DE4032287A1

DE4032287A1 - L-carnitin-dehydrogenase und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE4032287A1
Application number: DE4032287A
Authority: DE
Inventors: Mamoru Takahashi; Shinobu Nagasawa; Kazuo Matsuura
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1989-10-13
Filing date: 1990-10-11
Publication date: 1991-04-18
Also published as: US5173416A; JPH03127985A; FR2653135A1; IT9021728A0; JP3059735B2; DE4032287C2; IT1243739B; US5156966A; FR2653135B1; IT9021728A1

Description

Gegenstand der Erfindung ist eine Carnitin-Dehydrogenase, die in Lösung stabil ist, sowie Verfahren zu ihrer Herstellung. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Carnitin-Dehydrogenase, die in einer Lösung, in der die Carnitin-Dehydrogenase zur Bestimmung von L-Carnitin in der klinischen Chemie verwendbar ist, stabil ist, Nährstoffbedingungen und L-Carnitinbildung oder die Messung von aus der Hydrolyse von Acyl-L-Carnitin gebildetem L-Carnitin.

L-Carnitin ist eine essentielle Substanz zur Vermittlung des Transports langkettiger Fettsäuren durch die Mitochondrien- Membran vor der β-Oxidation in einer Zelle, und daher verursacht ein Mangel an L-Carnitin Störungen des Fettsäurestoffwechsels sowie verwandter Stoffwechselwege. Insbesondere wurde beschrieben, daß Störungen bezüglich der Skelettmuskulatur und des Herzmuskels, die beide einen hohen Energieverbrauch haben, in Abhängigkeit von Carnitin und bei fehlender bzw. mangelnder Carnitinbildung aufgetreten sind. Früher wurde den Erkrankungen im Zusammenhang mit angeborenen Carnitin- Stoffwechselfehlern Aufmerksamkeit geschenkt. In jüngster Zeit wurden jedoch Sekundärstörungen des Carnitin-Stoffwechsels zum Problem bei Nephrose- und Dialysepatienten. Carnitin wird Carnitin-defizienten Patienten, die diese Erkrankung im Muskel oder Herzmuskel oder infolge von Dialyse haben, verabreicht. Untersuchungen bezüglich Carnitin bei Erkrankung und in der Therapie wurden erforderlich; jedoch ist ein bevorzugtes Bestimmungsverfahren für Carnitin auf klinischem Gebiet bisher nicht bekannt.

Bisher sind die folgenden Bestimmungsverfahren für Carnitin bekannt:

L-Carnitin und Acetyl-CoA werden mit Carnitin-Acetyltransferase (CAT) behandelt, und so freigesetztes CoASH und 5,5′- Dithio-bis-2-nitrobenzoat (DTNB) werden weiter umgesetzt unter Bildung des Thiophenolations, das colorimetrisch gemessen wird (DTNB-Verfahren) [J. Biol. Chem., 238 : 2509 (1963), J. Lipid Res., 5 : 184-187 (1964) und Clinical Pathology, 36 (11) : 1296-1302 (1988)]; L-Carnitin und ¹⁴C- oder ³H-markiertes Acetyl-CoA werden mit CAT behandelt, um markiertes Acetyl-L-Carnitin und CoASH zu bilden, und die Radioaktivität wird gemessen (Radioisotopen-Verfahren) [Clin. Chem. Acta, 37 : 235-243 (1972)], [J. Lipid Res., 17 : 277-281 (1976), und J. Japan. Nut. Food. Soc., 41 (5) : 389-395 (1988)]; L-Carnitin und NAD⁺ werden mit L-Carnitin-Dehydrogenase unter Bildung von 3-Dehydrocarnitin und NADH behandelt, und die erhöhte UV-Absorption durch NADH wird gemessen (Carnitin-Dehydrogenaseverfahren) [Eur. J. Biochem., 6 : 196-201 (1968), ibid. 10 : 56-60 (1969), und Fresenius Z. Anal. Chem., 320 (3) : 285-289 (1985)]; und L-Carnitin und Acetyl-CoA werden mit CAT unter Bildung von CoA behandelt, das mit N-{p-(2-Benzimidazolyl)-phenyl}-malimid (BIPM) umgesetzt wird, und die Fluoreszenzintensität des gebildeten CoA-BIPM wird gemessen (Fluoreszenzverfahren) [Ann. Rep. MHW Institute for Nerve Disease, S. 315-318 (1986)].

Die bisher bekannte Carnitin-Dehydrogenase wurde bekanntlich von Pseudomonas aeruginosa A 7244 (NCTC) [Eur. J. Biochem., 6 : 196-201 (1968), ibid., 10 : 56-60 (1969)], Pseudomonas putida IFP 206 Arch. Microbiol., 116 : 213-220 (1978), Biochem. Biophys. Acta, 957 : 335-339 (1988)], Pseudomonas putida ATCC 17 633 [Fresenius′ Z. Anal. Chem., 320 : 285-289 (1985)] und Xanthomonas translucens IFO 13558 [Agr. Biol. Chem., 52 : 851-852 (1988)] gebildet.

In der klinischen Chemie werden fast alle biochemischen Reagenzien in lyophilisierter Form infolge der Stabilität der Reagenzien bereitgestellt. Kürzlich wurde eine Längzeitlagerung in flüssiger Form für Reagenzien verlangt. Angesichts der obigen Ausführungen müssen Reagenzien zur Bestimmung von Carnitin unter Verwendung von L-Carnitin- Dehydrogenase nicht außergewöhnlich sein. Im allgemeinen sind Enyzme in biochemischen Reagenzien äußerst instabil, und daher ist eine solche Instabilität ein Hindernis bei einem Bestimmungsverfahren, bei dem ein Enzym verwendet wird.

Die bisher bekannte L-Carnitin-Dehydrogenase ist ein Enzym bakteriellen Ursprungs, wie z. B. aus Pseudomonas oder Xanthomonas, und über die Stabilität des Enzyms in Lösung wurde nie berichtet, und sie ist auch unmöglich zu bestimmen. Unter diesen soll L-Carnitin-Dehydrogenase aus Pseudomonas putida IFP 206 sofort die Aktivität bei 35°C verlieren [Biochim. Biophys. Acta, 957 : 335-339 (1988)], und wenn eine Enzymaktivität bei 37°C gemessen wird, muß ein schneller Aktivitätsverlust während der Bestimmung erwartet werden, und somit besitzt sie keine praktische Verwertbarkeit.

Von den Erfindern wurde versucht, die Langzeitstabilität von L-Carnitin-Dehydrogenase verschiedenen Ursprungs in Lösung zu messen, und es wurden die L-Carnitin-Dehydrogenase bildenden Bakterienstämme gescreent. Anschließend wurde Pseudomonas Aeruginosa NCTC A 7244, Xanthomonas translucens IFO 13558, die beide in den zuvor erwähnten Berichten beschrieben sind, und Pseudomonas aeruginosa IFO 13130 ausgewählt. Diese drei Stämme wurden in Kultur genommen gemäß dem Verfahren, das in Eur. J. Biochem., 6 : 196-201 (1968), ibid., 10 : 56-60 (1969) und Agr. Biol. Chem., 52 : 249- 250 (1988) beschrieben ist, und L-Carnitin-Dehydrogenase wurde aus dem Kulturgut isoliert.

Eine zeitabhängige Stabilität von 10 Einheiten/ml L-Carnitin- Dehydrogenase in 50 mM Tris-HCl-Pufferlösung pH 9,0 über 2 Wochen bei 5°C wurde gemessen. L-Carnitin-Dehydrogenase, die von den obigen drei Stämmen erhalten wurde, hatte ihre Aktivität nach 2 Wochen auf unter 50% verloren, im Vergleich zur Eingangsaktivität. Insbesondere die Enzyme aus Pseudomonas aeruginosa NCTC A 7244 und IFO 13130 verloren ihre Aktivität auf unter 30%. Daher muß die aus dem Stand der Technik bekannte L-Carnitin-Dehydrogenase als instabil bewertet werden, und ein L-Carnitin-Bestimmungsreagens, bei dem dieses Enzym verwendet wird, liefert unglaubwürdige Ergebnisse infolge der Instabilität.

Daher wurde erfindungsgemäß versucht, eine L-Carnitin-Dehydrogenase mit einer Stabilität von über 50% der Aktivität im Vergleich zur Eingangsaktivität bei 5°C in einer gepufferten Lösung für 2 Wochen zu finden.

Es wurde gefunden, daß eine Mikroorganismengattung des Stammes Alcaligenes Nr. 981, isoliert aus einer Bodenprobe aus einem Kartoffelfeld in Gojo-shi, Nara Pref., Japan, L-Carnitin-Dehydrogenase mit der bevorzugten Stabilität in Lösung bildet.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer stabilen L-Carnitin-Dehydrogenase, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie eine Aktivität von mindestens über 70% nach Behandlung mit einer Tris-HCl-Pufferlösung bei pH 9,0 unter etwa 5°C für etwa 1 Woche im Vergleich mit der Aktivität davon vor der Behandlung beibehält.

Weiterhin soll erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung von L-Carnitin-Dehydrogenase bereitgestellt werden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man L-Carnitin-Dehydrogenase bildende Mikroorganismen, die zur Gattung Alcaligenes gehören, in einem Nährmedium in Kultur nimmt und L-Carnitin- Dehydrogenase daraus isoliert.

Die Erfindung wird anhand der beigefügten Figuren näher erläutert. Es zeigt

Fig. 1 die Hitzestabilität der erfindungsgemäßen L-Carnitin- Dehydrogenase.

Fig. 2 das Temperatur-Optimum des erfindungsgemäßen Enzyms.

Fig. 3 die pH-Stabilität des erfindungsgemäßen Enzyms.

Fig. 4 das pH-Optimum des erfindungsgemäßen Enzyms.

Fig. 5 die Stabilität von L-Carnitin-Dehydrogenase, die aus bekannten Mikroorganismen erhalten wurde, und gemäß vorliegender Erfindung, in einer wäßrigen Lösung.

Ein erfindungsgemäß verwendeter Stamm gehört zur Gattung Alcaligenes und der Stamm Nr. 981, der von den Erfindern isoliert wurde, ist ein bevorzugtes Beispiel für die Mikroorganismen.

Die taxonomischen Eigenschaften des Stammes sind wie folgt dargestellt.

Zur Identifizierung eines erfindungsgemäß verwendeten Bakterienstammes wurden "A Manual for Medical bacteria (2. Aufl.)" und "Microbiological Methods (Bd. 3)" zu Bestimmungsversuchen und Bergys′s Manual of Determinative Bacteriology (8. Aufl.), Bergys′s of Systematic Bacteriology Bd. 1 (1984) und Bd. 2 (1986) zum Nachschlagen verwendet.

(a) Morphologische Eigenschaften

Auf einem Agarnährmedium wurden an Kulturen für 18- 24 Stunden bei 28-30°C die folgenden Beobachtungen gemacht:

Runde Kanten an geraden oder leicht gekrümmten Stäbchen und einzelne oder doppelt verknüpfte etwas kürzere Ketten. Keine Sporenbildung. Die Größen betragen 0,4- 0,6×1,2-2,5 µm. Peritriche Bewegung. Kein Polymorphismus.

(b) Wachstum auf verschiedenen Medien

Auf verschiedenen Medien wurden an Kulturen für 18- 24 Stunden bei 28-30°C die folgenden Beobachtungen gemacht:

(1) Schräg-Agarnährmedium:
Gutes Wachstum unter Fadenbildung. Feucht unter Lumineszenz. Ockerfarbig, aber keine Bildung eines löslichen Pigments.
(2) Platten-Agarnährmedium:
Runde, konvexe und ganze runde Kolonien. Glatte feuchte Oberfläche. Ockerfarbig oder schwach ockerfarbig. Keine Bildung eines löslichen Pigments.
(3) Flüssiges Medium (wäßriges Pepton):
Gutes Wachstum mit gleichförmiger Trübe. Bildung einer Membran bei der Langzeitkultur (über 40 Stunden).
(4) BCP-Milchmedium:
Alkalisch nach 4-5 Tagen.

(c) Physiologische Eigenschaften

[+: positiv, (+): schwach positiv, -: negativ]

Gram-Färbung
-
KOH-Reaktion	+
Kapselbildung	-
Anfärbung auf Säurebeständigkeit	-
OF-Test (Hugh Leifson)	keine Veränderung
OF-Test (Stickstoffquelle: NH₄H₂PO₄)	O (oxidativ)
Aerobes Wachstum	+
Anaerobes Wachstum	-
Wachstumstemperatur @	41°C	-
37°C	+
15°C	+
Halotoleranz NaCl-Konzentration % @	0%	+
5%	+
7%	-
Wachstums-pH @	pH 4,6	-
pH 5,4	+
pH 8,9	+
pH 9,8	-
Gelatine-Hydrolyse	-
Stärke-Hydrolyse	-
Casein-Hydrolyse	-
Äsculin-Hydrolyse	-
Cellulose-Hydrolyse	-
Tyrosin-Hydrolyse	-
Catalase-Bildung	+
Oxidase-Bildung	+
LV-Reaktion	-
Urease-Bildung (SSR)	-
Urease-Bildung (Chris)	-
Indol-Bildung	-
H₂S-Bildung (Detektion: Bleiacetatpapier	-
Acetoin-Bildung (K₂HPO₄)	-
Acetoin-Bildung (NaCl)	-
MR-Test	-
Nitratreduktion @	Gasdetektion	+
NO₂^--Detektion	-
NO₃^--Detektion	-
Verwertung auf Simmons-Medium @	Citrat	+
Malat	+
Maleat	-
Malonat	(+)
Propionat	-
Gluconat	-
Succinat	+
Verwertung auf Christenssen-Medium @	Citrat	+
Malat	+
Maleat	+
Malonat	+
Propionat	-
Gluconat	+
Succinat	+
Gasbildung aus Glukose	-

Säurebildung aus Zucker
Adonit	-
L(+)-Arabinose	(+)
Cellobiose	-
Dulcit	-
Meso-erythrit	-
Fructose	-
Galactose	+
Glukose	+
Glycerin	(+)
Inosit	-
Inulin	-
Lactose	-
Maltose	-
Mannit	-
Mannose	+
Melezitose	-
Melibiose	-
Raffinose	-
L(+)-Rhamnose	-
D-Ribose	-
Salicin	-
L-Sorbose	-
Sorbit	-
Stärke	-
Saccharose	-
Xylose	-
Trehalose	-
Poly-β-hydroxybutyrat-Anreicherung	-

(d) Verwertung von Kohlenstoffquellen

Testmedium: flüssiges Medium (pH 7,0), das 5 g Kohlenstoffquelle, 5 g NaCl, 0,2 g MgSO₄ · 7 H₂O, 1,0 g NH₄H₂PO₄ und 1 l destilliertes Wasser enthält. Das Ergebnis ist wie folgt:

Glukose
+
L(+)-Arabinose	-
Fructose	+
Mannit	-
Mannose	+
Gluconat	+
Acetat	+
Adipat	-
Pimerat	+
Suberat	+
Tartrat	+

Gemäß den obigen taxonomischen Eigenschaften besitzt der Mikroorganismus die typischen Eigenschaften von gram-negativen Bazillen, d. h., peritriche Bewegung, Catalase positiv, Oxidase positiv, keine Säurebildung aus Glukose in Hugh- Leifson-Medium, das Pepton enthält, oxidative Zersetzung von Glukose und Säurebildung. Er bildet keine Sporen, ist nicht polymorph und aerob.

Unter den gram-negativen Bazillen gibt es drei Mikroorganismengattungen, die peritriche Bewegung zeigen, d. h. Genus-Alcaligenes, Genus Chromobacterium und Genus Flavobacterium. Chromobacterium bildet ein violett gefärbtes Pigment, und Flavobacterium bildet ein gelb gefärbtes Pigment. Der erfindungsgemäße Stamm jedoch bildet kein Pigment. Daher gehört der erfindungsgemäße Stamm zur Gattung Alcaligenes.

Die taxonomischen Eigenschaften von Alcaligenes im Vergleich mit den erfindungsgemäßen gemäß Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology, Bd. 1 (1984) sind im Vergleich mit Alcaligenes faecalis (im folgenden als F bezeichnet), Alcaligenes denitrificans (im folgenden als D bezeichnet) und Alcaligenes denitrificans subsp. xylosoxidans (im folgenden als X bezeichnet) wie folgt näher erläutert:

+: positive Wahrscheinlichkeit über 90%.
-: negative Wahrscheinlichkeit über 90%.
d: nicht identifiziert als + oder -.

Gemäß dem obigen Vergleich besitzt der erfindungsgemäße Stamm Nr. 981 viele identische Eigenschaften, besitzt jedoch spezifische Unterschiede hinsichtlich der Säurebildung auf OF-Medium und der Säurebildung aus Xylose. Folglich wurde der erfindungsgemäße Stamm aus Alcaligenes sp. Nr. 981 bezeichnet und bei dem Fermetation Research Institute hinterlegt und mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-2570 bezeichnet.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden L-Carnitin-Dehydrogenase bildende Mikroorganismen, die zu der Gattung Alcaligenes gehören, in einem Medium kultiviert.

Ein bevorzugtes Beispiel ist der oben erwähnte Alcaligenes sp. Nr. 981. Da die taxonomischen Eigenschaften eines Mikroorganismus im allgemeinen leicht variieren, können Mikroorganismen einer natürlichen oder künstlichen Mutante, die z. B. durch Mutation durch UV-Bestrahlung, Bestrahlung oder mutagene Chemikalien, wie z. B. N-Methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin oder Ethylmethan-sulfonat erzeugt wurden, die zur Gattung Alcaligenes gehören und die Fähigkeit zur Bildung von L-Carnitin-Dehydrogenase besitzen, erfindungsgemäß verwendet werden.

Eine Kultivierung kann nach an sich bekannten bakteriellen Kultivierungsverfahren vorgenommen werden. Da eine Bildung von L-Carnitin-Dehydrogenase durch Zugabe von Carnitin induziert werden kann, wird die Kultivierung vorzugsweise in einem carnitin-haltigen Medium vorgenommen.

Die Nährstoffquellen für das Medium sind, zusätzlich zu Carnitin, übliche Medien für die Kultivierung von Mikroorganismen, die assimilierbare Kohlenstoffquellen, abbaubare Stickstoffquellen und, sofern erforderlich, anorganische Salze enthalten.

Beispiele für assimilierbare Kohlenstoffquellen sind Glukose, Fructose, Saccharose, Rohrzucker und Melassen in Kombination oder allein. Abbaubare Stickstoffquellen sind z. B. Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt oder Getreidedicksaft (corn steep liquor) in Kombination oder allein. Ferner können, sofern erforderlich, Metallsalze, wie z. B. von Magnesium, Calcium, Kalium, Natrium, Eisen, Mangan usw. zugesetzt werden. Andere bekannte assimilierbare Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen können auch verwendet werden.

Die Kultivierung kann in einer an sich bekannten Schüttelkultur oder durch die geschüttelte bzw. gerührte Kultur unter Belüftung unter aeroben Bedingungen vorgenommen werden, und in industriellem Maßstab ist eine belüftete Submers- Kultur bevorzugt.

Die Temperatur der Kultur kann variiert werden, je nach der Wachstumsrate der Mikroorganismen und der Rate der L-Carnitin-Dehydrogenase-Bildung und sie beträgt 15-37°C, bevorzugt etwa 28°C. Die Kultivierungszeit hängt von den Bedingungen ab und beträgt üblicherweise 1-3 Tage. Die Kultivierung sollte im Stadium der maximalen Enzymproduktion beendet werden.

Diese Bedingungen, ebenso wie die Zusammensetzung und Konzentration des Kulturmediums, die Kulturtemperatur, die Rührgeschwindigkeit und die Belüftungsrate, können je nach Art des Stamms und anderen Bedingungen kontrolliert werden. In einer Flüssigkultur können Entschäumungsmittel, wie z. B. Siliconöl, Pflanzenöl zugesetzt werden, sofern notwendig.

L-Carnitin-Dehydrogenase ist in mikrobiellen Zellen eingeschlossen. Das Enzym kann beispielsweise dadurch isoliert werden, daß das Kulturmedium filtriert oder zentrifugiert wird, um die mikrobiellen Zellen abzutrennen, und daß die isolierten bakteriellen Zellen mit Ultraschall, einer Presse nach French, mechanischem Zerreißen unter Verwendung von Glasperlen oder Zerreißen durch Gefrieren behandelt werden, oder daß sie enzymatisch mit Lysozym verdaut werden, um eine rohe L-Carnitin-Dehydrogenase-Lösung zu erhalten. L-Carnitin-Dehydrogenase kann aus der rohen Enzymlösung nach an sich bekannten Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Proteinen und Enzymen erhalten werden. Zum Beispiel kann das Verfahren der Ausfällung durch Aussalzen, durch Zugabe von Ammoniumsulfat, Natriumsulfat oder Kaliumphosphat zu der rohen L-Carnitin-Dehydrogenase-haltigen Lösung verwendet werden. Ferner kann das Präzipitat gereinigt werden, sofern notwendig, indem man auch ein Molekularsieb, Chromatographie, Elektrophorese oder Ultrazentrifugation anwendet. Die Reinigung kann durchgeführt werden, indem man die physiko-chemischen Eigenschaften der L-Carnitin-Dehydrogenase ausnützt. Zum Beispiel wird das ausgefällte Enzym in Wasser oder einer Pufferlösung aufgelöst, mit einer semipermeablen Membran, sofern erforderlich, dialysiert und einer Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung von DEAE-Cellulose, DEAE-Sephacel, DEAE- Sepharose, DEAE-Sephadex A-50 (Pharmacia Corp.) oder DEAE- Toyopearl (Toyosoda Co.), oder Molekularsiebverfahren, wie z. B. Gelfiltration, unter Verwendung von Sephadex G-100, G-75 oder Sephacryl S-200, unterworfen. Diese Verfahren können in Kombination verwendet werden. Ein gereinigtes Pulver aus L-Carnitin-Dehydrogenase kann mit einem zugesetzten Stabilisator, z. B. einem Zucker wie Mannit, Saccharose oder Sorbit, einer Aminosäure, wie z. B. Glutaminsäure oder Glycin, oder einem Peptid oder Protein, wie z. B. Rinderserum- Albumin lyophilisiert werden.

Die erhaltene L-Carnitin-Dehydrogenase besitzt die folgenden Eigenschaften:

(1) Enzymwirkung:
Das Enzym katalysiert mindestens eine Reaktion mit L-Carnitin und NAD⁺, wobei 3-Dehydrocarnitin und NADH, wie unten gezeigt, gebildet werden.
(2) Substratspezifität:
L-Carnitin 100%
Cholin 0
Glycinbetain 0
Glukose 0
Lysin 0
(3) Molekulargewicht:
51 000 ± 6000
Gemessen auf TSK-Gel G3000 SW (Toso Co., 0,75×60 cm).
Elution: 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0,2 M NaCl enthält.
Standard: Die folgenden Molekularmarker (Oriental yeast Co.) wurden verwendet. MG  12 400 Cytochrom C
MG  32 000 Adenylatkinase
MG  67 000 Enolase
MG 142 000 Lactat-Dehydrogenase
MG 290 000 Glutamat-Dehydrogenase
(4) Isoelektrischer Punkt:
pH 5,3 ± 0,6
Gemessen durch Elektrofokussierung unter Verwendung von Träger-Ampholiten bei 4°C, 700 V, für 40 Stunden. Die Aktivität jeder Enzymfraktion wurde gemessen.
(5) Km-Wert: 0,141 mM (NAD⁺), 9,3 mM (L-Carnitin)
Der Km-Wert für NAD⁺ wurde in verschiedenen Konzentrationen an NAD⁺ in einem Reaktionsgemisch aus: 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 9,0)
  5 U Diaphorase (Toyo Jozo Co.)
  0,025% NBT (Wako Pure Chem., Co.)
  1% Tween 80 (Wako Pure Chem., Co.) und
50 mM L-Carnitingemessen.
In dem Reaktionsgemisch wurden 50 mM L-Carnitin durch 1 mM NAD⁺ ersetzt, und die Konzentration an L-Carnitin wurde zur Bestimmung des Km-Wertes für L-Carnitin verändert.
Die Ergebnisse sind oben gezeigt.
(6) Hitzestabilität:
Die Enzymlösung (1,00 U/ml), aufgelöst in 20 mM Tris- HCl-Puffer (pH 8,0), wird für 1 Stunde bei verschiedenen Temperaturen inkubiert, und die verbleibende Aktivität wird gemessen.
Die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt, bei der das Enyzm bis zu 45°C stabil ist.
(7) Temperaturoptimum:
Die Enzymaktivität wird bei 35, 40, 45, 50, 55 bzw. 60°C in einem 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 9,0) gemäß dem im folgenden näher erläuterten Bestimmungsverfahren gemessen. Die Reaktion wird nach 10minütiger Inkubation durch Zugabe von 0,1 N HCl (2 ml) gestoppt, und anschließend wird die optische Absorption bei 550 nm gemessen. Wie in Fig. 2 gezeigt, zeigt das Enzym maximale Aktivität bei 50°C.
(8) pH-Stabilität:
Die Restaktivität des Enzyms (1 U/ml, 40 mM Puffer- Lösung) nach 30minütigem Erhitzen auf 45°C wird gemessen. Wie in Fig. 3 gezeigt, ist das Enzym bei pH 8,0∼9,0 stabil, wobei die Restaktivität über 95% liegt. In dieser Figur bedeuten: -▲- = Acetatpuffer, pH 5,6∼6,0; -○- = Phosphatpuffer, pH 6,0∼8,0; -⚫- = Tris-HCl-Puffer, pH 9,0∼10,0 und -∆- = Glycin- NaOH-Puffer, pH 9,0∼10.
(9) pH-Optimum: etwa pH 9,0, wie in Fig. 4 gezeigt:
In dem im folgenden näher erläuterten Bestimmungsverfahren auf die Enzymaktivität wird 100 mM Tris-HCl- Puffer in einem Reaktionsgemisch durch 100 mM Phosphatpuffer (pH 6,5∼7,5, -○-), 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0∼9,0, -⚫-) oder 100 mM Glycin-NaOH-Puffer (pH 9,0∼10,0, -∆-) ersetzt, und bei 37°C 10 Minuten lang inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,1 N HCl gestoppt, und die Absorption wird bei 550 nm gemessen.
Das Ergebnis ist in Fig. 4 gezeigt. Die maximale Aktivität wird bei etwa pH 9,0 beobachtet.
(10) Langzeitstabilität in einer wäßrigen Lösung:
Die Stabilität von L-Carnitin-Dehydrogenase verschiedenen Ursprungs wird in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 9,0, 10 U/ml) bei 5°C für eine 2wöchige Lagerung gemessen.
Das Ergebnis ist in Fig. 5 gezeigt. (-○-: L-Carnitin-Dehydrogenase aus Pseudomonas aeruginosa IFO 13130; -▲-: Pseudomonas aeruginosa NCTC A 7244; -∆-: Xanthomonas translucens IFO 13558; --: Alcaligenes sp. Nr. 981, und -∎-: L-Carnitin-Dehydrogenase aus Alcaligenes sp. Nr. 981 versetzt mit 0,05 mM NAD⁺). Die L-Carnitin-Dehydrogenase, die aus den zuvor erwähnten früher bekannten drei Stämmen erhalten wurde, zeigt eine Restaktivität von 53∼40% nach 1wöchiger Lagerung und unter 45% nach 2wöchiger Lagerung. Insbesondere das Enzym aus Pseudomonas aeruginosa IFO 13130 zeigt eine noch schlechtere Restaktivität von 21%. Die erfindungsgemäße L-Carnitin-Dehydrogenase zeigt eine Restaktivität von 96% nach einer Woche und 82% nach 2 Wochen, was die überlegene Stabilität im Vergleich zu den Enzymen aus den bekannten Mikroorganismen zeigt. Die Ergebnisse zeigen auch, daß ein Enzym, dem 0,05 mM NAD⁺ zugesetzt worden war, eine Restaktivität von 99,7% nach einer Woche und von 95,1% nach 2 Wochen besitzt, was den überlegenen Stabilisierungseffekt der Zugabe von NAD⁺ zeigt.
(11) Bestimmungsverfahren auf L-Carnitin-Dehydrogenase- Aktivität:
- 1. Reaktionsgemisch:
  50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 9,0)
    1 mM NAD⁺
    5 U Diaphorase (Toyo Jozo Co.)
    0,05% NBT (Wako Pure Chem., Co.)
  100 mM KCl
    0,5% Polyoxyethylen-(20)-sorbitan-monooleat (Wako Pure Chem. Co.)
  100 mM L-Carnitin (Sigma Chem. Co.)
- 2. Enzymmassay:
  Das obige Reaktionsgemisch (1 ml) wird in einem kleinen Reagenzglas bei 37°C 5 Minuten lang inkubiert. Die verdünnte Enzymlösung (0,02 ml) wird zugegeben und es wird gerührt, um die Reaktion in Gang zu setzen. Nach exakt 10 Minuten werden 0,1 N HCl (2,0 ml) zugesetzt, und es wird gerührt, um die Reaktion zu stoppen. Die Absorption bei 550 nm (A_{550 nm}) wird gemessen, um die Absorption A₁ zu erhalten. Das obige Reaktionsgemisch ohne Zusatz von L-Carnitin wird ebenfalls auf gleiche Weise wie oben beschrieben behandelt und dessen Absorption A₀ wird gemessen.
- 3. Berechnung der Enzymaktivität: worin
  21,7: den molaren Absorptionskoeffizienten cm²/µmol
  Z: das Verdünnungsverhältnis
  bedeuten.

Die erfindungsgemäße L-Carnitin-Dehydrogenase mit Ursprung aus Alcaligenes sp. Nr. 981 zeigt bezüglich ihrer Langzeitstabilität in einer wäßrigen Lösung, wie z. B. ein Tris-HCl- Puffer (pH 9,0) bei 5°C, eine Restaktivität von 96% nach einer Woche und 80% nach zwei Wochen. Folglich liegt ein stabiles Enzym vor, das eine Stabilität besitzt, bei der über 70% der Aktivität nach einwöchiger Behandlung mit Tris-HCl-Puffer (pH 9,0) bei unter 5°C im Vergleich mit der obigen Behandlung verbleiben. Das Enzym besitzt auch eine überlegene Stabilität bei Lagerung in wäßriger Lösung im Vergleich mit Enzymen aus bekannten Bakterienstämmen. Daher kann ein stabiles Reagens zur Bestimmung von L-Carnitin hergestellt werden. Ebenso zeigt das erfindungsgemäße Enzym eine geringere Denaturierung während der Isolierungs- und Reinigungsverfahren und daher ist es ganz leicht zu reinigen, was ein vorteilhaftes L-Carnitin-Dehydrogenase-Herstellungsverfahren liefert.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1
(i) Kultivierung von Alcaligenes sp. Nr. 981:
DL-Carnitin-hydrochlorid (Sigma Chem., Co)\|3,0%
KH₂PO₄	0,2%
MgSO₄ · 7 H₂O	0,05%
FeSO₄ · 7 H₂O	0,002%
MnSO₄ · n H₂O	0,001%
pH 7,0

Ein Flüssigmedium (100 ml), umfassend die obige Zusammensetzung, in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben wurde bei 120°C 20 Minuten lang sterilisiert. Eine Öse Alcaligenes sp. Nr. 981 wurde in das Medium inokuliert, und das Medium wurde bei 28°C mit 120 Upm 40 Stunden lang kultiviert, um das Kulturgut (95 ml) zu erhalten (Enzymaktivität: 1,2 U/ml).

(ii) DL-Carnitin-hydrochlorid (Sigma Chem., Co)\|3,0%
Hefeextrakt (Kyokuto Seiyaku Co.)	0,1%
K₂HPO₄	0,054%
KH₂PO₄	0,746%
MgSO₄ · 7 H₂O	0,05%
CaCl₂ · 2 H₂O	0,002%
FeSO₄ · 7 H₂O (pH 7,0)	0,002%
MnSO₄ · n H₂O	0,002%
Disform CB 442 (Nihon Ushi Co.)	1 ml/l
pH 7,0

Das Flüssigmedium (20 ml), umfassend die obige Zusammensetzung, in einem 30 l Topf-Fermenter wurde durch Erhitzen sterilisiert. Das vorkultivierte Kulturgut, das in (i) oben erhalten worden war (90 ml), wurde darin inokuliert, und das Gemisch wurde bei 28°C unter Belüftung mit 20 l/Minute, einem inneren Druck von 0,4 kg/cm² und Rühren mit 200 Upm 27 Stunden lang kultiviert, um das Kulturgut (19 l) zu erhalten. (Enzymaktivität: 3,0 U/ml).

Beispiel 2 Reinigung des Enzyms

Bakterienzellen wurden durch Zentrifugation aus der Kulturbrühe (19 l), die gemäß Beispiel 1 erhalten worden war, gewonnen. Das Kulturgut (ii) wurde in 40 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) suspendiert und mit 0,1% Lysozym und 15 ml EDTA · 2 Na (5 l) gemischt und bei 37°C 1 Stunde lang solubilisiert. Anschließend wurde das Gemisch zentrifugiert, um das Präzipitat zu entfernen, und um die überstehende Lösung (4500 ml) (Aktivität: 10,3 U/ml) zu erhalten. Ammoniumsulfat (1100 g) wurde der überstehenden Lösung zugesetzt. Sie wurde durch Rühren gut gemischt und anschließend zentrifugiert, um das Präzipitat abzutrennen. Ammoniumsulfat (700 g) wurde weiter dem Überstand zugesetzt, um das Präzipitat aufzulösen, und die Lösung wurde zentrifugiert, um ein Präzipitat zu erhalten. Das in 40 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0, 500 ml) (spezifische Aktivität: 84,1 U/ml) aufgelöste Präzipitat wurde gegen 40 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0, 10 l) dialysiert. Die dialysierte Enzymlösung wurde auf eine Säule aus DEAE-Sepharose CL-6B (Pharmacia Co.) (200 ml) gegeben, die mit 40 mM Tris- HCl-Puffer (pH 8,0) gepuffert worden war, mit 40 mM Tris- HCl-Puffer, der 0,1 M KCl (pH 8,0, 1 l) enthielt, gewaschen worden war, und mit 40 mM Tris-HCl-Puffer, der 0,3 M KCl (pH 8,0) enthielt, eluiert, um die Enzymlösung (300 ml) (spezifische Aktivität: 120,5 U/ml) zu erhalten. Die Enzymlösung wurde gegen 40 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0, 10 l) dialysiert. Das Dialysat wurde auf eine Säule aus Hydroxylapatit (KOKEN Co., 100 ml) gegeben, mit 40 mM Tris-HCl- Puffer (pH 8,0, 200 ml) gewaschen, und anschließend mit 2 mM Phosphatpuffer (pH 7,0, 100 ml) eluiert, um die Enzymlösung (100 ml) (spezifische Aktivität: 331 U/ml) zu erhalten.

Die so erhaltene Enzymlösung wurde gegen 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,5, 5 l) dialysiert, um die Enzymlösung (95 ml) (spezifische Aktivität: 331 U/ml, Wiedergewinnung: 67,8%) zu erhalten.

Die gereinigte L-Carnitin-Dehydrogenase enthielt eine Aktivität an NADH-Oxidase von weniger als 0,0001 U/ml.

Claims

1. Stabile L-Carnitin-Dehydrogenase, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Aktivität von mindestens über 70% nach etwa einwöchiger Behandlung mit Tris-HCl-Pufferlösung bei pH 9,0 unter etwa 5°C im Vergleich mit der Aktivität vor der Behandlung beibehält.

2. L-Carnitin-Dehydrogenase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß L-Carnitin-Dehydrogenase ein Enzym ist, das von Carnitin-Dehydrogenase bildenden Mikroorganismen, die zu der Gattung Alcaligenes gehören, gebildet wird.

3. Verfahren zur Herstellung von L-Carnitin-Dehydrogenase, dadurch gekennzeichnet, daß man L-Carnitin-Dehydrogenase bildenden Mikroorganismen, die zur Gattung Alcaligenes gehören, in einem Nährmedium kultiviert, und daß man die so gebildete L-Carnitin-Dehydrogenase aus dem Kulturgut isoliert.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der L-Carnitin-Dehydrogenase bildende Mikroorganismus Alcaligenes sp. Nr. 981 FERM BP-2570 ist.