FR2653135A1 - L-carnitine deshydrogenase stable et procede pour sa production. - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne une L-carnitine déshydrogénase stable à long terme en solution aqueuse (courbe --), qui est produite par culture d'un microorganisme appartenant au genre Alcaligenes dans un milieu nutritif, à partir duquel on l'isole.
Description
L'invention concerne une carnitine déshydrogénase qui est stable en
solution et un procédé pour sa préparation. Plus particulièrement, la présente invention concerne une carnitine déshydrogénase qui est stable en solution, cette carnitine déshydrogénase pouvant être utilisée pour une détermination de la L-carnitine en chimie clinique, le conditionnement d'aliments et la production de L-carnitine ou la mesure de la L-carnitine produite par
hydrolyse de l'acyl-L-carnitine.
La L-carnitine est une substance essentielle comme intermédiaire du transport des acides gras à longue chaîne à travers la membrane mitochondriale avant la 0-oxydation dans une cellule, et par conséquent une carence en L-carnitine provoque des troubles des acides gras et de leur métabolisme. Plus particulièrement, on sait qu'il se produit des troubles du muscle squelettique et du muscle cardiaque qui, tous deux, ont une forte consommation d'énergie dépendante de la carnitine et ne produisent pas de carnitine. On s'est précédemment intéressé aux erreurs innées du métabolisme de la carnitine, mais, récemment, des troubles secondaires du métabolisme de la carnitine ont posé un problème chez les patients atteints de néphrose et soumis à une dialyse. On administre de la carnitine aux patients présentant une carence en carnitine atteints d'une maladie des muscles squelettiques ou cardiaques ou soumis à une dialyse. Il est nécessaire d'étudier la carnitine en pathologie et en thérapeutique, mais on ne connaît pas de procédé satisfaisant de
détermination clinique de la carnitine.
A ce jour, les procédés de détermination connus de la carnitine sont les suivants: on traite la L-carnitine et l'acétyl CoA avec la carnitine acétyltransférase (CAT) et on fait de
plus réagir le CoAH ainsi libéré et le 5,5'-dithio-bis-2-
nitrobenzoate (DTNB) pour produire l'ion thiophénolate que l'on mesure colorimétriquement (procédé au DTNB) [J. Biol. Chem., 238: 2509 (1963), J. Lipid. Res., 5: 184-187 (1964) et Clinical Pathlogy, 36 (11): 1296-1302 (1988)]; on traite la L-carnitine et de l'acétyl CoA marquée au 14C ou 3H avec la CAT pour produire de l'acétyl-L-carnitine marquée et de la CoASH et on mesure la radioactivité (procédé radio-isotopique) [Clin. Chem. Acta, 37:
235-243 (1972), J. Lipid Res., 17: 277-281 (1976) et J. Japan. Nut.
Food. Soc., 41 (5): 389-395 (1988)]; on traite la L-carnitine et le NAD+ avec la L-carnitine déshydrogénase pour produire de la 3déshydrocarnitine et du NADH et on mesure l'accroissement de l'absorption UV due au NADH (procédé à la carnitine déshydrogénase) (Eur. J. Biochem., 6: 196-201 (1968), ibid. 10: 56-60 (1969) et Fresenius Z. Anal. Chem., 320 (3): 285-289 (1985)]; et on traite la L-carnitine et l'acétyl CoA avec la CAT pour produire de la CoA que l'on fait réagir avec le N-{p-(2benzimidazolyl)phényl}maléimide (BIPM) et on mesure l'intensité de la fluorescence du CoA-BIPM produit (procédé par fluorescence) [Ann. Rep. MHW Institute for Nerve
Disease, p. 315-318 (1986)].
A ce jour, on sait que la carnitine déshydrogénase est produite par Pseudomonas aeruginosa A 7244 (NCTC) [Eur. J. Biochem., 6: 196-201 (1968), ibid., 10: 56-60 (1969)], Pseudomonas putida IFP 206 [Arch. microbiol., 116: 213-220 (1978), Biochim. Biophys. Acta, 957: 335-339 (1988)], Pseudomonas putida ATCC 17633 [Fresenius Z. Anal. Chem., 320: 285-289 (1985)] et Xanthomonas translucens IFO
13558 [Agr. Biol. Chem., 52: 851-852 (1988)].
L'invention vise à résoudre les problèmes suivants. En chimie clinique, presque tous les réactifs biochimiques sont fournis sous une forme lyophilisée pour assurer leur stabilité. Depuis peu, on recherche des réactifs liquides stables au stockage prolongé. Il en est de même des réactifs pour la détermination de la carnitine avec la L-carnitine déshydrogénase. En général, parmi les réactifs biochimiques, les enzymes sont les plus instables et, par conséquent,
cette instabilité limite les déterminations utilisant des enzymes.
La L-carnitine déshydrogénase précédemment connue est une enzyme provenant de bactéries, telles que Pseudomonas ou Xanthomonas, et la stabilité en solution de l'enzyme n'a jamais été mentionnée et est impossible à mesurer. Parmi elles, la L-carnitine déshydrogénase de Pseudomonas putida IFP 206 présente une perte immédiate d'activité à 35 C [Biochim. Biophys. Acta, 957: 335-339 (1988)] et, lorsqu'on mesure une activité enzymatique à 37 C, on peut prévoir une perte rapide d'activité au cours d'une détermination, si bien qu'on ne
l'utilise pas en pratique.
La demanderesse a tenté de mesurer la stabilité à long terme en solution de L-carnitine déshydrogénases de diverses origines et a étudié les souches bactériennes productrices de L-carnitine déshydrogénase, puis a sélectionné Pseudomonas aeruginosa NCTC A7244, Xanthomonas translucens IFO 13558, qui sont toutes deux décrites dans les publications précitées, et Pseudomonas aeruginosa IFO 13130. On cultive ces trois souches selon le procédé décrit dans Eur. J.
Biochem., 6: 196-201 (1968), ibid., 10: 56-60 (1969) et Agr. Biol.
Chem., 52: 249-250 (1988) et on isole la L-carnitine déshydrogénase
de la masse cultivée.
On a mesuré la stabilité au cours du temps de la L-carnitine déshydrogénase à raison de 10 unités/ml dans une solution de tampon TrisHCl 50 mM à pH 9,0 pendant 2 semaines à 5 C. La L-carnitine déshydrogénase provenant des trois souches ci-dessus a présenté une baisse d'activité à une valeur inférieure à 50 % par rapport à l'activité initiale après 2 semaines, en particulier les enzymes de Pseudomonas aeruginosa NCTC A7244 et IFO 13130 ont présenté une baisse d'activité à une valeur inférieure à 30 %. Donc les L-carnitine déshydrogénases connues sont instables et un réactif de détermination de la L-carnitine utilisant une telle enzyme convient
mal par suite de son instabilité.
La demanderesse a donc tenté de découvrir une L-carnitine déshydrogénase stable, conservant plus de 50 % de son activité à 5 C dans une solution tampon pendant 2 semaines par rapport à l'activité initiale. La demanderesse a découvert qu'un microorganisme du genre Alcaligenes, appartenant à la souche n 981 isolée d'un échantillon de sol d'un champ de pommes de terre à Gojo-shi, préfecture de Nara, Japon, produit une Lcarnitine déshydrogénase ayant la stabilité
souhaitée en solution.
Un but de l'invention est de fournir une L-carnitine déshydrogénase stable, ayant la propriété de conserver au moins plus de 70 % de son activité après traitement avec une solution de tampon Tris-HCl à pH 9,0 à une température inférieure à environ 5 C pendant
environ i semaine par rapport à son activité précédant le traitement.
Un autre but de l'invention est de fournir un procédé pour la production de L-carnitine déshydrogénase qui comprend la culture d'un microorganisme producteur de L-carnitine déshydrogénase appartenant au genre Alcaligenes dans un milieu nutritif et l'isolement de la
L-carnitine déshydrogénase de ce milieu.
Sur les dessins: La figure i illustre la stabilité thermique de la Lcarnitine
déshydrogénase de l'invention.
La figure 2 indique la température optimale de l'enzyme de l'invention. La figure 3 indique la stabilité en fonction du pH de
l'enzyme de l'invention.
La figure 4 indique le pH optimal de l'enzyme de l'invention.
La figure 5 illustre la stabilité de la L-carnitine déshydrogénase obtenue à partir de microorganismes connus et de celle
de l'invention en solution aqueuse.
L'invention va maintenant être décrite de façon détaillée.
Une souche utilisée dans l'invention appartient au genre Alcaligenes et la souche n 981 isolé par la demanderesse est un
exemple préférable du microorganisme.
Les propriétés taxonomiques de la souche sont indiquées ci-après: Pour identifier une souche bactérienne utilisée dans l'invention, on se reporte pour les expériences de détermination à "A Manual for Medical bacteria (2ème Ed.)" et "Microbiological Methods (Vol. 3)" et on utilise à titre consultatif le Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (8ème Ed.) et le Bergey's Manual of
Systematic Bacteriology Vol. 1 (1984) et Vol. 2 (1986).
(a) Propriétés morphologiques: Les observations des cultures pendant 18 à 24 heures entre 28
et 30 C sur gélose nutritive sont les suivantes.
Bacille à bord arrondi droit ou légèrement courbe, isolé, en paires ou en chaîne courte. Pas de formation de spores. Les dimensions sont 0,4-0,6 x 1,2-2,5 pm. Mouvement péritriche. Pas de polymorphisme. (b) Croissance sur divers milieux: Les observations des cultures de 18 & 24 heures entre 28 et 30 C sur divers milieux sont les suivantes. 1. Gélose nutritive inclinée:
Bonne culture filiforme.
Humide, luminescente. Ocre sans formation de pigment soluble. 2. Boite de gélose nutritive: Colonies rondes, convexes et entières. Surface lisse
humide. Ocre ou ocre pâle.
Pas de formation de pigment soluble.
3. Milieu liquide (eau peptonée): Bonne culture avec trouble uniforme. Formation d'une
pellicule sur les cultures de plus de 40 heures.
4. Lait au pourpre de bromocrésol:
Alcalin apres 4 à 5 jours.
(c) Propriétés physiologiques:
[+: positive, (+): faiblement positive, -: négative].
Coloration de Gram Réaction à KOH + Formation d'une capsule Acidorésistance Test OF (Hugh et Leifson) Pas de changement Test OF (Source d'azote: NH4 H2PO4) O (oxydation) Croissance aérob-ie + Croissance anaérobie
Température de croissance: 41 C -
37 C +
C +
Tolérance au sel, % de concentration de NaCl
0 % +
% +
7%
pH de croissance pH 4,6 -
pH 5,4 + pH 8,9 + pH 9,8 Hydrolyse de la gélatine Hydrolyse de l'amidon Hydrolyse de la caséine
Hydrolyse de l'esculine -
Hydrolyse de la cellulose Hydrolyse de la tyrosine Production de catalase + Production d'oxydase + Réaction LV Production d'uréase (SSR) Production d'uréase (Chris.) Production d'indole Production d'H2S (détection: papier à l'acétate de plomb) Production d'acétoïne (K2HP04) Production d'acétoïne (NaCl) Test au rouge de méthyle Réduction de nitrate Détection de gaz + Détection de NO2 Détection de N03 Utilisation sur milieu de Simmons Citrate + Malate + Maléate Malonate (+) Propionate Gluconate Succinate + Utilisation sur milieu de Christensen Citrate + Malate + Maléate + Malonate + Propionate Gluconate + Succinate + Production de gaz à partir du glucose Formation d'acice à partir de sucres Adonitol L(+) arabinose (+) Cellobiose Dulcitol Méso-érythritol Fructose Galactose + Glucose + Glycérine (+)
Inositol -
Inuline -
Lactose -
Maltose -
Mannitol -
Mannose +
Mélézitose -
Mélibiose -
Raffinose -
L(+) rhamnose -
D-ribose -
Salicine -
L-sorbose Sorbitol Amidon Saccharose Xylose Tréhalose
Accumulation de poly-p-hydroxy-
butyrate (d) Utilisation de sources de carbone: Milieu d'essai: milieu liquide (pH 7,0) contenant 5 g de source de carbone, 5 g de NaCl, 0,2 mg de MgSO4.7H2O, 1,0 g de
NH4H2PO4 et eau distillée 1 litre. Les résultats sont les suivants.
Glucose + L(+)arabinose Fructose + Mannitol Mannose + Gluconate + Acétate + Adipate Pimélate + Subérate + Tartrate + Selon les propriétés taxonomiques ci-dessus, le microorganisme a les caractéristitiques d'un bacille Gram négatif, c'est-à-dire mouvement péritriche, production de catalase, production d'oxydase, pas de production d'acide à partir du glucose dans le milieu de Hugh et Leifson qui contient une peptone, décomposition par oxydation du glucose et formation d'acide. Il n'y a pas de formation
de spores ni de polymorphisme et le microorganisme est aérobie.
Les bacilles Gram négatif ayant un mouvement péritriche appartiennent à trois genres, Alcaligenes, Chromobacterium et Flavobacterium. Chromobacterium produit un pigment violet, Flavobacterium produit un pigment jaune, tandis que la présente souche ne produit pas de pigment. Donc, la présente souche est un Alcaligenes. Les propriétés taxonomiques d'Alcaligenes par rapport à celles de la présente souche, selon le Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. i (1984), sont illustrées par comparaison d'Alcaligenes faecalis (désigné ci-après par l'abréviation F), Alcaligenes denitrificans (désigné ci-après par l'abréviation D) et Alcaligenes denitrificans subsp. xylosoxidans (désigné ci-après par l'abréviation X), comme suit:
+: positif avec une probabilité supérieure à 90 %.
-: négatif avec une probabilité supérieure à 90%.
d: non identifié comme + ou -.
F D X Présente souche Production d'oxydase + + + + Réduction des nitrates - + + + Réduction des nitrites + + + +
Hydrolyse de la gélatine - - - -
Formation d'acide dans le milieu OF Xylose - - + Glucose - - + Formation d'acide dans un milieu sans peptone
Xylose + -
Glucose + + Utilisation de sources de carbone Glucose - - + +
L(+)arabinose - - - -
Fructose - - d +
Mannitol - - - -
Mannose - - d + Gluconate - + + + Acétate + + + + Selon la comparaison cidessus, la présente souche n 981 présente de nombreuses propriétés identiques, mais des différences spécifiques en ce qui concerne la formation d'acide dans le milieu OF et la formation d'acide à partir du xylose. Par conséquent, la présente souche a été appelée Alcaligenes sp. n 981 et a été déposée le 29 août 1989 au Fermentation Research Institute et a reçu la dénomination-FERM BP-2570. Dans le procédé de l'invention, on cultive dans un milieu des microorganismes producteurs de L-carnitine déshydrogénase appartenant
au genre Alcaligenes.
Un exemple préféré des microorganismes est l'Alcaligens sp.
n0 981 mentionné ci-dessus. Comme les propriétés taxonomiques des microorganismes varient généralement facilement, on peut également utiliser dans l'invention des microorganismes mutants naturels ou artificiels, obtenus par exemple par mutation sous l'effet des rayons ultraviolets, d'un rayonnement ou d'agents chimiques mutagènes, tels que la N-méthyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine ou le méthanesulfonate d'éthyle, ces microorganismes appartenant au genre Alcaligenes et
étant capables de produire de la L-carnitine déshydrogénase.
On peut effectuer une culture bactérienne classique. Comme la production de L-carnitine déshydrogénase peut être induite par addition de carnitine, on cultive de préférence dans un milieu
contenant de la carnitine.
En plus de la carnitine, le milieu peut contenir les substances nutritives classiques pour la culture des microorganismes, telles qu'une source de carbone assimilable, une source d'azote
digestible et, le cas échéant, des sels minéraux.
Des exemples des sources de carbone assimilable sont le glucose, le fructose, le saccharose et la mélasse, isolément ou en combinaison. Des sources d'azote digestible sont par exemple la peptone, l'extrait de viande, l'extrait de levure ou l'infusion de maïs, isolément ou en combinaison. De plus, le cas échéant, on peut ajouter des sels métalliques, tels que ceux du magnésium, du calcium, du potassium, du sodium, du fer, du manganèse, etc. D'autres sources de carbone et d'azote assimilables connues peuvent également être utilisées. La culture peut être effectuée par culture classique avec agitation ou aération dans des conditions aérobies et, à l'échelle
industrielle, on préfère une culture aérée submergée.
La température de culture peut varier selon la vitesse de croissance des microorganismes et la vitesse de production de la L-carnitine déshydrogénase et elle est de 15 à 37 C, de préférence d'environ 28 C. La durée de culture dépend des conditions et est généralement de 1 à 3 jours. La culture doit être arrêtée au stade de
production maximale de l'enzyme.
Les conditions, telles que la composition et la concentration du milieu de culture, la température de culture, la vitesse d'agitation et le taux d'aération, peuvent être ajustées selon la nature de la souche et les autres conditions. On peut ajouter, au besoin, à une culture liquide des agents antimousses, tels qu'une
huile silicone ou une huile végétale.
La L-carnitine déshydrogénase est présente dans les cellules microbiennes. Par exemple, pour isoler l'enzyme, on traite le milieu de culture par filtration ou centrifugation pour séparer les cellules microbiennes et on traite les cellules bactériennes isolées avec des ultrasons, avec une presse French, par désintégration mécanique avec des perles de verre ou désintégration par congélation, ou on les soumet à une digestion enzymatique avec un lysozyme, pour obtenir une solution brute de Lcarnitine déshydrogénase. On peut obtenir la L-carnitine déshydrogénase à partir de la solution enzymatique brute de façon connue pour l'isolement et la purification des protéines et des enzymes. Par exemple, on peut utiliser le procédé de précipitation par relargage par addition de sulfate d'ammonium, de sulfate de sodium ou de phosphate de potassium à la solution brute contenant la L-carnitine déshydrogénase. De plus, le précipité peut être purifié, le cas échéant, par emploi d'un tamis moléculaire, par chromatographie, par électrophorèse ou par ultracentrifugation. On peut, pour la purification, utiliser les propriétés physico-chimiques de la L-carnitine déshydrogénase. Par exemple, on dissout l'enzyme précipitée dans de l'eau ou une solution tampon, on dialyse, le cas échéant, avec une membrane semi-perméable et on soumet à une chromatographie d'échange d'ions en utilisant de la DEAEcellulose, du DEAE-Sephacel, du DEAE-Sepharose, du DEAE-Sephadex A-50 (Pharmacia Corp.) ou du DEAE-Toyopearl (Toyosoda Co.), ou un dispositif de tamisage moléculaire, tel que la filtration sur gel avec du Sephadex G100 ou G-75 ou du Sephacryl S-200. Ces moyens peuvent être combinés. On peut lyophiliser une poudre purifiée de L-carnitine déshydrogénase additionnée d'un stabilisant, par exemple un sucre, tel que le mannitol, le saccharose ou le sorbitol, un amino-acide, tel que l'acide glutamique ou la glycine, ou un peptide ou une
protéine telle que la sérum-albumine bovine.
La L-carnitine déshydrogénase obtenue a les propriétés suivantes: (1) Action enzymatique: L'enzyme catalyse au moins une réaction de la Lcarnitine et du NAD+ pour produire de la 3-déshydrocarnitine et du NADH comme
indiqué ci-dessous.
- OOCCHz-CH-CHzN + (CH3)3 + NAD+ OH L-carnitine = - OOCClIIz-C-C[zN t (CH3)3 + NADH + H+ 3-déshydrocarnitine (2) Spécificité relative au substrat: L-carnitine 100 % Choline 0 Glycinebétaine 0 Glucose 0 Lysine 0 (3) Poids moléculaire:
51 000 6 000
Mesuré avec du TSK-gel G3000 SW (Toso Co., 0,75 x 60 cm) Elution: tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) contenant 0,2 M
de NaCl.
Etalons: on utilise les marqueurs moléculaires suivants (Oriental yeast Co.) PM 12 400 cytochrome C PM 32 000 adénylate kinase PM 67 000 énolase PH 142 000 lactate déshydrogénase PM 290 000 glutamate déshydrogénase (4) Point isoélectrique: pH 5,3 0,6 Mesuré par électrofocalisation avec un support ampholyte à 4 C, 700 V, pendant 40 heures. On mesure l'activité
enzymatique de chaque fraction.
(5) Km: 0,141 mM (NAD+), 9,3 mM (L-carnitine) On mesure la Km pour le NAD+ dans diverses concentrations de NAD+ dans un mélange réactionnel constitué de: 100 mM de tampon Tris-HCl (pH 9,0) U de diaphorase (Toyo Jozo Co.) 0,025 % de NBT (Wako Pure Chem. Co.) 1 % de Tween 80 (Wako Pure Chem. Co.), et
mM de L-carnitine.
Dans le mélange réactionnel, on remplace les 50 mM de L-carnitine par 1 mM de NAD+ et on fait varier la concentration de la
L-carnitine pour mesurer la Km relative à la L-carnitine.
Les résultats figurent ci-dessus.
(6) Stabilité thermique: On dissout l'enzyme à 1,00 U/ml dans du tampon Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) et on incube pendant 1 heure à diverses températures et on
mesure l'activité résiduelle.
Les résultats sont illustrés par la figure 1 et montrent que
l'enzyme est stable jusqu'à 45 C.
(7) Température optimale: On mesure l'activité enzymatique respectivement à 35, 40, 45, , 55 et 60 C dans du tampon Tris-HCl 100 mM (pH 9,0) selon la méthode d'analyse indiquée ci-après. On arrête la réaction après minutes d'incubation par addition de 2 ml d'HCl 0,1 N, puis on mesure l'absorption optique à 550 nm. Comme le montre la figure 2,
l'enzyme présente une activité maximale à 50 C.
(8) Stabilité relative au pH: On mesure l'activité résiduelle de l'enzyme (solution à 1 U/ml dans du tampon 40 mM) après chauffage à 45 C pendant 30 minutes. Comme le montre la figure 3, l'enzyme est stable à un pH de 8, 0-9,0, l'activité résiduelle étant supérieure à 95 %. Sur cette figure: à- = tampon acétate, pH 5,66,0; -O- = tampon phosphate, pH 6,0e8,0; -- = tampon Tris-HCl, pH 9,010,0 et -a- = tampon
glycine-NaOH, pH 9,0-10.
(9) pH optimal: environ pH 9,0, comme le montre la figure 4.
Dans une méthode de détermination de l'activité enzymatique, illustrée ciaprès, on remplace les 100 mM de tampon Tris-HCl d'un mélange réactionnel par 100 mM de tampon phosphate (pH 6,5-7,5, -o-), mM de tampon Tris-HCl (pH 8,0-9,0, -e-) ou 100 mM de tampon glycine-NaOH (pH 9,010,0, -o-) et on incube à 37 C pendant minutes. On arrête la réaction par addition d'HCl 0,1 N et on
mesure l'absorption à 550 nm.
Comme le montre la figure 4, on observe une activité maximale
à environ pH 9,0.
(10) Stabilité à long terme en solution aqueuse: On mesure la stabilité de L-carnitine déshydrogénases de diverses origines dans du tampon Tris- HCl 50 mM (pH 9,0, 10 U/ml) à
C pendant une période de stockage de 2 semaines.
Le résultat est indiqué sur la figure 5 (-o-: L-carnitine déshydrogénase de Pseudomonas aeruginosa IFO 13130); --: Pseudomonas aeruginosa NCTC A 7244; --: Xanthomonas translucens IFO 13558; -O-: Alcaligenes sp. n 981, et ---: L-carnitine déshydrogénase d'Alcaligenes sp. n 981 additionnée de 0,05 mM de NAD+). La L-carnitine déshydrogénase provenant des trois premières souches connues précitées conserve une activité résiduelle de 53 à % après une semaine de stockage et inférieure à 45 % après 2 semaines. En particulier, l'enzyme de Pseudomonas aeruginosa IFO 13130 présente la plus faible activité résiduelle de 21 %. La L-carnitine déshydrogénase de la présente invention présente une activité résiduelle de 96 % après une semaine et de 82 % après 2 semaines, ce qui révèle une stabilité supérieure par rapport aux enzymes provenant des microorganismes connus. Les résultats montrent également que l'enzyme additionnée de 0,05 mM de NAD+ a une activité résiduelle de 99,7 % après une semaine et de 95,1 % après 2 semaines, ce qui révèle l'effet stabilisant supérieur de l'addition de NAD+. (11) Méthode de détermination de l'activité de la L-carnitine déshydrogénase: 1. Mélange réactionnel: mM de tampon Tris-HCl (pH 9,0) l mM de NAD+ U de Diaphorase (Toyo Jozo Co.) 0,05 % de NBT (Wako Pure Chem. Co.) mM de KCl 0,5 % de polyoxyéthylène(20)sorbitan-monooléate (Wako Pure Chem. Co.) mM de L- carnitine (Sigma Chem. Co.) 2. Essai de l'enzyme: On incube 1 ml du mélange réactionnel ci-dessus dans un petit tube à essai à 37 C pendant 5 minutes. On ajoute 0,02 ml de solution diluée d'enzyme et on agite pour déclencher la réaction. Apres exactement 10 minutes, on ajoute 2,0 ml d'HCl 0,1 N et on agite pour arrêter la réaction. On mesure l'absorption à 550 nm (>50 nm) pour obtenir l'absorption A1. On traite également, de la même façon, le mélange réactionnel ci-dessus sans addition de L- carnitine et on
mesure son absorption A0.
3. Calcul de l'activité enzymatique:
(A1 - A0) 1 3,02
U/ml = X -X X Z
21,7 10 0,02
dans laquelle 21,7: coefficient d'absorption moléculaire cm2/pmol
Z: taux de dilution.
Effet de l'invention La L-carnitine déshydrogénase de l'invention, provenant d'Alcaligenes sp. n 981, présente une stabilité à long terme dans une solution aqueuse telle que du tampon Tris-HCl (pH 9,0) à 5 C, l'activité résiduelle étant de 96 % après une semaine et de 80 % après 2 semaines. Par conséquent, c'est une enzyme stable dont la stabilité est telle que plus de 70 % de l'activité demeurent après une semaine de traitement avec du tampon Tris-HCl (pH 9,0) au-dessous de 5 C par rapport à l'activité avant le traitement. L'enzyme a également une stabilité au stockage en solution aqueuse supérieure à celle d'une enzyme provenant d'une souche bactérienne connue. On peut
donc préparer un réactif stable pour l'analyse de la L-carnitine.
Egalement, l'enzyme de la présente invention présente une dénaturation moindre lors des opérations d'isolement et de purification et, par conséquent, est très facile à purifier, ce qui fournit un procédé avantageux de production de la L-carnitine déshydrogénase. L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants. ExemDile 1 (i) Culture d'Alcaligenes sp. n 981 Chlorhydrate de DL-carnitine (Sigma Chem. , Co.) 3,0 %
KIH2PO4 0,2 %
MgSO4 7H20 0,05 % FeSO4 '7H20 0,002 % MnSO4 nH20 0,001 % pH 7,0 On stérilise à 120 C pendant 20 minutes 100 ml d'un milieu
liquide ayant la composition ci-dessus dans un erlenmeyer de 500 ml.
On ensemence le milieu avec une anse d'Alcaligenes sp. n 981 et on cultive le milieu à 28 C et 120 tr/min pendant 40 heures pour obtenir
95 ml d'une masse cultivée (activité enzymatique: 1,2 U/ml).
(ii) Chlorhydrate de DL-carnitine (Sigma Chem. Co) 3,0 % Extrait de levure (Kyokuto Seiyaku Co.) 0,1 %
K2HPO4 0,054 %
KH2PO4 0,746 %
MgSO4 7H2o 0,05 % CaC1z2 À2H20 0,002 % FeSO4'7H2O (pH 7,0) 0,002 % MnSO4nH20 0,002 % Antimousse CB 442 (Nihon Ushi Co.) i ml/J pH 7,0 On stérilise par chauffage 20 1 du milieu liquide ayant la composition cidessus dans un fermenteur de 30 1. On ensemence avec 90 ml de l'inoculum obtenu en (i) ci-dessus et on cultive le mélange à 28 C avec une aération de 20 1/min, une pression intérieure de 0,4 bar et une agitation de 200 tr/min pendant 27 heures pour obtenir
19 1 d'une masse cultivée (activité enzymatique: 3,0 U/ml).
Exemple 2
Purification de l'enzyme: On met les cellules bactériennes, recueillies par centrifugation à partir du bouillon de culture (19 1) obtenues par culture de (ii) de l'exemple 1, en suspension dans 5 1 de tampon Tris-HCl 40 mM (pH 8,0), on mélange avec 0,1 % de lyzozyme, on ajoute 15 ml de sel disodique de i'EDTA et on solubilise à 37 C pendant 1 heure; on centrifuge ensuite le mélange pour séparer le précipité et obtenir 4 500 ml d'une solution surnageante (activité: ,3 U/ml). On ajoute 1 100 g de sulfate d'ammonium à la solution surnageante, on mélange soigneusement par agitation, puis on centrifuge pour séparer le précipité. On rajoute 700 g de sulfate d'ammonium à la suspension surnageante pour dissoudre le précipité et on centrifuge la solution pour obtenir un précipité. On dialyse le précipité dissous dans 500 ml de tampon Tris-HCl 40 mM (pH 8,0) (activité spécifique: 84,1 U/ml) contre 10 litres de tampon Tris-HCl 40 mM (pH 8,0). On applique la solution d'enzyme dialysée à une colonne de 200 ml de DEAE-Sepharose CL-6B (Pharmacia Co.) que l'on a tamponnée avec du tampon Tris-HCl 40 mM (pH 8,0), on lave avec 1 litre de tampon Tris- HCl 40 mM contenant 0,1 M de KCl (pH 8,0) et on élue avec du tampon Tris- HCl 40 mM contenant 0,3 M de KCl (pH 8,0) pour obtenir 300 ml de solution d'enzyme (activité spécifique: ,5 U/ml). On dialyse la solution d'enzymecontre 10 litres de tampon Tris-HCl 40 mM (pH 8,0). On applique le produit dialysé à une colonne de 100 ml d'hydroxy-apatite (KOKEN Co.), on lave avec 200 ml de tampon Tris-HCl 40 mM (pH 8,0), puis on élue avec 100 ml de tampon phosphate 2 mM (pH 7,0) pour obtenir 100 ml de solution d'enzyme (activité spécifique: 331 U/ml). On dialyse la solution d'enzyme ainsi obtenue contre 5 litres de tampon phosphate 20 mM (pH 7,5) pour obtenir 95 ml d'une solution d'enzyme (activité spécifique:
331 U/ml; récupération: 67,8 %).
La L-carnitine déshydrogénase purifiée présente une activité
NADH oxydasique inférieure à 0,0001 U/ml.
Claims (4)
1. L-carnitine déshydrogénase stable, caractérisée en ce qu'elle conserve au moins plus de 70 % de son activité après traitement avec une solution de tampon Tris-HCl à pH 9,0 au-dessous d'environ 5 C pendant environ une semaine par rapport à son activité
avant le traitement.
2. L-carnitine déshydrogénase selon la revendication 1, qui est une enzyme produite par un microorganisme producteur de
L-carnitine déshydrogénase appartenant au genre Alcaligenes.
3. Procédé pour la production de L-carnitine déshydrogénase, caractérisé en ce qu'il comprend la culture d'un microorganisme producteur de Lcarnitine déshydrogénase appartenant au genre Alcaligenes dans un milieu nutritif et l'isolement de la L-carnitine
déshydrogénase ainsi produite à partir de la masse cultivée.
4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel le microorganisme producteur de L-carnitine déshydrogénase est
Alcaligenes sp. n 981 FERM BP-2570.
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