JPS5914788A - Ｌ−α−グリセロ−ル−３−リン酸オキシダ−ゼの安定化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＬ−α−グリセロール−３−リン酸オキシタ゛
−ゼ（以下ＧＰＯと略称する。箇の安定化法に関するも
のであり、更に詳しくは、〕裏ビンアデニンジヌクレオ
チド（以下ＦＡＤと略称する。）またはキレート剤を、
それぞれ単独に、もしく′は、両者を混合して加え為こ
とにより、ＧＰ□０を安定化する方法に関するものであ
る６″　　　　□ＧＰＯは酵素法による中性脂肪の測定
に使用さ゛れる。゛すなわち、中性脂肪をリボプロティ
ンリパーゼ等により加水分解し、得られるグリセロール
に、ア・デノシン三１」ン酸（ＡＴＰ）とＭｇ２＋イオ
ンどの存在下でグ、リセロールキナーゼを作用させて、
アデノシンニリン酸（ＡＤＰ）とクリセロ−ルー３−リ
ン酸とを得る。このグリセロール−３゜−リン酸にＧＰ
Ｏを作用さすて、発生する過酸化水素を、パーオキシダ
ーゼ−４−アミノアンチピリン錦色系に導き、虫取する
キノン色素を比色定量する仁とにより、中性脂肪を定量
する。これを反応経路）に俤って、示せば、次のとおり
である。

グリセロール＋３脂肪酸 ゛　　　　　　　　　　　　　　グリセロールキナーゼ
グリセロール＋ＡＴＰ−Ｍｇ２＋ グリセロール−６゛−リン酸＋ＡＤＰ−Ｍｇ”Ｈ２Ｏ２
＋ジヒドロキシアセトンリン酸Ｈｗ　（ｈ　＋　４−７
□セノアンチビリン＋フ工ノール等二！が底ヤ７．。

従来法では、たとえば、中性脂肪のアルカリケン化によ
り得たグリセロールを過ヨウ素酸酸化し、生成したホル
ムアルデヒドをクロモトロープ酸またはアセチルアセト
ンに□より呈色させて、比色定量する方法が用いられて
いたが、夾雑物の影響を避けるために溶媒抽出などの予
備処理を必要とし、゛操作が煩雑で、測定に長時間を要
するという欠点を痔っていた。

この欠点は、酵素反応を用いること咳より、一応の解決
を見た。すなわち、酵素による反応は基質特異性が高く
、通常の夾雑物は防害とならないので、試料の精製のよ
う左前処理を必要とせず、迅速な測定が可能である。□
しかし、その反面、使用する酵素が溶液中で極めて不安
定であるという大きが欠点を持っておシミ新しい課題の
解決が求められている。

ＧＰＯも、一般の酵素同様安定性に欠け、自動分析器に
利用した場合、試薬溶液を頻繁に交換する必要が生じて
、試薬の浪費が多く、自動分析器の機能を十分には発揮
できない。

本件発明者らは、か＼る困難を克服するために鋭意検討
した結果、ＦＡＤまたはキレート剤をそりずれ、単独に
、もしくは、両者を混合して添加すれば、ＧＰＯ溶液の
安定性が著しく向上することを見出して、本発明を完成
するに至った。すなわち、本発明は、ＧＰＯを含有する
緩衝液に、ＦＡＤまたは一門謬汰をそれぞれ単独に、ま
たは、両者を混合して添加することを特徴とする、ＧＰ
Ｏの安定化に関するものである。　　　　　　　　　　
。

ＦＡＤがＧ’ＰＯの補酵素であることは、文献（たとえ
ばり、　Ｌ、　Ｋｏｄｉｔｓｃｈｅｃｋ　、　Ｗ　、　
Ｗ　、　Ｕｍｂｒｅｉｔ。

Ｊ、ｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、９８　１０６３（
１９６９））にも記載された公知の事実であるが、ＦＡ
Ｄを加えることにより、ＧＰＯの水溶液が、広い温度域
で長期間安定化することは、予想だにされなかった。さ
らに、キレート剤の添加がＧＰＯの安定化に効果がある
ことは、全く予知されなかったことである。

本発明の方法を自動分析装置に適用すれば、長期間にわ
たって、酵素を連続使用することが可能になり、能率お
よび費用の面で大きな改善が期待できる。

本発明は１．いかなる起源のＧＰＯにも適用できる。ま
た、本発明に使用するＦＡＤも、いかなる起源のもので
あってもよい◎ 本発明に使用するキレート剤け、いか彦る種類のもの″
であってもよいが、たとえば、エチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ）、エチレングリコールエーテルジアミン四
酢酸（ＥＧＴＡ）等が挙げられる。

本発明に用いる緩衝液の好ましいｐＨ′範゛囲゛は５、
Ｏｖ９．０である。・また、ＦＡＤの濃度は９．０１〜
５０ｍＭ／１１好ましくは０．０５〜５　ｍＭ／ｌ−。

キレート剤の濃度は０．１〜２００　ｍＭ／を好ましく
　１１０．５〜１０　ｍＭ／ｌである。

なシ、本発明で使用するＧＰＯの酵素活性は、たとえば
、以下に述べる方法で測定することができる。

バーオキシダ１−ゼ０．，５８　ｕ　／　ｄ　、　４．
−ア、ミノアンチピリン０．２５　ｍＭ　、　フェノー
ル２５ｍＭおよび酢酸マグネシウム１．５ｍＭを含ｔｒ
ｐＨ７，５ノ０．１Ｍ／ｌ）リス塩酸緩衝液０．５ｄＫ
検体３ＣＶｐｔを添加混合し、３７℃で１〜２分間予備
加温（プレインキューベー、′ヨン）スル。ついで、８
０ｍＭ／ｌグリセロールー３−リン酸溶液１００ｐｔを
添加し、３７℃で１〜３分間反応させる。生成するキノ
ン色素による５００ｔｍの吸光度の増加速度を測定ずぶ
ととＫｊって、酵素活性を求める。

次に１本発明番−施例忙より具体的に説明する。

実施例１ ０．１Ｍ／ｌヘベス緩衝液（１）Ｈ５，０〜９．０　）
に、ア亡ロコッカス・ビリデ７７　（Ａｅｒｏｃｏｃｃ
ｕｓ　Ｖｉｒｉ　−ｄａｎｓ　）　　由来のＧ　Ｐ　Ｑ
　’ｋ　２〜３　ｕ　／−の濃度になるように加え、こ
れにＦＡＤ　（最終濃度０．１　ｍＭ／１）を単独に、
また畔、ＥＤＴＡ　（最終濃度２１ ｍＭ／ｌ）と混合して添加し、試験溶液を調製する。そ
の溶液を２７℃、！７日間保存し、残存活性を測定した
。結果を第１．表に示す。

実施例、２　　　　　、　。

０．１Ｍ／ｌヘペス緩衝液（ｐＨ５，０〜９．０　）に
、アエロコツカスｅビリダｙス（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ
　Ｖｉｒｉ−ｄａｎｓ　）由来のＧＰＯを２〜３ｕ／−
の濃度になるように加え、これに、ＦＡＤ（最終濃度０
．１　ｍＭ／ｌ）およびＥＤＴＡ　（最終濃３２　ｍ　
Ｍ　／　Ｌ　）をそれぞれ単独に、または、両者を混合
して添加し、試験溶液を調製する。その溶液を２７℃で
６日間保存し、残存活性を測定した。結果を第２表に示
す。

（以下余白） 第１表 ＊試験液組成ｌは０．１Ｍ／ｌヘペス緩衝液のみ■はＦ
ＡＤを単独に加えたもの ■はＦＡＤおよびＥＤＴＡを加えたものｐＨ５，０およ
びｐＨ９，０では、ヘペスの緩衝作用が弱いのでｐＨ値
はや＼不安定である。

第２表 ＊試験液組成１ｊｏ、ＩＭ／ｌヘベス緩衝液のみ■はＦ
ＡＤを単独に加えたもの ■はＥＤＴＡを単独に加えたもの ｍＶ　ｌｌ１ＦＡＤおよびＥＤＴＡを加えたものｐＨ５
，０およびｐＨ９，０ではヘペスの緩衝作用が弱いので
ｐＨ値はや＼不安定である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. Ｌ−α−りＩＪセロ−ルー３−リン酸オキシダーゼを含
   有する緩衝液にフラビンアデニンジヌクレオチドまたは
   キレート剤をそれぞれ単独（、もしくは、両者を、混合
   して加えることを特徴とする、Ｌ−α−クリセロ−ルー
   ３−リン酸オキシター、ゼ、の安定化法。