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CN110903350A - 一种普卡那肽的固相合成方法 - Google Patents

一种普卡那肽的固相合成方法 Download PDF

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Publication number
CN110903350A
CN110903350A CN201911373333.8A CN201911373333A CN110903350A CN 110903350 A CN110903350 A CN 110903350A CN 201911373333 A CN201911373333 A CN 201911373333A CN 110903350 A CN110903350 A CN 110903350A
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CN
China
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fmoc
cys
leu
resin
val
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Pending
Application number
CN201911373333.8A
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English (en)
Inventor
康艳萍
刘磊
张才荣
杨代胜
王浩
戚建英
王晶翼
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Sichuan Kelun Pharmaceutical Research Co Ltd
Sichuan Kelun Pharmaceutical Research Institute Co Ltd
Original Assignee
Sichuan Kelun Pharmaceutical Research Institute Co Ltd
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Publication date
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
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Abstract

本发明公开了一种适合工业化制备普卡那肽的方法，通过引入特殊保护的氨基酸和/或保护的二肽来固相合成普卡那肽，例如：假脯氨酸二肽、Dmb二肽、Dmb/Hmb/Fmoc‑Hmb/Hnb/Hmsb/Mmsb/Mmtb保护的氨基酸等，解决了常规固相方法合成普卡那肽时，后续氨基酸偶联愈加困难的问题，从而提高了粗肽的纯度与收率；尤其在Ala11位置引入了上述保护氨基酸，纯度与收率兼能提高，粗肽的收率能达到95％，纯度能达到80％以上。

Description

一种普卡那肽的固相合成方法
技术领域
本发明涉及多肽制药领域，尤其涉及一种多肽化合物普卡那肽的固相合成方法。
背景技术
慢性特发性便秘(CIC)和肠易激综合征伴便秘(IBS-C)是影响胃肠道的两种最常见的疾病，这些疾病的特点是大便次数减少、紧张、腹痛或不适。我国成人慢性便秘，包括CIC、功能性排便障碍及IBS-C等，患病率4％-6％，就诊0.1亿-0.15亿。慢性便秘可继发精神心理障碍，对患者生活质量损害程度与糖尿病、心衰等慢性疾病相当。
普卡那肽(plecanatide)由美国Synergy制药公司研发，为含有16个氨基酸的环状多肽，能调节胃肠道中的酸碱离子，诱导液体转运进入胃肠道，增加胃肠道的蠕动，适用于治疗成人慢性特发性便秘。美国食品药品管理局(FDA)于2017年1月19日批准上市，商品名为Trulance。其结构式如下：
Figure BDA0002340285540000011
目前，普卡那肽主链的合成方法主要分为片段法和固相合成法。CN201280021221.6采用片段法，通过片段之间液相缩合形成主链，该方法需要提前制备2个以上的片段，且片段之间液相缩合后处理繁琐，工业化生产步骤多，成本高。对于含有16个氨基酸的短肽，利用固相合成法制备普卡那肽相对于片段法具有操作简单，易于自动化等优点，因此往往采用常规的保护氨基酸进行固相顺序偶联进行合成。但是，经分析普卡那肽的肽链后，本发明人发现，该肽链的空间位阻较大，使用固相常规方法偶联，后续氨基酸偶联愈加困难，从而产品收率低，原料大量浪费，并不适合工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于采用特殊保护的氨基酸和/或保护的二肽来固相合成普卡那肽，例如：假脯氨酸二肽、Dmb二肽、Dmb/Hmb/Fmoc-Hmb/Hnb/Hmsb/Mmsb/Mmtb保护的氨基酸等，来解决使用常规固相方法合成普卡那肽时，后续氨基酸偶联愈加困难的问题，从而提高了粗肽的纯度与收率。
本发明提供了一种制备普卡那肽的方法。普卡那肽序列是16个氨基酸单元长度，普卡那肽序列N-末端到C-末端的顺序为H-Asn1-Asp2-Glu3-Cys4-Glu5-Leu6-Cys7-Val8-Asn9-Val10-Ala11-Cys12-Thr13-Gly14-Cys15-Leu16-OH；二硫键(4-12)和(7-15)。
本发明提供了一种制备普卡那肽的方法，包括如下步骤：
(1)将树脂固相载体和Fmoc-Leu-OH偶联，得到Fmoc-Leu-树脂后，脱除Fmoc保护基；得到H-Leu-树脂；
(2)通过固相合成法，在偶联剂系统的存在下，按普卡那肽序列由碳端向氮端依次将保护氨基酸和/或保护的二肽偶联到H-Leu-树脂上，制备得到线性普卡那肽的肽树脂；所述，普卡那肽序列从N-末端到C-末端的顺序为H-Asn1-Asp2-Glu3-Cys4-Glu5-Leu6-Cys7-Val8-Asn9-Val10-Ala11-Cys12-Thr13-Gly14-Cys15-Leu16-OH；二硫键(4-12)和(7-15)；
其中，所述在普卡那肽序列的Leu6、Val8、Val10、Ala11、Gly14或Leu16中的一个或多个位置的保护氨基酸选自Dmb保护的氨基酸、Hmb保护的氨基酸、Fmoc-Hmb保护的氨基酸、Hnb保护的氨基酸、Hmsb保护的氨基酸、Mmsb保护的氨基酸、Mmtb保护的氨基酸中的一种或多种；
和/或，所述普卡那肽序列的Glu3-Cys4、Glu5-Leu6、Leu6-Cys7、Cys7-Val8、Asn9-Val10、Val10-Ala11、Ala11-Cys12、Cys12-Thr13、Thr13-Gly14或Gly14-Cys15中的一个或多个保护的二肽选自假脯氨酸二肽或Dmb二肽；
(3)线性普卡那肽的肽树脂经裂解，制得线性普卡那肽，再经液相环化，即得普卡那肽。
在一些实施方案中，步骤(1)中所述脱除Fmoc保护基的试剂由体积比为1:1～10的哌啶和DMF组成；优选地，所述脱除Fmoc保护基的试剂由体积比为1:4的哌啶和DMF组成。
在一些实施方案中，步骤(2)中所述Cys的侧链保护基团包括Trt、Mmt、tBu、StBu、Acm、Npys或Cys的侧链形成假脯氨酸结构，其中4和12位的保护基团不同于7和15位；优选地，所述Cys的侧链保护基团选自Trt和Acm保护基。
在一些实施方案中，步骤(2)中Leu6和/或Leu16位置的保护氨基酸选自Fmoc-(Dmb)Leu-OH、Fmoc-(Hmb)Leu-OH、Fmoc-(Fmoc-Hmb)Leu-OH、Fmoc-(Hnb)Leu-OH、Fmoc-(Hmsb)Leu-OH、Fmoc-(Mmsb)Leu-OH或Fmoc-(Mmtb)Leu-OH；
和/或，Val8和/或Val10位置的保护氨基酸选自Fmoc-(Dmb)Val-OH、Fmoc-(Hmb)Val-OH、Fmoc-(Fmoc-Hmb)Val-OH、Fmoc-(Hnb)Val-OH、Fmoc-(Hmsb)Val-OH、Fmoc-(Mmsb)Val-OH或Fmoc-(Mmtb)Val-OH；
和/或，Ala11位置的保护氨基酸选自Fmoc-(Dmb)Ala-OH、Fmoc-(Hmb)Ala-OH、Fmoc-(Fmoc-Hmb)Ala-OH、Fmoc-(Hnb)Ala-OH、Fmoc-(Hmsb)Ala-OH、Fmoc-(Mmsb)Ala-OH或Fmoc-(Mmtb)Ala-OH；
和/或，Gly14位置的保护氨基酸选自Fmoc-(Dmb)Gly-OH、Fmoc-(Hmb)Gly-OH、Fmoc-(Fmoc-Hmb)Gly-OH、Fmoc-(Hnb)Gly-OH、Fmoc-(Hmsb)Gly-OH、Fmoc-(Mmsb)Gly-OH或Fmoc-(Mmtb)Gly-OH；
和/或，Glu3-Cys4保护的二肽为Fmoc-Glu(OtBu)-Cys(ΨMe,Mepro)-OH；
和/或，Glu5-Leu6保护的二肽为Fmoc-Glu(OtBu)-(Dmb)Leu-OH；
和/或，Leu6-Cys7保护的二肽为Fmoc-Leu-Cys(ΨMe,Mepro)-OH；
和/或，Cys7-Val8保护的二肽选自Fmoc-Cys(Trt)-(Dmb)Val-OH或Fmoc-Cys(Acm)-(Dmb)Val-OH；
和/或，Asn9-Val10保护的二肽为Fmoc-Asn(Trt)-(Dmb)Val-OH；
和/或，Val10-Ala11保护的二肽为Fmoc-Val-(Dmb)Ala-OH；
和/或，Ala11-Cys12保护的二肽为Fmoc-Ala-Cys(ΨMe,Mepro)-OH；
和/或，Cys12-Thr13保护的二肽选自Fmoc-Cys(Acm)-Thr(ΨMe,Mepro)-OH或Fmoc-Cys(Trt)-Thr(ΨMe,Mepro)-OH；
和/或，Thr13-Gly14保护的二肽为Fmoc-Thr(tBu)-(Dmb)Gly-OH；
和/或，Gly14-Cys15保护的二肽为Fmoc-Gly-Cys(ΨMe,Mepro)-OH。
在一些实施方案中，步骤(2)中所述的偶联剂系统包括缩合剂和反应溶剂，所述缩合剂选自HBTU/DIEA、HATU/DIEA、HBTU/HOBt/DIEA、HCTU/NMM、HATU/HOAt/DIEA、TBTU/DIEA、HOBt/DIC、HOAt/DIC、Cl-HOBt/DIC、PyBOP/HOBt/DIEA、PyAOP/HOBt/DIEA和Oxyma/DIC中的一种或多种，所述反应溶剂选自DMF、DCM、NMP和DMSO中的一种或多种；优选地，所述缩合剂为HOBt/DIC，反应溶剂为DMF。
在一些实施方案中，步骤(3)所述的裂解采用的裂解试剂是由TFA、TIS、H2O、EDT、苯甲硫醚、苯酚和对甲苯酚中的2种或2种以上组成的混合溶液；优选地，所述的裂解试剂由体积比为74～96:1～7:1～7:1～7：1～5的TFA、苯酚、苯甲硫醚、H2O和EDT组成的混合溶液；或者所述的裂解试剂由体积比为90～95:1～5:1～5:1～5的TFA、TIS、H2O和EDT组成的混合溶液；或者所述的裂解试剂由体积比为85～95:1～5:2～8:2～8的TFA、TIS、H2O和对甲苯酚组成的混合溶液；或者所述的裂解试剂由体积比为85～95:1～5:2～8:2～8的TFA、TIS、H2O和苯甲硫醚组成的混合溶液；
更优选地，所述的裂解试剂由体积比为82.5：5：5：5：2.5的TFA、苯酚、苯甲硫醚、H2O和EDT组成的混合溶液；或者所述的裂解试剂由体积比为92:3:3:2的TFA、TIS、H2O和EDT组成的混合溶液；或者所述的裂解试剂由体积比为88：2:5:5或90:2:5:3的TFA、TIS、H2O和对甲苯酚组成的混合溶液；或者所述的裂解试剂由体积比为88：2:5:5的TFA、TIS、H2O和苯甲硫醚组成的混合溶液。
在一些实施方案中，步骤(3)所述的液相环化的方法包括：将线性普卡那肽溶解，氧化形成两对二硫键，得普卡那肽。
在一些实施方案中，所述溶解线性普卡那肽的溶剂选自MeOH、ACN、EtOH、i-PrOH或其水溶液中的一种或几种组成的混合溶剂，所述氧化形成两对二硫键的步骤中使用的氧化剂选自空气、O2、H2O2、GSSH、GSH、DMSO和碘中的一种或多种；优选地，所述溶解线性普卡那肽的溶剂为10％MeOH、10％ACN或15％EtOH，所述氧化形成两对二硫键的步骤中所用的氧化剂为DMSO、碘或H2O2。
在一些实施方案中，所述的固相合成方法为Fmoc固相合成，固相合成在Wang树脂或2-氯三苯甲基树脂上进行；优选地，所述Wang树脂取代度为0.4～1.0mmol/g；所述2-氯三苯甲基树脂取代度为0.7-1.1mmol/g。
在一些实施方案中，所述步骤(3)中经液相环化后还包括纯化的步骤。
本发明通过引入特殊保护的氨基酸和/或保护的二肽来固相合成普卡那肽，例如：假脯氨酸二肽、Dmb二肽、Dmb/Hmb/Fmoc-Hmb/Hnb/Hmsb/Mmsb/Mmtb保护的氨基酸等，解决了常规固相方法合成普卡那肽时，后续氨基酸偶联愈加困难的问题，从而提高了粗肽的纯度与收率；尤其在Ala11位置引入了上述保护氨基酸，纯度与收率兼能提高，粗肽的收率能达到95％，纯度能达到80％以上。
具体实施方式
本发明采用的试剂或原料皆为普通市售品，皆可于市场购得。
其中，本发明采用试剂的中英文名称对照如表1所示：
表1本发明采用试剂的中英文名称对照
Figure BDA0002340285540000061
Figure BDA0002340285540000071
Figure BDA0002340285540000081
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实验例1：一种线性普卡那肽的制备
(1)线性普卡那肽肽树脂的制备
称取6.03g取代度为0.83mmol/g的Wang树脂加入多肽反应器中，同时加入60mlDCM洗涤并溶胀树脂1小时。称取Fmoc-Leu-OH(7.5mmol，2.65g)，DMAP(0.5mmol，0.06g)，加42ml溶剂(DCM:DMF＝2:1)溶解，加入DIC(10mmol，1.6ml)活化后将溶解后的反应液加入至树脂中，25℃反应4小时。反应完成后，排干溶液，分别使用60ml DMF洗涤树脂2次后，再分别用60ml DCM溶液洗涤树脂2次。洗涤完成后，往树脂中加入60ml封闭液(DCM:Ac2O:吡啶＝90:5:5(V：V：V))封闭反应1小时，排干溶液，分别使用60ml DMF溶液洗涤树脂4次，得到Fmoc-Leu-Wang树脂。取少量树脂收缩干燥后，利用紫外分光度法测定哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的取代度为0.58mmol/g。
取Fmoc-Leu-Wang树脂，使用60ml脱除Fmoc的试剂(哌啶：DMF溶液＝1:4(V：V))处理树脂5min后，排干溶液，再用60ml脱除Fmoc的试剂(哌啶：DMF溶液＝1:4(V：V))溶液处理树脂15min，脱除Fmoc保护基，然后分别使用60ml DMF洗涤树脂5次，去除Fmoc副产物以及残余哌啶，以茚三酮法(Kaiser Test)检测判断反应终点，得到H-Leu-树脂。
称取Fmoc-Cys(Acm)-OH(10.48mmol，4.34g)，HOBt(10.48mmol，1.42g)溶解于42mlDMF溶液中，氮气保护条件下将该溶液冰浴至0-5℃，然后加入DIC(11.53mmol，1.8ml)搅拌反应10min。10min后，将反应溶液加入至制备的H-Leu-树脂中，室温反应，反应过程取小样，使用Kaiser Test检测缩合完成情况，1小时反应完全，抽干树脂，分别使用60ml DMF洗涤树脂3次，以Kaiser Test检测判断反应终点。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照普卡那肽主链肽序，依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-(Fmoc-Hmb)Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Boc-Asn(Trt)-OH的偶联。每种氨基酸、HOB每次分别投料10.48mmol，DIC每次投料11.53mmol。偶联完毕，分别用60ml DMF、60ml DCM、60ml MeOH交替洗涤树脂3次，洗涤完成后，将树脂置于真空干燥箱中干燥至恒重，得到线性普卡那肽肽树脂17.91g。
(2)线性普卡那肽的制备
称取步骤(1)得到的线性普卡那肽肽树脂17.91g加入至多肽裂解反应器中，加入180ml预先降温至0℃左右的由体积比为82.5：5：5：5：2.5的TFA、苯酚、苯甲硫醚、水、EDT组成的裂解试剂室温条件下搅拌反应1.5小时。反应完成后，将反应液过滤至1.8L预先降温至-10℃左右的甲基叔丁基醚，有白色固体产生，-10℃下搅拌该白色淤浆物30min，随后将白色淤浆物离心，离心机参数设置为3500r/min，离心5min，离心完成后，弃掉上清液，收集白色淤浆物，加入新鲜的甲基叔丁基醚，重复上述离心过程，收集白色淤浆物，真空干燥至恒重，最终获得白色线性普卡那肽固体6.17g，收率为97.65％，纯度为86.31％。
实验例2、一种线性普卡那肽的制备
(1)线性普卡那肽肽树脂的制备
称取6.05g取代度为1.1mmol/g的CTC树脂加入多肽反应器中，同时加入60ml DCM洗涤并溶胀树脂1小时。称取Fmoc-Leu-OH(7.5mmol，2.65g)加42ml溶剂DCM溶解，加入DIEA(22.5mmol，3.71ml)，向树脂反应液中25℃反应2小时。反应完成后，往树脂中加入3ml甲醇封闭反应1小时，排干溶液，分别使用60ml DMF溶液洗涤树脂4次，得到Fmoc-Leu-CTC树脂。取少量树脂收缩干燥后，利用紫外分光度法测定哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的取代度为0.89mmol/g。
取Fmoc-Leu-CTC树脂，使用60ml脱除Fmoc的试剂(哌啶：DMF溶液＝1:4(V：V))处理树脂5min后，排干溶液，再用60ml脱除Fmoc的试剂(哌啶：DMF溶液＝1:4(V：V))处理树脂15min，脱除Fmoc保护基，然后分别使用60ml DMF洗涤树脂5次，去除Fmoc副产物以及残余哌啶，以茚三酮法(Kaiser Test)检测判断反应终点，得到H-Leu-树脂。
称取Fmoc-Cys(Acm)-OH(12.14mmol，5.04g)，HOBt(12.14mmol，1.64g)溶解于42mlDMF溶液中，氮气保护条件下将该溶液冰浴至0-5℃，然后加入DIC(13.35mmol，2.1ml)搅拌反应10min。10min后，将反应溶液加入至制备的H-Leu-树脂中，室温反应，反应过程取小样，使用Kaiser Test检测缩合完成情况，1小时反应完全，抽干树脂，分别使用60ml DMF洗涤树脂3次，以Kaiser Test检测判断反应终点。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照普卡那肽主链肽序，依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-(Dmb)Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Boc-Asn(Trt)-OH的偶联。每种氨基酸、HOBt每次分别投料12.14mmol，DIC每次投料13.35mmol。偶联完毕，分别用60ml DMF、60ml DCM，60ml MeOH交替洗涤树脂3次，洗涤完成后，将树脂置于真空干燥箱中干燥至恒重，得到线性普卡那肽肽树脂16.86g。
(2)线性普卡那肽的制备
称取步骤(1)所得的线性普卡那肽肽树脂16.86g加入至多肽裂解反应器中，加入169ml预先降温至0℃左右的由体积比为88:2:5:5的TFA、TIS、水、对甲苯酚组成的裂解试剂，室温条件下搅拌反应1.5小时。反应完成后，将反应液过滤至1.69L预先降温至-10℃左右的甲基叔丁基醚，有白色固体产生，-10℃下搅拌该白色淤浆物30min，随后将白色淤浆物离心，离心机参数设置为3500r/min，离心5min，离心完成后，弃掉上清液，收集白色淤浆物，加入新鲜的甲基叔丁基醚，重复上述离心过程，收集白色淤浆物，真空干燥至恒重，最终获得白色线性普卡那肽固体6.67g，收率为94.54％，纯度为83.12％。
实验例3、一种线性普卡那肽的制备
(1)线性普卡那肽肽树脂的制备
称取8.10g取代度为0.62mmol/g的Wang树脂加入多肽反应器中，同时加入80mlDCM洗涤并溶胀树脂1小时。称取Fmoc-Leu-OH(6.5mmol，2.30g)，HOBt(7.5mmol，1.05g)，DMAP(0.75mmol，0.09g)，加54ml溶剂DCM溶解，将溶解后的反应液加入至树脂中，待树脂与反应液搅拌均匀后，向树脂反应液中DIC(7.5mmol，1.2ml)，25℃反应4小时。反应完成后，排干溶液，先分别使用80ml DMF洗涤树脂2次、再分别用80ml DCM溶液洗涤树脂2次。洗涤完成后，往树脂中加入80ml封闭液(DCM:Ac2O:吡啶＝85:7:8(V：V：V))封闭反应1小时，排干溶液，分别使用80ml DMF溶液洗涤树脂4次，得到Fmoc-Leu-Wang树脂。取少量树脂收缩干燥后，利用紫外分光度法测定哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的取代度为0.54mmol/g。
取Fmoc-Leu-Wang树脂，使用80ml脱除Fmoc的试剂(哌啶：DMF溶液＝1:4(V：V))处理树脂5min后，排干溶液，再用80ml脱除Fmoc的试剂(哌啶：DMF溶液＝1:4(V：V))处理树脂15min，脱除Fmoc保护基，然后分别使用80ml DMF洗涤树脂5次，去除Fmoc副产物以及残余哌啶，以Kaiser Test检测判断反应终点，得到H-Leu-树脂。
称取Fmoc-Cys(Acm)-OH(13.06mmol，5.41g)，HOBt(13.06mmol，1.78g)溶解于54mlDMF溶液中，氮气保护条件下将该溶液冰浴至0-5℃，然后加入DIC(14.37mmol，2.25ml)搅拌反应10min。10min后，将反应溶液加入至制备的H-Leu-树脂中，室温反应，反应过程取小样，使用Kaiser Test检测缩合完成情况，1小时反应完全，抽干树脂，分别使用80ml DMF洗涤树脂3次，以Kaiser Test检测判断反应终点，树脂显淡黄色，缩合反应完全。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照普卡那肽主链肽序，依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-(Hmb)Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Boc-Asn(Trt)-OH的偶联。每种氨基酸、HOBt每次分别投料13.06mmol，DIC每次投料14.37mmol。偶联完毕，分别用80ml DMF、80ml DCM，80ml甲醇交替洗涤树脂3次，洗涤完成后，将树脂置于真空干燥箱中干燥至恒重，得到线性普卡那肽肽树脂21.77g。
(2)线性普卡那肽的制备
称取步骤(1)得到的线性普卡那肽肽树脂21.77g加入至多肽裂解反应器中，加入220ml预先降温至0℃左右的由体积比为88:2:5:5的TFA、TIS、水、苯甲硫醚组成的裂解试剂，室温条件下搅拌反应1.5小时。反应完成后，将反应液过滤至2.2L预先降温至-10℃左右的甲基叔丁基醚，有白色固体产生，-10℃下搅拌该白色淤浆物30min，随后将白色淤浆物离心，离心机参数设置为3500r/min，离心5min，离心完成后，弃掉上清液，收集白色淤浆物，加入新鲜的甲基叔丁基醚，重复上述离心过程，收集白色淤浆物，真空干燥至恒重，最终获得白色线性普卡那肽固体7.49g，收率为96.45％，纯度为84.85％。
实验例4、一种线性普卡那肽的制备
(1)线性普卡那肽肽树脂的制备
称取5.52g取代度为0.91mmol/g的Wang树脂加入多肽反应器中，同时加入55mlDCM洗涤并溶胀树脂1小时。称取Fmoc-Leu-OH(7.5mmol，2.65g)，DMAP(1mmol，0.12g)，加39ml溶剂DCM溶解，将溶解后的反应液加入至树脂中，待树脂与反应液搅拌均匀后，向树脂反应液中DIC(102mmol，1.4ml)，25℃反应4小时。反应完成后，排干溶液，先分别使用55mlDMF洗涤树脂4次后、再分别用55ml DCM溶液洗涤树脂4次。洗涤完成后，往树脂中加入55ml封闭液(DCM:Ac2O:吡啶＝85:7:8(V：V：V))封闭反应1小时，排干溶液，分别使用55ml DMF溶液洗涤树脂4次，得到Fmoc-Leu-Wang树脂。取少量树脂收缩干燥后，利用紫外分光度法测定哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的取代度为0.73mmol/g。
取Fmoc-Leu-Wang树脂，使用55ml脱除Fmoc的试剂(哌啶：DMF溶液＝1:4(V：V))处理树脂5min后，排干溶液，再用55ml脱除Fmoc的试剂(哌啶：DMF溶液＝1:4(V：V))处理树脂15min，脱除Fmoc保护基，然后分别使用55ml DMF洗涤树脂5次，去除Fmoc副产物以及残余哌啶，以Kaiser Test检测判断反应终点，得到H-Leu-树脂。
称取Fmoc-Cys(Trt)-OH(12.03mmol，7.05g)，HOBt(12.03mmol，1.63g)溶解于39mlDMF溶液中，氮气保护条件下将该溶液冰浴至0-5℃，然后加入DIC(13.24mmol，2.1ml)搅拌反应10min。10min后，将反应溶液加入至制备的H-Leu-树脂中，室温反应，反应过程取小样，使用Kaiser Test检测缩合完成情况，1小时反应完全，抽干树脂，分别使用55ml DMF洗涤树脂3次，以Kaiser Test检测判断反应终点。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照普卡那肽主链肽序，依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Val-(Dmb)Ala-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Boc-Asn(Trt)-OH的偶联。每种氨基酸、HOBt每次分别投料12.03mmol，DIC每次投料13.24mmol。偶联完毕，分别用55mlDMF、55ml DCM，55ml甲醇交替洗涤树脂3次，洗涤完成后，将树脂置于真空干燥箱中干燥至恒重，得到线性普卡那肽肽树脂18.14g。
(2)线性普卡那肽的制备
称取步骤(1)得到的线性普卡那肽肽树脂18.14g加入至多肽裂解反应器中，加入180ml预先降温至0℃左右的由体积比为88：2:5:5的TFA、TIS、水、苯甲硫醚组成的裂解试剂，室温条件下搅拌反应1.5小时。反应完成后，将反应液过滤至1.80L预先降温至-10℃左右的甲基叔丁基醚，有白色固体产生，-10℃下搅拌该白色淤浆物30min，随后将白色淤浆物离心，离心机参数设置为3500r/min，离心5min，离心完成后，弃掉上清液，收集白色淤浆物，加入新鲜的甲基叔丁基醚，重复上述离心过程，收集白色淤浆物，真空干燥至恒重，最终获得白色线性普卡那肽固体6.92g，收率为96.45％，纯度为80.46％。
实验例5、一种线性普卡那肽的制备
(1)线性普卡那肽肽树脂的制备
称取6.96g取代度为0.72mmol/g的CTC树脂加入多肽反应器中，同时加入70ml DCM洗涤并溶胀树脂1小时。称取Fmoc-Leu-OH(7.5mmol，2.63g)加49ml溶剂DCM溶解，加入DIEA(22.5mmol，3.71ml)，向树脂反应液中25℃反应1.5小时。反应完成后，往树脂中加入3ml甲醇封闭反应1小时，排干溶液，使用70ml DMF溶液洗涤树脂4次，得到Fmoc-Leu-CTC树脂。取少量树脂收缩干燥后，利用紫外分光度法测定哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的取代度为0.58mmol/g。
取Fmoc-Leu-CTC树脂，使用70ml脱除Fmoc的试剂(哌啶：DMF溶液＝1:4(V：V))处理树脂5min后，排干溶液，再用70ml脱除Fmoc的试剂(哌啶：DMF溶液＝1:4(V：V))处理树脂15min，脱除Fmoc保护基，然后分别使用60ml DMF洗涤树脂5次，去除Fmoc副产物以及残余哌啶，以Kaiser Test检测判断反应终点，得到H-Leu-树脂。
称取Fmoc-Cys(Acm)-OH(12.08mmol，4.96g)，HOBt(12.08mmol，1.59g)溶解于49mlDMF溶液中，氮气保护条件下将该溶液冰浴至0-5℃，然后加入DIC(13.29mmol，2.0ml)搅拌反应10min。10min后，将反应溶液加入至制备的H-Leu-树脂中，室温反应，反应过程取小样，使用Kaiser Test检测缩合完成情况，1小时反应完全，抽干树脂，分别使用70ml DMF洗涤树脂3次，以Kaiser Test检测判断反应终点。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照普卡那肽主链肽序，依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-(Fmoc-Hmb)Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Boc-Asn(Trt)-OH的偶联。每种氨基酸、HOBt每次分别投料12.08mmol，DIC每次投料13.29mmol。偶联完毕，肽树脂树脂分别用70ml DMF、70ml DCM，70ml MeOH交替洗涤树脂3次，洗涤完成后，将树脂置于真空干燥箱中干燥至恒重，得到线性普卡那肽肽树脂20.45g。
(2)线性普卡那肽的制备
称取步骤(1)得到的线性普卡那肽肽树脂20.45g加入至多肽裂解反应器中，加入200ml预先降温至0℃左右的由体积比为90:2:5:3的TFA、TIS、水、对甲苯酚组成的裂解试剂，室温条件下搅拌反应1小时。反应完成后，将反应液过滤至1.69L预先降温至-10℃左右的甲基叔丁基醚，有白色固体产生，-10℃下搅拌该白色淤浆物30min，随后将白色淤浆物离心，离心机参数设置为3500r/min，离心5min，离心完成后，弃掉上清液，收集白色淤浆物，加入新鲜的甲基叔丁基醚，重复上述离心过程，收集白色淤浆物，真空干燥至恒重，最终获得白色线性普卡那肽固体6.93g，收率为96.11％，纯度为64.57％。
实验例6、一种线性普卡那肽的制备
(1)线性普卡那肽肽树脂的制备
称取4.48g取代度为0.62mmol/g的Wang树脂加入多肽反应器中，同时加入45mlDCM洗涤并溶胀树脂1小时。称取Fmoc-Leu-OH(3.3mmol，1.17g)，HOBt(3.6mmol，0.50g)，DMAP(0.2mmol，0.03g)，加31ml溶剂(DCM:DMF＝1:1)溶解，将溶解后的反应液加入至树脂中，待树脂与反应液搅拌均匀后，向树脂反应液中DIC(3.6mmol，0.6ml)，25℃反应4小时。反应完成后，排干溶液，先分别使用45ml DMF洗涤树脂2次后，再分别用45ml DCM溶液洗涤树脂2次。洗涤完成后，往树脂中加入45ml封闭液(DCM:Ac2O:DIEA＝90:5:5(V：V：V))封闭反应1h，排干溶液，使用45ml DMF溶液洗涤树脂4次，得到Fmoc-Leu-Wang树脂。取少量树脂收缩干燥后，利用紫外分光度法测定哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的取代度为0.54mmol/g。
取Fmoc-Leu-Wang树脂，使用45ml脱除Fmoc的试剂(哌啶：DMF溶液＝1:4(V：V))处理树脂5min后，排干溶液，再用45ml脱除Fmoc的试剂(哌啶：DMF溶液＝1:4(V：V))处理树脂15min，脱除Fmoc保护基，然后分别使用45ml DMF洗涤树脂5次，去除Fmoc副产物以及残余哌啶以Kaiser Test检测判断反应终点，得到H-Leu-树脂。
称取Fmoc-Cys(Acm)-OH(7.84mmol，3.25g)，HoBt(7.84mmol，1.08g)溶解于31mlDMF溶液中，氮气保护条件下将该溶液冰浴至0-5℃，然后加入DIC(8.62mmol，1.35ml)搅拌反应10min。10min后，将反应溶液加入至制备的H-Leu-树脂中，室温反应，反应过程取小样，使用Kaiser Test检测缩合完成情况，1小时反应完全，抽干树脂，分别使用45ml DMF洗涤树脂3次，以Kaiser Test检测判断反应终点。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照普卡那肽主链肽序，依次完成Fmoc-(Hmb)-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Boc-Asn(trt)-OH的偶联。每种氨基酸、HOBt每次分别投料7.84mmol，DIC每次投料8.62mmol。偶联完毕，分别用45ml DCM、45ml甲醇交替洗涤树脂3次，洗涤完成后，将树脂置于真空干燥箱中干燥至恒重，得到线性普卡那肽肽树脂13.06g。
(2)线性普卡那肽的制备
称取步骤(1)得到的线性普卡那肽肽树脂13.06g加入至多肽裂解反应器中，加入130ml预先降温至0℃左右的由体积比为92：3:3:2的TFA、TIS、H2O、EDT组成的裂解试剂，室温条件下搅拌反应2小时。反应完成后，将反应液过滤至1.3L预先降温至-10℃左右的甲基叔丁基醚，有白色固体产生，-10℃下搅拌该白色淤浆物30min，随后将白色淤浆物离心，离心机参数设置为3500-4000r/min，离心3-5min，离心完成后，弃掉上清液，收集白色淤浆物，加入新鲜的甲基叔丁基醚，重复上述离心过程，收集白色淤浆物，真空干燥至恒重，最终获得白色线性普卡那肽固体4.49g，收率为95.78％，纯度为70.12％。
实验例7、一种线性普卡那肽的制备
(1)线性普卡那肽肽树脂的制备
称取10.20g取代度为0.49mmol/g的Wang树脂加入多肽反应器中，同时加入100mlDCM洗涤并溶胀树脂0.5小时。称取Fmoc-Leu-OH(5.5mmol，1.94g)，HOBt(6mmol，0.84g)，DMAP(0.4mmol，0.05g)，加70ml溶剂DCM溶解，将溶解后的反应液加入至树脂中，待树脂与反应液搅拌均匀后，向树脂反应液中DIC(6mmol，0.9ml)，25℃反应3小时。反应完成后，排干溶液，先分别使用100ml DMF洗涤树脂2次，再分别用100ml DCM溶液洗涤树脂2次。洗涤完成后，往树脂中加入100ml封闭液(DCM:Ac2O:吡啶＝90:5:5)封闭反应0.5小时，排干溶液，分别使用100ml DMF溶液洗涤树脂4次，得到Fmoc-Leu-Wang树脂。取少量树脂收缩干燥后，利用紫外分光度法测定哌啶脱保护液中Fmoc量，树脂的取代度为0.41mmol/g。
取Fmoc-Leu-Wang树脂，使用100ml脱除Fmoc的试剂(哌啶：DMF溶液＝1:4(V：V))处理树脂5min后，排干溶液，再用100ml脱除Fmoc的试剂(哌啶：DMF溶液＝1:4(V：V))处理树脂15min，脱除Fmoc保护基，然后分别使用100ml DMF洗涤树脂5次，去除Fmoc副产物以及残余哌啶，以Kaiser Test检测判断反应终点，得到H-Leu-树脂。
称取Fmoc-Cys(Acm)-OH(12.55mmol，5.20g)，HOBt(12.55mmol，1.71g)溶解于70mlDMF溶液中，氮气保护条件下将该溶液冰浴至0-5℃，然后加入DIC(13.81mmol，2.14ml)搅拌反应10min。10min后，将反应溶液加入至制备的H-Leu-树脂中，室温反应，反应过程取小样，使用Kaiser Test检测缩合完成情况，1小时反应完全，抽干树脂，分别使用100ml DMF洗涤树脂，以Kaiser Test检测判断反应终点。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照普卡那肽主链肽序，依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ala-Cys(ΨMe,Mepro)OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(Otbu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Boc-Asn(Trt)-OH的偶联。每种氨基酸、HOBt每次分别投料12.55mmol，DIC每次投料13.81mmol。偶联完毕，肽树脂树脂分别用100ml DMF、100ml DCM、100ml甲醇交替洗涤树脂3次，洗涤完成后，将树脂置于真空干燥箱中干燥至恒重，得到线性普卡那肽肽树脂22.93g。
(2)线性普卡那肽的制备
称取步骤(1)得到的线性普卡那肽肽树脂22.93g加入至多肽裂解反应器中，加入230ml预先降温至0℃左右的由体积比为88：2:5:5的TFA、TIS、水、苯甲硫醚组成的裂解试剂，室温条件下搅拌反应1小时。反应完成后，将反应液过滤至2.3L预先降温至-10℃左右的甲基叔丁基醚，有白色固体产生，-10℃下搅拌该白色淤浆物30min，随后将白色淤浆物离心，离心机参数设置为3500r/min，离心5min，离心完成后，弃掉上清液，收集白色淤浆物，加入新鲜的甲基叔丁基醚，重复上述离心过程，收集白色淤浆物，真空干燥至恒重，最终获得白色线性普卡那肽固体7.28g，收率为93.86％，纯度为72.08％。
实验例8普卡那肽成品的制备
取实施例1得到的线性普卡那肽固体0.98g用15％乙醇水溶液900ml溶解，加入DMSO 100ml，室温搅拌反应，HPLC中控反应，至线性肽反应完全，第一步完成Cys4-Cys12二硫键的氧化。然后调PH至弱酸性，加入碘(2mmol，0.58g)的乙醇溶液30ml，反应0.5小时通过HPLC监控反应结束，多余的碘加入vitamin C终止反应。反应液直接经HPLC纯化后冻干，得普卡那肽白色固体0.38g，收率为39.18％，纯度为99.02％。
实验例9普卡那肽成品的制备
取实施例1得到的线性普卡那肽固体1.02g用10％乙腈水溶液1000ml溶解，用氨水调PH为7-8，室温搅拌反应24h，HPLC中控反应，至线性肽反应完全，第一步完成Cys4-Cys12二硫键的氧化。然后调PH至弱酸性，加入碘(1.5mmol，0.44g)的乙腈溶液30ml，反应0.5小时通过HPLC监控反应结束，多余的碘加入vitamin C终止反应。反应液直接经HPLC纯化后冻干，得普卡那肽白色固体0.36g，收率为35.22％，纯度为89.74％。
实验例10普卡那肽成品的制备
取实施例1得到的线性普卡那肽固体0.99g用10％甲醇水溶液1000ml溶解，用氨水调PH为7-8，加入2-3滴30％双氧水，HPLC中控反应，至线性肽反应完全，第一步完成Cys4-Cys12二硫键的氧化。然后调PH至弱酸性，加入碘(1.2mmol，0.35g)的甲醇溶液30ml，反应0.5小时通过HPLC监控反应结束，多余的碘加入vitamin C终止反应。反应液直接经HPLC纯化后冻干，得普卡那肽白色固体0.42g，收率为43％，纯度为99.31％。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以上实施例形式的具体实施方式，是对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以上的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

Claims (10)

1.一种制备普卡那肽的方法，其特征在于：所述的制备方法包括如下步骤：
(1)将树脂固相载体和Fmoc-Leu-OH偶联，得到Fmoc-Leu-树脂后，脱除Fmoc保护基；得到H-Leu-树脂；
(2)通过固相合成法，在偶联剂系统的存在下，按普卡那肽序列由碳端向氮端依次将保护氨基酸和/或保护的二肽偶联到H-Leu-树脂上，制备得到线性普卡那肽的肽树脂；所述，普卡那肽序列从N-末端到C-末端的顺序为H-Asn1-Asp2-Glu3-Cys4-Glu5-Leu6-Cys7-Val8-Asn9-Val10-Ala11-Cys12-Thr13-Gly14-Cys15-Leu16-OH；二硫键(4-12)和(7-15)；
其中，所述在普卡那肽序列的Leu6、Val8、Val10、Ala11、Gly14或Leu16中的一个或多个位置的保护氨基酸选自Dmb保护的氨基酸、Hmb保护的氨基酸、Fmoc-Hmb保护的氨基酸、Hnb保护的氨基酸、Hmsb保护的氨基酸、Mmsb保护的氨基酸、Mmtb保护的氨基酸中的一种或多种；
和/或，所述普卡那肽序列的Glu3-Cys4、Glu5-Leu6、Leu6-Cys7、Cys7-Val8、Asn9-Val10、Val10-Ala11、Ala11-Cys12、Cys12-Thr13、Thr13-Gly14或Gly14-Cys15中的一个或多个保护的二肽选自假脯氨酸二肽或Dmb二肽；
(3)线性普卡那肽的肽树脂经裂解，制得线性普卡那肽，再经液相环化，即得普卡那肽。
2.根据权利要求1所述的制备普卡那肽的方法，其特征在于：步骤(1)中所述脱除Fmoc保护基的试剂由体积比为1:1～10的哌啶和DMF组成；优选地，所述脱除Fmoc保护基的试剂由体积比为1:4的哌啶和DMF组成。
3.根据权利要求1所述的制备普卡那肽的方法，其特征在于：步骤(2)中所述Cys的侧链保护基团包括Trt、Mmt、tBu、StBu、Acm或Npys，其中4和12位的保护基团不同于7和15位；优选地，所述Cys的侧链保护基团选自Trt和Acm保护基。
4.根据权利要求1～3所述的制备普卡那肽的方法，其特征在于：步骤(2)中Leu6和/或Leu16位置的保护氨基酸选自Fmoc-(Dmb)Leu-OH、Fmoc-(Hmb)Leu-OH、Fmoc-(Fmoc-Hmb)Leu-OH、Fmoc-(Hnb)Leu-OH、Fmoc-(Hmsb)Leu-OH、Fmoc-(Mmsb)Leu-OH或Fmoc-(Mmtb)Leu-OH；
和/或，Val8和/或Val10位置的保护氨基酸选自Fmoc-(Dmb)Val-OH、Fmoc-(Hmb)Val-OH、Fmoc-(Fmoc-Hmb)Val-OH、Fmoc-(Hnb)Val-OH、Fmoc-(Hmsb)Val-OH、Fmoc-(Mmsb)Val-OH或Fmoc-(Mmtb)Val-OH；
和/或，Ala11位置的保护氨基酸选自Fmoc-(Dmb)Ala-OH、Fmoc-(Hmb)Ala-OH、Fmoc-(Fmoc-Hmb)Ala-OH、Fmoc-(Hnb)Ala-OH、Fmoc-(Hmsb)Ala-OH、Fmoc-(Mmsb)Ala-OH或Fmoc-(Mmtb)Ala-OH；
和/或，Gly14位置的保护氨基酸选自Fmoc-(Dmb)Gly-OH、Fmoc-(Hmb)Gly-OH、Fmoc-(Fmoc-Hmb)Gly-OH、Fmoc-(Hnb)Gly-OH、Fmoc-(Hmsb)Gly-OH、Fmoc-(Mmsb)Gly-OH或Fmoc-(Mmtb)Gly-OH；
和/或，Glu3-Cys4保护的二肽为Fmoc-Glu(OtBu)-Cys(ΨMe,Mepro)-OH；
和/或，Glu5-Leu6保护的二肽为Fmoc-Glu(OtBu)-(Dmb)Leu-OH；
和/或，Leu6-Cys7保护的二肽为Fmoc-Leu-Cys(ΨMe,Mepro)-OH；
和/或，Cys7-Val8保护的二肽选自Fmoc-Cys(Trt)-(Dmb)Val-OH或Fmoc-Cys(Acm)-(Dmb)Val-OH；
和/或，Asn9-Val10保护的二肽为Fmoc-Asn(Trt)-(Dmb)Val-OH；
和/或，Val10-Ala11保护的二肽为Fmoc-Val-(Dmb)Ala-OH；
和/或，Ala11-Cys12保护的二肽为Fmoc-Ala-Cys(ΨMe,Mepro)-OH；
和/或，Cys12-Thr13保护的二肽选自Fmoc-Cys(Acm)-Thr(ΨMe,Mepro)-OH或Fmoc-Cys(Trt)-Thr(ΨMe,Mepro)-OH；
和/或，Thr13-Gly14保护的二肽为Fmoc-Thr(tBu)-(Dmb)Gly-OH；
和/或，Gly14-Cys15保护的二肽为Fmoc-Gly-Cys(ΨMe,Mepro)-OH。
5.根据权利要求1～4任意一项所述的制备普卡那肽的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的偶联剂系统包括缩合剂和反应溶剂，所述缩合剂选自HBTU/DIEA、HATU/DIEA、HBTU/HOBt/DIEA、HCTU/NMM、HATU/HOAt/DIEA、TBTU/DIEA、HOBt/DIC、HOAt/DIC、Cl-HOBt/DIC、PyBOP/HOBt/DIEA、PyAOP/HOBt/DIEA和Oxyma/DIC中的一种或多种，所述反应溶剂选自DMF、DCM、NMP和DMSO中的一种或多种；优选地，所述缩合剂为HOBt/DIC，反应溶剂为DMF。
6.根据权利要求1～5任意一项所述的制备普卡那肽的方法，其特征在于：步骤(3)所述的裂解采用的裂解试剂是由TFA、TIS、H2O、EDT、苯甲硫醚、苯酚和对甲苯酚中的2种或2种以上组成的混合溶液；优选地，所述的裂解试剂由体积比为74～96:1～7:1～7:1～7：1～5的TFA、苯酚、苯甲硫醚、H2O和EDT组成的混合溶液；或者所述的裂解试剂由体积比为90～95:1～5:1～5:1～5的TFA、TIS、H2O和EDT组成的混合溶液；或者所述的裂解试剂由体积比为85～95:1～5:2～8:2～8的TFA、TIS、H2O和对甲苯酚组成的混合溶液；或者所述的裂解试剂由体积比为85～95:1～5:2～8:2～8的TFA、TIS、H2O和苯甲硫醚组成的混合溶液；
更优选地，所述的裂解试剂由体积比为82.5：5：5：5：2.5的TFA、苯酚、苯甲硫醚、H2O和EDT组成的混合溶液；或者所述的裂解试剂由体积比为92:3:3:2的TFA、TIS、H2O和EDT组成的混合溶液；或者所述的裂解试剂由体积比为88：2:5:5或90:2:5:3的TFA、TIS、H2O和对甲苯酚组成的混合溶液；或者所述的裂解试剂由体积比为88：2:5:5的TFA、TIS、H2O和苯甲硫醚组成的混合溶液。
7.根据权利要求1～6任意一项所述的制备普卡那肽的方法，其特征在于：步骤(3)所述的液相环化的方法包括：将线性普卡那肽溶解，氧化形成两对二硫键，得普卡那肽。
8.根据权利要求7所述的制备普卡那肽的方法，其特征在于：所述溶解线性普卡那肽的溶剂选自MeOH、ACN、EtOH、i-PrOH或其水溶液中的一种或几种组成的混合溶剂，所述氧化形成两对二硫键的步骤中使用的氧化剂选自空气、O2、H2O2、GSSH、GSH、DMSO和碘中的一种或多种；优选地，所述溶解线性普卡那肽的溶剂为10％MeOH、10％ACN或15％EtOH，所述氧化形成两对二硫键的步骤中所用的氧化剂为DMSO、碘或H2O2。
9.根据权利要求1～8任意一项所述的制备普卡那肽的方法，其特征在于：所述的固相合成方法为Fmoc固相合成，固相合成在Wang树脂或2-氯三苯甲基树脂上进行；优选地，所述Wang树脂取代度为0.4～1.0mmol/g；所述2-氯三苯甲基树脂取代度为0.7-1.1mmol/g。
10.根据权利要求1所述的制备普卡那肽的方法，其特征在于：所述步骤(3)中经液相环化后还包括纯化的步骤。
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