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WO2022051963A1 - 一种普卡那肽的制备方法 - Google Patents

一种普卡那肽的制备方法 Download PDF

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WO2022051963A1
WO2022051963A1 PCT/CN2020/114383 CN2020114383W WO2022051963A1 WO 2022051963 A1 WO2022051963 A1 WO 2022051963A1 CN 2020114383 W CN2020114383 W CN 2020114383W WO 2022051963 A1 WO2022051963 A1 WO 2022051963A1
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WO
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plecanatide
fmoc
resin
leu
preparation
Prior art date
Application number
PCT/CN2020/114383
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马洪季
吴丽芬
张利香
付玉清
邱心敏
林艳霞
Original Assignee
深圳市健元医药科技有限公司
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Publication date
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    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the Fmoc-Leu-HMP-Leu(Tmb)-MBHA resin in Example 3 was used, deprotected twice with 20% piperidine/DMF, and the color of the resin was detected by ninhydrin. The color of the resin indicated that Fmoc was completely removed.
  • Fmoc-Cys(Acm)-OH: 7.3g and HOBt 6.7g were dissolved in 45ml DMF, and DIC 8.1g was added to activate for 5 minutes. The reaction ended when the ninhydrin test was negative.
  • Example 14 Using the crude peptide of plecanatide in Example 14, using high-efficiency preparative liquid phase, Daiso C18 filler, sodium dihydrogen phosphate acetonitrile purification system, the crude peptide was purified, and lyophilized after purification to obtain 10.3 g of plecanatide refined peptide , the yield is 61.0%, the purity is 99.7%, and the maximum mono-impurity is 0.04%.
  • the HPLC chromatogram is shown in Figure 1, and the characteristic peak retention time and peak area results are shown in Table 1.
  • Table 1 The retention time and peak area results of the characteristic peaks of plecanatide spermatozoa in Example 20
  • Example 15 Using the crude peptide of plecanatide in Example 15, using high-efficiency preparative liquid phase, Daiso C18 filler, and sodium dihydrogen phosphate acetonitrile purification system, the crude peptide was purified, and lyophilized after purification to obtain 9.9 g of plecanatide refined peptide , the yield is 59.3%, the purity is 99.5%, and the maximum mono-impurity is 0.1%. Its HPLC chromatogram is similar to that in Figure 1.
  • Fmoc-Leu-wang resin was used, deprotected twice with 20% piperidine/DMF, and the color of the resin was detected by ninhydrin. The color of the resin indicated that Fmoc was completely removed.
  • Fmoc-Cys(Acm)-OH 7.9g and HOBt 4.1g dissolved in 50ml DMF, add DIC 5.3g to activate for 3-5 minutes, add the activated solution to the above solid phase reaction column, stir the reaction with nitrogen for 2-4h, and the ninhydrin test is negative, which is The reaction ends.
  • the above-mentioned plecanatide crude peptide was purified by using high-efficiency preparative liquid phase, Daiso C18 filler, sodium dihydrogen phosphate acetonitrile purification system, purified and freeze-dried to obtain plecanatide refined peptide 5.18g, with a yield of 5.18 g. 38.3%, the purity is 97.1%, and the maximum single impurity is 2.08%.
  • HPLC chromatogram is shown in Figure 2, and the characteristic peak retention time and peak area results are shown in Table 2.
  • Fmoc-Leu-wang resin was used, deprotected twice with 20% piperidine/DMF, and the color of the resin was detected by ninhydrin. The color of the resin indicated that Fmoc was completely removed.
  • Fmoc-Cys(Acm)-OH 8.9g and HOBt 4.5g dissolved in 50ml DMF, add DIC 5.3g to activate for 3-5 minutes, add the activated solution to the above solid phase reaction column, stir the reaction with nitrogen for 2-4h, and the ninhydrin test is negative, which is The reaction ends.
  • the above-mentioned plecanatide crude peptide was purified by using high-efficiency preparative liquid phase, Daiso C18 filler, sodium dihydrogen phosphate acetonitrile purification system, purified and lyophilized to obtain plecanatide refined peptide 6.8g with a yield of 6.8 g. 40.2%, the purity is 97.69%, the maximum single impurity is 0.96%, its HPLC chromatogram is shown in Figure 3, and the characteristic peak retention time and peak area results are shown in Table 3.
  • the data show that the purity of the plecanatide crude peptide obtained in Examples 14-19 is higher than that of the comparative examples 1 and 2. It can be seen that the synthetic method of plecanatide provided by the present invention can improve the purity of the plecanatide crude peptide. .
  • the HPLC chromatograms and the corresponding data in Examples 20-25 and Comparative Examples 1 and 2 show that, using the present invention to synthesize plecanatide, after simple purification, the purity and yield of the obtained plecanatide refined peptide are higher than Comparative examples 1 and 2 are high, and the maximum single impurity is also controlled. It can be seen that the synthesis method of plecanatide provided by the present invention can reduce the generation of impurities, reduce the difficulty of purification, and improve the product yield.

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Abstract

一种普卡那肽的制备方法，该方法包括以下步骤：1)将Y树脂，分别与X、Linker、Fmoc-Leu-OH偶联，得到Fmoc-Leu-Linker-X-Y树脂，其中X选自N端H由Dmb/Hmb/Tmb保护的氨基酸或Pro；2)在Fmoc-Leu-Linker-X-Y树脂上通过固相偶联合成方法依次接入序列中相应的保护氨基酸或片段，制得普卡那肽线性肽树脂；3)普卡那肽线性肽树脂经裂解，得到线性普卡那肽，经环化，即得普卡那肽。通过采用Fmoc-Leu-Linker-X-Y树脂用于普卡那肽的制备中，有效抑制合成过程中的缩聚现象。

Description

一种普卡那肽的制备方法 技术领域
本发明涉及多肽药物制备领域，尤其涉及一种普卡那肽的制备方法。
背景技术
普卡那肽(Plecanatide)由美国Synergy制药公司研发,是尿鸟苷蛋白的类似物,为含有16个氨基酸的环状多肽,具有促尿钠排泄的鸟苷酸环化酶受体激动药的作用,能调节胃肠道中的酸碱离子,诱导液体转运进入胃肠道,增加胃肠道的蠕动,适用于治疗成人慢性特发性便秘。美国食品药品管理局(FDA)于2017年1月19日批准上市,商品名为Trulance。其结构式如下：
Figure PCTCN2020114383-appb-000001
目前，普卡那肽主链的合成方法主要分为片段法和固相合成法。专利(CN104628827A)，采用固相偶联合成肽树脂，然后在树脂上采用固相氧化得到普卡那肽全保护肽树脂，经裂解后获得普卡那肽粗品。此方法采用固相氧化两对二硫键环化，其氧化效果较差，粗品纯度低，工业化生产难度大。专利(CN201280021221)采用液相片段法合成普卡那肽，合成周期长、操作步骤复杂、成本高，不利于商品化生产。专利(CN103694320B)，采用tBu或Acm作为半胱氨酸的侧链保护基制得普卡那肽线性肽树脂，经裂解制得普卡那肽线性粗肽；取普卡那肽线性粗肽，经第一环化、第二环化得到普卡那肽粗品。该工艺无法避免偶联过程中的肽树脂收缩，导致线性肽后续氨基酸偶联困难，氧化后粗品纯度低，难以纯化。在实际生产过程中，常规的化学合成法，由于普卡那肽序列第6-16位氨基酸的疏水性，容易形成β折叠构象，会导致氨基被包裹在折叠肽序中不易暴露出来，其中以第9位氨基酸Asn偶联时出现收缩现象最为明显，该现象加大了后续氨基酸的偶联难度，使得肽树脂偶联不完全，杂质产生较多，难以纯化，从而导致样品纯度偏低。
发明内容
针对普卡那肽在合成过程中出现的树脂缩聚而造成合成困难的问题，本发明旨在提供一种普卡那肽的制备方法，本发明工艺稳定，且杂质含量低、收率高，适合于大规模生产。
本发明提供的普卡那肽的制备方法包括以下步骤：
(1)将Y树脂，分别与X、Linker、Fmoc-Leu-OH偶联，得到Fmoc-Leu-Linker-X-Y树脂，其中X选自N端H由Dmb/Hmb/Hnb保护的氨基酸或Pro；
(2)在Fmoc-Leu-Linker-X-Y树脂上通过固相偶联合成方法依次接入序列中相应的保护氨基 酸或片段，制得普卡那肽线性肽树脂；
(3)普卡那肽线性肽树脂经裂解，得到线性普卡那肽，经环化，即得普卡那肽。
通过在树脂与目标肽序中间加入Linker和X，一方面增大了目标肽序与树脂间的空间距离，改变了肽序偶联过程中的空间结构；另一方面N端H由Dmb/Hmb/Tmb保护的氨基酸或Pro的加入，抑制了分子间氢键的形成，从而抑制β折叠的形成，减少了偶联难度，大大降低杂质的产生。
优选地，所述Y树脂为：MBHA树脂或AM树脂。上述树脂为固相合成常用树脂，可商业化获得，并且采用上述树脂，肽序偶联结束酸解步骤，可以将linker及X，保留在树脂上，不影响目标化合物的质量。
优选地，所述的Linker为：HMP，该结构可以保证肽树脂酸解后，肽序C端为羧酸，不影响普卡那肽碳末端结构。
作为优选方案，步骤(1)所述的氨基酸选自Leu、Val、Ala、Gly，这些氨基酸结构简单，均为单保护氨基酸，空间位阻小，提高偶联效率。
在某些具体实施例中，步骤(2)所述普卡那肽线性肽树脂为：
R1-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Cys(R2)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(R3)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(R2)-Thr(tBu)-Gly-Cys(R3)-Leu-HMP-X-Y树脂，其中R1为Fmoc或Boc；R2为Trt，所述R3为Acm。
优选地，步骤(3)肽树脂裂解体系为TFA与m-cresol、TIS、Mpr的混合溶液。
优选地，步骤(3)中环化由两步环化完成，第一步环化采用空气(O 2)氧化或双氧水(H 2O 2)氧化；第二步环化采用I 2氧化。通过两步环化，中间过程无需纯化，就得到了纯度以及收率都很高且二硫键准确定位的产物，且反应条件温和，利于工业化生产。
本发明通过采用Fmoc-Leu-Linker-X-Y树脂用于普卡那肽的制备中，有效抑制合成过程中的缩聚现象，所制备的普卡那肽收率大于50％，纯度大于99.5％，单一杂质小于0.1％。与现有技术相比，本发明工艺降低了普卡那肽的合成难度，提高了产品质量，极具生产价值。
附图说明
图1为实施例20制得的普卡那肽精肽的色谱图。
图2为对比例1制得的普卡那肽精肽的色谱图。
图3为对比例2制得的普卡那肽精肽的色谱图。
具体实施方式
实施例1：Fmoc-Leu-HMP-Gly(Dmb)-MBHA树脂的制备
取20.0g MBHA树脂(0.50mmol/g)装入固相反应柱中，DCM洗涤两次，DCM溶胀30分钟。将Fmoc-Gly(Dmb)-OH：8.7g、HOBT：4.5g、DIC：5.2g溶解在50ml DMF中，加入到上述固相反应柱中反应3.0h，反应结束，采用DMF洗涤4次。后采用20％哌啶/DMF脱保护2次，脱保护时间分别为5min、15min，依次偶联HMP linker及Fmoc-leu-OH，得到Fmoc-Leu-HMP-Gly(Dmb)-MBHA树脂。
实施例2；Fmoc-Leu-HMP-Gly(Hmb)-AM树脂的制备
取10.0g AM树脂(1.0mmol/g)装入固相反应柱中，DCM洗涤两次，DCM溶胀30分钟。将Fmoc-Gly(Hmb)-OH：8.7g、HOBT：4.1g、DIC：5.1g溶解在50ml DMF中，加入到上述固相反应柱中反应2.5h，反应结束，采用DMF洗涤4次。后采用20％哌啶/DMF脱保护2次，脱保护时间分别为5min、15min，依次偶联HMP linker及Fmoc-leu-OH，得到Fmoc-Leu-HMP-Gly(Hmb)-AM树脂。
实施例3：Fmoc-Leu-HMP-Leu(Tmb)-MBHA树脂的制备
取13.5g MBHA树脂(0.75mmol/g)装入固相反应柱中，DCM洗涤两次，DCM溶胀30分钟。将Fmoc-Leu(Tmb)-OH：12.6g、HOBT：4.5g、DIC：5.2g溶解在50ml DMF中，加入到上述固相反应柱中反应3.0h，反应结束，采用DMF洗涤4次。后采用20％哌啶/DMF脱保护2次，脱保护时间分别为5min、15min，依次偶联HMP linker及Fmoc-leu-OH，得到Fmoc-Leu-HMP-Leu(Tmb)-MBHA树脂。
实施例4：Fmoc-Leu-HMP-Leu(Hmb)-MBHA树脂的制备
取25.0g MBHA树脂(0.40mmol/g)装入固相反应柱中，DCM洗涤两次，DCM溶胀30分钟。将Fmoc-Leu(Hmb)-OH：11.5g、HOBT：4.5g、DIC：5.2g溶解在50ml DMF中，加入到上述固相反应柱中反应3.0h，反应结束，采用DMF洗涤4次。后采用20％哌啶/DMF脱保护2次，脱保护时间分别为5min、15min，依次偶联HMP linker及Fmoc-leu-OH，得到Fmoc-Leu-HMP-Leu(Hmb)-MBHA树脂。
实施例5：Fmoc-Leu-HMP-Val(Dmb)-AM树脂的制备
取10.0g AM树脂(1.0mmol/g)装入固相反应柱中，DCM洗涤两次，DCM溶胀30分钟。将Fmoc-Val(Dmb)-OH：11.9g、HOBT：4.1g、DIC：5.1g溶解在50ml DMF中，加入到上述固相反应柱中反应2.5h，反应结束，采用DMF洗涤4次。后采用20％哌啶/DMF脱保护2次，脱保护时间分别为5min、15min，依次偶联HMP linker及Fmoc-leu-OH，得到 Fmoc-Leu-HMP-Val(Dmb)-AM树脂。
实施例6：Fmoc-Leu-HMP-Ala(Tmb)-AM树脂的制备
取15.0g AM树脂(0.65mmol/g)装入固相反应柱中，DCM洗涤两次，DCM溶胀30分钟。将Fmoc-Ala(Tmb)-OH：10.2g、HOBT：4.1g、DIC：5.1g溶解在50ml DMF中，加入到上述固相反应柱中反应2.5h，反应结束，采用DMF洗涤4次。后采用20％哌啶/DMF脱保护2次，脱保护时间分别为5min、15min，依次偶联HMP linker及Fmoc-leu-OH，得到Fmoc-Leu-HMP-Ala(Tmb)-AM树脂。
实施例7：Fmoc-Leu-HMP-Pro-MBHA树脂的制备
取18.0g MBHA树脂(0.55mmol/g)装入固相反应柱中，DCM洗涤两次，DCM溶胀30分钟。将Fmoc-Pro-OH：7.5g、HOBT：4.5g、DIC：5.2g溶解在50ml DMF中，加入到上述固相反应柱中反应3.0h，反应结束，采用DMF洗涤4次。后采用20％哌啶/DMF脱保护2次，脱保护时间分别为5min、15min，依次偶联HMP linker及Fmoc-leu-OH，得到Fmoc-Leu-HMP-Pro-MBHA树脂。
实施例8：普卡那肽树脂的制备1
采用实施例1中的Fmoc-Leu-HMP Linker-Gly(Dmb)-MBHA树脂，用20％哌啶/DMF脱保护2次，用茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Cys(Acm)-OH：8.3g和HOBt 4.9g溶解在50ml DMF中，加入DIC 5.9g活化3-5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2-4h，以茚三酮检测呈阴性，为反应结束。
重复上述脱保护和氨基酸偶联步骤，按照普卡那肽序依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH偶联，得到普卡那肽线性肽树脂42.5g。
实施例9：普卡那肽树脂的制备2
采用实施例2中的Fmoc-Leu-HMP-Gly(Hmb)-AM树脂，用20％哌啶/DMF脱保护2次，用茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Cys(Acm)-OH：8.8g和HOBt 4.7g溶解在45ml DMF中，加入DIC 5.9g活化3-5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2-4h，以茚三酮检测呈阴性，为反应结束。
重复上述脱保护和氨基酸偶联步骤，按照普卡那肽序依次完成Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH偶联，得到普卡那肽线性肽树脂39.5g。
实施例10：普卡那肽树脂的制备3
Fmoc-Val-Ala-OH的制备：
取50g CTC树脂(1.0mmol/g)装入固相反应柱中，DCM洗涤两次，DCM溶胀30分钟。将Fmoc-Ala-OH：30.5g、DIEA：17.8g溶解在500ml DMF中，加入到上述固相反应柱中反应4.0h，反应结束，采用DMF洗涤4次，加入甲醇：50ml、DIEA：8.9g，封端反应1.0h。后采用20％哌啶/DMF脱保护2次，脱保护时间分别为5min、15min，继续偶联Fmoc-Val-OH，得到Fmoc-Val-Ala-CTC树脂76.3g。
将上述Fmoc-Val-Ala-CTC树脂，采用20％TFE/DCM裂解2.0h，裂解结束，过滤树脂，滤液浓缩得到Fmoc-Val-Ala-OH重量24.1g。
Fmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-OH的制备：
取70g CTC树脂(0.7mmol/g)装入固相反应柱中，DCM洗涤两次，DCM溶胀30分钟。将Fmoc-Glu(OtBu)-OH：46.5g、DIEA：18.8g溶解在500ml DMF中，加入到上述固相反应柱中反应4.0h，反应结束，采用DMF洗涤4次，加入甲醇：50ml、DIEA：9.1g，封端反应1.0h。后采用20％哌啶/DMF脱保护2次，脱保护时间分别为5min、15min，继续偶联Fmoc-Cys(Trt)-OH，得到Fmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-CTC树脂95.1g。
将上述Fmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-CTC树脂，采用20％TFE/DCM裂解2.0h，裂解结束，过滤树脂，滤液浓缩得到Fmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-OH重量41.6g。
采用实施例3中的Fmoc-Leu-HMP-Leu(Tmb)-MBHA树脂，用20％哌啶/DMF脱保护2次，用茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Cys(Acm)-OH：7.3g和HOBt 6.7g溶解在45ml DMF中，加入DIC 8.1g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2-4h，以茚三酮检测呈阴性，为反应结束。
重复上述脱保护和氨基酸偶联步骤，按照普卡那肽序依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Val-Ala-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Boc-Asn(Trt)-OH偶联，得到普卡那肽线性肽树脂39.5g。
实施例11：普卡那肽树脂的制备4
Fmoc-Leu-Cys(Acm)-Val-OH的制备：
取50g CTC树脂(1.0mmol/g)装入固相反应柱中，DCM洗涤两次，DCM溶胀30分钟。将Fmoc-Val-OH：33.9g、DIEA：19.5g溶解在500ml DMF中，加入到上述固相反应柱中反应4.0h，反应结束，采用DMF洗涤4次，加入甲醇：50ml、DIEA：8.1g，封端反应1.0h。后采用20％哌啶/DMF脱保护2次，脱保护时间分别为5min、15min，继续偶联Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Leu-OH，得到Fmoc-Leu-Cys(Acm)-Val-CTC树脂91.1g。
将上述Fmoc-Leu-Cys(Acm)-Val-CTC树脂，采用20％TFE/DCM裂解2.0h，裂解结束，过滤树脂，滤液浓缩得到Fmoc-Leu-Cys(Acm)-Val-OH重量38.3g。
Fmoc-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-OH的制备：
取80g CTC树脂(0.6mmol/g)装入固相反应柱中，DCM洗涤两次，DCM溶胀30分钟。将Fmoc-Glu(OtBu)-OH：33.5g、DIEA：16.3g溶解在500ml DMF中，加入到上述固相反应柱中反应4.0h，反应结束，采用DMF洗涤4次，加入甲醇：50ml、DIEA：10.3g，封端反应1.0h。后采用20％哌啶/DMF脱保护2次，脱保护时间分别为5min、15min，继续偶联Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH，得到Fmoc-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-CTC树脂110.5g。
将上述Fmoc-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-CTC树脂，采用20％TFE/DCM裂解2.0h，裂解结束，过滤树脂，滤液浓缩得到Fmoc-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-OH重量53.8g。
采用实施例5中的Fmoc-Leu-Linker-Val(Dmb)-AM树脂，用20％哌啶/DMF脱保护2次，用茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Cys(Acm)-OH：8.4g和HOBt：5.2g溶解在45ml DMF中，加入DIC：5.7g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2-4h，以茚三酮检测呈阴性，为反应结束。
重复上述脱保护和氨基酸偶联步骤，按照普卡那肽序依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Leu-Cys(Acm)-Val-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH偶联，得到普卡那肽肽树脂45.3g。
实施例12：普卡那肽树脂的制备5
采用实施例6中的Fmoc-Leu-HMP-Ala(Tmb)-AM树脂，用20％哌啶/DMF脱保护2次，用茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Cys(Acm)-OH：9.3g和 HOBt：5.7g溶解在45ml DMF中，加入DIC：6.3g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2-4h，以茚三酮检测呈阴性，为反应结束。
重复上述脱保护和氨基酸偶联步骤，按照普卡那肽序依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH偶联，得到普卡那肽肽树脂43.1g。
实施例13：普卡那肽树脂的制备6
采用实施例7中的Fmoc-Leu-HMP-Pro-MBHA树脂，用20％哌啶/DMF脱保护2次，用茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Cys(Acm)-OH：7.5g和HOBt：4.3g溶解在48ml DMF中，加入DIC：5.4g活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2-4h，以茚三酮检测呈阴性，为反应结束。
重复上述脱保护和氨基酸偶联步骤，按照普卡那肽序依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH偶联，得到普卡那肽肽树脂42.8g。
实施例14：普卡那肽粗肽的制备1
采用实施例8所得普卡那肽树脂42g，加入体积比为TFA/TIS/MPR/m-Cresol＝92.5/2.5/2.5/2.5的裂解液(用量10ml/克普卡那肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应2-4小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重，得到线性粗肽16.9g。
取上述所得普卡那肽线性粗肽，将线性肽加入10％乙腈/水溶液中，线性肽浓度为1mg/ml，然后向溶解液中加入2.0eq双氧水，反应2.0小时，然后向反应体系中加入10％体积醋酸，加入碘，继续反应20小时，HPLC检测反应结束，普卡那肽粗肽纯度为86.4％。
实施例15：普卡那肽粗肽的制备2
取实施例9所得普卡那肽树脂39g，加入体积比为TFA/TIS/MPR/m-Cresol＝91/3/3/3的裂解液(用量10ml/克普卡那肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应2-4小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水 乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重，得到线性粗肽17.1g。
取上述所得普卡那肽线性粗肽，将线性肽加入10％乙腈/水溶液中，线性肽浓度为1mg/ml，然后向溶解液中加入2.0eq双氧水，反应2.0小时，然后向反应体系中加入10％体积醋酸，加入碘，继续反应20小时，HPLC检测反应结束，普卡那肽粗肽纯度为81.8％。
实施例16：普卡那肽粗肽的制备3
取实施例10所得普卡那肽树脂39g，加入体积比为TFA/TIS/MPR/m-Cresol＝88/4/5/3的裂解液(用量10ml/克普卡那肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应2-4小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重，得到线性粗肽14.9g。
取上述所得普卡那肽线性粗肽，将线性肽加入10％乙腈/水溶液中，线性肽浓度为1mg/ml，然后向溶解液中加入2.0eq双氧水，反应2.0小时，然后向反应体系中加入10％体积醋酸，加入碘，继续反应20小时，HPLC检测反应结束，普卡那肽粗肽纯度为87.8％。
实施例17：普卡那肽粗肽的制备4
取实施例11所得普卡那肽树脂45g，加入体积比为TFA/TIS/MPR/m-Cresol＝90/4/2/4的裂解液(用量10ml/克普卡那肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应2-4小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重，得到线性粗肽17.8g。
取上述所得普卡那肽线性粗肽，将线性肽加入10％乙腈/水溶液中，线性肽浓度为1mg/ml，然后向溶解液中加入2.0eq双氧水，反应2.0小时，然后向反应体系中加入10％体积醋酸，加入碘，继续反应20小时，HPLC检测反应结束，普卡那肽粗肽纯度为85.6％。
实施例18：普卡那肽粗肽的制备5
取实施例12所得普卡那肽树脂43g，加入体积比为TFA/TIS/MPR/m-Cresol＝90/2/2/6的裂解液(用量10ml/克普卡那肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应2-4小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重，得到线性粗肽15.8g。
取上述所得普卡那肽线性粗肽，将线性肽加入10％乙腈/水溶液中，线性肽浓度为1mg/ml， 然后向溶解液中加入2.0eq双氧水，反应2.0小时，然后向反应体系中加入10％体积醋酸，加入碘，继续反应20小时，HPLC检测反应结束，普卡那肽粗肽纯度为86.6％。
实施例19：普卡那肽粗肽的制备6
取实施例13所得普卡那肽树脂42g，加入体积比为TFA/TIS/MPR/m-cresol＝93/2/4/1的裂解液(用量10ml/克普卡那肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应2-4小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重，得到线性粗肽16.9g。
取上述所得普卡那肽线性粗肽，将线性肽加入10％乙腈/水溶液中，线性肽浓度为1mg/ml，然后向溶解液中加入2.0eq双氧水，反应2.0小时，然后向反应体系中加入10％体积醋酸，加入碘，继续反应20小时，HPLC检测反应结束，普卡那肽粗肽纯度为84.6％。
实施例20：普卡那肽粗肽的纯化1
采用实施例14的普卡那肽粗肽，采用高效制备液相，Daiso C18填料，磷酸二氢钠乙腈纯化体系，对粗肽进行精制，纯化后冻干，得普卡那肽精肽10.3g，收率为61.0％，纯度为99.7％，最大单杂0.04％，其HPLC色谱图如图1所示，特征峰保留时间与峰面积结果如表1所示。
表1 实施例20的普卡那肽精肽特征峰保留时间与峰面积结果
<Peak Table>
Detector A210nm
Peak# Ret.Time Area Height Area％ Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP)
1 10.653 3405 167 0.03 -- -- 5133
2 10.992 882 80 0.01 -- 0.537 4333
3 11.193 847 78 0.01 -- 0.324 6103
4 11.663 1104 53 0.01 -- 0.821 6670
5 12.779 6753 219 0.07 0.681 1.827 6165
6 14.064 9853914 910744 99.71 0.928 2.755 39667
7 17.267 8358 251 0.08 -- 5.617 6484
8 18.027 1410 98 0.01 -- 1.123 21067
9 18.231 1017 82 0.01 -- 0.325 9317
10 19.425 1575 130 0.02 1.005 2.177 51756
11 20.381 3679 106 0.04 0.929 1.384 6137
Total   9882945 912008 100.00      
实施例21：普卡那肽粗肽的纯化2
采用实施例15的普卡那肽粗肽，采用高效制备液相，Daiso C18填料，磷酸二氢钠乙腈纯化体系，对粗肽进行精制，纯化后冻干，得普卡那肽精肽9.9g，收率为59.3％，纯度为99.5％，最大单杂0.1％，其HPLC色谱图与图1相似。
实施例22：普卡那肽粗肽的纯化3
采用实施例16的普卡那肽粗肽，采用高效制备液相，Daiso C18填料，磷酸二氢钠乙腈 纯化体系，对粗肽进行精制，纯化后冻干，得普卡那肽精肽9.8g，收率为58.3％，纯度为99.4％，最大单杂0.07％，其HPLC色谱图与图1相似。
实施例23：普卡那肽粗肽的纯化4
采用实施例17的普卡那肽粗肽，采用高效制备液相，Daiso C18填料，磷酸二氢钠乙腈纯化体系，对粗肽进行精制，纯化后冻干，得普卡那肽精肽10.1g，收率为60.1％，纯度为99.6％，最大单杂0.06％，其HPLC色谱图与图1相似。
实施例24：普卡那肽粗肽的纯化5
采用实施例18的普卡那肽粗肽，采用高效制备液相，Daiso C18填料，磷酸二氢钠乙腈纯化体系，对粗肽进行精制，纯化后冻干，得普卡那肽精肽9.5g，收率为56.5％，纯度为99.7％，最大单杂0.04％，其HPLC色谱图与图1相似。
实施例25：普卡那肽粗肽的纯化6
采用实施例19的普卡那肽粗肽，采用高效制备液相，Daiso C18填料，磷酸二氢钠乙腈纯化体系，对粗肽进行精制，纯化后冻干，普卡那肽精肽10.8g，收率为64.2％，纯度为99.5％，最大单杂0.05％，其HPLC色谱图与图1相似。
对比例1：
取20.0g wang树脂(1.0mmol/g)装入固相反应柱中，DCM洗涤两次，DCM溶胀30分钟。将Fmoc-Leu-OH：14.12g、HOBT：5.5g、DIC：5.2g、DMAP：0.48g溶解在50ml DMF中，加入到上述固相反应柱中反应4.0-6.0h，反应结束，采用DMF洗涤4次。取适量树脂进行替代值测定，得到Fmoc-Leu-wang树脂。
采用上述Fmoc-Leu-wang树脂，用20％哌啶/DMF脱保护2次，用茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Cys(Acm)-OH：7.9g和HOBt 4.1g溶解在50ml DMF中，加入DIC 5.3g活化3-5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2-4h，以茚三酮检测呈阴性，为反应结束。重复上述脱保护和氨基酸偶联步骤，按照普卡那肽序依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH偶联，得到普卡那肽线性肽树脂39.5g。
取上述所得普卡那肽树脂30g，加入体积比为TFA/TIS/MPR/m-cresol＝93/2/4/1的裂解液(用量10ml/克普卡那肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应2-4小时，反应混合物使用砂芯 漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重，得到线性粗肽10.9g。
取上述所得普卡那肽线性粗肽，将线性肽加入10％乙腈/水溶液中，线性肽浓度为1mg/ml，然后向溶解液中加入2.0eq双氧水，反应2.0小时，然后向反应体系中加入10％体积醋酸，加入碘，继续反应20小时，HPLC检测反应结束，普卡那肽粗肽纯度为68.6％。
上述普卡那肽粗肽，采用高效制备液相，Daiso C18填料，磷酸二氢钠乙腈纯化体系，对粗肽进行精制，纯化后冻干，得普卡那肽精肽5.18g，收率为38.3％，纯度为97.1％，最大单杂2.08％，其HPLC色谱图如图2所示，特征峰保留时间与峰面积结果如表2所示。
表2 对比例1的普卡那肽精肽特征峰保留时间与峰面积结果
<Peak Table>
Detector A210nm
Peak# Ret.Time Area Height Area％ Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP)
1 12.258 1455 155 0.03 1.092 -- 35753
2 12.659 4023 350 0.07 -- 1.361 23614
3 12.877 1176 130 0.02 -- 0.317 2428
4 13.639 5278669 510771 97.12 0.941 1.160 41134
5 14.011 112903 10597 2.08 -- 0.617 3571
6 14.468 29474 2214 0.54 -- 0.706 26594
7 14.874 7450 530 0.14 -- 1.067 21477
Total   5435149 524746 100.00      
对比例2：
取15.0g wang树脂(0.65mmol/g)装入固相反应柱中，DCM洗涤两次，DCM溶胀30分钟。将Fmoc-Leu-OH：14.12g、HOBT：5.5g、DIC：5.2g、DMAP：0.48g溶解在50ml DMF中，加入到上述固相反应柱中反应4.0-6.0h，反应结束，采用DMF洗涤4次。取适量树脂进行替代值测定，得到Fmoc-Leu-wang树脂。
采用上述Fmoc-Leu-wang树脂，用20％哌啶/DMF脱保护2次，用茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色表示Fmoc脱除完全，将Fmoc-Cys(Acm)-OH：8.9g和HOBt 4.5g溶解在50ml DMF中，加入DIC 5.3g活化3-5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2-4h，以茚三酮检测呈阴性，为反应结束。重复上述脱保护和氨基酸偶联步骤，按照普卡那肽序依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、实施例11制备所得的Fmoc-Leu-Cys(Acm)-Val-OH、实施例11制备所得的Fmoc-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH偶联，得到普卡那肽线性肽树脂41.7g。
取上述所得普卡那肽树脂40g，加入体积比为TFA/TIS/MPR/m-cresol＝93/2/4/1的裂解 液(用量10ml/克普卡那肽树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应2-4小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水乙醚沉淀，再用无水乙醚洗沉淀3次，抽干得类白色粉末，真空减压干燥至恒重，得到线性粗肽14.3g。
取上述所得普卡那肽线性粗肽，将线性肽加入10％乙腈/水溶液中，线性肽浓度为1mg/ml，然后向溶解液中加入2.0eq双氧水，反应2.0小时，然后向反应体系中加入10％体积醋酸，加入碘，继续反应20小时，HPLC检测反应结束，普卡那肽粗肽纯度为73.1％。
上述普卡那肽粗肽，采用高效制备液相，Daiso C18填料，磷酸二氢钠乙腈纯化体系，对粗肽进行精制，纯化后冻干，得普卡那肽精肽6.8g，收率为40.2％，纯度为97.69％，最大单杂0.96％，其HPLC色谱图如图3所示，特征峰保留时间与峰面积结果如表3所示。
表3 对比例2的普卡那肽精肽特征峰保留时间与峰面积结果
<Peak Table>
Detector A210nm
Peak# Ret.Time Area Height Area％ Tailing Factor Resolution(USP) Number of Theoretical Plate(USP)
1 13.644 10156945 980018 97.69 1.013 -- 39655
2 13.996 46456 6332 0.45 -- -- --
3 14.537 99317 9351 0.96 -- -- 43897
4 15.145 93971 4125 0.90 1.343 1.393 10361
Total   10396689 999826 100.00      
数据显示，实施例14-19所得普卡那肽粗肽的纯度均比对比例1、2高，由此可知本发明提供的普卡那肽的合成方法可提高普卡那肽粗肽的纯度。实施例20-25与对比例1、2中的HPLC图谱及相应的数据显示，采用本发明合成普卡那肽，经过简单的纯化后，得到的普卡那肽精肽纯度、收率均比对比例1、2高，最大单杂也得到了控制，由此可知本发明提供的普卡那肽的合成方法可减少杂质产生，降低纯化难度，提高产品收率。

Claims (8)

  1. 一种普卡那肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
    (1)将Y树脂，分别与X、Linker、Fmoc-Leu-OH偶联，得到Fmoc-Leu-Linker-X-Y树脂，其中X选自N端H由Dmb/Hmb/Tmb保护的氨基酸或Pro；
    (2)在Fmoc-Leu-Linker-X-Y树脂上通过固相偶联合成方法依次接入序列中相应的保护氨基酸或片段，制得普卡那肽线性肽树脂；
    (3)普卡那肽线性肽树脂经裂解，得到线性普卡那肽，经环化，即得普卡那肽。
  2. 根据权利要求1所述的普卡那肽的制备方法，其特征在于，所述的Y树脂为：MBHA树脂或AM树脂。
  3. 根据权利要求1所述的普卡那肽的制备方法，其特征在于，所述的Linker为：HMP。
  4. 根据权利要求1所述的普卡那肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的氨基酸选自Leu、Val、Ala、Gly。
  5. 根据权利要求1所述的普卡那肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述普卡那肽线性肽树脂为：R1-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Cys(R2)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(R3)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(R2)-Thr(tBu)-Gly-Cys(R3)-Leu-HMP-X-Y树脂，其中R1为Fmoc或Boc；R2为Trt，R3为Acm。
  6. 根据权利要求1所述的普卡那肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)肽树脂裂解体系为TFA与m-cresol、TIS、Mpr的混合溶液。
  7. 根据权利要求1所述的普卡那肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述环化由第一步环化、第二步环化完成。
  8. 根据权利要求6所述的普卡那肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)中第一步环化采用空气氧化或双氧水氧化；第二步环化采用碘氧化。
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