DE3889577T2

DE3889577T2 - Monoglycerid-Lipase, ihre Herstellungsverfahren und analytische Methode zu ihrer Verwendung.

Info

Publication number: DE3889577T2
Application number: DE3889577T
Authority: DE
Inventors: Shigeyuki Imamura; Kazuo Matsuura Kazuo Matsuura; Hideo Misaki; Mamoru Takahashi
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1987-04-01
Filing date: 1988-03-29
Publication date: 1995-01-05
Anticipated expiration: 2008-03-30
Also published as: DE3889577D1; JPS63245672A; EP0285101A1; US5079158A; EP0285101B1; KR960015263B1; KR880012754A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1) Gebiet der Erfindung:

Diese Erfindung bezieht sich auf eine neue Monoglycerid-Lipase, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ein analytisches Verfahren, bei den die neue Monoglycerid-Lipase eingesetzt wird, sowie ein analytisches Verfahren der enzymatischen Aktivität von Pankreas-Lipase.

2) Beschreibung des Standes der Technik:

Die Monoglycerid-Lipase, deren Existenz bisher in einen weiten Bereich von Organismen, von Mikroorganismen bis zu höheren Tieren, bekannt war, wirkt bekanntermaßen nicht nur auf Monoglycerid, sondern auch auf Diglycerid und Triglycerid ["KOSO HANDBOOK (Enzyme Handbook)", Seite 424, veröffentlicht am 1. Dezember 1982 durch "The Asakura Shoten K.K."]. Als eine andere Monoglycerid-Lipase ist die bekannt, die aus gewissen Mikroorganismenstämmen von Staphylococcus gewonnen wird (JP-OS 42 532/1980). Dieses Enzym wirkt, als Substrat-Spezifität, zusätzlich zu Monoglycerid auch auf Triglycerid, und es hat die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften: Sein optimaler pH ist 11. Der optimale Temperaturbereich für eine hohe Aktivität ist der von 37 bis 50ºC, wobei die Aktivitätsspitze um 37 bis 40ºC herum angeordnet ist, wenn "Ediol" (Handelsname, Kokosnußöl-Emulsion) als ein Substrat benutzt wird. Sein isoelektrischer Punkt ist 2,56, sein Molekulargewicht etwa 174.000. Weiter wird es rasch bei 55ºC und darüber aktiviert, und seine Inaktivierung bei 70ºC findet in 10 Minuten statt. Bekannte analytische Verfahren für die Aktivität der Lipase schließen ein Verfahren zur Trübungsmessung unter Verwendung von Triolein-Emulsion, das kolorimetrische Verfahren unter Einsatz eines synthetischen Substrates (JP-OS 254197/1986), das Titrationsverfahren, bei dem freigesetzte Fettsäure titriert wird, das enzymatische Meßverfahren einer unter Einsatz von 1,2-Diglycerid gebildeten Fettsäure, ein natürliches Substrat, in Form eines synthetischen Substrates (JP-OS 888/1983 und 91898/1984) usw.
Da konventionelle Monoglycerid-Lipasen nicht nur auf Monoglycerid, sondern, wie oben erwähnt, auch auf Diglycerid und Triglycerid wirken, können sie zum Beispiel nicht für ein Verfahren zum Messen nur von Monoglycerid eingesetzt werden, das aus einem synthetisierten Substrat bei dem Meßverfahren der Aktivität der Lipase freigesetzt wird. Auch die Monoglycerid-Lipase aus den Mikroorganismus-Stämmen von Staphylococcus kann, weil sie auch auf Triglycerid wirkt, ihr Molekulargewicht und ihr optimaler pH hoch sind, und sie in der Hitze instabil ist, nicht dafür benutzt werden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Mit den vorgenannten Problemen im Blick, haben die vorliegenden Erfinder eine ausgedehnte Untersuchung ausgeführt. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß ein Mikroorganismus-Stamm von Bacillus, H-165, isoliert aus dem Boden nahe der heißen Mineralquelle von Kirishima, Kagoshima-ken, Japan, eine neue Monoglycerid-Lipase, wie sie im Anspruch 1 definiert ist (die im folgenden als "die Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung" bezeichnet werden kann) erzeugt, die in der Lage ist, eine enzymatische Reaktion der folgenden Gleichung (a) zu katalysieren und als Substrat-Spezifität in der Lage ist, auf Monoglycerid zu wirken, nicht aber auf Diglycerid und Triglycerid:
(a) Monoglycerid + H&sub2;O → Glycerin + Fettsäure.
Es wurde auch als Ergebnis der Reinigung des Enzyms festgestellt, daß die durch Bacillus stearothermophilus H-165 erzeugte Monoglycerid-Lipase ausgezeichnete und absolut neue enzymatische Wirkungen zeigt, indem sie nur auf Monoglycerid, nicht aber auf Diglycerid und Triglycerid, als Substrat-Spezifität wirkt. Es wurde auch festgestellt, daß die Monoglycerid-Lipase ein hitzebeständiges Enzym ist, dessen optimaler pH um 5 herum liegt, und das bei einer optimalen Temperatur von 75ºC die maximale Aktivität zeigt, es hat einen isolelektrischen Punkt von 4,6 und ein Molekulargewicht von nur 27.000, es wird bei 70ºC nicht zu einem beträchtlichen Maße inaktiviert, und es weist selbst nach einer Behandlung bei 90ºC noch immer 20% seiner Aktivität auf. Die Monoglycerid-Lipase erwies sich daher als ein Enzym, das neu ist und brauchbar bei dem Verfahren zur Messung von Monoglycerid.
Die vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage der obigen Feststellungen gemacht. Diese Erfindung bezieht sich daher auf eine neue Monoglycerid-Lipase, die zumindest in der Lage ist, eine enzymatische Reaktion der folgenden Gleichung (a) zu katalysieren und die als Substrat-Spezifität in der Lage ist, auf Monoglycerid, nicht aber auf Diglycerid und Triglycerid, zu wirken; sie betrifft weiter ein Verfahren zur Herstellung einer neuen Monoglycerid-Lipase, umfassend das Züchten eines Monoglycerid-Lipase erzeugenden Mikroorganismus von Bacillus in einem Medium, die zumindest in der Lage ist, eine enzymatische Reaktion der folgenden Gleichung (a) zu katalysieren und als Substrat-Spezifität in der Lage ist, auf Monoglycerid, nicht aber auf Diglycerid und Triglycerid, zu wirken, und dann Gewinnen der Monoglycerid-Lipase aus der resultierenden Kultur; weiter betrifft sie ein analytisches Verfahren für eine Monoglycerid enthaltende Probenlösung, umfassend das Einwirken einer Monoglycerid-Lipase, die zumindest in der Lage ist, eine enzymatische Reaktion der folgenden Gleichung (a) zu katalysieren, und als Substrat-Spezifität in der Lage ist auf Monoglycerid, nicht aber auf Diglycerid und Triglycerid, zu wirken, auf Monoglycerid bei der Messung von Monoglycerid in der Probenlösung und dann entweder Messen eines von Glycerin und Fettsäure, die bei der Umsetzung gebildet wurden, und sie betrifft ein Meßverfahren für die Aktivität von Pankreas- Lipase in einer Probenlösung, umfassend die Einwirkung
der Pankreas-Lipase der Probenlösung auf ein Reagenz, das mindestens 1,2-Diglycerid enthält, um Monoglycerid freizusetzen, indem man eine Monoglycerid-Lipase, die zumindest in der Lage ist, eine enzymatische Reaktion der folgenden Gleichung (a) zu katalysieren, und als Substrat- Spezifität in der Lage ist, auf Monoglycerid, nicht aber auf Diglycerid und Triglycerid zu wirken, auf das so freigesetzte Monoglycerid wirken zu lassen und dann Messen eines von Glycerin und Fettsäure, die als Komponenten des Monoglycerids in der vorhergehenden Reaktion gebildet wurden.
(a) Monoglycerid + H&sub2;O → Glycerin + Fettsäure.
Aufgrund ihrer Substrat-Spezifität wirkt die Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung nur auf Monoglycerid. Ihr Molekulargewicht beträgt 27.000 ± 2.700 und ihr optimaler pH 5. Sie zeigt eine maximale Aktivität bei der optimalen Temperatur von 75ºC. Sie ist stabil bei pH 7 bis 8. Ihr isoelektrischer Punkt ist pH 4,6 ± 0,4. Sie ist bis zu 70ºC thermisch stabil. Sie ist daher brauchbar für verschiedene Analysen, zum Beispiel die Analyse von Monoglycerid, das in einem Getränk, Nahrungsmittel, einer Körperflüssigkeit oder ähnlichem enthalten ist, und für die Messung der Aktivität von Pankreas-Lipase, die in einer Körperflüssigkeit, einem Serum oder ähnlichem enthalten ist.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG

Die obigen und andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen in Verbindung mit der dazugehörigen Zeichnung deutlich, in der zeigen:
Fig. 1 eine Kurve des optimalen pH der Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung;
Fig. 2 eine Kurve der optimalen Temperatur des gleichen Enzyms;
Fig. 3 eine Kurve der pH-Stabilität des gleichen Enzyms;
Fig. 4 eine Kurve der thermischen Stabilität des gleichen Enzyms;
Fig. 5 ein Elutionsprofil des gleichen Enzyms bei der Reinigungsstufe und
Fig. 6 eine Kalibrierungskurve für Monoglycerid.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltene neue Monoglycerid-Lipase hat die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften:
(1) Wirkungen:
Monoglycerid + H&sub2;O → Glycerin + Fettsäure.
(Monoglycerid kann entweder α-Monoglycerid oder β-Monoglycerid sein).
(2) Molekulargewicht: 27.000 ± 2.700 [Gemessen unter Verwendung einer Säule von Polyvinylgel "TSK3000SW" (Handelsname, Produkt von Toyo Soda Mfg., Co., Ltd.) und einem 50 mm Phosphatpuffer (pH 6,5) enthaltend 0,2 M NaCl als eine mobile Phase].
(3) Optimaler pH: Ein im folgenden zu beschreibendes Meßverfahren der enzymatischen Aktivität wurde ausgeführt. Monolaurin und das Enzym wurden 10 Minuten miteinander umgesetzt, indem man separat einen Dimethylglutarat-Puffer (pH 4 bis 7; - - in Fig. 1) und einen Tris-HCl-Puffer (pH 7 bis 9,5; -Δ- in Fig. 1) als Puffer benutzte. Die Reaktionsmischung wurde danach 2 Minuten gekocht, um das Enzym zu inaktivieren, wodurch die Umsetzung beendet wurde. Die Reaktionsmischung wurde dann bei 37ºC inkubiert, gefolgt von einer enzymatischen Messung der Menge des gebildeten Glycerins. Die Ergebnisse sind in Figur gezeigt. Der optimale pH lag um 5 herum.
(4) Optimale Temperatur: Unter Verwendung eines PIPES- NaOH-Puffers (pH 7,3) wurden bei den in Fig. 2 gezeigten einzelnen Temperaturen separat Umsetzungen ausgeführt. Die Reaktionsmischungen wurden nach ihren entsprechenden Umsetzungen separat zum Sieden erhitzt. Unter Anwendung des unten beschriebenen Meßverfahrens wurden die Mengen des gebildeten Glycerins separat gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt. Die maximale Aktivität ergab sich bei 75ºC.
(5) pH-Stabilität: Lösungen (1,0 U/ml) des vorliegenden Enzyms wurden separat mit einem 10 mM Dimethylglutarsäure-NaOH-Puffer (pH 4 bis 7; - - in Fig. 3), einem Tris- HCI-Puffer (pH 8 bis 9; - - in Fig. 3) und einem Glycin- NaOH-Puffer (pH 9 bis 10; -Δ- in Fig. 3) zubereitet. Nach dem Behandeln der einzelnen Lösungen 10 Minuten bei 75ºC wurde ihre Restaktivität gemäß dem unten beschriebenen Meßverfahren der enzymatischen Aktivität gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt. Die enzymatische Aktivität blieb in einem pH-Bereich von 7 bis 8 stabil.
(6) Thermische Stabilität: Eine Lösung (1,0 U/ml) des vorliegenden Enzyms wurde mit einem 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) zubereitet. Nach der Wärmebehandlung von Teilen der Lösung für 10 Minuten bei den einzelnen in Fig. 4 gezeigten Temperaturen wurde die Restaktivität gemäß dem unten beschriebenen Meßverfahren der enzymatischen Aktivität gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt. Die enzymatische Aktivität blieb bis zu 70ºC stabil.
(7) Isoelektrischer Punkt: pH 4,6 +(7) Isoelektrischer Punkt: pH 4,6 ± 0,4. Nach dem Zuführen eines Stromes bei einer konstanten Spannung von 700 V bei 4ºC für 40 h bei der isoelektrischen Fokussierungs-Elektrophorese unter Einsatz eines Ampholyten als einem Träger, wurde die enzymatische Aktivität jeder Fraktion gemessen.
(8) Substrat-Spezifität: Die Substrat-Spezifität der Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung wurde unter Bedingungen untersucht, die auf das unten beschriebene Meßverfahren der enzymatischen Aktivität für die Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung folgen. Als ein Ergebnis ergab sich, wie in Tabelle 1 zusammengefaßt, die maximale Aktivität gegenüber α-Monolaurin. Wurden Diglycerid aus Eigelb-Lecithin, 1,2-Dilinolein, 1,3-Dilinolein und Triolein als Substrate benutzt, dann wurde in Anwesenheit der Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung kein aus diesen Substraten hydrolysiertes Glycerin festgestellt. Es wurde daher davon ausgegangen, daß die Monoglycerid-Lipase der vorliegenden Erfindung nicht auf Diglycerid und Triglycerid als Substrate wirkt.
Es folgt eine Beschreibung der Wirkung der Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung auf β-Monoglycerid als einer Substrat-Spezifität.
1) Bestätigung einer Fettsäure, die aus α-Linoleyl-β-oleyl-diglycerid als einem Substrat freigesetzt ist, durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC):
i) aus Pankreas gewonnene Lipase (50 ul) wurde zu 1,0 ml einer Reaktionslösung hinzugegeben, die eine Zusammensetzung aus 0,5 mg von α-Linoleyl-β-oleyl-diglycerid, 1,8 mg eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels ("Triton X-100", Handelsname, Produkt der Sigma Chemical Company), 3,8 mg Desoxycholsäure, 20 U Colipase, 0,15 mg Calciumchlorid und 200 W von 0,1 M N-Tri(hydroxymethyl) methyl-3-aminopropansulfonsäure (TAPS) -NaOH (pH 8,3) hatte. Nach zehnminütigem Umsetzen bei 37ºC wurde die Reaktion beendet. Ein Teil der Reaktionsmischung von 15 ul wurde auf eine Säule aufgebracht und dann durch HPLC unter den folgenden Bedingungen analysiert:
Säule: "Zorbox ODS" (Handelsname, 4,6 mm Φ·25 cm)
Lösungsmittel: Acetonitril: H&sub2;O (96 : 4)
Nachweis: UV-Absorption bei 205 nm
Strömungsrate: 1,2 ml/min.
Als Ergebnis wurde Linolsäure bei einer Verweilzeit von 23 Minuten nachgewiesen, doch wurde keine Ölsäure nachgewiesen. In Anbetracht des Nachweises der an der α-Position, die gleich der 1-Position ist, gebundenen Linolsäure erwies sich die Pankreas-Lipase als wirksam auf die α-Position von α,β-Diglycerid, die die gleiche wie die 1,2-Position ist, als einem Substrat, und sie hydrolysierte diese Position. Die Bildung von β-Oleyl-monoglycerid wurde auch festgestellt.
ii) Die Monoglycerid-Lipase (0,5 U) wurde zu einer Reaktionslösung der gleichen Zusammensetzung hinzugegeben, wie sie oben eingesetzt wurde. Eine in im wesentlichen der gleichen Weise freigesetzte Fettsäure wurde durch HPLC nachgewiesen. Als ein Ergebnis wurden Linolsäure und Ölsäure bei den Verweilzeiten von 23 Minuten bzw. 31 Minuten bestätigt. Damit wurde festgestellt, daß die Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung auf das Substrat, nämlich β-Monoglycerid, gleich der 2-Position, die durch Pankreas-Lipase aus α,β-Diglycerid gebildet wurde, wirkt und die an der β-Position gebundene Linolsäure freisetzt. Folglich wurde aus α,β-Diglycerid freigesetztes Glycerin nachgewiesen.
2) Substrat-Spezifität der Monoglycerid-Lipase bei Verwendung eines α,β-Diglycerids als einem Substrat:
i) Die unten beschriebenen α,β-Diglyceride wurden separat als Substrate benutzt. Ihre α-Positionen wurden unter Anwendung von Pankreas-Lipase hydrolysiert, und die Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung ließ man auf die so gebildeten β-Monoglyceride einwirken. Danach wurde das so freigesetzte Glycerin analysiert. Als ein Ergebnis wurde Glycerin bezüglich aller Substrate nachgewiesen, nämlich α-Oleyl-β-palmitoyldiglycerid, α-Palmitoyl-βoleyldiglycerid und α,β-Dilinoleyl-glycerid.
Glycerin wurde nicht nachgewiesen, wenn allein Pankreas-Lipase benutzt wurde.
(9) Wirkung von oberflächenaktiven Mitteln und Metallionen:
Wurden oberflächenaktive Mittel, wie "Triton X-100" (Handelsname) und Cholsäure hinzugegeben, dann wurde die Hemmung der Aktivität in einem Bereich hoher Konzentration beobachtet. Die Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung wird nicht durch die Zugabe von Ionen zweiwertiger Metalle, wie Ca&spplus;&spplus; und Mg&spplus;&spplus;, beeinflußt.

Tabelle 1

Substrat-Spezifität der Monoglycerid-Lipase

Substrat Aktivität der Lipase (%)
α-Monoglycerid:
Monoacetin 10,
Monobutyrin 47,
Monocaprin 89,1
Monolaurin 100,0
Monomyristin 85,7
Monopalmitin 39,5
Monoolein 56,3
β-Monoglycerid:
Monoolein 75,6
Diglyceride:
Gewonnen aus Eilecithin* 0
1,2-Dilinolein 0
1,3-Dilinolein 0
Triglyceride:
Triolein 0
* Herstellungsverfahren: Man ließ Phosphorlipase C auf gereinigtes Eilecithin einwirken. Mit Chloroform-Methanol extrahierte Fraktionen wurden benutzt. Tabelle 2 Wirkungen von oberflächenaktiven Mitteln und Metallionen auf die Monoglycerid-Lipase Reagenz Konzentration Aktivität der Lipase (%) Keines Triton X-100 Triton X-100 Cholsäure Cholsäure CaCl&sub2; MgCl&sub2; EDTA
Verfahren zum Messen der enzymatischen Aktivität
0,2 M PIPES-NaOH-Puffer (pH 7,3) 0,1 ml
0,3% 4-Aminoantipyrin 0,05 ml
0,2% TOOS** 0,05 ml
(45 U/ml) Peroxidase 0,05 ml
20 mM MgCl&sub2; 0,025 ml
20 mM ATP 0,025 ml
(25 U/ml) Glycerin-Kinase 0,01 ml
(1000 U/ml) Glycerophosphorsäure-Oxidase 0,015 ml
Gereinigtes Wasser 0,075 ml
* TOOS: N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-metatoluidin
Zu 0,4 ml einer Reaktionslösung der obigen Zusammensetzung wurden 50 ul von 10 mM Monolaurin (0,5%-ige wässerige Lösung von "Triton X-100") hinzugegeben. Die resultierende Mischung wurde für 2 bis 3 Minuten auf 37ºC erhitzt, und dann wurden 50 ul einer Enzymlösung hinzugegeben, um eine Umsetzung einzuleiten. Genau 10 Minuten nat) hinzugegeben, um die Umsetzung zu beenden. Die Extinktion wurde bei einer Wellenlänge von 550 nm gemessen. Hinsichtlich der enzymatischen Aktivität wurde die Aktivität als eine Einheit (1 U) definiert, die in der Lage war, ein umol Glycerin pro Minute zu erzeugen. Die folgende Gleichung wurde benutzt bei der Errechnung der enzymatischen Aktivität (Potenz) nach diesem Verfahren zum Messen der enzymatischen Aktivität:
Enzymatische Aktivität (U/ml) = ΔA 550·2,95/18,0·1.000/50·1/10
ΔA 550: Extinktion bei der Wellenlänge von 500 nm
2,95: Gesamtvolumen der Reaktionsmischung (ml)
18,0: Millimolare Extinktionskoeffizient von Wasserstoffperoxid (cm²/umol)
50: Volumen der eingesetzten Enzymlösung (ul)
10: Reaktionszeit (min).
Bacillus stearothermophilus H-165-Stamm, ein Beispiel der Mikroorganismen, die zur Erzeugung der Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung in der Lage sind, hat die folgenden mykologischen Eigenschaften:
A. Visuelle Beobachtung:
Es wurden die folgenden Ergebnisse beim Züchten bei 50 bis 55ºC für 18 bis 44 Stunden erhalten.
(1) Geneigte Nähragarkultur:
Zeigt eine grauweiße Farbe mit einem gelben Farbton. Wächst in Form von Linien. Das Wachstum ist gut, und es wird kein lösliches Pigment erzeugt.
(2) Flache Nähragarkultur:
Zeigt eine graue Farbe mit einem gelben Farbton. Es wird eine flache kreisförmige Kolonie gebildet, aber kein lösliches Pigment erzeugt.
(3) Flüssiges Medium:
Es wird ein gutes Wachstum beobachtet. Das Medium wird gleichmäßig trüb.
(4) BCP-Milchmedium:
Das Medium bleibt unverändert.
B. Morphologische Eigenschaften:
(1) Gestalt und Anordnung:
Der Stamm ist ein zylindrischer Bacillus, der entweder gerade oder an einem oder beiden Enden leicht gebogen ist. Die Zellen sind entweder diskret oder jeweils zu zweien miteinander verbunden. Kurze Ketten können gelegentlich gebildet werden.
(2) Größe:
0,6 bis 0,8·2,5 bis 4,0 um.
(3) Beweglichkeit:
Keine.
(4) Spore:
Eine Spore in Form eines Eies oder eines langgestreckten Kreises wird an einem zentralen Teil jeder Zelle oder an einer Stelle nahe der Kontur jeder Zelle gefunden. Ihre Größe ist 0,8 bis 1,2·1,5 bis 2,0 um. Die Zelle dehnt sich durch die Spore aus.
(5) Polymorphismus:
Keiner.
C. Physiologische und biochemische Eigenschaften:
Gramfärbung +
KOH-Reaktion -
Säure-Schnellfärbung -
Kapselbildung -
OF-Test (Hugh-Leifson-Medium) Keine Änderungen
OF-Test (modifiziertes Medium***) 0 (oxidiert)
Wachstum unter anaeroben Bedingungen -
Wachstumstemperatur:
60ºC +
50ºC +
47ºC +
Wachstums-pH:
8,6 -
7,7 +
5,6 +
4,4 -
Salzbeständigkeit:
0% +
3% +
Salzbeständigkeit 5% -
Hydrolyse von Gelatine -
Hydrolyse von Stärke +
Hydrolyse von Casein -
Hydrolyse von Aesculin +
Hydrolyse von Cellulose -
Hydrolyse von Arginin +
Produktion von Catalase +
Produktion von Oxidase +
Produktion von Urease (SSR-Medium) -
Produktion von Urease (Chris-Medium) +
Produktion von Indol -
Produktion von Schwefelwasserstoff -
Produktion von Acetoin -
MR-Test -
Reduktion von Nitraten +
Denitrifizierung -
*** Medium-Zusammensetzung
(NH&sub4;)&sub2;HPO&sub4; 1,0 g
MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,2 g
Glucose 10,0 g
BTB (0,2%-ige wässerige Lösung) 10,0 g
KCl 0,2 g
Hefeextrakt 1,0 g
Agar 3,0 g
Destilliertes Wasser 1000,0 ml
(pH 7,0)
Assimilationstest (Simons-Medium):
Zitronensäuresalze -
Maleinsäuresalze -
Apfelsäuresalze +
Gluconsäuresalze +
Propionsäuresalze -
Malonsäuresalze -
Bersteinsäuresalze +
Assimilationstest (Christensen-Medium)
Zitronensäuresalze +
Maleinsäuresalze -
Apfelsäuresalze +
Gluconsäuresalze +
Propionsäuresalze +
Malonsäuresalze -
Bersteinsäuresalze +
Erzeugung von Gas aus Glucose -
Erzeugung von Säuren aus Zuckern [(NH&sub4;)&sub2;HPO&sub4; wurde als eine N-Quelle benutzt]
Adonit -
L(+)-Arabinose -
Cellobiose +
Dulcit -
Mesoerythrit -
Fructose +
Galactose -
Glucose +
Glycerin +
Inosit -
Inulin -
Lactose -
Maltose +
Mannit +
Mannose -
Melezitose +
Melibiose +
Raffinose +
L(+)-Rhamnose -
D-Ribose +
Salicin +
Sorbit -
Sorbose -
Stärke +
Saccharose +
Trehalose +
Xylose +
Aufgrund der oben beschriebenen mykologischen Eigenschaften kann der Stamm H-165 als ein thermophiles aerobes Bakterium beschrieben werden, das ein nicht beweglicher, zylindrischer Bacillus mit einer geraden Gestalt oder leicht gebogenem Ende oder Enden, grampositiv ist, eine Größe von 0,6 bis 0,8·2,5 bis 4,0 um hat, eine Spore bildet und durch die Spore einer Zellausdehnung unterliegt, Glucose oxidativ zersetzt und eine Säure bildet und in der Katalase- und Oxidase-Produktivität positiv ist. Der solche Eigenschaften aufweisende Stamm wird als in die Familie von Bacillus fallend angesehen, weil es ein sporenbildendes, grampositives, aerobes und stabförmiges Bakterium ist. Als andere Mikroorganismen-Stämme, die die gleichen Eigenschaften wie der obige Stamm mit Bezug auf die Acetoin-Produktivität, Indol-Produktivität, Gas-Produktivität aus Glucose und die Fähigkeit, unter anaeroben Bedingungen zu wachsen haben, können erwähnt werden (A) Bacillus stearothermophilus, (B) Bacillus alcalophilus, (C) Bacillus badius und (D) Bacillus firmus. Die mykologischen Eigenschaften dieser Bakterienarten und die des Stammes dieser Erfindung können folgendermaßen verglichen werden [+: positiv, -: negativ, d: in Abhängigkeit von den Stämmen verschieden, ND: keine verfügbaren Daten]. Stamm dieser Erfindung Gram-Färbung Zellausdehnung durch Spore Anaerobes Wachstum Katalase-Produktion Gelatine-Hydrolyse Stärke-Hydrolyse Casein-Hydrolyse Indol-Produktion Acetoin-Produktion Reduktion von Nitraten Assimilation von Zitronensäuresalzen Produktion von Gas aus Glucose Stamm dieser Erfindung Produktion von Säure aus L-Arabinose Produktion von Säure aus D-Glucose Produktion von Säure aus Mannit Produktion von Säure aus D-Xylose Wachstum bei 60ºC
Aus dem obigen Vergleich ergibt sich, daß die Eigenschaften des Stammes dieser Erfindung sehr gut mit denen von Bacillus stearothermophilus übereinstimmen, ausgenommen hinsichtlich der Gelatine-Abbaubarkeit. Der Stamm dieser Erfindung wurde daher als zu Bacillus stearothermophilus gehörend identifiziert, als Bacillus stearothermophilus H-165 bezeichnet und unter FERM BP-1673 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministerium für Internationalen Handel und Industrie, Regierung von Japan, hinterlegt.
Der oben beschriebene Bacillus stearothermophilus H-165 ist lediglich ein Beispiel der Monoglycerid-Lipase erzeugenden Mikroorganismen von Bacillus, die bei der Ausführung dieser Erfindung brauchbar sind. Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die Verwendung dieses speziellen Stammes beschränkt, und Mikroorganismen, die zur Produktion der Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung in der Lage sind, können alle in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
Zur Produktion der Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung kann ein Mikroorganismus, der zur Erzeugung der Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung in der Lage ist, nach einem Verfahren gezüchtet werden, das routinemäßig bei der Erzeugung von Antibiotika, Enzymen und ähnlichen benutzt wird. Die Art der Kultur kann entweder eine Flüssigkeits-Kultur oder eine Feststoff-Kultur sein. Für industrielle Anwendung ist es erwünscht, Zellen eines Monoglycerid-Lipase erzeugenden Mikroorganismus in eIn Produktionsmedium zu impfen und dann die Zellen einer Submerszüchtung unter Belüftung und Rühren zu unterwerfen.
Als Nährstoffquellen für das Medium können verschiedene Nährstoffquellen benutzt werden, die im allgemeinen für das Züchten von Mikroorganismen eingesetzt werden. Als eine Kohlenstoffquelle kann irgendeine Kohlenstoff-Verbindung eingesetzt werden, solange sie assimilierbar ist. Es ist daher möglich, zum Beispiel Kohlenhydrate, wie Glucose, Saccharose, Lactose, Galactose, Maltose, Mannit, Sorbit, Dextrin und Stärke, verschiedene organische Säuren, Pflanzenöle, wie Sojabohnenöl und Olivenöl, tierische Öle und Fette, wie Speck- bzw. Schmalzöl, Geflügelöl usw. zu benutzen. Als eine Stickstoffquelle kann irgendeine Stickstoffverbindung benutzt werden, solange sie assimilierbar ist. Zum Beispiel können Pepton, pulverisierter Hefeextrakt, Fleischextrakt, Sojabohnenmehl, Casein, entfettetes Baumwollsamenmehl und ähnliches benutzt werden. Zusätzlich können ein oder mehrere verschiedene Salze, wie Phosphate, Magnesiumsalze, Calciumsalze, Kaliumsalze, Natriumsalze, Zinksalze, Eisensalze, Mangansalze und Halogensalze, Mais-Einweichflüssigkeit, verschiedene Vitamine und ähnliche, wie erforderlich, ebenfalls benutzt werden. Die Züchtungstemperatur kann geeigneterweise innerhalb eines Temperaturbereiches variiert werden, in dem ein Mikroorganismus, der zur Produktion der Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung in der Lage ist, wachsen kann und das Enzym dieser Erfindung erzeugt. Die bevorzugte Züchtungstemperatur kann jedoch von 40 bis 65ºC, besonders von 45 bis 50ºC, betragen. Obwohl die Züchtungszeit in Abhängigkeit von den Züchtungsbedingungen variiert, ist es lediglich erforderlich, das Züchten an einem geeigneten Zeitpunkt zu beenden, indem man beobachtet, wann das Enzym dieser Erfindung die maximale Potenz erreicht. Die bevorzugte Züchtungszeit kann 10 bis 22 Stunden betragen.
Die Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung wird dann aus der so erhaltenen Kultur des die Monoglycerid- Lipase erzeugenden Mikroorganismus gewonnen. Da das Enzym dieser Erfindung in den Zellen enthalten ist, werden die Zellen durch ein solches Verfahren, wie Filtrieren oder Zentrifugieren, aus der Kulturbrühe gewonnen. Die Zellen werden dann durch Auswahl und Kombination verschiedener Zellen zerstörender Verfahren, wie mechanischer Zerstörungsverfahren, zum Beispiel Ultraschall, Behandeln mit einer French-Presse und Bearbeiten durch Glasperlen sowie enzymatische Zerstörungsverfahren, zum Beispiel Lysozym- Behandlung, zerstört, wobei eine rohe Lösung erhalten wird, die die Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung enthält. Ein oberflächenaktives Mittel, wie "Triton X-100" (Handelsname), kann nach Bedarf ebenfalls hinzugegeben werden.
Die Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung kann dann in gereinigter Form aus der rohen Lösung unter Anwendung eines bekannten Isolations- und Reinigungsverfahrens für Proteine, Enzyme und ähnliche, gewonnen werden. Das Enzym dieser Erfindung kann zum Beispiel gewonnen werden durch fraktionierte Ausfällung oder durch Salz- Fraktionierung. Das erstere Verfahren umfaßt die Zugabe eines organischen Lösungsmittels, wie Aceton, Methanol, Ethanol oder Isopropanol, zu der rohen Enzymlösung, enthaltend die Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung, wahrend das letztere Verfahren die Zugabe von Ammoniumsulfat, Natriumchlorid, Natriumsulfat oder ähnlichem, zu der rohen Enzymlösung umfaßt. Die resultierende Ausfällung kann dann nach einem oder mehreren verschiedenen chromatographischen Verfahren, wie Molekularsieb-Chromatographie, und weiter durch Elektrophorese, Ultrazentrifugieren oder ähnliche, gereinigt werden, bis ein einzelner Peak angezeigt wird. Für diese Reinigungsverfahren ist es erforderlich, Reinigungsverfahren auszuwählen, die die Eigenschaften der Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung nutzen. So wird zum Beispiel nach dem Auflösen des obigen Niederschlages in Wasser oder einem Puffer und, falls erforderlich, Dialysieren der resultierenden Lösung durch eine semipermeable Membran, die Lösung oder das Dialysat einer Ionenaustausch-Chromatographie an einem Anionenaustauscherharz unterworfen, wie DEAE-Cellulose, DEAE- "Sephacel" (Handelsname), DEAE-"Sepharose" (Handelsname), DEAE-"Sephadex A-50" (Handelsname) oder DEAE-"Toyo Pearl" (Handelsname) oder einem Gelfiltrations-Medium, wie "Sephadex G-100" (Handelsname), "Sephadex G-75" (Handelsname) oder "Sephacryl 5-200" (Handelsname) - Nach geeigneter Anwendung von zwei oder mehr dieser Verfahren in Kombination wird die Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung durch Elektrophorese, Ultrazentrifugieren oder ähnliches gereinigt, bis ein einzelner Peak angezeigt wird. Dann wird ein Stabilisator, wie Zucker, zum Beispiel Mannit, Saccharose oder Sorbit, eine Aminosäure, wie Glutaminsäure oder Glycin oder ein Peptid oder Protein, wie Rinderserumalbumin, hinzugegeben, gefolgt vom weiteren Behandeln, wie Lyophilisieren, um Pulver des Enzyms dieser Erfindung in einer gereinigten Form zu erhalten.
Wie oben beschrieben, ist die Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung zumindest in der Lage, die enzymatische Reaktion der unten angegebenen- Gleichung (a) zu katalysieren, nicht aber in der Lage, die enzymatischen Reaktionen der unten angegebenen Gleichungen (b) und (c) zu katalysieren und als Substrat-Spezifität ist sie in der Lage, auf Monoglycerid einzuwirken, nicht aber auf Diglycerid und Triglycerid. Ihr Molekulargewicht beträgt 27.000 ± 2.700 und ihr optimaler pH 5. Sie zeigt maximale Aktivität bei der optimalen Temperatur von 75ºC. Sie ist beim pH 7 bis 8 stabil. Ihr isoelektrischer Punkt ist pH 4,6 ± 0,4. Sie ist bis zu 70ºC thermisch stabil. Aus diesen chemischen und physikalischen Eigenschaften ergab sich, daß die Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung sich von bekannten Monoglycerid-Lipasen unterscheidet. Es ist demgemäß klar, daß die Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung ein neues Enzym ist.
(a) Monoglycerid + H&sub2;O → Glycerin + Fettsäure
(b) Diglycerid + H&sub2;O → Monoglycerid + Fettsäure
(c) Triglycerid + H&sub2;O → Diglycerid + Fettsäure.
Eine Probenlösung, die Monoglycerid enthält, kann analysiert werden, indem man das Enzym dieser Erfindung, d. h. die Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung, auf das Monoglycerid in der Probenlösung einwirken läßt und entweder das resultierende Glycerin oder die gebildete Fettsäure mißt. Das neue analytische Verfahren für Monoglycerid ist brauchbar für verschiedene analytische Methoden, wie die Analyse von Monoglycerid, das in Getränken, Nahrungsmitteln, Körperflüssigkeiten und ähnlichen enthalten ist, und die Messung der Aktivität von Pankreas-Lipase, die in Körperflüssigkeiten, Serum und ähnlichen enthalten ist.
Die vorliegende Erfindung schafft somit ein analytisches Verfahren für eine Monoglycerid enthaltende Probenlösung, umfassend das Einwirkenlassen einer Monoglycerid-Lipase, die zumindest in der Lage ist, eine enzymatische Reaktion der unten angegebenen Gleichung (a) zu katalysieren, nicht aber in der Lage ist, enzymatische Reaktionen der unten angegebenen Gleichungen (b) und (c) zu katalysieren und als Substrat-Spezifität in der Lage ist, auf Monoglycerid einzuwirken, nicht aber auf Diglycerid und Triglycerid, auf Monoglycerid und Messen von entweder Glycerin oder einer Fettsäure, die als Komponenten des Monoglycerids bei der Umsetzung gebildet wurden.
(a) Monoglycerid + H&sub2;O → Glycerin + Fettsäure
(b) Diglycerid + H&sub2;O → Monoglycerid + Fettsäure
(c) Triglycerid + H&sub2;O → Diglycerid + Fettsäure.
Es gibt keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Monoglycerid enthaltenden Probenlösung in der vorliegenden Erfindung, solange Monoglycerid als ein Substrat für das neue Enzym, d. h. die Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung, darin enthalten ist. Es kann eine Monoglycerid enthaltende Probenlösung sein, erhalten aus einem Getränk oder einem Nahrungsmittel. Als eine Alternative kann es eine Probenlösung sein, die Monoglycerid enthält, das durch Hinzugeben von 1,2-Diglycerid zu einer Probenlösung von Pankreas-Lipase und Ausführen einer Umsetzung unter gewissen spezifischen Bedingungen zur Messung der Aktivität der Pankreas-Lipase gebildet wurde. Ein Verfahren zum Messen der Aktivität von Pankreas-Lipase durch Kombinieren von 1,2-Diglycerid, als einem Substrat für Pankreas-Lipase, und der Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung kann beispielsweise erwähnt werden, bei dem 1,2-Diglycerid, als das Substrat für Pankreas-Lipase, und ein nicht ionischen oberflächenaktives Mittel zu einer Pankreas-Lipase enthaltenden Körperflüssigkeit, als einer Probenlösung, hinzugegeben werden, eine Umsetzung unter gewissen spezifischen Reaktionsbedingungen eingeleitet wird, um Monoglycerid aus dem Substrat, d. h. 1,2-Diglycerid, durch die Wirkung von Pankreas-Lipase zu bilden, und man die Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung auf das so gebildete Monoglycerid einwirken läßt und entweder Glycerin oder eine Fettsäure, die als Komponenten des Monoglycerids gebildet wurden, quantitativ analysiert wird. Als Additive, die hinzugegeben werden können, um die Wirkung von Pankreas-Lipase bei der Messung der Aktivität von Pankreas-Lipase in der Probenlösung zu fördern, können beispielsweise Colipase, Natriumdesoxycholat, Calciumchlorid, Ammoniumchlorid und ähnliche erwähnt werden. Natriumcholat und ähnliche können als Solubilisator für das Substrat erwähnt werden.
Die Monoglycerid-Lipase, die bei der Messung der Aktivität der Pankreas-Lipase brauchbar ist, ist das oben beschriebene neue Enzym dieser Erfindung. Sie kann in einer genügenden Menge eingesetzt werden, um Monoglycerid, das durch die Pankreas-Lipase in der Probenlösung gebildet wurde, zu hydrolysieren. Es ist im allgemeinen ausreichend, sie in einer Menge von 0,1 U/ml oder mehr einzusetzen, wobei etwa 0,5 bis 2 U/ml bevorzugt sind. Das hier eingesetzte Enzym dieser Erfindung kann entweder in Form der wässerigen Lösung oder in einer Form vorliegen, bei der ein Puffer hinzugegeben wurde. Als eine Alternative kann sie auch in einer lyophilisierten Form eingesetzt werden.
In der oben beschriebenen Weise läßt man die Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung auf Monoglycerid einwirken und inkubiert dann für eine vorbestimmte Zeitdauer. Die Reaktionszeit und Reaktionstemperatur können derart sein, daß das Enzym genügend reagiert. Die Reaktionstemperatur kann zum Beispiel 30 bis 40ºC, vorzugsweise um 35ºC herum, betragen. Als ein Ergebnis dieser Reaktion werden Glycerin und eine Fettsäure in der Probenlösung gebildet, und entweder Glycerin oder Fettsäure werden dann gemessen.
Für die Messung von Glycerin ist die Anwendung eines Enzyms, das in der Lage ist, auf Glycerin als ein Substrat einzuwirken, zum Beispiel des Glycerokinase- Glycerophosphat-Oxidase-Verfahrens oder des Glycerin- Oxidase-Verfahrens einfach und wirksam. Bei dem ersteren Verfahren wird zum Beispiel Glycero-3-phosphat, das unter Anwendung von ATP und einer Glycerokinase aus Glycerin gebildet wird, durch Glycerophosphat-Oxidase oxidiert. Bei dem Glycerokinase-Glycerophosphat-Oxidase-Verfahren werden 0,1 bis 10 U/ml von Glycerokinase, 0,1 bis 2,0 mM Adenosintriphosphat (ATP) und 2 bis 50 mM Magnesiumchlorid zu Glycerin hinzugegeben, das durch die Monoglycerid- Lipase dieser Erfindung aus Monoglycerid gebildet worden ist, wobei Adenosindiphosphat (ADP) und Glycero-3-phosphat gebildet werden. Indem man 2,0 bis 50 U/ml von Glycerophosphat-Oxidase auf so gebildetes Glycero-3-phosphat einwirken läßt, wird Sauerstoff unter Bildung von Dihydroxyacetonphosphat und Wasserstoffperoxid verbraucht. Das Glycerin kann dann durch Messen des in der Reaktionsmischung verbrauchten Sauerstoffes quantitativ bestimmt werden oder es wird in der Reaktionsmischung gebildetes Dihydroxyacetonphosphat oder Wasserstoffperoxid gemessen. Zur Messung des verbrauchten Sauerstoffes ist der Einsatz von Sauerstoffelektroden einfach und leicht. Als ein Verfahren zur Messung des resultierenden Wasserstoffperoxids kann ein Verfahren erwähnt werden, das Wasserstoffperoxid-Elektroden benutzt, ein kolorimetrisches Verfahren, das eine Farbstoff-Zusammensetzung benutzt, die ein oder mehrere chromogene Reagenzien enthält, die bei Umsetzung mit dem Wasserstoffperoxid Änderungen hinsichtlich der Extinktion unterliegen oder ähnliche. Als veranschaulichende Beispiele solcher chromogenen Reagenzien können solche erwähnt werden, die Gebrauch von einer Umsetzung zwischen einer vierwertigen Titanverbindung, die zur Bildung einer stabilen roten Substanz bei Umsetzung mit dem resultierenden Wasserstoffperoxid in der Lage ist und Xylenol-orange, einer Umsetzung zwischen N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-metatoluidin (im folgenden abgekürzt als "TOOS") oder Phenol, 4-Aminoantipyrin und Peroxidase oder ähnlichem macht. Bei der Umsetzung zwischen TOOS oder Phenol, 4-Aminoantipyrin und Peroxidase kann Phenol oder TOOS in einer Menge von etwa 0,01 bis 0,1%, bezogen auf die gesamte Lösung, eingesetzt werden. 4-Aminoantipyrin kann in einer Menge von 0,01 bis 0,1%, vorzugsweise 0,3%, bezogen auf die Menge des resultierenden Wasserstoffperoxids, benutzt werden, während Peroxidase in einer Menge von 0,5 bis 10 U/ml eingesetzt werden kann. Das so zubereitete chromogene Reagenz kann auch zusammen mit der Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung zubereitet werden. Danach wird der als Ergebnis der Farbreaktion gebildete Chinonimin-Farbstoff bei einer geeigneten Wellenlänge gemessen. Das Wasserstoffperoxid kann dann quantitativ aus einer Kalibrierungskurve ermittelt werden. Weiter kann eine fluoreszierende Substanz, wie Homovanillinäure, anstelle des oben erwähnten chromogenen Reagenz benutzt werden. In ähnlicher Weise läßt man 5 bis 50 U/ml von Glycerin-Oxidase auf das, wie oben erwähnt, bei dem Glycerin-Oxidase-Verfahren gebildete Glycerin einwirken, so daß Sauerstoff verbraucht und Dihydroxyaceton und Wasserstoffperoxid gebildet werden. Es ist dann nur noch erforderlich, die Menge des so gebildeten Wasserstoffperoxids in der gleichen Weise wie bei dem Meßverfahren für die Menge von Sauerstoff oder Wasserstoffperoxid beim Glycerokinase-Glycerophosphat-Oxidase- Verfahren zu bestimmen. Als ein Verfahren zur quantitativen Analyse von Glycerin kann reduziertes NAD, das unter Einsatz von Glycerophosphat-Dehydrogenase statt der oben erwähnten Glycerophosphat-Oxidase gebildet wurde, nach einem bekannten Verfahren zur quantitativen Analyse bestimmt werden. Durch Einwirkung von Glycerokinase auf ATP gebildetes ADP kann gemäß einem bekannten Verfahren bestimmt werden.
Zur Messung der Aktivität von Pankreas-Lipase kann zum Beispiel 1,2-Diglycerid, das als Substrat für Pankreas-Lipase dienen kann, ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel, ein Additiv zur Förderung der Wirkungen der Pankreas-Lipase-Aktivität, ein Solubilisator für das Substrat, ein Additiv zur Förderung-der Umsetzung zur Bildung von Glycerin und einer Fettsäure aus Monoglycerid, ein Enzym zum Messen von so gebildetem Glycerin und ein Additiv zur Förderung der Wirkung des Enzyms, ein chromogenes Reagenz zur Messung des gebildeten Wasserstoffperoxids usw. zusammen mit der Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung formuliert werden. Die Arten und Mengen des Substrates, d. h. des 1,2-Diglycerids, des zur Messung der Aktivität der Pankreas-Lipase brauchbaren oberflächenaktiven Mittels, können geeigneterweise unter Bezugnahme auf die JP-OS 91 89871984 ausgewählt werden. Beim Geschwindigkeits-Assay, als einem Verfahren zur Messung der Aktivität von Pankreas-Lipase, läßt man 30 ul einer Probe (Serum), das für die Messung der Aktivität von Pankreas-Lipase vorgesehen ist, auf 1,5 ml einer Reaktionslösung einwirken, die vorher zubereitet wurde, woraufhin man die Reaktionsmischung einer kontinuierlichen kolorimetrischen Messung bei 37ºC (oder 30ºC oder 25ºC als Alternativen) und einer Wellenlänge von 550 nm unterwirft. Beim Endpunkt-Assay läßt man 50 W einer Probe (Serum), die zur Messung der Aktivität von Pankreas-Lipase vorgesehen ist, auf 1,0 ml einer Reaktionslösung einwirken, die vorher zubereitet wurde, und nach 30 minütigem Reagierenlassen bei 37ºC wird 1,0 ml eines 0,5%-igen SDS hinzugegeben, und es wird eine kolorimetrische Messung bei einer Wellenlänge von 550 nm ausgeführt.
Es kann eine Kreislauf-Reaktion als ein Verfahren zum Messen der Fettsäure benutzt werden. Die Kreislauf-Reaktion umfaßt eine Reaktionsstufe des Enzyms als eine anfängliche Stufe, bei der die durch die Wirkung der Monoglycerid-Lipase aus Monoglycerid freigesetzte Fettsäure als eine Ausgangssubstanz in Acyl-CoA umgewandelt wird, woraufhin eine Reihe mehrerer aufeinanderfolgender Stufen benutzt wird, umfassend eine Kombination mehrerer Reaktionsstufen, bei denen ein enzymatisches Reaktionsprodukt, das in der vorhergehenden Stufe erhalten wurde, als ein Substrat für eine enzymatische Reaktion in einer gegebenen Stufe benutzt wird, um das Substrat in ein Substrat für die enzymatische Reaktion in der nächsten Stufe umzuwandeln und eine Endstufe der Umwandlung in die in der Ausgangsstufe gebildete Acyl-CoA. Mehr im besonderen sind diese Stufen Umwandlungsstufen in die Acyl-CoA, bei denen die Fettsäure in der anfänglichen Stufe in die Acyl-CoA umgewandelt wird, die Acyl-CoA in der nächsten Stufe in die Dehydroacyl-CoA umgewandelt wird, die Dehydroacyl-CoA in die Hydroxyacyl-CoA umgewandelt wird, die Hydroxyacyl-CoA in die Ketoacyl-CoA umgewandelt wird und die Ketoacyl-CoA schließlich in die Acyl-CoA umgewandelt wird. Aufgrund der Kombination dieser Stufen kann die Menge der Fettsäure erfolgreich als eine Kreislauf-Reaktion gemessen werden. Die Acylgruppe der in der Endstufe der Reaktion gebildeten Acyl-CoA hat 2 Kohlenstoffatome weniger, verglichen mit der Kettenlänge der Ausgangs- Fettsäure der Reaktion. Die Acyl-CoA wird dann nacheinander durch die Kreislauf-Reaktion in die Dehydroacyl-CoA, Hydroxyacyl-CoA und Ketoacyl-CoA umgewandelt. Die Kreislauf-Reaktion bildet einen solchen Kreislauf, daß Acyl- CoA mit einer um 2 geringeren Kohlenstoffzahl in der Endstufe gebildet wird. Eine Kreislauf-Reaktion hoher Ordnung, entsprechend der Anzahl der Kohlenstoffe der Fettsäure findet statt. Durch Messen der kumulativen Menge einer Substanz eines hohen molaren Verhältnisses, die während der Kreislauf-Stufen aus einmolarer Fettsäure mit verschiedenen Mitteln gebildet oder verbraucht wird, kann die kumulative Menge als eine Variante, die mit einer außerordentlich hohen Empfindlichkeit nachweisbar ist, gemessen werden. Diese Messung schließt die folgenden Reaktionsstufen (a) bis (e) ein. (a) Die Fettsäure wird durch eine Umsetzung auf der Grundlage von ATP oder GTP, CoASH und der Aktivität der Acyl-CoA-Synthetase in die Acyi-CoA umgewandelt. (b) Die Acyl-CoA wird dann durch eine Reaktion, die auf Sauerstoff und der Aktivität der Acyl-CoA- Oxidase beruht, in die Dehydroacyl-CoA umgewandelt.
(c) Die Dehydroacyl-CoA wird als nächstes durch eine Umsetzung, die auf Wasser und der Aktivität von Enoyl-CoA- Hydratase beruht, in die Hydroxyacyl-CoA umgewandelt.
(d) Die Hydroxyacyl-CoA wird danach durch eine Reaktion, die auf NAD und der Aktivität der 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase beruht, in die Ketoacyl-CoA umgewandelt.
(e) Schießlich wird die Ketoacyl-CoA durch eine Umsetzung, die auf CoASH und der Aktivität der 3-Ketoacyl-CoA- Thiolase beruht, in die Acyl-CoA umgewandelt, deren Acylgruppe eine um 2 geringere Kohlenstoffzahl aufweist, verglichen mit der der Acylgruppe der Acyl-CoA, die in der Reaktionsstufe (a) gebildet wurde. Die so gebildete Acyl- CoA wird durch die Reaktionen der nachfolgenden Reaktionsstufen einer β-Oxidation unterworfen, so daß sie in Acyl-CoA umgewandelt wird, deren Acylgruppe eine um 2 geringere Kohlenstoffzahl aufweist, verglichen mit der ersterwähnten Acyl-CoA. Es ist daher lediglich erforderlich, spektrophotometrisch reduziertes NAD als eine nachweisbare Variante einer im Reaktionssystem gebildeten Substanz zu messen, die im Laufe der Kreislauf-Reaktion gebildet wird und sich ansammelt. Dieses reduzierte NAD kann spektrophotometrisch bei etwa 320 bis 360 nm gemessen werden, was Wellenlängen sind, die nicht spezifisch für NAD, aber spezifisch für reduziertes NAD sind. Als eine Alternative kann das reduzierte NAD kolorimetrisch gemessen werden, wozu man ein Chromogen benutzt, das am Wasserstoff-Transportsystem teilnimmt und Diaphorase und ein wasserlösliches Tetrazoliumsalz enthält. Die zur Messung der Fettsäure benutzten Enzyme und Reagenzien können geeigneterweise unter Bezugnahme auf die JP-OSn 51 899/ 1983 und 91 898/1984 zubereitet werden.
Das analytische Verfahren, das Gebrauch macht von der neuen Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung, die in der oben beschriebenen Weise hergestellt wurde, mißt entweder resultierendes Glycerin oder Fettsäure. Sie ist daher für verschiedene Analysen brauchbar, zum Beispiel die Analyse von Monoglycerid in einem Getränk, Nahrungsmittel, einer Körperflüssigkeit oder ähnlichem und für die Messung der Aktivität von Pankreas-Lipase, die in einer Körperflüssigkeit, einem Serum oder ähnlichem enthalten ist.
Diese Erfindung wird im folgenden spezifisch durch Beispiele beschrieben.

Beispiel 1: (Züchtung von Zellen)

Nach dem Sterilisieren von 100 ml einer Kultur (pH 7,0), enthaltend 1,0% Pepton, 0,5% pulverisierten Hefeextrakt, 1,0% Milchcasein, 0,2% NaCl, 0,1% K&sub2;HPO&sub4;, 0,05% MgSO&sub4;·7H&sub2;O und 0,5% Olivenöl bei 120ºC für 20 Minuten wurde eine Saatkultur von Bacillus stearothermophilus H-165, die vorher 15 Stunden bei 50ºC in einem Agarmedium der gleichen Zusammensetzung wie die obige Kultur gezüchtet worden war, in die obige Kultur eingeführt. Der Stamm wurde unter Schütteln 25 Stunden bei 50ºC gezüchtet. Von etwa der 10. Stunde an wurde die Aktivität der Monoglycerid-Lipase in derart gezüchteten Zellen beobachtet. Nachdem die Aktivität die Spitze (0,1 U/ml) erreicht hatte, wurde das Züchten beendet und die resultierende Kultur bei 3.000 U/min 10 Minuten zentrifugiert, um Zellen zu sammeln.

Beispiel 2: (Extraktion und Reinigung von Enzym)

Zellen, die aus 1.000 ml einer Kultur (10 Erlenmeyerkolben von 500 ml Kapazität), erhalten in der gleichen Weise wie in Beispiel 1, gewonnen worden waren, wurden in 200 ml eines 10 mM Phosphatpuffers (pH 7,0) suspendiert und Ultraschall-behandelt (200 W, 10 Minuten), um das Enzym zu solubilisieren. Die so solubilisierte Lösung wurde bei 15.000 U/min 10 Minuten zentrifugiert, wobei 175 ml eines klaren Überstehenden erhalten wurden, zu dem 350 ml gekühltes Aceton hinzugegeben wurden, um das Enzym auszufällen. Nach dem Auflösen der Ausfällung in 65 ml eines 10 mM Phosphatpuffers (pH 7,0), enthaltend 10% Ammoniumsulfat, wurde die resultierende Lösung auf eine mit "Octyl-Sepharose" (Handelsname, Produkt der Pharmacia AB) gepackte Säule (3,5·5 cm) gegeben, so daß das Enzym adsorbiert wurde. Nicht auf der Säule adsorbierte Komponenten wurden mit 50 ml eines Phosphatpuffers (pH 7,0), der 10% Ammoniumsulfat enthielt, ausgewaschen. Nach dem Waschen der Säule mit einem 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) wurde das Enzym mit 3% Triton X-100 aus der Säule eluiert. Das Eluat wurde in Form von 10 ml-Fraktionen fraktioniert. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 gezeigt. Aktive Fraktionen (Nr. 22 bis 25) wurden kombiniert und dann mittels einer Ultrafiltrationsmembran, die durch AMICON CORP. hergestellt war, auf 4 ml konzentriert. Das Enzym wurde dann mit 10 ml gekühlten Acetons ausgefällt, gefolgt vom Zentrifugieren bei 3.000 U/min für 10 Minuten, um die Ausfällung zu sammeln. Nach dem Lösen der Ausfällung in 5 ml eines 10 mM Phosphatpuffers (pH 7,0) wurde die resultierende Lösung 20 Stunden gegen 500 ml des gleichen Puffers dialysiert. Das Dialysat wurde danach lyophilisiert, und man erhielt 8 mg des Enzyms in gereinigter Form (3,8 U/g).

Beispiel 3: (Verfahren zum Messen der Aktivität von Pankreas-Lipase)

Zusammensetzung einer Reaktionslösung für das Glycerokinase-Glycerophosphat-Oxidase-Verfahren (GK-GPO- Verfahren):
Endkonzentration
HEPES-NaOH (pH 7,7)**** 20 mM
1,2-Dilinolein 1,0 mM
Nichtionisches oberflächenaktives Mittel 0,14%
Colipase 0,2 mg/ml
Natriumdesoxycholat 7,0 mM
Natriumcholat 3,0 mM
Calciumchlorid 0,7 mM
Ammoniumchlorid 10,0 mM
Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung 1,0 U/ml
Glycerokinase 0,5 U/ml
Adenosintriphosphat 0,5 mM
Magnesiumchlorid 0,7 mM
Glycerophosphat-Säure-Oxidase 20, 0 U/ml
TOOS 0,02%
4-Aminoantipyrin 0,03%
Peroxidase 3 U/ml
Zusammensetzung einer Reaktionslösung für das Glycerin-Oxidase-Verfahren (GO-Verfahren):
Endkonzentration
HEPES-NaOH (pH 7,7)**** 20 mM
1,2-Dilinolein 1,0 mM
Nichtionisches oberflächenaktives Mittel 0,14%
Colipase 0,2 mg/ml
Natriumdesoxycholat 7,0 mM
Natriumcholat 3,0 mM
Calciumchlorid 0,7 mM
Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung 1, 0 U/ml
Glycerin-Oxidase 20,O U/ml
Adenosintriphosphat 0,5 mM
Magnesiumchlorid 0,7 mM
TOOS 0,02%
4-Aminoantipyrin 0,03%
Peroxidase 3 U/ml
**** Als ein Puffer, irgendeiner der verschiedenen Good-Puffer BES, Bicine, DIPSO, EPPS, HEPES, HEPPSO, MOPS, POPS, TAPS, TAPSO, TES und Tricine, Tris-HCl, Dimethylglutarsäure, Imidazol oder ähnliche, kann benutzt werden. Phenol kann anstelle von TOOS eingesetzt werden.

Meßverfahren

(1) Geschwindigkeits-Assay:

Nach dem Hinzugeben von 30 ul menschlichen Serums zu 1,5 ml der Reaktionslösung der obigen Zusammensetzung und deren Vermischen, wurde die Extinktion kontinuierlich mittels eines Spektrophotometers ("Shimadzu VV=250", Handelsname, hergestellt durch Shimadzu Seisakusho Ltd.) bei 37ºC und 550 nm aufgezeichnet. Die Veränderung der Extinktion pro Minute wurde nach der dritten Minute gemessen. Die Aktivität der Lipase wurde gemäß einer weiter unten angegebenen Gleichung errechnet. Ergebnisse für das GK-GPO-Verfahren sind in Tabelle 3 und für das GO-Verfahren in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 3 [GK-GPO-Verfahren] Probe Nr. Milliextinktion/min U/L Tabelle 4 [GO-Verfahren] Probe Nr. Milliextinktion/min U/L
Messung der Aktivität der Lipase (U/L) = Extinktionszunahme (A550nm)7min·1,53715,6·1.000730·1.000
15,6: Millimolarer Extinktionskoeffizient (cm²/umol) der durch Wasserstoffperoxid erzeugten Farbe
1,53: Gesamtvolumen der Reaktionslösung (ml)
1.000/30: Umrechnung in ml
1.000: Umrechnung in l

(2) Endpunkt-Assay:

Nach der Zugabe von 50 ul menschlichen Serums zu 1,0 ml der Reaktionslösung der gleichen Zusammensetzung und deren Vermischen, wurden sie 30 Minuten bei 37ºC umgesetzt. Die Umsetzung wurde mit 1,0 ml von 0,5%-igem SDS beendet und die Extinktion bei 550 nm (AS) gemessen.
Als ein Blindtest wurde das obige Verfahren mit einer Reaktionslösung wiederholt, zu der 1,2-Diglycerid, Colipase und Desoxycholsäure nicht hinzugegeben worden waren. Die Reaktionslösung diente als eine Blindprobe (AB).
Die Aktivität der Lipase wurde gemäß einer weiter unten angegebenen Gleichung errechnet. Für das GK- GPG-Verfahren sind die Ergebnisse in Tabelle 5 gezeigt und für das GO-Verfahren in Tabelle 6. Tabelle 5 [GK-GPO-Verfahren] Probe Nr. Tabelle 6 [GO-Verfahren] Probe Nr.
Messung der Aktivität der Lipase (U/L) = A550nm (AS-AB)·2,05715,6·1730·1.000750·1.000
15,6: Millimolarer Extinktionskoeffizient (cm²/umol) der durch Wasserstoffperoxid erzeugten Farbe
1/30: Umrechnung in 1 Minute
1.000/50: Umrechnung in ml
1.000: Umrechnung in l
2,05: Gesamtvolumen der Reaktionslösung (ml)

Beispiel 4: (Messung des Monoglycerids)

Zusammensetzung einer Reaktionslösung für das Glycerokinase-Glycerophosphat-Oxidase-Verfahren (GK-GPO- Verfahren):
Endkonzentration
HEPES-NaOH (pH 7,7)**** 20 mM
Triton X-100 0,1%
Calciumchlorid 1,0 mM
Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung 0,5 U/ml
Glycerokinase 0,5 U/ml
Adenosintriphosphat 1,0 mM
Glycerophosphat-Oxidase 5,0 U/ml
TOOS 0,02%
4-Aminoantipyrin 0,03%
Peroxidase 3 U/ml
Zusammensetzung einer Reaktionslösung für das Glycerin-Oxidase-Verfahren (GO-Verfahren):
Endkonzentration
HEPES-NaOH (pH 7,7)**** 20 mM
Triton X-100 0,1%
Calciumchlorid 1,0 mM
Monoglycerid-Lipase dieser Erfindung 0,5 U/ml
Glycerin-Oxidase 5,0 U/ml
TOOS 0,02%
4-Aminoantipyrin 0,03%
Peroxidase 3 U/ml
**** Als ein Puffer, irgendeiner der verschiedenen Good-Puffer BES, Bicine, DIPSO, EPPS, HEPES, HEPPSO, MOPS, POPS, TAPS, TAPSO, TES und Tricine, Tris-HCl, Dimethylglutarsäure, Imidazol oder ähnliche, kann benutzt werden. Phenol kann anstelle von TOOS eingesetzt werden.

Meßverfahren

Zu 3,0 ml-Portionen der jeweiligen Reaktionsmischung wurden 50 ul-Portionen von Proben hinzugegeben, die 0 bis 0,5 umol des Monoglycerids (1-Monoolein) enthielten. Nach dem Ausführen einer farberzeugenden Reaktion bei 37ºC für 15 Minuten nach dem GK-GPO-Verfahren wurden die Extinktionsniveaus separat bei 500 nm gemessen. Wie in Fig. 6 veranschaulicht, wurde bis zu der Monoglycerid-Menge von 0,5 umol eine gerade Linie erhalten, die eine proportionale Beziehung anzeigt. Das GO- Verfahren ergab bis zur Monoglycerid-Menge von 0,5 umol ebenfalls eine gerade Linie, die eine proportionale Beziehung anzeigt.

Claims

1. Neue Monoglycerid-Lipase, erhältlich durch Züchten eines Monoglycerid-Lipase erzeugenden Mikroorganismus aus Bacillus in einem Medium, die in der Lage ist, eine enzymatische Reaktion der folgenden Gleichung (a) zu katalysieren und als Substrat-Spezifizität in der Lage ist, auf Monoglycerid einzuwirken, aber nicht in der Lage ist, auf Diglycerid und Triglycerid einzuwirken:

(a) Monoglycerid + H&sub2;O → Glycerin + Fettsäure,

worin die Monoglycerid-Lipase die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften hat:

(1) Molekulargewicht: 27.000 ± 2.700

(2) optimaler pH: um pH 5 herum

(3) optimale Temperatur: Zeigt die maximale Aktivität um 75ºC herum

(4) pH-Stabilität: pH 7-8 (10 Minuten lang bei 75ºC behandelt)

(5) thermische Stabilität: stabil bis zu 70ºC (10 Minuten lang beim pH 7,5 behandelt)

(6) isoelektrischer Punkt: pH 4,6 ± 0,4

2. Verfahren zum Herstellen einer neuen Monoglycerid- Lipase, wie sie in Anspruch 1 definiert ist, umfassend das Züchten eines Monoglycerid-Lipase erzeugenden Mikroorganismus aus Bacillus in einem Medium, die in der Lage ist, eine enzymatische Reaktion der folgenden Gleichung (a) zu katalysiren und als Substrat-Spezifizität in der Lage ist, auf Monoglycerid einzuwirken, aber nicht in der Lage ist, auf Diglycerid und Triglycerid einzuwirken und Gewinnen der Monoglycerid-Lipase aus der resultierenden Kultur;

(a) Monoglycerid + H&sub2;O → Glycerin + Fettsäure.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin der Monoglycerid- Lipase erzeugende Mikroorganismus aus Bacillus Bacillus stearothermophilus ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin der Monoglycerid- Lipase erzeugende Mikroorganismus aus Bacillus stearothermophilus Bacillus stearothermophilus H-165 (FERM BP-1673) ist.

5. Analytisches Verfahren für eine Monoglycerid enthaltende Probelösung, umfassend Einwirkenlassen einer Monoglycerid-Lipase, die zumindest in der Lage ist, eine enzymatische Reaktion der unten angegebenen Gleichung (a) zu katalysieren und als Substrat- Spezifizität in der Lage ist, auf Monoglycerid einzuwirken, aber nicht in der Lage ist, auf Diglycerid und Triglycerid einzuwirken, auf Monoglycerid nach Messung des Monoglycerids in der Probenlösung und dann Messen eines von Glycerin und einer Fettsäure, die sich in der Reaktion gebildet haben,

(a) Monoglycerid + H&sub2;O → Glycerin + Fettsäure.

6. Analytisches Verfahren nach Anspruch 5, worin das Monoglycerid in der Probenlösung Monoglycerid ist, das freigesetzt wird, indem man Pankreas-Lipase auf 1,2-Diglycerid in der Probenlösung einwirken läßt.

7. Analytisches Verfahren nach Anspruch 5, worin bei der Messung des Glycerins Wasserstoffperoxid gemessen wird, das gebildet wird durch Einwirkenlassen von Glycerin-Oxydase, Glycerokinase oder Glycerophosphat-Säure- Oxydase auf das resultierende Glycerin.

8. Analytisches Verfahren nach Anspruch 7, worin bei der Messung des Wasserstoffperoxids eine Farbstoffzusammensetzung benutzt wird, die mindestens ein chromogenes Reagenz enthält, das einer colorimetrischen Veränderung in Gegenwart des Wasserstoffperoxids unterliegt.

9. Analytisches Verfahren nach Anspruch 8, worin die Farbstoffzusammensetzung eine Peroxidase enthält.

10. Analytisches Verfahren nach Anspruch 9, worin die Peroxidase in einer Menge von 0,5 bis 10 Einheiten eingesetzt wird.

11. Analytisches Verfahren nach Anspruch 8, worin das chromogene Reagenz der Farbstoffzusammensetzung 4-Aminoantipyrin, N-Ethyl-N-(4-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidin oder Phenol und eine Peroxidase umfaßt.

12. Analytisches Verfahren nach Anspruch 5, worin die Messung der Fettsäure die folgenden Reaktionsstufen (a), (b), (c), (d) und (e) umfaßt:

(a) Umwandeln der Fettsäure in Acyl-CoA,

(b) Umwandeln der Acyl-CoA in Dehydroacyl-CoA,

(c) Umwandeln der Dehydroacyl-CoA in Hydroxyacyl- CoA,

(d) Umwandeln der Hydroxyacyl-CoA in Ketoacyl-CoA und

(e) Umwandeln der Ketoacyl-CoA in Acyl-CoA und Messen einer Änderung in der Menge eines nachweisbaren Reaktionsproduktes.

13. Analytisches Verfahren nach Anspruch 12, worin in den Reaktionsstufen (a), (b), (c), (d) und (e) die Reaktionsstufe (a) auf der Fettsäure, CoASH und ATP oder GTP sowie der Aktivität von Acyl-CoA-Synthetase beruht, die Reaktionsstufe (b) auf der Acyl-CoA und Sauerstoff sowie der Aktivität von Acyl-CoA-Oxidase beruht, die Reaktionsstufe (c) auf der Dehydroacyl-CoA und Wasser sowie der Aktivität von Enoyl-CoA-Hydratase beruht, die Reaktionsstufe (d) auf der Hydroxyacyl-CoA und der NAD sowie der Aktivität von 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase beruht und die Reaktionsstufe (e) auf der Ketoacyl-CoA und CoASH sowie der Aktivität von 3-Ketoacyl-CoA-Thiolase beruht.

14. Analytisches Verfahren nach Anspruch 12, worin die Stufe des Messens der Änderung in der Menge des nachweisbaren Reaktionsproduktes das quantitative Analysieren reduzierter NAD umfaßt, die durch die Reaktionsstufe gebildet ist.

15. Analytisches Verfahren nach Anspruch 14, worin die quantitative Analyse der resultierenden reduzierten NAD ausgeführt wird durch Spektrophotometrie um 320 bis 360 nm herum, was die Absorptions-Wellenlängen sind, die nicht für NAD, aber für reduziertes NAD charakteristisch sind.

16. Analytisches Verfahren nach Anspruch 14, worin die quantitative Analyse des resultierenden reduzierten NAD ausgeführt wird auf der Grundlage der Erzeugung einer Farbe durch ein Chromogen, das an dem Wasserstoff-Transportsystem teilnimmt und aufnahmefähig ist für die Wasserstoffatome des reduzierten NAD.

17. Analytisches Verfahren nach Anspruch 16, worin das Chromogen, das Aufnahmefähigkeit für die Wasserstoffatome reduzierten NAD hat, ein Chromogen ist, das teilnimmt am Wasserstoff-Transportsystem und Diaphorase und ein wasserlösliches Tetrazoliumsalz enthält.

18. Analytisches Verfahren für die Aktivität von Pankreas-Lipase in einer Probenlösung, umfassend das Einwirkenlassen der Pankreas-Lipase der Probenlösung auf ein Reagenz, das mindestens 1,2-Diglycerid enthält, um Monoglycerid freizusetzen, Einwirkenlassen einer Monoglycerid-Lipase, die zumindest in der Lage ist, eine enzymatische Reaktion der unten angegebenen Gleichung (a) zu katalysieren und als Substrat-Spezifizität in der Lage ist, auf Monoglycerid einzuwirken, aber nicht in der Lage ist, auf Diglycerid und Triglycerid einzuwirken, auf das so freigesetzte Monoglycerid und dann Messen eines von Glycerin und einer Fettsäure, die als Komponenten des Monoglycerids in der Reaktion gebildet wurden,

(a) Monoglycerid + H&sub2;O → Glycerin + Fettsäure.

19. Analytisches Verfahren nach Anspruch 18, worin bei der Messung des Glycerins Wasserstoffperoxid gemessen wird, das gebildet wird durch Einwirkenlassen von Glycerin-Oxydase, Glycerokinase oder Glycerophosphat-Säure- Oxydase auf das resultierende Glycerin.

20. Analytisches Verfahren nach Anspruch 19, worin bei der Messung des Wasserstoffperoxids eine Farbstoffzusammensetzung benutzt wird, die mindestens ein chromogenes Reagenz enthält, das einer colorimetrischen Veränderung in Gegenwart des Wasserstoffperoxids unterliegt.

21 Analytisches Verfahren nach Anspruch 20, worin die Farbstoffzusammensetzung eine Peroxidase enthält.

22. Analytisches Verfahren nach Anspruch 21, worin die Peroxidase in einer Menge von 0,5 bis 10 Einheiten eingesetzt wird.

23. Analytisches Verfahren nach Anspruch 20, worin das chromogene Reagenz der Farbstoffzusammensetzung 4-Aminoantipyrin, N-Ethyl-N-(4-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidin oder Phenol und eine Peroxidase umfaßt.