して同時形質移入することによって作製されうる。具体的な例では、抗体配列は、バキュロウイルス発現ベクター内に含有されるエピトープ標識の上流で融合する。このようなエピトープ標識はポリ−Ｈｉｓタグを含む。ｐＶＬ１３９３（Ｎｏｖａｇｅｎ）又はｐＡｃＧＰ６７Ｂ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）といった市販のプラスミド由来のプラスミドを含め、様々なプラスミドが使用されてよい。簡単に言うと、抗体ないしその断片をコードする配列は、５’および３’領域に相補的なプライマーによるＰＣＲによって増幅されうる。５’プライマーは、隣接（選択した）制限酵素部位を組み込んでよい。次いで、生成物を選択した制限酵素にて消化し、発現ベクターにサブクローニングしてよい。

発現ベクターにて形質移入した後、宿主細胞(例えばＳｆ９細胞)を２８℃で４−５日間インキュベートし、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いる。ウイルス感染およびタンパク質発現は、例えばO'Reilley et al. (Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual. Oxford: Oxford University Press (1994))に記述されるように実行されてよい。

次いで、発現されたポリ-Ｈｉｓタグ付加抗体を以下の通りに例えばＮｉ^２＋-キレート親和性クロマトグラフィにて精製されうる。抽出物は、Rupert et al. (Nature 362:175-179 (1993))に記述されるように組み換えウイルス感染Ｓｆ９細胞から調製されうる。簡単に言うと、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理バッファ(２５ｍＬ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．９；１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２；０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；１０％グリセロール；０．１％ＮＰ−40；０．４Ｍ ＫＣｌ)に再懸濁し、氷上で２０秒間、２度超音波処理する。超音波処理物は遠心分離をかけ、上清をローディングバッファ(５０ｍＭ リン酸塩；３００ｍＭ ＮａＣｌ；１０％グリセロールｐＨ７．８)にて５０倍に希釈し、０．４５μｍフィルタにてろ過する。Ｎｉ^２＋−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎから市販）は、５ｍＬの総容積にて調製し、２５ｍＬの水にて洗浄し、２５ｍＬのローディングバッファにて平衡化する。フィルタ処理細胞抽出物は毎分０．５ｍＬでカラムに流す。カラムはローディングバッファにて基準値Ａ_２８０に洗浄し、ここで分画回収を始める。次に、カラムは、二次洗浄バッファ（５０ｍＭのリン酸塩；３００ｍＭのＮａＣｌ；１０％グリセロールｐＨ６．０）にて洗浄し、非特異的に結合したタンパク質を溶出する。再びＡ_２８０基準値に達した後に、カラムは、０〜５００ｍＭのイミダゾール勾配を含む二次洗浄バッファにて反応させる。１ｍＬの分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色またはアルカリホスファターゼ（Ｑｉａｇｅｎ）にコンジュゲートしたＮｉ^２＋−ＮＴＡによるウエスタンブロットにより分析する。溶出されたＨｉｓ１０タグ付加抗体を含有する分画をプールし、ローディングバッファに対して透析する。

あるいは、抗体の精製は、例えばプロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィなどの公知のクロマトグラフィ技術を使用して実行されうる。一実施態様において、対象の抗体は、カオトロピック剤又は中性（ｍｉｌｄ）界面活性剤を含有する溶液への溶出によってカラムの固相から回収してもよい。例示的なカオトロピック剤および中性（ｍｉｌｄ）界面活性剤には、限定するものではないが、グアニジン-ＨＣｌ、尿素、過塩素酸リチウム、アルギニン、ヒスチジン、ＳＤＳ(ドデシル硫酸ナトリウム)、ツイーン、トリトンおよびＮＰ−４０が含まれ、これらすべては市販されている。

ＩＶ．ヘテロ多量体タンパク質形成／構築
完全なヘテロ多量体タンパク質の形成は、本発明において再フォールディングと呼ばれている、ジスルフィド結合の形成により第一のヒンジ含有ポリペプチド及び第二のヒンジ含有ポリペプチドの再構築が含まれる。再フォールディングは、第一のヒンジ含有ポリペプチドの第二のヒンジ含有ポリペプチドとの会合、及び鎖間ジスルフィド結合の形成を含む。再フォールディングはまた、再生とも呼ばれ、本発明においては還元剤を添加せずにインビトロで行われる。

宿主細胞は、別々の培養として、又は、単一培養のいずれかとして、上記の方法を用いて培養することができる。一つの方法において、第一宿主細胞と第二宿主細胞は、同じ培養容器で増殖される（時には共培養又は混合培養とも称される）。別の方法において、第一及び第二の宿主細胞は、別々の培養容器で増殖される。一つの方法において、別々の培養液は別々に処理され、次いで細胞膜の破壊に先だって、混合され／組み合わされる。一つの方法において、別々の培養液は混合され、次いで細胞膜の破壊に先だって処理される。一つの方法において、別々の培養液は、細胞膜の破壊に先だって更に処理されること無く、混合される。一つの方法において、第一宿主細胞及び第二宿主細胞を含む単一培養液が、細胞膜の破壊に先だって処理される。その他の方法において、共培養された細胞は細胞膜の破壊に先だって処理されない。細胞の処理は、遠心分離及び適切な緩衝液中（例えば、抽出緩衝液）での再懸濁を含む。

抽出緩衝液は当技術分野で知られており、当業者は、過度の実験によらず使用する緩衝液を決定することができるであろう。

宿主細胞膜は、当技術分野で公知の方法を用いて破砕する。そのような方法は、細胞膜の透過処理及び細胞膜の分解を含む。細胞膜の透過処理は、例えば、細胞が生きたままでいるように膜全体の完全性を破壊することなく、穴を導入することによって、膜を「漏れやすい」状態にすることを指す。言い換えれば、透過処理は、細胞膜を通過する高分子の移動を与え、細胞の生存を存続させるのを可能にするために十分な細胞構造を維持する。これとは対照的に、細胞膜の崩壊は、細胞内容物を細胞外環境に放出し、細胞死に至る。

細胞膜を破壊するための方法としては、限定されないが、酵素的溶解、超音波処理、浸透圧ショック、マイクロフルイダイザーの通過、ＥＤＴＡの添加、種々の界面活性剤、溶媒（例えば、トルエン、ジメチルスルホキシド等）、界面活性剤（例えば、トリトンＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ ２０等）、低張バッファーの使用、凍結／解凍技術、エレクトロポレーションの使用、ステンレス鋼のボールホモジナイザーの通過を含む。

ヒンジ含有ポリペプチドが（透過処理又は崩壊のどちらかによって）細胞から放出された後、ヘテロ多量体化ドメインは、ヘテロ多量体タンパク質の会合を促進するであろう。会合したヒンジ含有ポリペプチドの鎖間ジスルフィド形成が、還元剤を添加することなく進行する。得られたジスルフィド結合化ヘテロ多量体タンパク質は、その後精製される。任意で、それを、研究、診断、治療又は他の目的のために処方することができる。

Ｖ．標的分子
本発明のヘテロ多量体タンパク質によって標的化されうる分子の例には、限定するものではないが、可溶性血清タンパク質およびそのレセプターおよび他の膜結合タンパク質（例えばアドヘシン）が含まれる。

他の実施態様では、本発明のヘテロ多量体タンパク質は、ＢＭＰｌ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３Ｂ (ＧＤＦｌＯ)、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ８、ＣＳＦｌ (Ｍ-ＣＳＦ)、ＣＳＦ２ (ＧＭ-ＣＳＦ)、ＣＳＦ３ (Ｇ-ＣＳＦ)、ＥＰＯ、ＦＧＦｌ (ａＦＧＦ)、ＦＧＦ２ (ｂＦＧＦ)、ＦＧＦ３ (ｉｎｔ-２)、ＦＧＦ４ (ＨＳＴ)、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６ (ＨＳＴ-２)、ＦＧＦ７ (ＫＧＦ)、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１２Ｂ、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２３、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＩＦＮＡｌ、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＢｌ、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＷｌ、ＦＥＬｌ、ＦＥＬｌ (ＥＰＳＥＬＯＮ)、ＦＥＬｌ (ＺＥＴＡ)、ＩＬｌＡ、ＩＬｌＢ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬＩｌ、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＬＴＡ (ＴＮＦ-ｂ)、ＬＴＢ、ＴＮＦ (ＴＮＦ-ａ )、ＴＮＦＳＦ４ (ＯＸ４０リガンド)、ＴＮＦＳＦ５ (ＣＤ４０リガンド)、ＴＮＦＳＦ６ (ＦａｓＬ)、ＴＮＦＳＦ７ (ＣＤ２７リガンド)、ＴＮＦＳＦ８ (ＣＤ３０リガンド)、ＴＮＦＳＦ９ (４-１ＢＢ リガンド)、ＴＮＦＳＦｌ０ (ＴＲＡＩＬ)、ＴＮＦＳＦ１ｌ (ＴＲＡＮＣＥ)、ＴＮＦＳＦ１２ (ＡＰＯ３Ｌ)、ＴＮＦＳＦ１３(Ａｐｒｉｌ)、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４ (ＨＶＥＭ-Ｌ)、ＴＮＦＳＦ１５ (ＶＥＧＩ)、ＴＮＦＳＦ１８、ＨＧＦ (ＶＥＧＦＤ)、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＩＬｌＲ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ１ＲＬ１、ＬＬ１ＲＬ２、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ８ＲＡ、ＩＬ８ＲＢ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬｌ０ＲＡ、ＩＬｌ０ＲＢ、ＩＬ１ｌＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２Ｒ、ＩＬ１ＨＹ１、ＩＬｌＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＩＬｌＲＮ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ２２ＲＡ２、ＡＩＦｌ、ＨＧＦ、ＬＥＰ (レプチン)、ＰＴＮ、およびＴＨＰＯからなる群から選択される１、２またはそれ以上のサイトカイン、サイトカイン関連タンパク質およびサイトカインレセプターを結合することができる。

他の実施態様では、標的分子は、ＣＣＬｌ (Ｉ- ３０９)、ＣＣＬ２ (ＭＣＰ -１ / ＭＣＡＦ)、ＣＣＬ３ (ＭＩＰ-Ｉａ)、ＣＣＬ４ (ＭＩＰ-Ｉｂ)、ＣＣＬ５ (ＲＡＮＴＥＳ)、ＣＣＬ７ (ＭＣＰ- ３)、ＣＣＬ８ (ｍｃｐ-２)、ＣＣＬＨ (ｅｏｔａｘｉｎ)、ＣＣＬ１３ (ＭＣＰ-４)、ＣＣＬ１５ (ＭＩＰ-Ｉｄ)、ＣＣＬ１６ (ＨＣＣ-４)、ＣＣＬ１７ (ＴＡＲＣ)、ＣＣＬ１８ (ＰＡＲＣ)、ＣＣＬ１９ (ＭＤＰ-３ｂ)、ＣＣＬ２０ (ＭＩＰ-３ａ)、ＣＣＬ２１ (ＳＬＣ / ｅｘｏｄｕｓ-２)、ＣＣＬ２２ (ＭＤＣ / ＳＴＣ-Ｉ)、ＣＣＬ２３ (ＭＰＩＦ-Ｉ)、ＣＣＬ２４ (ＭＰＩＦ-２ /エオタキシン-２)、ＣＣＬ２５ (ＴＥＣＫ)、ＣＣＬ２６ (エオタキシン- ３)、ＣＣＬ２７ (ＣＴＡＣＫ / ＩＬＣ)、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬｌ (ＧＲＯｌ)、ＣＸＣＬ２ (ＧＲＯ２)、ＣＸＣＬ３ (ＧＲ０３)、ＣＸＣＬ５ (ＥＮＡ-７８)、ＣＸＣＬ６ (ＧＣＰ-２)、ＣＸＣＬ９ (ＭＩＧ)、ＣＸＣＬ１Ｏ (ＩＰ １０)、ＣＸＣＬ１１ (Ｉ-ＴＡＣ)、ＣＸＣＬ１２ (ＳＤＦｌ)、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＰＦ４ (ＣＸＣＬ４)、ＰＰＢＰ (ＣＸＣＬ７)、ＣＸ３ＣＬ１ (ＳＣＹＤｌ)、ＳＣＹＥｌ、ＸＣＬｌ (リンホタクチン)、ＸＣＬ２ (ＳＣＭ-Ｉｂ)、ＢＬＲｌ (ＭＤＲ１５)、ＣＣＢＰ２ (Ｄ６ / ＪＡＢ６１)、ＣＣＲｌ (ＣＫＲｌ / ＨＭ１４５)、ＣＣＲ２ (ｍｃｐ-ｌＲＢ / ＲＡ)、ＣＣＲ３ (ＣＫＲ３ / ＣＭＫＢＲ３)、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５ (ＣＭＫＢＲ５ / ＣｈｅｍＲ１３)、ＣＣＲ６ (ＣＭＫＢＲ６ / ＣＫＲ-Ｌ３ / ＳＴＲＬ２２ / ＤＲＹ６)、ＣＣＲ７ (ＣＫＲ７ / ＥＢＩｌ)、ＣＣＲ８ (ＣＭＫＢＲ８ / ＴＥＲｌ / ＣＫＲ- Ｌｌ)、ＣＣＲ９ (ＧＰＲ-９-６)、ＣＣＲＬｌ (ＶＳＨＫｌ)、ＣＣＲＬ２(Ｌ-ＣＣＲ)、ＸＣＲｌ(ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲｌ)、ＣＭＫＬＲｌ、ＣＭＫＯＲｌ(ＲＤＣｌ)、ＣＸ３ＣＲ１(Ｖ２８)、ＣＸＣＲ４、ＧＰＲ２(ＣＣＲｌＯ)、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ８１(ＦＫＳＧ８０)、ＣＸＣＲ３(ＧＰＲ９／ＣＫＲ-Ｌ２)、ＣＸＣＲ６(ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／ボンゾー)、ＨＭ７４、ＩＬ８ＲＡ(ＩＬ８Ｒａ)、ＩＬ８ＲＢ(ＩＬ８Ｒｂ)、ＬＴＢ４Ｒ(ＧＰＲ１６)、ＴＣＰｌＯ、ＣＫＬＦＳＦ２、ＣＫＬＦＳＦ３、ＣＫＬＦＳＦ４、ＣＫＬＦＳＦ５、ＣＫＬＦＳＦ６、ＣＫＬＦＳＦ７、ＣＫＬＦＳＦ８、ＢＤＮＦ、Ｃ５Ｒ１、ＣＳＦ３、ＧＲＣＣｌＯ(ＣｌＯ)、ＥＰＯ、ＦＹ(ＤＡＲＣ)、ＧＤＦ５、ＨＤＦｌＡ、ＤＬ８、プロラクチン、ＲＧＳ３、ＲＧＳ１３、ＳＤＦ２、ＳＬＩＴ２、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＲＥＭｌ、ＴＲＥＭ２およびＶＨＬからなる群から選択される、ケモカイン、ケモカインレセプターまたはケモカイン関連タンパク質である。

他の実施態様では、本発明のヘテロ多量体タンパク質は、ＡＢＣＦｌ；ＡＣＶＲｌ；ＡＣＶＲｌＢ；ＡＣＶＲ２；ＡＣＶＲ２Ｂ；ＡＣＶＲＬｌ；ＡＤ０ＲＡ２Ａ；アグリカン；ＡＧＲ２；ＡＩＣＤＡ；ＡＩＦｌ；ＡＩＧｌ；ＡＫＡＰｌ；ＡＫＡＰ２；ＡＭＨ；ＡＭＨＲ２；ＡＮＧＰＴｌ；ＡＮＧＰＴ２；ＡＮＧＰＴＬ３；ＡＮＧＰＴＬ４；ＡＮＰＥＰ；ＡＰＣ；ＡＰＯＣｌ；ＡＲ；ＡＺＧＰｌ(亜鉛-ａ-糖タンパク質)；Ｂ７.１；Ｂ７.２；ＢＡＤ；ＢＡＦＦ(ＢＬｙｓ)；ＢＡＧｌ；ＢＡＩｌ；ＢＣＬ２；ＢＣＬ６；ＢＤＮＦ；ＢＬＮＫ；ＢＬＲｌ(ＭＤＲ１５)；ＢＭＰｌ；ＢＭＰ２；ＢＭＰ３Ｂ(ＧＤＦｌＯ)；ＢＭＰ４；ＢＭＰ６；ＢＭＰ８；ＢＭＰＲｌＡ；ＢＭＰＲｌＢ；ＢＭＰＲ２；ＢＰＡＧｌ(プレクチン)；ＢＲＣＡｌ；Ｃ１９ｏｒｆｌＯ(ＩＬ２７ｗ)；Ｃ３；Ｃ４Ａ；Ｃ５；Ｃ５Ｒ１；ＣＡＮＴｌ；ＣＡＳＰ１；ＣＡＳＰ４；ＣＡＶｌ；ＣＣＢＰ２(Ｄ６／ＪＡＢ６１)；ＣＣＬｌ(１-３０９)；ＣＣＬＩｌ(エオタキシン)；ＣＣＬ１３(ＭＣＰ-４)；ＣＣＬ１５(ＭＩＰ-Ｉｄ)；ＣＣＬ１６(ＨＣＣ-４)；ＣＣＬ１７(ＴＡＲＣ)；ＣＣＬ１８(ＰＡＲＣ)；ＣＣＬ１９(ＭＩＰ-３ｂ)；ＣＣＬ２(ＭＣＰ-１)；ＭＣＡＦ；ＣＣＬ２０(ＭＩＰ-３ａ)；ＣＣＬ２１(ＭＴＰ-２)；ＳＬＣ；ｅｘｏｄｕｓ-２；ＣＣＬ２２(ＭＤＣ／ＳＴＣ−Ｉ)；ＣＣＬ２３(ＭＰＩＦ−１)；ＣＣＬ２４(ＭＰＩＦ-２／エオタキシン-２)；ＣＣＬ２５(ＴＥＣＫ)；ＣＣＬ２６(エオタキシン-３)；ＣＣＬ２７(ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ)；ＣＣＬ２８；ＣＣＬ３(ＭＴＰ-Ｉａ)；ＣＣＬ４(ＭＤＰ-Ｉｂ)；ＣＣＬ５(ＲＡＮＴＥＳ)；ＣＣＬ７(ＭＣＰ-３)；ＣＣＬ８(ｍｃｐ-２)；ＣＣＮＡｌ；ＣＣＮＡ２；ＣＣＮＤｌ；ＣＣＮＥｌ；ＣＣＮＥ２；ＣＣＲｌ(ＣＫＲｌ／ＨＭ１４５)；ＣＣＲ２(ｍｃｐ-ｌＲＢ／ＲＡ)；ＣＣＲ３(ＣＫＲ３／ＣＭＫＢＲ３)；ＣＣＲ４；ＣＣＲ５(ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３)；ＣＣＲ６(ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ-Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６)；ＣＣＲ７(ＣＫＲ７／ＥＢＩｌ)；ＣＣＲ８(ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲｌ／ＣＫＲ-Ｌｌ)；ＣＣＲ９(ＧＰＲ-９-６)；ＣＣＲＬｌ(ＶＳＨＫｌ)；ＣＣＲＬ２(Ｌ-ＣＣＲ)；ＣＤ１６４；ＣＤ１９；ＣＤｌＣ；ＣＤ２０；ＣＤ２００；ＣＤ２２；ＣＤ２４；ＣＤ２８；ＣＤ３；ＣＤ３７；ＣＤ３８；ＣＤ３Ｅ；ＣＤ３Ｇ；ＣＤ３Ｚ；ＣＤ４；ＣＤ４０；ＣＤ４０Ｌ；ＣＤ４４；ＣＤ４５ＲＢ；ＣＤ５２；ＣＤ６９；ＣＤ７２；ＣＤ７４；ＣＤ７９Ａ；ＣＤ７９Ｂ；ＣＤ８；ＣＤ８０；ＣＤ８１；ＣＤ８３；ＣＤ８６；ＣＤＨｌ(Ｅカドヘリン)；ＣＤＨ１０；ＣＤＨ１２；ＣＤＨ１３；ＣＤＨ１８；ＣＤＨ１９；ＣＤＨ２０；ＣＤＨ５；ＣＤＨ７；ＣＤＨ８；ＣＤＨ９；ＣＤＫ２；ＣＤＫ３；ＣＤＫ４；ＣＤＫ５；ＣＤＫ６；ＣＤＫ７；ＣＤＫ９；ＣＤＫＮｌＡ(ｐ２１Ｗａｐｌ／Ｃｉｐｌ)；ＣＤＫＮｌＢ(ｐ２７Ｋｉｐｌ)；ＣＤＫＮｌＣ；ＣＤＫＮ２Ａ(Ｐ１６ＩＮＫ４ａ)；ＣＤＫＮ２Ｂ；ＣＤＫＮ２Ｃ；ＣＤＫＮ３；ＣＥＢＰＢ；ＣＥＲｌ；ＣＨＧＡ；ＣＨＧＢ；キチナーゼ；ＣＨＳＴ１０；ＣＫＬＦＳＦ２；ＣＫＬＦＳＦ３；ＣＫＬＦＳＦ４；ＣＫＬＦＳＦ５；ＣＫＬＦＳＦ６；ＣＫＬＦＳＦ７；ＣＫＬＦＳＦ８；ＣＬＤＮ３；ＣＬＤＮ７(クローディン-７)；ＣＬＮ３；ＣＬＵ(クラステリン)；ＣＭＫＬＲｌ；ＣＭＫＯＲｌ(ＲＤＣｌ)；ＣＮＲｌ；ＣＯＬ１８Ａ１；ＣＯＬｌＡｌ；ＣＯＬ４Ａ３；ＣＯＬ６Ａ１；ＣＲ２；ＣＲＰ；ＣＳＦｌ(Ｍ-ＣＳＦ)；ＣＳＦ２(ＧＭ-ＣＳＦ)；ＣＳＦ３(ＧＣＳＦ)；ＣＴＬＡ４；ＣＴＮＮＢｌ(ｂ-カテニン)；ＣＴＳＢ(カテプシンＢ)；ＣＸ３ＣＬ１(ＳＣＹＤｌ)；ＣＸ３ＣＲ１(Ｖ２８)；ＣＸＣＬｌ(ＧＲＯｌ)；ＣＸＣＬ１０(ＩＰ-１０)；ＣＸＣＬＩｌ(Ｉ−ＴＡＣ／ＩＰ-９)；ＣＸＣＬ１２(ＳＤＦｌ)；ＣＸＣＬ１３；ＣＸＣＬ１４；ＣＸＣＬ１６；ＣＸＣＬ２(ＧＲＯ２)；ＣＸＣＬ３(ＧＲＯ３)；ＣＸＣＬ５(ＥＮＡ-７８／ＬＩＸ)；ＣＸＣＬ６(ＧＣＰ-２)；ＣＸＣＬ９(ＭＩＧ)；ＣＸＣＲ３(ＧＰＲ９／ＣＫＲ-Ｌ２)；ＣＸＣＲ４；ＣＸＣＲ６(ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ)；ＣＹＢ５；ＣＹＣｌ；ＣＹＳＬＴＲｌ；ＤＡＢ２ＩＰ；ＤＥＳ；ＤＫＦＺｐ４５１Ｊ０１１８；ＤＮＣＬｌ；ＤＰＰ４；Ｅ２Ｆ１；ＥＣＧＦｌ；ＥＤＧｌ；ＥＦＮＡｌ；ＥＦＮＡ３；ＥＦＮＢ２；ＥＧＦ；ＥＧＦＲ；ＥＬＡＣ２；ＥＮＧ；ＥＮＯ１；ＥＮＯ２；ＥＮＯ３；ＥＰＨＢ４；ＥＰＯ；ＥＲＢＢ２(Ｈｅｒ−２)；ＥＲＥＧ；ＥＲＫ８；ＥＳＲｌ；ＥＳＲ２；Ｆ３(ＴＦ)；ＦＡＤＤ；ＦａｓＬ；ＦＡＳＮ；ＦＣＥＲｌＡ；ＦＣＥＲ２；ＦＣＧＲ３Ａ；ＦＧＦ；ＦＧＦｌ(ａＦＧＦ)；ＦＧＦ１０；ＦＧＦ１１；ＦＧＦ１２；ＦＧＦ１２Ｂ；ＦＧＦ１３；ＦＧＦ１４；ＦＧＦ１６；ＦＧＦ１７；ＦＧＦ１８；ＦＧＦ１９；ＦＧＦ２(ｂＦＧＦ)；ＦＧＦ２０；ＦＧＦ２１；ＦＧＦ２２；ＦＧＦ２３；ＦＧＦ３(ｉｎｔ-２)；ＦＧＦ４(ＨＳＴ)；ＦＧＦ５；ＦＧＦ６(ＨＳＴ-２)；ＦＧＦ７(ＫＧＦ)；ＦＧＦ８；ＦＧＦ９；ＦＧＦＲ３；ＦＩＧＦ(ＶＥＧＦＤ)；ＦＥＬｌ(ＥＰＳＩＬＯＮ)；ＦＩＬｌ(ＺＥＴＡ)；ＦＬＪ１２５８４；ＦＬＪ２５５３０；ＦＬＲＴｌ(フィブロネクチン)；ＦＬＴｌ；ＦＯＳ；ＦＯＳＬｌ(ＦＲＡ−Ｉ)；ＦＹ(ＤＡＲＣ)；ＧＡＢＲＰ(ＧＡＢＡａ)；ＧＡＧＥＢｌ；ＧＡＧＥＣｌ；ＧＡＬＮＡＣ４Ｓ-６ＳＴ；ＧＡＴＡ３；ＧＤＦ５；ＧＦＩ１；ＧＧＴ１；ＧＭ-ＣＳＦ；ＧＮＡＳｌ；ＧＮＲＨｌ；ＧＰＲ２(ＣＣＲｌＯ)；ＧＰＲ３１；ＧＰＲ４４；ＧＰＲ８１(ＦＫＳＧ８０)；ＧＲＣＣｌＯ(ＣｌＯ)；ＧＲＰ；ＧＳＮ(ゲルソリン)；ＧＳＴＰｌ；ＨＡＶＣＲ２；ＨＤＡＣ４；ＨＤＡＣ５；ＨＤＡＣ７Ａ；ＨＤＡＣ９；ＨＧＦ；ＨＩＦｌＡ；ＨＤＰｌ；ヒスタミンおよびヒスタミンレセプター；ＨＬＡ−Ａ；ＨＬＡ-ＤＲＡ；ＨＭ７４；ＨＭＯＸｌ；ＨＵＭＣＹＴ２Ａ；ＩＣＥＢＥＲＧ；ＩＣＯＳＬ；ＩＤ２；ＩＦＮ−ａ；ＩＦＮＡ１；ＩＦＮＡ２；ＩＦＮＡ４；ＩＦＮＡ５；ＩＦＮＡ６；ＩＦＮＡ７；ＩＦＮＢ１；ＩＦＮガンマ；ＤＦＮＷｌ；ＩＧＢＰｌ；ＩＧＦｌ；ＩＧＦｌＲ；ＩＧＦ２；ＩＧＦＢＰ２；ＩＧＦＢＰ３；ＩＧＦＢＰ６；ＩＬ−Ｉ；ＩＬ１０；ＩＬ１０ＲＡ；ＩＬ１０ＲＢ；ＩＬ１１；ＩＬ１１ＲＡ；ＩＬ-１２；ＩＬ１２Ａ；ＩＬ１２Ｂ；ＩＬ１２ＲＢ１；ＩＬ１２ＲＢ２；ＩＬ１３；ＩＬ１３ＲＡ１；ＩＬ１３ＲＡ２；ＩＬ１４；ＩＬ１５；ＩＬ１５ＲＡ；ＩＬ１６；ＩＬ１７；ＩＬ１７Ｂ；ＩＬ１７Ｃ；ＩＬ１７Ｒ；ＩＬ１８；ＩＬ１８ＢＰ；ＩＬ１８Ｒ１；ＩＬ１８ＲＡＰ；ＩＬ１９；ＩＬ１Ａ；ＩＬ１Ｂ；ＩＬｌＦ１０；ＩＬ１Ｆ５；ＩＬ１Ｆ６；ＩＬ１Ｆ７；ＩＬ１Ｆ８；ＩＬ１Ｆ９；ＩＬ１ＨＹｌ；ＩＬ１Ｒｌ；ＩＬ１Ｒ２；ＩＬ１ＲＡＰ；ＩＬ１ＲＡＰＬ１；ＩＬ１ＲＡＰＬ２；ＩＬ１ＲＬ１；ＩＬ１ＲＬ２（ＩＬｌＲＮ）；ＩＬ２；ＩＬ２０；ＩＬ２０ＲＡ；ＩＬ２１Ｒ；ＩＬ２２；ＩＬ２２Ｒ；ＩＬ２２ＲＡ２；ＩＬ２３；ＩＬ２４；ＩＬ２５；ＩＬ２６；ＩＬ２７；ＩＬ２８Ａ；ＩＬ２８Ｂ；ＩＬ２９；ＩＬ２ＲＡ；ＩＬ２ＲＢ；ＩＬ２ＲＧ；ＩＬ３；ＩＬ３０；ＩＬ３ＲＡ；ＩＬ４；ＩＬ４Ｒ；ＩＬ５；ＩＬ５ＲＡ；ＩＬ６；ＩＬ６Ｒ；ＩＬ６ＳＴ(糖タンパク質１３０)；ＥＬ７；ＥＬ７Ｒ；ＥＬ８；ＩＬ８ＲＡ；ＤＬ８ＲＢ；ＩＬ８ＲＢ；ＤＬ９；ＤＬ９Ｒ；ＤＬＫ；ＩＮＨＡ；ＩＮＨＢＡ；ＩＮＳＬ３；ＩＮＳＬ４；ＩＲＡＫＩ；ＥＲＡＫ２；ＩＴＧＡｌ；ＩＴＧＡ２；ＩＴＧＡ３；ＩＴＧＡ６(ａ６インテグリン)；ＩＴＧＡＶ；ＩＴＧＢ３；ＩＴＧＢ４(ｂ４インテグリン)；ＪＡＧｌ；ＪＡＫｌ；ＪＡＫ３；ＪＵＮ；Ｋ６ＨＦ；ＫＡＩｌ；ＫＤＲ；ＫＩＴＬＧ；ＫＬＦ５(ＧＣボックスＢＰ)；ＫＬＦ６；ＫＬＫｌＯ；ＫＬＫ１２；ＫＬＫ１３；ＫＬＫ１４；ＫＬＫ１５；ＫＬＫ３；ＫＬＫ４；ＫＬＫ５；ＫＬＫ６；ＫＬＫ９；ＫＲＴ１；ＫＲＴ１９(ケラチン１９)；ＫＲＴ２Ａ；ＫＨＴＨＢ６(毛特異的タイプＨケラチン)；ＬＡＭＡＳ；ＬＥＰ(レプチン)；Ｌｉｎｇｏ-ｐ７５；Ｌｉｎｇｏ-Ｔｒｏｙ；ＬＰＳ；ＬＴＡ(ＴＮＦ-ｂ)；ＬＴＢ；ＬＴＢ４Ｒ(ＧＰＲ１６)；ＬＴＢ４Ｒ２；ＬＴＢＲ；ＭＡＣＭＡＲＣＫＳ；ＭＡＧ又はＯｍｇｐ；ＭＡＰ２Ｋ７(ｃ−Ｊｕｎ)；ＭＤＫ；ＭＩＢｌ；ミッドカイン；ＭＥＦ；ＭＩＰ-２；ＭＫＩ６７；(Ｋｉ-６７)；ＭＭＰ２；ＭＭＰ９；ＭＳ４Ａ１；ＭＳＭＢ；ＭＴ３(メタロチオネクチン-ＩＩＩ)；ＭＴＳＳｌ；ＭＵＣｌ(ムチン)；ＭＹＣ；ＭＹＤ８８；ＮＣＫ２；ニューロカン；ＮＦＫＢｌ；ＮＦＫＢ２；ＮＧＦＢ(ＮＧＦ)；ＮＧＦＲ；ＮｇＲ-Ｌｉｎｇｏ；ＮｇＲ−Ｎｏｇｏ６６(Ｎｏｇｏ)；ＮｇＲ-ｐ７５；ＮｇＲ-トロイ；ＮＭＥｌ(ＮＭ２３Ａ)；Ｎ０Ｘ５；ＮＰＰＢ；ＮＲＯＢｌ；ＮＲ０Ｂ２；ＮＲｌＤｌ；ＮＲ１Ｄ２；ＮＲ１Ｈ２；ＮＲ１Ｈ３；ＮＲ１Ｈ４；ＮＲ１Ｉ２；ＮＲ１Ｉ３；ＮＲ２Ｃ１；ＮＲ２Ｃ２；ＮＲ２Ｅ１；ＮＲ２Ｅ３；ＮＲ２Ｆ１；ＮＲ２Ｆ２；ＮＲ２Ｆ６；ＮＲ３Ｃ１；ＮＲ３Ｃ２；ＮＲ４Ａ１；ＮＲ４Ａ２；ＮＲ４Ａ３；ＮＲ５Ａ１；ＮＲ５Ａ２；ＮＲ６Ａ１；ＮＲＰｌ；ＮＲＰ２；ＮＴ５Ｅ；ＮＴＮ４；ＯＤＺｌ；ＯＰＲＤｌ；Ｐ２ＲＸ７；ＰＡＰ；ＰＡＲＴｌ；ＰＡＴＥ；ＰＡＷＲ；ＰＣＡ３；ＰＣＮＡ；ＰＤＧＦＡ；ＰＤＧＦＢ；ＰＥＣＡＭｌ；ＰＦ４(ＣＸＣＬ４)；ＰＧＦ；ＰＧＲ；ホスファカン；ＰＩＡＳ２；ＰＩＫ３ＣＧ；ＰＬＡＵ(ｕＰＡ)；ＰＬＧ；ＰＬＸＤＣｌ；ＰＰＢＰ(ＣＸＣＬ７)；ＰＰＩＤ；ＰＲｌ；ＰＲＫＣＱ；ＰＲＫＤｌ；ＰＲＬ；ＰＲＯＣ；ＰＲＯＫ２；ＰＳＡＰ；ＰＳＣＡ；ＰＴＡＦＲ；ＰＴＥＮ；ＰＴＧＳ２(ＣＯＸ-２)；ＰＴＮ；ＲＡＣ２(ｐ２１Ｒａｃ２)；ＲＡＲＢ；ＲＧＳｌ；ＲＧＳ１３；ＲＧＳ３；ＲＮＦＩｌＯ(ＺＮＦ１４４)；ＲＯＢＯ２；Ｓ１００Ａ２；ＳＣＧＢ１Ｄ２(リポフィリンＢ)；ＳＣＧＢ２Ａ１(マンマグロビン２)；ＳＣＧＢ２Ａ２(マンマグロビン１)；ＳＣＹＥｌ(内皮性単球活性化サイトカイン)；ＳＤＦ２；ＳＥＲＰＩＮＡｌ；ＳＥＲＰＩＮＡ３；ＳＥＲＰ１ＮＢ５(マスピン)；ＳＥＲＰＩＮＥｌ(ＰＡＩ−Ｉ)；ＳＥＲＰＤＭＦ１；ＳＨＢＧ；ＳＬＡ２；ＳＬＣ２Ａ２；ＳＬＣ３３Ａ１；ＳＬＣ４３Ａ１；ＳＬＩＴ２；ＳＰＰｌ；ＳＰＲＲｌＢ(Ｓｐｒｌ)；ＳＴ６ＧＡＬ１；ＳＴＡＢｌ；ＳＴＡＴ６；ＳＴＥＡＰ；ＳＴＥＡＰ２；ＴＢ４Ｒ２；ＴＢＸ２１；ＴＣＰｌＯ；ＴＤＧＦｌ；ＴＥＫ；ＴＧＦＡ；ＴＧＦＢｌ；ＴＧＦＢｌＩｌ；ＴＧＦＢ２；ＴＧＦＢ３；ＴＧＦＢＩ；ＴＧＦＢＲｌ；ＴＧＦＢＲ２；ＴＧＦＢＲ３；ＴＨｌＬ；ＴＨＢＳｌ(トロンボスポンジン-１)；ＴＨＢＳ２；ＴＨＢＳ４；ＴＨＰＯ；ＴＩＥ(Ｔｉｅ-１)；ＴＭＰ３；組織因子；ＴＬＲｌＯ；ＴＬＲ２；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＴＬＲ５；ＴＬＲ６；ＴＬＲ７；ＴＬＲ８；ＴＬＲ９；ＴＮＦ；ＴＮＦ−ａ；ＴＮＦＡＥＰ２(Ｂ９４)；ＴＮＦＡＩＰ３；ＴＮＦＲＳＦＩｌＡ；ＴＮＦＲＳＦｌＡ；ＴＮＦＲＳＦｌＢ；ＴＮＦＲＳＦ２１；ＴＮＦＲＳＦ５；ＴＮＦＲＳＦ６(Ｆａｓ)；ＴＮＦＲＳＦ７；ＴＮＦＲＳＦ８；ＴＮＦＲＳＦ９；ＴＮＦＳＦｌＯ(ＴＲＡＩＬ)；ＴＮＦＳＦｌ １(ＴＲＡＮＣＥ)；ＴＮＦＳＦ１２(ＡＰＯ３Ｌ)；ＴＮＦＳＦ１３(Ａｐｒｉｌ)；ＴＮＦＳＦ１３Ｂ；ＴＮＦＳＦ１４(ＨＶＥＭ-Ｌ)；ＴＮＦＳＦ１５(ＶＥＧＩ)；ＴＮＦＳＦ１８；ＴＮＦＳＦ４(ＯＸ４０リガンド)；ＴＮＦＳＦ５(ＣＤ４０リガンド)；ＴＮＦＳＦ６(ＦａｓＬ)；ＴＮＦＳＦ７(ＣＤ２７リガンド)；ＴＮＦＳＦ８(ＣＤ３０リガンド)；ＴＮＦＳＦ９(４-１ＢＢリガンド)；ＴＯＬＬＩＰ；Ｔｏｌｌ様レセプター；ＴＯＰ２Ａ(トポイソメラーゼＥａ)；ＴＰ５３；ＴＰＭｌ；ＴＰＭ２；ＴＲＡＤＤ；ＴＲＡＦｌ；ＴＲＡＦ２；ＴＲＡＦ３；ＴＲＡＦ４；ＴＲＡＦ５；ＴＲＡＦ６；ＴＲＥＭｌ；ＴＲＥＭ２；ＴＲＰＣ６；ＴＳＬＰ；ＴＷＥＡＫ；ＶＥＧＦ；ＶＥＧＦＢ；ＶＥＧＦＣ；バーシカン；ＶＨＬ Ｃ５；ＶＬＡ-４；ＸＣＬｌ(リンホタクチン)；ＸＣＬ２(ＳＣＭ-Ｉｂ)；ＸＣＲｌ(ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲｌ)；ＹＹｌ；およびＺＦＰＭ２からなる群から選択される一又は複数の標的を結合することができる。

本発明に包含される抗体に対する好適な分子標的分子には、ＣＤタンパク質、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４；ＣＤ６４、ＥＧＦレセプター、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４レセプターのようなＥｒｂＢレセプターファミリのＣＤ２００メンバー；細胞接着分子、例えばＬＦＡ-１、Ｍａｃ１、ｐ１５０.９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、α４／β７インテグリン、およびそのαまたはβサブユニットを含むαｖ／β３インテグリン(例えば抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８又は抗ＣＤ１１ｂ抗体)；増殖因子、例えばＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ-Ｃ；組織因子(ＴＦ)；αインターフェロン(αＩＦＮ)；ＴＮＦα、インターロイキン、例としてＩＬ−１β、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＩＬ−１８、ＩＬ−１３Ｒα１、ＩＬ１３Ｒα２、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−９Ｒ、ＩｇＥ；血液群抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３レセプター；肥満(ＯＢ)レセプター；ｍｐｌレセプター；ＣＴＬＡ-４；ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫ、ＲＳＶ Ｆタンパク質、プロテインＣなどが含まれる。

一実施態様において、本発明おヘテロ多量体タンパク質は低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質の（ＬＲＰ）−１又はＬＲＰ−８、又はトランスフェリンレセプター、及び、１）β−セクレターゼ（ＢＡＣＥ１またはＢＡＣＥ２）、２）α−セクレターゼ、３）γ−セクレターゼ、４）τ−セクレターゼ、５）アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、６）デスレセプター６（ＤＲ６）、７）アミロイドβペプチド、８）α−シヌクレイン、９）パーキン、１０）ハンチンチン、１１）ｐ７５ ＮＴＲ、および１２）カスパーゼ６からなる群から選択される少なくとも一の標的に結合する。

ある実施態様では、本発明のヘテロ多量体複合体は、ＩＬ-ｌαおよびＩＬ-ｌβ、ＩＬ-１２およびＩＬ-１８；ＩＬ-１３およびＩＬ-９；ＩＬ-１３およびＩＬ-４；ＩＬ-１３およびＩＬ-５；ＩＬ-５およびＩＬ-４；ＩＬ-１３およびＩＬ-１β；ＩＬ-１３およびＩＬ−２５；ＩＬ-１３およびＴＡＲＣ；ＩＬ-１３およびＭＤＣ；ＩＬ-１３およびＭＥＦ；ＩＬ-１３およびＴＧＦ-β；ＩＬ-１３およびＬＨＲアゴニスト；ＩＬ-１２およびＴＷＥＡＫ、ＩＬ-１３およびＣＬ２５；ＩＬ-１３およびＳＰＲＲ２ａ；ＩＬ-１３およびＳＰＲＲ２ｂ；ＩＬ−１３およびＡＤＡＭ８、ＩＬ-１３およびＰＥＤ２、ＩＬ１７ＡおよびＩＬ１７Ｆ、ＣＤ３およびＣＤ１９、ＣＤ１３８およびＣＤ２０；ＣＤ１３８およびＣＤ４０；ＣＤ１９およびＣＤ２０；ＣＤ２０およびＣＤ３；ＣＤ３８およびＣＤ１３８；ＣＤ３８およびＣＤ２０；ＣＤ３８およびＣＤ４０；ＣＤ４０およびＣＤ２０；ＣＤ-８およびＩＬ-６；ＣＤ２０およびＢＲ３、ＴＮＦαおよびＴＧＦ-β、ＴＮＦαおよびＩＬ−１β；ＴＮＦαおよびＩＬ−２、ＴＮＦαおよびＩＬ-３、ＴＮＦαおよびＩＬ-４、ＴＮＦαおよびＩＬ-５、ＴＮＦαおよびＩＬ６、ＴＮＦαおよびＩＬ８、ＴＮＦαおよびＩＬ-９、ＴＮＦαおよびＩＬ-１０、ＴＮＦαおよびＩＬ-１１、ＴＮＦαおよびＩＬ-１２、ＴＮＦαおよびＩＬ-１３、ＴＮＦαおよびＩＬ-１４、ＴＮＦαおよびＩＬ-１５、ＴＮＦαおよびＩＬ-１６、ＴＮＦαおよびＩＬ-１７、ＴＮＦαおよびＩＬ-１８、ＴＮＦαおよびＩＬ-１９、ＴＮＦαおよびＩＬ-２０、ＴＮＦαおよびＩＬ-２３、ＴＮＦαおよびＩＦＮα、ＴＮＦαおよびＣＤ４、ＴＮＦαおよびＶＥＧＦ、ＴＮＦαおよびＭＩＦ、ＴＮＦαおよびＩＣＡＭ-１、ＴＮＦαおよびＰＧＥ４、ＴＮＦαおよびＰＥＧ２、ＴＮＦαおよびＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦαおよびＴｅ３８；ＴＮＦαおよびＢＡＦＦ；ＴＮＦαおよびＣＤ２２；ＴＮＦαおよびＣＴＬＡ-４；ＴＮＦαおよびＧＰ１３０；ＴＮＦαおよびＩＬ-１２ｐ４０；ＶＥＧＦおよびＨＥＲ２、ＶＥＧＦ−ＡおよびＨＥＲ２、ＶＥＧＦ−ＡおよびＰＤＧＦ、ＨＥＲ１およびＨＥＲ２、ＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄ、ＨＥＲ２およびＤＲ５、ＶＥＧＦおよびＩＬ-８、ＶＥＧＦおよびＭＥＴ、ＶＥＧＦＲおよびＭＥＴレセプター、ＶＥＧＦＲおよびＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＣＤ６４、ＨＥＲ２およびＣＤ３、ＨＥＲ２およびＣＤ１６、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３；ＥＧＦＲ(ＨＥＲ１)およびＨＥＲ２、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ４、ＩＬ−１３およびＣＤ４０Ｌ、ＩＬ４およびＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦＲ１およびＩＬ−１Ｒ、ＴＮＦＲ１およびＩＬ−６ＲおよびＴＮＦＲ１およびＩＬ−１８Ｒ、ＥｐＣＡＭおよびＣＤ３、ＭＡＰＧおよびＣＤ２８、ＥＧＦＲおよびＣＤ６４、ＣＳＰＧｓおよびＲＧＭ Ａ；ＣＴＬＡ-４およびＢＴＮＯ２；ＩＧＦ１およびＩＧＦ２；ＩＧＦ１／２およびＥｒｂ２Ｂ；ＭＡＧおよびＲＧＭ Ａ；ＮｇＲおよびＲＧＭ Ａ；ＮｏｇｏＡおよびＲＧＭ Ａ；ＯＭＧｐおよびＲＧＭ Ａ；ＰＤＬ−ＩおよびＣＴＬＡ-４；そして、ＲＧＭ ＡおよびＲＧＭ Ｂからなる群から選択される少なくとも２の標的分子に結合する。

場合によって、他の分子にコンジュゲートした可溶性抗原ないしその断片は、抗原を生成するための免疫原として用いられうる。膜貫通分子、例えばレセプター、これらの断片(例えばレセプターの細胞外ドメイン)が免疫原として使われてよい。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞が免疫原として使われてよい。このような細胞は、天然の供与源(例えば癌細胞株)から得られてもよいし、膜貫通分子を発現するように組換え技術によって形質移入された細胞であってもよい。抗体を調製するために有用な他の抗原および様式は、従来技術において明らかであろう。

ＶＩ．活性のアッセイ
本発明のヘテロ多量体タンパク質は、当該分野で公知の種々のアッセイにより、それらの物理的/化学的性質及び生物学的機能について特徴づけることができる。

精製されたヘテロ多量体タンパク質は、限定されないが、Ｎ末端配列決定、アミノ酸分析、非変性サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析法、イオン交換クロマトグラフィー及びパパイン消化を含む、一連のアッセイによって更に特徴づけることができる。

本発明の所定の実施態様において、本明細書にて産生された生産免疫グロブリンは、その生物学的活性について分析される。幾つかの実施態様において、本発明の免疫グロブリンはその抗原結合活性について試験される。当技術分野で知られており、本明細書で使用することができる抗原結合アッセイとしては、限定されないが、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びプロテインＡイムノアッセイなどの技術を使用する任意の直接的又競合的結合アッセイを含む。例示的な抗原結合アッセイは、実施例の項で以下に提供される。

一実施態様において、本発明は、インビボにおける抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能（例えば補体およびＡＤＣＣなど）が不要または有害である多くの用途のための望ましい候補とならしめる、全てではないが一部のエフェクター機能を有する改変抗体を意図している。所定の実施態様において、所望の特性だけが維持されていることを確実にするために、生成されたヘテロ多量体タンパク質のＦｃ活性が測定される。インビトロ及び／又はインビボでの細胞毒性アッセイでは、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために行うことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、ヘテロ多量体タンパク質がＦｃγＲ結合を欠くが（それゆえ、おそらくＡＤＣＣ活性を欠くが）、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確認するために行うことができる。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介する初代細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)の４６４ページの表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロでのアッセイの一例が、米国特許第５５００３６２号又は米国特許第５８２１３３７号に記載されている。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されるように、インビボで、例えば動物モデルにおいて評価することができるＣ１ｑ結合アッセイはまた、抗体が体Ｃ１ｑを結合することができないこと、したがって、ＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために行うことができる。補体活性を評価するために、ＣＤＣアッセイが、例えばGazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されるように実施することができる。ＦｃＲｎ結合、及びインビボでのクリアランス／半減期の測定はまた、当該分野で公知の方法を用いて行うことができる。

ＶＩＩ．コンジュゲートタンパク質
また、本発明は、本明細書中に記載のヘテロ多量体タンパク質(例えば本明細書において記述される方法に従って作製される抗体)の何れかを含む、コンジュゲート抗体又はイムノコンジュゲート(例えば「抗体-薬剤コンジュゲート」又は「ＡＤＣ)といったコンジュゲートされたタンパク質であって、このとき軽鎖または重鎖の定常領域のうちの一つが、色素又は細胞障害性剤、例えば化学療法剤、薬剤、増殖阻害性剤、毒素(例えば細菌、真菌、植物又は動物の起源の酵素的に活性な毒素ないしその断片)又は放射性同位体(すなわち放射性コンジュゲート)のような化学的分子にコンジュゲートしている、コンジュゲートされたタンパク質を提供する。特に、本明細書に記述されるように、ヘテロ多量体化ドメインの使用により２の異なる重鎖(ＨＣ１およびＨＣ２)並びに２の異なる軽鎖(ＬＣ１およびＬＣ２)を含有する抗体の構築が可能となる。本明細書に記述される方法を用いて構築されるイムノコンジュゲートは、重鎖のうちの一つ(ＨＣ１又はＨＣ２)又は軽鎖のうちの一つ(ＬＣ１又はＬＣ２)の定常領域にコンジュゲートした細胞障害性剤を含有してよい。また、イムノコンジュゲートがただ一つの重鎖または軽鎖に接着した細胞障害性剤を有しうるので、被検体に投与される細胞障害性剤の量は、重鎖と軽鎖の両方に接着した細胞障害性剤を有する抗体の投与と比較して低い。被検体に投与される細胞障害性剤の量を減らすことは、細胞障害性剤と関係する副作用を制限する。

細胞障害性又は細胞分裂停止性の薬剤、すなわち癌治療における腫瘍細胞を殺す又は阻害するための薬剤の局部運搬に抗体−薬剤コンジュゲートを用いると(Syrigos及びEpenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172；米国特許第４９７５２７８号）、腫瘍への薬剤成分の標的とする運搬とそこでの細胞内集積が可能となるものであり、この非コンジュゲート薬物作用剤の全身性投与により正常細胞並びに除去しようとする腫瘍細胞への毒性が容認できないレベルとなりうる(Baldwin等, (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,」 in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pincheraら. (ed.s), pp. 475-506)。これによって、最小限の毒性で最大限の効果を求める。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体はこの方策に有用であるとして報告されている(Rowland等,(1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87)。この方法に用いる薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビジン、メトトレキサート及びビンデジンが含まれる(Rowland等,(1986)、上掲)。抗体−毒素コンジュゲートに用いる毒素には、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、ゲルダナマイシン(Mandlerら(2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581；Mandlerら(2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028；Mandlerら(2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791)、メイタンシノイド(EP 1391213；Liu等, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)、及びカリケアマイシン(Lode等, (1998) Cancer Res. 58:2928；Hinman等, (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)などのリシン、小分子毒素などの植物毒が含まれる。該毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合又はトポイソメラーゼ阻害を含む機能によりその細胞障害性及び細胞分裂停止性の効果に影響しうる。ある種の細胞障害性剤は、大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドにコンジュゲートした場合に、不活性又は活性が低減する傾向がある。

免疫複合体(イムノコンジュゲート)の生成に有用な化学治療薬を本明細書中(例えば、上記)に記載した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP-S)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。例として1993年10月28日に公開の国際公開公報93/21232を参照のこと。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、^２１２Ｂｉ、^１３１Ｉ、^１３１Ｉｎ、^９０Ｙ及び^１８６Ｒｅが含まれる。抗体及び細胞障害性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートＨＣＬ等)、活性エステル(ジスクシンイミジルスベレート等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス-アジド化合物(ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等)、ジイソシアネート(トリエン２，６-ジイソシアネート等)、及びビス-活性フッ素化合物(１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等)を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号参照。

抗体のコンジュゲートと一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウロスタチン、トリコセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｎｅ）及びＣＣ１０６５、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体が、ここで考察される。

ｉ．メイタンシン及びメイタンシノイド
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは一又は複数のメイタンシノイド分子と結合している本発明の抗体(完全長又は断片)を含んでなる。

メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブＭａｙｔｅｎｕｓ ｓｅｒｒａｔａから単離されたものである（米国特許第３８９６１１１号）。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４１５１０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４１３７２３０号；同４２４８８７０号；同４２５６７４６号；同４２６０６０８号；同４２６５８１４号；同４２９４７５７号；同４３０７０１６号；同４３０８２６８号；同４３０８２６９号；同４３０９４２８号；同４３１３９４６号；同４３１５９２９号；同４３１７８２１号；同４３２２３４８号；同４３３１５９８号；同４３６１６５０号；同４３６４８６６号；同４４２４２１９号；同４４５０２５４号；同４３６２６６３号；及び同４３７１５３３号に開示されている。

メイタンシノイド薬剤成分は、（ｉ）発酵又は化学修飾、発酵産物の誘導体化によって調製するために相対的に利用可能である（ｉｉ）抗体に対する非ジスルフィドリンカーによる共役に好適な官能基による誘導体化に従う、（ｉｉｉ）血漿中で安定、そして（ｉｖ）様々な腫瘍細胞株に対して有効であるため、抗体薬剤コンジュゲートの魅力的な薬剤成分である。

メイタンシノイドを含有するイムノコンジュゲート、その作製方法及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第５２０８０２０号、同５４１６０６４号、欧州特許第０４２５２３５ Ｂ１号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。Liu等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合するＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含有するイムノコンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞障害性を有することが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ-２／ｎｅｕオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ.１に結合しているイムノコンジュゲートが記載されている。ＴＡ.１-メイタンシノイドコンジュゲートの細胞障害性はヒト乳癌株化細胞ＳＫ-ＢＲ-３におけるインビトロで試験され、細胞当たり３×１０^５ＨＥＲ-２表面抗原が発現した。薬剤コンジュゲートにより、遊離のメイタンシノイド剤に類似した細胞障害度が達成され、該細胞障害度は、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることにより増加する。Ａ７-メイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいては低い全身性細胞障害性を示した。

抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子に抗体を化学的に結合させることにより調製される。例えば、米国特許第５２０８０２０号（この開示内容は出典明記により特別に組み込まれる）を参照。１分子の毒素／抗体は、裸抗体の使用において細胞障害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均３−４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第５２０８０２０号、及び他の特許、及び上述した特許ではない刊行物に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。

例えば、米国特許第５２０８０２０号又は欧州特許第０４２５２３５ Ｂ１号、Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)、及び米国特許出願公開２００５／０１６９９３３号（これらの開示内容は出典明記により特別に組み込まれる)に開示されているもの等を含め、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。リンカー成分ＳＭＣＣを含んでなる抗体−メイタンシノイドコンジュゲートは、米国特許出願公開２００５／０１６９９３３に開示されるように調製されうる。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。更なる結合基を本願明細書中に記載し、例示する。

抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、ジスルフィド結合により提供されるＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)及びＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737[1978])が含まれる。

リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。好ましい実施形態において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ-３位で形成される。

ｉｉ．アウリスタチン類及びドラスタチン類
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは、ドラスタチン又はドロスタチンペプチジル類似体及び誘導体、アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）（米国特許第５６３５４８３号；同第５７８０５８８号）にコンジュゲートした本発明の抗体を含んでなる。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解及び核と細胞の分割を妨げ(Woyke 等 (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584)、抗癌活性(米国特許第5663149号)及び抗真菌性活性(Pettit 等 (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)を有することが示されている。ドラスタチン又はアウリスタチン薬剤成分は、ペプチジル薬剤分子のＮ(アミノ)末端又はＣ(カルボキシル)末端により抗体に接着しうる(国際公開公報０２／０８８１７２）。

例示的なアウリスタチンの実施態様は、Ｎ末端連結モノメチルアウリスタチン薬剤成分ＤＥ及びＤＦを含み、"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", 米国出願公開２００５／０２３８６４９号に開示される。この開示内容は出典明記によってその全体が特別に組み込まれる。

一般的に、ペプチドベースの薬剤成分は、２以上のアミノ酸及び／又はペプチド断片間でペプチド結合を形成することによって調製されうる。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野において周知の液相合成方法に従って調製することができる(E. Schroder and K. Lubke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Pressを参照)。アウリスタチン／ドラスタチン薬剤成分は、米国特許第5635483号；同第5780588号；Pettit et al., J. Nat. Prod. 44:482-485 (1981)；Pettit et al., Anti-Cancer Drug Design 13:47-66 (1998)；Poncet, Curr. Pharm. Des. 5:139-162 (1999)；およびPettit, Fortschr. Chem. Org. Naturst. 70:1-79 (1997)の方法に従って調製されうる。また、Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7): 778-784；および"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands" 米国出願公開２００５０２３８６４９も参照のこと。これらは出典明記によってその全体が本願明細書中に組み込まれる(例えば、リンカー及びモノメチルバリン化合物、例えばＭＭＡＥ及びリンカーにコンジュゲートしたＭＭＡＦの調整方法を開示している)。

ｉｉｉ．カリケアマイシン
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した本発明の抗体を含んでなる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５７１２３７４号、同５７１４５８６号、同５７３９１１６号、同５７６７２８５号、同５７７０７０１号、同５７７０７１０号、同５７７３００１号、同５８７７２９６号（全て、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ_１ ^Ｉ、α_２ ^Ｉ、α_３ ^Ｉ、Ｎ-アセチル-γ_１ ^Ｉ、ＰＳＡＧ及びθ^Ｉ _１(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。

ｉｖ．他の細胞障害剤
本発明の抗体またはここに記載の方法に従って作製された抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５−フルオロウラシル、米国特許第５０５３３９４号、同５７７０７１０号に記載されており、集合的にＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎｅ）（米国特許第５８７７２９６号）が含まれる。

使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(PAPI、PAPII及びPAP-S)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。

本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ)との間に形成されるイムノコンジュゲートをさらに考察する。

腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗体を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例には、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２、Ｐｂ^２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。コンジュゲートが検出に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ^９９ｍ又はＩ^１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）映像（磁気共鳴映像、ｍｒｉとしても公知）用のスピン標識、例えばヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。

放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ^９９ｍ又はＩ^１２３、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８及びＩｎ^１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。ＩＯＤＯＧＥＮ法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。

抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。例として国際公開第94/11026号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号）。

本発明の化合物は、限定するものではないが、架橋剤：市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａより）ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−（４−ビニルスルホン）安息香酸塩）にて調製したＡＤＣが特に考えられる。Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ａｎｄ Ｃａｔａｌｏｇ ２００３−２００４の４６７−４９８頁を参照。

ｖ．コンジュゲート抗体の調製
本発明のコンジュゲート抗体において、抗体を、場合によってリンカーを介して、一つ以上の薬剤部分（例えば薬剤部分）、例えば抗体につき約１〜約２０の部分にコンジュゲートする。コンジュゲート抗体はいくつかの手段、当業者に公知の有機化学反応、状態及び試薬を用いて調製されうる：（１）共有結合による二価のリンカー試薬と抗体の求核基との反応の後に対象の部分と反応；及び（２）共有結合による二価のリンカー試薬と部分の求核基との反応の後に抗体の求核基との反応、が含まれる。コンジュゲート抗体を調製するための更なる方法は本願明細書中に記載される。

リンカー試薬は、一つ以上のリンカー成分から成ってもよい。例示的なリンカー成分は、６-マレイミドカプロイル(「ＭＣ」)、マレイミドプロパノイル(「ＭＰ」)、バリン-シトルリン（「ｖａｌ−ｃｉｔ」）、アラニン−フェニルアラニン（「ａｌａ−ｐｈｅ」）、ｐ−アミノベンジルオキシカルボンイル(「ＰＡＢ」)、Ｎ-スクシンイミジル４(２-ピリジルチオ)ペンタノエート(「ＳＰＰ」)、Ｎ-スクシンイミジル４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１カルボキシレート(「ＳＭＣＣ」)、及びＮ-スクシンイミジル(４-イオド-アセチル)アミノ安息香酸エステル(「ＳＩＡＢ」)を含む。更なるリンカー成分は当分野で公知であり、そのいくつかは本願明細書において記述される。また、"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、米国出願公開２００５／０２３８６４９を参照。その内容は出典明記により本願明細書に組み込まれる。

いくつかの実施態様では、リンカーはアミノ酸残基を含みうる。例示的なアミノ酸リンカー成分には、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド又はペンタペプチドなどがある。例示的なジペプチドは、バリン−シトルリン（ｖｃ又はｖａｌ−ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン（ａｆ又はａｌａ−ｐｈｅ）を含む。例示的なトリペプチドは、グリシン−バリン−シトルリン（ｇｌｙ−ｖａｌ−ｃｉｔ）及びグリシン−グリシン−グリシン（ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ）を含む。アミノ酸リンカー成分を含んでなるアミノ酸残基は、天然に生じるもの、並びに微量のアミノ酸及び非天然に生じるアミノ酸類似体、例えばシトルリンを含む。アミノ酸リンカー成分は設定され、特に酵素、例えば腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ及びＤ又はプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断の選択性に最適化できる。

抗体上の求核基には、限定するものでなく、以下のものを含む：（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリシン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えばシステイン、及び（ｉｖ）抗体がグリコシル化される糖水酸基又はアミノ基。アミン、チオール及び水酸基は、求核であり、反応して、リンカー部分上の求電子性の群及びリンカー試薬により共有結合を形成することができる：（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸及び酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド群、が含まれる。特定の抗体は、還元しうる鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、還元剤、例えばＤＴＴ（ジチオトレイトール）による処置によって、リンカー試薬を用いたコンジュゲート反応を行ってもよい。ゆえに、各々のシステイン架橋は、理論的には、２の反応性のチオール求核基を形成する。チオールにアミンを転換させる２−イミノチオラン（トラウトの試薬）を用いてリシンを反応させることによって抗体に付加的な求核基を導入することができる。反応性のチオール基は、１、２、３、４又はそれ以上のシステイン残基を導入する（例えば、一又は複数の非天然のシステインアミノ酸残基を含んでなる変異体抗体を調製する）ことによって抗体（又は、その断片）に導入されてもよい。

また、本発明のコンジュゲート抗体は、抗体を修飾して求電子性の部分を導入する(リンカー試薬又は薬剤又は抗体部分上の求核置換基と反応させることができる)ことによって生成してもよい。グリコシル化された抗体の糖質を、例えば過ヨウ素酸塩酸化剤を用いて酸化して、リンカー試薬又は薬剤又は他の部分のアミン基と反応するアルデヒド又はケトン基を形成させてもよい。生じたイミンシッフ塩基群が安定結合を形成するか、又は例えば安定アミン結合を形成させるホウ化水素試薬によって、還元してもよい。一実施態様では、ガラクトースオキシダーゼ又はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩の何れかによるグリコシル化抗体の炭水化物部分の反応により、薬剤又は他の部分（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）上の適当な基と反応することができるタンパク質のカルボニル（アルデヒド及びケトン）基が生じうる。他の実施態様では、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を含んでいるタンパク質はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩と反応して、第一のアミノ酸の代わりにアルデヒドを生成する(Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146；米国特許第５３６２８５２号）。このようなアルデヒドは、薬剤部分又はリンカー求核基と反応することができる。

同様に、部分（例えば薬剤部分）上の求核基には、限定するものではないが、以下のものを含む：反応して、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子性の基と共有結合することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸エステル及びアリールヒドラジド基：（ｉ）活性エステル（例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸及び酸ハロゲン化物）；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；および（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド基、が含まれる。

別法として、抗体及び細胞障害剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを個体に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から非結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。

ＶＩＩＩ．実用性
本明細書にて与えられる本方法は、ヘテロ多量体タンパク質の生産において産業上の利用可能性を見いだしている。本発明の方法は、２つの別々な発酵において固有の技術的な難しさがあるため、２つの別々な発酵と単離に必要な作業の量を減らす。更に、従来の方法の手順のアニーリング（ａｎｎｅａｌｍｅｎｔ）と酸化還元工程の排除は、収量を上げ、処理の複雑さとコストを削減することができる。

本明細書中に記載のヘテロ多量体タンパク質は、例えば、インビトロ、エクスビボ及びインビボでの治療方法に用途を見出している。本発明は、これらの分子の1つまたは複数を使用することに基づいく様々な方法を提供する。特定の病的状態において、ヘテロ多量体タンパク質、例えば、多選択性を利用することが必要であるか及び／又は望ましい。本発明は、例えば、治療薬、予防薬及び診断薬として、様々な目的のために使用することができるヘテロ多量体タンパク質を提供する。例えば、本発明は、疾患を治療する方法を提供し、該方法は、治療を必要とする被検体に、本発明のヘテロ多量体タンパク質を投与することを含み、それによって疾患が治療される。本明細書に記載された本発明のヘテロ多量体タンパク質のいずれかは、本明細書に記載の治療（又は予防又は診断）の方法で使用することができる。

例えば、ヘテロ多量体タンパク質が多価である場合には、価値ある利点は、それらの抗原に対してそれらが提示する結合活性の増強である。抗原ベースに対する結合単位（すなわちＦａｂ）の本質的な高い親和性を有することに加え、正常なＩｇＧ抗体はまた、標的に対するそれらの二価結合の結果として、抗原との結合を増加させる結合活性効果を利用している。

同じ抗原分子上の２つの別々のエピトープに対するヘテロ多量体タンパク質は、（二価結合のため）強化された結合親和力の利点を与え得るたけでなく、親抗体の何れかに結合していない新規な特性を獲得し得る。従って、本発明のヘテロ多量体タンパク質は、例えば、レセプター−リガンド相互作用の遮断に用途を見出している。

本明細書に記載のヘテロ多量体タンパク質はまた、一つの分子で２つの標的のシグナル伝達経路を遮断することの用途における使用を見いだしている。

ＩＸ．治療上の使用
本明細書に記載の抗体又は抗体断片などのヘテロ多量体タンパク質(例えば本明細書に記述される方法に従って作製される抗体及び／又はその断片)は、治療上の適用のために使われてよい。例えば、このようなヘテロ多量体タンパク質は、前癌性、非転移性、転移性および癌性の腫瘍(例えば初期癌)を含む腫瘍の治療のため、アレルギー性または炎症性の疾患の治療のため、または自己免疫性疾患の治療のため、または、癌(例えば乳癌、結腸直腸癌、肺癌、腎臓細胞カルチノーマ、膠腫又は卵巣癌)、アレルギー性または炎症性の疾患又は自己免疫性疾患を発症するリスクがある被検体の治療のために使われてよい。

癌なる用語は、前癌性の増殖、良性腫瘍及び悪性腫瘍を含むがこれに限らず、一まとまりの増殖性疾患を包含する。良性腫瘍は、起源の部位に限局化されたままであり、遠位部位に浸潤、侵入又は転移する能力を有していない。悪性腫瘍は、周辺の他の組織に侵入して、障害を与える。また、それらは、起源の部位から切り離れる能力を獲得し、通常はリンパ節が配置されるリンパ系や血流を介して身体の他の部位に拡がりうる(転移する)。原発性腫瘍は、それらが生じる組織の種類によって分類され、転移性腫瘍は、癌細胞が由来する組織の種類によって分類される。時間とともに、悪性腫瘍の細胞は、より異常になり、正常細胞のようではなくなる。癌細胞にみられるこの変化は、腫瘍グレードと呼ばれており、癌細胞は、十分に分化されている、中程度に分化されている、ほとんど分化されていない、又は、未分化であると表される。十分に分化した細胞はで全く正常な見かけであり、起源の正常細胞のようである。未分化な細胞は、細胞の起源を決定することがもはや不可能であるほど異常となっている細胞である。

腫瘍は固形腫瘍であるか、或いは非固形腫瘍又は軟組織腫瘍でありうる。軟組織腫瘍の例には、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、成人急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、成熟Ｂ細胞急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、前リンパ球性白血病、又はヘアリーセル白血病）、或いはリンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、又はホジキン病）が含まれる。固形腫瘍には、血液、骨髄、又はリンパ系以外の身体組織のあらゆる癌が含まれる。固形腫瘍は更に、上皮細胞を起源とするものと、非上皮細胞を起源とするものとに分けられる。上皮細胞固形腫瘍の例には、胃腸管、結腸、胸部、前立腺、肺、腎臓、肝臓、膵臓、卵巣、頭頸部、口腔、胃、十二指腸、小腸、大腸、肛門、胆嚢、下唇、鼻いん頭、皮膚、子宮、男性生殖器、泌尿器、膀胱、及び皮膚の腫瘍が含まれる。非上皮起源の固形腫瘍には、肉腫、脳腫瘍、及び骨腫瘍が含まれる。

上皮性癌は一般に、良性腫瘍から侵襲前段階(例えばインサイツでの癌腫)、基底膜を透過して、上皮下間質に侵入した悪性癌に発達する。

また、多選択性タンパク質複合体は治療上の適用にも用いることができ、ＨＥＲ２を結合する抗体は、特に、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、腎臓細胞癌腫、膠腫又は卵巣癌を治療するために用いることができる。

本発明の組成物が投与される候補にある他の患者は、血管結合組織の異常増殖、赤瘡、後天性免疫不全症候群、動脈閉塞、アトピー性角膜炎、細菌性潰瘍、ベーチェット疾患、血液が媒介する腫瘍、頸動脈閉塞性疾患、脈絡叢血管新生、慢性炎症、慢性網膜剥離、慢性ブドウ膜炎、慢性 硝子体炎、コンタクトレンズ疲労、角膜移植片拒絶、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、クローン病、イールズ病、流行性角結膜炎、真菌潰瘍、単純ヘルペス感染、帯状ヘルペス感染、過粘稠度症候群、カポシ肉腫、白血病、脂質変性、ライム病、周縁表皮剥離、モーレン潰瘍、ハンセン病以外のマイコバクテリア感染、近視、眼性新生血管疾患、視神経窩、オスラー-ウェーバー症候群(オスラー-ウェーバー-ランデュ)、骨関節炎、パジェット病、毛様体扁平部炎、類天疱瘡、phylectenulosis、多発動脈炎、レーザー後合併症、原生動物の感染、弾性線維性偽性黄色腫、翼状片角膜炎乾燥、放射状角膜切開、網膜血管新生、未熟児の網膜症、水晶体後繊維増殖、類肉腫、強膜炎、鎌状赤血球貧血、シェーグレン症候群、固形腫瘍、シュタルガルト病、スティーブンジョンソン病、上辺縁角膜炎、梅毒、全身狼瘡、テリアン周縁変性、トキソプラズマ症、ユーイング肉腫の腫瘍、神経芽細胞腫の腫瘍、骨肉腫の腫瘍、網膜芽細胞腫の腫瘍、横紋筋肉腫の腫瘍、潰瘍性大腸炎、静脈閉塞、ビタミンＡ欠乏、ヴェゲナー肉芽腫、糖尿病と関係している望ましくない脈管形成、寄生虫病、異常な創傷治癒、手術、損傷又は外傷後の肥大(例えば急性の肺損傷／ＡＲＤＳ)、体毛成長の阻害、排卵および黄体形成の阻害、移植の阻害および子宮における胚発達の阻害を有するか、又は発症するリスクにある。

本明細書中に記載の方法に従って作製されるコイルドコイル含有抗体、テザー抗体又は抗体を用いて治療されうるアレルギー性ないし炎症性疾患または自己免疫性疾患の例には、限定するものではないが、関節炎(関節リウマチ(例えば急性の関節炎、慢性の関節リウマチ、痛風性関節炎、急性の痛風性関節炎、慢性炎症性関節炎、変形性関節症、感染性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬の関節炎、椎骨関節炎及び若年性発症関節リウマチ、骨関節炎、関節炎慢性化、関節炎変形、関節炎慢性原発、反応性関節炎、及び強直性脊椎炎)、炎症性過剰増殖性皮膚病、乾癬、例えばプラーク乾癬、滴状乾癬、膿疱性乾癬及び爪乾癬)、皮膚炎、例として接触皮膚炎、慢性接触皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、ヘルペス状の皮膚炎、貨幣状皮膚炎、脂漏性皮膚炎、非特異的皮膚炎、一次刺激物接触皮膚炎及び過敏性皮膚炎、Ｘ連鎖性過剰ＩｇＭ症候群、蕁麻疹、例えば慢性アレルギー性蕁麻疹及び慢性特発性蕁麻疹、例として慢性自己免疫蕁麻疹、多発性筋炎／皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、中毒性上皮性表皮壊死症、強皮症(全身強皮症を含む)、硬化症、例えば全身性硬化症、多発性硬化症(ＭＳ)、例えば脊椎-眼(spino-optical) ＭＳ)、一次進行性ＭＳ(ＰＰＭＳ)及び再発性寛解ＭＳ(ＲＲＭＳ)、進行性全身性硬化症、アテローム性動脈硬化、動脈硬化症、硬化症汎発、失調性硬化症、炎症性腸疾患(ＩＢＤ)(例えばクローン病、自己免疫性胃腸疾患、大腸炎、例えば潰瘍性大腸炎、大腸性潰瘍、微細な大腸炎、膠原性大腸炎、大腸ポリープ、壊死性全腸炎及び経壁の大腸炎、及び自己免疫炎症性腸疾患)、膿皮症壊疽、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、上強膜炎、呼吸窮迫症候群、例として成人性又は急性の呼吸窮迫症候群(ＡＲＤＳ)、髄膜炎、葡萄膜の全部又は一部の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫血液疾患、リウマチ様脊椎炎、リウマチ様関節滑膜炎、突発性聴力障害、ＩｇＥ媒介性疾患、例えばアナフィラキシー及びアレルギー性鼻炎及びアトピー性鼻炎、脳炎、例えばラスマッセンの脳炎及び辺縁及び／又は脳幹脳炎、ブドウ膜炎、例として、前部ブドウ膜炎、急性前ブドウ膜炎、肉芽腫ブドウ膜炎、非顆粒性ブドウ膜炎、水晶体抗原性ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎又は自己免疫ブドウ膜炎、ネフローゼ症候群を有する又は有さない糸球体腎炎(ＧＮ)、例として、慢性又は急性の糸球体腎炎、例として原発性ＧＮ、免疫性ＧＮ、膜性ＧＮ(膜性ネフロパシ)、特発性膜性ＧＮ又は特発性膜性ネフロパシ、膜又は膜性増殖性ＧＮ(ＭＰＧＮ)(タイプＩ及びタイプＩＩを含む)、急速進行性ＧＮ、アレルギー性症状、アレルギー性反応、湿疹、例としてアレルギー性又はアトピー性湿疹、喘息、例えば喘息気管支炎、気管支喘息及び自己免疫喘息、Ｔ細胞の浸潤を伴う症状及び慢性炎症反応、慢性肺炎症性疾患、自己免疫心筋炎、白血球粘着力欠損、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)又は全身性ループスエリテマトーデス、例えば皮膚ＳＬＥ、亜急性の皮膚ＳＬＥ、新生児期ループス症候群(ＮＬＥ)、紅班性狼瘡汎発、ループス(例としてループス腎炎、ループス脳炎、小児ループス、非腎性ループス、腎外ループス、円板状ループス、脱毛症ループス)、若年性開始型(Ｉ型)真正糖尿病、例として小児インシュリン依存性真正糖尿病(ＩＤＤＭ)、成人発症型真正糖尿病(ＩＩ型糖尿病)、自己免疫性糖尿病、特発性の尿崩症、サイトカイン及びＴリンパ球によって媒介される急性及び遅発性過敏症と関係する免疫応答、結核、サルコイドーシス、肉芽腫症、例としてリンパ腫肉芽腫症、ヴェゲナーの肉芽腫症、無顆粒球症、脈管炎、例として血管炎、大血管性血管炎(例えば大脈管脈管炎(リウマチ性多発性筋痛及び巨細胞(高安)動脈炎を含む)、中脈管脈管炎(川崎病及び結節性多発動脈炎を含む)、微小多発動脈炎、ＣＮＳ脈管炎、壊死性血管炎、皮膚性血管炎又は過敏性血管炎、全身性壊死性血管炎、及びＡＮＣＡ関連の脈管炎、例としてチャーグ-ストラウス脈管炎又は症候群(ＣＳＳ))、側頭動脈炎、無形成性貧血、自己免疫無形成性貧血、クームズ陽性貧血症、ダイアモンドブラックファン貧血症、溶血性貧血又は免疫溶血性貧血、例として自己免疫溶血性貧血(ＡＩＨＡ)、悪性貧血(貧血症悪性熱)、アジソン病、純粋な赤血球貧血症又は形成不全(ＰＲＣＡ)、第VIII因子欠損症、血友病Ａ、自己免疫好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球血管外遊出を伴う疾患、ＣＮＳ炎症性疾患、多器官損傷症候群、例えば敗血症、外傷又は出血の二次症状、抗原-抗体複合体関連疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット又はベーチェット病、カールスマン症候群、グッドパスチャー症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンスジョンソン症候群、類天疱瘡、例えば水疱性類天ぽうそう及び類天疱瘡皮膚、天疱瘡(尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、ペンフィグス粘液膜類天疱瘡及び天疱瘡エリテマトーデスを含む)、自己免疫多腺性内分泌障害、ライター病又は症候群、免疫複合体腎炎、抗体媒介性腎炎、視神経脊髄炎、多発性神経炎、慢性神経障害、例えばＩｇＭ多発性神経炎又はＩｇＭ媒介性神経障害、血小板減少(例えば心筋梗塞患者によるもの)、例えば血栓性血小板減少性紫斑病(ＴＴＰ)、及び自己免疫性又は免疫媒介性血小板減少、例えば慢性及び急性のＩＴＰを含む特発性血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)、自己免疫性精巣炎及び卵巣炎を含む精巣及び卵巣の自己免疫性疾患、一次甲状腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、自己免疫内分泌性疾患、例えば甲状腺炎、例えば自己免疫性甲状腺炎、橋本病、慢性甲状腺炎(橋本甲状腺炎)又は亜急性の甲状腺炎、自己免疫甲状腺性疾患、特発性甲状腺機能低下症、グレーブ病、自己免疫多腺性症候群、例として多腺性症候群(又は、多腺性内分泌障害症候群)、腫瘍随伴症候群、例として神経系新生物関連症候群、例えばランバート-イートン筋無力症症候群又はイートン―ランバート症候群、スティッフマン又はスティッフマン症候群、脳脊髄炎、例として、アレルギー性脳脊髄炎又は脳脊髄炎性アレルギー及び実験的アレルギー性脳脊髄炎(ＥＡＥ)、重症筋無力症、例えば胸腺腫関連の重症筋無力症、小脳性退化、神経ミオトニ、眼球クローヌス又は眼球クローヌス筋硬直症候群(ＯＭＳ)及び感覚系神経障害、多病巣性運動神経障害、シーハン症候群、自己免疫肝炎、慢性肝炎、類狼瘡肝炎、巨細胞肝炎、慢性活動性肝炎又は自己免疫慢性活動性肝炎、リンパ系間隙間質性肺炎(ＬＩＰ)、閉塞性細気管支炎(非移植)対ＮＳＩＰ、ギラン‐バレー症候群、ベルガー病(ＩｇＡネフロパシ)、特発性ＩｇＡネフロパシ、線状ＩｇＡ皮膚病、原発性胆管萎縮症、肺線維症、自己免疫腸疾患症候群、セリアック病、コエリアック病、脂肪便症(グルテン腸疾患)、抵抗性スプルー、特発性スプルー、クリオグロブリン血症、アミロトロフィック側索硬化症(ＡＬＳ；筋萎縮性側索硬化症(Lou Gehrig's disease))、冠状動脈疾患、自己免疫性耳疾患、例として、自己免疫内耳疾患(ＡＩＥＤ)、自己免疫聴力障害、眼球クローヌス筋硬直徴候(ＯＭＳ)、多発性軟骨炎、例として、抵抗性又は再発性多発性軟骨炎、肺胞状蛋白症、アミロイドーシス、強膜炎、非癌性リンパ球増多症、一次リンパ球増多症、これにはモノクローナルＢ細胞リンパ球増多症(例えば良性モノクローナル免疫グロブリン症及び未同定の有意なモノクローナル免疫グロブリン血症(monoclonal gammopathy of undetermined significance)、ＭＧＵＳ)が含まれる、末梢性神経障害、腫瘍随伴症候群、チャネル病、例として、癲癇、片頭痛、不整脈、筋疾患、難聴、盲目、周期性麻痺及びＣＮＳのチャネル病、自閉症、炎症性ミオパシ、局所性分節性糸球体硬化症(ＦＳＧＳ)、内分泌性眼障害、ブドウ膜網膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫性肝臓病、線維症、多内分泌性不全、シュミット症候群、副腎炎、胃萎縮、初老期痴呆、脱髄性疾患、例として自己免疫脱髄性病、糖尿病性ネフロパシ、ドレスラー症候群、円形脱毛症、ＣＲＥＳＴ症候群(石灰沈着、レイノー現象、食道運動障害、強指症及び毛細管拡張症)、雌雄自己免疫性不妊性、混合性結合組織病、シャーガス病、リウマチ熱、再発性中絶、農夫肺、多形性紅斑、心切開術後症候群、クッシング症候群、愛鳥家肺、アレルギー性肉芽腫性脈管炎、良性リンパ球血管炎、アルポート症候群、肺胞炎、例えばアレルギー性肺胞炎及び繊維化肺胞炎、間隙肺疾患、輸血反応、ハンセン病、マラリア、リーシュマニア症、キパノソミアシス(kypanosomiasis)、住血吸虫症、蛔虫症、アスペルギルス症、サンプター症候群、カプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維形成、広汎性間質性肺線維形成、間質性肺線維形成、特発性の肺線維形成、嚢胞性線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、胎児赤芽球症、好酸性筋膜炎(eosinophilic faciitis)、シャルマン症候群、フェルティー症候群、フィラリア(flariasis)、毛様体炎、例えば慢性毛様体炎、ヘテロ慢性毛様体炎、虹彩毛様体炎、又はＦｕｃｈの毛様体炎)、ヘーノホ-シェーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)感染、エコーウィルス感染、心筋症、アルツハイマー病、パルボウィルス感染、風疹ウィルス感染、種痘後症候群、先天性風疹感染、エプスタインバーウイルス感染、耳下腺炎、エヴァンの症候群、自己免疫性腺機能不全、シドナム舞踏病、連鎖球菌感染後腎炎、閉塞性血栓性血管炎(thromboangitis ubiterans)、甲状腺中毒症、脊髄癆、脈絡膜炎、巨細胞多発性筋痛、内分泌性眼障害、慢性過敏性肺炎、乾性角結膜炎、流行性角結膜炎、特発性腎臓症候群、微小変化ネフロパシ、良性家族性及び乏血-再灌流障害、網膜自己免疫、関節炎症、気管支炎、慢性閉塞性気道疾患、珪肺症、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化症疾患、アスペルミオジェネース(aspermiogenese)、自己免疫性溶血、ベック病、クリオグロブリン血症、デュピュイトラン拘縮、水晶体過敏性眼内炎、腸炎アレルギー、結節性紅斑、leprosum、特発性顔麻痺、慢性疲労症候群、リウマチ性熱、ハンマンリッチ病、感覚器性(sensoneural)聴力障害、血色素尿症発作(haemoglobinuria paroxysmatica)、性機能低下、回腸炎領域、白血球減少症、単核細胞増加症感染、横移動脊髄炎、一次特発性の粘液水腫、ネフローゼ、眼炎symphatica、精巣炎肉芽腫症、膵炎、多発性神経根炎急性、膿皮症壊疽、Ｑｕｅｒｖａｉｎ甲状腺炎、後天性脾臓萎縮、抗精子抗体による不妊性、非悪性胸腺腫、白斑、ＳＣＩＤ及びエプスタインバーウイルス関連疾患、後天性免疫不全症候群(エイズ)、寄生虫病、例えばLesihmania、毒性ショック症候群、食中毒、Ｔ細胞の浸潤を伴う症状、白血球-粘着力欠損、サイトカイン及びＴリンパ球に媒介される急性及び遅発性過敏症関連免疫応答、白血球血管外遊出を伴う疾患、多器官損傷症候群、抗原-抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、アレルギー性神経炎、自己免疫多腺性内分泌障害、卵巣炎、原発性粘液水腫、自己免疫萎縮性胃炎、交感性眼炎、リウマチ性疾患、混合性結合組織病、ネフローゼ症候群、膵島炎、多内分泌性不全、末梢性神経障害、自己免疫多腺性症候群Ｉ型、成人発症型特発性副甲状腺機能低下症(ＡＯＩＨ)、完全脱毛症、拡張型心筋症、後天性表皮水疱症(ＥＢＡ)、ヘモクロマトーシス、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性又は非化膿性副鼻腔炎、急性又は慢性副鼻腔炎、篩骨、正面、上顎骨又は蝶形骨副鼻腔炎、好酸球性関連疾患、例えば好酸球増加症、肺浸潤好酸球増加症、好酸球増加症-筋肉痛症候群、レフラー症候群、慢性好酸性肺炎、熱帯肺好酸球増加症、気管支肺炎アスペルギルス症、アスペルギローム又は好酸球性を含有する肉芽腫、アナフィラキシー、血清陰性脊椎関節炎疹、多内分泌性自己免疫性疾患、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性皮膚粘膜カンジダ症、ブラットン症候群、乳児期の一過性低ガンマグロブリン血症、ウィスコット‐アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症候群、膠原病と関係する自己免疫疾患、リウマチ、神経病学的疾患、虚血性再灌流障害、血圧応答の減退、血管機能不全、antgiectasis、組織損傷、心血管乏血、痛覚過敏、脳虚血、及び脈管化を伴う疾患、アレルギー性過敏症疾患、糸球体腎炎、再灌流障害、心筋又は他の組織の再
灌流損傷、急性炎症性成分を有する皮膚病、急性化膿性髄膜炎又は他の中枢神経系炎症性疾患、眼性及び眼窩の炎症性疾患、顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘発性毒性、急性重症炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、肺線維症、糖尿病性網膜症、糖尿病性大動脈疾患、動脈内過形成、消化性潰瘍、弁膜炎、及び子宮内膜症などがある。

治療的な使用に加えて、本発明の抗体は、本明細書中に記載の疾患および症状についての診断的方法といった診断方法を含む他の目的のために用いられうる。

Ｘ．用量、製剤および持続時間
本発明のタンパク質は、良好な医療行為に一致した形で処方され、投与量が決められ、投与される。この場合に考慮される因子には、治療されている特定の疾患、治療されている特定の哺乳動物、個々の被検体の臨床症状、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医師に知られている他のファクターが含まれる。投与されるタンパク質の「治療上有効量」は、このような考慮によって調整され、特定の疾患(例えば癌、アレルギーないし炎症性疾患または自己免疫性疾患)を予防するか、改善するかまたは治療するために必要な最小限量である。タンパク質は、必ずしもそうする必要はないが、場合によっては、疾患の予防又は治療のために現在使用されている一又は複数の薬剤と共に処方される。かかる他の薬剤の有効量は、製剤中に存在するタンパク質の量、疾患又は治療のタイプ、及び上で検討した他の因子に依存する。これらは、一般に、これまで使用されたものと同じ用量及び投与経路で、あるいはこれまで用いられた投薬量の約１から９９％で使用される。一般に、癌の寛解又は治療は、癌と関係する一又は複数の症状又は医学的な問題を少なくすることを伴う。治療上有効な量の薬剤によって、以下の何れか又はいくつかが達成される。癌細胞数の(少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％以上の)減少；腫瘍サイズ又は腫瘍負担の低減又は阻害；周辺臓器への癌細胞の浸潤の阻害(すなわちある程度の減少及び／又は停止)；腺腫の場合のホルモン分泌の低減；血管密度の低減；腫瘍転移の阻害；腫瘍増殖の低減又は阻害；及び／又は、癌関連の一又は複数の症状のある程度の軽減。ある実施態様では、タンパク質を用いて、被検体の癌又は自己免疫性疾患の発症又は再発を防ぐ。

一実施態様では、本発明は、癌又は自己免疫性疾患に罹りやすいか又はそうと診断されたヒト被検体の生存期間を増すために用いられうる。生存期間は、薬剤の最初の投与から死亡の時と定める。また、生存期間は治療中の被検体の死亡のリスクを表す、コントロール群に対する治療群の危険率(ＨＲ)を層別化することによって測定することもできる。

更に他の実施態様では、本発明の治療法は、様々な抗癌療法にて治療される癌であると疑われるか診断された一群のヒト被検体において奏効率を有意に増加させる。奏効率は治療に反応した治療された患者の割合と定義される。一態様では、本発明のタンパク質と、手術、放射線療法又は一又は複数の化学療法剤を使用する本発明の併用治療法は、手術、放射線療法又は化学療法単独で治療された群と比較して治療被検体群において奏効率を有意に増大させ、該奏効率は０．００５未満のχ二乗ｐ値を有する。癌の治療における治療上の有効性の他の測定値は米国特許出願公開２００５０１８６２０８に記載される。

治療用製剤は、所望の純度を有する活性成分を、任意の生理的に許容される担体、賦形剤又は安定剤と混合することによって、当分野で公知の標準的な方法を用いて調製される(Remington's Pharmaceutical Sciences (20th edition), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA)。許容可能な担体には、生理食塩水、又はリン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などのバッファ；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量(およそ１０未満の残基)のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン、アミノ酸、例として、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；単糖、二糖および他の炭水化物、例としてグルコース、マンノース又はデキストリン；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトール又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；および／又は非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ^ＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ^ＴＭ又はＰＥＧが含まれる。

場合によって、しかし、好ましくは、製剤は、薬学的に許容可能な塩、好ましくは塩化ナトリウムを、好ましくは生理的濃度で含有する。場合によって、本発明の製剤は、薬学的に許容可能な防腐剤を含有してもよい。いくつかの実施態様では、保存の濃度は、０．１から２．０％、一般的にｖ／ｖの範囲である。好適な防腐剤には製薬の分野で知られているものが含まれる。ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベンおよびプロピルパラベンは、好適な防腐剤である。場合によって、本発明の製剤は、０．００５〜０．０２％の濃度で、薬学的に許容可能な界面活性剤を含んでもよい。

また、本明細書中の製剤は、治療される特定の徴候の必要に応じて、一よりも多い活性な化合物、好ましくは互いに悪影響を与えない相補的活性を有するものを含有してもよい。このような分子は、意図する目的のために有効である量で組み合わされて適切に存在する。

活性成分はまた、コロイド性薬物デリバリーシステム(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロカプセル、ミクロエマルション、ナノ−粒子、およびナノカプセルなど)又はマクロエマルション中、例えば、それぞれ、コアセルベーション法又は界面重合法によって製造された、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−(メチルメタシラート）（ｐｏｌｙ−（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ）マイクロカプセルに取込むことができる。このような技術は、上掲のRemington's Pharmaceutical Sciencesにおいて開示される。

徐放性製剤も調製できる。徐放性製剤の適切な例には、ヘテロ多量体タンパク質を含有する固形疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれ、このマトリックスはフィルムやマイクロカプセル等の成形品の形である。徐放性マトリックスの例として、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２−ヒドロキシエチルメタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール))、ポリアクチド(米国特許第３７７３９１９号)、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタマートの共重合体、非−分解性エチレン−ビニルアセテート、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ^ＴＭ(乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ ａｃｅｔａｔｅ）から構成される注射用ミクロスフェア)のような分解性乳酸−グリコール酸共重合体、およびポリ−Ｄ−(−)−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グルコール酸のようなポリマーは分子を１００日間にわたって放出することができるが、ある種のヒドロゲルはタンパクをより短時間の間放出する。被包されたヘテロ多量体タンパク質が体内に長時間維持された場合、３７℃で水分に暴露されて変性するか凝集し、結果として生物学的活性を失い免疫原性が変化するかもしれない。関与する機構に応じて安定化のための合理的な戦略を考案することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を介する分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であることが分かれば、安定化は、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含量のコントロール、適当な添加物の使用、および特異的なポリマーマトリックス組成物の使用によって達成することができる。

ここに記載のタンパク質(例えばヘテロ多量体タンパク質またはここに記載の方法に従って作製された多選択性抗体)は、ボーラスとして又はある期間の連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液内、包膜内、経口、局所などの投与経路又は吸入経路などの既知の方法でヒト患者に投与される。広範囲な副作用又は毒性がタンパク質が認識する標的分子に対する拮抗作用と関係している場合、局所投与が特に望ましい。また、エクスビボ方策が医療適用のために用いられてもよい。エクスビボ方策は、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを被検体から得られる細胞に形質移入させるか又は形質導入させることを伴う。形質移入させるか又は形質導入させた細胞は、次いで被検体に戻される。細胞は、造血性細胞(例えば骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｔ細胞又はＢ細胞)、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、ケラチン合成細胞又は筋細胞を含むが、これらに限定されるものではない様々な範囲のいずれかでありうる。

一例では、タンパク質(例えばヘテロ多量体タンパク質、またはここに記載の方法に従って作製された多選択性抗体)は、疾患又は腫瘍の位置が許す限り、例えば直接注射によって局所的に投与され、この注射は周期的に繰り返されうる。また、タンパク質複合体は、局所の再発又は転移を予防するかまたは低減するために、被検体に全身的に、又は腫瘍細胞、例えば腫瘍の外科的切除後の腫瘍又は腫瘍巣に直接、送達されてよい。

ＸＩ．製造品
本発明の他の実施態様は、本明細書中に記載の一又は複数のタンパク質複合体と疾患(例えば自己免疫性疾患または癌)の治療または診断に有用な材料を具備する製造品である。製造品は、容器と容器上ないしは容器に付随するラベルないしはパッケージ挿入物を具備する。適切な容器には、例えば瓶、バイアル、注射器などが含まれる。容器は、ガラス又はプラスチックのような様々な材料から形成されてよい。容器は、症状の治療に有効である組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、容器は皮下注射針により貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい)。組成物中の少なくとも一つの活性薬剤は本発明のヘテロ多量体タンパク質（例えば、抗体又は抗体断片）である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が特定の疾患の治療に用いられることを示す。ラベル又はパッケージ挿入物は更に、ヘテロ多量体タンパク質の組成物を被検体に投与するための指示を含む。また、本明細書中に記載の併用用治療を含む製造品及びキットも考慮される。

パッケージ挿入物は、慣習的に治療用製品の市販パッケージに含まれる指示書を指し、効能、使用、用量、投与、禁忌及び／又はこのような治療用製品の使用に関する警告についての情報を含むものである。他の実施態様では、パッケージ挿入物は、組成物が、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、腎臓細胞癌腫、膠腫又は卵巣癌の治療のために用いられることを示す。

さらに、製造品は、製薬的に許容可能なバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第２の容器を具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。

また、様々な目的、例えば抗原(例えばＨＥＲ２またはＥＧＦＲ)を細胞から精製する又は免疫沈降するために有用なキットが提供される。抗原(例えばＨＥＲ２またはＥＧＦＲ)の単離又は精製のために、キットは、ビーズ(例えばセファロースビーズ)に結合したヘテロ多量体タンパク質(例えばＥＧＦＲ／ＨＥＲ２抗体)を含みうる。例えば、ＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットにおいて、抗原をインビトロで検出及び定量するためのヘテロ多量体タンパク質を具備するキットが提供されうる。製造品と同様に、キットは、容器と容器上ないしは容器に付随するラベルないしはパッケージ挿入物を具備する。容器は、本発明の少なくとも一のヘテロ多量体タンパク質（例えば、多選択性抗体又は抗体断片）を含む組成物を収容する。例えば希釈剤及びバッファ又はコントロール抗体を具備する他の容器が具備されてよい。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物の説明並びにインビトロでの使用又は診断上の使用についての指示を提供してよい。

前述の記載は当業者が本発明を実施するために十分であるとみなされる。以下の実施例は、事例のためだけであって、本発明の権利範囲が制限されるものでは決してない。事実、本明細書に示したもの及び記載内容に本発明の様々な変更が加わることは、前述の記載から当業者に明らかであり、添付の特許請求の範囲内のものである。

後の実験の開示において；以下の略語が適用される：当量（当量）；Ｍ（モル）；μＭ（マイクロモル）；Ｎ（正常）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｋｇ（キログラム）；μｇ（マイクログラム）；Ｌ（リットル）；ｍｌ（ミリリットル）；μｌ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；℃（摂氏温度）；ｈ（時間）；ｍｉｎ（分）；ｓｅｃ（秒）；ｍｓｅｃ（ミリ秒）；ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害 ））；ＢｓＡｂ（二重特異性抗体）；Ｃ_Ｌ（軽鎖の定常ドメイン）；Ｃ_Ｈ（重鎖の定常ドメイン）；ＣＭＣ（補体媒介性細胞傷害）のＦａｂ（抗原結合断片）；Ｆｃ（結晶化断片）；ＦＶ（可変断片（Ｖ_Ｌ＋Ｖ_Ｈ））；ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）；ＨＣ（重鎖）；ＩＧＦＲ（インスリン様成長因子受容体）；ＬＣ（軽鎖）；ｓｃＦｖ（単鎖可変断片（アミノ酸リンカーによって繋がったＶ_ＬおよびＶ_Ｈ）；ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）；ＶＥＧＦＲ２（血管内皮増殖因子受容体２）；Ｖ_Ｈ（可変重鎖ドメイン）；Ｖ_Ｌ（可変軽鎖ドメイン）。

本発明は以下の実施例に更に詳細に記載されるが、これらは特許請求される本発明の範囲を限定することを意図のものではない。添付図面は、本発明の明細書と説明の不可欠な部分と見なされることが意図される。全ての参考文献は、本明細書に記載されている全てにおいて、参照により援用される。以下の実施例は、説明するために提供されるが、請求項に記載の発明を限定するものではない。
実施例１：
発現ベクターの構築

この例では、宿主細胞を形質転換するために使用する核酸コンストラクトを示している。

一般的には、重鎖及び軽鎖の両方をコードするＤＮＡ配列が、配列の各々に対して別個のプロモーター要素、及び発現プラスミドを含む細菌細胞を選択するための抗生物質耐性を含む、発現プラスミドにクローニングされる。ベクターのコンストラクトは、細菌細胞のペリプラズム空間への抗体ポリペプチドの排出のため、熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）分泌シグナル(Picken et al., 1983, Infect. Immun. 42:269-275, and Lee et al., 1983, Infect. Immun. 42:264-268) をコード化する。各鎖の転写はｐｈｏＡプロモーターによって制御され(Kikuchi et al.,1981, Nucleic Acids Res., 9:5671-5678)、翻訳制御が、測定された相対的翻訳力について以前に説明されたＳＴＩＩシグナル配列の変異体によって与えられ、それは翻訳開始領域（ＴＩＲ）におけるサイレントコドンの変化を含む(Simmons and Yansura, 1996, Nature Biotechnol. 14:629-634及びSimmons et al., 2002, J. Immunol Methods, 263:133-147)。ノブ及びホールのプラスミドの模式図を、図２Ａ及び２Ｂのそれぞれに示す。

本発明は、特定の抗体の結合配列に依存しておらず、任意の半抗体の組み合わせに適用可能であるが、本明細書の実施例では、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＩＬ−４及びＩＬ−１３を対象としたヘテロ多量体抗体に向けられている。抗ｃ−ｍｅｔ抗体の例は、米国特許第７，４７２，７２４号、及び米国特許７，４９８，４２０第号に与えられる。抗ＥＧＦＲ抗体の例は、米国仮出願第６１／２１０５６２号（２００９年３月２０日出願）、米国特許出願公開第２００８０２７４１１４号（２００８年１１月６日公開）及び米国特許５８４４０９３号（１９９８年１２月１日付与）に与えられる。抗ＩＬ−１３抗体の例は、米国特許第７５０１１２１号（２００９年３月１０日付与）、米国特許７６１５２１３号（２００９年１１月１０日付与）、国際公開第２００６／０８５９３８号（２００６年８月１７日公開）、米国特許出願公開第２００９０２１４５２３号（２００９年８月２７日公開）、及び米国特許７６７４４５９号（２０１０年３月９付与）に記載されている。抗ＩＬ−４抗体の例は、米国特許出願公開第２００８０２４１１６０号（２００８年１０月２日公開）、及び米国特許６３５８５０９号（２００２年３月１９日付与）に記載されている。

各半抗体は、米国特許第７６４２２２８号に記載されているように重鎖に操作された、ノブ（突起）又はホール（空洞）を有していた。簡単に説明すると、Ｃ_Ｈ３ノブ変異体が最初に生成された。Ｃ_Ｈ３ホール変異体のライブラリーが、その後、パートナーのＣ_Ｈ３ドメイン上のノブに近接している残基３６６、３６８及び４０７をランダム化することにより作成された。次の例では、ノブの変異はＴ３６６Ｗであり、ホールはＩｇＧ１のバックボーンにおいて変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを有する。他の免疫グロブリンアイソタイプにおける同等の突然変異は、当業者によって容易に決定される。更に、当業者は、二重特異性のために使用される２つの半抗体が同じアイソタイプであることが好ましいことが容易に分かるであろう。異なるアイソタイプの半抗体が使用され得るが、更なる変異が必要である場合がある。

この実施例で説明されるベクターは、抗ｃ−Ｍｅｔ又は抗ＥＧＦＲ半抗体どちらかであるが、当業者は、任意の抗体をプラスミド中にコード化することができることを容易に理解するであろう。本明細書で使用される全てのコンストラクトについての開始プラスミドは、以前に記載された、抗組織因子分離シストロンプラスミドのｐａＴＦ５０であり、相対的ＴＩＲが重に対して１及び軽に対して１である(Simmons et al., 2002, J. Immunol Methods, 263:133-147,及び米国特許第６９７９５５６号）。相対的ＴＩＲ強度の増加が、これらの半抗体の発現力価を高めるために使用された。

実施例２：
別々の細胞培養を用いるヘテロ多量体タンパク質の生産
以下の例では、単量体成分を発現する細胞を別々の培養において増殖させるヘテロ多量体タンパク質の産生を示す。この方法では、別々の培養において半抗体を発現するように細胞を増殖し、誘導する。一つの方法では、宿主細胞培養液は、タンパク質精製の前に組み合わせることができる。別の方法では、その成分を最初に精製し、その後ヘテロ多量体タンパク質を形成するために組み合わせ得る。

両方の方法において、第一のヒンジ含有ポリペプチド（例えば、半抗体（ノブ））をコードする核酸が第一の宿主細胞に導入され、そして第二のヒンジ含有ポリペプチド（例えば、半抗体（ホール））をコードする核酸が第二の宿主細胞に導入される。この例では、ＢｓＡｂの形成を示しているが、当業者は、記載されている方法は、ヒンジ領域を含む任意のヘテロ多量体タンパク質、例えば、アフィボディなどにも適用可能であることを容易に理解するであろう。
方法１−インタクトなＢｓＡｂを形成するための、半抗体の別々の培養、別々の精製、混合及び酸化還元による、ノブ半抗体及びホール半抗体の独立した産生。

ノブの変異又はホールの変異の何れかを含む半抗体が、細菌宿主細胞、例えば大腸菌で、実施例１に記載のコンストラクトを用いて重鎖及び軽鎖を発現させることにより、別々の培養で産生された。図３Ｂ及び４Ａを参照。この方法１では、ノブ半抗体は抗ＥＧＦＲでホール半抗体は、抗ｃ−ｍｅｔであった。実施例１の発現プラスミドを大腸菌宿主株３３Ｄ３ (Ridgway et al. (1999) 59 (11): 2718)又は６４Ｂ４（Ｗ３１１０ ΔｆｈｕＡ ΔｐｈｏＡ ｉｌｖＧ＋Δｐｒｃ ｓｐｒ４３Ｈ１ ΔｄｅｇＰ ΔｍａｎＡ ｌａｃＩｑΔｏｍｐＴ）に導入し、形質転換体をカルベニシリンを含むＬＢプレート上で選択した。実施例１の発現プラスミドは大腸菌宿主株３３Ｄ３(Ridgway et al. Cancer Res, (1999) 59 (11): 2718) 又は６４Ｂ４（Ｗ３１１０ ΔｆｈｕＡ ΔｐｈｏＡ ｉｌｖＧ＋Δｐｒｃ ｓｐｒ４３Ｈ１ ΔｄｅｇＰ ΔｍａｎＡ ｌａｃＩ^ｑ ΔｏｍｐＴ）に導入された。そして形質転換体をカルベニシリンを含むＬＢプレート上で選択した。形質転換体は、その後、カルベニシリンを含むＬＢ種培養液を播種するために使用され、これを３０℃で振とうしながら一晩増殖させた。種培養液はカルベニシリンを含むリン酸塩制限培地Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ．(Simmons et al., 2002, J. Immunol Methods, 263:133-147)へ１００倍に希釈され、３０℃で２４時間震とうして増殖させた。培養液を遠心分離し、細胞ペレットは、抗体精製が開始されるまで凍結した。ペレットを解凍し、塩酸でｐＨ７．５に調整した２５ｍＭのトリスベース、１２５ｍＭのＮａＣｌ及び５ｍＭのＥＤＴＡ（ＴＥＢまたはトリス抽出緩衝液）を含み、容積重量比が５グラムの細胞ペレットあたり１００ｍＬのＴＥＢである抽出緩衝液に再懸濁し、そしてマイクロフルイディクスコーポレーションモデル１１０Ｆマイクロフルイダイザー（Ｎｅｗｔｏｎ， ＭＡ）を通して再懸濁した混合物を３回通すことにより、マイクロ流体工学を用いて細胞を破壊することによって抽出した。細菌の細胞抽出液を１５，０００×ｇで２０分間遠心分離によって清澄化し、上清が収集され、精製前に０．２２ミクロンのアセテートフィルターを介してろ過した。

各半抗体はプロテインＡ捕捉により別々に精製され、陽イオン交換クロマトグラフィーが続いた。ノブ半抗体からの清澄化細胞抽出物は、１ｍＬのＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳＵＲＥカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｔｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））上に２ｍＬ／分でロードされた。ロードした後、陽イオン交換カラムによる捕捉を容易にするために、カラムは１０カラム体積（ＣＶ）の４０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、１２５ｍＭの塩化ナトリウム、及び５ｍＭのＥＤＴＡで洗浄し、続いて５カラム体積の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０で洗浄した。半抗体捕捉親和性は０．２ｍＭの酢酸（ｐＨ２−３）の１０カラム容量（ＣＶ）で溶出し、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅからの１ｍＬのＨｉＴｒａｐ ＳＰ−ＨＰの強陽イオン交換カラム上で直接捕捉した。カラムは２５ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）ｐＨ５．８を含む１０ＣＶの緩衝液Ａで洗浄した。半抗体を０−５０％の緩衝液Ｂ（２５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ５．８、１Ｍの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ））の直線勾配で溶出した。２０−４０％のＢ、及び２８０ｎｍのＵＶ吸光度と回収画分の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって決められた溶出液のピークとの間に溶出されたタンパク質の両方が、ノブ又はホール抗体として別々にプールされた。両タンパク質は、一般的に主要な溶出ピークを示し、お互いに酸化された重鎖種と軽鎖種を含む全ての画分がプールに含まれていた。還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、精製ハーフ抗体の分析が図４Ｂに示される。結果は、発現され捕捉されたタンパク質の大半は、大きさが７５ｋＤであることを示している。我々は、図４（ｃ）に示すように、ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析することによって、これを確認した。半抗体の質量は予測された質量であり、ヒンジ領域内の２つのシステイン残基を含む任意のシステインにはジスルフィド付加物がなかったことを示している。ヒンジシステインが還元され反応性の遊離チオールを示すかどうかを判断するため、タンパク質は、質量分析法による分析の１時間前に１ｍＭのＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）と中性ｐＨで反応させた。タンパク質の質量は変わらず、ヒンジシステインがお互いに酸化され、鎖内ジスルフィド、例えば、環状ジスルフィドのである可能性が高い。これらの二つの半抗体（ノブとホール）を使用して、完全にインタクトな二重特異性抗体を構築するため、最初に、ヒンジ領域における鎖内ジスルフィドを還元し、システイン遊離チオールを遊離させ、その後、それらが別の重鎖へと酸化され、１５０ｋＤの二重特異性抗体を形成するようにする必要があった。

インタクトな二重特異性分子を形成するため、２つの相補的な半抗体のアニーリング、還元及び再酸化を達成するために、以下の手順が開発された。独立に分離した後、精製したタンパク質は、手順のプール工程でに等しい質量で一緒に結合され（図５Ａに示す）、プールのｐＨを、１Ｍトリス、ｐＨ７．５の１０分の１の体積を追加することにより７．５に調整し、タンパク質を０．５ｍＭのトリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン（ＴＣＥＰ）により室温で還元した。２時間還元した後、プールされたタンパク質は、５ｍＬのＺｅｂａ Ｄｅｓａｌｔスピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて、２５ｍＭトリス、ｐＨ７．５、及び１２５ｍＭのＮａＣｌ中にバッファー交換され、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度の約４ｍＬｓの体積が得られる。タンパク質は、その後、２５分間５２℃に混合物を加熱することによりアニールし、続いて約２０℃の室温まで冷却した。アニールされた抗体は、１０ｋＤの分子量カットオフスピンコンセントレータを使用して、約８ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で０．５ｍＬの体積まで濃縮され、ジメチルスルホキシドに溶解された１００ｍＭのＤＨＡＡのストック溶液からの反応混合物への３００マイクロモルのデヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ）の添加により酸化された。酸化のために添加されたＤＨＡＡの量は、タンパク質モル濃度の約１０倍超過である。一晩室温で酸化した後、酸化された物質を、２５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０および３００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液中でＳ−２００ゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケアからの２２ｍＬのＳ２００ Ｔｒｉｃｏｒｎ）に流した。インタクトな抗体をプールし、水で１０倍に希釈した。ＢｓＡｂタンパク質を、その後、カルボキシメチル（ＣＭ）樹脂（１ｍＬののＨｉＴｒａｐ ＣＭ−ＦＦ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる弱陽イオン交換クロマトグラフィーにより、４．５から９．２へのｐＨ勾配溶出で精製した。緩衝液ＡとＢの組成物は、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、３０ｍＭのＭＥＳ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２０ｍＭのイミダゾール、２０ｍＭのトリス、２０ｍＭのＣＡＰＳ、及び２５ｍＭのＮａＣｌからなり、Ａ緩衝液はＨＣｌでｐＨ４．２に調整され、Ｂ緩衝液はＮａＯＨを用いてｐＨ９．２（または１０．４）に調整される。ＣＭクロマトグラフィー後に得られた精製された物質は、正確な分子組成を決定するために質量分析法で分析した（図４Ｄ）。質量スペクトル分析は、検出可能なインタクトな抗体生成物のみ分子量が１４６，０５１．８９であることを示し、これは、理論分子量が１４５，０５１．７５であるヘテロ二量体ノブ−ホール種の抗ＥＧＦＲ／抗ｃ−ｍｅｔとほぼ同じように一致する。約２ｍｇのノブ及び約２ｍｇのホールで始まるこの手順の収率は、約０．５から１ｍｇであった。

インビボでの実験、例えば、非ヒト霊長類における薬物動態学的特性の決定などのための抗体の大量生産については、１００ｍｇからグラム規模の量の抗体が必要とされている。我々は、これらの量でインタクトな二重特異性抗体を産生するため、図５Ａに示すように、各半抗体について別個の独立した培養を使用する手順を開発した。これらの調製物について、１０リットルの発酵が、十分な量の抗体を持つ細胞ペレット又は全ブロスを生成するために必要とされた（Simmons et al., 2002. J. Immunol. Methods, 263:133-147，及び米国特許第６９７９５５６号）。実験の過程で、細胞ペレットまたは全ブロスのいずれかが、発現された抗体を含むバイオマスために使用された。いくつかのケースでは、抗体のかなりの割合が培地に漏れ出しており、ここでは全ブロスが高収率を与えた。細胞ペレットについては、材料を２５ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、５ｍＭのＥＤＴＡ、１２５ｍＭのＮａＣｌを含む抽出緩衝液に再懸濁し、マイクロフルイディクス（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）（Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）からモデルＨＣ８０００３Ａのマイクロフルイダイザーを使用してマイクロ流動化することによって溶解した。全ブロスは、添加剤を添加することなく、直接マイクロ流動化された。どちらのケースでも、測定器を通す材料の３回の通過が行われた。この例では、サイトカインのインターロイキン−４（ノブ）及びインターロイキン−１３（ホール）を標的とする二重特異性抗体の２つの型を５００ｍｇ調製した。

二重特異性体の第一の型では、ノブ変異とホール変異のみを有するヒトＩｇＧ１ａ Ｆｃを含んでおり、第二の型は、２箇所の変異、Ｔ３０７Ｑ及びＮ４３４Ａで更に改変されたＦｃを含んでおり、それは新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する高い親和性を引き起こした。第二の型は、抗体の遅いクリアランスと長い半減期を付与することが期待される。ホール抗体（ＩＬ−４を標的）とノブ抗体（ＩＬ−１３を標的）（ＦＣの両方の型（前者について野生型Ｆｃ、後者についてＦｃＲｎ改変体）における）を、両方とも１０リットル発酵で個別に増殖させ、増殖培地及び細菌細胞をを含む全ブロスをホモジナイズし、独立して精製した。全ブロスのマイクロ流動化後、遠心分離による清澄のための抽出液を調製するため、抽出液を０．４％ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（ｐＨ９．０）の等量で処理した。混合物を室温で３時間又は４℃で一晩撹拌した。ＰＥＩは、抽出物の大規模な沈殿を引き起こし、これは４５分間１５０００×ｇでの遠心分離により清澄化した。上清はその後、１００ｍＬのＭａｂ Ｓｅｌｅｃｔ ＳＵＲＥプロテインＡ捕獲カラムにロードする前に、０．２２ミクロンのフィルターでろ過した。抽出液を２０ｍｌ／分でロードし、２８０でのＵＶ吸光度が安定したベースライン、一般的に約１０カラム容量（ＣＶ）に達するまで、４０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、１００ｍＭのＮａＣｌで洗浄した。洗浄緩衝液が２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨを６．０に変更され、およそ２ＣＶで洗浄した。捕捉半抗体を０．２Ｍ酢酸を用いて溶出した。プロテインＡによる分離後、不純物や凝集物を除去するために、抗体を、Ｓ−ＦＦ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーにより、又はＳ２００樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するゲルろ過クロマトグラフィーにより精製した。図５Ｂに示すように、精製された半抗体は主に７５ｋＤの種であった。第二の分離工程の後に、５００ｍｇの各半抗体を１ｍｇ／ｍＬの濃度で一緒にプールし、ｐＨを、１Ｍのトリス、ｐＨ７．５を用いて７．５に調整した。混合物をインキュベーター中で３７℃に加熱し、１５０ｋＤの抗体種の出現についてゲルろ過によって監視した。２時間後、アニール処理が完了し、二量体１５０ｋＤの種への完全な変換を示し、混合物を室温まで冷却した。タンパク質は、２４℃で２時間、２ｍＭのＤＴＴの添加により還元され、その後１０ｋＤのカットオフスピンフィルターを用いて２０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。濃縮液は、２５ｍＭトリス、ｐＨ８．０をのみを含む緩衝液中で一晩透析することによって酸化した。酸化された物質は、その後、純度および凝集について分析した。インタクトな抗体の種は、インタクトな、完全に酸化されたヘテロ二量体重特異性分子であることが質量分析により決定されたが、ゲルろ過法、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、かなりの量の凝集体の存在を示し、そのうちのいくつかは、明らかにジスルフィド結合多量体の結果であった（データは示していない）。インビボでの実験のために二重特異性抗体を更に精製するため、抗体を、トリス、ｐＨ７．５及び１２５ｍＭのＮａＣｌ中でＳ−２００ゲルろ過カラムで分離した。精製された材料は、導入された凝集体の除去のために、材料の３０％を超える損失を示した。調製の最終段階において、タンパク質を陽イオン交換カラムに接着させ、夾雑エンドトキシンを除去するため、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０中の０．１％ＴＸ１１４で洗浄し、そして５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０を含有する高ｐＨの緩衝液で溶出した。溶出されたタンパク質は、その後、インビボでの実験に適する緩衝液に透析によって処方され、４℃で保管された。野生型ＦｃおよびＦｃＲｎ変異体からなる最終的な材料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、質量分析法、夾雑エンドトキシンレベルを決定するためのＬＡＬアッセイ、及びゲルろ過分析により分析された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果が図５（ｃ）に示され、主要種は１５０ｋＤのインタクトな二重特異性抗体であることを示している。図６Ａは、サイトカインＩＬ−４及びＩＬ−１３の中和を試験するＴＦ−２細胞増殖アッセイにおける抗体の生物学的活性を示す。このアッセイのため、抗ＩＬ−４／ＩＬ−１３二重特異性抗体、抗ＩＬ−４抗体及び抗ＩＬ−１３抗体は、２５μｇ／ｍｌのの出発濃度で使用され、９６ウェル培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ，カタログ番号３５３０７２）中で、アッセイ培地（ｒｈＧＭ−ＣＳＦのない培養培地）中、又は０．４ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２０４−ＩＬ）プラス２０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−１３（ジェネンテック）を５０ｕｌ／ウェルの最終体積で含むアッセイ培地中で、０．０２５ｐｇ／ｍｌの最終濃度になるまで、連続的に１０倍希釈された。希釈抗体は、３７℃で３０分間プレインキュベートした。

プレインキュベーション後、ＲＰＭＩ１６４０（ジェネンテック社）、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３０００７１．０３）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０３７８）、及び２ｎｇ／ｍＬのｒｈＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２１５−ＧＭ）で培養されたＴＦ−１細胞は、アッセイ培地に再懸濁され、２×１０^５細胞／ｍｌの最終濃度を得た。５０μｌの細胞を、希釈抗体、アッセイ培地プラスＩＬ−４サイトカイン及びＩＬ−１３サイトカイン（最大増殖コントロール）又はアッセイ培地のみ（バックグラウンドコントロール）のいずれかを含有する各ウェルに添加した。全てのサンプルは重複して蒔かれた。プレートを３７℃で５％のＣＯ_２で４日間インキュベートした。１ｕＣｉ ^３Ｈのチミジン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，カタログ番号ＮＥＴ０２７００５ＭＣ）がインキュベーションの最後の４時間の間、各ウェルに添加した。プレートはＰａｃｋａｒｄ Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅを使用してＵｎｉｆｉｌｔｅｒ−９６ＧＦ／Ｃ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号６００５１７４）上に回収され、^３Ｈチミジンの取込みをＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して測定した。データは、カレイダグラフ（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ）を使用してプロットした。結果は、野生型抗Ｉｌ−４／抗ＩＬ−１３二重特異性抗体は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３の活性を中和することにおいて、ＩＬ−４及びＩＬ−１３のＩｇＧ抗体の組み合わせと同程度に有効であることを示す。

２抗体（野生型抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３及びＦｃＲｎ変異体抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３）を、カニクイザルでそれらの薬物動態（ＰＫ）特性について試験した。単回投与の注射を使用し、２０ｍＭのヒスチジン−酢酸、ｐＨ５．５、２４０ｍＭスクロース、及び０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０中に、１０．８ｍｇ／ｍＬ及び１ｍｇ／ｍＬで処方された野生型分子、及び２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、２４０ｍＭスクロース、及び０．０２％のＴｗｅｅｎ ２０中に、０．５ｍｇ／ｍＬで処方されたＦｃＲｎ変異体が、静脈注射によって投与された。投与量は２つの野生型濃度について２０ｍｇ／ｋｇと２ｍｇ／ｋｇで、ＦｃＲｎ変異体については２０ｍｇ／ｋｇであった。３つの処方を注射された２匹のメスサル及び２匹のオスサルからの血清サンプルを、４２日間かけて定期的に採取した。血清サンプルを、ＥＬＩＳＡによってインタクトな二重特異性抗体についてアッセイし、ここで、ＩＬ４又はＩＬ３の何れか一抗原をプレート上にコーティングし、その抗体は、その後血清から捕獲された。存在する二重特異性抗体の捕獲された量は、ＩＬ１３又はＩＬ１４の何れかである第二のビオチン化リガンド（何れのリガンドもプレート上にコーティングされてない）、及び酵素結合ストレプトアビジンによる検出で決定された。図６（ｂ）の結果は、３つのサンプルの予想される２つのコンパートメントクリアランスを示す。抗体の２つの異なる型のＰＫ特性を、ＣＨＯ産生宿主に由来し、Ｆｃ−グリコシル化を含む２つの他の抗体（アバスチンとハーセプチン）と比較して、表２に示す。大腸菌が産生する二重特異性抗体は、標準的なプロセスからのＣＨＯ由来の抗体に類似しており、及びＦｃＲｎ変異体が長い半減期を有することが明らかである。

方法２−別々の（すなわち独立した）培養におけるノブ半抗体及びホール半抗体の産生、半抗体の精製に先立つ全ブロスの混合、及びインタクトなＢｓＡｂを形成するための還元剤の添加無しでの溶解。

この方法は、ノブ半抗体及びホール半抗体を同時に精製することにより、プロセスの工程数を減らすための試みであった。従って、発酵ブロスは、ペレット化及び抽出バッファーへの再懸濁の前に、混合される。各宿主細胞は、ヒンジ領域内に環状ジスルフィドを含む発現された半抗体を、細胞膜破壊によって抽出緩衝液中に放出すると考えられていた。その後、両方の半抗体の精製を同時に行うことができ、酸化還元アニーリング工程が続き、インタクトなＢｓＡｂを形成する驚くべきことに、我々は、ノブ−ホール抗体がヘテロ二量体化し自ら酸化し、インタクト及び半抗体（〜７５ｋＤ）の組み合わされた合計の２０％以上で、全長抗体（〜１５０ｋＤ）を形成することを発見した（表３を参照）。

ハーフ抗体及びホール半抗体を発現する宿主細胞を増殖させ、上記の方法１で説明したプロセスを使用し、別々の培養で誘導された。各培養物からの全細胞発酵ブロスは、３つの異なる体積比で他と混合され、次いで遠心分離し、単一細胞ペレットを形成した。比較的等しい存在比での２つの抗体の回収を一致させる意図で、及び抗ＥＧＦＲ半抗体は同じ条件下でｃＭｅｔ抗体に類似して発現されることを知って、全細胞発酵ブロスは、（抗ｃ−ＭＥＴ）：（抗ＥＧＦＲ）の比が１：１、２：１又は１：２で、５００ｍＬの最終体積に一緒に混合した。各細胞ペレットを抽出緩衝液に再懸濁し、溶解した。タンパク質は、実施例２の方法１に記載のように、ロテインＡクロマトグラフィー、続いて陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。抽出緩衝液は、２５ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１２５ｍＭのＮａＣｌ及び５ｍＭのＥＤＴＡを含んでいた。別々に精製された時、ノブーハーフ抗体とホール−ハーフ抗体の各々は、そのヒンジ領域内に環状ジスルフィド、すなわち、鎖内ジスルフィドを形成し、ノブ重鎖及びホール重鎖の共有結合を防いでいる。しかし、第一の宿主細胞及び第二の宿主細胞は、共培養した後、または遠心分離前に全発酵ブロスを混合した後の何れかで一緒に溶解され、インタクトな抗体種への若干量の会合体が存在することが分かった。図７は、３つの比率で観察されたインタクトな抗体種を示す。これは、本手順への変更は、追加の化学工程の必要性を実質的に排除することができるインタクトな二重特異性抗体の自発的形成につながる可能性を示唆した。

２つのタンパク質種の定量は、Ｎｏｖｅｘ ４−２０％トリスグリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）を使用して、５マイクログラムのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離することにより行った。電気泳動後、ゲルを、１５０ｍＭの硫酸アンモニウム、１．７４Ｍ酢酸、１０％メタノール及び水に０．４グラム／Ｌのクマシー色素Ｒ２５０を含むコロイド状クーマシー染色で染色した。ゲルは１０％酢酸を含む水で脱色し、Ｇｅｌ−Ｄｒｙ Ｄｒｙｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で平衡化し、２枚のセロファンシートの間で乾燥させた。ゲルを乾燥させた後、タンパク質のバンドは７００ｎｍにおけるオデッセイＩＲイメージングシステム（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）で定量した。

方法３−独立して培養し、独立して遠心分離し、ペレットを混合され＆再懸濁され、続いて溶解し、そして還元剤の添加無しでＢｓＡｂの精製によるノブ半抗体及びホール半抗体の産生

この方法は、ノブ及びホールを同時に精製することにより、プロセスの工程数を減らすための試みである。

細胞を独立して培養し、遠心分離によってペレット化する。ペレットを混合し、抽出緩衝液中に一緒に再懸濁する。細胞膜の破壊によって、半抗体は抽出緩衝液中に放出され、そして、類似した産物のプロファイルが上記の方法２と同じように見られるであろうと考えられている。

実施例３：
単一混合細胞培養を用いたヘテロ多量体タンパク質の生産
この例では、２つの宿主細胞の集団を含む培養物からのヘテロ多量体タンパク質の形成を示し、ここで該プロセスにおいて還元は添加しない。

方法４−還元剤を添加せずにインタクトなＢｓＡｂを形成するための、同じ培養中の異なる細胞集団からのノブ半抗体及びホール半抗体の産生。

最初に、ノブ又はホール半抗体の何れかを含む二つの異なる大腸菌形質転換体を含む、０．５リットル振とうフラスコ中で共培養実験が行われた。この実験では、ノブ（抗ＥＧＦＲ）半抗体とホール（抗ＣＭＥＴ）半抗体の両方のスターター培養液は、３０℃で５ｍＬの培養液中で、ＬＢ−メディア（１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン）で一晩培養することにより生産された。ＯＤ_６００に等しい一晩の培養液が、５００ｍｌの完全ＣＲＡＰ培地（１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン）を３つの異なる比率（抗ＥＧＦＲ：抗ＣＭＥＴ；１．５：１、１：１及び１：１．５）で、全播種量を培養液の１／１００に保って播種するために使用された。細胞を３０℃、２００ｒｐｍで２４時間増殖させた。次いで細胞を遠心分離（６７５０×ｇ、１０分間、４℃）によってペレット化し、精製に使用した。

細胞を、２５ｍＭトリス、ｐＨ７．５、５ｍＭのＥＤＴＡ、及び１２５ｍＭのＮａＣｌを、１０グラムの細胞ペレットあたり１００ｍｌの割合で含む抽出緩衝液に再懸濁した。実施例２に記載のように、マイクロ流動化による抽出及びクロマトグラフィー用に調製した後で、３つの異なる比率の細胞抽出物は、最初に、Ｍａｂ Ｓｅｌｅｃｔ ＳＵＲＥ １ｍＬのＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓ．Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）上に二重特異性抗体を捕獲し、ｐＨ６でわずか４０ｍＭクエン酸ナトリウムを含有するカラムの洗浄用緩衝液を用いて精製した。実施例２に記載のように、洗浄および溶出した後、プロテインＡの捕獲プールは、ＳＰ−ＨＰ陽イオン交換カラムにロードし、実施例２に記載のように精製した。陽イオン交換により分離した後、３精製の各々からのクロマトグラムのピークをプールし、約１５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を持つ約５０−１００マイクロリットルの体積まで濃縮した。初回播種率は、インタクトな抗体の最終量に違いが生じるように見え、これは、細胞ペレットを３７℃で一晩培養した後に一緒に混合した場合に観察されるより、低分子量型に対するインタクトな二重特異性抗体の高い比率であった。表４を参照。

共培養を、１０リットルの発酵規模に拡張することができるかどうかを判断するため、このことはスケールアップの手順において重要であるが、いくつかの実験が、抗ＥＧＦＲ半抗体及び抗ＣＭＥＴ半抗体を用いて行われた。１０リットル発酵については、播種開始培養物は、抗ＥＧＦＲと抗ｃＭｅｔの１：１の細胞比を含むものを使用した。１０リットルの共培養液は実施例２に記載の単一半抗体培養用として同一条件下で増殖させた。細胞ペレット又は全ブロスのどちらかを、上述したように、抗体物質の抽出と単離のために使用した。細胞ペレットからの物質の抽出において、約２．５キロのペレットが、１つの１０リットル発酵から生成された。細胞ペレットを、２５ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１２５ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液の５リットルに再懸濁した。ペレットはペレットを再懸濁する前に、ポリトロンミキサーで２分間処理した後、マイクロ流動化し、清澄化し、実施例２に記載のようにプロテインＡの捕獲物を調製した。発酵実験は２回以上繰り返され、１０リットル発酵槽からの共培養の分離の結果を図８Ｃに示す。質量分析法が、分子成分を決定するために、約１５０ｋＤのタンパク質と約７５ｋＤのタンパク質を特徴付けるために使用された。私たちが驚いたことに、差発現プロファイルに起因して、優位な上位の分子量のタンパク質は、二重特異性抗体であり、約７５ｋＤのタンパク質は主にｃＭｅｔ半抗体であった。これは、二重特異性抗体は、追加の化学工程を必要とせずに完全に形成されたことを示している。二重特異性抗体は、ノブ半抗体とホール半抗体の１：１の化学量論の組み合わせであるため、わずか７５ｋＤのタンパク質の存在は、限定的半抗体の大半は自発的にインタクトな二重特異性抗体に組み込まれていたことを示している。

図８Ｄに示すように、この観察は、簡略化した発現及び精製スキームの開発につながった。プロテインＡ捕獲後に、抗体を、１．５Ｍ硫酸アンモニウム及び２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５を含む緩衝液で１：１に希釈しまし、疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ） Ｄｉｏｎｅｘ Ｐｒｏ Ｐａｃ ＨＩＣ−１０ ４．６ｍｍｘ１００ｍｍ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）にロードした。３０−６０％のＢの勾配は、２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．９５、および１．５Ｍ硫酸アンモニウムからなるＡ緩衝液、及び２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．９５、２５％イソプロピルアルコールからなりＢ緩衝液による。タンパク質は１５ＣＶの勾配で分離した。タンパク質は、２つの主要な種へと分離し、その一つは二重特異性抗体を含み、他方は過剰な抗ＥＧＦＲ半抗体を含む、クロマトグラフ分離の結果を図８Ｅに示す。インタクトな抗体を含む画分をプールして、残りの汚染されたエンドトキシンを除去するため、ｐＨ５．０で２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液中のＳ−ＦＦカラムへ付着させ、０．１％のトリトンＸを含有する同じ酢酸緩衝液で洗浄し、その後始めの酢酸緩衝液で洗浄して界面活性剤を除去することによって、処理した。タンパク質は、２５ｍＭトリス、ｐＨ８．０を用いてＳ−ＦＦカラムから溶出し、プールし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、質量分析及びエンドトキシンについてのＬＡＬアッセイにより分析した。タンパク質は、最終調製物中に０．０７６ＥＵ／ｍｇのエンドトキシンを含有しており、インビボでの適用に適していることを示している。最後の特性評価を、図８（ｆ）に示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、タンパク質の大部分が最終的なインタクトな二重特異性抗体であることをを示しており、質量スペクトル分析は、二重特異性抗体の予想分子量、および任意の汚染種の欠如、特に存在する可能性があるホモ二量体型の欠如を示している。アニーリングと酸化還元化学を必要とする手順に比べた、共培養を使用する改変された手順の比較が図８Ｇに示されている。

方法５−異なるノブ：ホールの比率を使用してインタクトなＢｓＡｂを形成するための、同じ培養中におけるノブ半抗体及びハーフ半抗体の産生。

この例では、類似した発現コンストラクト（発現される半抗体においてのみ異なる）を使用する宿主細胞が互いに成長せず、そしてインタクトなＢｓＡｂを生成しないことを示している。

実験では、いずれかの鎖の比を制御することは、増殖及び発現の前に播種率を調整することによって容易に行われることを明らかにした。２つの菌株はお互いを越えて成長しない。

播種の割合が、共培養の発酵を通して保持されているかどうかを確認するため、異なる細胞比率を持つ共培養液の２４時間発行の終了時に存在していたノブ又はホールの重鎖の量を測定するため、一つの実験が実施された。ノブ（抗ＥＧＦＲ）プラスミド又はホール（抗ｃ−Ｍｅｔ）プラスミドの何れかを保持する細胞を、３０℃で一晩ＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン）で別々に増殖させた。開始培養液が、異なる比率の一晩培養液により、組み合わされた播種体積をその最終培養液の１：１００で保ちつつ、完全ＣＲＡＰ培地（１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン）を播種するために使用された。抗ＥＧＦＲ：抗ｃＭｅｔについて試験された比率は、１０：１，５：１，２：１，１：１，１：２，１：５，及び１：１０であった。２４時間３０℃で培養した後、細胞のサンプルが得られ、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％ＴｒｉｓＧｌｙｃｉｎｅ）によって分析され、その後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体ＨＲＰコンジュゲート（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ）によるウェスタンブロッティングが続いた。２種の重鎖は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、その結果を図８Ｂに示す。各半抗体の量は、共培養の播種比率と相関し、異なる半抗体をコードするプラスミドを保持する細胞は共培養でお互いを越えて成長ししないことを示している。

方法６−インタクトなＢｓＡｂを形成するための、同じ培養中におけるノブ半抗体及びハーフ半抗体の産生−膜透過処理。

この例では、膜透過が培地に半抗体を放出し、更なる化学反応（例えば、酸化還元、またはカップリング）を必要とせずに、インタクトなＢｓＡｂをその後形成することを示している。

リポタンパク質合成の損失につながる変異は大腸菌の細胞膜を変化させ、ペリプラズム蛋白質の培地中への漏出を付与し、またＥＤＴＡに対して大腸菌を過敏性にすることが知られている。ＥＤＴＡの添加のある場合ない場合における、菌株６５Ｇ４（Ｗ３１１０ ΔｆｈｕＡ ΔｐｈｏＡ ｉｌｖＧ＋Δｐｒｃ ｓｐｒ４３Ｈ１ ΔｄｅｇＰ ΔｍａｎＡ ｌａｃＩ^ｑ ΔｏｍｐＴ Δｌｐｐ）からの発現抗体の放出が比較された。ＩＬ−４（ホール）又はＩＬ−１３（ノブ）のどちらかを発現する細胞が方法４記載のように１：１の比率で共培養され、インキュベーター振とう機中で、３０℃で２０時間、２００ｒｐｍで増殖させた。インキュベーションの終了時に、培養液を、次の３つの等しいアリコートに分割した。一つのサンプルをＥＤＴＡの添加無しのコントロールとして使用した。他の２つのサンプルには、ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を、１０ｍＭの最終濃度まで添加した。インキュベーションを全てのサンプルについて３０分間続け、その後、ＥＤＴＡで処理したサンプルの一つにＭｇＣｌ２を、２０ｍＭの最終濃度まで添加した。全てのサンプルはインキュベーター振とう機でさらに３０分間インキュベートし、遠心分離（９２００×ｇ、２０分間、４℃）により細胞を除去し、そしてＧＦ／Ｆフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）と０．２μｍのＰＥＳフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を介して上清をろ過した。ＤＮａｓｅＩ、ウシ膵臓（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）が、ろ過を改善するために４ｍｇ／ｌまで追加することができる。

前述したように、ろ過した上清はその後直接１ｍＬのプロテインＡ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳＵＲＥたＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードされた。捕獲されたタンパク質は上述のように酢酸で溶出され、タンパク質のピークの回復が図９Ａに見られる。結果は、ＥＤＴＡで処置されたサンプルの総ＵＶ吸光度が増加したことを示している。この吸光度はインタクトな二重特異性抗体と過剰な半抗体である。図９Ｂ及び９Ｃを参照。

別の実験では、抗ＩＬ−４半抗体及び抗ＩＬ−１３は半抗体は、別々に、あるいは６５Ｇ４細胞の１：１の共培養として発現させた。細胞を、完全ＣＲＡＰ培地をＳｉｌｉｃｏｎｅ Ａｎｔｉｆｏａｍ （Ｆｌｕｋａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により０．０２％（ｖ／ｖ）まで補充することを除き、上記のように（方法４）培養した。細胞を、インキュベーター振とう機で２４時間、３０℃で、２００ｒｐｍで培養後、ｐＨ８．０のＥＤＴＡを、１０ｍＭの最終濃度まで添加し、インキュベーションを１時間続け、ＭｇＣｌ２を２０ｍＭまで添加した。細胞を遠心分離（６７５０×ｇ、１０分間、４℃）により回収し、上清をろ過し（０．２μＰＥＳ，Ｎａｌｇｅｎｅ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、及び抗体は、上述のプロテインＡによって捕獲され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析法により分析した。図９Ｄに示す結果は、インタクトな二重特異性抗体の形成は、二重特異性の両方の半分の存在下においてのみ観察されていることを示している。更に、７５ｋＤのタンパク質バンドは主に抗ＩＬ−４半抗体であったことを質量スペクトル分析が示した場合、抗ＩＬ−１３抗体の大部分は、更なる酸化還元化学処理無しに、二重特異性抗体に組み込まれている。プロテインＡで精製した二重特異性抗体は、硫酸アンモニウム緩衝液で１：１に希釈し、更に、実施例３に記載したのと同じ手順を用いて、７．５ｍｍＸ１５０ｍｍ ＰｒｏＰａｃ ＨＩＣ−１０カラム（Ｄｉｏｎｅｘ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）により精製した。インタクトな二重特異性抗体は、９９．６８の保持時間で溶出することが分かった。このピークをプールし、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、ほぼ完全にインタクトな抗体種から成ることが判明した。このタンパク質が純粋なヘテロ二重特異性分子であったことを確認するために、我々は、ＥＳＩ−ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳによりタンパク質を分析した。二重特異性抗体の約１０マイクログラムを、ＰＬＲＰ−Ｓ ３００Ａ ３マイクロメーター５０ｘ２．１ｍｍの逆相カラム（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に注入し、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ Ｓｅｒｉｅｓ ＨＰＬＣを使用して０．０５％ＴＦＡ及びアセトニトリル、３４−４５％の４．３分間の勾配により、及び０．５μＬ／分の流量及び８０℃のカラム加熱により分離した。ＬＣから溶出するタンパク質はＡｇｉｌｅｎｔ ６２１０ ＴＯＦにより解析された。タンパク質を含有する単一のピークが観察され、アジレントマスハンターソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍａｓｓ Ｈｕｎｔｅｒ）バージョンＢ．０２．００、５０，０００−１６０，０００の質量範囲、１．０Ｄａのステップ、３０．０ Ｓ／Ｎのしきい値、平均質量が９０、無制限の質量範囲、及び自動に設定された同位体の幅を用いて、このピークがデコンボリューションされた。シグナルの大半は二重特異性分子の予想質量を表している。アミノ酸配列から計算されるインタクトなヘテロ二重特異性抗体の質量は１４４０４４であり、これは、測定された質量の１ー２ダルトンの範囲内であるが、ホモ二量体タンパク質の可能性のある計算質量は、抗ＩＬ−４について１４４，９５４．６、抗ＩＬ−１３について１４５，１３３．４であった。

異なる播種率が、この組の抗体の培養を通じて、また６５Ｇ４のｌｐｐ欠失に関連して再び存続するかを試験した。ＯＤ_６００に等しい、抗ＩＬ−４（ホール）又は抗ＩＬ−１３（ノブ）の何れかによるシード培養液が、５００ｍｌのＣＲＡＰ培地を２：１及び１：２の比率で播種するために用いられ、培養し、以前に記載のように、発酵の最後に透過処理された（方法６を参照）。２つの異なる培地の調製物がプロテインＡ捕獲により精製され、続いて、ＨＩＣのＡ及びＢ緩衝液のｐＨを６．５に下げたことを除いて、上記のようにＨＩＣ分離された。二つの異なる出発培養物の比率の結果を図９Ｅに示す。タンパク質の大部分がインタクトな二重特異性抗体であることが観察される。他のピークは、質量分析法によって特徴付けされ、図９Ｅにおいて標識された。抗ＩＬ−１３抗体が半若干検出され、かなりの量の多くの抗ＩＬ−４が見られる。抗ＩＬ−１３に対する抗ＩＬ−４が３３／６６の割合で、より多くの抗ＩＬ−１３がわずかな量の抗ＩＬ−４の残りとともに観察される。ここでは、播種の割合は培養を通して維持されること、及びプロセスの最適化が、開始時の培養比を操作することを通じて、発現された抗体の半分の比率のバランスをとることにより達成できることがわかった。

我々は多くの異なった抗体変異体において、デルタＬＰＰ細胞における共培養発現のこのプロセスを試験し続けてきた。図９Ｆに、いくつかの例示的な半抗体のＨＩＣ後のクロマトグラフィー処方後の最終的な精製タンパク質を示す。

実施例４：
ヘテロ多量体タンパク質ライブラリー
この例では、ヘテロ多量体タンパク質ライブラリーの構成を示している。

二重特異性抗体の混合物をスクリーニングするために使用することができる特定の方法、または本方法を使用して、二重特異性抗体の大規模なアレイを迅速に生成するために使用され得る特定の方法が説明される。

方法７
いくつかのケースでは二重特異性抗体の選択は知られていないが、多くの異なる半抗体の組み合わせの結果であるかもしれない。あるいは、特定の標的の組み合わせ、例えば、抗ＩＬ−４／抗ＩＬ−１３が望まれるが、中から選択される数多くの候補の半抗体が存在する。最良の結合又は効果をもたらす特定の半抗体の組み合わせを見つけることは、マトリックス形式で半抗体を組み合わせることによって達成することができ、多くの二重特異性抗体変異体を迅速に生成することができる。この実験では、抗ＣＤ３などの抗体は、スクリーニングのために必要な抗体の量の約１０倍（またはそれ以上）過剰で産生することができる。この分子は、その後アニールし、例１に記載された手順を用いて酸化することができる。第一の抗体の総量の約１０分の１は、図１０に図解したように、異なる抗原（例えば、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、等）を標的とする約１０の半抗体の等しい量と組合わせるために使用できる。更なる一次半抗体が、第二の半抗体レパートリーと組み合わせるために必要とされる場合に、これは、一組のスクリーニング分子を生成するために行うことができる。

方法の第２の改変では、一次抗体（例えば、抗ＣＤ３）は「通常の」大腸菌宿主細胞を用いた共培養として、又は非機能的リポ蛋白質の表現型を有する変異株により増殖させることができる。この半抗体を系統的に可変半抗体の各々に追加することができ、全てが一次標的半抗体を含む二重特異性分子配列を生成する。

方法８
一次半抗体は、半抗体が結合した他の抗体のすべてを結合するのに十分な量で、この半抗体を産生することからなる方法で半抗体と提携する代替の宿主と組み合わせることができる。バルクアニーリングは、一次半抗体が重鎖のノブ型またはホール型のいずれかであって、二次標的半抗体の組が相補的変異体であるように、単一の反応で実行できる。ここでは、抗体の複合体混合物を、組合わせとして疾患を治療することに有用であり得るように産生することができる。

また、上記実施例に記載の方法を用いる共培養アプローチは、一次半抗体と可変二次半抗体による二重特異性抗体の複合体混合物を産生するために使用することができる。このような混合物は、二重特異性変異体のプール内の陽性結果を、活性な二重特異性抗体種を決定するために、後にデコンボリューションすることができるように、又は組み合わせた混合物を、より効果的な治療用混合物として使用することができるように、その後大量に単離され、スクリーニング物質として使用することができる。

実施例５：
インビトロでの活性
この例では本明細書に記載の二重特異性抗体はインビトロ系での活性を有する。二つの細胞株はが、この実施例５および以下の実施例６で用いられた。これらの実験では、ＫＰ４、膵管癌細胞株、及びＡ４３１、表皮癌細胞株は、それぞれ強くＭｅｔまたはＥＧＦＲによって駆動され、従って、これらは、各標的に対して独立してｂｓＡｂの有効性を探るために良好な細胞株及び腫瘍異種移植片である。

ＫＰ４細胞株は理化学研究所バイオリソースセンター細胞バンクから入手した（細胞株＃：ＲＣＢ１００５；３−１−１ Ｋｏｙａｄａｉ，Ｔｕｓｋｕｂａ−ｓｈｉ，Ｉｂａｒａｋｉ ３０５−００７４ Ｊａｐａｎ）。Ａ４３１細胞株（ＣＲＬ−１５５５）は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、から入手した。

癌細胞、Ａ４３１をＰＢＳで１回洗浄し、無血清培地に再懸濁し、カウントし、その後９６ウェルプレート（２５００細胞／ウェル）に添加された。次いで、細胞をヒトＨＧＦ（０．５ｎＭ）およびＴＧＦα（０．０５ｎｍ）単独で、又は、（１）抗ＥＧＦＲ、（２）抗ｃ−Ｍｅｔ抗体（「ワンアームド」ｃ−Ｍｅｔ）、（３）抗ＥＧＦＲと抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の組合わせ、又は（４）二重特異性抗ＥＧＦＲ／抗ｃ−ｍｅｔ抗体の何れかの用量範囲で処置した。三日間のＡｌａｍａｒＢｌｕｅ^ＴＭアッセイが、製造業者の推奨に従って行われた（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）。ＩＣ_５０値は４パラメータモデルによる非線形回帰分析により決定した（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ ｖｅｒ．３．６，Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ；Ｒｅａｄｉｎｇ，ＰＡ）。

インビトロ及びインビボでＭｅｔ依存性であるＫＰ４細胞アッセイにおいて、ＴＧＦ−αおよびＨＧＦを用いた処置によって刺激された増殖は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体と抗ＥＧＦＲの組合わせ、及び二重特異性抗体によって阻害することができる。抗ＥＧＦＲによる処置は、これらの細胞において単剤のような限定的な活性を示す。しかし、単独の抗ｃ−ｍｅｔ又は別々に添加された抗ｃ−Ｍｅｔプラス抗ＥＧＦＲ Ａｂｓよりも、ＫＰ４細胞においては二重特異性抗体により、より強力な阻害があった。Ａ４３１細胞において、それはＥＧＦＲによって主に駆動されるが、抗ＥＧＦＲ抗体又は抗ｃ−Ｍｅｔ抗体単独の何れも、細胞増殖を有意に阻害することができなかった。両分子の組み合わせは細胞増殖の若干の阻害を示したが、しかし、二重特異性抗体は、同じ濃度で高い活性を示した。また、細胞は、抗増殖に加えて、アポトーシスを示した。

これらのアッセイでは、二重特異性抗体は、他の抗体単独または別個に添加される抗−Ｍｅｔ抗体と抗ＥＧＦＲ抗体組合わせと比較し、改善された性能を示した。これらのデータは、二重特異性抗体を優れたものにするのは、一つの抗体における抗Ｍｅｔ抗体と抗ＥＧＦＲ抗体の配置であることを示唆している。結果を図１１に示す。

実施例６：
インビボでの活性
この例では、本明細書に記載の二重特異性抗体はインビボモデルでの活性を有することを示す。

６−８週齢で体重２２−３０グラムの雌ヌードマウスはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）から得られた。マウスは、標準的なげっ歯類マイクロアイソレーターケージ内でジェネンテックで飼育し、腫瘍細胞移植の前に少なくとも３日間、条件を研究するために順応させた。健康的に見え、明らかに異常の無い動物のみを研究に使用した。すべての実験手順は、アメリカ生理学会の指針に準拠し、ジェネンテックの施設内動物のケアと使用委員会によって承認された。マウスは、ヒトＫＰ４膵臓癌細胞（マウスあたりＨａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）プラスマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に５００万個の細胞）またはヒトＡ４３１表皮癌細胞（ＨＢＳＳプラスマトリゲル／マウスに５万個の細胞）のいずれかを皮下注射した。腫瘍が約１５０立方ミリメートルに達したときに、マウスが無作為化され、ビヒクルまたは二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ（ｂｓＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔの）（５０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、１ｘ／週）で２週間処置した。

腫瘍体積はＵｌｔｒａ Ｃａｌ−ＩＶキャリパー（モデル５４−１０−１１１；Ｆｒｅｄ Ｖ．Ｆｏｗｌｅｒ Ｃｏ．；Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）を使用して２つの寸法（長さと幅）で測定し、エクセルのバージョン１１．２（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｒｅｄｍｏｎｄ ＷＡ）を用いて解析した。腫瘍抑制グラフは、カレイダグラフバージョン３．６（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ；Ｒｅａｄｉｎｇ，ＰＡ）を使用してプロットした。腫瘍体積は、次の式で算出した：
腫瘍サイズ（ｍｍ^３）＝（長い測定×短い測定^２）×０．５

データは以下に記述される混合モデリング手法により解析した。ここでは、厳密な平均値及び標準偏差は算出されない。ばらつきを考慮するために標準偏差を提供するのではなく、信頼区間が使用される。これらは、表において、ＡＵＣ／日％ＴＧＩの横に括弧内に上限値と下限値として報告されている。動物の体重はＡｄｖｅｎｔｕｒａ Ｐｒｏ ＡＶ８１２スケール（Ｏｈａｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｐｉｎｅ Ｂｒｏｏｋ，ＮＪ）を用いて測定した。グラフはカレイダグラフバージョン３．６を使用して生成された重量変化の割合は、次の式で算出した：
グループパーセントの体重変化＝（新しい重量−初期重量）／初期重量）×１００

時間をかけて同じ動物からの腫瘍体積の反復測定を分析するために、混合モデリングアプローチを用いた(Pinheiro et al., Linear and Nonlinear Mixed Effects Models. (2008) R パッケージバージョン3.1-89)。このアプローチは、反復測定と研究終了前の動物の任意の無処置関連死による適度な脱落率の両方を扱う。

キュービック回帰スプラインが、各投与量についてｌｏｇ２腫瘍体積の経時変化に非線形プロファイルを適合するために使用された。これらの非線形プロファイルは、次いで混合モデルの中で用量に関連するものであった。ビヒクルの割合（％ＴＧＩ）としての腫瘍増殖阻害は、以下の式を用いて、ビヒクルとの関係で一日あたり各用量群に対する近似曲線下面積（ＡＵＣ）の割合として算出した：
％ＴＧＩ＝１００ｘ（１−ＡＵＣ用量／ＡＵＣ_ビヒクル）

％ＴＧＩについて不確か間隔（ＵＩ）を決定するために、近似曲線と近似共分散行列が、％ＴＧＩの分布に対する近似値としてランダムサンプルを生成するために使用された。ランダムサンプルはフィット混合モデルの１０００のシミュレートされた実現化で構成され、ここで％ＴＧＩは各実現化に対して再計算されている。報告されたＵＩは、時間の９５％に対して、％ＴＧＩの再計算された値が、与えられた近似モデルのこの領域に落ちるだろうする値であった。シミュレートされた分布の２．５パーセンタイル及び９７．５パーセンタイルが、上下のＵＩとして使用された。

作図が行われ、Ｒ、バージョン２．８．１（Ｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ ２００８；Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ；Ｖｉｅｎｎａ， Ａｕｓｔｒｉａ）及びエクセル、バージョン１２．０．１（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して生成されたデータはＲ、バージョン２．８．１を使用して分析し、および混合モデルはｎｌｍｅパッケージ、バージョン３．１（Ｐｉｎｈｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，２００８）を使用してＲに収まるようにした。

図１２と１３は、それぞれ、ＫＰ４膵移植モデル及びＡ４３１表皮癌異種移植モデルにおける抗ＥＧＦＲ／ｃ−ｍｅｔ二重特異性抗体のインビボ活性を示す。二重特異性抗体は、処置としてビヒクルのみ受け取ったコントロール動物と比較して、両方のモデルに対して、インビボで腫瘍の増殖を阻害することができた。グラフは、ＫＰ４異種移植において処置後２０日での線形混合効果（ＬＭＥ）適合腫瘍体積が、ビヒクルだけのアームにおいての１７１０ｍｍ^３と比較して５０５ｍｍ^３であり、及びビヒクルだけのコントロールにおいての４９５ｍｍ^３と比較して、Ａ４３１異種移植において２０日後で３２８ｍｍ^３であり、腫瘍体積が二重特異性抗体の投与により減少したことを示している。全体として、％ＴＧＩとして表現されたＡＵＣ／日に有意な変化があった。ＫＰ４異種移植片における二重特異性抗体治療において、８５パーセントの腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）があり、Ａ４３１異種移植モデルでは６８％ＴＧＩがあった。

実施例７：
ＣＨＯ細胞培養を用いたヘテロ多量体タンパク質の生産
この例では、２つの宿主CHO細胞集団を含む培養液からのヘテロ多量体タンパク質の形成を示す。

ノブ変異又はホール変異のいずれかを含有する半抗体は、当該技術分野において周知であるコンストラクト及び技術を用いて、重鎖及び軽鎖を一時的に発現させることによって、別々の培養で生成された。（例えば、Ye et al., Biotechnol Bioeng. 2009 Jun 15;103(3):542-51を参照。）細胞は、１リットルの培地で培養し(例えば、Wong et al., J. Biol. Chem. 2007 282(31):22953-22963を参照) 、１４日後に回収した。

各抗体は、５ｍＬのＭａｂＳＵＲＥ ＳＥＬＥＣＴカラムに捕獲された。次いで、カラムを平衡化緩衝液の１０カラム容量（ＣＶ）で洗浄し、続いて１０ＣＶのクエン酸ナトリウム低導電率緩衝液（平衡化緩衝液は５０ｍＭトリスｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％トリトンＸ−１００、０．０５％トリトンＸ−１１４から成り；低導電率洗浄緩衝液は２５ｍＭのクエン酸ナトリウムのｐＨは６．０から成る）で洗浄した。各アームは、０．１５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ２．７で溶出した。

各半抗体を、一晩室温で、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１〜３００の比率での１ｍＭのＥＤＴＡに透析した。各アームは、その後、遠心分離し、０．２２ミクロンの酢酸セルロースフィルターを用いてろ過し、２本のアームは、１対１の割合で混合した（総濃度は２ｍｇ／ｍＬ未満であった）。次いで、この混合物を、２つの方法のいずれか一で以下のように処理した：

酸化還元（ウォーターバスあり）：次いで、混合物を３７℃の水浴中で加熱した。１時間後、酸化還元混合物を水浴から取り出し、室温まで放冷した。混合物が室温に達したら、新たに調製された還元剤、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）が添加され、２ｍＭのＤＴＴの最終濃度を達成した。混合物を、２時間室温で放置し、次にアミコンＵｌｔｒａｃｅｌｌ遠心フィルター（１０Ｋ）を使用して、１１ｍｇ／ｍｌに濃縮し、そして５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＬのＮａＣｌ（１：３００）に一晩透析した。

酸化還元（ウォーターバス無し）：混合物を３時間室温で放置し、その後、新たに調製された還元剤、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）が添加され、２ｍＭのＤＴＴの最終濃度を達成した。混合物を、２時間室温で放置し、アミコンＵｌｔｒａｃｅｌｌ遠心フィルター（１０Ｋ）を使用して、１１ｍｇ／ｍｌに濃縮し、そして５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＬのＮａＣｌ（１：３００）に一晩透析した。

酸化還元の後、構築された物質は、前節と同様の２０ＣＶの勾配を用いて１５ｍＬのＨＩＣ ＰｒｏＰａｃ１０カラムで精製した。ランニング緩衝液は、２５ｍＭのリン酸カリウム、０．７Ｍ硫酸アンモニウム液ｐＨ６．５、及び溶出バッファーは２５ｍＭのリン酸カリウムｐＨ６．５、２５％イソプロパノールであった。１ｍＬの画分を集め、ピーク画分を、純度を分析するための４−２０％トリス−グリシンＳＤＳ ＰＡＧＥにより分離し、それに応じて、プールした。プールは、アミコンＵｌｔｒａｃｅｌｌ遠心フィルター（１０Ｋ）を使用して約１．５ｍｇ／ｍｌに濃縮され、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌに透析し、０．２２μｍでフィルタリングした。

各々の構築された二重特異性の同一性は質量分析法によって確認された。純度は４〜２０％のトリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及びバイオアナライザーで分析した。凝集体の量は、ＳＥＣ−ＭＡＬＳにより測定した。

結果を図１４−１９に示す。この例では、二重特異性抗体がＣＨＯ宿主細胞を用いて生成され得ることを実証している。当業者であれば、本方法は他のヘテロ多量体タンパク質を生成するために使用することができることを認識するであろう。

Claims (48)

1. 第一のヘテロ二量体化ドメインを有する第一のヒンジ含有ポリペプチド及び第二のヘテロ二量体化ドメインを有する第二のヒンジ含有ポリペプチドを含み、第二のヘテロ二量体化ドメインが第一のヘテロ二量体化ドメインと相互作用しており、第一及び第二のヒンジ含有ポリペプチドがヒンジ領域間にある少なくとも一の鎖間ジスルフィド結合により連結されているヘテロ多量体タンパク質を調製する方法であって、該方法が、
   （ａ）第一のヒンジ含有ポリペプチドが発現される条件下で第一のヒンジ含有ポリペプチドをコードする第一の核酸を含む第一の宿主細胞を培養する工程、
   （ｂ）第二のヒンジ含有ポリペプチドが発現される条件下で第二のヒンジ含有ポリペプチドをコードする核酸を含む第二の宿主細胞を培養する工程、
   （ｃ）第一の及び第二の宿主細胞を組み合わせて、第一の宿主細胞及び第二の宿主細胞を含む組合せ培養物を作製する工程、及び
   （ｄ）第一及び第二の宿主細胞の細胞膜を組合せ培養物中で破壊し、宿主細胞から第一及び第二のヒンジ含有ポリペプチドを放出してヘテロ多量体タンパク質を形成し、ヘテロ多量体タンパク質が組合せ培養物中で形成される工程を含む、方法。
2. 第一のヘテロ二量体化ドメインを有する第一のヒンジ含有ポリペプチド及び第二のヘテロ二量体化ドメインを有する第二のヒンジ含有ポリペプチドを含み、第二のヘテロ二量体化ドメインが第一のヘテロ二量体化ドメインと相互作用しており、第一及び第二のヒンジ含有ポリペプチドがヒンジ領域間にある少なくとも一の鎖間ジスルフィド結合により連結されているヘテロ多量体タンパク質を調製する方法であって、該方法が、
   （ａ）第一のヒンジ含有ポリペプチドが発現される条件下で第一のヒンジ含有ポリペプチドをコードする第一の核酸を含む第一の宿主細胞を培養する工程、
   （ｂ）第二のヒンジ含有ポリペプチドが発現される条件下で第二のヒンジ含有ポリペプチドをコードする核酸を含む第二の宿主細胞を培養する工程、
   （ｃ）第一の宿主細胞の培養物及び第二の宿主細胞の培養物を組み合わせて、第一の宿主細胞及び第二の宿主細胞を含む組合せ培養物を作製する工程、及び
   （ｉ）組合せ培養物中で、第一の及び第二のヒンジ含有ポリペプチドを分泌させてヘテロ多量体タンパク質を形成する工程、又は
   （ｉｉ）組合せ培養物中で、第一の及び第二の宿主細胞の細胞膜を破壊し、第一の及び第二のヒンジ含有ポリペプチドを宿主細胞から放出させて組合せ培養物中でヘテロ多量体タンパク質を形成する工程
   を含む、方法。
3. 第一のヘテロ二量体化ドメインを有する第一のヒンジ含有ポリペプチド及び第二のヘテロ二量体化ドメインを有する第二のヒンジ含有ポリペプチドを含み、第二のヘテロ二量体化ドメインが第一のヘテロ二量体化ドメインと相互作用しており、第一及び第二のヒンジ含有ポリペプチドがヒンジ領域間にある少なくとも一の鎖間ジスルフィド結合により連結されているヘテロ多量体タンパク質を調製する方法であって、該方法が、
   第一の及び第二のヒンジ含有ポリペプチドが発現される条件下で、第一のヒンジ含有ポリペプチドをコードする第一の核酸を含む第一の宿主細胞及び第二のヒンジ含有ポリペプチドをコードする核酸を含む第二の宿主細胞を、第一の宿主細胞及び第二の宿主細胞を含む組合せ培養物中で培養し、及び
   （ｉ）組合せ培養物中で、第一の及び第二のヒンジ含有ポリペプチドを分泌させてヘテロ多量体タンパク質を形成する工程、又は
   （ｉｉ）組合せ培養物中で、第一の及び第二の宿主細胞の細胞膜を破壊し、第一の及び第二のヒンジ含有ポリペプチドを宿主細胞から放出させてヘテロ多量体タンパク質を形成する工程
   を含む、方法。
4. ヘテロ多量体タンパク質を回収する工程を更に含む請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
5. 第一のヘテロ二量体化ドメインと第二のヘテロ二量体化ドメインが界面で接触し、第二のヘテロ二量体化ドメインのインターフェイシング部分が、第一のヘテロ二量体化ドメインのインターフェイシング部分の空洞（ホール）内に配置可能である突起（ノブ）を含む、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
6. 第一の及び第二のヘテロ二量体化ドメインがＦｃポリペプチドである、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
7. 第一のＦｃポリペプチドと第二のＦｃポリペプチドが界面で接触し、第二のＦｃポリペプチドの界面が、第一のＦｃポリペプチドの界面にある空洞（ホール）内に配置可能である突起（ノブ）を含み、及び空洞又は突起又はその両方がそれぞれ、第一及び第二のＦｃポリペプチドの界面中に導入されている、請求項６に記載の方法。
8. 第一のヘテロ二量体化ドメイン及び第二のヘテロ二量体化ドメインがロイシンジッパー又はコイルドコイルを含む、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
9. ヒンジ含有ポリペプチドが、Ｃ_Ｈドメイン又はその変異体、或いはＦｃ領域又はその変異体を含む、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
10. 第一のヒンジ含有ポリペプチドが抗体重鎖である、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
11. 第二のヒンジ含有ポリペプチドが抗体重鎖である、請求項１から５及び１０の何れか一項に記載の方法。
12. 第一のヒンジ含有ポリペプチドが、抗体軽鎖と対合して第一の対を形成する抗体重鎖である、請求項１から５、１０及び１１の何れか一項に記載の方法。
13. 第二のヒンジ含有ポリペプチドが、抗体軽鎖と対合して第二の対を形成する抗体重鎖である、請求項１から５及び１０から１２の何れか一項に記載の方法。
14. ヒンジ含有ポリペプチドが抗体軽鎖ポリペプチドと対合して標的結合アームを形成する、請求項１２又は１３に記載の方法。
15. ヒンジ含有ポリペプチドがヒトＣ_Ｈ２及び／又はＣ_Ｈ３ドメインの少なくとも一部分を含む、請求項１から５及び１０から１３の何れか一項に記載の方法。
16. ヒンジ含有ポリペプチドと軽鎖の片方もしくは両方の対がヒト化されている、請求項１３に記載の方法。
17. ヒンジ含有ポリペプチドと軽鎖が、別個の発現プラスミド上にコードされている、請求項１２又は１３に記載の方法。
18. ヒンジ含有ポリペプチドと軽鎖が、同じ発現プラスミド上にコードされている、請求項１２又は１３に記載の方法。
19. 宿主細胞が、原核細胞、大腸菌細胞、真核細胞、哺乳動物細胞、植物細胞からなる群から選択される、請求項１から１８の何れか一項に記載の方法。
20. 宿主細胞が、真核細胞又は哺乳動物細胞である、請求項１９に記載の方法。
21. 前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項２０に記載の方法。
22. 第一の及び第二の宿主細胞が、
    （ｉ）組合わされ、遠心分離され、細胞膜を破壊する前に緩衝液に再懸濁され、又は
    （ｉｉ）遠心分離され、緩衝液に再懸濁され、細胞膜を破壊する前に組合わされる、請求項１及び４−２１の何れか一項に記載の方法。
23. 第一の及び第二の宿主細胞の細胞膜が破壊され、細胞膜を破壊することが、細胞膜を透過処理すること、細胞膜の崩壊、細胞溶解、超音波処理、浸透圧ショック、マイクロフルイダイザーの通過、ＥＤＴＡの添加、種々の界面活性剤、溶媒、界面活性剤、低張緩衝液、凍結／解凍技術の使用、エレクトロポレーション、及びステンレス鋼のボールホモジナイザーの通過からなる群から選択される、請求項１及び３から２１の何れか一項に記載の方法。
24. 前記溶媒がトルエン及びジメチルスルホキシドから選択される、請求項２３に記載の方法。
25. 前記界面活性剤がトリトンＸ１００及びＴｗｅｅｎ２０から選択される、請求項２３に記載の方法。
26. 還元剤を添加する工程を更に含む、請求項１から２５の何れか一項に記載の方法。
27. 回収工程が、少なくとも一つの精製工程を更に含む、請求項４から２６の何れか一項に記載の方法。
28. （ａ）プロテインＡを含むカラム上で前記ヘテロ多量体タンパク質を捕獲する工程、
    （ｂ）前記ヘテロ多量体タンパク質を前記カラムから溶出する工程、及び
    （ｃ）前記溶出されたヘテロ多量体タンパク質をカオトロピック剤又は中性界面活性剤を含有する溶液に希釈する工程を更に含む、請求項１から２７の何れか一項に記載の方法。
29. ヘテロ多量体タンパク質が、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、ワンアームド抗体、多重特異性一価抗体、二重特異性マキシボディ、モノボディ、イムノアドヘシン、ペプチボディ、二重特異性ペプチボディ、一価ペプチボディ、抗体断片、Ｆｃ融合ポリペプチド、及びアフィボディからなる群から選択される、請求項１から２８の何れか一項に記載の方法。
30. ヘテロ多量体タンパク質が二重特異性抗体であり、二重特異性抗体が、第一の軽鎖と対合して第一の対を形成する第一のヒンジ含有ポリペプチド、及び第二の軽鎖と対合して第二の対を形成する第二のヒンジ含有ポリペプチドを含む、請求項２９に記載の方法。
31. ヘテロ多量体タンパク質が抗体であり、前記抗体が、重鎖定常ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む、請求項２９に記載の方法。
32. ヘテロ多量体タンパク質が抗体であり、前記抗体が、ヒト化抗体、全長抗体、ヒト抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、治療用抗体、アゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体、診断用抗体、遮断抗体、中和抗体、腫瘍抗原に結合することができる抗体、クラスター分化因子に結合することができる抗体、細胞生存調節因子に結合することができる抗体、細胞増殖調節因子に特異的に結合することができる抗体、組織発達又は分化に関連する分子に結合することができる抗体、細胞表面分子に結合することができる抗体、又はリンホカインに結合することができる抗体である、請求項２９に記載の方法。
33. 重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの片方もしくは両方の対がヒト型である、請求項１３又は３０に記載の方法。
34. 抗体が、ヒトＣ_Ｈ２及び／又はＣ_Ｈ３ドメインの少なくとも一部分を含む抗体断片である、請求項２９に記載の方法。
35. 前記抗体が、腫瘍抗原に結合することができ、
    （ｉ）腫瘍抗原が細胞表面分子ではなく、又は
    （ｉｉ）腫瘍抗原がクラスター分化因子ではない
    請求項３２に記載の方法。
36. 第一の対及び第二の対の軽鎖が異なる可変ドメイン配列を含む、請求項１３又は３０に記載の方法。
37. ヘテロ多量体タンパク質が二重特異性抗体であり、少なくとも４５％のポリペプチドが前記二重特異性抗体を形成する、請求項２９に記載の方法。
38. 前記二重特異性抗体が２つの標的分子に特異的に結合することができる、請求項３０に記載の方法。
39. 第一のアームが第一の標的分子に特異的に結合し、及び第二のアームが第二の標的分子に特異的に結合する、請求項３８に記載の方法。
40. 少なくとも４５％のポリペプチドが、第一のヒンジ含有ポリペプチドと軽鎖の対及び第二のヒンジ含有ポリペプチドと軽鎖の対を含む複合体の状態である、請求項１３又は３０に記載の方法。
41. ヘテロ多量体タンパク質を精製する工程の前に、１０％以下の単離されたポリペプチドが単量体又はホモ二量体として存在する、請求項２７に記載の方法。
42. 第一の対及び第二の対の軽鎖が異なる可変ドメイン配列を含む、請求項１３又は３０に記載の方法。
43. 第一及び第二の重鎖−軽鎖の対の各々が、互いにジスルフィド結合した重鎖及び軽鎖を含む、請求項１３又は３０に記載の方法。
44. 第一の対及び第二の対の間のｐＩ値の違いが少なくとも０．５である、請求項１３又は３０に記載の方法。
45. 第一のヘテロ二量体化ドメインを有する第一のヒンジ含有ポリペプチド及び第二のヘテロ二量体化ドメインを有する第二のヒンジ含有ポリペプチドを含み、第二のヘテロ二量体化ドメインが第一のヘテロ二量体化ドメインと相互作用しており、第一及び第二のヒンジ含有ポリペプチドがヒンジ領域間にある少なくとも一の鎖間ジスルフィド結合により連結されているコンビナトリアルヘテロ多量体タンパク質ライブラリを生成する方法であって、該方法が、
    （ａ）第一の宿主細胞と少なくとも２つの更なる宿主細胞を培養する工程であって、
    （ｉ）前記第一の宿主細胞が、第一のヒンジ含有ポリペプチドをコードする第一の核酸を含み、及び
    （ｉｉ）前記更なる宿主細胞が、第二のヒンジ含有ポリペプチドを含む核酸を含む、工程、
    （ｂ）第一の宿主細胞と該少なくとも２つの更なる宿主細胞を組み合わせて、第一の宿主細胞及び該少なくとも２つの更なる宿主細胞を含む組合せ培養物を作製する工程、及び
    （ｃ）第一の宿主細胞及び該少なくとも２つの更なる宿主細胞の細胞膜を組合せ培養物中で破壊し、第一及び第二のヒンジ含有ポリペプチドが細胞外環境に放出され、ヘテロ多量体タンパク質複合物が組合せ培養物中で形成される工程であって、先に精製工程がない、工程、並びに
    （ｄ）ヘテロ多量体タンパク質複合物を回収する工程を含む、方法。
46. 第一のヘテロ二量体化ドメインを有する第一のヒンジ含有ポリペプチド及び第二のヘテロ二量体化ドメインを有する第二のヒンジ含有ポリペプチドを含み、第二のヘテロ二量体化ドメインが第一のヘテロ二量体化ドメインと相互作用しており、第一及び第二のヒンジ含有ポリペプチドがヒンジ領域間にある少なくとも一の鎖間ジスルフィド結合により連結されているコンビナトリアルヘテロ多量体タンパク質ライブラリを生成する方法であって、該方法が、
    （ａ）第一の宿主細胞と少なくとも２つの更なる宿主細胞を培養する工程であって、
    （ｉ）前記第一の宿主細胞は、第一のヒンジ含有ポリペプチドをコードする第一の核酸を含み；及び
    （ｉｉ）前記更なる宿主細胞は、第二のヒンジ含有ポリペプチドを含む核酸を含む、工程、
    （ｂ）第一の宿主細胞の培養物及び該少なくとも２つの更なる宿主細胞の培養物を組み合わせて、第一の宿主細胞及び該少なくとも２つの更なる宿主細胞を含む組合せ培養物を作製し、且つ
    （ｉ）第一の及び該少なくとも２つの更なるヒンジ含有ポリペプチドを組合せ培養物中に分泌させて、ヘテロ多量体タンパク質を組合せ培養物中で形成する、先に精製工程がない、工程、又は
    （ｉｉ）第一の宿主細胞及び該少なくとも２つの更なる宿主細胞の細胞膜を組合せ培養物中で破壊し、第一の及び第二のヒンジ含有ポリペプチドを細胞外環境に放出させて、ヘテロ多量体タンパク質複合体を組合せ培養物中で形成する、先に精製工程がない、工程
    及び
    （ｃ）組合せ培養物からヘテロ多量体タンパク質複合物を単離する工程を含む、方法。
47. 第一のヒンジ含有ポリペプチドが抗体軽鎖ポリペプチドと対合して第一の標的結合アームを形成し、第二のヒンジ含有ポリペプチドが抗体軽鎖ポリペプチドと対合して第二の標的結合アームを形成する、請求項１から４６の何れか一項に記載の方法。
48. 標的結合アームの各々又は両方が二以上の標的に結合することができる、請求項４７に記載の方法。