CN110922452B - 一种戈舍瑞林的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多肽合成技术领域，特别涉及一种戈舍瑞林的合成方法。该合成方法包括：将Azagly与树脂进行偶联，得到Azagly‑树脂；在Azagly‑树脂氨基端依次偶联氨基酸；采用裂解液对得到的肽树脂进行裂解；将裂解后得到的多肽中Arg(NO2)的硝基还原为氨基，得到戈舍瑞林；还原采用的体系为氢转移体系SnCl2和酸的混合物。本发明采用氢转移体系还原Arg侧链的硝基而脱除保护基，从而避开钯碳氢化还原步骤，合成工艺简单，安全性高，设备要求较低。本发明裂解条件可以在肽树脂裂解的同时，将Mmt、Trt保护基脱除，却不影响tBu脱除，一步得到粗肽戈舍瑞林；反应完毕直接乙醚沉淀，减少杂质的生成。
Description
技术领域
本发明涉及多肽合成技术领域，特别涉及一种戈舍瑞林的合成方法。
背景技术
醋酸戈舍瑞林是一种促黄体生成素释放激素类似物(LHRHa)，其氨基酸序列为Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2。它可以抑制性激素的分泌(睾丸酮和雌二醇)，从而使激素敏感性肿瘤萎缩；是一种皮下植入剂，属于长效的激素制剂，作用时间可维持1个月。原研厂家为阿斯利康(AstraZeneca plc)，商品名Zoladex“诺雷得”，1987年3月在英国首次完成研发；1990年5月在美国上市；1996年应用于药物治疗乳腺癌在中国上市。该药物目前的销量在LHRHa制剂中世界排名第二。
该产品合成方法主要有两大类，一类是液相合成；另一类是固相合成。液相合成的策略主要是采用片段缩合法，即先合成不同片段，再片段缩合；比如“4+6”、“5+5”、“3+7”等策略。液相合成的方法主要有以下专利和文献：
J.Med.Chem 121(10),1018-1024,1978采用“4+6”片段缩合法，首先采用液相合成法合成保护六肽Z-Tyr(Bzl)-D-Ser-Arg(NO2)-Pro-AzaGly-NH2，合成除四肽pGlu-His-Trp-Ser-OMe；将合成出来的四肽片段和六肽片段再次采用叠氮物法合成出戈舍瑞林。US4024248PL194997等采用“3+7”片段或“5+5”缩合法。首先，液相合成保护三肽pGlu-His-Trp-OMe，再合成七肽Z-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2。再通过肼解，脱保护，叠氮法缩合得戈舍瑞林。但液相片段缩合存在合成周期长，合成操作繁琐，后处理纯化等比较复杂，粗肽纯度低且需肼解，叠氮化，钯碳脱除保护基等步骤。不易放大生产。
而固相合成的策略主要是针对保护基策略和脱保护方法。常用的策略有先合成全保护肽，再与NH2-Azagly-NH2缩合，最后采用不同的方式脱除保护基。采用固液相结合，这一类合成方法，大致都是先合成全保护肽，再进行C端修饰，再脱保护基。只是保护基的选择不同，采用的脱除方式也不相同。主要的保护基位点是His、Ser、Tyr、Arg的侧链。例如：专利201010256054.6采用His(Trt)、Ser(Trt)、Arg(HCl)保护，5％TFA-DCM脱除；专利201210155366.7采用His(Trt)、Tyr(Bzl)、Arg(NO2)保护，钯碳氢转移方式脱除；专利201310557778.8采用His(Trt)、Ser(Bzl)、Tyr(Bzl)、Arg(NO2)，采用甲醇或乙醇溶液中钯碳催化氢解脱除；专利201510005951.2采用His(Trt)、Tyr(Bzl)、Arg(NO2)保护，分两步脱除，先采用20％TFA-DCM脱除Trt，再采用氢转移反应脱除Bzl和NO2。但固液相缩合的方式，大多均采用了Bn、NO2这类保护基，需要液体脱除，而常用的脱除方式均为钯碳氢化还原，或者钯碳/醋酸/60℃加热脱除，高温会导致消旋化和多肽立体结构的破坏，高压反应釜钯碳氢化还原，对设备要求较高。且在液相进行C端修饰，存在全保护肽自身缩合等副反应，导致收率降低，上述四篇专利公开的技术方案下戈舍瑞林的粗肽收率仅达到30％～40％。
因此，急需开发一种新的合成工艺，来解决液相操作繁琐，不利于纯化的缺点，同时避免使用钯碳还原等一系列问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种戈舍瑞林的合成方法。该合成方法得到的戈舍瑞林收率高，操作简单，利于纯化，同时避免了使用钯碳还原。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种戈舍瑞林的合成方法，包括如下步骤：
步骤A：将Azagly与树脂进行偶联，得到Azagly-树脂；在Azagly-树脂氨基端依次偶联Pro、Arg(NO2)、Leu、D-Ser(tBu)、Tyr、Ser(Trt)、Trp、His(Mmt)、Pyr，得到Pyr-His(Mmt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azagly-树脂；
步骤B：采用裂解液对步骤A得到的肽树脂进行裂解，得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azagly-NH2；
步骤C：将步骤B得到的多肽中Arg(NO2)的硝基还原为氨基，得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2，即戈舍瑞林；还原采用的还原试剂为氢转移体系。
作为优选，树脂为Sieber Resin树脂。
作为优选，Sieber Resin树脂的替代度为0.5～1.0mmol/g。
优选地，Sieber Resin树脂的替代度为0.5～0.7mmol/g。
作为优选，步骤A中偶联采用的偶联剂为HOBt/DIC。
作为优选，裂解液为TFE和DCM的混合物，或者为TFA和DCM的混合物。
作为优选，TFE在裂解液中的体积百分含量为20％～30％。
优选地，TFE在裂解液中的体积百分含量为20％。
作为优选，TFA在裂解液中的体积百分含量为1％～20％。
优选地，TFA在裂解液中的体积百分含量为5％～15％。
作为优选，氢转移体系为SnCl2和酸的混合物，酸为HCl或AcOH。
作为优选，以mmol/mL计，氢转移体系中SnCl2和酸的比例为(15～20)：50。
优选地，以mmol/mL计，还原试剂中SnCl2和酸的比例为18：50。
作为优选，步骤B中，采用裂解液对步骤A得到的肽树脂进行裂解与得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azagly-NH2之间还包括乙醚沉淀、离心的步骤。
作为优选，步骤C中，将步骤B得到的多肽中Arg(NO2)的硝基还原为氨基与得到戈舍瑞林之间还包括乙醚沉淀、离心的步骤。
作为优选，离心后还包括将戈舍瑞林粗肽进行精制的步骤。
本发明提供了一种戈舍瑞林的合成方法。该合成方法包括如下步骤：
步骤A：将Azagly与树脂进行偶联，得到Azagly-树脂；在Azagly-树脂氨基端依次偶联Pro、Arg(NO2)、Leu、D-Ser(tBu)、Tyr、Ser(Trt)、Trp、His(Mmt)、Pyr，得到Pyr-His(Mmt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azagly-树脂；
步骤B：采用裂解液对步骤A得到的肽树脂进行裂解，得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azagly-NH2；
步骤C：将步骤B得到的多肽中Arg(NO2)的硝基还原为氨基，得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2，即戈舍瑞林；还原采用的还原试剂为氢转移体系。
本发明具有的技术效果为：
1、采用Serb Resin树脂和本发明的保护氨基酸组合，不需要再进行C端修饰，可以实现在树脂上偶联、脱保护、修饰。该工艺操作简单，后处理方便，重现性好。
2、采用SnCl2/HCl体系或SnCl2/AcOH体系还原Arg侧链的硝基为氨基从而避开钯碳氢化还原步骤，钯碳氢化还原反应工艺对设备要求高，且不便于放大生产。而本发明采用SnCl2/HCl等体系还原Arg侧链的硝基为氨基条件温和，不需要高压反应釜加氢，合成工艺简单，安全性高，设备要求较低。
3、His(Mmt)(5％TFA)、Ser(Trt)(1％TFA)和Serb树脂(1％TFA)的裂解条件一致，而与Ser(tBu)(90％TFA)侧链tBu酸条件差异较大。因此可以做到在肽树脂裂解的同时，将Mmt、Trt保护基脱除，却不影响tBu脱除，一步得到粗肽戈舍瑞林。操作简便。
4、反应完毕直接乙醚沉淀，而不是文献提及的浓缩TFA全保护肽，再进行C端修饰。在TFA浓缩的过程中，酸浓度增加，势必造成Ser(tBu)侧链保护基tBu的脱除，该杂质与目标产物结构类似，难以除去。
附图说明
图1示实施例6中粗肽的HPLC图谱；
图2示实施例7中粗肽的HPLC图谱；
图3示实施例8中粗肽的HPLC图谱；
图4示实施例9中粗肽的HPLC图谱；
图5示实施例10中粗肽的HPLC图谱；
图6示对比例1中粗肽的HPLC图谱；
图7示对比例2中粗肽的HPLC图谱；
图8示对比例3中粗肽的HPLC图谱；
图9示本发明多肽合成流程图。
具体实施方式
本发明公开了一种戈舍瑞林的合成方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明方案保护基的脱除，避免液相环境下的钯碳氢步骤，可以在固相树脂上常温脱除，操作简单，收率高。
本发明多肽合成流程图见图9。
缩写及英文含义如下：
本发明提供的戈舍瑞林的合成方法中所用试剂或仪器等均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1肽树脂的合成
称取0.7mmol/g的sieber Resin树脂100g，DMF洗涤1次，DCM溶胀30分钟，加入20％哌啶-DMF，脱除Fmoc 2次：5+7分钟。DMF洗涤6次，加入已预热处理的Fmoc-Azagly-COOH(70g，210mmol)和HOBt(34，252mmol)DMF溶液，搅拌，再加入DIC(40mL，252mmol)，室温反应2小时，茚三酮检测，反应完毕。抽滤，DMF洗涤5次，抽干，加入20％哌啶-DMF，脱除Fmoc2次：5+7分钟。DMF洗涤6次，加入已预热处理的Fmoc-Pro-OH(70.8g，210mmol)和HOBt(34，252mmol)DMF溶液，搅拌，再加入DIC(40mL，252mmol)，室温反应2小时，茚三酮检测是否透明。
再依次偶联Fmoc-Arg(NO2)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-His(Mmt)-OH、Pyr-OH，最后DMF洗涤5次，DCM洗涤5次，甲醇收缩树脂，得到229.2g，增重约129.2g，收率94.6％。
实施例2肽树脂的合成
称取0.5mmol/g的sieber Resin树脂100g，DMF洗涤1次，DCM溶胀30分钟，加入20％哌啶-DMF，脱除Fmoc2次：5+7分钟。DMF洗涤6次，加入已预热处理的Fmoc-Azagly-COOH(50g，150mmol)和HOBt(24.5，180mmol)DMF溶液，搅拌，再加入DIC(28.5mL，180mmol)，室温反应2小时，茚三酮检测，反应完毕。抽滤，DMF洗涤5次，抽干，加入20％哌啶-DMF，脱除Fmoc2次：5+7分钟。DMF洗涤6次，加入已预热处理的Fmoc-Pro-OH(50.4g，150mmol)和HOBt(24.5，180mmol)DMF溶液，搅拌，再加入DIC(28.5mL，180mmol)，室温反应2小时，茚三酮检测是否透明。
再依次偶联Fmoc-Arg(NO2)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-His(Mmt)-OH、Pyr-OH，最后DMF洗涤5次，DCM洗涤5次，甲醇收缩树脂，得到223g，增重约123g，收率97.6％。
实施例3 Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azagly-NH2合成
取上述肽树脂合成例1的110g肽树脂，置于5L圆底烧杯中；配制5％TFA:DCM的裂解液1100mL(55mL TFA加入到1045mL DCM中，搅拌均匀冷冻处理)；将裂解液缓慢倒入至上述圆底烧瓶中，搅拌反应2小时，抽滤，滤液倒入至10L乙醚中(乙醚提前冷冻处理)，置于-20℃冷冻过夜，离心，氮气吹干得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azagly-NH2，称重：37.95g(1314)，收率82.5％，HPLC纯度90％。
实施例4 Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azagly-NH2合成
取上述肽树脂合成例1的110g肽树脂，置于5L圆底烧杯中；配制10％TFA:DCM的裂解液1000mL(100mL TFA加入到900mL DCM中，搅拌均匀冷冻处理)；将裂解液缓慢倒入至上述圆底烧瓶中，搅拌反应2小时，抽滤，滤液倒入至10L乙醚中(乙醚提前冷冻处理)，置于-20℃冷冻过夜，离心，氮气吹干得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azagly-NH2，称重：39.59g，收率86.1％，HPLC纯度85％。
实施例5 Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azagly-NH2合成
取上述肽树脂合成例2的110g肽树脂，置于5L圆底烧杯中；配制15％TFA:DCM的裂解液1000mL(150mL TFA加入到850mL DCM中，搅拌均匀冷冻处理)；将裂解液缓慢倒入至上述圆底烧瓶中，搅拌反应2小时，抽滤，滤液倒入至10L乙醚中(乙醚提前冷冻处理)，置于-20℃冷冻过夜，离心，氮气吹干得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azagly-NH2，称重：29.57g，收率90％，HPLC纯度74％。
实施例6 Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2合成(目标化合物合成)
取实施例3Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azagly-NH220g(15mmol)加入到100mL冰醋酸-甲醇(50:50)溶液中，搅拌溶解，加入3.46g(18mmol)氯化亚锡，室温搅拌4小时，色谱检测原料峰消失，加入至1000mL冷冻的乙醚，沉淀，离心，干燥，得到目标化合物(1268)：15.79g，收率83％，HPLC纯度80.29％(图1)。
实施例7 Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2合成(目标化合物合成)
取实施例4Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azagly-NH220g加入到100mL盐酸-甲醇(50:50)溶液中，搅拌溶解，加入3.46g(18mmol)氯化亚锡，室温搅拌4小时，色谱检测原料峰消失，加入至1000mL冷冻的乙醚，沉淀，离心，干燥，得到目标化合物：14.93g，收率78.5％，HPLC纯度80.51％(图2)。
实施例8 Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2合成(目标化合物合成)
取实施例5Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azagly-NH220g加入到100mL冰醋酸-甲醇(50:50)溶液中，搅拌溶解，加入3.46g(18mmol)氯化亚锡，室温搅拌6小时，色谱检测原料峰消失，加入至1000mL冷冻的乙醚，沉淀，离心，干燥，得到目标化合物：15.99g，收率83.5％，HPLC纯度80.29％(图3)。
实施例9 Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2合成(目标化合物合成)
取实施例3Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azagly-NH220g加入到100mL冰醋酸-甲醇(50:50)溶液中，搅拌溶解，加入3.46g(18mmol)氯化亚锡，室温搅拌2小时，色谱检测原料峰消失，加入至1000mL冷冻的乙醚，沉淀，离心，干燥，得到目标化合物：15.09g，收率78.8％，HPLC纯度63.6％(图4)。
对比例1戈舍瑞林粗肽的制备(常规方案)
称取替代度sub＝1.0mmol/g的2-CTC Resin，DCM溶胀10min，抽干，DMF洗涤3次，抽干后，加入3倍当量的Fmoc-Pro-OH并加入约200mLDMF溶解，偶联2小时，同时冰水浴降温，加入8.7mLDIPEA活化10min后，将氨基酸活化液体加入至反应柱中反应，5min后再向反应器中加入17.5mLDIPEA继续反应2小时，反应结束后，加入DMF、DCM洗涤，采用封闭液DCM/MEOH/DIPEA(17：2:1体积比)封闭2次，每次10分钟，封闭结束后DMF洗涤MeOH收缩，取样测得替代度0.52mmol/g
取19.2g(10mmol)上述Fmoc-Pro-CTC Resin，DCM溶胀10min，抽干，DMF洗涤3次，抽干后，加入20％哌啶-DMF(脱Fmoc)，一次5分钟，一次7分钟，DMF洗涤5次，加入3倍量的Fmoc-Arg(NO2)-OH，1.2eqHOBt/1.2eqDIC，偶联2小时，茚三酮检测透明；抽干，DMF洗涤3次，抽干后，加入20％哌啶-DMF(脱Fmoc)，一次5分钟，一次7分钟，DMF洗涤5次，再参照以上固相合成的方法，依次偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(Bzl)-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Pyr-OH，偶联完毕，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，抽干。甲醇收缩。
上述肽树脂加入到1％TFA-DCM(V/V)溶液中搅拌2小时，浓缩至干，得到白色固体。(M＝1533.40)Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-COOH。
加入DCM溶解上述固体，再加入HOBt\DIC，搅拌溶解，最后加入NH2-Azagly-CONH2的DMF溶液，搅拌反应2小时。加入5％柠檬酸水溶液洗涤2次，取DCM层，再采用10％Na2CO水溶液洗涤2次，饱和氯化钠水溶液洗涤2次，取DCM层，无水硫化钠干燥，浓缩得到白色固体物。Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azagly-NH2
将上述化合物溶解在甲醇中，加入1.1倍当量的10％Pd/C，加压到10个大气压，室温反应5小时，过滤掉钯碳，反应液加入到冰冻的乙醚中，析出沉淀。总收率约32％，HPLC69.07％(图6)。
对比例2戈舍瑞林粗肽的制备(7+2)
称取替代度sub＝1.0mmol/g的2-CTC Resin，DCM溶胀10min，抽干，DMF洗涤3次，抽干后，加入3倍当量的Fmoc-Leu-OH并加入约200mLDMF溶解，偶联2小时，同时冰水浴降温，加入8.7mLDIPEA活化10min后，将氨基酸活化液体加入至反应柱中反应，5min后再向反应器中加入17.5mLDIPEA继续反应2小时，反应结束后，加入DMF、DCM洗涤，采用封闭液DCM/MEOH/DIPEA(17：2:1体积比)封闭2次，每次10分钟，封闭结束后DMF洗涤MeOH收缩，取样测得替代度0.52mmol/g
取19.2g(10mmol)上述Fmoc-Leu-CTC Resin，DCM溶胀10min，抽干，DMF洗涤3次，抽干后，加入20％哌啶-DMF(脱Fmoc)，一次5分钟，一次7分钟，DMF洗涤5次，加入3倍量的Fmoc-D-Ser(tBu)-OH，1.2eqHOBt/1.2eqDIC，偶联2小时，茚三酮检测透明；抽干，DMF洗涤3次，抽干后，加入20％哌啶-DMF(脱Fmoc)，一次5分钟，一次7分钟，DMF洗涤5次，再参照以上固相合成的方法，依次偶联Fmoc-Tyr(Bzl)-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Pyr-OH，偶联完毕，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，抽干。甲醇收缩。
上述肽树脂加入到1％TFA-DCM(V/V)溶液中搅拌2小时，浓缩至干，得到白色固体。(M＝1533.40)Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-COOH。
Boc-Pro-OH和DCM搅拌溶解，加入1.2倍当量的NH2-Azagly-CONH2的DMF溶液，然后加入1.2倍当量的DCC，室温反应过夜，点板监控，原料Boc-Pro-OH消失，加入5％柠檬酸水溶液洗涤2次，取DCM层，再采用10％Na2CO水溶液洗涤2次，饱和氯化钠水溶液洗涤2次，取DCM层，无水硫化钠干燥，浓缩得到白色固体物。Boc-Pro-NH-Azagly-CONH2。
将上述固体，溶解在氯化氢的乙酸乙酯溶液中，搅拌2小时，脱除Boc，反应结束后，浓缩至干，加入DCM溶解，再采用10％Na2CO水溶液洗涤2次，饱和氯化钠水溶液洗涤2次，取DCM层，无水硫化钠干燥，浓缩得到白色固体物。NH2-Pro-NH-Azagly-CONH2。
Boc-Arg(NO2)-OH和DCM搅拌溶解，加入1.2倍当量的NH2-Pro-NH-Azagly-CONH2的DMF溶液，然后加入1.2倍当量的DCC，室温反应过夜，点板监控，原料Boc-Arg(NO2)-OH，加入5％柠檬酸水溶液洗涤2次，取DCM层，再采用10％Na2CO水溶液洗涤2次，饱和氯化钠水溶液洗涤2次，取DCM层，无水硫化钠干燥，浓缩得到白色固体物。Boc-Arg(NO2)-Pro-NH-Azagly-CONH2。
将上述固体，溶解在氯化氢的乙酸乙酯溶液中，搅拌2小时，脱除Boc，反应结束后，浓缩至干，加入DCM溶解，再采用10％Na2CO水溶液洗涤2次，饱和氯化钠水溶液洗涤2次，取DCM层，无水硫化钠干燥，浓缩得到白色固体物。NH2-Arg(NO2)-Pro-NH-Azagly-CONH2。
取Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu–COOH加入DCM搅拌溶解，加入1.1倍当量的NH2-Arg(NO2)-Pro-NH-Azagly-CONH2的DMF溶液，然后加入1.1倍当量的DCC，室温反应，HPLC监控，原料Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu–COOH消失，加入5％柠檬酸水溶液洗涤2次，取DCM层，再采用10％Na2CO水溶液洗涤2次，饱和氯化钠水溶液洗涤2次，取DCM层，无水硫化钠干燥，浓缩得到白色固体物。Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NH-Azagly-CONH2。
将上述化合物溶解在甲醇中，加入1.1倍当量的10％Pd/C，加压到10个大气压，室温反应5小时，过滤掉钯碳，反应液加入到冰冻的乙醚中，析出沉淀。总收率约34％，HPLC74.7％(图7)。
对比例3戈舍瑞林粗肽的制备(液相合成)
Boc-Pro-OH和DCM搅拌溶解，加入1.2倍当量的NH2-Azagly-CONH2的DMF溶液，然后加入1.2倍当量的DCC，室温反应过夜，点板监控，原料Boc-Pro-OH消失，加入5％柠檬酸水溶液洗涤2次，取DCM层，再采用10％Na2CO水溶液洗涤2次，饱和氯化钠水溶液洗涤2次，取DCM层，无水硫化钠干燥，浓缩得到白色固体物。Boc-Pro-NH-Azagly-CONH2。
将上述固体，溶解在氯化氢的乙酸乙酯溶液中，搅拌2小时，脱除Boc，反应结束后，浓缩至干，加入DCM溶解，再采用10％Na2CO水溶液洗涤2次，饱和氯化钠水溶液洗涤2次，取DCM层，无水硫化钠干燥，浓缩得到白色固体物。NH2-Pro-NH-Azagly-CONH2。
Boc-Arg(NO2)-OH和DCM搅拌溶解，加入1.2倍当量的NH2-Pro-NH-Azagly-CONH2的DMF溶液，然后加入1.2倍当量的DCC，室温反应过夜，点板监控，原料Boc-Arg(NO2)-OH，加入5％柠檬酸水溶液洗涤2次，取DCM层，再采用10％Na2CO水溶液洗涤2次，饱和氯化钠水溶液洗涤2次，取DCM层，无水硫化钠干燥，浓缩得到白色固体物。Boc-Arg(NO2)-Pro-NH-Azagly-CONH2。
将上述固体，溶解在氯化氢的乙酸乙酯溶液中，搅拌2小时，脱除Boc，反应结束后，浓缩至干，加入DCM溶解，再采用10％Na2CO水溶液洗涤2次，饱和氯化钠水溶液洗涤2次，取DCM层，无水硫化钠干燥，浓缩得到白色固体物。NH2-Arg(NO2)-Pro-NH-Azagly-CONH2。
按照上述偶联和脱除方法，依次液相缩合Leu、D-Ser(tBu)、Tyr(Bzl)、Ser(Trt)、Trp、His(Trt)、Pyr。得到Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NH-Azagly-CONH2。
将上述化合物溶解在甲醇中，加入1.1倍当量的10％Pd/C，加压到10个大气压，室温反应5小时，过滤掉钯碳，反应液加入到冰冻的乙醚中，析出沉淀。总收率约19％，HPLC62.94％(图8)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种戈舍瑞林的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤A：将Fmoc-Azagly-COOH与树脂进行偶联，脱除Fmoc得到Azagly-树脂；在所述Azagly-树脂氨基端依次偶联Pro、Arg(NO2)、Leu、D-Ser(tBu)、Tyr、Ser(Trt)、Trp、His(Mmt)、Pyr，得到Pyr-His(Mmt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azagly -树脂；所述树脂为Sieber Resin树脂；所述Sieber Resin树脂的替代度为0.5~1.0mmol/g；步骤A中所述偶联采用的偶联剂为HOBt/DIC；
步骤B：采用裂解液对步骤A得到的肽树脂进行裂解，得到Pyr-His-Trp-Ser- Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azagly-NH2；所述裂解液为TFA和DCM的混合物，所述TFA在裂解液中的体积百分含量为1%~20%；
步骤C：将步骤B得到的多肽中Arg(NO2)的硝基还原为氨基而脱除保护基，得到Pyr-His-Trp-Ser- Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2，即戈舍瑞林；所述还原采用的还原试剂为氢转移体系，所述氢转移体系为SnCl2、甲醇和酸的混合物，所述酸为HCl或AcOH；以mmol/mL计，所述氢转移体系中SnCl2和酸的比例为（15~20）：50。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，步骤B中，采用裂解液对步骤A得到的肽树脂进行裂解与得到Pyr-His-Trp-Ser- Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azagly-NH2之间还包括乙醚沉淀、离心的步骤。
3.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，步骤C中，将步骤B得到的多肽中Arg(NO2)的硝基还原为氨基与得到戈舍瑞林之间还包括乙醚沉淀、离心的步骤。
4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述离心后还包括将戈舍瑞林粗肽进行精制的步骤。
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